WO2022098078A1 - 프리온-fc 영역 융합 단백질 및 그 용도 - Google Patents
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Definitions
- These degenerative neurological diseases are classified according to the brain region where the neuronal abnormalities appear and major symptoms, and representative diseases include Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Lewy bodies disease, and Pick's disease. Pick's disease), traumatic encephalopathy, amyotrophic lateral sclerosis (ALS), tauopathy, frontotemporal dementia, etc.
- the present specification provides a prion-Fc region fusion protein capable of inducing the removal of neurotoxic protein aggregates.
- KKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKH (SEQ ID NO: 32);
- the fusion protein further comprises a secretion signal peptide, and the C-terminus of the secretion signal peptide is linked to the N-terminus of the hPrP.
- ISA ISAMVRS (SEQ ID NO: 18); (G) n ; (GGGGS) n (SEQ ID NO: 19); (EAAAK) n (SEQ ID NO: 20); and (XP) n .
- the neurodegenerative disease is Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Lewy bodies disease, Pick's disease, traumatic encephalopathy, amyotrophic lateral sclerosis (Amyotrophic Lateral Sclerosis; ALS), tauopathy, and frontotemporal dementia (Frontotemporal dementia) at least one selected from the pharmaceutical composition is provided.
- Alzheimer's disease Parkinson's disease, Lewy bodies disease, Pick's disease, traumatic encephalopathy, amyotrophic lateral sclerosis (Amyotrophic Lateral Sclerosis; ALS), tauopathy, and frontotemporal dementia (Frontotemporal dementia) at least one selected from the pharmaceutical composition is provided.
- treatment means to eliminate, alleviate, alleviate, inhibit, ameliorate, or eliminate, or alleviate, a disease, disorder, disorder, and/or symptom of a subject.
- therapeutic agent refers to various substances (eg, compounds or peptides) that can exhibit the "therapeutic” effect when given in an appropriate way to a subject.
- treatment or therapeutic agent may include all other meanings recognized by those of ordinary skill in the art.
- the Fc is the Fc region of human immunoglobulin.
- the prion-Fc region fusion protein is characterized in that it includes the entire human prion protein, a fragment thereof, and/or a variant thereof.
- the human prion protein is characterized by binding to a protein aggregate having neurotoxicity.
- the neurotoxic protein aggregate is, for example, oligomerized, fibrilized, or a protein constituting a Lewy body, alpha-synuclein, amyloid beta ( Amyloid beta), Tau, TDP-43 and/or Prion.
- the prion-Fc region fusion protein may include a normal prion protein (PrP C ) found in humans.
- PrP C normal prion protein
- the vector capable of expressing the prion-Fc region fusion protein may be formulated by a person skilled in the art by a known method.
- the vector capable of expressing the formulated prion-Fc region fusion protein may include a peptide-based delivery system.
- the peptide-based delivery system may comprise protamine.
- the formulated encoding nucleic acid may be a protamine-mRNA complex.
- composition comprising a prion-Fc region fusion protein or a vector capable of expressing the same 5 - administration cycle
- Example 6 The fusion protein of Example 6, wherein at least one selected from the 127th amino acid, the 129th amino acid, and the 219th amino acid of the protein represented by SEQ ID NO: 1 is substituted for the human prion protein.
- ISA ISAMVRS (SEQ ID NO: 18); (G) n ; (GGGGS) n (SEQ ID NO: 19); (EAAAK) n (SEQ ID NO: 20); and (XP) n .
- the fusion protein characterized in that the C-terminus of the human prion protein and the N-terminus of the immunoglobulin Fc region are connected through the second linker.
- the fusion protein according to any one of Examples 1 to 22, wherein the fusion protein is capable of inducing the removal of neurotoxic protein aggregates.
- the secretion signal peptide is selected from SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 52 to SEQ ID NO: 53,
- the vector according to embodiment 30, wherein the viral vector is selected from retroviruses, lentiviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, vacciniaviruses, poxviruses and herpes simplex viruses.
- a composition comprising:
- a pharmaceutically acceptable carrier is selected from:
- Methods for removing neurotoxic protein aggregates including:
- Example 42 limiting neurotoxic protein aggregates
- Example 43 limited aggregate morphology
- Example 52 brain tissue limited
- the plasmid was prepared by amplifying an E. coli-based miniprep. Expression and secretion efficiency of human prion protein in the conditioned culture medium was verified by Western blot analysis according to Experimental Example 1.9, which is shown in FIG. 2 .
- the SH-SY5Y cells of Experimental Example 1.2 were transfected with pAAV-IL-2ss-hPrP-Fc prepared in Experimental Example 1.1.
- Lipofectamine 2000 transfection reagent (Thermo-Fisher) was used for transient transfection according to the manufacturer's instructions.
- DMEM Serum-free Dulbecco's modified Eagle's medium
- the culture medium was further cultured for 18 hours.
- the medium was centrifuged at 10,000 g for 10 minutes. After centrifugation, the recovered supernatant was concentrated using a 10K cut-off centrifugal filter.
- the target cells are SH-SY5Y cells according to each Example, and the primary antibody is pS129-a-Synuclein (abcam, ab51253); Tyrosine hydroxylase (Novus Biologicals, NB300-109) was used.
- the obtained immunofluorescence images are shown in FIGS. 5 to 6 .
- SIM-A9 cells rapidly phagocytosed alpha-synuclein PFF in an environment in which both alpha-synuclein PFF and prion-Fc fusion proteins were added.
- the AAV-PrP-Fc virus capable of expressing the prion-Fc fusion protein was stereotaxic injected into the rooi body model mouse prepared according to Experimental Example 1.5.
- FIGS. 16 to 20 The results of measuring the fluorescence intensity according to each Example are shown in FIGS. 16 to 20 .
- the relative TH fluorescence intensity was significantly increased when injected into the substantia nigra pars compacta (SNpc) site of the mouse (Example 4.3, SNpc) compared to the result of the rooi body model mouse (Comparative example 4.2, LB). This indicates that the mouse dopaminergic neurons are alive ( FIGS. 16 and 17 ).
- the survival rate evaluation results are shown in FIGS. 23 and 24 .
- the primary hippocampal neuron cells cultured in a medium containing a prion-Fc region fusion protein were cells cultured in a medium containing only alpha-synuclein PFF or tau PFF (Comparative example) 6.3, and Comparative example 6.4) showed a higher survival rate.
- a prion-Fc region fusion protein comprising a fragment, variant, or variant of a human prion protein
- human prion represented by SEQ ID NOs: 2 to 15 with reference to Experimental Examples 1.1 and 5.1
- An AAV vector capable of expressing the prion-Fc region fusion protein containing the protein was prepared, respectively.
- a prion-Fc region fusion protein and a vector capable of expressing the same, which can be used for treatment of diseases associated with neurotoxic protein aggregates.
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Abstract
본 명세서에서는 프리온-Fc 영역 융합 단백질 및 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질을 발현할 수 있는 벡터를 개시한다. 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질은 인간 프리온 단백질 및 면역글로불린의 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질이다. 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질은 전술한 신경독성이 있는 단백질 응집체에 작용하여 이를 제거하는 기능을 할 수 있다. 또한, 본 명세서에서는 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질 또는 이를 발현할 수 있는 벡터를 신경독성을 가지는 단백질 응집체와 관련된 질병을 치료하는 용도를 개시한다.
Description
본 명세서에서 개시되는 발명은 퇴행성 신경질환 치료와 관련 있는 기술 분야의 발명이다.
퇴행성 신경질환은 중추신경계의 신경세포가 오랜 시간에 걸쳐 악화되어 기능 이상과 장애를 가져오는 질병이다. 퇴행성 신경질환을 앓고 있는 환자는 신체의 운동조절능력, 인지기능, 지각기능, 감각기능, 기타 자율신경기능을 포함한 다양한 범위에 기능 이상을 보인다.
이러한 퇴행성 신경질환은 신경세포 이상이 나타난 뇌 부위, 및 주요 증상에 따라 구분되며, 대표적인 질환으로는 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 루이바디병(Lewy bodies disease), 픽병(Pick's disease), 외상성 뇌병증(Traumatic encephalopathy), 근위축성 측삭경화증(Amyotrophic Lateral Sclerosis; ALS), 타우병증(Tauopathy), 전두측두엽치매(Frontotemporal dementia)등이 있다.
퇴행성 신경질환의 발생 기전은 명확하게 밝혀지지 않았고, 활성산소 및 자유기에 의한 손상 (oxidative damage and free radical injury), 미토콘드리아 기능장애에 의한 에너지 장애 (mitochondrial dysfunction and energy failure), 신경세포 축삭의 운반 기능장애 (axonal transport defect), 신경염증기전 (neuroinflammation), 뇌신경세포 자멸사 (neuronal apoptosis), 세포 내 응집체의 축적 (intracellular aggregates accumulation), 단백질 응집체에 의한 세포 독성 (protein oligomer toxicity), 이상단백질 처리 시스템의 이상 (abnormal protein degradation system dysfunction) 등 다양한 기전이 복합적으로 작용하여 나타나는 것으로 이해되고 있다. 이 중, 신경독성(Neurotoxicity)을 가진 단백질 응집체(aggregated protein)의 세포 내 축적 및 전파, 및 이러한 단백질 응집체의 독성으로 인한 신경세포 사멸이 중요한 기전 중 하나로 지목되고 있다.
