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Verfahren zur Stabilisierung von Virusantigenmaterial
Die Erfindung betrifft verbesserte Virusantigene, wie Virusvaccine, und Verfahren zur Herstellung von antigenen Stoffen. Im besondern bezieht sich die Erfindung auf Virusmaterialien mit erhöhter Antigenstabilität.
Im Hinblick darauf, dass die handelsüblichen Virusmaterialien im allgemeinen dazu neigen, bei der Lagerung an antigener Wirksamkeit zu verlieren, wurde bereits vorgeschlagen, stabilisierende Mittel zu inkorporieren, um die Wirksamkeit für längere Zeiträume zu erhalten bzw. zu stabilisieren. Verschiedenste stabilisierende Mittel wurden zu diesem Zweck bereits beschrieben. Bei der Vaccinherstellung wird das Problem dadurch kompliziert, dass Schritte notwendig sein können, bei welchen das Vaccinmaterial gefriergetrocknet wird, um ein nichtwässeriges Produkt zu erhalten, oder einfach gefroren wird, um einen Zustand maximaler Stabilität zu erreichen, worauf es nach Bedarf aufgetaut wird, so dass das flüssige Produkt in Phiolen gefüllt werden kann.
Wenn das Vaccinmaterial die zur unmittelbaren Abfüllung notwendige Menge überschreitet, was bei der kommerzielle Herstellung gewöhnlich der Fall ist, muss das überschüssige Vaccin erneut gefroren und so lange aufbewahrt werden, bis zur weiteren Abfüllung zusätzliches Vaccin gebraucht wird.
Dies führt unvermeidlich zu einer Reihe von Gefrierungs- und Auftauungsarbeitsgängen, was bei Fehlen eines geeigneten Stabilisierungsmittels eine nachteilige Wirkung hat und zum vorzeitigen Verlust der Antigenwirksamkeit führt. In diesem Zusammenhang ist es bekannt, dass hohe Salzkonzentrationen einen zerstörenden Einfluss auf die Antigenwirksamkeit besitzen. Die Verwendung von Salzen als Stabilisatoren ist daher nicht angezeigt. Die Salzkonzentration stellt beim Trocknen ein besonderes Problem dar, weil diese während der Entfernung des Wassers aus dem wässerigen Produkt fortschreitend steigt, wodurch die antigenen Faktoren zunehmend einer möglichen Schädigung ausgesetzt werden. Die Zugabe von Salzen bewirkt auch eine Herabsetzung der Temperatur, bei welcher ein flüssiges Produkt in den festen Zustand übergeführt werden kann.
Von hygroskopischen Stoffen ist ebenfalls abzuraten, weil sie bei hoher Konzentration Sirupe bilden, die schwer zu handhaben sind, besonders bei der Trocknungsoperation.
Es ist also ein Ziel der Erfindung, Virusmaterialien zu schaffen, die, insbesondere während der Gefriertrocknung oder bei längerdauernder Lagerhaltung oder Aufarbeitung, eine erhöhte Antigenstabilität besitzen.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Schaffung von flüssigen Virusmaterialien, die ohne wesentlichen Verlust der Antigenwirksamkeit einem wiederholten Gefrieren und Auftauen unterworfen werden können.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Schaffung von stabilisierten Vaccinen.
Des weiteren bezweckt die Erfindung die Schaffung flüssiger Virusmaterialien, die ohne Bildung von Sirupen in nicht hygroskopischen festen Zustand übergeführt werden können und die, wenn sie mit Wasser wieder in den ursprünglichen Zustand gebracht oder in anderer Weise verarbeitet werden, als Vaccine für immunogene oder prophylaktische Zwecke verwendet werden können.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Schaffung von Mitteln zur Stabilisierung von Virusmaterialien.
Diese und andere Ziele, Merkmale und Vorteile, die sich aus der folgenden Beschreibung der Erfindung ergeben, werden durch die Schaffung von Virusantigenen, die einen geringen Anteil des als Calciumlactobionat bekannten Salzes enthalten, verwirklicht. Die Produkte gemäss der Erfindung, die Calciumlactobionat enthalten, sind antigenstabil und behalten ihre erwünschte Wirksamkeit für lange Zeiträume, was einen grossen Vorteil darstellt.
