WO2021235983A1 - Средство пролонгированного анальгетического действия - Google Patents

Средство пролонгированного анальгетического действия Download PDF

Info

Publication number
WO2021235983A1
WO2021235983A1 PCT/RU2021/050133 RU2021050133W WO2021235983A1 WO 2021235983 A1 WO2021235983 A1 WO 2021235983A1 RU 2021050133 W RU2021050133 W RU 2021050133W WO 2021235983 A1 WO2021235983 A1 WO 2021235983A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
peptide
hcrg21
pain
analgesic
test
Prior art date
Application number
PCT/RU2021/050133
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Елена Владимировна ЛЕЙЧЕНКО
Оксана Владимировна Синцова
Ирина Николаевна ГЛАДКИХ
Анна Анатольевна КЛИМОВИЧ
Маргарита Михайловна МОНАСТЫРНАЯ
Игорь Александрович ДЬЯЧЕНКО
Аркадий Николаевич МУРАШЕВ
Ирина Владимировна МОШАРОВА
Сергей Александрович КОЗЛОВ
Эмма Павловна КОЗЛОВСКАЯ
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б.Елякова Дальневосточного отделения Российской академии наук (ТИБОХ ДВО РАН)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б.Елякова Дальневосточного отделения Российской академии наук (ТИБОХ ДВО РАН) filed Critical Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б.Елякова Дальневосточного отделения Российской академии наук (ТИБОХ ДВО РАН)
Priority to EP21809722.8A priority Critical patent/EP4154899A1/en
Publication of WO2021235983A1 publication Critical patent/WO2021235983A1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1767—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]

