WO2023047810A1 - 免疫関連細胞の一次繊毛の抑制剤およびその利用 - Google Patents

免疫関連細胞の一次繊毛の抑制剤およびその利用 Download PDF

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WO2023047810A1
WO2023047810A1 PCT/JP2022/029762 JP2022029762W WO2023047810A1 WO 2023047810 A1 WO2023047810 A1 WO 2023047810A1 JP 2022029762 W JP2022029762 W JP 2022029762W WO 2023047810 A1 WO2023047810 A1 WO 2023047810A1
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mass
immune
primary cilia
cells
related cells
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PCT/JP2022/029762
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English (en)
French (fr)
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香織 齋藤
郁尚 藤田
文裕 岡田
真奈美 鳥山
寛子 玉置
デフリ リザルディ
Original Assignee
株式会社マンダム
国立大学法人大阪大学
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    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
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    • A61K31/352—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings, e.g. methantheline 
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K31/357—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having two or more oxygen atoms in the same ring, e.g. crown ethers, guanadrel
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    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the present invention relates to an inhibitor of primary cilia of immune-related cells and its use.
  • Inflammation is one of biological reactions caused by chemical and/or physical stimuli. Since inflammation can damage living tissue, anti-inflammatory agents are sometimes applied to inflammation.
  • the present inventors have so far found that immune-related cells have organelles called primary cilia, and that the expression of primary cilia is enhanced in skin diseases accompanied by inflammation (for example, see Patent Documents 1 to 3). This indicates that inhibitors of primary cilia of immune-related cells can be used as anti-inflammatory agents.
  • An object of one aspect of the present invention is to provide an inhibitor of primary cilia of immune-related cells and a technique for using the same.
  • the present inventors found that (i) silymarin, silybin and dehydrosilybin, which are components of the extract of Silybum marianum, and (ii) graviola (Annona muricata)
  • the inventors have found that annonacin and quercetin, which are components of the extract of A., have the effect of suppressing the expression of primary cilia of immune-related cells, and completed the present invention. That is, the present invention includes the following configurations.
  • An inhibitor of primary cilia of immune-related cells containing at least one selected from the group consisting of A to E below: A: silymarin, B: silybin, C: dehydrosilybin, D: Annonacine, E: Quercetin.
  • an inhibitor of primary cilia of immune-related cells it is possible to provide an inhibitor of primary cilia of immune-related cells and a technique for using the same.
  • 101 is a graph showing the inhibitory effect of silymarin on primary cilia in immune-related cells
  • 102 is a graph showing the inhibitory effect of silybin on primary cilia in immune-related cells
  • 201 and 202 are graphs showing the inhibitory effects of 2,3-dehydrosilybin A and 2,3-dehydrosilybin B on primary cilia in immune-related cells, respectively.
  • 301, 302 and 303 are graphs showing the inhibitory effects of primary cilia on immune-related cells of cosmetic raw materials containing materials derived from Silybum marianum, respectively.
  • 401 and 402 are graphs showing the inhibitory effects of annonacine and quercetin hydrate on primary cilia in immune-related cells, respectively.
  • An inhibitor of primary cilia of immune-related cells contains at least one selected from the group consisting of A to E below: A: silymarin, B: silybin, C : dehydrosilybin, D: annonacine, E: quercetin.
  • the above-mentioned immune-related cells include immune cells that are mainly responsible for immune reactions and immune function-bearing cells that are indirectly involved in immune cells.
  • Immune function-possessing cells have, for example, the function of activating immune cells.
  • immune cells include skin dendritic cells (e.g., Langerhans cells, dermal dendritic cells), lymphoid immune cells (e.g., T cells, NK cells, B cells), and monocytic immune cells. (eg, conventional dendritic cells, monocytic dendritic cells (eg, plasmacytoid dendritic cells)).
  • immune function-bearing cells include, for example, keratinocytes, fibroblasts, and epithelial cells.
  • the immune-related cells may be immune-related cells collected from a living body or established immune-related cells (eg, HaCaT cells).
  • Silymarin (CAS No. 65666-07-1) is a mixture of flavonolignans obtained from Silybum marianum. Silymarin contains silybin and dehydrosilybin among the B to E compounds described above.
  • silymarin it is possible to use commercially available silymarin, or it is possible to use silymarin obtained from an extract of Silybum marianum.
  • the method for obtaining silymarin from the milk thistle extract is not limited.
  • milk thistle seeds are first extracted with an organic solvent (eg, ethanol, methanol, acetone, or ethyl acetate) to obtain an extract.
  • silymarin can be obtained by removing lipids and highly polar impurities from the extracted extract and then drying the extracted extract by a spray drying method or the like.
  • the inhibitor of primary cilia of immune-related cells is a material derived from Silybum marianum (eg, seeds, leaves, stems, buds, flowers of Silybum marianum, or , roots), or pulverized) to inhibit primary cilia of immune-related cells.
  • Silybum marianum eg, seeds, leaves, stems, buds, flowers of Silybum marianum, or , roots
  • Silybin (CAS No.22888-70-6) is one of the compounds contained in the above-mentioned silymarin.
  • silybin it is possible to use commercially available silybin, or it is possible to use silybin obtained from an extract of Silybum marianum.
  • the method for obtaining silybin from the milk thistle extract is not limited.
  • milk thistle seeds are first extracted with an organic solvent (eg, ethanol, methanol, acetone, or ethyl acetate) to obtain an extract.
  • Silybin can then be obtained by further purifying the extracted extract by a known purification method (eg, column chromatography, high performance liquid chromatography).
  • the inhibitor of primary cilia of immune-related cells is a material derived from Silybum marianum (eg, seeds, leaves, stems, buds, flowers of Silybum marianum, or , roots), or pulverized) to inhibit primary cilia of immune-related cells.
  • Dehydrosilybin e.g., 2,3-dehydrosilybin A (CAS No.25166-14-7), 2,3-dehydrosilybin B (CAS No.142796-24-5)
  • 2,3-dehydrosilybin A CAS No.25166-14-7
  • 2,3-dehydrosilybin B CAS No.142796-24-5
  • dehydrosilybin commercially available dehydrosilybin can be used, and dehydrosilybin obtained from milk thistle extract can also be used.
  • the method for obtaining dehydrosilybin from the milk thistle extract is not limited.
  • milk thistle seeds are first extracted with an organic solvent (eg, ethanol, methanol, acetone, or ethyl acetate) to obtain an extract.
  • dehydrosilybin can be obtained by further purifying the extracted extract by a known purification method (eg, column chromatography, high performance liquid chromatography).
  • the inhibitor of primary cilia of immune-related cells is a material derived from Silybum marianum (eg, seeds, leaves, stems, buds, flowers of Silybum marianum, or , roots), or pulverized) to inhibit primary cilia of immune-related cells.
  • Annonacin (CAS No. 111035-65-5) is one of the compounds obtained from graviola (Annona muricata).
  • annonacin commercially available annonacin can be used, and annonacin obtained from graviola extract can also be used.
  • the method for obtaining annonacine from the extract of graviola is not limited. For example, first, graviola seeds or leaves are extracted with an organic solvent (eg, ethanol, methanol, acetone, or ethyl acetate) to obtain an extract. Then, annonacin can be obtained by further purifying the extracted extract by a known purification method (eg, column chromatography, high performance liquid chromatography).
  • an organic solvent eg, ethanol, methanol, acetone, or ethyl acetate
  • an inhibitor of primary cilia of immune-related cells is a material derived from graviola, such as graviola (e.g., seeds, leaves, stems, buds, flowers, or roots of graviola). may be an inhibitor of primary cilia of immune-related cells containing an extract or pulverized product of .
  • graviola e.g., seeds, leaves, stems, buds, flowers, or roots of graviola.
  • Quercetin (CAS No. 117-39-5) is one of the compounds obtained from graviola (Annona muricata).
  • the quercetin may be in the form of hydrate (quercetin hydrate).
  • quercetin commercially available quercetin can be used, and quercetin obtained from graviola extract can also be used.
  • the method for obtaining quercetin from the graviola extract is not limited. For example, first, graviola seeds or leaves are extracted with an organic solvent (eg, ethanol, methanol, acetone, or ethyl acetate) to obtain an extract. Next, quercetin can be obtained by further purifying the extracted extract by a known purification method (eg, column chromatography, high performance liquid chromatography).
  • an inhibitor of primary cilia of immune-related cells is a material derived from graviola, such as graviola (e.g., seeds, leaves, stems, buds, flowers, or roots of graviola). may be an inhibitor of primary cilia of immune-related cells containing an extract or pulverized product of .
  • Active ingredients contained in the inhibitor of primary cilia of immune-related cells is not particularly limited, for example, when the inhibitor is 100% by mass, it may be 0.00001% by mass to 100% by mass, may be 0.001% by mass to 100% by mass, may be 0.01% by mass to 100% by mass, may be 0.1% by mass to 100% by mass, and may be 0.001% by mass to 100% by mass. It may be 1% by mass to 95% by mass, may be 0.1% by mass to 90% by mass, may be 0.1% by mass to 80% by mass, and may be 0.1% by mass to 70% by mass.
