WO2015015844A1 - イオンセンサ - Google Patents

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WO2015015844A1
WO2015015844A1 PCT/JP2014/060519 JP2014060519W WO2015015844A1 WO 2015015844 A1 WO2015015844 A1 WO 2015015844A1 JP 2014060519 W JP2014060519 W JP 2014060519W WO 2015015844 A1 WO2015015844 A1 WO 2015015844A1
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WO
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group
repeating unit
poly
substituent
copolymer
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PCT/JP2014/060519
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福島　孝典
文崇 石割
花子 長谷部
隆夫 染谷
毅 関谷
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独立行政法人科学技術振興機構
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    • G01N33/84—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving inorganic compounds or pH
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    • G01N31/22—Investigating or analysing non-biological materials by the use of the chemical methods specified in the subgroup; Apparatus specially adapted for such methods using chemical indicators

Definitions

  • the present invention relates to a novel copolymer and a device for detecting polyvalent metal ions using the same.
  • calcium plays an important role in muscle contraction, nerve excitatory conduction, enzyme activation, hormone secretion, etc. It acts as an activator of antagonism with Na and K ions, regulation of muscle and nerve excitability, nerve stimulation transmission, blood coagulation, and enzyme activity. Therefore, it is important to measure the distribution and change of calcium ions in the living body in real time in the discovery of diseases, the course of treatment, the study of physiological functions, and the like.
  • the extracellular calcium ion concentration is 1 to 2 mM, while the intracellular calcium ion concentration is 50 to 100 nM, which is 1 / 10,000 of the extracellular cell.
  • Non-patent Document 1 a compound (Fura-2) having a glycol ether diamine tetraacetic acid (EGTA) skeleton has been reported (Non-patent Document 1).
  • this sensor has a large association constant with a pKa of about 6 to 10, it can detect a calcium ion concentration of nM order, but cannot detect an extracellular calcium ion concentration.
  • it has only irreversible sensing ability under extracellular calcium concentration and is difficult to integrate with a device, and is only used for in vitro imaging in cells.
  • An object of the present invention is to provide a compound useful as a multivalent metal ion sensor such as calcium capable of reversible sensing and capable of being made into a device, and an ion sensor using the compound.
  • the present inventor has paid attention to a polymer having a carboxyl group in the side chain represented by polyacrylic acid, manufactured a copolymer in which a compound having an aggregation-inducing light-emitting ability is introduced into a part thereof, and has various metal ion sensing effects.
  • a polyvalent metal ion such as calcium ion
  • fluorescence is generated by the aggregation-induced luminescent compound, and the fluorescence is reversible.
  • the copolymer can be immobilized on a solid substrate or the like. As a result, the present invention was completed.
  • the present invention provides [1] to [15].
  • the repeating unit (A) is a repeating unit derived from a monomer selected from acrylic acid, methacrylic acid, and styrene carboxylic acid.
  • the repeating unit (B) is a repeating unit derived from a monomer selected from acrylate, methacrylate, and styrene carboxylate having an ester residue derived from the compound represented by the following formula (1) or (2) [ [1] or [2] copolymer.
  • R 1 is the same or different and represents an aromatic hydrocarbon group which may have a substituent or an aromatic heterocyclic group which may have a substituent
  • E 1 Represents a silicon atom or a germanium atom
  • a 1 and B 1 are the same or different, each represents a hydrocarbon group
  • n represents an integer of 1 to 4
  • R 2 and R 3 are the same or different and each represents an aromatic hydrocarbon group which may have a substituent or an aromatic heterocyclic group which may have a substituent.
  • a 2 and B 2 are the same or different and each represents a hydrogen atom, a hydrocarbon group which may have a substituent, or an aromatic heterocyclic group which may have a substituent.
  • the compound represented by the formula (1) or (2) may be substituted with 1 to 5 hydrophilic groups on the phenyl group, 1-methyl-1,2,3,4,5
  • the copolymer according to [3] which is pentaphenylsilole, 2,3,4,5-tetraphenyl-1,1-dimethylsilole or tetraphenylethylene.
  • a device for detecting polyvalent metal ions comprising the copolymer according to any one of [1] to [10].
  • the device for detecting polyvalent metal ions according to [11], wherein the copolymer according to any one of [1] to [10] is immobilized on a solid substrate.
  • the polyvalent compound according to [12], wherein the means for immobilizing the copolymer according to any one of [1] to [10] on the solid substrate is based on a covalent bond between the solid substrate and the copolymer.
  • Metal ion detection device [14] A method for quantifying a polyvalent metal ion concentration in a sample, wherein the sample is brought into contact with the device according to any one of [1] to [13] and the fluorescence intensity is measured. [15] A compound represented by the following formula (3).
  • R 4 represents a hydrogen atom or a methyl group
  • R 5 represents a direct bond, an alkylene group having 1 to 8 carbon atoms or a phenylene group
  • X represents the following formula (1) or (2)
  • R 1 is the same or different and represents an aromatic hydrocarbon group which may have a substituent or an aromatic heterocyclic group which may have a substituent
  • E 1 Represents a silicon atom or a germanium atom
  • a 1 and B 1 are the same or different and represent a hydrocarbon group
  • n represents an integer of 1 to 4.
  • R 2 and R 3 are the same or different and each represents an aromatic hydrocarbon group which may have a substituent or an aromatic heterocyclic group which may have a substituent.
  • a 2 and B 2 are the same or different and each represents a hydrogen atom, a hydrocarbon group which may have a substituent, or an aromatic heterocyclic group which may have a substituent.
  • copolymer of the present invention polyvalent metal ions typified by calcium ions can be detected with high sensitivity, and the detectability (luminousness) is reversible. Further, the copolymer of the present invention can be easily fixed to a resinous substrate or the like. Therefore, if the copolymer of the present invention is used, a device for detecting polyvalent metal ions represented by calcium ions can be produced.
  • the fluorescence intensity of poly-1 0.05 with respect to the Ca 2+ concentration is shown.
  • Changes in the fluorescence intensity of poly-1 0.05 with respect to Na + , K + , Mg 2+ and Ca 2+ concentrations are shown.
  • 1 shows the Ca 2+ sensing ability of poly-1 0.05 for various polyvalent metal ions. It shows the Ca 2+ sensing ability of poly-1 0.05 in the presence of Na + and Mg 2+ .
  • the effect of EDTA on the Ca 2+ sensing ability of poly-1 0.05 is shown.
  • the change of Ca 2+ sensing ability by the composition change of poly-1 is shown.
  • Changes in fluorescence intensity of poly-1 0.05 are shown in (a) 5 mg / L, (b) 10 mg / L, and (c) 50 mg / L.
  • Changes in fluorescence intensity of poly-1 0.05 are shown in (a) 5 mg / L, (b) 10 mg / L, and (c) 50 mg / L.
  • the effect of adding Et 3 N and TFA on the calcium sensing ability of poly-1 0.05 is shown.
  • the Ca 2+ sensing ability by the composition change of gel-1 is shown.
  • gel-1 0.015 Ca 2+ reversibility.
  • the relationship between the fluorescence quantum yield of a gel and Ca2 + sensing ability is shown.
  • the reproducibility of change in calcium concentration and fluorescence quantum yield is shown.
  • the structural conceptual diagram of a flexible sensor is shown in combination with OLED and OPV on a flexible substrate.
  • the copolymer of the present invention has at least a repeating unit (A) having a carboxyl group in the side chain and a repeating unit (B) having a carboxylate group having an ester residue that exhibits aggregation-induced light-emitting ability in the side chain.
  • the main chain is not particularly limited as long as it has a carboxyl group (—COOH) in the side chain, but a main chain by radical polymerization is preferred.
  • a main chain by radical polymerization is preferred.
  • R 4 represents a hydrogen atom or a methyl group.
  • the main chain represented by is preferable.
  • main chain and the carboxyl group may be directly bonded, or may be via a divalent hydrocarbon group such as an alkylene group having 1 to 8 carbon atoms or a phenylene group. More preferably.
  • repeating unit (A) are preferably repeating units derived from monomers such as acrylic acid, methacrylic acid, and styrene carboxylic acid, and more preferably a repeating unit represented by the formula (5).
  • R 4 represents a hydrogen atom or a methyl group
  • R 5 represents a direct bond, an alkylene group having 1 to 8 carbon atoms, or a phenylene group.
  • the repeating unit (B) has a carboxylate group having an ester residue exhibiting aggregation-induced light-emitting ability in the side chain.
  • ester residue that exhibits aggregation-induced luminescence ability include groups derived from the compound represented by the following formula (1) or (2).
  • R 1 is the same or different and represents an aromatic hydrocarbon group which may have a substituent or an aromatic heterocyclic group which may have a substituent
  • E 1 Represents a silicon atom or a germanium atom
  • a 1 and B 1 are the same or different and represent a hydrocarbon group
  • n represents an integer of 1 to 4.
  • R 2 and R 3 are the same or different and each represents an aromatic hydrocarbon group which may have a substituent or an aromatic heterocyclic group which may have a substituent.
  • a 2 and B 2 are the same or different and each represents a hydrogen atom, a hydrocarbon group which may have a substituent, or an aromatic heterocyclic group which may have a substituent.
  • Examples of the aromatic hydrocarbon group represented by R 1 , R 2 and R 3 include aromatic hydrocarbon groups having 6 to 14 carbon atoms, and specific examples include a phenyl group, a naphthyl group, and a biphenyl group.
  • the aromatic heterocyclic group is preferably an aromatic heterocyclic group having 1 to 3 nitrogen atoms, oxygen atoms or sulfur atoms, such as a pyrrolyl group, an imidazolyl group, a pyridyl group, a pyrimidinyl group, a thienyl group, Examples include thiazolyl groups.
  • the group that can be substituted with these aromatic hydrocarbon groups or aromatic heterocyclic groups is preferably a hydrophilic group, and is a hydroxy group, amino group, alkylamino group, dialkylamino group, sulfo group, thiol group, polyoxy group. More preferred are 1 to 5 groups selected from an ethylene group, a polyoxypropylene group, and a sulfinyl group.
  • the alkylamino group and the dialkylamino group are preferably a C 1 -C 6 alkylamino group and a di (C 1 -C 6 alkyl) amino group.
  • R 1 , R 2 and R 3 is a phenyl group which may have 1 to 5 hydrophilic substituents.
  • the hydrocarbon group represented by A 1 and B 1 is preferably an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms or an aromatic hydrocarbon group.
  • the alkyl group include a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an n-butyl group, and an isopropyl group.
  • the aromatic hydrocarbon group is preferably the same aromatic hydrocarbon group as R 1 , R 2 and R 3 , particularly a phenyl group which may have 1 to 5 hydrophilic substituents.
  • the aromatic hydrocarbon group or aromatic heterocyclic group represented by R 1 , R 2 and R 3 are preferable.
  • the group that can be substituted with these hydrocarbon group or heterocyclic group is preferably a hydrophilic group, and is a hydroxy group, an amino group, an alkylamino group, a dialkylamino group, a sulfo group, a thiol group, a polyoxyethylene group, More preferred are 1 to 5 groups selected from a polyoxypropylene group and a sulfinyl group.
  • the alkylamino group and the dialkylamino group are preferably a C 1 -C 6 alkylamino group and a di (C 1 -C 6 alkyl) amino group.
  • a preferable example of A 2 and B 2 is a phenyl group which may have 1 to 5 hydrophilic groups.
  • N is particularly preferably 4.
  • Particularly preferred examples of the compound represented by the formula (1) are 2,3,4,5-tetraphenyl-1,1-1 in which the 1 to 5 hydrophilic groups may be substituted on the phenyl group.
  • TPS 1-methyl-1,2,3,4,5-pentaphenylsilole
  • a particularly preferred example of the compound represented by the formula (2) is tetraphenylethylene (TPE) in which the 1 to 5 hydrophilic groups may be substituted on the phenyl group.
  • the main chain is not particularly limited, but a main chain by radical polymerization is preferred.
  • a main chain by radical polymerization is preferred.
  • R 4 represents a hydrogen atom or a methyl group.
  • the main chain represented by is preferable.
  • main chain and the carboxylate group may be directly bonded, or may be via a divalent hydrocarbon group such as an alkylene group having 1 to 8 carbon atoms or a phenylene group. It is more preferable that
  • repeating unit (B) are preferably repeating units derived from monomers such as acrylate, methacrylate, styrene carboxylate, and more preferably a repeating unit represented by the formula (7).
  • R 4 represents a hydrogen atom or a methyl group
  • R 5 represents a direct bond, an alkylene group having 1 to 8 carbon atoms, or a phenylene group
  • X represents the formula (1) or (2). Indicates a group derived from the represented compound.
  • the molar ratio (A / B) of the repeating unit (A) to the repeating unit (B) in the copolymer of the present invention is preferably 2 or more and 1000 or less, more preferably 3 to 1000 from the viewpoint of sensitivity to calcium ions and the like.
  • 4 to 1000 is more preferable, and 5 to 1000 is more preferable.
  • the copolymer of the present invention may have other repeating units as long as it has the repeating unit (A) and the repeating unit (B).
  • the other repeating unit include a repeating unit derived from a polyfunctional monomer (C), a repeating unit derived from ethylene, styrene, alkyl (meth) acrylate, (meth) acrylamide, and the like.
  • a copolymer having a repeating unit (C) derived from a polyfunctional monomer in addition to the repeating unit (A) and the repeating unit (B) is gelled by formation of a crosslinked structure, and is particularly preferable as a polyvalent metal ion sensor. .