상기 퇴행성 신경질환과 관련된 물질은 주로 단백질로, 체내에서 생리적으로 합성된 단량체의 경우 독성을 띄지 않는다. 상기 단백질이 생체 내에서 미스폴딩(misfolding)이 일어나 아이소타입이 형성되는 경우, 혹은 체내에 축적되고 응집되어 올리고머(Oligomer), 원섬유(protofibril), 섬유(fibril), 및/또는 루이바디(Lewybody)를 이루는 경우 신경독성(Neurotoxicity)을 나타내게 되며, 퇴행성 신경질환의 발생과 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져있다. 단백질 응집체를 이루는 경우 신경독성을 나타내는 대표적인 단백질은 알파-시뉴클린(α-synuclein), 아밀로이드 베타(Amyloid beta), 타우(Tau), TDP-43 및 프리온(Prion) 등이 있다.
퇴행성 신경질환을 치료하는 중요한 전략으로 이러한 신경독성을 가지는 단백질 응집체의 축적을 방지하고, 이미 축적된 단백질 응집체를 제거하는 전략이 제시되고 있다.
본 명세서에서는 신경독성이 있는 단백질 응집체의 제거를 유도할 수 있는 프리온-Fc 영역 융합 단백질을 제공한다.
본 명세서에서는 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질을 발현할 수 있는 벡터를 제공한다.
본 명세서에서는 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질 또는 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질을 발현할 수 있는 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 명세서에서는 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질 또는 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질을 발현할 수 있는 벡터를 포함하는 조성물의 용도를 제공한다.
본 명세서에서는 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질 또는 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질을 발현할 수 있는 벡터를 포함하는 조성물을 이용한 퇴행성 신경질환 치료방법을 제공한다.
본 명세서에서는 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질 또는 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질을 발현할 수 있는 벡터를 포함하는 조성물을 사용하여 상기 신경독성이 있는 단백질 응집체를 제거하는 방법을 제공한다.
본 명세서에서는 다음 [화학식 1]로 표현되는, 신경독성이 있는 단백질 응집체 제거를 유도할 수 있는 융합 단백질을 제공한다:
[화학식 1] hPrP - L1 - Fc
상기 hPrP는 인간 프리온 단백질 전체, 인간 프리온 단백질 절편, 인간 프리온 단백질 변이체, 및 인간 프리온 단백질 변이체의 절편 중 선택된 것이고,
상기 L1은 링커, 또는 부존재하고,
상기 Fc는 인간 또는 마우스 면역글로불린의 Fc 영역이며,
상기 신경독성이 있는 단백질 응집체는 알파-시뉴클린(α-synuclein) 응집체, 아밀로이드 베타(Amyloid beta) 응집체, 타우(Tau) 응집체, TDP-43 응집체 및 프리온(Prion) 응집체 중 선택된 하나 이상이다.
일 실시예로, 상기 hPrP는 다음 중 선택되는 서열로 표현되는 융합 단백질을 제공한다:
MANLGCWMLVLFVATWSDLGLCKKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAMSRPIIHFGSDYEDRYYRENMHRYPNQVYYRPMDEYSNQNNFVHDCVNITIKQHTVTTTTKGENFTETDVKMMERVVEQMCITQYERESQAYYQRGSSMVLFSSPPVILLISFLIFLIVG (서열번호 1);
PQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKH (서열번호 30);
PQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAM (서열번호 31);
KKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKH (서열번호 32);
KKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAM (서열번호 33);
THSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAM (서열번호 34);
MANLGCWMLVLFVATWSDLGLCKKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGVYMLGSAMSRPIIHFGSDYEDRYYRENMHRYPNQVYYRPMDEYSNQNNFVHDCVNITIKQHTVTTTTKGENFTETDVKMMERVVEQMCITQYERESQAYYQRGSSMVLFSSPPVILLISFLIFLIVG (서열번호 35);
PQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGVYMLGSAM (서열번호 36);
KKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGVYMLGSAM (서열번호 37);
THSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGVYMLGSAM (서열번호 38);
MANLGCWMLVLFVATWSDLGLCKKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGGYVLGSAMSRPIIHFGSDYEDRYYRENMHRYPNQVYYRPMDEYSNQNNFVHDCVNITIKQHTVTTTTKGENFTETDVKMMERVVEQMCITQYERESQAYYQRGSSMVLFSSPPVILLISFLIFLIVG (서열번호 39);
KKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGGYVLGSAM (서열번호 40);
PQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGGYVLGSAM (서열번호 41);
THSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGGYVLGSAM (서열번호 42);
MANLGCWMLVLFVATWSDLGLCKKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAMSRPIIHFGSDYEDRYYRENMHRYPNQVYYRPMDEYSNQNNFVHDCVNITIKQHTVTTTTKGENFTETDVKMMERVVEQMCITQYKRESQAYYQRGSSMVLFSSPPVILLISFLIFLIVG (서열번호 43); 및
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 44).
일 실시예로, 상기 제1 링커는 다음 중 선택된 서열로 표현되는 융합 단백질을 제공한다:
ISA; ISAMVRS(서열번호 18); (G)n; (GGGGS)n (서열번호 19); (EAAAK)n (서열번호 20); 및 (XP)n.
일 실시예로, 상기 Fc는 인간 면역글로불린 G의 Fc 영역인 융합 단백질을 제공한다.
일 실시예로, 상기 인간 면역글로불린 G는 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4 중 선택된 것인 융합 단백질을 제공한다.
일 실시예로, 상기 Fc는 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 16)으로 표현되는 융합 단백질을 제공한다.
일 실시예로, 상기 융합 단백질은 분비 신호 펩타이드를 추가로 포함하고, 상기 분비 신호 펩타이드의 C 말단은 상기 hPrP의 N 말단에 연결된 융합 단백질을 제공한다.
일 실시예로, 상기 융합 단백질은 제2 링커를 추가로 포함하고, 상기 분비 신호 펩타이드의 C 말단 및 상기 hPrP의 N 말단이 상기 제2 링커를 통해 연결된 융합 단백질을 제공한다.
일 실시예로, 상기 제2 링커는 다음 중 선택된 서열로 표현되는 융합 단백질을 제공한다:
ISA; ISAMVRS(서열번호 18); (G)n; (GGGGS)n (서열번호 19); (EAAAK)n (서열번호 20); 및 (XP)n.
일 실시예로, 상기 융합 단백질은 다음 중 선택된 서열로 표현되는 것을 특징으로 하는 융합 단백질을 제공한다:
MANLGCWMLVLFVATWSDLGLCKKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAMSRPIIHFGSDYEDRYYRENMHRYPNQVYYRPMDEYSNQNNFVHDCVNITIKQHTVTTTTKGENFTETDVKMMERVVEQMCITQYERESQAYYQRGSSMVLFSSPPVILLISFLIFLIVGISADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 21);
PQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGVYMLGSAMISADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 22);
PQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHISADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 23);
KKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHISADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 24);
KKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGVYMLGSAMISADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 25); 및
THSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGVYMLGSAMISADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 26).
일 실시예로, 상기 융합 단백질은 다음 중 선택된 서열로 표현되는 것을 특징으로 하는 융합 단백질:
MYRMQLLSCIALSLALVTNSISAMVRSMANLGCWMLVLFVATWSDLGLCKKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAMSRPIIHFGSDYEDRYYRENMHRYPNQVYYRPMDEYSNQNNFVHDCVNITIKQHTVTTTTKGENFTETDVKMMERVVEQMCITQYERESQAYYQRGSSMVLFSSPPVILLISFLIFLIVGISADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 36);
MYRMQLLSCIALSLALVTNSISAMVRSPQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGVYMLGSAMISADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 37);
MYRMQLLSCIALSLALVTNSISAMVRSPQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHISADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 38);
MYRMQLLSCIALSLALVTNSISAMVRSKKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHISADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 39);
MYRMQLLSCIALSLALVTNSISAMVRSKKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGVYMLGSAMISADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 40); 및
MYRMQLLSCIALSLALVTNSISAMVRSTHSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGVYMLGSAMISADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 41).
일 실시예로, 상기 융합 단백질을 암호화하는 DNA을 제공한다.
일 실시예로, 상기 융합 단백질은 서열번호 21 내지 서열번호 26, 및 서열번호 36 내지 서열번호 41 중 선택된 서열로 표현되는 DNA.
본 명세서에서는 다음을 포함하는 프리온-Fc 영역 융합 단백질을 발현할 수 있는 벡터를 제공한다:
상기 융합 단백질을 암호화하는 DNA; 및
프로모터.
