WO2022124295A1 - 酪酸菌用プレバイオティクス組成物 - Google Patents

酪酸菌用プレバイオティクス組成物 Download PDF

Info

Publication number
WO2022124295A1
WO2022124295A1 PCT/JP2021/044875 JP2021044875W WO2022124295A1 WO 2022124295 A1 WO2022124295 A1 WO 2022124295A1 JP 2021044875 W JP2021044875 W JP 2021044875W WO 2022124295 A1 WO2022124295 A1 WO 2022124295A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
acid
oligosaccharide
gluuronic
salt
butyrate
Prior art date
Application number
PCT/JP2021/044875
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
隆太 村上
Original Assignee
森永乳業株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 森永乳業株式会社 filed Critical 森永乳業株式会社
Priority to EP21903394.1A priority Critical patent/EP4257183A1/en
Priority to US18/256,080 priority patent/US20240016825A1/en
Priority to JP2022568285A priority patent/JPWO2022124295A1/ja
Priority to CN202180082232.4A priority patent/CN116782909A/zh
Publication of WO2022124295A1 publication Critical patent/WO2022124295A1/ja

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/702—Oligosaccharides, i.e. having three to five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/125—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives containing carbohydrate syrups; containing sugars; containing sugar alcohols; containing starch hydrolysates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/20—Reducing nutritive value; Dietetic products with reduced nutritive value
    • A23L33/21—Addition of substantially indigestible substances, e.g. dietary fibres
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/734—Alginic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/38—Chemical stimulation of growth or activity by addition of chemical compounds which are not essential growth factors; Stimulation of growth by removal of a chemical compound
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Definitions

