JP7339008B2 - 酪酸菌用プレバイオティクス組成物 - Google Patents
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Description
健康のために酪酸を体内に取り込むことは有用であるが、酪酸は非常に強い不快臭を放つため、食品や医薬品等の形態で摂取することは現実的ではない。また、腸内に生息する主な酪酸菌は、酸素感受性が極端に高いためにin vitroでの培養が非常に困難で
あり、酪酸菌を製剤化して摂取することも難しい(非特許文献2)。
(食品素材:ごま、アーモンド、抹茶、プルーン、キウイ、ケール、アボカド、にんじん、純ココア、おから)
好ましくは、前記酪酸菌は、フィーカリバクテリウム属細菌及び/又はゲンミゲル属細菌である。
好ましい態様において、本発明の組成物は食品素材を組成物全体の0.1質量%以上含
有する。
本発明の組成物は、好ましくは飲食品である。
また、本発明の組成物は、好ましくは医薬品である。
ごま、アーモンド、プルーン、キウイ、アボカドについては、通常は果実部をいう。ケールは、植物体全体でもよいが、葉部が好ましい。にんじんは、植物体全体でもよいが、根部が好ましい。おからは、大豆から豆乳を絞った後の残渣である。
また、前記食品素材は、その破砕物、抽出物、又は抽出物の画分、精製した画分、又はそれらの溶媒除去物であってもよい。
具体的な抽出方法としては、例えば、植物体等の抽出に用いる部位乃至はその乾燥物を予め粉砕あるいは細切したもの1質量部に対して、溶媒を1~30質量部加え、室温であれば数日間、沸点付近の温度であれば数時間浸漬し、室温まで冷却し後、所望により不溶物及び/又は溶媒除去し、カラムクロマトグラフィー等で分画精製する方法が挙げられる。
具体的には、試料を含有する培地中で腸内細菌を中和培養する培養工程、及び前記培養工程後の培地中の細菌叢の構成を解析する解析工程を含む方法により評価する。
被験試料(素材)がヒト小腸で通常吸収される糖類を含む場合は、前記培養工程の前に被験試料から分子量666.58以下の糖類を除去する前処理工程を行うことが好ましい。前記前処理工程は、好ましくはエタノール沈殿により行われる。該前処理工程により被験試料(素材)からヒト小腸で通常吸収される糖類、すなわち分子量666.58以下の糖類を予め除き、ヒト小腸で通常吸収されず大腸に到達する糖類を中和培養に供することにより、プレバイオティクスのヒト大腸での酪酸菌への影響を正確に感度よく評価することができる。なお、分子量666.58以下の糖類としては、ニストース、ケストース、シュークロース、グルコース、フルクトース、ガラクトース、ラクトース等が挙げられる。
前記試料の培地への添加量としては、培養を妨げない限りにおいて任意に設定でき、例えば0.1~5%(w/v)とすることができる。
中和培養は、通常は嫌気条件下で行われる。
また、培養時間は、好ましくは12時間以上、より好ましくは24時間以上とし、通常は96時間以下、より好ましくは48時間以下とする。
材の使用である。
本発明の別の態様は、腸内での酪酸菌の増殖における、前記食品素材の使用である。
本発明の別の態様は、腸内で酪酸菌を増殖させるために用いられる、前記食品素材である。
前記食品素材を動物に投与することを含む、腸内で酪酸菌を増殖させ方法である。ここで、動物は、特に限定されないが、通常はヒトである。
なお、摂取(投与)の量や期間にかかわらず、組成物は1日1回又は複数回に分けて投与することができる。
なお、これらの態様の場合、酪酸菌は生菌であることが好ましい。
飲料、粉末飲料、濃縮飲料、スポーツ飲料、栄養飲料、アルコール飲料、その他の嗜好飲料等の嗜好飲料類、ベビーフード、ふりかけ、お茶漬けのり等のその他の市販食品等;育児用調製粉乳;経腸栄養食;機能性食品(特定保健用食品、栄養機能食品)等が挙げられる。