일 실시예로, 상기 벡터는 아데노-연관 바이러스(Adeno-Associate Virus)인 것을 특징으로 하는 벡터를 제공한다.
본 명세서에서는 다음을 포함하는 퇴행성 신경질환 치료용 약학적 조성물을 제공한다:
상기 융합 단백질 또는 제14항의 벡터; 및
약학적으로 허용되는 담체.
일 실시예로, 상기 퇴행성 신경질환은 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 루이바디병(Lewy bodies disease), 픽병(Pick's disease), 외상성 뇌병증(Traumatic encephalopathy), 근위축성 측삭경화증(Amyotrophic Lateral Sclerosis; ALS), 타우병증(Tauopathy), 전두측두엽치매(Frontotemporal dementia) 중 선택된 하나 이상인 약학적 조성물을 제공한다.
본 명세서에서는 다음을 포함하는 퇴행성 신경질환 치료방법을 제공한다:
상기 융합 단백질 또는 상기 벡터, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 대상의 중추 신경계에 투여하는 것.
일 실시예로, 상기 대상의 중추 신경계는 대상의 뇌 조직인 치료방법을 제공한다.
일 실시예로, 상기 대상의 뇌 조직은 흑색질(Substantia Nigra), 뇌실(Cerebral Ventricle), 및 선조체(Striatum) 중에서 선택되는 치료방법을 제공한다.
일 실시예로, 상기 조성물을 대상의 중추 신경계에 투여하는 것은 뇌내 주사(intracerebral injection), 및 뇌실내 주사(intracerebroventricular injection; ICV) 중 선택된 투여방법으로 투여하는 것인 치료방법을 제공한다.
본 명세서에서는 다음을 포함하는 대상 내의 신경독성을 가지는 단백질 응집체 제거방법을 제공한다:
상기 융합 단백질 또는 상기 벡터, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 상기 대상의 중추 신경계에 투여하는 것.
일 실시예로, 상기 대상의 중추 신경계는 대상의 뇌 조직인 방법을 제공한다.
일 실시예로, 상기 조성물을 대상의 중추 신경계에 투여하는 것은 뇌내 주사(intracerebral injection), 및 뇌실내 주사(intracerebroventricular injection; ICV) 중 선택된 투여방법으로 투여하는 것인 방법을 제공한다.
본 명세서에서는 다음을 포함하는 조성물의 퇴행성 신경질환 치료제 제조 용도를 제공한다:
상기 융합 단백질 또는 상기 벡터; 및
약학적으로 허용되는 담체.
본 명세서에서 제공하는 프리온-Fc 영역 융합 단백질, 또는 이를 발현할 수 있는 벡터를 사용하면 신경독성이 있는 단백질 응집체의 축적, 전파 및 신경세포 사멸을 방지하여 퇴행성 신경질환 치료 효과를 낼 수 있다.
도 1은 프리온-Fc 융합 단백질을 발현할 수 있는 벡터의 예시를 모식적으로 나타낸 것이다.
도 2는 실험예 1.1에 따라 제조된 프리온-Fc 융합 단백질을 발현할 수 있는 AAV 벡터에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과이다. 여기서, Mock은 대조군, pAAV-PrP-Fc는 프리온-Fc 융합 단백질을 발현할 수 있는 AAV 벡터, Anti-Fc는 Fc 영역에 결합할 수 있는 항체를 의미한다.
도 3은 실험예 2의 실험을 모식적으로 나타낸 것이다. 구체적으로 실험예 1.2에 따라 SH-SY5Y 세포를 준비하고, No treat(Comparative example 2.1), CM treat(Comparative example 2.2), PFF treat(Comparative example 2.3), 및 Pre-incubated PFF with CM(example 2.1)의 실시예를 나누어 세포 생존율 평가(실험예 2.2) 및 면역 형광 이미지 관찰(실험예 2.3)을 실시하는 것을 모식화하여 나타낸다.
도 4는 실험예 2.2에 따른 세포 생존율 평가(CCK-8) 결과를 나타낸 것이다. 여기서, 세로축은 CCK-8 분석에 따른 세포 생존율, No treat(Ctrl)은 Comparative example 2.1, CM only treat는 Comparative example 2.2, PFF only treat은 Comparative example 2.3, CM + PFF treat는 Example 2.1의 실험 결과를 의미한다.
도 5는 실험예 2.3에 따른 면역 형광 이미지를 나타낸 것이다. 도 5에서는 핵 염색 결과, 프리온-Fc 영역 융합 단백질 표지 형광, 및 알파-시뉴클린 염색 결과를 확인할 수 있다. 여기서, No treat(Ctrl)은 Comparative example 2.1, CM only treat는 Comparative example 2.2, PFF only treat은 Comparative example 2.3, CM + PFF treat는 Example 2.1의 실험 결과를 의미한다.
도 6은 실험예 2.3에 따른 면역 형광 이미지를 나타낸 것이다. 도 6에서는 알파-시뉴클린 염색 결과를 확인할 수 있다. 여기서, PFF only treat은 Comparative example 2.3, CM + PFF treat는 Example 2.1의 실험 결과를 의미한다.
도 7은 실험예 2.3에 따라, 알파-시뉴클린에 대한 형광 세기를 측정할 결과이다. 여기서, 세로축은 알파-시뉴클린의 염색 결과 형광 세기를 나타내고, α-syn PFF/Oligomer는 Comparative example 2.3, α-syn PFF/Oligomer + pAAV-PrP-Fc-EGFP CM은 Example 2.1의 실험 결과를 의미한다.
도 8은 실험예 3.2에 따라, 알파-시뉴클린 및 SIM-A9 세포의 핵에 대한 면역 형광 이미지를 나타낸다. 이때, PFF/Oligomer는 Comparative example 3.1 내지 3.7 (각 배양 시간 별)을 나타내고, PFF/Oligomer + pAAV-PrP-Fc-eGFP CM은 Example 3.1 내지 3.7 (각 배양 시간 별)을 나타낸다.
도 9는 실험예 3.2에 따라, 알파-시뉴클린 및 SIM-A9 세포의 핵에 대한 면역 형광 이미지를 나타낸다. 이때, PFF는 Comparative example 3.3을 나타내고, hPrP-CM+PFF는 Example 3.3을 나타내고, Iba1은 SIM-A9세포에 대한 면역 형광 이미지, pS129-α-Syn은 알파-시뉴클린에 대한 면역 형광 이미지를 나타낸다.
도 10은 실험예 3.3에 따라 SIM-A9 세포에 대한 활성을 평가한 결과이다. 여기서, 가로축은 배양 시간 (0.5, 1, 3, 5, 8, 10, 및 12시간), 세로축은 pS219 알파-시뉴클린에 대한 평균 형광 세기를 나타낸다. PFF/Oligomer는 Comparative example 3.3을 나타내고, PFF/Oligomer + pAAV-PrP-Fc-eGFP CM은 Example 3.3을 나타낸다.
도 11은 실험예 3.3에 따라 SIM-A9 세포 내부에서 측정되는 pS219 알파-시뉴클린에 대한 평균 형광 세기를 나타낸다. 여기서, PFF/Oligomer는 Comparative example 3.3을 나타내고, PFF/Oligomer + pAAV-PrP-Fc-eGFP CM은 Example 3.3을 나타낸다.
도 12는 실험예 4.2에 따라, 마우스에 대한 폴 테스트를 진행한 결과를 나타낸다. 여기서, 세로축은 마우스가 기둥 바닥에 도달하는 데 걸린 총 시간을 의미한다. WT는 Comparative example 4.1, LB는 Comparative example 4.2, LB + PrP-Fc (STR)는 Example 4.1, LB + PrP-Fc(ICV)는 Example 4.2, 및 LB + PrP-Fc (SNpc)는 Example 4.3을 나타낸다.
도 13은 실험예 4.4에 따른 마우스 뇌조직에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸다.
도 14는 실험예 4.5에 따른 마우스 뇌조직에 따른 면역 형광 이미지를 나타낸다. 구체적으로, 마우스 도파민성 뉴런(Dopaminergic neuron)에 대한 염색 결과를 나타낸다. WT는 Comparative example 4.1, LB는 Comparative example 4.2, LB + PrP-Fc (STR)는 Example 4.1, LB + PrP-Fc(ICV)는 Example 4.2, 및 LB + PrP-Fc (SNpc)는 Example 4.3을 나타낸다.
도 15는 실험예 4.5에 따른 마우스 뇌조직에 따른 면역 형광 이미지를 나타낸다. 구체적으로, 알파-시뉴클린에 대한 염색 결과를 나타낸다. WT는 Comparative example 4.1, LB는 Comparative example 4.2, LB - PrP-Fc는 Example 4.3을 나타낸다.