  • % by mass may be 0.1% by mass to 60% by mass, may be 0.1% by mass to 50% by mass, and may be 0.1% by mass to 40% by mass. may be 0.1% by mass to 30% by mass, may be 0.1% by mass to 20% by mass, or may be 0.1% by mass to 10% by mass.
  • silymarin, silybin, dehydrosilybin, annonacine, and quercetin are used at concentrations of 48 ⁇ g/mL or higher, 100 ⁇ M or higher, 10 ⁇ M or higher, 0.5 ⁇ M or higher, and 10 ⁇ M or higher, respectively.
  • concentrations 48 ⁇ g/mL or higher, 100 ⁇ M or higher, 10 ⁇ M or higher, 0.5 ⁇ M or higher, and 10 ⁇ M or higher, respectively.
  • the expression of primary cilia in those cells can be better suppressed.
  • the inhibitor of primary cilia of immune-related cells is 30 ⁇ g/mL or more, 48 ⁇ g/mL or more when the inhibitor is administered to a subject. , 75 ⁇ g/mL or higher, 1 mg/mL or higher, or 5 mg/mL or higher concentration (the upper limit of the concentration is not limited, for example, 100 mg/mL or 10 mg/mL) is immune-related It is preferred to contain an amount of the active ingredient that allows it to come into contact with the cells.
  • the inhibitor of primary cilia of immune-related cells according to one embodiment of the present invention contains silymarin or silybin at the above concentration. may With this configuration, the expression of primary cilia of immune-related cells can be better suppressed.
  • the inhibitor of primary cilia of immune-related cells has a 1 mM or more, or 5 mM or more concentration (the upper limit of the concentration is not limited, for example, 1 M, 100 mM, or 10 mM) active ingredient in an amount that can contact immune-related cells It is preferable to contain.
  • the inhibitor of primary cilia of immune-related cells according to one embodiment of the present invention contains silymarin or silybin at the above concentration. may With this configuration, the expression of primary cilia of immune-related cells can be better suppressed.
  • the inhibitor of primary cilia of immune-related cells has a , 50 ⁇ M or more, 100 ⁇ M or more, or 500 ⁇ M or more (the upper limit of the concentration is not limited, for example, 1 M, 100 mM, or 10 mM). It is preferable to contain the active ingredient of Of course, the inhibitor of primary cilia of immune-related cells according to one embodiment of the present invention (for example, liquid, gel, cream) may contain dehydrosilybin at the concentration. . With this configuration, the expression of primary cilia of immune-related cells can be better suppressed.
  • the inhibitor of primary cilia of immune-related cells is 0.2 ⁇ M or more, 0.5 ⁇ M or more when the inhibitor is administered to a subject. , 1 ⁇ M or more, 5 ⁇ M or more, or 10 ⁇ M or more (the upper limit of the concentration is not limited, for example, 1 M, 100 mM, or 10 mM). It is preferable to contain the active ingredient of Of course, the inhibitor of primary cilia of immune-related cells according to one embodiment of the present invention (for example, liquid, gel, cream) may contain annonasin at the above concentration. With this configuration, the expression of primary cilia of immune-related cells can be better suppressed.
  • the inhibitor of primary cilia of immune-related cells has a concentration of 8 ⁇ M or more, 10 ⁇ M or more, 50 ⁇ M or more, 100 ⁇ M or more, or 500 ⁇ M or more concentration (the upper limit of the concentration is not limited, for example, 1 M, 100 mM, or 10 mM) active ingredient in an amount that can contact immune-related cells It is preferable to contain.
  • An inhibitor of primary cilia of immune-related cells according to an embodiment of the present invention may contain quercetin at the concentration. With this configuration, the expression of primary cilia of immune-related cells can be better suppressed.
  • Dehydrosilybin and annonacine can suppress the expression of primary cilia in immune-related cells more efficiently at lower concentrations than silymarin, silybin, and quercetin. Therefore, inhibitors containing dehydrosilybin and annonacine may be more effective in suppressing the expression of primary cilia in immune-related cells than inhibitors containing silymarin, silybin and quercetin.
  • the inhibitor of primary cilia of immune-related cells may contain ingredients other than the active ingredients described above.
  • Ingredients other than the active ingredient are not particularly limited. .
  • Examples of the buffering agent include phosphoric acid or phosphate, boric acid or borate, citric acid or citrate, acetic acid or acetate, carbonic acid or carbonate, tartaric acid or tartrate, ⁇ -aminocaproic acid, trometamol is mentioned.
  • Examples of the phosphate include sodium phosphate, sodium dihydrogen phosphate, disodium hydrogen phosphate, potassium phosphate, potassium dihydrogen phosphate, and dipotassium hydrogen phosphate.
  • Examples of the borate include borax, sodium borate, and potassium borate.
  • Examples of the citrate include sodium citrate, disodium citrate, and trisodium citrate.
  • Examples of the acetate include sodium acetate and potassium acetate.
  • Examples of the carbonate include sodium carbonate and sodium hydrogen carbonate.
  • Examples of the tartrate include sodium tartrate and potassium tartrate.
  • pH adjuster examples include hydrochloric acid, phosphoric acid, citric acid, acetic acid, sodium hydroxide, and potassium hydroxide.
  • tonicity agent examples include ionic tonicity agents (e.g., sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride, magnesium chloride), nonionic tonicity agents (e.g., glycerin, propylene glycol, sorbitol, mannitol, ).
  • ionic tonicity agents e.g., sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride, magnesium chloride
  • nonionic tonicity agents e.g., glycerin, propylene glycol, sorbitol, mannitol, ).
  • antiseptic examples include benzalkonium chloride, benzalkonium bromide, benzethonium chloride, sorbic acid, potassium sorbate, methyl parahydroxybenzoate, propyl parahydroxybenzoate, and chlorobutanol.
  • antioxidants examples include ascorbic acid, tocopherol, dibutylhydroxytoluene, butylhydroxyanisole, sodium erythorbate, propyl gallate, and sodium sulfite.
  • high molecular weight polymer examples include methylcellulose, ethylcellulose, hydroxymethylcellulose, hydroxyethylcellulose, hydroxypropylcellulose, hydroxyethylmethylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, carboxymethylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose acetate succinate, and hydroxypropylmethylcellulose phthalate. , carboxymethylethylcellulose, cellulose acetate phthalate, polyvinylpyrrolidone, polyvinyl alcohol, carboxyvinyl polymer, polyethylene glycol, atelocollagen.
  • excipients examples include lactose, sucrose, D-mannitol, xylitol, sorbitol, erythritol, starch, and crystalline cellulose.
  • Examples of the solvent include water, physiological saline, and alcohol.
  • antibacterial agent examples include ⁇ -lactam, aminoglycoside, tetracycline, lincomycin, chloramphenicol, macrolide, ketolide, polypeptide, and glycopeptide antibiotics; pyridonecarboxylic acid; (quinolone)-based, new quinolone-based, oxazolidinone-based, and sulfa drug-based synthetic antibacterial agents.
  • the amount of components other than the active ingredient contained in the inhibitor of primary cilia of immune-related cells is not particularly limited. % to 99.99999% by mass, may be 0% to 99.9999% by mass, may be 0% to 99.999% by mass, and may be 0% to 99.99% by mass It may be 0% by mass to 99.9% by mass, may be 5% by mass to 99.9% by mass, and may be 10% by mass to 99.9% by mass.
  • the weight to weight to 99.9% by mass may be 20% by mass to 99.9% by mass, may be 30% by mass to 99.9% by mass, may be 40% by mass to 99.9% by mass, may be 50% by mass % to 99.9% by mass, 60% to 99.9% by mass, 70% to 99.9% by mass, 80% to 99.9% by mass % by mass, or 90% by mass to 99.9% by mass.
  • the dosage form of the inhibitor of primary cilia of immune-related cells is not particularly limited, and examples thereof include external preparations (e.g., liquid preparations, gel preparations, cream preparations, stick preparations, sheet preparations), and tablets. , powders and granules.
  • external preparations e.g., liquid preparations, gel preparations, cream preparations, stick preparations, sheet preparations
  • tablets e.g., powders and granules.
  • Subjects to which the inhibitor of primary cilia of immune-related cells according to one embodiment of the present invention is administered are not particularly limited. Examples include collected tissues, cells collected from these, and established cell lines. Examples of non-human animals include, but are not limited to, monkeys, chimpanzees, cows, pigs, sheep, goats, horses, dogs, cats, rabbits, mice, and rats.
  • the administration route of the inhibitor of primary cilia of immune-related cells is not particularly limited, and examples thereof include parenteral administration (eg, transdermal administration) and oral administration.
  • the administration interval of the inhibitor of primary cilia of immune-related cells according to one embodiment of the present invention to a subject is not particularly limited, and is, for example, once an hour, once every 1 to 6 hours, 6 to 12 hours. 12 hours to 1 day, 1 to 3 days, 1 to 5 days, 1 to 7 days, 7 to 14 days, 14 days to 21 days, once per month, once every 2 months, once every 3 months, once every 4 months, once every 5 months, once every 6 months, or once per year times.
