WO2021158053A1 - 흡입전달용 핵산 또는 단백질 탑재 폐 계면활성제입자 및 이의 제조 방법 - Google Patents

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lung
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박지호
오찬희
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한국과학기술원
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Definitions

  • the present invention is an invention for optimizing a particle-forming method using biocompatible lung surfactant particles and positively charged protamine protein to deliver negatively charged proteins or nucleic acids deep into the lungs.
  • a negatively charged protein or nucleic acid it was attempted to combine with a particle and an electric charge through the medium of positively charged protamine. Because.
  • influenza and corona viruses mainly infect type II alveolar type II cells in the alveolar region.
  • a technique for efficient delivery to type II alveolar cells is needed.
  • the alveolar type II cells function to secrete and store a pulmonary surfactant, and the pulmonary surfactant plays a role in regulating the tension of the lungs during respiration.
  • Lung surfactant is composed of a lipid and a membrane protein (non-patent literature, Eur Respir J. 1999 Jun; 13(6): 1455-76).
  • the present invention was completed by preparing a complex in which a protein or nucleic acid was bound to a liposome made of a lung surfactant.
  • Non-Patent Document 1 Eur Respir J. 1999 Jun;13(6):1455-76
  • Another object of the present invention is to provide a method for preparing a composition for protein or nucleic acid delivery for selective protein or nucleic acid delivery to the lungs.
  • the complex in which a protein or a nucleic acid is bound to a liposome prepared with a pulmonary surfactant preserveds the original form and function without damaging the structure of the protein or nucleic acid when administered in vivo.
  • it can efficiently fuse with the pulmonary surfactant membrane present in the alveoli to efficiently deliver the bound protein or nucleic acid (gene) to surrounding cells, and has low toxicity and a structure There is an effect of excellent stability.
  • FIG. 1 is a diagram showing a schematic diagram of a protein loading method using a pulmonary surfactant.
  • Figure 2 shows that the amounts of green fluorescent protein (GFP) and lung surfactant were fixed at 50 ⁇ g and 5 mg, respectively, and the amount of protamine was 1:1, 1:5, 1:10, based on 1 mole of green fluorescent protein (GFP); It is a diagram showing the results of measuring the green fluorescent protein (GFP) loading rate and the size and charge of particles while increasing the molar ratio of 1:20.
  • GFP green fluorescent protein
  • FIG. 3 is a view showing a photograph of observation of the shape of the lung surfactant particles loaded with green fluorescent protein through an electron microscope (TEM) photograph.
  • TEM electron microscope
  • Figure 4 is in order to evaluate the stability of the finished particles, the particles are placed in a culture medium containing 10% (v/v) Fetal bovine serum (FBS), which is an environment similar to a living body, and the particle size and GFP fluorescence at 37 ° C. It is a figure which shows the result of confirming the change and the result of confirming the particle toxicity.
  • FBS Fetal bovine serum
  • Figure 5 is a control protamine-protein complex (Pro-GFP) human alveolar epithelial cells (HPAepic), macrophages (Raw 264.7), or type II alveolar cell-derived lung cancer cells (A549) after treatment for 24 hours, respectively, It is a diagram showing the result of confirming intracellular delivery through a confocal microscope.
  • Pro-GFP protamine-protein complex
  • HPAepic human alveolar epithelial cells
  • macrophages Raw 264.7
  • A549 type II alveolar cell-derived lung cancer cells
  • FIG. 6 is a view showing the results of confirming intracellular delivery through a confocal microscope after each treatment of lung surfactant-protein-protamine (Surf-Pro-GFP) particles in human alveolar epithelial cells (HPAepic) for 24 hours .
  • Surf-Pro-GFP lung surfactant-protein-protamine
  • HPAepic human alveolar epithelial cells
  • FIG. 7 is a view showing the results of confirming intracellular delivery through a confocal microscope after each treatment of lung surfactant-protein-protamine (Surf-Pro-GFP) particles in macrophages (Raw 264.7) for 24 hours.
  • Surf-Pro-GFP lung surfactant-protein-protamine
  • FIG. 10 is a lung surfactant-protein-protamine (Surf-Pro-GFP) particle based on 1 mg of lung surfactant to confirm the long-term distribution of lung surfactant-protein-protamine (Surf-Pro-GFP) particles by time. Then, it is a diagram showing the results of inhalation delivery to the mouse animal model and confirming the long-term distribution of proteins and particles over time.
  • Surf-Pro-GFP lung surfactant-protein-protamine
  • FIG. 11 is a lung surfactant-protein-protamine (Surf-Pro-GFP) particle based on 1 mg of lung surfactant to confirm the long-term distribution of lung surfactant-protein-protamine (Surf-Pro-GFP) particles by time. Then, it is a diagram showing a graph quantifying the results of FIG. 10, which is a result of inhalation delivery to a mouse animal model and checking the long-term distribution of proteins and particles over time.
  • FIG. 12 is a diagram showing a schematic diagram of a nucleic acid loading method using a lung surfactant.
  • FIG. 13 is a diagram showing the results of measuring the size and charge of the siRNA-protamine complex using DLS equipment.
  • FIG. 15 is a view showing the results of confirming the luminescence through IVIS equipment after treatment with luminescence-expressing A549 (A549-luc) cells in order to confirm the protein expression reduction ability of Luc-siRNA using the lung surfactant.
  • 16 is a view showing the results of confirming the apoptosis through MTT technique after treatment of each experimental group in type II alveolar cell-derived lung cancer cells (A549-luc) (left) and Luc-siRNA protein using lung surfactant It is a figure (right) showing quantitatively the result of confirming the luminescence through the IVIS equipment for the expression lowering ability.
  • FIG. 17 shows the apoptosis effect using KRAS-siRNA, RPN2-siRNA, and lung surfactant known as siRNA capable of inducing apoptosis function against type II alveolar cell-derived A549 lung cancer cells through the existing literature. It is a drawing showing the result.
  • the embodiment of the present invention may be modified in various other forms, and the scope of the present invention is not limited to the embodiments described below.
  • the embodiments of the present invention are provided in order to more completely explain the present invention to those of ordinary skill in the art.
  • the binding of the protein or nucleic acid to the liposome may be binding and/or encapsulated inside the liposome, or binding to the outside of the liposome.
  • the lung surfactant may be a lung surfactant derived from a living body, and in the present invention, a composition for protein or nucleic acid delivery was prepared using a lung surfactant derived from a living body through Examples.
  • the lung surfactant is not limited to the lung surfactant derived from a living body, and may include one that mimics a lung surfactant derived from a living body, and is synthetic, semi-synthetic (ie, modified natural). pulmonary surfactants.
  • the surfactant mimicking the bioderived pulmonary surfactant, or synthetic or semi-synthetic pulmonary surfactant is 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% with the bioderived pulmonary surfactant %, including those having at least 90% protein homology.
  • the protein bound to the liposome is bound to the liposome through a protein or peptide having a positive charge
  • the protein having a positive charge includes protamine, histone protein (histone), lysozyme, etc. It can be used, and preferably, FDA-approved protamine can be used.
  • the positively charged protein or peptide is preferably a protein or peptide including a domain rich in cationic amino acids.
  • Cationic amino acids include arginine, histidine, and lysine.
  • the arginine-rich protein includes protamine.
  • the protein binding to the liposome is preferably a protein having a negative charge.
  • a positively charged protamine is used as a linker to mount a negatively charged protein, and the reason is to deliver the protein in a state that preserves the original protein structure without damaging the protein structure.
  • the nucleic acid binding to the liposome may be, for example, DNA or RNA
  • the RNA is, for example, messenger RNA (mRNA), ribosomal RNA (rRNA), transfer RNA (tRNA), small nuclear RNA (snRNA). ), snoRNA (small nucleolar RNA), aRNA (antisense RNA), miRNA (micro RNA), siRNA (small interfering RNA), piRNA (piwi interacing RNA).
  • mRNA messenger RNA
  • rRNA ribosomal RNA
  • tRNA transfer RNA
  • snRNA small nuclear RNA
  • snoRNA small nucleolar RNA
  • aRNA antisense RNA
  • miRNA miRNA
  • micro RNA small interfering RNA
  • piRNA piRNA
  • the nucleic acid includes a gene therapy agent.
  • the protein or nucleic acid delivery composition can selectively deliver a protein or nucleic acid bound to a liposome to the lung (lung), which is a lung surfactant constituting the liposome, and the interaction between the lung surfactant membrane and cells present in the lung by action.
  • lung which is a lung surfactant constituting the liposome
  • the pulmonary surfactant may be a lipid-protein complex composed of lipids and proteins produced in type II alveolar cells. That is, the lung surfactant may include a mammalian lung surfactant collected from a mammalian lung.
  • the mammal may be a human, and may be an animal other than a human, specifically, a pig or a cow.
  • liposomes based on lung surfactant can efficiently target type II alveolar cells and deliver bound proteins and nucleic acids.
  • lipid in the lipid-protein complex refers to a naturally occurring, synthetic or semi-synthetic (ie, modified natural) compound that is generally amphiphilic.
  • Lipids typically include a hydrophilic component and a hydrophobic component.
  • Exemplary lipids include, but are not limited to, phospholipids, fatty acids, fatty alcohols, triglycerides, phosphadides, oils, glycolipids, fatty alcohols, waxes, terpenes, and steroids.
  • the phrase "semi-synthetic (or modified natural)" refers to a natural compound that has been chemically modified in some way.
  • phospholipids examples include natural and/or synthetic phospholipids.
  • Phospholipids that may be used include phosphatidylcholine (saturated and unsaturated), phosphatidylglycerol, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, phosphatidic acid, phosphatidylinositol, sphingolipids, diacylglycerides, cardiolipin, ceramides and cerebrosides, and the like. However, it is not limited thereto.
  • Exemplary phospholipids include dipalmitoyl phosphatidylcholine (DPPC), dilauryl phosphatidylcholine (DLPC) (C12:0), dimyristoyl phosphatidylcholine (DMPC) (C14:0), distearoyl phosphatidylcholine (DSPC), dipitanoyl Phosphatidylcholine, nonadecanoyl phosphatidylcholine, arachidoyl phosphatidylcholine, dioleoyl phosphatidylcholine (DOPC) (C18:1), dipalmitoleoyl phosphatidylcholine (C16:1), linoleoyl phosphatidylcholine (C18:2), myristoyl Palmitoyl Phosphatidylcholine (MPPC), Steroyl Myristoyl Phosphatidylcholine (SMPC), Steroyl Palmito
  • fatty acids and fatty alcohols include, but are not limited to, sterols, palmitic acid, cetyl alcohol, lauric acid, myristic acid, stearic acid, phytanic acid, dipalmitic acid, and the like.
  • exemplary fatty acids include palmitic acid.
  • fatty acid esters include, but are not limited to, methyl palmitate, ethyl palmitate, isopropyl palmitate, cholesteryl palmitate, palmityl palmitate, sodium palmitate, potassium palmitate, tripalmitine, and the like.
  • the pulmonary surfactant includes a membrane protein, and the presence of this membrane protein makes it possible to selectively and effectively target type II alveolar cells.
  • the membrane protein may include one or more natural surfactant polypeptides selected from the group consisting of SP-A, SP-B, SP-C and SP-D, a portion thereof, or a mixture thereof.
  • Exemplary peptides may comprise at least about 1 to 50 amino acids, or 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, or 50 amino acid segments of a natural surfactant polypeptide.
  • Exemplary SP-B polypeptides may comprise segments of at least about 1 to 50 amino acids, or 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, or 50 amino acids of SP-B.
  • the SP-B peptide may be an amino-terminal peptide or a carboxy-terminal peptide.
  • An exemplary SP-B peptide may be a 25-amino acid amino terminal peptide.
  • the pulmonary surfactant may comprise a recombinantly produced surfactant polypeptide.
  • Recombinant SP-A, SPB, SP-C, SP-D, or portions thereof can be expressed in a suitable prokaryotic or eukaryotic expression system using a variety of known techniques to produce SP-A, SP-B, SP-C, SP-D or It is obtainable by expressing a DNA sequence encoding a portion thereof.
  • Recombinant vectors readily adapted to contain an isolated nucleic acid encoding a surfactant polypeptide or a portion thereof, host cells containing the recombinant vectors and methods of making such vectors and host cells, as well as in recombinant techniques Their use in the production of polypeptides encoded by them is well known.
  • a nucleic acid encoding a surfactant polypeptide or portion thereof may be provided in an expression vector comprising a nucleotide sequence encoding a surfactant polypeptide operably linked to at least one regulatory sequence. It should be understood that the design of the expression vector may depend on factors such as the selection of the host cell to be transformed and/or the type of protein desired to be expressed.
  • the vector copy number the ability to control that copy number, and expression of any other protein encoded by the vector (eg, an antibiotic marker) should be considered.
  • a nucleic acid of interest can be used to cause expression and overexpression of the kinase and phosphatase polypeptides in cells grown in culture.
  • host cells can be transfected with the recombinant gene.
  • the host cell can be any prokaryotic or eukaryotic cell.
  • the polypeptide can be expressed in bacterial cells, such as E. coli, insect cells, yeast or mammalian cells. In these examples, when the host cell is a human, it may or may not be from a living subject. Other suitable host cells are known to those skilled in the art. Additionally, the host cell can be supplemented with tRNA molecules not typically found in the host, in order to optimize expression of the polypeptide. Other methods suitable for maximizing expression of a polypeptide will be known to those skilled in the art. Methods for producing polypeptides are well known in the art.
  • a host cell transfected with an expression vector encoding a surfactant polypeptide or a portion thereof can be cultured under appropriate conditions to allow expression of the polypeptide to occur.
  • the polypeptide can be secreted and isolated from a mixture of cells and the medium containing the polypeptide. Alternatively, the polypeptide may remain cytoplasmically intact. Cells are then harvested, lysed, and proteins isolated from cell lysates.
  • the surfactant polypeptide and surfactant lipid interact by hydrostatic interaction.