  • the repeating unit (C) may be any repeating unit derived from a monomer having two or more polymerizable vinyl groups, such as polyol polyunsaturated carboxylate, linear or branched alkylene polyacrylamide, polyol polyacrylamide, divinylbenzene. And the like.
  • the polyol polyunsaturated carboxylate is preferably polyol poly (meth) acrylate.
  • the polyol includes ethylene glycol, polyethylene glycol, propylene glycol, polypropylene glycol, butylene glycol (including 1,3-butanediol and 1,4-butanediol), polybutylene glycol, neopentyl glycol, glycerin, poly Glycerin, pentaerythritol, 1,6-hexanediol, trimethylolpropane, bisphenol A, tricyclo [5.2.1.0 2,6 ] decandimethanol, tris (2-hydroxyethyl) isocyanurate, bis ( 2-hydroxyethyl), hexafluorohexanediol, decanediol, pentanediol and the like are preferred.
  • the linear or branched alkylene polyacrylamide is preferably a linear or branched alkylene polyacrylamide having 1 to 4 carbon atoms, and examples thereof include methylene bisacrylamide, ethylene bisacrylamide, and propylene bisacrylamide.
  • Examples of the polyol diacrylamide include (1,2-dihydroxyethylene) bisacrylamide.
  • Examples of divinylbenzenes include ortho-, meta- or para-divinylbenzene.
  • the repeating unit (C) is preferably contained in the copolymer of the present invention in an amount of 0.1 to 10 mol%, more preferably 0.1 to 8 mol%, from the viewpoint of gel formation and ion measurement sensitivity. More preferably, it is contained in an amount of 0.5-5 mol%, more preferably 1-5 mol%. Further, the degree of swelling of the gel increases depending on the content of the repeating unit (C), and the degree of swelling is preferably 340% or more, more preferably 340 to 1500%, more preferably 500 to 1500% from the viewpoint of the Ca 2+ sensing ability. Is more preferable.
  • the copolymer of the present invention may have a functional group that serves as a binding site with a substrate, and examples of such a functional group include alcohol, thiol, amine, carboxylic acid, sulfonic acid, phosphonic acid, and siloxane. , Vinyl, acetylene and the like.
  • the number average molecular weight (Mn) of the copolymer of the present invention is preferably 10,000 or more and 1,000,000 or less, more preferably 10,000 to 800,000, more preferably 10,000 to 500, from the viewpoint of sensitivity to calcium ions and the like. Is more preferred.
  • the number average molecular weight can be measured by the method described in Examples below.
  • copolymerization form of the copolymer of the present invention may be any of random copolymerization, alternating copolymerization, block copolymerization, and graft copolymerization, but random copolymerization is preferred.
  • the copolymer of the present invention may be obtained by radical copolymerization of, for example, a monomer that becomes the repeating unit (A), a monomer that becomes the repeating unit (B), and a monomer that becomes the repeating unit (C) if necessary. Moreover, after repeating the radical copolymerization of the monomer which becomes the repeating unit (A) in which the carboxyl group is protected, the monomer which becomes the repeating unit (B), and the monomer which becomes the repeating unit (C) if necessary, A method for removing the carboxyl-protecting group of the unit (A) is also included.
  • the monomer serving as the repeating unit represented by the formula (7) is represented by the following formula (3).
  • This monomer (3) can be obtained, for example, by reacting (meth) acrylic halide with XOH in the presence of a base such as triethylamine.
  • a tert-butyl group is preferred.
  • the radical copolymerization reaction is performed in the presence of a polymerization initiator.
  • the polymerization initiator include 2,2′-azobis (isobutyronitrile), dimethyl 2,2′-azobis (2-methylpropionate), 2,2′-azobis (4-methoxy-2).
  • Azo initiators such as 1,4-dimethylvaleronitrile; photopolymerization initiators such as 2,2-dimethoxy-1,2-diphenylethane-1-one; di (3,5,5-trimethylhexanoyl) peroxide And peroxides such as benzoyl peroxide.
  • These polymerization initiators can be used alone or in combination of two or more.
  • the total amount of the polymerization initiator used is usually about 0.0002 to 0.2 times by mass with respect to the monomer of the repeating unit (A).
  • Solvents include amide solvents such as dimethylformamide, dimethylacetamide and N-methylpyrrolidone; sulfoxide solvents such as dimethyl sulfoxide; ester solvents such as ethyl acetate, butyl acetate and ⁇ -butyrolactone; aromatics such as toluene and benzene System solvents; ether solvents such as 1,4-dioxane and diethyl ether can be used, and these solvents can be used alone or in combination of two or more.
  • amide solvents such as dimethylformamide, dimethylacetamide and N-methylpyrrolidone
  • sulfoxide solvents such as dimethyl sulfoxide
  • ester solvents such as ethyl acetate, butyl acetate and ⁇ -butyrolactone
  • aromatics such as toluene and benzene System solvents
  • ether solvents such as 1,4-dioxane and dieth
  • the total amount of these solvents used is usually about 0.5 to 15 times by mass with respect to the monomer of the repeating unit (A).
  • the chain transfer agent include mercaptoethanol, thioglycerol, tert-dodecyl mercaptan, and the like.
  • the copolymerization reaction time is usually about 0.5 to 24 hours, and the reaction temperature may be appropriately selected below the boiling point of the solvent, but is usually about 0 to 120 ° C.
  • the removal of the protective group of the carboxyl group of the repeating unit (A), for example, the tert-butyl group can be easily performed by trifluoroacetic acid treatment.
  • the copolymer of the present invention does not generate fluorescence in the absence of calcium ions or the like, and generates strong fluorescence depending on the concentration of calcium ions. This is because the carboxyl group in the copolymer binds to the polyvalent metal ion to form a cross-linked structure, and thus the group having the aggregation-induced light emission ability generates fluorescence due to aggregation. Moreover, since the copolymer of this invention which has a repeating unit (C) is gelatinized, it can fix to a specific location and can measure a polyvalent metal ion stably for a long period of time.
  • C repeating unit
  • the copolymer of the present invention reacts with a polyvalent metal ion such as calcium to produce fluorescence as shown in the examples described later, it is useful as various polyvalent metal ion sensors.
  • the copolymer of the present invention is useful as a device for detecting polyvalent metal ions because the fluorescence disappears in the presence of a chelating agent and the generation of fluorescence is reversible.
  • the copolymer having the repeating unit (C) is in the form of a gel and is useful as a multivalent metal ion sensor that is stable over a long period of time.
  • the copolymer of the present invention is formed on a substrate.
  • a copolymer on a base material it is preferable to copolymerize the monomer that becomes the repeating unit (A) and the monomer that becomes the repeating unit (B) on the base material.
  • it is produced by introducing an ⁇ -bromo- ⁇ , ⁇ -dimethylacetate group on a substrate and then surface-initiating copolymerization of a monomer that becomes a repeating unit (A) and a monomer that becomes a repeating unit (B). can do.
  • the copolymer of the present invention having a repeating unit (C) is a gel
  • it can be used as it is as a polyvalent metal ion sensor, or it can be used as an ion sensor device by gel polymerization on a substrate.
  • you can also.
  • the gel formed from the copolymer of the present invention can detect calcium in a concentration range close to the extracellular calcium concentration of the order of mM, it can be applied to a device that detects the calcium concentration outside the cell. That is, it is considered that a flexible calcium sensor can be constructed in combination with an organic light emitting diode (OLED) or an organic solar cell (OPV) on a flexible substrate. In addition, by integrating them, it is possible to construct a calcium sensing device with a large area.
  • OLED organic light emitting diode
  • OOV organic solar cell
  • examples of the substrate include glass, a transparent resin film, a transparent resin needle, and the like.
  • examples of the transparent resin material include polyesters such as polyethylene, polypropylene, polystyrene, and polyethylene terephthalate, polyvinyl chloride, polyvinylidene chloride, polyvinyl alcohol, polycarbonate, polyacrylonitrile, and an ethylene-vinyl acetate copolymer.
  • the concentration of polyvalent metal ions in the sample can be determined.
  • the sample include body fluids such as blood, plasma, serum, lymph, urine, and various tissues in the case of calcium ions.
  • polyvalent metal ions other than calcium ions include heavy metal ions such as zinc, lead, cadmium, mercury, copper, chromium, manganese, arsenic, and cobalt. In the case of these heavy metal ions, river water, lake water, various environmental waters such as drainage, soil and the like can be mentioned.
  • the measurement is performed by measuring the generated fluorescence by irradiating the device with excitation light after contacting the device and the sample. Therefore, the fluorescence measurement kit includes the device, the excitation light irradiator, and the fluorescence measurement device. To quantify the polyvalent metal ion concentration from the obtained fluorescence intensity, it is easy to use a calibration curve prepared in advance.
  • Example 1 In an argon gas atmosphere, zinc powder (15.6 g) and 200 ml of tetrahydrofuran were charged into a reaction vessel. TiCl 4 (13.2 ml) was slowly added with a syringe cooled to ⁇ 5 to 0 ° C. and maintained below 10 ° C. The mixture was stirred at room temperature for 0.5 hours and heated to reflux for 2.5 hours. The mixture was cooled again to ⁇ 5 to 0 ° C., pyridine (5.0 ml) was added, and the mixture was stirred for 10 minutes.
  • Example 2 (1) p-hydroxy TPE obtained in Example 1 (21.3 mg, 5 mol%), tert-butyl acrylate (146 ⁇ L, 95 mol%) and 2,2′-azobis (isobutyronitrile) (AIBN) A solution of dimethylformamide (1 ml) was deoxygenated three times using vacuum / argon gas. The mixture was stirred at 60 ° C. for 12 hours, cooled to room temperature, and evaporated to give 156 mg of (p-hydroxy TPE acrylate) 0.05- (tert-butyl acrylate) 9.95 -copolymer.
  • AIBN 2,2′-azobis (isobutyronitrile)
  • Example 3 In the same manner as in Example 2 (1), (p-hydroxy TPE acrylate) 0.01- (tert-butyl acrylate) 9.99 -copolymer was obtained.
  • 1 H NMR 400 MHz, CDCl 3 , 293 K) ⁇ 6.78-7.15, 2.08-2.35, 1.71-1.89, 1.20-1.62 ppm.
  • FT-IR ⁇ 2980, 2936, 1731, 1481, 1458, 1394, 1368, 1258, 1148, 1035, 909, 847, 752, 701, 471, 435cm -1 .
  • M n 21000
  • M w 29000
  • PDI 1.36 (GPC: eluent; DMF, PSt standards).
  • Example 4 In the same manner as in Example 2 (1), (p-hydroxy TPE acrylate) 0.02- (tert-butyl acrylate) 0.80 -copolymer was obtained.
  • 1 H NMR 400 MHz, CDCl 3 , 293 K) ⁇ 6.45-7.24, 0.60-2.76 ppm.
  • FT-IR ⁇ 3439, 3055, 2978, 2933, 2360, 1757, 1728, 1599, 1503, 1493, 1408, 1444, 1393, 1368, 1256, 1200, 1149, 1075, 1031, 1018, 846, 762 , 749, 700, 614, 572, 473, 430cm -1 .
  • M n 34,000
  • M w 67,000
  • PDI 1.98 (GPC: eluent; DMF, PSt standards).
  • Example 5 In the same manner as in Example 2 (1), (p-hydroxy TPE acrylate) 0.50- (tert-butyl acrylate) 0.50 -copolymer was obtained.
  • 1 H NMR 400 MHz, CDCl 3 , 293 K) ⁇ 6.50-7.20, 1.05-2.95 ppm.
  • FT-IR ⁇ 3440, 3054, 3022, 2977, 2932, 2360, 1757, 1727, 1599, 1502, 1493, 1444, 1393, 1368, 1251, 1200, 1165, 1147, 1075, 1030, 1018, 845 , 762, 748, 699, 614, 572, 496cm -1 .
  • M n 18,000
  • M w 35,000
  • PDI 1.95 (GPC: eluent; DMF, PSt standards).
  • Example 2 The structure and properties of the copolymer obtained in Example 5 are shown in Table 1.
  • transition metal ions include those that increase the fluorescence intensity when added to poly-1 0.05 , such as Zn 2+ , and those that decrease the fluorescence intensity, such as Fe 2+ .
  • EDTA was added to the poly-1 0.05 to Ca 2+ was added.
  • EDTA was added to 1.0 mM with respect to poly-1 0.05 to which 1.0 mM Ca 2+ was added, and changes in the fluorescence spectrum were observed (FIG. 6).
  • Example 8 (Change of Ca 2+ sensing ability due to change in composition of Poly-1)
  • poly-1 0.01 , poly-1 0.05 , poly-1 0.20 The response behavior of poly-1 0.50 to Ca 2+ was examined.
  • poly-1 0.20 and poly-1 0.50 are more hydrophobic than poly-1 0.01 and poly-1 0.05 , and there are few carboxylic acid sites that interact with Ca 2+ and cause aggregation of polymer chains. It is thought that it comes from. That is, it was found that the detection range of the Ca 2+ concentration changes by changing the composition of poly-1.
  • Example 9 (Change of Ca 2+ sensing ability by Poly-1 0.05 concentration change) The change in the Ca 2+ sensing ability of poly-1 due to the difference in the concentration of Poly-1 0.05 was examined. Therefore, CaCl 2 was added to three types of poly-1 0.05 solutions having different concentrations of (a) 5 mg / L, (b) 10 mg / L, and (c) 50 mg / L, and changes in the fluorescence spectrum were observed. .
