상기한 본 발명의 목적은 하기의 화학식 1 내지 8로 표시되는 화합물로 이루 어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 스핑고신카나제의 활성화제를 유효성분으로 하는 것에 의해서 효과적으로 달성될 수 있다.
[화학식 1]
(식 중에서, R1 및 R2는 각각 탄소수 4~22의 직쇄 또는 분지형 알킬기이다.)
[화학식 2]
(식 중에서, R1 및 R2는 각각 탄소수 4~22의 직쇄 또는 분지형 알킬기이다.)
[화학식 3]
(식 중에서, R1 및 R2는 각각 탄소수 4~22의 직쇄 또는 분지형 알킬기이다.)
[화학식 4]
(식 중에서, R1 및 R2는 각각 탄소수 4~22의 직쇄 또는 분지형 알킬기이다.)
[화학식 5]
(식 중에서, R1 및 R2는 각각 탄소수 4~22의 직쇄 또는 분지형 알킬기이다.)
[화학식 6]
(식 중에서, R1 및 R2는 각각 탄소수 4~22의 직쇄 또는 분지형 알킬기이다.)
[화학식 7]
(식 중에서, R1 및 R2는 각각 탄소수 4~22의 직쇄 또는 분지형 알킬기이다.)
[화학식 8]
(식 중에서, R1 및 R2는 각각 탄소수 4~22의 직쇄 또는 분지형 알킬기이다.)
또한 상기한 본 발명의 목적은 적어도 1종의 상기한 화학식 1 내지 8의 스핑고신키나제의 활성화제를 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 50.0 중량% 포함하는 치료제 조성물에 의하여 효과적으로 달성될 수 있다.
상기한 본 발명에 있어서의 스핑고신키나제의 활성화제를 유효성분으로서 포함하는 피부질환 치료제는 피부상처치료, 아토피 피부염, 습진 및 건선 증상 등의 완화, 경감 및 치료, 주름개선, 피부노화억제, 국소 스테로이드 부작용 억제 등을 위한 용도로 효과적으로 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서의 스핑고신키나제의 활성화제를 포함하는 치료제는 피부 내 스핑고신키나제를 활성화시킴으로서, 그 결과 스핑고신-1-포스페이트의 생합성이 증가되어 스핑고신-1-포스페이트에 의한 다양한 생리활성효과를 준다.
본 발명자들은 먼저 상기의 스핑고신키나제의 활성화제가 각질형성세포에 있어서는 세포 증식을 억제하고 분화를 촉진하며, 섬유아세포에 있어서는 세포증식을 촉진하고 콜라겐 합성을 촉진한다는 사실을 확인함으로서 상처치유에 높은 효과를 나타냄과, 실제 피부표피에서도 각질형성세포의 증식을 억제하고, 분화를 촉진한다는 사실을 확인함으로서 아토피 피부염 및 습진, 건선에 있어서 손상된 피부기 능을 회복시키는 효과를 발휘함과, 자외선에 의한 주름유발 및 피부자극을 억제함으로써 주름개선 및 피부노화를 억제함과, 스테로이드를 도포하는 경우 생기는 피부위축을 억제함으로써 스테로이드 부작용 감소 효과도 나타낸다는 사실을 규명하였다.
본 발명에 따른 피부질환치료제에 있어서 스핑고신키나제 활성화제의 함량은 특별히 한정되어 있지는 않으나, 바람직하게는 치료제 총 중량에 대하여 0.001 내지 50.0 중량%로 포함되는 것이 좋고, 보다 바람직하게는 0.01 내지 30.0 중량%로 포함하는 것이 좋다. 상기 함량 이 외의 경우에는 효과가 미미하거나 제조단가가 매우 높아져 바람직하지 않을 수 있다.
본 발명의 스핑고신키나제의 활성화제를 유효성분으로서 함유하는 치료제는 피부에 적용되는 모든 제형에서 적용될 수 있으며, 보다 구체적으로는 토너, 로션, 크림, 에센스, 팩, 파우더, 연고, 서스펜션, 에멀젼, 스프레이, 미용액, 비누, 샴푸, 피부접착용 패치, 겔 등으로 제조될 수 있다. 또한, 상기의 스핑고신키나제의 활성화제는 화장, 세제 및 섬유 등 피부에 접촉하는 피부접촉물질로서도 제조될 수 있다.