飼料の形態としては特に制限されず、例えば、トウモロコシ、小麦、大麦、ライ麦、マイロ等の穀類;大豆油粕、ナタネ油粕、ヤシ油粕、アマニ油粕等の植物性油粕類;フスマ、麦糠、米糠、脱脂米糠等の糠類;コーングルテンミール、コーンジャムミール等の製造粕類;魚粉、脱脂粉乳、ホエイ、イエローグリース、タロー等の動物性飼料類;トルラ酵母、ビール酵母等の酵母類;第三リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の鉱物質飼料;油脂類;単体アミノ酸;糖類等を含有するものであってよい。
また、「表示」は、需要者が上記用途を直接的に認識できるような表現により行われることが好ましい。具体的には、飲食品に係る商品又は商品の包装に前記用途を記載したものを譲渡し、引き渡し、譲渡若しくは引き渡しのために展示し、輸入する行為、商品に関する広告、価格表若しくは取引書類に上記用途を記載して展示し、若しくは頒布し、又はこれらを内容とする情報に上記用途を記載して電磁気的(インターネット等)方法により提供する行為等が挙げられる。
かかる表示としては、例えば、「酪酸菌を増やしたい方」、「フィーカリバクテリウム属細菌を増やしたい方」、「酪酸で整腸作用」等と表示することが挙げられる。
医薬品の投与経路は、経口又は非経口のいずれでもよいが経口が好ましい。また、非経口摂取(投与)としては、直腸投与等が挙げられる。
医薬品の形態としては、投与方法に応じて、適宜所望の剤形に製剤化することができる
。例えば、経口投与の場合、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤等の固形製剤;溶液剤、シロップ剤、懸濁剤、乳剤等の液剤等に製剤化することができる。また、非経口投与の場合、座剤、軟膏剤、注射剤等に製剤化することができる。
製剤化に際しては、通常製剤化に用いられている賦形剤、pH調整剤、着色剤、矯味剤等の成分を用いることができる。また、他の薬効成分や、公知の又は将来的に見出されるプレバイオティクスなどを併用することも可能である。
加えて、製剤化は剤形に応じて適宜公知の方法により実施できる。製剤化に際しては、適宜、製剤担体を配合して製剤化してもよい。
なお、経口投与用の液剤の場合に使用する担体としては、水等の溶剤等が挙げられる。
(1)被験試料の前処理
被験試料としては、ごま、アーモンド、抹茶、プルーン、キウイ、ケール、アボカド、にんじん、純ココア、おから、イヌリンを用い、以下のように調製した。
市販されている、ごま(900g)をミキサーで粉砕して鍋に入れ、材料が浸る程度の水を加えて沸騰状態で2時間加熱する。室温まで冷却した後、ガーゼを用いて濾過し、濾液を回収した。得られた液を遠心(1800g、10分)し、上澄みを、ろ紙(2種)で濾した後、さらに濾過(1種)して抽出液を得た。この抽出液に対して公知のエタノール沈殿法を行い、得られた沈殿物を凍結乾燥して粉末(7000mg)を得た。これを0.1%(w/v)になるようMilliQ水に溶解後、0.22μmフィルター(メルクミリポ
ア社製)を通過させ、試験に供する溶液を取得した。
市販されている、アーモンド(550g)をミキサーで粉砕して鍋に入れ、材料が浸る程度の水を加えて沸騰状態で2時間加熱する。室温まで冷却した後、ガーゼを用いて濾過し、濾液を回収した。得られた液を遠心(1800g、10分)し、上澄みを、ろ紙(2種)で濾した後、さらに濾過(1種)して抽出液を得た。この抽出液に対して公知のエタノール沈殿法を行い、得られた沈殿物を凍結乾燥して粉末(2500mg)を得た。これを0.1%(w/v)になるようMilliQ水に溶解後、0.22μmフィルター(メルク
ミリポア社製)を通過させ、試験に供する溶液を取得した。
.22μmフィルター(メルクミリポア社製)を通過させ、試験に供する溶液を取得した。
市販されている、プルーン(370g)をミキサーで粉砕して鍋に入れ、材料が浸る程度の水を加えて沸騰状態で2時間加熱する。室温まで冷却した後、ガーゼを用いて濾過し、濾液を回収した。得られた液を遠心(1800g、10分)し、上澄みを、ろ紙(2種)で濾した後、さらに濾過(1種)して抽出液を得た。この抽出液に対して公知のエタノール沈殿法を行い、得られた沈殿物を凍結乾燥して粉末(1270mg)を得た。これを0.1%(w/v)になるようMilliQ水に溶解後、0.22μmフィルター(メルクミ