  • FIG. 11 shows a graph in which the horizontal axis of FIG. 10 is converted into the ratio of the amount of Ca 2+ to the carboxylic acid (COOH) at the PAA site.
  • the ratio of the amount of Ca 2+ to the carboxylic acid (COOH) whose fluorescence intensity is saturated is different when the concentration of poly-1 0.05 is different even if the amount ratio of the polymer and Ca 2+ is normalized. . That is, poly-1 0.05 at a concentration of 5 mg / L is saturated in fluorescence intensity when the ratio of Ca 2+ to carboxylic acid (COOH) is about 10, whereas poly-1 0.05 at a concentration of 50 mg / L is carboxylic. It is saturated when the amount of Ca 2+ with respect to the acid (COOH) is 50-100.
  • Example 10 (Effect of introduction of hydrophilic group into TPE) A calcium sensor having a dimethylamino group and having a maximum fluorescence wavelength near 546 nm was constructed.
  • the acrylate monomer and polymer having dimethylaminated TPE were synthesized as follows.
  • FT-IR ⁇ 3449, 3083, 3035, 2921, 2889, 2802, 1746, 1608, 1519, 1444, 1402, 1354, 1294, 1248, 1198, 1166, 1153, 1126, 1065, 1018, 976, 946, 902 , 818, 768, 739, 700, 589, 471, 454, 432, 420 cm -1 .
  • Example 11 (Immobilization to a substrate)
  • the polymer surface initiated polymerization it is possible to immobilize the substrate using the (SIP S urface- I nitiated P olymerization ) method.
  • the immobilization method to the glass substrate will be described.
  • the RAFT agent that can be immobilized on the substrate is prepared.
  • deoxygenated 3 times using reduced pressure / argon gas.
  • the mixture is stirred at 80 ° C. for 12 hours, and the solvent is distilled off under reduced pressure to obtain a RAFT agent having a trimethoxysilyl group.
  • the substrate is immersed in toluene as a RAFT agent having 0.01 mol / L of a tritrimethoxysilyl group and allowed to stand at 80 ° C. for 16 hours.
  • the system is returned to room temperature, the substrate is taken out, washed with toluene, chloroform, dichloromethane, tetrahydrofuran, dimethylformamide, methanol, acetone and dried under vacuum to obtain a glass substrate on which the RAFT initiating group is immobilized.
  • Example 12 In addition to the SIP method, the polymer can be insolubilized by gelation.
  • Example 13 The photopolymerization initiator was changed from 1 mol% of AIBN to 2 mol% of 2,2-dimethoxy-1,2-diphenylethane-1-one (IRGACURE651, BASF) and polymerized by irradiation with white light. As a result, a gel similar to that in Example 12 was obtained.
  • Example 14 In the same manner as in Example 13, the ratio of each monomer was changed and gel polymerization was performed to obtain a copolymer.
  • Table 2 shows the relationship among the structure, molar ratio, and swelling degree of the obtained copolymer.
  • Example 15 (1) The Ca 2+ sensing ability of the copolymer obtained in Example 13 was evaluated.
  • AIBN thermal polymerization initiator
  • the fluorescence quantum yield hardly changed even when calcium was added.
  • the gel prepared at a polymerization concentration of 2.0 M showed a significantly higher degree of swelling as z was smaller.
  • gel-1e and f showed almost no change in the fluorescence quantum yield, but gel-1g and h showed a fluorescence quantum yield with the addition of calcium.
  • the yield increased significantly.
  • the gel prepared by diluting the polymerization concentration and having a polymerization concentration of 1.5 M showed a higher degree of swelling.
  • gel-1j having a higher degree of swelling significantly increased the fluorescence quantum yield with the addition of calcium. The higher the degree of swelling, the higher the mobility of the polymer chain in the gel, and it is considered that the fluorescence quantum yield changed greatly.
  • Example 17 (Calcium sensing in water)
  • the fluorescence quantum yield decreased to the initial value by decreasing the calcium concentration around the gel. Thereafter, the fluorescence quantum yield of the gel was also raised and lowered with good reproducibility by raising and lowering the concentration of the surrounding calcium concentration (FIG. 17).
  • FIG. 18 shows a conceptual diagram for constructing a flexible sensor in combination with OLED or OPV on a flexible substrate.
  • 1-NMe 2 is polymerized in the same manner as in Example 2 (1, 2), and polyacrylic acid (poly-1) having dimethylaminated tetraphenylethene as a fluorescent moiety is obtained. -NMe 2 ) was synthesized.
  • poly-2-NMe 2 Yellow solid 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ) ⁇ 6.72-7.15, 6.38-6.56, 2.79-2.92, 2.09-2.50, 2.34-2.98 ppm.
  • FT-IR (KBr) ⁇ 3437, 2979, 2933, 1730, 1609, 1521, 1480, 1450, 1393, 1367, 1256, 1149, 846, 752, 700, 472 cm -1 .
  • poly-1-NMe 2 Yellow solid: 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ) ⁇ 6.79-7.37, 2.28-2.57, 1.36-2.14 ppm.
  • FT-IR (KBr) ⁇ 3448, 2959, 1719, 1509, 1451, 1411, 1251, 1197, 800, 723, 704 cm -1 .

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Abstract

　可逆的なセンシングが可能で、デバイス化可能なカルシウム等の多価金属イオンセンサとして有用な化合物及びその化合物を用いたイオンセンサの提供。　側鎖にカルボキシル基を有する繰り返し単位（Ａ）と、側鎖に凝集誘起発光能を示すエステル残基を有するカルボキシレート基を有する繰り返し単位（Ｂ）とを有するコポリマー。

Description

イオンセンサ
　本発明は、新規なコポリマー及びこれを用いた多価金属イオン検出用デバイスに関する。
　カルシウムは、生体内で骨の成分として存在する他、筋肉の収縮、神経の興奮伝導、酵素の活性化、ホルモン分泌等に重要な作用をしており、具体的には細胞の浸透圧調整、Ｎａ、Ｋイオンとの拮抗作用、筋肉や神経の興奮性の調節、神経の刺激伝達、血液凝固、酵素活性の賦活因子として作用する。従って、生体内のカルシウムイオンの分布、変化をリアルタイムで測定することは、疾病の発見、治療経過、生理機能の研究等において重要である。細胞外のカルシウムイオン濃度は１～２mMであり、一方、細胞内のカルシウムイオン濃度は細胞外の１００００分の１の５０～１００nMである。
　このようなカルシウムイオンのセンサとしては、例えばグリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）骨格を有する化合物（Ｆｕｒａ－２）が報告されている（非特許文献１）。しかしながら、このセンサーは、ｐＫａがおよそ６～１０と会合定数が大きいことからnMオーダーのカルシウムイオン濃度は検出できるが、細胞外のカルシウムイオン濃度は検出できない。また細胞外カルシウム濃度下では不可逆的なセンシング能を有するにすぎず、デバイスとの一体化が困難であることから、細胞内のｉｎ　ｖｉｔｒｏイメージングで使用されているにすぎない。
J. Biol. Chem., 1985, 260, 3440
　本発明の課題は、可逆的なセンシングが可能で、デバイス化可能なカルシウム等の多価金属イオンセンサとして有用な化合物及びその化合物を用いたイオンセンサを提供することにある。
　そこで本発明者は、ポリアクリル酸に代表される側鎖にカルボキシル基を有するポリマーに着目し、その一部に凝集誘起発光能を有する化合物を導入したコポリマーを製造し、種々の金属イオンセンシング効果を検討したところ、当該コポリマーがカルシウムイオン等の多価金属イオンと結合すると凝集誘起発光化合物による蛍光が生じ、かつその蛍光は可逆性であること、さらに当該コポリマーは固体基材等に固定化でき、デバイス化が可能であることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、〔１〕～〔１５〕を提供するものである。
〔１〕側鎖にカルボキシル基を有する繰り返し単位（Ａ）と、側鎖に凝集誘起発光能を示すエステル残基を有するカルボキシレート基を有する繰り返し単位（Ｂ）とを有するコポリマー。
〔２〕繰り返し単位（Ａ）が、アクリル酸、メタクリル酸、及びスチレンカルボン酸から選ばれるモノマー由来の繰り返し単位である〔１〕記載のコポリマー。
〔３〕繰り返し単位（Ｂ）が、次式（１）又は（２）で示される化合物由来のエステル残基を有する、アクリレート、メタクリレート、及びスチレンカルボキシレートから選ばれるモノマー由来の繰り返し単位である〔１〕又は〔２〕記載のコポリマー。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
（式（１）中、Ｒ1は同一又は異なって、置換基を有していてもよい芳香族炭化水素基又は置換基を有していてもよい芳香族複素環式基を示し、Ｅ1は、ケイ素原子又はゲルマニウム原子を示し、Ａ1及びＢ1は同一又は異なって、炭化水素基を示し、ｎは１～４の整数を示す）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
（式（２）中、Ｒ2及びＲ3は、同一又は異なって、置換基を有していてもよい芳香族炭化水素基又は置換基を有していてもよい芳香族複素環式基を示し、Ａ2及びＢ2は、同一又は異なって、水素原子、置換基を有していてもよい炭化水素基、又は置換基を有していてもよい芳香族複素環式基を示す。）
