DE68909542T2 - Viruskonservierung. - Google Patents

Viruskonservierung.

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Description

  • Diese Erfindung bezieht sich auf die Erhaltung lebendiger Viren, und insbesondere auf das Trocknen lebendiger Viren in stabiler Form, aus der diese wiederhergestellt werden können, wobei sie ihre immunogene oder eine andere nützliche Wirkung wiedergewinnen.
  • Lebendige Viren haben eine Vielzahl wichtiger Verwendungen. Die bedeutendste ist die Verwendung von Viren, entweder intakt oder mit verminderter Virulenz, als immunogene Impfstoffe. Zwei gute Beispiele sind der Polio-Virus und Masern-Virus. Jedoch sind lebendige Virus-Impfstoffe äusserst schwierig unter Lagerbedingungen zu erhalten. Sie können gegenwärtig nicht getrocknet und wiederhergestellt werden, ohne ihre immunogene Wirkung zu verlieren. In ähnlicher Weise können sie aus dem gleichen Grund nicht eingefroren werden. Folglich ist es erforderlich, dass Virus-Impfstoffe in wässrigen Medien unter kalten sterilen Bedingungen, beispielsweise in Kühlschränken, aufbewahrt werden. Eine der zuvor genannten Krankheiten, Masern, ist von grosser epidemiologischer Wirkung, besonders in der dritten Welt. Jedes Jahr starben allein in Afrika Millionen von Kindern an Masern. Der Grund hierfür besteht hauptsächlich darin, dass die für die Vorbeugung erforderlichen Impfstoffe in der Mehrzahl der betroffenen Länder, die nicht die Infrastruktur oder den Wohlstand haben, um Kühlung zur Verfügung zu stellen, nicht verteilt werden können.
  • Somit besteht ein verzweifeltes weltweites Verlangen nach einem einfachen Mittel zum Konservieren von Viren in intakter immunogener Form, welches ohne Kühlung oder eine andere mühsame Kontrolle aufbewahrt werden kann, und welches einfach mit Wasser gerade vor Gebrauch wiederhergestellt werden kann.
  • Andere Viren haben beträchtliche Bedeutung in anderen Bereichen. Beispielsweise ist der Epstein Barr-Virus (EBV) von beträchtlicher Bedeutung bei der Herstellung von Human B-Zellinien für die Erzeugung monoklonaler Antikörper und für Untersuchungen in bezug auf Human-Molekulargenetik. EBV wird gegenwärtig in wässrigen Medien unter Kühlung gelagert.
  • Auf gleiche Weise sind Bakteriophagen, wie beispielsweise der von E. coli abstammende Phage Lambda, im Hinblick auf die Manipulation von DNA und die Herstellung von Genbibliotheken beim sogenannten Genetik Engineering von Bedeutung. Dieser Virus muss wiederum unter wässrigen Bedingungen unter Kühlung aufbewahrt werden.
  • Während es allgemein bekannt ist, dass das Trocknen unstabiler biologischer Produkte entweder bei Raumtemperatur oder in gefrorenem Zustand (Lyophilisierung) durch Hinzufügen von Stabilisierungsmitteln zu dem fraglichen Produkt unterstützt werden kann, gibt es unseres nach Wissens keinen Bericht über die erfolgreiche Stabilisierung lebendiger Viren.
  • Beispielsweise beschreibt die GB-Patentanmeldung 2009198A die Stabilisierung von Meningokokken betreffenden Polysacchariden unter Lyophilisierung, indem diese mit verschiedenen Zuckern, einschliesslich Sucrose, Raffinose, Glucose und Trehalose kombiniert werden. In diesem Fall ist natürlich die Antigen-Komponente kein lebender Virus. Auf ähnliche Weise beschreibt die GB-Patentanmeldung 2126588A die Stabilisierung des Tumor Necrosis-Faktors in Anwesenheit bestimmter Zucker und Zuckersäuren.
  • In der EP-Anmeldung 140489A1 wird Rötelvirus-Antigen durch Eintauchen in bestimmte Zucker stabilisiert. Jedoch wird nicht die Möglichkeit der Stabilisierung des Virus selbst erwähnt.