  • An anti-inflammatory (e.g., anti-inflammatory, anti-inflammatory) topical preparation according to an embodiment of the present invention contains an inhibitor of primary cilia of immune-related cells according to an embodiment of the present invention.
  • An anti-inflammatory (e.g., prevention of inflammation, treatment of inflammation) topical preparation according to one embodiment of the present invention comprises the inhibitor of primary cilia of immune-related cells according to one embodiment of the present invention, good too.
  • Inflammation to which the topical agent is applied is not particularly limited, and includes, for example, inflammation caused by chemical and/or physical irritation, and inflammation associated with inflammatory diseases.
  • the inflammatory diseases include atopic dermatitis, psoriasis, eczema, comedones, and contact dermatitis.
  • the anti-inflammatory agent for external use can be an anti-inflammatory agent, an anti-inflammatory agent, an anti-inflammatory agent, an anti-inflammatory cosmetic, an anti-inflammatory cosmetic, or an anti-inflammatory cosmetic.
  • cosmetics include body lotions, deodorant cosmetics, lotions, milky lotions, skin care creams, tonics, stick cosmetics, lipsticks, facial cleansers, cleansers, sheet cosmetics, and shaving cosmetics. , and hair growth agents.
  • the dosage form of the external preparation is not particularly limited, and examples include liquids, gels, creams, sticks, and sheets.
  • the degree of gelation of the gel is not particularly limited as it may vary depending on the application.
  • the skin to which the external preparation can be applied is not particularly limited, and includes, for example, the head, face, neck, arm, hand, elbow, shin, back, torso, and foot.
  • the amount of the inhibitor of primary cilia of immune-related cells contained in the anti-inflammatory topical preparation according to one embodiment of the present invention is not particularly limited. It may be 0.00001% by mass to 100% by mass, may be 0.0001% by mass to 100% by mass, may be 0.001% by mass to 100% by mass, and may be 0.01% by mass ⁇ 100% by mass, may be 0.1% by mass to 100% by mass, may be 0.1% by mass to 95% by mass, and may be 0.1% by mass to 90% by mass may be 0.1% by mass to 80% by mass, may be 0.1% by mass to 70% by mass, may be 0.1% by mass to 60% by mass, It may be 0.1% by mass to 50% by mass, may be 0.1% by mass to 40% by mass, may be 0.1% by mass to 30% by mass, or may be 0.1% by mass It may be up to 20% by mass, or 0.1% by mass to 10% by mass.
  • the anti-inflammatory topical preparation according to one embodiment of the present invention may contain components other than the inhibitor of primary cilia of immune-related cells described above.
  • the "component other than the inhibitor of primary cilia of immune-related cells” is not particularly limited, and examples thereof include the above [1. inhibitor of primary cilia of immune-related cells].
  • the amount of components other than the inhibitor of primary cilia of immune-related cells contained in the anti-inflammatory topical preparation according to one embodiment of the present invention is not particularly limited, and for example, the topical preparation is 100% by mass. In the case, it may be 0% by mass to 99.99999% by mass, may be 0% by mass to 99.9999% by mass, may be 0% by mass to 99.999% by mass, and may be 0% by mass % to 99.99% by mass, 0% to 99.9% by mass, 5% to 99.9% by mass, 10% to 99.9% by mass % by mass, may be 20% by mass to 99.9% by mass, may be 30% by mass to 99.9% by mass, and may be 40% by mass to 99.9% by mass. may be 50% by mass to 99.9% by mass, may be 60% by mass to 99.9% by mass, may be 70% by mass to 99.9% by mass, may be 80% by mass % to 99.9% by mass, or 90% to 99.9% by mass.
  • the administration target, administration route, and administration interval of the anti-inflammatory topical preparation according to one embodiment of the present invention are not particularly limited, and the suppression of primary cilia of immune-related cells according to one embodiment of the present invention is described above.
  • the administration target, administration route, and administration interval of the agent may be the same.
  • One embodiment of the present invention can also be configured as follows.
  • An inhibitor of primary cilia of immune-related cells containing at least one selected from the group consisting of A to E below: A: Silymarin, B: Silybin, C: Dehydrosilybin, D: Annonacin, E : Quercetin.
  • a subject e.g., human or non-human animal (e.g., monkey, chimpanzee, A method for suppressing primary cilia of immune-related cells, comprising the step of administering to cows, pigs, sheep, goats, horses, dogs, cats, rabbits, mice, and rats: A: Silymarin, B: Silybin, C: dehydrosilybin, D: annonacine, E: quercetin.
  • Subject e.g., human or non-human animal (e.g., , monkeys, chimpanzees, cattle, pigs, sheep, goats, horses, dogs, cats, rabbits, mice, and rats). treatment method: A: silymarin, B: silybin, C: dehydrosilybin, D: annonacine, E: quercetin.
  • ⁇ 5> Use of at least one selected from the group consisting of A to E below for producing an inhibitor of primary cilia of immune-related cells: A: silymarin, B: silybin, C: dehydrosilybin, D: annonacin, E: quercetin;
  • a to E for manufacturing an anti-inflammatory external preparation A: Silymarin, B: Silybin, C: Dehydrosilybin, D: Annonacin, E : Quercetin.
  • Neonatal normal human keratinocytes (NHEK, Lonza), one of immune-related cells, were cultured in KGM-Gold medium (Lonza).
  • NHEK cells were collected after subculturing, and the NHEK cells were seeded at 1.0 ⁇ 10 5 cells/well on each well of the 8-well chamber slide, and placed under conditions of 37° C. and 5% CO 2 . and incubated overnight.
  • IL-13 (manufactured by PeproTech, model number: AF-200-13) was added to each well to a final concentration of 100 ng/mL, and then placed under conditions of 37°C and 5% CO 2 for 48 hours. cultured. This induced the expression of primary cilia in NHEK cells.
  • NHEK cells on the slide were fixed at 4° C. for 20 minutes using 4% paraformaldehyde phosphate buffer (manufactured by Fujifilm, model number: 163-20145).
  • the NHEK cells after the fixation treatment were washed with PBS (Phosohate-buffered saline) three times, the NHEK cells were treated with 10% FBS (Fetal Bovine Serum)/0.1% Triton X-100 (manufactured by Sigma, model number : T8787) at room temperature for 30 minutes for blocking.
  • PBS Phosohate-buffered saline
  • the NHEK cells after blocking treatment were allowed to react with the primary antibody overnight at 4°C.
  • the primary cilia marker protein ARL13B was stained to detect primary cilia
  • the centrosome marker protein CEP164 was stained to detect centrosomes. Information on the primary antibody used and the dilution factor when using the primary antibody are shown below.
  • the NHEK cells after reacting with the primary antibody were washed in phosphate-buffered saline (PBST) containing 0.1% Tween-20 (manufactured by Sigma, model number: P9416), and then the NHEK cells were The plate was allowed to react with the secondary antibody at room temperature for 1 hour while shielding from light.
  • PBST phosphate-buffered saline
  • Hoechst 33342 (1:1000) (manufactured by Thermo Fisher Scientific, model number: H3570) was used to stain the nuclei of the NHEK cells.
  • anti-mouse IgG donkey polyclonal antibody (1:1000) (manufactured by Thermo Fisher Scientific, model number: A-21202) and anti-rabbit IgG donkey polyclonal antibody (1:1000) (manufactured by Thermo Fisher Scientific , model number: A-21207) was used.
  • the NHEK cells enclosed between the slide and the cover glass were observed using a confocal laser scanning microscope (manufactured by OLYMPUS, trade name: FV1200 IX83 or FV3000 IX83).
  • ⁇ Test 1> Silybin (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.), 2,3-dehydrosilybin A (manufactured by Phytolab) or 2,3-dehydrosilybin B (manufactured by Phytolab) at various concentrations (0 ⁇ M, 5 ⁇ M, 10 ⁇ M, 50 ⁇ M, or 100 ⁇ M) Phytolab), or silymarin (Sigma-Aldrich) at various concentrations (0 ⁇ g/mL, 2.4 ⁇ g/mL, 4.8 ⁇ g/mL, 24 ⁇ g/mL, or 48 ⁇ g/mL), and ( ii) NHEK cells were induced to express primary cilia in KGM-Gold medium containing IL-13 (100 ng/mL).
  • NHEK cells with primary cilia were immunostained after induction of primary cilia expression, and the presence or absence of ARL13B and CEP164 staining was used as an index to determine the presence of ARL13B and CEP164 staining. Percentage of cells was calculated. 1 and 2 show the test results.
  • 101 in FIG. 1 is a graph showing the inhibitory effect of silymarin on primary cilia in immune-related cells.
  • 102 in FIG. 1 is a graph showing the inhibitory effect of silybin on primary cilia in immune-related cells.
  • silymarin was found to inhibit the expression of primary cilia in NHEK cells in a concentration-dependent manner. More specifically, silymarin was found to more effectively inhibit the expression of primary cilia in HEK cells at concentrations of 48 ⁇ g/mL and above.
