JP2021075516A - 免疫関連細胞の一次繊毛の調整方法および調整剤、試験試料の評価方法、並びに、その利用 - Google Patents

Abstract

【課題】免疫関連細胞の一次繊毛の調整方法および調整剤、並びに、試験試料の評価方法を提供する。
【解決手段】免疫関連細胞の一次繊毛の調整方法は、免疫関連細胞を、（ａ）Ｔｈ２サイトカイン、（ｂ）Ｔｈ１７サイトカイン、および（ｃ）Ｔｈ２２サイトカインからなる群より選択される少なくとも１種のサイトカインのシグナル伝達経路を活性化または不活性化させるシグナル制御物質に接触させる接触工程を有する。
【選択図】なし

Description

本発明は、免疫関連細胞の一次繊毛の調整方法および調整剤、試験試料の評価方法、並びに、その利用に関する。

一次繊毛は、微小管を内部骨格として有するアンテナ様の器官である。非運動性である一次繊毛は、当該一次繊毛の表面に存在する様々な受容体を介して、細胞外のシグナルを細胞内へ伝達する。略全ての細胞が一次繊毛を有することが知られているが、免疫関連細胞における一次繊毛と免疫反応との関係については、明らかにされていない部分が多い。

近年の研究によって、免疫関連細胞に一次繊毛が存在すること、一次繊毛が免疫関連疾患と関連すること、および、一次繊毛を有する免疫関連細胞の数と免疫関連疾患の発症とに相関関係があること、が示唆されている。そして、これらの知見に基づいて、一次繊毛を観察することによる免疫関連疾患の指標の検出方法が提案されている（特許文献１参照）。

ＷＯ２０１９／１７２４１９号国際公開公報

免疫関連細胞の一次繊毛を調整すること（例えば、一次繊毛を有する免疫関連細胞の数および／または割合を調整すること）により、免疫系の調整、および、免疫関連疾患の治療に寄与できると考えられる。それ故に、免疫関連細胞の一次繊毛を調整する技術の開発が期待されている。

本発明の一実施形態は、前記問題点に鑑みなされたものであり、その目的は、免疫関連細胞の一次繊毛の調整方法および調整剤、試験試料の評価方法、並びに、その利用を提供することにある。

本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討した結果、（ｉ）免疫関連細胞にて特定のサイトカインのシグナル伝達経路の活性化状態を調整することによって、一次繊毛を有する免疫関連細胞の数および／または割合を調整することができるという新規知見、および、（ｉｉ）免疫関連細胞の一次繊毛を調整すると、特定のタンパク質の発現が変化するという新規知見を見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下の構成を含む。

＜１＞免疫関連細胞を、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される少なくとも１種のサイトカインのシグナル伝達経路を活性化または不活性化させるシグナル制御物質に接触させる接触工程を有する、免疫関連細胞の一次繊毛の調整方法；（ａ）Ｔｈ２サイトカイン、（ｂ）Ｔｈ１７サイトカイン、（ｃ）Ｔｈ２２サイトカイン。

＜２＞＜１＞に記載の免疫関連細胞の一次繊毛の調整方法を工程の１つとして有する、ＪＮＫ、ＤＳＧ１およびＣＬＤＮ４からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質の発現の調整方法。

＜３＞以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される少なくとも１種のサイトカインのシグナル伝達経路を活性化または不活性化させるシグナル制御物質を含有する、免疫関連細胞の一次繊毛の調整剤；（ａ）Ｔｈ２サイトカイン、（ｂ）Ｔｈ１７サイトカイン、（ｃ）Ｔｈ２２サイトカイン。

＜４＞＜３＞に記載の免疫関連細胞の一次繊毛の調整剤を含有する、ＪＮＫ、ＤＳＧ１およびＣＬＤＮ４からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質の発現の調整剤。

＜５＞免疫関連細胞を、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される少なくとも１種のサイトカインのシグナル伝達経路を活性化または不活性させるシグナル制御物質に接触させた後、当該免疫関連細胞の一次繊毛を観察する、第１の観察工程と、前記免疫関連細胞を、前記第１の観察工程に用いた前記シグナル制御物質、および、試験試料に接触させた後、当該免疫関連細胞の一次繊毛を観察する、第２の観察工程と、前記第１の観察工程の観察結果と、前記第２の観察工程の観察結果とを比較することによって、前記試験試料が前記免疫関連細胞の一次繊毛に及ぼす影響を評価する評価工程と、を有する、試験試料の評価方法；（ａ）Ｔｈ２サイトカイン、（ｂ）Ｔｈ１７サイトカイン、（ｃ）Ｔｈ２２サイトカイン。

＜６＞さらに、前記評価工程における評価結果に基づいて、前記試験試料が前記免疫関連細胞における、ＪＮＫ、ＤＳＧ１およびＣＬＤＮ４からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質の発現に及ぼす影響を評価する評価工程と、を有する、＜５＞に記載の試験試料の評価方法。

本発明によれば、免疫関連細胞の一次繊毛の調整方法および調整剤、並びに、試験試料の評価方法を提供できる。

本発明の実施例において、ＨａＣａｔ細胞（ヒト表皮角化細胞株）の一次繊毛に与える、各サイトカインの影響を示すグラフである。 本発明の実施例において、ＨａＣａｔ細胞（ヒト表皮角化細胞株）の一次繊毛に与える、各サイトカインの影響を示すグラフである。 本発明の実施例において、ＨａＣａｔ細胞（ヒト表皮角化細胞株）の一次繊毛に与える、サイトカインの混合物の影響を示すグラフである。 本発明の実施例において、初代ヒト表皮角化細胞の一次繊毛に与える、各サイトカインの影響を示すグラフである。 本発明の実施例において、初代ヒト表皮角化細胞の一次繊毛に与える、各サイトカイン、および、サイトカインの混合物の影響を示すグラフである。 本発明の実施例において、ＪＮＫタンパク質の発現に与える、サイトカインの影響を示すグラフである。 本発明の実施例において、ＣＬＤＮ４タンパク質の発現に与える、サイトカインの影響を示すグラフである。 本発明の実施例において、ＤＳＧ１タンパク質の発現に与える、サイトカインの影響を示すグラフである。

本発明について以下に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。本発明は、以下に説明する各構成に限定されるものではなく、請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能である。また、異なる実施形態または実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態または実施例についても、本発明の技術的範囲に含まれる。さらに、各実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を組み合わせることにより、新しい技術的特徴を形成することができる。なお、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考文献として援用される。本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ｘ〜Ｙ」は、「Ｘ以上Ｙ以下」を意図する。

〔１．免疫関連細胞の一次繊毛の調整方法〕
本発明に係る免疫関連細胞の一次繊毛の調整方法は、免疫関連細胞を、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される少なくとも１種のサイトカインのシグナル伝達経路を活性化または不活性化させるシグナル制御物質に接触させる接触工程を有する；（ａ）Ｔｈ２サイトカイン、（ｂ）Ｔｈ１７サイトカイン、（ｃ）Ｔｈ２２サイトカイン。

本発明に係る免疫関連細胞の一次繊毛の調整方法は、より具体的に、（ｉ）一次繊毛を有する免疫関連細胞の数および／または割合を増加させる方法、（ｉｉ）一次繊毛を有する免疫関連細胞の数および／または割合が増加することを抑制する方法、（ｉｉｉ）一次繊毛を有する免疫関連細胞の数および／または割合を減少させる方法、または、（ｉｖ）一次繊毛を有する免疫関連細胞の数および／または割合が減少することを抑制する方法、であってもよい。