〔４〕式（１）又は（２）で表される化合物が、フェニル基上に１～５個の親水性基が置換していてもよい１－メチル－１，２，３，４，５－ペンタフェニルシロール、２，３，４，５－テトラフェニル－１，１－ジメチルシロール又はテトラフェニルエチレンである〔３〕記載のコポリマー。
〔５〕繰り返し単位（Ａ）と繰り返し単位（Ｂ）のモル比（Ａ／Ｂ）が、４～１０００である〔１〕～〔４〕のいずれかに記載のコポリマー。
〔６〕数平均分子量が１０，０００～１，０００，０００である〔１〕～〔５〕のいずれかに記載のコポリマー。
〔７〕多価金属イオン蛍光検出用コポリマーである〔１〕～〔６〕のいずれかに記載のコポリマー。
〔８〕さらに、多官能性モノマーに由来する繰り返し単位（Ｃ）を有する〔１〕～〔７〕のいずれかのコポリマー。
〔９〕繰り返し単位（Ｃ）を０．１～１０モル％含有する〔８〕記載のコポリマー。
〔１０〕繰り返し単位（Ｃ）が、２以上の重合性ビニル基を有するモノマー由来の繰り返し単位である〔８〕又は〔９〕記載のコポリマー。
〔１１〕〔１〕～〔１０〕のいずれかに記載のコポリマーを有する多価金属イオン検出用デバイス。
〔１２〕固体基材上に〔１〕～〔１０〕のいずれかに記載のコポリマーが固定化されている〔１１〕記載の多価金属イオン検出用デバイス。
〔１３〕固体基材上への〔１〕～〔１０〕のいずれかに記載のコポリマーの固定化手段が、固体基材と前記コポリマーとの共有結合によるものである〔１２〕記載の多価金属イオン検出用デバイス。
〔１４〕〔１〕～〔１３〕のいずれかに記載のデバイスに、試料を接触させ、蛍光強度を測定することを特徴とする試料中の多価金属イオン濃度の定量法。
〔１５〕次式（３）で示される化合物。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
（式（３）中、Ｒ4は水素原子又はメチル基を示し、Ｒ5は直接結合、炭素数１～８のアルキレン基又はフェニレン基を示し、Ｘは、次式（１）又は（２）で示される化合物由来の基を示す。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
（式（１）中、Ｒ1は同一又は異なって、置換基を有していてもよい芳香族炭化水素基又は置換基を有していてもよい芳香族複素環式基を示し、Ｅ1は、ケイ素原子又はゲルマニウム原子を示し、Ａ1及びＢ1は同一又は異なって、炭化水素基を示し、ｎは１～４の整数を示す。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
（式（２）中、Ｒ2及びＲ3は、同一又は異なって、置換基を有していてもよい芳香族炭化水素基又は置換基を有していてもよい芳香族複素環式基を示し、Ａ2及びＢ2は、同一又は異なって、水素原子、置換基を有していてもよい炭化水素基、又は置換基を有していてもよい芳香族複素環式基を示す。）
　本発明のコポリマーを用いれば、カルシウムイオンに代表される多価金属イオンが高感度で検出でき、その検出性（発光性）は可逆的である。また、本発明のコポリマーは、樹脂性基材等への固定化が容易である。従って、本発明のコポリマーを用いれば、カルシウムイオンに代表される多価金属イオン検出用デバイスが作成可能である。
メタノール／水混合溶媒中でのｐｏｌｙ－１0.05の蛍光スペクトルを示す（１０mg／Ｌ、励起光＝３０７nm、以下同じ）。 Ｃａ2+濃度に対するｐｏｌｙ－１0.05の蛍光強度を示す。 Ｎａ+、Ｋ+、Ｍｇ2+、Ｃａ2+濃度に対するｐｏｌｙ－１0.05の蛍光強度変化を示す。 各種多価金属イオンに対するｐｏｌｙ－１0.05のＣａ2+センシング能を示す。 Ｎａ+、Ｍｇ2+の存在下におけるｐｏｌｙ－１0.05のＣａ2+センシング能を示す。 ｐｏｌｙ－１0.05のＣａ2+センシング能に対するＥＤＴＡの効果を示す。 ｐｏｌｙ－１の組成変化によるＣａ2+センシング能の変化を示す。 ｐｏｌｙ－１の組成変化によるＣａ2+センシング能の変化を示す。 ｐｏｌｙ－１0.20とｐｏｌｙ－１0.05のメタノール／水＝８／２におけるＣａ2+センシング能を示す。 ｐｏｌｙ－１0.05の（ａ）５mg／Ｌ、（ｂ）１０mg／Ｌ、（ｃ）５０mg／Ｌにおける蛍光強度変化を示す。 ｐｏｌｙ－１0.05の（ａ）５mg／Ｌ、（ｂ）１０mg／Ｌ、（ｃ）５０mg／Ｌにおける蛍光強度変化を示す。 ｐｏｌｙ－１0.05のカルシウムセンシング能に対するＥｔ3Ｎ及びＴＦＡの添加効果を示す。 ｇｅｌ－１の組成変化によるＣａ2+センシング能を示す。 ｇｅｌ－１0.015のＣａ2+の可逆性を示す。 ゲルの蛍光量子収率とＣａ2+センシング能の関係を示す。 Ｈｅｐｅｓｂｕｆｆｅｒ：Ｈ2Ｏ＝５０：５０溶液中でのゲルのＣａ2+センシング能を示す。 カルシウム濃度の変化と蛍光量子収率の再現性を示す。 フレキシブル基板上でＯＬＥＤやＯＰＶと組み合わせてフレキシブルセンサーの構造概念図を示す。 ）ｐｏｌｙ－１０．０５、ｐｏｌｙ－１－ＮＭｅ２のＨ２Ｏ／ＭｅＯＨ＝１／１中（濃度１０ｍｇ／Ｌ）の規格化した吸収、蛍光スペクトルを示す。 ｐｏｌｙ－１－ＮＭｅ２の０、１、５　ｏｒ　１０ｍＭ（１０ｍｇ／Ｌ，２９３Ｋ，ｉｎ　ＭｅＯＨ／ｗａｔｅｒ＝１／１，λｅｘ＝３４１ｎｍ）におけるＣａＣｌ2センシング能（ＦＬスペクトル）を示す。
　本発明のコポリマーは、少なくとも、側鎖にカルボキシル基を有する繰り返し単位（Ａ）と、側鎖に凝集誘起発光能を示すエステル残基を有するカルボキシレート基を有する繰り返し単位（Ｂ）とを有する。
　繰り返し単位（Ａ）としては、側鎖にカルボキシル基（－ＣＯＯＨ）を有する限り、主鎖は特に限定されないがラジカル重合による主鎖が好ましい。そのような主鎖としては、式（４）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
（式（４）中、Ｒ4は水素原子又はメチル基を示す。）
で表される主鎖が好ましい。
　また、主鎖とカルボキシル基との間は、直接結合していてもよく、炭素数１～８のアルキレン基、フェニレン基などの二価の炭化水素基を介していてもよいが、直接結合であるのがより好ましい。
　繰り返し単位（Ａ）の具体例としては、アクリル酸、メタクリル酸、スチレンカルボン酸等のモノマー由来の繰り返し単位が好ましく、式（５）で表される繰り返し単位がさらに好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
（式（５）中、Ｒ4は水素原子又はメチル基を示し、Ｒ5は直接結合、炭素数１～８のアルキレン基又はフェニレン基を示す。）
　繰り返し単位（Ｂ）は、側鎖に、凝集誘起発光能を示すエステル残基を有するカルボキシレート基を有する。
　凝集誘起発光能を示すエステル残基としては、次式（１）又は（２）で示される化合物由来の基が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
（式（１）中、Ｒ1は同一又は異なって、置換基を有していてもよい芳香族炭化水素基又は置換基を有していてもよい芳香族複素環式基を示し、Ｅ1は、ケイ素原子又はゲルマニウム原子を示し、Ａ1及びＢ1は同一又は異なって、炭化水素基を示し、ｎは１～４の整数を示す。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
（式（２）中、Ｒ2及びＲ3は、同一又は異なって、置換基を有していてもよい芳香族炭化水素基又は置換基を有していてもよい芳香族複素環式基を示し、Ａ2及びＢ2は、同一又は異なって、水素原子、置換基を有していてもよい炭化水素基、又は置換基を有していてもよい芳香族複素環式基を示す。）
　Ｒ1、Ｒ2及びＲ3で示される芳香族炭化水素基としては、炭素数６～１４の芳香族炭化水素基が挙げられ、具体的にはフェニル基、ナフチル基、ビフェニル基が挙げられる。また、芳香族複素環式基としては、１～３個の窒素原子、酸素原子又は硫黄原子を有する芳香族複素環式基が好ましく、ピロリル基、イミダゾリル基、ピリジル基、ピリミジニル基、チエニル基、チアゾリル基等が挙げられる。これらの芳香族炭化水素基又は芳香族複素環式基に置換し得る基としては、親水性基が好ましく、ヒドロキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、スルホ基、チオール基、ポリオキシエチレン基、ポリオキシプロピレン基、及びスルフィニル基から選ばれる１～５個がより好ましい。ここで、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基としては、Ｃ1～Ｃ6アルキルアミノ基、ジ（Ｃ1～Ｃ6アルキル）アミノ基が好ましい。
　Ｒ1、Ｒ2及びＲ3の好ましい例は、前記１～５個の親水性置換基を有していてもよいフェニル基である。
　Ａ1及びＢ1で示される炭化水素基としては、炭素数１～６のアルキル基、芳香族炭化水素基が好ましい。ここでアルキル基としては、具体的にはメチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｎ－ブチル基、イソプロピル基等が挙げられる。芳香族炭化水素基としては、前記Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3と同様の芳香族炭化水素基、特に１～５個の親水性置換基を有していてもよいフェニル基が好ましい。
　Ａ2及びＢ2で示される炭化水素基、芳香族複素環式基としては、前記Ｒ1、Ｒ2及びＲ3として示した芳香族炭化水素基又は芳香族複素環式基が好ましい。また、これらの炭化水素基又は複素環式基に置換し得る基は、親水性基が好ましく、ヒドロキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、スルホ基、チオール基、ポリオキシエチレン基、ポリオキシプロピレン基、及びスルフィニル基から選ばれる１～５個がより好ましい。ここで、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基としては、Ｃ1～Ｃ6アルキルアミノ基、ジ（Ｃ1～Ｃ6アルキル）アミノ基が好ましい。
　Ａ2及びＢ2の好ましい例は、前記１～５個の親水性基を有していてもよいフェニル基である。
　ｎは、４が特に好ましい。
　式（１）で表される化合物の特に好ましい例は、フェニル基上に前記１～５個の親水性基が置換していてもよい２，３，４，５－テトラフェニル－１，１－ジメチルシロール又は１－メチル－１，２，３，４，５－ペンタフェニルシロール（ＴＰＳ）である。式（２）で表される化合物の特に好ましい例は、フェニル基上に前記１～５個の親水性基が置換していてもよいテトラフェニルエチレン（ＴＰＥ）である。
　繰り返し単位（Ｂ）の側鎖に前記のカルボキシレート基を有する限り、主鎖は特に限定されないがラジカル重合による主鎖が好ましい。そのような主鎖としては、式（６）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
（式（６）中、Ｒ4は水素原子又はメチル基を示す。）
で表される主鎖が好ましい。
　また、主鎖とカルボキシレート基との間は、直接結合していてもよく、炭素数１～８のアルキレン基、フェニレン基などの二価の炭化水素基を介していてもよいが、直接結合であるのがより好ましい。
　繰り返し単位（Ｂ）の具体例としては、アクリレート、メタクリレート、スチレンカルボキシレート等のモノマー由来の繰り返し単位が好ましく、式（７）で表される繰り返し単位がさらに好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
（式（７）中、Ｒ4は水素原子又はメチル基を示し、Ｒ5は直接結合、炭素数１～８のアルキレン基又はフェニレン基を示し、Ｘは前記式（１）又は（２）で表される化合物由来の基を示す。）
　本発明のコポリマーにおける繰り返し単位（Ａ）と繰り返し単位（Ｂ）のモル比（Ａ／Ｂ）は、カルシウムイオン等に対する感度の点から、２以上１０００以下であることが好ましく、３～１０００がより好ましく、４～１０００がさらに好ましく、５～１０００がさらに好ましい。
　また、本発明のコポリマーは、繰り返し単位（Ａ）と繰り返し単位（Ｂ）とを有する限り、他の繰り返し単位を有していてもよい。当該他の繰り返し単位としては、多官能性モノマーに由来する繰り返し単位（Ｃ）、エチレン、スチレン、アルキル（メタ）アクリレート、（メタ）アクリルアミド等に由来する繰り返し単位等が挙げられる。このうち、繰り返し単位（Ａ）及び繰り返し単位（Ｂ）に加えて、多官能性モノマーに由来する繰り返し単位（Ｃ）を有するコポリマーは、架橋構造形成によりゲル化し、多価金属イオンセンサとして特に好ましい。
　繰り返し単位（Ｃ）としては、２以上の重合性ビニル基を有するモノマー由来の繰り返し単位であればよく、例えばポリオールポリ不飽和カルボキシレート、直鎖又は分岐鎖アルキレンポリアクリルアミド、ポリオールポリアクリルアミド、ジビニルベンゼン類等が挙げられる。このうち、ポリオールポリ不飽和カルボキシレートとしては、ポリオールポリ（メタ）アクリレートが好ましい。ここで、ポリオールとしては、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、ブチレングリコール（１，３－ブタンジオール、１，４－ブタンジオールを含む）、ポリブチレングリコール、ネオペンチルグリコール、グリセリン、ポリグリセリン、ペンタエリスリトール、１，６－ヘキサンジオール、トリメチロールプロパン、ビスフェノールＡ、トリシクロ〔５．２．１．０2,6〕デカンジメタノール、トリス（２－ヒドロキシエチル）イソシアヌレート、リン酸ビス（２－ヒドロキシエチル）、ヘキサフルオロヘキサンジオール、デカンジオール、ペンタンジオール等の２～５価のポリオールが好ましい。
　直鎖又は分岐鎖アルキレンポリアクリルアミドとしては、炭素数１～４の直鎖又は分岐鎖アルキレンポリアクリルアミドが好ましく、メチレンビスアクリルアミド、エチレンビスアクリルアミド、プロピレンビスアクリルアミド等が挙げられる。また、ポリオールジアクリルアミドとしては、（１，２－ジヒドロキシエチレン）ビスアクリルアミド等が挙げられる。ジビニルベンゼン類としては、オルト－、メタ－又はパラ－ジビニルベンゼン等が挙げられる。
　繰り返し単位（Ｃ）は、ゲル形成性及びイオン測定感度の点から、本発明コポリマー中に０．１～１０モル％含有するのが好ましく、０．１～８モル％含有するのがより好ましく、０．５～５モル％含有するのがさらに好ましく、１～５モル％含有するのがさらに好ましい。
　また、繰り返し単位（Ｃ）の含有率によってゲルの膨潤度が上昇し、当該膨潤度はＣａ2+センシング能の点から、３４０％以上が好ましく、３４０～１５００％がより好ましく、５００～１５００％がさらに好ましい。
　さらに本発明のコポリマーには、基材との結合部位となる官能基を有していてもよく、そのような官能基としては、アルコール、チオール、アミン、カルボン酸、スルホン酸、ホスホン酸、シロキサン、ビニル、アセチレン等が挙げられる。
　本発明のコポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）は、カルシウムイオン等に対する感度の点から１０，０００以上１，０００，０００以下が好ましく、１０，０００～８００，０００がより好ましく、１０，０００～５００，０００がさらに好ましい。数平均分子量は、後記実施例記載の方法で測定できる。
　本発明のコポリマーの共重合形態は、ランダム共重合、交互共重合、ブロック共重合、グラフト共重合のいずれでもよいが、ランダム共重合が好ましい。
　次に本発明のコポリマーの製造法について説明する。
　本発明のコポリマーは、例えば繰り返し単位（Ａ）となるモノマー及び繰り返し単位（Ｂ）となるモノマー、さらに必要に応じて繰り返し単位（Ｃ）となるモノマーをラジカル共重合させればよい。また、カルボキシル基が保護された繰り返し単位（Ａ）となるモノマーと、繰り返し単位（Ｂ）となるモノマーと、必要に応じて繰り返し単位（Ｃ）となるモノマーとをラジカル共重合させた後、繰り返し単位（Ａ）のカルボキシル基の保護基を脱離させる方法も挙げられる。