  • Unsere eigene frühere britische Patentanmeldung 2187191lA (W087/00196) beschreibt und beansprucht die Erhaltung verschiedener Proteine und anderer Macromoleküle in bezug auf Trocknen bei Raumtemperatur durch Trocknen in Anwesenheit von Trehalose. Tote Virus-Impfstoffe sind erwähnt, aber es gibt keine Angabe darüber, dass die immunogene Funktion oder andere Funktionen von lebendigen Viren auf diese Weise erhalten werden können.
  • Wir haben jetzt festgestellt, dass die Anwesenheit von Trehalose in dem viralen Medium während des Trocknens in entweder gefrorenem Zustand oder bei Raumtemperatur es ermöglicht, dass lebende Viren vor dem Verderben geschützt und anschliessend wiederhergestellt werden können, wobei sie im wesentlichen ihre gesamten immunogenen Wirkungen oder andere geeignete Eigenschaften, einschliesslich der Entwicklungsfähigkeit beibehalten. Somit wird zum ersten Mal die Möglichkeit zur Verfügung gestellt, stabile trockene Formulierungen von Impfstoffen, wie beispielsweise Polio- und Influenza- Viren, zu haben.
  • Gemäss der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Konservieren lebendiger Viren zur Verfügung gestellt, wobei das Verfahren umfasst: Trocknen eines wässrigen, den Virus enthaltenden Systems, entweder in gefrorenem Zustand oder bei Raumtemperatur in Anwesenheit von Trehalose.
  • Im allgemeinen ist es umso besser, je mehr Trehalose hinzugefügt wird, obwohl in der Praxis vorteilhafte Wirkungen erhalten werden können, wenn das wässrige System 1 bis 20 Gew.% Trehalose, üblicherweise 5 bis 10 Gew.%, enthält. Natürlich hängt die hinzugefügte Menge von Trehalose teilweise von der Menge des in dem System vorhandenen Virus ab, aber das genaue Verhältnis von Trehalose zum Virus ist nicht besonders kritisch.
  • Wenn das Virussystem anschliessend erfolgreich unter Verwendung von Standardtechniken lyophilisiert werden kann, um ein trockenes Material, welches bei Raumtemperatur gelagert werden kann, für die anschliessende Wiederherstellung mit Wasser zur Verfügung zu stellen, ist es tatsächlich möglich, das wässrige System bei Raumtemperaturen ohne Verlust der immunogenen Aktivität oder anderer Aktivitäten zu trocknen. Somit wurde beispielsweise eine wässrige Präparation, die den Bakteriophagen Lambda GT10 und 10 Gew.% Trehalose enthält, bei Raumtemperatur (etwa 20ºC) getrocknet und anschliessend unter Hinzufügen einer wässrigen E. coli-Suspension in einem wässrigen Medium wiederhergestellt.
  • Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung weiterhin.
    • BEISPIEL 1 Prüfung der Trehalosewirkung auf die Konservierung von Epstein Barr- Virus bei Raumtemperatur in trockenem Zustand: Materialien und Verfahren;: (1) Virusherstellung:
  • Die B95.8 Erzeuger-Zellinie (The Epstein Barr Virus, Herausgeber: Epstein and Achong, Springer Verlag, Berlin 1979) wurde zu einer Menge in DMEM/10 % FCS wachsen gelassen, 30 ng/ml 12-O-Tetradeconyl-phorbol-13-acetat (TPA) wurden hinzugefügt und die Kultur wurde 10 Tage bei 33ºC aufbewahrt. Der Überstand wurde gesammelt, durch ein 0,45 um-Filter gereinigt und mittels Ultrafiltration (300 Kdalton Abschnitts-Nennwert) um das 40-fache in bezug auf die Ursprungskultur konzentriert.
