WO2021193909A1 - 重合体、検査薬、アナライト濃度測定法、及び、アナライト濃度測定装置 - Google Patents

重合体、検査薬、アナライト濃度測定法、及び、アナライト濃度測定装置 Download PDF

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WO2021193909A1
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polymer
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skeleton
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PCT/JP2021/012829
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秀平 大日方
脇屋　武司
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積水化学工業株式会社
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    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K11/00—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials
    • C09K11/06—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing organic luminescent materials
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G—PHYSICS
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
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    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label

Definitions

  • the present invention relates to a polymer capable of suppressing background fluorescence and measuring an analysis with good detection sensitivity.
  • the present invention also relates to a test agent containing the polymer, an analyte concentration measuring method using the polymer, and an analytical concentration measuring device used in the analytical concentration measuring method.
  • the method of detecting the fluorescence and measuring the substance to be measured in the sample is capable of simple and highly sensitive measurement, and can be automated by using an analyzer such as an immunoplate reader. It is used in many fields including clinical tests.
  • the fluorescence method is extremely excellent in terms of high efficiency, simplicity, and the like.
  • the fluorescence method may cause so-called background fluorescence that is not caused by the substance to be measured.
  • Background fluorescence is caused by an endogenous substance other than the substance to be measured in the sample having autofluorescence, or when it is generated from a fluorescent dye non-specifically attached to a protein or the like in the sample, the substance to be measured is injected. It may arise from the container (plate, etc.) that is used. In either case, the sensitivity and specificity are affected, which is a common problem in the fluorescence method, and a method of suppressing the influence of background fluorescence for measurement has been required.
  • Patent Documents 1 and 2 disclose an antibody using a subject dye complex as an antigen, which has a dye that is not substantially fluorescent to the subject.
  • an antibody corresponds only to a specific antigen, and the background fluorescence may not be reduced due to the influence of a plurality of proteins contained in the sample.
  • Patent Document 3 describes agglomerated fluorescent material-containing particles comprising core particles, a binding partner provided on the core particles that binds to an analyze, and a aggregated fluorescent material that agglomerates and fluoresces when the allite binds to the binding partner. It is disclosed.
  • aggregated fluorescent material-containing particles By using such aggregated fluorescent material-containing particles, it is possible to measure the analyst with a certain degree of good detection sensitivity while suppressing background fluorescence.
  • radioactive isotopes such as cesium-137 (137Cs) and cesium-134 (134Cs) may be generated.
  • a germanium semiconductor detector as disclosed in Patent Document 4 a NaI (Tl) scintillation spectrometer, or the like has been required for measuring radioactive substances, but the device is expensive and the operation is complicated. It took a lot of effort to measure. Therefore, there has been a demand for a low-cost and easy method for measuring radioactive substances.
  • Japanese Unexamined Patent Publication No. 9-5324 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2007-171213 International Publication No. 2018/043688 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2013-2406049
  • the present invention is a polymer having an aggregation-induced luminescent group on the polymer skeleton and having a binding partner capable of binding to an analyte on the polymer skeleton.
  • the present invention will be described in detail below.
  • the aggregated fluorescent material-containing particles as disclosed in Patent Document 3 have a problem that the scattered light due to the movement of the particles affects the background, that is, the background fluorescence tends to increase.
  • the detection sensitivity is lowered because the particles as the carrier absorb or scatter the fluorescence generated by the aggregation excitation, and in particular, the analyte may not be detected when the concentration of the analyst is low. .. Therefore, the present inventors have investigated the use of a polymer having an aggregation-induced luminescent group on the polymer skeleton and having a binding partner capable of binding to an analyte on the polymer skeleton.
  • the polymer of the present invention hardly causes problems such as scattered light when the aggregated fluorescent material-containing particles are used, it is excellent in the effect of suppressing background fluorescence.
  • the aggregation-induced luminescent groups emit fluorescence in close proximity to each other due to the entanglement of the polymer in which the portion that can participate in the reaction is spatially large, the detection sensitivity is higher than that in the case of using the aggregated fluorescent material-containing particles. Can be shown.
  • the polymer of the present invention has an aggregation-induced luminescent group on the polymer skeleton and has a binding partner capable of binding to an analyte on the polymer skeleton.
  • "having an aggregation-induced luminescent group on the polymer skeleton and having a binding partner capable of binding to an analyte on the polymer skeleton” means the above-mentioned aggregation-induced luminescent group.
  • the binding partner is chemically bonded on the polymer skeleton
  • the case where the compound having these is physically in contact with the polymer skeleton is also included.
  • the case is preferably a chemical bond.
  • having on the polymer skeleton may be either in the main chain of the polymer or in the side chain of the polymer.
  • “physically in contact with the polymer skeleton” refers to a state in which the polymer skeleton is in close proximity due to hydrophobic interaction, ⁇ - ⁇ interaction, CH interaction, or the like.
  • the polymer skeleton is preferably chain-shaped or reticulated, and is more preferably chain-shaped because the polymers are easily entangled with each other and can exhibit higher detection sensitivity.
  • chain means a structure in which a polymer main chain is not two-dimensionally crosslinked and has no branched structure.
  • the polymerizable monomer from which the polymer skeleton is derived include a polymerizable monomer having an ethylenically unsaturated group.
  • Examples of the polymerizable monomer having an ethylenically unsaturated group include a carboxyl group-containing monofunctional monomer, a hydroxyl group-containing monofunctional monomer, a hydroxyl group-containing polyfunctional monomer, an amino group-containing monofunctional monomer, and an amino group-containing polyfunctional monomer. , Amid group-containing monofunctional monomer, amide group-containing polyfunctional monomer, sulfonic acid group-containing monofunctional monomer and the like.
  • Examples of the carboxyl group-containing monofunctional monomer include (meth) acrylic acid, ⁇ -carboxyethyl (meth) acrylate, and 2- (meth) acryloyloxyethyl succinic acid.
  • Examples of the hydroxyl group-containing monofunctional monomer include 2-hydroxyethyl (meth) acrylate, 2-hydroxypropyl (meth) acrylate, and 4-hydroxybutyl (meth) acrylate.
  • Examples of the hydroxyl group-containing polyfunctional monomer include glycerin di (meth) acrylate and the like.
  • Examples of the amino group-containing monofunctional monomer include dimethylaminoethyl (meth) acrylate, dimethylaminopropyl (meth) acrylate, diethylaminoethyl (meth) acrylate and the like.
  • Examples of the amino group-containing polyfunctional monomer include PEG-NH 2 , PEG-NHS and the like.
  • Examples of the amide group-containing monofunctional monomer include (meth) acrylamide, N-methylol (meth) acrylamide, isopropyl (meth) acrylamide, and sulfobetaine monomer FAM-101 manufactured by FUJIFILM Corporation.
  • Examples of the amide group-containing polyfunctional monomer include N, N'-methylenebis (meth) acrylamide, and polyfunctional acrylamide monomers FAM-401, 301, 201, 402 manufactured by FUJIFILM Corporation.
  • the sulfonic acid group-containing monofunctional monomer examples include 2- (meth) acrylamide-2-methylpropanesulfonic acid, 2- (meth) acryloyloxyethyl acid phosphate, and p-styrene sulfonate. These may be used alone or in combination of two or more.
  • the crosslinked structure in the polymer of the present invention can be obtained by copolymerizing the polyfunctional monomer mentioned as the above-mentioned polymerizable monomer having an ethylenically unsaturated group, and a molecule using a carboxyl group or a hydroxyl group. It can also be obtained by internal cross-linking (dehydration polymerization).
  • (meth) acrylic acid, 2-hydroxyethyl (meth) acrylate, (meth) acrylamide, N-methylol (meth) acrylamide, and N, N'-methylenebis (meth) acrylamide are preferable.
  • other monomers such as styrene, methyl (meth) acrylate, and glycidyl (meth) acrylate may be copolymerized.
  • the preferable upper limit of the usage ratio of the other monomer is 50% by weight, the more preferable upper limit is 30% by weight, and the further preferable upper limit is 10% by weight.
  • the above-mentioned "(meth) acrylic” means acrylic or methacrylic
  • the above-mentioned "(meth) acrylate” means acrylate or methacrylate.
  • the polymer skeleton preferably contains a hydrophilic group.
  • the obtained polymer has excellent solubility in water, the background fluorescence is reduced, and the collision frequency between the analyte and the binding partner is increased. Aggregation of the polymer due to the above is likely to occur, and the fluorescence intensity due to the aggregation-induced luminescent group becomes higher.
  • the hydrophilic group is preferably at least one group selected from the group consisting of a hydroxyl group, a carboxyl group, an amino group, an amide group, and a sulfonic acid group. At least one group selected from the group consisting of a hydroxyl group, a carboxyl group, and an amino group is more preferable.
  • the aggregation-induced luminescent group is non-luminescent in a state where the molecular motion of the group is not suppressed, but the group is due to aggregation of the group portion, spatial restrictions, interaction with surrounding molecules, and the like. It is a group that emits fluorescence by significantly suppressing the molecular motion of the substance and inhibiting the non-radiation deactivation pathway.
  • the aggregation-induced luminescent group preferably contains a hydrophilic group. Since the aggregation-induced luminescent group contains a hydrophilic group, the obtained polymer has excellent solubility in water, the background fluorescence is reduced, and the collision frequency between the analyte and the binding partner is increased. Aggregation of the polymer is likely to occur, and the fluorescence intensity due to the aggregation-induced luminescent group becomes higher.
  • the hydrophilic group includes at least one group selected from the group consisting of a hydroxyl group, a carboxyl group, an amino group, an amide group, and a sulfonic acid group.
  • at least one group selected from the group consisting of a hydroxyl group, a carboxyl group, and an amino group is more preferable.
  • the aggregation-induced luminescent group is preferably a group represented by the following formula (1) or a group represented by the following formula (2).
  • E represents a silicon atom or a germanium atom, and R 1 and R 2 may be the same, may be different, or may have a substituent. It represents a saturated or unsaturated hydrocarbon group of ⁇ 6, a phenyl group which may have a substituent, a hydrogen atom, a hydroxyl group, a halogen atom, an amino group, a carboxyl group, or a nitro group. Any one of R 3 to R 6 is a bond, and any of R 3 to R 6 that is not a bond may be the same or different, and has a substituent. Indicates an aromatic hydrocarbon group which may also have an aromatic hydrocarbon group, or an aromatic heterocyclic group which may have a substituent.