Da das Vorhandensein von zusätzlichen Salzen in Vaccinen oder Antigenmaterialien gewöhnlich unerwünscht ist, ist es überraschend, dass die erfindungsgemässen Produkte, welche das Salz Caiciumlactobionat enthalten, ähnlichen Materialien, die Calciumlactobionat nicht enthalten, in bezug auf Antigenstabilität weit überlegen sind. Überdies können die flüssigen Antigene gemäss der Erfindung ohne Bildung von schwer handhabbaren Sirupen u. a. hygroskopischer Formen in die Form eines trockenen, flockigen Pulvers gebracht werden.
Ein anderer unerwarteter Vorteil besteht darin, dass, während im allgemeinen viele Vaccintypen gefroren und bei äusserst niedriger Temperatur aufbewahrt werden müssen, um während der Lagerung grösstmögliche Stabilität zu erhalten, die erfindunggemässen Produkte ohne merkbaren Verlust an Wirksamkeit im gefrorenen Zustand bei wesentlich höherer
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Temperatur lange Zeit aufbewahrt werden können. Z. B. muss ein übliches Masernvaccin, welches normalerweise einen kleinen Anteil Calciumchlorid enthält, bei Temperaturen unter etwa-60 C gehalten werden ; bei höherer Temperatur geht die Antigenwirkung rasch und praktisch zur Gänze verloren.
Im auffallenden Gegensatz dazu kann ein erfindungsgemäss stabilisiertes Masernvaccin bequem bei Temperaturen bis etwa-20 C aufbewahrt werden ; bei diesen höheren Temperaturen wird eine maximale Stabilität erreicht. Darüberhinaus können die erfindungsgemässen Produkte wiederholten Gefrier- und Auftau- arbeitsgängen ohne unzulässigen Verlust der Antigenwirksamkeit unterworfen werden.
Die Erfindung ist auf antigene Virusmaterialien auf breiter Basis anwendbar und bezieht sich insbeson- dere auf solche Virusmaterialien in trockener oder wässeriger Form, die entweder Vaccine sind oder zur Herstellung von Vaccinen oder Antisera verwendet werden können.
Die Erfindung ist somit auf Virusvaccine allgemein, einschliesslich Vaccine mit geschwächten lebenden Viren oder Vaccine mit abgetöteten Viren, anwendbar. Zur Erläuterung werden einige der vielen Vaccine, auf die die Erfindung anwendbar ist, angeführt : Poliomyelitis-, Masern-, infektiöse Hepatitis-, Gelbfieber-, Mumps-, Tollwut-und Blatternvaccine. Die Erfindung ist sowohl auf nicht-stabilisierte als auch auf teilweise stabilisierte Vaccine, die nach üblichen, dem Fachmann geläufigen Methoden herstellbar sind, anwendbar. Die Erfindung ist auch zur Stabilisierung von Ausgangsmaterialien für Virusvaccine, wie Viruskulturfiltrate, -zentrifugate u. dgl., unfertige Virusvaccine, Vaccinpools u. a. in Verarbeitung befindliche antigene Materialien anwendbar.
In der folgenden Beschreibung wird die Erfindung zur Erläuterung mit besonderer Bezugnahme auf fertige Vaccine und deren Herstellung beschrieben ; es soll jedoch bemerkt werden, dass die Erfindung stabilisierte Virusmaterialien allgemein betrifft und nicht auf fertige Vaccine beschränkt ist.
Calciumlactobionat ist ein verhältnismässig billiger Stoff und ist in hohem Reinheitsgrad im Handel erhältlich. Technische Güteklassen sind zufriedenstellend, aber verfeinerte Gütestufen, die der nachstehenden typischen Analyse nahekommen oder diese übertreffen, werden bevorzugt :
Calcium 4, 94%
Feuchtigkeit 5, 14os
Gesamtmenge der reduzierenden Substanzen als Lactose, H20 0, 27%
Schwermetalle 10 TpM
PH (lomige Lösung) 6, 5-7, 5.
