JP2018531913A - ネクチン−4に対する特異性を有する抗体及びその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ネクチン−4に対する特異性を有する抗体及びその使用に関する。
ネクチン−4は、4つのメンバーを含むタンパク質のネクチンファミリーに属する表面分子である。発達及び成人期において、上皮細胞、内皮細胞、免疫細胞及び神経細胞では、ネクチンは、極性、増殖、分化及び遊走などの様々な生物学的過程において重要な役割を果たす細胞接着分子である。それらは、ヒトにおけるいくつかの病理学的過程に関与する。それらは、ポリオウイルス、単純ヘルペスウイルス及び麻疹ウイルスのための主なレセプターである。ネクチン−1(PVRL1)又はネクチン−4(PVRL4)をコードする遺伝子の突然変異は、他の異常に関連する外胚葉性異形成症候群を引き起こす。ネクチン−4は、胎児発達中に発現される。成人組織では、その発現は、ファミリーの他のメンバーのものよりも限定的である。それぞれ乳ガン、卵巣ガン及び肺ガンの50%、49%及び86%において(すなわち、主に予後不良の腫瘍において)、ネクチン−4は腫瘍関連抗原である。対応する正常組織では、その発現は検出されない。乳房腫瘍では、ネクチン−4は、主にトリプルネガティブ及びERBB2+ガン腫において発現される。これらのガンを有する患者の血清では、可溶性形態のネクチン−4の検出は、予後不良に関連する。血清ネクチン−4のレベルは転移進行中に増加し、処置後に減少する。これらの結果は、ネクチン−4が、ガンの処置のための信頼性のあるターゲットであり得ることを示唆している。したがって、先行技術には、いくつかの抗ネクチン−4抗体が記載されている。特に、エンフォルツマブベドチン(ASG−22ME)は、ネクチン−4をターゲティングする抗体−薬物コンジュゲート(ADC)であり、現在、固形腫瘍を患っている患者の処置について臨床的に研究されている。
本発明は、ネクチン−4に対する特異性を有する抗体及びその使用に関する。特に、本発明は、N41mab抗体(N41mab)に由来する抗体を提供する。実際、本発明者らは、N41mabが固有の抗転移活性を有していたことを示す:N41mabは、マトリゲル浸潤を減少させることによって、ネクチン4発現乳房腫瘍細胞の腫瘍浸潤特性を著しく減少させた。異種移植マウスモデルを使用して、本発明者らは、腫瘍細胞をマウス尾静脈に全身注射した後、10mg/kg N41mabでマウスを週2回処置すると、原発部位からの腫瘍拡散が著しく阻害され、さらには転移形成が遮断されることを示した。N41mabとオーリスタチン−Eとのコンジュゲーション(N41mab−MMAE)は、5ng/ml(33pM)のIC50値で、in vitroにおける乳房腫瘍細胞成長の著しい阻害を誘導した。2.5又は10mg/kg N41mab−MMAEの2回の静脈内注射で腫瘍発症時に処置したマウスは、迅速かつ持続的な腫瘍退縮を誘導した。より具体的には、本発明者らは、N41mabが、先行技術に記載されている最新の抗ネクチン4抗体(すなわち、ASG−22ME)よりも効率的であることを実証する。したがって、前記抗体は、ガン患者を処置して腫瘍進行を予防及び/又は根絶するための新たな方法である。
シクロアルケニル会合残基F、H、W及びY
疎水性残基A、C、F、G、H、I、L、M、R、T、V、W及びY
負に荷電した残基D及びE
極性残基C、D、E、H、K、N、Q、R、S及びT
正に荷電した残基H、K及びR
小型残基A、C、D、G、N、P、S、T及びV
非常に小型の残基A、G及びS
ターン形成に関与する残基A、C、D、E、G、H、K、N、Q、R、S、P及びT
フレキシブルな残基Q、T、K、S、G、P、D、E及びR
材料及び方法
細胞株:
10%FBS(ウシ胎児血清)、50IU/ml ペニシリン、50μg/ml ストレプトマイシン及び2mM グルタミンを補充したDMEM中で、ヒト乳ガン細胞株MDA−MB−231(ATCC, Manassas, VA)を培養した。PVRL4 cDNAを含有する発現ベクターp3XFLR4.C1を細胞にトランスフェクションした[x]。SUM−185、SUM−190及びSUM−225乳ガン株は、Dr S. P. Ethier (University of Michigan)よって厚意で提供されたものであった。5%FBS、非必須アミノ酸、10μg/ml インスリン、1μg/ml ヒドロコルチゾン、50IU/ml ペニシリン、50μg/ml ストレプトマイシン及び2mM グルタミンを含むHam’s F12培地中で、それらを培養した。10%FBS、10μg/ml インスリン、50IU/ml ペニシリン、50μg/ml ストレプトマイシン及び2mM グルタミンを補充したRPMI中で、BT−474(ERBB2+)乳ガン細胞株(ATCC)を培養した。
サンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイを使用して、N41mab抗体の特異性をコントロールし、mab間の競合アッセイを実施した。5ug/ml ネクチン4V−Fc又はネクチン1V−Fc(IgVドメインのみを含有する)で96ウェルトレイを+4℃で一晩コーティングした。PBSによる洗浄及び飽和の後、1%BSA細胞を0.625μg/ml N41mabと共に一晩インキュベーションした。ペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗マウス抗体を25℃で2時間インキュベーションした(Pierce)。競合の場合、可変濃度の「コールド」mAbの存在下で、ペルオキシダーゼコンジュゲートN41mabの結合を測定した。ペルオキシダーゼ基質 100μlを追加し(One Step ABST, Pierce)、ODを405nmで読み取った。
2μg/ml N41mab抗体を使用した、ネクチン4のN末端Flagタグ付エピトープをトランスフェクションしたMDAMB231細胞株のFACS分析。次いで、フィコエリトリンコンジュゲートヤギ抗マウス抗体(Beckman-Coulter)で細胞を染色した。
イムノブロット実験:細胞溶解物MDAMB231ネクチン4細胞の分析。100mmディッシュ中の細胞を氷冷PBSで3回洗浄し、次いで、50mM Hepes、pH7.5、150mM NaCl、1.5mM MgCl2、1mM EGTA、1%Triton X−100及び10%グリセロールを含有する氷冷溶解バッファー 750_lに30分間再懸濁した。製造業者(Roche Diagnostics)によって推奨されているように、プロテアーゼ阻害剤混合物を追加した。SDSサンプルバッファー(60mM Tris−HCl、pH6.7、3%SDS、2%(v/v)2−メルカプトエタノール及び5%グリセロール)中で溶解物を加熱し、8%SDS−PAGEによって分離し、フッ化ポリビニリデン膜(Immobilon-P, Millipore, Boston, MA)に半乾で転写し、Mini-Protean II multiscreen装置を使用して1μg/ml MOPC21、抗FLAG M2及びN41mabでプローブした。ECL (Pierce)を用いて、可視化を行った。
簡潔に言えば、精製N41mab及びHa22−2モノクローナル抗体から、コンジュゲートを生産した。使用したリンカーは、モノメチルオーリスタチン−E(MMAE)に共有結合されたMC−Val−Cit−PAB−PNP(マレイミドカプロイル−L−バリン−L−シトルリン−p−アミノベンジルアルコールp−ニトロフェニルカーボナート)である。薬物対抗体比は、それぞれ4.73及び4.04であった。
ADCの効果を分析するために、製造業者(Biosource, CA, USA)によって推奨されているようにalamarBlue染色手順を使用して、細胞成長を測定した。試験には、蛍光酸化還元指標が組み込まれている。蛍光強度は、細胞代謝の減少に比例する。0日目に、96ウェルプレート中、1ウェル当たり細胞 3000個をADCの連続希釈物と共に3回反復でインキュベーションすることによって、実験を行った。5日目に、1/10容量のalamarBlue溶液を37℃で2時間インキュベーションすることによって、alamarBlueを測定し、595nmで読み取った(FLUOstar Optima, BMG Labtech)。
