WO2023013763A1 - がんの治療剤 - Google Patents

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WO2023013763A1
WO2023013763A1 PCT/JP2022/030084 JP2022030084W WO2023013763A1 WO 2023013763 A1 WO2023013763 A1 WO 2023013763A1 JP 2022030084 W JP2022030084 W JP 2022030084W WO 2023013763 A1 WO2023013763 A1 WO 2023013763A1
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cancer
cells
administration
antibody
immune checkpoint
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PCT/JP2022/030084
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Inventor
義正 田中
公則 木村
Original Assignee
国立大学法人 長崎大学
東京都
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    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the present invention relates to a therapeutic agent for cancer comprising a combination of a T-cell growth factor such as interleukin-2 (IL-2), interleukin-18 (IL-18), and an immune checkpoint inhibitor.
  • a T-cell growth factor such as interleukin-2 (IL-2), interleukin-18 (IL-18), and an immune checkpoint inhibitor.
  • Liver cancer is mainly non-drug therapy such as liver resection, liver transplantation, local puncture therapy, and hepatic artery chemoembolization (TACE).
  • Drug therapy with growth factor (VEGF) inhibitors such as sorafenib and lenvatinib has been performed, but the response rate of the latest drug lenvatinib is about 40%.
  • VEGF growth factor
  • anti-PD-1 antibodies nivolumab, pembrolizumab
  • the controlled phase III trial did not meet its primary endpoints of overall survival and progression-free survival.
  • Concomitant use with VEGF inhibitors is also being studied, but the response rate in combination with pembrolizumab and lenvatinib remains at about 60%, and it cannot be said that there is sufficient effect yet.
  • IL-18 markedly enhances proliferation of NK cells, CD8-positive killer T cells (CTL), ⁇ T cells, and the like.
  • CTL CD8-positive killer T cells
  • administration of IL-18 alone did not show sufficient efficacy in a phase II trial against metastatic melanoma.
  • the research group of the present inventors previously reported that the combined use of IL-18 with immune checkpoint inhibitors increased NK cells (helper NK cells) and CTLs, which are expected to enhance acquired immunity, and increased immune check. It has been reported that the antitumor effect of point inhibitors is enhanced (Patent Document 1, Non-Patent Document 1).
  • IL-2 is produced by activated T cells, NK cells, dendritic cells, etc., and causes the proliferation and activation of tumoricidal cells such as CTL and NK cells. It is clinically used for the treatment of metastatic renal cancer, malignant melanoma, etc. in combination with activated NK cells (Non-Patent Document 2).
  • the present inventors found that culturing peripheral blood-derived NK cells in combination with IL-18 and IL-2 markedly promoted the proliferation and activation of NK cells (Non-Patent Document 3).
  • cytokines that have an immunostimulatory effect may also have the effect of promoting tumor growth.
  • IL-2 induces differentiation and activation of Th1, Th2, Th17, and regulatory T cells (Treg) from naive T cells. Whether or not the effect is reproducible is completely unpredictable.
  • IL-18 has both an antitumor effect and a tumor growth-promoting effect (Non-Patent Document 4).
  • IL-18BP IL-18-binding protein
  • the expression of is further increased (Non-Patent Document 5). Therefore, it is unknown how effective the combined use of an immune checkpoint inhibitor and IL-18 will be in actual human clinical practice.
  • An object of the present invention is to provide a novel and effective cancer immunotherapeutic agent that exhibits therapeutic effects against refractory cancers, especially cancers for which immune checkpoint inhibitors alone or in combination with other agents are ineffective. to provide.
  • Spontaneous mice have been used as a model of liver cancer that is difficult to treat, but there are few effective therapeutic agents against this model, and lenvatinib, a standard first-line treatment for advanced hepatocellular carcinoma, is also ineffective.
  • the present inventors used spontaneous hepatocellular carcinoma model mice (Mdr2 KO mice) deficient in the mdr2 gene that encodes P-glycoprotein, and used a peritoneal dissemination model by colon cancer cell transfer and a melanoma cell transfer model.
  • tumor size tended to increase, suggesting that the combined use of immune checkpoint inhibitors and IL-18 is not effective against refractory liver cancer. Therefore, as a result of extensive studies, the present inventors found that administration of a T cell growth factor (e.g., IL-2) in addition to the above two drugs to Mdr2 KO mice tended to reduce tumor size. found to show. Combined use of an immune checkpoint inhibitor and IL-2 resulted in an increase in tumor size, and sufficient therapeutic effects were not obtained. The triple combination significantly reduced serum levels of the tumor marker alpha-fetoprotein (AFP) compared with any double combination.
  • AFP tumor marker alpha-fetoprotein
  • the triple drug combination significantly increased the production of anti-tumor cytokines (interferon-gamma (IFN- ⁇ ) and tumor necrosis factor- ⁇ (TNF- ⁇ )), which was higher than any double drug combination. showed a trend.
  • IFN- ⁇ interferon-gamma
  • TNF- ⁇ tumor necrosis factor- ⁇
  • the effects of the three-drug combination including tumor shrinkage, decreased AFP levels, and increased IFN- ⁇ /TNF- ⁇ production, were abrogated by the administration of anti-CD8 antibody. T cells were considered important.
  • the anti-asialo-GM1 antibody abrogated the tumor shrinkage effect of the three-drug combination, suggesting the involvement of NK cells in the therapeutic effect of the three-drug combination.
  • [Section 1] A therapeutic agent for cancer comprising a combination of an immune checkpoint inhibitor, interleukin-18 (IL-18) and a T cell growth factor.
  • the T cell growth factor is one or more cytokines selected from the group consisting of interleukin-2 (IL-2), interleukin-15 (IL-15) and interleukin-7 (IL-7), [ Item 1].
  • IL-2 interleukin-2
  • IL-15 interleukin-15
  • IL-7 interleukin-7
  • the immune checkpoint inhibitor is one or more antibodies selected from the group consisting of anti-PD-L1 antibody, anti-PD-1 antibody, anti-CTLA4 antibody, anti-LAG-3 antibody and anti-TIM-3 antibody [Section 1] to [Item 3], the agent according to any one of items.
  • [Section 5] The agent according to any one of [1] to [4] for cancer resistant to immune checkpoint inhibitor monotherapy or combination therapy with immune checkpoint inhibitor and IL-18.
  • [Section 6] The agent according to any one of [1] to [5], which is administered to a subject whose serum IL-18 binding protein (IL-18BP) level is 10 pg/mL or higher.
  • IL-18BP serum IL-18 binding protein
  • the agent according to any one of [1] to [6], wherein the cancer is inflammation-associated cancer.
  • [Item 8] The agent according to [7], wherein the inflammation-related cancer is gastrointestinal cancer.
  • a combined cancer immunotherapeutic agent is provided that is effective against intractable cancers such as liver cancer, particularly cancers for which immune checkpoint inhibitors alone or in combination with other drugs are ineffective. be done.
  • FIG. 2 schematically shows the drug administration and test schedules for Mdr2 KO mice.
  • Baseline at the start of administration, 4W: 4 weeks after the start of administration.
  • the lower right is a photograph of the liver excised 4 weeks after the start of administration.
  • the lower right is a photograph of the liver excised 4 weeks after the start of administration.
  • FIG. 2 shows serum AFP levels (ng/mL).
  • IFN- ⁇ and TNF- ⁇ levels (ng/mL) in the serum of Mdr2 KO mice in each administration group 4 weeks after the start of administration, and 3 drugs (anti-PD-L1 antibody, IL-18 and IL-2)
  • Representative examples of CT images showing that the tumor reduction effect in Mdr2 KO mice by administration of three drugs (anti-PD-L1 antibody, IL-18 and IL-2) is abolished by removal of NK cells.
  • Baseline at the start of administration, 4W: 4 weeks after the start of administration.
  • the lower right is a photograph of the liver excised 4 weeks after the start of administration. Representative examples of CT images showing that the tumor reduction effect in Mdr2 KO mice by administration of three drugs (anti-PD-L1 antibody, IL-18 and IL-2) is abolished by removal of CD8-positive T cells.
  • the lower right is a photograph of the liver excised 4 weeks after the start of administration.
  • FIG. 10 shows serum IL-18BP levels (pg/mg) at the start of administration (Baseline) and 4 weeks after the start of administration (4W) in Mdr2 KO mice of the (PBS administration) group.
  • FIG. 4 shows that the reduction of serum IL-18BP level in Mdr2 KO mice by administration of three drugs (anti-PD-L1 antibody, IL-18 and IL-2) is abrogated by removal of CD8-positive T cells.
  • FIG. 2 shows serum IL-18BP levels (pg/mL) in hepatocellular carcinoma patients (HCC), intrahepatic cholangiocarcinoma patients (CCC) and healthy volunteers.
  • FIG. 2 shows serum IL-18 levels (pg/mL) in hepatitis C virus (HCV)-positive hepatocellular carcinoma patients (HCC), chronic hepatitis patients (CH), liver cirrhosis patients (LC), and healthy volunteers.
  • HCC hepatitis C virus
  • CH chronic hepatitis patients
  • LC liver cirrhosis patients
  • the present invention provides a therapeutic agent for cancer (hereinafter also referred to as "combination agent of the present invention”), which is a combination of an immune checkpoint inhibitor, IL-18, and a T-cell growth factor. That is, the combination drug of the present invention is a combined cancer immunotherapeutic agent containing (a) an immune checkpoint inhibitor, (b) IL-18, and (c) a T cell growth factor as active ingredients.
  • Immune checkpoint inhibitor refers to an immunosuppressive co-stimulatory molecule (immune checkpoint molecule) expressed on T cells or NK cells. , means a drug that inhibits binding to ligands expressed on cancer cells or antigen-presenting cells, blocks transmission of immunosuppressive signals, and releases suppression of T cell or NK cell activation.
  • Immune checkpoint inhibitors used as active ingredients of the combination drug of the present invention include inhibitory co-stimulatory molecules expressed on T cells or NK cells (e.g., PD-1, CTLA4, TIM-3, LAG-3 , TIGIT, CD96, BTLA, VISTA, KIR, etc.) to bind to their ligands (e.g. PD-L1, PD-L2, CD80/86, CEACAM1, Galectin-9, MHC class-II molecules, LSECtin, Galectin -3, CD155, CD112, CD113, CD111, HVEM, VSIG3, etc.), or a substance that binds to the ligand and inhibits binding to immune checkpoint molecules, is not particularly limited.
  • ligands e.g. PD-L1, PD-L2, CD80/86, CEACAM1, Galectin-9, MHC class-II molecules, LSECtin, Galectin -3, CD155, CD112, CD113, CD111,
  • blocking antibodies against immune checkpoint molecules or their ligands can be mentioned.
  • anti-PD-1 antibody, anti-PD-L1 antibody, anti-CTLA4 antibody, anti-PD-L2 antibody, anti-TIM-3 antibody, anti-LAG-3 antibody, anti-KIR antibody, etc. more preferably anti-PD-1 antibody , anti-PD-L1 antibody, anti-CTLA4 antibody, and the like.
  • Antibodies against immune checkpoint molecules or their ligands may be either polyclonal antibodies or monoclonal antibodies, preferably monoclonal antibodies. These antibodies can be produced according to a known antibody or antiserum production method. Although the isotype of the antibody is not particularly limited, IgG, IgM or IgA is preferred, and IgG is particularly preferred. Since the Fc regions of IgG1 and IgG2 have effector functions such as ADCC, ADCP, and CDC, they can be preferably used in antibodies targeting ligands expressed in cancer cells. On the other hand, IgG4 has low effector function, so it can be preferably used in antibodies targeting immune checkpoint molecules expressed on T cells and NK cells. CTLA4 is also strongly expressed in regulatory T cells (Treg), and anti-CTLA4 antibodies of the IgG1 and IgG2 subtypes can also be used in anticipation of removing Treg.
  • Treg regulatory T cells
  • Antibodies against immune checkpoint molecules or their ligands are not particularly limited as long as they have at least a complementarity determining region (CDR) for specifically recognizing and binding to a target antigen.
  • CDR complementarity determining region
  • Fab', F(ab') 2 , etc. genetically engineered conjugate molecules such as scFv, scFv-Fc, minibodies, diabodies, etc., or protein stabilizing effects such as polyethylene glycol (PEG) It may be a derivative thereof modified with a molecule or the like having
  • an antibody against an immune checkpoint molecule or its ligand is used as a pharmaceutical for administration to humans, so the antibody (preferably monoclonal antibody) exhibits antigenicity when administered to humans.
  • Risk-reduced antibodies specifically fully human antibodies, humanized antibodies, mouse-human chimeric antibodies, and the like, with fully human antibodies being particularly preferred.
  • Humanized antibodies and chimeric antibodies can be produced by genetic engineering according to standard methods.