    • (2) Trocknen und Lagerung:
  • Zu Aliquoten des konzentrierten Virus wurden gleiche Volumina an Konservierungsmitteln (2 %, 20 % oder 40 % Trehalose (Sigma) in Wasser) hinzugefügt, und die Hälfte jeder Lösung wurde bei 4ºC gelagert. Die andere Hälfte wurde in einer Glasampulle gefriergetrocknet und bei Raumtemperatur gelagert. Nach 1 Woche wurde das gefriergetrocknete Material mit sterilem Wasser wiederhergestellt, und es wurden Verdünnungen aus jeder Probe unter Verwendung von DMDM/10 % FCS hergestellt, wobei eine Endvirus-Verdünnung (relativ zum Ursprungs-Kulturüberstand) von 1:3 erhalten wurde.
    • (3) ³H Thymidin-Einführungsvermehrungs-Assay:
  • Zu jeder Endvirus-Verdünnung wurden Human-Mandel B-Zellen zu 10&sup6;/ml hinzugefügt und 90 Minuten unter leichtem Rühren inkubiert, wodurch Virusinfektion bewirkt wurde. Die Zellen wurden anschliessend mittels Zentrifugation gesammelt, bei 5x10&sup5;/ml resuspendiert und 0,2 ml Aliquots (10&sup5; Zellen) wurden pro Vertiefung einer flachen Gewebekulturschale mit 96 Vertiefungen plattiert, wobei drei Vertiefungen für jeden Zustand plattiert wurden. Nach 5-tägiger Inkubation bei 37ºC wurde 1 uCi ³H Thymidin pro Vertiefung hinzugefügt und nach 6-stündiger Inkubation wurden die Vertiefungen geerntet und das eingebracht ³H Thymidin mit einem Beta-Zähler gezählt. Ergebnisse: Probe EBV bei 4ºC EBV gefriergetrocknet EBV + Trehalose
  • Zusätzlich zeigte Elektronenmikroskopie negativ gefärbter Präparationen, dass in Anwesenheit von 10 %-iger Trehalose die Ultrastruktur des getrockneten EBV bewahrt wurde, wohingegen in Abwesenheit von Trehalose die Ultrastruktur vollständig zerstört ist.
    • BEISPIEL 2 E. coli-Bacteriophage (Lambda) GT10: Hintergrund:
  • Der Bacteriophage Lambda eignet sich dazu, E. coli zu infizieren und entweder in den lytischen oder lysogenen Weg einzutreten. Bei dem lytischen Weg repliziert der Phage in dem Wirt und lysiert eventuell den Wirt, wobei der gesamte Phage freigegeben wird. Bei dem lysogenen Weg tritt die Phagen- DNA anstelle des Replizierens und Lysierens der Bakterienwirte in das Wirtsgenom ein und repliziert damit. Das für die Kontrolle des Eintritts in den lysogenen oder lytischen Weg verantwortliche Gen ist das Phagenrepressorgen (C1) . Der Phage λ, der eine Insertion trägt wird auf Agar-Platten ausgesät, der Bakterienrasen enthält klare Bereiche (Plaques), die die Stellen der Bakterienzellenlyse aufgrund der Phagenreplikation und Vermehrung darstellen.
    • EXPERIMENT 1
  • Ein einzelner Plaque wurde von einer Agar-Platte entfernt und in 1 ml SM-Puffer (5,8 g NaCl, 2 g MgSO&sub4; 7H&sub2;O, 5 ml 1 M Tris-HCl, pH 7,5 und 5 ml 2 %-ige Gelatine, aufgefüllt auf 1 l) bei 4ºC gelagert.