Die Menge des in die Virusprodukte zwecks Stabilisierung einzubringenden Calciumlactobionats hängt von der Art des Vaccins, der relativen Labilität des vorhandenen Antigens u. a. ähnlichen Faktoren ab. Das Calciumlactobionat wird in Form eines trockenen Pulvers oder als verdünnte wässerige Lösung bequem in das flüssige Virusmaterial unter gründlichem Mischen bei niedriger Temperatur eingebracht, wobei eine homogene Suspension oder Lösung erhalten wird. Im allgemeinen wird eine Konzentration von mindestens etwa 0, 1% (Gew./Vol.) angewendet. Um eine grösstmögliche Stabilität zu erreichen, wird eine Konzentration von 1% (Gew./Vol.) bevorzugt.
So hohe Konzentrationen wie etwa 5% (Gew./Vol.) sind ebenfalls zufriedenstellend ; die Erfindung sieht auch die Verwendung höherer Konzentrationen vor, obwohl der erwünschte Stabilisierungseffekt immer weniger deutlich wird, je mehr die Konzentration vergrössert wird. Trockene, stabilisierte Produkte werden zweckmässig aus den erwähnten flüssigen Produkten nach üblichen, in der Fachwelt bekannten Trocknungsverfahren hergestellt, wie Gefriertrocknen oder Lyophilisieren. Gewichtsmässig enthalten solche nicht-wässerige Produkte eine hohe Konzentration von Calciumlactobionat, gemessen am Gesamtgehalt an Feststoffen. Die Erfindung bezieht sich, wie erwähnt, nicht nur auf flüssige, wässerige Virusmaterialien und Vaccine, sondern auch auf trockene,
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werden können.
Gemäss einem weiteren Merkmal der Erfindung können die Produkte, um die Antigenwirkung zu steigern, kleine Mengen von immunogen verträglichen Protein oder Polypeptid, wie Protamin, menschlichem Albumin, Pepton u. dgl., enthalten. Z. B. kann man etwa 1-5% (Gew./Vol.) Protein oder Polypeptid verwenden.
Gemäss einer weiteren Ausführungsform der Erfindung, welche sich auf das Trocknen von flüssigen Produkten bezieht und nicht nur eine grössere Leichtigkeit in der Handhabung, sondern auch einen verbesserten Stabilisierungseffekt bewirkt, wird eine kleine Menge [z. B. etwa 2-10% (Gew./Vol.), vorzugsweise etwa z Lactose zusätzlich zu dem Calciumlactobionat in das flüssige Produkt vor der Trocknung eingebracht. Da die Lactose eine verträgliche und verarbeitbare Matrix schafft, wird der Trocknungsschritt dadurch erleichtert. Überdies sind trockene, Lactose enthaltende Produkte im allgemeinen antigenstabiler als solche Produkte, die Lactose nicht enthalten.
Nach der üblichen Praxis werden die erfindungsgemässen Produkte zweckmässig unter aseptischen Bedingungen verarbeitet, wobei Komponenten verwendet werden, die vorher bakeriensteril gemacht wurden. Die Sterilität kann bei der Lagerung aufrechterhalten werden, wenn man einen mit dem Antigen verträglichen keimtötenden Stoff, wie Natriumäthylquecksilberthiosalicylat (Thimerosal) oder Benzyl- dimethyl- (2- [2- (p-l, 3, 3-Tetramethylbutylphenoxy)-äthoxy]-äthyl}-ammoniumchlorid (Benzethoniumchlorid) zufügt. Bei Produkten, die in den trockenen, nicht-wässerigen Zustand gebracht sind, ist jedoch die Verwendung eines keimtötenden (germiziden) oder sterilisierenden Mittels gewöhnlich unnötig.