이하 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 하나, 이는 본 발명을 예증하기 위한 것일 뿐 본 발명의 영역을 한정하기 위한 것은 아니다.
이하의 실시예에서 사용한 스핑고신키나제의 활성화제는 상기한 화학식 1 내지 8 중에서 R1=R2=C6인 예로서, N-(2,3-디히드록시프로필)-2-헥실-3-옥소-데칸아미드(이하 ‘K6PC-4’로 약칭함), 또는 N-(1,3-디히드록시이소프로필)-2-헥실-3-옥소-데칸아미드(이하 ‘K6PC-5’로 약칭함), 또는 N-(2-메칠-1,3-디히드록시이소프로필)-2-헥실-3-옥소-데칸아미드(이하 ‘K6PC-7’로 약칭함), 또는 N-에탄올-2-헥실-3-옥소-데칸아미드(이하 ‘K6PC-9’로 약칭함)를 통해 수행하였다.
먼저 실시예 1~4에서 K6PC-4, K6PC-5, K6PC-7, K6PC-9에 대한 in vitro 평가를 실시하였다. 본 실시예에서 상기의 물질 각각에 대한 세포 내 칼슘 변화, 스핑고신키나제 활성 능력, 섬유아세포에 대한 콜라겐 합성 능력, 각질형성세포에 대한 분화 능력을 평가함으로서 본 발명에서 목적으로 하는 상처치료, 아토피 피부염 및 습진, 건선 등에서 있어서 피부장벽회복효과를 통한 치료, 주름 치료 및 피부노화방지 치료, 국소 스테로이드 부작용에 의한 피부 위축 치료 효과 등을 확인하였다.
실시예 1: 세포 내 칼슘변화에 대한 효과
먼저 상기의 물질이 스핑고신-1-포스페이트를 활성화시켜 그 결과 스핑고신-1-포스페이트에 대표적인 작용기작인 세포 내 칼슘 변화를 유도하는 지 확인하기 위하여 칼슘이동 실험을 실시하였다.
세포 내 칼슘변화를 보는 대표적인 세포주에 하나인 RBL-2H3 세포주를 이용하여 상기의 물질이 세포 내 칼슘변화를 유도하는 지 확인하였다. RPMI 1640 배 지를 이용하여 먼저 세포를 배양한 후 세포 세척과 함께 배지를 제거하고, 10 uM의 fura-2/AM와 250 uM의 sulfinpyrazone를 넣어 30분간 배양하였다. 이후 원심분리를 통해 세포 펠렛을 얻은 다음 Ca2 +-free Locke's solution에 분산하고, 1× 106 세포단위로 나누어 시료 처리용으로 사용하였다. 이후 형광현미경의 cuvet에 준비된 세포를 넣고, 상기의 물질을 넣어 세포 내 칼슘의 이동을 유도하는 지 형광현미경(RF-5310PC, Spectrofluorophotometer, SHIMADZU)으로 관찰하였다. 세포 내 칼슘이온이 나오면 fura-2와 결합하여 형광을 유도함으로 칼슘과 결합한 fura-2의 값(380nm)과 칼슘과 결합하지 않은 fura-2의 값(340nm)의 차이를 구해 시료에 의한 칼슘이동 정도를 평가하였다.
그 결과 도 1a 내지 도 1d에 각각 나타낸 것과 같이 상기의 K6PC-4, K6PC-5, K6PC-7, K6PC-9모두에서 세포 내 칼슘의 이동을 유도함을 확인하였고, 이러한 칼슘신호전달이 상기의 물질들이 세포의 생리활성기능을 주는 작용기작임을 알 수 있었다.
실시예 2: 스핑고신키나제에 대한 활성 효과
다음으로 상기의 물질이 실시예 1의 세포 내 칼슘신호전달 효과가 스핑고신키나제의 활성에 의한 효과를 나타낸 것인지 확인하기 위해서 스핑고신카나제 활성 실험을 실시하였다.