  • Charged amino acids interact with the polar head groups of lipids, and hydrophobic amino acids interact with phospholipid acyl side chains.
  • SP-B and SP-C are hydrophobic proteins. Both SP-B and SP-C bind preferentially to anionic lipids (eg, phosphatidylglycerol (PG)).
  • SP-A and SP-D are hydrophilic proteins and interact with a wide range of amphiphilic lipids, including glycerophospholipids, sphingophospholipids, sphingoglycolipids, lipid A and lipoglycans. SP-A binds to DPPC.
  • hydrostatic interaction of the SP-B mimetic KL4 with lipids in natural surfactants or lipids contained in surface active agents is observed.
  • a lysine residue in the KL4 peptide interacts with the charged head group of DPPC
  • a hydrophobic leucine residue interacts with the phospholipid acyl side chain of phosphatidylglycerol.
  • the average diameter range of the protein-bound complex is not particularly limited, but may be in the range of 250 to 1200 nm, and 260 to 1200 nm, for example. It can range from 1200 nm, it can be from 270 to 1200 nm, it can be from 280 to 1200 nm, it can be from 290 to 1200 nm, it can be from 300 to 1200 nm, it can be from 250 to 1150 nm and may be in the range of 250 to 1120 nm, in the range of 250 to 1110 nm, in the range of 260 to 1150 nm, in the range of 270 to 1120 nm, in the range of 280 to 1110 nm, in the range of 298 to 1108 nm, and may range from 298.9 to 1108 nm. Alternatively, it may be 1 ⁇ m or less, and if it is 1 ⁇ m or more, it may
  • the average diameter of the complex can be appropriately adjusted by using an extruder kit and controlling the amount of a waste surfactant used in the manufacture of the complex, a positively charged protein or peptide, and the like.
  • composition for delivery of the protein or nucleic acid may be delivered to the lungs by inhalation.
  • Inhalation devices such as inhalers (including dry powder inhalers and metered dose inhalers) and nebulizers (also known as atomizers) can be used to deliver the bound protein or nucleic acid to the lungs.
  • An exemplary dry powder inhaler can be obtained from Inhale Therapeutic Systems. Dry powder inhalers are also available from 3M.
  • Another aspect of the present invention is
  • Step 1 preparing a first solution in which the lung surfactant is dissolved
  • Step 2 drying the solution in which the prepared waste surfactant is dissolved to form a lipid film
  • Step 3 treating the formed lipid membrane with a second solution in which the binding target protein or nucleic acid is dissolved to hydrate, thereby preparing a complex in which the binding target protein or nucleic acid is bound to a liposome prepared with a lung surfactant; containing,
  • step 1 is a step of preparing a first solution in which a pulmonary surfactant to form liposomes is dissolved.
  • any solvent that can easily dissolve the waste surfactant can be used without limitation, and in one embodiment, chloroform, methanol, etc. can be used alone or in combination. .
  • liposomes prepared from lung surfactants Due to the intrinsic properties of lung surfactant, liposomes prepared from lung surfactants have an effect of selectively targeting the lungs by interaction with cells present in the lungs.
  • the pulmonary surfactant is a complex (lipid-protein complex) composed of lipids and proteins produced in type II alveolar cells, and the pulmonary surfactant is a membrane It is preferable to include a protein (membrane protein).
  • the complex to which a protein or nucleic acid is bound to the liposome prepared with the pulmonary surfactant can target type II alveolar cells.
  • step 2 is a step of drying the solution in which the lung surfactant is dissolved to form a lipid film.
  • the method of forming the lipid film may be performed by employing a commonly known method, and in one embodiment, a solution in which the waste surfactant is dissolved is placed in a glass vial and dried at room temperature to form a lipid film.
  • step 3 is to hydrate the formed lipid membrane by treating a second solution in which the binding target protein or nucleic acid is dissolved, so that the binding target protein or nucleic acid is This is a step of preparing a complex bound to liposomes made of pulmonary surfactant.
  • the third solution in which the positively charged protein or peptide is dissolved is also treated, and the protein or nucleic acid bound to the liposome. It is preferable to induce binding to the liposome through a positively charged protein or peptide.
  • the binding target protein or nucleic acid since most proteins or nucleic acids have a negative charge, when the binding target protein or nucleic acid has a negative charge, the third solution in which the positively charged protein or peptide is dissolved in the hydration step of the lipid membrane is treated together, and the positive charge Via a protein or peptide having a , the binding target protein or nucleic acid can be stably bound to the inside and/or outside of the liposome formed with the lung surfactant (FIG. 1).
  • the binding target protein or nucleic acid when the binding target protein or nucleic acid is stably bound to the inside and/or outside of the liposome formed with the lung surfactant, the protein or nucleic acid structure is not damaged when administered in vivo, and the original protein or nucleic acid form is preserved. can be transmitted to
  • One aspect of the present invention is an invention for optimizing a method of granulating using a biocompatible lung surfactant particle and a positively charged protamine protein to deliver a negatively charged protein or nucleic acid deep into the lung, and this optimization is It can be achieved by specifying the amount of the lung surfactant, the binding target protein or nucleic acid, the positively charged protein or peptide when carrying out the method for preparing the composition for protein or nucleic acid delivery as follows.
  • weight of nucleic acid to be bound /(weight of positively charged protein or peptide) may be, for example, 0.5, 0.75, 1, 1.25, 1.5, 2, 4, preferably 1.
  • the mass ratio of the lung surfactant to the weight of the complex of the binding target nucleic acid and the positively charged protein or peptide may be 1:1 to 1:20, for example, 1:1 to 1:18, 1:2 to 1 :15, 1:2 to 1:13, 1:2 to 1:8, 1:8 to 1:10, 1:5 to 1:15.
  • 100 to 130 parts by weight of the lung surfactant may be used based on 1 part by weight of the binding target protein or nucleic acid,
  • 100 to 120 parts by weight of the lung surfactant may be used based on 1 part by weight of the binding target protein or nucleic acid,
  • 100 to 110 parts by weight of the lung surfactant may be used based on 1 part by weight of the binding target protein or nucleic acid,
  • 100 parts by weight of the lung surfactant may be used based on 1 part by weight of the binding target protein or nucleic acid.
  • a positively charged protein or peptide may be used based on 1 mole (mol) of the binding target protein or nucleic acid,
  • a positively charged protein or peptide may be used based on 1 mole (mol) of the binding target protein or nucleic acid,
  • 10 moles of a protein or peptide having a positive charge may be used based on 1 mole (mol) of the binding target protein or nucleic acid.
  • the amount of binding target protein or nucleic acid is fixed at 50 ⁇ g and the amount of lung surfactant used at 5 mg, the amount of positively charged protein or peptide is varied based on 1 mol (mol) of the binding target protein or nucleic acid.
  • the varying binding efficiency (%) of the binding target protein or nucleic acid is demonstrated in FIG. 2, and the ratio on the x-axis on the graph of FIG. 2 is a protein or nucleic acid having a positive charge based on 1 mole (mol) of the binding target protein or nucleic acid. It means the molar (mol) used of the peptide.
  • the lung surfactant based on 1 part by weight of the binding target protein or nucleic acid, and at the same time use 10 mol of the positively charged protein or peptide based on 1 mol (mol) of the binding target protein or nucleic acid. do.
  • the hydration step may be performed without limitation as long as the lipid membrane is easily hydrated.
  • the hydration may be carried out at a temperature of 30 to 90 °C, may be carried out at a temperature of 35 to 90 °C, may be carried out at a temperature of 40 to 90 °C, may be carried out at a temperature of 45 to 90 °C and can be carried out at a temperature of 30 to 80 ° C, can be carried out at a temperature of 30 to 70 ° C, can be carried out at a temperature of 30 to 60 ° C, can be carried out at a temperature of 30 to 50 ° C, and can be carried out at a temperature of 30 to 45 ° C It can be carried out at a temperature, it can be carried out at a temperature of 35 to 55 °C, it can be carried out at a temperature of 40 to 50 °C, it can be carried out at a temperature of 45 °C.
  • the step of adjusting the diameter of the complex may be further included.
  • the diameter of the composite was adjusted using an extruder kit, but the present invention is not particularly limited thereto.
  • the average diameter range of the protein or nucleic acid-bound complex is not particularly limited, but may be in the range of 250 to 1200 nm, and 260 to 1200 nm, for example. It can range from 1200 nm, it can be from 270 to 1200 nm, it can be from 280 to 1200 nm, it can be from 290 to 1200 nm, it can be from 300 to 1200 nm, it can be from 250 to 1150 nm and may be in the range of 250 to 1120 nm, in the range of 250 to 1110 nm, in the range of 260 to 1150 nm, in the range of 270 to 1120 nm, in the range of 280 to 1110 nm, in the range of 298 to 1108 nm, and may range from 298.9 to 1108 nm. Alternatively, it may be 1 ⁇ m or less, and if it is 1 ⁇ m or more, it may
  • the complex in which a protein or nucleic acid is bound to a liposome prepared with a lung surfactant provided in one aspect of the present invention is in a state of preserving the original protein or nucleic acid form and function without damaging the structure of the protein or nucleic acid when administered in vivo.
  • a lung surfactant provided in one aspect of the present invention
  • a positively charged protamine protein is used as an intermediate linker to induce binding between the protein and the lung surfactant.
  • a lung surfactant solution was prepared.
  • Protamine protein was dissolved in distilled water at a concentration of 2 mg/ml to prepare a protamine protein solution.
  • Green fluorescent protein (GFP) was dissolved in distilled water at a concentration of 0.5 mg/ml to prepare a green fluorescent protein solution.
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of a protein loading method using pulmonary surfactant.
  • green fluorescent protein (GFP) was used as a binding target protein or nucleic acid. because it has a negative charge.
  • Green fluorescent protein has a molecular weight of about 26.9 kDa, and has a negative charge of about -5 to -7 mV when the electric charge is measured through a DLS (Dynamic light scattering) device.
  • the contents are shown in Table 1 below.
  • GFP green fluorescent protein
  • the amount of protamine was changed while the amount of green fluorescent protein (GFP) and lung surfactant used in particle preparation were fixed at 50 ⁇ g and 5 mg.
  • GFP green fluorescent protein
  • lung surfactant was fixed at 5 mg
  • the amount of protamine was 1 times compared to the mole of green fluorescent protein (GFP) (1:1 mol/mol) up to 20 times (1:20 mol/mol) was used separately.
  • DiI a very hydrophobic, poorly water-soluble dye
  • a solution in which the red dye DiI was dissolved in methanol at a concentration of 1.25 mg/ml was separately prepared.
  • the waste surfactant solution prepared in (1) and the solution in which the DiI was dissolved were mixed, and the waste surfactant and the DiI dye were adjusted to be mixed in a ratio of 1000:1 by mass.
  • the mixed solution is placed in a glass vial, and the solvent is evaporated to form a lipid film. Subsequent processes were performed in the same manner as the above-described processes (5) and (6).
  • the loading rate (%) change was evaluated. As described above, the amount of green fluorescent protein (GFP) was fixed at 50 ⁇ g.
  • the amount of protamine was 1:1, 1:5, 1:10, 1:20 based on 1 mole of green fluorescent protein (GFP).
  • the green fluorescent protein (GFP) loading rate and particle size and charge were measured by DLS.
  • Figure 2 shows that the amounts of green fluorescent protein (GFP) and lung surfactant were fixed at 50 ⁇ g and 5 mg, respectively, and the amount of protamine was 1:1, 1:5, 1:10, based on 1 mole of green fluorescent protein (GFP); It is a diagram showing the results of measuring the green fluorescent protein (GFP) loading rate and the size and charge of particles while increasing the molar ratio of 1:20.
  • GFP green fluorescent protein
  • the shape of the lung surfactant particles loaded with green fluorescent protein was observed through transmission electron microscopy of the particles. Through this, it can be seen that circular and uniform nanoparticles were well manufactured.
  • the protein-bound lung surfactant-based particles used in subsequent experimental examples are,
  • the lung surfactant 100 parts by weight of the lung surfactant was used based on 1 part by weight of the binding target protein or nucleic acid (GFP), and particles prepared by using 10 mol of the protamine protein based on 1 mol of the binding target protein were used.
  • GFP nucleic acid
  • the particles were put in a culture medium containing 10% Fetal bovine serum (FBS), an environment similar to that of a living body, and the size of the particles was compared over time at 37°C.
  • FBS Fetal bovine serum
  • the stability of the particles was tested by comparing the particle size before and after the nebulizer.
  • the particle itself was tested for toxicity against A549 lung cancer cells derived from type II alveolar cells.
  • the stability of the particles was confirmed by comparing the particle sizes before and after the nebulizer treatment.
  • the stability of the particles was verified by confirming that particles having a size of about 261 nm were formed before the nebulizer and particles having a size of about 253.8 were formed even after the nebulizer.
  • Figure 4 is to evaluate the stability of the finished particles, the particles were placed in a culture medium containing 10% (v / v) FBS (Fetal bovine serum), which is an environment similar to a living body, and the size of the particles was compared over time at 37 ° C. It is a drawing showing the result.
  • FBS Fetal bovine serum
  • A549 a type II alveolar cell-derived lung cancer cell line
  • PBS PBS
  • protamine-protein complex Pro-GFP
  • Protein FTP
  • HPAepic human alveolar epithelial cells
  • macrophages Raw 264.7
  • type II alveolar cell-derived lung cancer cells A549
  • Figure 5 is a control, protamine-protein complex (Pro-GFP) human alveolar epithelial cells (HPAepic), macrophages (Raw 264.7), or type II alveolar cell-derived lung cancer cells (A549) after treatment for 24 hours, respectively, It is a diagram showing the result of confirming intracellular delivery through a confocal microscope.
  • Pro-GFP protamine-protein complex
  • HPAepic human alveolar epithelial cells
  • macrophages Raw 264.7
  • A549 type II alveolar cell-derived lung cancer cells
  • lung surfactant-protein-protamine (Surf-Pro-GFP) particles were treated in the same cells.