Wenn
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nicht anders angegeben, werden die Antigensubstanzen, wenn möglich, während der Herstellung vorzugsweise kühl gehalten (etwa 4 C).
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert, welche die Erfindung jedoch nicht einschränken sollen. Die Konzentration der Bestandteile ist, wenn nicht anders spezifiziert, in Gewichtpro-Volumen-Prozenten angegeben.
Beispiel 1 : a) Herstellung von Gewebekulturzellen.-Gewebekulturzellen, die nach den genormten Trypsinisierungstechniken aus 11-12 Tage alten angebrüteten Hühnereiern bereitet wurden, werden 3-5 Tage in stillstehenden Flaschen gezüchtet. Das für die Zellen verwendete Kulturmedium ist synthetisches Medium Nr. 199 (vgl. Anm. Journ. Hyg. 60, 225-230 [1954]). Die Zellmonoschichten werden zweimal mit 100ml-Mengen des Mediums Nr. 199 bei einem pH-Wert von 7, 4-7, 6 und einem Gehalt von lg Streptomycin gewaschen. b) Animpfung von Zellen.-Nach dem Waschen werden 50 cm3 einer Lösung, die 1000-10. 000 für 50% der Gewebekultur infektiöse Dosen (TCIDgo) von geschwächten Masernviren, Stamm Edmonston, suspendiert in Medium Nr. 199, enthält, zu jeder Gewebekulturflasche zugegeben.
Der Virusstamm ist erhältlich bei der Research Division of Infections Diseases des Children's Medical Center, Boston, Mass.
Vgl. American Journal of Public Health, 47 : 275-282 (1957) ; Connecticut Medicine, 23 : 561-567 (1959). c) Inkubation.-Die angeimpften Kulturen werden bei 32 C stationär bebrütet, bis etwa 2j3 bis 3h der Monoschicht einen cytopatischen Effekt zeigt, was gewöhnlich nach 7-14 Tagen nach der Beimpfung der Fall ist, in welchem Zeitpunkt die Virusausbeute am besten ist. d) Ernte.-Die Zellschichten aus den bebrüteten Kulturen werden in den Flüssigkeiten suspendiert und in einem gemeinsamen gekühlten Auffanggefäss gesammelt. Die so erhaltene Suspension wird bei 4 C zehn Minuten bei 1500 Umdr/min zentrifugiert.
Die überstehende Flüssigkeit wird von dem zusammengepressten Zellenkuchen entfernt und, solange sie kalt ist, durch ein Filter (mittlere Glasfritte) geleitet, um zurückbleibende Zellenreste zu entfernen. Die so erhaltene überstehende Flüssigkeit ist als Masernvaccin geeignet, ist aber in bezug auf die Antigenwirkung verhältnismässig labil, wenn sie einer längeren Lagerung, wiederholten Gefrier- und Auftau-Arbeitsgängen, Gefriertrocknen usw. unterworfen wird.
Im folgenden wird die Herstellung von stabilisierten Masernvaccinen aus Antigen-Ausgangsmaterialien, die gemäss der obigen Verfahrensweise bereitet wurden, beschrieben. Des weiteren wird eine Gegen- überstellung des antigenen Verhaltens von unstabilisierten und stabilisierten Masernvaccinen bei verschiedenen Umweltbedingungen, wie sie beim Gefrieren, Trocknen und bei der Lagerung gegeben sind, gebracht. Die verwendeten unstabilisierten Vaccine waren einerseits überstehende Flüssigkeiten des nach der Arbeitsweise 1 d) erhaltenen Typs, die im folgenden als "Kontrolle" bezeichnet werden, und anderseits dieselben Flüssigkeiten mit einem Zusatz von menschlichem Albumin (1%), die im folgenden als Kontrolle mit Albumin" bezeichnet sind.