　ここで、前記式（７）で表される繰り返し単位となるモノマーは、次式（３）で示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
（式（３）中、Ｒ4、Ｒ5及びＸは前記と同じ。）
　このモノマー（３）は、例えば（メタ）アクリルハライドとＸＯＨとをトリエチルアミンのような塩基の存在下で反応させることにより得ることができる。
　繰り返し単位（Ａ）のカルボキシル基の保護基としては、ｔｅｒｔ－ブチル基が好ましい。
　前記ラジカル共重合反応は、重合開始剤の存在下に行なわれる。上記重合開始剤としては、例えば、２，２’－アゾビス（イソブチロニトリル）、ジメチル２，２’－アゾビス（２－メチルプロピオネート）、２，２’－アゾビス（４－メトキシ－２，４－ジメチルバレロニトリル等のアゾ系開始剤；２，２－ジメトキシ－１，２－ジフェニルエタン－１－オン等の光重合開始剤；ジ(３，５，５－トリメチルヘキサノイル)パーオキサイド、過酸化ベンゾイル等の過酸化物が挙げられ、これら重合開始剤は１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用できる。
　重合開始剤の合計使用量は、繰り返し単位（Ａ）のモノマーに対し、通常０．０００２～０．２質量倍程度である。
　また、ラジカル共重合反応には溶媒、連鎖移動剤を使用してもよい。溶媒としては、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ－メチルピロリドン等のアミド系溶媒；ジメチルスルホキシド等のスルホキシド系溶媒；酢酸エチル、酢酸ブチル、γ－ブチロラクトン等のエステル系溶媒；トルエン、ベンゼン等の芳香族系溶媒；１、４－ジオキサン、ジエチルエーテル等のエーテル系溶媒が挙げられ、これら溶媒は１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用できる。これら溶媒の合計使用量は、繰り返し単位（Ａ）のモノマーに対し、通常０．５～１５質量倍程度である。
　また、上記連鎖移動剤としては、メルカプトエタノール、チオグリセロール、ｔｅｒｔ－ドデシルメルカプタン等が挙げられる。
　また、共重合反応時間は通常０．５～２４時間程度であり、反応温度は、溶媒の沸点以下で適宜選択すればよいが、通常０～１２０℃程度である。
　共重合反応後、繰り返し単位（Ａ）のカルボキシル基の保護基、例えばｔｅｒｔ－ブチル基の脱離は、トリフルオロ酢酸処理により容易に行うことができる。
　本発明のコポリマーは、カルシウムイオン等の非存在下では蛍光を発生せず、カルシウムイオンの濃度に依存して強い蛍光を発生する。これは、コポリマー中のカルボキシル基が多価金属イオンと結合して架橋構造を形成するため、凝集誘起発光能を有する基が凝集による蛍光が発生するものである。また、繰り返し単位（Ｃ）を有する本発明のコポリマーは、ゲル化しているため特定箇所に固定することができ、長期間安定して多価金属イオンを計測可能である。
　かくして、本発明のコポリマーは、後記実施例に示すように、カルシウム等の多価金属イオンと反応して蛍光を生じるので、種々の多価金属イオンセンサとして有用である。また、本発明のコポリマーは、キレート剤の存在下で蛍光を消失し、蛍光の発生が可逆的であるので、多価金属イオン検出用デバイスとして有用である。また、繰り返し単位（Ｃ）を有するコポリマーは、ゲルの形態になっており、長期間にわたって安定した多価金属イオンセンサとして有用である。
　本発明のコポリマーを多価金属イオンセンサデバイス（多価金属イオン検出用デバイス）とするには、基材上に本発明のコポリマーを形成させる。基材上にコポリマーを形成させるには、基材上で前記繰り返し単位（Ａ）となるモノマーと前記繰り返し単位（Ｂ）となるモノマーとを共重合させるのが好ましい。例えば、基材上にα－ブロモ－α，α－ジメチルアセテート基を導入後、これに繰り返し単位（Ａ）となるモノマーと繰り返し単位（Ｂ）となるモノマーとを表面開始共重合させることによって製造することができる。
　また、繰り返し単位（Ｃ）を有する本発明のコポリマーは、ゲルであるためそのまま多価金属イオンセンサとして利用できる他、基材上でゲル重合させて固定化することにより、イオンセンサデバイスとすることもできる。本発明のコポリマーにより形成されるゲルはｍＭオーダーという細胞外カルシウム濃度に近い濃度範囲でのカルシウムセンシングが可能であることから、細胞外でカルシウム濃度を検出する、デバイスへの応用が可能である。すなわち、フレキシブル基板上で有機発光ダイオード（ＯＬＥＤ）や有機太陽電池（ＯＰＶ）と組み合わせてフレキシブルカルシウムセンサーが構築可能であると考えられる。また、それを集積することにより大面積のカルシウムセンシングデバイスの構築も可能になる。
　ここで基材としては、ガラス、透明樹脂フィルム、透明樹脂針等が挙げられる。透明樹脂の素材としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート等のポリエステル、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリビニルアルコール、ポリカーボネート、ポリアクリロニトリル、エチレン－酢酸ビニル共重合体が挙げられる。
　多価金属イオン検出用デバイスに、試料を接触させ、発生した蛍光強度を測定すれば、試料中の多価金属イオン濃度が定量できる。ここで試料としては、カルシウムイオンの場合には、血液、血漿、血清、リンパ液、尿などの体液、各種組織等が挙げられる。また、カルシウムイオン以外の多価金属イオンとしては、亜鉛、鉛、カドミウム、水銀、銅、クロム、マンガン、ヒ素、コバルト等の重金属イオンが挙げられる。これらの重金属イオンの場合には、河川水、湖沼水、排水等の各種環境水、土壌等が挙げられる。
　測定は、具体的には、デバイスと試料を接触後、デバイスに励起光を照射して、発生する蛍光を測定することにより行なわれる。従って、蛍光測定キットには、前記デバイス、励起光照射器、及び蛍光測定器が含まれる。得られた蛍光強度から多価金属イオン濃度を定量するには、予め作成された検量線を用いるのが簡単である。
　次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。
実施例１
（１）アルゴンガス雰囲気下、亜鉛粉末（１５．６ｇ）及びテトラヒドロフラン２００mlを反応容器に投入した。－５～０℃に冷却し、１０℃以下に維持したシリンジでＴｉＣｌ4（１３．２ml）をゆっくり添加した。混合物を室温にて０．５時間攪拌し、２．５時間加熱還流した。再び－５～０℃に冷却し、ピリジン（５．０ml）を加え１０分攪拌した。ｐ－ヒドロキシベンゾフェノン（４．８０ｇ）及びベンゾフェノン（５．２８ｇ）のテトラヒドロフラン（３０ml）溶液をシリンジでゆっくり加えた。添加後、反応混合物を７０℃に加熱し、ＴＬＣで原料がなくなるまで還流した。１０％Ｋ2ＣＯ3水溶液を加え、次いでジクロロメタンを加えた。有機相を水及び食塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥後、減圧で乾固し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ3）で精製し、ｐ－ヒドロキシテトラフェニルエチレン（ｐ－ヒドロキシＴＰＥ）を２．７６ｇ（収率３２％）得た。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 6.98-7.15(m,15H), 6.89(dd,J=8.68,2.07Hz,2H), 6.56(dd,J=8.76,2.23Hz,2H), 4.63(s,1H)ppm.
（２）ｐ－ヒドロキシテトラフェニルエチレン（０．９１０ｇ）及びトリエチルアミン（１．４６ml）のジクロロメタン（３０ml）溶液を０℃に冷却し、アクリロイルクロリド（４２０μL）のジクロロメタン５ml溶液を滴下した。反応混合物を、ＴＬＣで原料がなくなるまで室温で３時間攪拌した。反応液に炭酸水素ナトリウムを加え、さらにジクロロメタンを加えた。有機相を水及び食塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥後、減圧で乾固した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：ＣＨＣｌ3＝１：１）で精製し、ｐ－ヒドロキシテトラフェニルエチレン　アクリレート０．７５６ｇ（ｐ－ヒドロキシＴＰＥアクリレート）（収率７２％）を得た。テトラフェニルエチレンをＴＰＥと略した。
1H NMR(400MHz, CDCl3, 293 K) δ7.01-7.11(m,15H), 6.89(d,J=9.0Hz,2H), 6.56(dd,J=17.3,1.3Hz,1H), 6.27(dd,J=10.5,17.3Hz,1H), 5.99(dd,J=10.5,1.3Hz,1H)ppm.
13C NMR(100MHz, CDCl3, 293K) δ 164.3, 149.0, 143.7, 143.6, 143.5, 141.4, 141.3,140.0, 132.4, 132.3, 131.4, 131.3, 128.1, 127.9, 127.8, 127.7, 126.6, 126.5, 120.7ppm.
FT-IR(KBr) ν 3076, 3054, 3024, 1756, 1677, 1599, 1502, 1443, 1356, 1200, 1166, 1140, 1017, 763, 748, 699, 613, 572, 498 cm-1.
HRMS(FAB)Cald for C29H22O2[M]+m/z=402.1620, Found:m/z=402.167
実施例２
（１）実施例１で得たｐ－ヒドロキシＴＰＥ（２１．３mg，５モル％）、ｔｅｒｔ－ブチルアクリレート（１４６μL，９５モル％）及び２，２’－アゾビス（イソブチロニトリル）（ＡＩＢＮ）のジメチルホルムアミド（１ml）溶液を、減圧／アルゴンガスを使用して３回脱酸素した。６０℃で１２時間攪拌し、室温まで冷却し、溶媒留去して、（ｐ－ヒドロキシＴＰＥアクリレート）0.05－（ｔｅｒｔ－ブチルアクリレート）9.95－コポリマーを１５６mg得た。
1H NMR(400MHz, CDCl3, 293 K) δ 6.79-7.11, 2.05-2.39, 1.71-1.86, 1.20-1.63ppm. 
FT-IR(KBr) ν 2979, 2935, 1731, 1481, 1457, 1393, 1368, 1257, 1149, 1034, 909, 846, 751, 701, 471, 430cm-1.
Mn=24,000, Mw=44,000, PDI=1.86(GPC : eluent ; DMF, PSt standards).
（２）（１）で得られたコポリマー１０．０mgをトリフルオロ酢酸（５８．０μL）に溶解し、室温で１２時間攪拌した。反応液を溶媒留去して（ｐ－ヒドロキシＴＰＥアクリレート）0.05－（アクリル酸）9.95－コポリマーを９．８０mg得た。
1H NMR(400 MHz, CD3OD, 293 K) δ 6.79-7.21, 2.28-2.65, 1.40-2.22 ppm. 
FT-IR(KBr) ν 2961, 2361, 1716, 1503, 1454, 1417, 1249, 1168, 802, 701, 614, 503, 414 cm-1.
実施例３
（１）実施例２（１）と同様にして、（ｐ－ヒドロキシＴＰＥアクリレート）0.01－（ｔｅｒｔ－ブチルアクリレート）9.99－コポリマーを得た。
1H NMR(400 MHz, CDCl3, 293 K) δ 6.78-7.15, 2.08-2.35, 1.71-1.89, 1.20-1.62ppm.
FT-IR (KBr) ν 2980, 2936, 1731, 1481, 1458, 1394, 1368, 1258, 1148, 1035, 909, 847, 752, 701, 471, 435cm-1.
Mn=21000, Mw=29000, PDI=1.36 (GPC : eluent ; DMF, PSt standards).
（２）実施例２（２）と同様にして、（ｐ－ヒドロキシＴＰＥアクリレート）0.01－（アクリル酸）9.99－コポリマーを得た。
1H NMR(400MHz, CD3OD, 293 K) δ 6.82-7.21, 2.22-2.64, 1.42-2.10ppm
FT-IR(KBr) ν 2961, 2349, 1717, 1456, 1417, 1253, 1169, 802, 701, 617, 511, 463,436, 404cm-1.
実施例４
（１）実施例２（１）と同様にして、（ｐ－ヒドロキシＴＰＥアクリレート）0.02－（ｔｅｒｔ－ブチルアクリレート）0.80－コポリマーを得た。
1H NMR(400MHz, CDCl3, 293 K) δ 6.45-7.24, 0.60-2.76ppm.
FT-IR(KBr) ν 3439, 3055, 2978, 2933, 2360, 1757, 1728, 1599, 1503, 1493, 1408, 1444, 1393, 1368, 1256, 1200, 1149, 1075, 1031, 1018, 846, 762, 749, 700, 614, 572, 473, 430cm-1.
Mn=34,000, Mw=67,000, PDI=1.98(GPC : eluent ; DMF, PSt standards).
（２）実施例２（２）と同様にして、（ｐ－ヒドロキシＴＰＥアクリレート）0.20－（アクリル酸）0.80－コポリマーを得た。
1H NMR(400MHz, CD3OD, 293 K) δ 6.62-7.21, 1.10-2.79ppm.
FT-IR(KBr) ν 3054, 2932, 2362, 1718, 1599, 1502, 1444, 1406, 1198, 1166, 1075, 1030, 1017, 803, 763, 748, 699, 613, 572cm-1.
実施例５
（１）実施例２（１）と同様にして、（ｐ－ヒドロキシＴＰＥアクリレート）0.50－（ｔｅｒｔ－ブチルアクリレート）0.50－コポリマーを得た。
1H NMR(400 MHz, CDCl3, 293 K) δ 6.50-7.20, 1.05-2.95ppm.
FT-IR(KBr) ν 3440, 3054, 3022, 2977, 2932, 2360, 1757, 1727, 1599, 1502, 1493, 1444, 1393, 1368, 1251, 1200, 1165, 1147, 1075, 1030, 1018, 845, 762, 748, 699, 614, 572, 496cm-1.
Mn=18,000, Mw=35,000, PDI=1.95(GPC : eluent ; DMF, PSt standards).
（２）実施例２（２）と同様にして、（ｐ－ヒドロキシＴＰＥアクリレート）0.50－（アクリル酸）0.50－コポリマーを得た。
1H NMR(400 MHz, CDCl3, 293 K) δ 6.39-7.24, 0.65-3.05ppm.
FT-IR(KBr) ν 3438, 3053, 3024, 2931, 2361, 1950, 1752, 1599, 1576, 1502, 1493, 1444, 1199, 1166, 1075, 1030, 1017, 762, 749, 698, 613, 572, 496cm-1.