接触工程において、免疫関連細胞をシグナル制御物質に接触させる方法は、特に限定されない。例えば、免疫関連細胞を培養している培地にシグナル制御物質を添加することによって、免疫関連細胞をシグナル制御物質に接触させてもよい。接触工程において、免疫関連細胞をシグナル制御物質に接触させる時間は、特に限定されず、例えば、０．１時間〜１００時間、０．１時間〜７５時間、０．１時間〜５０時間、０．１時間〜２５時間、０．１時間〜１０時間、または、０．１時間〜１時間であってもよい。

接触工程では、免疫関連細胞をシグナル制御物質に接触させた後、当該免疫関連細胞を、所望の時間、培養してもよい。なお、当該培養の間、免疫関連細胞とシグナル制御物質とは、接触していてもよいし、接触していなくてもよい。なお、培養時間は、特に限定されず、１日〜３日であってもよく、１日〜７日であってもよく、７日以上であってもよい。

免疫関連細胞には、免疫反応を主に担当する免疫細胞と、免疫細胞に間接的に関与する免疫機能保有細胞とが包含される。免疫機能保有細胞は、例えば、免疫細胞を活性化させる機能を有している。免疫細胞としては、例えば、皮膚樹状細胞（例えば、ランゲルハンス細胞、真皮樹状細胞）、リンパ球系の免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞）、および単球系の免疫細胞（例えば、通常型樹状細胞、単球系樹状細胞（例えば、形質細胞様樹状細胞））を挙げることができる。一方、免疫機能保有細胞としては、例えば、ケラチノサイト、繊維芽細胞、および上皮細胞を挙げることができる。免疫関連細胞は、生体から採取された免疫関連細胞であってもよいし、株化された免疫関連細胞（例えば、ＨａＣａＴ細胞）であってもよい。

接触工程では、免疫関連細胞にて、１種類のサイトカインのシグナル伝達経路を活性化または不活性化させてもよいし、複数種類のサイトカインのシグナル伝達経路を同時に活性化または不活性化させてもよい。活性化または不活性化させるサイトカインのシグナル伝達経としては、例えば、（ａ）Ｔｈ２サイトカインのシグナル伝達経路、（ｂ）Ｔｈ１７サイトカインのシグナル伝達経路、（ｃ）Ｔｈ２２サイトカインのシグナル伝達経路、（ｄ）Ｔｈ２サイトカインのシグナル伝達経路およびＴｈ１７サイトカインのシグナル伝達経路の組み合わせ、（ｅ）Ｔｈ１７サイトカインのシグナル伝達経路およびＴｈ２２サイトカインのシグナル伝達経路の組み合わせ、（ｆ）Ｔｈ２サイトカインのシグナル伝達経路およびＴｈ２２サイトカインのシグナル伝達経路の組み合わせ、および、（ｇ）Ｔｈ２サイトカインのシグナル伝達経路、Ｔｈ１７サイトカインのシグナル伝達経路およびＴｈ２２サイトカインのシグナル伝達経路の組み合わせ、を挙げることができる。

接触工程では、Ｔｈ２サイトカインのシグナル伝達経路、Ｔｈ１７サイトカインのシグナル伝達経路およびＴｈ２２サイトカインのシグナル伝達経路の各々を活性化または不活性化させる場合、各シグナル伝達経路の活性化または不活性化を、１種類のシグナル制御物質を用いて行ってもよいし、複数種類のシグナル制御物質を用いて行ってもよい。例えば、Ｔｈ２サイトカイン、Ｔｈ１７サイトカインおよびＴｈ２２サイトカインの各々には、後述するように複数種類のサブファミリーが存在する。接触工程では、複数種類のサブファミリーの組み合わせを用いて（例えば、（ｉ）インターロイキン−４、インターロイキン−１３、およびインターロイキン−３１の組み合わせ、（ｉｉ）インターロイキン−４阻害剤、インターロイキン−１３阻害剤、およびインターロイキン−３１阻害剤の組み合わせ）、Ｔｈ２サイトカインのシグナル伝達経路、Ｔｈ１７サイトカインのシグナル伝達経路およびＴｈ２２サイトカインのシグナル伝達経路の各々を活性化または不活性化させてもよい。

特定の疾患（例えば、アトピー性皮膚炎）では、細胞において、特定のシグナル制御物質（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、およびＩＬ−３１）の量、または、特定のシグナル制御物質（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、およびＩＬ−３１）の組み合わせの合計量が増加する。このことは、細胞に特定のシグナル制御物質を加えれば、特定の疾患のモデル細胞を作製し得ることを示唆している。それ故に、本発明に係る免疫関連細胞の一次繊毛の調整方法であれば、特定の疾患のモデル細胞にて一次繊毛を調整することが可能になるとともに、一次繊毛を調整することが特定の疾患に及ぼす影響を観察することが可能になる。

Ｔｈ２サイトカインとしては、特に限定されず、より具体的に、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）、インターロイキン−３１（ＩＬ−３１）、インターロイキン−３３（ＩＬ−３３）、ｇｐ１３０ ／ ＩＬ−６サイトカインファミリーなどが挙げられる。

Ｔｈ１７サイトカインとしては、特に限定されず、より具体的に、インターロイキン−１７Ａ（ＩＬ−１７Ａ）、インターロイキン−１７Ｂ（ＩＬ−１７Ｂ）、インターロイキン−１７Ｃ（ＩＬ−１７Ｃ）、インターロイキン−１７Ｄ（ＩＬ−１７Ｄ）、インターロイキン−１７Ｆ（ＩＬ−１７Ｆ）、インターロイキン−２５（ＩＬ−２５）などが挙げられる。

Ｔｈ２２サイトカインとしては、特に限定されず、より具体的に、インターロイキン−２２（ＩＬ−２２）、インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）、インターロイキン−２６（ＩＬ−２６）などが挙げられる。

シグナル制御物質は、（ａ）Ｔｈ２サイトカイン、（ｂ）Ｔｈ１７サイトカイン、（ｃ）Ｔｈ２２サイトカインからなる群より選択される少なくとも１種のサイトカインのシグナル経路を活性化または不活性化させ得るものであればよく、特に限定されない。

シグナル制御物質としては、具体的に、（ｉ）サイトカインのシグナル伝達経路を活性化する物質、（ｉｉ）サイトカインのシグナル伝達経路の活性化を抑制する物質、（ｉｉｉ）サイトカインのシグナル伝達経路を不活性化する物質、または、（ｉｖ）サイトカインのシグナル伝達経路の不活性化を抑制する物質、を挙げることができる。

シグナル制御物質としては、より具体的に、（ｉ）サイトカインレセプターを活性化する物質、（ｉｉ）サイトカインレセプターの活性化を抑制する物質、（ｉｉｉ）サイトカインレセプターを不活性化する物質、または、（ｉｖ）サイトカインレセプターの不活性化を抑制する物質、を挙げることができる。

シグナル制御物質の具体例としては、サイトカイン自体、サイトカインレセプターの阻害剤、サイトカイン以外のサイトカインレセプターの活性化剤を挙げることができる。

サイトカイン自体としては、例えば、Ｔｈ２サイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＬ−３１、ＩＬ−３３、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＧＭ−ＣＳＦ）、Ｔｈ１７サイトカイン（例えば、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｂ、ＩＬ−１７Ｃ、ＩＬ−１７Ｄ、ＩＬ−１７Ｆ、ＩＬ−２５）、Ｔｈ２２サイトカイン（例えば、ＩＬ−２２、ＩＬ−１３、ＩＬ−２６）、および、これらの組み合わせを挙げることができる。