  • Eine 1:1000-Verdünnung wurde von diesem Vorratsstamm in SM-Puffer hergestellt. Aliquote Teile von entweder 1 ul oder 10 ul wurden herausgenommen und in Polypropylen-Eppendorf-Röhren mit einem gleichen Volumen von 20 %-iger Trehalose in destilliertem Wasser gefüllt. Die Proben wurden bei Raumtemperatur getrocknet. Die kleineren Volumina wurden in einer laminaren Strömungshaube über Nacht getrocknet, und die grösseren Volumina wurden in einen Exsikator, der mit einer Luftevakuierungsleitung verbunden war, getrocknet. Die Proben wurden 24 bis 48 Stunden in trockenem Zustand belassen. Für den Plaque-Assay wurden 100 ul einer E. coli-Suspension (etwa 8x10&sup7; des Stammes NM 514) in 10 mM MgSO&sub4; zu jeder getrockneten Phagenprobe hinzugefügt und 30 Minuten bei 37ºC inkubiert. Nach der Inkubation wurden 10 ml λ-Oberagar (1 % Bactotrypton, 0,5 % Bacto-Hefeextrakt, 0,5 % NaCl, 0,25 % MgSO&sub4; und 1 % Bacto-Agar) bei 42ºC zu jeder Probe, die auf den zuvor hergestellten L-Agarplatten ausplattiert war, hinzugegeben. Man liess diese abkühlen, drehte sie um und inkubierte etwa 16 Stunden bei 37ºC, wonach die Anzahl der Plaques gezählt wurde. Ergebnisse: Phagenbehandlung Verdünnung der Stammkultur Anzahl der Plaques/Platte Lagerung bei 4ºC in SM Puffer getrocknet in SM-Puffer getrocknet in 10 %-iger Trehalose Verdünnung (40 %-ige Plaque-Wirksamkeit der Kontrolle)
    • EXPERIMENT 2 Langzeitlagerung:
  • Das vorherige Experiment ergab Details, wie der Bacteriophage Lambda, der eine Insertion trägt in Trehalose getrocknet werden kann, wobei die Funktion im Hinblick auf die erneute Hydratisierung erhalten bleibt. Die Bacteriophagen in diesen Experimenten wurden 24 bis 48 Stunden nach dem Trocknen wieder hydratisiert, und es wurde gezeigt, dass sie sich dazu eignen, auf einem E. coli-Wirtsbakterium zu adsorbieren und anschliessend einzudringen und dann zu replizieren, zu reifen und letztendlich den Wirt unter Freigabe vieler neuer Bacteriophagen zu lysieren.
  • Das nachfolgende Experiment testet die Fähigkeit der Trehalose, den Bacteriophagen Lambda zu konservieren, so dass er wiederum hydratisiert werden kann und noch längere Perioden unter ungünstigen Bedingungen wirken kann. Ein 10 %-iger, alles umfassender aliquoter Teil wurde von der Bacteriophagen-Stammkultur Lambda genommen und mit einem gleichen Volumen von 20 %-iger Glucose oder SM-Puffer oder 20 %-iger Trehalose oder Luria-Brühe in eine Eppendorf-Röhre gefüllt. Die verwendete Stammkultur des Bacteriophagen Lambda wurde hergestellt, indem ein einzelner Plaque von einer Agar- Plattenkultur in 1 ml SM-Puffer gebracht wurde. Die Proben wurden in einem Exsikator, der mit einer Evakuierungs-Luftleitung verbunden war, mindestens 16 Stunden getrocknet, und anschliessend wurden die Verschlüsse auf die Eppendorf-Röhren aufgeschraubt. Bis zur erneuten Hydratisierung wurden die Eppendorf-Röhren, die die Proben enthielten, unter einer Vielzahl von Bedingungen aufbewahrt. Sie wurden auf eine Bank bei üblicher Raumtemperatur, die in Abhängigkeit von der Tageszeit und den Jahreszeiten variierte, gestellt. Sie wurden im Dunklen oder in direktem Sonnenlicht aufbewahrt. Sie wurden bei 4ºC aufbewahrt. Nach 10 Monaten wurden sie erneut in einer 100 ul-Suspension von E. coli (etwa 8x10&sup7;) in 10 mM MgSO&sub4; hydratisiert und im Anschluss an gründliches Mischen bei 37ºC etwa 30 Minuten inkubiert. Nach der Inkubation wurden 4 ml Lambda-Oberagar bei 42ºC zu jeder Probe gegeben und auf zuvor hergestellten L-Agarplatten ausplattiert. Man liess diese abkühlen und inkubierte anschliessend etwa 16 Stunden bei 37ºC. Die Anzahl der Plaques wurde gezählt. Phage getrocknet in folgenden Anzahl der Plaques/Platte Glucose 5M Puffer Luria-Brühe Trehalose Null
  • Dieses ergibt einen Wert von 12x10&sup6; plaquebildenden Einheiten pro ml Stammkultur. Dieser wurde mit 47x10&sup6; plaquebildende Einheiten, die in dem Assay erhalten worden waren, der 10 Monate zuvor mit der gleichen Stammkultur durchgeführt worden war, und mit 19x10&sup6; plaquebildenden Einheiten in den Proben, die sofort nach der Trocknung in Trehalose-Puffer wiederum hydratisiert worden waren, verglichen.