도 16은 실험예 4.5에 따라 면역 형광 염색 후 형광 세기를 측정한 결과이다. 여기서, 세로축은 마우스 도파민성 뉴런에 대한 형광 세기를 나타낸다. WT는 Comparative example 4.1, LB는 Comparative example 4.2, LB + PrP-Fc (STR)는 Example 4.1, LB + PrP-Fc(ICV)는 Example 4.2, 및 LB + PrP-Fc (SNpc)는 Example 4.3을 나타낸다.
도 17은 실험예 4.4에 따른 마우스 뇌조직에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과, 상대적인 TH 수준을 도시한 것이다. 여기서, 세로축은 도 13의 TH 수준을 Comparative example 4.1로 정규화(normalizing)한 결과이다. WT는 Comparative example 4.1, LB는 Comparative example 4.2, LB + PrP-Fc는 Example 4.3을 나타낸다.
도 18은 실험예 4.5에 따라 면역 형광 염색 후 형광 세기를 측정한 결과이다. 여기서, 세로축은 알파-시뉴클린에 대한 형광 세기를 나타낸다. WT는 Comparative example 4.1, LB는 Comparative example 4.2, LB + PrP-Fc는 Example 4.3을 나타낸다.
도 19는 실험예 4.4에 따른 마우스 뇌조직에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과, 상대적인 pS129-α-Syn 수준을 도시한 것이다. 여기서, 세로축은 도 13의 pS129-α-Syn 수준을 Comparative example 4.2로 정규화(normalizing)한 결과이다. WT는 Comparative example 4.1, LB는 Comparative example 4.2, LB + PrP-Fc는 Example 4.3을 나타낸다.
도 20은 실험예 4.4에 따른 마우스 뇌조직에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과, 상대적인 프리온 단백질 발현 수준을 도시한 것이다. 여기서, 세로축은 도 13의 hCD230(PrP)의 발현 수준을 나타낸다. WT는 Comparative example 4.1, LB는 Comparative example 4.2, LB + PrP-Fc는 Example 4.3을 나타낸다.
도 21은 실험예 5.2에 따라 인간 프리온 단백질 변형체 및 절편의 발현을 웨스턴 블롯 분석을 통해 확인한 결과이다. 여기서, WT는 서열번호 21, 서열번호 22, F2는 서열번호 23, F3은 서열번호 24, F4는 서열번호 25, F5는 서열번호 26의 프리온-Fc 영역 융합 단백질의 발현을 나타낸다.
도 22는 실험예 5.3에 따라 SH-SY5Y 세포에 대한 in vitro 효능을 평가한 결과를 나타낸다.
도 23은 실험예 6에 따라 1차 해마 뉴런 세포에 대한 세포 생존율 평가(CCK-8) 결과를 나타낸 것이다. 여기서, 세로축은 CCK-8 분석에 따른 세포 생존율, PBS는 Comparative example 6.1, a-syn PFF는 Comparative example 6.3, a-syn PFF + PrP(Full Length)-Fc는 Example 6.1, a-syn PFF + PrP(F4)-Fc는 Example 6.2를 의미한다.
도 24는 실험예 6에 따라 1차 해마 뉴런 세포에 대한 세포 생존율 평가(CCK-8) 결과를 나타낸 것이다. 여기서, 세로축은 CCK-8 분석에 따른 세포 생존율, PBS는 Comparative example 6.2, Tau PFF는 Comparative example 6.4, Tau PFF + PrP(Full Length)-Fc는 Example 6.3, Tau PFF + PrP(F4)-Fc는 Example 6.4를 의미한다.
용어의 정의
약
본 명세서에서 사용되는 "약"이라는 용어는 어떤 수량에 거의 가까운 정도를 의미하며, 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.
대상
본 명세서에서 사용되는 "대상"이라는 용어는 특정 물질(예를 들어, 펩타이드 등)에 노출되는 객체가 되는 유기체를 의미한다. 상기 대상은 인간, 동물 등의 독립적인 유기체를 의미할 수도 있고, 조직의 일부, 세포 등 상기 독립적인 유기체의 일부 구성을 의미할 수도 있다. 이러한 의미는 문맥에 따라 적절하게 해석될 수 있다. 또한, 상기 "대상"이라는 용어는 그 외 당업계 통상의 기술자에게 인식되는 의미를 모두 포함할 수 있다.
치료 또는 치료제
본 명세서에서 사용되는 "치료"라는 용어는 대상이 가진 질환, 질병, 장애, 및/또는 증상을 제거하거나, 완화하거나, 경감하거나, 억제하거나, 개선하거나, 상기 질환, 질병, 장애, 및/또는 증상을 예방하는 결과를 야기하는 직접, 간접적인 행동이나 조치를 통틀어서 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 "치료제"라는 용어는 대상에 적절한 방법으로 주어지는 경우, 상기 "치료" 효과를 보일 수 있는 각종 물질(예를 들어, 화합물 또는 펩타이드)을 의미한다. 또한, 상기 "치료" 또는 "치료제"라는 용어는 그 외 당업계 통상의 기술자에게 인식되는 의미를 모두 포함할 수 있다.
표준 아미노산
본 명세서에서 사용되는 "표준 아미노산(standard amino acid)"이라는 용어는 유기체의 체내에서 유전자의 전사 및 번역 과정을 통해 합성되는 20종의 아미노산을 통틀어 의미한다. 구체적으로, 상기 표준 아미노산은 알라닌(Alanine; Ala, A), 아르기닌(Arginine; Arg, R), 아스파라긴(Asparagine; Asn, N), 아스파르트산(Aspartic acid; Asp, D), 시스테인(Cysteine; Cys, C), 글루탐산(Glutamic acid; Glu, E), 글루타민(Glutamine; Gln, Q), 글리신(Glycine; Gly, G), 히스티딘(Histidine; His, H), 이소류신(Isoleucine; Ile, I), 류신(Leucine; Leu, L), 리신(Lysine; Lys K), 메티오닌(Methionine; Met, M), 페닐알라닌(Phenylalanine; Phe, F), 프롤린(Proline; Pro, P), 세린(Serine; Ser, S), 트레오닌(Threonine; Thr, T), 트립토판(Tryptophan; Trp, W), 티로신(Tyrosine; Tyr, Y), 및 발린(Valine; Val, V)을 포함한다. 상기 표준 아미노산 각각은 모두 대응하는 DNA 코돈이 존재하며, 일반적인 아미노산 일문자 또는 세문자 표기법으로 나타낼 수 있다. 상기 표준 아미노산이라는 용어가 지칭하는 대상은 문맥에 따라 적절하게 해석되어야 하며, 그 외 통상의 기술자가 인식할 수 있는 의미를 모두 포함한다.
펩타이드 서열 기재
달리 서술하지 않는 한, 본 명세서에서 펩타이드의 서열을 기재할 때는 아미노산 일문자 표기법, 또는 세문자 표기법을 사용하여, N-터미널에서 C-터미널 방향으로 기재한다. 예를 들어, ISA로 표기하는 경우, N-터미널에서 C-터미널 방향으로 이소류신(Isoleucine), 세린(Serine), 및 알라닌(Alanine)이 차례로 연결된 펩타이드를 의미한다. 또 다른 예를 들어, Met-Ala-Asn로 표기하는 경우, N-터미널에서 C-터미널 방향으로 메티오닌(Methionine), 알라닌(Alanine), 및 아스파라긴(Asparagine)이 차례로 연결된 펩타이드를 의미한다. 상기 일문자 표기법으로 나타낼 수 없는 아미노산의 경우, 다른 문자를 사용하여 표기하며, 추가적으로 보충하여 설명한다.
펩타이드를 구조식으로 표현할 때, N말단, 또는 C말단을 명확히 표기하기 위해 N- 및 -C를 사용하여 표기할 수 있으며, N말단 및/또는 C말단이라는 구분을 위해 밑줄로 표시할 수 있다. 예를 들어, 펩타이드 구조식을 N-B-T-A-C로 표기하는 경우, 달리 기재되지 않은 한, 맨 앞에 기재된 "N-" 및 맨 뒤에 기재된 "-C"는 N말단 및 C말단 방향을 명확히 하기 위한 기호이며, 이는 N-터미널에서 C-터미널 방향으로 B, T, A로 표시되는 서열이 연결된 펩타이드를 의미한다.
퇴행성 신경질환(Neurodegenerative disease)
퇴행성 신경질환 개괄
퇴행성 신경질환은 중추신경계의 신경세포가 오랜 시간에 걸쳐 악화되어 기능 이상과 장애를 가져오는 질병이다. 퇴행성 신경질환을 앓고 있는 환자는 신체의 운동조절능력, 인지기능, 지각기능, 감각기능, 기타 자율신경기능을 포함한 다양한 범위에 기능 이상을 보인다. 이러한 퇴행성 신경질환은 신경세포 이상이 나타난 뇌 부위, 및 주요 증상에 따라 구분되며, 대표적인 질환으로는 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 루이바디병(Lewy bodies disease), 픽병(Pick's disease), 외상성 뇌병증(Traumatic encephalopathy), 근위축성 측삭경화증(Amyotrophic Lateral Sclerosis; ALS), 타우병증(Tauopathy), 전두측두엽치매(Frontotemporal dementia)등이 있다.