サイトカインレセプターの阻害剤としては、例えば、レセプターの中和抗体、抗体製剤、低分子化合物などを挙げることができる。これらのサイトカインレセプターの阻害剤としては、市販のものを用いることができる。

本発明者は、免疫関連細胞の一次繊毛を調整すると、特定のタンパク質（具体的には、ＪＮＫ、ＤＳＧ１、および、ＣＬＤＮ４）の発現が変化することを新たに見出した。このことは、本発明の免疫関連細胞の一次繊毛の調整方法を、特定のタンパク質の発現の調整方法として利用可能であることを示している。

本発明に係るＪＮＫ、ＤＳＧ１、または、ＣＬＤＮ４の発現の調整方法は、本発明に係る免疫関連細胞の一次繊毛の調整方法（例えば、接触工程）を工程の１つとして有する。

ＪＮＫ（c-jun N-terminal kinase）は、アポトーシス、神経変性、細胞分化、細胞増殖、炎症、サイトカイン産生等に関係する、リン酸化タンパク質である。

ＤＳＧ１（desmoglein 1）は、細胞接着装置の１つである接着斑を構成する細胞接着分子であって、カルシウム結合性の膜貫通タンパク質である。ＤＳＧ１は、皮膚において、細胞同士の接着に関与する。

ＣＬＤＮ４（claudin 4）は、タイトジャンクションを構成するタンパク質の１つである。ＣＬＤＮ４は、皮膚において、バリア機能の維持、および、バリアの形成に大きな役割を担う。

本発明に係るＪＮＫ、ＤＳＧ１およびＣＬＤＮ４からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質の発現の調整方法は、より具体的に、（ｉ）一次繊毛を増加させることで特定のタンパク質（例えば、ＪＮＫ）の発現量を増加させる方法、（ｉｉ）一次繊毛を増加させることで特定のタンパク質（例えば、ＤＳＧ１およびＣＬＤＮ４）の発現量を減少させる方法、（ｉｉｉ）一次繊毛を減少させることで特定のタンパク質（例えば、ＤＳＧ１およびＣＬＤＮ４）の発現量を増加させる方法、（ｉｖ）一次繊毛を減少させることで特定のタンパク質（例えば、ＪＮＫ）の発現量を減少させる方法であってもよい。なお、一次繊毛を増加あるいは減少させる方法については、上記の通りである。

本発明に係る免疫関連細胞の一次繊毛の調整方法であれば、免疫関連細胞の一次繊毛を調整できるだけでなく、免疫関連細胞の一次繊毛に関連するタンパク質の発現量を調整することができるとともに、前記タンパク質の発現量が細胞に与える影響を観察することができる。

〔２．免疫関連細胞の一次繊毛の調整剤〕
本発明に係る免疫関連細胞の一次繊毛の調整剤は、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される少なくとも１種のサイトカインのシグナル伝達経路を活性化または不活性化させるシグナル制御物質を含有する；（ａ）Ｔｈ２サイトカイン、（ｂ）Ｔｈ１７サイトカイン、（ｃ）Ｔｈ２２サイトカイン。

本発明に係る免疫関連細胞の一次繊毛の調整剤は、より具体的に、（ｉ）一次繊毛を有する免疫関連細胞の数および／または割合を増加させるもの、（ｉｉ）一次繊毛を有する免疫関連細胞の数および／または割合が増加することを抑制するもの、（ｉｉｉ）一次繊毛を有する免疫関連細胞の数および／または割合を減少させるもの、または、（ｉｖ）一次繊毛を有する免疫関連細胞の数および／または割合が減少することを抑制するもの、であってもよい。

シグナル制御物質に関しては、上記〔１．免疫関連細胞の一次繊毛の調整方法〕にて説明したので、ここでは、その詳細な説明を省略する。

本発明に係る免疫関連細胞の一次繊毛の調整剤は、シグナル制御物質以外の成分を含有していてもよい。当該シグナル制御物質以外の成分としては、特に限定されず、緩衝剤、ｐＨ調整剤、等張化剤、防腐剤、抗酸化剤、高分子量重合体、賦形剤、担体、希釈剤、溶媒、可溶化剤、安定剤、充填剤、結合剤、界面活性剤、安定化剤等が挙げられる。

本発明に係る免疫関連細胞の一次繊毛の調整剤に含有されているシグナル制御物質の量は、特に限定されず、例えば、調整剤を１００質量％とした場合に、０．００１質量％〜１００質量％であってもよく、０．０１質量％〜１００質量％であってもよく、０．１質量％〜１００質量％であってもよく、０．１質量％〜９５質量％であってもよく、０．１質量％〜９０質量％であってもよく、０．１質量％〜８０質量％であってもよく、０．１質量％〜７０質量％であってもよく、０．１質量％〜６０質量％であってもよく、０．１質量％〜５０質量％であってもよく、０．１質量％〜４０質量％であってもよく、０．１質量％〜３０質量％であってもよく、０．１質量％〜２０質量％であってもよく、０．１質量％〜１０質量％であってもよい。

本発明に係る免疫関連細胞の一次繊毛の調整剤に含有されているシグナル制御物質以外の量は、特に限定されず、例えば、調整剤を１００質量％とした場合に、０質量％〜９９．９９９質量％であってもよく、０質量％〜９９．９９質量％であってもよく、０質量％〜９９．９質量％であってもよく、５質量％〜９９．９質量％であってもよく、１０質量％〜９９．９質量％であってもよく、２０質量％〜９９．９質量％であってもよく、３０質量％〜９９．９質量％であってもよく、４０質量％〜９９．９質量％であってもよく、５０質量％〜９９．９質量％であってもよく、６０質量％〜９９．９質量％であってもよく、７０質量％〜９９．９質量％であってもよく、８０質量％〜９９．９質量％であってもよく、９０質量％〜９９．９質量％であってもよい。

本発明に係る免疫関連細胞の一次繊毛の調整剤に含有されているシグナル制御物質の量は、特に限定されず、例えば、免疫関連細胞とシグナル制御物質とを接触させる溶液（例えば、培地）中に含まれるシグナル制御物質の量が、０．０１ｎｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬ、０．０１ｎｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬ、０．０１ｎｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬ、０．０１ｎｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬ、０．０１ｎｇ／ｍＬ〜１μｇ／ｍＬ、０．０１ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬ、または、０．０１ｎｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬになるように、調節されていてもよい。

本発明者は、免疫関連細胞の一次繊毛を調整すると、特定のタンパク質（具体的には、ＪＮＫ、ＤＳＧ１、および、ＣＬＤＮ４）の発現が変化することを新たに見出した。このことは、本発明の免疫関連細胞の一次繊毛の調整剤を、特定のタンパク質の発現の調整剤として利用可能であることを示している。

本発明に係るＪＮＫ、ＤＳＧ１、または、ＣＬＤＮ４の発現の調整剤は、本発明に係る免疫関連細胞の一次繊毛の調整剤を含有する。本発明に係るＪＮＫ、ＤＳＧ１、または、ＣＬＤＮ４の発現の調整剤は、本発明に係る免疫関連細胞の一次繊毛の調整剤からなるものであってもよい。