F9-12세포에 양성대조물질로서 PMA(phorbol myristate acetate) 300nM을 처리한 것과 K6PC-4와 K6PC-5을 각각 50μM이 되도록 하여 24시간 처리한 후 수거하고 50μg의 단백질량으로 스핑고신키나제의 활성도를 C17-스핑고신-1-포스페이트의 생성량으로 측정하였다. 수거한 세포로부터 스핑고신-1-포스페이트의 추출은 1) 트립신-EDTA, 2) 1,500rpm, 10분 원심분리, 3) PBS 세척의 단계를 거친 후 동결하였다. 이후 동결된 상태에서 PBS를 가하고 초음파처리를 하여 세포를 파괴하였다. 이후 HPLC에 의해 스핑고신-1-포스페이트의 양을 측정하였으며, 추출 시료에 OPA(o-phthalaldehyde)반응용액과 보릭산 버퍼를 가하여 상온에서 20분간 반응시켰다. HPLC조건은 90% 아세토니트릴의 용액에서 340nm, 455nm의 형광파장에서 형광의 세기를 측정하여 내부표준과의 형광세기 비율로 계산하였다.
스핑고신키나제에 대한 활성도를 평가한 결과, 하기의 표 1에서와 같이 무처리 대조구와 비교하여 K6PC-4, K6PC-9에서는 약 30%, K6PC-5, K6PC-7에서는 약 46%의 증가된 스핑고신-1-포스페이트의 생성량을 나타냈다. 한편, 양성대조군으로 사용한 PMA에서는 약 48%의 증가율을 보였다. 따라서 본 발명에 따른 상기한 물질은 스핑고신키나제의 활성화제로 작용함을 확인하였다.
[표 1]
스핑고신키나제에 대한 활성도 결과
|
C17-S1P 생성량(pmol/min/mg) |
표준편차 |
대조 무처치 |
51.72 |
7.86 |
PMA(양성대조) |
76.76 |
6.15 |
K6PC-4 |
67.69 |
5.51 |
K6PC-5 |
75.59 |
2.06 |
K6PC-7 |
75.51 |
10.0 |
K6PC-9 |
66.72 |
5.4 |
실시예 3: 섬유아세포에 대한 콜라겐 합성 효과
섬유아세포를 이용하여 본 발명에 있어서의 스핑고신키나제의 활성화제가 콜라겐 합성에 주는 효과를 평가하였다.
인체 적용 시 콜라겐 합성을 촉진하는 것은 상처가 났을 때 그 치료를 촉진하고, 피부 노화에 의한 주름을 개선시킬 수 있으며, 스테로이드의 대표적인 부작용인 피부 위축을 억제할 수 있다는 점에서 다양한 영역에서 응용이 가능하다.
K6PC-4, K5PC-5, K6PC-7, K6PC-9를 각각 0.3, 1.0μg/ml의 농도가 되도록 DMSO에 녹여 시료로 사용하였으며, 72시간 배양하여 콜라겐 합성량을 분석하였다. 시료 처리 후 72시간 지난 후에, 배양액을 버리고 세포를 혈청이 없는 DMEM으로 3회 세척한 다음 세포를 새로이 혈청이 없는 DMEM으로 교체하여 24시간 배양하였다. 배양 후 각 웰의 상청액을 모아 PICP(procollagen type I C-peptide) 양을 키트를 사용하여 새로 합성된 콜라겐을 분석하였다. 콜라겐 측정 키트에 포함된 표준용액을 샘플 희석한 후 450nm에서 흡광도를 측정하여 표준 농도 곡선을 작성하였다(이하의 표 2 참조).
[표 2]
표준 농도 곡선 작성을 위한 표준용액과 샘플희석의 비율
최종농도(ng/㎖) |
0 |
10 |
20 |
40 |
80 |
160 |
320 |
640 |
샘플희석 |
400㎕ |
393.75㎕ |
387.5㎕ |
375㎕ |
350㎕ |
300㎕ |
200㎕ |
- |
표준액(640ng/㎖) |
- |
6.25㎕ |
12.5㎕ |
25㎕ |
50㎕ |
100㎕ |
200㎕ |
400㎕ |
1차 콜라겐 항체가 균일하게 도포된 항체 코팅 마이크로역가-플레이트( antibody Coated Microtiter-plate)에 항체-POD 컨쥬게이트 용액(antibody-POD conjugate solution) 100㎕과 채취된 세포 상청액을 넣고 3시간 동안 37℃로 배양하여 항원 항체 반응을 유도하였다. 이후 세척, 발색반응을 시켰다. 반응색은 노란색을 띄며 반응의 정도에 따라 노란색의 정도가 다르게 나타났다. 노란색을 띈 96 웰 플레이트를 마이크로역가 플레이트 판독기(Microtiter plate reader)를 이용하여 450nm에서 측정하였다.