  • the present invention relates to a prebiotic composition for butyrate-producing bacteria.
  • Probiotics which is known as a term related to improving the intestinal environment, generally refers to living microorganisms that bring about beneficial effects on humans by improving the balance of the intestinal flora, and is generally known by bifidobacteria and the like. Has been done.
  • prebiotics as a materialization of such probiotics. Prebiotics are not degraded or absorbed in the upper gastrointestinal tract and serve as a selective nutrient source for beneficial bacteria that coexist in the large intestine, promoting their growth and improving the intestinal flora composition of the large intestine to a healthy balance. Generally means anything that helps maintain and promote and maintain human health.
  • Butyrate-producing bacteria are one of the beneficial bacteria that coexist in the large intestine.
  • Fatty acid is one of the short-chain fatty acids present in the intestine and is not only a major nutrient that provides energy to colon cells, but also host gene expression, cell differentiation, intestinal tissue development, immunomodulation, and reduced oxidative stress. It is a cell mediator that regulates various functions not only in the intestine but also in diarrhea control (Non-Patent Document 1). Although it is useful to take fatty acid into the body for health, it is not realistic to take it in the form of foods, medicines, etc. because fatty acid gives off a very strong unpleasant odor.
  • Non-Patent Document 2 the main butyrate-producing bacteria that inhabit the intestine are extremely difficult to culture in vitro due to their extremely high oxygen sensitivity, and it is also difficult to formulate and ingest the butyrate-producing bacteria.
  • alginic acid and / or a salt thereof can grow butyrate-producing bacteria such as Faecalibacterium prausnitzii in the intestine and can be an active ingredient of prebiotics. It has been disclosed.
  • the present inventors have studied alginic acid and / or a salt thereof as a prebiotic material for butyrate-producing bacteria. It was found that the plasnitch cannot assimilate alginic acid and / or a salt thereof having a degree of polymerization above a certain level and does not grow. In view of such a situation, it is an object of the present invention to provide prebiotics for more efficiently growing butyrate-producing bacteria such as Ficalibacterium plus niche.
  • alginic acid decomposition products obtained by allowing alginic acid lyase to act on alginic acid and / or its salts or their hydrolysates.
  • alginic acid lyase to act on alginic acid and / or its salts or their hydrolysates.
  • butyrate-producing bacteria containing plus niches can be remarkably grown, and have completed the present invention.
  • the first aspect of the present invention is a prebiotic composition for butyrate-producing bacteria containing an oligosaccharide composed of ⁇ -D-mannuronic acid and / or ⁇ -L-gluuronic acid or a salt thereof.
  • the oligosaccharide is a composition having an unsaturated form of ⁇ -D-mannuronic acid residue or ⁇ -L-gluuronic acid residue at the non-reducing end.
  • the unsaturated compound preferably has a double bond between the carbons at the 4-position and the 5-position.
  • the oligosaccharide preferably contains an oligosaccharide having a degree of polymerization of 2 to 10.
  • the butyrate-producing bacterium is preferably a bacterium belonging to the genus Ficalibacterium, and more preferably a Ficalibacterium plus niche.
  • the composition contains an oligosaccharide composed of ⁇ -D-mannuronic acid and / or ⁇ -L-gluuronic acid or a salt thereof, and the oligosaccharide is non-reduced.
  • compositions are also provided that are administered or inoculated to a subject with a disease or condition resulting from a decrease in fatty acid.
  • the composition of this embodiment is preferably used for intestinal regulation, immunomodulation, reduction of oxidative stress, prevention or amelioration of diarrhea, prevention or amelioration of inflammatory bowel disease, or prevention of colorectal cancer.
  • the composition of this embodiment is preferably a food or drink.
  • the composition of this embodiment is preferably a pharmaceutical product.
  • a second aspect of the present invention is to produce a prebiotic composition for butyrate-producing bacteria, which comprises a step of allowing alginic acid lyase to act on alginic acid and / or a salt thereof or a hydrolyzate thereof to obtain an alginic acid decomposition product. How to do it.
  • the method of this embodiment preferably comprises a step of hydrolyzing alginic acid and / or a salt thereof to obtain an alginic acid hydrolyzate, and a step of allowing an alginic acid lyase to act on the alginic acid hydrolyzate to obtain an alginic acid hydrolyzate. ..
  • the method of this embodiment preferably further comprises a step of recovering an oligosaccharide having a degree of polymerization of 2 to 3 and / or a salt thereof.
  • the alginate lyase is preferably an endo-type alginate lyase and / or an exo-type alginate lyase.
  • the butyrate-producing bacterium is preferably a bacterium belonging to the genus Ficalibacterium, and more preferably a Ficalibacterium plus niche.
  • a prebiotic capable of more efficiently growing a ficalibacterium plus niche.
  • the fatty acid produced by Phycalibacterium pranich functions as a cell mediator to maintain and improve health, and thus the present invention is very useful industrially.
  • a graph (n 3) showing the turbidity of the culture solution 24 hours after culturing when the omega bacterium plus niche was independently cultured in the medium to which each sample was added.
  • a graph (n 3) showing the turbidity of the medium 24 hours after culturing when the omega bacterium plus niche was independently cultured in the culture broth to which each sample was added.
  • a photograph of a TLC plate on which a culture solution before and after 24 hours of culture was developed.
  • a graph (n 3) showing the turbidity of the culture solution 24 hours after the culture when the Omega 3 plus niche was independently cultured in the culture solution to which each sample was added.
  • Test Example 3 a photograph of a TLC plate on which a culture solution before and after 24 hours of culture was developed.
  • Test Example 4 a photograph of a TLC plate on which a sample after hydrolysis treatment and / or lyase decomposition treatment of sodium alginate was developed.
  • Test Example 6 a photograph of a TLC plate in which a sample after hydrolysis treatment of sodium alginate and then lyase decomposition treatment was developed.
  • Test Example 7 the graph which shows the amount of oligosaccharide contained in the sample before and after permeation of the lyase-treated product of potassium alginate by the degree of polymerization. Each peak area in the HPLC chart of the sample was defined as the amount of oligosaccharide having a corresponding degree of polymerization.
  • Test Example 7 a photograph of a TLC plate in which a sample before and after permeation of an NF membrane permeation of a lyase-treated product of potassium alginate was developed.
  • Test Example 9 the turbidity of the culture solution after 24 hours of culture when the Ficaribacterium pranich was independently cultured in the culture solution to which the permeate obtained by treating the lyase-treated product of potassium alginate with an NF membrane was added is shown.
  • Graph (n 3).
  • the present invention will be described in detail.
  • the present invention is not limited to the following embodiments, and can be freely changed within the scope of the present invention.
  • the numerical range indicated by “-” means a numerical range in which the numerical values before and after "-" are the lower limit value and the upper limit value unless otherwise specified.
  • the composition of the present invention contains an oligosaccharide composed of ⁇ -D-mannuronic acid and / or ⁇ -L-gluuronic acid or a salt thereof.
  • oligosaccharides are usually linear in which the pyranose ring is glycosidically bonded in ⁇ 1 ⁇ 4, but are not particularly limited.
  • the constituent sugars of the oligosaccharides may be all ⁇ -D-mannuronic acid, all may be ⁇ -L-gluuronic acid, and ⁇ -D-mannuronic acid and ⁇ -L-gluuronic acid may be used. It may be in any order and composition ratio.
  • the composition of the present invention may contain oligosaccharides other than the oligosaccharides according to the present invention or salts thereof.
  • the oligosaccharide according to the present invention has an unsaturated form of ⁇ -D-mannuronic acid residue or ⁇ -L-gluuronic acid residue at the non-reducing end.
  • Such unsaturated substances usually have a double bond between the carbons at the 4- and 5-positions of the non-reducing terminal sugar.
  • it is composed of a hydrolyzate of alginic acid that has not been treated with lyase, that is, ⁇ -D-mannuronic acid having no unsaturated end and / or ⁇ -L-gluuronic acid.
  • the oligosaccharide according to the present invention is more easily assimilated by the butyrate-producing bacteria as compared with the oligosaccharides produced, the oligosaccharide having an unsaturated substance at the non-reducing end improves the assimilation property of the butyrate-producing bacteria. It is presumed.
  • the degree of polymerization of the oligosaccharide according to the present invention is preferably 2 to 10, more preferably 2 to 6, still more preferably 2 to 5, and particularly preferably 2 to 3.
  • the oligosaccharide in the composition of the present invention preferably contains oligosaccharides having a degree of polymerization of 2 to 10, but it is not prevented that oligosaccharides having a degree of polymerization of 11 or more are also contained. As shown in Examples described later, oligosaccharides having a low degree of polymerization, particularly oligosaccharides having a degree of polymerization of 2 to 3, are likely to be assimilated by butyrate-producing bacteria.
  • the oligosaccharide having a degree of polymerization of 2 to 3 and / or the salt thereof is contained in an amount of 30% by mass or more, and 50% by mass or more, based on the oligosaccharide or the salt thereof contained in the composition of the present invention. It is more preferable that the content is 90% by mass or more.
  • oligosaccharide salt examples include sodium salt, potassium salt, calcium salt, ammonium salt and the like. Although not particularly limited in the present invention, sodium salts and potassium salts are preferable from the viewpoint of water solubility.
  • oligosaccharide As the oligosaccharide according to the present invention, commercially available oligosaccharides can be used. For example, it is sold as "alginate oligosaccharide (AOS)" by Hokkaido Mitsui Chemicals, Inc., Shandong, Runxin, and the like.
  • AOS alginate oligosaccharide
  • the oligosaccharide according to the present invention can also be obtained by enzymatically decomposing alginic acid and / or a salt thereof or a hydrolyzate thereof with a lyase. That is, the present specification discloses a method for producing a prebiotic composition for butyrate-producing bacteria, which comprises a step of allowing alginic acid lyase to act on alginic acid and / or a salt thereof or a hydrolyzate thereof to obtain an alginic acid decomposition product. ..
  • Alginic acid is a polysaccharide contained in seaweeds such as kelp and wakame seaweed, and is widely used as a thickening stabilizer including application to foods.
  • Alginic acid has a linear structure in which ⁇ -D-mannuronic acid and ⁇ -L-gluuronic acid are bonded by ⁇ 1 ⁇ 4.
  • the degree of polymerization of alginic acid varies depending on the origin, but usually has a molecular weight of about 40,000 to several million.
  • the salt of alginic acid include sodium salt, potassium salt, calcium salt, ammonium salt and the like. Although not particularly limited in the present invention, sodium salts and potassium salts are preferable from the viewpoint of water solubility.
  • the alginic acid and / or a salt thereof used in the production method of the present invention can be obtained by extracting from seaweed or the like, and commercially available products such as "IS (molecular weight of about 3 to 4 million)” and “ Obtained I-5 (molecular weight about 2.8 million), “ULV-L3 (molecular weight 40,000-60,000)", “IL-6 (molecular weight about 40,000-60,000)” (all manufactured by Kimika Co., Ltd.). Can be used.
  • oligosaccharides having a low degree of polymerization are more likely to be assimilated by butyrate-producing bacteria. Therefore, when the oligosaccharides according to the present invention are produced from arginic acid and / or a salt thereof, the oligosaccharides having a low degree of polymerization are used. In order to obtain it, it is preferable to carry out a hydrolysis treatment before the decomposition treatment with lyase on alginic acid and / or a salt thereof.
  • the oligosaccharide according to the present invention is produced by a step of allowing an alginic acid lyase to act on a hydrolyzate of alginic acid and / or a salt thereof to obtain an alginic acid decomposition product. Further, as a preferred embodiment, a step of hydrolyzing alginic acid and / or a salt thereof to obtain an alginic acid hydrolyzate, and a step of allowing alginic acid lyase to act on the alginic acid hydrolyzate to obtain an alginic acid hydrolyzate are performed. To produce the oligosaccharide according to the present invention.
  • An embodiment comprising a step of allowing alginic acid lyase to act on a hydrolyzate of alginic acid and / or a salt thereof to obtain an alginic acid decomposition product, or a step of hydrolyzing alginic acid and / or a salt thereof to obtain an alginic acid hydrolyzate.
  • the hydrolysis treatment is carried out after the decomposition treatment with lyase
  • This is the proportion of the oligosaccharides according to the present invention, that is, oligosaccharides having an unsaturated compound of ⁇ -D-mannuronic acid residue or ⁇ -L-gluuronic acid residue at the non-reducing end, out of all the obtained oligosaccharides. From the viewpoint of enhancing. As shown in Examples described later, oligosaccharides obtained by first hydrolyzing sodium alginate and then decomposing with lyase are easily assimilated by the Phycalibacterium pranich and their growth. Can be promoted.
  • the hydrolyzate of alginic acid and / or a salt thereof to be subjected to the alginic acid lyase treatment may be an oligosaccharide having a degree of polymerization of preferably 20 or less, more preferably 10 or less, still more preferably 8 or less, and particularly preferably 5 or less. ..
  • the weight average molecular weight as measured by the HPLC method performed under the following conditions may be preferably 10,000 or less, more preferably 8,000 or less, still more preferably 7,000 or less, and particularly preferably 5,000 or less.
  • Measuring equipment Ultimate3000 (manufactured by Thermo) Detection: Refracto Max 521 detector (manufactured by Thermo), Column: TSKgel G3000PW (manufactured by Tosoh) Mobile phase: 0.1 M aqueous solution of sodium nitrate Flow rate: 0.3 mL / min Column temperature: 40 ° C Standard: STANDARD P-82 (manufactured by Shodex) It should be noted that the molecular weight measured by HPLC performed under the above conditions is an "apparent" value that may deviate from the "true" molecular weight calculated from the actual degree of polymerization. Alginic acid oligosaccharides having a degree of polymerization of 4 to 5 usually have a molecular weight of about 3500 when measured under the above conditions.
  • an acid hydrolysis method is preferably mentioned, but is not particularly limited. Specifically, acid hydrolysis is carried out by setting the pH of an aqueous solution of alginic acid and / or a salt thereof to about 3 to 5 and heating to a high temperature of, for example, 100 ° C. or higher for several hours, and acetic acid is used to adjust the pH. It is performed by adding a weak acid such as, but is not limited to this.
  • a 0.3 v / v% acetic acid aqueous solution containing 3% by mass of commercially available sodium alginate having a molecular weight of 40,000 to 60,000 is acid-hydrolyzed by autoclaving at 104 ° C. for 7.5 hours to obtain a weight average molecular weight.
  • About 6000 hydrolysates can be obtained.
  • the method for producing an oligosaccharide according to the present invention comprises a step of allowing alginic acid lyase to act on alginic acid and / or a salt thereof or a hydrolyzate thereof to obtain an alginic acid decomposition product.
  • Alginate lyase cleaves the ⁇ 1 ⁇ 4 glycosidic bond of alginic acid, and between the carbons at the 4- and 5-positions of the ⁇ -D-mannuronic acid residue or ⁇ -L-gluuronic acid residue at the non-reducing end of the decomposition product. To generate a double bond.
  • the alginic acid decomposition product (also referred to as alginic acid lyase-treated product) in the production method of the present invention can be an oligosaccharide according to the composition of the present invention.
  • the composition ratio of ⁇ -D-mannuronic acid residue and ⁇ -L-gluuronic acid in the oligosaccharide or alginic acid decomposition product produced by the production method of the present invention depends on the origin of alginic acid as a raw material.
  • any of an endo-type alginate lyase, an exo-type alginate lyase, and a mixture thereof may be used.
  • examples of such enzymes are commercially available ones, and examples thereof include “alginate lyase S” (manufactured by Nagase ChemteX), "HULK alginate degrading enzyme” (manufactured by Nippon Gene), and one or two of these. Enzymes of more than one species may be selected and used.
  • the amount of alginic acid lyase used for alginic acid and / or a salt thereof or a hydrolyzate thereof is not particularly limited and may be appropriately adjusted depending on the substrate concentration, enzyme titer, reaction temperature, reaction time and the like, but generally. , Alginic acid and / or a salt thereof or a hydrolyzate thereof is preferably added at a ratio of 20 to 100 active units per 1 g.
  • the pH of the enzyme reaction system may be adjusted to the optimum pH of the enzyme used by using salts that can be used in foods such as potassium carbonate and sodium hydroxide.
  • the pH of the reaction solution is preferably adjusted to 5-8, more preferably 6-7.
  • the reaction temperature of the alginate lyase is preferably in the range of the optimum temperature of the enzyme to be used, preferably 30 to 50 ° C, more preferably 40 to 45 ° C.
  • the reaction time of the alginate lyase may be appropriately adjusted, and may be, for example, 0.5 to 24 hours, preferably 0.5 to 12 hours, and more preferably 0.5 to 6 hours.
  • the decomposition reaction by alginate lyase may be terminated by heating the enzyme to inactivate it. For example, it is preferable to inactivate at 100 ° C. or higher (preferably 110 to 130 ° C.) for 1 to 3 seconds, and to inactivate at 60 ° C. or higher and lower than 100 ° C. for 3 to 40 minutes. ..
  • the pH of the alginic acid decomposition product solution may be preferably adjusted to about 6 to 8 as needed.
  • the alginic acid decomposition product obtained by the alginic acid lyase reaction contains oligosaccharides having a degree of polymerization of 2 to 10 of the total decomposition product, preferably 30% by mass or more, more preferably 50% by mass or more, still more preferably 90% by mass. Contains% by mass or more. It is preferable to proceed the decomposition reaction with alginate lyase so as to be within such a range, and it is preferable to appropriately adjust the reaction conditions for that purpose.
  • the alginic acid decomposition product after the enzymatic reaction may be used in an unpurified state, or may be further subjected to known separation and purification as appropriate.
  • the obtained alginic acid decomposition product can be subjected to membrane separation, molecular weight fractionation, ethanol precipitation, or the like to obtain an oligosaccharide fraction having an appropriate degree of polymerization or molecular weight.
  • a preferred embodiment of the production method of the present invention further comprises a step of recovering an oligosaccharide having a degree of polymerization of 2 to 3 and / or a salt thereof.
  • the order in which this recovery step is performed is not particularly limited, but it is usually performed after the decomposition step with alginate lyase.
  • the ratio of the oligosaccharide having a degree of polymerization of 2 to 3 and / or a salt thereof to the total oligosaccharide may be higher than that before the recovery step, and the degree of polymerization of the oligosaccharide after the recovery step is 4 or more. The inclusion of oligosaccharides is not prevented.
  • an oligosaccharide having a degree of polymerization of 2 to 3 and / or The salt can be recovered.
  • the conditions (pressure, flow rate, etc.) of the membrane separation treatment are not particularly limited as long as the desired recovery is possible, and may be appropriately adjusted.
  • a method such as HPLC can be adopted, whereby an oligosaccharide having an unnecessary molecular weight and undecomposed alginic acid can be removed.
  • a known separation / purification method for example, ion exchange resin or the like may be used in order to desalinate, remove impurities, or increase the purity.
  • the amount of the above-mentioned oligosaccharide and / or a salt thereof in the composition of the present invention may be appropriately set depending on the embodiment of the composition and is not particularly limited, but is preferably 0.1% by mass or more of the whole composition. It is more preferably 1% by mass or more, still more preferably 10% by mass or more.
  • the upper limit of the content is not particularly limited, but may be, for example, 100% by mass or less, more preferably 80% by mass or less, still more preferably 50% by mass or less of the whole composition.
  • these values are converted into oligosaccharides. Further, these contents may be any of the value at the time of production, the value at the time of distribution, or the value at the time of ingestion (administration) of the composition of the present invention.
  • composition of the present invention is used as a prebiotic for butyrate-producing bacteria. That is, it can be assimilated by butyrate-producing bacteria and promote its growth.
  • promotion means that the amount or growth rate of butyrate-producing bacteria is increased as compared with the case where the oligosaccharide according to the present invention is not ingested.
  • Butyrate-producing bacteria is a general term for bacteria that produce fatty acid.
  • the butyrate-producing bacteria in the present invention are not particularly limited, and examples thereof include the genus Faecalibacterium, and more specifically, Faecalibacterium plausnitzii, which is present in the human intestine. Can be mentioned.
  • composition of the present invention may be useful for a subject of a disease or condition that can be prevented or ameliorated by increasing the amount of fatty acid in the body, or a disease or condition caused by a decrease in fatty acid in the body.
  • a disease or condition that can be prevented or ameliorated by increasing the amount of fatty acid in the body, or a disease or condition caused by a decrease in fatty acid in the body.
  • it can be used for intestinal regulation, immunomodulation, reduction of oxidative stress, prevention / improvement of diarrhea, inflammatory bowel disease, prevention of colorectal cancer, and the like.
  • Another aspect of the present invention is composed of ⁇ -D-mannuronic acid and / or ⁇ -L-gluuronic acid in the production of a prebiotic composition for butyrate-producing bacteria, and ⁇ -D-mannuronic acid residue at the non-reducing end.
  • Another aspect of the present invention is composed of ⁇ -D-mannuronic acid and / or ⁇ -L-gluuronic acid in promoting the growth of butyrate-producing bacteria, and ⁇ -D-mannuronic acid residue or ⁇ -L at the non-reducing end.