Definitions

  • the invention relates to biochemistry, specifically to the use of biologically active peptides as analgesics that can be used in medicine and veterinary medicine to reduce pain syndromes, including acute and chronic, and also be used in scientific research to develop methods for finding new promising drugs or in as tools for studying the molecular organization and mechanisms of functioning of ion channels, receptors and proteolytic enzymes.
  • pain therapy includes the combined use of non-steroidal anti-inflammatory drugs and other non-opioid analgesics such as acetylsalicylic acid and its derivatives, acetaminophen, ibuprofen, fenoprofen, difluzinal and naproxen; and / or opioid analgesics, including morphine, hydromorphone, methadone, levorphanol, fentanyl, oxycodone, and oxymorphone.
  • opioid analgesics including morphine, hydromorphone, methadone, levorphanol, fentanyl, oxycodone, and oxymorphone.
  • Opioid use is associated with numerous side effects, including physical and drug dependence. Rapid growth in the use of prescription opioid drugs in the United States has been shown to correlate well with increased opioid overdose deaths and increased illegal drug sales.
  • TRP channels are used by animals as thermoreceptors to regulate body temperature and measure the temperature of the environment, which is especially important to protect against temperatures that are hazardous to the body's life and to ensure the body's survival.
  • TRPV1 transient receptor potential vanilloid type 1
  • a non-selective cation channel with a preference for Ca 2+ Szallasi A.
  • the vanilloid receptor TRPV1 10 years from channel cloning to antagonist pro of -of-concept // Nat. Rev. Drug Discov. 2007, 6, 357-372).
  • TRPV1 channels are intrinsically heat sensitive and negatively regulated by phosphoinositide lipids // Neuron 2013, 77, 667-679). Indirectly, TRPV1 is also activated and sensitized by a wide range of other inflammatory mediators such as histamine, bradykinin, prostaglandins and ATP, as well as NGF, which, among others among other things, increases the expression of TRPV1 in sensory neurons (RU 2621708, RU 2648445, RU 2541127, RU 2506077, RU 2379282, EP 2352726, US 2017266139).
  • TRPV1 is expressed in cells of the central and peripheral nervous system and is involved in many important physiological processes such as thermoregulation, lipogenesis, bladder function, cardiac activity, and neurogenesis in the brain.
  • TRPV 1 channel agonists capsaicin and resiniferatoxin have long been used as analgesics (US 5178879, US 566378, US 6239180, US 4313958, US 4599342, US 5188837), which are also used to activate or ablate cells expressing TRPV1, which gives an idea of the role of these specific nociceptors in somatic or visceral pain (Cianchetti C. Capsaicin jelly against migraine pain // Int. J. Clin. Pract. 2010, 64, 457-459; Myzsik G. Capsaicin as new orally applicable gastroprotective and therapeutic drug alone or in combination with nonsteroidal anti-inflammatory drugs in healthy human subjects and in patients // Prog.
  • TRPV1 antagonists have initiated extensive research, both in research institutes and pharmaceutical companies, as a result which the therapeutic potential of these compounds has been formulated. It is recommended to use them for the treatment of diseases accompanied by manifestations of chronic pain conditions (RU 2151014, RU 2396261, RU 2448108, RU 2450006, RU 2452733, RU 2458055, RU 2468020, RU 2621708, RU 2621708, EP 235278826, US 2017266139, JP, US 62487 2016047822), as well as for the treatment or prevention of diseases or conditions in which activation of the TRPV1 ion channel plays a role or is involved, such as migraine (RU 2448108), osteoarthritis (RU 2151014, RU 2448108, RU 2458055, RU 2621708), overactive urinary bladder (RU 2151014, RU 2448108, RU 2450006, RU 2452733, RU 2458055, RU 2468020, RU 2621
  • TRPV1 Transient receptor potential vanilloid 1
  • the Transient Receptor Potential Vanilloid 1 Antagonist Capsazepine Improves the Impaired Lung Mechanics during E ndotoxemia // Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology, 2016, 119, 421-427; EP 2352726, RU 2448108), inflammatory diseases of the respiratory tract (Lv N. et al.
  • transient receptor potential vanilloid-1 on cough hypersensitivity induced by particulate matter 2.5 // Life Science, 2016, 151, 157-166), including including asthma (RU 2151014, RU 2448108), inflammatory bowel diseases (IBD), including irritable bowel syndrome (IBS) (RU 2151014, RU 2448108, RU 2452733, RU 2458055, RU 2621708), peptic ulcer (RU 2151014, RU 2448108, RU 2621708), diabetes (Gram DX et al. TRPV1: A Potential Therapeutic Target in Type 2 Diabetes and Comorbidities? // Trends in Molecular Medicine, 2017, 23, 1002-1013; Zhong, B. et al.
  • TRPVl mediates glucose-induced insulin secretion through releasing neuropeptides // In Vivo (Brooklyn), 2019, 33, 1431-1437; RU 2448108) and dermatitis (Yun, JW et al. TRPVl antagonist can suppress the atopic dermatitis-like symptoms by accelerating skin barrier recovery // Journal of Dermatological Science, 2011, 62, 8-15; RU 2448108).
  • TRPVl antagonist-based chronic pain medications SB-705498 (GSK), AMG-517 (Amgen), MK-2295 (Merck), AZD-1386 (Astra-Zeneca) and GRC-6211 (Lilly / Glenmark), (Gunthorpe MJ et al. Clinical development of TRPVl antagonists: target in pivotal point in the pain pathway // Drug Discov Today, 2009, 14, 56-67; Khairatkar-Joshi N. et al. . TRPVl antagonists: the challenges for therapeutic targeting // Trends Mol. Med. 2009, 15, 14-22).
  • a high dose (400 mg) of SB-705498 which has a half-life of 35-93 hours, has been shown to exhibit targeted pharmacodynamic activity in reducing inflammation caused by thermal burns, UV radiation, and after the use of capsaicin (Gunthorpe MJ et al. Clinical development of TRPV1 antagonists: targeting a pivotal point in the pain pathway // Drug Discov. Today 2009, 14, 56-67; Chizh B. A. et al. . The effects of the TRPV1 antagonist SB-705498 on TRPV1 receptor-mediated activity and inflammatory hyperalgesia in humans // Pain 2007, 132, 132-141).
  • AMG-517 which has an elimination half-life of 13 to 23 days, causes a large and sustained increase in temperature in humans, which is only partially mitigated by repeated dosing (Gawa NR et al. Repeated administration of vanilloid receptor TRPV1 antagonists attenuates hyperthermia elicited by TRPV1 blockade // J Pharmacol Exp Ther 2007, 323, 128-37). It was found that ABT-102, in comparison with AMG-517, demonstrates a slight increase in temperature, which quickly dies out after repeated administration of the drug (Honore R. et al.
  • ABT-102 a potent and selective TRPV1 antagonist, enhances TRPV 1 -mediated analgesic activity in rodents, but attenuates antagonist-induced hyperthermia // Pain 2009, 142, 27-35).
  • TRPV1 channel antagonists such as SB-705498, AMG-517, MK-2295 and GRC-6211 have been delayed or stopped to date.
  • the antagonists of TRPV1 which do not have a hyperthermic effect, are the compounds ARNS1, ARNS2, and ARNSZ, the first peptide inhibitors of this channel, which were found in the venom of the sea anemone Heteractis crispa. They have a pronounced analgesic effect when administered intravenously at doses of 0.01 mg / kg, associated with partial inhibition of TRPV1, which has been shown in various models of pain stimulation in experimental animals (RU2368621 C1, 09/27/2009; RU2404245, C1, 20.11.2010; RU2619170, C2, 12.05.2017).
  • Peptide HCRG21 (sequence number in the UniProt database P0DL86), related to the APNS1, ARNS2 and ARNS3 compounds, which can be obtained biotechnologically or isolated from sea anemone extract, is also an antagonist of the TRPV1 channel (Monastyrnaya MM et al. Kunitz-type peptide HCRG21 from the sea anemone Heteractis crispa is a full antagonist of the TRPVl receptor // Mar. Drugs 2016, 14, 229-234). The potential of the HCRG21 peptide as an analgesic has not been previously disclosed.
  • HCRG21 peptide as an analgesic, temperature lowering agent and / or anti-inflammatory agent, which is supported by data obtained in several animal models.
  • the HCRG21 peptide has an advantage over the APHC1 peptide in terms of the duration of the analgesic effect, which was found in comparative experiments.
  • the HCRG21 peptide is also characterized by a pronounced hypothermic and anti-inflammatory effect.
  • the drug based on the HCRG21 peptide is superior to the known analogues in its effectiveness.
  • the invention solves the problem of developing an active pharmacological substance with a prolonged analgesic effect, and / or a pronounced hypothermic and anti-inflammatory effect, and creating on its basis a medicinal product intended to alleviate painful conditions in humans and animals with parenteral or intranasal administration.
  • HCRG21 peptide which has a prolonged analgesic effect, pronounced hypothermic effect and anti-inflammatory activity.
  • a peptide is an active pharmacological substance that is introduced into a finished dosage form for the manufacture of a medicament for parenteral or intranasal administration.
  • the resulting drug is intended to relieve acute pain conditions and pain in chronic pathological processes, where normal functional activity is impaired and the increased activity of the TRPV1 ion channel is involved.
  • the drug relieves inflammation, effectively lowers the body temperature of mammals, including humans.
  • the present invention relates to an HCRG21 peptide for use as a medicament having prolonged analgesic, anti-inflammatory and / or hypothermic action.
  • the HCRG21 peptide is recombinantly produced.
  • the invention provides for the use of the HCRG21 peptide parenterally or intranasally at a dose of at least 0.1 mg / kg.
  • a drug based on the HCRG21 peptide is intended for the treatment of patients, specifically for relieving pain caused by band surgeries, joint and oncological pain.
  • This patient can be a mammal, including a human.
  • the HCRG21 peptide is provided for use as a drug for the treatment of acute and chronic diseases: migraine, osteoarthritis, cough, overactive bladder, inflammatory airway disease, asthma, inflammatory bowel disease, irritable bowel syndrome, diabetes, dermatitis ...
  • the HCRG21 peptide is recombinantly produced.
  • the invention also provides a method of treatment, which provides for the introduction of a drug containing the peptide HCRG21, to provide a prolonged analgesic, anti-inflammatory and hypothermic action.
  • the drug administered in the method contains an effective amount of the HCRG21 peptide.
  • an effective amount of the HCRG21 peptide is an amount sufficient to achieve a specific stated purpose, such as relieving or reducing pain, relieving or decreasing inflammation, and lowering body temperature.
  • the "effective amount” can be determined empirically and by methods known in the art for the stated purpose.
  • the technical effect of the invention consists in a significantly longer analgesic effect of the claimed agent, observed in animal models of pain (at least 13 hours) when administered intravenously, subcutaneously, intramuscularly and intranasally to mice at a dose of 0.1 mg / kg.
  • the invention discloses information on the biological properties of the HCRG21 peptide obtained as a result of testing the peptide in various models of pain sensitivity in animals.
  • the claimed peptide outperforms the analogs of ARNS1 - ARNSZ in the following parameters:
  • Analogues ARNS1 and ARNSZ are polymodal, and, depending on the strength of the stimulus (concentration of agonist (capsaicin), pH, temperature), they either potentiate TRPV1, or inhibit (up to 32%) the current passing through the channel (Andreev YA et al. Polypeptide modulators of TRPV1 produce analgesia without hyperthermia // Mar. Drugs 2013, 11 (12): 5100-15), while the HCRG21 peptide completely blocks (inhibits by 95%) the ionic current induced by capsaicin across the cell membrane.
  • FIG. 1 Inhibition of the level of intracellular calcium in response to the addition of 3 ⁇ M capsaicin solution on the CHO cell line stably expressing the TRPV1 ion channel. A 30 nM concentration of the HCRG21 peptide was used. The reliability of the differences is calculated by the Student's t-test, the value *** is considered reliable - p ⁇ 0.001 in comparison with the control.
  • FIG. 2 Analgesic effect of different doses of HCRG21 peptide in the hot plate test when administered intramuscularly.
  • the ordinate represents the response time to a painful stimulus.
  • Control animals receive a similar volume of saline (PBS).
  • PBS saline
  • the analogue, peptide ARNS1 is measured at doses of 0.01, 0.1, and 1 mg / kg.
  • the significance of the differences is calculated by the Student's t-test, the value * - p ⁇ 0.05, ** - p ⁇ 0.01, *** - p ⁇ 0.001 is considered significant as compared with the PBS group.
  • FIG. 3 The analgesic effect of different doses of the HCRG21 peptide and the analogue, the APHC1 peptide, in the hot plate test with the intravenous route of administration.
  • the ordinate represents the response time to a painful stimulus.
  • Control animals receive a similar volume of PBS solution.
  • the significance of the differences is calculated by the Student's t-test, the value * - p ⁇ 0.05, ** - p ⁇ 0.01 is considered significant in comparison with the PBS group.
  • FIG. 4 Analgesic effect of different doses of the HCRG21 peptide in the hot plate test with the intranasal route of administration.
  • the ordinate represents the response time to a painful stimulus.
  • Control animals receive a similar volume of PBS solution.
  • the significance of the differences is calculated by the Student's t-test, the value *** is considered significant - p ⁇ 0.001 in comparison with the PBS group.
  • FIG. 5 Pharmacodynamics of the analgesic effect of the HCRG21 peptide and the analogue, the APHC1 peptide, in the hot plate test at a dose of 0.1 mg / kg when injected intramuscularly.
  • the ordinate represents the response time to the painful stimulus; the abscissa represents the time between the peptide administration and the measurement of the effect.
  • the significance of the differences is calculated Student's t-test, the value ** - p ⁇ 0.01, *** - p ⁇ 0.001 is considered reliable in comparison with the group of control animals, which were injected with an equal volume of PBS.
  • FIG. 6 Analgesic effect of 0.1 mg / kg dose of HCRG21 peptide in the hot plate test with subcutaneous (A) and intravenous (B) administration for two time points of effect measurement 2 and 13 hours after drug administration.
  • the ordinate represents the response time to a painful stimulus.
  • Control animals receive a similar volume of PBS solution. The significance of the differences is calculated by the Student's t-test, the value * - p ⁇ 0.05, *** - p ⁇ 0.001 is considered reliable as compared with the PBS group.
  • FIG. 7 Analgesic effect of peptide HCRG21 and analogue - peptide ARHC1, at a dose of 0.1 mg / kg when administered intramuscularly in a capsaicin test.
  • the measured parameters are plotted for 15 minutes of observation: (A) the latent period of the first reaction, (B) the time the mouse spent licking the paw, (C) the number of licking acts. Control animals receive a similar volume of PBS solution. The significance of the differences is calculated by the Student's t-criterion, the value * - p ⁇ 0.05, ** - p ⁇ 0.01, *** - p ⁇ 0.001 is considered reliable as compared with the PBS group.
  • FIG. 8 Anti-inflammatory effect of HCRG21 peptide at a dose of 0.1 mg / kg when administered intramuscularly in a thermal hypersensitivity test caused by intraplantar administration of Freund's complete adjuvant.
  • the significance of the differences is calculated by the Student's t-test, the value ** - p ⁇ 0.01 is considered significant as compared with the group of control animals, which were injected with an equal volume of PBS.
  • FIG. 9 Analgesic effect of HCRG21 peptide in doses of 0.1 and 1 mg / kg when administered intramuscularly in a formalin test.
  • Control animals receive a similar volume of PBS solution (negative control) or ibuprofen solution at a dose of 100 mg / kg (positive control).
  • the ordinate is the measured parameters for 1 minute of observation: (A) the latent time of the hind paw tucked in, (B) the number of acts of licking the hind paw, the abscissa is the time between the peptide injection and the start of the next measurement.
  • FIG. 10 Analgesic effect of HCRG21 peptide at doses of 0.1 and 1 mg / kg when administered intramuscularly in a mechanical hypersensitivity test under conditions of acute local inflammation induced by intraplantar administration of carrageenan. Control animals receive a similar volume of PBS solution (negative control) or ibuprofen solution at a dose of 100 mg / kg (positive control). On the ordinate, the squeezing force is plotted with forceps. The significance of the differences is calculated by the Student's t-test, the value * is considered significant - p ⁇ 0.05 in comparison with the PBS group.
  • FIG. 11 Anti-inflammatory effect of HCRG21 peptide at doses of 0.1 and 1 mg / kg when administered intravenously in the test of acute local inflammation induced by intraplantar administration of carrageenan.
  • Control animals receive a similar volume of PBS solution (negative control) or indomethacin solution at a dose of 10 mg / kg (positive control).
  • the ordinate represents the increase in the paw volume of the animal as a percentage of the initial volume. The significance of the differences is calculated by the Student's t-test, the value * - p ⁇ 0.05, ** - p ⁇ 0.01 is considered significant in comparison with the PBS group.
  • FIG. 12 Influence of the HCRG21 peptide and the analogue, the APHC1 peptide, on the rectal body temperature of ICR mice when injected intramuscularly at a dose of 0.1 mg / kg.
  • the significance of the differences is calculated by the Student's t-test, the value * - p ⁇ 0.05, ** - p ⁇ 0.01, *** - p ⁇ 0.001 is considered reliable compared to the group of control animals, which were injected with an equal volume of PBS.
  • FIG. 13 The effect of the HCRG21 peptide on the rectal body temperature of ICR mice at different routes of administration at a dose of 0.1 mg / kg. The significance of the differences is calculated by the Student's t-test, the value * - p ⁇ 0.05 is considered significant in comparison with the group of control animals, which were injected with an equal volume of PBS.
  • the active peptide is obtained by a biotechnological method as part of a chimeric protein with a thioredoxin fragment.
  • the synthesis of the hcrg21 gene is carried out by PCR (2 stages) using specific primers designed based on the obtained sequence of the hcrg21 gene and optimized in accordance with rare codons for expression in E. coli that completely overlap the nucleotide sequence (Monastyrnaya M.M. et al. Kunitz-type peptide HCRG21 from the sea anemone Heleraclis crispa is a full antagonist of the TRPV1 receptor // Mar. Drugs 2016, 14, 229- 234).
  • Restriction sites for EcoRI and Xhol were introduced into the sequence of the forward and reverse flanking primers, respectively.
  • An additional codon, ATG, encoding a methionine residue is introduced into the forward flanking primer sequence before the sequence encoding the first amino acid residue of the HCRG21 peptide.
  • a HAA stop codon is added to the reverse primer sequence.
  • coli cells is obtained on the basis of the synthesized hcrg21 gene fragment by ligation with the pET32b + expression vector (Novagen) after treatment of the hcrg21 gene fragment and pET32b + plasmid with EcoRI and Xhol restrictases. The resulting plasmids are verified by sequencing. As a result, a plasmid carrying the genes of the TrxA-HCRG21 chimeric protein under the control of the T7 promoter is obtained.
  • the chimeric protein for HCRG21 peptide synthesis can include any other commercially available helper protein (e.g. barnase (bar '), disulfide exchange protein (DsbC), maltose binding protein (MBP), or a combination of a chitin binding domain and the mini-intein DnaB from Synechocystis sp., which is capable of undergoing pH-dependent self-cleavage).
  • helper protein e.g. barnase (bar '), disulfide exchange protein (DsbC), maltose binding protein (MBP), or a combination of a chitin binding domain and the mini-intein DnaB from Synechocystis sp., which is capable of undergoing pH-dependent self-cleavage.
  • TrxA-HCRG21 is a fused amino acid sequence of a thioredoxin A fragment (TrxA, 109 amino acid residues), a sequence of 6 amino acid residues of histidine, a methionine residue located immediately before the first residue of the HCRG21 peptide, and the target peptide HCRG21.
  • BL21 (DE3) cells are transformed with an expression vector containing a chimeric protein coding sequence.
  • a selective antibiotic carbenicillin
  • the cells are subcultured into a flask with 1200 ml of liquid nutrient medium (LB) with a selective antibiotic (carbenicillin) and grown with stirring to an optical density of ⁇ 0.6 units (Aboo) at a temperature of 37 ° C.