섬유아세포에 대한 콜라겐 합성량을 평가한 결과, 하기의 표 3에 나타낸 바와 같이 대조 무처리와 비교하여 K6PC-4에서 약 1.7배, K6PC-5에서 약 2.4배, K6PC-7에서 약 1.9배, K6PC-9에서 약 2.0배 정도의 콜라겐 합성량을 증가시킴을 확 인하였다.
따라서, 본 결과는 상기의 시료 물질을 인체 적용 시 콜라겐 합성을 증가시켜 상처 치료, 주름 개선 및 스테로이드 부작용 감소에 유용한 효과를 줄 수 있음을 암시하고 있다.
[표 3]
섬유아세포에서 생성된 PICP양(평균 ± SEM)
농도(㎍/㎖) |
처리 시료 |
대조 무처리 |
K6PC-4 |
K6PC-5 |
K5PC-7 |
K6PC-9 |
0.0 |
47.1± 9.7 |
|
|
|
|
0.3 |
|
62.01± 2.5 |
111.2± 3.9 |
90.3± 12.5 |
95.0± 5.2 |
1.0 |
|
80.51± 4.4 |
96.0± 5.6 |
87.3± 14.9 |
86.7± 8.2 |
실시예 4: 각질형성세포의 분화유도 효과
각질형성세포를 이용하여 본 발명에 있어서의 스핑고신키나제의 활성화제가 세포증식억제효과 및 분화에 미치는 효과를 평가하였다.
각질형성세포는 피부의 최외각층을 형성하여 피부의 보습 및 보호기능에 매우 중요한 역할을 하는 세포로서 과도한 증식은 억제되고, 세포사가 억제되며, 분화를 촉진하는 것이 바람직하다. 이는 과도한 증식은 피부각질층을 비정상적으로 비대하게 하여 피부가 거칠어지고 두꺼워지는 원인이 되며, 비정상적인 분화로 인해 정상적인 피부장벽기능을 수행할 수 없게 되므로 피부건조증, 아토피 피부염, 건선 등과 같은 여러 가지 문제를 야기할 가능성을 높이게 된다.
각질형성세포에 대한 분화에 주는 영향을 평가하기 위해서 K6PC-4, K5PC-5, K6PC-7, K6PC-9에 대해 각각 10μM의 농도가 되도록 DMSO에 녹여 시료로 사용하였으며, 웨스턴 블롯팅(Western blotting)법으로 평가하였다. 분화마커로는 각질형성세포의 분화마커인 인볼루크린과 케라틴-1을 측정하였다. 시료 처리 후 48시간 지난 후에, 배양액을 버리고 세포를 PBS로 세척한 후 세포를 필터하여 수거하였다. 이를 재세척한 후 원심 분리하여 상층액을 제거하였다. 세포를 용해액으로 용해시킨 후 12,000rpm에서 10분간 원심 분리하여 세포막 성분 등을 제거하였다. 단백질 농도는 브래드포드(Bradford)법을 이용하여 정량하였다. 정량된 단백질을 7.5% 미니겔(mini gel) SDS-PAGE(Polyacrylamide Gel Electrophoresis)로 분리 한 후, PVDF막(Polyvinylidene fluoride membrane)에 100V, 1시간 트랜스퍼(transfer)하여 겔상의 단백질을 트랜스퍼막(transfer membrane)으로 블롯팅(blotting)하였다. Ponceau S 용액으로 트랜스(transfer)한 막(membrane)을 염색하여, 트랜스퍼(transfer)를 확인하였다. 5% 탈지 건조 밀크(nonfat dried milk)가 함유된 TTBS(TBS+0.1% Tween 20) 용액을 이용하여 막(membrane)을 블록킹(blocking)하였다. 각질형성세포의 분화마커인 인볼루크린의 발현 양을 검토하기 위해 제1 항체 인볼루크린(Primary antibody Involucrin: Neomarkers Co.)은 약 1/200에서 1/400으로 희석하였으며, 케라틴-1(Keratin-1: Covance Co.)은 약 1/1000으로 희석하여 사용하였고, 반응은 4℃에서 밤새 진행하였다. 제2 항체(Secondary antibody)는 서양고추냉이 퍼옥시다제(Horseradish Peroxidase: HRP)가 결합된 항-마우스(anti- mouse) IgG와 항-토끼(anti-rabbit) IgG를 1:2000으로 희석하여 이용하였으며, 반응은 상온에서 1시간 진행하여 제1 항체에 결합시켰다. 막(membrane)을 TTBS로 3회 세정하여 ECL 기질(Amersham Co.)과 1~3분간 반응시킨 후 X-선 필름에 감광시켰다.