  • any one of R 7 to R 10 is a bond, and any of R 7 to R 10 that is not a bond may be the same or different, and may be substituted. It represents a saturated or unsaturated hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms, which may have a group, a hydrogen atom, a hydroxyl group, a halogen atom, an amino group, a carboxyl group, or a nitro group.
  • the aggregation-induced luminescent group is polymerized by using a polymerizable monomer containing a aggregation-induced luminescent compound or a aggregation-induced luminescent compound having a polymerizable functional group, or by a side chain reaction on the polymer skeleton. Depending on the method of introduction, it can be introduced on the above-mentioned polymer skeleton.
  • the aggregation-induced luminescent compound may be copolymerized on the polymer skeleton, or may be chemically bonded via a functional group such as a carboxyl group, a hydroxyl group, an amino group, an amide group, or an epoxy group.
  • the aggregation-induced luminescent group can also be introduced onto the polymer skeleton by bringing the aggregation-induced luminescent compound into physical contact with the polymer skeleton.
  • Examples of the aggregation-induced luminescent compound include tetraphenylethylene derivatives, hexaphenylbenzene derivatives, triphenylamine derivatives, ketoimin boron complex derivatives, diimine boron complex derivatives, aminomaleimide derivatives, aminobenzopyroxanthene derivatives, and tetraphenylsilol derivatives. , Pentaphenyl silol derivative, hexaphenylsilol derivative and the like.
  • tetraphenylethylene derivatives tetraphenylethylene derivatives, hexaphenylbenzene derivatives, triphenylamine derivatives, tetraphenylsilol derivatives, pentaphenylsilol derivatives and hexaphenylsilol derivatives are preferable, and tetraphenylethylene derivatives and tetraphenyls are preferable.
  • Sirol derivatives, pentaphenylsilol derivatives and hexaphenylsilol derivatives are more preferred.
  • Particularly preferred is a tetraphenylethylene derivative.
  • tetraphenylethylene derivative examples include tetraphenylethylene in which a functional group may be substituted on the phenyl group.
  • tetraphenylethylene 4- (1,2,2-triphenylvinyl) phenyl (meth) acrylate, p-hydroxytetraphenylethylene (meth) acrylate, p-carboxytetraphenylethylene (meth) acrylate.
  • one having one hydroxyl group is 4-((4-hydroxyphenyl) diphenylvinyl) phenyl (meth) acrylate (note that the 4-hydroxyl group is the phenyl of the compound. It may be in any of the 4th place on the basis).
  • those having two hydroxyl groups include 4- (bis (4-hydroxyphenyl) phenylvinyl) phenyl (meth) acrylate (note that the two 4-hydroxyl groups are relevant. It may be in any of the 4-positions on the phenyl group of the compound).
  • Examples of the p-hydroxytetraphenylethylene (meth) acrylate having three hydroxyl groups include 4- (1,2,2-tris (4-hydroxyphenyl) vinyl) phenyl (meth) acrylate.
  • 4- (1,2,2-tris (4-hydroxyphenyl) vinyl) phenyl (meth) acrylate examples include 4- (1,2,2-tris (4-hydroxyphenyl) vinyl) phenyl (meth) acrylate.
  • one having one carboxyl group is 4-((4-carboxyphenyl) diphenylvinyl) phenyl (meth) acrylate (note that the 4-carboxyl group is the compound. It may be in any of the 4-positions on the phenyl group).
  • those having two carboxyl groups include 4- (bis (4-carboxyphenyl) phenylvinyl) phenyl (meth) acrylate (note that the two 4-carboxyl groups are It may be in any of the 4-positions on the phenyl group of the compound).
  • those having three carboxyl groups include 4- (1,2,2-tris (4-carboxyphenyl) vinyl) phenyl (meth) acrylate.
  • tetraphenylethylene (meth) acrylate tetraphenylethylene (meth) acrylate, p-hydroxytetraphenylethylene (meth) acrylate, p-carboxytetraphenylethylene (meth) acrylate and its salts, tetrakis (4-hydroxyphenyl) ethylene, 4,4'- (1,2-Diphenylethene-1,2-diyl) dibenzoic acid, 4,4'-(1,2-diphenylmethene-1,2-diyl) diphenyl are preferable.
  • Examples of the tetraphenylsilol derivative or the hexaphenylcyrol derivative include 1,1,2,3,4,5-hexaphenylcyclol, wherein 1 to 5 functional groups may be substituted on the phenyl group.
  • 2,3,4,5-Tetraphenyl-1,1-dimethylsilol may be substituted with 1 to 5 functional groups on the phenyl group, and 1 to 5 functional groups are substituted on the phenyl group.
  • 2,3,4,5-Tetraphenyl-1,1-diallylsilol may be, 1-5 functional groups may be substituted on the phenyl group 1-methyl-1,2,3 Examples thereof include 4,5-pentaphenylcilol.
  • hexaphenylbenzene derivative examples include a benzene derivative substituted with four or more phenyl groups or a phenyl group derivative. Specific examples thereof include hexaphenylsiror and hexaphenylbenzene.
  • triphenylamine derivative examples include 4- (di-p-triamino) benzaldehyde and the like.
  • the aggregation-induced luminescent compound is preferably a compound represented by the following formula (3) or a compound represented by the following formula (4).
  • E represents a silicon atom or a germanium atom.
  • R 11 and R 12 may have a saturated or unsaturated hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms and a substituent which may be the same or different and may have a substituent. It may indicate a phenyl group, a hydrogen atom, a hydroxyl group, a halogen atom, an amino group, a carboxyl group, or a nitro group.
  • R 13 to R 16 may be the same, different, aromatic hydrocarbon groups which may have a substituent, or an aromatic complex which may have a substituent. Indicates a cyclic group.
  • R 17 to R 20 are saturated or unsaturated hydrocarbon groups having 1 to 6 carbon atoms, which may be the same, different, or have substituents. It indicates a hydrogen atom, a hydroxyl group, a halogen atom, an amino group, a carboxyl group, or a nitro group.
  • the binding partner capable of binding to the analyte can be introduced onto the polymer skeleton by reacting the compound having the binding partner with the polymer into which the aggregation-induced luminescent group has been introduced.
  • the bond partner may be copolymerized on the polymer skeleton, or may be chemically bonded via a functional group such as a carboxyl group, a hydroxyl group, an amino group, an amide group, an epoxy group, or a tosyl group.
  • a condensing agent may be used as the coupling agent.
  • the condensing agent examples include a carbodiimide-based condensing agent, an imidazole-based condensing agent, a triazine-based condensing agent, a phosphonium-based condensing agent, a uronium-based condensing agent, a halouronium-based condensing agent, and the like.
  • the carbodiimide-based condensing agent include 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC / HCl), N, N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC), and N, N'-diisopropylcarbodiimide.
  • Examples of the imidazole-based condensing agent include N, N'-carbonyldiimidazole and the like.
  • Examples of the phosphonium-based condensing agent include 1H-benzotriazole-1-yloxytris (dimethylamino) phosphonium hexafluorophosphate (BOP) and 1H-benzotriazole-1-yloxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphorus. Examples thereof include acid salt (PyBOP).
  • Examples of the uronium-based condensing agent include O- (benzotriazole-1-yl) -N, N, N', N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU), O- (7-aza).
  • Bentotriazole-1-yl) -N, N, N', N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU), ⁇ [(1-cyano-2-ethoxy-2-oxoethylidene) amino] Oxy ⁇ -4-morpholinomethylene ⁇ dimethylammonium hexafluorophosphate (COMU) and the like can be mentioned.
  • the halouronium-based condensing agent include 1- (chloro-1-pyrrolidinyl methylene) pyrrolidinium hexafluorophosphate (PyCIU) and the like.
  • a reaction accelerator may be used in addition to the above-mentioned condensing agent.
  • reaction accelerator examples include 1-hydroxybenzotriazole (HOBt), 1-hydroxy-7-azabenzotriazole (HOAt), N-hydroxysulfuric acid imide (HOSu), and N, N'-discusin imidyl carbonate (HOBt). DSC) and the like.
  • the binding partner can also be introduced onto the polymer skeleton by bringing the compound having the binding partner into physical contact with the polymer skeleton.
  • the above-mentioned analyze is not particularly limited, and examples thereof include molecules that can be theoretically measured by a measurement method, such as proteins, peptides, amino acids, lipids, sugars, nucleic acids, and haptens.
  • CRP C-reactive protein
  • Lp lipoprotein (a)
  • MMP3 matrix metalloproteinase 3
  • anti-CCP cyclic citrulylated peptide
  • anti-phospholipid antibody anti- Pyramid antigen antibody
  • RPR type IV collagen
  • PSA AFP
  • CEA AFP
  • BNP brain natriuretic peptide
  • NT-proBNP insulin
  • microalbumin cystatin C
  • RF renal plasma fibroblast growth factor
  • KL-6 KL-6
  • PIVKA-II FDP
  • D dimer D dimer
  • SF soluble fibrin
  • TAT thrombin-antithrombin III complex
  • PIC PAI, XIII factor, pepsinogen I,
  • the polymer of the present invention can be suitably used for measuring radioactive substances as the above-mentioned analyst.
  • the radioactive substance include cobalt-60 (60Co), strontium-90 (90Sr), radioactive zirconium, technetium-99 (99Tc), ruthenium 106 (106Ru), radioactive iodine, radioactive cesium, radioactive thorium, radioactive uranium, and radioactive plutonium. Radioactive americium, radioactive curium and the like can be mentioned.
  • the radioactive zirconium include zirconium 93 (93Zr) and zirconium 95 (95Zr).
  • radioactive iodine examples include iodine-129 (129I) and iodine-131 (131I).
  • radioactive cesium include cesium-137 (137Cs) and cesium-134 (134Cs).
  • radioactive thorium examples include thorium-230 (230Th) and the like.
  • radioactive uranium examples include uranium 235 (235U) and uranium 238 (238U).
  • radioactive plutonium examples include plutonium 240 (240Pu) and the like.
  • radioactive americium examples include americium 242 (242 Am) and the like.
  • radioactive curium examples include curium 244 (244 Cm) and the like.
  • the binding partner is appropriately selected according to the type of the analysis, and examples thereof include groups derived from proteins, peptides, amino acids, lipids, nucleic acids, haptens and the like.