  • fully human antibodies can be produced from human-human (or mouse) hybridomas, human antibody-producing mice and phage display methods are used in order to stably provide large amounts of antibodies at low cost. It is desirable to manufacture using
  • nivolumab As an anti-PD-1 antibody, nivolumab (Opdivo (registered trademark)), pembrolizumab (Keytruda (registered trademark)), AMP-514 (MEDI0680), vigilizumab (CT-011), etc.
  • an anti-PD-L1 antibody As an anti-PD-L1 antibody, atezolizumab (RG7446, MPDL3280A), durvalumab (MEDI4736), avelumab (PF-06834635, MSB0010718C), BMS-936559 (MDX1105), etc.
  • Anti-CTLA4 antibody, ipilimumab (Yervoy (registered trademark)), tremelimumab, etc., anti-TIM-3 antibody Examples include MBG453 and the like, anti-LAG-3 antibodies such as BMS-986016 and LAG525, and anti-KIR antibodies such as lililumab.
  • fragments containing a portion e.g., extracellular domain
  • substances conjugated to the fragments with molecules capable of removing immune-compromised effector cells can be done.
  • a fusion protein eg, AMP-224, etc.
  • a substance that binds to an immune checkpoint molecule and inhibits binding to its ligand may also be an antagonist that binds to the immune checkpoint molecule competitively with the ligand.
  • Such antagonists can be obtained by constructing a competitive assay system using an immune checkpoint molecule and its ligand and screening a compound library.
  • the combination drug of the present invention can be used in combination with any one of the above immune checkpoint inhibitors or two or more.
  • IL-18 IL-18 is a pro-inflammatory cytokine belonging to the IL-1 family and promotes IFN- ⁇ production by T cells and NK cells.
  • Human IL-18 is produced as an inactive 192-amino acid precursor (pro-IL-18), but activation of a protein complex called the inflammasome by PAMPs and DAMPs activates caspase-1.
  • pro-IL-18 is processed by its enzymatic activity to generate an active mature IL-18 consisting of 157 amino acids.
  • the amino acid sequence information of human IL-18 can be referred to, for example, UniProtKB (accession number: Q14116).
  • the amino acid sequence of human mature IL-18 is shown in SEQ ID NO:2.
  • the IL-18 used as the active ingredient of the combination drug of the present invention is a protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2.
  • IL-18 is regulated by IL-18-producing cells (e.g., macrophages, dendritic cells, microglia, synovium) of humans and other mammals (e.g., rats, mice, monkeys, dogs, cows, rabbits, pigs, sheep, etc.). fibroblasts, epithelial cells, etc.) or proteins isolated and purified from tissues containing them.
  • IL-18-producing cells e.g., macrophages, dendritic cells, microglia, synovium
  • mammals e.g., rats, mice, monkeys, dogs, cows, rabbits, pigs, sheep, etc.
  • fibroblasts, epithelial cells, etc. or proteins isolated and purified from tissues containing them.
  • It may also be a protein chemically synthesized or biochemically synthesized in a cell-free translation system, or a recombinant protein produced from a transformant introduced with a nucleic acid having a nucleotide sequence encoding the above amino acid sequence. It may be a protein.
  • amino acid sequence that is substantially identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2 is 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and particularly preferably 97% of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2.
  • amino acid sequences having 98% or more identity are most preferred.
  • identity refers to the optimal alignment when two amino acid sequences are aligned using a mathematical algorithm known in the art (preferably, the algorithm determines the alignment of the sequences for optimal alignment). It means the ratio (%) of identical amino acid residues to all overlapping amino acid residues in one or both of which the introduction of gaps may be considered.
  • IL-18 is a protein containing substantially the same amino acid sequence as shown in SEQ ID NO:2 and having the same activity as the protein containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2.
  • activity means any activity that contributes to cancer suppression, such as receptor-binding activity, proliferation/activation-promoting activity of T cells and NK cells, and the like.
  • homogeneous here means that their activities are qualitatively the same. Therefore, it is preferred that the activity of IL-18 is equal to or greater than that of wild-type IL-18, although the extent of these activities may differ.
  • IL-18 used in the present invention includes, for example, (i) 1 or 2 or more (eg, about 1 to 30, preferably about 1 to 10) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2; Preferably, 1 to several (5, 4, 3 or 2) amino acid sequences are deleted, (ii) 1 or 2 or more (for example, about 1 to 30) amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 2, preferably about 1 to 10, more preferably 1 to several (5, 4, 3 or 2) amino acids added, (iii) 1 or 2 or more in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (for example, about 1 to 30, preferably about 1 to 10, more preferably about 1 to several (5, 4, 3 or 2) amino acids are inserted into an amino acid sequence, (iv) shown in SEQ ID NO: 2 1 or 2 or more (for example, about 1 to 30, more preferably about 1 to 10, more preferably 1 to several (5, 4, 3 or 2)) amino acids in the amino acid sequence are other amino acids Also included are proteins containing amino acid sequences substituted with
  • the position of the insertion, deletion or substitution is not particularly limited. At least one of the cysteine (Cys) residues at positions 38, 68, 76 and 127 is replaced with another amino acid (e.g., Ser, Ala, Asp, Thr, Val, Leu, etc.) to improve stability.
  • Cys cysteine residues
  • Improved mutants see, for example, Japanese Patent No. 4024366
  • C38S, C68S or C68D as well as amino acid substitutions of L144C or D157C, with altered affinity for the IL-18 receptor and/or IL-18BP mutant (see, for example, Japanese Patent No.
  • amino acid residues important for binding to IL-18BP for example, Glu at position 42, Ile at position 85, and position 87 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 Met at position 89, Met at position 96, Asp at position 130, Lys at position 132, Pro at position 143, Met at position 149 and Leu at position 189, preferably G42 and/or Or a mutant in which K89 is replaced with another amino acid and has a reduced affinity for IL-18BP (see, for example, JP-A-2004-530432), Y1X, L5X, K8X, M51X, K53X, S55X, Q56X, P57X , G59X, M60X, E77X, Q103X, S105X, D110X, N111X, M113X, V153X and N155X (where X represents an amino acid different from that of wild-type IL-18), preferably M51X.
  • M60X, S105X, D110X and N111X, or IL-18BP low affinity mutants having M51X, K53X, Q56X, S105X and N111X substitutions see, for example, JP-A-2020-533301.
  • IL-18 mutants created by the present inventors i.e., C38/68/76/127S-E6A-K53A, C68/76/127S-E6A-K53A-C38M, C38/68/76/127S-E6A -K53A-G3Y, C38/68/76/127S-E6A-K53A-G3L, C38/68/76/127S-E6A-K53A-S72Y, C38/68/76/127S-E6A-K53A-S72M, C38/68 /76/127S-E6A-K53A-S72F) can also be preferably used.
  • the IL-18 used in the present invention may be a free form or a salt.
  • salts include salts with physiologically acceptable acids (e.g., inorganic acids, organic acids) and bases (e.g., alkali metals, alkaline earth metals). acid addition salts are preferred.
  • Such salts include, for example, salts with inorganic acids (e.g., hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid), or organic acids (e.g., acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid). acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like.
  • inorganic acids e.g., hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids e.g., acetic acid, formic acid,
  • IL-18 can be purified from the extracellular matrix or culture supernatant of IL-18-producing cells or tissues of humans or other mammals described above by a known protein purification method such as reverse phase chromatography or ion exchange chromatography. , affinity chromatography, and the like.
  • IL-18 can also be produced according to known peptide synthesis methods.
  • a peptide synthesis method for example, either a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method may be used. That is, it can be produced by condensing a partial peptide or amino acid that can constitute IL-18 with the remaining portion, and removing the protecting group if the product has a protecting group.
  • IL-18 can be produced by culturing a transformant containing a nucleic acid encoding it, and separating and purifying the resulting culture.
  • the nucleic acid may be DNA or RNA.
  • it is preferably double-stranded DNA.
  • an oligo DNA primer is synthesized based on the cDNA sequence information, and total RNA or an mRNA fraction prepared from IL-18-producing cells is used as a template, followed by RT-PCR. can be cloned by amplification by Using the obtained cDNA as a template, the above-described various mutations can be introduced using a site-directed mutagenesis method known per se.
  • DNA encoding IL-18 examples include DNA containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, or a nucleotide sequence that hybridizes with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 under stringent conditions, Examples thereof include DNAs encoding proteins having the same activity as wild-type IL-18 described above.
  • DNAs that can hybridize with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 under stringent conditions include, for example, 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, Particularly preferably, a DNA containing a base sequence having 97% or more identity, most preferably 98% or more identity is used.
  • NCBI BLAST National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool
  • the DNA encoding IL-18 is preferably DNA encoding wild-type human IL-18 having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, or DNA encoding the various human IL-18 mutant proteins described above. be.
  • the full length of the IL-18-encoding DNA can be obtained by chemically synthesizing a DNA strand or connecting partially overlapping short oligo DNA strands synthesized using the PCR method or the Gibson Assembly method. It is also possible to construct a DNA encoding
  • the advantage of constructing a full-length DNA by chemical synthesis or a combination with the PCR method or Gibson Assembly method is that codons to be used can be designed over the entire length of the CDS according to the host into which the DNA is introduced. When heterologous DNA is expressed, the amount of protein expression can be expected to be increased by converting the DNA sequence into codons that are frequently used in the host organism.
  • codon usage frequency in the host to be used can be obtained, for example, from the genetic code usage frequency database (http://www.kazusa.or.jp/codon/index.html) published on the website of Kazusa DNA Research Institute. ) can be used, or the literature describing codon usage in each host can be consulted.
  • the cloned DNA can be used as is, or after digestion with restriction enzymes or addition of linkers, if desired.
  • the DNA may have ATG as a translation initiation codon at its 5' end and TAA, TGA or TAG as a translation stop codon at its 3' end. These translation initiation codons and translation termination codons can be added using suitable synthetic DNA adapters.
  • An expression vector containing IL-18-encoding DNA is produced, for example, by excising a target DNA fragment from IL-18-encoding DNA and ligating the DNA fragment downstream of a promoter in an appropriate expression vector.
  • Expression vectors include E. coli-derived plasmids (eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13); Bacillus subtilis-derived plasmids (eg, pUB110, pTP5, pC194); yeast-derived plasmids (eg, pSH19, pSH15); insect cell expression Plasmids (e.g., pFast-Bac); animal cell expression plasmids (e.g., pA1-11, pXT1, pRc/CMV, pRc/RSV, pcDNAI/Neo); bacteriophages such as phage ⁇ ; insect virus vectors such as baculovirus ( BmNPV, AcNP
  • Any promoter may be used as long as it is suitable for the host used for gene expression.
  • the host is an animal cell
  • SR ⁇ promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV (cytomegalovirus) promoter, RSV (Rous sarcoma virus) promoter, MoMuLV (Moloney murine leukemia virus) LTR, HSV-TK (herpes simplex viral thymidine kinase) promoter and the like are used. Promoters known per se can be appropriately selected for other hosts.
  • SV40 ori an SV40 replication origin
  • IL-18 can be produced by transforming a host with an expression vector containing the above-described IL-18-encoding DNA and culturing the resulting transformant.
  • hosts that can be used include Escherichia spp., Bacillus spp., yeast, insect cells, insects, and animal cells.
  • mammalian cells include monkey COS-7 cells, monkey Vero cells, Chinese hamster ovary cells (hereinafter abbreviated as CHO cells), dhfr gene-deficient CHO cells (hereinafter abbreviated as CHO (dhfr ⁇ ) cells), and mouse cells.
  • L cells mouse AtT-20 cells, mouse myeloma cells, rat GH3 cells, human FL cells, HeLa cells, HepG2 cells, HEK293 cells and the like are used.
  • cells known per se can be appropriately selected.
  • Transformation can be carried out according to known methods, depending on the type of host.
  • Animal cells are transformed according to the method described in, for example, Cell Engineering Supplementary Volume 8 New Cell Engineering Experimental Protocol, 263-267 (1995) (published by Shujunsha), Virology, Vol. 52, 456 (1973). can be done.
  • Cultivation of transformants can be carried out according to known methods depending on the type of host.
  • the medium for culturing a transformant whose host is an animal cell includes, for example, minimum essential medium (MEM) containing about 5 to about 20% fetal bovine serum, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), and RPMI. 1640 medium, 199 medium, Ham's F-12 medium, etc. are used.
  • the pH of the medium is preferably from about 6 to about 8.
  • Cultivation is usually carried out at about 30° C. to about 40° C. for about 15 to about 60 hours. Aeration and stirring may be performed as necessary.
  • IL-18 can be produced intracellularly or extracellularly in transformants.