  • Expression is induced by adding isopropyl-P-0-1 thiogalactopyranoside to a concentration of 0.4 mM.
  • the cells are continued to incubate and stir at 19 ° C to produce the chimeric protein, and after 20 hours, precipitated and frozen.
  • the cells are resuspended in a buffer solution (20 mM Tris-HC1 pH 7.2, 150 mM NaCl). Cells are disintegrated by ultrasound, cell debris is precipitated by centrifugation. The target chimeric protein is isolated from the soluble fraction.
  • Separation of the product from other cellular proteins is carried out using metal-affinity chromatography on a 2+ sorbent in a buffer solution (20 mM Tris-HC1 pH 7.2, 150 MMNaCl); to elute the chimeric protein, a buffer solution (150 mM imidazole, 300 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 7.5).
  • a buffer solution 150 mM imidazole, 300 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 7.5.
  • the affinity tag and the helper protein are removed by cleaving the fusion protein with cyanogen bromide at the methionine residue introduced specifically before the first amino acid of the HCRG21 peptide.
  • the chimeric protein is dissolved in 0.1 M HC1 to a protein concentration of 1 mg / ml, cleaved with cyanogen bromide for 18 hours in the dark using a 600-fold molar excess of cyanogen bromide.
  • the solvent and excess cyanogen bromide are removed in a vacuum concentrator, then the mixture of hydrolysis products is applied to a column with a reversed phase Jupiter C 18 sorbent (10x250 mm, Phenomenex, Torrance, CA, USA). Fractionation is carried out in a linear concentration gradient of acetonitrile in 0.1% (v / v) trifluoroacetic acid.
  • the purity of the obtained recombinant peptide is controlled by mass spectrometric analysis.
  • a stable cell line is thawed from a cryobank and kept for at least 2 weeks on a nutrient medium (DMEM / 10% fetal bovine serum / 1% PS (penicillin / streptomycin)) with the addition of a mixture of antibiotics B / Z (Blasticidin S (5 ⁇ g / ml), zeocin (250 ⁇ g / ml)), in sterile mattresses at 37 ° C in the presence of 5% CCL, replanting regularly every 2-3 days.
  • DMEM fetal bovine serum / 1% PS (penicillin / streptomycin)
  • B / Z Bacillicidin S (5 ⁇ g / ml
  • zeocin 250 ⁇ g / ml
  • cells are seeded in 96-well plates with black walls and a transparent bottom in the amount of 75,000 pieces per well and cultured overnight at 37 ° C in the presence of 5% CO 2 in complete medium without antibiotics PS containing 1 ⁇ g / ml tetracycline.
  • Cells are stained with the cytoplasmic calcium indicator Fluo-4AM using the Fluo-4 Direct TM (Invitrogene) technique and ready-to-use solutions for calcium analysis and subsequently incubated in the dark at 37 ° C for 45-60 minutes and then at 25 ° C for 45-60 minutes ... Measurements are carried out at room temperature using a flatbed spectrophotometer equipped with a built-in automatic liquid dosing system, NOVOstar (BMG LABTECH, Germany). Selective ion currents through the TRPV1 ion channel (flare-up of the dye by increasing the concentration of intracellular calcium) is caused by the addition of 3 ⁇ M capsaicin solution with a dosing device to each well during the measurement.
  • Fluo-4 Direct TM Invitrogene
  • CHO cells without TRPV1 ion channel were used as negative control, maximum fluorescence was determined 20 seconds after capsaicin addition.
  • the test peptide HCRG21 is added to the well before the start of measurement so that its final concentration is 30 nM, an equal volume of buffer solution is added to the control wells.
  • the HCRG21 peptide caused a significant decrease in intracellular calcium levels (FIG. 1), calculated as the difference between maximum and baseline fluorescence (dFl) divided by baseline fluorescence (Fl 0 ).
  • the results are averaged over 9 independent measurements, the reliability of the differences between the control and experimental groups is determined by the Student's t-criterion.
  • mice are divided into 19 groups (3 control and 16 experimental), 9 animals each. The tests are carried out on male white ICR mice weighing 20-30 g. Pain irritation is simulated by placing the mouse on a metal surface of the device heated to 55 ° C. To prevent burns of the paws, the time of exposure to irritation is limited to 60 seconds. A test sample of the HCRG21 peptide is dissolved in sterile saline and administered at a dose of 0.01, 0.05, 0.1, 0.5 and 1 mg / kg. To determine the most effective method, various routes of administration are used: intramuscularly, intravenously, intranasally.
  • the ARNS1 peptide is used as a control to compare the effectiveness of the analgesic effect under the same conditions with intramuscular and intravenous administration.
  • Control animals receive an equivalent volume of sterile saline.
  • the analgesic effect is measured by the increase in the time elapsed from the moment the animal lands on the plate until the moment it first bounces. Measurement of pain sensitivity is carried out 60 minutes after intramuscular (Fig. 2), 30 minutes after intravenous (Fig. 3) and 120 minutes after intranasal (Fig. 4) administration of drugs.
  • the analgesic effect of the HCRG21 peptide occurs at a dose of 0.1 mg / kg, while ARNS1 has a slightly greater effect, which is comparable to the effect of HCRG21 at a dose of 0.5 mg / kg.
  • the dose is increased to 1 mg / kg, there is a slight decrease in the effectiveness of both peptides (Fig. 2).
  • the control is effective in the 0.01-1 mg / kg dose range, while HCRG21 is effective in the 0.1-1 mg / kg range (FIG. 3).
  • the activity of the HCRG21 peptide is maintained at the same minimum dose of 0.1 mg / kg.
  • the results are processed statistically, the reliability of the differences between the results of the control and experimental groups is determined using the Student's test.
  • the HCRG21 peptide at a dose of 0.1 mg / kg is obtained to effectively reduce pain sensitivity for any route of administration.
  • mice are divided into 24 groups (control and experimental), 9 animals each. The tests are carried out on male white ICR mice weighing 20-30 g. Pain irritation is simulated by placing the mouse on a metal surface of the device heated to 55 ° C. To prevent burns of the paws, the time of exposure to irritation is limited to 60 seconds. A test sample of the HCRG21 peptide is dissolved in sterile saline and administered at a dose of 0.1 mg / kg intramuscularly. The ARNS1 peptide is used as a control to compare the duration of the analgesic effect at the same concentration under the same conditions. Control animals receive an equivalent volume of sterile saline.
  • the analgesic effect is measured by the increase in the time elapsed from the moment the animal lands on the plate to the moment of the first bouncing (Fig. 5). Measurement of pain sensitivity is carried out 5 minutes, 15 minutes, 1, 2, 3, 6, 13 and 24 hours after drug administration. Based on the results obtained, it is determined that the analgesic effect of HCRG21 develops gradually, significantly different from the control by 1 hour (maximum effect 2 hours), is prolonged (at least 13 hours). This distinguishes the action of the HCRG21 peptide from the APHC1 analog, which quickly produces an analgesic effect, but only for 2 hours. Each mouse is used for only one measurement of analgesic effect. The results are processed statistically, the reliability of the differences between the results of the control and experimental groups is determined using the Student's test.
  • Example 5 Testing the duration of the analgesic effect of the HCRG21 peptide in mice in the hot plate test with different routes of administration
  • mice are divided into 8 groups (4 control and 4 experimental), 7 animals each. The tests are carried out on male white ICR mice weighing 20-30 g. Pain irritation is simulated by placing the mouse on a metal surface of the device heated to 55 ° C. To prevent burns of the paws, the time of exposure to irritation is limited to 60 seconds.
  • a test sample of the HCRG21 peptide is dissolved in sterile saline and administered at a dose of 0.1 mg / kg intravenously and subcutaneously. Control animals receive an equivalent volume of sterile saline.
  • the analgesic effect is measured by the increase in the time elapsed from the moment the animal lands on the plate until the moment it first bounces (FIG. 6). Measurement of pain sensitivity is carried out 2 and 13 hours after drug administration.
  • Test peptide HCRG21 is dissolved in sterile saline and injected intramuscularly at a dose of 0.1 mg / kg.
  • the APHC1 peptide was used as a control to compare the effect at the same concentration under the same conditions.
  • Control animals receive an equivalent volume of sterile saline.
  • 20 ⁇ l of a mixture (ratio 1: 9 (v / v)) of 10% alcoholic solution of capsaicin with saline is injected into the hindpaw pad of all mice.
  • the amount of capsaicin in 20 ⁇ l of the mixed solution is 3 ⁇ g.
  • capsaicin After the injection of capsaicin, immediately begin to observe the behavior of the mouse and record the time of the onset of the animal's reaction to the induction of pain (the first licking or twitching of the injured paw), then the number and duration of the licking of the injured paw are counted. Observation of every animal carried out within 15 minutes. The results are processed statistically, the reliability of the differences between the results of the control and experimental groups is determined using the Student's test.
  • the analgesic effect is measured by the increase in the time elapsed from the moment the animal is placed on the plate until the moment the animal responds to pain induction (Fig. 7A), as well as the decrease in the duration (Fig. 7B) and the number (Fig. 7C) of licks of the injured paw. Based on the results obtained, it is determined that the analgesic effect of HCRG21 is expressed in a decrease in the sensitivity of animals to the irritating effect of capsaicin: the intensity and time of licking the irritated paw decreases by more than 2.5 times and the time of onset of the animal's behavioral reactions to pain induction increases by 3.5 times. compared with the control group. The analgesic effect of the reference peptide ARNS1 is less pronounced in all three recorded parameters.
  • mice Male white ICR mice weighing 20-30 g.
  • the mice are divided into 2 groups (control and experimental), 9 animals each.
  • the mice of the experimental group are injected with an inflammatory agent in the hindpaw pad, which is 20 ⁇ l of a mixture of Freund's complete adjuvant and saline in a ratio of 1: 1 (v / v).
  • an inflammatory agent in the hindpaw pad which is 20 ⁇ l of a mixture of Freund's complete adjuvant and saline in a ratio of 1: 1 (v / v).
  • the animals are injected intramuscularly with 200 ⁇ l of a solution of the test peptide HCRG21 in sterile saline at a dose of 0.1 mg / kg; animals of the control group are injected with 200 ⁇ l of saline.
  • the measurement is carried out 60 minutes after administration.
  • the analgesic effect is measured by the increase in the time elapsed from the moment the animal is placed on the plate until the moment the hind paw is first licked (FIG. 8).
  • the results are processed statistically, the reliability of the differences between the results of the control and experimental groups is determined using the Student's test.
  • mice Male white ICR mice weighing 20-30 g. The mice are divided into 4 groups (control and experimental), 9 animals each.
  • the test peptide HCRG21 is dissolved in sterile saline and injected intramuscularly at doses of 0.1 and 1.0 mg / kg. Control animals receive an equivalent volume of sterile saline. Ibuprofen at a dose of 100 mg / kg is used as a positive control and is administered orally to the animals.
  • mice After 60 minutes, all mice are injected with 20 ⁇ l of a 2.5% formalin solution into the hind paw pad.
  • the patterns of pain reaction (the number of acts of licking and the time the hind paw is tucked in) are calculated in the following mode:
  • the analgesic effect was assessed by the decrease in the duration of pain response patterns relative to control animals (Fig. 9).
  • the results are processed statistically, the reliability of the differences between the results of the control and experimental groups is determined using the Student's test.
  • analgesic effect of HCRG21 is expressed in a significant decrease in the number of acts of licking and the time of the tucked hind paw both in phase I of the acute period of the formalin test (0-10 min), which characterizes the interaction with nociceptors, and in phase II (after 10 -15 min), blocking pH-mediated or modulated TRPV1 activation that occurs during inflammation.
  • Ibuprofen a typical analgesic of the NSAID group
  • mice Male white ICR mice weighing 20-30 g.
  • the mice are divided into 4 groups (control and experimental), 9 animals each.
  • the test peptide HCRG21 is dissolved in sterile saline and injected intramuscularly at doses of 0.1 and 1.0 mg / kg.
  • Control animals receive an equivalent volume of sterile saline.
  • Ibuprofen at a dose of 100 mg / kg is used as positive control and administered orally to the animals.
  • mice After 60 minutes, all mice are injected with 20 ⁇ l of 1% carrageenan solution into the hindpaw pad. Immediately after the introduction, the squeezing force is measured with forceps (values over 300 are taken as 300).
  • the analgesic effect is assessed by the increase in the strength of the action relative to the control animals (Fig. 10). The results are processed statistically, the reliability of the differences between the results of the control and experimental groups is determined using the Student's test.
  • the statistically significant analgesic effect of HCRG21 is manifested at a dose of 1 mg / kg and is expressed in an increase in the force of action, which significantly exceeds the indicators (dose and force of action) that are observed for ibuprofen.
  • the tests are carried out on male white ICR mice weighing 20-30 g. The mice are divided into 4 groups (control and experimental), 6 animals each.
  • the test peptide HCRG21 is dissolved in sterile saline and injected intravenously at doses of 0.1 and 1.0 mg / kg. Control animals receive an equivalent volume of sterile saline. Indom ethacin at a dose of 10 mg / kg is used as a positive control and is administered orally to animals. All animals measure the volume of the hind right paw using a plethysmometer (Ugo Basile).
  • mice subjected to intravenous administration of saline or peptide HCRG21 were subjected to intravenous administration of saline or peptide HCRG21, and after 60 minutes, to mice receiving oral indomethacin, 20 ⁇ l of 1% carrageenan solution (Sigma, USA) was injected into the pad of the hind right paw. Then, using a plethysmometer, the resulting edema is measured after 1, 2, 3, 4 and 24 hours. The results are processed statistically, the reliability of the differences between the results of the control and experimental groups is determined using the Student's test.
  • HCRG21 The statistically significant anti-inflammatory effect of HCRG21 is manifested at doses of 0.1 and 1 mg / kg and is expressed in a smaller volume of edema compared to the control and comparable to that as a result of the use of indomethacin, an anti-inflammatory drug of the NSAID group, at a dose of 10 mg / kg (Fig. 11 ).
  • mice Effect of HCRG21 peptide on body temperature
  • the tests are carried out on male white ICR mice weighing 20-30 g. The mice are divided into 3 groups (control and experimental), 9 animals each.
  • a test sample of the HCRG21 peptide is dissolved in sterile saline and administered at a dose of 0.1 mg / kg intramuscularly.
  • the APHC1 peptide is used as a control to compare the activity at the same concentration under the same conditions.
  • Control animals receive an equivalent volume of sterile saline.
  • the initial body temperature is measured (0 min), then measurements are taken 60, 180 and 360 min after the introduction of the peptides (Fig. 12).
  • the results are processed statistically, the reliability of the differences between the results of the control and experimental groups is determined using the Student's test.
  • Both peptides cause a statistically significant decrease in the body temperature of animals by 0.7-1.0 ° C at 60 minutes after administration, while HCRG21 exhibits a longer hypothermic effect, which is observed even after 360 minutes, with a maximum temperature decrease of 1.5 degrees 180 minutes after administration.
  • mice Male white ICR mice weighing 20-30 g.
  • the mice are divided into 4 groups (control and experimental), 7 animals each.
  • a test sample of the HCRG21 peptide is dissolved in sterile saline and administered at a dose of 0.1 mg / kg intranasally, subcutaneously and intravenously.
  • Control animals receive an equivalent volume of sterile saline.
  • the results are processed statistically, the reliability of the differences between the results of the control and experimental groups is determined using the Student's test.
  • the HCRG21 peptide causes a statistically significant decrease in the body temperature of animals by 0.4-0.5 ° C at 60 minutes after intravenous and intranasal administration, while HCRG21 exhibits a prolonged hypothermic effect, which is observed even 13 hours after intranasal administration.
  • the animal is placed on the research site of the device.
  • the residence time of the animal in the field is 3 minutes.
  • the indicators of motor activity are recorded: the distance traveled (DT - Ambulatory distance traveled by the subject), the time of absence of movement of the animal (RT - Resting time), the time of movement of the animal (AT - Ambulatory time, when the subject), the number of times the animal has assumed a vertical position (V1C / V1B rearing).
  • HCRG21 peptide exhibits analgesic activity in mammals by various routes of administration (intramuscular, intravenous, subcutaneous and intranasal).
  • the effect of the HCRG21 peptide was studied in five different tests on wild-type mice, which confirms the possibility of using the peptide as an analgesic for relieving pain syndromes of various etiologies.
  • the hot plate test is most associated with TRPV 1 ion channel inhibition, as TRPV 1 plays an important role in the sensation of temperature.
  • capsaicin is a selective agonist of the TRPV1 channel
  • the efficacy of the peptide is tested as an antagonist of this receptor in a capsaicin-induced pain model.
  • Capsaicin injection simulates pain from various pro-inflammatory endogenous and exogenous ligands, which is manifested by licking and shaking the injected paw.
  • the formalin test is a complex in vivo pain model that assesses not only the analgesic activity, but the anti-inflammatory effect in general.
  • formalin injections induce a biphasic behavioral response.
  • the first phase (acute) lasts during the first 10 minutes after formalin administration and is due to direct stimulation of nociceptors; the second phase (chronic) is recorded 10-15 minutes after the introduction of formalin and lasts for 20-40 minutes, is associated with the mechanisms of development of neurogenic inflammation and sensitization of the central nervous system.
  • Thermal hyperalgesia induced by the administration of Freund's complete adjuvant (CFA), another variant of the inflammatory model, in which different pathways are involved inflammation.
  • CFA complete adjuvant
  • the introduction of carrageenan causes the development of an inflammatory process and, as a consequence, pain, which is caused by the activation of such nociceptors as TRPA1 and TRPV1, by mediators of inflammation and changes (decrease) in acidity.
  • HCRG21 shows a longer analgesic effect (not less than 13 hours) than ARNS1 (less than 3 hours) when administered intramuscularly at a dose of 0.1 mg / kg (Fig. 5).
  • HCRG21 has a longer (8 s) latency period for the first response to pain caused by capsaicin, shorter time (59 s) and fewer acts of licking the corresponding paw (10 s), in contrast to ARNS1 (5, 9, 110 and 18 s, respectively ) when administered intramuscularly at a dose of 0.1 mg / kg (Fig. 7).
  • HCRG21 in comparison with APNS1, has a longer hypothermic effect, which is observed even after 360 minutes after administration (Fig. 12).
  • the inventive agent exhibits a significant analgesic effect when administered intramuscularly in a formalin test at a dose of 0.1-1.0 mg / kg, surpassing the effect of ibuprofen, an analgesic and anti-inflammatory drug widely used in practice (Fig. 9).
  • HCRG21 in the open field test does not have a negative effect on the central nervous system (table), and its analgesic and anti-inflammatory action refers to the effect of specific inhibition of the TRPV 1 channel.
  • HCRG21 peptide can be used individually or as an active component of a finished dosage form of an anesthetic for the needs of veterinary medicine and medicine.
  • Medicinal preparations containing the claimed agent as an active form can be administered parenterally or intranasally.