  • silybin was found to inhibit the expression of primary cilia in NHEK cells in a concentration-dependent manner. More specifically, silybin was found to more effectively inhibit the expression of primary cilia in HEK cells at concentrations of 100 ⁇ M and above.
  • 201 and 202 in FIG. 2 are graphs showing the inhibitory effects of 2,3-dehydrosilybin A and 2,3-dehydrosilybin B on primary cilia in immune-related cells, respectively.
  • 2,3-dehydrosilybin A was found to inhibit the expression of primary cilia in NHEK cells in a concentration-dependent manner. More specifically, 2,3-dehydrosilybin A was found to more effectively inhibit the expression of primary cilia in HEK cells at concentrations of 10 ⁇ M or higher.
  • 2,3-dehydrosilybin B was found to inhibit the expression of primary cilia in NHEK cells in a concentration-dependent manner. More specifically, 2,3-dehydrosilybin B was found to more effectively inhibit the expression of primary cilia in HEK cells at concentrations of 10 ⁇ M or higher.
  • Holstein Ingredient name: Ameriox; Display name: lecithin, carnosine, tocopherol, milk thistle fruit extract, glycerin, ethanol, water) and SilstemU (manufactured by H-Holstein; Raw material name: Silstem-U; Display name: glycerin, water , propanediol, marian thistle extract, urticaria leaf extract) are known.
  • NHEK cells in KGM-Gold medium containing (i) cosmetic ingredients at various concentrations (0%, 0.1%, or 1%) and (ii) IL-13 (100 ng/mL). induced the expression of primary cilia.
  • NHEK cells with primary cilia were immunostained after induction of primary cilia expression, and the presence or absence of ARL13B and CEP164 staining was used as an index to determine the presence of ARL13B and CEP164 staining. Percentage of cells was calculated.
  • FIG. 3 shows the test results.
  • FIG. 3 are graphs showing the inhibitory effect of primary cilia on immune-related cells of cosmetic raw materials containing organic milk thistle extract, Ameliox, and SilstemU, respectively.
  • ⁇ Test 3> (i) annonacin (Cayman Chemical) or quercetin hydrate (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) at various concentrations (0 ⁇ M, 0.5 ⁇ M, 1 ⁇ M, 10 ⁇ M, or 100 ⁇ M), and (ii) NHEK cells were induced to express primary cilia in KGM-Gold medium containing IL-13 (100 ng/mL).
  • NHEK cells with primary cilia were immunostained after induction of primary cilia expression, and the presence or absence of ARL13B and CEP164 staining was used as an index to determine the presence of ARL13B and CEP164 staining. Percentage of cells was calculated.
  • FIG. 4 shows the test results.
  • FIG. 4 are graphs showing the inhibitory effects of annonacine and quercetin (quercetin hydrate) on primary cilia in immune-related cells, respectively.
  • annonacine was found to inhibit the expression of primary cilia in NHEK cells in a concentration-dependent manner. More specifically, annonacine was found to more effectively inhibit the expression of primary cilia in HEK cells at concentrations of 0.5 ⁇ M or higher.
  • quercetin (quercetin hydrate) inhibits the expression of primary cilia in NHEK cells in a concentration-dependent manner. More specifically, it was revealed that quercetin (quercetin hydrate) more effectively inhibits the expression of primary cilia in HEK cells at a concentration of 10 ⁇ M or higher.
  • immune-related cells have organelles called primary cilia, and that the expression of primary cilia is enhanced in skin diseases associated with inflammation.
  • the inhibitor of primary cilia of immune-related cells of the present invention has the effect of inhibiting the expression of primary cilia in immune-related cells. This suggests that the agent for suppressing primary cilia of immune-related cells of the present invention also has the effect of suppressing inflammation.
  • the present invention can be used as an inhibitor of primary cilia of immune-related cells, and more specifically, an anti-inflammatory agent for external use (e.g., anti-inflammatory agent, anti-inflammatory agent, anti-inflammatory agent, anti-inflammatory (cosmetics, anti-inflammatory cosmetics, anti-inflammatory cosmetics).
  • an anti-inflammatory agent for external use e.g., anti-inflammatory agent, anti-inflammatory agent, anti-inflammatory agent, anti-inflammatory (cosmetics, anti-inflammatory cosmetics, anti-inflammatory cosmetics).