マトリゲル(BD BioCoat Growth Factor reduced Matrigel Invasion Chamber (Becton Dickinson, MA, USA))でコーティングした8mm孔径膜を有する24個の細胞培養インサートを使用して、浸潤アッセイを実施した。化学誘導物質(10%FCS)をウェルに追加し、細胞 105個をRPMI 0.1%BSA中のインサートにロードした。プレートを37℃で72時間インキュベーションした。遊走後、綿棒を用いて上部膜表面上の非遊走細胞を除去し(4回/インサート)、膜の底面に付着した遊走細胞を0.2%クリスタルバイオレットエタノール溶液(Sigma)で20分間染色した。蒸留水 200mlで5回洗浄した後、倒立顕微鏡を用いて侵襲性細胞をカウントした。各測定は、2回反復で行った3回の個々の実験の平均を表す。
Charles River Laboratory (Margate, UK)から、NOD/SCID(非肥満糖尿病/重症複合免疫不全)/gcヌルマウス(NSG)を入手した。
結果は、図1〜9に示されている。
材料及び方法
患者及び乳ガンサンプル。倫理声明。
遺伝子発現分析のためにDNAマイクロアレイを使用して、臨床サンプルをプロファイリングした。本発明者ら独自のデータセットには、診断時において非転移性の患者に由来する処置前浸潤性ガン腫に相当する353症例が含まれていた。本研究は、本発明者らの施設内倫理委員会によって承認された(the Institut Paoli Calmettes (IPC) “Comite d’Orientation Strategique”承諾番号15−002)。各患者から、研究利用に関する書面によるインフォームドコンセントを得た。本発明者らは、PVRL4に相当する少なくとも1つのプローブセットを含む17個の利用可能なデータセットを用いて本発明者らの系列をプールした。National Center for Biotechnology Information (NCBI)/Genbank GEO及びArrayExpressのデータベース並びに著者のWebサイトから、これらのセットを収集した(データは示さず)。最終的にプールしたデータセットには、PVRL4 mRNA発現を有し、臨床病理学的データが利用可能な非冗長、非転移性、非炎症性、原発性、浸潤性乳ガン 5,673個が含まれていた(データは示さず)。タンパク質発現のために、診断時及び全身療法前のTNBCサンプル 61個の連続パネルの分析を、本発明者らの施設で処置した女性から得た。各患者について、研究参加に関するインフォームドコンセントを得、研究は、本発明者らの施設内倫理委員会によって承認された(データは示さず)。
以前に記載されているように(21)、Affymetrix U133 Plus 2.0ヒトマイクロアレイ(Affymetrix(登録商標), Santa Clara, CA, USA)を使用して、本発明者ら独自の遺伝子発現データセットを作成した。MIAME準拠のデータは、GEOデータベースに保管されている(GSE31448)。NCBIプログラムBLASTN 2.2.31+を使用してその同定及び特異性を検証した異なるプローブセットを分析することによって、PVRL4発現を測定した(データは示さず)。データ分析は、分析前の加工が必要であった。最初に、利用可能な加工された非Affymetrixデータのための分位正規化(Agilent, SweGene, Illumina)及び生Affymetrixデータのためのノンパラメトリック分位アルゴリズムによるRobust Multichip Average(RMA)(22)を使用して、各データセットを別個に正規化した。Bioconductor及び関連パッケージを使用してRで正規化を行った。第2の工程では、示されている異なる技術プラットフォームにわたってEntrezGeneIDを使用して、ハイブリダイゼーションプローブをマッピングした。複数のプローブが同じGeneIDにマッピングされる場合、本発明者らは、特定のデータセットにおいて分散が最も高いものを保持した。