Abstract

Изобретение относится к биохимии, конкретно к применению биологически активных пептидов, обладающих ингибирующим действием на болевые рецепторы, и касается способов применения в качестве анальгетического средства пептида HCRG21 из морской анемоны Heteractis crispa, обладающего длительным анальгетическим эффектом за счет ингибирования функциональной активности ионного канала TRPV1. Указанный пептид может быть использован как лекарственное средство самостоятельно или в смеси с другими активными компонентами для снижения болевых синдромов различной этиологии, в том числе острых и хронических, для снятия воспаления, а также для достижения умеренного гипотермического эффекта. Изобретение позволяет получить эффективный анальгетический препарат длительного действия, имеющий направленное действие на клеточную мишень, который может быть доставлен в организм, как неинвазивным, так и парентеральным путем.

Description

СРЕДСТВО ПРОЛОНГИРОВАННОГО АНАЛЬГЕТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ
Область техники к КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ изобретение
Изобретение относится к биохимии, конкретно к использованию биологически активных пептидов как анальгетических средств, которые могут найти применение в медицине и ветеринарии для снижения болевых синдромов, в том числе острых и хронических, а также использоваться в научных исследованиях для разработки методов поиска новых перспективных лекарств или в качестве инструментов изучения молекулярной организации и механизмов функционирования ионных каналов, рецепторов и протеолитических ферментов.
Ппелнтествуюнтий уровень техники
Боль - важное физиологическое явление, почти всегда сопровождающееся развитием патологий. Различают острую и хроническую боль. В отличие от хронической, острая боль, как правило, краткосрочна, имеет легко идентифицируемую причину и обычно хорошо поддаётся излечению. Хроническая боль бывает ноцицептивной (вызванная повреждением ткани или воспалением) или нейропатической. Нейропатическая боль возникает в результате патологического возбуждения нейронов в периферической или центральной нервной системе и поддерживается нарушенными соматосенсорными процессами. Традиционно терапия болевых состояний включает сочетанное применение нестероидных противовоспалительных препаратов и прочих неопиоидных анальгетиков, таких как ацетилсалициловая кислота и ее производные, ацетаминофен, ибупрофен, фенопрофен, дифлузинал и напроксен; и/или опиоидных анальгетиков, включая морфин, гидроморфон, метадон, леворфанол, фентанил, оксикодон и оксиморфон. Использование опиоидов связано с многочисленными побочными эффектами, включая физическую и наркотическую зависимость. Доказано, что быстрый рост в использовании рецептурных опиоидных препаратов в Соединенных Штатах хорошо коррелирует с увеличением смертности от передозировки опиоидами и ростом продаж наркотиков на нелегальном рынке. Злоупотребление и зависимость от опиоидов из года в год растет, и это ведет мировое сообщество в целом к серьезному кризису, который имеет разрушительные последствия для здравоохранения и экономики. К сожалению, в настоящее время нет эффективных альтернатив для замены опиоидных анальгетических препаратов в случаях острых послеоперационных болей и при онкологических заболеваниях.
Создание принципиально новых анальгетических средств, способных управлять молекулярными механизмами генерации боли, невозможно без выяснения таргетной специфичности исследуемого препарата. Установлено, что ключевыми игроками в процессах болевого сигналинга являются рецепторы и ионные каналы периферических терминалей и аксонов ноцицепторов (Basbaum A.I. et al. Cellular and molecular mechanisms of pain // Cell 2009, 139, 267-284). К ним относятся, в частности, неселективные катионные каналы семейства TRP (Transient Receptor Potential), участвующие у живых организмов в различных физиологических процессах, таких как фоторецепция, восприятие феромонов, ощущение вкуса, боль, механорецепция, регуляция кровяного давления и другие. Для млекопитающих было показано, что нарушение функционирования этих каналов напрямую связано с развитием ряда патологических состояний (Mickle A.D. et al. Nociceptive TRP Channels: Sensory Detectors and Transducers in Multiple Pain Pathologies // Pharmaceuticals 2016, 9, e72).
Определенные типы TRP каналов используются животными как терморецепторы для регулирования температуры тела и измерения температуры окружающей среды, что особенно актуально для предохранения от опасной для жизнедеятельности организма температуры и обеспечения выживания организма. Среди так называемых «термо» TRP каналов, наиболее хорошо охарактеризованным является TRPV1 (transient receptor potential vanilloid type 1), неселективный катионный канал с предпочтением к Са2+ (Szallasi A. The vanilloid receptor TRPV1: 10 years from channel cloning to antagonist pro of-of-concept // Nat. Rev. Drug Discov. 2007, 6, 357-372). Он является полимодальным ионным каналом, который активируется различными химическими веществами, такими как капсаицин перца чили, резинифератоксин из молочая смолоносного, камфора из камфорного дерева, пептидные токсины, эндогенные липиды (анандамид, N-арахидоноилдопамин, лейкотриен В4), известные как «эндованилоиды», а также отвечает на закисление межклеточной среды (рН<5,9). Однако, наиболее значимой его функцией у млекопитающих является активация опасной температурой (> 42 °С) (Starowicz К. et al. Biochemistry and pharmacology of endovanilloids // Pharmacol. Ther. 2007, 114:13-33; Cao E., et al. TRPV1 channels are intrinsically heat sensitive and negatively regulated by phosphoinositide lipids // Neuron 2013, 77, 667-679). Косвенно TRPV1 также активируется и сенсибилизируется широким спектром других медиаторов воспаления, таких как гистамин, брадикинин, простагландины и АТФ, а также NGF, который, помимо всего прочего, увеличивает экспрессию TRPV1 в сенсорных нейронах (RU 2621708, RU 2648445, RU 2541127, RU 2506077, RU 2379282, ЕР 2352726, US 2017266139).
TRPV1 экспрессируется в клетках центральной и периферической нервной системы и участвует во многих важных физиологических процессах, таких как терморегуляция, липогенез, функционирование мочевого пузыря, сердечная деятельность, нейрогенез в головном мозге.
Многочисленные исследования показали, что этот канал вовлечен в регуляцию ряда патологических состояний, таких как гастроэзофагеальная рефлюксная болезнь, недержание кала/мочи, аллергический контактный дерматит, гиперчувствительность дыхательных путей, сердечно-сосудистые расстройства, диабетическая и периферическая нейропатия и боли, связанные с онкологическими заболеваниями (Jara-Oseguera A. et al. TRPV1 : On the road to pain relief // Curr. Mol. Pharmacol. 2008, 1, 255-269; Mickle A.D. et al. Nociceptive TRP Channels: Sensory Detectors and Transducers in Multiple Pain Pathologies // Pharmaceuticals 2016, 9, pii.E72).
В медицинской практике в качестве анальгетиков давно применяются агонисты TRPV 1 канала капсаицин и резинифератоксин (RTX) (US 5178879, US 566378, US 6239180, US 4313958, US 4599342, US 5188837), которые также используются для активации или абляции клеток, экспрессирующих TRPV1, что дает представление о роли этих специфических ноцицепторов в соматических или висцеральных болевых ощущениях (Cianchetti С. Capsaicin jelly against migraine pain // Int. J. Clin. Pract. 2010, 64, 457-459; Myzsik G. Capsaicin as new orally applicable gastroprotective and therapeutic drug alone or in combination with nonsteroidal anti-inflammatory drugs in healthy human subjects and in patients // Prog. Drug Res. 2014, 68, 209-258). В патентной литературе практическое использование таких агонистов встречается в документах известных международных компаний: Glenmark Pharmaceuticals S.A. (W02007042906, W02008110863, W02008059339, W02009095726, W02009010824, W02009081219, WO 2009081222, W02008010061, W02009090548, W02009034433),
Gruenenthal GmbH (W02007045462, WO2008125295, WO2008125296, WO2008125337, WO2008125342, W02008046647), PharmEste s.r.l. (W02008075150, W02008006481, W02008006480) и Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. (W02008091021). Основным недостатком использования этих агонистов канала в качестве лекарственных препаратов являются сильные болевые реакции при их введении.
Обнаружение антагонистов TRPV1 инициировало обширные исследования, как в научно-исследовательских институтах, так и фармацевтических компаниях, в результате которых был сформулирован терапевтический потенциал этих соединений. Рекомендовано использовать их для лечения болезней, сопровождающихся проявлениями хронических болевых состояний (RU 2151014, RU 2396261, RU 2448108, RU 2450006, RU 2452733, RU 2458055, RU 2468020, RU 2621708, RU 2621708, ЕР 2352726, US 2017266139, US 6248788, JP 2016047822), а также для лечения или профилактики заболеваний или состояний, в которых играет роль или участвует активация ионного канала TRPV1, таких как мигрень (RU 2448108), остеоартрит (RU 2151014, RU 2448108, RU 2458055, RU 2621708), гиперактивное состояние мочевого пузыря (RU 2151014, RU 2448108, RU 2450006, RU 2452733, RU 2458055, RU 2468020, RU 2621708, ЕР 2352726), кашель (Khalid S. et al. Transient receptor potential vanilloid 1 (TRPV1) antagonism in patients with refractory chronic cough: a double-blind randomized controlled trial // J. Allergy Clin. Immunol. 2014, 134, 56-62; Cabral L.D.M. & Giusti-Paiva A. The Transient Receptor Potential Vanilloid 1 Antagonist Capsazepine Improves the Impaired Lung Mechanics during Endotoxemia // Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology, 2016, 119, 421-427; EP 2352726, RU 2448108), воспалительные заболевания дыхательных путей (Lv Н. et al. Effect of transient receptor potential vanilloid- 1 on cough hypersensitivity induced by particulate matter 2.5 // Life Science, 2016, 151, 157-166), в том числе астма (RU 2151014, RU 2448108), воспалительные заболевания кишечника (IBD), в том числе синдром раздраженного кишечника (IBS) (RU 2151014, RU 2448108, RU 2452733, RU 2458055, RU 2621708), язвенная болезнь (RU 2151014, RU 2448108, RU 2621708), диабет (Gram D.X. et al. TRPV1: A Potential Therapeutic Target in Type 2 Diabetes and Comorbidities? // Trends in Molecular Medicine, 2017, 23, 1002-1013; Zhong, B. et al. TRPVl mediates glucose-induced insulin secretion through releasing neuropeptides // In Vivo (Brooklyn), 2019, 33, 1431-1437; RU 2448108) и дерматит (Yun, J.W. et al. TRPVl antagonist can suppress the atopic dermatitis-like symptoms by accelerating skin barrier recovery // Journal of Dermatological Science, 2011, 62, 8-15; RU 2448108).
Для ряда лекарственных средств для лечения хронической боли на основе антагонистов TRPVl были опубликованы клинические данные испытаний фазы I: SB-705498 (GSK), AMG-517 (Amgen), МК-2295 (Merck), AZD-1386 (Astra-Zeneca) и GRC-6211 (Lilly/Glenmark), (Gunthorpe M.J. et al. Clinical development of TRPVl antagonists: target in pivotal point in the pain pathway // Drug Discov Today, 2009, 14, 56-67; Khairatkar-Joshi N. et al. TRPVl antagonists: the challenges for therapeutic targeting // Trends Mol. Med. 2009, 15, 14-22). Показано, что высокая доза (400 мг) SB-705498, имеющего период полувыведения 35-93 ч, показывает целевую фармакодинамическую активность в снижении воспаления, вызванного термическими ожогами, УФ радиацией, и после применение капсаицина (Gunthorpe M.J. et al. Clinical development of TRPV1 antagonists: targeting a pivotal point in the pain pathway // Drug Discov. Today 2009, 14, 56-67; Chizh B .A. et al. The effects of the TRPV1 antagonist SB-705498 on TRPV1 receptor-mediated activity and inflammatory hyperalgesia in humans // Pain 2007, 132, 132-141). AMG-517, имеющий период полувыведения от 13 до 23 дней, вызывает большое и устойчивое повышение температуры у людей, которое ослабляется лишь частично многократным дозированием (Gawa N.R. et al. Repeated administration of vanilloid receptor TRPV1 antagonists attenuates hyperthermia elicited by TRPV1 blockade // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2007, 323, 128-37). Установлено, что ABT-102, по сравнению c AMG-517, демонстрирует незначительное повышение температуры, которое быстро затухает при многократном введении препарата (Honore Р. et al. Repeated dosing of ABT-102, a potent and selective TRPV1 antagonist, enhances TRPV 1 -mediated analgesic activity in rodents, but attenuates antagonist-induced hyperthermia // Pain 2009, 142, 27-35).
Дальнейшие испытания с использованием перорального способа введения антагонистов TRPV1 канала, таких как SB-705498, AMG-517, МК-2295 и GRC-6211, на сегодняшний день отложены или остановлены. Основным препятствием для введения большинства из этих агентов в клинику остается их неудовлетворительный профиль безопасности, в частности гипертермия.
Антагонистами TRPV1, не обладающими гипертермическим эффектом, являются соединения АРНС1, АРНС2 и АРНСЗ - первые пептидные ингибиторы этого канала, которые были найдены в яде морской анемоны Heteractis crispa. Они обладают выраженным анальгетическим действием при внутривенном введении в дозах 0,01 мг/кг, связанным с частичным ингибированием TRPV1, что было показано на различных моделях стимуляции боли у экспериментальных животных (RU2368621 С1, 27.09.2009; RU2404245, С1, 20.11.2010; RU2619170, С2, 12.05.2017).
Пептид HCRG21 (номер последовательности в базе UniProt P0DL86), родственный соединениям АРНС1, АРНС2 и АРНСЗ, который может быть получен биотехнологическим способом или быть выделенным из экстракта морской анемоны, также является антагонистом TRPV1 канала (Monastyrnaya М.М. et al. Kunitz-type peptide HCRG21 from the sea anemone Heteractis crispa is a full antagonist of the TRPVl receptor // Mar. Drugs 2016, 14, 229-234). Потенциал пептида HCRG21 как анальгетика раскрыт ранее не был.
Раскрытие изобретения В настоящем документе мы показываем возможность использования пептида HCRG21 как анальгетика, средства, понижающего температуру тела и/или противовоспалительного средства, что подтверждается данными, полученными на нескольких животных моделях. Пептид HCRG21 имеет преимущество над пептидом АРНС1 по длительности обезболивающего действия, которое было обнаружено в ходе сравнительных экспериментов. Пептид HCRG21 также характеризуется выраженным гипотермическим и противовоспалительным эффектом. Таким образом, лекарственное средство на основе пептида HCRG21 превосходит известные аналоги по своей эффективности..
Изобретение решает задачу разработки активной фармакологической субстанции с пролонгированным анальгетическим действием, и/или выраженным гипотермическим и противовоспалительным действием, и создания на его основе лекарственного препарата, предназначенного для облегчения болезненных состояний у человека и животных при парентеральном или интраназальном способе введения.
Задачу решают применением пептида HCRG21, который обладает пролонгированным анальгетическим действием, выраженным гипотермическим эффектом и противовоспалительной активностью. Такой пептид является активной фармакологической субстанцией, которую вводят в состав готовой лекарственной формы для изготовления лекарственного средства для парентерального или интраназального способа введения.
Получаемый лекарственный препарат предназначен для облегчения острых болевых состояний и боли при хронических патологических процессах, где нарушена нормальная функциональная активность и задействована повышенная активность ионного канала TRPV1. Препарат снимает воспаление, эффективно понижает температуру тела млекопитающих, в том числе человека.
Таким образом настоящее изобретение относиться к пептиду HCRG21 для применения в качестве лекарственного средства, обладающего пролонгированным анальгетическим, противовоспалительным и/или гипотермическим действием.
Предпочтительно пептид HCRG21 получают рекомбинантным путем.
В частности, изобретением предусмотрено применение пептида HCRG21 парентерально или интраназально в дозе не менее 0, 1 мг/кг.
Лекарственное средство на основе пептида HCRG21 предназначено для лечения пациентов, конкретно для снятия болевых ощущений, вызванных полосными операциями, суставными и онкологическими болями. Данным пациентом может быть млекопитающее, и в том числе человек.
В следующем аспекте изобретения предусмотрен пептид HCRG21 для применения в качестве лекарственного средства, для лечения острых и хронических заболеваний: мигрень, остеоартрит, кашель, гиперактивное состояние мочевого пузыря, воспалительное заболевание дыхательных путей, астма, воспалительные заболевания кишечника, синдром раздраженного кишечника, диабет, дерматит.
Предпочтительно, пептид HCRG21 получают рекомбинантным путем.
Также в изобретении предлагается способ лечения, где предусмотрено введение лекарственного средства, содержащего пептид HCRG21, для обеспечения пролонгированного анальгетического, противовоспалительного и гипотермического действия.
В частности, вводимое в способе лекарственное средство, содержит эффективное количество пептида HCRG21.
Эффективное количество пептида HCRG21, представляет собой количество, достаточное для достижения конкретной заявленной цели, такой как снятие или уменьшение болевого синдрома, снятие или уменьшение воспаления, понижение температуры тела. «Эффективное количество» может быть определено опытным путем и известными способами, относящимися к заявленной цели.
Технический эффект изобретения заключается в значительно более длительном анальгетическом действии заявляемого средства, наблюдаемом в животных моделях боли (не менее 13 часов) при внутривенном, подкожном, внутримышечном и интраназальном способе введения мышам в дозе 0, 1 мг/кг.
Изобретение раскрывает информацию о биологических свойствах пептида HCRG21, полученную в результате тестирования пептида в различных моделях болевой чувствительности на животных. В сравнительных тестах заявляемый пептид превосходит аналоги АРНС1 - АРНСЗ по следующим параметрам:
•более длительное анальгетическое действие;