  • 0.2 mg of lung surfactant particles were labeled with DiI (1.25 mg/ml in methanol) fluorescence to check whether the particles (red) and protein (green) were well delivered into the cells.
  • cell nuclei were stained with Hoechst and intracellular delivery was confirmed through confocal microscopy.
  • the cells were subcultured in a 6-well plate (well plate) of about 30,000 animals 24 hours before the experiment.
  • FIG. 6 is a view showing the results of confirming intracellular delivery through a confocal microscope after each treatment of Surf-Pro-GFP particles in human alveolar epithelial cells (HPAepic) for 24 hours.
  • FIG. 7 is a view showing the results of confirming intracellular delivery through a confocal microscope after each treatment of Surf-Pro-GFP particles in macrophages (Raw 264.7) for 24 hours.
  • FIG. 8 is a view showing the results of confirming intracellular delivery through a confocal microscope after each treatment of Surf-Pro-GFP particles to type II alveolar cell-derived lung cancer cells (A549) for 24 hours.
  • Figure 10 is after preparing Surf-Pro-GFP particles based on 1 mg of lung surfactant in order to confirm the long-term distribution of Surf-Pro-GFP particles over time, delivered by inhalation to a mouse animal model, and long-term distribution of proteins and particles over time It is a drawing showing the result of checking.
  • red indicates organ autofluorescence
  • green indicates lung surfactant particles.
  • FIG. 11 shows the long-term distribution of proteins and particles according to time after inhalation delivery to a mouse animal model after preparing Surf-Pro-GFP particles based on 1 mg of lung surfactant to confirm the long-term distribution of Surf-Pro-GFP particles over time It is a view showing a graph quantifying the result of FIG. 10 , which is a result of confirming .
  • a protamine-siRNA (Pro-siRNA) complex was prepared as follows. First, an siRNA solution was prepared by dissolving siRNA in distilled water at a concentration of 10 nmol/mL, and protamine was dissolved in distilled water at a concentration of 1 mg/mL to prepare a protamine protein solution.
  • the mass ratio of siRNA:protamine based on 2 nmol siRNA was 0.5:1, 0.75:1, 1:1, 1.25:1, 1.5:1, 2:1 , 4:1 was mixed and the reaction was induced at room temperature for about 15 minutes to prepare an siRNA-protamine complex.
  • FIG. 12 shows a schematic diagram of a nucleic acid loading method using a lung surfactant.
  • the size and charge of the prepared protamine-siRNA complex were measured using DLS equipment, and the results are shown in FIG. 13 . As a result, it was confirmed that as the mass ratio of siRNA to protamine increased, the protamine-siRNA complex had a negative charge. On the other hand, since it is efficient to select a positively charged complex to be well loaded in the negatively charged waste surfactant, a complex having a size of about 200 nm and a positive charge of 20 mV and a mass ratio of 1:1 as seen in FIG. 13 is selected. To prepare a lung surfactant-based particle bound to the following nucleic acid.
  • siRNA-conjugated lung surfactant-based particles using the protamine-siRNA complex prepared in 2-1 above first, lung surfactant (Newfacten) was added to a 2:1 solution of chloroform and methanol at a concentration of 10 mg/mL. was prepared, and the waste surfactant solution in a ratio of 1:5 and 1:10 relative to the mass of the protamine-siRNA complex prepared in 2-1 was placed in a glass vial, and the solvent was evaporated to form a lipid membrane. Then, the siRNA-protamine complex was put into the lipid membrane and the hydration process was performed at about 45° C. or higher to prepare siRNA-conjugated lung surfactant-based particles.
  • lung surfactant Newfacten
  • Table 3 below shows the results of measuring the size and charge of the prepared siRNA-coupled lung surfactant-based particles using DLS equipment.
  • lung surfactant -40 Protamine/siRNA complex (1:1 w/w) 230 +20 Complex + Lung Surfactant (1:5 w/w) 240 -25 Complex + Lung Surfactant (1:10 w/w) 250 -35
  • the charge of the waste surfactant alone is about -40 mV, and if the complex is well loaded in the waste surfactant, the final finished particle also has a similar charge.
  • the ratio of the waste surfactant to the complex was varied, it was confirmed that particles of about 250 nm in size and -35 mV were produced when the particles were prepared at a ratio of 1:10.
  • Example 2 The intracellular delivery of the lung surfactant-protamine-siRNA (Surf-Pro-siRNA) particles prepared in Example 2 into type II alveolar cells-derived lung cancer cells was confirmed.
  • Protamine-siRNA Pro-siRNA
  • Example 2-1 protamine-siRNA without the lung surfactant prepared in Example 2-1 was used as a control to confirm intracellular delivery.
  • A549 cells were cultured in a 6-well plate (20,000 cells/well), and after one day of culture, cells were negatively controlled, protamine-Fluorescein-siRNA complex, lung surfactant-protamine-Fluorescein-siRNA (Surf-Pro-siRNA) to process At this time, the concentration of siRNA treated in all groups was fixed at 2 nmol/mL. After culturing for about 24 hours, the cells were photographed through a confocal microscope, and the results are shown in FIG. 14 .
  • protamine-luciferase siRNA complex Pro-Luc-siRNA
  • lung surfactant-protamine-negative control siRNA Surf-Pro
  • lung surfactant-protamine-luciferase siRNA Surf-Pro-Luc-siRNA
  • Lipofectamine3000-luciferase siRNA LF-Luc-siRNA
  • the protein expression reduction ability could not be confirmed with the protamine-luciferase siRNA complex alone, and the protein expression reduction ability could be confirmed when the luciferase siRNA was delivered in the form of lung surfactant particles.
  • the efficiency was lower than that of lipofectamine.
  • lipofectamine unlike the lung surfactant, lipofectamine has the disadvantage that it cannot be utilized at all in vivo, so the lung surfactant particles may be usefully used for in vivo transfection in the lung.
  • protamine-luciferase siRNA complex Pro-Luc-siRNA
  • lung surfactant-protamine-negative control siRNA Surf-Pro
  • lung surfactant-protamine-luciferase siRNA Surf-Pro-Luc-siRNA
  • Lipofectamine3000-luciferase siRNA LF-Luc-siRNA
  • the protein expression reduction ability could not be confirmed with the protamine-luciferase siRNA complex alone, and the protein expression reduction ability could be confirmed when the luciferase siRNA was delivered in the form of lung surfactant particles.
  • the efficiency was lower than that of lipofectamine.
  • lipofectamine unlike the lung surfactant, lipofectamine has the disadvantage that it cannot be utilized at all in vivo, so the lung surfactant particles may be usefully used for in vivo transfection in the lung.
  • the lung surfactant particles according to the present invention can be used to effectively deliver nucleic acids such as siRNA into lung cells as a means for suppressing abnormal protein expression induced in lung diseases.
  • Lung cancer a representative lung disease, is caused by various oncogenes and tends to get worse as the corresponding proteins are overexpressed. Therefore, there is a need for a technology capable of inhibiting oncogenes in order to suppress lung cancer, and the inhibition can be achieved using the lung surfactant-based particles loaded with nucleic acids according to the present invention.
  • Lung surfactant-based particles to which GM-CSF (Granulocyte-macrophage colony stimulating factor), an immune protein, are bound were prepared through the following experimental process.
  • GM-SCF was dissolved in distilled water at a concentration of 10 ⁇ g/ml to prepare 1 ml of GM-SCF solution.
  • Dialysis process is performed for at least 8 hours with a 100 kDa membrane in distilled water to remove proteins not loaded on the particles.
  • the size and charge of the manufactured particles were measured using DLS equipment, and the amount of GM-SCF loaded in the manufactured particles was measured using an ELISA kit.
  • the lung surfactant particles loaded with GM-CSF had a size of about 300 nm and about -20 mV. was confirmed to have a charge of , and when the amount of loaded GM-CSF was measured after removing the unloaded protein, it was confirmed that about 1.06 ⁇ g of the protein was loaded. Through this, it was confirmed that GM-CSF, an immune protein, can be efficiently loaded onto lung surfactant-based particles using protamine.

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Abstract

폐 계면활성제로 제조되는 리포좀에 단백질 또는 핵산이 결합된 복합체는, 생체 내 투여시 단백질 또는 핵산의 구조가 훼손되지 않으면서 본래 형태와 기능을 보존한 상태로 폐(lung)에 선택적으로 전달할 수 있을 뿐만 아니라, 폐포 내에 존재하는 폐 계면활성제 막과 효율적으로 융합되어 결합된 단백질 또는 핵산(유전자)을 주변 세포에 효율적으로 전달할 수 있으며, 독성이 적고 구조 안정성이 우수한 효과가 있다.

Description

흡입전달용 핵산 또는 단백질 탑재 폐 계면활성제입자 및 이의 제조 방법
본 발명은 음전하를 띠는 단백질 또는 핵산을 폐 내로 깊숙이 전달하기 위해 생체친화적인 폐 계면활성제입자와 양전하를 띠는 프로타민 단백질을 활용해 입자화 시키는 방법을 최적화하는 발명이다. 음전하를 띠는 단백질 또는 핵산을 탑재하기 위해 양전하를 띠는 프로타민을 매개로 입자와 전하간 인력으로 결합하고자 했는데 그 이유는 단백질 또는 핵산 구조를 훼손하지 않으면서 본래 형태를 보존한 상태로 전달하고자 하기 때문이다.
매년 폐질환 환자 증가량이 대폭 증가하고 있으며, 폐질환 환자 전체 중 호흡기성 바이러스 감염에 걸린 환자가 사망률이 가장 높은 부류에 속한다. 이에, 폐를 선택적으로 표적하여 약물이나 단백질의 구조가 훼손되지 않으면서 본래의 형태와 기능을 보존한 상태로 전달할 수 있는 전달체가 요구되고 있다.
특히, 호흡기성 감염을 유발하는 바이러스중 인플루엔자 및 코로나 바이러스는 주로 폐포 영역(alveolar region)에 있는 타입 II 폐포 세포(alveolar type II cell)을 감염시키는 경우가 많아서 면역강화제 및 항바이러스제를 폐포 영역에 특히, 타입 II 폐포 세포에 효율적으로 전달하는 기술이 필요하다.
상기 타입 II 폐포 세포(alveolar type II cell)는 폐 계면활성제(Pulmonary surfactant)를 분비 및 저장하는 기능을 수행하며, 상기 폐 계면활성제는 호흡하는 과정에서 폐의 장력을 조절하는 역할을 수행한다. 폐 계면활성제는 지질(lipid)과 막 단백질(membrane protein)로 구성되어 있다(비특허문헌, Eur Respir J. 1999 Jun;13(6):1455-76).
이러한 폐 계면활성제를 사용하여 단백질 또는 핵산을 폐포에 전달할 경우, 폐포내 폐 계면활성제막과의 융합을 통하여 단백질 또는 핵산을 폐포내 장기간 유지시킬 수 있을 뿐만 아니라 폐 계면활성제를 분비 및 저장하는 기능을 수행하는 타입 II 폐포 세포(alveolar type II cell)에 단백질 또는 핵산을 효과적으로 표적할 수 있을 것이라 예상되어,
폐 계면활성제로 제조되는 리포좀(Liposome)에 단백질 또는 핵산을 결합한 복합체를 제조함으로써 본 발명을 완성하였다.
(비특허문헌 1)Eur Respir J. 1999 Jun;13(6):1455-76
본 발명의 일 측면에서의 목적은 폐(lung)로의 선택적인 단백질 또는 핵산 전달을 위한 단백질 또는 핵산 전달용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 일 측면에서의 목적은 폐(lung)로의 선택적인 단백질 또는 핵산 전달을 위한 단백질 또는 핵산 전달용 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
폐 계면활성제(pulmonary surfactant)로 제조되는 리포좀에, 단백질 또는 핵산이 결합된 복합체를 함유하는, 단백질 또는 핵산 전달용 조성물을 제공한다.
폐 계면활성제가 용해된 제1 용액을 준비하는 단계;
상기 준비한 폐 계면활성제가 용해된 용액을 건조시켜 지질막(lipid film)을 형성시키는 단계;
상기 형성된 지질막에, 결합대상 단백질 또는 핵산이 용해된 제2 용액을 처리해 수화시켜, 결합대상 단백질 또는 핵산이 폐 계면활성제로 제조되는 리포좀에 결합된 복합체를 제조하는 단계; 를 포함하는, 단백질 또는 핵산 전달용 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 측면에서 제공하는 폐 계면활성제(pulmonary surfactant)로 제조되는 리포좀에 단백질 또는 핵산이 결합된 복합체는, 생체 내 투여시 단백질 또는 핵산의 구조가 훼손되지 않으면서 본래 형태와 기능을 보존한 상태로 폐(lung)에 선택적으로 전달할 수 있을 뿐만 아니라, 폐포 내에 존재하는 폐 계면활성제 막과 효율적으로 융합되어 결합된 단백질 또는 핵산(유전자)을 주변 세포에 효율적으로 전달할 수 있으며, 독성이 적고 구조 안정성이 우수한 효과가 있다.
도 1은 폐 계면활성제(pulmonary surfactant)를 활용한 단백질의 탑재방법 모식도를 나타내는 도면이다.
도 2는 초록형광단백질(GFP)과 폐 계면활성제 양을 각기 50 μg, 5 mg으로 고정한 상태에서, 프로타민 양을 초록형광단백질(GFP) 1몰 기준 1:1, 1:5, 1:10, 1:20 몰 비율로 늘려가면서 초록형광단백질(GFP) 탑재율과 입자의 크기 및 전하를 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 3은 초록형광단백질이 탑재된 폐 계면활성제 입자의 모양을 전자 현미경(TEM) 사진을 통해 관측한 사진을 나타내는 도면이다.