각질형성세포의 분화에 주는 효과를 평가한 결과, 첨부한 도 2에 도시한 바와 같이 K6PC-4, K6PC-5, K6PC-7, K6PC-9 모두에서 분화마커가 발현되는 것을 확인할 수 있었으며, 인볼루크린에서 보다 좋은 효과가 발현됨을 확인하였다. 따라서, 상기의 물질들이 각질형성세포에 대한 분화 효과가 있음을 확인하였다. 이러한 분화마커가 대조구와 비교하여 높게 발현됨을 확인함으로서 본 발명에 따른 화합물이 각질형성세포의 분화를 촉진하여 결과적으로 피부장벽기능을 신속히 회복시켜 줄 수 있다는 사실을 규명하였다.
이하 실시예 5~7에서는 본 발명에 의한 K6PC-4, K6PC-5, K6PC-7, K6PC-9 중 대표물질로서 K6PC-5를 선정하여 in vivo 평가를 실시하였다. 그 결과, 피부표피에서의 칼슘기울기 회복효과, 표피에서의 각질형성세포 분화 효과, 자외선에 있어서 주름유발억제 효과, 스테로이드 부작용 감소 효과에 대하여 우수한 효과가 있음을 in vivo에서도 증명하였다.
실시예 5: 피부표피에서의 칼슘기울기 회복 효과
본 발명에 있어서의 피부장벽회복효과를 확인하기 위해서 표피 내 칼슘이 온의 기울기에 대한 회복효과를 평가하였다.
표피 내 칼슘기울기는 피부장벽기능의 항상성유지에 매우 중요한 역할을 수행한다. 예컨대, 무모생쥐의 등부에 대해 테이프 스트리핑(tape stripping)에 의한 급성장벽 손상을 주게 되면 표피 내 칼슘 이온의 기울기가 소실된다. 따라서, 무모생쥐를 이용한 급성장벽 손상모델에서 소실된 칼슘 기울기의 회복을 관찰함으로서 실험 시료가 손상된 피부장벽 회복에 주는 영향을 평가할 수 있다.
본 발명에 따른 K6PC-5에 대해서 손상된 피부장벽에서 칼슘 기울기의 변화에 주는 영향을 평가하였다.
대조구로 시료를 처리하지 않은 조직과 테이프 스트리핑 직후, 3시간, 6시간, 24시간째에 조직을 얻어 칼슘이온 포획(capture) 세포 화학적 염색을 시행하여 얻은 대조구와 K6PC-5(1.0% in PEG:EtOH=7:3)의 결과를 비교하였다. 보다 구체적인 시험방법으로는 각각의 조직을 얻은 즉시 2% 글루타알데히드, 2% 포름알데히드, 90mM 포타슘옥살레이트, 1.4% 서당으로 조성되고 4℃로 냉장된 고정액에 조직을 고정한 후 칼슘이온의 관찰을 위해 칼슘이온 포획 세포 화학적 염색을 시행하였다. 입체현미경 하에서 냉고정액 한방울을 점적 후 0.5mm X 3으로 세절하여 얼음조각 위에서 하룻밤 고정하였다. 고정액을 버리고 1ml의 4% OSO4와 3ml의 2% 포타슘 피로안티모네이트 스톡용액과 혼합한 후 고정액으로 얼음 위에서 2시간 동안 후고정하였다. 이후 모든 후고정 조직들을 냉증류수 (pH 10)에 10분간 수세한 다음, 통상적인 방법으로 탈수, 포맷하고 염색하였다. 이렇게 준비된 표본은 투과전자현미경 하 에서 표피 전층을 관찰하였다.