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Abstract

本発明は、免疫関連細胞の一次繊毛の抑制剤、および、その利用技術を提供することを課題とする。シリマリン、シリビン、デヒドロシリビン、アンノナシン、および、ケルセチンからなる群より選択される少なくとも１つを含有する、免疫関連細胞の一次繊毛の抑制剤を用いる。

Description

免疫関連細胞の一次繊毛の抑制剤およびその利用
　本発明は、免疫関連細胞の一次繊毛の抑制剤およびその利用に関する。
　炎症は、化学的刺激、および／または、物理的刺激などによって引き起こされる生体反応の１つである。炎症は、生体組織に損傷を与えることがあるため、炎症に対して抗炎症剤が適用されることがある。
　研究が進むにつれて、炎症の発症機構は様々であることが明らかになりつつある。このことは、炎症の種類に応じて適切な抗炎症剤が存在することを示しており、それ故に、新たな抗炎症剤の開発が精力的に進められている。
　本発明者らは、これまでに、免疫関連細胞に一次繊毛と呼ばれる細胞小器官が存在すること、および、炎症を伴う皮膚疾患において一次繊毛の発現が亢進していること、を見出している（例えば、特許文献１～３を参照）。このことは、免疫関連細胞の一次繊毛の抑制剤は、抗炎症剤として用い得ることを示している。
ＷＯ２０１９／１７２４１９号国際公開公報 特開２０２１－７３９２８号公報 特開２０２１－７５５１６号公報
　しかしながら、免疫関連細胞の一次繊毛の抑制剤は見出されておらず、当該抑制剤の開発が求められていた。
　本発明の一態様は、免疫関連細胞の一次繊毛の抑制剤およびその利用技術を提供することを目的とする。
　本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討した結果、（ｉ）マリアアザミ（Silybum marianum）の抽出エキスの成分である、シリマリン、シリビンおよびデヒドロシリビン、並びに、（ｉｉ）グラビオラ（Annona muricata）の抽出エキスの成分である、アンノナシンおよびケルセチンが、免疫関連細胞の一次繊毛の発現を抑制する作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、以下の構成を含む。
　＜１＞以下のＡ～Ｅからなる群より選択される少なくとも１つを含有する、免疫関連細胞の一次繊毛の抑制剤：
Ａ：シリマリン、
Ｂ：シリビン、
Ｃ：デヒドロシリビン、
Ｄ：アンノナシン、
Ｅ：ケルセチン。
　本発明の一態様によれば、免疫関連細胞の一次繊毛の抑制剤およびその利用技術を提供することができる。
１０１は、シリマリンの免疫関連細胞における一次繊毛の抑制効果を示すグラフであり、１０２は、シリビンの免疫関連細胞における一次繊毛の抑制効果を示すグラフである。 ２０１および２０２は、各々、２，３－デヒドロシリビンＡ、および、２，３－デヒドロシリビンＢの免疫関連細胞における一次繊毛の抑制効果を示すグラフである。 ３０１、３０２および３０３は、各々、マリアアザミに由来する材料を含有する化粧品原料の免疫関連細胞における一次繊毛の抑制効果を示すグラフである。 ４０１および４０２は、各々、アンノナシン、および、ケルセチン水和物の免疫関連細胞における一次繊毛の抑制効果を示すグラフである。
　本発明について以下に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。本発明は、以下に説明する各構成に限定されるものではなく、請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能である。また、異なる実施形態または実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態または実施例についても、本発明の技術的範囲に含まれる。さらに、各実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を組み合わせることにより、新しい技術的特徴を形成することができる。なお、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考文献として援用される。本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ｘ～Ｙ」は、「Ｘ以上Ｙ以下」を意図する。
　〔１．免疫関連細胞の一次繊毛の抑制剤〕
　本発明の一実施形態に係る免疫関連細胞の一次繊毛の抑制剤は、以下のＡ～Ｅからなる群より選択される少なくとも１つを含有するものである：Ａ：シリマリン、Ｂ：シリビン、Ｃ：デヒドロシリビン、Ｄ：アンノナシン、Ｅ：ケルセチン。
　上記免疫関連細胞には、免疫反応を主に担当する免疫細胞と、免疫細胞に間接的に関与する免疫機能保有細胞とが包含される。免疫機能保有細胞は、例えば、免疫細胞を活性化させる機能を有している。免疫細胞としては、例えば、皮膚樹状細胞（例えば、ランゲルハンス細胞、真皮樹状細胞）、リンパ球系の免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞）、および、単球系の免疫細胞（例えば、通常型樹状細胞、単球系樹状細胞（例えば、形質細胞様樹状細胞））を挙げることができる。一方、免疫機能保有細胞としては、例えば、ケラチノサイト、繊維芽細胞、および、上皮細胞を挙げることができる。免疫関連細胞は、生体から採取された免疫関連細胞であってもよいし、株化された免疫関連細胞（例えば、ＨａＣａＴ細胞）であってもよい。
　シリマリン（CAS No.65666-07-1）は、マリアアザミ（Silybum marianum）から得られるフラボノリグナン類の混合物である。シリマリンには、上述したＢ～Ｅの化合物のうち、シリビン、および、デヒドロシリビンが含有されている。
　シリマリンとしては、市販のシリマリンを用いることも可能であるし、マリアアザミの抽出エキスから得たシリマリンを用いることも可能である。マリアアザミの抽出エキスからシリマリンを得る方法は、限定されない。例えば、まず、マリアアザミの種子を有機溶媒（例えば、エタノール、メタノール、アセトン、または、酢酸エチル）によって抽出して、抽出エキスを得る。次いで、当該抽出エキスから、脂質、および、極性の高い不純物を除去した後、当該抽出エキスをスプレードライ法などによって乾燥させることによって、シリマリンを得ることができる。
　上述したように、シリマリンはマリアアザミの抽出エキスから得ることができる。それ故に、本発明の一実施形態に係る免疫関連細胞の一次繊毛の抑制剤は、マリアアザミに由来する材料（例えば、マリアアザミ（例えば、マリアアザミの種子、葉、茎、芽、花、または、根）の抽出エキス、または、粉砕物）を含有する、免疫関連細胞の一次繊毛の抑制剤であってもよい。
　シリビン（CAS No.22888-70-6）は、上述したシリマリンに含まれる化合物の１つである。
　シリビンとしては、市販のシリビンを用いることも可能であるし、マリアアザミの抽出エキスから得たシリビンを用いることも可能である。マリアアザミの抽出エキスからシリビンを得る方法は、限定されない。例えば、まず、マリアアザミの種子を有機溶媒（例えば、エタノール、メタノール、アセトン、または、酢酸エチル）によって抽出して、抽出エキスを得る。次いで、当該抽出エキスを公知の精製方法（例えば、カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー）によって更に精製することによって、シリビンを得ることができる。
　上述したように、シリビンはマリアアザミの抽出エキスから得ることができる。それ故に、本発明の一実施形態に係る免疫関連細胞の一次繊毛の抑制剤は、マリアアザミに由来する材料（例えば、マリアアザミ（例えば、マリアアザミの種子、葉、茎、芽、花、または、根）の抽出エキス、または、粉砕物）を含有する、免疫関連細胞の一次繊毛の抑制剤であってもよい。
　デヒドロシリビン（例えば、２，３－デヒドロシリビンＡ（CAS No.25166-14-7）、２，３－デヒドロシリビンＢ（CAS No.142796-24-5））は、上述したシリマリンに含まれる化合物の１つである。
　デヒドロシリビンとしては、市販のデヒドロシリビンを用いることも可能であるし、マリアアザミの抽出エキスから得たデヒドロシリビンを用いることも可能である。マリアアザミの抽出エキスからデヒドロシリビンを得る方法は、限定されない。例えば、まず、マリアアザミの種子を有機溶媒（例えば、エタノール、メタノール、アセトン、または、酢酸エチル）によって抽出して、抽出エキスを得る。次いで、当該抽出エキスを公知の精製方法（例えば、カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー）によって更に精製することによって、デヒドロシリビンを得ることができる。
　上述したように、デヒドロシリビンはマリアアザミの抽出エキスから得ることができる。それ故に、本発明の一実施形態に係る免疫関連細胞の一次繊毛の抑制剤は、マリアアザミに由来する材料（例えば、マリアアザミ（例えば、マリアアザミの種子、葉、茎、芽、花、または、根）の抽出エキス、または、粉砕物）を含有する、免疫関連細胞の一次繊毛の抑制剤であってもよい。
　アンノナシン（CAS No.111035-65-5）は、グラビオラ（Annona muricata）から得られる化合物の１つである。
　アンノナシンとしては、市販のアンノナシンを用いることも可能であるし、グラビオラの抽出エキスから得たアンノナシンを用いることも可能である。グラビオラの抽出エキスからアンノナシンを得る方法は、限定されない。例えば、まず、グラビオラの種子または葉を有機溶媒（例えば、エタノール、メタノール、アセトン、または、酢酸エチル）によって抽出して、抽出エキスを得る。次いで、当該抽出エキスを公知の精製方法（例えば、カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー）によって更に精製することによって、アンノナシンを得ることができる。