本発明に係るＪＮＫ、ＤＳＧ１およびＣＬＤＮ４からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質の発現の調整剤は、より具体的に、（ｉ）一次繊毛を増加させることで特定のタンパク質（例えば、ＪＮＫ）の発現量を増加させるもの、（ｉｉ）一次繊毛を増加させることで特定のタンパク質（例えば、ＤＳＧ１およびＣＬＤＮ４）の発現量を減少させるもの、（ｉｉｉ）一次繊毛を減少させることで特定のタンパク質（例えば、ＤＳＧ１およびＣＬＤＮ４）の発現量を増加させるもの、（ｉｖ）一次繊毛を減少させることで特定のタンパク質（例えば、ＪＮＫ）の発現量を減少させるものであってもよい。なお、一次繊毛を増加あるいは減少させる調整剤については、上記の通りである。

本発明に係るＪＮＫ、ＤＳＧ１、または、ＣＬＤＮ４の発現の調整剤が、本発明に係る免疫関連細胞の一次繊毛の調整剤（以下、有効成分と呼ぶ）を含有するものである場合、本発明に係るＪＮＫ、ＤＳＧ１、または、ＣＬＤＮ４の発現の調整剤は、有効成分以外の成分を含有していてもよい。当該有効成分以外の成分（以下、副成分と呼ぶ）としては、緩衝剤、ｐＨ調整剤、等張化剤、防腐剤、抗酸化剤、高分子量重合体、賦形剤、担体、希釈剤、溶媒、可溶化剤、安定剤、充填剤、結合剤、界面活性剤、安定化剤等が挙げられる。

本発明に係るＪＮＫ、ＤＳＧ１、または、ＣＬＤＮ４の発現の調整剤に含有されている有効成分の量は、特に限定されず、例えば、調整剤を１００質量％とした場合に、０．００１質量％〜１００質量％であってもよく、０．０１質量％〜１００質量％であってもよく、０．１質量％〜１００質量％であってもよく、０．１質量％〜９５質量％であってもよく、０．１質量％〜９０質量％であってもよく、０．１質量％〜８０質量％であってもよく、０．１質量％〜７０質量％であってもよく、０．１質量％〜６０質量％であってもよく、０．１質量％〜５０質量％であってもよく、０．１質量％〜４０質量％であってもよく、０．１質量％〜３０質量％であってもよく、０．１質量％〜２０質量％であってもよく、０．１質量％〜１０質量％であってもよい。

本発明に係るＪＮＫ、ＤＳＧ１、または、ＣＬＤＮ４の発現の調整剤に含有されている副成分の量は、特に限定されず、例えば、調整剤を１００質量％とした場合に、０質量％〜９９．９９９質量％であってもよく、０質量％〜９９．９９質量％であってもよく、０質量％〜９９．９質量％であってもよく、５質量％〜９９．９質量％であってもよく、１０質量％〜９９．９質量％であってもよく、２０質量％〜９９．９質量％であってもよく、３０質量％〜９９．９質量％であってもよく、４０質量％〜９９．９質量％であってもよく、５０質量％〜９９．９質量％であってもよく、６０質量％〜９９．９質量％であってもよく、７０質量％〜９９．９質量％であってもよく、８０質量％〜９９．９質量％であってもよく、９０質量％〜９９．９質量％であってもよい。

〔３．試験試料の評価方法〕
本発明に係る試験試料の評価方法は、免疫関連細胞を、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される少なくとも１種のサイトカインのシグナル伝達経路を活性化または不活性化させるシグナル制御物質に接触させた後、当該免疫関連細胞の一次繊毛を観察する、第１の観察工程と、前記免疫関連細胞を、前記第１の観察工程に用いた前記シグナル制御物質、および、試験試料に接触させた後、当該免疫関連細胞の一次繊毛を観察する、第２の観察工程と、前記第１の観察工程の観察結果と、前記第２の観察工程の観察結果とを比較することによって、前記試験試料が前記免疫関連細胞の一次繊毛に及ぼす影響を評価する評価工程と、を有する；（ａ）Ｔｈ２サイトカイン、（ａ）Ｔｈ１７サイトカイン、（ｃ）Ｔｈ２２サイトカイン。

シグナル制御物質は、特定のサイトカインのシグナル伝達経路を活性化または不活性化させるものである。第１の観察工程では、シグナル制御物質を用いることによって、当該シグナル制御物質が免疫関連細胞の一次繊毛に与える影響を観察する（対照試験に相当）。一方、第２の観察工程では、シグナル制御物質および試験試料を用いることによって、シグナル制御物質が免疫関連細胞の一次繊毛に与える影響に対して、更に、試験試料が如何なる影響を与えるか観察する。そして、両方の観察結果を比較すれば、試験試料がシグナル制御物質に与える影響（換言すれば、試験試料が免疫関連細胞の一次繊毛に及ぼす影響）を評価することができる。

以下では、本発明に係る試験試料の評価方法が有する各工程について説明する。なお、上記〔１．免疫関連細胞の一次繊毛の調整方法〕、および、上記〔２．免疫関連細胞の一次繊毛の調整剤〕にて説明した構成については、以下では、その説明を省略する。

＜第１の観察工程＞
第１の観察工程では、免疫関連細胞を、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される少なくとも１種のサイトカインのシグナル伝達経路を活性化または不活性化させるシグナル制御物質に接触させた後、当該免疫関連細胞の一次繊毛を観察する；（ａ）Ｔｈ２サイトカイン、（ｂ）Ｔｈ１７サイトカイン、（ｃ）Ｔｈ２２サイトカイン。

第１の観察工程において、免疫関連細胞をシグナル制御物質に接触させる方法は、特に限定されない。例えば、免疫関連細胞を培養している培地にシグナル制御物質を添加することによって、免疫関連細胞をシグナル制御物質に接触させてもよい。免疫関連細胞をシグナル制御物質に接触させる時間は、特に限定されず、例えば、０．１時間〜１００時間、０．１時間〜７５時間、０．１時間〜５０時間、０．１時間〜２５時間、０．１時間〜１０時間、または、０．１時間〜１時間であってもよい。

第１の観察工程では、免疫関連細胞をシグナル制御物質に接触させた後、当該免疫関連細胞を、所望の時間、培養してもよい。なお、当該培養の間、免疫関連細胞とシグナル制御物質とは、接触していてもよいし、接触していなくてもよい。なお、培養時間は、特に限定されず、１日〜３日であってもよく、１日〜７日であってもよく、７日以上であってもよい。

第１の観察工程では、顕微鏡等を用いて免疫関連細胞の一次繊毛を観察し、免疫関連細胞の一次繊毛の形成率を算出する。以下に、一次繊毛の形成率の算出方法、および、一次繊毛の観察方法の一例について説明する。

第１の観察工程では、指標の１つとして、免疫関連細胞における一次繊毛を観察して、一次繊毛数を算出することができる。一次繊毛数を算出する場合、例えば、（ａ）免疫関連細胞１個あたりの一次繊毛の数を算出してもよいし、（ｂ）所定の数の免疫関連細胞あたりの、一次繊毛を有する免疫関連細胞の割合を算出してもよいし、（ｃ）前記（ａ）及び（ｂ）の両方の算出を行ってもよい。また、検体に含まれる免疫関連細胞の全数は、検体中の核の全数として算出してもよい。

例えば、上述した（ａ）の場合、下記の式（Ｉ）にしたがって、［免疫関連細胞の一次繊毛の形成率］として、一次繊毛数を算出することができる；
［免疫関連細胞の一次繊毛の形成率］＝〔［検体に含まれる免疫関連細胞が有する一次繊毛の全数］／［検体に含まれる免疫関連細胞の全数］〕×１００ ・・・式（Ｉ）。