リポア社製)を通過させ、試験に供する溶液を取得した。
ポア社製)を通過させ、試験に供する溶液を取得した。
市販されている、ケール(400g)をミキサーで粉砕して鍋に入れ、材料が浸る程度の水を加えて沸騰状態で2時間加熱する。室温まで冷却した後、ガーゼを用いて濾過し、濾液を回収した。得られた液を遠心(1800g、10分)し、上澄みを、ろ紙(2種)で濾した後、さらに濾過(1種)して抽出液を得た。この抽出液に対して公知のエタノール沈殿法を行い、得られた沈殿物を凍結乾燥して粉末(4160mg)を得た。これを0.1%(w/v)になるようMilliQ水に溶解後、0.22μmフィルター(メルクミリ
ポア社製)を通過させ、試験に供する溶液を取得した。
ール沈殿法を行い、得られた沈殿物を凍結乾燥して粉末(3290mg)を得た。これを0.1%(w/v)になるようMilliQ水に溶解後、0.22μmフィルター(メルクミ
リポア社製)を通過させ、試験に供する溶液を取得した。
市販されている、にんじん(340g)ミキサーで粉砕して鍋に入れ、材料が浸る程度の水を加えて沸騰状態で2時間加熱する。室温まで冷却した後、ガーゼを用いて濾過し、濾液を回収した。得られた液を遠心(1800g、10分)し、上澄みを、ろ紙(2種)で濾した後、さらに濾過(1種)して抽出液を得た。この抽出液に対して公知のエタノール沈殿法を行い、得られた沈殿物を凍結乾燥して粉末(1700mg)を得た。これを0.1%(w/v)になるようMilliQ水に溶解後、0.22μmフィルター(メルクミリ
ポア社製)を通過させ、試験に供する溶液を取得した。
liQ水に溶解後、0.22μmフィルター(メルクミリポア社製)を通過させ、試験に供する溶液を取得した。
市販のイヌリン(フジ日本精糖株式会社製)10gを100mLのMilliQ水に溶解後、約15mLずつ遠心チューブ(FALCON社352070)に分注し、30mLの99.5%エタノール(Wako社050-00446)を加え、混和した。その後×1,300gで10分間遠心、上清を除去し、次いで99.5%エタノールを45mL加え混和し、×1,300gで10分間遠心した。再度上清を除去し、沈殿物を凍結乾燥させ合計8.7gの粉末を得た。これを0.1%(w/v)になるようMilliQ水に溶解後
、0.22μmフィルター(メルクミリポア社製)を通過させ、試験に供する溶液を取得した。
糖を含有しないYCFA培地を100mL作成し、pHコントロール可能な培養装置Bio Jr.8(株式会社バイオット社製BJR-25NA1S-8M)のベッセルに入
れ、(1)で前処理した各被験試料を1g添加した。また、陰性対象として、被験試料を添加しない培地も用意した。各培地をベッセルごと、115℃20分間のオートクレーブ処理にかけた。その後、無菌的にフィルター滅菌処理したビタミン液とシステイン液を添加し、被験試料の終濃度が1%(w/v)となる培養液を調製した。その後、窒素置換を一晩行うことで嫌気状態とし、生理食塩水で10%(w/v)に予め調整しておいた糞便溶液100μLを添加し、pHが6以下にならないよう1MのNa2CO3液でコントロールしながら24時間37℃で嫌気培養を行った。
なお、前記糞便は、通常の食餌を継続している健康なヒト(40歳代男性1名、30歳代男性2名、20歳代男性2名、及び30歳代女性1名)から提供されたものである。
陰性対照とした。
前記(2)における24時間培養後の培養液を1mL採取し、15,000gで10分間遠心して沈殿を得た。前記沈殿を、450μLの抽出液(100mM Tris/HC
l, 4mM EDTA, pH9.0)に懸濁した後、10%SDS溶液50μL、0.1
mm径のガラスビーズ300mg、500μLのTE飽和フェノール(和光純薬)と混合し、FastPrep FP 100A(フナコシ社製)にてパワーレベル5、30秒の破砕処理を行った。次いで、14,000gで5分間遠心後400μLの上清を取り、250μLのフェノール・クロロホルム溶液(和光純薬)を加えて混合し、14,000gで