퇴행성 신경질환의 발생 기전
퇴행성 신경질환의 발생 기전은 명확하게 밝혀지지 않았고, 활성산소 및 자유기에 의한 손상 (oxidative damage and free radical injury), 미토콘드리아 기능장애에 의한 에너지 장애 (mitochondrial dysfunction and energy failure), 신경세포 축삭의 운반 기능장애 (axonal transport defect), 신경염증기전 (neuroinflammation), 뇌신경세포 자멸사 (neuronal apoptosis), 세포 내 응집체의 축적 (intracellular aggregates accumulation), 단백질 응집체에 의한 세포 독성 (protein oligomer toxicity), 이상단백질 처리 시스템의 이상 (abnormal protein degradation system dysfunction) 등 다양한 기전이 복합적으로 작용하여 나타나는 것으로 이해되고 있다. 이 중, 신경독성(Neurotoxicity)을 가진 단백질 응집체(aggregated protein)의 세포 내 축적 및 전파, 및 이러한 단백질 응집체의 독성으로 인한 신경세포 사멸이 중요한 기전 중 하나로 지목되고 있다.
신경독성이 있는 단백질 응집체
상기 퇴행성 신경질환과 관련된 물질은 주로 단백질로, 체내에서 생리적으로 합성된 단량체의 경우 독성을 띄지 않는다. 상기 단백질이 생체 내에서 미스폴딩(misfolding)이 일어나 아이소타입이 형성되는 경우, 혹은 체내에 축적되고 응집되어 올리고머(Oligomer), 원섬유(protofibril), 섬유(fibril), 및/또는 루이바디(Lewybody)를 이루는 경우 신경독성(Neurotoxicity)을 나타내게 되며, 퇴행성 신경질환의 발생과 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져있다. 단백질 응집체를 이루는 경우 신경독성을 나타내는 대표적인 단백질은 알파-시뉴클린(α-synuclein), 아밀로이드 베타(Amyloid beta), 타우(Tau), TDP-43 및 프리온(Prion) 등이 있으며, 최근 문헌들에서는 이들 단백질 응집체 여러 종류가 동시에 발견되는 사례가 많다.
퇴행성 신경질환을 치료하는 중요한 전략으로 이러한 신경독성을 가지는 단백질 응집체의 축적을 방지하고, 이미 축적된 단백질 응집체를 제거하는 전략이 제시되고 있다.
종래 기술의 한계점
세포 치료 요법(Cell Therapy)의 한계점
상기 퇴행성 신경질환에 대한 치료법 중 하나로, 외부에서 건강한 신경세포를 공급하여 중추신경계를 치료하고자 하는 세포 치료 요법이 있다. 세포 치료 요법은 다양한 유래의 줄기세포(예를 들어, 역-분화 줄기세포, 배아줄기세포, 및 인간 단위생식 줄기세포 등)를 목적하는 신경세포(예를 들어, 신경줄기세포, 신경 전구세포, 도파민 신경세포 등)로 분화시켜 환자의 중추신경계에 직접 이식하여 중추신경계를 치료하는 방법이다. 이는 손상된 중추신경계를 외부 세포 이식을 통해 직접적으로 회복시킬 수 있다는 장점이 있지만, 1) 퇴행성 뇌질환의 특성상 세포독성을 나타내는 단백질 응집체가 있는 환경에서 세포 engraftment의 어려움, 2) 혈액-뇌 장벽(Blood-Brain Barrier; BBB)을 외부 세포가 투과하기 힘들어 뇌에 직접 이식해야 하는 어려움, 3) 외부 세포가 이식된 부위에 저산소증(Hypoxia)이 발생하는 등 영양 공급이 원할하지 않아 외부 세포가 증식하지 못하고 사멸하는 문제, 및 4) 외부 세포에 대해 환자의 면역 반응이 일어나 외부 세포가 사멸하는 문제등이 한계점으로 작용한다.
항체 치료 요법의 한계점
상기 퇴행성 신경질환에 대한 또 다른 치료법으로, 전술한 신경독성이 있는 단백질 응집체에 특이적으로 결합하는 항체를 환자에게 투여하여 상기 단백질 응집체의 축적을 방지하고, 이를 제거하려는 항체 치료 요법이 있다. 상기 항체 치료 요법은 높은 특이성으로 신경독성이 있는 단백질 응집체에 작용한다는 장점이 있지만, 1) 단일 단백질 응집체 타겟팅으로 다양한 종류의 단백질 응집체가 발견되는 퇴행성 뇌질환 치료는 어렵다는 한계점 2) 상기 항체가 혈액-뇌 장벽을 투과하기 어렵다는 문제점, 및 3) 투여되는 항체로 인해 전신 부작용(systemic side-effect)이 일어나는 문제 등이 있다.
프리온-Fc 영역 융합 단백질
프리온-Fc 영역 융합 단백질 개괄
본 명세서에서는 프리온-Fc 영역 융합 단백질을 개시한다. 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질은 인간 프리온 단백질 및 면역글로불린의 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질이다. 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질은 전술한 신경독성이 있는 단백질 응집체에 작용하여 이를 제거하는 기능을 할 수 있다. 이하 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질의 구조에 대해 자세히 설명한다.
프리온-Fc 영역 융합 단백질 구조 1 - 일반적 표현
상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질은 인간 프리온 단백질 및 Fc 영역을 포함한다. 상기 인간 프리온 단백질은 인간 프리온 단백질 전체, 상기 인간 프리온 단백질 절편, 상기 인간 프리온 단백질 변이체, 및/또는 상기 인간 프리온 단백질 변이체의 절편을 의미한다. 상기 Fc 영역은 인간 면역글로불린의 crystalizable fragment를 의미한다.
일 구현예로, 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질은 펩타이드 서열의 N 말단부터 C 말단 방향으로, 상기 인간 프리온 단백질 및 상기 Fc 영역이 차례로 연결된 것이다. 여기서, 상기 인간 프리온 단백질의 C 말단 및 상기 Fc 영역의 N 말단은 펩타이드 링커를 통해 연결되어 있을 수 있다.
또 다른 구현예로, 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질은 펩타이드 서열의 N 말단부터 C 말단 방향으로, 분비 신호 펩타이드, 상기 인간 프리온 단백질, 및 상기 Fc 영역이 차례로 연결된 것이다. 여기서, 상기 분비 신호 펩타이드의 C 말단 및 상기 인간 프리온 단백질의 N 말단, 상기 인간 프리온 단백질의 C 말단 및 상기 Fc 영역의 N 말단은 각각 펩타이드 링커를 통해 연결되어 있을 수 있다.
프리온-Fc 영역 융합 단백질 구조 2 - 구조식 표현
일 구현예로, 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질은 다음 [화학식 1]로 표현될 수 있다:
[화학식 1] hPrP - L - Fc
여기서, 상기 [화학식 1]은 단백질의 N말단에서 C말단 순서로 표기한 것이며,
상기 hPrP는 인간 프리온 단백질 전체, 인간 프리온 단백질 절편, 인간 프리온 단백질 변이체, 및/또는 인간 프리온 단백질 변이체의 절편이고,
상기 L은 링커, 또는 부존재하고,
상기 Fc는 인간 면역글로불린의 Fc 영역이다.
일 구현예로, 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질은 다음 [화학식 2]로 표현될 수 있다:
[화학식 2] S - L1 - hPrP - L2 - Fc
여기서, 상기 S는 분비 신호 펩타이드(Secretion Signal Peptide), 또는 부존재하고,
상기 L1은 제1 링커, 또는 부존재하고,
상기 hPrP는 인간 프리온 단백질 전체, 인간 프리온 단백질 절편, 인간 프리온 단백질 변이체, 및/또는 인간 프리온 단백질 변이체의 절편이고,
상기 L2는 제2 링커, 또는 부존재하고,
상기 Fc는 인간 면역글로불린의 Fc 영역이다.
프리온-Fc 영역 융합 단백질의 특징 1 - 프리온 단백질, 절편, 또는 그 변이체 사용
상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질은 인간 프리온 단백질 전체, 그 절편, 및/또는 그 변이체를 포함하는 것이 특징이다. 상기 인간 프리온 단백질은 신경독성을 가지는 단백질 응집체에 결합하는 특징이 있다. 상기 신경독성을 가지는 단백질 응집체는, 예를 들어 올리고머화된(oligomerized), 섬유화된(fibrilized), 또는 루이바디(Lewy body)를 구성한 단백질로, 알파-시뉴클린(α-synuclein), 아밀로이드 베타(Amyloid beta), 타우(Tau), TDP-43 및/또는 프리온(Prion)일 수 있다. 또한, 상기 인간 프리온 단백질은 알파-시뉴클린(α-synuclein), 아밀로이드 베타(Amyloid beta), 타우(Tau), TDP-43 및/또는 프리온(Prion) 단백질이 단량체 형태 - 즉, 생리학적 단량체(physiological monomer)로, 독성을 보이지 않는 상태 - 일 때는 결합하지 않는다는 특징이 있다. 따라서, 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질은 상기 신경독성이 있는 단백질 응집체에 선택적으로 작용할 수 있다는 장점을 지닌다.