例えば、上述した（ｂ）の場合、下記の式（ＩＩ）にしたがって、［免疫関連細胞の一次繊毛の形成率］として、一次繊毛数を算出することができる；
［免疫関連細胞の一次繊毛の形成率］＝〔［検体に含まれる一次繊毛を有する免疫関連細胞の全数］／［検体に含まれる免疫関連細胞の全数］〕×１００ ・・・式（ＩＩ）。

一次繊毛の観察は、例えば、公知の免疫組織化学染色法によって行うことができる。具体的に、一次繊毛の観察は、被験検体含有試料（例えば、細胞をパラホルムアルデヒド等の固定化剤によって固定化したもの、被験検体をパラフィン包埋切片化したもの）と、一次繊毛に対する特異的結合物質（以下、「第１の特異的結合物質」と呼ぶ）とを接触させて、第１の特異的結合物質を被験検体含有試料に含まれる一次繊毛に結合させ、当該第１の特異的結合物質に結合した標識物質を検出することによって行うことができる。なお、被験検体含有試料の作製方法は、限定されず、公知の方法を用いることができる。

第１の特異的結合物質としては、一次繊毛のマーカーとなる物質に特異的に結合する物質（例えば、抗体（一次抗体））を挙げることができる。一次繊毛のマーカーとなる物質としては、例えば、ＡＤＰリボシル化因子様タンパク質（Ａｒｌ１３Ｂ）、アセチル化チューブリン、アデニル酸シクラーゼＩＩＩ、ネフロシスチン３（ＮＰＨＰ３）、鞭毛内輸送タンパク質（ＩＦＴ８８）、ソマトスタチンレセプター３（ｓｓｔｒ３）、ポリシステン−１（ＴＲＰＣ１）、一過性受容体電位バニロイド４（ＴＲＰＶ４）、血小板由来成長因子レセプターα（ＰＤＧＦＲα）、及びスムーズンド（Ｓｍｏ）を挙げることができる。

上述したように、第１の特異的結合物質としては、例えば、一次繊毛のマーカーとなる物質に特異的に結合する抗体を挙げることができる。当該抗体としては、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、及びこれら抗体の断片（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、及び単鎖抗体）を挙げることができる。

モノクローナル抗体は、例えば、免疫関連細胞の一次繊毛のマーカーに対するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを所望の培地中にて培養して培養上清を得、必要に応じて当該培養上清を精製することによって得ることができる。ハイブリドーマは、免疫関連細胞の一次繊毛のマーカーを動物（例えば、マウス、ラット）の静脈内、皮下、又は腹腔内に投与した後、当該動物から抗体産生細胞を得、当該抗体産生細胞とミエローマ細胞とを細胞融合させることによって得ることができる。

ポリクローナル抗体は、例えば、免疫関連細胞の一次繊毛のマーカーを動物（例えば、ウサギ）の静脈内、皮下、又は腹腔内に投与した後、当該動物から血清を得、必要に応じて当該血清を精製することによって得ることができる。

Ｆａｂフラグメントは、例えば、免疫関連細胞の一次繊毛のマーカーに対するモノクローナル抗体をパパインによって消化し、必要に応じて当該消化産物を精製することによって得ることができる。

Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントは、例えば、免疫関連細胞の一次繊毛のマーカーに対するモノクローナル抗体をペプシンによって消化し、必要に応じて当該消化産物を精製することによって得ることができる。

単鎖抗体は、例えば、免疫関連細胞の一次繊毛のマーカーに対するモノクローナル抗体の軽鎖の可変領域をコードする核酸と、リンカーをコードする核酸と、当該モノクローナル抗体の重鎖の可変領域をコードする核酸とを連結させた核酸構築物を含有するファージミドベクターを宿主細胞に導入し、当該宿主細胞内にて核酸構築物にコードされるポリペプチドを発現させ、必要に応じて当該ポリペプチドを精製することによって得ることができる。

前記標識物質は、蛍光、又は色などの検出可能なシグナルを生成できる物質（例えば、蛍光色素、酵素）であればよい。なお、当該標識物質は、第１の特異的結合物質と直接結合していてもよいし、第１の特異的結合物質に対する特異的結合物質（以下、「第２の特異的結合物質」と呼ぶ）と直接結合していてもよい。第２の特異的結合物質としては、例えば、第１の特異的結合物質に特異的に結合する物質（例えば、抗体（二次抗体））を挙げることができる。

標識物質としては、例えば、フルオレセインイソチオシアネート；２−（３−イミニオ−４，５−ジスルホナト−６−アミノ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）−５−［［５−（２，５−ジオキソ−３−ピロリン−１−イル）ペンチル］カルバモイル］安息香酸（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８）；６−（２−カルボキシラト−４−カルボキシフェニル）−１，２，１０，１１−テトラヒドロ−１，２，２，１０，１０，１１−ヘキサメチル−４，８−ビス−（スルホメチル）−１，１１−ジアザ−１３−オキソニアペンタセン（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４）；ペルオキシダーゼ；アルカリホスファターゼを挙げることができる。

第１の特異的結合物質に結合した標識物質の検出は、例えば、光学顕微鏡（例えば、蛍光顕微鏡、及び共焦点レーザー顕微鏡）、画像解析装置（例えば、蛍光イメージングアナライザー）、又はフローサイトメトリー装置（蛍光フローサイトメーター、及びイメージングフローサイトメーター）を用いて目視による検出や、蛍光強度などの数値による検出として行うことができる。

＜第２の観察工程＞
第２の観察工程では、免疫関連細胞を、第１の観察工程に用いたシグナル制御物質、および、試験試料に接触させた後、当該免疫関連細胞の一次繊毛を観察する。

第２の観察工程において、免疫関連細胞をシグナル制御物質および試験試料に接触させる方法は、特に限定されず、第１の観察工程と同じ方法を採用すればよい。免疫関連細胞をシグナル制御物質および試験試料に接触させる時間は、特に限定されず、第１の観察工程と同じ時間を採用すればよい。第２の観察工程では、第１の観察工程と同様に、免疫関連細胞をシグナル制御物質および試験試料に接触させた後、当該免疫関連細胞を、所望の時間、培養することが可能である。なお、第２の観察工程では、免疫関連細胞をシグナル制御物質および試験試料に、同時に接触させてもよいし、異なる時に接触させてもよい。

第２の観察工程で用いられる試験試料は、特に限定されず、例えば、無機化合物、有機化合物、植物抽出物、微生物抽出物、および各種細胞の培養上清を挙げることができる。被験試料は、そのままの状態にて用いられてもよく、溶媒に溶解された状態にて用いられてもよい。当該溶媒としては、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、および水を挙げることができる。

第２の観察工程では、顕微鏡等を用いて免疫関連細胞の一次繊毛を観察し、免疫関連細胞の一次繊毛の形成率を算出する。一次繊毛を観察方法、および、一次繊毛の形成率の算出方法は、第１の観察工程と同じ方法にしたがえばよい。

＜評価工程（１）＞
評価工程では、第１の観察工程の観察結果と、第２の観察工程の観察結果とを比較することによって、試験試料が免疫関連細胞の一次繊毛に及ぼす影響を評価する。

例えば、第１の観察工程において、一次繊毛の形成率が上昇するという結果が得られ、第２の観察工程において、一次繊毛の形成率が第１の観察工程の観察結果よりも上昇するという結果が得られたとする。この場合、試験試料は免疫関連細胞の一次繊毛を増加させる効果を有すると評価することができる。