Stabilisierte Vaccine.-Getrennte aliquote Anteile von überstehenden Masernvirusflüssigkeiten, die nach der Arbeitsweise 1 d) erhalten wurden, wurden mit Calciumlactobionat (1% ; verfeinerte Gütestufe, Sheffield Chemical Div., Sheffield Farms Co., Inc., Norwich, Conn. ) bzw. mit Calciumlactobionat (1% und 5%) und menschlichem Albumin (1%) bzw. mit Calciumlactobionat (1%), menschlichem Albumin (1%) und Lactose (5%) gemischt. In jedem Fall wurden die Bestandteile in der Kälte gründlich gemischt, um eine homogene Flüssigkeit herzustellen.
Die so erhaltenen Produkte hatten die folgende Zusammensetzung, berechnet auf das Gesamtvolumen des Vaccins :
Vaccin A : CalciumlactobiQnat (1 %)
Vaccin B : Calciumlactobionat (1%) menschliches Albumin (1%)
Vaccin C : Calciumlactobionat (5%) menschliches Albumin (1%)
Vaccin D : Calciurnlactobionat (1 %) menschliches Albumin (1%)
Lactose (5%).
Die Widerstandsfähigkeit gegen einen Verlust der Wirksamkeit während der Gefriertrocknung wurde dadurch demonstriert, dass man die Vaccine C und D sowie ein Kontrollvaccin einer üblichen Gefriertrocknung (0 C, Virtis-Trockner, Modell Nr. P-24-PR, Virtis Company, Inc. ; Gardiner, N. Y. ) unterwarf. Die Wirksamkeit vor und nach der Trocknung, ausgedrückt durch den Infektivitätstiter, wurde für jedes Vaccin bestimmt. Diese Bestimmung erfolgte derart, dass Monoschichtkulturen von Hühnerembryozellen mit einem aliquoten Anteil des jeweiligen Vaccins beimpft und die Entwicklung der Scheibenbildung beobachtet wurde, gemäss der von Dulbecco et al., J. Exper. Med., 99 : 167, 1954, beschriebenen Methode.
Der Infektivitätstiter, der direkt auf die Antigenwirkung des Impfmittels Bezug nimmt, wird durch Scheibenbildungseinheiten (PFU) pro Milliliter Vaccin ausgedrückt. Es wurden folgende Resultate erhalten : (Tabelle 1 siehe Seite 4.)
Diese Resultate zeigen, dass, während die stabilisierten Masernvaccine C und D während des Trocknens nur einen mässigen Verlust an Wirksamkeit erlitten, das Kontrollvaccin, welches keinen Stabilisator enthielt, über 80% seiner Wirksamkeit verlor.
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Tabelle 1
EMI4.1
<tb>
<tb> Vaccin <SEP> Infektivitatsfiter <SEP> vorgetrocknet <SEP> (PFU/ml) <SEP> getrocknet
<tb> Kontrolle <SEP> mit <SEP> Albumin <SEP> 33110 <SEP> 5888
<tb> Vaccin <SEP> C <SEP> 10000 <SEP> 8511
<tb> Vaccin <SEP> D <SEP> ..................................
<SEP> 19950 <SEP> 18200
<tb>
Der Stabilisierungseffekt bei Trocknung (Sublimation unter Vakuum) und siebentägiger Lagerung wurde ebenfalls demonstriert. Bei diesem Verfahren wurden mehrere Anteile Vaccin B und eine Kontrolle mit Albumin verschiedenen Trocknungstemperaturen (0 C,-40 C und ein Bereich zwischen 0 und #40 C) und Lagerungstemperaturen (+15 und-80 C) unterworfen. Die Wirksamkeit (Infektivitätstiter) wurde zu Beginn und am Ende jeder Versuchsreihe bestimmt.