　実施例２－実施例５で得られたコポリマーの構造及び特性を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
実施例６（メタノール／水混合溶媒中のｐｏｌｙ－１0.05の発光）
　Ｐｏｌｙ－１0.05の溶解性を調べたところ、メタノールに対しては溶解性を示すが、水には不溶であることが分かった。本発明では、生体内でのＣａ2+認識を目的にしているため、水系で実験を行う必要があったが、ここではまずメタノールと水の混合溶媒系での実験を行うことにした。
　そこで、様々な組成比のメタノール/水混合溶媒（メタノール／水＝１００／０～メタノール／水＝１／９９）中で、ｐｏｌｙ－１0.05のＵＶスペクトル、蛍光スペクトルを測定した。
　ＵＶ－ｖｉｓスペクトルにおいて、水を加えていくに従い、沈殿形成に伴う光散乱が観測されたが、それ以外に大きな変化は観測されなかった。
　一方、蛍光スペクトルにおいては大きな変化が観測された（図１）。すなわちｐｏｌｙ－１0.05は、メタノール１００％溶液において蛍光性はほとんど観測されなかったが、水を加えるに従い蛍光性が大きく上昇した。
　以降の実験では、メタノール／水＝５／５の混合溶媒でＣａ2+との反応性を評価した。
実施例７（Ｃａ2+センシング能）
（１）前述の通り、ｐｏｌｙ－１0.05は水に不溶であるため、メタノール／水＝５／５の混合溶媒にｐｏｌｙ－１0.05を溶解させ、Ｃａ2+を添加した時の蛍光挙動の変化について検討した。具体的には、１０mg／Ｌのｐｏｌｙ－１0.05溶液に対し、ＣａＣｌ2を少量ずつ添加したときの、蛍光スペクトルを観察した。その蛍光スペクトルの変化は、図２に、Ｃａ2+濃度に対して、極大蛍光波長（λmax＝４６５nm）における蛍光強度をプロットした。
　図２の蛍光スペクトルにおいてはＣａＣｌ2を加えるに従い、蛍光強度の上昇が観測された。この蛍光強度の上昇は、ｐｏｌｙ－１0.05はＣａ2+の存在下では、ポリマー鎖の凝集が誘起され、ＴＰＥ部位の分子内回転運動が抑制されて、蛍光強度が上昇するために起こると考えられる。このスペクトル変化が単なる塩析による溶解性の低下に起因するものか否かについて調べるために、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ2の他の金属イオンについても同様にｐｏｌｙ－１0.05に添加していき、蛍光強度の変化を観察した。図３に、金属塩濃度に対して、極大蛍光波長（λmax＝４６５nm）における蛍光強度をプロットしたグラフを示す。
　図３より、Ｎａ+、Ｋ+、Ｍｇ2+をｐｏｌｙ－１0.05に添加していったところ、驚くべきことに蛍光強度の上昇はＣａ2+に比べ僅かであり、ｐｏｌｙ－１0.05はＣａ2+を選択的にセンシングできることが分かった。すなわち、この蛍光スペクトル変化が単なる塩析による溶解性の低下に起因するのではなく、Ｃａ2+を添加することで、ポリマー鎖の凝集が誘起され、ＴＰＥ部位の分子内回転運動が抑制されたことに起因することが示唆された。
（２）また図３より、同じ２価の金属イオンであるＣａ2+とＭｇ2+では、蛍光スペクトルの変化に大きな差があることが分かる。この選択性について考察するために、他のアルカリ土類金属であるＳｒ2+やＢａ2+、また遷移金属であるＺｎ2+、Ｆｅ2+の塩化物をｐｏｌｙ－１0.05に添加し、蛍光スペクトルを測定した。図４に、金属塩濃度に対して、極大蛍光波長（λmax＝４６５ｎｍ）における蛍光強度をプロットした。
　Ｃａ2+をｐｏｌｙ－１0.05に対して添加していった際には、約１．０mMのCaCl2を添加することで蛍光強度はほぼ飽和するが、Ｓｒ2+、Ｂａ2+では約０．１mMの添加で蛍光強度は飽和した。またＺｎ2+の場合では、約０．４mMの添加で蛍光強度は飽和した。すなわちｐｏｌｙ－１0.05は、Ｓｒ2+、Ｂａ2+、Ｚｎ2+に対してはＣａ2+よりも敏感に応答することが分かった。
　アルカリ土類金属においては、Ｍｇ2+、Ｃａ2+、Ｓｒ2+、Ｂａ2+の順にイオン半径が大きくなるが、ｐｏｌｙ－１0.05の応答性はおよそこの順になっており、イオン半径の大きいアルカリ土類金属イオンほどｐｏｌｙ－１0.05と強く相互作用し、ポリマーの凝集を促進することが示唆された。遷移金属であるＺｎ2+の添加による蛍光スペクトルの変化は、Ｃａ2+に比べ大きかった。一方、Ｆｅ2+の添加によりｐｏｌｙ－１0.05の蛍光強度は減少していったため、Ｆｅ2+は消光剤として働くことが考えられる。このように遷移金属イオンではＺｎ2+のようにｐｏｌｙ－１0.05に添加することで蛍光強度を上昇させるものと、Ｆｅ2+のように蛍光強度を減少させるものがあることが分かった。
（３）次に、Ｎａ+やＭｇ2+の存在下でもｐｏｌｙ－１0.05はＣａ2+を選択的にセンシングすることができるか検討した。１．０mMのＮａ+、Ｍｇ2+が添加されたｐｏｌｙ－１0.05の溶液に、１．０mMのＣａ2+を添加したときの蛍光スペクトルの変化を観察した（図５）。
　まず、１．０mMのＮａＣｌまたはＭｇＣｌ2をｐｏｌｙ－１0.05に添加したところ蛍光強度はほとんど上昇しなかった。そこにＣａＣｌ2を１．０mM添加したところ、蛍光強度は大幅に上昇した。このことは、Ｎａ+やＭｇ2+存在下でも、ｐｏｌｙ－１0.05はＣａ2+を選択的にセンシングできることを示している。このことは多くの共雑物が存在する生体内においても、ｐｏｌｙ－１0.05はＣａ2+を選択的にセンシングできる可能性を示唆している。
（４）また、ｐｏｌｙ－１0.05のＣａ2+センシングの可逆性を調べるために、Ｃａ2+が添加されたｐｏｌｙ－１0.05にＥＤＴＡを添加した。ＥＤＴＡはＣａ2+キレート剤であり、Ｃａ2+の会合定数はｐＫa＝１０．７６である。１．０mMのＣａ2+が添加されたｐｏｌｙ－１0.05に対してＥＤＴＡを１．０mM添加し、蛍光スペクトルの変化を観測した（図６）。
　１．０mMのＣａ2+が添加されたｐｏｌｙ－１0.05に１．０mMのＥＤＴＡを添加したところ、蛍光強度はＣａ2+添加前の強度まで減少した（図６）。これはｐｏｌｙ－１0.05と相互作用していたＣａ2+がＥＤＴＡにキレートされ、ｐｏｌｙ－１0.05はＣａ2+添加前の状態に戻ったことに由来すると考えられる。このことからｐｏｌｙ－１0.05のＣａ2+センシングは可逆性があることが示唆される。
実施例８（Ｐｏｌｙ－１の組成変化によるＣａ2+センシング能の変化）
　ＴＰＥ部位とポリアクリル酸部位の組成比の違いによって、ｐｏｌｙ－１のＣａ2+センシング能にどのような影響があるのか調べるために、ｐｏｌｙ－１0.01、ｐｏｌｙ－１0.05、ｐｏｌｙ－１0.20、ｐｏｌｙ－１0.50のＣａ2+に対する応答挙動について検討した。まず、様々な組成比のメタノールと水の混合溶媒、またはDMFと水の混合溶媒を用いて、ｐｏｌｙ－１0.01、ｐｏｌｙ－１0.05、ｐｏｌｙ－１0.20、ｐｏｌｙ－１0.50の蛍光スペクトルの変化を観測した。ｐｏｌｙ－１0.50はメタノールに溶解しなかったため、ＤＭＦ／水混合溶媒を用いた。そこで図７（ａ）～（ｄ）に、メタノール／水またはＤＭＦ／水混合溶媒中の水の組成比に対して、極大蛍光波長（λmax=４６５nm）における蛍光強度をプロットしたグラフを示す。
　図７（ａ）～（ｄ）をみると、ｐｏｌｙ－１0.01、ｐｏｌｙ－１0.05では含水量が４０％付近から蛍光強度が上昇するが、ｐｏｌｙ－１0.20やｐｏｌｙ－１0.50では含水量が１０％付近から上昇し始め、５０％のときにすでに蛍光強度が飽和している。これは、ｐｏｌｙ－１0.20やｐｏｌｙ－１0.50は、より疎水的であることに由来するものと考えられる。
　そこで、組成比の異なるｐｏｌｙ－１0.01、ｐｏｌｙ－１0.05、ｐｏｌｙ－１0.20、ｐｏｌｙ－１0.50に対して、メタノール／水＝１／１またはＤＭＦ／水＝１／１の混合溶媒を用いてＣａＣｌ2を添加していき、蛍光スペクトルの変化を観測した。図８に、Ｃａ2+濃度に対して、極大蛍光波長（λmax＝４６５nm）における飽和値で規格化した蛍光強度をプロットしたグラフを示す。
　ｐｏｌｙ－１0.01、ｐｏｌｙ－１0.05では、ＣａＣｌ2を添加すると蛍光強度は上昇したが、ｐｏｌｙ－１0.20、ｐｏｌｙ－１0.50ではＣａＣｌ2を添加しても、蛍光強度にほとんど変化は見られなかった。これは、含水量が５０％のｐｏｌｙ－１0.20、ｐｏｌｙ－１0.50では、溶媒の効果によって既に蛍光強度が飽和状態であるためｐｏｌｙ－１0.20、ｐｏｌｙ－１0.50は既に凝集しており、Ｃａ2+を添加してもｐｏｌｙ－１0.20、ｐｏｌｙ－１0.50はさらに凝集することができなかったためと考えられる。
　そこで低含水条件において、ｐｏｌｙ－１0.20、ｐｏｌｙ－１0.50のＣａ2+滴定実験を行った。メタノール／水＝８／２またはＤＭＦ／水＝８／２の混合溶媒中では蛍光強度は飽和していないことが分かる（図７（ｃ），（ｄ））。そこでこの組成比の混合溶媒中のｐｏｌｙ－１0.20、ｐｏｌｙ－１0.50に対してＣａＣｌ2を添加し蛍光スペクトル変化を観測した。図９に、Ｃａ2+濃度に対して、極大蛍光波長（λmax＝４６５nm）における蛍光強度をプロットしたグラフを示す。
　溶媒組成比がメタノール／水＝８／２のｐｏｌｙ－１0.20およびＤＭＦ／水＝８／２のｐｏｌｙ－１0.50にＣａ2+を添加すると、蛍光強度は上昇し、０．１mMのＣａ2+濃度で飽和した。よって、ＴＰＥ部位を多くもつｐｏｌｙ－１でも、低含水条件ではＣａ2+をセンシングできることが分かった。
　また、ｐｏｌｙ－１0.01、ｐｏｌｙ－１0.05のＣａ2+濃度の検出範囲が０ｍＭ～１．０ｍＭであるのに対し（図８）、ｐｏｌｙ－１0.20、ｐｏｌｙ－１0.50はＣａ2+濃度の検出範囲は０mM～０．１mMであることも分かる（図９）。これは、ｐｏｌｙ－１0.20、ｐｏｌｙ－１0.50がｐｏｌｙ－１0.01、ｐｏｌｙ－１0.05に比べより疎水的であることや、Ｃａ2+と相互作用しポリマー鎖の凝集を引き起こすカルボン酸部位が少ないことに由来するものと考えられる。つまり、ｐｏｌｙ－１の組成を変えることによって、Ｃａ2+濃度の検出範囲が変化することが分かった。
実施例９（Ｐｏｌｙ－１0.05の濃度変化によるＣａ2+センシング能の変化）
　Ｐｏｌｙ－１0.05の濃度の違いによって、ｐｏｌｙ－１のＣａ2+センシング能にどのような変化があるか検討した。そこで（ａ）５mg／Ｌ、（ｂ）１０mg／Ｌ、（ｃ）５０mg／Ｌの濃度の異なる３種類のｐｏｌｙ－１0.05の溶液に対してＣａＣｌ2を添加し、蛍光スペクトルの変化を観測した。図１０に、Ｃａ2+濃度に対して、極大蛍光波長（λmax＝４６５nm）における飽和時の蛍光強度で規格化した蛍光強度をプロットしたグラフをに示す。
　５mg／Ｌの濃度のｐｏｌｙ－１0.05では約０．３mMのＣａ2+の添加で蛍光強度は飽和し、５０mg／Ｌの濃度のｐｏｌｙ－１0.05では３０～５０mMのＣａ2+の添加で蛍光強度は飽和した。これは、薄い濃度のｐｏｌｙ－１0.05では、濃い濃度のｐｏｌｙ－１0.05に比べポリマー数が少なくなり、Ｃａ2+と相互作用しポリマー鎖の凝集を引き起こすカルボン酸部位が少なくないため、より少量のＣａ2+の添加で蛍光強度は飽和するものと考えられる。
　そこで、図１０の横軸をＰＡＡ部位のカルボン酸（ＣＯＯＨ）に対するＣａ2+量の比に変換したグラフを図１１に示す。
　このようにポリマーとＣａ2+の量比で規格化しても、ｐｏｌｙ－１0.05の濃度が異なると、蛍光強度が飽和するカルボン酸（ＣＯＯＨ）に対するＣａ2+量の比が異なることが分かった。すなわち５mg／Ｌの濃度のｐｏｌｙ－１0.05はカルボン酸（ＣＯＯＨ）に対するＣａ2+量の比が約１０のとき蛍光強度は飽和しているが、５０mg／Ｌの濃度のｐｏｌｙ－１0.05はカルボン酸（ＣＯＯＨ）に対するＣａ2+の量が５０～１００のときに飽和している。これは、カルボン酸はＣａ2+と相互作用する場合にはプロトンが解離したカルボキシラート（ＣＯＯ-）の状態で相互作用しており、ｐｏｌｙ－１0.05の濃度が薄くなることによって、カルボン酸（ＣＯＯＨ）の解離度が上昇し、カルボン酸（ＣＯＯＨ）とＣａ2+の相互作用が起こりやすくなっていることに由来する。
　この考えに基づくと、ｐｏｌｙ－１0.05に塩基や酸を添加し、カルボン酸（ＣＯＯＨ）の解離度を変化させることで、Ｃａ2+センシング挙動も変化すると考えられる。そこで０．１mMもしくは１．０mMのＣａ2+が添加されたｐｏｌｙ－１0.05にＴＦＡまたはトリエチルアミンを加え、蛍光スペクトルの変化を観察した。図１２にその蛍光スペクトルを示す。
　０．１mMのＣａＣｌ2が添加されたｐｏｌｙ－１0.05に、トリエチルアミンを添加することで、蛍光強度が上昇し０．５mMのトリエチルアミンを加えた時点で飽和した。また１mMのＣａＣｌ2が添加されたｐｏｌｙ－１0.05に、ＴＦＡを添加すると、蛍光強度は減少した。これらの変化は、トリエチルアミンをｐｏｌｙ－１0.05に加えることで、カルボン酸（ＣＯＯＨ）の解離度が上昇し多くのカルボキシラートが生成し、Ｃａ2+との相互作用が強くなり、ポリマー鎖の凝集が誘起され、ＴＦＡをｐｏｌｙ－１0.05に加えることで、カルボン酸（ＣＯＯＨ）の解離度は減少し、Ｃａ2+との相互作用が弱くなり、Ｃａ2+放出することに由来するものと考えられる。このように、酸性度・塩基性度の変化によって、ｐｏｌｙ－１0.05のＣａ2+センシング能は変化することが分かった。