도 4는 완성된 입자의 안정성을 평가하기 위해, 입자를 생체와 유사한 환경인 10%(v/v) FBS(Fetal bovine serum)가 들어가있는 배양액에 넣고 37℃에서 시간별로 입자의 크기 및 GFP 형광 변화를 확인한 결과 및, 입자 독성을 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 5는 대조군인 프로타민-단백질 복합체(Pro-GFP)를 사람폐포상피세포 (HPAepic), 대식세포 (Raw 264.7), 또는 타입 II 폐포세포 유래 폐암세포 (A549)에 24시간 동안 각각 처리한 뒤, 공초점 현미경을 통해 세포 내 전달을 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 6은 폐 계면활성제-단백질-프로타민(Surf-Pro-GFP) 입자를 사람폐포상피세포 (HPAepic)에 24시간 동안 각각 처리한 뒤, 공초점 현미경을 통해 세포 내 전달을 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 7은 폐 계면활성제-단백질-프로타민(Surf-Pro-GFP) 입자를 대식세포 (Raw 264.7)에 24시간 동안 각각 처리한 뒤, 공초점 현미경을 통해 세포 내 전달을 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 8은 폐 계면활성제-단백질-프로타민(Surf-Pro-GFP) 입자를 타입 II 폐포세포 유래 폐암세포 (A549)에 24시간 동안 각각 처리한 뒤, 공초점 현미경을 통해 세포 내 전달을 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 9는 실제 소형 동물 마우스 모델에서폐 계면활성제-단백질-프로타민(Surf-Pro-GFP) 입자가 폐에 잘 전달되는지를 확인하고자, 대조군인 GFP 단백질만 폐에 흡입 전달한 경우와, 폐 계면활성제-단백질-프로타민(Surf-Pro-GFP) 입자로 전달한 경우를 비교한 결과를 나타내는 도면이다.
도 10은 시간별 폐 계면활성제-단백질-프로타민(Surf-Pro-GFP) 입자의 장기분포를 확인하기 위해 폐 계면활성제 1 mg 기준 폐 계면활성제-단백질-프로타민(Surf-Pro-GFP) 입자를 제작한 후, 마우스 동물 모델에 흡입 전달하고 시간에 따른 단백질 및 입자의 장기 분포를 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 11은 시간별 폐 계면활성제-단백질-프로타민(Surf-Pro-GFP) 입자의 장기분포를 확인하기 위해 폐 계면활성제 1 mg 기준 폐 계면활성제-단백질-프로타민(Surf-Pro-GFP) 입자를 제작한 후, 마우스 동물 모델에 흡입 전달하고 시간에 따른 단백질 및 입자의 장기 분포를 확인한 결과인 도 10의 결과를 정량화한 그래프를 나타내는 도면이다.
도 12는 폐 계면활성제를 활용한 핵산의 탑재방법 모식도를 나타내는 도면이다.
도 13은 siRNA-프로타민 복합체의 크기와 전하를 DLS 장비를 이용하여 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 14는 폐 계면활성제-프로타민-siRNA(Surf-Pro-siRNA) 입자를 타입 II 폐포세포 유래 폐암 세포 (A549)에 24시간 동안 각각 처리한 뒤, 공초점 현미경을 통해 세포 내 전달을 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 15는 폐 계면활성제를 활용한 Luc-siRNA의 단백질 발현 저하능을 확인하기위해 luminescence를 발현하는 A549 (A549-luc) 세포에 처리한 뒤 IVIS 장비를 통해 발광을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 16은 타입 II 폐포세포 유래 폐암 세포(A549-luc)에 각 실험군을 처리한 후의 세포 사멸도를 MTT 기법을 통해 확인한 결과를 나타낸 도면 (좌) 및 폐 계면활성제를 활용한 Luc-siRNA의 단백질 발현 저하능을 IVIS 장비를 통해 발광을 확인한 결과를 정량적으로 나타낸 도면 (우)이다.
도 17은 기존 문헌을 통해 타입 II 폐포세포 유래 A549 폐암 세포에 대해 사멸 기능을 유도할 수 있는 siRNA로 알려진 KRAS-siRNA, RPN2-siRNA와 폐 계면활성제를 활용하여 세포 사멸 효과를 MTT 기법을 통해 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
한편, 본 발명의 실시 형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 실시 형태는 당해 기술분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다.
나아가, 명세서 전체에서 어떤 구성요소를 "포함"한다는 것은 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있다는 것을 의미한다.
폐 계면활성제(pulmonary surfactant)로 제조되는 리포좀에, 단백질 또는 핵산이 결합된 복합체를 함유하는, 단백질 또는 핵산 전달용 조성물을 제공한다.
상기 리포좀에 단백질 또는 핵산이 결합되는 것은, 리포좀의 내부에 결합 및/또는 봉입되는 것일 수 있고, 리포좀의 외부에 결합되는 것일 수도 있다.
상기 폐 계면활성제는 생체 유래의 폐 계면활성제일 수 있으며 본 발명은 실시예를 통해 생체 유래의 폐 계면활성제를 이용하여 단백질 또는 핵산 전달용 조성물을 제조하였다. 뿐만 아니라, 상기 폐 계면활성제는 생체 유래의 폐 계면활성제에 한정되는 것이 아니라, 생체 유래의 폐 계면활성제를 모사(mimic)한 것을 포함할 수 있으며, 합성, 반-합성(즉, 개질된 천연) 폐 계면활성제를 포함한다.
상기 생체 유래 폐 계면활성제를 모사한 계면활성제, 또는 합성 또는 반-합성 폐 계면활성제는 생체 유래 폐 계면활성제와 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상의 단백질 상동성을 갖는 것을 포함한다.
이때, 상기 리포좀에 결합되는 단백질은, 양전하를 띠는 단백질 또는 펩타이드를 매개로 리포좀에 결합되며, 상기 양전하를 띠는 단백질로는 프로타민(protamine), 히스톤 단백질(histone), 리소자임(lysozyme) 등을 사용할 수 있고, 바람직하게는 FDA 승인을 받은 프로타민을 사용할 수 있다.
상기 양전하를 띠는 단백질 또는 펩타이드는 양이온성 아미노산이 풍부한 도메인(domain)을 포함하는 단백질 또는 펩타이드인 것이 바람직하다. 양이온성 아미노산은 아르기닌(Arginine), 히스티딘(Histidine), 리신(Lysine)이 있다. 예를 들어 상기 아르기닌이 풍부한(arginine-rich) 단백질으로는 프로타민이 있다.
이에, 상기 리포좀에 결합하는 단백질은, 음전하를 띠는 단백질인 것이 바람직하다. 음전하를 띠는 단백질을 탑재하기 위해 양전하를 띠는 프로타민을 링커로 사용한 것인데, 그 이유는, 단백질 구조를 훼손하지 않으면서 본래 단백질 형태를 보존한 상태로 전달하고자 하기 위함이다.
상기 리포좀에 결합하는 핵산(nucleic acid)은 예를 들면 DNA 또는 RNA일 수 있고, RNA는 예를 들면, mRNA(messenger RNA), rRNA(ribosomal RNA), tRNA(transfer RNA), snRNA(small nuclear RNA), snoRNA(small nucleolar RNA), aRNA(antisense RNA), miRNA(micro RNA), siRNA(small interfering RNA), piRNA(piwi interacing RNA)일 수 있다.
또한, 상기 핵산은 유전자 치료제를 포함한다.
상기 단백질 또는 핵산 전달용 조성물은, 리포좀에 결합된 단백질 또는 핵산을 폐(lung)로 선택적으로 전달할 수 있으며, 이는 리포좀을 이루는 폐 계면활성제와, 폐에 존재하는 폐 계면활성제막 및 세포와의 상호작용에 의한 것이다.
보다 구체적으로, 상기 폐 계면활성제(pulmonary surfactant)는, 타입 II 폐포세포(type II alveolar cells)에서 생성되는 지질과 단백질로 구성된 복합체(lipid-protein complex)일 수 있다. 즉, 상기 폐 계면활성제는 포유류의 폐로부터 수집된 포유류 폐 계면활성제를 포함할 수 있다. 이때 포유류란 사람일 수 있고, 사람을 제외한 동물, 구체적으로 돼지나 소일 수 있다.
일반적으로 천연 폐 계면활성제는 상기 타입 II 폐포 세포(alveolar type II cell)에서 분비되고 저장되므로, 폐 계면활성제 기반인 리포좀은 타입 II 폐포 세포를 효율적으로 표적하여 결합된 단백질 및 핵산을 전달할 수 있다.
상기 지질과 단백질로 구성된 복합체(lipid-protein complex)에서 지질이라는 용어는, 일반적으로 양친매성인 천연 발생이거나, 합성 또는 반-합성(즉, 개질된 천연) 화합물을 의미한다. 지질은 전형적으로 친수성 성분과 소수성 성분을 포함한다. 예시적인 지질에는 인지질, 지방산, 지방 알코올, 중성 지방, 포스파디드, 오일, 당지질, 지방족 알코올, 왁스, 테르펜 및 스테로이드가 포함되지만, 이로 한정되지 않는다. "반-합성(또는 개질된 천연)"이라는 어구는 어떠한 방법으로 화학적으로 개질된 천연 화합물을 나타낸다.
인지질의 예에는 천연 및/또는 합성 인지질이 포함된다.
사용될 수 있는 인지질에는 포스파티딜콜린(포화 및 불포화), 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티드산, 포스파티딜이노시톨, 스핑고지질, 디아실글리세라이드, 카르디올리핀, 세라마이드 및 세레브로사이드 등이 포함되지만, 이로 한정되지 않는다. 예시적인 인지질에는 디팔미토일 포스파티딜콜린(DPPC), 디라우릴 포스파티딜콜린(DLPC) (C12:0), 디미리스토일 포스파티딜콜린(DMPC) (C14:0), 디스테아로일 포스파티딜콜린(DSPC), 디피타노일 포스파티딜콜린, 노나데카노일 포스파티딜콜린, 아라키도일 포스파티딜콜린, 디올레오일 포스파티딜콜린(DOPC) (C18:1), 디팔미톨레오일 포스파티딜콜린(C16:1), 리노레오일 포스파티딜콜린(C18:2), 미리스토일 팔미토일 포스파티딜콜린(MPPC), 스테로일 미리스토일 포스파티딜콜린(SMPC), 스테로일 팔미토일 포스파티딜콜린(SPPC), 팔미토일올레오일 포스파티딜콜린(POPC), 팔미토일 팔미토올레오일 포스파티딜콜린(PPoPC), 디팔미토일 포스파티딜에탄올아민(DPPE), 팔미토일올레오일 포스파티딜에탄올아민(POPE), 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 디미리스토일포스파티딜에탄올아민(DMPE), 디스테아로일 포스파티딜에탄올아민(DSPE), 디올레오일 포스파티딜글리세롤(DOPG), 팔미토일올레오일 포스파티딜글리세롤(POPG), 디팔미토일 포스파티딜글리세롤(DPPG), 디미리스토일 포스파티딜글리세롤(DMPG), 디스테아로일 포스파티딜글리세롤(DSPG), 디미리스토일포스파티딜세린(DMPS), 디스테아로일포스파티딜세린(DSPS), 팔미토일올레오일 포스파티딜세린(POPS), 대두 레시틴, 난황 레시틴, 스핑고미엘린, 포스파티딜이노시톨, 디포스파티딜글리세롤, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티드산 및 달걀 포스파티딜콜린(EPC)이 포함되지만, 이로 한정되지 않는다.
지방산 및 지방 알코올의 예에는 스테롤, 팔미트산, 세틸 알코올, 라우르산, 미리스트산, 스테아르산, 피탄산 및 디팔미트산 등이 포함되지만, 이로 한정되지 않는다. 예시적인 지방산에는 팔미트산이 포함된다.
지방산 에스테르의 예에는 메틸 팔미테이트, 에틸 팔미테이트, 이소프로필 팔미테이트, 콜레스테릴 팔미테이트, 팔미틸 팔미테이트, 나트륨 팔미테이트, 칼륨 팔미테이트 및 트리팔미틴 등이 포함되지만, 이로 한정되지 않는다.
한편, 상기 폐 계면활성제(pulmonary surfactant)는, 막 단백질(membrane protein)을 포함하는데, 이 막 단백질의 존재로 인하여 타입 II 폐포세포를 선택적이고 효과적으로 표적할 수 있게 된다. 상기 막 단백질은 SP-A, SP-B, SP-C 및 SP-D로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 천연 계면활성제 폴리펩타이드, 이들의 일부분 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 예시적인 펩타이드는 천연 계면활성제 폴리펩타이드의 적어도 약 1 내지 50개의 아미노산, 또는 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50개의 아미노산 절편을 포함할 수 있다. 예시적인 SP-B 폴리펩타이드는 SP-B의 적어도 약 1 내지 50개의 아미노산, 또는 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50개의 아미노산 절편을 포함할 수 있다. SP-B 펩타이드는 아미노-말단 펩타이드일 수도 있고 카르복시-말단 펩타이드일 수도 있다. 예시적인 SP-B 펩타이드는 25-아미노산 아미노 말단 펩타이드일 수 있다.
다른 실시 형태에서, 상기 폐 계면활성제는 재조합적으로 생성되는 계면활성제 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 재조합 SP-A, SPB, SP-C, SP-D 또는 그의 일부분이 각종 공지된 기술을 이용하여 적합한 원핵생물 또는 진핵생물 발현 시스템에서 SP-A, SP-B, SP-C, SP-D 또는 그의 일부분을 암호화하는 DNA 서열을 발현시킴으로써 획득 가능하다. 계면활성제 폴리펩타이드 또는 그의 일부분을 인코딩하는 단리된 핵산을 포함하도록 용이하게 적합화된 재조합벡터들, 재조합 백터들을 함유하는 숙주 세포들 및 그러한 벡터들 및 숙주 세포들을 제조하는 방법과, 이외에도 재조합 기술에 의한 인코딩된 폴리펩타이드의 생성에 있어서의 그들의 사용은 익히 공지되어 있다. 계면활성제 폴리펩타이드 또는 그의 일부분을 인코딩하는 핵산은, 적어도 하나의 조절 서열에 작동 가능하게 연결되는 계면활성제 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터에서 제공될 수 있다. 발현 벡터의 설계는 형질전환될 숙주 세포의 선택 및/또는 발현되기를 원하는 단백질의 유형과 같은 인자들에 달려 있을 수 있음이 이해되어야 한다. 벡터 카피 수, 그 카피 수의 제어 능력, 및 벡터에 의해 인코딩된 임의의 다른 단백질(예를 들어, 항생제 마커(antibiotic marker))의 발현이 고려되어야 한다. 예를 들어, 융합 단백질 또는 폴리펩타이드를 포함한 단백질 또는 폴리펩타이드를 생성하기 위해서, 배양으로 증식된 세포에서 키나아제 및 포스파타아제 폴리펩타이드의 발현 및 과잉발현을 야기시키는 데 대상의 핵산이 사용될 수 있다.