•более длительный латентный период первой реакции на боль, вызванную капсаицином, меньшее время облизывания и меньшее количество актов облизывания;
•более выраженный гипотермический эффект.
Лучшая эффективность заявляемого пептида по сравнению с ближайшими аналогами обусловлена принципиальными различиями в механизме действия на биологическую мишень. Аналоги АРНС1 и АРНСЗ являются полимодальными, и, в зависимости от силы стимула (концентрация агониста (капсаицина), pH, температура), они либо потенцируют TRPV1, либо ингибируют (до 32%) проходящий через канал ток (Andreev Y. A. et al. Polypeptide modulators of TRPV1 produce analgesia without hyperthermia // Mar. Drugs 2013, 11 (12): 5100- 15), тогда как пептид HCRG21 полностью блокирует (ингибирует на 95%) индуцированный капсаицином ионный ток через мембрану клеток.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1. Ингибирование уровня внутриклеточного кальция в ответ на добавление 3 мкМ раствора капсаицина на линии клеток СНО, стабильно экспрессирующей ионный канал TRPV1. Используют 30 нМ концентрацию пептида HCRG21. Достоверность различий вычисляют t-критерием Стьюдента, достоверным считают значение *** - р<0,001 по сравнению с контролем.
Фиг. 2. Анальгетический эффект разных доз пептида HCRG21 в тесте «горячая пластина» при внутримышечном способе введения. По оси ординат откладывают время реакции на болевой стимул. Контрольные животные получают аналогичный объем физиологического раствора (PBS). Для сравнения измеряют аналог - пептид АРНС1, в дозах 0,01, 0,1 и 1 мг/кг. Достоверность различий вычисляют t-критерием Стьюдента, достоверным считают значение *- р<0,05, **- р<0,01, ***- р<0,001 по сравнению с группой PBS.
Фиг. 3. Анальгетический эффект разных доз пептида HCRG21 и аналога - пептида АРНС1, в тесте «горячая пластина» при внутривенном способе введения. По оси ординат откладывают время реакции на болевой стимул. Контрольные животные получают аналогичный объем раствора PBS. Достоверность различий вычисляют t-критерием Стьюдента, достоверным считают значение *- р<0,05, **- р<0,01 по сравнению с группой PBS.
Фиг. 4. Анальгетический эффект разных доз пептида HCRG21 в тесте «горячая пластина» при интраназальном способе введения. По оси ординат откладывают время реакции на болевой стимул. Контрольные животные получают аналогичный объем раствора PBS. Достоверность различий вычисляют t-критерием Стьюдента, достоверным считают значение ***- р<0,001 по сравнению с группой PBS.
Фиг. 5. Фармакодинамика анальгетического эффекта пептида HCRG21 и аналога - пептида АРНС1, в тесте «горячая пластина» в дозе 0,1 мг/кг при внутримышечном введении. По оси ординат откладывают время реакции на болевой стимул, по оси абсцисс приводят время между введением пептида и измерением эффекта. Достоверность различий вычисляют t-критерием Стьюдента, достоверным считают значение **- р<0,01, ***- р<0,001 по сравнению с группой контрольных животных, которым вводили равный объем PBS.
Фиг. 6. Анальгетический эффект 0,1 мг/кг дозы пептида HCRG21 в тесте «горячая пластина» при подкожном (А) и при внутривенном (Б) способе введения для двух временных точек измерения эффекта через 2 и 13 часов после введения препарата. По оси ординат откладывают время реакции на болевой стимул. Контрольные животные получают аналогичный объем раствора PBS. Достоверность различий вычисляют t-критерием Стьюдента, достоверным считают значение *- р<0,05, ***- р<0,001 по сравнению с группой PBS.
Фиг. 7. Анальгетический эффект пептида HCRG21 и аналога - пептида АРНС1, в дозе 0,1 мг/кг при внутримышечном введении в капсаициновом тесте. По оси ординат откладывают измеряемые параметры за 15 минут наблюдения: (А) латентный период первой реакции, (Б) время, которое мышь провела за лизанием лапы, (В) количество актов облизывания. Контрольные животные получают аналогичный объем раствора PBS. Достоверность различий вычисляют t-критерием Стьюдента, достоверным считают значение *- р<0,05, **- р<0,01, ***- р<0,001 по сравнению с группой PBS.
Фиг. 8. Противовоспалительный эффект пептида HCRG21 в дозе 0,1 мг/кг при внутримышечном введении в тесте тепловой гиперчувствительности, вызванной интраплантарным введением полного адьюванта Фрейнда. По оси ординат откладывают время отдергивания воспаленной лапы от горячей пластины (t=53 °С). Достоверность различий вычисляют t-критерием Стьюдента, достоверным считают значение **- р<0,01 по сравнению с группой контрольных животных, которым вводили равный объем PBS.
Фиг. 9. Анальгетический эффект пептида HCRG21 в дозах 0,1 и 1 мг/кг при внутримышечном введении в формалиновом тесте. Контрольные животные получают аналогичный объем раствора PBS (отрицательный контроль) или раствор ибупрофена в дозе 100 мг/кг (положительный контроль). По оси ординат откладывают измеряемые параметры за 1 минуту наблюдения: (А) латентное время поджатая задней лапы, (Б) количество актов облизывания задней лапы, по оси абсцисс приводят время между введением пептида и началом очередного измерения. Достоверность различий вычисляют t-критерием Стьюдента, достоверным считают значение *- р<0,05, **- р<0,01, ***- р<0,001 по сравнению с группой PBS. Фиг. 10. Анальгетический эффект пептида HCRG21 в дозах 0,1 и 1 мг/кг при внутримышечном введении в тесте механической гиперчувствительности в условиях острого локального воспаления, индуцируемого интраплантарным введением каррагинана. Контрольные животные получают аналогичный объем раствора PBS (отрицательный контроль) или раствор ибупрофена в дозе 100 мг/кг (положительный контроль). По оси ординат откладывают силу сдавливания щипцами. Достоверность различий вычисляют t-критерием Стьюдента, достоверным считают значение *- р<0,05 по сравнению с группой PBS.
Фиг. 11. Противовоспалительный эффект пептида HCRG21 в дозах 0,1 и 1 мг/кг при внутривенном введении в тесте острого локального воспаления, индуцируемого интраплантарным введением каррагинана. Контрольные животные получают аналогичный объем раствора PBS (отрицательный контроль) или раствор индометацина в дозе 10 мг/кг (положительный контроль). По оси ординат откладывают увеличение объема лапы животного в процентах от исходного объёма. Достоверность различий вычисляют t-критерием Стьюдента, достоверным считают значение *- р<0,05, **- р<0,01 по сравнению с группой PBS.
Фиг. 12. Влияние пептида HCRG21 и аналога - пептида АРНС1, на ректальную температуру тела мышей линии ICR при внутримышечном введении в дозе 0,1 мг/кг. Достоверность различий вычисляют t-критерием Стьюдента, достоверным считают значение *- р<0,05, **- р<0,01, ***- р<0,001 по сравнению с группой контрольных животных, которым вводили равный объем PBS.
Фиг. 13. Влияние пептида HCRG21 на ректальную температуру тела мышей линии ICR при различных способах введения в дозе 0,1 мг/кг. Достоверность различий вычисляют t-критерием Стьюдента, достоверным считают значение *- р<0,05 по сравнению с группой контрольных животных, которым вводили равный объем PBS.
Осуществление изобретения
Пример 1
Получение пептида HCRG21
Активный пептид получают биотехнологическим методом в составе химерного белка с фрагментом тиоредоксина. Синтез гена hcrg21 проводят с помощью ПЦР (2 стадии) с использованием специфичных праймеров, созданных на основе полученной последовательности гена hcrg21 и оптимизированных в соответствии с редкими кодонами для экспрессии в E.coli, которые полностью перекрывают нуклеотидную последовательность (Monastyrnaya М.М. et al. Kunitz-type peptide HCRG21 from the sea anemone Heleraclis crispa is a full antagonist of the TRPV1 receptor // Mar. Drugs 2016, 14, 229-234). В последовательность прямого и обратного фланкирующих праймеров вводят сайты рестрикции для EcoRI и Xhol соответственно. В последовательность прямого фланкирующего праймера перед последовательностью, кодирующей первый аминокислотный остаток пептида HCRG21, вводят дополнительный кодон, ATG, кодирующий остаток метионина. За сайтом рестрикции Xhol в последовательность обратного праймера добавляют стоп-кодон ГАА. Генно-инженерную конструкцию (экспрессионный вектор), способную экспрессировать пептид HCRG21 в клетках Е. coli, получают на основе синтезированного фрагмента гена hcrg21 путем лигирования с экспрессирующим вектором pET32b+ (Novagen) после обработки фрагмента гена hcrg21 и плазмиды рЕТ32Ь+ рестриктазами EcoRI и Xhol. Полученные плазмиды проверяют секвенированием. В результате получают плазмиду, несущую гены химерного белка TrxA-HCRG21 под контролем Т7 промотера.
В состав химерного белка для синтеза пептида HCRG21 может входить любой другой коммерчески доступный белок-помощник (например, барназа (bar'), дисульфид-обменный белок (DsbC), белок, связывающий мальтозу (МБР), или же комбинация хитин-связывающего домена и мини-интеина DnaB из Synechocystis sp., способного подвергаться pH- зависимому самоотщеплению). Химерный белок TrxA-HCRG21 представляет собой слитную аминокислотную последовательность фрагмента тиоредоксина А (ТгхА, 109 аминокислотных остатков), последовательности 6 аминокислотных остатков гистидина, остатка метионина, расположенного непосредственно перед первым остатком пептида HCRG21, и целевого пептида HCRG21.
Клетки BL21(DE3) трансформируют экспрессионным вектором, содержащим последовательность, кодирующую химерный белок. После селекции на чашках с селективным антибиотиком (карбенициллин), клетки пересеивают в колбу с 1200 мл жидкой питательной среды (LB) с селективным антибиотиком (карбенициллин) и выращивают при перемешивании до оптической плотности ~0,6 единиц (Абоо) при температуре 37°С. Индукцию экспрессии проводят добавлением изопропил-Р-0-1 -тиогалактопиранозида до концентрации 0,4 мМ. Клетки продолжают инкубировать и перемешивать при 19°С для продукции химерного белка и через 20 часов осаждают и замораживают. Для проведения дезинтеграции клетки ресуспендируют в буферном растворе (20 мМ Трис-НС1 pH 7,2, 150 мМ NaCl). Дезинтегрируют клетки ультразвуком, клеточный дебрис осаждают центрифугированием. Целевой химерный белок выделяют из растворимой фракции.
Отделение продукта от прочих клеточных белков проводят с помощью металло-аффинной хроматографии на 2+-сорбенте в буферном растворе (20 мМ Трис-НС1 pH 7,2, 150 MMNaCl), для элюирования химерного белка используют буферный раствор (150 мМ имидазол, 300 мМ NaCl, 20 мМ Tris, pH 7,5). Далее аффинную метку и белок- помощник удаляют, расщепляя слитный белок бромцианом по остатку метионина, введенному специально перед первой аминокислотой пептида HCRG21. Химерный белок растворяют в 0,1 М НС1 до концентрации белка 1 мг/мл, расщепляют бромцианом 18 часов в темноте, используя 600-кратный молярный избыток бромциана. Растворитель и избыток бромциана удаляют на вакуумном концентраторе, далее смесь продуктов гидролиза наносят на колонку с обращенной фазой сорбента Jupiter С 18 (10x250 mm, Phenomenex, Torrance, СА, USA). Фракционирование проводят в линейном градиенте концентрации ацетонитрила в 0,1%-ной (v/v) трифторуксусной кислоте. Контроль чистоты полученного рекомбинантного пептида проводят методом масс-спектрометрического анализа.
Пример 2
Подтверждение правильности фолдинга рекомбинантного аналога
Проводят тестированием методом in vitro на культуре клеток СНО, стабильно экспрессирующей ионный канал TRPV1. Стабильную линию клеток размораживают из криобанка и ведут не менее 2 недель на питательной среде (DMEM / 10% фетальная телячья сыворотка / 1% PS (пенициллин/стрептомицин)) с добавлением смеси антибиотиков B/Z (Blasticidin S (5 мкг/ мл), zeocin (250 мкг/мл)), в стерильных матрасах при 37°С в присутствии 5% ССЬ, регулярно пересаживая через каждые 2-3 дня. Для измерения клетки высевают в 96-луночные планшеты с черными стенками и прозрачным дном в количестве 75000 штук на лунку и культивируют ночь при 37°С в присутствии 5% СО 2 в полной среде без антибиотиков PS, содержащей 1 мкг/мл тетрациклина.
Клетки окрашивают цитоплазматическим кальциевым индикатором Fluo-4AM с использованием методики и готовых растворов для анализа кальция Fluo-4 Direct™ (Invitrogene) и последовательно инкубируют в темноте при 37°С 45-60 минут и далее при 25°С в течение 45-60 минут. Измерения проводят при комнатной температуре с использованием планшетного спектрофотометра, укомплектованного встроенной автоматической системой дозирования жидкости, NOVOstar (BMG LABTECH, Германия). Селективные ионные токи через ионный канал TRPV1 (разгорание красителя за счет повышения концентрации внутриклеточного кальция) вызывают добавлением 3 мкМ раствора капсаицина дозирующим устройством в каждую лунку в ходе измерения. Флуоресцентные сигналы регистрируют снизу при следующих параметрах (Лех 485 нМ, Лет = 520 нМ, интервал измерения каждые 2 с по 10 вспышек). В качестве отрицательного контроля используют клетки СНО без ионного канала TRPV1, максимальную флуоресценцию определяют через 20 секунд после добавления капсаицина. Тестируемый пептид HCRG21 вносят в лунку перед началом измерения так, чтобы его конечная концентрация равнялась 30 нМ, в контрольные лунки вносят равный объем буферного раствора. Пептид HCRG21 вызывает достоверное снижение уровня внутриклеточного кальция (фиг. 1), рассчитанного как разница между максимальной и базовой флуоресценции (dFl), деленная на базовую флуоресценцию (Fl0). Усредняют результаты по 9 независимым измерениям, достоверность отличий между контрольной и экспериментальной группой определяют t-критерием Стьюдента.
Пример 3
Тестирование анальгетического действия пептида HCRG21 на мышах в тесте «горячая пластина» при различных способах введения
Мышей делят на 19 групп (3 контрольные и 16 экспериментальных) по 9 особей в каждой. Тесты проводят на самцах белых мышей линии ICR массой 20-30 г. Болевое раздражение моделируют, помещая мышь на металлическую поверхность прибора, разогретую до 55°С. Для предотвращения ожогов лап время воздействия раздражения ограничивают 60 секундами. Тестируемый образец пептида HCRG21 растворяют в стерильном физиологическом растворе и вводят в дозе 0,01, 0,05, 0,1, 0,5 и 1 мг/кг. Для определения наиболее эффективного способа используют различные маршруты введения: внутримышечно, внутривенно, интраназально. Пептид АРНС1 применяют как контроль для сравнения эффективности обезболивающего действия в тех же условиях при внутримышечном и внутривенном введении. Контрольные животные получают эквивалентный объём стерильного физиологического раствора. Анальгетический эффект измеряют по увеличению времени, прошедшего от момента посадки животного на пластину до момента первого подпрыгивания. Измерение болевой чувствительности проводят через 60 мин после внутримышечного (фиг. 2), через 30 мин после внутривенного (фиг. 3) и через 120 мин после интраназального (фиг. 4) введения препаратов. На основании полученных результатов определяют, что при внутримышечном введении анальгетический эффект пептида HCRG21 наступает в дозе 0,1 мг/кг, при этом АРНС1 обладает немного большим эффектом, который сопоставим с эффектом HCRG21 в дозе 0,5 мг/кг. При повышении дозы до 1 мг/кг происходит незначительное снижение эффективности обоих пептидов (фиг. 2). При внутривенном введении контрольный образец эффективен в диапазоне доз 0,01-1 мг/кг, тогда как HCRG21 в диапазоне 0,1-1 мг/кг (фиг. 3). При интраназальном введении активность пептида HCRG21 сохраняется в той же минимальной дозе 0,1 мг/кг. Результаты обрабатывают статистически, достоверность отличий результатов контрольной и экспериментальной группы определяют с помощью теста Стьюдента. Получают, что в дозе 0,1 мг/кг пептид HCRG21 эффективно снижает болевую чувствительность при любых способах введения.
Пример 4
Тестирование длительности анальгетического действия пептида HCRG21 на мышах в тесте «горячая пластина» при внутримышечном введении
Мышей делят на 24 группы (контрольные и экспериментальные) по 9 особей в каждой. Тесты проводят на самцах белых мышей линии ICR массой 20-30 г. Болевое раздражение моделируют, помещая мышь на металлическую поверхность прибора, разогретую до 55°С. Для предотвращения ожогов лап время воздействия раздражения ограничивают 60 сек. Тестируемый образец пептида HCRG21 растворяют в стерильном физиологическом растворе и вводят в дозе 0,1 мг/кг внутримышечно. Пептид АРНС1 применяют как контроль для сравнения длительности обезболивающего действия в той же концентрации при тех же условиях. Контрольные животные получают эквивалентный объем стерильного физиологического раствора. Анальгетический эффект измеряют по увеличению времени, прошедшего от момента посадки животного на пластину до момента первого подпрыгивания (фиг. 5). Измерение болевой чувствительности проводят через 5 мин, 15 мин, 1, 2, 3, 6, 13 и 24 ч после введения препарата. На основании полученных результатов определяют, что анальгетическое действие HCRG21 развивается постепенно, достоверно отлично от контроля к 1 ч (максимальный эффект 2 ч), является пролонгированным (не менее 13 ч). Это отличает действие пептида HCRG21 от аналога АРНС1, который быстро дает анальгетический эффект, но только на 2 часа. Каждая мышь используется только для одного измерения анальгетического эффекта. Результаты обрабатывают статистически, достоверность отличий результатов контрольной и экспериментальной группы определяют с помощью теста Стьюдента.
Пример 5 Тестирование длительности анальгетического действия пептида HCRG21 на мышах в тесте «горячая пластина» при различных способах введения
Мышей делят на 8 групп (4 контрольные и 4 экспериментальные) по 7 особей в каждой. Тесты проводят на самцах белых мышей линии ICR массой 20-30 г. Болевое раздражение моделируют, помещая мышь на металлическую поверхность прибора, разогретую до 55°С. Для предотвращения ожогов лап время воздействия раздражения ограничивают 60 сек.
Тестируемый образец пептида HCRG21 растворяют в стерильном физиологическом растворе и вводят в дозе 0,1 мг/кг внутривенно и подкожно. Контрольные животные получают эквивалентный объем стерильного физиологического раствора. Анальгетический эффект измеряют по увеличению времени, прошедшего от момента посадки животного на пластину до момента первого подпрыгивания (фиг. 6). Измерение болевой чувствительности проводят через 2 и 13 ч после введения препарата.