  • IL-18 can be isolated and purified from the culture obtained by culturing the transformant according to a method known per se.
  • methods utilizing solubility such as salting out and solvent precipitation; dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis primarily utilizing differences in molecular weight.
  • method using charge difference such as ion exchange chromatography; method utilizing specific affinity such as affinity chromatography; method utilizing hydrophobicity difference such as reversed-phase high performance liquid chromatography; isoelectric
  • a method using a difference in isoelectric points, such as point electrophoresis, is used. These methods can be combined as appropriate.
  • the free form can be converted into a salt by a method known per se or a method analogous thereto, and when IL-18 is obtained as a salt, The salt can be converted into the free form or other salt by a method known per se or a method analogous thereto.
  • T-cell growth factor used in the combination drug of the present invention is not particularly limited as long as it is a humoral factor that induces proliferation and activation of T-cells such as CTL and Th1 cells.
  • cytokines such as IL-2, IL-15, IL-7, IL-9 and IL-21 can be mentioned, preferably IL-2, IL-15 and IL-7, more preferably IL- 2 is mentioned.
  • T cell growth factors may be used alone or in combination of two or more.
  • T cell growth factors can also induce proliferation of NK cells (eg IL-2, IL-15).
  • the T cell growth factors are sometimes referred to as "NK cell and T cell growth factors.”
  • IL-2 is produced by activated T cells, NK cells, and dendritic cells, and causes the proliferation and activation of tumoricidal cells such as CTL and NK cells.
  • Human IL-2 is produced as a precursor consisting of 153 amino acids and secreted as mature IL-2 consisting of 133 amino acids after cleavage of the signal sequence consisting of 20 amino acids at the N-terminus.
  • the amino acid sequence information of human IL-2 can be referred to, for example, UniProtKB (accession number: P60568).
  • the amino acid sequence of human mature IL-2 is shown in SEQ ID NO:4.
  • IL-15 is produced by monocytes, macrophages, dendritic cells, etc., and exhibits effects similar to IL-2 on CTL and NK cells.
  • Human IL-15 is produced as a 162-amino acid precursor, cleaved with a 29-amino acid signal sequence at the N-terminus, secreted as an inactive pro-form, and further cleaved with a 19-amino acid pro-peptide to form 114 It becomes mature IL-15 (active form) consisting of amino acids.
  • the amino acid sequence information of human IL-15 can be referred to, for example, UniProtKB (accession number: P40933).
  • the amino acid sequence of human mature IL-15 is shown in SEQ ID NO:6.
  • IL-7 is produced by stromal cells, reticular fibroblasts, thymic epithelial cells, etc., and contributes to the promotion of early differentiation of T cells and the quantitative maintenance of peripheral T cells.
  • Human IL-7 is produced as a precursor consisting of 177 amino acids and secreted as mature IL-7 consisting of 152 amino acids after cleavage of the signal sequence consisting of 25 amino acids at the N-terminus.
  • the amino acid sequence information of human IL-7 can be referred to, for example, UniProtKB (accession number: P13232).
  • the amino acid sequence of human mature IL-7 is shown in SEQ ID NO:8.
  • IL-2, IL-15 and IL-7 used as active ingredients of the combination drug of the present invention contain amino acid sequences identical or substantially identical to the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 4, 6 and 8, respectively.
  • IL-2, IL-15 and IL-7 are isolated from cytokine-producing cells (e.g., IL-2) of humans and other mammals (e.g., rats, mice, monkeys, dogs, cows, rabbits, pigs, sheep, etc.).
  • Producer cells include T cells, NK cells, NKT cells, activated dendritic cells, mast cells, etc.
  • IL-15-producing cells include monocytes, macrophages, dendritic cells, etc.
  • IL-7-producing cells include stromal cells.
  • reticular fibroblasts reticular fibroblasts, thymic epithelial cells, etc.
  • proteins isolated and purified from tissues containing them may also be a protein chemically synthesized or biochemically synthesized in a cell-free translation system, or a recombinant produced from a transformant introduced with a nucleic acid having a base sequence encoding each of the above amino acid sequences. It may be a replacement protein.
  • amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, 6 or 8 is 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, 6 or 8. % or more, particularly preferably 97% or more, most preferably 98% or more, and the like.
  • identity has the same meaning as described above for IL-18.
  • IL-2, IL-15 and IL-7 comprise amino acid sequences substantially identical to each of the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 4, 6 and 8, respectively, and each of A protein having the same activity as a protein containing an amino acid sequence.
  • activity means any activity that contributes to cancer suppression, such as binding activity to receptors, differentiation/proliferation/activation promoting activity of T cells and NK cells, and the like. "Homogeneous” here means that their activities are qualitatively the same. Therefore, the activities of IL-2, IL-15 and IL-7 are preferably equal to or higher than those of wild-type IL-2, wild-type IL-15 and wild-type IL-7, respectively; may vary in degree.
  • IL-2, IL-15 and IL-7 used in the present invention include, for example, (i) 1 or 2 or more in each amino acid sequence shown in SEQ ID NOS: 4, 6 and 8 (eg 1 to About 30 amino acids, preferably about 1 to 10, more preferably 1 to several (5, 4, 3 or 2) amino acids are deleted, (ii) shown in SEQ ID NOS: 4, 6 and 8 1 or 2 or more (for example, about 1 to 30, preferably about 1 to 10, more preferably 1 to several (5, 4, 3 or 2)) amino acids added to each amino acid sequence , (iii) 1 or 2 or more (eg, about 1 to 30, preferably about 1 to 10, more preferably 1 to several (5, 4, (iv) 1 or 2 or more (eg, about 1 to 30, more preferably 1) in each amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 4, 6 and 8 A protein containing an amino acid sequence in which about 10, more preferably 1 to several (5, 4, 3 or 2) amino acids are substituted with other amino acids, or (v) an amino acid sequence in which
  • the position of the insertion, deletion or substitution is not particularly limited. At least one of the Thr at position 3, Phe at position 42, Tyr at position 45, and Leu at position 72 is substituted with another amino acid (e.g., Ala, Ser, Val, etc.) to increase expression on Tregs.
  • Mutants with reduced affinity for the IL-2R ⁇ chain of the affinity ⁇ c receptor can be mentioned.
  • IL-15 and IL-7 known mutants having activity equivalent to or higher than that of the wild type can be used.
  • IL-2, IL-15 and IL-7 used in the present invention may be free forms or salts.
  • Such salts include those similar to those described above for IL-18.
  • IL-2, IL-15 and IL-7 are isolated from the extracellular matrix and culture supernatant of the above-mentioned cytokine-producing cells or tissues of humans and other mammals using a protein purification method known per se. can do.
  • IL-2, IL-15 and IL-7 can also be produced according to known peptide synthesis methods. As a method for purifying such a protein and a method for synthesizing a peptide, the same methods as described above for IL-18 can be used.
  • IL-2, IL-15 and IL-7 can be produced by culturing transformants containing nucleic acids encoding them and separating and purifying from the resulting culture.
  • DNAs encoding IL-2, IL-15 and IL-7 include DNAs containing the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 3, 5 and 7, respectively, or DNAs shown in SEQ ID NOs: 3, 5 and 7.
  • Examples include DNAs encoding proteins containing base sequences that hybridize with each base sequence under stringent conditions and having the same activity as wild-type IL-2, IL-15 and IL-7 described above.
  • DNAs that can hybridize with each nucleotide sequence shown in SEQ ID NOS: 3, 5 and 7 under stringent conditions are, for example, 80% or more, preferably 90%, with each nucleotide sequence shown in SEQ ID NOS: 3, 5 and 7.
  • DNAs encoding IL-2, IL-15 and IL-7 are preferably wild-type human IL-2, IL-15 and IL-7 having the base sequences shown in SEQ ID NOs: 3, 5 and 7, respectively. or DNA encoding the various human IL-2, IL-15 and IL-7 variant proteins described above.
  • DNAs encoding IL-2, IL-15 and IL-7 can be obtained by chemically synthesizing DNA strands or synthesizing partially overlapping short oligo DNA strands using PCR or Gibson Assembly methods. It is also possible to construct a DNA encoding the full length by joining together.
  • the cloned DNA can be used as is, or after digestion with restriction enzymes or addition of linkers, if desired.
  • the DNA may have ATG as a translation initiation codon at its 5' end and TAA, TGA or TAG as a translation stop codon at its 3' end. These translation initiation codons and translation termination codons can be added using suitable synthetic DNA adapters.
  • An expression vector containing a DNA encoding IL-2, IL-15 or IL-7 can be obtained, for example, by excising a DNA fragment of interest from a DNA encoding IL-2, IL-15 or IL-7, can be produced by ligating downstream of a promoter in an appropriate expression vector.
  • a promoter those described above for IL-18 are preferably used.
  • the expression vector may also contain enhancers, splicing signals, poly A addition signals, selectable markers, SV40 ori, etc., as desired. Selectable markers include, for example, dihydrofolate reductase gene, ampicillin resistance gene, neomycin resistance gene and the like.
  • IL-2, IL-15 or IL-7 can be obtained by transforming a host with an expression vector containing the DNA encoding IL-2, IL-15 or IL-7 and culturing the resulting transformant. can be manufactured.
  • the host, transformation method, culture method for the transformant, purification method for the resulting IL-2 protein, conversion method from free form to salt or from salt to free form, etc. are those described above for IL-18, or methods similar to those described above. It is also preferably used.
  • IL-2, IL-15 and IL-7 have been described as examples of T cell growth factors, but a person skilled in the art can also use other T cell growth factors based on the description of this specification. You can get them easily.
  • (II) Concomitant drug of the present invention As shown in the examples below, the combination of immune checkpoint inhibitors, IL-18 and T-cell growth factors results in almost no drugs exhibiting therapeutic effects, Significant tumor growth compared to combination of immune checkpoint inhibitor and IL-18 or immune checkpoint inhibitor and T cell growth factor in spontaneous cancer model mice, which are models of refractory cancer can be suppressed. Therefore, the combination drug of the present invention can be used as a therapeutic agent for cancer.
  • cancer treatment is used as a concept encompassing all of tumor growth, cancer progression, suppression of invasion/metastasis, delay in onset of cancer, suppression of recurrence, and the like.
  • the combination drug of the present invention is particularly resistant to existing cancer treatments, including monotherapy with immune checkpoint inhibitors and combination therapy with immune checkpoint inhibitors and IL-18, or is resistant to such cancer treatments. It can be preferably used for subjects (humans or other mammals, preferably humans) with maladaptive cancers.
  • cancers for which the combination drug of the present invention can be used are not particularly limited, and include any cancers.
  • it may be cancer derived from epithelial cells, but it may also be non-epithelial sarcoma or blood cancer.
  • gastrointestinal cancer e.g., liver cancer (hepatocellular carcinoma, cholangiocarcinoma), gallbladder cancer, bile duct cancer, pancreatic cancer, duodenal cancer, esophageal cancer , stomach cancer, colorectal cancer (colon cancer, rectal cancer), anal cancer
  • cancer of the urinary system e.g., kidney cancer, ureter cancer, bladder cancer, prostate cancer, penile cancer, testicular cancer
  • breast cancer e.g. breast cancer, lung cancer (non-small cell lung cancer, small cell lung cancer)
  • genital cancer e.g.
  • uterine cancer cervical cancer, endometrial cancer
  • ovarian vulvar, and vaginal cancers
  • head and neck cancers e.g., maxillary, pharyngeal, laryngeal, tongue, and thyroid cancers
  • skin cancers e.g., basal cell carcinoma, squamous cell carcinoma.
  • the Mdr2 KO mice used in the Examples below exhibit chronic peribiliary inflammation and cholestasis due to a deficiency in the iAbc4 protein, a member of the superfamily of ATP-binding cassette (ABC) transporters encoded by the mdr2 gene. develops sexual liver disease and spontaneously develops hepatocellular carcinoma (Katzenellengoben et al., Mol. Cancer Res. 2007, 5(11): 1159-1170). Therefore, in a preferred embodiment of the present invention, the cancer targeted by the combination drug of the present invention is inflammation-related cancer, preferably liver cancer that can be caused by chronic inflammation caused by digestive juices such as bile and pancreatic juice.
  • inflammation-related cancer preferably liver cancer that can be caused by chronic inflammation caused by digestive juices such as bile and pancreatic juice.
  • pancreatic cancer pancreatic cancer
  • bile duct cancer gallbladder cancer
  • gastrointestinal cancer such as duodenal cancer
  • liver cancer derived from inflammation, fibrosis, or cirrhosis due to viral infection such as hepatitis B or hepatitis C virus (these primary, including metastatic cancer).
  • Immune checkpoint inhibitors, IL-18 and T-cell growth factors have low toxicity and can be administered orally or parenterally to humans or other mammals as liquid preparations or as pharmaceutical compositions in suitable formulations.