第１の観察工程において、一次繊毛の形成率が下降するという結果が得られ、第２の観察工程において、一次繊毛の形成率が第１の観察工程の観察結果よりも上昇するという結果が得られたとする。この場合、試験試料は免疫関連細胞の一次繊毛を増加させる効果を有すると評価することができる。

例えば、第１の観察工程において、一次繊毛の形成率が上昇するという結果が得られ、第２の観察工程において、一次繊毛の形成率が第１の観察工程の観察結果よりも下降するという結果が得られたとする。この場合、試験試料は免疫関連細胞の一次繊毛を減少させる効果を有すると評価することができる。

第１の観察工程において、一次繊毛の形成率が下降するという結果が得られ、第２の観察工程において、一次繊毛の形成率が第１の観察工程の観察結果よりも下降するという結果が得られたとする。この場合、試験試料は免疫関連細胞の一次繊毛を減少させる効果を有すると評価することができる。

例えば、第１の観察工程において、一次繊毛の形成率が上昇するという結果が得られ、第２の観察工程において、一次繊毛の形成率が第１の観察工程の観察結果と略同じという結果が得られたとする。この場合、試験試料は免疫関連細胞の一次繊毛を増減させる効果を有していない、または、シグナル制御物質は一次繊毛を有する免疫関連細胞の数および／または割合が変化（増加または減少）することを抑制するものである、と評価することができる。

第１の観察工程において、一次繊毛の形成率が変化しないという結果が得られ、第２の観察工程において、一次繊毛の形成率が第１の観察工程の観察結果と略同じという結果が得られたとする。この場合、試験試料は免疫関連細胞の一次繊毛を増減させる効果を有していない、または、シグナル制御物質は一次繊毛を有する免疫関連細胞の数および／または割合が変化（増加または減少）することを抑制するものである、と評価することができる。

第１の観察工程において、一次繊毛の形成率が下降するという結果が得られ、第２の観察工程において、一次繊毛の形成率が第１の観察工程の観察結果と略同じという結果が得られたとする。この場合、試験試料は免疫関連細胞の一次繊毛を増減させる効果を有していない、または、シグナル制御物質は一次繊毛を有する免疫関連細胞の数および／または割合が変化（増加または減少）することを抑制するものである、と評価することができる。

＜評価工程（２）＞
さらに、前記評価工程における評価結果に基づいて、前記試験試料が前記免疫関連細胞における、ＪＮＫ、ＤＳＧ１およびＣＬＤＮ４からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質の発現に及ぼす影響を評価する評価工程、を有していてもよい。すなわち、本評価工程では、前記試験試料が前記免疫関連細胞の一次繊毛に及ぼす影響に関する評価結果に基づいて、ＪＮＫ、ＤＳＧ１およびＣＬＤＮ４からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質の発現に及ぼす影響を評価することになる。

上述のとおり、免疫関連細胞の一次繊毛と、ＪＮＫ、ＤＳＧ１およびＣＬＤＮ４の発現とは相関するため、前記試験試料がこれらタンパク質の発現について及ぼす影響も評価することができる。

より具体的には、例えば、（ｉ）前記試験試料が一次繊毛を増加させるとの評価結果が得られた場合、前記試験試料が特定のタンパク質（例えば、ＪＮＫ）の発現量を増加させ得ると評価、（ｉｉ）前記試験試料が一次繊毛を増加させるとの評価結果が得られた場合、特定のタンパク質（例えば、ＤＳＧ１およびＣＬＤＮ４）の発現量を減少させ得ると評価、（ｉｉｉ）前記試験試料が一次繊毛を減少させるとの評価結果が得られた場合、前記試験試料が特定のタンパク質（例えば、ＤＳＧ１およびＣＬＤＮ４）の発現量を増加させ得ると評価、（ｉｖ）前記試験試料が一次繊毛を減少させるとの評価結果が得られた場合、前記試験試料が特定のタンパク質（例えば、ＪＮＫ）の発現量を減少させ得ると評価、する方法であってもよい。

本評価工程によれば、前記試験試料の免疫関連細胞における一次繊毛へ及ぼす影響を評価できるだけでなく、免疫関連細胞の一次繊毛に関連するタンパク質の発現量に及ぼす影響についても評価することができる。

本発明の実施例について、以下に説明する。

＜１．ＨａＣａｔ細胞の一次繊毛に与える各サイトカインの影響＞
ＨａＣａｔ細胞（ヒト表皮角化細胞株）を培養している培地に、Ｔｈ１サイトカイン（ＩＬ−１β、ＴＮＦα、ＩＦＮγ）、Ｔｈ１７サイトカイン（ＩＬ−１７Ａ）、Ｔｈ２２サイトカイン（ＩＬ−２２）、または、Ｔｈ２サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＬ−３１、ＩＬ−３３）を加えた。なお、培地中の各サイトカインの濃度は、図１に示す濃度に調節した。なお、図１中の「ｃｔｒｌ」は、培地にサイトカインを加えていない試験に対応している。培地に各サイトカインを加えた後、サイトカイン存在下にて、ＨａＣａｔ細胞を４８時間培養した。

４８時間の培養の後、ＨａＣａｔ細胞を、一次繊毛のマーカー蛋白質であるＡｒｌ１３Ｂを認識する抗体を用いて染色した。

具体的に、ＨａＣａｔ細胞をＰＢＳ（phosphate buffered saline）溶液にて洗浄した後、当該ＨａＣａｔ細胞を、４％パラホルムアルデヒドを含有するＰＢＳ溶液中に浸して固定化処理を行った。次いで、当該ＨａＣａｔ細胞を、界面活性剤含有ＰＢＳ溶液中に浸して透過処理を行った。

洗浄後のＨａＣａｔ細胞と、抗Ａｒｌ１３Ｂ抗体〔ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ社製、商品名：Ａｒｌ１３Ｂ Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ、品番：１７７１１−１−ＡＰ〕とを、一晩４℃にて反応させた。

反応後のＨａＣａｔ細胞を、界面活性剤含有ＰＢＳ溶液を用いて洗浄した。洗浄後のＨａＣａｔ細胞と、蛍光色素にて標識された抗ラビットＩｇＧ抗体〔サーモフィッシャー社製、商品名：Ｄｏｎｋｅｙ Ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ Ｈ＆Ｌ（蛍光色素：Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４、カタログナンバー：Ａ−２１２０７）〕と、核染色剤Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２〔サーモフィッシャー社製、商品名：Hoechst 33342,
Trihydrochloride, Trihydrate - 10 mg/mL Solution in Water、品番：H3570〕とを、室温（２５℃）にて１時間反応させることによって、ＨａＣａｔ細胞を染色した。染色後のサンプルを、界面活性剤含有ＰＢＳ溶液を用いて洗浄した。

洗浄後のＨａＣａｔ細胞を、共焦点顕微鏡〔オリンパス（株）製、品番：ＦＶ１２００〕を用いて観察し、５カ所の観察視野の画像を取得した。画像中に含まれる細胞核の数と、一次繊毛の数と、をそれぞれ測定した。その後、式（Ｉａ）にしたがって、ＨａＣａｔ細胞の一次繊毛の形成率を算出し、算出した値から平均値を計算した；
［一次繊毛の形成率］＝［画像中の一次繊毛の数］／［画像中の全細胞核数］×１００
・・・・・（Ｉａ）。