  • oligosaccharides or salts thereof that have unsaturated forms of gluronic acid residues.
  • Another aspect of the present invention is composed of ⁇ -D-mannuronic acid and / or ⁇ -L-gluuronic acid used to promote the growth of butyrate-producing bacteria, and ⁇ -D-mannuronic acid residue at the non-reducing end.
  • An oligosaccharide composed of ⁇ -D-mannuronic acid and / or ⁇ -L-gluuronic acid and having an unsaturated form of ⁇ -D-mannuronic acid residue or ⁇ -L-gluuronic acid residue at the non-reducing end or an oligosaccharide thereof.
  • a method of promoting the growth of butyrate-producing bacteria which comprises administering a salt to an animal.
  • the animal is not particularly limited, but is usually a human.
  • the ingestion (administration) timing of the composition of the present invention is not particularly limited and can be appropriately selected according to the condition of the administration target.
  • the ingestion (administration) amount of the composition of the present invention is appropriately selected depending on the age, gender, condition, other conditions, etc. of the ingestion (administration) target.
  • amount of the oligosaccharide according to the present invention it is preferable to use an amount in the range of preferably 1 to 300 mg / kg / day, more preferably 20 to 50 mg / kg / day as a guide.
  • the composition can be administered once a day or in multiple divided doses, regardless of the amount and duration of ingestion (administration).
  • the route of ingestion (administration) of the composition of the present invention may be oral or parenteral, but is usually oral.
  • parenteral ingestion (administration) rectal administration and the like can be mentioned.
  • the composition of the present invention may contain butyrate-producing bacteria together with the oligosaccharide according to the present invention.
  • the composition of the present invention may be ingested in combination with a butyrate-producing bacterium or a preparation containing a butyrate-producing bacterium.
  • the butyrate-producing bacteria are preferably live bacteria.
  • composition of the present invention is a composition to be orally ingested, it is preferably in the form of food and drink.
  • the form and properties of the food and drink are not particularly limited as long as they do not impair the effects of the present invention and can be orally ingested. It can be produced by a usual method using the raw materials to be used. As described above, a prebiotic food or drink for butyrate-producing bacteria can also be produced by a method usually comprising a step of adding an oligosaccharide and / or a salt thereof obtained by the production method of the present invention to a food or drink raw material.
  • Foods and drinks may be in the form of liquid, paste, gel solid, powder, etc., for example, from tablet confectionery; liquid food (nutrient food for tube intake); bread, macaroni, spaghetti, noodles, cake mix, etc.
  • Wheat flour products such as fried flour and bread flour; instant noodles, cup noodles, retort / cooked foods, canned foods, microwave foods, instant soups / stews, instant miso soup / suckers, canned soups, freeze / dry foods, and other instant foods.
  • Frozen foods such as ingredients, dressings, noodles, spices, and other complex seasonings; frozen foods such as frozen foods, semi-cooked frozen foods, and cooked frozen foods; caramel, candy, chewing gum, chocolate , Cookies, biscuits, cakes, pies, snacks, crackers, Japanese confectionery, rice confectionery, bean confectionery, dessert confectionery, jelly, and other confectionery; carbonated beverages, natural fruit juice, fruit juice beverages, refreshing beverages with fruit juice, fruit meat beverages , Fruit beverages with fruit grains, vegetable beverages, soy milk, soy milk beverages, coffee beverages, tea beverages, powdered beverages, concentrated beverages, sports beverages, nutritional beverages, alcoholic beverages, other favorite beverages such as favorite beverages, baby food, Other commercial foods such as sprinkles and Ochazuke paste; Prepared milk for childcare (including powdered milk, liquid milk, etc.); Enteric nutritional foods; Functional foods (foods for specified health use, nutritional functional foods, functional labeling) Foods), nutritional supplements, etc.
  • feed can also be used as feed as an aspect of food and drink.
  • the feed include pet food, livestock feed, fish feed and the like.
  • the form of the feed is not particularly limited, and in addition to the oligosaccharide or its salt according to the present invention, for example, alginic acid or a salt thereof, oligosaccharides other than the oligosaccharide according to the present invention, corn, wheat, barley, rye, mylo, etc.
  • Grains vegetable oil cakes such as soybean oil cake, rapeseed oil cake, palm oil cake, flaxseed oil cake; bran such as bran, wheat bran, rice bran, defatted rice bran; Animal feeds such as defatted milk powder, whey, yellow grease, and corn; yeasts such as tolla yeast and beer yeast; mineral feeds such as tertiary calcium phosphate and calcium carbonate; oils and fats; single amino acids; those containing sugars, etc. May be.
  • composition of the present invention is an aspect of a food or drink (including feed), it is provided as a food or drink indicating that it is a prebiotic for butyrate-producing bacteria and that it is used to promote the growth of butyrate-producing bacteria in the intestine. It can be sold.
  • Such "display” actions include all actions for informing the consumer of the use, and if the expression is such that the use can be recalled or inferred, the purpose of the display, the content of the display, and the like. Regardless of the object or medium to be displayed, all of them fall under the “display” act of the present invention. Further, it is preferable that the "display” is performed by an expression that allows the consumer to directly recognize the above-mentioned use.
  • Examples include the act of describing the above-mentioned use and displaying or distributing it, or describing the above-mentioned use in the information containing these and providing it by an electromagnetic (Internet, etc.) method.
  • the display content is a display approved by the government or the like (for example, a display obtained based on various systems established by the government and performed in a manner based on such approval).
  • labeling includes health foods, functional foods, enteral nutrition foods, special-purpose foods, health functional foods (specified health foods, nutritional functional foods, functionally labeled foods), nutritional supplements, and pharmaceutical departments. Labeling as a foreign product is also mentioned. Among these, in particular, labeling approved by the Consumer Affairs Agency, for example, a system related to foods for specified health use, nutritionally functional foods, or foods with functional claims, or labeling approved by a system similar to these can be mentioned. Specifically, labeling as a food for specified health use, labeling as a food for specified health use conditionally, labeling to the effect that it affects the structure and function of the body, labeling for reducing the risk of illness, and functionality based on scientific evidence. Indications, etc.
  • the composition of the present invention can also be in the form of a pharmaceutical product.
  • the route of administration of the drug may be oral or parenteral, but oral is preferable.
  • parenteral ingestion administration
  • rectal administration administration and the like can be mentioned.
  • As the form of the drug it can be appropriately formulated into a desired dosage form depending on the administration method.
  • oral administration it can be formulated into a solid preparation such as a powder, a granule, a tablet or a capsule; a liquid preparation such as a solution, a syrup, a suspension or an emulsion.
  • parenteral administration it can be formulated into a suppository, an ointment, an injection or the like.
  • the formulation in addition to the oligosaccharide or the salt thereof according to the present invention, components such as excipients, pH adjusters, colorants, and flavoring agents usually used for the formulation can be used. It is also possible to use other medicinal ingredients, known or future prebiotics, and the like in combination.
  • the formulation can be carried out by a known method as appropriate depending on the dosage form.
  • a formulation carrier may be blended and formulated as appropriate.
  • excipients include sugar derivatives such as lactose, sucrose, dextrose, mannit, and sorbit; starch derivatives such as corn starch, potato starch, ⁇ -starch, dextrin, and carboxymethyl starch; crystalline cellulose, hydroxypropyl cellulose, and the like.
  • Cellulose derivatives such as hydroxypropylmethyl cellulose, carboxymethyl cellulose, carboxymethyl cellulose calcium; gum arabic; dextran; purulan; silicate derivatives such as light anhydrous silicic acid, synthetic aluminum silicate, magnesium aluminometasilicate; phosphate derivatives such as calcium phosphate; carbonic acid Carbonated carbonate derivatives such as calcium; sulfate derivatives such as calcium sulfate can be mentioned.
  • binder examples include gelatin; polyvinylpyrrolidone; macrogol, etc., in addition to the above-mentioned excipients.
  • disintegrant examples include, in addition to the above-mentioned excipients, chemically modified starch or cellulose derivatives such as croscarmellose sodium, carboxymethyl starch sodium, and crosslinked polyvinylpyrrolidone.
  • lubricant examples include talc; stearic acid; stearic acid metal salts such as calcium stearate and magnesium stearate; colloidal silica; waxes such as bee gum and gay wax; boric acid; glycol; carboxylic acids such as fumaric acid and adipic acid.
  • Sodium carboxylates such as sodium benzoate; Sulfates such as sodium sulfate; Leucine; Lauryl sulfates such as sodium lauryl sulfate and magnesium lauryl sulfate; Stearic acids such as anhydrous silicic acid and silicate hydrate; Stearic acid derivatives and the like. Be done.
  • the stabilizer examples include paraoxybenzoic acid esters such as methylparaben and propylparaben; alcohols such as chlorobutanol, benzyl alcohol and phenylethyl alcohol; benzalkonium chloride; acetic anhydride; sorbic acid and the like.
  • flavoring agent examples include sweeteners, acidulants, and fragrances.
  • carrier used in the case of a liquid preparation for oral administration include a solvent such as water.
  • the timing of ingesting the pharmaceutical product of the present invention is not particularly limited, for example, before meals, after meals, between meals, and before bedtime.
  • Test Example 2 the same raw materials and reagents used in Test Example 1 were used.
  • acetic acid Korean Kagaku Co., Ltd.
  • alginate oligosaccharide (manufactured by Hokkaido Mitsui Chemicals Co., Ltd.)
  • YCFA medium composition powder a commercially available alginate lyase-treated product 1 (“alginate oligosaccharide” (manufactured by Hokkaido Mitsui Chemicals Co., Ltd.)
  • Alginate oligosaccharide manufactured by Hokkaido Mitsui Chemicals Co., Ltd.
  • a specified amount of YCFA medium composition powder other than sugar was added thereto, and the mixture was subjected to autoclave treatment at 115 ° C. for 15 minutes to obtain an alginic acid hydrolyzate-containing medium.
  • Glucose 0.2 g, maltose 0.2 g, and cellobiose 0.2 g are added to the total amount of the above-prepared medium preparation medium, and a specified amount of YCFA medium composition powder other than sugar is added. Then, it was subjected to an autoclave treatment at 115 ° C. for 15 minutes to obtain a positive control medium.
  • a specified amount of YCFA medium composition powder other than sugar was added to the total amount of the above-prepared aqueous solution for medium preparation, and the mixture was autoclaved at 115 ° C. for 15 minutes to obtain a negative control medium.
  • Ficalibacterium Plasnitch MCC2041 September 20, 2019, Incorporated Administrative Agency Product Evaluation Technology Infrastructure Organization Patent Microorganism Deposit Center (post code 292-0818, Kazusa, Kisarazu City, Chiba Prefecture) Kazusakamatari room 2-5-8 122) was inoculated with the preculture solution that was inoculated internationally under the accession number NITE BP-03027) and anaerobically cultured at 37 ° C. Anaerobic culture was performed at ° C. The turbidity of the culture solution at a wavelength of 600 nm was measured using a lower fluorescence measuring device (SH9000-Lab, manufactured by Hitachi High-Tech Science Corporation).
  • FIG. 1 shows the turbidity (OD 600 ) of the culture solution after 24 hours of culture.
  • OD 600 turbidity
  • the guar gum hydrolyzate-containing medium was obtained by the autoclaving treatment of the above. It is already known that the guar gum hydrolyzate has the ability to grow Ficalibacterium plus niche in the intestine.
  • 0.2 g of glucose, 0.2 g of maltose, and 0.2 g of cellobiose (all manufactured by Nakaraitesk Co., Ltd.) were added, and a specified amount of YCFA medium composition powder other than sugar was added to 115.
  • a positive control medium was obtained by autoclaving at ° C for 15 minutes.
  • a specified amount of YCFA medium composition powder other than sugar was added to 64.7 mL of MilliQ water, and the mixture was autoclaved at 115 ° C. for 15 minutes to obtain a negative control medium.
  • FIG. 2 shows the turbidity (OD 600 ) of the culture solution after 24 hours of culture. Ficalibacterium pranich was unable to assimilate sodium alginate or guar gum hydrolyzate and hardly proliferated. On the other hand, in all of the alginate lyase-treated products 1 to 3, remarkable proliferation of the faecalibacterium plus niche was observed.
  • FIG. 3 shows the TLC plate after coloration. In the medium containing the alginate lyase-treated product 1 to 3, it was found that the spots corresponding to the oligosaccharides having a degree of polymerization of 2 to 6 became thin or disappeared after the culture. From this, it can be seen that Ficalibacterium pranich assimilated oligosaccharides having a degree of polymerization of 2 to 6 among the alginate lyase-treated products.
  • a sodium alginate-containing medium was obtained by adding 1 g of a sodium alginate material to the total amount of the above-prepared aqueous solution for preparing a medium, further adding a specified amount of a YCFA medium composition powder other than sugar, and autoclaving at 115 ° C. for 15 minutes.
  • guar gum hydrolyzate (“Sun Fiber” (manufactured by Taiyo Kagaku Co., Ltd.)) to the total amount of the above-prepared aqueous solution for medium preparation, and further add a specified amount of YCFA medium composition powder other than sugar to 115 ° C.
  • a guar gum hydrolyzate-containing medium was obtained by autoclaving for 15 minutes.
  • 0.2 g of glucose, 0.2 g of maltose, and 0.2 g of cellobiose are added to the total amount of the above-prepared aqueous solution for medium preparation, and a specified amount of YCFA medium composition powder other than sugar is added, and the autoclave is performed at 115 ° C.
  • a positive control medium was obtained during the treatment.
  • a specified amount of YCFA medium composition powder other than sugar was added to the total amount of the above-prepared aqueous solution for medium preparation, and the mixture was autoclaved at 115 ° C. for 15 minutes to obtain a negative control medium.
  • FIG. 4 shows the turbidity (OD 600 ) of the culture solution after 24 hours of culture. Ficalibacterium pranich was unable to assimilate sodium alginate or guar gum hydrolyzate and hardly proliferated. On the other hand, in the alginate lyase-treated product 4, remarkable proliferation of Ficalibacterium pranich was observed.
  • FIG. 5 shows the TLC plate after coloration. In the medium containing the alginate lyase-treated product 4, it was found that the spots corresponding to the oligosaccharides having a degree of polymerization of 2 to 6 became thin or disappeared after the culture. From this, it can be seen that Ficalibacterium pranich assimilated oligosaccharides having a degree of polymerization of 2 to 6 among the alginate lyase-treated products 4.
  • Example 4 Examination of the degree of decomposition by hydrolysis treatment with sodium alginate and treatment with alginate lyase (1) Preparation of samples Unless otherwise specified, the same reagents as in Test Example 1 were used. A commercially available sodium alginate material (3 g) was dissolved in 99.7 mL of MilliQ water to prepare a sodium alginate solution. Immediately after adding 0.3 mL of acetic acid to the sodium alginate solution, a 4N NaOH solution was added to adjust the pH to 6.2 ⁇ 0.1 to obtain an acetic acid-containing sodium alginate solution (sample a').
  • an acetic acid-containing sodium alginate solution (sample a')
  • 1 mL of a 6 mg / mL aqueous solution of alginate lyase S (manufactured by Nagase ChemteX Corporation) was added, and the mixture was enzymatically reacted at 40 ° C. for 3 hours. Then, the enzyme was inactivated by heating at 80 ° C. for 30 minutes to obtain an alginate lyase-treated product solution (sample b').
  • Acetic acid was added to the alginate lyase-treated solution (sample b') to adjust the pH to 4.2 ⁇ 0.1, and the mixture was autoclaved at 104 ° C. for 7.5 hours. Then, a 4N NaOH solution was added to adjust the pH to 6.2 ⁇ 0.1 to prepare the final sample of the alginate lyase-treated hydrolyzate solution (sample c). 0.3 mL of acetic acid was added to the prepared sodium alginate solution to adjust the pH to 4.2 ⁇ 0.1, and the solution was subjected to autoclave treatment at 104 ° C. for 7.5 hours to form an alginate hydrolyzate solution (sample d').
  • Acetic acid in acetic acid-containing sodium alginate solution (sample a'), alginate lyase-treated solution (sample b'), arginic acid hydrolyzate solution (sample d'), and arginite hydrolyzate lyase-treated solution (sample e'), respectively.
  • a 4N NaOH solution was immediately added to adjust the pH to 6.2 ⁇ 0.1 to prepare each final sample (samples a, b, d, e).
  • Table 1 shows the treatments performed to obtain each sample.
  • Results Figure 6 shows the TLC plate after coloration. It was found that by hydrolyzing sodium alginate before or after enzymatic decomposition, the degree of decomposition is increased and oligosaccharides having a low degree of polymerization can be easily obtained.
  • guar gum hydrolyzate (“Sun Fiber” (manufactured by Taiyo Kagaku Co., Ltd.)) to MilliQ water, add a specified amount of YCFA medium composition powder other than sugar, and autoclave at 115 ° C for 15 minutes. Then, a medium containing 0.6% by mass of guar gum hydrolyzate was obtained. A specified amount of YCFA medium composition powder other than sugar was added to 64.7 mL of MilliQ water, and autoclaving was performed at 115 ° C. for 15 minutes to obtain a negative control medium.
  • Results Figure 8 shows the TLC plate after coloration. It was found that by hydrolyzing sodium alginate before enzymatic decomposition, the degree of decomposition was increased and oligosaccharides having a low degree of polymerization could be easily obtained.
  • the aqueous solution of the sodium alginate material "I-5" used has a very high viscosity, and is not suitable for culturing Ficalibacterium pranich or treating with alginate lyase as it is, so that it is hydrolyzed. This facilitates the decomposition reaction by alginate lyase. As a result, it can become a prebiotic that can be easily assimilated into the Phycalibacterium plus niche and promote its growth.
  • AOSK potassium alginate lyase-treated product
  • 12 L of RO water was added to the obtained AOSK to dilute it, and 20 L of the diluted solution was passed through an NF membrane (NTR7450, manufactured by Nitto Denko KK) at a pressure of 10 kgf / cm 3 for fractionation.
  • the NF membrane permeate was recovered to obtain an NF membrane permeate solution of AOSK.
  • the permeate solution was freeze-dried using a freeze-dryer (RL-B04 type) to obtain 17.02 g of a dry powder (hereinafter, also referred to as "AOSK-NF").
  • the mobile phase was measured isocratically for 90 minutes using distilled water in which 0.3 M sodium dihydrogen phosphate was dissolved.
  • the flow rate was set to 1.0 mL / min, the column oven temperature was set to 40 ° C., and the detection was performed by absorption at 235 nm.
  • alginate lyase-treated product 1 (“alginate oligosaccharide” (manufactured by Mitsui Chemicals, Hokkaido)) was used as the standard M.
  • alginate oligosaccharide manufactured by Mitsui Chemicals, Hokkaido
  • Neutralization culture 100 mL of YCFA medium containing no sugar was prepared, and a pH-controllable culture device Bio Jr. 8 (BJR-25NA1S-8M manufactured by Biot Co., Ltd.) was placed in a vessel, and 1 g of AOSK or AOSK-NF obtained in Test Example 7 was added. Each medium was autoclaved at 115 ° C. for 20 minutes with the vessel. Then, a vitamin solution and a cysteine solution aseptically filtered and sterilized were added to prepare a culture solution having a final concentration of 1% (w / v) of the test sample.
  • a pH-controllable culture device Bio Jr. 8 BJR-25NA1S-8M manufactured by Biot Co., Ltd.
  • the 1st primer set (SEQ ID NOs: 1 and 2) for amplifying the 3rd to 4th variable regions of the 16S rRNA gene of the bacterium and the 2nd primer required for analysis with the next-generation sequencer Miseq (manufactured by Illumina).
  • a set (SEQ ID NOS: 3 and 4, where n is an arbitrary base sequence (index region) for processing a plurality of samples in one analysis) was designed, and primers were synthesized by Life Technologies' oligo primer preparation service.
  • a reaction solution containing a template DNA solution and a 1st primer set having a total liquid volume of 25 ⁇ L was prepared using a TaKaRa Ex Taq HS kit (manufactured by Takara Bio Inc.).
  • a PCR reaction was carried out by Veriti 200 (manufactured by Life Technologies) at 94 ° C. for 3 minutes, then 94 ° C. for 30 seconds, 50 ° C. for 30 seconds, and 72 ° C. for 30 seconds 20 times for 72 ° C. for 10 minutes.
  • the obtained PCR product was electrophoresed on a 1% agarose gel, and a band pattern was confirmed. Subsequently, 1 ⁇ L of the obtained PCR product was used as a template, and PCR was carried out using the 2nd primer set under the same conditions as described above. The number of PCR cycles was 15 times.
  • the obtained PCR product was electrophoresed on a 1% agarose gel, and after confirming the band pattern, it was purified by QIAquick 96 PCR Purification Kit (manufactured by Qiagen), and was purified by Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit (manufactured by Life Technologies). ) was used to measure the concentration.
  • a mixture of DNA solutions having the same concentration was subjected to a Miseq v2 Reagent kit (manufactured by Illumina), and sequence analysis was performed with Miseq.
  • the obtained pair-end sequence was analyzed for the composition of the intestinal flora using QIIME software (version 2.0) (http://qiime.org/), and the most predominant butyrate-producing bacteria (Facaribacterium plus) among them was analyzed. The proportion of the niche) in the total intestinal bacteria was calculated, and the average of all test samples was calculated.
  • FIG. 11 shows the change over time in the proportion of faecalibacterium plus niche in the total intestinal bacteria.
  • a 1/4 volume of the oligosaccharide-containing aqueous solution was added to the YCFA medium preparation solution to prepare a 0.6% by mass sugar-containing YCFA medium. Further, a specified amount of YCFA medium composition powder other than sugar was added to 64.7 mL of MilliQ water and autoclaved at 115 ° C. for 15 minutes to obtain a negative control medium.
  • FIG. 12 shows the turbidity (OD 600 ) of the culture solution after 24 hours of culture. It can be seen that the growth of Phycaribacterium plus niche was promoted by AOSK-NF rather than by AOSK.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)