  • the binding partners are linear polyethers, cyclic ethers, calixarenes, macrocyclic heterocyclic compounds, cyclodextrins, tetraphenylboric acids, and ,
  • a group derived from at least one compound selected from the group consisting of these derivatives is preferable, and a group derived from a compound represented by the following formula (5) is more preferable.
  • the bond is preferably present at any position on the benzene ring or at any position on the methyl group bonded to the carbonyl group. ..
  • the binding partner is preferably an antibody or an antigen because the polymer of the present invention can be suitably used for a clinical test drug.
  • the sugar chain of the present invention may unexpectedly interact with the substance in the sample, it is preferable that the polymer main chain does not have a sugar chain, and it is preferable that the polymer does not have a sugar chain. More preferred.
  • the polymer of the present invention is preferably hydrophilic. Specifically, the polymer of the present invention is preferably dissolved in a liquid having a solubility parameter of 12 to 25 (cal / cc) 1/2, that is, it is mixed with a solvent and uniformly dispersed. By dissolving the polymer in a liquid having a solubility parameter of 12 to 25 (cal / cc) 1/2 , precipitation and background fluorescence are suppressed, and the detection sensitivity of the analyte is improved.
  • the polymer of the present invention may be an oligomer or a polymer. Further, the polymer of the present invention preferably satisfies at least one of a number average degree of polymerization of 20 or more and 70,000 or less and a number average molecular weight of 2000 or more and 5 million or less. When at least one of the above-mentioned number average degree of polymerization and the above-mentioned number average molecular weight is within the above range, precipitation and background fluorescence are suppressed, and the detection sensitivity of the analyte is improved.
  • the more preferable lower limit of the number average degree of polymerization is 125, and the more preferable upper limit is 14000.
  • the more preferable lower limit of the number average molecular weight is 10,000, and the more preferable upper limit is 1 million.
  • the number average degree of polymerization and the number average molecular weight are measured by size exclusion chromatography (SEC) using 150 mM phosphate buffer (pH 7.0) as a solvent, and are calibrated as a standard (pH 7.0). It is a value obtained from the measurement results of obalbumin, myoglobin, aprotinin, neurotensin, angiotensin II).
  • SEC size exclusion chromatography
  • Examples of the column for measuring the number average molecular weight by SEC include AdvanceBio SEC (manufactured by Agilent Technologies).
  • Examples of the method for producing the polymer of the present invention include the following methods. That is, first, the polymerizable monomer, the aggregation-induced luminescent compound, and the polymerization initiator are dissolved in the solvent. Then, the obtained solution is stirred while heating to obtain a polymer having a coagulation-induced luminescent group introduced therein. Next, the polymer of the present invention can be obtained by adding a compound having a binding partner according to the type of Analite to the obtained aqueous dispersion of the polymer into which the aggregation-induced luminescent group has been introduced and reacting the mixture. can. The above condensing agent and the above reaction accelerator may be used when the compound having the binding partner is added and reacted.
  • solvent examples include N, N-dimethylformamide, ethyl acetate, tetrahydrofuran, acetonitrile, ethanol, methanol, water and the like.
  • polymerization initiator examples include oil-soluble initiators such as azobisisobutyronitrile and benzoyl peroxide, and water-soluble initiators such as potassium persulfate and ammonium persulfate.
  • the polymer of the present invention is preferably used as a test agent.
  • a test agent containing the polymer of the present invention is also one of the present inventions.
  • the test agent of the present invention can be suitably used as a clinical test agent in various methods utilizing a biological reaction such as an enzyme immunoassay method using an antigen-antibody reaction, a fluorescence immunoassay method, and an immunochromatography method. ..
  • the test agent of the present invention is also suitably used for measuring radioactive substances. By using the test agent of the present invention, radioactive substances can be easily measured at low cost.
  • An analyze having a step of comparing the calibration line of the fluorescence intensity with respect to the analyzer concentration and the fluorescence intensity generated from the polymer and associating the fluorescence intensity generated from the polymer with the analyte concentration in the mixed solution.
  • the concentration measurement method is also one of the present inventions.
  • a step of irradiating the mixed solution with excitation light and a step of measuring the amount of change in emission intensity such as fluorescence and phosphorescence emitted by the mixed solution are performed. It is preferable to do so.
  • the analyte concentration measuring device used in the analyte concentration measuring method of the present invention is also one of the present inventions.
  • the analysis concentration measuring device of the present invention it is suitable to use an automatic analyzer capable of measuring quickly and easily, and an automatic analyzer capable of measuring emission intensity such as fluorescence or phosphorescence is preferable.
  • the light source used in the step of irradiating the mixed solution with excitation light is not particularly limited. Further, as the wavelength of the light irradiated in the step of irradiating the mixed solution with the excitation light, a wavelength in the ultraviolet light region is suitable, and a wavelength of 10 nm to 400 nm is particularly preferable. In the above-mentioned automatic analyzer, the amount of change in fluorescence intensity at any two time points from immediately after mixing the sample solution containing the analyte and the solution containing the polymer of the present invention to a maximum of 1000 seconds can be measured.
  • the total measurement time per sample can be set to 10 minutes or less, which is the maximum of various automatic analyzers on the market. You can enjoy the benefit of sample processing speed.
  • the light irradiation angle in the step of irradiating the mixed solution with excitation light is preferably 15 degrees to 35 degrees. By setting the irradiation angle within this range, the light receiving portion for detecting fluorescence is not strongly affected by the transmitted light, and the ability to receive fluorescence is also advantageous.
  • the irradiation angle is more preferably 20 to 30 degrees.
  • the amount of change in fluorescence intensity is not particularly limited as long as it is an applicable calculation method such as a difference or ratio between two time points and a converted value per unit time.
  • the step of associating the fluorescence intensity generated from the polymer with the analysis concentration in the mixture it is preferable to use a calibration curve of the fluorescence intensity prepared by using an analysis-containing sample having a known concentration.
  • a calibration curve for measurement of fluorescence intensity with a wide dynamic range, it is preferable to prepare a calibration curve in a wider concentration range.
  • good accuracy and reproducibility of the measured value of the low-concentration analyte is an index of high sensitivity.
  • the above-mentioned "dynamic range” means a range up to the maximum measurable amount of analyze.
  • the dynamic range of the analysis method of the present invention is a range in which a change in the amount of light proportional to the analysis density can be detected.
  • the present invention it is possible to provide a polymer capable of suppressing background fluorescence and measuring an analysis with good detection sensitivity. Further, according to the present invention, it is possible to provide a test agent containing the polymer, an analyze concentration measuring method using the polymer, and an analyze concentration measuring device used in the analyze concentration measuring method. ..
  • KL-6 antibody concentration 0.75 mg / mL) 2 parts by weight was added. Then, the mixture was stirred at 25 ° C. for 24 hours to obtain a polymer A.
  • the polymer A obtained by 1 H-NMR and FT-IR measurement has a group (R 7 ) represented by the above formula (2) bonded as an aggregation-induced luminescent group on a chain polyacrylic acid skeleton.
  • R 8 ⁇ R 10 is a hydrogen atom
  • R 8 ⁇ R 10 is a hydrogen atom
  • Synthesis Example 2 Polymer B was obtained in the same manner as in Synthesis Example 1 except that the amount of azobisisobutyronitrile added was changed to 1 part by weight. 1
  • the polymer B obtained by 1 H-NMR and FT-IR measurements has a group (R 7 ) represented by the above formula (2) bonded as an aggregation-induced luminescent group on a chain polyacrylic acid skeleton. hand, R 8 ⁇ R 10 is a hydrogen atom), was confirmed to be a polymer having a group derived from KL-6 antibody as a binding partner.
  • the obtained polymer B was measured by SEC using 150 mM phosphate buffer (pH 7.0) as a solvent, and the number average degree of polymerization obtained from the measurement results of the calibration standard was 1400, number average.
  • the molecular weight was 100,000.
  • the obtained polymer C was measured by SEC using 150 mM phosphate buffer (pH 7.0) as a solvent, and the number average degree of polymerization obtained from the measurement result of the calibration standard was 55,000, number average.
  • the molecular weight was 4 million.
  • the obtained polymer D was measured by SEC using 150 mM phosphate buffer (pH 7.0) as a solvent, and the number average degree of polymerization obtained from the measurement results of the calibration standard was 1350, number average.
  • the molecular weight was 100,000.
  • R 8 and R 9 is a carboxyl group
  • R 10 is a hydrogen atom
  • the obtained polymer E was measured by SEC using 150 mM phosphate buffer (pH 7.0) as a solvent, and the number average degree of polymerization obtained from the measurement result of the calibration standard was 1330, number average.
  • the molecular weight was 100,000.
  • the obtained polymer F was measured by SEC using 150 mM phosphate buffer (pH 7.0) as a solvent, and the number average degree of polymerization obtained from the measurement result of the calibration standard was 1300, number average.
  • the molecular weight was 100,000.
  • Synthesis Example 7 Polymer G was obtained in the same manner as in Synthesis Example 6 except that 95 parts by weight of acrylic acid was changed to 94 parts by weight of acrylic acid and 1 part by weight of ethylene glycol diacrylate (EGDA). 1
  • the polymer G obtained by H-NMR and FT-IR measurements is a group (R) represented by the above formula (2) as an aggregation-induced luminescent group on a reticulated acrylic acid / EGDA copolymer skeleton. 7 is a bond, and R 8 ⁇ R 10 is a hydroxyl group), was confirmed to be a polymer having a group derived from KL-6 antibody as a binding partner.
  • the obtained polymer G was measured by SEC using 150 mM phosphate buffer (pH 7.0) as a solvent, and the number average degree of polymerization obtained from the measurement results of the calibration standard was 1350, number average.
  • the molecular weight was 100,000.
  • the polymer into which the aggregation-induced luminescent group obtained in the same manner as in Synthesis Example 6 was introduced was designated as polymer H. 1
  • the polymer H obtained by 1 H-NMR and FT-IR measurements has a group (R 7 ) represented by the above formula (2) bonded as an aggregation-induced luminescent group on a chain polyacrylic acid skeleton. It was confirmed that the polymer had hands (R 8 to R 10 are hydroxyl groups) and did not have a binding partner capable of binding to the KL-6 antigen.