계면활성제 폴리펩타이드 또는 그의 일부분을 발현하기 위해서, 숙주 세포들이 재조합 유전자로 형질감염될 수 있다. 숙주 세포는 임의의 원핵생물 또는 진핵생물 세포일 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 세균성 세포, 예를 들어 E. 콜리(E. coli), 곤충 세포, 효모 또는 포유류 세포에서 발현될 수 있다. 이러한 예들에서, 숙주 세포가 사람일 경우, 그것은 살아 있는 대상에서 일 수도 있고 아닐 수도 있다. 다른 적합한 숙주 세포가 당업자들에게 공지되어 있다. 추가적으로, 숙주 세포는 폴리펩타이드의 발현을 최적화하도록 하기 위해서, 숙주에서는 전형적으로는 발견되지 않는 tRNA 분자들로 보충될 수 있다. 폴리펩타이드의 발현을 최대화하는 데 적합한 다른 방법들이 당업자들에게 공지되어 있을 것이다. 폴리펩타이드를 생성하는 방법은 당업계에 익히 공지되어 있다. 예를 들어, 계면활성제 폴리펩타이드 또는 그의 일부분을 인코딩하는 발현 벡터로 형질감염된 숙주 세포가 폴리펩타이드의 발현이 일어나게 하는 적절한 조건 하에서 배양될 수 있다. 폴리펩타이드는 세포들과 폴리펩타이드를 함유하는 배지의 혼합물로부터 분비되고 단리될 수 있다. 대안적으로, 폴리펩타이드는 세포질적으로 그대로 유지될 수 있다. 이어서, 세포가 수집되고, 용해되고, 단백질이 세포 용해물로부터 단리된다.
상기 계면활성제 폴리펩타이드와 계면활성제 지질은 정수압 상호작용(hydrostatic interaction)에 의해 상호작용한다. 하전된 아미노산은 지질의 극성 머리 기와 상호작용하고, 소수성 아미노산은 인지질 아실 측쇄와 상호작용한다. 예를 들어, SP-B 및 SP-C는 소수성 단백질이다. SP-B 및 SP-C 둘 모두 음이온성 지질(예를 들어, 포스파티딜글리세롤(PG))과 우선적으로 결합한다. SP-A 및 SP-D는 친수성 단백질이며, 글리세로인지질, 스핑고인지질, 스핑고당지질, 지질 A 및 리포글리칸을 포함한, 넓은 범위의 양친매성 지질들과 상호작용한다. SP-A는 DPPC와 결합한다. 예로서, SP-B 모방체인 KL4과 천연 계면활성제 중의 지질들 또는 표면 활성제 중에 포함된 지질들의 정수압 상호작용이 관찰된다. 예를 들어, KL4 펩타이드 중의 리신 잔기는 DPPC의 하전된 머리 기와 상호작용하고, 소수성 류신 잔기는 포스파티딜글리세롤의 인지질 아실 측쇄와 상호작용한다.
한편, 상기 폐 계면활성제(pulmonary surfactant)로 제조되는 리포좀에, 단백질이 결합된 복합체의 평균 직경 범위는 특별히 제한되는 것은 아니나, 몇 가지 구체예를 들면, 250 내지 1200 nm 범위일 수 있고, 260 내지 1200 nm 범위일 수 있고, 270 내지 1200 nm 범위일 수 있고, 280 내지 1200 nm 범위일 수 있고, 290 내지 1200 nm 범위일 수 있고, 300 내지 1200 nm 범위일 수 있고, 250 내지 1150 nm 범위일 수 있고, 250 내지 1120 nm 범위일 수 있고, 250 내지 1110 nm 범위일 수 있고, 260 내지 1150 nm 범위일 수 있고, 270 내지 1120 nm 범위일 수 있고, 280 내지 1110 nm 범위일 수 있고, 298 내지 1108 nm 범위일 수 있고, 298.9 내지 1108 nm 범위일 수 있다. 또는 1 μm 이하일 수 있고, 만일 1 μm 이상이면 리포좀을 폐포(lung alveolus)에 전달하기 힘들 수 있다.
상기 복합체의 평균 직경은, 상기 복합체 제조시 사용하는 폐 계면활성제, 양전하를 띠는 단백질 또는 펩타이드 등의 사용량 조절과, 압출기 키트(extruder kit)를 사용하여 적절히 조절할 수 있다.
상기 단백질 또는 핵산 전달용 조성물은 흡입에 의해 폐로 전달될 수 있다. 흡입 장치, 예를 들어 흡입기(건조 분말 흡입기 및 정량식 흡입기를 포함함) 및 네불라이저(아토마이저로도 알려짐)가 결합된 단백질 또는 핵산을 폐로 전달하는데 사용될 수 있다.
예시적인 건조 분말 흡입기는 인헤일 테라퓨틱 시스템즈(Inhale Therapeutic Systems)으로부터 획득할 수 있다. 건조 분말 흡입기는 쓰리엠(3M)으로부터 또한 획득할 수 있다.
본 발명의 다른 일 측면은,
(단계 1) 폐 계면활성제가 용해된 제1 용액을 준비하는 단계;
(단계 2) 상기 준비한 폐 계면활성제가 용해된 용액을 건조시켜 지질막(lipid film)을 형성시키는 단계;
(단계 3) 상기 형성된 지질막에, 결합대상 단백질 또는 핵산이 용해된 제2 용액을 처리해 수화시켜, 결합대상 단백질 또는 핵산이 폐 계면활성제로 제조되는 리포좀에 결합된 복합체를 제조하는 단계; 를 포함하는,
단백질 또는 핵산 전달용 조성물의 제조방법을 제공한다.
이하, 본 발명의 일 측면에서 제공하는 단백질 또는 핵산 전달용 조성물의 제조방법을 단계별로 상세히 설명한다.
본 발명의 일 측면에서 제공하는 단백질 또는 핵산 전달용 조성물의 제조방법에 있어서, 단계 1은 리포좀을 형성할 폐 계면활성제(pulmonary surfactant)가 용해된 제1 용액을 준비하는 단계이다.
폐 계면활성제의 용해를 위해 사용하는 용매 종류로는, 폐 계면활성제를 용이하게 용해시킬 수 있는 용매라면 제한 없이 사용할 수 있으며, 일 구체예로는 클로로포름, 메탄올 등의 단독, 또는 조합하여 사용할 수 있다.
폐 계면활성제 고유의 특성으로 인하여 추후 폐 계면활성제로 제조되는 리포좀은 폐에 존재하는 세포와의 상호작용에 의해 폐를 선택적으로 표적할 수 있는 효과가 발생한다.
한편, 상기 폐 계면활성제(pulmonary surfactant)는, 타입 II 폐포세포(type II alveolar cells)에서 생성되는 지질과 단백질로 구성된 복합체(lipid-protein complex)이고, 상기 폐 계면활성제(pulmonary surfactant)는, 막 단백질(membrane protein)을 포함하는 것이 바람직하다.
일 측면에서, 상기 폐 계면활성제(pulmonary surfactant)로 제조되는 리포좀에, 단백질 또는 핵산 이 결합된 복합체는 타입 II 폐포세포를 표적할 수 있다.
다만 이는 본 발명에 따른 폐 계면활성제(pulmonary surfactant)로 제조되는 리포좀이 상기 상기 타입 II 폐포세포 또는 타입 II 폐포세포 유래의 폐암세포로의 전달만을 한정하고자 하는 것은 아니며, 폐 전달의 예시를 든 것 뿐이다.
본 발명의 일 측면에서 제공하는 단백질 또는 핵산 전달용 조성물의 제조방법에 있어서, 단계 2는 상기 준비한 폐 계면활성제가 용해된 용액을 건조시켜 지질막(lipid film)을 형성시키는 단계이다.
지질막을 형성시키는 방법은 통상적으로 공지된 방법을 채용하여 수행할 수 있으며, 일 구체예로는 상기 폐 계면활성제가 용해된 용액을 유리 바이알에 넣고 상온에서 건조시켜 지질막을 형성시킬 수 있다.
본 발명의 일 측면에서 제공하는 단백질 또는 핵산 전달용 조성물의 제조방법에 있어서, 단계 3은 상기 형성된 지질막에, 결합대상 단백질 또는 핵산이 용해된 제2 용액을 처리해 수화시켜, 결합대상 단백질 또는 핵산이 폐 계면활성제(pulmonary surfactant)로 제조되는 리포좀에 결합된 복합체를 제조하는 단계이다.
이때, 상기 형성된 지질막에, 결합대상 단백질 또는 핵산이 용해된 제2 용액을 처리해 수화시키는 단계에서, 양전하를 띠는 단백질 또는 펩타이드가 용해된 제3 용액을 함께 처리하여, 리포좀에 결합되는 단백질 또는 핵산이, 양전하를 띠는 단백질 또는 펩타이드를 매개로 리포좀에 결합될 수 있게 유도하는 것이 바람직하다.
전술한 바와 같이, 단백질 또는 핵산은 대부분 음전하를 띠므로, 결합대상 단백질 또는 핵산이 음전하를 띌 경우, 지질막의 수화 단계에서 양전하를 띠는 단백질 또는 펩타이드가 용해된 제3 용액을 함께 처리하면, 양전하를 띠는 단백질 또는 펩타이드를 매개로, 결합대상 단백질 또는 핵산이 폐 계면활성제로 형성되는 리포좀 내부 및/또는 외부에 안정하게 결합될 수 있다(도 1).
이렇게, 결합대상 단백질 또는 핵산이 폐 계면활성제로 형성되는 리포좀 내부 및/또는 외부에 안정하게 결합되면, 생체 내 투여시 단백질 또는 핵산 구조가 훼손되지 않으면서 본래 단백질 또는 핵산 형태를 보존한 상태로 폐에 전달될 수 있다.
본 발명의 일 측면은 음전하를 띠는 단백질 또는 핵산을 폐 내로 깊숙이 전달하기 위해 생체친화적인 폐 계면활성제입자와 양전하를 띠는 프로타민 단백질을 활용해 입자화 시키는 방법을 최적화하는 발명이며, 이 최적화는 단백질 또는 핵산 전달용 조성물의 제조방법을 수행할 때 폐 계면활성제, 결합대상 단백질 또는 핵산, 양전하를 띠는 단백질 또는 펩타이드의 사용량을 아래와 같이 특정함으로써 달성될 수 있다.
보다 구체적으로,
상기 단백질 또는 핵산 전달용 조성물의 제조방법을 수행할 때,
결합대상 단백질 또는 핵산 1 중량부 기준으로 폐 계면활성제를 100 내지 140 중량부만큼 사용함과 동시에,
결합대상 단백질 또는 핵산 1 몰(mol) 기준으로 양전하를 띠는 단백질 또는 펩타이드를 1 내지 10 몰만큼 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 결합대상 핵산 1 중량부 기준 양전하를 띠는 단백질 또는 펩타이드를 0.5 내지 20 중량부만큼 사용하는 것이 바람직하다.
(결합대상 핵산의 중량)/(양전하를 띠는 단백질 또는 펩타이드의 중량)은 예를 들면, 0.5, 0.75, 1, 1.25, 1.5, 2, 4일 수 있고, 1일 때가 바람직하다.
또한, 결합대상 핵산과 양전하를 띠는 단백질 또는 펩타이드의 복합체 중량 대비 폐 계면활성제의 질량비는 1:1 내지 1:20일 수 있고, 예를 들면 1:1 내지 1:18, 1:2 내지 1:15, 1:2 내지 1:13, 1:2 내지 1:8, 1:8 내지 1:10, 1:5 내지 1:15일 수도 있다.
폐 계면활성제의 경우,
더욱 바람직하게는 상기 결합대상 단백질 또는 핵산 1 중량부 기준으로 폐 계면활성제를 100 내지 130 중량부만큼 사용할 수 있고,
더욱 더 바람직하게는 상기 결합대상 단백질 또는 핵산 1 중량부 기준으로 폐 계면활성제를 100 내지 120 중량부만큼 사용할 수 있고,
더욱 더 바람직하게는 상기 결합대상 단백질 또는 핵산 1 중량부 기준으로 폐 계면활성제를 100 내지 110 중량부만큼 사용할 수 있고,
가장 바람직하게는 상기 결합대상 단백질 또는 핵산 1 중량부 기준으로 폐 계면활성제를 100 중량부만큼 사용할 수 있다.
이와 동시에,
양전하를 띠는 단백질 또는 펩타이드의 경우,
더욱 바람직하게는 결합대상 단백질 또는 핵산 1 몰(mol) 기준으로 양전하를 띠는 단백질 또는 펩타이드를 2 내지 10 몰만큼 사용할 수 있고,
더욱 바람직하게는 결합대상 단백질 또는 핵산 1 몰(mol) 기준으로 양전하를 띠는 단백질 또는 펩타이드를 4 내지 10 몰만큼 사용할 수 있고,
더욱 바람직하게는 결합대상 단백질 또는 핵산 1 몰(mol) 기준으로 양전하를 띠는 단백질 또는 펩타이드를 6 내지 10 몰만큼 사용할 수 있고,
더욱 바람직하게는 결합대상 단백질 또는 핵산 1 몰(mol) 기준으로 양전하를 띠는 단백질 또는 펩타이드를 8 내지 10 몰만큼 사용할 수 있고,
가장 바람직하게는 결합대상 단백질 또는 핵산 1 몰(mol) 기준으로 양전하를 띠는 단백질 또는 펩타이드를 10 몰만큼 사용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서,
결합대상 단백질 또는 핵산 사용량을 50 μg으로, 폐 계면활성제 사용량을 5 mg으로 고정할 때, 결합대상 단백질 또는 핵산 1 몰(mol) 기준으로 양전하를 띠는 단백질 또는 펩타이드 사용량을 다양하게 변화시킴에 따라 변화하는 결합대상 단백질 또는 핵산 결합 효율(%) 결과가 도 2에 입증되어 있으며, 도 2의 그래프상 x축에서의 비율이 결합대상 단백질 또는 핵산 1 몰(mol) 기준으로 양전하를 띠는 단백질 또는 펩타이드의 사용 몰(mol)을 의미한다.