Abstract

酪酸菌を効率的に増殖させるプレバイオティクスを提供することを課題とする。β－Ｄ－マンヌロン酸及び／又はα－Ｌ－グルロン酸から構成され、非還元末端にβ－Ｄ－マンヌロン酸残基又はα－Ｌ－グルロン酸残基の不飽和体を有するオリゴ糖又はその塩を、酪酸菌用プレバイオティクス組成物の有効成分とする。前記オリゴ糖は、アルギン酸及び／若しくはその塩又はそれらの加水分解物にアルギン酸リアーゼを作用させてアルギン酸分解物を取得することにより製造することができる。

Description

酪酸菌用プレバイオティクス組成物
　本発明は、酪酸菌用プレバイオティクス組成物に関する。
　近年、腸内細菌と健康との関連性に注目が集まり、世界中で研究が行われている。腸内環境改善に関連する用語として知られる「プロバイオティクス」は、一般に腸内フローラのバランスを改善することにより人に有益な作用をもたらす生きた微生物を指し、ビフィズス菌等が一般的に知られている。また、かかるプロバイオティクスが資化するものとして「プレバイオティクス」がある。プレバイオティクスは、消化管上部で分解・吸収されず、大腸に共生する有益な細菌の選択的な栄養源となりそれらの増殖を促進し、大腸の腸内フローラ構成を健康的なバランスに改善し維持し、ヒトの健康の増進維持に役立つものを一般に意味する。
　大腸に共生する有益な細菌のひとつとして、酪酸菌がある。酪酸は、腸内に存在する短鎖脂肪酸のひとつであり、大腸細胞にエネルギーを提供する主要な栄養素としてだけでなく、宿主の遺伝子発現、細胞分化、腸組織発生、免疫調節、酸化ストレス低下、及び下痢コントロールなど、腸内のみならず種々の機能を調節する細胞メディエーターである（非特許文献１）。
　健康のために酪酸を体内に取り込むことは有用であるが、酪酸は非常に強い不快臭を放つため、食品や医薬品等の形態で摂取することは現実的ではない。また、腸内に生息する主な酪酸菌は、酸素感受性が極端に高いためにｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養が非常に困難であり、酪酸菌を製剤化して摂取することも難しい（非特許文献２）。
　そのため、酪酸菌を摂取することに替えて、腸内に生息する酪酸菌を増殖させることが提案されている。例えば、特許文献１には、アルギン酸及び／又はその塩が腸内でフィーカリバクテリウム・プラスニッチ（Faecalibacterium prausnitzii）等の酪酸菌を増殖させることができ、プレバイオティクスの有効成分となり得ることが開示されている。
国際公開第２０２０／１３８５１１号パンフレット
Cell. 2016 Jun 2;165(6):1332-1345 Best. Pract. Res. Clin. Gastroenterol. 2017 Dec;31(6):643-648.
　本発明者らは酪酸菌用プレバイオティクス素材としてのアルギン酸及び／又はその塩について検討を進めたところ、腸内ではない環境、すなわち酪酸菌以外の菌の非存在下では、フィーカリバクテリウム・プラスニッチは一定以上の重合度のアルギン酸及び／又はその塩を資化できず増殖しないという知見を得た。
　かかる状況に鑑み、本発明は、フィーカリバクテリウム・プラスニッチ等の酪酸菌をより効率的に増殖させるプレバイオティクスを提供することを課題とする。
　本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、アルギン酸及び／若しくはその塩又はそれらの加水分解物にアルギン酸リアーゼを作用させて取得したアルギン酸分解物が、フィーカリバクテリウム・プラスニッチを含む酪酸菌を著しく増殖させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明の第一の態様は、β－Ｄ－マンヌロン酸及び／又はα－Ｌ－グルロン酸から構成されるオリゴ糖又はその塩を含有する、酪酸菌用プレバイオティクス組成物であって、前記オリゴ糖は、非還元末端にβ－Ｄ－マンヌロン酸残基又はα－Ｌ－グルロン酸残基の不飽和体を有する、組成物である。
　本態様において好ましくは、前記不飽和体は４位と５位の炭素間に二重結合を有する。
　本態様において好ましくは、前記オリゴ糖が重合度２～１０のオリゴ糖を含む。
　本態様において、前記酪酸菌はフィーカリバクテリウム属細菌であることが好ましく、フィーカリバクテリウム・プラスニッチであることがより好ましい。
　また、本態様の別の側面として、β－Ｄ－マンヌロン酸及び／又はα－Ｌ－グルロン酸から構成されるオリゴ糖又はその塩を含有する組成物であって、前記オリゴ糖は、非還元末端にβ－Ｄ－マンヌロン酸残基又はα－Ｌ－グルロン酸残基の不飽和体を有し、体内の酪酸が増加することにより予防もしくは改善しうる疾患もしくは病態の対象者、又は体内の酪酸が減少することに起因する疾患もしくは病態の対象者に対して投与又は接種される、組成物も提供される。
　本態様の組成物は、整腸、免疫調節、酸化ストレス低減、下痢の予防もしくは改善、炎症性腸疾患の予防もしくは改善、又は大腸がんの予防のために好ましく用いられる。
　本態様の組成物は、好ましくは飲食品である。
　本態様の組成物は、好ましくは医薬品である。
　また、本発明の第二の態様は、アルギン酸及び／若しくはその塩又はそれらの加水分解物にアルギン酸リアーゼを作用させてアルギン酸分解物を取得する工程を含む、酪酸菌用プレバイオティクス組成物を製造する方法である。
　本態様の方法は、好ましくはアルギン酸及び／又はその塩を加水分解してアルギン酸加水分解物を取得する工程、及び前記アルギン酸加水分解物にアルギン酸リアーゼを作用させてアルギン酸分解物を取得する工程を含む。
　本態様の方法は、好ましくはさらに重合度が２～３のオリゴ糖及び／又はその塩を回収する工程を含む。
　本態様において好ましくは、前記アルギン酸リアーゼはエンド型アルギン酸リアーゼ及び／又はエキソ型アルギン酸リアーゼである。
　本態様において、前記酪酸菌はフィーカリバクテリウム属細菌であることが好ましく、フィーカリバクテリウム・プラスニッチであることがより好ましい。
　本発明によれば、フィーカリバクテリウム・プラスニッチをより効率的に増殖させることができるプレバイオティクスが提供される。フィーカリバクテリウム・プラスニッチが産生する酪酸は、細胞メディエーターとして機能し健康を維持向上させるため、本発明は産業上非常に有用である。
試験例１において、各試料を添加した培地でフィーカリバクテリウム・プラスニッチを単独培養したときの、培養２４時間後の培養液の濁度を示すグラフ（ｎ＝３）。 試験例２において、各試料を添加した培養液でフィーカリバクテリウム・プラスニッチを単独培養したときの、培養２４時間後の培地の濁度を示すグラフ（ｎ＝３）。 試験例２において、培養前及び培養２４時間後の培養液を展開したＴＬＣプレートの写真。 試験例３において、各試料を添加した培養液でフィーカリバクテリウム・プラスニッチを単独培養したときの、培養２４時間後の培養液の濁度を示すグラフ（ｎ＝３）。 試験例３において、培養前及び培養２４時間後の培養液を展開したＴＬＣプレートの写真。 試験例４において、アルギン酸ナトリウムを加水分解処理及び／又はリアーゼ分解処理をした後の試料を展開したＴＬＣプレートの写真。 試験例５において、各試料を添加した培養液でフィーカリバクテリウム・プラスニッチを単独培養したときの、培養２４時間後の培養液の濁度を示すグラフ（ｎ＝３）。 試験例６において、アルギン酸ナトリウムを加水分解処理した後にリアーゼ分解処理をした後の試料を展開したＴＬＣプレートの写真。 試験例７において、アルギン酸カリウムのリアーゼ処理物のＮＦ膜透過前後の試料に含まれるオリゴ糖量を重合度別に示すグラフ。前記試料のＨＰＬＣチャートにおける各ピーク面積を対応する重合度のオリゴ糖量とした。 試験例７において、アルギン酸カリウムのリアーゼ処理物のＮＦ膜透過前後の試料を展開したＴＬＣプレートの写真。 試験例８において、アルギン酸カリウムのリアーゼ処理物をＮＦ膜処理した透過物を用いて中和培養したときの、フィーカリバクテリウム・プラスニッチの腸内細菌全体に占める割合の経時変化を示すグラフ（ｎ＝４）。 試験例９において、アルギン酸カリウムのリアーゼ処理物をＮＦ膜処理した透過物を添加した培養液でフィーカリバクテリウム・プラスニッチを単独培養したときの、培養２４時間後の培養液の濁度を示すグラフ（ｎ＝３）。
　次に、本発明を詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更することができるものである。
　本明細書において、「～」で示される数値範囲は、特に断りのない限り、「～」の前後の数値を下限値及び上限値とする数値範囲を意味する。
　本発明の組成物は、β－Ｄ－マンヌロン酸及び／又はα－Ｌ－グルロン酸から構成されるオリゴ糖又はその塩を含有する。かかるオリゴ糖は、通常は、ピラノース環がβ１→４でグリコシド結合した直鎖であるが、特に限定されない。オリゴ糖の構成糖は、全てがβ－Ｄ－マンヌロン酸であってもよく、全てがα－Ｌ－グルロン酸であってもよく、β－Ｄ－マンヌロン酸とα－Ｌ－グルロン酸とが任意の並び順及び構成比であってもよい。
　本発明の組成物は、本発明にかかるオリゴ糖又はその塩以外のオリゴ糖を含んでいてもよい。
　本発明に係るオリゴ糖は、非還元末端にβ－Ｄ－マンヌロン酸残基又はα－Ｌ－グルロン酸残基の不飽和体を有する。係る不飽和体は、通常は、非還元末端糖の４位と５位の炭素間に二重結合を有するものである。
　後述の実施例に示されるように、アルギン酸の加水分解物であってリアーゼ処理をしていないもの、すなわち不飽和末端を持たないβ－Ｄ－マンヌロン酸及び／又はα－Ｌ－グルロン酸から構成されるオリゴ糖に比べて、本発明に係るオリゴ糖は酪酸菌により資化されやすいことから、オリゴ糖がその非還元末端に不飽和体を有することが、酪酸菌の資化性を向上させると推測される。
　本発明に係るオリゴ糖の重合度は、好ましくは２～１０であり、より好ましくは２～６であり、さらに好ましくは２～５であり、特に好ましくは２～３である。なお、本発明の組成物におけるオリゴ糖は重合度２～１０のものを含むことが好ましいが、重合度１１以上のものも含まれることは妨げられない。
　後述の実施例に示されるように、重合度が小さいオリゴ糖、特に重合度が２～３のオリゴ糖は酪酸菌に資化されやすい。そのため、本発明の組成物に含まれるオリゴ糖又はその塩全体に対して、重合度が２～３のオリゴ糖及び／又はその塩が３０質量％以上含まれることが好ましく、５０質量％以上含まれることがより好ましく、９０質量％以上含まれることがさらに好ましい。
　オリゴ糖の塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩等が挙げられる。本発明においては特に限定されないが、ナトリウム塩及びカリウム塩が水溶性の観点から好ましい。
　本発明に係るオリゴ糖は、市販のものを用いることができる。例えば、「アルギン酸オリゴ糖（ＡＯＳ）」として、北海道三井化学株式会社、Shandong社、Runxin社等から販売されている。
　また、本発明に係るオリゴ糖はアルギン酸及び／若しくはその塩又はそれらの加水分解物をリアーゼにより酵素分解することにより取得することもできる。
　すなわち、本明細書はアルギン酸及び／若しくはその塩又はそれらの加水分解物にアルギン酸リアーゼを作用させてアルギン酸分解物を取得する工程を含む、酪酸菌用プレバイオティクス組成物を製造する方法を開示する。
　アルギン酸は、コンブやワカメ等の海藻に含まれる多糖類であり、増粘安定剤として食品への適用を含め広く利用されている。アルギン酸はβ－Ｄ－マンヌロン酸とα－Ｌ－グルロン酸とがβ１→４結合してなる直鎖構造を有する。アルギン酸の重合度は由来によりさまざまであるが、通常は分子量が約４万～数百万である。
　アルギン酸の塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩等が挙げられる。本発明においては特に限定されないが、ナトリウム塩及びカリウム塩が水溶性の観点から好ましい。
　本発明の製造方法に用いるアルギン酸及び／又はその塩としては、海藻等から抽出して取得することができる他、市販のものとして、例えば「Ｉ－Ｓ（分子量約３００万～４００万）」「Ｉ－５（分子量約２８０万）、「ＵＬＶ－Ｌ３（分子量４万～６万）」、「ＩＬ－６（分子量約４万～６万）」（いずれも株式会社キミカ製）等を入手して用いることができる。
　前述のように、重合度が小さいオリゴ糖の方が酪酸菌に資化されやすいため、アルギン酸及び／又はその塩を原料として本発明に係るオリゴ糖を製造する場合は、重合度の小さいものを取得するために、アルギン酸及び／又はその塩に対するリアーゼによる分解処理の前に加水分解処理を行うことが好ましい。
　好ましい態様としては、アルギン酸及び／又はその塩の加水分解物にアルギン酸リアーゼを作用させてアルギン酸分解物を取得する工程により、本発明に係るオリゴ糖を製造する。また、好ましい態様としては、アルギン酸及び／又はその塩を加水分解してアルギン酸加水分解物を取得する工程、及び前記アルギン酸加水分解物にアルギン酸リアーゼを作用させてアルギン酸分解物を取得する工程を行うことにより、本発明に係るオリゴ糖を製造する。
　アルギン酸リアーゼの酵素反応の至適温度は４０度付近であるため、酵素反応を行っている間に食品に好ましくない微生物が増殖し易い。アルギン酸及び／又はその塩の加水分解物にアルギン酸リアーゼを作用させてアルギン酸分解物を取得する工程を含む態様、又は、アルギン酸及び／又はその塩を加水分解してアルギン酸加水分解物を取得する工程、及び前記アルギン酸加水分解物にアルギン酸リアーゼを作用させてアルギン酸分解物を取得する工程を含む態様とすることで、アルギン酸リアーゼを作用させる時間を短縮することが可能であり、微生物の増殖を抑制することが可能である。
　なお、加水分解処理はリアーゼによる分解処理の後に行うことも妨げられないが、リアーゼによる分解処理の前に行う方が好ましい。
　これは、得られるオリゴ糖全体のうち、本発明に係るオリゴ糖、すなわち非還元末端にβ－Ｄ－マンヌロン酸残基又はα－Ｌ－グルロン酸残基の不飽和体を有するオリゴ糖の割合を高める観点からである。後述の実施例で示される通り、アルギン酸ナトリウムに対して先に加水分解処理をした後にリアーゼによる分解処理を行って得たオリゴ糖は、フィーカリバクテリウム・プラスニッチにより資化されやすく、その増殖を促進させることができる。
　アルギン酸リアーゼ処理に供するアルギン酸及び／又はその塩の加水分解物は、重合度が好ましくは２０以下、より好ましくは１０以下、さらに好ましくは８以下、特に好ましくは５以下のオリゴ糖であってもよい。あるいは、以下の条件で行うＨＰＬＣ法で測定したときの重量平均分子量が好ましくは１００００以下、より好ましくは８０００以下、さらに好ましくは７０００以下、特に好ましくは５０００以下であってよい。
　測定機器： Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ社製)
　検出：Ｒｅｆｒａｃｔｏ Ｍａｘ ５２１検出器(Ｔｈｅｒｍｏ社製)、
　　　　　　カラム：ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＰＷ（東ソー社製）
　移動相：０．１Ｍ硝酸ナトリウム水溶液
　流速：０．３ｍＬ／ｍｉｎ
　カラム温度：４０℃
　スタンダード：ＳＴＡＮＤＡＲＤ Ｐ－８２（Ｓｈｏｄｅｘ社製）