  • suitable formulations eg, intravascular administration (intravenous administration, intraarterial administration, etc.), subcutaneous administration, intradermal administration, intraperitoneal administration, intramuscular injection, local administration, etc.).
  • the combination drug of the present invention may be formulated with three active ingredients separately, or two or more of them may be formulated as a single agent.
  • compositions for parenteral administration include, for example, injections and suppositories, and injections are in the form of intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, drip infusions, and the like. may be included.
  • Such injections can be prepared according to known methods. Injections can be prepared, for example, by dissolving, suspending or emulsifying one or more active ingredients in a sterile aqueous or oily liquid that is commonly used for injections.
  • Aqueous solutions for injection include, for example, physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants, and the like.
  • propylene glycol polyethylene glycol
  • nonionic surfactants eg, polysorbate 80, HCO-50 (polyoxyethylene (50 mol) adduct of hydrogenated castor oil)
  • oily liquid for example, sesame oil, soybean oil, etc. may be used, and benzyl benzoate, benzyl alcohol, etc. may be used together as a solubilizing agent.
  • the prepared injection solution is preferably filled into a suitable ampoule.
  • Suppositories for rectal administration may be prepared by mixing the active ingredient with a conventional suppository base.
  • compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including sugar-coated tablets and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (including soft capsules), and syrups. agents, emulsions, suspensions and the like.
  • Such compositions may be produced by known methods and may contain carriers, diluents or excipients commonly used in the pharmaceutical field. Carriers and excipients for tablets include, for example, lactose, starch, sucrose and magnesium stearate.
  • the above parenteral or oral pharmaceutical compositions are conveniently prepared in dosage unit form to suit the dosage of the active ingredient.
  • dosage unit forms include, for example, tablets, pills, capsules, injections (ampoules), and suppositories.
  • the immune checkpoint inhibitor is usually contained in a dosage unit form of 10-10000 mg, preferably 50-1000 mg, more preferably 100-1000 mg.
  • IL-18 is usually contained in a dosage unit dosage form of 1-100 mg, preferably 5-50 mg.
  • IL-2 is usually contained in a dosage unit form of 10 4 to 10 6 Units, preferably 5 ⁇ 10 4 to 5 ⁇ 10 5 Units.
  • the dosage of each active ingredient varies depending on the subject, target disease, symptoms, route of administration, etc.
  • the amount is usually about 0.5 to 500 mg/kg body weight, preferably about 2.5 to 50 mg/kg body weight, more preferably about 5 to 50 mg/kg body weight.
  • IL-2 as a single dose is usually about 5 ⁇ 10 2 to 5 ⁇ 10 4 units/kg body weight, preferably about 2.5 ⁇ 10 3 to 2.5 ⁇ 10 4 units/
  • the ratio of active ingredients in the combination drug of the present invention is not particularly limited as long as the dosage of each active ingredient is within the above range. can be about 5-200, preferably about 10-50.
  • the dose of the T-cell growth factor can be about 0.1 to 1, preferably about 0.2 to 0.5, with respect to 1 dose of IL-18, in terms of 0.5 ng per unit. .
  • the combination drug of the present invention is provided in the form of a separate composition for each active ingredient, or in the form of a single composition for any two agents and the form of a separate composition for the remaining one agent.
  • each composition can be administered to the subject at the same time or at different times, by the same route or by separate routes.
  • IL-18BP is highly expressed in the tumor microenvironment and binds to IL-18 with high affinity to bind and signal IL-18 receptors on effector cells such as T cells and NK cells. It can function as a soluble immune checkpoint molecule that blocks and suppresses the proliferation and activation of the effector cells.
  • IL-18BP levels are markedly elevated in the sera of cancer patients who received cytokine therapy with IL-18. As shown in the Examples below, IL-18BP levels are elevated in the serum of spontaneous liver cancer model mice, and IL -BP levels cannot be lowered, whereas the three-drug combination of the present invention can significantly lower IL-18BP levels.
  • Serum IL-18BP levels in hepatocellular carcinoma patients not receiving IL-18 therapy were markedly higher than those in healthy subjects, but it was also found that the levels varied greatly among patients. rice field.
  • High serum IL-18BP levels are thought to reflect the establishment of an immunosuppressive state by IL-18BP in the tumor microenvironment. Therefore, for cancer patients with particularly high serum IL-18BP levels, the concomitant drug of the present invention, which can reduce the expression of IL-18BP, is effective in suppressing immunosuppression (T cells and NK cells) by IL-18 in such patients. It can be particularly useful because it is thought that it can relieve immune exhaustion such as.
  • the combination drug of the present invention can be administered to cancer patients with a serum IL-18BP level of 10 pg/mL or higher, preferably 20 pg/mL or higher.
  • Serum IL-18BP levels can be measured, for example, by immunochemical assays (eg, ELISA, etc.) using anti-IL-18BP antibodies, and such ELISA kits are commercially available.
  • Example 1 Combination therapy of immune checkpoint inhibitor and IL-18 and/or IL-2 against Mdr2 ⁇ / ⁇ KO mice
  • Mdr2 ⁇ / ⁇ KO mice spontaneously developing hepatocellular carcinoma (60 to 64 weeks old Females; obtained from The Jackson Laboratory) were divided into four groups, 1) anti-mouse PD-L1 antibody (clone 10F.9G2; purchased from BioXcell) 200 ⁇ g/mouse, IL-18 (recombinant mouse IL-18; manufactured by GlaxoSmithKline) 10 ⁇ g/mouse, and IL-2 ( Recombinant IL-2 (Immunase Note 35); manufactured by Shionogi & Co., Ltd.) 5,000 units/kg (IL-2 + IL-18 + PD-L1 administration group); 2) anti-mouse PD-L1 antibody 200 ⁇ g/mouse and IL-2 5,000 units/kg (IL-2+PD-L1 administration group); 3) anti-mouse PD-L
  • IL-18BP level was significantly decreased by combined administration in the IL-2+IL-18+PD-L1 administration group (Fig. 10-1, right).
  • the IL-18BP expression-lowering effect of the three-drug combination was abrogated by administration of an anti-CD8 antibody (Fig. 10-2). This suggests that CTL plays an important role in the action of lowering IL-18BP expression.
  • hepatitis C virus HCV
  • intrahepatic cholangiocarcinoma 8 intrahepatic cholangiocarcinoma patients
  • 24 healthy volunteers who visited Tokyo Metropolitan Komagome Hospital IL-18BP levels were measured.
  • the serum IL-18BP level was remarkably elevated in hepatocellular carcinoma patients compared to healthy subjects and intrahepatic bile duct cancer patients (Fig. 11-1).
  • differences in IL-18BP levels up to 4-fold or more were also observed among hepatocellular carcinoma patients.