実施例１０（ＴＰＥへの親水性基導入の効果）
　ジメチルアミノ基を有し、５４６nm付近に極大蛍光波長を有するカルシウムセンサーの構築を行った。
　ジメチルアミノ化ＴＰＥを有するアクリレートモノマー、およびポリマーは以下のようにして合成した。
（１）アルゴンガス雰囲気下、亜鉛粉末（３．２５g）及びテトラヒドロフラン６０mlを反応容器に投入した。－５～０℃に冷却し、１０℃以下に維持したシリンジでＴｉＣｌ4（２．７５ml）をゆっくり添加した。混合物を室温にて０．５時間攪拌し、２．５時間加熱還流した。再び－５～０℃に冷却し、ピリジン（１．０ml）を加え１０分攪拌した。ｐ－ヒドロキシベンゾフェノン（０．９９ｇ）及び４，４’－ジメチルアミノベンゾフェノン（１．３４ｇ）のテトラヒドロフラン（３０ml）溶液をシリンジでゆっくり加えた。添加後、反応混合物を７０℃に加熱し、ＴＬＣで原料がなくなるまで還流した。１０％Ｋ2ＣＯ3水溶液を加え、次いでジクロロメタンを加えた。有機相を水及び食塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥後、減圧で乾固し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ＝９５：５）で精製し、Rf値０．３０のスポットの生成物を集め粗精製物を（３１０mg）得た。
　この粗精製物（４３．４mｇ）及びトリエチルアミン（５６μL）のジクロロメタン（０．５ml）溶液を０℃に冷却し、アクリロイルクロリド（１６μL）のジクロロメタン５ml溶液を滴下した。反応混合物を、ＴＬＣで原料がなくなるまで室温で３時間攪拌した。反応液に炭酸水素ナトリウムを加え、さらにジクロロメタンを加えた。有機相を水及び食塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥後、減圧で乾固した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ＝９９：１）で精製し、４－ヒドロキシ－４’，４”－ビス（ジメチルアミノ）テトラフェニルエチレン　アクリレート４２．７ｍｇ（４’，４”－ビス（ジメチルアミノ）ＴＰＥ－アクリレート）（２段階収率１２％）を得た。
1H NMR (400MHz, CDCl3, 293 K) δ 7.03-7.26 (m, 7H), 6.87-6.91 (m, 6H), 6.56 (dd,J = 17.29, 1.32 Hz, 1H), 6.47 (d, J = 8.96 Hz, 2H), 6.45 (d, J = 8.96 Hz, 2H), 6.28 (dd, J = 17.29, 1.32 Hz, 1H), 5.96 (dd, J = 10.44, 1.32 Hz, 1H), 2.90 (s, 6H), 2.88 (s, 6H) ppm
13C NMR (100MHz, CDCl3, 293 K) δ 164.4, 148.9, 148.9, 148.3, 145.0, 142.9, 141.7, 135.9, 132.5, 132.4, 132.2, 132.0, 131.6, 128.2, 127.6, 125.6, 120.4, 111.5, 111.4, 40.4 ppm.
FT-IR: ν 3449, 3083, 3035, 2921, 2889, 2802, 1746, 1608, 1519, 1444, 1402, 1354, 1294, 1248, 1198, 1166, 1153, 1126, 1065, 1018, 976, 946, 902, 818, 768, 739, 700, 589, 471, 454, 432, 420 cm-1.
（２）（１）で得た４’，４”－ビス（ジメチルアミノ）ＴＰＥ－アクリレート（１２．２mg，５モル％）、ｔｅｒｔ－ブチルアクリレート（６９．０μL，９５モル％）及び２，２’－アゾビス（イソブチロニトリル）（ＡＩＢＮ）のジメチルホルムアミド（０．５ml）溶液を、減圧／アルゴンガスを使用して３回脱酸素した。６０℃で１２時間攪拌し、室温に冷却し、溶媒留去して、（４’，４”－ビス（ジメチルアミノ）ＴＰＥ－アクリレート）0.05－（ｔｅｒｔ－ブチルアクリレート）9.95－コポリマーを７３．０mg得た。
1H NMR (400MHz, CDCl3, 293 K) δ 6.72-7.16 (m), 6.35-6.53 (m), 2.80-2.95 (m), 2.12-2.45 (m), 1.14-1.93 (m) ppm. 
FT-IR(KBr) ν3437, 2978, 2933, 1729, 1609, 1520, 1480, 1450, 1393, 1367, 1256, 1149, 947, 845, 752, 700, 578, 471, 449, 418 cm-1.
Mn=24,000, Mw=44,000, PDI=1.86(GPC : eluent ; DMF, PSt standards).
（３）（２）で得られたコポリマー３０．０mgをトリフルオロ酢酸（４００μL）に溶解し、室温で１２時間攪拌した。反応液を溶媒留去して（４’，４”－ビス（ジメチルアミノ）ＴＰＥ－アクリレート）0.05－（アクリル酸）9.95－コポリマーを１７mg得た。
1H NMR δ 6.83-7.21 (m), 3.01-3.24 (m), 2.31-2.60 (m), 1.45-2.18 (m) ppm
FT-IR (KBr) ν 3448, 2959, 1719, 1509, 1451, 1411, 1250, 1196, 1018, 901, 800, 723, 703, 605, 579, 521, 482, 443, 418 cm-1
（４）（３）で得られたコポリマーを水／メタノール＝１／１混合溶媒に溶解させ（１０mg／L）、カルシウムクロリドを滴下して行ったところ、蛍光強度は増大し、カルシウムセンサーとして機能した。その蛍光スペクトルは５４６nmに極大波長を有し、黄色に発光した。このように、このセンサーでは異なる発光波長のＡＩＥ色素を用いることにより、その発光波長を選択することが可能であることが分かった。
実施例１１（基材への固定化）
　このポリマーは表面開始重合（SIP: Surface-Initiated Polymerization）法を用いて基材へ固定化することも可能である。ここではガラス基板への固定化方法について説明する。まず、基板への固定化が可能なRAFT剤を調整する。トリメトキシシリルプロピルメタクリレート（２９８mg）、２－シアノ－２－プロピルドデシルトリチオカルボナート（１０５mg）、２，２’－アゾビス（イソブチロニトリル）（ＡＩＢＮ,１６mg）をトルエン（１．０ml）溶液に溶解させ、減圧／アルゴンガスを使用して３回脱酸素した。８０℃で１２時間撹拌し、溶媒を減圧留去することによってトリメトキシシリル基を有するＲＡＦＴ剤を得る。
　硫酸、塩酸、ＵＶオゾンクリーナーで対象となるガラス基板をよく洗浄する。０．０１モル／Lのシトリメトキシシリル基を有するＲＡＦＴ剤のトルエンに基板を浸漬し８０℃で１６時間静置する。系を室温に戻し基板を取り出し、トルエン、クロロホルム、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、メタノール、アセトンで洗浄し、真空下で乾燥させることにより、ＲＡＦＴ開始基が固定化されたガラス基板を得る。
　ＴＰＥ－アクリレート（１２．２mg，５モル％）、ｔｅｒｔ－ブチルアクリレート（６９．０μL，９５モル％）及び２，２’－アゾビス（イソブチロニトリル）（ＡＩＢＮ）のトルエン（０．５ml）溶液に修飾ガラス基板を浸漬し、減圧／アルゴンガスを使用して３回脱酸素した。６０℃で１２時間攪拌し、室温に冷却し、トルエン、クロロホルム、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、メタノール、アセトンで基板を洗浄し、（ＴＰＥ－アクリレート）0.05－（ｔｅｒｔ－ブチルアクリレート）9.95－コポリマーが固定化されたガラス基板を得た。（ATR-FT-IR (Ge) ν 2979, 2935, 1729, 1481, 1457, 1393, 1367, 1258, 1149, 846, 752, 471 cm-1）この基板をトリフルオロ酢酸に浸漬し、１２時間放置し、トルエン、クロロホルム、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、メタノール、アセトンで基板を洗浄することにより、（ＴＰＥ－アクリレート）0.05－（アクリル酸）9.95－コポリマーが固定化されたガラス基板を得た。（ATR-FT-IR (Ge) ν 2960, 1717, 1456, 1419, 1250, 1170, 802, 738 cm-1.）このガラス基板の蛍光スペクトルを測定したところ、テトラフェニルエテン部分に由来する発光が確認され、基材への固定化が確認された。シランカップリング材で表面修飾可能な基材であればどのような基材への固定化も可能である。
実施例１２
　ＳＩＰ法のほかにも、ゲル化によってもポリマーを不溶化させることができる。TPE-アクリレート（２０．１mg，５モル％）、アクリル酸（６１．７μL，９０モル％）、テトラエチレングリコールビスアクリレート（１５．１mg,５モル％）及び２，２’－アゾビス（イソブチロニトリル）（ＡＩＢＮ）のジメチルホルムアミド（０．５ml）溶液を、減圧／アルゴンガスを使用して３回脱酸素した。６０℃で１２時間攪拌することによって不溶の固体が得られる。この固体を、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、メタノール、アセトンで基板を洗浄することによって目的のゲルを得た。（FT-IR (KBr) ν2934, 1729, 1645, 1444, 1388, 1254, 1167, 1106, 807, 702, 669 cm-1.）
　このゲルをメタノール／水＝１／１混合溶液中に浸漬し、カルシウムクロリドを添加しながら蛍光量子収率を測定して行ったところ、カルシウムクロリドを添加するに従って、蛍光量子収率は上昇し、カルシウムセンサーとして機能することが分かった。
実施例１３
　光重合開始剤をＡＩＢＮ　１モル％から２，２－ジメトキシ－１，２－ジフェニルエタン－１－オン（ＩＲＧＡＣＵＲＥ６５１、ＢＡＳＦ社）２モル％に代え、白色光を照射して重合した。その結果、実施例１２と同様のゲルが得られた。
実施例１４
　実施例１３と同様の方法で、各モノマーの比率を変化させて、ゲル重合してコポリマーを得た。得られたコポリマーの構造とモル比と膨潤度の関係を表２に示す。ここで膨潤度は、ＨＥＰＥＳ　ｂｕｆｆｅｒ（pH７．４）／メタノール＝１／１の混合溶媒を用いてゲルを３０分間膨潤させた時の膨潤度を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
　表２より、ｚのモル比により膨潤度が変化し、ゲル化重合していることがわかる。
実施例１５
（１）実施例１３で得られたコポリマーのＣａ2+センシング能を評価した。ＨＥＰＥＳ　ｂｕｆｆｅｒ／メタノール＝１／１の混合溶媒に３０分膨潤させたｇｅｌ－１0.01～ｇｅｌ－１0.10にＣａ2+を添加し実施例７と同様にして蛍光量子収率を測定した。その結果を図１３に示す。
　図１３から、ｚのモル比が０．０５モル（５モル％）以下で、蛍光量子収率が変化し、Ｃａ2+の測定が可能であることがわかる。
（２）次に、ｇｅｌ－１のＣａ2+センシングにおける可逆性を検討した。ｇｅｌ－１0.03，ｇｅｌ－１0.02，ｇｅｌ－１0.015，ｇｅｌ－１0.01にＣａ2+を０．２mM添加し蛍光量子収率を測定した。その後、溶媒を加え、Ｃａ2+濃度を１／２（０．１mM）に希薄化し、蛍光量子収率を測定した。
　架橋度の低いｇｅｌ－１0.02，ｇｅｌ－１0.015，ｇｅｌ－１0.01では、Ｃａ2+濃度を０．１mMまで希薄化すると蛍光量子収率は減少し、Ｃａ2+センシングが可逆的であることが示唆された。架橋度が高いｇｅｌ－１では、Ｃａ2+を一度取り込むと濃度を希薄化してもＣａ2+を放出しにくくなると考えられる。
　次にｇｅｌ－１0.015を用いて、可逆性についてさらなる知見を得るために、Ｃａ2+濃度を繰り返し変化させ、蛍光量子収率の変化を測定した（図１４）。Ｃａ2+濃度を高くすると蛍光量子収率は高くなり、またＣａ2+濃度を低くするとそれに伴い蛍光量子収率は低くなり、その変化は繰り返し確認できた。このことから、ｇｅｌ－１0.015のＣａ2+センシングは可逆的であると考えられる。
実施例１６