급성장벽 손상 모델에서 칼슘이온 포획 세포화학적 염색을 시행하여 결과, K6PC-5를 처리하였을 때 테이프 스트리핑 직후 소실된 칼슘이 대조구와 비교하여 3시간째부터 칼슘이온의 농도가 높아지면서 보다 빠른 정상적인 칼슘 기울기를 형성해 감을 확인할 수 있었으며, 첨부한 도 3a는 스트리핑 직후 표피에서의 칼슘이 소실된 사진이며, 도 3b는 대조구로서 6시간 경과 후의 사진, 도 3c는 K6PC-5를 처리한 후 6시간 경과 후 관찰한 결과를 나타낸다.
이러한 결과는 손상된 피부장벽에서 칼슘이 중요한 신호전달물질로 작용한다는 점에서 본 발명에 있어서의 스핑고신키나제의 활성화제 화합물은 피부장벽기능의 빠른 회복효과를 나타낸다는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 앞서 실시한 in vitro 결과와 함께 상처치료, 아토피 피부염 및 습진, 건선, 피부노화방지 등에 효과가 있음을 암시하는 in vivo 결과임을 나타낸다.
실시예 6: 주름 및 노화 억제효과에 대한 평가
본 발명에 있어서의 스핑고신키나제의 활성화제 화합물에 대한 주름 및 노화 억제효과 평가를 위해서 랫트를 이용한 자외선 조사에 따른 주름 유발 모델을 이용하여 주름억제효과 및 자외선에 대한 부작용 억제 효과를 확인하였다. 일반적으로 자외선을 지속적으로 쬐게 되면 주름이 유발되고, 선번, 염증 등의 부작용을 유발하여 결국 피부노화를 촉진하게 된다.
본 실험을 위해 3 주름 SD 랫트(rat)에 대해 6주간 주 3회에 걸쳐 UVB를 130 mJ/cm2의 세기로 랫트의 뒷다리에 조사하였으며, 자외선을 처음 조사한 당일부터 6주간 주 5회 자외선 조사 직후에 K6PC-5를 랫드의 뒷다리 피부에 10μl(1% in 80% EtOH)씩 도포하였다. 9주령 째 알버틴 마취제를 이용하여 마취 후 주름유발부위를 카메라로 촬영하고, 또한, 엑사핀 친수성 비닐 폴리실록산 표현재(exafine hydrophilic vinyl polysiloxane impression meterial)를 사용하여 주름유발부위를 복제하였다. 복제한 이미지는 이미지 분석장치를 이용하여 음영 화상(shadow image)에 대한 정량적 분석을 실시하였다.
주름 및 노화 억제효과에 대한 평가 결과에 있어서, 먼저 첨부한 도 4a의 주름억제효과를 평가한 결과를 보면 자외선이 조사되지 않은 대조군(Con)과 비교하여 자외선이 조사된 대조군(V.C, vehicle control)에서 상당한 주름이 유발된 것을 확인할 수 있었고, V.C와 비교하여 K6PC-5에서는 약 63%의 주름유발억제효과가 있음을 확인할 수 있었다. 또한, 첨부한 도 4b에서의 피부사진을 관찰해 보면 자외선의 대표적 부작용인 홍반이 K6PC-5를 도포한 군에서는 V.C와 비교하여 홍반의 유발도 억제됨을 확인하였다. 따라서, 자외선에 의한 대표적 부작용인 주름 및 홍반의 유발이 억제됨을 확인함으로서 본 발명에 있어서의 스핑고신키나제의 활성화제가 주름개선 및 항노화에 효과적으로 작용할 수 있음을 밝혔다.
실시예 7: 스테로이드 부작용에 대한 억제 효과
본 발명에 있어서의 스핑고신키나제의 활성화제 화합물의 스테로이드 부작용에 대한 억제 효과를 평가하기 위하여 무모생쥐에 스테로이드 도포 실험을 실시하였다. 스테로이드는 장기간 또는 과다 사용했을 때 피부가 얇아지고, 기능이 약해지는 피부위축(skin atrophy) 현상과 사용 중 중단하는 경우에 증상이 재발하는 반동현상이 대표적인 부작용이다. 이러한 부작용의 주요 원인은 스테로이드에 의한 섬유아세포의 활성억제 및 콜라겐 생성 저하에 있음이 보고되어 있다(S. Hammer et al., J. Cell. Biochem, 91, 840-851, 2004). 따라서, 본 발명에 의한 화합물은 콜라겐 합성을 촉진하고, 각질형성세포의 분화를 촉진함으로서 이러한 스테로이드에 의한 부작용을 억제할 것으로 생각되었다.