  • the obtained polymer H was measured by SEC using 150 mM phosphate buffer (pH 7.0) as a solvent, and the number average degree of polymerization obtained from the measurement result of the calibration standard was 1300, number average.
  • the molecular weight was 100,000.
  • Polystyrene particles having an average particle diameter of 0.15 ⁇ m were prepared as seed particles.
  • An emulsion was prepared by mixing 0.5 parts by weight of tetraphenylethylene, 5 parts by weight of ethyl acetate, 0.1 parts by weight of sodium styrenesulfonate, and 10 parts by weight of ion-exchanged water as the aggregation-induced luminescent compound. ..
  • the emulsion was added to the dispersion of 1 part by weight of the seed particles and stirred at room temperature for 24 hours to obtain a dispersion of swollen particle droplets of the seed particles that had absorbed tetraphenylethylene and ethyl acetate.
  • the dispersion of the obtained swelling particle droplets was stirred at 65 ° C. for 24 hours to dry ethyl acetate, and aggregated luminescent material-containing particles were obtained.
  • Table 1 shows the polymers A to H obtained in Synthesis Examples 1 to 8, the aggregated luminescent material-containing particles obtained in Synthesis Examples 9 and 10, and the aggregated luminescent material-encapsulating micelles obtained in Synthesis Example 11, respectively.
  • An aqueous solution or an aqueous dispersion contained at the indicated concentration was obtained.
  • a KL-6 antigen as an analyte was added to a buffer solution containing bovine serum albumin and stirred to prepare a sample solution containing the analyte (analite concentration 100 U / mL).
  • a mixed solution was obtained by mixing 1 part by weight of the obtained sample solution containing Analite with 10 parts by weight of each aqueous solution or aqueous dispersion obtained in Examples and Comparative Examples. The obtained mixed solution was shaken with a way blower for 1 minute.
  • the fluorescence intensity of the mixed solution before shaking is defined as the fluorescence intensity before the antigen-antibody reaction
  • the fluorescence intensity of the mixed solution after shaking is defined as the fluorescence intensity after the antigen-antibody reaction.
  • the present invention it is possible to provide a polymer capable of suppressing background fluorescence and measuring an analysis with good detection sensitivity. Further, according to the present invention, it is possible to provide a test agent containing the polymer, an analyte concentration measuring method using the polymer, and an analytical concentration measuring device used in the analytical concentration measuring method. ..

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Abstract

本発明は、バックグラウンド蛍光を抑制でき、かつ、良好な検出感度でアナライトを測定できる重合体を提供することを目的とする。また、本発明は、該重合体を含む検査薬、該重合体を用いたアナライト濃度測定法、及び、該アナライト濃度測定法に用いられるアナライト濃度測定装置を提供することを目的とする。 本発明は、凝集誘起発光性基を重合体骨格上に有し、かつ、アナライトと結合可能な結合パートナーを該重合体骨格上に有する重合体。

Description

重合体、検査薬、アナライト濃度測定法、及び、アナライト濃度測定装置
本発明は、バックグラウンド蛍光を抑制でき、かつ、良好な検出感度でアナライトを測定できる重合体に関する。また、本発明は、該重合体を含む検査薬、該重合体を用いたアナライト濃度測定法、及び、該アナライト濃度測定法に用いられるアナライト濃度測定装置に関する。
蛍光を検知して試料中の測定対象物質を測定する方法（蛍光法）は、簡便かつ高感度な測定が可能であり、イムノプレートリーダ等の分析装置を使用して自動化が可能なことから、臨床検査をはじめ多くの分野で利用されている。蛍光法は、高効率、簡便さ等の点で極めて優れている。
しかしながら、蛍光法では、測定対象物質に起因しない、いわゆるバックグラウンド蛍光を生じることがある。バックグラウンド蛍光は、試料中の測定対象物質以外の内在性物質が自家蛍光を有するために生じる場合、試料中のタンパク質等に非特異的に付着した蛍光色素から生じる場合、測定対象物質が注入されている容器（プレート等）から生じる場合等がある。いずれの場合も、感度、特異性に影響を与えるため、蛍光法に共通した問題点であり、バックグラウンド蛍光の影響を抑制して測定する方法が要求されていた。
特許文献１、２には被検体に実質的に蛍光性でない色素を有する被検体色素複合体を抗原とする抗体が開示されている。しかしながら、このような抗体は特定の抗原にのみ対応したものであり、検体中に含まれる複数のタンパク質の影響を受けて、バックグラウンド蛍光が小さくならない場合があった。
特許文献３には、コア粒子と、コア粒子上に設けられた、アナライトと結合する結合パートナーと、結合パートナーにアナライトが結合すると凝集蛍光する凝集蛍光材料とを備える凝集蛍光材料含有粒子が開示されている。このような凝集蛍光材料含有粒子を用いれば、バックグラウンド蛍光を抑制しながら、ある程度良好な検出感度でアナライトの測定を行うことが可能である。しかしながら、バックグラウンド蛍光を抑制する効果、及び、アナライトの検出感度に更に優れる測定方法が求められていた。
また、原子力発電において、ウランやプルトニウムの核分裂反応が生じた際に、放射性同位体であるセシウム１３７（１３７Ｃｓ）やセシウム１３４（１３４Ｃｓ）等が生成する場合がある。従来、放射性物質の測定には、特許文献４に開示されているようなゲルマニウム半導体検出器や、ＮａＩ（Ｔｌ）シンチレーションスペクトロメータ等が必要であったが、装置が高額な上、操作も煩雑で測定に労力が掛かっていた。そのため、低コストかつ簡易に放射性物質を測定できる方法が求められていた。
特開平９－５３２４号公報 特開２００７－１７１２１３号公報 国際公開第２０１８／０４３６８８号 特開２０１３－２４６０４９号公報
本発明は、バックグラウンド蛍光を抑制でき、かつ、良好な検出感度でアナライトを測定できる重合体を提供することを目的とする。また、本発明は、該重合体を含む検査薬、該重合体を用いたアナライト濃度測定法、及び、該アナライト濃度測定法に用いられるアナライト濃度測定装置を提供することを目的とする。
本発明は、凝集誘起発光性基を重合体骨格上に有し、かつ、アナライトと結合可能な結合パートナーを該重合体骨格上に有する重合体である。
以下に本発明を詳述する。
特許文献３に開示されているような凝集蛍光材料含有粒子は、粒子の運動による散乱光が、バックグラウンドに影響を与える、即ち、バックグラウンド蛍光が大きくなりやすいという問題があった。また、凝集励起して発生した蛍光を担体である粒子が吸収又は散乱することで検出感度が低くなり、特に、アナライトの濃度が低い場合にアナライトを検出できないことがあるという問題があった。
そこで本発明者らは、凝集誘起発光性基を重合体骨格上に有し、かつ、アナライトと結合可能な結合パートナーを該重合体骨格上に有する重合体を用いることを検討した。その結果、バックグラウンド蛍光を抑制でき、かつ、良好な検出感度でアナライトを測定できる重合体を得ることができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
本発明の重合体は、凝集蛍光材料含有粒子を用いた場合の散乱光のような問題をほとんど生じさせないため、バックグラウンド蛍光を抑制する効果に優れるものとなる。また、反応に関与できる部分が空間的に大きい重合体の絡み合いに伴って凝集誘起発光性基が近接して蛍光を発するものであるため、凝集蛍光材料含有粒子を用いた場合よりも高い検出感度を示すことができる。