  • the combination drug of the present invention is a combined cancer immunotherapy that is effective against refractory cancers such as liver cancer, especially against cancers for which immune checkpoint inhibitor monotherapy and combination therapy with other drugs are ineffective or unsuitable. It is extremely useful in that it can be used as a therapeutic agent. In addition, implementation of companion diagnostics to measure serum IL-18BP levels will make it possible to predict cancer patients who will respond more effectively to this combination drug.

Abstract

本発明は、難治性がん、特に免疫チェックポイント阻害薬の単独療法やそれと他剤との併用が無効ながんに対して治療効果を示す、新規かつ有効ながん免疫療法剤を提供する。具体的には、免疫チェックポイント阻害薬と、インターロイキン-18（IL-18）と、T細胞増殖因子（例、インターロイキン-2（IL-2））とを組み合わせてなる、がん治療剤を提供する。

Description

がんの治療剤
　本発明は、インターロイキン-2（IL-2）等のT細胞増殖因子と、インターロイキン-18（IL-18）と、免疫チェックポイント阻害薬とを組み合わせてなる、がんの治療剤に関する。
　肝臓がんは、肝切除や肝移植、穿刺局所療法、肝動脈化学塞栓療法（TACE）など非薬物療法が中心で、それらに適応がない進行性の肝細胞がんに対しては、血管内皮増殖因子（VEGF）阻害薬であるソラフェニブやレンバチニブによる薬物療法が行われているが、最新薬のレンバチニブでも奏効率は40%程度である。最近になって、免疫チェックポイント阻害薬である抗PD-1抗体（ニボルマブ、ペムブロリズマブ）が、ソラフェニブ投与歴のある肝細胞がんに対する2次治療薬として米国で承認されたが、ペムブロリズマブは、プラセボ対照の第III相試験で、全生存期間と無増悪生存期間という主要評価項目を達成できなかった。VEGF阻害薬との併用等も研究されているが、ペムブロリズマブとレンバチニブとの併用での奏効率は6割程度にとどまり、未だ十分な効果があるとはいえない。
　炎症性サイトカインは、がん免疫に重要なT細胞やナチュラルキラー（NK）細胞を強力に活性化するため、抗腫瘍効果を期待してさまざまなサイトカイン療法が検討されてきた。IL-18はNK細胞、CD8陽性キラーT細胞（CTL）、γδT細胞などの増殖を著明に亢進する。しかし、IL-18の単独投与は転移性メラノーマに対する第II相試験で十分な有効性を示せなかった。本発明者らの研究グループは以前、免疫チェックポイント阻害薬にIL-18を併用することにより、獲得免疫を亢進する能力が期待されるNK細胞（ヘルパーNK細胞）やCTLが増加し、免疫チェックポイント阻害薬の抗腫瘍効果が増強されることを報告している（特許文献１、非特許文献１）。
　一方、IL-2は活性化T細胞・NK細胞・樹状細胞などにより産生され、CTLやNK細胞といった殺腫瘍作用を示す細胞の増殖・活性化を引き起こすことから、単独投与やIL-2により活性化したNK細胞との併用により、転移性腎癌や悪性黒色腫などの治療に臨床的に用いられている（非特許文献２）。本発明者らは、末梢血由来NK細胞をIL-18とIL-2を併用して培養すると、NK細胞の増殖・活性化を著明に促進することを見出した（非特許文献３）。
　しかしながら、免疫賦活化作用を示すサイトカインが、一方で腫瘍増殖を促進する作用を示す場合がある。IL-2はナイーブT細胞からTh1、Th2、Th17、制御性T細胞（Treg）の分化・活性化を誘導するが、TregはCTL活性の抑制を増強させるため、in vivo投与によりin vitroでの効果が再現し得るか否かは全く予測できない。IL-18についても、抗腫瘍効果と腫瘍増殖促進効果の二面性があることが報告されている（非特許文献４）。また、がん微小環境では、IL-18に極めて高親和性のIL-18結合タンパク質（IL-18BP）の発現が増大しており、IL-18や抗PD-L1抗体による治療によりIL-18BPの発現がさらに増大することも報告されている（非特許文献５）。従って、免疫チェックポイント阻害薬とIL-18との併用が、実際のヒト臨床においてどれだけ有効であるかは未知数である。
特許第6245622号公報
Ma, Z. et al., Clin. Cancer Res., 22(12): 2969-2980 (2009) 公益社団法人 日本臨床腫瘍学会編, 「がん免疫療法ガイドライン」（金原出版株式会社）, 第15頁, 2016年12月20日発行 El-Darawish, Y.et al., J. Leukoc. Biol., 104: 253-264 (2018) Fabbi, M.et al., J. Leukoc. Biol., 97: 665-675 (2015) Zhou, T.et al., Nature, 583(7817): 609-614 (2020)
　本発明の目的は、難治性がん、特に免疫チェックポイント阻害薬の単独療法やそれと他剤との併用が無効ながんに対して治療効果を示す、新規かつ有効ながん免疫療法剤を提供することである。
　治療困難な肝臓がんモデルとして自然発症型のマウスが使用されているが、当該モデルに対して有効な治療薬はほとんどなく、進行肝細胞がんに対する一次治療の標準薬であるレンバチニブも無効である。本発明者らは、P-糖タンパク質をコードするmdr2遺伝子を欠損させた自然発症型肝細胞がんモデルマウス（Mdr2 KOマウス）を用い、大腸がん細胞移入による腹膜播種モデルやメラノーマ細胞移入による肺転移モデルにおいて効果を認めた免疫チェックポイント阻害薬（抗PD-L1抗体）とIL-18の併用投与の治療効果を検討した。その結果、腫瘍サイズの増大傾向を認め、免疫チェックポイント阻害薬とIL-18の併用は、難治性の肝臓がんに対しては十分な効果を奏さないことが示唆された。
　そこで、本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、Mdr2 KOマウスに対して、上記2剤に加えてさらにT細胞増殖因子（例えば、IL-2）を併用投与すると、腫瘍サイズが縮小傾向を示すことを見出した。免疫チェックポイント阻害薬とIL-2の2剤併用によっては、腫瘍サイズの増大傾向を認め、十分な治療効果が得られなかった。3剤併用により、いずれの2剤併用と比較しても腫瘍マーカーであるα-フェトプロテイン（AFP）の血清レベルは有意に低下した。また、3剤併用により抗腫瘍性サイトカイン（インターフェロン-γ（IFN-γ）や腫瘍壊死因子-α（TNF-α））の産生は有意に増大し、いずれの2剤併用と比較しても増大傾向を示した。
　3剤併用による腫瘍縮小、AFP値の低下、IFN-γ・TNF-α産生の増大効果は、抗CD8抗体の投与により無効化されたことから、3剤併用による治療効果には、少なくともCD8陽性T細胞が重要であると考えられた。また、3剤併用による腫瘍縮小効果は、抗アシアロGM1抗体の投与により無効化されたことから、3剤併用による治療効果には、NK細胞の関与も示唆された。
　IL-18によるがん治療の障壁となっていることが示唆されるIL-18BPのMdr2 KOマウスにおける発現を調べると、血清中のIL-18BPのタンパク質レベルは、抗PD-L1抗体とIL-18との2剤併用では変化はなく、抗PD-L1抗体とIL-2との2剤併用ではむしろ増加したのに対し、3剤併用では有意に低下した。肝細胞がん患者及び肝内胆管がん患者の血清中のIL-18BPタンパク質レベルを調べたところ、肝細胞がん患者において、健常者のそれと比較して著明にIL-18BPレベルが上昇していたが、患者間でも最大4倍以上の差異が認められたことから、3剤併用療法はIL-18BPの血清レベルが上昇しているがん患者に有効であり得ることが示唆された。
　本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究の重ねた結果、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下のものを提供する。
［項１］
　免疫チェックポイント阻害薬と、インターロイキン-18（IL-18）と、T細胞増殖因子とを組み合わせてなる、がん治療剤。
［項２］
　T細胞増殖因子が、インターロイキン-2（IL-2）、インターロイキン-15（IL-15）及びインターロイキン-7（IL-7）からなる群より選択される１以上のサイトカインである、［項１］に記載の剤。
［項３］
　T細胞増殖因子としてIL-2を含む、［項２］に記載の剤。
［項４］
　免疫チェックポイント阻害薬が、抗PD-L1抗体、抗PD-1抗体、抗CTLA4抗体、抗LAG-3抗体及び抗TIM-3抗体からなる群より選択される1以上の抗体である、［項１］～［項３］のいずれか１項に記載の剤。
［項５］
　免疫チェックポイント阻害薬の単独療法又は免疫チェックポイント阻害薬とIL-18との併用療法に抵抗性のがんに対する、［項１］～［項４］のいずれか１項に記載の剤。
［項６］
　血清IL-18結合タンパク質（IL-18BP）レベルが10 pg/mL以上である対象に投与される、［項１］～［項５］のいずれか１項に記載の剤。
［項７］
　がんが炎症関連がんである、［項１］～［項６］のいずれか１項に記載の剤。
［項８］
　炎症関連がんが消化器がんである、［項７］に記載の剤。
　本発明によれば、肝臓がんなどの難治性がん、特に免疫チェックポイント阻害薬の単独療法やそれと他剤との併用が無効ながんに対して有効な複合がん免疫療法剤が提供される。
Mdr2 KOマウスに対する薬剤投与及び試験のスケジュールを模式的に示す図である。 コントロール（PBS投与）群のMdr2 KOマウスの投与開始時（Baseline）及び投与開始4週間後（4W）の腫瘍サイズを示すCT画像の代表例である。右下は投与開始4週間後に切除した肝臓の写真である。 コントロール（PBS投与）群のMdr2 KOマウスの投与開始4週間後の肝臓のヘマトキシリン・エオシン（HE）染色像の代表例である。 3剤（抗PD-L1抗体、IL-18及びIL-2）投与によるMdr2 KOマウスにおける腫瘍サイズの縮小を示すCT画像の代表例である。Baseline：投与開始時、4W：投与開始4週間後。右下は投与開始4週間後に切除した肝臓の写真である。 3剤（抗PD-L1抗体、IL-18及びIL-2）投与群の投与開始4週間後の肝臓のHE染色像の代表例である。 2剤（抗PD-L1抗体及びIL-2）投与群のMdr2 KOマウスでは腫瘍サイズが増大したことを示すCT画像の代表例である。Baseline：投与開始時、4W：投与開始4週間後。右下は投与開始4週間後に切除した肝臓の写真である。 2剤（抗PD-L1抗体及びIL-18）投与群のMdr2 KOマウスでは腫瘍サイズが増大したことを示すCT画像の代表例である。Baseline：投与開始時、4W：投与開始4週間後。 （Ａ）投与開始4週間後の各投与群のMdr2 KOマウスの血清AFPレベル（ng/mL）を示す図である。（Ｂ）3剤（抗PD-L1抗体、IL-18及びIL-2）投与群とコントロール（PBS投与）群のMdr2 KOマウスにおける投与開始時（Baseline）及び投与開始4週間後（4W）の血清AFPレベル（ng/mL）を示す図である。 投与開始4週間後の各投与群のMdr2 KOマウスの血清中のIFN-γ及びTNF-αレベル（ng/mL）、並びに、3剤（抗PD-L1抗体、IL-18及びIL-2）投与群とコントロール（PBS投与）群のMdr2 KOマウスにおける投与開始時（Baseline）及び投与開始4週間後（4W）の血清中のIFN-γ及びTNF-αレベル（ng/mL）を示す図である。 3剤（抗PD-L1抗体、IL-18及びIL-2）投与によるMdr2 KOマウスにおける腫瘍縮小効果がNK細胞の除去により無効化することを示すCT画像の代表例である。Baseline：投与開始時、4W：投与開始4週間後。右下は投与開始4週間後に切除した肝臓の写真である。 3剤（抗PD-L1抗体、IL-18及びIL-2）投与によるMdr2 KOマウスにおける腫瘍縮小効果がCD8陽性T細胞の除去により無効化することを示すCT画像の代表例である。Baseline：投与開始時、4W：投与開始4週間後。右下は投与開始4週間後に切除した肝臓の写真である。 3剤（抗PD-L1抗体、IL-18及びIL-2）投与によるMdr2 KOマウスにおける血清AFPレベルの低減作用、IFN-γ及びTNF-αレベルの産生促進作用がCD8陽性T細胞の除去により無効化することを示す図である。 投与開始4週間後の各投与群のMdr2 KOマウスの血清中のIL-18BPレベル（pg/mg）、並びに、3剤（抗PD-L1抗体、IL-18及びIL-2）投与群とコントロール（PBS投与）群のMdr2 KOマウスにおける投与開始時（Baseline）及び投与開始4週間後（4W）の血清中のIL-18BPレベル（pg/mg）を示す図である。 3剤（抗PD-L1抗体、IL-18及びIL-2）投与によるMdr2 KOマウスにおける血清中のIL-18BPレベルの低減作用がCD8陽性T細胞の除去により無効化することを示す図である。 肝細胞がん患者（HCC）、肝内胆管がん患者（CCC）及び健常ボランティアにおける血清IL-18BPレベル（pg/mL）を示す図である。 C型肝炎ウイルス（HCV）陽性の肝細胞がん患者（HCC）、慢性肝炎患者（CH）及び肝硬変患者（LC）、並びに健常ボランティアにおける血清IL-18レベル（pg/mL）を示す図である。 C型肝炎ウイルス（HCV）陽性肝細胞がん患者の血清中のIL-18レベルとIL-18BPレベルの相関を調べた結果を示す図である。
　本発明は、免疫チェックポイント阻害薬と、IL-18と、T細胞増殖因子とを組み合わせてなる、がん治療剤（以下、「本発明の併用剤」ともいう。）を提供する。即ち、本発明の併用剤は、有効成分として（ａ）免疫チェックポイント阻害薬、（ｂ）IL-18、及び（ｃ）T細胞増殖因子を含む複合がん免疫療法剤である。
（Ｉ）有効成分
（ａ）免疫チェックポイント阻害薬
　本明細書において「免疫チェックポイント阻害薬」とは、T細胞又はNK細胞上に発現する免疫抑制性の共刺激分子（免疫チェックポイント分子）と、がん細胞や抗原提示細胞上に発現するそれらのリガンドとの結合を阻害し、免疫抑制シグナルの伝達を遮断してT細胞又はNK細胞の活性化抑制を解除する薬剤を意味する。
　本発明の併用剤の有効成分として用いられる免疫チェックポイント阻害薬としては、T細胞又はNK細胞上に発現する抑制性の共刺激分子（例えば、PD-1、CTLA4、TIM-3、LAG-3、TIGIT、CD96、BTLA、VISTA、KIR等）に結合して、それらのリガンド（例えば、PD-L1、PD-L2、CD80/86、CEACAM1、Galectin-9、MHCクラス-II分子、LSECtin、Galectin-3、CD155、CD112、CD113、CD111、HVEM、VSIG3等）との結合を阻害する物質や、該リガンドに結合して免疫チェックポイント分子との結合を阻害する物質であれば、特に制限はないが、好ましい一実施態様においては、免疫チェックポイント分子又はそのリガンドに対するブロッキング抗体を挙げることができる。好ましくは、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA4抗体、抗PD-L2抗体、抗TIM-3抗体、抗LAG-3抗体、抗KIR抗体等、より好ましくは抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA4抗体等が挙げられる。
　免疫チェックポイント分子又はそのリガンドに対する抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよいが、好ましくはモノクローナル抗体である。これらの抗体は、自体公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。抗体のアイソタイプは特に限定されないが、好ましくはIgG、IgMまたはIgA、特に好ましくはIgGが挙げられる。IgG1やIgG2のFc領域はADCC、ADCP、CDC等のエフェクター機能を有するので、がん細胞に発現するリガンドを標的とする抗体において好ましく用いられ得る。一方、IgG4はエフェクター機能が低いので、T細胞やNK細胞上に発現する免疫チェックポイント分子を標的とする抗体において好ましく用いられ得る。尚、CTLA4は制御性T細胞（Treg）でも強く発現しており、Tregの除去作用を期待して、抗CTLA4抗体としてIgG1やIgG2サブタイプを用いることもできる。