　なお、上記条件で行うＨＰＬＣで測定される分子量は、現実の重合度から算出される「真の」分子量とはずれが生じうる「みかけの」値である。重合度４～５のアルギン酸オリゴ糖は、上記条件で測定した場合に通常は分子量約３５００とされる。
　アルギン酸及び／又はその塩を加水分解する方法としては、酸加水分解法が好ましく挙げられるが、特に限定されない。
　酸加水分解は、具体的には、アルギン酸及び／又はその塩の水溶液のｐＨを３～５程度にして、例えば１００℃以上の高温に数時間加熱することにより行われ、ｐＨの調整には酢酸等の弱酸の添加により行われるが、これに限られない。例えば、分子量４万～６万の市販のアルギン酸ナトリウムを３質量％含有する０．３ｖ/ｖ％酢酸水溶液を、１０４℃、７．５時間のオートクレーブ処理することにより酸加水分解すると、重量平均分子量約６０００の加水分解物を取得できる。
　前述の通り、本発明に係るオリゴ糖を製造する方法は、アルギン酸及び／若しくはその塩又はそれらの加水分解物にアルギン酸リアーゼを作用させてアルギン酸分解物を取得する工程を含む。
　アルギン酸リアーゼは、アルギン酸のβ１→４グリコシド結合を解裂させて、分解物の非還元末端のβ－Ｄ－マンヌロン酸残基又はα－Ｌ－グルロン酸残基の４位と５位の炭素間に二重結合を生成させる。したがって、本発明の製造方法におけるアルギン酸分解物（アルギン酸リアーゼ処理物ともいう）が、本発明の組成物に係るオリゴ糖となり得る。
　本発明の製造方法により製造されるオリゴ糖あるいはアルギン酸分解物における、β－Ｄ－マンヌロン酸残基及びα－Ｌ－グルロン酸の構成比は、原料とするアルギン酸の由来に拠る。
　本発明の製造方法におけるアルギン酸リアーゼは、エンド型アルギン酸リアーゼ、エキソ型アルギン酸リアーゼ、及びこれらの混合物のいずれを用いてもよい。
　かかる酵素としては、市販のものを入手でき、例えば「アルギン酸リアーゼＳ」（ナガセケムテックス社製）、「ＨＵＬＫアルギン酸分解酵素」（ニッポン・ジーン社製）等が挙げられ、これらから１種又は２種以上の酵素を選択して用いてもよい。
　アルギン酸及び／若しくはその塩又はそれらの加水分解物に対するアルギン酸リアーゼの使用量は、特に限定されず、基質濃度、酵素力価、反応温度及び反応時間等により適宜調整すればよいが、一般的には、アルギン酸及び／若しくはその塩又はそれらの加水分解物１ｇ当り２０～１００活性単位の割合で添加することが好ましい。
　酵素反応系のｐＨは、炭酸カリウム、水酸化ナトリウム等の食品上使用可能な塩類を用いて、使用酵素の至適ｐＨに調整してもよい。例えば、反応溶液のｐＨは、好ましくは５～８、より好ましくは６～７に調整する。
　アルギン酸リアーゼの反応温度は、使用酵素の最適温度の範囲で行うことが好ましく、好ましくは３０～５０℃、より好ましくは４０～４５℃で行う。
　アルギン酸リアーゼの反応時間は、適宜調整すればよく、例えば０．５～２４時間で行うことが可能であり、好ましくは０．５～１２時間、より好ましくは０．５～６時間である。
　アルギン酸リアーゼによる分解反応は、当該酵素を加熱して失活させて終了させればよい。例えば、１００℃以上（好適には１１０～１３０℃）で失活させる場合には１～３秒間、６０℃以上１００℃未満で失活させる場合には３～４０分間で行うことが好適である。
　酵素分解終了後、必要に応じてアルギン酸分解物溶液のｐＨを、好ましくは６～８程度に調整してもよい。
　本発明の製造方法において、アルギン酸リアーゼ反応により得られるアルギン酸分解物は重合度２～１０のオリゴ糖を分解物全体の、好ましくは３０質量％以上、より好ましくは５０質量％以上、さらに好ましくは９０質量％以上含む。このような範囲になるように、アルギン酸リアーゼによる分解反応を進行させることが好ましく、またそのために反応条件を適宜調整することが好ましい。
　酵素反応後のアルギン酸分解物は、未精製のままの状態で使用してもよいが、さらに、適宜公知の分離精製を行ってもよい。例えば、得られたアルギン酸分解物に対して膜分離、分子量分画、エタノール沈殿等を行い、適当な重合度又は分子量のオリゴ糖の分画を得ることができる。
　本発明の製造方法の好ましい態様は、重合度が２～３のオリゴ糖及び／又はその塩を回収する工程をさらに含む。本発明の製造方法において、この回収工程を行う順番は特に限定されないが、通常はアルギン酸リアーゼによる分解工程の後に行われる。
　なお、この回収工程により重合度が２～３のオリゴ糖及び／又はその塩のオリゴ糖全体に対する割合が、回収工程前に比べて高まればよく、回収工程後のオリゴ糖に重合度が４以上のオリゴ糖が含まれることは妨げられない。
　回収工程に用い得る膜分離としては、ＮＦ（ナノろ過）膜、ＲＯ（逆浸透）膜等を透過させる方法が採用でき、かかる膜の透過物として重合度が２～３のオリゴ糖及び／又はその塩を回収することができる。なお、膜分離処理の条件（圧力、流速等）は、所望の回収が可能である限り特に限定されず、適宜調整して行えばよい。
　回収工程に用い得る分子量分画としては、例えば、ＨＰＬＣ等の方法が採用でき、これにより不要な分子量のオリゴ糖や未分解のアルギン酸を除くことができる。
　さらに、脱塩や不純物を除去したり、純度を高めたりするために、公知の分離精製方法（例えば、イオン交換樹脂等）を用いてもよい。
　本発明の組成物における前述のオリゴ糖及び／又はその塩の量は、組成物の態様により適宜設定すればよく、特に限定されないが、例えば、好ましくは組成物全体の０．１質量％以上、より好ましくは１質量％以上、さらに好ましくは１０質量％以上とするのがよい。含有量の上限は特に制限されないが、例えば組成物全体の１００質量％以下、より好ましくは８０質量％以下、さらに好ましくは５０質量％以下であってよい。なお、これらの数値は、オリゴ糖の塩の場合は、オリゴ糖に換算した値である。また、これらの含有量は、本発明の組成物の製造時の値、流通時の値、又は摂取（投与）時の値のいずれかであってよい。
　本発明の組成物は、酪酸菌用プレバイオティクスとして用いられる。すなわち、酪酸菌により資化されその増殖を促進させることができる。ここで促進とは、本発明に係るオリゴ糖を非摂取のときに比べて酪酸菌の量又は増殖速度が増大することをいう。
　なお、酪酸菌とは、酪酸を産生する細菌の総称である。本発明における酪酸菌は、特に限定されないが、例えばフィーカリバクテリウム（Faecalibacterium）属が挙げられ、より具体的にはヒト腸内に存在する、フィーカリバクテリウム・プラスニッチ（Faecalibacterium prausnitzii）等が挙げられる。
　本発明の組成物は、体内の酪酸が増加することにより予防又は改善しうる疾患や病態、あるいは体内の酪酸が減少することに起因する疾患や病態の対象者に対して、有用となり得る。例えば、整腸用、免疫調節用、酸化ストレス低減用、又は下痢の予防・改善用、炎症性腸疾患用、大腸がんの予防用等とすることができる。
　本発明の別の態様は、酪酸菌用プレバイオティクス組成物の製造における、β－Ｄ－マンヌロン酸及び／又はα－Ｌ－グルロン酸から構成され、非還元末端にβ－Ｄ－マンヌロン酸残基又はα－Ｌ－グルロン酸残基の不飽和体を有するオリゴ糖又はその塩の使用である。
　本発明の別の態様は、酪酸菌の増殖促進における、β－Ｄ－マンヌロン酸及び／又はα－Ｌ－グルロン酸から構成され、非還元末端にβ－Ｄ－マンヌロン酸残基又はα－Ｌ－グルロン酸残基の不飽和体を有するオリゴ糖又はその塩の使用である。
　本発明の別の態様は、酪酸菌の増殖を促進させるために用いられる、β－Ｄ－マンヌロン酸及び／又はα－Ｌ－グルロン酸から構成され、非還元末端にβ－Ｄ－マンヌロン酸残基又はα－Ｌ－グルロン酸残基の不飽和体を有するオリゴ糖又はその塩である。
　β－Ｄ－マンヌロン酸及び／又はα－Ｌ－グルロン酸から構成され、非還元末端にβ－Ｄ－マンヌロン酸残基又はα－Ｌ－グルロン酸残基の不飽和体を有するオリゴ糖又はその塩を動物に投与することを含む、酪酸菌の増殖を促進させる方法である。ここで、動物は、特に限定されないが、通常はヒトである。
　本発明の組成物の摂取（投与）時期は、特に限定されず、投与対象の状態に応じて適宜選択することが可能である。
　本発明の組成物の摂取（投与）量は、摂取（投与）対象の年齢、性別、状態、その他の条件等により適宜選択される。本発明に係るオリゴ糖の量として、好ましくは１～３００ｍｇ／ｋｇ／日、より好ましくは、２０～５０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲となる量を目安とするのがよい。
　なお、摂取（投与）の量や期間にかかわらず、組成物は１日１回又は複数回に分けて投与することができる。
　本発明の組成物の摂取（投与）経路は、経口又は非経口のいずれでもよいが、通常は経口である。また、非経口摂取（投与）としては、直腸投与等が挙げられる。
　本発明の組成物は、本発明に係るオリゴ糖とともに酪酸菌を含有する態様でもよい。また、本発明の組成物は、酪酸菌又は酪酸菌を含有する製剤と併用して摂取されてもよい。かかる態様により、腸内における酪酸菌増殖促進効果、及びそれによる酪酸増加効果がより期待できる。
　なお、これらの態様の場合、酪酸菌は生菌であることが好ましい。
　本発明の組成物を経口摂取される組成物とする場合は、飲食品の態様とすることが好ましい。
　飲食品としては、本発明の効果を損なわず、経口摂取できるものであれば形態や性状は特に制限されず、本発明に係るオリゴ糖又はその塩を含有させること以外は、通常飲食品に用いられる原料を用いて通常の方法によって製造することができる。
　前述のように通常、本発明の製造方法により得られたオリゴ糖及び／又はその塩を飲食品原料に添加する工程を含む方法により、酪酸菌用プレバイオティクス飲食品を製造することもできる。
　飲食品としては、液状、ペースト状、ゲル状固体、粉末等の形態を問わず、例えば、錠菓；流動食（経管摂取用栄養食）；パン、マカロニ、スパゲッティ、めん類、ケーキミックス、から揚げ粉、パン粉等の小麦粉製品；即席めん、カップめん、レトルト・調理食品、調理缶詰め、電子レンジ食品、即席スープ・シチュー、即席みそ汁・吸い物、スープ缶詰め、フリーズ・ドライ食品、その他の即席食品等の即席食品類；農産缶詰め、果実缶詰め、ジャム・マーマレード類、漬物、煮豆類、農産乾物類、シリアル（穀物加工品）等の農産加工品；水産缶詰め、魚肉ハム・ソーセージ、水産練り製品、水産珍味類、つくだ煮類等の水産加工品；畜産缶詰め・ペースト類、畜肉ハム・ソーセージ等の畜産加工品；加工乳、乳飲料、ヨーグルト類、乳酸菌飲料類、チーズ、アイスクリーム類、クリーム、その他の乳製品等の乳・乳製品；バター、マーガリン類、植物油等の油脂類；しょうゆ、みそ、ソース類、トマト加工調味料、みりん類、食酢類等の基礎調味料；調理ミックス、カレーの素類、たれ類、ドレッシング類、めんつゆ類、スパイス類、その他の複合調味料等の複合調味料・食品類；素材冷凍食品、半調理冷凍食品、調理済冷凍食品等の冷凍食品；キャラメル、キャンディー、チューインガム、チョコレート、クッキー、ビスケット、ケーキ、パイ、スナック、クラッカー、和菓子、米菓子、豆菓子、デザート菓子、ゼリー、その他の菓子などの菓子類；炭酸飲料、天然果汁、果汁飲料、果汁入り清涼飲料、果肉飲料、果粒入り果実飲料、野菜系飲料、豆乳、豆乳飲料、コーヒー飲料、お茶飲料、粉末飲料、濃縮飲料、スポーツ飲料、栄養飲料、アルコール飲料、その他の嗜好飲料等の嗜好飲料類、ベビーフード、ふりかけ、お茶漬のり等のその他の市販食品等；育児用等の調製乳（粉乳、液状乳等を含む）；経腸栄養食；機能性食品（特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品）、栄養補助食品等が挙げられる。
　また、飲食品の一態様として飼料とすることもできる。飼料としては、ペットフード、家畜飼料、養魚飼料等が挙げられる。
　飼料の形態としては特に制限されず、本発明に係るオリゴ糖又はその塩の他に例えば、アルギン酸又はその塩、本発明に係るオリゴ糖以外のオリゴ糖、トウモロコシ、小麦、大麦、ライ麦、マイロ等の穀類；大豆油粕、ナタネ油粕、ヤシ油粕、アマニ油粕等の植物性油粕類；フスマ、麦糠、米糠、脱脂米糠等の糠類；コーングルテンミール、コーンジャムミール等の製造粕類；魚粉、脱脂粉乳、ホエイ、イエローグリース、タロー等の動物性飼料類；トルラ酵母、ビール酵母等の酵母類；第三リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の鉱物質飼料；油脂類；単体アミノ酸；糖類等を含有するものであってよい。
　本発明の組成物が飲食品（飼料を含む）の態様である場合、酪酸菌用プレバイオティクスであることや腸内の酪酸菌の増殖を促進させるという用途が表示された飲食品として提供・販売されることが可能である。
　かかる「表示」行為には、需要者に対して前記用途を知らしめるための全ての行為が含まれ、前記用途を想起・類推させうるような表現であれば、表示の目的、表示の内容、表示する対象物・媒体等の如何に拘わらず、全て本発明の「表示」行為に該当する。
　また、「表示」は、需要者が上記用途を直接的に認識できるような表現により行われることが好ましい。具体的には、飲食品に係る商品又は商品の包装に前記用途を記載したものを譲渡し、引き渡し、譲渡若しくは引き渡しのために展示し、輸入する行為、商品に関する広告、価格表若しくは取引書類に上記用途を記載して展示し、若しくは頒布し、又はこれらを内容とする情報に上記用途を記載して電磁気的（インターネット等）方法により提供する行為等が挙げられる。
　一方、表示内容としては、行政等によって認可された表示（例えば、行政が定める各種制度に基づいて認可を受け、そのような認可に基づいた態様で行う表示等）であることが好ましい。また、そのような表示内容を、包装、容器、カタログ、パンフレット、ＰＯＰ等の販売現場における宣伝材、その他の書類等へ付することが好ましい。
　また、「表示」には、健康食品、機能性食品、経腸栄養食品、特別用途食品、保健機能食品（特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品）、栄養補助食品、医薬用部外品等としての表示も挙げられる。この中でも特に、消費者庁によって認可される表示、例えば、特定保健用食品、栄養機能食品、若しくは機能性表示食品に係る制度、又はこれらに類似する制度にて認可される表示等が挙げられる。具体的には、特定保健用食品としての表示、条件付き特定保健用食品としての表示、身体の構造や機能に影響を与える旨の表示、疾病リスク減少表示、科学的根拠に基づいた機能性の表示等を挙げることができ、より具体的には、健康増進法に規定する特別用途表示の許可等に関する内閣府令（平成二十一年八月三十一日内閣府令第五十七号）に定められた特定保健用食品としての表示（特に保健の用途の表示）及びこれに類する表示が典型的な例である。
　かかる表示としては、例えば、「おなかの中の酪酸菌を増やしたい方」、「フィーカリバクテリウム属細菌を増やしたい方」、「酪酸で整腸作用」、「酪酸菌を増やして免疫力アップ」等と表示することが挙げられる。
　本発明の組成物は、医薬品の態様とすることもできる。
　医薬品の投与経路は、経口又は非経口のいずれでもよいが経口が好ましい。また、非経口摂取（投与）としては、直腸投与等が挙げられる。