　上述したように、アンノナシンはグラビオラの抽出エキスから得ることができる。それ故に、本発明の一実施形態に係る免疫関連細胞の一次繊毛の抑制剤は、グラビオラに由来する材料（例えば、グラビオラ（例えば、グラビオラの種子、葉、茎、芽、花、または、根）の抽出エキス、または、粉砕物）を含有する、免疫関連細胞の一次繊毛の抑制剤であってもよい。
　ケルセチン（CAS No.117-39-5）は、グラビオラ（Annona muricata）から得られる化合物の１つである。当該ケルセチンは、水和物の形態のもの（ケルセチン水和物）であってもよい。
　ケルセチンとしては、市販のケルセチンを用いることも可能であるし、グラビオラの抽出エキスから得たケルセチンを用いることも可能である。グラビオラの抽出エキスからケルセチンを得る方法は、限定されない。例えば、まず、グラビオラの種子または葉を有機溶媒（例えば、エタノール、メタノール、アセトン、または、酢酸エチル）によって抽出して、抽出エキスを得る。次いで、当該抽出エキスを公知の精製方法（例えば、カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー）によって更に精製することによって、ケルセチンを得ることができる。
　上述したように、ケルセチンはグラビオラの抽出エキスから得ることができる。それ故に、本発明の一実施形態に係る免疫関連細胞の一次繊毛の抑制剤は、グラビオラに由来する材料（例えば、グラビオラ（例えば、グラビオラの種子、葉、茎、芽、花、または、根）の抽出エキス、または、粉砕物）を含有する、免疫関連細胞の一次繊毛の抑制剤であってもよい。
　本発明の一実施形態に係る免疫関連細胞の一次繊毛の抑制剤に含有される有効成分（換言すれば、シリマリン、シリビン、デヒドロシリビン、アンノナシン、および、ケルセチンからなる群より選択される少なくとも１つ）の量は、特に限定されず、例えば、抑制剤を１００質量％とした場合に、０．００００１質量％～１００質量％であってもよく、０．０００１質量％～１００質量％であってもよく、０．００１質量％～１００質量％であってもよく、０．０１質量％～１００質量％であってもよく、０．１質量％～１００質量％であってもよく、０．１質量％～９５質量％であってもよく、０．１質量％～９０質量％であってもよく、０．１質量％～８０質量％であってもよく、０．１質量％～７０質量％であってもよく、０．１質量％～６０質量％であってもよく、０．１質量％～５０質量％であってもよく、０．１質量％～４０質量％であってもよく、０．１質量％～３０質量％であってもよく、０．１質量％～２０質量％であってもよく、０．１質量％～１０質量％であってもよい。
　後述する実施例から理解できるように、シリマリン、シリビン、デヒドロシリビン、アンノナシン、および、ケルセチンは、各々、４８μｇ／ｍＬ以上、１００μＭ以上、１０μＭ以上、０．５μＭ以上、および、１０μＭ以上の濃度にて免疫関連細胞と接触したときに、当該免疫関連細胞における一次繊毛の発現を、より良く抑制することができる。
　上記有効成分がシリマリンである場合には、本発明の一実施形態に係る免疫関連細胞の一次繊毛の抑制剤は、当該抑制剤を対象に投与したときに、３０μｇ／ｍＬ以上、４８μｇ／ｍＬ以上、７５μｇ／ｍＬ以上、１ｍｇ／ｍＬ以上、または、５ｍｇ／ｍＬ以上の濃度（濃度の上限値は、限定されず、例えば、１００ｍｇ／ｍＬ、または、１０ｍｇ／ｍＬである）の有効成分が免疫関連細胞と接触することができる量の有効成分を含有することが好ましい。勿論、本発明の一実施形態に係る免疫関連細胞の一次繊毛の抑制剤（例えば、液剤、ゲル剤、クリーム剤のもの）は、当該濃度にて、シリマリン、または、シリビンを含有するものであってもよい。当該構成であれば、免疫関連細胞の一次繊毛の発現をより良く抑制することができる。
　上記有効成分がシリビンである場合には、本発明の一実施形態に係る免疫関連細胞の一次繊毛の抑制剤は、当該抑制剤を対象に投与したときに、７５μＭ以上、１００μＭ以上、５００μＭ以上、１ｍＭ以上、または、５ｍＭ以上の濃度（濃度の上限値は、限定されず、例えば、１Ｍ、１００ｍＭ、または、１０ｍＭである）の有効成分が免疫関連細胞と接触することができる量の有効成分を含有することが好ましい。勿論、本発明の一実施形態に係る免疫関連細胞の一次繊毛の抑制剤（例えば、液剤、ゲル剤、クリーム剤のもの）は、当該濃度にて、シリマリン、または、シリビンを含有するものであってもよい。当該構成であれば、免疫関連細胞の一次繊毛の発現をより良く抑制することができる。
　上記有効成分がデヒドロシリビンである場合には、本発明の一実施形態に係る免疫関連細胞の一次繊毛の抑制剤は、当該抑制剤を対象に投与したときに、８μＭ以上、１０μＭ以上、２５μＭ以上、５０μＭ以上、１００μＭ以上、または、５００μＭ以上の濃度（濃度の上限値は、限定されず、例えば、１Ｍ、１００ｍＭ、または、１０ｍＭである）の有効成分が免疫関連細胞と接触することができる量の有効成分を含有することが好ましい。勿論、本発明の一実施形態に係る免疫関連細胞の一次繊毛の抑制剤（例えば、液剤、ゲル剤、クリーム剤のもの）は、当該濃度にて、デヒドロシリビンを含有するものであってもよい。当該構成であれば、免疫関連細胞の一次繊毛の発現をより良く抑制することができる。
　上記有効成分がアンノナシンである場合には、本発明の一実施形態に係る免疫関連細胞の一次繊毛の抑制剤は、当該抑制剤を対象に投与したときに、０．２μＭ以上、０．５μＭ以上、１μＭ以上、５μＭ以上、または、１０μＭ以上の濃度（濃度の上限値は、限定されず、例えば、１Ｍ、１００ｍＭ、または、１０ｍＭである）の有効成分が免疫関連細胞と接触することができる量の有効成分を含有することが好ましい。勿論、本発明の一実施形態に係る免疫関連細胞の一次繊毛の抑制剤（例えば、液剤、ゲル剤、クリーム剤のもの）は、当該濃度にて、アンノナシンを含有するものであってもよい。当該構成であれば、免疫関連細胞の一次繊毛の発現をより良く抑制することができる。
　上記有効成分がケルセチンである場合には、本発明の一実施形態に係る免疫関連細胞の一次繊毛の抑制剤は、当該抑制剤を対象に投与したときに、８μＭ以上、１０μＭ以上、５０μＭ以上、１００μＭ以上、または、５００μＭ以上の濃度（濃度の上限値は、限定されず、例えば、１Ｍ、１００ｍＭ、または、１０ｍＭである）の有効成分が免疫関連細胞と接触することができる量の有効成分を含有することが好ましい。本発明の一実施形態に係る免疫関連細胞の一次繊毛の抑制剤（例えば、液剤、ゲル剤、クリーム剤のもの）は、当該濃度にて、ケルセチンを含有するものであってもよい。当該構成であれば、免疫関連細胞の一次繊毛の発現をより良く抑制することができる。
　デヒドロシリビン、および、アンノナシンは、シリマリン、シリビン、および、ケルセチンと比較して、より低濃度にて、より効率良く、免疫関連細胞における一次繊毛の発現を抑制できる。それ故に、デヒドロシリビン、および、アンノナシンを含有する抑制剤は、シリマリン、シリビン、および、ケルセチンを含有する抑制剤よりも、免疫関連細胞における一次繊毛の発現抑制効果が高いと考え得る。
　本発明の一実施形態に係る免疫関連細胞の一次繊毛の抑制剤は、上述した有効成分以外の成分を含有していてもよい。
　有効成分以外の成分は、特に限定されず、例えば、緩衝剤、ｐＨ調整剤、等張化剤、防腐剤、抗酸化剤、高分子量重合体、賦形剤、溶媒、抗菌剤などであり得る。
　上記緩衝剤としては、例えば、リン酸またはリン酸塩、ホウ酸またはホウ酸塩、クエン酸またはクエン酸塩、酢酸または酢酸塩、炭酸または炭酸塩、酒石酸または酒石酸塩、ε－アミノカプロン酸、トロメタモールが挙げられる。上記リン酸塩としては、例えば、リン酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウムが挙げられる。上記ホウ酸塩としては、例えば、ホウ砂、ホウ酸ナトリウム、ホウ酸カリウムが挙げられる。上記クエン酸塩としては、例えば、クエン酸ナトリウム、クエン酸二ナトリウム、クエン酸三ナトリウムが挙げられる。上記酢酸塩としては、例えば、酢酸ナトリウム、酢酸カリウムが挙げられる。上記炭酸塩としては、例えば、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムが挙げられる。上記酒石酸塩としては、例えば、酒石酸ナトリウム、酒石酸カリウムが挙げられる。
　上記ｐＨ調整剤としては、例えば、塩酸、リン酸、クエン酸、酢酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムが挙げられる。
　上記等張化剤としては、例えば、イオン性等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム）、非イオン性等張化剤（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、ソルビトール、マンニトール）が挙げられる。
　上記防腐剤としては、例えば、ベンザルコニウム塩化物、ベンザルコニウム臭化物、ベンゼトニウム塩化物、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸プロピル、クロロブタノールが挙げられる。
　上記抗酸化剤としては、例えば、アスコルビン酸、トコフェノール、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、エリソルビン酸ナトリウム、没食子酸プロピル、亜硫酸ナトリウムが挙げられる。
　上記高分子量重合体としては、例えば、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、カルボキシメチルエチルセルロース、酢酸フタル酸セルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、カルボキシビニルポリマー、ポリエチレングリコール、アテロコラーゲンが挙げられる。