異なるデータセットにわたって免疫組織化学分析に関連するバイアスを回避するために、及び対応するmRNA発現レベルの二峰性分布により、それぞれESR1、PGR及びERBB2のmRNA発現データを使用して、エストロゲンレセプター(ER)、プロゲステロンレセプター(PR)及びHER2の発現(陰性/陽性)を転写レベルで定義した(23)。次いで、異なる多重遺伝子分類を各データセットに別個に適用した。ESR1、PGR及びERBB2(ESR1+及び/又はPGR+及び;ERBB2−腫瘍の場合にはHR+;ERBB2+腫瘍の場合にはERBB2+及びESR1−,PGR−及び;ERBB2−腫瘍の場合にはTN)のmRNA発現レベルを使用して、並びにPAM50分類を使用して、腫瘍の固有分子サブタイプを定義した(24)。PVRL4が基礎遺伝子クラスタに存在するので、本発明者らはまた、免疫応答に関連し、ER−、TN又は基礎乳ガンにおいて検証された3つの予後遺伝子発現シグネチャー(GES):「免疫応答GES」(25)、「LCK GES」(26)及び「キナーゼ免疫GES」(27)を分析した。PVRL4 mRNA発現の分析前に、参照として管腔A集団を使用して、各データセット内で発現データを標準化し、実験室固有の変動及び集団の不均一性によるバイアスを排除し、全てのデータセットを比較可能にする。以前に報告されているように(28)、標準化の前後に全ての腫瘍及びPAM50遺伝子に適用した主成分分析(PCA)により、正規化の正確性を検証することができた。
ネクチン−4の遠位IgV様ドメインに対する6つの異なるモノクローナル抗体(mab1〜mab6)を生産及び分析した。リコンビナント可溶性キメラネクチン4V−Fcタンパク質を使用して、マウスを免疫化した(6)。トランスフェクションMDA−MB−231細胞を使用したフローサイトメトリーとELISAとによって、ネクチン−4に対するハイブリドーマ由来抗体のスクリーニングを行った。
凍結組織由来の5μm切片に対して、IHCを行った。切片をアセトンで10分間固定し、10分間風乾し、TBSTで再水和した。0.5μg/ml mab1/N41mabを用いて、染色を37℃で3時間行った。二次抗体OmnipMap抗Ms HRP (Multimer HRP, Roche)を15分間インキュベーションした。次いで、ヘマトキシリンII及びブルーイング試薬(Roche)を用いて、対比染色を行った。陽性細胞(P)の割合に強度(I)を掛けることによって、結果をスコアリングした(Quick score)。式:QS=P×I。最大スコアは300である。
10%FBS(ウシ胎児血清)、50IU/ml ペニシリン、50μg/ml ストレプトマイシン及び2mM グルタミンを補充したDMEM中で、ヒト乳ガン細胞株MDA−MB−231(ATCC, Manassas, VA)を培養した。PVRL4 cDNAを含有する発現ベクターp3XFLR4.C1を細胞にトランスフェクションした(7)。SUM190乳ガン株は、Dr S. P. Ethier (University of Michigan)よって厚意で提供されたものであり、5%FBS、非必須アミノ酸、10μg/ml インスリン、1μg/ml ヒドロコルチゾン、50IU/ml ペニシリン、50μg/ml ストレプトマイシン及び2mM グルタミンを含むHam’s F12培地中で培養した。
Concortis (San Diego, CA, USA)によって、ADCの生産を実施した。簡潔に言えば、精製mab1/N41mabモノクローナル抗体から、コンジュゲートを生産した。使用したリンカーは、モノメチルオーリスタチン−E(MMAE)に共有結合されたMC−Val−Cit−PAB−PNP(マレイミドカプロイル−L−バリン−L−シトルリン−pアミノベンジルアルコールp−ニトロフェニルカーボナート)である。この切断可能なリンカーは強力なバイスタンダー殺傷を誘導したので、それを選択した。薬物対抗体比は、4.73であった。
サンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイを使用して、N41mab抗体の特異性をコントロールした。5ug/ml ネクチン4V−Fc又はネクチン1V−Fc(IgVドメインのみを含有する)で96ウェルトレイを+4℃で一晩コーティングした。PBSによる洗浄及び飽和の後、1%BSA細胞を0.625μg/ml N41mabと共に一晩インキュベーションした。ペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗マウス抗体を25℃で2時間インキュベーションした(Pierce)。ペルオキシダーゼ基質 100μlを追加し(One Step ABST, Pierce)、ODを405nmで読み取った。
2□g/ml mab1/N41mab抗体を使用して、ネクチン4のN末端Flagタグ付エピトープをトランスフェクションしたMDA−MB−231細胞のFACS分析を行った。次いで、フィコエリトリンコンジュゲートヤギ抗マウス抗体(Beckman-Coulter)で細胞を染色した。
100mmディッシュ中、MDA−MB−231ネクチン−4細胞においてネクチン−4発現を分析し、氷冷PBSで3回洗浄し、次いで、50mM Hepes、pH7.5、150mM NaCl、1.5mM MgCl2、1mM EGTA、1%Triton X−100及び10%グリセロールを含有する氷冷溶解バッファー 750μlに30分間再懸濁した。推奨されているように(Roche Diagnostics)、プロテアーゼ阻害剤混合物を追加した。SDSサンプルバッファー(60mM Tris−HCl、pH6.7、3%SDS、2%(v/v)2−メルカプトエタノール及び5%グリセロール)中で溶解物を加熱し、8%SDS−PAGEによって分離し、フッ化ポリビニリデン膜(Immobilon-P, Millipore, Boston, MA, USA)に半乾で転写し、Mini-Protean II multiscreen装置を使用して1μg/ml MOPC21、抗FLAG M2及びmab1/N41mabでプローブした。ECL (Pierce)を用いて、可視化を行った。
ADCの効果を分析するために、製造業者(Biosource, CA, USA)によって推奨されているようにalamarBlue染色手順を使用して、細胞成長を測定した。試験には、蛍光酸化還元指標が組み込まれている。蛍光強度は、細胞代謝の減少に比例する。0日目に、96ウェルプレート中、1ウェル当たり細胞 3000個をADCの連続希釈物と共に3回反復でインキュベーションすることによって、実験を行った。5日目に、1/10容量のalamarBlue溶液を37℃で2時間インキュベーションすることによって、alamarBlueを測定し、595nmで読み取った(FLUOstar Optima, BMG Labtech)。
実験は全て、動物管理に関するフランスのガイドラインにしたがって実施し、地方倫理委員会によって承認された(承諾番号01152−01)。Dr. C. Rivers (Margate, UK)から、NOD/SCID/γcヌルマウス(NSG)を得た。滅菌飼料及び水を不断給餌で提供する滅菌条件下でマウスを飼育し、明期12時間及び暗期12時間で維持した。SUM190細胞を、50%フェノールレッドフリーマトリゲル(Becton Dickinson Bioscience)に懸濁した(0.5×106)で乳房脂肪体に接種した。患者由来の腫瘍細胞(PDXモデル)を、50%フェノールレッドフリーマトリゲルに懸濁した(0.2〜0.5×106)で乳房脂肪体に接種した。
フィッシャーの直接確率検定を使用して、腫瘍群と臨床病理学的特徴との間の相関を分析した。診断日から遠隔再発の日まで、無転移生存(MFS)を計算した。無症候患者について診断日から最新情報の日まで、経過観察を測定した。カプラン・マイヤー法を使用して生存を計算し、ログランク検定を用いて曲線を比較した。コックス回帰分析(ワルド検定)を使用して、単変量生存分析及び多変量生存分析を行った。単変量分析で試験した変数には、診断時の患者の年齢(50歳以下対50歳超)、病理学的種類(管状対結節性)、病理学的腫瘍サイズ(pT:pT1対pT2〜3)、病理学的腋窩リンパ節の状態(pN:陰性対陽性)、病理学的悪性度(1〜2対3)及びPVRL4発現(「高」対「低」)が含まれていた。単変量分析で0.05未満のp値の変数を多変量分析で試験した。統計的検定は全て、5%レベルの有意性で両側であった。Rソフトウェア(バージョン2.30)(バージョン2.9.1;http://www.cran.r-project.org/)の生存パッケージを使用して、統計分析を行った。本発明者らは、腫瘍マーカー予後研究(REMARK基準)に関する報告推奨に従った。データは平均+s.e.m.として示されており、GraphPad Prismソフトウェアを使用してマンホイットニー検定によって計算した。P<0.05を統計的に有意であるとみなした。データは、少なくとも3回の実験の代表である。