　医薬品の形態としては、投与方法に応じて、適宜所望の剤形に製剤化することができる。例えば、経口投与の場合、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤等の固形製剤；溶液剤、シロップ剤、懸濁剤、乳剤等の液剤等に製剤化することができる。また、非経口投与の場合、座剤、軟膏剤、注射剤等に製剤化することができる。
　製剤化に際しては、本発明に係るオリゴ糖又はその塩の他に、通常製剤化に用いられている賦形剤、ｐＨ調整剤、着色剤、矯味剤等の成分を用いることができる。また、他の薬効成分や、公知の又は将来的に見出されるプレバイオティクスなどを併用することも可能である。
　加えて、製剤化は剤形に応じて適宜公知の方法により実施できる。製剤化に際しては、適宜、製剤担体を配合して製剤化してもよい。
　賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニット、ソルビット等の糖誘導体；トウモロコシデンプン、馬鈴薯デンプン、α－デンプン、デキストリン、カルボキシメチルデンプン等のデンプン誘導体；結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム等のセルロース誘導体；アラビアゴム；デキストラン；プルラン；軽質無水珪酸、合成珪酸アルミニウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウム等の珪酸塩誘導体；リン酸カルシウム等のリン酸塩誘導体；炭酸カルシウム等の炭酸塩誘導体；硫酸カルシウム等の硫酸塩誘導体等が挙げられる。
　結合剤としては、例えば、上記賦形剤の他、ゼラチン；ポリビニルピロリドン；マクロゴール等が挙げられる。
　崩壊剤としては、例えば、上記賦形剤の他、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドン等の化学修飾されたデンプン又はセルロース誘導体等が挙げられる。
　滑沢剤としては、例えば、タルク；ステアリン酸；ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等のステアリン酸金属塩；コロイドシリカ；ビーガム、ゲイロウ等のワックス類；硼酸；グリコール；フマル酸、アジピン酸等のカルボン酸類；安息香酸ナトリウム等のカルボン酸ナトリウム塩；硫酸ナトリウム等の硫酸塩類；ロイシン；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム等のラウリル硫酸塩；無水珪酸、珪酸水和物等の珪酸類；デンプン誘導体等が挙げられる。
　安定剤としては、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン等のパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコール等のアルコール類；塩化ベンザルコニウム；無水酢酸；ソルビン酸等が挙げられる。
　矯味矯臭剤としては、例えば、甘味料、酸味料、香料等が挙げられる。
　なお、経口投与用の液剤の場合に使用する担体としては、水等の溶剤等が挙げられる。
　本発明の医薬品を摂取するタイミングは、例えば食前、食後、食間、就寝前など特に限定されない。
　以下に実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
　試験例２以降では、特に断りのない場合は、試験例１で用いた原料、試薬と同じものを用いた。
＜試験例１＞フィーカリバクテリウム・プラスニッチ単独培養１
（１）培地の調製
　９９．７ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水に０．３ｍＬの酢酸（国産化学株式会社）を添加して、１０４℃、７．５時間のオートクレーブ処理にかけた。その後、得られた滅菌水をスピードバックに供して酢酸及び水分を完全に除去し、そこに４０ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水を加え、再度スピードバックに供して水分を完全に除去した。再度ＭｉｌｌｉＱ水を６４．７ｍＬ添加して、培地調製用水溶液を得た。
　上記調製した培地調製用水溶液全量に、市販のアルギン酸リアーゼ処理物１（「アルギン酸オリゴ糖」（北海道三井化学株式会社製））を１ｇ添加し、さらに糖以外のＹＣＦＡ培地組成粉末を規定量加えて、アルギン酸リアーゼ処理物１含有培地を取得した。
　上記調製した培地調製用水溶液全量に、市販のアルギン酸ナトリウム素材(「ＵＬＶ－Ｌ３(分子量４万～６万)」(株式会社キミカ製))を１ｇ添加し、さらに糖以外のＹＣＦＡ培地組成粉末を規定量加えて、１１５℃、１５分間のオートクレーブ処理にかけて、アルギン酸ナトリウム含有培地を取得した。
　市販のアルギン酸ナトリウム素材(「ＵＬＶ－Ｌ３(分子量４万～６万)」(株式会社キミカ製))１ｇを９９．７ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水で溶解し、０．３ｍＬの酢酸を添加して、１０４℃、７．５時間のオートクレーブ処理にかけた。その後、スピードバックに供して酢酸及び水分を完全に除去し、そこに４０ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水を加え、再度スピードバックに供して水分を完全に除去した。再度ＭｉｌｌｉＱ水を６４．７ｍＬ添加してアルギン酸加水分解物の水溶液を取得した。ここに、糖以外のＹＣＦＡ培地組成粉末を規定量加えて、１１５℃、１５分間のオートクレーブ処理にかけて、アルギン酸加水分解物含有培地を取得した。
　上記調製した培地調製用水溶液全量に、グルコース０．２ｇ、マルトース０．２ｇ、及びセロビオース０．２ｇ（いずれもナカライテスク株式会社製）を添加し、さらに糖以外のＹＣＦＡ培地組成粉末を規定量加えて、１１５℃、１５分間のオートクレーブ処理にかけて、陽性対照培地を取得した。
　上記調製した培地調製用水溶液全量に、糖以外のＹＣＦＡ培地組成粉末を規定量加えて、１１５℃、１５分間のオートクレーブ処理にかけて、陰性対照培地を取得した。
（２）単独培養
　（１）で調製した各ＹＣＦＡ培地に無菌的にフィルター滅菌処理したビタミン液とシステイン液を添加し、被験糖の終濃度が１％（ｗ／ｖ）となる培養液を調製した。培養液を５ｍＬチューブ３５２０６３ (Ｆａｌｃｏｎ社製)に２ｍＬずつ分注した。その後、Ｃｏｙ嫌気チャンバー(Ｃｏｙ社製)内に前記５ｍＬチューブを一晩静置し培養液を嫌気状態に置換した。これに培養実験に供する２４時間前にフィーカリバクテリウム・プラスニッチ ＭＣＣ２０４１（２０１９年９月２０日に独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（郵便番号292-0818、千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室）に、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０３０２７で国際寄託された）を接種し３７℃で嫌気培養を行った前培養液を６０μＬずつ培養液に接種し２４時間、３７℃で嫌気培養を行った。
　培養液の波長６００ｎｍにおける濁度を下方蛍光測定器（日立ハイテクサイエンス社製、ＳＨ９０００－Ｌａｂ）を用いて測定した。
（３）結果
　図１に、培養２４時間後の培養液の濁度（ＯＤ６００）を示す。フィーカリバクテリウム・プラスニッチは、アルギン酸ナトリウムは資化できずほとんど増殖しなかったが、アルギン酸加水分解物では資化が認められ、さらにアルギン酸リアーゼ処理物１では著しい増殖が認められた。
＜試験例２＞フィーカリバクテリウム・プラスニッチ単独培養２
（１）培地の調製
　ＭｉｌｌｉＱ水６４．７ｍＬに、試験例１で用いたアルギン酸リアーゼ処理物１、アルギン酸リアーゼ処理物２（「アルギン酸オリゴ糖」（Shandong社製））、又はアルギン酸リアーゼ処理物３（「アルギン酸オリゴ糖」（Runxin社製））をそれぞれ１ｇ添加し、さらに糖以外のＹＣＦＡ培地組成粉末を規定量加えて、１１５℃、１５分間のオートクレーブ処理にかけて、アルギン酸リアーゼ処理物１～３含有培地を取得した。
　ＭｉｌｌｉＱ水６４．７ｍＬに、市販のアルギン酸ナトリウム素材を１ｇ添加し、さらに糖以外のＹＣＦＡ培地組成粉末を規定量加えて、１１５℃、１５分間のオートクレーブ処理にかけて、アルギン酸ナトリウム含有培地を取得した。
　ＭｉｌｌｉＱ水６４．７ｍＬに、市販のグアーガム加水分解物（「サンファイバー」（太陽化学株式会社製））を１ｇ添加し、さらに糖以外のＹＣＦＡ培地組成粉末を規定量加えて、１１５℃、１５分間のオートクレーブ処理にかけて、グアーガム加水分解物含有培地を取得した。なお、グアーガム加水分解物は、腸内でフィーカリバクテリウム・プラスニッチ増殖能を有することが既に知られている。
　ＭｉｌｌｉＱ水６４．７ｍＬに、グルコース０．２ｇ、マルトース０．２ｇ、及びセロビオース０．２ｇ（いずれもナカライテスク株式会社製）を添加し、さらに糖以外のＹＣＦＡ培地組成粉末を規定量加えて、１１５℃、１５分間のオートクレーブ処理にかけて、陽性対照培地を取得した。
　ＭｉｌｌｉＱ水６４．７ｍＬに、糖以外のＹＣＦＡ培地組成粉末を規定量加えて、１１５℃、１５分間のオートクレーブ処理にかけて、陰性対照培地を取得した。
（２）単独培養
　（１）で調製した各ＹＣＦＡ培地を用いて、試験例1と同様に、フィーカリバクテリウム・プラスニッチ ＭＣＣ２０４１を培養した。
（３）フィーカリバクテリウム・プラスニッチ資化画分の分析
　薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により、フィーカリバクテリウム・プラスニッチに資化されたオリゴ糖の重合度を分析した。
　（２）の培養前及び培養２４時間後の培養液を、それぞれ１３０００×ｇ、４℃で３分間遠心分離して各上清を回収しサンプルとした。
　薄層クロマトグラフィー用アルミプレート silica gel 60（Merck社製）に各サンプルを１μＬずつスポットし、展開溶媒（ギ酸:１－ブタノール：蒸留水＝６：４：１）で展開した。ジフェニルアミン・アニリン・リン酸試薬（１００ｍＬアセトン、１ｇジフェニルアミン、１ｍＬアニリン、１０ｍＬリン酸）を噴霧した後、加熱し糖を呈色した。
（４）結果
　図２に、培養２４時間後の培養液の濁度（ＯＤ６００）を示す。フィーカリバクテリウム・プラスニッチは、アルギン酸ナトリウムやグアーガム加水分解物を資化できずほとんど増殖しなかった。一方、アルギン酸リアーゼ処理物１～３ではいずれも、フィーカリバクテリウム・プラスニッチの著しい増殖が認められた。
　図３に呈色後のＴＬＣプレートを示す。アルギン酸リアーゼ処理物１～３含有培地では、重合度２～６のオリゴ糖に相当するスポットが、培養後に薄くなるか消失したことが認められた。このことから、フィーカリバクテリウム・プラスニッチは、アルギン酸リアーゼ処理物のうち特に重合度２～６のオリゴ糖を資化したことが分かる。
＜試験例３＞フィーカリバクテリウム・プラスニッチ単独培養３
（１）培地の調製
　市販のアルギン酸ナトリウム素材５ｇを９６ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水で溶解した。そこに５ｍｇ/ｍＬアルギン酸リアーゼＳ（ナガセケムテックス社製）水溶液を４ｍＬ添加し、４０℃、２４時間で酵素反応させた。次いで８０℃で６０分間加熱して酵素を失活させた。反応液を８０００×ｇで２０分間遠心し、上清を回収して、５％アルギン酸リアーゼ処理物４水溶液を得た。このアルギン酸リアーゼ処理物４水溶液２０ｍＬと２．２４倍量のＭｉｌｌｉＱ水とを混合し、さらに糖以外のＹＣＦＡ培地組成粉末を規定量加えて、１１５℃、１５分間のオートクレーブ処理にかけて、アルギン酸リアーゼ処理物４含有培地を取得した。
　アルギン酸リアーゼＳ（ナガセケムテックス社製）の０．０２質量％水溶液を、４０℃、２４時間インキュベートした後、８０℃で６０分間加熱して酵素を失活させた。水溶液を８０００×ｇで２０分間遠心し、上清を回収した。上清２０ｍＬと２．２４倍量のＭｉｌｌｉＱ水とを混合して、１１５℃、１５分間のオートクレーブ処理にかけて、培地調製用水溶液を得た。
　上記調製した培地調製用水溶液全量に、アルギン酸ナトリウム素材を１ｇ添加し、さらに糖以外のＹＣＦＡ培地組成粉末を規定量加えて、１１５℃、１５分間のオートクレーブ処理にかけて、アルギン酸ナトリウム含有培地を取得した。
　上記調製した培地調製用水溶液全量に、市販のグアーガム加水分解物（「サンファイバー」（太陽化学株式会社製））を１ｇ添加し、さらに糖以外のＹＣＦＡ培地組成粉末を規定量加えて、１１５℃、１５分間のオートクレーブ処理にかけて、グアーガム加水分解物含有培地を取得した。
　上記調製した培地調製用水溶液全量に、グルコース０．２ｇ、マルトース０．２ｇ、及びセロビオース０．２ｇを添加し、さらに糖以外のＹＣＦＡ培地組成粉末を規定量加えて、１１５℃、１５分間のオートクレーブ処理にかけて、陽性対照培地を取得した。
　上記調製した培地調製用水溶液全量に、糖以外のＹＣＦＡ培地組成粉末を規定量加えて、１１５℃、１５分間のオートクレーブ処理にかけて、陰性対照培地を取得した。
（２）単独培養
　（１）で調製した各ＹＣＦＡ培地を用いて、試験例1と同様に、フィーカリバクテリウム・プラスニッチ ＭＣＣ２０４１を培養した。
　培養液の波長６００ｎｍにおける濁度を、試験例１と同様に測定した。
（３）フィーカリバクテリウム・プラスニッチ資化画分の分析
　試験例２と同様に、ＴＬＣにより、フィーカリバクテリウム・プラスニッチに資化されたオリゴ糖の重合度を分析した。
（４）結果
　図４に、培養２４時間後の培養液の濁度（ＯＤ６００）を示す。フィーカリバクテリウム・プラスニッチは、アルギン酸ナトリウムやグアーガム加水分解物を資化できずほとんど増殖しなかった。一方、アルギン酸リアーゼ処理物４では、フィーカリバクテリウム・プラスニッチの著しい増殖が認められた。
　図５に呈色後のＴＬＣプレートを示す。アルギン酸リアーゼ処理物４含有培地では、重合度２～６のオリゴ糖に相当するスポットが、培養後に薄くなるか消失したことが認められた。このことから、フィーカリバクテリウム・プラスニッチは、アルギン酸リアーゼ処理物４のうち特に重合度２～６のオリゴ糖を資化したことが分かる。
＜試験例４＞アルギン酸ナトリウムに対する加水分解処理及びアルギン酸リアーゼ処理による分解度の検討
（１）試料の調製
　試薬については、特に記載のない場合は試験例１と同じものを用いた。
　市販のアルギン酸ナトリウム素材３ｇを９９．７ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水で溶解しアルギン酸ナトリウム溶液を調製した。アルギン酸ナトリウム溶液に０．３ｍＬの酢酸を添加後ただちに４ＮのＮａＯＨ溶液を添加してｐＨを６．２±０．１に調整して、酢酸含有アルギン酸ナトリウム溶液（試料ａ’）を得た。
　酢酸含有アルギン酸ナトリウム溶液（試料ａ’）１００ｍＬに、６ｍｇ／ｍＬのアルギン酸リアーゼＳ（ナガセケムテックス社製）水溶液を１ｍＬ添加し、４０℃、３時間酵素反応させた。次いで８０℃３０分間加熱して酵素を失活させて、アルギン酸リアーゼ処理物溶液（試料ｂ’）を得た。
　アルギン酸リアーゼ処理物溶液（試料ｂ’）に、酢酸を添加し ｐＨを４．２±０．１に調整し、１０４℃、７．５時間のオートクレーブ処理した。その後、４ＮのＮａＯＨ溶液を加え、ｐＨを６．２±０．１に調整し、アルギン酸リアーゼ処理物加水分解物溶液（試料ｃ）の最終試料とした。