프리온-Fc 영역 융합 단백질의 특징 2 - 여러 종류의 단백질 응집체에 작용 가능
상기 인간 프리온 단백질은 전술한 신경독성을 가지는 여러 종류의 단백질 응집체와 결합할 수 있다는 특징이 있다. 따라서, 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질은 복수의 신경독성이 있는 단백질 응집체를 표적함으로써, 퇴행성 신경질환에서 나타날 수 있는 복수의 단백질 응집체를 타겟할 수 있으며, 다양한 퇴행성 신경질환의 치료에 효과를 보일 수 있다는 장점을 지닌다.
프리온-Fc 영역 융합 단백질의 특징 3 - Fc 영역에 의한 대식작용(phagocytosis) 유도 효과
상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질은 면역글로불린의 Fc 영역을 포함하는 것이 특징이다. 상기 Fc 영역은 대식세포, 예를 들어 매크로파지(Macrophage) 및/또는 미세아교세포(Microglia)의 대식작용(Phagocytosis)을 유도하는 기능을 한다. 전술한 바, 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질에 포함된 인간 프리온 단백질은 신경독성이 있는 단백질 응집체에 결합할 수 있으므로, 결과적으로 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질은 상기 단백질 응집체에 대한 대식세포의 대식작용을 유도하여 이를 효과적으로 제거할 수 있다.
프리온-Fc 영역 융합 단백질의 특징 4 - Fc 영역에 의한 반감기 증대 효과
상기 Fc 영역은 세포 표면의 FcRn (Fc Receptor neonate)과 결합해 재순환될 수 있으며, 이는 체내에서 반감기를 연장시키는 기능을 가진다. 따라서, 약물 분자 등을 상기 Fc 영역과 연결시키는 경우, 상기 약물 분자를 단독으로 투여할 때보다 체내 반감기가 향상되는 결과를 얻을 수 있다. 본 명세서에서 제공하는 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질은 Fc 영역이 융합된 단백질이므로, 전술한 Fc 영역의 기능으로 인해 체내 반감기가 매우 길다는 장점을 가진다.
프리온-Fc 영역 융합 단백질의 특징 5 - 프리온-Fc 영역 융합 단백질 발현 벡터 사용 가능
퇴행성 뇌질환 치료 방법에 있어, 약물을 혈액-뇌 장벽(Blood-Brain Barrier; BBB)를 통과시켜 대상의 뇌에 전달하는 것이 중요한 과제이다. 일반적으로 분자량이 큰 약물 분자는 혈액-뇌 장벽을 통과하기 어려운 것으로 알려져 있는데, 이를 통과하기 위한 다양한 전략들이 개발되어 있다. 단백질, 펩타이드, 및/또는 핵산과 같은 바이오재료로 구성된 약물에 대해, 상기 혈액-뇌 장벽을 통과하기 위한 전략 중 하나가 혈액-뇌 장벽을 통과할 수 있는 발현 벡터를 투여하는 것이다. 본 명세서에서 제공하는 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질은 표준 아미노산으로 구성된 단백질이므로 이를 암호화하는 핵산을 구성할 수 있으며, 따라서 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질을 발현시킬 수 있는 발현 벡터를 구성하여 사용할 수 있는 것이 특징이다. 따라서, 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질은 벡터로 제조하여, 혈액-뇌 장벽을 통과하는 다양한 전략을 이용할 수 있다는 장점을 지닌다.
프리온-Fc 영역 융합 단백질 서열 예시
일 구현예로, 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질은 다음 중 선택된 서열로 표현될 수 있다:
MANLGCWMLVLFVATWSDLGLCKKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAMSRPIIHFGSDYEDRYYRENMHRYPNQVYYRPMDEYSNQNNFVHDCVNITIKQHTVTTTTKGENFTETDVKMMERVVEQMCITQYERESQAYYQRGSSMVLFSSPPVILLISFLIFLIVGISADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 21);
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KKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGGYVLGSAMISADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 32);
PQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGGYVLGSAMISADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 33);
THSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGGYVLGSAMISADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 34); 및
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MYRMQLLSCIALSLALVTNSISAMVRSMANLGCWMLVLFVATWSDLGLCKKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAMSRPIIHFGSDYEDRYYRENMHRYPNQVYYRPMDEYSNQNNFVHDCVNITIKQHTVTTTTKGENFTETDVKMMERVVEQMCITQYKRESQAYYQRGSSMVLFSSPPVILLISFLIFLIVGISADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 50).
프리온 단백질
프리온 단백질의 기능
본 명세서에서 개시하는 프리온-Fc 영역 융합 단백질은 인간 프리온 단백질을 포함한다. 상기 인간 프리온 단백질은 퇴행성 신경질환과 관련된 단백질 응집체와 결합할 수 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질에 포함된 인간 프리온 단백질 부분은 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질을 신경독성이 있는 단백질 응집체와 결합시키는 기능을 하며, 이에 따라 목적하는 효과를 낼 수 있도록 한다.
일 구현예로, 상기 인간 프리온 단백질은 알파-시뉴클린(α-synuclein) 응집체, 아밀로이드 베타(Amyloid beta) 응집체, 타우(Tau) 응집체, TDP-43 응집체 및/또는 프리온(Prion) 응집체와 결합하는 기능을 가진다. 일 예로, 상기 응집체는 올리고머(Oligomer), 프로토피브릴(Protofibril), 피브릴(Fibril), 및/또는 루이바디(Lewy body) 형태일 수 있다.
인간 프리온 단백질
본 명세서에서 개시하는 프리온-Fc 영역 융합 단백질은 프리온 단백질 중 인간에게서 발견되는 프리온 단백질을 포함하는 것을 특징으로 한다. 프리온 단백질은 인간 뿐 아니라 다른 동물들에게서도 발견되며, 상기 프리온 단백질은 종 별로 그 서열이 다른 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 마우스 프리온 단백질(MoPrP) 및 인간 프리온 단백질(hPrP)는 같은 프리온 단백질로 분류되지만, 그 아미노산 서열은 상이하다. 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질은 인간에 대한 치료 용도로 사용하는 것이 목적이므로, 인간에게서 발견되는 프리온 단백질 서열을 포함해야 한다. 상기 프리온 단백질이 인간에게서 발견되는 인간 프리온 단백질이 아니라 다른 종의 프리온 단백질인 경우, 1) 상기 프리온 단백질이 인간에 대해 신경독성이 있는 단백질 응집체와 특이적으로 결합하지 못할 가능성이 있고, 2) 상기 프리온 단백질이 "외부 유래"의 단백질이므로, 인간 체내에 투여되는 경우 면역반응이 일어나는 등, 부작용이 있을 수 있다. 따라서, 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질은 인간 프리온 단백질을 포함하는 것을 특징으로 한다.
일 구현예로, 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질은 인간에게서 발견되는 정상 프리온 단백질(PrPC)을 포함할 수 있다.
인간 프리온 단백질 서열 예시
일 구현예로, 상기 인간 프리온 단백질은 MANLGCWMLVLFVATWSDLGLCKKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAMSRPIIHFGSDYEDRYYRENMHRYPNQVYYRPMDEYSNQNNFVHDCVNITIKQHTVTTTTKGENFTETDVKMMERVVEQMCITQYERESQAYYQRGSSMVLFSSPPVILLISFLIFLIVG (서열번호 1)일 수 있다.
인간 프리온 단백질의 절편
상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질에서 프리온 단백질을 사용하는 것은, 상기 프리온 단백질이 신경독성이 있는 단백질 응집체와 결합하는 기능을 활용하기 위함이다. 따라서, 상기 프리온 단백질 중 상기 신경독성이 있는 단백질 응집체와 결합하는 역할을 하는 부분만을 사용해도 무방하다. 일 구현예로, 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질은 인간 프리온 단백질의 절편을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 인간 프리온 단백질의 절편은 상기 인간 프리온 단백질 중 상기 퇴행성 신경질환의 원인이 되는 병원성 물질과 결합할 수 있는 부분이다.
인간 프리온 단백질의 절편 예시
일 구현예로, 상기 인간 프리온 단백질의 절편은 서열번호 1의 인간 프리온 단백질의 51번째 아미노산부터 111번째 아미노산으로 구성된 절편일 수 있다. 일 구현예로, 상기 인간 프리온 단백질의 절편은 서열번호 1의 인간 프리온 단백질의 51번째 아미노산부터 134번째 아미노산으로 구성된 절편일 수 있다. 일 구현예로, 상기 인간 프리온 단백질의 절편은 서열번호 1의 인간 프리온 단백질의 23번째 아미노산부터 111번째 아미노산으로 구성된 절편일 수 있다. 일 구현예로, 상기 인간 프리온 단백질의 절편은 서열번호 1의 인간 프리온 단백질의 23번째 아미노산부터 134번째 아미노산으로 구성된 절편일 수 있다. 일 구현예로, 상기 인간 프리온 단백질의 절편은 서열번호 1의 인간 프리온 단백질의 95번째 아미노산부터 134번째 아미노산으로 구성된 절편일 수 있다.