Folgende Resultate wurden erhalten :
Tabelle 2
EMI4.2
<tb>
<tb> Endgultiger <SEP> Invektivitatistiter <SEP> (PFU/ml)
<tb> Sublimationstemperatur <SEP> C <SEP> Lagerungstemperatur <SEP> C <SEP>
<tb> Kontrolle <SEP> mit <SEP> Albumin <SEP> Vaccin <SEP> B
<tb> (ursprünglich <SEP> 8,913.000) <SEP> (ursprunglich <SEP> 8,913.000)
<tb> 0 <SEP> 15 <SEP> 5248 <SEP> I <SEP> 2, <SEP> 138. <SEP> 000 <SEP>
<tb> 0-80 <SEP> 31620 <SEP> 2, <SEP> 951. <SEP> 000 <SEP>
<tb> - <SEP> 40 <SEP> 15 <SEP> 5248 <SEP> 1, <SEP> 288. <SEP> 000 <SEP>
<tb> - <SEP> 40 <SEP> -80 <SEP> < 5012 <SEP> 2, <SEP> 239. <SEP> 000 <SEP>
<tb> 0 <SEP> bis-40 <SEP> 15 <SEP> < 5012 <SEP> 1, <SEP> 698. <SEP> 000 <SEP>
<tb> 0 <SEP> bis-40-80 <SEP> < 5012 <SEP> 2, <SEP> 512. <SEP> 000 <SEP>
<tb>
Diese Resultate zeigen, dass das Kontrollvaccin in allen Fällen über 99% seiner ursprünglichen Wirksamkeit verlor.
Im Gegensatz dazu zeigen die Resultate, dass ein in erfindungsgemässer Weise stabilisiertes Vaccin während der Trocknung und Lagerung eine bedeutende Wirksamkeit beibehielt.
Ferner wurde die Widerstandsfähigkeit bei wiederholtem Gefrieren und Auftauen demonstriert. Bei diesem Verfahren wurden Vaccin B und eine Kontrolle mit Albumin nacheinander achtmal auf-76 C gefroren und bei 37, 5 C aufgetaut. Die Wirksamkeit der Vaccine wurde vor dem ersten Arbeitsgang und nach den Zyklen 1, 2,4 und 8 bestimmt, wobei folgende Ergebnisse erhalten wurden :
Tabelle 3
EMI4.3
<tb>
<tb> Infektivitastiter <SEP> (PFU)
<tb> Gefrier-Auftau-Zyklen
<tb> Kontrolle <SEP> mit <SEP> Albumin <SEP> Vaccin <SEP> B
<tb> 0 <SEP> 16, <SEP> 220. <SEP> 000 <SEP> 19, <SEP> 050. <SEP> 000 <SEP>
<tb> 1 <SEP> 15, <SEP> 490. <SEP> 000 <SEP> 18, <SEP> 620. <SEP> 000 <SEP>
<tb> 2 <SEP> 11, <SEP> 220. <SEP> 000 <SEP> 18, <SEP> 620. <SEP> 000 <SEP>
<tb> 4 <SEP> 9, <SEP> 333. <SEP> 000 <SEP> 15, <SEP> 140. <SEP> 000 <SEP>
<tb> 8 <SEP> 5, <SEP> 129. <SEP> 000 <SEP> 11, <SEP> 480. <SEP> 000 <SEP>
<tb>
Diese Resultate zeigen, dass ein erfindungsgemäss stabilisertes Vaccin bei wiederholtem Gefrieren und Auftauen eine gute Stabilität besass.
Obwohl sowohl dieses Vaccin als auch ein Kontrollvaccin bei steigender Zahl der Zyklen fortschreitend an Wirksamkeit verloren, zeigte es sich doch, dass das erstgenannte Vaccin bei jedem Zyklus durchschnittlich eine doppelt so hohe Wirksamkeit behielt als das Kontrollvaccin.