ネクチン4/PVRL4は、TNBC特異的バイオマーカーである
本発明者らは、DNAマイクロアレイ及び100%特異的な5つの異なるPVRL4プローブを使用してプロファイリングした一連のプールした浸潤性乳ガン 5673個におけるPVRL4 mRNA発現を検査した(材料及び方法を参照のこと)。本発明者ら独自のサンプル系列 353個の全ゲノムクラスタリングにより、PVRLは「基礎」遺伝子クラスタ内にあったことが示された(データは示さず)。高いPVRL4発現は、トリプルネガティブ(TN)サブタイプ及びPAM50基礎サブタイプの両方を含む予後不良特徴に関連していた(データは示さず)。転移性再発を伴わない613人(平均経過観察、83カ月間)及び転移性再発を伴う424人(再発までの平均時間、24カ月間)を含む患者 1,037人について、無転移生存(MFS)データが利用可能であった。5年MFS率は、61%であった(95CI、0.58〜0.65)。全集団において、高いPVRL4発現はより短いMFSに関連していた(p=0.0143、ログランク検定)(データは示さず)。TNサブグループにおいてのみ、高いPVRL4発現はMFSに実際に関連しており、それぞれ「PVRL4−高」群及び「PVRL4−低」群における5年MFSは47%(95CI、0.40〜0.55)対62%(95CI、0.51〜0.74)であり(p=0.014、ログランク検定)、(図1c)、多変量分析では、PVRL4発現は予後影響力を保持していた(p=0.036、ワルド検定;HR=1.53[1.02−2.30])(表1)。次に、本発明者らは、TNBC 61個(これらのうちの12個は、DNAマイクロアレイを使用して以前にプロファイリングされている)において、免疫組織化学によって、タンパク質レベルにおけるネクチン−4の発現を検査した。この分析に使用したモノクローナル抗体は、本発明者らのスクリーニングから選択し(次の段落を参照のこと)、ヒトネクチン−4の遠位IgV様ドメインを認識し、他のヒトネクチン又はマウスネクチン−4と交差反応しなかった(データは示さず)。QuickScore(QS)半定量的評価に基づいて、本発明者らは、100超のQSを有する「ネクチン−4−高群」と100未満のQSを有する「ネクチン−4−低群」とを区別した(これらは、それぞれTNBCの62%及び38%に相当する)(データは示さず)。ネクチン−4発現は、原形質膜において検出された。ネクチン−4のmRNA及びタンパク質発現は、優れた相関を示した(データは示さず;p=0.0022)。重要なことに、正常乳腺上皮(データは示さず)及び皮膚を除く30個の異なる成人正常組織(データは示さず)において、ネクチン−4は検出されなかった。これらの結果は、ネクチン−4が、新たな細胞表面バイオマーカー及びTNBCの潜在的なターゲットの両方であることを立証している。
本発明者らは、ネクチン−4のIgV様遠位ドメインに対する6つのモノクローナル抗体(mAb)を生産及び試験して、インターナリゼーションを誘導することができるmAbを単離した。EC50、最大結合能力、細胞表面インターナリゼーション及び細胞傷害性について、mAbを評価した(データは示さず)。MDA−MB−231細胞において発現されたFlagタグ付ネクチン−4と、FITC標識抗Flag抗体(M2, Sigma-Aldrich)とを使用して、インターナリゼーションを試験して、残存表面ネクチン−4を定量した。mab1は、最も効率的な抗体であった。それは、24時間で細胞表面ネクチン−4の60%の減少を誘導し、サポリンにコンジュゲートされたヤギ抗マウスモノクローナル抗体(mab-ZAP kit, ATS-bio)と共にインキュベーションした後に60%の細胞成長阻害を誘導した。