인간 프리온 단백질의 절편 서열 예시
일 구현예로, 상기 인간 프리온 단백질의 절편은 PQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKH (서열번호 2), PQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAM (서열번호 3), KKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKH (서열번호 4), KKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAM (서열번호 5), 및 THSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAM (서열번호 6) 중 선택된 것일 수 있다.
인간 프리온 단백질 및 그 절편의 변이체
상기 프리온 단백질은 인간 프리온 단백질의 변이체, 인간 프리온 단백질 변이체의 절편, 및/또는 인간 프리온 단백질 절편의 변이체일 수 있다. 상기 프리온 단백질의 변이체는 자연계에서 발견되는 프리온 단백질의 아미노산 서열 중 전부 또는 일부가 변형된 것이다. 상기 프리온 단백질의 변이체는 상기 자연계에서 발견되는 프리온 단백질과 비교해 특정 기능 또는 성질이 부가, 제거, 및/또는 개선된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 프리온 단백질의 변이체는 상기 자연계에서 발견되는 프리온 단백질과 비교해 체내에 축적될 경우 독성을 띄는 성질이 제거된 것일 수 있다.
인간 프리온 단백질 및 그 절편의 변이체 예시
일 구현예로, 상기 인간 프리온 단백질 및 그 절편의 변이체는 서열번호 1의 인간 프리온 단백질의 아미노산 서열 중 127번째 G를 V로 변형한 단백질, 또는 상기 변형된 아미노산을 포함하는 절편일 수 있다. 일 구현예로, 상기 인간 프리온 단백질 및 그 절편의 변이체는 서열번호 1의 인간 프리온 단백질의 아미노산 서열 중 129번째 M를 V로 변형한 단백질, 또는 상기 변형된 아미노산을 포함하는 절편일 수 있다. 일 구현예로, 상기 인간 프리온 단백질 및 그 절편의 변이체는 서열번호 1의 인간 프리온 단백질의 아미노산 서열 중 219번째 E를 K로 변형한 단백질, 또는 상기 변형된 아미노산을 포함하는 절편일 수 있다.
인간 프리온 단백질 및 그 절편의 변이체 서열 예시
일 구현예로, 상기 인간 프리온 단백질 및 그 절편의 변이체는 MANLGCWMLVLFVATWSDLGLCKKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGVYMLGSAMSRPIIHFGSDYEDRYYRENMHRYPNQVYYRPMDEYSNQNNFVHDCVNITIKQHTVTTTTKGENFTETDVKMMERVVEQMCITQYERESQAYYQRGSSMVLFSSPPVILLISFLIFLIVG (서열번호 7), PQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGVYMLGSAM (서열번호 8), KKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGVYMLGSAM (서열번호 9), THSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGVYMLGSAM (서열번호 10), MANLGCWMLVLFVATWSDLGLCKKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGGYVLGSAMSRPIIHFGSDYEDRYYRENMHRYPNQVYYRPMDEYSNQNNFVHDCVNITIKQHTVTTTTKGENFTETDVKMMERVVEQMCITQYERESQAYYQRGSSMVLFSSPPVILLISFLIFLIVG (서열번호 11), KKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGGYVLGSAM (서열번호 12), PQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGGYVLGSAM (서열번호 13), THSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGGYVLGSAM (서열번호 14), 및 MANLGCWMLVLFVATWSDLGLCKKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAMSRPIIHFGSDYEDRYYRENMHRYPNQVYYRPMDEYSNQNNFVHDCVNITIKQHTVTTTTKGENFTETDVKMMERVVEQMCITQYKRESQAYYQRGSSMVLFSSPPVILLISFLIFLIVG (서열번호 15) 중 선택된 것일 수 있다.
Fc 영역
Fc 영역의 기능
본 명세서에서 개시하는 프리온-Fc 영역 융합 단백질은 면역글로불린의 Fc 영역을 포함한다. 상기 Fc 영역은 대식세포(Macrophage) 및/또는 미세아교세포(Microglia)의 Fc 수용체(Fc receptor)와 결합하여 대식작용(Phagocytosis)을 유도하는 기능을 가진다. 또한, 상기 Fc 영역은 세포 표면의 FcRn (Fc Receptor neonate)과 결합해 재순환될 수 있으며, 이는 결과적으로 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질의 반감기를 증대시키는 효과를 나타낸다. 결론적으로, 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질에 포함된 Fc 영역은 1) 상기 융합 단백질이 결합한 대상 (신경독성이 있는 단백질 응집체)의 제거를 유도하는 기능, 및 2) FcRn을 통한 재순환 작용으로 체내서에 안정적으로 머무를 수 있도록 하는 기능을 한다.
Fc 영역 예시
본 명세서에서 개시하는 프리온-Fc 영역 융합 단백질에 포함된 상기 Fc 영역은 전술한 목적을 달성하기 위한 것이라면 크게 제한되지 않는다.
일 구현예로, 상기 Fc 영역은 인간 면역글로불린 단백질의 Fc 영역일 수 있다. 구체적으로, 상기 Fc 영역은 인간 면역글로불린 G의 Fc 영역일 수 있다. 더 구체적으로, 상기 Fc 영역은 인간의 IgG1, IgG2, IgG3, 및/또는 IgG4에서 유래한 Fc 영역일 수 있다.
또 다른 구현예로, 상기 Fc 영역은 인간 면역글로불린 단백질의 Fc 영역의 변이체일 수 있다. 상기 Fc 영역의 변이체는 자연계에서 발견되는 인간 면역글로불린 단백질의 Fc 영역과 비교해, 그 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산이 제거, 부가, 및/또는 치환된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 Fc 영역은 인간의 IgG1, IgG2, IgG3, 및/또는 IgG4에서 유래한 Fc 영역의 변이체일 수 있다.
또 다른 구현예로, 상기 Fc 영역은 마우스 면역글로불린 단백질의 Fc 영역일 수 있다. 구체적으로, 상기 Fc 영역은 마우스 면역글로불린 G의 Fc 영역일 수 있다. 더 구체적으로, 상기 Fc 영역은 마우스 IgG1, IgG2, IgG3, 및/또는 IgG4에서 유래한 Fc 영역일 수 있다.
또 다른 구현예로, 상기 Fc 영역은 마우스 면역글로불린 단백질의 Fc 영역의 변이체일 수 있다. 상기 Fc 영역의 변이체는 자연계에서 발견되는 마우스 면역글로불린 단백질의 Fc 영역과 비교해, 그 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산이 제거, 부가, 및/또는 치환된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 Fc 영역은 마우스의 IgG1, IgG2, IgG3, 및/또는 IgG4에서 유래한 Fc 영역의 변이체일 수 있다.
Fc 영역 서열 예시
일 구현예로, 상기 Fc 영역은 다음 서열로 표현될 수 있다:
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 16); 및
PPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (서열번호 51).
기타 구성
기타 구성 개괄
본 명세서에서 개시하는 프리온-Fc 영역 융합 단백질은 프리온 단백질 및 Fc 영역 외 기타 구성을 추가로 포함할 수 있다. 상기 기타 구성은 예를 들어, 각각의 구성을 연결하기 위한 링커 펩타이드, 벡터 형태로 세포 내에서 발현시킬 때 중요한 기능을 하는 분비 신호 펩타이드 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
분비 신호 펩타이드
상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질은 분비 신호 펩타이드를 포함할 수 있다. 상기 분비 신호 펩타이드는 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질을 세포 내에서 발현시키고자 할 때, 상기 세포가 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질을 세포 밖으로 분비하도록 하는 신호 역할을 한다. 상기 분비 신호 펩타이드는 전술한 기능을 하는 펩타이드라면 특별히 제한되지 않는다. 일 구현예로, 상기 분비 신호 펩타이드는 공지된 분비 신호 펩타이드일 수 있다. 일 구현예로, 상기 분비 신호 펩타이드는 체내에서 분비되는 단백질의 분비신호 펩타이드일 수 있다. 일 구현예로, 상기 분비 신호 펩타이드는 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질의 N 말단쪽에 위치할 수 있다. 또 다른 구현예로, 상기 분비 신호 펩타이드는 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질의 C 말단쪽에 위치할 수 있다.
분비 신호 펩타이드 예시
일 구현예로, 상기 분비 신호 펩타이드는 MYRMQLLSCIALSLALVTNS(서열번호 17), MAFLWLLSCWALLGTTFG(서열번호 52), 및 MNLLLILTFVAAAVA(서열번호 53) 중 선택된 서열로 표현될 수 있다.
링커
상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질은 링커를 포함할 수 있다. 상기 링커는 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질에 포함된 각 부분을 연결하는 기능을 하는 펩타이드라면 특별히 제한되지 않는다.