　免疫チェックポイント分子又はそのリガンドに対する抗体は、標的抗原を特異的に認識し結合するための相補性決定領域（CDR）を少なくとも有するものであれば特に制限はなく、完全抗体分子の他、例えばFab、Fab'、F(ab’)2等のフラグメント、scFv、scFv-Fc、ミニボディー、ダイアボディー等の遺伝子工学的に作製されたコンジュゲート分子、あるいはポリエチレングリコール（PEG）等のタンパク質安定化作用を有する分子等で修飾されたそれらの誘導体などであってもよい。
　好ましい一実施態様において、免疫チェックポイント分子又はそのリガンドに対する抗体は、ヒトを投与対象とする医薬品として使用されることから、該抗体（好ましくはモノクローナル抗体）はヒトに投与した場合に抗原性を示す危険性が低減された抗体、具体的には、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、マウス－ヒトキメラ抗体などであり、特に好ましくは完全ヒト抗体である。ヒト化抗体およびキメラ抗体は、常法に従って遺伝子工学的に作製することができる。また、完全ヒト抗体は、ヒト－ヒト（もしくはマウス）ハイブリドーマより製造することも可能ではあるが、大量の抗体を安定に且つ低コストで提供するためには、ヒト抗体産生マウスやファージディスプレイ法を用いて製造することが望ましい。
　免疫チェックポイント分子又はそのリガンドに対するモノクローナル抗体のいくつかは、既に医薬品として上市されているか臨床試験中であり、それらを使用することができる。例えば、抗PD-1抗体として、ニボルマブ（オプジーボ（登録商標））、ペンブロリズマブ（Keytruda（登録商標））、AMP-514（MEDI0680）、ビジリズマブ（CT-011）等、抗PD-L1抗体として、アテゾリズマブ（RG7446、MPDL3280A）、デュルバルマブ（MEDI4736）、アベルマブ（PF-06834635、MSB0010718C）、BMS-936559（MDX1105）等、抗CTLA4抗体として、イピリムマブ（ヤーボイ（登録商標））、トレメリムマブ等、抗TIM-3抗体として、MBG453等、抗LAG-3抗体として、BMS-986016、LAG525等、抗KIR抗体として、リリルマブ等が挙げられる。
　あるいは、免疫チェックポイント分子に結合してがん細胞や腫瘍浸潤マクロファージ等の抗原提示細胞上に発現するそのリガンドとの結合を阻害する物質として、該リガンドの免疫チェックポイント分子との結合に必要な部分（例、細胞外ドメイン）を含み、かつ免疫抑制性シグナルを伝達する能力を有しないフラグメント、さらには、該フラグメントに免疫疲弊したエフェクター細胞を除去し得る分子をコンジュゲートさせた物質を用いることができる。後者の例として、PD-L1やPD-L2の細胞外ドメインとIgG1やIgG2抗体のFc領域との融合タンパク質（例、AMP-224等）を挙げることができる。
　免疫チェックポイント分子に結合してそのリガンドとの結合を阻害する物質はまた、該リガンドと競合的に免疫チェックポイント分子に結合するアンタゴニストであってもよい。そのようなアンタゴニストは、免疫チェックポイント分子とそのリガンドとを用いた競合アッセイ系を構築し、化合物ライブラリーをスクリーニングすることにより取得することができる。
　本発明の併用剤は、上記の免疫チェックポイント阻害薬のいずれか1種又は2種以上を組み合わせて用いることができる。
（ｂ）IL-18
　IL-18は、IL-1ファミリーに属する炎症促進性サイトカインであり、T細胞やNK細胞によるIFN-γ産生を促進する。ヒトIL-18は192アミノ酸からなる不活性な前駆体（プロIL-18）として産生されるが、PAMPsやDAMPsによってインフラマソームと呼ばれるタンパク質複合体が活性化されると、カスパーゼ-１が活性化し、その酵素活性によりプロIL-18がプロセシングされ、157アミノ酸からなる活性型の成熟IL-18が生成される。ヒトIL-18のアミノ酸配列情報は、例えば、UniProtKB（accession番号：Q14116）を参照することができる。ヒト成熟IL-18のアミノ酸配列を配列番号２に示す。
　本発明の併用剤の有効成分として用いられるIL-18は、配列番号２に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質である。IL-18は、ヒトや他の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、サル、イヌ、ウシ、ウサギ、ブタ、ヒツジなど）のIL-18産生細胞（例、マクロファージ、樹状細胞、ミクログリア、滑膜線維芽細胞、上皮細胞等）もしくはそれを含む組織から単離・精製される蛋白質であってもよい。また、化学合成もしくは無細胞翻訳系で生化学的に合成された蛋白質であってもよいし、あるいは上記アミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸を導入された形質転換体から産生される組換え蛋白質であってもよい。
　配列番号２に示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号２に示されるアミノ酸配列と80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、特に好ましくは97％以上、最も好ましくは98％以上の同一性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。ここで「同一性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸残基の割合（％）を意味する。本明細書におけるアミノ酸配列の同一性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値=10；ギャップを許す；マトリクス=BLOSUM62；フィルタリング=OFF）にて計算することができる。
　IL-18は、配列番号２に示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含み、かつ配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む蛋白質と同質の活性を有する蛋白質である。ここで「活性」とは、例えば、受容体との結合活性や、T細胞やNK細胞の増殖・活性化促進活性等、がんの抑制に寄与する任意の活性を意味する。ここで「同質」とは、それらの活性が定性的に同じであること意味する。したがって、IL-18の活性は野生型IL-18と同等もしくはそれ以上であることが好ましいが、これらの活性の程度は異なっていてもよい。
　あるいは、本発明で用いられるIL-18としては、例えば、（i）配列番号２に示されるアミノ酸配列中の1または2個以上（例えば1～30個程度、好ましくは1～10個程度、さらに好ましくは1～数（5、4、3もしくは2）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ii）配列番号２に示されるアミノ酸配列に1または2個以上（例えば1～30個程度、好ましくは1～10個程度、さらに好ましくは1～数（5、4、3もしくは2）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（iii）配列番号２に示されるアミノ酸配列に1または2個以上（例えば1～30個程度、好ましくは1～10個程度、さらに好ましくは1～数（5、4、3もしくは2）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（iv）配列番号２に示されるアミノ酸配列中の1または2個以上（例えば1～30個程度、より好ましくは1～10個程度、さらに好ましくは1～数（5、4、3もしくは2）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（v）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有する蛋白質なども含まれる。
　上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置は特に制限されないが、例えば、IL-18変異体として、配列番号２に示されるアミノ酸配列中、38位、68位、76位及び127位のシステイン（Cys）残基の少なくとも1つが他のアミノ酸（例、Ser、Ala、Asp、Thr、Val、Leu等）で置換され、安定性が向上した変異体（例えば、特許第4024366号参照）、C38S、C68S又はC68Dに加え、L144C又はD157Cのアミノ酸置換を有し、IL-18受容体及び/又はIL-18BPとの親和性が改変された変異体（例えば、特許第4753867号参照）、IL-18BPとの結合に重要なアミノ酸残基、例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列中、42位のGlu、85位のIle、87位のMet、89位のLys、96位のMet、130位のAsp、132位のLys、143位のPro、149位のMet及び189位のLeuの少なくとも1つのアミノ酸残基、好ましくはG42及び/又はK89が他のアミノ酸で置換され、IL-18BPとの親和性が低下した変異体（例えば、特表2004-530432号公報参照）、Y1X、L5X、K8X、M51X、K53X、S55X、Q56X、P57X、G59X、M60X、E77X、Q103X、S105X、D110X、N111X、M113X、V153X及びN155X（Xは野生型IL-18のアミノ酸残基とは異なるアミノ酸を示す）のうちの少なくとも１つの置換、好ましくはM51X、M60X、S105X、D110X及びN111X、あるいはM51X、K53X、Q56X、S105X及びN111Xの置換を有するIL-18BP低親和性変異体（例えば、特表2020-533301号公報参照）を挙げることができる。あるいは、本発明者らが創製したIL-18変異体（即ち、C38/68/76/127S-E6A-K53A、C68/76/127S-E6A-K53A-C38M、C38/68/76/127S-E6A-K53A-G3Y、C38/68/76/127S-E6A-K53A-G3L、C38/68/76/127S-E6A-K53A-S72Y、C38/68/76/127S-E6A-K53A-S72M、C38/68/76/127S-E6A-K53A-S72F）も好ましく用いられ得る。
　本発明で用いられるIL-18は遊離体であってもよいし、塩であってもよい。そのような塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属、アルカリ土類金属）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
　IL-18は、前述したヒトや他の哺乳動物のIL-18産生細胞もしくは組織の細胞外マトリクスや培養上清から、自体公知の蛋白質の精製方法、例えば、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー等を用いて単離することができる。また、IL-18は、公知のペプチド合成法に従って製造することもできる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによってもよい。即ち、IL-18を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより製造することができる。
　好ましい実施態様においては、IL-18は、それをコードする核酸を含有する形質転換体を培養し、得られる培養物から分離精製することによって製造することができる。ここで核酸はDNAであってもRNAであってもよい。DNAの場合は、好ましくは二本鎖DNAである。IL-18をコードするDNAは、例えば、そのcDNA配列情報に基づいてオリゴDNAプライマーを合成し、IL-18を産生する細胞より調製した全RNAもしくはmRNA画分を鋳型として用い、RT-PCR法によって増幅することにより、クローニングすることができる。得られたcDNAを鋳型にして、自体公知の部位特異的変異誘発法を用いて、上記した各種変異を導入することができる。
　IL-18をコードするDNAとしては、例えば、配列番号１に示される塩基配列を含有するDNA、または配列番号１に示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、前記した野生型IL-18と同質の活性を有する蛋白質をコードするDNAなどが挙げられる。配列番号１に示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるDNAとしては、例えば、配列番号１に示される塩基配列と80％以上、好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは97%以上、最も好ましくは98％以上の同一性を有する塩基配列を含有するDNAなどが用いられる。
　本明細書における塩基配列の同一性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値=10；ギャップを許す；フィルタリング=ON；マッチスコア=1；ミスマッチスコア=-3）にて計算することができる。
　IL-18をコードするDNAは、好ましくは、配列番号１に示される塩基配列を有する野生型ヒトIL-18をコードするDNA、又は上述の種々のヒトIL-18変異体タンパク質をコードするDNAである。
　IL-18をコードするDNAは、化学的にDNA鎖を合成するか、もしくは合成した一部オーバーラップするオリゴDNA短鎖を、PCR法やGibson Assembly法を利用して接続することにより、その全長をコードするDNAを構築することも可能である。化学合成又はPCR法もしくはGibson Assembly法との組み合わせで全長DNAを構築することの利点は、該DNAを導入する宿主に合わせて使用コドンをCDS全長にわたり設計できる点にある。異種DNAの発現に際し、そのDNA配列を宿主生物において使用頻度の高いコドンに変換することで、タンパク質発現量の増大が期待できる。使用する宿主におけるコドン使用頻度のデータは、例えば（公財）かずさDNA研究所のホームページに公開されている遺伝暗号使用頻度データベース（http://www.kazusa.or.jp/codon/index.html）を用いることができ、または各宿主におけるコドン使用頻度を記した文献を参照してもよい。
　クローン化されたDNAは、目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化するか、リンカーを付加した後に、使用することができる。該DNAはその5’末端側に翻訳開始コドンとしてのATGを有し、また3’末端側には翻訳終止コドンとしてのTAA、TGAまたはTAGを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成DNAアダプターを用いて付加することができる。
　IL-18をコードするDNAを含む発現ベクターは、例えば、IL-18をコードするDNAから目的とするDNA断片を切り出し、該DNA断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、pBR322，pBR325，pUC12，pUC13）；枯草菌由来のプラスミド（例、pUB110，pTP5，pC194）；酵母由来プラスミド（例、pSH19，pSH15）；昆虫細胞発現プラスミド（例、pFast-Bac）；動物細胞発現プラスミド（例、pA1-11，pXT1，pRc/CMV，pRc/RSV，pcDNAI/Neo）；λファージなどのバクテリオファージ；バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクター（例、BmNPV，AcNPV）；レトロウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスなどの動物ウイルスベクターなどが用いられる。
　プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、宿主が動物細胞である場合、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMV（サイトメガロウイルス）プロモーター、RSV（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、MoMuLV（モロニーマウス白血病ウイルス）LTR、HSV-TK（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーターなどが用いられる。他の宿主においても自体公知のプロモーターを適宜選択することができる。
