AT227879B - Verfahren zur Herstellung eines stabilen Vaccins - Google Patents

Description

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  Verfahren zur Herstellung eines stabilen Vaccins 
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf gewisse Viren vom   Ribonucleinsäure-enthaltenden   Typ (RNA) und auf Vaccine, die aus diesen hergestellt worden sind, insbesondere auf Vaccine mit lebendem Poliovirus. Ausserdem betrifft sie Verfahren zur Stabilisierung gewisser   RNA-Viren   sowie Vaccinen, die aus denselben hergestellt sind, und auf Verfahren für die Abscheidung von Fremdviren, die in den Virusprodukten enthalten sind, aus welchen das Vaccin hergestellt ist. 



   Seit der Einführung der Gewebekulturverfahren sind abgeschwächte Stämme zahlreicher Viren gezüchtet worden. Diese Stämme haben ihre Fähigkeit, Krankheitssymptome hervorzurufen, verloren, ihre Vermehrungsfähigkeit jedoch beibehalten und können, wenn sie in einem Vaccin verwendet werden, den Wirt vor nachfolgender Infektion durch virulente Stämme desselben Virus schützen. Die Infektionsfähigkeit des Virus ist für diese Wirkungen wesentlich und daher auch für die Wirksamkeit des Vaccins, das den lebenden, abgeschwächten Virus enthält. 



   Die Schwierigkeiten der Aufrechterhaltung der Infektionsfähigkeit eines Virus vor dessen Verwendung sind bekannt. Im allgemeinen müssen spezielle Kühlbedingungen eingehalten werden, wenn die Vaccinprodukte auch nur eine kurze Lebensdauer haben sollen. Die Kosten der Kühlhaltung erhöhen den preis der Vaccine wesentlich. Ausserdem werden aber in einem. loch viel höheren Masse die Kosten der Vaccine dadurch erhöht, dass auf Grund der kurzzeitigen Haltbarkeit bei Temperaturen oberhalb der Kühltemperaturen ein grosser Teil des Vaccins dem Hersteller unverwendet zurückgestellt wird. 



   Bekannte Verfahren zur Aufrechterhaltung der Infektionsfähigkeit von Vaccinen mit lebendem Virus, insbesondere Kuhpockenvirus, umfassen ausser der Lagerung im gefrorenen Zustand eine Lagerung in trockener Form, eine Lagerung in der Kälte in Kombination mit Glycerin und einem Zusatz von Natriumchlorid, Kaliumchlorid oder Ammoniumchlorid als konzentrierte Lösungen. Abgesehen von der Lagerung unter Kühlraumbedingungen haben diese Verfahren nur eine beschränkte Anwendbarkeit, da jene Methoden, die für Viren des DNA-Typs, wie Kuhpockenvirus (Vacciniavirus), geeignet sind, für die Viren der RNA-Type wegen der geringeren Stabilität der letzteren im Vergleich zum Kuhpockenvirus weniger in Frage kommen.

   Die Polioviren in Form von Suspensionen, wie sie für Oralvaccine verwendet werden, sind im Gegensatz zu den rohen Gewebeextrakten von infiziertem Gewebe, wie es für Blatternvaccin benutzt wird, der Zerstörung besonders ausgesetzt, insbesondere in getrockneter Form oder selbst im flüssigen Zustand, wenn sie bei Temperaturen oberhalb der Gefriertemperatur aufbewahrt werden. 



   Ein anderes Problem, das bei der Herstellung von Virusgewebekulturvaccinen auftritt, ist die unbeabsichtigte Einverleibung von Viren, die als spontane Verunreinigungen der Zellkulturen in den Virusprodukten auftreten, aus welchen das Vaccin hergestellt wird. Im Falle von lebenden poliovirusvaccinen wird das dafür erforderliche Virus üblicherweise in Affennierenkulturen gezüchtet, wobei das verunreinigende Virus mit dem Vaccinvirus eingeschleppt werden kann und so in das schliesslich erhaltene Vaccin gelangt. Auf diese Weise sind viele Partien von Vaccin mit lebendem Poliovirus, insbesondere solche, 
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 Vaccins). 



   Die vorliegende Erfindung zielt auf die Schaffung eines billigen und einfachen Verfahrens zur Erhöhung der Lagerfähigkeit von Vaccinen mit lebendem   RNA- Virus,   vorzugsweise Poliovirus, wobei die 

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Vaccine ihre volle Lebens- und Infektionsfähigkeit selbst bei Temperaturen bis zu   500C   beibehalten, und auf die Schaffung solcher lebender Virusvaccine ab, die, wenn sie auf Temperaturen oberhalb der Ge- friertemperatur gekühlt werden, wie sie für biologische Erzeugnisse allgemein üblich sind, mehrere Monate oder länger, und wochenlang verwendbar sind, wenn sie bei Zimmertemperatur aufbewahrt werden. 



  Die Erfindung sieht auch Mittel zur Entfernung von Fremdviren vor, die in Kulturen für die Vaccinerzeugung enthalten sind, wobei das gewünschte Virus zur Verwendung in dem Vaccin stabilisiert wird. 