本発明の重合体は、凝集誘起発光性基を重合体骨格上に有し、かつ、アナライトと結合可能な結合パートナーを該重合体骨格上に有する。
なお、本明細書において「凝集誘起発光性基を重合体骨格上に有し、かつ、アナライトと結合可能な結合パートナーを該重合体骨格上に有する」とは、上記凝集誘起発光性基、及び、上記結合パートナーが重合体骨格上に化学結合している場合のみならず、これらを有する化合物が重合体骨格と物理的に接している場合も含む。好ましくは化学結合している場合である。また、「重合体骨格上に有する」とは、重合体の主鎖に有する場合及び重合体の側鎖に有する場合のいずれであってもよい。更に、「重合体骨格と物理的に接している」とは、疎水性相互作用やπ－π相互作用、Ｃ－Ｈ相互作用等によって近接している状態を指す。
上記重合体骨格は、鎖状又は網状であることが好ましく、重合体同士が絡み合いやすく、かつ、より高い検出感度を示すことができることから、鎖状であることがより好ましい。なお、本明細書において「鎖状」とは、重合体主鎖が２次元的に架橋されていない分岐構造の無い構造であることを意味する。
上記重合体骨格の由来となる重合性単量体としては、例えば、エチレン性不飽和基を有する重合性単量体等が挙げられる。
上記エチレン性不飽和基を有する重合性単量体としては、例えば、カルボキシル基含有単官能モノマー、水酸基含有単官能モノマー、水酸基含有多官能モノマー、アミノ基含有単官能モノマー、アミノ基含有多官能モノマー、アミド基含有単官能モノマー、アミド基含有多官能モノマー、スルホン酸基含有単官能モノマー等が挙げられる。
上記カルボキシル基含有単官能モノマーとしては、例えば、（メタ）アクリル酸、β－カルボキシエチル（メタ）アクリレート、２－（メタ）アクリロイロキシエチルコハク酸等が挙げられる。
上記水酸基含有単官能モノマーとしては、例えば、（メタ）アクリル酸２－ヒドロキシエチル、（メタ）アクリル酸２－ヒドロキシプロピル、４－ヒドロキシブチル（メタ）アクリレート等が挙げられる。
上記水酸基含有多官能モノマーとしては、例えば、グリセリンジ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
上記アミノ基含有単官能モノマーとしては、例えば、ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリレート、ジエチルアミノエチル（メタ）アクリレート等が挙げられる。
上記アミノ基含有多官能モノマーとしては、例えば、ＰＥＧ－ＮＨ２、ＰＥＧ－ＮＨＳ等が挙げられる。
上記アミド基含有単官能モノマーとしては、例えば、（メタ）アクリルアミド、Ｎ－メチロール（メタ）アクリルアミド、イソプロピル（メタ）アクリルアミド、富士フイルム社製のスルホベタインモノマーＦＡＭ－１０１等が挙げられる。
上記アミド基含有多官能モノマーとしては、例えば、Ｎ，Ｎ’－メチレンビス（メタ）アクリルアミド、富士フイルム社製の多官能アクリルアミドモノマーＦＡＭ－４０１、３０１、２０１、４０２等が挙げられる。
上記スルホン酸基含有単官能モノマーとしては、例えば、２－（メタ）アクリルアミド－２－メチルプロパンスルホン酸、２－（メタ）アクリロイロキシエチルアシッドホスフェート、ｐ－スチレンスルホン酸塩等が挙げられる。
これらは単独で用いられてもよいし、２種以上が組み合わせて用いられてもよい。
また、本発明の重合体における架橋体構造は、上記エチレン性不飽和基を有する重合性単量体として挙げた多官能モノマーを共重合することで得られる他、カルボキシル基や水酸基を用いた分子内架橋（脱水縮合）によっても得ることができる。
なかでも、（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル酸２－ヒドロキシエチル、（メタ）アクリルアミド、Ｎ－メチロール（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ’－メチレンビス（メタ）アクリルアミドが好ましい。
また、必要に応じてスチレン、（メタ）アクリル酸メチル、グリシジル（メタ）アクリレート等の他の単量体を共重合してもよい。上記他の単量体を共重合する場合の該他の単量体の使用割合の好ましい上限は５０重量％、より好ましい上限は３０重量％、更に好ましい上限は１０重量％である。
本明細書において上記「（メタ）アクリル」は、アクリル又はメタクリルを意味し、上記「（メタ）アクリレート」は、アクリレート又はメタクリレートを意味する。
上記重合体骨格は、親水性基を含むことが好ましい。上記重合体骨格が親水性基を含むものであることにより、得られる重合体が水への溶解性に優れるものとなり、バックグラウンド蛍光の低減、及び、アナライトと結合パートナーとの衝突頻度が増加することによる重合体の凝集が起こりやすくなって上記凝集誘起発光性基による蛍光強度がより高いものとなる。
上記重合体骨格が親水性基を含む場合の該親水性基としては、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、アミド基、及び、スルホン酸基からなる群より選択される少なくとも１種の基が好ましく、水酸基、カルボキシル基、及び、アミノ基からなる群より選択される少なくとも１種の基がより好ましい。
上記凝集誘起発光性基とは、当該基の分子運動が抑制されていない状態では非発光性であるが、当該基部分の凝集、空間的制約、及び、周囲分子との相互作用等により当該基の分子運動が大幅に抑制され、無放射失活経路が阻害されることで蛍光を発する基である。
上記凝集誘起発光性基は、親水性基を含むものであることが好ましい。上記凝集誘起発光性基が親水性基を含むものであることにより、得られる重合体が水への溶解性に優れるものとなり、バックグラウンド蛍光の低減、及び、アナライトと結合パートナーとの衝突頻度が増加することによる重合体の凝集が起こりやすくなって上記凝集誘起発光性基による蛍光強度がより高いものとなる。
上記凝集誘起発光性基が親水性基を含む場合の該親水性基としては、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、アミド基、及び、スルホン酸基からなる群より選択される少なくとも１種の基が好ましく、水酸基、カルボキシル基、及び、アミノ基からなる群より選択される少なくとも１種の基がより好ましい。
上記凝集誘起発光性基は、具体的には、下記式（１）で表される基又は下記式（２）で表される基であることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
式（１）中、Ｅは、ケイ素原子又はゲルマニウム原子を示し、Ｒ１及びＲ２は、同一であってもよいし、異なっていてもよく、置換基を有していてもよい炭素数１～６の飽和若しくは不飽和炭化水素基、置換基を有していてもよいフェニル基、水素原子、水酸基、ハロゲン原子、アミノ基、カルボキシル基、又は、ニトロ基を示す。Ｒ３～Ｒ６のいずれか１つは結合手であり、Ｒ３～Ｒ６のうち結合手でないものは、同一であってもよいし、異なっていてもよく、置換基を有していてもよい芳香族炭化水素基、又は、置換基を有していてもよい芳香族複素環式基を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
式（２）中、Ｒ７～Ｒ１０のいずれか１つは結合手であり、Ｒ７～Ｒ１０のうち結合手でないものは、同一であってもよいし、異なっていてもよく、置換基を有していてもよい炭素数１～６の飽和若しくは不飽和炭化水素基、水素原子、水酸基、ハロゲン原子、アミノ基、カルボキシル基、又は、ニトロ基を示す。
上記凝集誘起発光性基は、凝集誘起発光性化合物を含有する重合性単量体若しくは重合性官能基を有する凝集誘起発光性化合物を用いて重合する方法、又は、重合体骨格に側鎖反応で導入する方法によって、上記重合体骨格上に導入することができる。
上記凝集誘起発光性化合物は、上記重合体骨格上に共重合されていてもよく、カルボキシル基、水酸基、アミノ基、アミド基、エポキシ基等の官能基を介して化学結合されていてもよい。
また、上記凝集誘起発光性基は、上記凝集誘起発光性化合物が重合体骨格と物理的に接している状態とすることによっても、上記重合体骨格上に導入することができる。
上記凝集誘起発光性化合物としては、例えば、テトラフェニルエチレン誘導体、ヘキサフェニルベンゼン誘導体、トリフェニルアミン誘導体、ケトイミンホウ素錯体誘導体、ジイミンホウ素錯体誘導体、アミノマレイミド誘導体、アミノベンゾピロキサンテン誘導体、テトラフェニルシロール誘導体、ペンタフェニルシロール誘導体、ヘキサフェニルシロール誘導体等が挙げられる。なかでも、入手容易性等の観点から、テトラフェニルエチレン誘導体、ヘキサフェニルベンゼン誘導体、トリフェニルアミン誘導体、テトラフェニルシロール誘導体、ペンタフェニルシロール誘導体、ヘキサフェニルシロール誘導体が好ましく、テトラフェニルエチレン誘導体、テトラフェニルシロール誘導体、ペンタフェニルシロール誘導体、ヘキサフェニルシロール誘導体がより好ましい。特に好ましくは、テトラフェニルエチレン誘導体である。
上記テトラフェニルエチレン誘導体としては、フェニル基上に官能基が置換していてもよいテトラフェニルエチレンが挙げられる。具体的には例えば、テトラフェニルエチレン、４－（１，２，２－トリフェニルビニル）フェニル（メタ）アクリレート、ｐ－ヒドロキシテトラフェニルエチレン（メタ）アクリレート、ｐ－カルボキシテトラフェニルエチレン（メタ）アクリレート及びその塩、１－（４－ブロモフェニル）－１，２，２－トリフェニルエチレン、テトラキス（４－ヒドロキシフェニル）エチレン、１，２－Ｂｉｓ［４－（ａｚｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］－１，２－ｄｉｐｈｅｎｙｌｅｔｈｅｎｅ、１，２－Ｂｉｓ［４－（ｂｒｏｍｏｍｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］－１，２－ｄｉｐｈｅｎｙｌｅｔｈｅｎｅ、１，２－Ｂｉｓ（４－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－１，２－ｄｉｐｈｅｎｙｌｅｔｈｅｎｅ、４，４’－Ｂｉｓ（１，２，２－ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｖｉｎｙｌ）－１，１’－ｂｉｐｈｅｎｙｌ、［（１，２－Ｄｉｐｈｅｎｙｌｅｔｈｅｎｅ－１，２－ｄｉｙｌ）ｂｉｓ（４，１－ｐｈｅｎｙｌｅｎｅ）］ｄｉｂｏｒｏｎｉｃ　ａｃｉｄ、４，４’－（１，２－Ｄｉｐｈｅｎｙｌｅｔｈｅｎｅ－１，２－ｄｉｙｌ）ｄｉｂｅｎｚｏｉｃ　ａｃｉｄ、２，２’－［（１，２－Ｄｉｐｈｅｎｙｌ－１，２－ｅｔｈｅｎｅｄｉｙｌ）ｄｉ－４，１－ｐｈｅｎｙｌｅｎｅ］ｂｉｓ［４，４，５，５－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－１，３，２－ｄｉｏｘａｂｏｒｏｌａｎｅ］、１－｛４－［１，２－Ｄｉｐｈｅｎｙｌ－２－（ｐ－ｔｏｌｙｌ）ｖｉｎｙｌ］ｐｈｅｎｙｌ｝－１Ｈ－ｐｙｒｒｏｌｅ－２，５－ｄｉｏｎｅ、１－Ｅｔｈｙｎｙｌ－４－（１，２，２－ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｅｔｈｅｎｙｌ）ｂｅｎｚｅｎｅ、Ｓｏｄｉｕｍ　３，３’－｛［（１，２－ｄｉｐｈｅｎｙｌｅｔｈｅｎｅ－１，２－ｄｉｙｌ）ｂｉｓ（４，１－ｐｈｅｎｙｌｅｎｅ）］ｂｉｓ（ｏｘｙ）｝ｂｉｓ（ｐｒｏｐａｎｅ－１－ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）、４－（１，２，２－Ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｅｔｈｅｎｙｌ）ｂｅｎｚａｌｄｅｈｙｄｅ、Ｂ－［４－（１，２，２－Ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｅｔｈｅｎｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］ｂｏｒｏｎｉｃ　ａｃｉｄ等が挙げられる。