　実施例１２と同様に、重合開始剤としてＡＩＢＮ（熱重合開始剤）を用い、架橋剤であるモノマー（Ｃ）のモル比を変化させてゲル重合を行った。その結果、架橋剤のモル比が１～５モル％（ｚ＝０．０１～０．０５）の範囲で、ゲル化し、かつＣａ2+センシング能に優れたコポリマーが得られた。また、膨潤度が３４０％以上、さらに３４０～１５００％、特に５００～１５００％のゲルがＣａ2+センシング能に優れていた。
　この時重合濃度と架橋剤添加量（ｚ）を変えながらゲルを合成した（表３）。全てのゲルは、メタノールとアセトンでソックスレー抽出器でそれぞれ１２時間ずつ洗浄することにより精製した。重合濃度２．０Ｍではｚ＜１の条件ではゲルは生成しなかった。これらのゲルをＨＥＰＥＳ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）／メタノール＝１／１中で３０分膨潤させた後の膨潤度（表３）と、その後カルシウム添加に対する蛍光量子収率の変化（図１５）を測定した。４．０Ｍの重合濃度で調製したゲルは、ｚが小さいほど高い膨潤度を示したがいずれも低い値であった。また、カルシウムを添加しても蛍光量子収率はほとんど変化しなかった。一方で、２．０Ｍの重合濃度で調製したゲルは、ｚが小さいほど顕著に高い膨潤度を示した。また、これらのゲルにカルシウムを添加し、蛍光量子収率を測定した所、ｇｅｌ－１ｅ，ｆはほとんど蛍光量子収率に変化はないが、ｇｅｌ－１ｇ，ｈはカルシウムの添加に伴い蛍光量子収率が顕著に増大した。さらに重合濃度を薄めて１．５Ｍの重合濃度で調製したゲルはより高い膨潤度を示した。また、これらのゲルにカルシウムを添加し、蛍光量子収率を測定した所、膨潤度のより高いｇｅｌ－１ｊはカルシウムの添加に伴い蛍光量子収率が顕著に増大した。
　膨潤度の高いゲルほどゲル中の高分子鎖の運動性が高いために、蛍光量子収率の大きな変化が起ったものと考えられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
実施例１７（水中でのカルシウムセンシング）
　また、ｇｅｌ－１ｊは、ＨＥＰＥＳ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）／メタノール＝１／１中だけではなく、ＨＥＰＥＳ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）中でもカルシウムセンシング能を示した（図１６）。また、ゲルの周囲のカルシウム濃度を減少させることにより、蛍光量子収率は初期値まで減少した。その後も、周囲のカルシウム濃度の濃度を上下させることにより、ゲルの蛍光量子収率も再現性良く上下した（図１７）。
実施例１８
（１）フレキシブル基板上でＯＬＥＤやＯＰＶと組み合わせてフレキシブルセンサーを構築する概念図を図１８に示す。
（２）異なる吸収波長、蛍光波長のセンサーの構築
　このようなＯＬＥＤ、ＯＰＶと組み合わせた際には励起光、蛍光の波長の調節も重要である。このような場合、蛍光性部位の化学構造を変化させることにより調節可能である。
　例えば、テトラフェニルエテンにジメチルアミノ基を二つ導入した誘導体は、無置換のそれよりも長波長側に吸収と蛍光を有する。そこで我々は、ジメチルアミノ基を有するテトラフェニルエテンにビニル基を導入したモノマー１－ＮＭｅ２を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
（３）アルゴンガス雰囲気下、亜鉛粉末（３．２５ｇ）及びテトラヒドロフラン６０mlを反応容器に投入した。－５～０℃に冷却し、１０℃以下に維持したシリンジでＴｉＣｌ4（２．７５ml）をゆっくり添加した。混合物を室温にて０．５時間攪拌し、２．５時間加熱還流した。再び－５～０℃に冷却し、ピリジン（１．０ml）を加え１０分攪拌した。ｐ－ヒドロキシベンゾフェノン（０．９９ｇ）及びジメチルアミノベンゾフェノン（１．３４ｇ）のテトラヒドロフラン（３０ml）溶液をシリンジでゆっくり加えた。添加後、反応混合物を７０℃に加熱し、ＴＬＣで原料がなくなるまで還流した。１０％Ｋ2ＣＯ3水溶液を加え、次いでジクロロメタンを加えた。有機相を水及び食塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥後、減圧で乾固し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2：ＭｅＯＨ＝９５．５）で精製し、ｐ－ヒドロキシジメチルアミノテトラフェニルエチレンを３１０ｍｇ（収率１４％）得た。
　ｐ－ヒドロキシジメチルアミノテトラフェニルエチレン（４３．４ｍｇ）及びトリエチルアミン（５６．０μＬ）のジクロロメタン（５００μＬ）溶液を０℃に冷却し、アクリロイルクロリド（１６．０μＬ）のジクロロメタン５００μＬ溶液を滴下した。反応混合物を、ＴＬＣで原料がなくなるまで室温で２時間攪拌した。反応液に炭酸水素ナトリウムを加え、さらにジクロロメタンを加えた。有機相を水及び食塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥後、減圧で乾固した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ＝９９：１）で精製し、ｐ－ヒドロキシテトラジメチルアミノフェニルエチレン　アクリレート４２．７（収率８８％）を得た。これを以下、１－ＮＭｅ2と略す。
Yellow solid: 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.00 - 7.15 (m, 7H), 6.85 - 6.93 (m, 6H), 6.56 (dd, J = 17.0, 1.3 Hz, 1H), 6.46 (t, J = 8.7 Hz, 4H), 6.27 (dd, J = 10.5, 17.3 Hz, 1H), 5.99 (dd, J = 10.5, 1.3 Hz, 1H), 2.89 (d, J = 4.9 Hz, 12H) ppm.
FT-IR (KBr) ν 3469, 3034, 2886, 2801, 1747, 1608, 1520, 1444, 1403, 1354, 1294, 1249, 1167, 1065, 1017, 977, 947, 903, 819, 768, 740, 702, 580, 538 cm-1.
HRMS (FAB) Calcd for C33H32N2O2 [M]+ m/z = 488.2464. Found: m/z = 488.2470.
（４）次に、１－ＮＭｅ2を実施例２（１、２）と同様にして、同様の手法で重合し、ジメチルアミノ化テトラフェニルエテンを蛍光性部位として有するポリアクリル酸（ｐｏｌｙ－１－ＮＭｅ2）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
poly-2-NMe2 
Yellow solid: 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.72 - 7.15, 6.38 - 6.56, 2.79 - 2.92, 2.09 - 2.50, 2.34 - 2.98 ppm.
FT-IR (KBr) ν 3437, 2979, 2933, 1730, 1609, 1521, 1480, 1450, 1393, 1367, 1256, 1149, 846, 752, 700, 472 cm-1.
poly-1-NMe2 
Yellow solid: 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.79 - 7.37, 2.28 - 2.57, 1.36 - 2.14 ppm.
FT-IR (KBr) ν 3448, 2959, 1719, 1509, 1451, 1411, 1251, 1197, 800, 723, 704 cm-1.
（５）得られたｐｏｌｙ－１－ＮＭｅ２はｐｏｌｙ－１よりも長波長側に吸収と蛍光を示した（図１９）。さらに、この溶液にＣａＣｌ２を添加した所、蛍光強度は増大し、このｐｏｌｙ－１－ＮＭｅ２もカルシウムセンサーとして機能する（図２０）。
　これらの結果よりＡＩＥ部位の構造を変えることにより吸収波長（励起波長）、蛍光波長（検出波長）を変化させることが可能であり、様々なＯＬＥＤ、ＯＰＶに対応できるカルシウムセンサーを設計できることがわかる。

Claims (15)

  1. 　側鎖にカルボキシル基を有する繰り返し単位（Ａ）と、側鎖に凝集誘起発光能を示すエステル残基を有するカルボキシレート基を有する繰り返し単位（Ｂ）とを有するコポリマー。
  2. 　繰り返し単位（Ａ）が、アクリル酸、メタクリル酸、及びスチレンカルボン酸から選ばれるモノマー由来の繰り返し単位である請求項１記載のコポリマー。
  3. 　繰り返し単位（Ｂ）が、次式（１）又は（２）で示される化合物由来のエステル残基を有する、アクリレート、メタクリレート、及びスチレンカルボキシレートから選ばれるモノマー由来の繰り返し単位である請求項１又は２記載のコポリマー。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式（１）中、Ｒ1は同一又は異なって、置換基を有していてもよい芳香族炭化水素基又は置換基を有していてもよい芳香族複素環式基を示し、Ｅ1は、ケイ素原子又はゲルマニウム原子を示し、Ａ1及びＢ1は同一又は異なって、炭化水素基を示し、ｎは１～４の整数を示す）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （式（２）中、Ｒ2及びＲ3は、同一又は異なって、置換基を有していてもよい芳香族炭化水素基又は置換基を有していてもよい芳香族複素環式基を示し、Ａ2及びＢ2は、同一又は異なって、水素原子、置換基を有していてもよい炭化水素基、又は置換基を有していてもよい芳香族複素環式基を示す。）
  4. 　式（１）又は（２）で表される化合物が、フェニル基上に１～５個の親水性基が置換していてもよい１－メチル－１，２，３，４，５－ペンタフェニルシロール、２，３，４，５－テトラフェニル－１，１－ジメチルシロール又はテトラフェニルエチレンである請求項３記載のコポリマー。
  5. 　繰り返し単位（Ａ）と繰り返し単位（Ｂ）のモル比（Ａ／Ｂ）が、４～１０００である請求項１～４のいずれかに記載のコポリマー。
  6. 　数平均分子量が１０，０００～１，０００，０００である請求項１～５のいずれかに記載のコポリマー。
  7. 　多価金属イオン蛍光検出用コポリマーである請求項１～６のいずれかに記載のコポリマー。
  8. 　さらに、多官能性モノマーに由来する繰り返し単位（Ｃ）を有する請求項１～７のいずれかのコポリマー。
  9. 　繰り返し単位（Ｃ）を０．１～１０モル％含有する請求項８記載のコポリマー。
  10. 　繰り返し単位（Ｃ）が、２以上の重合性ビニル基を有するモノマー由来の繰り返し単位である請求項８又は９記載のコポリマー。
  11. 　請求項１～１０のいずれかに記載のコポリマーを有する多価金属イオン検出用デバイス。
  12. 　固体基材上に請求項１～１０のいずれかに記載のコポリマーが固定化されている請求項１１記載の多価金属イオン検出用デバイス。
  13. 　固体基材上への請求項１～１０のいずれかに記載のコポリマーの固定化手段が、固体基材と前記コポリマーとの共有結合によるものである請求項１２記載の多価金属イオン検出用デバイス。
  14. 　請求項１１～１３のいずれかに記載のデバイスに、試料を接触させ、蛍光強度を測定することを特徴とする試料中の多価金属イオン濃度の定量法。
  15. 　次式（３）で示される化合物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     （式（３）中、Ｒ4は水素原子又はメチル基を示し、Ｒ5は直接結合、炭素数１～８のアルキレン基又はフェニレン基を示し、Ｘは、次式（１）又は（２）で示される化合物由来の基を示す。）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     （式（１）中、Ｒ1は同一又は異なって、置換基を有していてもよい芳香族炭化水素基又は置換基を有していてもよい芳香族複素環式基を示し、Ｅ1は、ケイ素原子又はゲルマニウム原子を示し、Ａ1及びＢ1は同一又は異なって、炭化水素基を示し、ｎは１～４の整数を示す。）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     （式（２）中、Ｒ2及びＲ3は、同一又は異なって、置換基を有していてもよい芳香族炭化水素基又は置換基を有していてもよい芳香族複素環式基を示し、Ａ2及びＢ2は、同一又は異なって、水素原子、置換基を有していてもよい炭化水素基、又は置換基を有していてもよい芳香族複素環式基を示す。）
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