5分間遠心後、250μLの上清を取得した。さらに2-プロパノールを250μL加えて得た沈殿を200μLのTris-EDTAバッファー(pH8.0)で溶解し、鋳型DNA溶液とした。
イマーセット(配列番号1及び2)と、次世代シーケンサーMiseq (イルミナ社製)にて解析するために必要な2ndプライマーセット(配列番号3及び4、なおnは1度の解析で複数サンプルを処理するための任意の塩基配列(インデックス領域))を設計し、Life
Technologies社のオリゴプライマー作成サービスによりプライマーを合成した。
鋳型DNA溶液および1stプライマーセットを含む総液量を25μLとした反応液をTaKaRa Ex Taq HS kit(タカラバイオ社製)を用いて調製した。Veriti 200(Life Technologies社製)により、94℃3分の後、94℃30秒、50℃30秒、72℃30秒を20回、72℃10分のPCR反応を行った。得られたPCR産物を1%アガロースゲルにて電気泳動し、バンドパターンを確認した。続いて得られたPCR産物1μLを鋳型とし、2ndプライマーセットを用いて上述した条件と同様にPCRを実施した。ただしPCRのサイクル数は20回ではなく15回とした。得られたPCR産物を1%アガロースゲルにて電気泳動し、バンドパターンを確認後、QIAquick 96 PCR Purification Kit(キアゲン社製)にて精製を行い、Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit
(Life Technologies社製)にて濃度を測定した。同濃度のDNA溶液を混合したものをMiseq v2 Reagent kit(イルミナ社製)に供し、M
iseqにてシークエンス解析を実施した。
バクテリウム・プラスニッチ)及び別の酪酸菌(ゲンミゲル・フォルミシリス)の腸内細菌全体に占める割合をそれぞれ算出し、全被験者の平均を求めた。
前記(2)における24時間培養後の培養上清を40μL用いて、以下の測定を実施した。
サンプルのラベル化はラベル化試薬FAキット(YMC)を用いて行い、Nano F
ilter Plunger w(THOMSON)を用いて濾過し、HPLC測定に供した。
酪酸の測定にはalliance HPLC(waters)及びYMC-Pack FAカラム(YMC)を用いた。移動相Aはメタノール、移動相Cは0.1% トリフルオ
ロ酢酸(TFA)水溶液、移動相Dは0.1% TFAを溶解したアセトニトリル液を用
いた。グラジエントプログラムは、(i)0~5分:移動相A 16%、移動相C 79%、移動相D 5%、(ii)5~30分:移動相A 16%、移動相C 54%、移動相D 30%、(iii)30~35分:移動相A 16%、移動相C 79%、移動相D 30
%、(iv)35~40分:移動相A 16%、移動相C 79%、移動相D 5%、(v
)40~45分:移動相A 16%、移動相C 79%、移動相D 5%と5段階でプログ
ラムした。流速は1.00 mL/min、カラムオーブン温度は50℃に設定した。蛍
光検出器を用いて吸光230 nmで測定した。
おからを添加して中和培養した後の培養溶液では酪酸濃度の増加が認められた。
Claims (5)
- 以下の食品素材群から選択される一種以上を含有する、酪酸菌用プレバイオティクス組成物。
(食品素材:ごま、抹茶、プルーン、キウイ、ケール、アボカド、にんじん、純ココア、おから) - 前記食品素材を組成物全体の0.1質量%以上含有する、請求項1に記載の組成物。
- 前記酪酸菌が、フィーカリバクテリウム属細菌及び/又はゲンミゲル属細菌である、請求項1又は2に記載の組成物。
- 飲食品である、請求項1~3の何れか一項に記載の組成物。
- 医薬品である、請求項1~3の何れか一項に記載の組成物。
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