결합대상 단백질 1 몰(mol) 기준으로 양전하를 띠는 단백질 또는 펩타이드를 1몰, 5몰, 10몰 20몰사용할 경우 결합대상 단백질의 결합 효율(%)이 점차 증가하다가, 10몰이 초과하는 경우부터 결합대상 단백질의 결합 효율(%)이 대폭 떨어졌다. 또한, 양전하를 띠는 단백질 또는 펩타이드의 사용량이 10 몰을 초과할 경우 입자의 크기가 비정상적으로 뭉치는 경향을 보였고, 입자의 전하가 변동하면서 불안정한 형태를 보였다.
즉, 도 2의 결과로부터 결합대상 단백질 또는 핵산 1 몰(mol) 기준으로 양전하를 띠는 단백질 또는 펩타이드를 1 내지 10 몰(mol)만큼, 특히 10 몰만큼 사용하여야, 결합대상 단백질 또는 핵산의 우수한 결합 효율(%)이 달성됨을 알 수 있다.
종합하여,
상기 단백질 또는 핵산 전달용 조성물의 제조방법을 수행할 때,
결합대상 단백질 또는 핵산 1 중량부 기준으로 폐 계면활성제를 100 중량부만큼 사용함과 동시에, 결합대상 단백질 또는 핵산 1 몰(mol) 기준으로 양전하를 띠는 단백질 또는 펩타이드를 10 몰만큼 사용하는 것이 가장 바람직하다.
한편, 상기 수화 단계는 지질막이 용이하게 수화될 수 있는 조건이라면 제한 없이 수행할 수 있다. 일 구체예로, 상기 수화는 30 내지 90℃ 온도에서 수행할 수 있고, 35 내지 90℃ 온도에서 수행할 수 있고, 40 내지 90℃ 온도에서 수행할 수 있고, 45 내지 90℃ 온도에서 수행할 수 있고, 30 내지 80℃ 온도에서 수행할 수 있고, 30 내지 70℃ 온도에서 수행할 수 있고, 30 내지 60℃ 온도에서 수행할 수 있고, 30 내지 50℃ 온도에서 수행할 수 있고, 30 내지 45℃ 온도에서 수행할 수 있고, 35 내지 55℃ 온도에서 수행할 수 있고, 40 내지 50℃ 온도에서 수행할 수 있고, 45℃ 온도에서 수행할 수 있다.
또한, 상기 수화 단계를 수행한 후, 복합체의 직경을 조절하는 단계를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 압출기 키트를 사용하여 복합체의 직경을 조절하였으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 폐 계면활성제(pulmonary surfactant)로 제조되는 리포좀에, 단백질 또는 핵산이 결합된 복합체의 평균 직경 범위는 특별히 제한되는 것은 아니나, 몇 가지 구체예를 들면, 250 내지 1200 nm 범위일 수 있고, 260 내지 1200 nm 범위일 수 있고, 270 내지 1200 nm 범위일 수 있고, 280 내지 1200 nm 범위일 수 있고, 290 내지 1200 nm 범위일 수 있고, 300 내지 1200 nm 범위일 수 있고, 250 내지 1150 nm 범위일 수 있고, 250 내지 1120 nm 범위일 수 있고, 250 내지 1110 nm 범위일 수 있고, 260 내지 1150 nm 범위일 수 있고, 270 내지 1120 nm 범위일 수 있고, 280 내지 1110 nm 범위일 수 있고, 298 내지 1108 nm 범위일 수 있고, 298.9 내지 1108 nm 범위일 수 있다. 또는 1 μm 이하일 수 있고, 만일 1 μm 이상이면 리포좀을 폐포(lung alveolus)에 전달하기 힘들 수 있다.
본 발명의 일 측면에서 제공하는 폐 계면활성제로 제조되는 리포좀에 단백질 또는 핵산이 결합된 복합체는, 생체 내 투여시 단백질 또는 핵산의 구조가 훼손되지 않으면서 본래 단백질 또는 핵산형태와 기능을 보존한 상태로 폐(lung)에 선택적으로 전달할 수 있을뿐만 아니라, 폐포 내에 존재하는 폐 계면활성제 막과 효율적으로 융합되어 결합된 단백질 또는 핵산(유전자)을 주변 세포에 효율적으로 전달할 수 있으며, 독성이 적고 구조 안정성이 우수한 효과가 있으며, 이는 후술하는 실시예, 실험예에 의해 뒷받침된다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예를 통해 상세히 설명한다.
단, 후술하는 실시예 및 실험예는 본 발명을 일 측면에서 구체적으로 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 단백질이 결합된 폐 계면활성제 기반 입자 제조
폐 계면활성제가 강한 음전하를 띠고, 대부분의 단백질이 약한 음전하를 띠기 때문에, 중간 연결체로써 양전하를 띠는 프로타민 (protamine) 단백질을 활용해 단백질과 폐 계면활성제간의 결합을 유도한다.
구체적인 실험과정은 다음과 같다.
(1) 클로로폼(chloroform)과 메탄올을 2:1(v:v)의 부피비로 혼합한 용액에, 폐 계면활성제 가루(제조사: 유한양행 / 제품명: NEWFACTEN)를 10 mg/ml 농도로 용해시켜, 폐 계면활성제 용액을 준비하였다.
(2) 프로타민 단백질을 증류수에 2 mg/ml 농도로 용해시켜, 프로타민 단백질 용액을 준비하였다.
(3) 초록형광단백질(Green Fluorescent Protein, GFP)을 증류수에 0.5 mg/ml 농도로 용해시켜, 초록형광단백질 용액을 준비하였다.
(4) 상기 (1)에서 준비한 폐 계면활성제 용액을 유리 바이알(glass vial)에 넣고, 용매를 증발시켜 지질막(lipid film)을 형성시킨다.
(5) 상기 폐 계면활성제 지질막이 형성된 유리 바이알에, 상기 (2)에서 준비한 프로타민 단백질 용액과, 상기 (3)에서 준비한 초록형광단백질 용액을 넣고, 45℃ 온도의 핫 플레이트(hot plate)에서 혼합하여 폐 계면활성제 지질막을 수화시켰다. 수화 과정에서 만들어지는 입자는 압출기 키트(extruder kit)를 사용하여 평균 직경이 400 nm가 되도록 하였다. 이 과정에서 프로타민 단백질과 초록형광단백질이 폐 계면활성제 기반 입자 내부 및/또는 외부에 결합된다.
(6) 이후, 100 kDa 막을 이용하여 투석(dialysis) 기법을 통해, 입자 속 결합되지 못한 단백질을 제거하였다.
도 1에 폐 계면활성제(pulmonary surfactant)를 활용한 단백질의 탑재방법 모식도를 나타내었다.
본 <실시예 1>에서 결합대상 단백질 또는 핵산로 초록형광단백질(GFP)를 사용하였는데, 그 이유는, 초록형광단백질이 형광을 띠고있어 정량적인 면에서 확인이 유리하고, 대부분의 단백질과 같이 약한 음전하를 띠고있기 때문이다.
초록형광단백질은 약 26.9 kDa 분자량 크기를 갖고 있고, DLS(Dynamic light scattering) 장비를 통해 전하를 측정해 보았을 때 약 -5 내지 -7 mV의 음전하를 띠고있다. 해당 내용을 하기 표 1에 나타내었다.
GFP
Molecular weight (kDa) 26.9
Zeta potential (mV) -5 내지 -7
한편, 결합대상 단백질 또는 핵산인 초록형광단백질(GFP)의 최대 결합효율(%)을 달성하기 위하여, 폐 계면활성제와 프로타민의 사용량을 다양하게 조절하며, 전술한 과정을 통해 단백질이 결합된 폐 계면활성제 기반 입자를 제조해보았다.
보다 구체적으로, 비율 최적화를 위해, 입자 제조시 사용하는 초록형광단백질(GFP) 양과 폐 계면활성제의 양을 50 μg, 5 mg으로 고정한 상태에서, 프로타민 양을 변화시켜 보았다. 모델 단백질인 초록형광단백질(GFP) 양을 50 μg으로 고정한 상태에서, 폐 계면활성제 양을 5 mg으로 고정하고, 프로타민 양을 초록형광단백질(GFP) 몰 대비 1배 (1:1 mol/mol)에서 20배 (1:20 mol/mol)까지 구분하여 사용하였다.
또한, 후술하는 세포 내 섭취를 관측하기 위해 소수성이 매우 높은 수난용성 염료인 DiI를 폐 계면활성제에 다음과 같이 추가적으로 표지하였다.
보다 구체적으로, 붉은 염료 DiI를 메탄올에 1.25 mg/ml 농도로 용해시킨 용액을 별도로 준비하였다. 상기 (1)에서 준비한 폐 계면활성제 용액과, 상기 DiI가 용해된 용액을 혼합하되, 폐 계면활성제와 DiI 염료가 질량 기준 1000:1 비율로 혼합될 수 있도록 조절하였다. 혼합된 용액을 유리 바이알(glass vial)에 넣고, 용매를 증발시켜 지질막(lipid film)을 형성시킨다. 이후의 과정은 전술한 (5), (6) 과정과 동일하게 수행하였다.
< 실험예 1> 폐 계면활성제와 프로타민 사용량에 따른, 결합대상 단백질 또는 핵산인 초록형광단백질(GFP)의 탑재율(%) 변화 평가
상기 <실시예 1>에서 투석(dialysis) 기법을 통해 입자 속 결합되지 못한 단백질을 제거하기 전과 후 초록형광단백질(GFP) 형광을 통한 입자 내 결합된 단백질의 양 비교를 통해, 탑재율(%) 변화를 평가하였다. 전술한 바와 같이, 초록형광단백질(GFP) 양은 50 μg 으로 고정하였다.
초록형광단백질(GFP)과 폐 계면활성제 양을 각기 50 μg, 5 mg으로 고정한 상태에서, 프로타민 양을 초록형광단백질(GFP) 1몰 기준 1:1, 1:5, 1:10, 1:20 몰 비율로 늘려가면서 초록형광단백질(GFP) 탑재율과 입자의 크기 및 전하를 DLS로 측정해 살펴보았다.
그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2는 초록형광단백질(GFP)과 폐 계면활성제 양을 각기 50 μg, 5 mg으로 고정한 상태에서, 프로타민 양을 초록형광단백질(GFP) 1몰 기준 1:1, 1:5, 1:10, 1:20 몰 비율로 늘려가면서 초록형광단백질(GFP) 탑재율과 입자의 크기 및 전하를 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 2에 나타난 바와 같이,
1:10 몰 비율 초과로 늘려보았을때부터 탑재율이 오히려 낮아졌을뿐만 아니라, 입자의 크기가 비정상적으로 뭉치는 경향을 보였고, 입자의 전하가 변동하면서 불안정한 형태를 보였다. 따라서, 최종적으로 초록형광단백질(GFP) 1몰 기준 프로타민을 10몰 만큼 사용하기로 결정하였다.
종합하여, 결합대상 단백질 또는 핵산(GFP) 1 중량부 기준으로 폐 계면활성제를 100 중량부만큼 사용하면서, 결합대상 단백질 (GFP) 1 몰 기준으로 프로타민 단백질을 1 내지 10 몰만큼, 특히 10 몰만큼 사용하여, <실시예 1>의 단백질이 결합된 폐 계면활성제 기반 입자를 제조하는 것이 바람직함을 확인하였다.
도 3에 나타난 바와 같이,
또한 입자의 투과 전자 현미경 (Transmission Electron Microscopy) 사진을 통해 초록형광단백질이 탑재된 폐계면활성제입자의 모양을 관측하였다. 이를 통해 원형의 균일한 나노입자가 잘 제작 되었음을 알 수 있다.
이후의 실험예에서 사용한 단백질이 결합된 폐 계면활성제 기반 입자는,
입자 제조시 결합대상 단백질 또는 핵산(GFP) 1 중량부 기준으로 폐 계면활성제를 100 중량부만큼 사용하면서, 결합대상 단백질 1 몰 기준으로 프로타민 단백질을 10 몰만큼 사용하여 제조되는 입자를 사용하였다.
<실험예 2> 입자 안정성 평가
완성된 입자의 안정성을 평가하기 위해, 입자를 생체와 유사한 환경인 10 % FBS(Fetal bovine serum)가 들어가있는 배양액에 넣고 37℃에서 시간별로 입자의 크기를 비교해 보았다. 또한 네뷸라이저 전/후의 입자 크기 비교를 통해 입자의 안정성을 시험해 보았다. 더불어 타입 Ⅱ 폐포세포 유래 A549 폐암 세포에 대해서 입자 자체 독성을 테스트 하였다.
입자 크기 (nm)
네뷸라이저 전 260.9 ± 4.88
네뷸라이저 후 253.8 ± 12.93
표 2에 나타난 바와 같이,
네뷸라이저 처리 전/후의 입자 크기를 비교함으로써 입자의 안정성을 확인하였다. 네뷸라이저 전의 경우 약 261 nm 크기의 입자를 형성하고 네뷸라이저 후에도 약 253.8 크기의 입자를 형성함을 확인함으로써 입자의 안정성을 검증하였다.