インターナリゼーション及び細胞傷害性は相関していた(R2=0.9606)。mab1は、in vitroにおける細胞生存及びin vivoにおける腫瘍細胞成長に影響を与えなかった(データは示さず)。次いで、切断可能なバリン−シトルリン(vc)ジペプチドリンカーを介して、mab1をモノメチルオーリスタチン−E(MMAE)にコンジュゲートして(以下、N41mab−vcMMAE、すなわちADCと称する)ADCを生産し、これを、選択乳ガン細胞株において特異性及び有効性についてin vitroで試験した。ネクチン−1、ネクチン−2及びネクチン−3を発現するがネクチン−4を発現しないMDA−MB−231細胞は、ADCに対して非感受性であった。しかしながら、ネクチン−4の異所性発現は、IC50=2ng/mlで感受性を付与した(データは示さず)。内因性ネクチン−4を発現するSUM190細胞は、IC50=4ng/mlで感受性であった(データは示さず)。これらのデータにより、N41mab−vcMMAEの特異性及び有効性が示された。
TNBCを発症した免疫不全NSGマウスのin vivoモデル 3匹において、本発明者らのADCの活性を試験した。第1に、SUM190細胞を異種移植したマウスを、N41mab−vcMMAEの2回の連続する静脈内投与で処置した(データは示さず)。これら投与は、マウスにとって毒性ではなかった(データは示さず)。N41mab−vcMMAEは、迅速(4日)かつ用量依存的な腫瘍退縮を誘導し、これは最大40日間持続した(データは示さず)。再発後、腫瘍は依然として、少なくとも6カ月間にわたってADCに対する感受性を保持していた(データは示さず)。
本出願を通して、本発明が関係する技術水準が様々な参考文献に記載されている。これらの参考文献の開示は、参照により本開示に組み入れられる。
Claims (15)
- ネクチン−4に対する特異性を有する抗体であって、
−i)N41mabのH−CDR1と少なくとも90%の同一性を有するH−CDR1と、ii)N41mabのH−CDR2と少なくとも90%の同一性を有するH−CDR2と、iii)N41mabのH−CDR3と少なくとも90%の同一性を有するH−CDR3とを含む重鎖と、
−i)N41mabのL−CDR1と少なくとも90%の同一性を有するL−CDR1と、ii)N41mabのL−CDR2と少なくとも90%の同一性を有するL−CDR2と、iii)N41mabのL−CDR3と少なくとも90%の同一性を有するL−CDR3とを含む軽鎖とを有し、
−N41mabのH−CDR1が、配列番号1の31位のアミノ酸残基から35位のアミノ酸残基までの範囲の配列によって定義され、
−N41mabのH−CDR2が、配列番号1の50位のアミノ酸残基から65位のアミノ酸残基までの範囲の配列によって定義され、
−N41mabのH−CDR3が、配列番号1の98位のアミノ酸残基から105位のアミノ酸残基までの範囲の配列によって定義され、
−N41mabのL−CDR1が、配列番号2の24位のアミノ酸残基から34位のアミノ酸残基までの範囲の配列によって定義され、
−N41mabのL−CDR2が、配列番号2の50位のアミノ酸残基から56位のアミノ酸残基までの範囲の配列によって定義され、
−N41mabのL−CDR3が、配列番号2の89位のアミノ酸残基から96位のアミノ酸残基までの範囲の配列によって定義される、抗体。 - i)N41mabのH−CDR1と、ii)N41mabのH−CDR2と、iii)N41mabのH−CDR3とを含む重鎖と、i)N41mabのL−CDR1と、ii)N41mabのL−CDR2と、iii)N41mabのL−CDR3とを含む軽鎖とを有する、請求項1に記載の抗体。
- 配列番号1と同一の重鎖と、配列番号2と同一の軽鎖とを有する、請求項1に記載の抗体。
- キメラ抗体である、請求項1に記載の抗体。
- N41mab抗体のCDRを含むヒト化抗体である、請求項1に記載の抗体。
- 請求項1に記載の抗体をコードする、核酸分子。
- 細胞傷害性部分にコンジュゲートされている、請求項1に記載の抗体。