Des weiteren wurde die Widerstandsfähigkeit gegen einen Verlust der Wirksamkeit für getrocknete Produkte bei längerer Lagerung bei 4 C gezeigt. Die Produkte (Masernkontrollvaccin und Vaccine A und B) wurden nach einer Gefriertrocknung gelagert und von Zeit zu Zeit auf Wirksamkeit geprüft, wobei folgende Resultate erhalten wurden :
Tabelle 4
EMI4.4
<tb>
<tb> Infektivltatstlter <SEP> (PFU/ml)
<tb> Lagerungsdauer <SEP> (Wochen) <SEP> I <SEP> Kontrolle <SEP> vorgetrocknet <SEP> 10.000
<tb> Vaccin <SEP> A <SEP> vorgetrocknet <SEP> 12. <SEP> 590 <SEP> Vaccin <SEP> B <SEP> vorgetrocknet <SEP> 3162
<tb> 1 <SEP> 692 <SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb> 8--3467
<tb> 9 <SEP> 50--
<tb>
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<tb>
<tb> Wochen <SEP> Kontrolle <SEP> Vaccin <SEP> A <SEP> Vaccin <SEP> B
<tb> 17 <SEP> < 10-3800
<tb> 19 <SEP> - <SEP> 870 <SEP> - <SEP>
<tb> 28 <SEP> - <SEP> 646 <SEP> - <SEP>
<tb> 40 <SEP> - <SEP> - <SEP> 3310 <SEP>
<tb>
Diese Resultate zeigen, dass ein Kontrollvaccin ohne Stabilisator nach viermonatiger Lagerung im wesentlichen die gesamte Antigenwirkung verliert, während Vaccine gemäss der Erfindung für viel längere Perioden eine deutliche Antigenwirkung beibehalten.
Ferner wurde die Widerstandsfähigkeit gegen einen Verlust der Wirksamkeit für ein gefrorenes Vaccinprodukt, welches gelagert wurde, im Vergleich mit einem Kontrollvaccin demonstriert. Zum Gefrieren wurden zwei Temperaturen angewendet. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten :
Tabelle 5
EMI5.2
<tb>
<tb> Infektivitatstiter <SEP> in <SEP> Intervallen <SEP> (PFU/ml)
<tb> Gefrierungs- <SEP>
<tb> Lagertemperatur <SEP> C <SEP> temperatur <SEP> C <SEP> Kontrollvaccin <SEP> Vaccin <SEP> B
<tb> 0 <SEP> 1 <SEP> Woche <SEP> 1 <SEP> Monat <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> Woche <SEP> 1 <SEP> Monat
<tb> #20 <SEP> #40 <SEP> 10,230. <SEP> 000 <SEP> 3,162.000 <SEP> 2,630.000 <SEP> 14,790.000 <SEP> 5,012.000 <SEP> 10,000.000
<tb> #65 <SEP> #40 <SEP> 12.
<SEP> 590.000 <SEP> 794.300 <SEP> 631.000 <SEP> 14,450.000 <SEP> 17,380.000 <SEP> 15,850.000
<tb>
Diese Resultate zeigen, dass das unstabilisierte Kontrollvaccin bei der Lagerung bei niedriger Temperatur einen grösseren Verlust an Wirksamkeit erleidet, während das erfindungsgemäss stabiliserte Vaccin unter denselben Bedingungen innerhalb der Grenzen der experimentellen Genauigkeit seine ursprüngliche Wirksamkeit ohne Verlust beibehält.
Die wie beschrieben hergestellten stabilisierten Masernvaccine können direkt für immunogene Zwecke verwendet werden. Ein bevorzugtes Produkt ist eine zellenfreie Maserngewebekulturflüssigkeit, zu welcher 1% Caiciumlactobionat und 1% menschliches Albumin zugefügt wurden und welche gefriergetrocknet und in Phiolen für einfache Dosen unter aseptischen Bedingungen abgefüllt wurde, so dass eine Minimumeinheit-Wirksamkeit von 1000 PFU erhalten wird. Ein solches Produkt, welches eine gute Stabilität besitzt und bei Reconstitution mit Wasser zur Verabreichung geeignet ist, hat sich als klinisch wirksam erwiesen.