　上記調製したアルギン酸ナトリウム溶液に０．３ｍＬの酢酸を添加してｐＨを４．２±０．１に調整し、１０４℃、７．５時間のオートクレーブ処理にかけアルギン酸加水分解物溶液（試料ｄ’）を得た。
　アルギン酸加水分解物溶液（試料ｄ’）に４ＮのＮａＯＨ溶液を加え、ｐＨを６．２±０．１に調整した。試料ｂ’の調製と同様の手順にて、アルギン酸加水分解物溶液（試料ｄ’）のリアーゼ処理反応を行い、アルギン酸加水分解物リアーゼ処理物溶液（試料ｅ’）を得た。
　酢酸含有アルギン酸ナトリウム溶液（試料ａ’）、アルギン酸リアーゼ処理物溶液（試料ｂ’）、アルギン酸加水分解物溶液（試料ｄ’）、及びアルギン酸加水分解物リアーゼ処理物溶液（試料ｅ’）それぞれに酢酸を添加してただちに４ＮのＮａＯＨ溶液を加え、ｐＨを６．２±０．１に調整して、各最終試料（試料ａ、ｂ、ｄ、ｅ）とした。各試料を得るために行った処理を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（２）各試料の分解度の分析
　薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により、試料ａ～ｅを分析した。
　（１）で取得した各試料をＭｉｌｌｉＱ水で希釈した３％（ｗ／ｖ）希釈溶液をＴＬＣサンプルとした。また、試験例１で用いたアルギン酸リアーゼ処理物１の１％（ｗ／ｖ）溶液を試料Ｍとして用いた。
　ＴＬＣは試験例２と同様の手順にて行った。
（３）結果
　図６に呈色後のＴＬＣプレートを示す。アルギン酸ナトリウムに対して、酵素分解を行う前又は後に加水分解を行うことにより、分解度が高まり、重合度の小さいオリゴ糖が得られやすいことが分かった。
＜試験例５＞フィーカリバクテリウム・プラスニッチ単独培養４
　（１）培地の調製
　ＹＣＦＡ培地組成粉末に規定量の８割体積になるようにＭｉｌｌｉＱ水を加えて混合し、１１５℃、１５分間、オートクレーブ処理にかけてＹＣＦＡ培地調製液を得た。試験例４で取得した試料ａ～ｅの各溶液を１１５℃、１５分でオートクレーブ処理にを行った。ＹＣＦＡ培地調製液にその体積の１／４量のオートクレーブ処理後の試料ａ～ｅを加えて、０．６質量％糖含有ＹＣＦＡ培地を調製した。
　ＭｉｌｌｉＱ水に、市販のグアーガム加水分解物（「サンファイバー」（太陽化学株式会社製））を添加して、さらに糖以外のＹＣＦＡ培地組成粉末を規定量加えて１１５℃、１５分でオートクレーブ処理を行い、０．６質量％グアーガム加水分解物含有培地を取得した。
　ＭｉｌｌｉＱ水６４．７ｍＬに、糖以外のＹＣＦＡ培地組成粉末を規定量加えて、１１５℃、１５分でオートクレーブ処理を行いて陰性対照培地を取得した。
（２）単独培養
　（１）で調製した各ＹＣＦＡ培地を用いて、試験例1と同様に、フィーカリバクテリウム・プラスニッチ ＭＣＣ２０４１を培養した。
（３）フィーカリバクテリウム・プラスニッチ資化画分の分析
　試験例２と同様に、ＴＬＣにより、フィーカリバクテリウム・プラスニッチに資化されたオリゴ糖の重合度を分析した。
　培養液の波長６００ｎｍにおける濁度を、試験例１と同様に測定した。
（４）結果
　ＴＬＣの結果から、試料ｂ～ｅ含有培地では、２～６糖のオリゴ糖に相当するスポットが、培養後に薄くなったことが認められた。このことから、フィーカリバクテリウム・プラスニッチは、アルギン酸リアーゼ処理物のうち特に重合度２～６のオリゴ糖を資化したことが分かる。
　図７に、培養２４時間後の培養液の濁度（ＯＤ６００）を示す。フィーカリバクテリウム・プラスニッチは、アルギン酸ナトリウム（試料ａ）やグアーガム加水分解物を資化できずほとんど増殖しなかった。一方、アルギン酸リアーゼ処理物（試料ｂ）では、フィーカリバクテリウム・プラスニッチの増殖が認められた。また、アルギン酸ナトリウムを加水分解した後にリアーゼ処理したアルギン酸加水分解物リアーゼ処理物（試料ｅ）では、フィーカリバクテリウム・プラスニッチの著しい増殖が認められた。
　アルギン酸ナトリウムをリアーゼ処理した後に加水分解したアルギン酸リアーゼ処理物加水分解物（試料ｃ）では、試料ｂよりも重合度の小さいオリゴ糖量が多いにも関わらず（図６参照）、フィーカリバクテリウム・プラスニッチの生育は鈍化した。これは、リアーゼ処理後の加水分解により飽和体のオリゴ糖が生成し、フィーカリバクテリウム・プラスニッチに資化されやすい非還元末端に不飽和体を有するオリゴ糖が相対的に少なくなったためと考えられる。
＜試験例６＞アルギン酸ナトリウムに対する加水分解処理及びアルギン酸リアーゼ処理による分解度の検討
（１）試料の調製
　５０℃に保温したＭｉｌｌｉＱ水に市販のアルギン酸ナトリウム素材(「Ｉ－５（分子量約２８０万）」(株式会社キミカ製))を溶解して３質量％のアルギン酸ナトリウム水溶液を調製した。酢酸（国産化学株式会社）を０．３質量％となるように添加してｐＨを４．２±０．１に調整した後、１０４℃、３．５時間又は７．５時間のオートクレーブ処理にかけアルギン酸加水分解物溶液を得た。さらに４ＮのＮａＯＨ溶液を加え、ｐＨを６．２±０．１に調整した後に、アルギン酸リアーゼＳ（ナガセケムテックス社製）を当初のアルギン酸ナトリウム素材１００ｇに対して０．２ｇ添加し、４０℃で、０．５、１、２又は３時間酵素反応させた。次いで８０℃３０分間加熱して酵素を失活させて、アルギン酸加水分解物リアーゼ処理物溶液を得た。
（２）各試料の分解度の分析
　薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により、アルギン酸加水分解物リアーゼ処理物溶液を分析した。ＴＬＣは試験例２と同様の手順にて行った。
（３）結果
　図８に呈色後のＴＬＣプレートを示す。アルギン酸ナトリウムに対して、酵素分解を行う前に加水分解を行うことにより、分解度が高まり、重合度の小さいオリゴ糖が得られやすいことが分かった。
　なお、用いたアルギン酸ナトリウム素材「Ｉ－５」の水溶液は非常に粘度が高く、そのままではフィーカリバクテリウム・プラスニッチの培養や、アルギン酸リアーゼ処理に供するのに適さないところ、加水分解処理を行うことにより、アルギン酸リアーゼによる分解反応を行いやすくなる。その結果、フィーカリバクテリウム・プラスニッチに資化されやすくなり、その増殖を促進することができるプレバイオティクスとなり得る。
＜試験例７＞ナノろ過膜（ＮＦ膜）処理によるアルギン酸リアーゼ処理物の分画
（１）アルギン酸オリゴ糖の入手及び分画
　市販のアルギン酸カリウム素材(「ＫＵＬＶ－Ｌ３(分子量４万～６万)」(株式会社キミカ製))４００ｇを７．６Ｌの逆浸透膜透過水（ＲＯ水）を用いて溶解した。そこに１．６ｇのアルギン酸リアーゼＳ（ナガセケムテックス社製）を添加し、４０℃にて６時間の酵素反応を行った。次いで８５℃で１０分間加熱して酵素を失活させアルギン酸カリウムリアーゼ処理物(以下、「ＡＯＳＫ」とも記載する。)を得た。得られたＡＯＳＫに１２ＬのＲＯ水を加え希釈し、該希釈溶液２０ＬをＮＦ膜（ＮＴＲ７４５０、日東電工社製）に１０ｋｇｆ／ｃｍ３の圧力で通過させ分画した。ＮＦ膜透過液を回収しＡＯＳＫのＮＦ膜透過物溶液を得た。該透過物溶液を凍結乾燥機（ＲＬ－Ｂ０４型）を用いて凍結乾燥し、乾燥粉末(以下、「ＡＯＳＫ－ＮＦ」とも記載する。)１７．０２ｇを得た。
（２）ＮＦ膜処理前後でのオリゴ糖含有割合の比較
　（１）で取得したＡＯＳＫとＡＯＳＫ-ＮＦに含まれる重合度２～６のオリゴ糖の各存在量をＨＰＬＣにて測定した。ＡＯＳＫ水溶液及びＡＯＳＫ－ＮＦ水溶液を調製し（各１質量％）、０．２２μｍフィルター（メルクミリポア社製）に通過させた後にＨＰＬＣに供した。システムはＵｌｔｉｍａｔｅ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ社製）、検出はダイオードアレイ検出器（Ｔｈｅｒｍｏ社製）、及びカラムはＮＨ２Ｐ－５０　４Ｅ（昭光サイエンス社製）を用いた。移動相は０．３Ｍリン酸二水素ナトリウムを溶解した蒸留水を用いて、イソクラティックで９０分間測定した。流速は１．０ｍＬ/ｍｉｎ、カラムオーブン温度は４０℃に設定し、検出は２３５ｎｍの吸収で行った。標品Ｍにはアルギン酸リアーゼ処理物１（「アルギン酸オリゴ糖」(北海道三井化学社製)）の１％（ｗ／ｖ）溶液を使用した。
　図９に、ＨＰＬＣチャートにおける各ピーク面積を、対応する重合度のオリゴ糖ごとに、ＮＦ膜処理前後のアルギン酸カリウムリアーゼ処理物に含まれるオリゴ糖量として示す。ＮＦ膜処理で分画することにより、試料中のオリゴ糖に占める重合度２又は３のオリゴ糖の含有量が増加し、重合度４～６のオリゴ糖の含有量が減少したことが確認できた。
（３）オリゴ糖重合度の分析
　（１）で取得したＡＯＳＫとＡＯＳＫ－ＮＦに含まれるオリゴ糖の重合度をＴＬＣにより分析した。
　ＡＯＳＫ水溶液及びＡＯＳＫ－ＮＦ水溶液を調製し（各１質量％）、ＴＬＣ分析に用いた。ＴＬＣは試験例２と同様の手順にて行った。
　図１０に呈色後のＴＬＣプレートを示す。ＡＯＳＫ-ＮＦではＡＯＳＫに比べて重合度２又は３のオリゴ糖に相当するスポットが濃く、重合度４以上のオリゴ糖に相当するスポットが薄かった。このことから、ＮＦ膜処理で分画することにより、試料中のオリゴ糖に占める重合度２又は３のオリゴ糖の含有量が増加し、四糖～六糖の含有量が減少したことが確認できた。
＜試験例８＞中和培養
（１）中和培養
　糖を含有しないＹＣＦＡ培地を１００ｍＬ作成し、ｐＨコントロール可能な培養装置Ｂｉｏ Ｊｒ．８（株式会社バイオット社製、ＢＪＲ－２５ＮＡ１Ｓ－８Ｍ）のベッセルに入れ、試験例７で取得したＡＯＳＫ又はＡＯＳＫ－ＮＦを１ｇ添加した。各培地をベッセルごと、１１５℃２０分間のオートクレーブ処理にかけた。その後、無菌的にフィルター滅菌処理したビタミン液とシステイン液を添加し、被験試料の終濃度が１％（ｗ／ｖ）となる培養液を調製した。その後、窒素置換を一晩行うことで嫌気状態とし、生理食塩水で１０％（ｗ／ｖ）に予め調整しておいた糞便溶液１００μＬを添加し、ｐＨが６以下にならないよう１ＭのＮａ２ＣＯ３液でコントロールしながら６８時間３７℃で嫌気培養を行った。培養開始から０、１６、２０、２４、４８、及び６８時間後に培養液を１ｍＬずつ回収した。
　なお、前記糞便は、通常の食餌を継続している健康なヒト（ｎ＝４；４０歳代男性１名、３０歳代男性２名、及び２０歳代男性１名）から提供されたものである。
（２）腸内細菌の解析
　（１）で回収した培養液を１５，０００ｇで１０分間遠心して沈殿を得た。前記沈殿を、４５０μＬの抽出液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ, ４ｍＭ ＥＤＴＡ, ｐＨ９．０）に懸濁した後、１０％ＳＤＳ溶液５０μＬ、０．１ｍｍ径のガラスビーズ３００ｍｇ、５００μＬのＴＥ飽和フェノール（和光純薬）と混合し、ＦａｓｔＰｒｅｐ ＦＰ １００Ａ（フナコシ社製）にてパワーレベル５、３０秒の破砕処理を行った。次いで、１４，０００ｇで５分間遠心後４００μＬの上清を取り、２５０μＬのフェノール・クロロホルム溶液（和光純薬）を加えて混合し、１４，０００ｇで５分間遠心後、２５０μＬの上清を取得した。さらに２－プロパノールを２５０μＬ加えて得た沈殿を２００μＬのＴｒｉｓ－ＥＤＴＡバッファー（ｐＨ８．０）で溶解し、鋳型ＤＮＡ溶液とした。
　次に細菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の第３～４可変領域を増幅させるための１ｓｔプライマーセット（配列番号１及び２）と、次世代シーケンサーＭｉｓｅｑ （イルミナ社製）にて解析するために必要な２ｎｄプライマーセット（配列番号３及び４、なおｎは１度の解析で複数サンプルを処理するための任意の塩基配列（インデックス領域））を設計し、Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のオリゴプライマー作成サービスによりプライマーを合成した。
　鋳型ＤＮＡ溶液及び１ｓｔプライマーセットを含む総液量を２５μＬとした反応液をＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ ＨＳ ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて調製した。Ｖｅｒｉｔｉ ２００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）により、９４℃３分の後、９４℃３０秒、５０℃３０秒、及び７２℃３０秒を２０回、７２℃１０分のＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ産物を１％アガロースゲルにて電気泳動し、バンドパターンを確認した。続いて得られたＰＣＲ産物１μＬを鋳型とし、２ｎｄプライマーセットを用いて上述した条件と同様にＰＣＲを実施した。ＰＣＲのサイクル数は１５回とした。得られたＰＣＲ産物を１％アガロースゲルにて電気泳動し、バンドパターンを確認後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ９６ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社製）にて精製を行い、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）にて濃度を測定した。同濃度のＤＮＡ溶液を混合したものをＭｉｓｅｑ ｖ２ Ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ（イルミナ社製）に供し、Ｍｉｓｅｑにてシークエンス解析を実施した。
　得られたペアエンド配列をＱＩＩＭＥ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０）(http://qiime.org/)にて腸内細菌叢の構成を解析し、その中の最優勢酪酸菌（フィーカリバクテリウム・プラスニッチ）の腸内細菌全体に占める割合をそれぞれ算出し、全被験試料の平均を求めた。
　図１１にフィーカリバクテリウム・プラスニッチの腸内細菌全体に占める割合の経時変化を示す。ＮＦ膜処理で分画することで試料中のオリゴ糖に占める重合度２又は３のオリゴ糖の含有量を高めたことで、フィーカリバクテリウム・プラスニッチの増殖が促進し、腸内細菌全体における占有率が増加したことが認められた。
＜試験例９＞フィーカリバクテリウム・プラスニッチ単独培養５
（１）培地の調製
　ＹＣＦＡ培地組成粉末に規定量の８割体積になるように調整したＭｉｌｌｉＱ水を加えて混合し、１１５℃、１５分でオートクレーブ処理にかけてＹＣＦＡ培地調製液を得た。試験例６で取得したＡＯＳＫ又はＡＯＳＫ－ＮＦをＭｉｌｌｉＱ水にそれぞれ添加して３％（ｗ／ｖ）オリゴ糖水溶液を調製し、１１５℃、１５分でオートクレーブ処理した。ＹＣＦＡ培地調製液にその体積の１／４量のオリゴ糖含有水溶液を加えて、０．６質量％糖含有ＹＣＦＡ培地を調製した。また、ＭｉｌｌｉＱ水６４．７ｍＬに、糖以外のＹＣＦＡ培地組成粉末を規定量加えて、１１５℃、１５分でオートクレーブ処理して陰性対照培地を取得した。
（２）単独培養
　（１）で調製した各ＹＣＦＡ培地を用いて、試験例1と同様に、フィーカリバクテリウム・プラスニッチ ＭＣＣ２０４１を嫌気培養した。
　図１２に、培養２４時間後の培養液の濁度（ＯＤ６００）を示す。フィーカリバクテリウム・プラスニッチは、ＡＯＳＫよりもＡＯＳＫ－ＮＦにより増殖が促進されたことが分かる。