　上記賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、Ｄ－マンニトール、キシリトール、ソルビトール、エリスリトール、デンプン、結晶セルロースが挙げられる。
　上記溶媒としては、例えば、水、生理的食塩水、アルコールが挙げられる。
　上記抗菌剤としては、例えば、β-ラクタム系、アミノグリコシド系、テトラサイクリン系、リンコマイシン系、クロラムフェニコール系、マクロライド系、ケトライド系、ポリペプチド系、グリコペプチド系の抗生物質；ピリドンカルボン酸（キノロン）系、ニューキノロン系、オキサゾリジノン系、サルファ剤系の合成抗菌薬が挙げられる。
　本発明の一実施形態に係る免疫関連細胞の一次繊毛の抑制剤に含有される有効成分以外の成分の量は、特に限定されず、例えば、抑制剤を１００質量％とした場合に、０質量％～９９．９９９９９質量％であってもよく、０質量％～９９．９９９９質量％であってもよく、０質量％～９９．９９９質量％であってもよく、０質量％～９９．９９質量％であってもよく、０質量％～９９．９質量％であってもよく、５質量％～９９．９質量％であってもよく、１０質量％～９９．９質量％であってもよく、２０質量％～９９．９質量％であってもよく、３０質量％～９９．９質量％であってもよく、４０質量％～９９．９質量％であってもよく、５０質量％～９９．９質量％であってもよく、６０質量％～９９．９質量％であってもよく、７０質量％～９９．９質量％であってもよく、８０質量％～９９．９質量％であってもよく、９０質量％～９９．９質量％であってもよい。
　本発明の一実施形態に係る免疫関連細胞の一次繊毛の抑制剤の剤型は、特に限定されず、例えば、外用剤（例えば、液剤、ゲル剤、クリーム剤、スティック剤、シート剤）、錠剤、粉末剤、顆粒剤が挙げられる。
　本発明の一実施形態に係る免疫関連細胞の一次繊毛の抑制剤の投与対象は、特に限定されず、例えば、ヒト、非ヒト動物（例えば、家畜、愛玩動物、および、実験動物）、これらから採取した組織、これらから採取した細胞、株化された細胞が挙げられる。上記非ヒト動物としては、特に限定されず、例えば、サル、チンパンジー、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、および、ラットが挙げられる。
　本発明の一実施形態に係る免疫関連細胞の一次繊毛の抑制剤の投与経路は、特に限定されず、例えば、非経口投与（例えば、経皮投与）、および、経口投与が挙げられる。
　本発明の一実施形態に係る免疫関連細胞の一次繊毛の抑制剤の対象への投与間隔は、特に限定されず、例えば、１時間に１回、１～６時間に１回、６～１２時間に１回、１２時間～１日あたり１回、１日～３日あたり一回、１日～５日あたり１回、１日～７日あたり１回、７日～１４日あたり１回、１４日～２１日あたり１回、１カ月あたり１回、２カ月あたり１回、３カ月あたり１回、４カ月あたり１回、５カ月あたり１回、６カ月あたり１回、または、１年あたり１回が挙げられる。
　〔２．抗炎症用の外用剤〕
　本発明の一実施形態に係る抗炎症用（例えば、炎症予防用、炎症治療用）の外用剤は、本発明の一実施形態に係る免疫関連細胞の一次繊毛の抑制剤を含有するものである。本発明の一実施形態に係る抗炎症用（例えば、炎症予防用、炎症治療用）の外用剤は、本発明の一実施形態に係る免疫関連細胞の一次繊毛の抑制剤からなるものであってもよい。
　上記免疫関連細胞の一次繊毛の抑制剤については、既に説明したので、ここではその説明を省略する。
　上記外用剤を適用する炎症としては、特に限定されず、例えば、化学的刺激および／または物理的刺激などによって引き起こされる炎症、および、炎症性疾患に伴う炎症が挙げられる。上記炎症性疾患としては、例えば、アトピー性皮膚炎、乾癬、湿疹、面皰、および、接触性皮膚炎が挙げられる。
　上記抗炎症用の外用剤は、より具体的に、抗炎症剤、炎症予防剤、炎症治療剤、抗炎症用の化粧料、炎症予防用の化粧料、炎症治療用の化粧料であり得る。
　上記化粧料の具体例としては、例えば、ボディーローション、デオドラント化粧料、化粧水、乳液、スキンケアクリーム、トニック、スティック化粧料、リップ、洗顔料、洗浄料、シート状化粧料、髭そり用化粧料、育毛剤が挙げられる。
　上記外用剤の剤型としては、特に限定されず、例えば、液剤、ゲル剤、クリーム剤、スティック剤、および、シート剤が挙げられる。上記ゲル剤のゲル化度は、用途によって異なり得るので、特に限定されない。
　上記外用剤が適用され得る皮膚としては、特に限定されず、例えば、頭、顔、首、腕、手、肘、脛、背中、胴、および、足が挙げられる。
　本発明の一実施形態に係る抗炎症用の外用剤に含有される、免疫関連細胞の一次繊毛の抑制剤の量は、特に限定されず、例えば、外用剤を１００質量％とした場合に、０．００００１質量％～１００質量％であってもよく、０．０００１質量％～１００質量％であってもよく、０．００１質量％～１００質量％であってもよく、０．０１質量％～１００質量％であってもよく、０．１質量％～１００質量％であってもよく、０．１質量％～９５質量％であってもよく、０．１質量％～９０質量％であってもよく、０．１質量％～８０質量％であってもよく、０．１質量％～７０質量％であってもよく、０．１質量％～６０質量％であってもよく、０．１質量％～５０質量％であってもよく、０．１質量％～４０質量％であってもよく、０．１質量％～３０質量％であってもよく、０．１質量％～２０質量％であってもよく、０．１質量％～１０質量％であってもよい。
　本発明の一実施形態に係る抗炎症用の外用剤は、上述した免疫関連細胞の一次繊毛の抑制剤以外の成分を含有していてもよい。当該「免疫関連細胞の一次繊毛の抑制剤以外の成分」としては、特に限定されず、例えば、上述した〔１．免疫関連細胞の一次繊毛の抑制剤〕にて説明した「有効成分以外の成分」が挙げられる。
　本発明の一実施形態に係る抗炎症用の外用剤に含有される、免疫関連細胞の一次繊毛の抑制剤以外の成分の量は、特に限定されず、例えば、外用剤を１００質量％とした場合に、０質量％～９９．９９９９９質量％であってもよく、０質量％～９９．９９９９質量％であってもよく、０質量％～９９．９９９質量％であってもよく、０質量％～９９．９９質量％であってもよく、０質量％～９９．９質量％であってもよく、５質量％～９９．９質量％であってもよく、１０質量％～９９．９質量％であってもよく、２０質量％～９９．９質量％であってもよく、３０質量％～９９．９質量％であってもよく、４０質量％～９９．９質量％であってもよく、５０質量％～９９．９質量％であってもよく、６０質量％～９９．９質量％であってもよく、７０質量％～９９．９質量％であってもよく、８０質量％～９９．９質量％であってもよく、９０質量％～９９．９質量％であってもよい。
　本発明の一実施形態に係る抗炎症用の外用剤の投与対象、投与経路、および、投与間隔は、特に限定されず、上述した本発明の一実施形態に係る免疫関連細胞の一次繊毛の抑制剤の投与対象、投与経路、および、投与間隔と同じであり得る。
　〔３．その他〕
　本発明の一実施形態は、以下のように構成することもできる。
　＜１＞以下のＡ～Ｅからなる群より選択される少なくとも１つを含有する、免疫関連細胞の一次繊毛の抑制剤：Ａ：シリマリン、Ｂ：シリビン、Ｃ：デヒドロシリビン、Ｄ：アンノナシン、Ｅ：ケルセチン。
　＜２＞＜１＞に記載の抑制剤を含有する、抗炎症用の外用剤。
　＜３＞以下のＡ～Ｅからなる群より選択される少なくとも１つを含有する免疫関連細胞の一次繊毛の抑制剤を被験体（例えば、ヒト、または、非ヒト動物（例えば、サル、チンパンジー、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、および、ラット））へ投与する工程を有する、免疫関連細胞の一次繊毛の抑制方法：Ａ：シリマリン、Ｂ：シリビン、Ｃ：デヒドロシリビン、Ｄ：アンノナシン、Ｅ：ケルセチン。
　＜４＞以下のＡ～Ｅからなる群より選択される少なくとも１つを含有する免疫関連細胞の一次繊毛の抑制剤を含有する外用薬を被験体（例えば、ヒト、または、非ヒト動物（例えば、サル、チンパンジー、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、および、ラット））へ投与する工程を有する、炎症の処置方法（例えば、炎症の予防方法、または、炎症の治療方法）：Ａ：シリマリン、Ｂ：シリビン、Ｃ：デヒドロシリビン、Ｄ：アンノナシン、Ｅ：ケルセチン。
　＜５＞免疫関連細胞の一次繊毛の抑制剤を製造するための、以下のＡ～Ｅからなる群より選択される少なくとも１つの使用：Ａ：シリマリン、Ｂ：シリビン、Ｃ：デヒドロシリビン、Ｄ：アンノナシン、Ｅ：ケルセチン。
　＜６＞抗炎症用の外用剤を製造するための、以下のＡ～Ｅからなる群より選択される少なくとも１つの使用：Ａ：シリマリン、Ｂ：シリビン、Ｃ：デヒドロシリビン、Ｄ：アンノナシン、Ｅ：ケルセチン。
　本発明の実施例について、以下に説明する。
　（１．細胞の培養方法）
　免疫関連細胞の１つであるNeonatal normal human keratinocyte（ＮＨＥＫ、Ｌｏｎｚａ社）を、ＫＧＭ－Ｇｏｌｄ培地（Ｌｏｎｚａ社製）中で培養した。
　（２．一次繊毛の誘導方法）
　８ｗｅｌｌのチャンバースライド（Thermo Fisher Scientific社製、型番：１５４５３４）の各ｗｅｌｌ内に、ＫＧＭ－Ｇｏｌｄ培地を加えた。
　ＮＨＥＫ細胞を継代培養した後に回収し、当該ＮＨＥＫ細胞を、上記８ｗｅｌｌのチャンバースライドの各ｗｅｌｌに対して１．０×１０５　ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌずつ播き、３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて一晩培養した。
　各ｗｅｌｌ内に、ＩＬ－１３（PeproTech社製、型番：ＡＦ－２００－１３）を最終濃度が１００ｎｇ／ｍＬとなるように加えた後、３７℃、５％ＣＯ２の条件下にて４８時間培養した。これによって、ＮＨＥＫ細胞における一次繊毛の発現を誘導した。
　（３．細胞の免疫染色方法）