   Es wurde die überraschende Feststellung gemacht, dass pharmakologisch   verträgliche   zweiwertige Metallkationen, wie solche des Magnesiums, Kalziums, Zinks, Kobalts oder Mangans, in hohen Konzentrationen die Zerstörung der Typen 1, 2 und 3 der abgeschwächten und virulenten Poliostämme bei Temperaturen von   OOC   bis mehr als   500C   verzögern, wobei keine Änderung der d- und t- (rct/400C) - Kennwerte oder der niedrigen Affenneurovirulenzeigenschaften, welche die abgeschwächten Stämme kennzeichnen, eintritt.

   Ferner haben diese zweiwertigen Metallkationen, durch die der besonders empfindliche RNA-Poliovirus stabilisiert wird, keine stabilisierende Wirkung auf die Fremdviren, die als Verunreinigungen in den aus Affennierenkulturen erhaltenen Virussuspensionen enthalten sind, so dass sie eine Inaktivierung der letzteren ermöglichen. Überraschenderweise wurde auch gefunden, dass die Stabilisierung des RNA-Virus, die durchzweiwertige Kationen bewirkt wird, von der Art des Anions des zugesetzten Salzes unabhängig ist. 



   Demgemäss besteht das Verfahren gemäss der vorliegenden Erfindung darin, dass konzentrierte Lösungen, die   pharmakologisch verträgliche zweiwertige   Metallkationen, vorzugsweise Magnesium in Form von Magnesiumchlorid, enthalten, zu Suspensionen des gewünschten lebenden Virus zugesetzt werden, bis die Endkonzentration wenigstens 0, 4-molar ist und vorzugsweise der Konzentration einer etwa   0, 5-molaren   Lösung bis der   Sättigungskonzentration   der Lösung entspricht.

   Die entstehende Virussuspension kann als Oralvaccin in dieser Form verwendet werden, wobei gegebenenfalls auch andere Zusätze, Schutzstoffe, Streckmittel   od. dgl.   beigegeben werden können, oder sie kann zwecks Inaktivierung vorhandener Fremdviren 1 oder 2 h auf   500C   erhitzt werden und dann ohne oder gegebenenfalls mit den erwähnten Zusätzen benützt werden. 



   Einer   andernAusführungsfbrmder   vorliegenden Erfindung liegt die überraschende Erkenntnis zugrunde, dass pharmakologisch verträgliche dreiwertige Kationen,   z. B.   dreiwertiges Aluminium, auch die Typen 1, 2 und 3 des abgeschwächten Poliovirus gegen thermische Inaktivierung ohne Änderung der Lebensfähigkeit und Infektionsfähigkeit derselben schützen. Dreiwertiges Aluminium wird vorzugsweise in Form von Alu- 
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 wendet. 



   Bei dieser Ausführungsform der Erfindung, z.   B.   bei Anwendung von Aluminiumchlorid als Zusatz zu einem oralen poliovaccinstamm in der Weise, dass das dreiwertige Aluminiumkation in Konzentrationen zwischen 0, 0001 Mol und 0, 1 Mol vorliegt, kann die Suspension 1 h auf 480C erhitzt werden, ohne dass eine Verringerung der Infektionsfähigkeit eintritt. Bei diesen Konzentrationen verstärkt das dreiwertige Salz die thermische Zerstörung jener Viren, die manchmal als Verunreinigungen der Gewebekulturzellen, in welchen der Poliovirusvaccinstamm gezüchtet wird, vorhanden sind. Die vorliegende Erfindung ermöglicht somit auch die bequeme Zerstörung von unerwünschten Virusverunreinigungen in der Poliovirussuspension. 



   Wenn beispielsweise Aluminiumchlorid zu abgeschwächten, mit vakuolenbildendem   SV-Virus   ver-   unreinigten Affennierenkulturen hergestellten Poliovirussuspensionen   zur Einstellung der oben angegebenen Konzentrationen zugesetzt und die entstehende Suspension 1 h auf   480C   erhitzt wird, wird das   vakuolen-   bildende   SV-Virus   zerstört und das gewünschte Poliovirus bleibt intakt und voll infektionsfähig. 



   Gemäss einer andern Ausführungsform der Erfindung wurde gefunden, dass Mischungen der pharmakologisch verträglichen zweiwertigen Metallkationen und dreiwertigen Metallkationen bei Zugabe zu Suspensionen des lebenden Virus in solchen Mengen, die zur Einstellung der oben angegebenen Konzentrationen ausreichend sind, Poliovirussuspensionen stabilisieren, die keine lebenden Nichtpolioviren enthalten. Zur Entfernung der infektiösen Fremdviren kann die Suspension, die die Mischungen des zwei-und 
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 det werden. 