Claims (19)

  1. 　β－Ｄ－マンヌロン酸及び／又はα－Ｌ－グルロン酸から構成されるオリゴ糖又はその塩を含有する、酪酸菌用プレバイオティクス組成物であって、
    　前記オリゴ糖は、非還元末端にβ－Ｄ－マンヌロン酸残基又はα－Ｌ－グルロン酸残基の不飽和体を有する、組成物。
  2. 　前記不飽和体は４位と５位の炭素間に二重結合を有する、請求項１に記載の組成物。
  3. 　前記オリゴ糖が重合度２～１０のオリゴ糖を含む、請求項１又は２に記載の組成物。
  4. 　前記酪酸菌がフィーカリバクテリウム（Faecalibacterium）属細菌である、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
  5. 　前記フィーカリバクテリウム属細菌がフィーカリバクテリウム・プラスニッチ（Faecalibacterium prausnitzii）である、請求項４に記載の組成物。
  6. 　β－Ｄ－マンヌロン酸及び／又はα－Ｌ－グルロン酸から構成されるオリゴ糖又はその塩を含有する組成物であって、
    　前記オリゴ糖は、非還元末端にβ－Ｄ－マンヌロン酸残基又はα－Ｌ－グルロン酸残基の不飽和体を有し、
    　体内の酪酸が増加することにより予防もしくは改善しうる疾患もしくは病態の対象者、又は体内の酪酸が減少することに起因する疾患もしくは病態の対象者に対して投与又は接種される、組成物。
  7. 　整腸、免疫調節、酸化ストレス低減、下痢の予防もしくは改善、炎症性腸疾患の予防もしくは改善、又は大腸がんの予防のために用いられる、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
  8. 　飲食品である、請求項１～７の何れか一項に記載の組成物。
  9. 　医薬品である、請求項１～７の何れか一項に記載の組成物。
  10. 　酪酸菌用プレバイオティクス組成物の製造における、β－Ｄ－マンヌロン酸及び／又はα－Ｌ－グルロン酸から構成されるオリゴ糖又はその塩の使用であって、
    　前記オリゴ糖は、非還元末端にβ－Ｄ－マンヌロン酸残基又はα－Ｌ－グルロン酸残基の不飽和体を有する、使用。
  11. 　酪酸菌の増殖促進における、β－Ｄ－マンヌロン酸及び／又はα－Ｌ－グルロン酸から構成されるオリゴ糖又はその塩の使用であって、
    　前記オリゴ糖は、非還元末端にβ－Ｄ－マンヌロン酸残基又はα－Ｌ－グルロン酸残基の不飽和体を有する、使用。
  12. 　酪酸菌の増殖を促進させるために用いられる、β－Ｄ－マンヌロン酸及び／又はα－Ｌ－グルロン酸から構成され、非還元末端にβ－Ｄ－マンヌロン酸残基又はα－Ｌ－グルロン酸残基の不飽和体を有するオリゴ糖又はその塩。
  13. 　酪酸菌の増殖を促進させる方法であって、
    　β－Ｄ－マンヌロン酸及び／又はα－Ｌ－グルロン酸から構成されるオリゴ糖又はその塩を動物に投与することを含み、
    　前記オリゴ糖は、非還元末端にβ－Ｄ－マンヌロン酸残基又はα－Ｌ－グルロン酸残基の不飽和体を有する、方法。
  14. 　アルギン酸及び／若しくはその塩又はそれらの加水分解物にアルギン酸リアーゼを作用させてアルギン酸分解物を取得する工程を含む、酪酸菌用プレバイオティクス組成物を製造する方法。
  15. 　前記アルギン酸リアーゼが、エンド型アルギン酸リアーゼ及び／又はエキソ型アルギン酸リアーゼである、請求項１４に記載の方法。
  16. 　アルギン酸及び／又はその塩を加水分解してアルギン酸加水分解物を取得する工程、及び前記アルギン酸加水分解物にアルギン酸リアーゼを作用させてアルギン酸分解物を取得する工程を含む、請求項１４又は１５に記載の方法。
  17. 　さらに重合度が２～３のオリゴ糖及び／又はその塩を回収する工程を含む、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 　前記酪酸菌がフィーカリバクテリウム（Faecalibacterium）属細菌である、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 　前記フィーカリバクテリウム属細菌がフィーカリバクテリウム・プラスニッチ（Faecalibacterium prausnitzii）である、請求項１８に記載の方法。
PCT/JP2021/044875 2020-12-07 2021-12-07 酪酸菌用プレバイオティクス組成物 WO2022124295A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP21903394.1A EP4257183A1 (en) 2020-12-07 2021-12-07 Prebiotic composition for butyric acid bacteria
US18/256,080 US20240016825A1 (en) 2020-12-07 2021-12-07 Prebiotic Composition for Butyric Acid Bacteria
JP2022568285A JPWO2022124295A1 (ja) 2020-12-07 2021-12-07
CN202180082232.4A CN116782909A (zh) 2020-12-07 2021-12-07 产丁酸菌用益生元组合物

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2020202884 2020-12-07
JP2020-202884 2020-12-07
JP2021089998 2021-05-28
JP2021-089998 2021-05-28

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2022124295A1 true WO2022124295A1 (ja) 2022-06-16

Family

ID=81974578

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2021/044875 WO2022124295A1 (ja) 2020-12-07 2021-12-07 酪酸菌用プレバイオティクス組成物

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20240016825A1 (ja)
EP (1) EP4257183A1 (ja)
JP (1) JPWO2022124295A1 (ja)
WO (1) WO2022124295A1 (ja)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005145885A (ja) * 2003-11-14 2005-06-09 Japan Science & Technology Agency アルギン酸オリゴマーからなる免疫機構賦活剤
US10272100B2 (en) * 2015-03-27 2019-04-30 Industry Foundation Of Chonnam National University Non-reducing end unsaturated mannuronic acid oligosaccharides and compositions containing same as active ingredient
WO2020138511A1 (ja) * 2018-12-28 2020-07-02 森永乳業株式会社 酪酸菌用プレバイオティクス組成物
WO2021059639A1 (ja) * 2019-09-27 2021-04-01 森永乳業株式会社 酪酸菌用プレバイオティクス組成物

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005145885A (ja) * 2003-11-14 2005-06-09 Japan Science & Technology Agency アルギン酸オリゴマーからなる免疫機構賦活剤
US10272100B2 (en) * 2015-03-27 2019-04-30 Industry Foundation Of Chonnam National University Non-reducing end unsaturated mannuronic acid oligosaccharides and compositions containing same as active ingredient
WO2020138511A1 (ja) * 2018-12-28 2020-07-02 森永乳業株式会社 酪酸菌用プレバイオティクス組成物
WO2021059639A1 (ja) * 2019-09-27 2021-04-01 森永乳業株式会社 酪酸菌用プレバイオティクス組成物

Non-Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BEST. PRACT. RES. CLIN. GASTROENTEROL, vol. 31, no. 6, December 2017 (2017-12-01), pages 643 - 648
CELL, vol. 165, no. 6, 2 June 2016 (2016-06-02), pages 1332 - 1345
HAN ZHEN-LIAN, YANG MIN, FU XIAO-DAN, CHEN MENG, SU QIAN, ZHAO YUAN-HUI, MOU HAI-JIN: "Evaluation of Prebiotic Potential of Three Marine Algae Oligosaccharides from Enzymatic Hydrolysis", MARINE DRUGS, MOLECULAR DIVERSITY PRESERVATION INTERNATIONAL, BASEL, CH, vol. 17, no. 173, 1 March 2019 (2019-03-01), Basel, CH , pages 1 - 17, XP055807016, ISSN: 1660-3397, DOI: 10.3390/md17030173 *
LI MIAOMIAO; LI GUANGSHENG; SHANG QINGSEN; CHEN XIUXIA; LIU WEI; PI XIONG'E; ZHU LIYING; YIN YESHI; YU GUANGLI; WANG XIN: "In vitrofermentation of alginate and its derivatives by human gut microbiota", ANAEROBE, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 39, 16 February 2016 (2016-02-16), AMSTERDAM, NL, pages 19 - 25, XP029536930, ISSN: 1075-9964, DOI: 10.1016/j.anaerobe.2016.02.003 *
LI SHANGYONG, WANG LINNA, LIU BO, HE NINGNING: "Unsaturated alginate oligosaccharides attenuated obesity-related metabolic abnormalities by modulating gut microbiota in high-fat-diet mice", FOOD & FUNCTION, R S C PUBLICATIONS, GB, vol. 11, no. 5, 26 May 2020 (2020-05-26), GB , pages 4773 - 4784, XP055941197, ISSN: 2042-6496, DOI: 10.1039/C9FO02857A *
MATSUURA, YASUSHI: "Assimilation of Pectic Acid by Clostridium butyricum-Clostridium beijerinckii Group and by Other Anaerobic Intestinal Bacteria from Human Feces", NIPPON NOGEIKAGAKU KAISHI, vol. 69, no. 1, 1 January 1995 (1995-01-01), JP , pages 17 - 22, XP009537572, ISSN: 0002-1407, DOI: 10.1271/nogeikagaku1924.69.17 *
MURAKAMI RYUTA; HASHIKURA NANAMI; YOSHIDA KEISUKE; XIAO JIN-ZHONG; ODAMAKI TOSHITAKA: "Growth-promoting effect of alginate on Faecalibacterium prausnitzii through cross-feeding with Bacteroides", FOOD RESEARCH INTERNATIONAL, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 144, 22 March 2021 (2021-03-22), AMSTERDAM, NL , XP086581995, ISSN: 0963-9969, DOI: 10.1016/j.foodres.2021.110326 *
NAGASHIMA, KOJI: "Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis of 16S rDNA Sequences from the Pig Gastrointestinal Tract by Computer Simulation and Comparison of the Results of Porcine and Human Analysis", BULLETIN OF THE FOOD PROCESSING RESEARCH CENTER HOKKAIDO RESEARCH ORGANIZATION, no. 9, 1 March 2011 (2011-03-01), pages 35 - 44, XP009537573, ISSN: 2185-8667 *
OJIMA, TAKAO: "II-2. Production of functional food materials by the use of enzymes", NIPPON SUISAN GAKKAISHI = BULLETIN OF THE JAPANESE SOCIETY OF SCIENTIFIC FISHERIES, vol. 78, no. 5, 1 January 2012 (2012-01-01), JP , pages 1009, XP009537570, ISSN: 0021-5392, DOI: 10.2331/suisan.78.1009 *
WAN JIN, JIANG FEI, XU QINGSONG, CHEN DAIWEN, HE JUN: "Alginic acid oligosaccharide accelerates weaned pig growth through regulating antioxidant capacity, immunity and intestinal development", RSC ADVANCES, vol. 6, no. 90, 1 January 2016 (2016-01-01), pages 87026 - 87035, XP055941198, DOI: 10.1039/C6RA18135J *
WAN JIN, ZHANG JIAO, CHEN DAIWEN, YU BING, HUANG ZHIQING, MAO XIANGBING, ZHENG PING, YU JIE, HE JUN: "Alginate oligosaccharide enhances intestinal integrity of weaned pigs through altering intestinal inflammatory responses and antioxidant status", RSC ADVANCES, vol. 8, no. 24, 1 January 2018 (2018-01-01), pages 13482 - 13492, XP055941199, DOI: 10.1039/C8RA01943F *

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2022124295A1 (ja) 2022-06-16
US20240016825A1 (en) 2024-01-18
EP4257183A1 (en) 2023-10-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2019112054A1 (ja) 新規ビフィドバクテリウム属細菌及び当該細菌を含む組成物
EP3981255A1 (en) Nutritional composition
WO2021149663A1 (ja) 組成物
WO2020246583A1 (ja) 組成物
WO2019112053A1 (ja) 新規ビフィドバクテリウム属細菌及び当該細菌を含む組成物
WO2020138511A1 (ja) 酪酸菌用プレバイオティクス組成物
JP6998193B2 (ja) 新規ビフィドバクテリウム属細菌及び当該細菌を含む組成物
WO2022124295A1 (ja) 酪酸菌用プレバイオティクス組成物
JP5603036B2 (ja) プロバイオティクス増殖促進剤
JP7273983B2 (ja) 酪酸菌用プレバイオティクス組成物
WO2021059894A1 (ja) 組成物並びに該組成物含有する飲食品組成物および調製乳
EP3932484A1 (en) Composition for inducing pili formation in bacterium of genus bifidobacterium
JP2021164423A (ja) ラクノスピラ科細菌増殖用組成物
JP2021155349A (ja) 腸内細菌叢改善用組成物
JP2020156444A (ja) 酪酸菌用プレバイオティクス組成物
CN116782909A (zh) 产丁酸菌用益生元组合物
JP6978621B1 (ja) 組成物
WO2023277041A1 (ja) 乳酸菌およびビフィズス菌増殖促進剤
WO2023068374A1 (en) Composition for promoting the assimilation of an oligosaccharide
JP7339008B2 (ja) 酪酸菌用プレバイオティクス組成物
WO2022064839A1 (ja) コラーゲン、エラスチン若しくはヒアルロン酸の産生又は分解に関与する遺伝子の発現調節用組成物
JP2022141436A (ja) 概日リズム改善のための組成物
WO2022255441A1 (ja) 組成物
JP2022156305A (ja) エリスロポエチン産生促進用組成物
JP2023062563A (ja) 栄養組成物

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 21903394

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2022568285

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 202180082232.4

Country of ref document: CN

Ref document number: 18256080

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2021903394

Country of ref document: EP

Effective date: 20230707