- タキソール;サイトカラシンB;グラミシジンD;エチジウムブロミド;エメチン;マイトマイシン;エトポシド;テノポシド;ビンクリスチン;ビンブラスチン;コルチシン;ドキソルビシン;ダウノルビシン;ジヒドロキシアントラシンジオン;チューブリン阻害剤、例えば、メイタンシン又はその類似体若しくは誘導体;メルタシン又はそのペプチド類似体、誘導体若しくはプロドラッグ;抗有糸分裂剤、例えば、モノメチルオーリスタチンE若しくはF又はそれらの類似体若しくは誘導体;ドラスタチン10若しくは15又はそれらの類似体;イリノテカン又はその類似体;マイトキサントロン;ミトラマイシン;アクチノマイシンD;1−デヒドロテストステロン;グルココルチコイド;プロカイン;テトラカイン;リドカイン;プロプラノロール;ピューロマイシン;カリケアマイシン又はその類似体若しくは誘導体;代謝拮抗剤、例えば、メトトレキサート、6メルカプトプリン、6チオグアニン、シタラビン、フルダラビン、5フルオロウラシル、デカルバジン、ヒドロキシ尿素、アスパラギナーゼ、ゲムシタビン又はクラドリビン;アルキル化剤、例えば、メクロレタミン、チオエパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン(BSNU)、ロムスチン(CCNU)、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブルモマンニトール、ストレプトゾトシン、ダカルバジン(DTIC)、プロカルバジン、マイトマイシンC;プラチナ誘導体、例えば、シスプラチン又はカルボプラチン;デュオカルマイシンA、デュオカルマイシンSA、ラケルマイシン(CC−1065)又はその類似体若しくは誘導体;抗生物質、例えば、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ミトラマイシン、マイトマイシン、マイトキサントロン、プリカマイシン、アントラマイシン(AMC);ピロール[2,1−c][1,4]−ベンゾジアゼピン(PDB);ジフテリアトキシン及び関連分子、例えば、ジフテリアA鎖及びその活性フラグメント並びにハイブリッド分子、リシントキシン、例えば、リシンA又は脱グリコシル化リシンA鎖トキシン、コレラトキシン、シガ様トキシン、例えば、SLT I、SLT II、SLT IIV、LTトキシン、C3トキシン、シガトキシン、百日咳トキシン、破傷風トキシン、ボウマン・バークダイズプロテアーゼ阻害剤、シュードモナス外毒素、アロリン、サポリン、モデシン、ゲラニン、アブリンA鎖、モデシンA鎖、アルファ−サルシン、アレウリテス・フォルジ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチンタンパク質、フィトラッカ・アメリカナ(Phytolacca americana)タンパク質、例えば、PAPI、PAPII及びPAP−S、モモルディカ・カラチア(momordica charantia)阻害剤、クルシン、クロチン、サポナリア・オフィシナリス(sapaonaria officinalis)阻害剤、ゲロニン、マイトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン及びエノマイシントキシン;リボヌクレアーゼ(RNase);DNaseI、ブドウ球菌内毒素A;ポークウィード抗ウイルスタンパク質;ジフテリントキシン;及びシュードモナス外毒素からなる群より選択される細胞傷害性部分にコンジュゲートされている、請求項7に記載の抗体。
- オーリスタチン又はそのペプチド類似体、誘導体若しくはプロドラッグにコンジュゲートされている、請求項7又は8に記載の抗体。
- 医薬として使用するための、請求項1に記載の抗体。
- それを必要とする被験体におけるガンを処置する方法であって、治療有効量の請求項1に記載の抗体を該被験体に投与することを含む、方法。
- ガンが乳ガン、卵巣ガン又は肺ガンである、請求項11に記載の方法。
- ガンが転移性ガンである、請求項11に記載の方法。
- 請求項1に記載の抗体を含む、医薬組成物。
- 請求項1に記載の抗体の少なくとも1つのVH及び/又はVL配列を含む、キメラ抗原レセプター。
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