На основании полученных результатов определяют, что анальгетическое действие HCRG21 достоверно отлично от контроля и является пролонгированным (не менее 13 ч) как в случае подкожного (фиг. 6А), так и в случае внутривенного введения (фиг. 6Б). Каждая мышь используется только для одного измерения анальгетического эффекта. Результаты обрабатывают статистически, достоверность отличий результатов контрольной и экспериментальной группы определяют с помощью теста Стьюдента.
Пример 6
Тестирование анальгетического действия пептида HCRG21 в капсаициновом тесте
Тестирование проводят на самцах белых мышей линии ICR массой 20-30 г. Мышей делят на 3 группы (контрольную и экспериментальные) по 9 особей в каждой. Тестируемый пептид HCRG21 растворяют в стерильном физиологическом растворе и вводят внутримышечно в дозе 0,1 мг/кг. Пептид АРНС1 применяют как контроль для сравнения эффекта в той же концентрации при тех же условиях. Контрольные животные получают эквивалентный объем стерильного физиологического раствора. Через 60 минут всем мышам в подушечку задней лапы вводят 20 мкл смеси (соотношение 1:9 (v/v)) 10% спиртового раствора капсаицина с физиологическим раствором. Количество капсаицина в 20 мкл смесевого раствора составляет 3 мкг. После инъекции капсаицина немедленно начинают наблюдение за поведением мыши и регистрируют время начала реакции животного на индукцию боли (первое облизывание или подёргивание повреждённой лапы), далее подсчитывают количество и продолжительность облизывания повреждённой лапы. Наблюдение за каждым животным проводится в течение 15 мин. Результаты обрабатывают статистически, достоверность отличий результатов контрольной и экспериментальной группы определяют с помощью теста Стьюдента.
Анальгетический эффект измеряют по увеличению времени, прошедшего от момента посадки животного на пластину до момента начала реакции животного на индукцию боли (фиг. 7А), а также уменьшению продолжительности (фиг. 7Б) и количества (фиг. 7В) облизываний повреждённой лапы. На основании полученных результатов определяют, что анальгетическое действие HCRG21 выражается в снижении чувствительности животных к раздражающему действию капсаицина: уменьшается интенсивность и время облизывания раздражённой лапы более чем в 2,5 раза и увеличивается в 3,5 раза время начала поведенческих реакций животного на индукцию боли по сравнению с контрольной группой. Анальгетическое действие пептида сравнения АРНС1 является менее выраженным по всем трем регистрируемым параметрам.
Пример 7
Тестирование противовоспалительного действия пептида HCRG21 в модели тепловой гиперчувствительности
Тесты проводят на самцах белых мышей линии ICR массой 20-30 г. Мышей делят на 2 группы (контрольную и экспериментальную) по 9 особей в каждой. Мышам экспериментальной группы в подушечку задней лапы вводят воспалительный агент, представляющий собой 20 мкл смеси полного адьюванта Фрейнда и физраствора в соотношении 1:1 (v/v). Через 24 часа животным внутримышечно вводят 200 мкл раствора тестируемого пептида HCRG21 в стерильном физиологическом растворе в дозе 0,1 мг/кг; животным контрольной группы вводят 200 мкл физиологического раствора. Измерение проводят через 60 минут после введения. Фиксируют латентное время отдергивания лапы, подвергшейся действию воспалительного агента, от горячей пластины (t = 53°C). Анальгетический эффект измеряют по увеличению времени прошедшего от момента посадки животного на пластину до момента первого облизывания задней лапы (фиг. 8). Результаты обрабатывают статистически, достоверность отличий результатов контрольной и экспериментальной группы определяют с помощью с помощью теста Стьюдента.
Пример 8
Тестирование анальгетического действия пептида HCRG21 в формалиновом тесте Тесты проводят на самцах белых мышей линии ICR массой 20-30 г. Мышей делят на 4 группы (контрольную и экспериментальные) по 9 особей в каждой. Тестируемый пептид HCRG21 растворяют в стерильном физиологическом растворе и вводят внутримышечно в дозах 0,1 и 1,0 мг/кг. Контрольные животные получают эквивалентный объем стерильного физиологического раствора. Ибупрофен в дозе 100 мг/кг применяют в качестве положительного контроля и вводят животным перорально. Через 60 минут всем мышам в подушечку задней лапы вводят 20 мкл 2,5% раствора формалина. Сразу после введения подсчитывают паттерны болевой реакции (количество актов облизывания и время поджатая задней лапы) в следующем режиме:
1-й период (острый): в течение 20 мин после инъекции паттерны подсчитывают за 1 мин через 6-минутные интервалы (0, 6, 12, 18 мин);
2-й период (тонический): спустя 30 мин после введения формалина паттерны подсчитывали в течение 20 мин за 1 мин через 6-минутные интервалы (30, 36, 42, 48 мин).
Анальгетический эффект оценивают по уменьшению продолжительности паттернов болевой реакции относительно контрольных животных (фиг. 9). Результаты обрабатывают статистически, достоверность отличий результатов контрольной и экспериментальной группы определяют с помощью с помощью теста Стьюдента.
На основании полученных результатов определяют, что анальгетическое действие HCRG21 выражается в значительном уменьшении количества актов облизывания и времени поджатая задней лапы как в I фазе острого периода формалинового теста (0-10 мин), характеризующей взаимодействие с ноцицептрорами, так и во II фазе (спустя 10-15 мин), блокируя опосредованную pH или модулированную активацию TRPV1, которая происходит во время воспаления. Ибупрофен (типичный анальгетик группы НПВС) намного проигрывает по своим анальгетическим свойствам пептиду HCRG21.
Пример 9
Тестирование анальгетического действия пептида HCRG21 в модели боли, вызванной воспалением, индуцированным введением каррагинана
Тесты проводят на самцах белых мышей линии ICR массой 20-30 г. Мышей делят на 4 группы (контрольную и экспериментальные) по 9 особей в каждой. Тестируемый пептид HCRG21 растворяют в стерильном физиологическом растворе и вводят внутримышечно в дозах 0,1 и 1,0 мг/кг. Контрольные животные получают эквивалентный объем стерильного физиологического раствора. Ибупрофен в дозе 100 мг/кг применяют в качестве положительного контроля и вводят животным перорально. Через 60 минут всем мышам в подушечку задней лапы вводят 20 мкл 1 % раствора каррагинана. Сразу после введения измеряют силу сдавливания щипцами (значения больше 300 принимаются за 300). Анальгетический эффект оценивают по увеличению силы воздействия относительно контрольных животных (фиг. 10). Результаты обрабатывают статистически, достоверность отличий результатов контрольной и экспериментальной группы определяют с помощью теста Стьюдента. Статистически значимый анальгетический эффект HCRG21 проявляется в дозе 1 мг/кг и выражается в увеличении силы воздействия, что значительно превосходит показатели (доза и сила воздействия), которые наблюдаются для ибупрофена.
Пример 10
Тестирование противовоспалительного действия пептида HCRG21 в модели острого локального воспаления, индуцированного введением каррагинана
Тесты проводят на самцах белых мышей линии ICR массой 20-30 г. Мышей делят на 4 группы (контрольную и экспериментальные) по 6 особей в каждой. Тестируемый пептид HCRG21 растворяют в стерильном физиологическом растворе и вводят внутривенно в дозах 0,1 и 1,0 мг/кг. Контрольные животные получают эквивалентный объем стерильного физиологического раствора. Индом етацин в дозе 10 мг/кг применяют в качестве положительного контроля и вводят животным перорально. Всем животным измеряют объем задней правой лапы при помощи плетизмометра (Ugo Basile). Через 30 минут мышам, подвергнутым внутривенному введению физиологического раствора или пептида HCRG21, и через 60 минут мышам, получавшим перорально индометацин, в подушечку задней правой лапы вводят 20 мкл 1 % раствора каррагинана (Sigma, США). Затем при помощи плетизмометра проводят измерение образовавшегося отека через 1, 2, 3, 4 и 24 часа. Результаты обрабатывают статистически, достоверность отличий результатов контрольной и экспериментальной группы определяют с помощью теста Стьюдента. Статистически значимый противовоспалительный эффект HCRG21 проявляется в дозах 0,1 и 1 мг/кг и выражается в меньшем объеме отека по сравнению с контролем и сравнимым с таковым в результате применения индометацина, противовоспалительного препарата группы НПВС, в дозе 10 мг/кг (фиг. 11).
Пример 11
Влияние пептида HCRG21 на температуру тела Тесты проводят на самцах белых мышей линии ICR массой 20-30 г. Мышей делят на 3 группы (контрольную и экспериментальные) по 9 особей в каждой. Тестируемый образец пептида HCRG21 растворяют в стерильном физиологическом растворе и вводят в дозе 0,1 мг/кг внутримышечно. Пептид АРНС1 применяют как контроль для сравнения активности в той же концентрации при тех же условиях. Контрольные животные получают эквивалентный объем стерильного физиологического раствора. С помощью электронного термометра, введенного ректально, измеряют исходную температуру тела (0 мин), далее проводят измерения спустя 60, 180 и 360 мин после введения пептидов (фиг. 12). Результаты обрабатывают статистически, достоверность отличий результатов контрольной и экспериментальной группы определяют с помощью теста Стьюдента.
Оба пептида вызывают статистически значимое понижение температуры тела животных на 0,7-1,0°С на 60 минуте после введения, при этом HCRG21 проявляет более длительный гипотермический эффект, который наблюдают даже спустя 360 мин, с максимальным снижением температуры на 1,5 градуса через 180 мин после введения.
Пример 12
Влияние пептида HCRG21 на температуру тела при различных способах введения
Тесты проводят на самцах белых мышей линии ICR массой 20-30 г. Мышей делят на 4 группы (контрольную и экспериментальные) по 7 особей в каждой. Тестируемый образец пептида HCRG21 растворяют в стерильном физиологическом растворе и вводят в дозе 0,1 мг/кг интраназально, подкожно и внутривенно. Контрольные животные получают эквивалентный объем стерильного физиологического раствора. С помощью электронного термометра, введенного ректально, измеряют исходную температуру тела (0 мин), далее проводят измерения спустя 1, 3 и 6 и 13 часов после введения пептида (фиг. 13). Результаты обрабатывают статистически, достоверность отличий результатов контрольной и экспериментальной группы определяют с помощью теста Стьюдента.
Пептид HCRG21 вызывает статистически значимое понижение температуры тела животных на 0,4-0, 5°С на 60 минуте после внутривенного и интраназального введения, при этом HCRG21 проявляет длительный гипотермический эффект, который наблюдают даже спустя 13 часов, после интраназального введения.
Пример 13
Тестирование локомоторной активности в тесте «Открытое поле» Для анализа возможного нейротоксического или раздражающего действия тестируемого пептида HCRG21 проводят оценку его влияния на локомоторную активность и поведение животных в тесте «Открытое поле» с помощью автоматического актометра «OPTO-VARIMEX АТМЗ AUTO SYSTEM». Тесты проводят на самцах белых мышей линии ICR массой 20-30 г. Мышей делят на 7 групп (контрольную и экспериментальные) по 8 особей в каждой. Тестируемый образец растворяют в стерильном физиологическом растворе и вводят в дозах 0,01-1,0 мг/кг внутримышечно. Пептид АРНС1 применяют как контроль для сравнения активности в той же концентрации при тех же условиях. Контрольные животные получают эквивалентный объем стерильного физиологического раствора. Спустя 55 мин после введения веществ, животное помещают на исследовательскую площадку прибора. Время пребывания животного на поле составляет 3 мин. Регистрируют показатели двигательной деятельности: пройденное расстояние (DT - Ambulatory distance traveled by the subject), время отсутствия перемещения животного (RT - Resting time), время перемещения животного (AT - Ambulatory time, when the subject), количество принятия животным вертикального положения (V1C/V1B rearing).
Данные для каждой группы заносят в таблицу, результаты представляют как среднее значение ± SEM. Достоверные отличия представляют относительно контрольной группы (1%-ный PBS), *— р < 0,05, **— р < 0,01.
Таблица
Figure imgf000022_0001
PBS 779,4±14 69,3±2,9 110,7±2,9 10,7±2,5
APHC1 - 1мг/кг 851±17,2 70,6±4,3 109,4±4,2 10,2±2,6
Изменение от конт, % 9,2 1,9 1,2 - 4,3
Figure imgf000022_0002
АРНС1 - 0,01 мг/кг 892,9±13 68,4±3,9 104,1±3,6 19,5±2,4* Изменение от конт, % 14,5 -1,3 -5,9 82,0
Figure imgf000022_0003
HCRG21 - 0,1 мг/кг 1399,4±26,9* 56,1±5,1 123,9±5,1 21,5±3,3*
Изменение от конт, % 79,5 -19,0 11,9 100,7
Figure imgf000022_0004
Figure imgf000023_0001
Статистический анализ по критерию Стьюдента показывает, что, по сравнению с контрольной группой, у животных в опытных группах не наблюдается дозозависимых достоверных отличий по анализируемым параметрам. Тестируемый пептид HCRG21 и контрольный АРНС1 не проявляют ярко-выраженного депрессивного действия на ЦНС, их введение в дозе 0,1 мг/кг наоборот приводит к слабому усилению двигательной активности. Так как в исследуемых дозах оба пептида не оказывают побочного нейротоксического действия на организм животных считают, что все специфические эффекты анальгезии являются прямыми.
Промышленная применимость
Приведенные выше примеры доказывают, что пептид HCRG21 проявляет анальгетическую активность на млекопитающих при различных способах введения (внутримышечно, внутривенно, подкожно и интраназально).
Эффект пептида HCRG21 изучался в пяти различных тестах на диком типе мышей, что подтверждает возможность использования пептида как анальгетика для купирования болевых синдромов различной этиологии. Тест «горячая пластина» является наиболее связанным с ингибированием ионного канала TRPV 1 , поскольку TRPV 1 играет важную роль в ощущении температуры. В связи с тем, что капсаицин является селективным агонистом канала TRPV1, эффективность пептида тестируют в качестве антагониста этого рецептора в модели боли, вызванной капсаицином. Инъекция капсаицина моделирует боль от различных провоспалительных эндогенных и экзогенных лигандов, что проявляется в облизывании и встряхивании инъецированной лапы. Формалиновый тест представляет собой сложную модель боли in vivo, в которой оценивают не только анальгетическую активность, а противовоспалительное действие в целом. У мышей инъекции формалина вызывают двухфазную поведенческую реакцию. Первая фаза (острая) длится в течение первых 10 минут после введения формалина и обусловлена прямой стимуляцией ноцицепторов; вторая фаза (хроническая) фиксируется спустя 10-15 минут после введения формалина и длится в течение 20-40 минут, связана с механизмами развития нейрогенного воспаления и сенсибилизацией ЦНС. Термическая гиперальгезия, индуцированная введением полного адьюванта Фрейнда (CFA), еще один вариант воспалительной модели, в котором задействованы различные пути воспаления. Введение каррагинана вызывает развитие воспалительного процесса и как следствие боль, которая обусловлена активацией таких ноцицепторов, как TRPA1 и TRPV1, посредством медиаторов воспаления и изменения (уменьшения) кислотности.
Контрольный пептид АРНС1 используют во многих экспериментах для сравнения. HCRG21 показывает более длительное анальгетическое действие (не менее 13 ч), чем АРНС1 (менее 3 ч), при внутримышечном способе введения в дозе 0,1 мг/кг (фиг. 5). HCRG21 обладает более длительным (8 с) латентным периодом первой реакции на боль, вызванную капсаицином, меньшим временем (59 с) и меньшим количеством актов облизывания соответствующей лапы (10 с), в отличие от АРНС1 (5, 9, 110 и 18 с соответственно) при внутримышечном введении в дозе 0,1 мг/кг (фиг. 7). HCRG21, по сравнению с АРНС1, оказывает более длительный гипотермический эффект, который наблюдается даже спустя 360 мин после введения (фиг. 12).
Заявляемое средство проявляет достоверный анальгетический эффект при внутримышечном введении в формалиновом тесте в дозе 0,1 -1,0 мг/кг, превосходящий эффект ибупрофена, широко применяемого на практике анальгетического и противовоспалительного препарата (фиг. 9).
HCRG21 в тесте открытое поле не оказывает негативного воздействия на ЦНС (таблица), и его анальгетическое и противовоспалительное действие относится к эффекту специфического ингибирования канала TRPV 1.
Все вышеперечисленное позволяет использовать пептид HCRG21 индивидуально или как активный компонент готовой лекарственной формы обезболивающего средства для нужд ветеринарии и медицины. Лекарственные препараты, содержащие заявляемое средство в качестве активной формы, могут вводиться парентерально или интраназально.
Все публикации или патенты, процитированные в настоящем документе, включены во всей своей полноте в настоящий документ путем отсылки, поскольку они показывают уровень техники на момент настоящего изобретения и/или обеспечивают описание и реализацию настоящего изобретения.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Е Пептид HCRG21 для применения в качестве лекарственного средства, обладающего пролонгированным анальгетическим, противовоспалительным и/или гипотермическим действием.
2. Пептид HCRG21 по п. 1, где пептид HCRG21 получают рекомбинантным путем.
3. Пептид HCRG21 по п. 2, где пептид HCRG21 применяют парентерально или интраназально в дозе не менее 0,1 мг/кг.
4. Пептид HCRG21 по п. 2, где пептид HCRG21 применяют у млекопитающих, в частности человека.
5. Пептид HCRG21 по пп. 2-4, где пептид HCRG21 применяют для снятия болевых ощущений, вызванных полосными операциями, суставными и онкологическими болями.
6. Пептид HCRG21 для применения в качестве лекарственного средства, для лечения острых и хронических заболеваний, таких как мигрень, остеоартрит, кашель, гиперактивное состояние мочевого пузыря, воспалительное заболевание дыхательных путей, астма, воспалительные заболевания кишечника, синдром раздраженного кишечника, диабет, дерматит.
7. Пептид HCRG21 по п. 6, где пептид HCRG21 получают рекомбинантным путем.
PCT/RU2021/050133 2020-05-20 2021-05-19 Средство пролонгированного анальгетического действия WO2021235983A1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP21809722.8A EP4154899A1 (en) 2020-05-20 2021-05-19 Drug with prolonged analgesic action