그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4는 완성된 입자의 안정성을 평가하기 위해, 입자를 생체와 유사한 환경인 10%(v/v) FBS(Fetal bovine serum)가 들어가있는 배양액에 넣고 37℃에서 시간별로 입자의 크기를 비교한 결과를 나타내는 도면이다.
도 4에 나타난 바와 같이,
120 분까지 시간별로 DLS 장비를 통해 입자의 크기를 살펴보았을 때 그 크기는 변하지 않음으로 보아 생체 내 환경에서 입자가 안정하다는 것을 확인하였다. 또한, 같이 탑재된 단백질 자체도 해당 환경에서 변성이 일어나지 않음을 GFP의 형광이 변하지 않음으로 확인하였다.
또한 입자 자체의 독성을 평가하기 위해 타입 II 폐포세포 유래 폐암 세포주인 A549를 96 well 플레이트에 5000마리씩 분주하고 하루 뒤, 폐계면활성제 기준 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1 mg/ml 농도의 입자를 처리하였다. 약 1시간 뒤 PBS로 교체를 해주고 24 시간 뒤에 세포 사멸도를 확인하였다. 1 mg/ml 농도로 처리했음에도 입자 자체의 독성을 확인되지 않았다.
<실험예 3> 세포 종류에 따른, 폐 계면활성제 입자의 세포내 전달효율 평가
폐 계면활성제-단백질-프로타민(Surf-Pro-GFP) 입자의 세포 내 전달을 확인하였다.
먼저, 폐 계면활성제를 통한 폐 세포내 전달 효과를 검증하기 위해 폐 계면활성제 없이프로타민-단백질 복합체(Pro-GFP)만을 대조군으로 하여 세포 내 전달 여부를 확인하였다. 단백질(GFP)은 7 μg 기준으로 프로타민은 1:10의 몰 비율로 섞어 복합체를 만들었다. 해당 복합체는 약 1364 nm의 평균직경을 가지고 15.3 mV의 양전하를 띠었다. 만들어진 대조군 복합체는 사람폐포상피세포 (HPAepic), 대식세포 (Raw 264.7), 또는 타입 II 폐포세포 유래 폐암세포 (A549)에 24시간 동안 각각 처리한 뒤, 공초점 현미경을 통해 세포 내 전달을 확인하였다. 이때 세포는 실험 전 24시간 전에 약 3 만마리씩 6 웰 플레이트(well plate)에 계대배양(subculture) 하였다.
그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5는 대조군인프로타민-단백질 복합체(Pro-GFP)를 사람폐포상피세포 (HPAepic), 대식세포 (Raw 264.7), 또는 타입 II 폐포세포 유래 폐암세포 (A549)에 24시간 동안 각각 처리한 뒤, 공초점 현미경을 통해 세포 내 전달을 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 5에 나타난 바와 같이,
핵을 Hoechst 염색약을 통해 5분간 염색하고(파란색), 단백질 형광(초록색)을 공초점 현미경을 통해 살펴보았을 때, 3 가지 세포군 어디에서도 세포내 전달이 원활히 이루어지지 않았음을 알 수 있다.
다음으로, 폐 계면활성제-단백질-프로타민(Surf-Pro-GFP) 입자를 같은 세포에 처리해 보았다. 0.2 mg의 폐 계면활성제입자를 DiI (1.25 mg/ml in methanol) 형광으로 표지하여 입자(빨간색)와 단백질(초록색)이 세포내로 잘 전달되는지를 확인하였다. 24시간 동안 처리한 뒤 세포핵을 Hoechst로 염색하고 공초점 현미경을 통해 세포 내 전달을 확인하였다. 이때 세포는 실험 전 24시간 전에 약 3 만마리씩 6 웰 플레이트(well plate)에 계대배양(subculture) 하였다.
그 결과를 도 6, 도 7, 도 8에 나타내었다.
도 6은 Surf-Pro-GFP 입자를 사람폐포상피세포 (HPAepic)에 24시간 동안 각각 처리한 뒤, 공초점 현미경을 통해 세포 내 전달을 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 7은 Surf-Pro-GFP 입자를 대식세포 (Raw 264.7)에 24시간 동안 각각 처리한 뒤, 공초점 현미경을 통해 세포 내 전달을 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 8은 Surf-Pro-GFP 입자를 타입 II 폐포세포 유래 폐암세포 (A549)에 24시간 동안 각각 처리한 뒤, 공초점 현미경을 통해 세포 내 전달을 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 6, 도 7, 도 8에 나타난 바와 같이,
사람폐포상피세포 (HPAepic cell)의 경우 Surf-Pro-GFP 입자가 거의 세포 내로 전달되지 않음을 알 수 있다. 대식세포 (Raw264.7 cell)의 경우도 Surf-Pro-GFP 입자가 세포 내로 잘 전달되지 않음을 알 수 있다. 반면, 타입 II 폐포세포 유래 폐암세포 (A549)의 경우 폐 계면활성제와의 상호작용이 일어나 세포내로 잘 전달되고 입자에 탑재되어 있는 단백질 역시 세포 내로 잘 전달됨을 알 수 있다.
<실험예 4> 동물 마우스 모델에서, 폐 계면활성제 입자의 전달효율 평가
실제 소형 동물 마우스 모델에서 SGP 입자가 폐에 잘 전달되는지를 확인하고자, 대조군인 GFP 단백질만 폐에 흡입 전달한 경우와, SGP 입자로 전달한 경우를 비교해보았다. 이때, 단백질 또는 SGP 입자의 흡입을 위해 SCIREQ의 nebulizer를 사용하여 마우스에 전달해 주었다. 단백질 15 μg과, 같은 단백질 양이 결합된 SGP 입자를 동물 모델에 흡입 전달한 후, 1시간 실제 소형 동물 마우스 모델에서 Surf-Pro-GFP 입자가 폐에 잘 전달되는지를 확인하고자, 대조군인 GFP 단백질만 폐에 흡입 전달한 경우와, Surf-Pro-GFP 입자로 전달한 경우를 비교해보았다. 이때, 단백질 또는 SGP 입자의 흡입을 위해 SCIREQ의 nebulizer를 사용하여 마우스에 전달해 주었다. 단백질 15 μg과, 같은 단백질 양이 결합된 Surf-Pro-GFP 입자를 동물 모델에 흡입 전달한 후, 1시간 후에 폐를 적출하여 폐 내 GFP 신호를 IVIS 장비를 통해 분석하였다.
그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9는 실제 소형 동물 마우스 모델에서 Surf-Pro-GFP 입자가 폐에 잘 전달되는지를 확인하고자, 대조군인 GFP 단백질만 폐에 흡입 전달한 경우와, Surf-Pro-GFP 입자로 전달한 경우를 비교한 결과를 나타내는 도면이다.
도 9에 나타난 바와 같이,
GFP 단백질만 전달했을 때는 GFP 단백질이 폐 전역에 퍼지지 못하고 기도 쪽에 밀집된 양상을 보이는 반면, <실시예 1>과 같은 Surf-Pro-GFP 입자로 전달하게 되면 폐 전역적으로 GFP 단백질의 전달이 가능함을 알 수 있다.
< 실험예 5> 동물 마우스 모델에서, 흡입 전달 후 시간 경과에 따른 폐 계면활성제 입자의 장기분포 평가
시간별 Surf-Pro-GFP 입자의 장기분포를 확인하기 위해 폐 계면활성제 1 mg 기준 Surf-Pro-GFP 입자를 제작한 후, 마우스 동물 모델에 흡입 전달하고 시간에 따른 단백질 및 입자의 장기 분포를 확인하였다. 이때, 입자에는 DiI (1 mg/ml in methanol) 형광을 표지하였고 단백질은 GFP 형광을 통해 관측하였다. 흡입 전달 후 0 h, 1 h, 6 h, 24 h 동안 마우스를 배양하고 장기를 적출한 뒤 입자의 분포를 확인하였다. 장기의 DiR 분포는 LiCoR 장비를 활용해 확인하였다. 또한, GFP 신호는 적출된 장기를 IVIS 장비를 활용해 측정하였다.
그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10은 시간별 Surf-Pro-GFP 입자의 장기분포를 확인하기 위해 폐 계면활성제 1 mg 기준 Surf-Pro-GFP 입자를 제작한 후, 마우스 동물 모델에 흡입 전달하고 시간에 따른 단백질 및 입자의 장기 분포를 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 10에 나타난 바와 같이,
장기의 DiR 분포를 확인하였을 때, 24시간까지 입자가 폐에만 분포함을 확인하였다. 도 10에서 빨간색은 장기의 자발형광이고, 초록색은 폐 계면활성제 입자를 의미한다.
*
상기 결과를 정량화한 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11은 시간별 Surf-Pro-GFP 입자의 장기분포를 확인하기 위해 폐 계면활성제 1 mg 기준 Surf-Pro-GFP 입자를 제작한 후, 마우스 동물 모델에 흡입 전달하고 시간에 따른 단백질 및 입자의 장기 분포를 확인한 결과인 도 10의 결과를 정량화한 그래프를 나타내는 도면이다.
도 11에 나타난 바와 같이,
입자와 단백질 모두 24 시간 동안 폐 내에만 있음을 알 수 있고 입자와 단백질 신호의 경향이 유사함을 알 수 있다. 따라서, 흡입 전달한 입자와 단백질이 폐에 잘 남아있으며 다른 장기로 퍼지지 않음을 확인할 수 있다.
<실시예 2> 핵산이 결합된 폐 계면활성제 기반 입자 제조
2-1. 프로타민-siRNA 복합체 제조
핵산이 결합된 폐 계면활성제 기반 입자를 제조하기 위하여, 하기와 같이 프로타민-siRNA (Pro-siRNA) 복합체를 제조하였다. 먼저, siRNA를 증류수에 10 nmol/mL 농도로 용해시켜 siRNA 용액을 준비하고, 프로타민을 증류수에 1 mg/mL 농도로 용해시켜 프로타민 단백질 용액을 준비하였다. 이때, siRNA와 프로타민의 질량비에 따른 크기 및 전하를 측정하기 위하여, 2 nmol siRNA 기준 siRNA:프로타민의 질량비를 0.5:1, 0.75:1, 1:1, 1.25:1, 1.5:1, 2:1, 4:1로 혼합하고 상온에서 약 15분 동안 반응을 유도하여 siRNA-프로타민 복합체를 제조하였다.
도 12에 폐 계면활성제를 활용한 핵산의 탑재방법 모식도를 나타내었다.
제조된 프로타민-siRNA 복합체를 DLS 장비를 이용하여 크기와 전하를 측정하고 그 결과를 도 13에 나타내었다. 그 결과, siRNA의 프로타민에 대한 질량 비율이 높아질수록 프로타민-siRNA 복합체가 음전하를 띠는 것으로 확인되었다. 한편, 음전하인 폐 계면활성제 내에 잘 탑재하기 위해서는 양전하의 복합체를 선정하는 것이 효율적이므로, 도 13에서 확인할 수 있는 약 200 nm 크기를 가지고 20 mV의 양전하를 띠는 질량비가 1:1인 복합체를 선정하여 하기 핵산이 결합된 폐 계면활성제 기반 입자를 제조하였다.
2-2. siRNA가 결합된 폐 계면활성제 기반 입자 제조
상기 2-1에서 제조한 프로타민-siRNA 복합체를 이용하여 siRNA가 결합된 폐 계면활성제 기반 입자를 제조하기 위하여, 먼저 폐 계면활성제(Newfacten)을 클로로폼과 메탄올 2:1 용액에 10 mg/mL 농도로 준비하고, 상기 2-1에서 제조한 프로타민-siRNA 복합체 질량 대비 1:5 및 1:10 비율의 폐 계면활성제 용액을 유리 바이알에 넣고, 용매를 증발시켜 지질막을 형성하였다. 그 다음 siRNA-프로타민 복합체를 상기 지질막에 넣고 약 45 ℃ 이상에서 수화과정을 진행하여 siRNA가 결합된 폐 계면활성제 기반 입자를 제조하였다.
제조된 siRNA가 결합된 폐 계면활성제 기반 입자를 DLS 장비를 이용하여 크기와 전하를 측정한 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
크기 (nm) 표면 전하 (mV)
폐 계면활성제 -40
프로타민/siRNA 복합체
(1:1 w/w)		 230 +20
복합체+폐 계면활성제
(1:5 w/w)		 240 -25
복합체+폐 계면활성제
(1:10 w/w)		 250 -35
상기 표 3에서 확인할 수 있는 것처럼, 폐 계면활성제만의 전하는 약 -40 mV이고, 복합체가 폐 계면활성제 내에 잘 탑재되었다면 최종 완성된 입자 역시 비슷한 전하를 띠게 된다. 복합체 대비 폐 계면활성제 비율을 달리해보았을 때, 1:10 비율로 입자를 제작하였을 때 약 250 nm 크기와 -35 mV의 입자가 제작되는 것을 확인하였다.
< 실험예 6> 폐 계면활성제 입자의 타입 II 폐포세포 유래 폐암 세포 내 전달 효율 평가
상기 실시예 2에서 제조한 폐 계면활성제-프로타민-siRNA(Surf-Pro-siRNA) 입자의 타입 II 폐포세포 유래 폐암 세포 내 전달을 확인하였다. 폐 계면활성제를 통한 폐 세포 내 전달 효과를 검증하기 위해 상기 실시예 2-1에서 제조한 폐 계면활성제가 없는 프로타민-siRNA(Pro-siRNA)를 대조군으로 하여 세포 내 전달 여부를 확인하였다.
먼저, A549 세포를 6 well plate에 배양하고 (20000 cells/well), 배양 하루 뒤, 세포에 음성 대조군, 프로타민-Fluorescein-siRNA 복합체, 폐 계면활성제-프로타민-Fluorescein-siRNA(Surf-Pro-siRNA)를 처리한다. 이 때 모든 그룹에 처리한 siRNA의 농도는 2 nmol/mL로 고정하였다. 약 24시간 배양 뒤 공초점 현미경을 통해 세포를 촬영하여 그 결과를 도 14에 나타내었다.