図１に、試験結果を示す。図１から明らかなように、Ｔｈ２サイトカイン、Ｔｈ１７サイトカイン、およびＴｈ２２サイトカインは、一次繊毛の形成率を著しく上昇させた。

＜２．ＨａＣａｔ細胞の一次繊毛に与える各サイトカインの影響＞
ＨａＣａｔ細胞（ヒト表皮角化細胞株）を培養している培地に、Ｔｈ２サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−１３）、または、ＴＮＦαを加えた。なお、培地中の各サイトカインの濃度は、図２に示すように、１０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、または、２００ｎｇ／ｍＬに調節した。なお、図２中の「ｃｔｒｌ」は、培地にサイトカインを加えていない試験に対応している。培地に各サイトカインを加えた後、サイトカイン存在下にて、ＨａＣａｔ細胞を４８時間培養した。

以降の試験は、上述した＜１＞と同様の試験方法に従って行い、ＨａＣａｔ細胞を染色した後、一次繊毛の形成率を計算した。

図２に、試験結果を示す。図２から明らかなように、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、および、ＩＬ−３１は、一次繊毛の形成率を著しく上昇させた。特に、ＩＬ−１３、および、ＩＬ−３１は、サイトカインの濃度に依存して、一次繊毛の形成率を上昇させた。一方、ＴＮＦαは、一次繊毛の形成率を上昇させなかった。

また、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＬ−３１、および、ＴＮＦαの各々は、アトピー性皮膚炎にて発現が上昇するサイトカインである。このことは、アトピー性皮膚炎と、特定のサイトカインの発現量と、一次繊毛の形成率とが、関連性を有していることを示唆している。

＜３．ＨａＣａｔ細胞の一次繊毛に与えるサイトカインの混合物の影響＞
ＨａＣａｔ細胞（ヒト表皮角化細胞株）を培養している培地に、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、およびＴＮＦαの混合物を加えた。なお、培地中の各サイトカインの濃度は、図３に示すように、１ｎｇ／ｍＬ、または、２ｎｇ／ｍＬに調節した。なお、図３中の「ｃｔｒｌ」は、培地にサイトカインを加えていない試験に対応している。培地にサイトカインの混合物を加えた後、サイトカイン存在下にて、ＨａＣａｔ細胞を４８時間培養した。

以降の試験は、上述した＜１＞と同様の試験方法に従って行い、ＨａＣａｔ細胞を染色した後、一次繊毛の形成率を計算した。

図３に、試験結果を示す。図３から明らかなように、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、およびＴＮＦαの混合物は、サイトカインの濃度が低濃度であっても、一次繊毛の形成率が著しく上昇した。このことは、各サイトカインの相乗効果によって、一次繊毛の形成率が著しく上昇したことを示唆している。

＜４．初代ヒト表皮角化細胞の一次繊毛に与える各サイトカインの影響＞
初代ヒト表皮角化細胞を培養している培地に、Ｔｈ１サイトカイン（ＩＬ−１β、ＴＮＦα、ＩＦＮγ）、Ｔｈ１７サイトカイン（ＩＬ−１７Ａ）、Ｔｈ２２サイトカイン（ＩＬ−２２）、または、Ｔｈ２サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＬ−３１、ＩＬ−３３）を加えた。なお、培地中の各サイトカインの濃度は、図４に示す濃度に調節した。なお、図４中の「ｃｔｒｌ」は、培地にサイトカインを加えていない試験に対応している。培地に各サイトカインを加えた後、サイトカイン存在下にて、初代ヒト表皮角化細胞を４８時間培養した。

以降の試験は、上述した＜１＞と同様の試験方法に従って行い、初代ヒト表皮角化細胞を染色した後、一次繊毛の形成率を計算した。

図４に試験結果を示す。図４から明らかなように、Ｔｈ２サイトカイン、Ｔｈ１７サイトカイン、およびＴｈ２２サイトカインは、一次繊毛の形成率を著しく上昇させた。

＜５．初代ヒト表皮角化細胞の一次繊毛に与える各サイトカイン、および、サイトカインの混合物の影響＞
初代ヒト表皮角化細胞を培養している培地に、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、ＩＬ−３１、または、これらの混合物を加えた。なお、培地中の各サイトカインの濃度は、図５に示す濃度に調節した。なお、図５中の「ｃｔｒｌ」は、培地にサイトカインを加えていない試験に対応している。培地に各サイトカインを加えた後、サイトカイン存在下にて、初代ヒト表皮角化細胞を４８時間培養した。

以降の試験は、上述した＜１＞と同様の試験方法に従って行い、初代ヒト表皮角化細胞を染色した後、一次繊毛の形成率を計算した。

図５に、試験結果を示す。図５から明らかなように、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、および、ＩＬ−３１は、一次繊毛の形成率を著しく上昇させた。

また、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、および、ＩＬ−３１の各々は、アトピー性皮膚炎にて発現が上昇するサイトカインである。このことは、アトピー性皮膚炎と、特定のサイトカインの発現量と、一次繊毛の形成率とが、関連性を有していることを示唆している。

＜６．一次繊毛の調整が、ＪＮＫ、ＤＳＧ１、ＣＬＤＮ４の発現に与える影響＞
本試験では、ＩＬ−１３を用いて、一次繊毛の形成を誘導した。一方、本試験では、ＩＦＴ８８（intraflagellar transport protein 88）のｍＲＮＡの発現を阻害するｓｉＲＮＡであるｓｉＩＦＴ８８（Thermo Fisher Scientific社製）を用いて、一次繊毛の形成を阻害した。ｓｉＩＦＴ８８のコントロールとしては、特定の遺伝子の発現を阻害することのないｓｉＣＴＲＬ（Ｓｉｌｅｎｃｅｒ^ＴＭ Ｎｏ．２、Thermo Fisher Scientific社製）を用いた。

正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ：Normal Human Epidermal Keratinocyte）を、ウェルプレート上に、ウェルプレート表面の面積の約５０〜６０％を覆う密度にて播種した。

ＮＨＥＫを播種してから１６〜１８時間後に、ＮＨＥＫを培養する培地を、Lipofectamine（Thermo Fisher Scientific社製）およびｓｉＩＦＴ８８（最終濃度３０ｎＭ）を含む培地に交換し、当該培地中でＮＨＥＫを６時間培養した。６時間の培養の後、培地を、LipofectamineおよびｓｉＩＦＴ８８を含まない培地に交換した。当該処理によって、ＩＦＴ８８がノックダウンされたＮＨＥＫを得た。また、コントロールとして、ｓｉＩＦＴ８８の代わりにｓｉＣＴＲＬを用いた試験を行った。

ノックダウンの１日後、ＮＨＥＫを培養する培地を、ＩＬ−１３を５０ｎｇ／ｍＬの濃度にて含む培地、ＩＬ−１３を１００ｎｇ／ｍＬの濃度にて含む培地、または、ＩＬ−１３を含まない培地に交換した。

培地を交換してから６、１２、２４、４８時間後に、それぞれ細胞を回収した。回収した細胞を、冷やしたＤＰＢＳ（Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline）を用いて洗浄した後、当該細胞を、プロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤を含むＲＩＰＡバッファー中に溶解させて、細胞溶解液を得た。

当量のタンパク質を含む各細胞溶解液を、１０％ポリアクリルアミドゲル内に充填し、電気泳動させた後、ポリアクリルアミドゲル内で分離されたタンパク質をＰＶＤＦ膜上に転写した。