上記ｐ－ヒドロキシテトラフェニルエチレン（メタ）アクリレートのうち水酸基が１つのものとしては、４－（（４－ヒドロキシフェニル）ジフェニルビニル）フェニル（メタ）アクリレート（なお、４－ヒドロキシル基は当該化合物のフェニル基上４位のいずれにあってもよい）が挙げられる。
上記ｐ－ヒドロキシテトラフェニルエチレン（メタ）アクリレートのうち水酸基が２つのものとしては、４－（ビス（４－ヒドロキシフェニル）フェニルビニル）フェニル（メタ）アクリレート（なお、２つの４－ヒドロキシル基は当該化合物のフェニル基上４位のいずれにあってもよい）が挙げられる。
上記ｐ－ヒドロキシテトラフェニルエチレン（メタ）アクリレートのうち水酸基が３つのものとしては、４－（１，２，２－トリス（４－ヒドロキシフェニル）ビニル）フェニル（メタ）アクリレートが挙げられる。
上記ｐ－カルボキシテトラフェニルエチレン（メタ）アクリレートのうちカルボキシル基が１つのものとしては、４－（（４－カルボキシフェニル）ジフェニルビニル）フェニル（メタ）アクリレート（なお、４－カルボキシル基は当該化合物のフェニル基上４位のいずれにあってもよい）が挙げられる。
上記ｐ－カルボキシテトラフェニルエチレン（メタ）アクリレートのうちカルボキシル基が２つのものとしては、４－（ビス（４－カルボキシフェニル）フェニルビニル）フェニル（メタ）アクリレート（なお、２つの４－カルボキシル基は当該化合物のフェニル基上４位のいずれにあってもよい）が挙げられる。
上記ｐ－カルボキシテトラフェニルエチレン（メタ）アクリレートのうちカルボキシル基が３つのものとしては、４－（１，２，２－トリス（４－カルボキシフェニル）ビニル）フェニル（メタ）アクリレートが挙げられる。
なかでも、テトラフェニルエチレン（メタ）アクリレート、ｐ－ヒドロキシテトラフェニルエチレン（メタ）アクリレート、ｐ－カルボキシテトラフェニルエチレン（メタ）アクリレート及びその塩、テトラキス（４－ヒドロキシフェニル）エチレン、４，４’－（１，２－Ｄｉｐｈｅｎｙｌｅｔｈｅｎｅ－１，２－ｄｉｙｌ）ｄｉｂｅｎｚｏｉｃ　ａｃｉｄ、４，４’－（１，２－Ｄｉｐｈｅｎｙｌｅｔｈｅｎｅ－１，２－ｄｉｙｌ）ｄｉｐｈｅｎｏｌが好ましい。
上記テトラフェニルシロール誘導体又は上記ヘキサフェニルシロール誘導体としては、例えば、フェニル基上に１～５個の官能基が置換していてもよい１，１，２，３，４，５－ヘキサフェニルシロール、フェニル基上に１～５個の官能基が置換していてもよい２，３，４，５－テトラフェニル－１，１－ジメチルシロール、フェニル基上に１～５個の官能基が置換していてもよい２，３，４，５－テトラフェニル－１，１－ジアリルシロール、フェニル基上に１～５個の官能基が置換していてもよい１－メチル－１，２，３，４，５－ペンタフェニルシロール等が挙げられる。
上記ヘキサフェニルベンゼン誘導体としては、例えば、４つ以上のフェニル基又はフェニル基誘導体により置換されたベンゼン誘導体等が挙げられる。具体的には例えば、ヘキサフェニルシロール、ヘキサフェニルベンゼン等が挙げられる。
上記トリフェニルアミン誘導体としては、例えば、４－（ジ－ｐ－トリアミノ）ベンズアルデヒド等が挙げられる。
特に、上記凝集誘起発光性化合物は、下記式（３）で表される化合物又は下記式（４）で表される化合物であることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
式（３）中、Ｅは、ケイ素原子又はゲルマニウム原子を示す。Ｒ１１及びＲ１２は、同一であってもよいし、異なっていてもよく、置換基を有していてもよい炭素数１～６の飽和若しくは不飽和炭化水素基、置換基を有していてもよいフェニル基、水素原子、水酸基、ハロゲン原子、アミノ基、カルボキシル基、又は、ニトロ基を示す。Ｒ１３～Ｒ１６は、同一であってもよいし、異なっていてもよく、置換基を有していてもよい芳香族炭化水素基、又は、置換基を有していてもよい芳香族複素環式基を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
式（４）中、Ｒ１７～Ｒ２０は、同一であってもよいし、異なっていてもよく、置換基を有していてもよい炭素数１～６の飽和若しくは不飽和炭化水素基、水素原子、水酸基、ハロゲン原子、アミノ基、カルボキシル基、又は、ニトロ基を示す。
上記アナライトと結合可能な結合パートナーは、該結合パートナーを有する化合物を、凝集誘起発光性基を導入した重合体と反応させることによって上記重合体骨格上に導入することができる。
上記結合パートナーは、上記重合体骨格上に共重合されていてもよく、カルボキシル基、水酸基、アミノ基、アミド基、エポキシ基、トシル基等の官能基を介して化学結合されていてもよい。
上記官能基を介して化学結合する場合、カップリング剤として縮合剤を用いてもよい。
上記縮合剤としては、例えば、カルボジイミド系縮合剤、イミダゾール系縮合剤、トリアジン系縮合剤、ホスホニウム系縮合剤、ウロニウム系縮合剤、ハロウロニウム系縮合剤等が挙げられる。
上記カルボジイミド系縮合剤としては、例えば、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ）、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）等が挙げられる。
上記イミダゾール系縮合剤としては、例えば、Ｎ，Ｎ’－カルボニルジイミダゾール等が挙げられる。
上記トリアジン系縮合剤としては、例えば、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウム＝クロリドｎ水和物（ＤＭＴ－ＭＭ）等が挙げられる。
上記ホスホニウム系縮合剤としては、例えば、１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロりん酸塩（ＢＯＰ）、１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イルオキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロりん酸塩（ＰｙＢＯＰ）等が挙げられる。
上記ウロニウム系縮合剤としては、例えば、Ｏ－（ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロりん酸塩（ＨＢＴＵ）、Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロりん酸塩（ＨＡＴＵ）、｛｛［（１－シアノ－２－エトキシ－２－オキソエチリデン）アミノ］オキシ｝－４－モルホリノメチレン｝ジメチルアンモニウムヘキサフルオロりん酸塩（ＣＯＭＵ）等が挙げられる。
上記ハロウロニウム系縮合剤としては、例えば、１－（クロロ－１－ピロリジニルメチレン）ピロリジニウムヘキサフルオロりん酸塩（ＰｙＣＩＵ）等が挙げられる。
また、上記縮合剤に加えて反応促進剤を用いてもよい。
上記反応促進剤としては、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、Ｎ－ヒドロキシこはく酸イミド（ＨＯＳｕ）、炭酸Ｎ，Ｎ’－ジスクシンイミジル（ＤＳＣ）等が挙げられる。
また、上記結合パートナーは、該結合パートナーを有する化合物が重合体骨格と物理的に接している状態とすることによっても、上記重合体骨格上に導入することができる。
上記アナライトは特に限定されず、例えば、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、糖、核酸、ハプテン等、理論的に測定法により測定可能な分子が挙げられる。具体的には例えば、ＣＲＰ（Ｃ反応性タンパク質）、Ｌｐ（ａ）（リポプロテイン（ａ））、ＭＭＰ３（マトリクスメタロプロテイナーゼ３）、抗ＣＣＰ（環状シトルリン化ペプチド）抗体、抗リン脂質抗体、抗梅毒抗原抗体、ＲＰＲ、ＩＶ型コラーゲン、ＰＳＡ、ＡＦＰ、ＣＥＡ、ＢＮＰ（脳性ナトリウム利尿ペプチド）、ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ、インスリン、マイクロアルブミン、シスタチンＣ、ＲＦ（リウマチ因子）、ＣＡ－ＲＦ、ＫＬ－６、ＰＩＶＫＡ－ＩＩ、ＦＤＰ、Ｄダイマー、ＳＦ（可溶性フィブリン）、ＴＡＴ（トロンビン－アンチトロンビンＩＩＩ複合体）、ＰＩＣ、ＰＡＩ、ＸＩＩＩ因子、ペプシノーゲンＩ、ペプシノーゲンＩＩ、フェニトイン、フェノバルビタール、カルバマゼピン、バルプロ酸、テオフィリン等が挙げられる。
また、本発明の重合体は、上記アナライトとして放射性物質の測定にも好適に用いることができる。
上記放射性物質としては、例えば、コバルト６０（６０Ｃｏ）、ストロンチウム９０（９０Ｓｒ）、放射性ジルコニウム、テクネチウム９９（９９Ｔｃ）、ルテニウム１０６（１０６Ｒｕ）、放射性ヨウ素、放射性セシウム、放射性トリウム、放射性ウラン、放射性プルトニウム、放射性アメリシウム、放射性キュリウム等が挙げられる。
上記放射性ジルコニウムとしては、例えば、ジルコニウム９３（９３Ｚｒ）、ジルコニウム９５（９５Ｚｒ）等が挙げられる。
上記放射性ヨウ素としては、例えば、ヨウ素１２９（１２９Ｉ）、ヨウ素１３１（１３１Ｉ）等が挙げられる。
上記放射性セシウムとしては、例えば、セシウム１３７（１３７Ｃｓ）やセシウム１３４（１３４Ｃｓ）等が挙げられる。
上記放射性トリウムとしては、例えば、トリウム２３０（２３０Ｔｈ）等が挙げられる。
上記放射性ウランとしては、例えば、ウラン２３５（２３５Ｕ）やウラン２３８（２３８Ｕ）等が挙げられる。
上記放射性プルトニウムとしては、例えば、プルトニウム２４０（２４０Ｐｕ）等が挙げられる。
上記放射性アメリシウムとしては、例えば、アメリシウム２４２（２４２Ａｍ）等が挙げられる。
上記放射性キュリウムとしては、例えば、キュリウム２４４（２４４Ｃｍ）等が挙げられる。
上記結合パートナーは上記アナライトの種類に応じて適宜選ばれ、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、核酸、ハプテン等に由来する基が挙げられる。