　発現ベクターとしては、上記の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、SV40複製起点（以下、SV40 oriと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
　上記したIL-18をコードするDNAを含む発現ベクターで宿主を形質転換し、得られる形質転換体を培養することによって、IL-18を製造することができる。宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。哺乳動物細胞としては、例えば、サルCOS-7細胞、サルVero細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（以下、CHO細胞と略記）、dhfr遺伝子欠損CHO細胞（以下、CHO(dhfr-)細胞と略記）、マウスL細胞，マウスAtT-20細胞、マウスミエローマ細胞，ラットGH3細胞、ヒトFL細胞、HeLa細胞、HepG2細胞、HEK293細胞などが用いられる。他の宿主についても自体公知の細胞をそれぞれ適宜選択することができる。
　形質転換は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。動物細胞は、例えば、細胞工学別冊８　新細胞工学実験プロトコール，263-267 (1995)（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Virology），52巻，456 (1973)に記載の方法に従って形質転換することができる。
　形質転換体の培養は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。
　例えば、宿主が動物細胞である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、約5～約20%の胎児ウシ血清を含む最小必須培地（MEM）、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、RPMI 1640培地、199培地、Ham’s F-12培地などが用いられる。培地のpHは、好ましくは約6～約8である。培養は、通常約30℃～約40℃で、約15～約60時間行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
　以上のようにして、形質転換体の細胞内または細胞外にIL-18を製造せしめることができる。
　前記形質転換体を培養して得られる培養物からIL-18を自体公知の方法に従って分離精製することができる。このような方法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法；透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法；イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法；アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法；逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法；等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法；などが用いられる。これらの方法は、適宜組み合わせることもできる。
　かくして得られるIL-18が遊離体である場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって、該遊離体を塩に変換することができ、IL-18が塩として得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、該塩を遊離体または他の塩に変換することができる。
（ｃ）T細胞増殖因子
　本発明の併用剤に用いられるT細胞増殖因子としては、CTLやTh1細胞をはじめとするT細胞の増殖・活性化を引き起こす液性因子であれば特に制限はなく、例えば、IL-2、IL-15、IL-７、IL-9、IL-21等のサイトカインを挙げることができるが、好ましくはIL-2、IL-15、IL-７、より好ましくはIL-2が挙げられる。これらのT細胞増殖因子は1種のみを用いてもよいし、2種以上を組み合わせて用いてもよい。一実施態様においては、T細胞増殖因子はNK細胞の増殖も引き起こすことができる（例、IL-2、IL-15）。この場合、該T細胞増殖因子を「NK細胞及びT細胞増殖因子」と称することがある。
　IL-2は、活性化T細胞・NK細胞・樹状細胞により産生され、CTLやNK細胞といった殺腫瘍作用を示す細胞の増殖・活性化を引き起こす。ヒトIL-2は153アミノ酸からなる前駆体として産生され、N末端の20アミノ酸からなるシグナル配列が切断されて、133アミノ酸からなる成熟IL-2として分泌される。ヒトIL-2のアミノ酸配列情報は、例えば、UniProtKB（accession番号：P60568）を参照することができる。ヒト成熟IL-2のアミノ酸配列を配列番号４に示す。
　IL-15は、単球、マクロファージ、樹状細胞等により産生され、CTLやNK細胞に対してIL-2と類似の作用を示す。ヒトIL-15は162アミノ酸からなる前駆体として産生され、N末端の29アミノ酸からなるシグナル配列が切断されて不活性なプロ体として分泌され、さらに19アミノ酸からなるプロペプチドが切断されて、114アミノ酸からなる成熟IL-15（活性体）となる。ヒトIL-15のアミノ酸配列情報は、例えば、UniProtKB（accession番号：P40933）を参照することができる。ヒト成熟IL-15のアミノ酸配列を配列番号６に示す。
　IL-7は、間質細胞、細網線維芽細胞、胸腺上皮細胞等により産生され、T細胞の初期分化の促進、末梢T細胞の量的維持等に寄与している。ヒトIL-7は177アミノ酸からなる前駆体として産生され、N末端の25アミノ酸からなるシグナル配列が切断されて、152アミノ酸からなる成熟IL-7として分泌される。ヒトIL-7のアミノ酸配列情報は、例えば、UniProtKB（accession番号：P13232）を参照することができる。ヒト成熟IL-7のアミノ酸配列を配列番号８に示す。
　本発明の併用剤の有効成分として用いられるIL-2、IL-15及びIL-7は、それぞれ配列番号４、６及び８に示される各アミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質である。IL-2、IL-15及びIL-7は、ヒトや他の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、サル、イヌ、ウシ、ウサギ、ブタ、ヒツジなど）の各サイトカイン産生細胞（例えば、IL-2産生細胞として、T細胞、NK細胞、NKT細胞、活性化樹状細胞、肥満細胞等、IL-15産生細胞として、単球、マクロファージ、樹状細胞等、IL-7産生細胞として、間質細胞、細網線維芽細胞、胸腺上皮細胞等）もしくはそれを含む組織から単離・精製される蛋白質であってもよい。また、化学合成もしくは無細胞翻訳系で生化学的に合成された蛋白質であってもよいし、あるいは上記各アミノ酸配列をコードする塩基配列を有する核酸を導入された形質転換体から産生される組換え蛋白質であってもよい。
　配列番号４、６又は８に示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号４、６又は８に示されるアミノ酸配列と80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、特に好ましくは97％以上、最も好ましくは98％以上の同一性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。ここで「同一性」とは、IL-18について前記したのと同義である。
　IL-2、IL-15及びIL-7は、それぞれ配列番号４、６及び８に示される各アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含み、かつ配列番号４、６及び８に示される各アミノ酸配列を含む蛋白質と同質の活性を有する蛋白質である。ここで「活性」とは、例えば、受容体との結合活性や、T細胞やNK細胞の分化・増殖・活性化促進活性等、がんの抑制に寄与する任意の活性を意味する。ここで「同質」とは、それらの活性が定性的に同じであること意味する。したがって、IL-2、IL-15及びIL-7の活性は、それぞれ野生型IL-2、野生型IL-15及び野生型IL-7と同等もしくはそれ以上であることが好ましいが、これらの活性の程度は異なっていてもよい。
　あるいは、本発明で用いられるIL-2、IL-15及びIL-7としては、例えば、（i）配列番号４、６及び８に示される各アミノ酸配列中の1または2個以上（例えば1～30個程度、好ましくは1～10個程度、さらに好ましくは1～数（5、4、3もしくは2）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ii）配列番号４、６及び８に示される各アミノ酸配列に1または2個以上（例えば1～30個程度、好ましくは1～10個程度、さらに好ましくは1～数（5、4、3もしくは2）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（iii）配列番号４、６及び８に示される各アミノ酸配列に1または2個以上（例えば1～30個程度、好ましくは1～10個程度、さらに好ましくは1～数（5、4、3もしくは2）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（iv）配列番号４、６及び８に示される各アミノ酸配列中の1または2個以上（例えば1～30個程度、より好ましくは1～10個程度、さらに好ましくは1～数（5、4、3もしくは2）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（v）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有する蛋白質なども含まれる。
　上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置は特に制限されないが、例えば、IL-2変異体として、配列番号４に示されるアミノ酸配列中、3位のThr、42位のPhe、45位のTyr及び72位のLeu残基の少なくとも1つが他のアミノ酸（例、Ala、Ser、Val等）で置換され、Treg上で発現する高親和性のαβγc受容体のIL-2Rα鎖に対する親和性が低下した変異体（例えば、特2020-33362号公報参照）等を挙げることができる。IL-15、IL-7についても、野生型と同等もしくはそれ以上の活性を有する自体公知の変異体を用いることができる。
　本発明で用いられるIL-2、IL-15及びIL-7は遊離体であってもよいし、塩であってもよい。そのような塩としては、IL-18について前記したのと同様の塩が挙げられる。
　IL-2、IL-15及びIL-7は、前述したヒトや他の哺乳動物の各サイトカイン産生細胞もしくは組織の細胞外マトリクスや培養上清から、自体公知の蛋白質の精製方法を用いて単離することができる。また、IL-2、IL-15及びIL-7は、公知のペプチド合成法に従って製造することもできる。このような蛋白質の精製方法、ペプチド合成法としては、IL-18について前記したのと同様の方法を用いることができる。
　好ましい実施態様においては、IL-2、IL-15及びIL-7は、それをコードする核酸を含有する形質転換体を培養し、得られる培養物から分離精製することによって製造することができる。
　IL-2、IL-15及びIL-7をコードするDNAとしては、例えば、それぞれ配列番号３、５及び７に示される各塩基配列を含有するDNA、または配列番号３、５及び７に示される各塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、前記した野生型IL-2、IL-15及びIL-7と同質の活性を有する蛋白質をコードするDNAなどが挙げられる。配列番号３、５及び７に示される各塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるDNAとしては、例えば、配列番号３、５及び７に示される各塩基配列と80％以上、好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは97%以上、最も好ましくは98％以上の同一性を有する塩基配列を含有するDNAなどが用いられる。
　本明細書における塩基配列の同一性は、IL-18をコードするDNAの場合と同様にして計算することができる。
　IL-2、IL-15及びIL-7をコードするDNAは、好ましくは、それぞれ配列番号３、５及び７に示される各塩基配列を有する野生型ヒトIL-2、IL-15及びIL-7をコードするDNA、又は上述の種々のヒトIL-2、IL-15及びIL-7変異体タンパク質をコードするDNAである。
　IL-2、IL-15及びIL-7をコードするDNAは、化学的にDNA鎖を合成するか、もしくは合成した一部オーバーラップするオリゴDNA短鎖を、PCR法やGibson Assembly法を利用して接続することにより、その全長をコードするDNAを構築することも可能である。
　クローン化されたDNAは、目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化するか、リンカーを付加した後に、使用することができる。該DNAはその5’末端側に翻訳開始コドンとしてのATGを有し、また3’末端側には翻訳終止コドンとしてのTAA、TGAまたはTAGを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成DNAアダプターを用いて付加することができる。
　IL-2、IL-15又はIL-7をコードするDNAを含む発現ベクターは、例えば、IL-2、IL-15又はIL-7をコードするDNAから目的とするDNA断片を切り出し、該DNA断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。発現ベクター、プロモーターとしては、IL-18について前記したものが同様に好ましく用いられる。また、発現ベクターは、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、SV40 oriなどを含有していてもよい。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
　上記したIL-2、IL-15又はIL-7をコードするDNAを含む発現ベクターで宿主を形質転換し、得られる形質転換体を培養することによって、IL-2、IL-15又はIL-7を製造することができる。宿主、形質転換法、形質転換体の培養法、得られたIL-2タンパク質の精製方法、遊離体から塩もしくは塩から遊離体への変換方法等は、IL-18について前記したもの又は方法が同様に好ましく用いられる。
　T細胞増殖因子として、IL-2、Il-15及びIL-7を例に挙げて説明してきたが、当業者であれば、本明細書の記載に基づいて、他のT細胞増殖因子についても容易にそれらを取得することができる。
（ＩＩ）本発明の併用剤
　後述の実施例に示されるとおり、免疫チェックポイント阻害薬、IL-18及びT細胞増殖因子の3剤を組み合わせて用いることにより、治療効果を奏する薬剤がほとんどなく、難治性がんのモデルとなる自然発症型のがんモデルマウスにおいて、免疫チェックポイント阻害薬とIL-18、免疫チェックポイント阻害薬とT細胞増殖因子との併用に比べて、顕著に腫瘍の増殖を抑制することができる。従って、本発明の併用剤は、がんの治療剤として使用することができる。ここで「がんの治療」とは、腫瘍の増殖、がんの進展、及び浸潤・転移の抑制、がんの発症遅延、再発の抑制等をすべて包含する概念として用いられる。本発明の併用剤は、特に、免疫チェックポイント阻害薬の単独療法や免疫チェックポイント阻害薬とIL-18との併用療法を含む既存のがん治療に抵抗性であるか、当該がん治療が不適応のがんを有する対象（ヒト又は他の哺乳動物、好ましくはヒト）に対して、好ましく使用することができる。