    • BEISPIEL 3 Polio-Virus Typ 3:
  • 50 ml Virus-Stammkultur und 50 ul 20 %-ige Trehalose wurden bei 37ºC getrocknet und bei dieser Temperatur entweder 24 Stunden oder 7 Tage vor der erneuten Hydratisierung gelagert und im Vergleich zum ohne Trehalose getrockneten Virus und ungetrockneten Virus geprüft. Die Zahlen zeigen den Abfall in bezug auf zytopathischen Titer, bezogen auf Logarithmen (Basis 10) 24 Stunden 7 Tage mit Trehalose ohne Trehalose ungetrocknet
  • das heisst, Trehalose zeigt eine bemerkenswerte Schutzwirkung besonders bei Lagerung bei 37ºC.
    • BEISPIEL 4 Influenza-Virusstamm X79 (A/Phil/2/82 x PR/(8H3N2) ER340:
  • 50 ul Virus und 50 ul 20 %-ige Trehalose wurden bei Raumtemperatur getrocknet und 48 Stunden bei dieser Temperatur gelagert, anschliessend mit Dulbecco's MEM-Gewebekulturmedium wiederhergestellt, 10 ul-Proben wurden auf MDCK-Zellen (FB24) übertragen und 48 Stunden inkubiert. Der Hämagglutinierungstiter wurde anschliessend überprüft. Titer mit Trehalose ohne Trehalose ungetrocknet
  • d.h. Trehalose schützt vollständig bei dieser Temperatur. Andere Trocknungs- und Lagerungssysteme sowohl mit Polio wie auch mit Influenza zeigten sehr viel weniger oder gar keine Schutzwirkung.
    • BEISPIEL 5 Immunogene Wirksamkeit von mit Trehalose getrocknetem Nerz-Enteritis- Virus:
  • Die Experimente wurden von der United Vaccines Division of Harlan Sprague Dawley Inc., Madison Wisconsin 53711, USA, durchgeführt.
  • United Vaccines BIOCOMP-DP (Handelsname) ist eine Impfstoffkombination aus Nerz-Staupe-Enteritis-Virusimpfstoffen und Clostridium-botulinum-Typ C mit Pseudomonas aeruginosa als Bakterienimpfstoff-Toxoide. Die einzig relevanten Aussagen für dieses Patent sind, dass inaktivierter Nerz-Enteritis- Virus (MEV) die Fähigkeit besitzt, Nerz gegen den Angriff mit lebendigem virulenten Enteritis-Virus zu immunisieren. Diese Komponente des kombinierten Impfstoffs wird als Flüssigsuspension von Virionen, wobei die anderen Komponenten des Impfstoffs in lyophilisierter Form unverzüglich vor der Injektion wieder suspendiert werden, verkauft.
  • Der flüssige MEV wurde mit und ohne 10 %-iger hinzugefügter Trehalose lyophilisiert und nach United Vaccines in Madison Wisc. verschifft, die die Präparationen mit normaler physiologischer Kochsalzlösung in Mischung mit den getrockneten Komponenten wiederherstellten und die Impfstoffe im Hinblick auf deren Wirkung, immunisierten Nerz gegen den tödlichen Angriff mit lebendigem Enteritis-Virus zu schützen, untersuchten. lebendig/angegriffen mit Trehalose ohne Trehalose
  • d.h., die immunogene Wirkung dieses sehr trocknungsempfindlichen Virus wird durch Trehalose erhalten.

Claims (3)

1. Verfahren zum Konservieren lebender Viren, dadurch gekennzeichnet, dass man ein den Virus enthaltendes, wässriges System in Gegenwart von Trehalose in gefrorenem Zustand oder bei Raumtemperatur trocknet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet dass das wässrige System 1 bis 20 Gew.% Trehalose enthält.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das wässrige System 5 bis 20 Gew.% Trehalose enthält.
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