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2020117918A RU2755206C1 (ru) 2020-05-20 2020-05-20 Средство пролонгированного анальгетического действия и лекарственный препарат на его основе
RU2020117918 2020-05-20

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2021235983A1 true WO2021235983A1 (ru) 2021-11-25

Family

ID=77745581

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2021/050133 WO2021235983A1 (ru) 2020-05-20 2021-05-19 Средство пролонгированного анальгетического действия

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP4154899A1 (ru)
RU (1) RU2755206C1 (ru)
WO (1) WO2021235983A1 (ru)

Citations (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US566378A (en) 1896-08-25 Fence-post
US4313958A (en) 1980-10-24 1982-02-02 The Procter & Gamble Company Method of producing analgesia
US4599342A (en) 1984-01-16 1986-07-08 The Procter & Gamble Company Pharmaceutical products providing enhanced analgesia
US5178879A (en) 1992-04-17 1993-01-12 Michael Adekunle Capsaicin gel
US5188837A (en) 1989-11-13 1993-02-23 Nova Pharmaceutical Corporation Lipsopheres for controlled delivery of substances
RU2151014C1 (ru) 1999-06-22 2000-06-20 "МАТИ" - Российский государственный технологический университет им. К.Э. Циолковского Способ получения труб из волокнистых композиционных материалов с продольным армированием
US6239180B1 (en) 1995-11-08 2001-05-29 The Regents Of The University Of California Transdermal therapeutic device and method with capsaicin and capsaicin analogs
US6248788B1 (en) 1996-11-06 2001-06-19 The Regents Of The University Of California Therapeutic method with capsaicin and capasicin analogs
WO2007042906A1 (en) 2005-10-07 2007-04-19 Glenmark Pharmaceuticals S.A. Substituted benzofused derivatives and their use as vanilloid receptor ligands
WO2007045462A2 (de) 2005-10-19 2007-04-26 Grünenthal GmbH Neue vanilloid-rezeptor liganden und ihre verwendung zur herstellung von arzneimitteln
WO2008006481A1 (en) 2006-07-10 2008-01-17 Pharmeste S.R.L. Vr1 vanilloid receptor antagonists with a iononic substructure
WO2008006480A1 (en) 2006-07-10 2008-01-17 Pharmeste S.R.L. Biarylcarboxyarylamides as vanilloid-1 receptor modulators
WO2008010061A2 (en) 2006-07-17 2008-01-24 Glenmark Pharmaceuticals S.A. 3-azabicyclo [3.1.0] hexane vanilloid receptor ligands, pharmaceutical compositions containing them, and processes for their preparation
WO2008046647A1 (de) 2006-10-19 2008-04-24 Grünenthal GmbH VR1-REZEPTOR-LIGANDEN UND μ-OPIOID-REZEPTOR-LIGANDEN ZUR BEHANDLUNG VON SCHMERZ
WO2008059339A2 (en) 2006-11-13 2008-05-22 Glenmark Pharmaceuticals S.A. Isoquinoline derivatives as vanilloid receptor modulators
WO2008075150A1 (en) 2006-12-21 2008-06-26 Pharmeste S.R.L. O-substituted-dibenzyl urea-derivatives as trpv1 receptor antagonists
WO2008091021A1 (ja) 2007-01-24 2008-07-31 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. ヘテロシクリデン－ｎ－（アリール）アセトアミド誘導体
WO2008110863A1 (en) 2007-03-15 2008-09-18 Glenmark Pharmaceuticals S.A. Indazole derivatives and their use as vanilloid receptor ligands
WO2008125337A2 (de) 2007-04-16 2008-10-23 Grünenthal GmbH Neue vanilloid-rezeptor liganden und ihre verwendung zur herstellung von arzneimitteln
WO2008125342A2 (de) 2007-04-16 2008-10-23 Grünenthal GmbH Vanilloid-rezeptor-liganden und ihre verwendung zur herstellung von arzneimitteln
WO2008125295A2 (de) 2007-04-13 2008-10-23 Grünenthal GmbH Neue vanilloid-rezeptor liganden und ihre verwendung zur herstellung von arzneimitteln
WO2008125296A1 (de) 2007-04-13 2008-10-23 Grünenthal GmbH Vanilloid-rezeptor liganden und ihre verwendung zur herstellung von arzneimitteln
WO2009010824A1 (en) 2007-07-13 2009-01-22 Glenmark Pharmaceuticals, S.A. Dihydrochromenopyrazole derivatives as vanilloid receptor ligands
WO2009034433A2 (en) 2007-09-10 2009-03-19 Glenmark Pharmaceuticals, S.A. 3-azabicyclo [3.1.0] hexane derivatives as vanilloid receptor ligands
WO2009081219A1 (en) 2007-12-20 2009-07-02 Glenmark Pharmaceuticals, S.A. Quinazoline derivatives as vanilloid receptor modulators
WO2009081222A1 (en) 2007-12-21 2009-07-02 Glenmark Pharmaceuticals, S.A. Substituted tricyclic pyridine or pyrimidine vanilloid receptor ligands
WO2009090548A2 (en) 2008-01-17 2009-07-23 Glenmark Pharmaceuticals, S.A. 3-azabicyclo [3.1.0] hexane derivatives as vanilloid receptor ligands
WO2009095726A1 (en) 2008-01-29 2009-08-06 Glenmark Pharmaceuticals, S.A. Acrylamide derivatives as vanilloid receptor 1 modulators
RU2368621C1 (ru) 2008-04-04 2009-09-27 Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН Полипептид актинии, обладающий анальгетическим действием
RU2379282C2 (ru) 2004-07-30 2010-01-20 Индена С.П.А. Агонисты trpv1, содержащие их препараты и их применение
RU2396261C2 (ru) 2004-06-08 2010-08-10 Новартис Аг Производные хиназолинона, полезные в качестве ванилоидных антагонистов
RU2404245C1 (ru) 2009-07-09 2010-11-20 Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН Полипептид актинии, обладающий анальгетическим действием
EP2352726A1 (en) 2008-10-17 2011-08-10 Abbott Laboratories Trpv1 antagonists
RU2448108C2 (ru) 2006-07-27 2012-04-20 Эморпасифик Корпорейшн Новые соединения, их изомер или их фармацевтически приемлемые соли в качестве антагониста ванилоидного рецептора и содержащая их фармацевтическая композиция
RU2450006C2 (ru) 2006-04-18 2012-05-10 Эбботт Лэборетриз Антагонисты ванилоидного рецептора подтипа 1(vr1) и их применение
RU2452733C2 (ru) 2007-04-27 2012-06-10 Пэдью Фарма Л.П. Антагонисты trpv1 и их применение
RU2458055C2 (ru) 2006-08-11 2012-08-10 Астразенека Аб Производные бензимидазола в лечении расстройств, ассоциированных с ванилоидным рецептором trpv1
RU2506077C1 (ru) 2013-01-25 2014-02-10 Общество С Ограниченной Ответственностью "Валента-Интеллект" Комбинация для профилактики, коррекции и терапии боли, связанной с нейродегенерацией или ассоциированной с соматоформными расстройствами
RU2541127C1 (ru) 2013-11-15 2015-02-10 Закрытое акционерное общество "Институт экспериментальной фармакологии" Анальгетическое средство пептидной структуры на основе ундекапептида, содержащего d-октааргининовый вектор
JP2016047822A (ja) 2002-12-18 2016-04-07 センタクシオン・ワン・インコーポレイテッド カプサイシノイドの投与
RU2619170C2 (ru) 2015-09-18 2017-05-12 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А.Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) Рекомбинантная плазмидная ДНК pER-APHC3, кодирующая гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием APHC3, штамм Escherichia coli C3030/pER-APHC3 продуцент указанных белков и способ получения рекомбинантного APCH3
RU2621708C2 (ru) 2011-06-22 2017-06-07 ПУРДЬЮ ФАРМА Эл. Пи. Антагонисты trpv1, включающие дигидроксигруппу в качестве заместителя, и их применение
US20170266139A1 (en) 2002-12-18 2017-09-21 Centrexion Therapeutics Corporation Injectable resiniferatoxin
RU2648445C1 (ru) 2016-11-03 2018-03-26 Светлана Асылхановна Астафьева 6-(3,3- диметил-3,4-дигидроизохинолин-1-ил) аминогексановая кислота и фармацевтическая композиция на ёе основе, обладающие анальгетической активностью

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2656188C1 (ru) * 2017-05-03 2018-06-04 Общество с ограниченной ответственностью "Анкрим" (ООО "Анкрим") Синтетическое анальгетическое средство пептидной природы и способ его применения