　本発明の併用剤を用いることができるがん種は特に制限されず、任意のがんが挙げられる。例えば、上皮細胞由来の癌であり得るが、非上皮性の肉腫や血液がんであってもよい。より具体的には、例えば、消化器のがん（例えば、肝がん（肝細胞がん、胆管細胞がん）、胆嚢がん、胆管がん、膵がん、十二指腸がん、食道がん、胃がん、大腸がん（結腸がん、直腸がん）、肛門がん）、泌尿器のがん（例えば、腎がん、尿管がん、膀胱がん、前立腺がん、陰茎がん、精巣（睾丸）がん）、胸部のがん（例えば、乳がん、肺がん（非小細胞肺がん、小細胞肺がん））、生殖器のがん（例えば、子宮がん（子宮頸がん、子宮体がん）、卵巣がん、外陰がん、膣がん）、頭頸部のがん（例えば、上顎がん、咽頭がん、喉頭がん、舌がん、甲状腺がん）、皮膚のがん（例えば、基底細胞がん、有棘細胞がん）を含むが、これらに限定されない。
　後述の実施例で使用したMdr2 KOマウスは、mdr2遺伝子によってコードされる、ATP結合カセット（ABC）トランスポーターのスーパーファミリーのメンバーであるiAbc4タンパク質の欠損により、慢性の胆管周囲性炎症及び胆汁うっ滞性肝臓疾患を発症し、肝細胞がんを自然発症する（Katzenellengoben et al., Mol. Cancer Res. 2007, 5(11): 1159-1170）。そのため、本発明の好ましい一実施態様においては、本発明の併用剤が対象とするがんは、炎症関連がん、好ましくは、胆汁、膵液などの消化液による慢性炎症が原因となりうる肝臓がん、膵臓がん、胆管がん、胆嚢がん、十二指腸がん等の消化器がん、あるいはB型・C型肝炎ウイルスなどのウイルス感染による炎症・線維症・肝硬変由来の肝臓がん（それらを原発性とする転移がんを含む）であり得る。
　免疫チェックポイント阻害薬、IL-18及びT細胞増殖因子は低毒性であり、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒト又は他の哺乳動物に対して経口的または非経口的（例、血管内投与（静脈内投与、動脈内投与等）、皮下投与、皮内投与、腹腔内投与、筋肉注射、局所投与など）に投与することができる。
　本発明の併用剤は、有効成分3剤をそれぞれ別個に製剤化してもよいし、それらの2剤以上を単剤として製剤化してもよい。
　非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良い。このような注射剤は、公知の方法に従って調製できる。注射剤の調製方法としては、例えば、1以上の有効成分を、通常注射剤に用いられる無菌の水性液、または油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製できる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート80、HCO-50（polyoxyethylene（50mol）adduct of hydrogenated castor oil）〕等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。直腸投与に用いられる坐剤は、有効成分を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製されてもよい。
　経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。このような組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有していてもよい。錠剤用の担体、賦形剤としては、例えば、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムが用いられる。
　上記の非経口用または経口用医薬組成物は、有効成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。このような投薬単位の剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤が挙げられる。免疫チェックポイント阻害薬は、投薬単位剤形当たり通常10～10000mg、好ましくは50～1000mg、より好ましくは100～1000mg含有されている。IL-18は、投薬単位剤形当たり通常1～100mg、好ましくは5～50mg含有されている。IL-2は、投薬単位剤形当たり通常104～106単位、好ましくは5×104～5×105単位含有されている。
　各有効成分の投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、成人の肝臓がんの治療のために使用する場合には、免疫チェックポイント阻害薬を1回量として、通常0.5～500mg/kg体重程度、好ましくは2.5～50mg/kg体重程度、より好ましくは5～50mg/kg体重程度、IL-18を1回量として、通常0.05～1mg/kg体重程度、好ましくは0.25～2.5mg/kg体重程度、IL-2を1回量として、通常5×102～5×104単位/kg体重程度、好ましくは2.5×103～2.5×104単位/kg体重程度を、1日1回～週1回程度、好ましくは週2～3回程度、静脈内又は腹腔内投与により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
　本発明の併用剤における有効成分の比率は、各有効成分の投与量が上記の範囲内にあれば特に制限はないが、例えば、IL-18の投与量を1とすると、免疫チェックポイント阻害薬の投与量は5～200程度、好ましくは10～50程度であり得る。また、T細胞増殖因子の投与量は、例えばIL-2の場合、1単位0.5ng換算で、IL-18の投与量1に対して、0.1～1程度、好ましくは0.2～0.5程度であり得る。
　本発明の併用剤が、各有効成分がそれぞれ別個の組成物の形態、あるいは、いずれか2剤が単一の組成物の形態で、残りの1剤が別の組成物の形態で提供される場合、各組成物は、同時に又は時間差をおいて、同一経路又は別経路で対象に投与することができる。
　IL-18BPはがん微小環境において発現が上昇しており、高い親和性でIL-18に結合してT細胞やNK細胞などのエフェクター細胞上のIL-18受容体との結合及びシグナル伝達を遮断して該エフェクター細胞の増殖・活性化を抑制する、可溶性の免疫チェックポイント分子として機能し得る。また、IL-18によるサイトカイン療法を受けたがん患者の血清中では、IL-18BPレベルが著明に上昇していることが報告されている。後述の実施例に示されるように、自然発症肝臓がんモデルマウスの血清ではIL-18BPレベルが上昇しており、免疫チェックポイント阻害薬とIL-18もしくはIL-2との2剤併用ではIL-BPレベルを低下させることはできないのに対し、3剤を組み合わせた本発明の併用剤は、IL-18BPレベルを著明に低下させることができる。また、IL-18療法を受けていない肝細胞がん患者の血清IL-18BPレベルは健常者のそれよりも著明に上昇しているが、患者間でもその数値は大きく異なることが明らかとなった。血清IL-18BPレベルの高値は、がん微小環境下でIL-18BPによる免疫抑制状態が成立していることを反映していると考えられる。そのため、血清IL-18BPレベルが特に高いがん患者に対して、IL-18BPの発現を低下させることのできる本発明の併用剤は、当該患者におけるIL-18による免疫抑制（T細胞やNK細胞等の免疫疲弊）を解除し得ると考えられるので、特に有用であり得る。実際、後述の実施例でも、個体数は少ないものの、自然発症肝臓がんモデルマウスにおいて、投与開始時の血清IL-18BPレベルが特に高い個体において、3剤投与後に顕著なIL-18BPレベルの低下が認められており、血清IL-18BPレベルを指標として本発明の併用剤が著効する対象を特定できる可能性が強く示唆される。
　IL-18BPは健常者でも恒常的に発現しており、正常血清レベルは数pg/mL程度と言われている。従って、好ましい一実施態様において、本発明の併用剤は、例えば、血清IL-18BPレベルが10 pg/mL以上、好ましくは20 pg/mL以上のがん患者に対して投与され得る。血清IL-18BPレベルは、例えば、抗IL-18BP抗体を用いた免疫化学的アッセイ（例、ELISA等）により測定することができ、そのようなELISAキットは市販されている。
　以下、実施例により、本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１　Mdr2-/- KOマウスに対する免疫チェックポイント阻害薬とIL-18及び/又はIL-2との併用療法
　肝細胞がんを自然発症したMdr2-/-KOマウス（60～64週齢、雌；The Jackson Laboratoryより入手）を4群に分け、
１）抗マウスPD-L1抗体（クローン10F.9G2；BioXcellより購入）200 μg/マウス、IL-18（組換えマウスIL-18；グラクソスミスクライン社製）10 μg/マウス、及びIL-2（遺伝子組換え型IL-2（イムネース注35）；塩野義製薬株式会社製）5,000単位/kg（IL-2+IL-18+PD-L1投与群）；
２）抗マウスPD-L1抗体 200 μg/マウス、及びIL-2 5,000単位/kg（IL-2+PD-L1投与群）；
３）抗マウスPD-L1抗体 200 μg/マウス、及びIL-18 10 μg/マウス（IL-18+PD-L1投与群）；又は
４）生理食塩水（Control（PBS投与）群）；
を週2回の間隔で、4週間腹腔内投与した。薬剤投与開始4週間後に各併用剤の効果を調べた。本実験のスケジュールを図１に示す。
（１）腫瘍増殖抑制効果
　CTスキャン（実験動物用3DマイクロX線CT装置（R_mCT2-SP2）：リガク社製）を用いて、薬剤投与開始時及び投与開始4週間後の肝臓のCT画像を撮影した。その結果、Control群では腫瘍サイズの増大傾向を認めたのに対し（図２－１）、IL-2+IL-18+PD-L1投与群では腫瘍サイズの縮小傾向が認められた（図３－１）。他方、IL-2+PD-L1投与群（図４）及びIL-18+PD-L1投与群（図５）では、腫瘍サイズの増大傾向を認め、免疫チェックポイント阻害薬といずれか一方のサイトカインとの2剤併用では腫瘍増殖抑制効果を奏しないことが明らかとなった。
　肝臓組織切片のHE染色の結果、Control群では、肝実質内に腺管様構造を伴う肝細胞がんを認めたが、腫瘍周辺への炎症細胞の浸潤は明らかでなかった（図２－２、Ａ～Ｃ）。一方、IL-2+IL-18+PD-L1投与群では、肝実質内に腺管様構造を伴う肝細胞がんや壊死した組織を認めた。また、腫瘍周辺への炎症細胞の浸潤が顕著であり、リンパ球や単核球を認めた。さらに腫瘍内にも炎症細胞の浸潤を認め、壊死組織の周囲に肝細胞の再生像やリンパ球の浸潤を認めた（図３－２、Ａ～Ｃ）。
（２）腫瘍マーカーの発現低下
　投与開始4週間後に各群のマウスから採血し、常法により血清AFPレベルを測定した。その結果、IL-2+IL-18+PD-L1投与群では、IL-2+PD-L1投与群及びIL-18+PD-L1投与群と比較して、有意にAFPレベルの低下を認めた（図６Ａ）。薬剤投与前後を比較すると、IL-2+IL-18+PD-L1投与群で併用投与によりAFP値の低下傾向を示した（図６Ｂ）。
（３）サイトカインの産生増強効果
　投与開始4週間後に各薬剤投与群における血清中のIFN-γ及びTNF-αレベルを測定・比較した。その結果、2剤併用（IL-2+PD-L1投与群及びIL-18+PD-L1投与群）では、IFN-γ、TNF-αのいずれも有意にその産生を増大させることはできなかったが、3剤を併用（IL-2+IL-18+PD-L1投与群）すると、FN-γ及びTNF-αの産生が有意に増大した（図７、左）。薬剤投与前後を比較すると、IL-2+IL-18+PD-L1投与群で併用投与によりIFN-γ、TNF-αのいずれの血清レベルも有意に上昇した（図７、右）。
（４）3剤併用の治療効果に対するT細胞及びNK細胞の寄与
　IL-2+IL-18+PD-L1に加えて、NK細胞表面上に発現する糖脂質のアシアロGM1に対する抗体を投与して、NK細胞を除去したところ、薬剤投与前後の画像診断により腫瘍サイズが増大することが明らかとなった（図８）。このことから、3剤併用による腫瘍増殖抑制効果にNK細胞が役割を果たしていることが示唆された。
　また、IL-2+IL-18+PD-L1に加えて、キラーT細胞（CTL）表面上に発現するCD8に対する抗体を投与して、CTLを除去したところ、薬剤投与前後の画像診断により腫瘍サイズが増大することが明らかとなった（図９－１）。さらに、投与開始4週間後の血清中のAFP、IFN-γ、TNF-αのレベルを比較すると、IL-2+IL-18+PD-L1+抗CD8抗体投与群では、IL-2+IL-18+PD-L1投与群と比較して、AFPレベルの有意な上昇と、IFN-γ、TNF-αレベルの有意な低下を認めた（図９－２）。このことから、3剤併用による腫瘍増殖抑制効果に、CTLが少なくとも炎症性サイトカインの産生増強作用を介して重要な役割を果たしていることが示された。
（５）IL-18BPとの関係
　投与開始4週間後に各薬剤投与群のマウスから血清を採取し、血清中のIL-18BPレベルを測定・比較した。その結果、Mdr2 KOマウスの血清中でIL-18BPレベルが上昇しており、がん微小環境においてIL-18BPが高発現していることが示唆された。2剤併用（IL-2+PD-L1投与群及びIL-18+PD-L1投与群）では、IL-18BPレベルを低下させることはできず、N数は少ないものの、IL-2+PD-L1投与群では薬剤投与によりむしろIL-18BPレベルは上昇した。これに対し、IL-2+IL-18+PD-L1投与群ではIL-18BPレベルを有意に低下させることができた（図１０－１、左）。薬剤投与前後を比較すると、IL-2+IL-18+PD-L1投与群で併用投与によりIL-18BPレベルが有意に低下した（図１０－１、右）。
　3剤併用によるIL-18BP発現低下作用は、抗CD8抗体の投与により無効化された（図１０－２）。このことは、IL-18BP発現低下作用にCTLが重要な役割を果たしていることを示唆している。
　東京都立駒込病院を受診したC型肝炎ウイルス（HCV）陽性の肝細胞がん患者69人、肝内胆管がん患者8人及び健常ボランティア24人から、インフォームドコンセントを得て採取した血清中のIL-18BPレベルを測定した。その結果、肝細胞がん患者では、健常人、肝内胆管がん患者に比べて血清IL-18BPレベルが著明に上昇していることが明らかとなった（図１１－１）。また、肝細胞がん患者間でもIL-18BPレベルに最大4倍以上の差異が認められた。
　一方、前記肝細胞がん患者69人と健康ボランティア24人から採取した血清中のIL-18レベルを測定したところ、肝細胞がん患者では、健常人に比べて血清IL-18レベルが有意に上昇していた（図１１－２；慢性肝炎患者30人、肝硬変患者15人から採取した血清中のIL-18レベルの結果を合わせて示す）。しかし、肝細胞がん患者における血清IL-18レベルと血清IL-18BPレベルとの間には相関が認められなかった（図１１－３）。
　本発明の併用剤は、肝臓がんなどの難治性がん、特に免疫チェックポイント阻害薬の単独療法やそれと他剤との併用が無効もしくは不適応ながんに対して有効な複合がん免疫療法剤となり得る点で極めて有用である。また、血清IL-18BPレベルを測定するコンパニオン診断の実施により、本併用剤がより著効するがん患者を予測することも可能となる。
　本出願は日本で出願された特願２０２１－１３０２９４（出願日：２０２１年８月６日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (8)

  1. 　免疫チェックポイント阻害薬と、インターロイキン-18（IL-18）と、T細胞増殖因子とを組み合わせてなる、がん治療剤。
  2. 　T細胞増殖因子が、インターロイキン-2（IL-2）、インターロイキン-15（IL-15）及びインターロイキン-7（IL-7）からなる群より選択される1以上のサイトカインである、請求項１に記載の剤。
  3. 　T細胞増殖因子としてIL-2を含む、請求項２に記載の剤。
  4. 　免疫チェックポイント阻害薬が、抗PD-L1抗体、抗PD-1抗体、抗CTLA4抗体、抗LAG-3抗体及び抗TIM-3抗体からなる群より選択される1以上の抗体である、請求項１～３のいずれか１項に記載の剤。
  5. 　免疫チェックポイント阻害薬の単独療法又は免疫チェックポイント阻害薬とIL-18との併用療法に抵抗性のがんに対する、請求項１～４のいずれか１項に記載の剤。
  6. 　血清IL-18結合タンパク質（IL-18BP）レベルが10 pg/mL以上である対象に投与される、請求項１～５のいずれか１項に記載の剤。
  7. 　がんが炎症関連がんである、請求項１～６のいずれか１項に記載の剤。
  8. 　炎症関連がんが消化器がんである、請求項７に記載の剤。
PCT/JP2022/030084 2021-08-06 2022-08-05 がんの治療剤 WO2023013763A1 (ja)

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