도 14에 나타난 바와 같이,
Pro-siRNA만을 활용하면 타입 II 폐포세포 유래 A549 폐암 세포 내에 효과적으로 전달되지 않음을 알 수 있다. 반면 폐 계면활성제를 활용하여 siRNA를 전달하였을 때는 효과적으로 타입 II 폐포세포 유래 폐암 세포 내에 전달할 수 있음을 확인할 수 있다.
<실험예 7> 폐 계면활성제를 활용한 siRNA의 단백질 발현 저하능 확인
상기 실시예 2에서 제조한 핵산이 결합된 폐 계면활성제 기반 입자를 이용한 siRNA의 단백질 발현 저해 효능을 확인하기 위하여 다음과 같이 실험하였는데, 구체적으로 본 실험을 통해 음성 대조군 siRNA와 luciferase siRNA 자체의 효과 비교, luciferase siRNA가 복합체를 통해 전달되었을 때와 폐 계면활성제 입자 형태로 전달되었을 때의 효과 차이 확인, 세포 배양 환경에서 lipofectamine3000과 폐 계면활성제 간의 효율 차이를 확인하기 위하여 다음과 같이 실험하였다.
먼저, A549-luciferase 세포를 24 well plate에 배양한 후 (30000 cells/well), 음성 대조군, 프로타민-luciferase siRNA 복합체 (Pro-Luc-siRNA), 폐계면활성제-프로타민-음성 대조군 siRNA (Surf-Pro-NC-siRNA), 폐계면활성제-프로타민-luciferase siRNA(Surf-Pro-Luc-siRNA), Lipofectamine3000-luciferase siRNA (LF-Luc-siRNA)을 배양한 세포에 처리하였다. 이때 각 그룹은 약 200 pmol/mL 농도의 siRNA를 처리하였다. 세포를 24시간 배양한 후, 세포 배지 세척 과정을 거친 후, 단백질 발현 저하를 위해 24시간을 추가로 배양하였다. 그 다음 발광(luminescence) 확인을 위해 각 well에 luciferin 12.5 mg/mL을 10 μL씩 처리하고, IVIS 장비를 이용하여 발광을 측정하였다. 또한, 세포 사멸도를 확인하기 위하여 MTT 기법을 진행하였다. 그 결과를 도 15 및 도 16에 나타내었다.
그 결과 프로타민-luciferase siRNA 복합체 만으로는 단백질 발현 저하능을 확인할 수 없었고, 폐 계면활성제 입자 형태로 luciferase siRNA를 전달하였을 때는 단백질 발현 저하능을 확인할 수 있었다. 대조군(control)과 비교해봤을 때 통계적으로 유의미한 차이는 보였으나 lipofectamine에 비해 낮은 효율을 보였다. 하지만 lipofectamine의 경우 폐 계면활성제와는 달리 in vivo 상에서 전혀 활용할 수 없다는 단점이 있기 때문에 폐 내 in vivo 형질주입(transfection)을 위한 용도로 폐 계면활성제 입자를 유용하게 활용할 수 있을 것이다.
<실험예 8> 폐 계면활성제를 활용한 폐암 세포 사멸능 확인
먼저, A549-luciferase 세포를 24 well plate에 배양한 후 (30000 cells/well), 음성 대조군, 프로타민-luciferase siRNA 복합체 (Pro-Luc-siRNA), 폐계면활성제-프로타민-음성 대조군 siRNA (Surf-Pro-NC-siRNA), 폐계면활성제-프로타민-luciferase siRNA(Surf-Pro-Luc-siRNA), Lipofectamine3000-luciferase siRNA (LF-Luc-siRNA)을 배양한 세포에 처리하였다. 이때 각 그룹은 약 200 pmol/mL 농도의 siRNA를 처리하였다. 세포를 24시간 배양한 후, 세포 배지 세척 과정을 거친 후, 단백질 발현 저하를 위해 24시간을 추가로 배양하였다. 그 다음 발광(luminescence) 확인을 위해 각 well에 luciferin 12.5 mg/mL을 10 μL씩 처리하고, IVIS 장비를 이용하여 발광을 측정하였다. 또한, 세포 사멸도를 확인하기 위하여 MTT 기법을 진행하였다. 그 결과를 도 15 및 도 16에 나타내었다.
그 결과 프로타민-luciferase siRNA 복합체 만으로는 단백질 발현 저하능을 확인할 수 없었고, 폐 계면활성제 입자 형태로 luciferase siRNA를 전달하였을 때는 단백질 발현 저하능을 확인할 수 있었다. 대조군(control)과 비교해봤을 때 통계적으로 유의미한 차이는 보였으나 lipofectamine에 비해 낮은 효율을 보였다. 하지만 lipofectamine의 경우 폐 계면활성제와는 달리 in vivo 상에서 전혀 활용할 수 없다는 단점이 있기 때문에 폐 내 in vivo 형질주입(transfection)을 위한 용도로 폐 계면활성제 입자를 유용하게 활용할 수 있을 것이다.
KRAS silencing siRNA (Human)
- Sense: 5'-GUCUCUUGGAUAUUCUCGA-3' (서열번호 1)
- Antisense: 3'-UCGAGAAUAUCCAAGAGAC-5' (서열번호 2)
RPN2 silencing siRNA (Human ribophorin II)
- Sense: 5'-GGCCACUGUUAAACUAGAACA-3' (서열번호 3)
- Antisense: 3'-GUCCGGUGACAAUUUGAUCUU-5' (서열번호 4)
먼저, A549-luciferase 세포를 24 well plate에 배양한 후 (30000 cells/well), 세포에 음성 대조군 (Control), Lipofectamine3000-RPN2 siRNA (LF-PRN2-siRNA), 폐계면활성제-프로타민-RPN2 siRNA(Surf-Pro-RPN2-siRNA), Lipofectamine3000-KRAS siRNA, 폐계면활성제-프로타민-KRAS siRNA(Surf-Pro-KRAS-siRNA)를 처리하였다. 이때 각 그룹에서 siRNA의 농도는 약 300 pmol/mL 농도가 되도록 처리되었다. 24시간 동안 배양한 후 세포 배지 세척 과정을 거친 후, 단백질 발현 저하를 위해 24시간을 추가로 배양하고 세포 사멸도를 확인하기 위해 MTT 기법을 진행하였다. 그 결과를 도 17에 나타내었다.
도 17에서 확인할 수 있는 것처럼, KRAS-siRNA와 RPN2-siRNA 모두 폐 계면활성제 입자 형태로 세포에 전달하였을 때 우수한 타입 II 폐포세포 유래 폐암 세포 사멸능을 보였으며, 비교를 위해 lipofectamine으로도 처리한 군 역시 유사한 결과를 보였다. 따라서, 본 발명에 따른 실시예의 siRNA가 탑재된 폐 계면활성제 입자는 흡입 기법을 통해 실제 폐 내에서 단백질 발현 억제가 우수한 것을 확인할 수 있었다.
따라서 본 발명에 따른 폐 계면활성제 입자는 폐 질환들에서 유발되는 비정상적 단백질 발현을 억제하기 위한 수단으로써 siRNA와 같은 핵산을 폐 세포 내에 효과적으로 전달하는데에도 사용될 수 있다. 폐 질환 중 대표적으로 폐암은 다양한 종양 유전자들로 인해 유발되고 해당 단백질들이 과발현 되면서 더욱 악화되는 경향을 보인다. 따라서 폐암을 억제하기 위해 종양 유전자를 억제할 수 있는 기술이 필요하며, 본 발명에 따른 핵산이 탑재된 폐 계면활성제 기반 입자를 이용하여 상기 억제를 달성할 수 있다.
<실시예 3> 단백질이 결합된 폐 계면활성제 기반 입자 제조-2
다음과 같은 실험 과정을 통해 면역 단백질인 GM-CSF(Granulocyte-macrophage colony stimulating factor)이 결합된 폐 계면활성제 기반 입자를 제조하였다.
구체적인 실험과정은 다음과 같다.
(1) 클로로폼(chloroform)과 메탄올을 2:1(v:v)의 부피비로 혼합한 용액에, 폐 계면활성제(Newfacten)를 10 mg/ml 농도로 용해시켜, 폐 계면활성제 용액을 준비하였다.
(2) GM-SCF를 증류수에 10 μg/ml 농도로 용해시켜, GM-SCF 용액 1 ml를 준비하였다.
(3) GM-SCF 몰 대비 10배의 프로타민 설페이트 용액을 준비하였다.
(4) 상기 (1)에서 준비한 폐 계면활성제를 이용해 (폐 계면활성제 1 mg) 지질 필름을 형성시킨다.
(5) 상기 지질 필름에 상기 (2)에서 준비한 GM-SCF 용액 1 ml와, 상기 (3)에서 준비한 프로타민 설페이트 용액을 넣어주고 약 45℃ 온도의 핫 플레이트(hot plate)에서 혼합하여 폐 계면활성제 지질막을 수화시켰다. 수화 과정에서 만들어지는 입자는 압출기 키트(extruder kit)를 사용하여 평균 직경이 400 nm가 되도록 하였다 (나노입자화). 이 과정에서 프로타민 단백질과 GM-SCF이 폐 계면활성제 기반 입자 에 결합된다.
(6) 입자에 탑재되지 않은 단백질을 제거하기 위해 증류수에 100 kDa 막으로 최소 8시간 투석과정을 진행한다.
(7) 제작된 입자의 크기와 전하를 DLS 장비를 통해 측정하고, 제작된 입자의 탑재된 GM-SCF양을 ELISA 키트를 활용해 측정하였다.
그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
크기 (nm) 표면 전하 (mV) 탑재된 GM-CSF 양
(μg)
GM-CSF - -9.4 -
GM-CSF가 탑재된 폐 계면활성제입자 317.5 -17.5 1.06
음전하를 띠는 면역 단백질인 GM-CSF 10 μg을 폐 계면활성제 1 mg에 전하를 이용하여 탑재를 진행한 결과, GM-CSF가 탑재된 폐 계면활성제 입자는 약 300 nm의 크기와 약 -20 mV의 전하를 가지는 것으로 확인되었으며, 탑재되지 않은 단백질을 제거한 후에 탑재된 GM-CSF 양을 측정해보았을 때 약 1.06 μg의 단백질이 탑재된 것으로 확인되었다. 이를 통해 면역 단백질인 GM-CSF를 프로타민을 이용하여 폐 계면활성제 기반 입자에 효율적으로 탑재할 수 있음을 확인하였다.

Claims (16)

  1. 폐 계면활성제(pulmonary surfactant)로 제조되는 리포좀에, 단백질 또는 핵산이 결합된 복합체를 함유하는, 단백질 또는 핵산 전달용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 리포좀에 결합되는 단백질 또는 핵산은, 양전하를 띠는 단백질 또는 펩타이드를 매개로 리포좀에 결합되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 양전하를 띠는 단백질은 프로타민(protamine)인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 리포좀에 결합되는 단백질은, 음전하를 띠는 단백질인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은, 리포좀에 결합된 단백질 또는 핵산을 폐(lung)로 선택적으로 전달하기 위한 것인, 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 폐 계면활성제(pulmonary surfactant)는, 타입 II 폐포세포(type II alveolar cells)에서 생성되는 지질단백질 복합체(lipoprotein complex)인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 폐 계면활성제(pulmonary surfactant)는, 막 단백질(membrane protein)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 복합체는 타입 II 폐포세포 유래의 폐암세포를 표적하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 복합체의 평균 직경 범위는 250 내지 1200 nm인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  10. 폐 계면활성제가 용해된 제1 용액을 준비하는 단계;
    상기 준비한 폐 계면활성제가 용해된 용액을 건조시켜 지질막(lipid film)을 형성시키는 단계;
    상기 형성된 지질막에, 결합대상 단백질 또는 핵산이 용해된 제2 용액을 처리해 수화시켜, 결합대상 단백질 또는 핵산이 폐 계면활성제로 제조되는 리포좀에 결합된 복합체를 제조하는 단계; 를 포함하는, 단백질 또는 핵산 전달용 조성물의 제조방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 형성된 지질막에, 결합대상 단백질 또는 핵산이 용해된 제2 용액을 처리해 수화시키는 단계에서, 양전하를 띠는 단백질 또는 펩타이드가 용해된 제3 용액을 함께 처리하여, 리포좀에 결합되는 단백질 또는 핵산이, 양전하를 띠는 단백질 또는 펩타이드를 매개로 리포좀에 결합될 수 있게 유도하는 것을 특징으로 하는, 조성물의 제조방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 조성물의 제조방법을 수행할 때,
    결합대상 단백질 또는 핵산 1 중량부 기준으로 폐 계면활성제를 100 내지 140 중량부만큼 사용함과 동시에,
    결합대상 단백질 또는 핵산 1 몰(mol) 기준으로 양전하를 띠는 단백질 또는 펩타이드를 1 내지 10 몰만큼 사용하는 것을 특징으로 하는, 조성물의 제조방법.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 조성물의 제조방법을 수행할 때,
    결합대상 단백질 또는 핵산 1 중량부 기준으로 폐 계면활성제를 100 중량부만큼 사용함과 동시에,
    결합대상 단백질 또는 핵산 1 몰(mol) 기준으로 양전하를 띠는 단백질 또는 펩타이드를 10 몰만큼 사용하는 것을 특징으로 하는, 조성물의 제조방법.
  14. 제11항에 있어서,
    상기 조성물의 제조방법을 수행할 때,
    결합대상 단백질 또는 핵산 1 중량부 기준으로 양전하를 띠는 단백질 또는 펩타이드를 0.5 내지 20 몰만큼 사용하는 것을 특징으로 하는, 조성물의 제조방법.
  15. 제10항에 있어서,
    상기 수화는 30 내지 90℃ 온도에서 수행하는 것을 특징으로 하는, 조성물의 제조방법.
  16. 제10항에 있어서,
    수화 단계를 수행한 후, 복합체의 직경을 조절하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물의 제조방법.
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