また、上記アナライトが上記放射性物質である場合、上記結合パートナーは、直鎖状ポリエーテル類、環状エーテル類、カリックスアレーン類、大環状複素環化合物類、シクロデキストリン類、テトラフェニルホウ酸類、及び、これらの誘導体からなる群より選択される少なくとも一種の化合物に由来する基であることが好ましく、下記式（５）で表される化合物に由来する基であることがより好ましい。下記式（５）で表される化合物に由来する基において、結合手は、ベンゼン環上のいずれかの位置、又は、カルボニル基に結合するメチル基上のいずれかの位置に存在することが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
特に、本発明の重合体が臨床検査薬に好適に用いることができるようになることから、上記結合パートナーは、抗体又は抗原であることが好ましい。
本発明の重合体は、糖鎖が検体中の物質に想定外に相互作用する場合があることから、重合体主鎖に糖鎖を有さないことが好ましく、糖鎖を有さないことがより好ましい。
本発明の重合体は、親水性であることが好ましい。具体的には、本発明の重合体は、溶解性パラメーターが１２～２５（ｃａｌ／ｃｃ）１／２である液体に溶解、即ち、溶媒和し均一に分散するものであることが好ましい。上記溶解性パラメーターが１２～２５（ｃａｌ／ｃｃ）１／２である液体に上記重合体が溶解することにより、沈殿やバックグラウンド蛍光を抑制しつつ、アナライトの検出感度により優れるものとなる。
本発明の重合体は、オリゴマーであってもよいし、ポリマーであってもよい。
また、本発明の重合体は、数平均重合度が２０以上７万以下、及び、数平均分子量が２０００以上５００万以下の少なくともいずれかを満たすことが好ましい。上記数平均重合度及び上記数平均分子量の少なくともいずれかが上記範囲であることにより、沈殿やバックグラウンド蛍光を抑制しつつ、アナライトの検出感度により優れるものとなる。
上記数平均重合度のより好ましい下限は１２５、より好ましい上限は１４０００である。
上記数平均分子量のより好ましい下限は１万、より好ましい上限は１００万である。
なお、本明細書において、上記数平均重合度及び上記数平均分子量は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で溶媒として１５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて測定を行い、キャリブレーション標準（オブアルブミン、ミオグロビン、アプロチニン、ニューロテンシン、アンギオテンシンＩＩ）の測定結果から求められる値である。ＳＥＣによる上記数平均分子量を測定する際のカラムとしては、例えば、ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏ　ＳＥＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）等が挙げられる。
本発明の重合体を製造する方法としては、例えば、以下の方法等が挙げられる。
即ち、まず、溶媒中に、上記重合性単量体と、上記凝集誘起発光性化合物と、重合開始剤とを溶解させる。次いで、得られた溶液を加熱しながら撹拌することで、凝集誘起発光性基を導入した重合体を得る。次いで、得られた凝集誘起発光性基を導入した重合体の水分散液に、アナライトの種類に応じた結合パートナーを有する化合物を加えて反応させることにより、本発明の重合体を得ることができる。上記結合パートナーを有する化合物を加えて反応させる際に上記縮合剤及び上記反応促進剤を用いてもよい。
上記溶媒としては、例えば、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、酢酸エチル、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、エタノール、メタノール、水等が挙げられる。
上記重合開始剤としては、例えば、アゾビスイソブチロニトリル、過酸化ベンゾイル等の油溶性開始剤、過硫酸カリウム、過硫酸アンモニウム等の水溶性開始剤等が挙げられる。
本発明の重合体は、検査薬に好適に用いられる。本発明の重合体を含む検査薬もまた、本発明の１つである。
本発明の検査薬は、臨床検査薬として、抗原抗体反応を利用した酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、イムノクロマトグラフ法等の生物学的反応を利用した種々の方法に好適に用いることができる。
また、本発明の検査薬は、放射性物質の測定にも好適に用いられる。本発明の検査薬を用いれば、低コストかつ簡易に放射性物質を測定することができる。
アナライトを含有する試料溶液と、本発明の重合体を含有する溶液とを混合して混合液を調製する工程と、上記混合液中の上記重合体から発生する蛍光強度を測定する工程と、アナライト濃度に対する蛍光強度の検量線と上記重合体から発生する蛍光強度とを対比して、上記重合体から発生する蛍光強度と上記混合液中のアナライト濃度とを関連付ける工程とを有するアナライト濃度測定法もまた、本発明の１つである。
上記混合液中の上記重合体から発生する蛍光強度を測定する工程では、混合液に励起光を照射する工程、及び、混合液が発する蛍光や燐光等の発光強度の変化量を測定する工程を行うことが好ましい。
本発明のアナライト濃度測定法に用いられるアナライト濃度測定装置もまた、本発明の１つである。
本発明のアナライト濃度測定装置としては、迅速かつ簡便に測定を行うことができる自動分析装置の利用が適しており、蛍光や燐光等の発光強度を測定できる自動分析装置が好ましい。
上記混合液に励起光を照射する工程に用いられる光源は特に限定されない。
また、上記混合液に励起光を照射する工程で照射される光の波長としては、紫外光領域の波長が適しており、特に１０ｎｍ～４００ｎｍの波長が好適である。
上述した自動分析装置においては、アナライトを含む試料溶液と、本発明の重合体を含有する溶液との混合直後から、最大１０００秒までの任意の２時点における蛍光強度の変化量を測定できる。特に、混合直後から３００秒以内の２時点の蛍光強度の変化量を測定することにより、１試料あたりの総測定時間を１０分以内とすることができ、市販されている各種自動分析装置の最大検体処理速度の利益を享受することができる。
上記混合液に励起光を照射する工程における光の照射角度としては、１５度～３５度が好ましい。上記照射角度をこの範囲とすることにより、蛍光を検知するための受光部において透過光の影響を強く受けず、また、蛍光を受光する能力に関しても有利となる。上記照射角度は、２０度～３０度がより好ましい。
上記蛍光強度の変化量は、２時点間の差や比、単位時間あたりの換算値等、適用可能な算出法であれば特に制限はない。
上記重合体から発生する蛍光強度と上記混合液中のアナライト濃度とを関連付ける工程では、既知濃度のアナライト含有試料を用いて作成した、蛍光強度の検量線を用いることが好ましい。ダイナミックレンジが広い蛍光強度の測定では、より広い濃度範囲で検量線を作成することが好ましい。
なお、本発明のアナライト濃度測定法においては、低濃度のアナライト測定値の正確性や再現性が良好であることが高感度の指標となる。
また、上記「ダイナミックレンジ」とは、測定可能な最大のアナライト量までの範囲を意味する。本発明のアナライト濃度測定法のダイナミックレンジは、アナライト濃度に比例した光量変化が検出できる範囲となる。
本発明によれば、バックグラウンド蛍光を抑制でき、かつ、良好な検出感度でアナライトを測定できる重合体を提供することができる。また、本発明によれば、該重合体を含む検査薬、該重合体を用いたアナライト濃度測定法、及び、該アナライト濃度測定法に用いられるアナライト濃度測定装置を提供することができる。
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されない。
（合成例１）
４－（１，２，２－トリフェニルビニル）フェニルアクリレート１重量部と、アクリル酸９９重量部と、アゾビスイソブチロニトリル５重量部と、Ｎ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド１００重量部とをナスフラスコに投入し、均一に撹拌した。その後、加熱を開始して６０℃で１８時間反応させ、凝集誘起発光性基を導入した重合体を得た。
得られた凝集誘起発光性基を導入した重合体を水に分散させた分散液に、シアル化糖鎖抗原ＫＬ－６（以下、単に「ＫＬ－６」ともいう）抗体を含むＰＢＳ溶液（ＫＬ－６抗体濃度０．７５ｍｇ／ｍＬ）２重量部を加えた。次いで、２５℃で２４時間撹拌することにより、重合体Ａを得た。
１Ｈ－ＮＭＲ及びＦＴ－ＩＲ測定により、得られた重合体Ａは、鎖状のポリアクリル酸骨格上に、凝集誘起発光性基として上記式（２）で表される基（Ｒ７が結合手、Ｒ８～Ｒ１０が水素原子）と、結合パートナーとしてＫＬ－６抗体に由来する基とを有する重合体であることを確認した。
また、得られた重合体Ａについて、ＳＥＣで溶媒として１５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて測定を行い、キャリブレーション標準の測定結果から求められた数平均重合度は３５０、数平均分子量は２５０００であった。
（合成例２）
アゾビスイソブチロニトリルの添加量を１重量部に変更したこと以外は、合成例１と同様にして重合体Ｂを得た。
１Ｈ－ＮＭＲ及びＦＴ－ＩＲ測定により、得られた重合体Ｂは、鎖状のポリアクリル酸骨格上に、凝集誘起発光性基として上記式（２）で表される基（Ｒ７が結合手、Ｒ８～Ｒ１０が水素原子）と、結合パートナーとしてＫＬ－６抗体に由来する基とを有する重合体であることを確認した。
また、得られた重合体Ｂについて、ＳＥＣで溶媒として１５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて測定を行い、キャリブレーション標準の測定結果から求められた数平均重合度は１４００、数平均分子量は１０万であった。
（合成例３）
アゾビスイソブチロニトリルの添加量を０．００１重量部に変更したこと以外は、合成例１と同様にして重合体Ｃを得た。
１Ｈ－ＮＭＲ及びＦＴ－ＩＲ測定により、得られた重合体Ｃは、鎖状のポリアクリル酸骨格上に、凝集誘起発光性基として上記式（２）で表される基（Ｒ７が結合手、Ｒ８～Ｒ１０が水素原子）と、結合パートナーとしてＫＬ－６抗体に由来する基とを有する重合体であることを確認した。
また、得られた重合体Ｃについて、ＳＥＣで溶媒として１５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて測定を行い、キャリブレーション標準の測定結果から求められた数平均重合度は５５０００、数平均分子量は４００万であった。
（合成例４）
４－（１，２，２－トリフェニルビニル）フェニルアクリレート１重量部に代えて４－（１，２，２－トリス（４－ヒドロキシフェニル）ビニル）フェニルアクリレート１重量部を用いたこと以外は、合成例１と同様にして重合体Ｄを得た。
１Ｈ－ＮＭＲ及びＦＴ－ＩＲ測定により、得られた重合体Ｄは、鎖状のポリアクリル酸骨格上に、凝集誘起発光性基として上記式（２）で表される基（Ｒ７が結合手、Ｒ８～Ｒ１０が水酸基）と、結合パートナーとしてＫＬ－６抗体に由来する基とを有する重合体であることを確認した。