본 실험을 위해 무모생쥐에 스테로이드로서 0.05% 클로베타손-17-프로피오네이트와 본 발명에 의한 K6PC-5 (1.0% in PEG:EtOH=7:3)를 도포한 후 피부변화를 관찰하였다. 하루에 한번 9일간 무모생쥐의 등부에 도포한 후 조직을 채취하였으며, 일반적으로 잘 알려진 조직염색법인 H&E 염색(Hematoxylin and Eosin staining)을 실시하여 피부의 표피 및 진피조직을 관찰하였다. 그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 스테로이드를 함유하지 않았던 대조군에서는 표피 및 진피의 변화가 거의 없었으나, 클로베타손-17-프로피오네이트만 바른 경우에는 표피가 상당히 얇아지고, 진피에도 많은 이상을 발견하였다. 그러나, 클로베타손-17-프로피오네이트와 K6PC-5를 혼합하여 바른 경우에는 대조구와 유사하게 스테로이드에 의한 부작용이 상당히 억제됨을 확인하였다. 따라서, 스테로이드의 대표적인 부작용인 피부위축현상이 본 발명에 의한 화합물이 억제할 수 있음을 밝혔다.
실시예 8: 피부자극에 대한 안전성 평가
본 발명에 있어서의 스핑고신키나제의 활성화제 화합물을 피부외용제로 적용하기 위한 안전성을 확인하기 위해 동물을 이용한 독성시험 및 사람에 대한 인체첩포시험을 실시하였다.
본 평가를 위해 K6PC-5를 이용한 동물에 대한 독성시험으로는 랫트를 이용한 단회 경구투여독성시험, 토끼를 이용한 피부자극시험, 기니픽을 이용한 피부감작성시험, 토끼를 이용한 안점막자극시험을 실시하였다. 본 시험은 한국식품의약품안정청에서 고시한 ‘의약품 등의 독성시험기준’에 준하여 실시하였다. 또한, 총 30명의 피험자(평균연령: 25.8세)를 대상으로 K6PC-5에 대한 인체첩포시험을 실시하였다. 그 결과, 표 4에 나타낸 것과 같이 토끼를 이용한 피부자극시험에만 약한 자극이 관찰되었으나, 이는 다른 독성시험 및 인체첩포시험결과를 총괄하여 평가할 때 안전성에는 문제가 없는 것으로 판단되었다.
[표 4] 피부자극에 대한 안전성 평가
시험항목 |
결 과 |
독성시험으로는 랫트를 이용한 단회경구투여독성시험 |
무자극 |
토끼를 이용한 피부자극시험 |
약한 자극 |
기니픽을 이용한 피부감작성시험 |
무자극 |
토끼를 이용한 안점막자극시험 |
무자극 |
인체첩포시험(1% K6PC-5) |
무자극 |
인체첩포시험(10% K6PC-5) |
무자극 |
이하 실시예 9에서는 본 발명에 의한 K6PC-4, K6PC-5, K6PC-7, K6PC-9 중 대표물질로서 K6PC-5를 선정하여 주름개선에 대한 임상평가를 실시하였다. 아울러 본 실시예를 통해 앞서 실시한 in vitro 및 in vivo 결과가 사람에 대한 임상 적용에서도 유용한 효과를 줄 수 있음을 증명하고자 하였다.