Die obige Arbeitsweise kann auch zur Stabilisierung anderer Vaccine, die von verschiedenen Virusvaccin-Ausgangsmaterialien gewonnen wurden, verwendet werden. Z. B. kann man an Stelle von Masernvaccin auch inaktiviertes Mumpsvirusvaccin [100 Hühnerzellenagglutinations-Einheiten (CCA-Einheiten) pro ml], welches Thimerosal (1 : 10. 000) enthält, verwendet werden. Hiebei werden erfindungsgemäss Calciumlactobionat (1%) und menschliches Albumin (1%) zu diesem Vaccin zugefügt und die Mischung in der Kälte gerührt, bis eine homogene Lösung erhalten wird. Die Lösung wird bei 4 C gehalten und nach Bedarf zur Ausgabe in Phiolen abgefüllt.
Beispiel 2 : Eine zellenfreie Kuhpockenvirus-Gewebekulturflüssigkeit wird wie folgt hergestellt : Unter Verwendung üblicher Trypsinisierungstechniken werden siebentägige Monoschichtkulturen von embryonaler Rinderhaut hergestellt. Synthetisches Medium Nr. 199 wird zu den Kulturen zugefügt und jede Kultur wird mit 50 ml einer Suspension, die Kuhpockenvirus enthält (1000 TCID5o), geimpft.
Die beimpften Kulturen werden vier bis sieben Tage bebrütet und die Flüssigkeiten werden geerntet, vereinigt und zentrifugiert.
Um den Stabilisierungseffekt des Calciumlactobionats in Kuhpockenvirusvaccin zu bestimmen, wurde ein aliquoter Anteil der überstehenden Flüssigkeit zu Kontrollzwecken aufbewahrt und ein weiterer aliquoter Anteil wurde durch Zumischung von Calciumlactobionat in einer Menge von 1% stabilisiert. Das so erhaltene stabilisierte Vaccin und das Kontrollvaccin wurden jeweils gefroren und in einem VirtisTrockner getrocknet.
Die Antigenwirksamkeit, ausgedrückt durch den Infektivitätstiter, wurde vor und nach dem Gefriertrocknen bestimmt, wobei folgende Resultate erhalten wurden :
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<tb>
<tb> Infektivitatstiter <SEP> (PFU/ml)
<tb> vor <SEP> Gefriertrocknung <SEP> nach <SEP> Gefriertrocknung
<tb> Kontrollvaccin <SEP> .............................. <SEP> 3,981.000 <SEP> 1,585.000
<tb> mit <SEP> 1% <SEP> Caiciumlactobionat <SEP> stabilisiertes <SEP> Vaccin <SEP> 4, <SEP> 169. <SEP> 000 <SEP> > <SEP> 5, <SEP> 000. <SEP> 000 <SEP>
<tb>
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Diese Resultate zeigen, dass das unstabilisierte Kontrollvaccin während der Gefriertrocknung über die Hälfte seiner Wirksamkeit verlor. Unter denselben Bedingungen behielt das mit Calciumlactobionat stabilisierte Vaccin ohne sichtbaren Verlust seinen hohen Wirksamkeitsgrad bei.
Das obige Verfahren kann auch zur Stabilisierung anderer Antigenmaterialien verwendet werden.
Z. B. kann man an Stelle der Kuhpockenvirusflüssigkeit ein wässeriges Medium, welches Poliomyelitisvirusantigen enthält, wie ein Affennierengewebekulturfiltrat, verwenden, welches einen oder mehrere der
EMI6.1
048) ;Zentrifugat einer Mumpsvirus enthaltenden Hühnerembryoamnionkulturflüssigkeit, Infektivitäts (Hae- magglutinations) titer 10- ; ;, verwenden.
Obgleich in der vorstehenden Beschreibung Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung im Detail beschrieben sind, ist es für Fachleute verständlich, dass bei solchen Details beträchtliche Variationen vorgenommen werden können, ohne dass vom Wesen der Erfindung abgewichen wird.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Stabilisierung von labilen, flüssigen antigenen Virusmaterialien, insbesondere Vaccinen, mit gegebenenfalls nachfolgendem Gefrieren oder Gefriertrocknen der stabilisierten Mischung, dadurch gekennzeichnet, dass dem flüssigen Virusantigenmaterial Calciumlactobionat in einer Menge von mindestens 0, 1 Gew.-% zugemischt wird.