     Bei s piel l : Magnesiumchlorid (MgC1. 6 HO)   wird in destilliertem Wasser bis zur Bildung einer 2-molaren Lösung aufgelöst. Die Lösung wird dann durch Autoklavieren während 15 min bei einem Druck von   0, 154 kg/cmz (151bs)   sterilisiert. Nach Abkühlen der Lösung wird 1   Vol. -Teil   eines Vaccins eines abgeschwächten Poliovirusstammes des Typs 1 mit einer gleichen Volumsmenge der 2-molaren Lösung 

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 einer Vaccinsuspension eines lebenden Poliovirus des Typs 2 gegeben sowie ferner auch zu einem lebenden   Poliovirusvaccin   des Typs 3 und zu einer Mischung der   Poliovirusvaccine   der Typen I, 2 und 3.

   Dabei entstehen stabilisierte Virussuspensionen, die als Vaccine verwendbar sind und Aluminiumchlorid in   0,1-molarer   Konzentration enthalten. 



   Beispiel 14 : Die stabilisierten Virussuspensionen und die Vaccine des Beispieles 13 werden, wie in Beispiel 12 angegeben, behandelt, wobei eine Inaktivierung des infektiösen, vakuolenbildenden Virus, das als Verunreinigung vorliegt, erfolgt. 



     Be is piel 15 : Zu Vaccinen   des lebenden Poliovirus, wie sie in den Beispielen 11-14 beschrieben   sind. wird Aluminiumchlorid ill   einer 0,0002-molaren Konzentration und auch in einer   0, 2-molaren   Konzentration gegeben. Die entstehenden stabilisierten Virussuspensionen sind als Vaccine verwendbar und enthalten Aluminiumchlorid in   0, 0001- und 0, 1-molarer Konzentration ; wenn diese Suspensionen,   wie 
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      04-molarBeispiel 16 : Gemäss   diesem Beispiel wild Aluminiumsulfat an Stelle des Aluminiumehlorids der Beispiele   11 - 15   in den oben angegebenen Konzentrationen benützt. Es entstehen stabilisierte Virussuspensionen, die als Vaccine in den oben angegebenen Konzentrationen verwendbar sind ; wenn sie, wie vorstehend beschrieben, erhitzt werden, wird das infektiöse, vakuolenbildende Virus inaktiviert. 



     Beispiel 17 :   Eine Mischung von zwei-und dreiwertigen Kationen gemäss den vorstehenden Beispielen in den angegebenen Konzentrationen wird in gleichen Anteilen zu Vaccinen aus lebendem Poliovirus gegeben ; dabei erhält man stabilisierte Virussuspensionen, die als Vaccine mit Aluminiumkonzentrationen von   0, 0001- bis 0, 1-molar   und mit Magnesium, Kalzium, Zink, Mangan und Kobalt Konzentrationen zwischen 0, 4-molar und der Sättigung verwendbar sind. Das infektiöse, vakuolenbildende Virus wird ferner inaktiviert, wenn die Mischungen aus Virus und Salzen bei Temperaturen von   500C   oder niedriger,   z. B.   bei   25 C,   1 h stehengelassen werden. 



   Somit können auch dreiwertige Kationen verwendet werden, u. zw. entweder für sich oder in Kombination mit zweiwertigen Kationen, um stabilisierte Vaccine zu schaffen, die von unerwünschten verunreinigenden Viren frei sind. 



   Im vorstehenden ist vor allem die Stabilisierung von Polioviren und daraus hergestellten Vaccinen beschrieben ; es können aber auch andere RNA-Viren unter den angegebenen Bedingungen stabilisiert werden, beispielsweise Coxsackie-Viren, ECHO-Viren und Reo-Viren. 



    PATENTANSPRÜCHE :    
1. Verfahren zur Herstellung eines stabilen, lebendes Virus enthaltenden Vaccins, dadurch gekennzeichnet, dass man zu einer Suspension eines lebenden RNA-Virus ein lösliches, pharmakologisch verträgliches Salz mit einem zweiwertigen Metallkation bis zu einer Endkonzentration von wenigstens 0, 4-molar und bzw. oder ein lösliches, pharmakologisch verträgliches Salz mit einem dreiwertigen Metallkation bis zu einer Endkonzentration von etwa 0, 0001-molar bis etwa 0, 1-molar zusetzt.

Claims (1)

1. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als lebende RNA-Virussuspension eine Poliovirussuspension verwendet.

   3. Verfahren nachAnspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man das entstehende Virusvaccin auf eine nicht über 500C liegende Temperatur so lange erhitzt, bis die Fremdviren inaktiviert werden und dass man dann das Erhitzen unterbricht.

   4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als Salz mit einem zweiwertigen Metallkation ein solches der Metalle Magnesium, Kalzium, Zink, Kobalt oder Mangan verwendet.

   5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man das zweiwertige Metallkation in einer Endkonzentration zwischen 0, 5-molar und der Sättigungskonzentration anwendet.

   . 6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als Salz mit einem pharmakologisch verträglichen dreiwertigen Kation Aluminiumchlorid oder Aluminiumsulfat verwendet. <Desc/Clms Page number 5>

   7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass man ein pharmakologisch verträgliches dreiwertiges Kation anwendet und das entstehende Virusvaccin auf eine nicht über 480C liegende Temperatur genügend lange erhitzt, um die Fremdviren zu inaktivieren und dass man dann das Erhitzen unterbricht.