실시예 9: 사람에서의 눈가 주름에 대한 개선 효과
본 실험을 위해 총 32명의 피험자(평균연령:46.7세)를 대상으로 눈가 주름에 대한 개선효과를 평가하였다. 총 8주간 피험자의 양쪽 눈가를 각각 1% K6PC-5 함유 크림과 함유하지 않은 대조크림을 사용하게 한 후 기기평가를 실시하였다. 피험자의 눈꼬리쪽 부위에 대한 실리콘 모사판을 제작하고, 제작된 주름 모사판에 일정 각도의 빛을 조사하여 모사판 주름의 굴곡에 따라 생기는 그림자 명암의 정도를 CCD 카메라로 찍은 후 이미지를 컴퓨터 영상분석시스템을 이용하여 주름의 정도를 정량하였다. 이때 사용한 프로그램은 C+K사(독일)의 Skin Visiometer SV 600으로 정량된 주름 파라미터값을 R1~R5값으로 나타내었다. R1,R2,R3는 깊은 주름, R4,R5는 얕은 주름을 나타낸다. 본 실험 결과, 먼저 도 6a는 K6PC-5를 함유한 크림을 8주간 사용한 후 대조군과 비교하여 통계적으로 유의한 주름개선효과가 있음을 나타내는 그림이며(P<0.05, t-test), 도 6b는 실제 실리콘 모사판의 사진을 나타내는 것으로 육안으로도 주름개선효과를 확인할 수 있었다. 아울러 K6PC-5 함유 크림을 사용한 후 4주 후와 8주 후에 피부과전문의의 문진 및 시진 결과, 본 크림의 사용 중 피부자극증상이나 과민반응은 관찰되지 않았다.
따라서, 본 발명에 있어서의 스핀고신키나제의 활성화제는 in vitro 평가, in vivo 평가, 임상시험에서 모두 일관된 효과를 나타냄을 증명하였다.
제형예 1: 에몰리엔트 크림 처방
정제수에 보습제를 가하고 70℃로 가열 조정하였다. K6PC-5와 유성분을 가열용해 후 유화제, 방부제 등을 가하고 70℃로 조정하였다. 이것을 앞의 수상에 가하고 호모믹서로 유화입자를 균일화하고, 탈기포, 여과, 냉각시켰다.
[표 5]
기 능 |
성 분 |
함량(%) |
주성분 |
K6PC-5 |
1.0 |
유성분 |
세토스테아릴알코올 스테아린산 라놀린 스쿠알란 옥틸도데카놀 |
6.0 2.0 4.0 9.0 10.0 |
보습제 |
1,3-부틸렌글리콜 글리세린 |
3.0 2.0 |
유화제 |
POE(25) 세틸알코올에테르 모노스테아린산글리세린 |
3.0 2.0 |
방부제 |
프로필파라벤 메칠파라벤 |
적당량 적당량 |
|
정제수 |
잔량 |
제형예 2: 외용 연고 처방
K6PC-5와 유성분을 가열용해 후 유화제, 방부제 등을 가하고 70℃로 조정하였다. 이것을 호모믹서로 균질하게 혼합한 다음, 탈기포, 여과, 냉각시켰다.
[표 6]
기 능 |
성 분 |
함량(%) |
주성분 |
K6PC-5 |
1.0 |
유성분 |
페트롤라툼 세토스테아릴알코올 라놀린 스쿠알란 |
잔량 2.0 3.0 3.0 |
유화제 |
세테아레쓰-20 |
3.0 |
방부제 |
프로필파라벤 메칠파라벤 |
적당량 적당량 |
제형예 3: 보습로션 처방
정제수에 보습제를 가하고 70℃ 가열, 조정하였다. K6PC-5와 유성분을 가열용해 후 유화제, 방부제 등을 가하고 70℃로 조정하였다. 이것을 앞의 수상에 가하고 호모믹서로 유화시킨 다음, 히아루론산 1% 수용액 첨가하여 호모믹서로 균질하게 혼합한 후, 탈기포, 여과, 냉각시켰다.
[표 7]
기능 |
성분 |
함량(%) |
주성분 |
K6PC-5 |
1.0 |
유성분 |
세토스테아릴알코올 밀납 바세린 스쿠알란 디메칠롤리실록산 |
1.0 0.5 2.0 6.0 2.0 |
유화제 |
POE(10) 모노올레인산 에스테르 글리세롤 모노스테아린산 에스테르 |
1.0 1.0 |
보습제 |
글리세린 1,3-부틸렌글리콜 |
4.0 4.0 |
방부제 |
프로필파라벤 메칠파라벤 |
적당량 적당량 |
기타 |
히아루론산 1% 수용액 정제수 |
3.0 잔량 |