当該ＰＶＤＦ膜上に転写されたＪＮＫ、ＤＳＧ１、および、ＣＬＤＮ４をウエスタンブロット法にて検出し、検出結果に基づいて、ＪＮＫ、ＤＳＧ１、および、ＣＬＤＮ４を定量した。

１次抗体として、抗リン酸化ＪＮＫ抗体を用いた。また、タンパク質を定量化するための基準となるＧＡＰＤＨを検出するために、抗ＧＡＰＤＨ抗体を用いた。目的のタンパク質が転写されたＰＶＤＦ膜と、各抗体とを４℃で一晩接触させた後、当該ＰＶＤＦ膜をＴＢＳＴで洗浄した。

２次抗体として、ＨＲＰが結合した２次抗体を用いた。ＴＢＳＴで洗浄したＰＶＤＦ膜と、２次抗体とを接触させた後、当該ＰＶＤＦ膜をＴＢＳＴで洗浄した。

ＴＢＳＴで洗浄したＰＶＤＦ膜と、ＨＲＰの基質とを接触させることによって、ＰＶＤＦ膜に転写された目的のタンパク質をバンドとして画像化した。バンドの強度を数値化し、統計的に分析した。

また、１次抗体として抗ＤＳＧ１抗体または抗ＣＬＤＮ４抗体を用いた試験を同様に行った。このとき、タンパク質を定量化するための基準となるアクチンを検出するために、抗アクチン抗体を用いた。このとき用いたＮＨＥＫは、ＩＬ−１３を１００ｎｇ／ｍＬ含む培地による刺激を４８時間行ったＮＨＥＫである。

図６は、１次抗体として抗リン酸化ＪＮＫ抗体を用いた試験の結果である。図７は、１次抗体として抗ＣＬＤＮ４抗体を用いた試験の結果である。図８は、１次抗体として抗ＤＳＧ１抗体を用いた試験の結果である。

図６の「ｓｉＣＴＲＬ」、「ｓｉＣＴＲＬ＋ＩＬ−１３ ５０ｎｇ／ｍｌ」および「ｓｉＣＴＲＬ＋ＩＬ−１３ １００ｎｇ／ｍｌ」の試験結果の比較から明らかなように、一次繊毛を増加させると、ＪＮＫの発現量が増加した。

図６の「ｓｉＣＴＲＬ＋ＩＬ−１３ ５０ｎｇ／ｍｌ」および「ｓｉＩＦＴ８８＋ＩＬ−１３ ５０ｎｇ／ｍｌ」の試験結果の比較、並びに、「ｓｉＣＴＲＬ＋ＩＬ−１３ １００ｎｇ／ｍｌ」および「ｓｉＩＦＴ８８＋ＩＬ−１３ １００ｎｇ／ｍｌ」の試験結果の比較から明らかなように、一次繊毛を減少させると、ＪＮＫの発現量が減少した。

図７および図８の「ｓｉＣＴＲＬ」および「ｓｉＣＴＲＬ＋ＩＬ−１３」の試験結果の比較から明らかなように、一次繊毛を増加させると、ＤＳＧ１およびＣＬＤＮ４の発現量が減少した。

図７および図８の「ｓｉＣＴＲＬ」および「ｓｉＩＦＴ８８」の試験結果の比較から明らかなように、一次繊毛を減少させると、ＤＳＧ１およびＣＬＤＮ４の発現量が増加した。

なお、図７および図８では、細胞をｓｉＩＦＴ８８およびＩＬ−１３の両方で刺激すると、ＤＳＧ１およびＣＬＤＮ４の発現量は、細胞をｓｉＩＦＴ８８およびＩＬ−１３で刺激していない場合の発現量と略同じになった（「ｓｉＣＴＲＬ」および「ｓｉＩＦＴ８８＋ＩＬ−１３」の試験結果の比較）。

したがって、一次繊毛の調整によって、免疫関連細胞の一次繊毛だけでなく、免疫関連細胞の一次繊毛に関連するタンパク質の発現量も調整可能であることが示された。

本発明は、免疫関連細胞の一次繊毛の調整方法および調整剤、並びに、試験試料の評価方法として好適に利用することができる。特許文献１に記載のとおり、免疫関連細胞の一次繊毛と免疫関連疾患とが相関していることから、免疫関連細胞の一次繊毛を調整する本発明によれば、例えば、免疫関連疾患の指標の検出、免疫関連疾患の罹患の有無の診断の補助または免疫関連疾患の予後の診断の補助、免疫関連疾患の治療または免疫関連疾患抑制剤による免疫関連疾患に対する抑制効果の評価ならびに被験試料が免疫機能制御作用を有する物質であるかどうかの評価を行なうことができる。また、免疫関連細胞の一次繊毛は、免疫関連細胞の増殖および免疫関連疾患に関与していることから、免疫関連細胞の一次繊毛の形成を制御することにより、免疫機能の制御を行なうこともできる。したがって、本発明は、免疫関連疾患の検査、免疫関連疾患の罹患の有無の診断の補助または免疫関連疾患の予後の診断の補助、免疫関連疾患の治療薬の開発、免疫関連疾患を抑制するための医薬部外品または化粧料成分の開発などに用いられることが期待されるものである。

Claims (6)

1. 免疫関連細胞を、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される少なくとも１種のサイトカインのシグナル伝達経路を活性化または不活性化させるシグナル制御物質に接触させる接触工程を有する、免疫関連細胞の一次繊毛の調整方法。
   （ａ）Ｔｈ２サイトカイン
   （ｂ）Ｔｈ１７サイトカイン
   （ｃ）Ｔｈ２２サイトカイン
2. 請求項１に記載の免疫関連細胞の一次繊毛の調整方法を工程の１つとして有する、免疫関連細胞における、ＪＮＫ、ＤＳＧ１およびＣＬＤＮ４からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質の発現の調整方法。
3. 以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される少なくとも１種のサイトカインのシグナル伝達経路を活性化または不活性化させるシグナル制御物質を含有する、免疫関連細胞の一次繊毛の調整剤。
   （ａ）Ｔｈ２サイトカイン
   （ｂ）Ｔｈ１７サイトカイン
   （ｃ）Ｔｈ２２サイトカイン
4. 請求項３に記載の免疫関連細胞の一次繊毛の調整剤を含有する、免疫関連細胞における、ＪＮＫ、ＤＳＧ１およびＣＬＤＮ４からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質の発現の調整剤。
5. 免疫関連細胞を、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される少なくとも１種のサイトカインのシグナル伝達経路を活性化または不活性化させるシグナル制御物質に接触させた後、当該免疫関連細胞の一次繊毛を観察する、第１の観察工程と、
   前記免疫関連細胞を、前記第１の観察工程に用いた前記シグナル制御物質、および、試験試料に接触させた後、当該免疫関連細胞の一次繊毛を観察する、第２の観察工程と、
   前記第１の観察工程の観察結果と、前記第２の観察工程の観察結果とを比較することによって、前記試験試料が前記免疫関連細胞の一次繊毛に及ぼす影響を評価する評価工程と、を有する、試験試料の評価方法。
   （ａ）Ｔｈ２サイトカイン
   （ｂ）Ｔｈ１７サイトカイン
   （ｃ）Ｔｈ２２サイトカイン
6. さらに、前記評価工程における評価結果に基づいて、前記試験試料が前記免疫関連細胞における、ＪＮＫ、ＤＳＧ１およびＣＬＤＮ４からなる群より選択される少なくとも１種のタンパク質の発現に及ぼす影響を評価する評価工程と、を有する、請求項５に記載の試験試料の評価方法。

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