　スライド上のＮＨＥＫ細胞に対して、４％パラホルムアルデヒドリン酸緩衝液（富士フイルム社製、型番：１６３－２０１４５）を用いて、４℃の条件下にて２０分間の固定処理を行った。
　固定処理後のＮＨＥＫ細胞をＰＢＳ（Phosohate-buffered saline）を用いて３回洗浄した後、当該ＮＨＥＫ細胞を１０％ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum）／０．１%Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００（Sigma社製、型番：Ｔ８７８７）中、室温の条件下にて３０分間インキュベートすることによって、ブロッキング処理を行った。
　ブロッキング処理後のＮＨＥＫ細胞を、４℃の条件下にて一晩、一次抗体と反応させた。以下の試験では、一次繊毛を検出するために、一次繊毛のマーカータンパク質であるＡＲＬ１３Ｂを染色し、中心体を検出するために、中心体のマーカータンパク質であるＣＥＰ１６４を染色した。使用した一次抗体に関する情報と、当該一次抗体の使用時の希釈倍率とを、以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 　一次抗体と反応させた後のＮＨＥＫ細胞を、０．１％　Ｔｗｅｅｎ－２０（sigma社製、型番：Ｐ９４１６）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳＴ）中で洗浄した後、当該ＮＨＥＫ細胞を、室温の条件下にて１時間、遮光しながら二次抗体と反応させた。また、ＮＨＥＫ細胞と二次抗体とを反応させているときに、同時に、Ｈｏｅｃｈｓｔ　３３３４２（１：１０００）（Thermo Fisher Scientific社製、型番：Ｈ３５７０）を用いて、ＮＨＥＫ細胞の核を染色した。
　二次抗体としては、抗マウスＩｇＧ　ロバポリクローナル抗体（１：１０００）（Thermo Fisher Scientific社製、型番：Ａ－２１２０２）、および、抗ウサギＩｇＧ　ロバポリクローナル抗体（１：１０００）（Thermo Fisher Scientific社製、型番：Ａ－２１２０７）を使用した。
　二次抗体と反応させた後のＮＨＥＫ細胞を、ＰＢＳＴ中で洗浄した後、スライド上のＮＨＥＫ細胞へＰｒｏＬｏｎｇ　Ｇｏｌｄ（登録商標）（Thermo Fisher Scientific社製、型番：Ｐ３６９８０）を滴下した後、当該ＮＨＥＫ細胞の上をカバーガラスにて覆い、スライドとカバーガラスとの間にＮＨＥＫ細胞を封入した。
　スライドとカバーガラスとの間に封入されたＮＨＥＫ細胞を、共焦点レーザ走査型顕微鏡（OLYMPUS社製、商品名：ＦＶ１２００　ＩＸ８３、または、ＦＶ３０００　ＩＸ８３）を用いて観察した。
　一次繊毛を有する細胞の割合は、以下の式（Ｉ）にしたがって算出した：
　［一次繊毛を有する細胞（％）］＝［顕微鏡の観察画像中の一次繊毛を有する細胞の数］／［顕微鏡の観察画像中の全細胞の数］×１００　　　　・・・式（Ｉ）。
　＜試験１＞
　（ｉ）様々な濃度（０μＭ、５μＭ、１０μＭ、５０μＭ、または、１００μＭ）のシリビン（東京化成工業社製）、２，３－デヒドロシリビンＡ（Ｐｈｙｔｏｌａｂ社製）若しくは２，３－デヒドロシリビンＢ（Ｐｈｙｔｏｌａｂ社製）、または、様々な濃度（０μｇ／ｍＬ、２．４μｇ／ｍＬ、４．８μｇ／ｍＬ、２４μｇ／ｍＬ、または、４８μｇ／ｍＬ）のシリマリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、および、（ｉｉ）ＩＬ－１３（１００ｎｇ／ｍＬ）、を含有するＫＧＭ－Ｇｏｌｄ培地中で、ＮＨＥＫ細胞に対して一次繊毛の発現を誘導した。
　一次繊毛の発現を誘導した後のＮＨＥＫ細胞を免疫染色し、ＡＲＬ１３Ｂ、およびＣＥＰ１６４の染色の有無を指標として、共焦点レーザ走査型顕微鏡による観察像から、観察した全ＮＨＥＫ細胞における一次繊毛を有するＮＨＥＫ細胞の割合を算出した。図１および図２に試験結果を示す。
　図１の１０１は、シリマリンの免疫関連細胞における一次繊毛の抑制効果を示すグラフである。図１の１０２は、シリビンの免疫関連細胞における一次繊毛の抑制効果を示すグラフである。
　図１の１０１から明らかなように、シリマリンは、濃度依存的にＮＨＥＫ細胞における一次繊毛の発現を阻害することが明らかになった。より具体的に、シリマリンは、４８μｇ／ｍＬ以上の濃度にて、より効果的にＨＥＫ細胞における一次繊毛の発現を阻害することが明らかになった。
　図１の１０２から明らかなように、シリビンは、濃度依存的にＮＨＥＫ細胞における一次繊毛の発現を阻害することが明らかになった。より具体的に、シリビンは、１００μＭ以上の濃度にて、より効果的にＨＥＫ細胞における一次繊毛の発現を阻害することが明らかになった。
　図２の２０１および２０２は、各々、２，３－デヒドロシリビンＡ、および、２，３－デヒドロシリビンＢの免疫関連細胞における一次繊毛の抑制効果を示すグラフである。
　図２の２０１から明らかなように、２，３－デヒドロシリビンＡは、濃度依存的にＮＨＥＫ細胞における一次繊毛の発現を阻害することが明らかになった。より具体的に、２，３－デヒドロシリビンＡは、１０μＭ以上の濃度にて、より効果的にＨＥＫ細胞における一次繊毛の発現を阻害することが明らかになった。
　図２の２０２から明らかなように、２，３－デヒドロシリビンＢは、濃度依存的にＮＨＥＫ細胞における一次繊毛の発現を阻害することが明らかになった。より具体的に、２，３－デヒドロシリビンＢは、１０μＭ以上の濃度にて、より効果的にＨＥＫ細胞における一次繊毛の発現を阻害することが明らかになった。
　＜試験２＞
　マリアアザミの抽出エキスを含有する化粧品原料として、オーガニックマリアアザミエキス（香栄工業株式会社製；原料名：オーガニックマリアアザミエキスＢＧ－５０；表示名称：オオアザミ種子エキス）、Ａｍｅｌｉｏｘ（エイチ・ホルスタイン社製；原料名：アメリオックス；表示名称：レシチン、カルノシン、トコフェロール、オオアザミ果実エキス、グリセリン、エタノール、水）、および、ＳｉｌｓｔｅｍＵ（エイチ・ホルスタイン社製；原料名：Ｓｉｌｓｔｅｍ－Ｕ；表示名称：グリセリン、水、プロパンジオール、マリアアザミエキス、ウワウルシ葉エキス）が知られている。
　（ｉ）様々な濃度（０％、０．１％、または、１％）の化粧品原料、および、（ｉｉ）ＩＬ－１３（１００ｎｇ／ｍＬ）、を含有するＫＧＭ－Ｇｏｌｄ培地中で、ＮＨＥＫ細胞に対して一次繊毛の発現を誘導した。
　一次繊毛の発現を誘導した後のＮＨＥＫ細胞を免疫染色し、ＡＲＬ１３Ｂ、およびＣＥＰ１６４の染色の有無を指標として、共焦点レーザ走査型顕微鏡による観察像から、観察した全ＮＨＥＫ細胞における一次繊毛を有するＮＨＥＫ細胞の割合を算出した。図３に試験結果を示す。
　図３の３０１、３０２および３０３は、各々、オーガニックマリアアザミエキス、Ａｍｅｌｉｏｘ、および、ＳｉｌｓｔｅｍＵを含有する化粧品原料の免疫関連細胞における一次繊毛の抑制効果を示すグラフである。
　図３の３０１～３０３から明らかなように、オーガニックマリアアザミエキス、Ａｍｅｌｉｏｘ、および、ＳｉｌｓｔｅｍＵを含有する化粧品原料は、濃度依存的にＮＨＥＫ細胞における一次繊毛の発現を阻害することが明らかになった。つまり、マリアアザミの抽出エキスには、一次繊毛の発現を阻害する化合物が含有されていることが明らかになった。
　＜試験３＞
　（ｉ）様々な濃度（０μＭ、０．５μＭ、１μＭ、１０μＭ、または、１００μＭ）の、アンノナシン（Ｃａｙｍａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）、または、ケルセチン水和物（東京化成工業社製）、および、（ｉｉ）ＩＬ－１３（１００ｎｇ／ｍＬ）、を含有するＫＧＭ－Ｇｏｌｄ培地中で、ＮＨＥＫ細胞に対して一次繊毛の発現を誘導した。
　一次繊毛の発現を誘導した後のＮＨＥＫ細胞を免疫染色し、ＡＲＬ１３Ｂ、およびＣＥＰ１６４の染色の有無を指標として、共焦点レーザ走査型顕微鏡による観察像から、観察した全ＮＨＥＫ細胞における一次繊毛を有するＮＨＥＫ細胞の割合を算出した。図４に試験結果を示す。
　図４の４０１および４０２は、各々、アンノナシン、および、ケルセチン（ケルセチン水和物）の免疫関連細胞における一次繊毛の抑制効果を示すグラフである。
　図４の４０１から明らかなように、アンノナシンは、濃度依存的にＮＨＥＫ細胞における一次繊毛の発現を阻害することが明らかになった。より具体的に、アンノナシンは、０．５μＭ以上の濃度にて、より効果的にＨＥＫ細胞における一次繊毛の発現を阻害することが明らかになった。
　図４の４０２から明らかなように、ケルセチン（ケルセチン水和物）は、濃度依存的にＮＨＥＫ細胞における一次繊毛の発現を阻害することが明らかになった。より具体的に、ケルセチン（ケルセチン水和物）は、１０μＭ以上の濃度にて、より効果的にＨＥＫ細胞における一次繊毛の発現を阻害することが明らかになった。
　免疫関連細胞に一次繊毛と呼ばれる細胞小器官が存在すること、および、炎症を伴う皮膚疾患において一次繊毛の発現が亢進していること、が知られている。上述したように、本発明の免疫関連細胞の一次繊毛の抑制剤は、免疫関連細胞における一次繊毛の発現を阻害する効果を有する。このことは、本発明の免疫関連細胞の一次繊毛の抑制剤は、炎症を抑制する効果をも有することを示唆している。
　本発明は、免疫関連細胞の一次繊毛の抑制剤に利用することができ、より具体的に、抗炎症用の外用剤（例えば、抗炎症剤、炎症予防剤、炎症治療剤、抗炎症用の化粧料、炎症予防用の化粧料、炎症治療用の化粧料）に利用することができる。

Claims (2)

  1. 　以下のＡ～Ｅからなる群より選択される少なくとも１つを含有する、免疫関連細胞の一次繊毛の抑制剤：
    Ａ：シリマリン、
    Ｂ：シリビン、
    Ｃ：デヒドロシリビン、
    Ｄ：アンノナシン、
    Ｅ：ケルセチン。
  2. 　請求項１に記載の抑制剤を含有する、抗炎症用の外用剤。
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