Patent Citations (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US566378A (en) 1896-08-25 Fence-post
US4313958A (en) 1980-10-24 1982-02-02 The Procter & Gamble Company Method of producing analgesia
US4599342A (en) 1984-01-16 1986-07-08 The Procter & Gamble Company Pharmaceutical products providing enhanced analgesia
US5188837A (en) 1989-11-13 1993-02-23 Nova Pharmaceutical Corporation Lipsopheres for controlled delivery of substances
US5178879A (en) 1992-04-17 1993-01-12 Michael Adekunle Capsaicin gel
US6239180B1 (en) 1995-11-08 2001-05-29 The Regents Of The University Of California Transdermal therapeutic device and method with capsaicin and capsaicin analogs
US6248788B1 (en) 1996-11-06 2001-06-19 The Regents Of The University Of California Therapeutic method with capsaicin and capasicin analogs
RU2151014C1 (ru) 1999-06-22 2000-06-20 "МАТИ" - Российский государственный технологический университет им. К.Э. Циолковского Способ получения труб из волокнистых композиционных материалов с продольным армированием
US20170266139A1 (en) 2002-12-18 2017-09-21 Centrexion Therapeutics Corporation Injectable resiniferatoxin
JP2016047822A (ja) 2002-12-18 2016-04-07 センタクシオン・ワン・インコーポレイテッド カプサイシノイドの投与
RU2396261C2 (ru) 2004-06-08 2010-08-10 Новартис Аг Производные хиназолинона, полезные в качестве ванилоидных антагонистов
RU2379282C2 (ru) 2004-07-30 2010-01-20 Индена С.П.А. Агонисты trpv1, содержащие их препараты и их применение
WO2007042906A1 (en) 2005-10-07 2007-04-19 Glenmark Pharmaceuticals S.A. Substituted benzofused derivatives and their use as vanilloid receptor ligands
WO2007045462A2 (de) 2005-10-19 2007-04-26 Grünenthal GmbH Neue vanilloid-rezeptor liganden und ihre verwendung zur herstellung von arzneimitteln
RU2450006C2 (ru) 2006-04-18 2012-05-10 Эбботт Лэборетриз Антагонисты ванилоидного рецептора подтипа 1(vr1) и их применение
WO2008006480A1 (en) 2006-07-10 2008-01-17 Pharmeste S.R.L. Biarylcarboxyarylamides as vanilloid-1 receptor modulators
RU2468020C2 (ru) 2006-07-10 2012-11-27 Фарместе С.Р.Л. Биарилкарбоксиариламиды как модуляторы ванилоидного рецептора типа 1
WO2008006481A1 (en) 2006-07-10 2008-01-17 Pharmeste S.R.L. Vr1 vanilloid receptor antagonists with a iononic substructure
WO2008010061A2 (en) 2006-07-17 2008-01-24 Glenmark Pharmaceuticals S.A. 3-azabicyclo [3.1.0] hexane vanilloid receptor ligands, pharmaceutical compositions containing them, and processes for their preparation
RU2448108C2 (ru) 2006-07-27 2012-04-20 Эморпасифик Корпорейшн Новые соединения, их изомер или их фармацевтически приемлемые соли в качестве антагониста ванилоидного рецептора и содержащая их фармацевтическая композиция
RU2458055C2 (ru) 2006-08-11 2012-08-10 Астразенека Аб Производные бензимидазола в лечении расстройств, ассоциированных с ванилоидным рецептором trpv1
WO2008046647A1 (de) 2006-10-19 2008-04-24 Grünenthal GmbH VR1-REZEPTOR-LIGANDEN UND μ-OPIOID-REZEPTOR-LIGANDEN ZUR BEHANDLUNG VON SCHMERZ
WO2008059339A2 (en) 2006-11-13 2008-05-22 Glenmark Pharmaceuticals S.A. Isoquinoline derivatives as vanilloid receptor modulators
WO2008075150A1 (en) 2006-12-21 2008-06-26 Pharmeste S.R.L. O-substituted-dibenzyl urea-derivatives as trpv1 receptor antagonists
WO2008091021A1 (ja) 2007-01-24 2008-07-31 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. ヘテロシクリデン－ｎ－（アリール）アセトアミド誘導体
WO2008110863A1 (en) 2007-03-15 2008-09-18 Glenmark Pharmaceuticals S.A. Indazole derivatives and their use as vanilloid receptor ligands
WO2008125296A1 (de) 2007-04-13 2008-10-23 Grünenthal GmbH Vanilloid-rezeptor liganden und ihre verwendung zur herstellung von arzneimitteln
WO2008125295A2 (de) 2007-04-13 2008-10-23 Grünenthal GmbH Neue vanilloid-rezeptor liganden und ihre verwendung zur herstellung von arzneimitteln
WO2008125342A2 (de) 2007-04-16 2008-10-23 Grünenthal GmbH Vanilloid-rezeptor-liganden und ihre verwendung zur herstellung von arzneimitteln
WO2008125337A2 (de) 2007-04-16 2008-10-23 Grünenthal GmbH Neue vanilloid-rezeptor liganden und ihre verwendung zur herstellung von arzneimitteln
RU2452733C2 (ru) 2007-04-27 2012-06-10 Пэдью Фарма Л.П. Антагонисты trpv1 и их применение
WO2009010824A1 (en) 2007-07-13 2009-01-22 Glenmark Pharmaceuticals, S.A. Dihydrochromenopyrazole derivatives as vanilloid receptor ligands
WO2009034433A2 (en) 2007-09-10 2009-03-19 Glenmark Pharmaceuticals, S.A. 3-azabicyclo [3.1.0] hexane derivatives as vanilloid receptor ligands
WO2009081219A1 (en) 2007-12-20 2009-07-02 Glenmark Pharmaceuticals, S.A. Quinazoline derivatives as vanilloid receptor modulators
WO2009081222A1 (en) 2007-12-21 2009-07-02 Glenmark Pharmaceuticals, S.A. Substituted tricyclic pyridine or pyrimidine vanilloid receptor ligands
WO2009090548A2 (en) 2008-01-17 2009-07-23 Glenmark Pharmaceuticals, S.A. 3-azabicyclo [3.1.0] hexane derivatives as vanilloid receptor ligands
WO2009095726A1 (en) 2008-01-29 2009-08-06 Glenmark Pharmaceuticals, S.A. Acrylamide derivatives as vanilloid receptor 1 modulators
RU2368621C1 (ru) 2008-04-04 2009-09-27 Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН Полипептид актинии, обладающий анальгетическим действием
EP2352726A1 (en) 2008-10-17 2011-08-10 Abbott Laboratories Trpv1 antagonists
RU2404245C1 (ru) 2009-07-09 2010-11-20 Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН Полипептид актинии, обладающий анальгетическим действием
RU2621708C2 (ru) 2011-06-22 2017-06-07 ПУРДЬЮ ФАРМА Эл. Пи. Антагонисты trpv1, включающие дигидроксигруппу в качестве заместителя, и их применение
RU2506077C1 (ru) 2013-01-25 2014-02-10 Общество С Ограниченной Ответственностью "Валента-Интеллект" Комбинация для профилактики, коррекции и терапии боли, связанной с нейродегенерацией или ассоциированной с соматоформными расстройствами
RU2541127C1 (ru) 2013-11-15 2015-02-10 Закрытое акционерное общество "Институт экспериментальной фармакологии" Анальгетическое средство пептидной структуры на основе ундекапептида, содержащего d-октааргининовый вектор
RU2619170C2 (ru) 2015-09-18 2017-05-12 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А.Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) Рекомбинантная плазмидная ДНК pER-APHC3, кодирующая гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием APHC3, штамм Escherichia coli C3030/pER-APHC3 продуцент указанных белков и способ получения рекомбинантного APCH3
RU2648445C1 (ru) 2016-11-03 2018-03-26 Светлана Асылхановна Астафьева 6-(3,3- диметил-3,4-дигидроизохинолин-1-ил) аминогексановая кислота и фармацевтическая композиция на ёе основе, обладающие анальгетической активностью

Non-Patent Citations (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANDREEV Y. A ET AL.: "Polypeptide modulators of TRPV1 produce analgesia without hyperthermia", MAR. DRUGS, vol. 11, no. 12, 2013, pages 5100 - 15
BASBAUM A.I ET AL.: "Cellular and molecular mechanisms of pain", CELL, vol. 139, 2009, pages 267 - 284, XP055076583, DOI: 10.1016/j.cell.2009.09.028
CABRAL L.D.MGIUSTI-PAIVA A: "The Transient Receptor Potential Vanilloid 1 Antagonist Capsazepine Improves the Impaired Lung Mechanics during Endotoxemia", BASIC & CLINICAL PHARMACOLOGY & TOXICOLOGY, vol. 119, 2016, pages 421 - 427
CAO E. ET AL.: "TRPV1 channels are intrinsically heat sensitive and negatively regulated by phosphoinositide lipids", NEURON, vol. 77, 2013, pages 667 - 679, XP028983420, DOI: 10.1016/j.neuron.2012.12.016
CHIZH B.A ET AL.: "The effects of the TRPV1 antagonist SB-705498 on TRPV1 receptor-mediated activity and inflammatory hyperalgesia in humans", PAIN, vol. 132, 2007, pages 132 - 141, XP022283617, DOI: 10.1016/j.pain.2007.06.006
CIANCHETTI C: "Capsaicin jelly against migraine pain", INT. J. CLIN. PRACT, vol. 64, 2010, pages 457 - 459
GAWA N.R ET AL.: "Repeated administration of vanilloid receptor TRPV1 antagonists attenuates hyperthermia elicited by TRPV1 blockade", 1 PHARMACOL. EXP. THER, vol. 323, 2007, pages 128 - 37
GRAM D.X ET AL.: "TRPV1: A Potential Therapeutic Target in Type 2 Diabetes and Comorbidities?", TRENDS IN MOLECULAR MEDICINE, vol. 23, 2017, pages 1002 - 1013, XP085283335, DOI: 10.1016/j.molmed.2017.09.005
GUNTHORPE M.J. ET AL.: "Clinical development of TRPV1 antagonists: targeting a pivotal point in the pain pathway", DRUG DISCOV. TODAY, vol. 14, 2009, pages 56 - 67, XP025868050, DOI: 10.1016/j.drudis.2008.11.005
GUNTHORPE MI ET AL.: "Clinical development of TRPV1 antagonists: target in pivotal point in the pain pathway", DRUG DISCOV TODAY, vol. 14, 2009, pages 56 - 67, XP025868050, DOI: 10.1016/j.drudis.2008.11.005
HONORE P ET AL.: "Repeated dosing of ABT-102, a potent and selective TRPV1 antagonist, enhances TRPV1-mediated analgesic activity in rodents, but attenuates antagonist-induced hyperthermia", PAIN, vol. 142, 2009, pages 27 - 35, XP025949704, DOI: 10.1016/j.pain.2008.11.004
JARA-OSEGUERA A ET AL.: "TRPV1: On the road to pain relief", CURR. MOL. PHARMACOL., vol. 1, 2008, pages 255 - 269, XP055538475, DOI: 10.2174/1874467210801030255
KHAIRATKAR-JOSHI N ET AL.: "TRPV1 antagonists: the challenges for therapeutic targeting", TRENDS MOL. MED, vol. 15, 2009, pages 14 - 22, XP025875126, DOI: 10.1016/j.molmed.2008.11.004
KHALID S. ET AL.: "Transient receptor potential vanilloid 1 (TRPV1) antagonism in patients with refractory chronic cough: a double-blind randomized controlled trial", J ALLERGY CLIN. IMMUNOL, vol. 134, 2014, pages 56 - 62
LV H ET AL.: "Effect of transient receptor potential vanilloid-1 on cough hypersensitivity induced by particulate matter 2.5", LIFE SCIENCE, vol. 151, 2016, pages 157 - 166, XP029527970, DOI: 10.1016/j.lfs.2016.02.064
MICKLE A.D ET AL.: "Nociceptive TRP Channels: Sensory Detectors and Transducers in Multiple Pain Pathologies", PHARMACEUTICALS, vol. 9, 2016, pages E72
MONASTYRNAYA M. M ET AL.: "Kunitz-type peptide HCRG21 from the sea anemone Heteractis crispa is a full antagonist of the TRPV1 receptor", MAR. DRUGS, vol. 14, 2016, pages 229 - 234, XP055874735, DOI: 10.3390/md14120229
MONASTYRNAYA MARGARITA, PEIGNEUR STEVE, ZELEPUGA ELENA, SINTSOVA OKSANA, GLADKIKH IRINA, LEYCHENKO ELENA, ISAEVA MARINA, TYTGAT JA: "Kunitz-Type Peptide HCRG21 from the Sea Anemone Heteractis crispa Is a Full Antagonist of the TRPV1 Receptor", MARINE DRUGS, vol. 14, no. 12, 1 January 2016 (2016-01-01), XP055874735, DOI: 10.3390/md14120229 *
MYZSIK G: "Capsaicin as new orally applicable gastroprotective and therapeutic drug alone or in combination with nonsteroidal anti-inflammatory drugs in healthy human subjects and in patients", PROG. DRUG RES, vol. 68, 2014, pages 209 - 258
SINTSOVA, O.V. ET AL.: "Peptidny blokator ionnogo kanala trpv1 proyavlyaet dlitelny analgetichesky effekt v modeli teplovoy stimulyatsii = Peptide blocker of ion channel TRPV1 exhibits a long analgesic effect in the heat stimulation model", DOKLADY ROSSIYSKOY AKADEMII NAUK, vol. 493, 3 June 2020 (2020-06-03), RU , pages 423 - 426, XP009542039, ISSN: 0869-5652, DOI: 10.31857/s268673892003018x *
STAROWICZ K. ET AL.: "Biochemistry and pharmacology of endovanilloids", PHARMACOL. THER, vol. 114, 2007, pages 13 - 33, XP022011302, DOI: 10.1016/j.pharmthera.2007.01.005
SZALLASI A: "The vanilloid receptor TRPY1: 10 years from channel cloning to antagonist proof-of-concept", NAT. REV. DRUG DISCOV, vol. 6, 2007, pages 357 - 372
YUN, J.W ET AL.: "TRPV1 antagonist can suppress the atopic dermatitis-like symptoms by accelerating skin barrier recovery", JOURNAL OF DERMATOLOGICAL SCIENCE, vol. 62, 2011, pages 8 - 15, XP028166554, DOI: 10.1016/j.jdermsci.2010.10.014
ZHONG, B ET AL.: "TRPV1 mediates glucose-induced insulin secretion through releasing neuropeptides", IN VIVO, vol. 33, 2019, pages 1431 - 1437

Also Published As

Publication number Publication date
RU2755206C1 (ru) 2021-09-14
EP4154899A1 (en) 2023-03-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhang et al. Mechanisms of NLRP3 inflammasome activation: its role in the treatment of Alzheimer’s disease
US9402826B2 (en) Neuronal pain pathway modulators
Salat et al. Transient receptor potential channels-emerging novel drug targets for the treatment of pain
Zapała et al. Humanins, the neuroprotective and cytoprotective peptides with antiapoptotic and anti-inflammatory properties
Srebro et al. Magnesium in pain research: state of the art
KR101937255B1 (ko) 제 2형 당뇨병 관련 통증에서 시그마 리간드의 이용
KR20030096227A (ko) 신경 및 신경정신 질환의 치료방법
De Petrocellis et al. Modulation of the TRPV1 channel: current clinical trials and recent patents with focus on neurological conditions
Koroleva et al. Semax as a universal drug for therapy and research
JP2008501716A (ja) 自己炎症性疾患を処置するためのｉｌ−１アンタゴニストを使用する方法
WO2018068670A1 (zh) 神经兴奋性损伤相关多肽在预防、缓解或治疗疼痛的用途
Ma Pharmacological inhibition of the NLRP3 inflammasome: structure, molecular activation, and inhibitor-NLRP3 interaction
Zhang et al. STING mediates neuroinflammatory response by activating NLRP3‐related pyroptosis in severe traumatic brain injury
KR20200130681A (ko) 펩티드 및 그의 용도
JP2018524306A (ja) テトラヒドロ−ｎ，ｎ−ジメチル−２，２−ジフェニル−３−フランメタンアミン（ａｎａｖｅｘ２−７３）のエナンチオマーならびにシグマ１レセプターにより調節されるアルツハイマー型および他の傷害の処置におけるその使用
Tabikh et al. Parkinson disease: Protective role and function of neuropeptides
Lu et al. Shaoyao-Gancao decoction promoted microglia M2 polarization via the IL-13-mediated JAK2/STAT6 pathway to alleviate cerebral ischemia-reperfusion injury
Hu et al. A crucial role of HMGB1 in orofacial and widespread pain sensitization following partial infraorbital nerve transection
WO2021235983A1 (ru) Средство пролонгированного анальгетического действия
Edye et al. Epilepsy and the inflammasome: targeting inflammation as a novel therapeutic strategy for seizure disorders
EA046469B1 (ru) Средство пролонгированного анальгетического действия
Hopster et al. Pharmacology of the equine foot: medical pain management for laminitis
US20070148159A1 (en) Use of crotoxin as an analgesic - CIP
EP3965769B1 (en) Use of 2-phenyl-6-(1h-imidazol-1-yl)quinazoline for treating neurodegenerative diseases, preferably alzheimer&#39;s disease
JP4895219B2 (ja) Ｒｏｃｋ阻害剤を含有する疼痛治療剤

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 21809722

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 17926318

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2021809722

Country of ref document: EP

Effective date: 20221220