また、得られた重合体Ｄについて、ＳＥＣで溶媒として１５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて測定を行い、キャリブレーション標準の測定結果から求められた数平均重合度は１３５０、数平均分子量は１０万であった。
（合成例５）
４－（１，２，２－トリフェニルビニル）フェニルアクリレート１重量部に代えて４－（１，２－ビス（４－カルボキシフェニル）２－フェニルビニル）フェニルアクリレート１重量部を用いたこと以外は、合成例１と同様にして重合体Ｅを得た。
１Ｈ－ＮＭＲ及びＦＴ－ＩＲ測定により、得られた重合体Ｅは、鎖状のポリアクリル酸骨格上に、凝集誘起発光性基として上記式（２）で表される基（Ｒ７が結合手、Ｒ８及びＲ９がカルボキシル基、Ｒ１０が水素原子）と、結合パートナーとしてＫＬ－６抗体に由来する基とを有する重合体であることを確認した。
また、得られた重合体Ｅについて、ＳＥＣで溶媒として１５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて測定を行い、キャリブレーション標準の測定結果から求められた数平均重合度は１３３０、数平均分子量は１０万であった。
（合成例６）
４－（１，２，２－トリス（４－ヒドロキシフェニル）ビニル）フェニルアクリレートの添加量を５重量部に変更し、アクリル酸の添加量を９５重量部に変更したこと以外は、合成例４と同様にして重合体Ｆを得た。
１Ｈ－ＮＭＲ及びＦＴ－ＩＲ測定により、得られた重合体Ｆは、鎖状のポリアクリル酸骨格上に、凝集誘起発光性基として上記式（２）で表される基（Ｒ７が結合手、Ｒ８～Ｒ１０が水酸基）と、結合パートナーとしてＫＬ－６抗体に由来する基とを有する重合体であることを確認した。
また、得られた重合体Ｆについて、ＳＥＣで溶媒として１５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて測定を行い、キャリブレーション標準の測定結果から求められた数平均重合度は１３００、数平均分子量は１０万であった。
（合成例７）
アクリル酸９５重量部を、アクリル酸９４重量部及びエチレングリコールジアクリレート（ＥＧＤＡ）１重量部に変更したこと以外は、合成例６と同様にして重合体Ｇを得た。
１Ｈ－ＮＭＲ及びＦＴ－ＩＲ測定により、得られた重合体Ｇは、網状のアクリル酸／ＥＧＤＡ共重合体骨格上に、凝集誘起発光性基として上記式（２）で表される基（Ｒ７が結合手、Ｒ８～Ｒ１０が水酸基）と、結合パートナーとしてＫＬ－６抗体に由来する基とを有する重合体であることを確認した。
また、得られた重合体Ｇについて、ＳＥＣで溶媒として１５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて測定を行い、キャリブレーション標準の測定結果から求められた数平均重合度は１３５０、数平均分子量は１０万であった。
（合成例８）
合成例６と同様にして得られた凝集誘起発光性基を導入した重合体を重合体Ｈとした。
１Ｈ－ＮＭＲ及びＦＴ－ＩＲ測定により、得られた重合体Ｈは、鎖状のポリアクリル酸骨格上に、凝集誘起発光性基として上記式（２）で表される基（Ｒ７が結合手、Ｒ８～Ｒ１０が水酸基）を有し、ＫＬ－６抗原と結合可能な結合パートナーを有さない重合体であることを確認した。
また、得られた重合体Ｈについて、ＳＥＣで溶媒として１５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて測定を行い、キャリブレーション標準の測定結果から求められた数平均重合度は１３００、数平均分子量は１０万であった。
（合成例９）
水１００重量部に、スチレン３．６重量部、及び、重合開始剤としてＶ－５０（富士フイルム和光純薬社製）０．１３６重量部を混合した。得られた混合液を６０℃で４時間撹拌した後、２－クロロプロピオニルオキシエチルメタクリレート０．３７５重量部を添加して更に６０℃で６時間撹拌した。得られた溶液をろ過した後、遠心分離により精製し、コア粒子を得た。
得られたコア粒子を含有割合が１．０重量％となるように水中に分散させ、分散液を得た。得られた分散液３０重量部に、金属錯体として塩化銅（Ｉ）／トリス［２－（ジメチルアミノ）エチル］アミンの存在下で、メタクリル酸０．５１７重量部、及び、還元剤としてアスコルビン酸２１．１重量部を添加し、３０℃で２時間撹拌した。得られた溶液を遠心分離により精製し、コア粒子の表面に有機グラフト鎖を付与した。
得られた粒子１．０重量部をエチレングリコール中に分散させ、４－（１，２，２－トリフェニルビニル）フェノール０．５７８重量部、及び、塩酸１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド０．２８重量部を加え、室温で６時間撹拌した。得られた分散液を遠心分離により精製し、有機グラフト鎖に凝集誘起発光性基を導入した。
得られた有機グラフト鎖に凝集誘起発光性基を導入した粒子を含有割合が０．５重量％となるように水中に分散させ、分散液を得た。得られた分散液１０重量部にＫＬ－６抗体を含むＰＢＳ溶液（ＫＬ－６抗体濃度０．７５ｍｇ／ｍＬ）２０重量部を加え、室温で２４時間撹拌した。得られた溶液を遠心分離により精製し、凝集発光性材料を表面に有する凝集発光性材料含有粒子を得た。
（合成例１０）
種粒子として平均粒子径０．１５μｍのポリスチレン粒子を用意した。凝集誘起発光性化合物としてテトラフェニルエチレン０．５重量部と、酢酸エチル５重量部と、スチレンスルホン酸ナトリウム０．１重量部と、イオン交換水１０重量部とを混合し、乳化液を調製した。上記種粒子１重量部の分散液に上記乳化液を加え、室温にて２４時間撹拌して、テトラフェニルエチレンと酢酸エチルを吸収した種粒子の膨潤粒子液滴の分散液を得た。
　得られた膨潤粒子液滴の分散液を６５℃で２４時間撹拌することで酢酸エチルを乾燥させ、凝集発光性材料含有粒子を得た。
（合成例１１）
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）とＫＬ－６抗体を含むＰＢＳ溶液（ＫＬ－６抗体濃度０．７５ｍｇ／ｍＬ）とを用いて、ＳＤＳ濃度が１．０×１０－２ｍｏｌ／ＬのＰＢＳ溶液（以下、「ＳＤＳ溶液」ともいう）を調製した。また、２，３，４，５－テトラフェニル－１，１－ジメチルシロール（ＴＰＳ）とメタノールとを用いて、ＴＰＳ濃度が１．０×１０－３ｍｏｌ／Ｌのメタノール溶液（以下、「ＴＰＳ溶液」ともいう）を調製した。
ＳＤＳ溶液１０ｍＬにＴＰＳ溶液０．１ｍＬを添加し、１時間撹拌した後、冷暗所で一晩静置することにより、凝集発光性材料内包ミセルを得た。
（実施例１～７、比較例１～４）
合成例１～８で得られた重合体Ａ～Ｈ、合成例９、１０で得られた凝集発光性材料含有粒子、合成例１１で得られた凝集発光性材料内包ミセルを、それぞれ表１に示した濃度で含有する水溶液又は水分散液を得た。
＜評価＞
実施例及び比較例で得られた各水溶液又は水分散液について以下の評価を行った。結果を表１に示した。
（蛍光強度）
ウシ血清アルブミンを含む緩衝液中にアナライトとしてＫＬ－６抗原を添加して撹拌し、アナライトを含む試料溶液（アナライト濃度１００Ｕ／ｍＬ）を調製した。得られたアナライトを含む試料溶液１重量部と、実施例及び比較例で得られた各水溶液又は水分散液１０重量部とを混合して混合液を得た。得られた混合液をウェイブローターで１分間振とうさせた。
振とう前の混合液（混合直後）の蛍光強度を抗原抗体反応前の蛍光強度、振とう後の混合液の蛍光強度を抗原抗体反応後の蛍光強度として、Ｆ－２７００（日立ハイテクサイエンス社製）を用いて、それぞれの蛍光強度を測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
実施例４～６から、テトラフェニルエチレン上の官能基を親水性基にすることで、バックグラウンドを低く保ったまま、重合体の水に対する溶解度を向上させることができ、その結果、アナライトと結合パートナーが相互作用する頻度が増加し、より多くの重合体が凝集することで抗原抗体反応後の蛍光強度が増大することが分かる。
本発明によれば、バックグラウンド蛍光を抑制でき、かつ、良好な検出感度でアナライトを測定できる重合体を提供することができる。また、本発明によれば、該重合体を含む検査薬、該重合体を用いたアナライト濃度測定法、及び、該アナライト濃度測定法に用いられるアナライト濃度測定装置を提供することができる。

Claims (10)

  1. 凝集誘起発光性基を重合体骨格上に有し、かつ、アナライトと結合可能な結合パートナーを該重合体骨格上に有することを特徴とする重合体。
  2. 前記重合体骨格は、鎖状である請求項１記載の重合体。
  3. 数平均重合度が２０以上７万以下、及び、数平均分子量が２０００以上５００万以下の少なくともいずれかを満たす請求項１又は２記載の重合体。
  4. 重合体主鎖に糖鎖を有さない請求項１、２又は３記載の重合体。
  5. 糖鎖を有さない請求項４記載の重合体。
  6. 前記結合パートナーは、抗体又は抗原である請求項１、２、３、４又は５記載の重合体。
  7. 前記凝集誘起発光性基は、下記式（１）で表される基又は下記式（２）で表される基である請求項１、２、３、４、５又は６記載の重合体。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     式（１）中、Ｅは、ケイ素原子又はゲルマニウム原子を示し、Ｒ１及びＲ２は、同一であってもよいし、異なっていてもよく、置換基を有していてもよい炭素数１～６の飽和若しくは不飽和炭化水素基、置換基を有していてもよいフェニル基、水素原子、水酸基、ハロゲン原子、アミノ基、カルボキシル基、又は、ニトロ基を示す。Ｒ３～Ｒ６のいずれか１つは結合手であり、Ｒ３～Ｒ６のうち結合手でないものは、同一であってもよいし、異なっていてもよく、置換基を有していてもよい芳香族炭化水素基、又は、置換基を有していてもよい芳香族複素環式基を示す。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     式（２）中、Ｒ７～Ｒ１０のいずれか１つは結合手であり、Ｒ７～Ｒ１０のうち結合手でないものは、同一であってもよいし、異なっていてもよく、置換基を有していてもよい炭素数１～６の飽和若しくは不飽和炭化水素基、水素原子、水酸基、ハロゲン原子、アミノ基、カルボキシル基、又は、ニトロ基を示す。
  8. 請求項１、２、３、４、５、６又は７記載の重合体を含む検査薬。
  9. アナライトを含有する試料溶液と、請求項１、２、３、４、５、６又は７記載の重合体を含有する溶液とを混合して混合液を調製する工程と、
    前記混合液中の前記重合体から発生する蛍光強度を測定する工程と、
    アナライト濃度に対する蛍光強度の検量線と前記重合体から発生する蛍光強度とを対比して、前記重合体から発生する蛍光強度と前記混合液中のアナライト濃度とを関連付ける工程と
    を有するアナライト濃度測定法。
  10. 請求項９記載のアナライト濃度測定法に用いられるアナライト濃度測定装置。
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