일 구현예로, 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질에 포함된 인간 프리온 단백질 및 Fc 영역은 링커를 통해 연결되어 있을 수 있다. 일 구현예로, 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질은 상기 분비 신호 펩타이드와 링커를 통해 연결되어 있을 수 있다.
일 구현예로, 상기 링커는 공지문헌 Fusion Protein Linkers: Property, Design and Functionality, Chen et al., 2013, Advanced Drug Delivery Reviews, Vol. 65에 개시된 링커, 또는 상기 문헌에서 개시된 방법으로 설계된 링커일 수 있다.
링커 예시
일 구현예로, 상기 링커는 다음 중 선택된 서열로 표현될 수 있다:
ISA; ISAMVRS(서열번호 18); (G)n; (GGGGS)n (서열번호 19); (EAAAK)n (서열번호 20); 및 (XP)n,
여기서, n은 1 이상의 정수이고, X는 임의의 표준 아미노산을 의미한다.
프리온-Fc 영역 융합 단백질을 발현할 수 있는 벡터
프리온-Fc 영역 융합 단백질을 발현할 수 있는 벡터 개괄
본 명세서에서는 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질을 발현할 수 있는 벡터를 개시한다. 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질을 외부에서 제조하여 대상의 체내에 투여할 수도 있지만, 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질을 발현할 수 있는 벡터를 대상의 체내에 투여하여, 대상의 세포가 직접 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질을 생산, 분비하게 할 수도 있다. 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질을 발현할 수 있는 벡터는 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질을 암호화하는 핵산, 및 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질을 발현시키기 위한 추가 구성, 예를 들어, 프로모터 서열 등을 포함한다.
프리온-Fc 영역 융합 단백질을 암호화하는 핵산
상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질을 발현할 수 있는 벡터는 프리온-Fc 영역 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 포함한다. 이때, 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질은 위에서 설명된 것과 같다.
일 구현예로, 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질을 암호화하는 핵산은 "프리온-Fc 영역 융합 단백질 서열 예시" 단락에 개시된 프리온-Fc 영역 융합 단백질을 암호화하는 것일 수 있다. 일 구현예로, 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질을 암호화하는 핵산은 "프리온-Fc 영역 융합 단백질 서열 예시" 단락에 개시된 프리온-Fc 영역 융합 단백질의 C말단 또는 N말단에 분비 신호 펩타이드가 연결된 단백질을 암호화하는 것일 수 있다.
프리온-Fc 영역 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열 예시
일 구현예로, 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 다음 서열을 포함할 수 있다:
벡터 추가 구성
상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질을 발현할 수 있는 벡터는 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질을 암호화하는 핵산이 대상 세포 내에서 단백질로 번역될 수 있도록 하는 추가 구성을 포함한다. 상기 추가 구성은 예를 들어, 조절/제어 구성요소, 프로모터, 전사종결신호 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구현예로, 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질을 발현할 수 있는 벡터는 프로모터를 포함한다. 일 예로, 상기 프로모터는 세포 종류에 특이적인 프로모터일 수 있다. 구체적으로, 상기 프로모터는 뉴론, 상피세포(epithelial cell), 또는 뇌실막세포(ependymal cell) 특이적인 프로모터일 수 있다. 또 다른 예로, 상기 프로모터는 특정 기능을 가지는 프로모터일 수 있다. 구체적으로, 상기 프로모터는 약물-유도성 프로모터(drug-inducible promoter), 염증-유도성 프로모터(inflammation-inducible promoter)일 수 있다.
핵산 종류
상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질을 암호화하는 핵산, 및/또는 상기 융합 단백질을 발현하기 위한 추가 구성 핵산은 세포 내에서 전술한 목적을 달성할 수 있다면, 그 종류가 특별히 제한되지 않는다. 일 구현예로, 상기 핵산은 DNA, mRNA, 및 화학적으로 변형된 핵산 중 선택된 것일 수 있다.
벡터 형태 1 - 일반적인 형태
상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질을 발현할 수 있는 벡터는, 전술한 구성을 포함하는 것으로, 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질을 발현할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않는다. 일 구현예로, 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질을 발현할 수 있는 벡터는 플라스미드, 파지, 네이키드 DNA, DNA 복합체, mRNA, 및 바이러스 벡터 중 선택된 형태일 수 있다. 여기서, 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 백시니아바이러스, 폭스바이러스 및 단순포진 바이러스 중에서 선택된 것일 수 있다.
벡터 형태 2 - 아데노-연관 바이러스
일 구현예로, 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질을 발현할 수 있는 벡터는 아데노-연관 바이러스 형태일 수 있다. 일 구현예로, 상기 아데노-연관 바이러스는 혈액-뇌 장벽 투과성을 가지도록 항원형(Serotype)이 변형된 것일 수 있다. 일 구현예로, 상기 아데노-연관 바이러스는 대상 세포 특이적으로 형질감염 될 수 있도록 항원형(Serotype)이 변형된 것일 수 있다. 구체적으로 상기 대상 세포는 뉴론, 상피세포(epithelial cell), 및 뇌실막세포(ependymal cell) 중 선택된 것일 수 있다. 일 구현예로, 상기 아데노-연관 바이러스는 중추 신경계(Central Nervous System;CNS)에 더 잘 감염될 수 있도록 그 캡시드 표면이 엔지니어링 된 것일 수 있다. 일 구현예로, 상기 아데노-연관 바이러스는 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV8, 및 AAV9 중 선택된 항원형(Serotype)일 수 있다.
프리온-Fc 영역 융합 단백질 또는 이를 발현할 수 있는 벡터를 포함하는 조성물
프리온-Fc 영역 융합 단백질 또는 이를 발현할 수 있는 벡터를 포함하는 조성물 개괄
본 명세서에서는 프리온-Fc 영역 융합 단백질, 또는 이를 발현할 수 있는 벡터를 포함하는 조성물을 개시한다. 상기 조성물은 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질, 또는 이를 발현할 수 있는 벡터를 다양한 목적으로 사용하기 위해 적절히 제제화하거나, 제형화하거나, 및/또는 부가적인 물질을 포함시킨 것이다.
조성물의 제제화 형태
일 구현예로, 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질, 또는 이를 발현할 수 있는 벡터를 포함하는 조성물은 경구 투여 용도, 주사제 용도, 점막 투여 용도, 경피 투여 용도, 및/또는 국소 피부 투여 용도로 제제화된 것일 수 있다. 일 구현예로, 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질, 또는 이를 발현할 수 있는 벡터를 포함하는 조성물은 주사제 용도로 제제화된 것일 수 있다. 구체적으로 상기 조성물은 뇌혈관 주사 용도로 제제화된 것일 수 있다.
프리온-Fc 영역 융합 단백질을 제제화하기 위한 구성
일 구현예로, 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질은 트로키제 (troches), 로젠지 (lozenge), 정제, 수용성 현탁액, 유성 현탁액, 조제 분말, 과립, 에멀젼, 하드 캡슐, 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제로 제제화될 수 있다. 일 구현예로, 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질을 경구 투여용으로 제제화하기 위해, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴 등과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트 등과 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분 등과 같은 붕해제; 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴 푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌 글리콜 왁스 등과 같은 윤활유 등을 사용할 수 있으며, 감미제, 방향제, 시럽제 등도 사용할 수 있다. 나아가 캡슐제의 경우에는 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체 등을 추가로 사용할 수 있다. 일 구현예로, 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질은 주사액, 좌제, 호흡기 흡입용 분말, 스프레이용 에어로졸제, 연고, 도포용 파우더, 오일, 크림으로 제제화될 수 있다. 일 구현예로, 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질을 비경구 투여용으로 제제화하기 위해, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조 제제, 외용제 등을 사용할 수 있으며, 상기 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 일 구현예로, 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질을 주사액으로 제제화하기 위해, 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다. 일 구현예로, 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질 에 추진제 등을 첨가제와 함께 배합하여 수분산된 농축물, 또는 습윤 분말을 제조하여 에어로졸제로 제제화할 수 있다. 일 구현예로, 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질을 경피용으로 제제화하는 경우, 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질에 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화 아연 등을 담체로 첨가하여 연고, 크림, 도포용 파우더, 오일, 피부 외용제 등을 제조할 수 있다.
프리온-Fc 영역 융합 단백질을 발현할 수 있는 벡터를 제제화하기 위한 구성
상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질을 발현할 수 있는 벡터는 통상의 기술자가 공지된 방법으로 제제화한 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 제제화 된 프리온-Fc 영역 융합 단백질을 발현할 수 있는 벡터는 다음 중 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다: 네이키드 핵산(naked nucleic acid); 양이온성 펩티드-복합 핵산(Protamine); 양전하를 띠는 oil-water 양이온 나노에멀젼(Cationic nanoemulsion); 화학적으로 변형된 덴드리머와 결합되고, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol) 및 PEG-지질과 복합체화 된 핵산(Modified dendrimer nanoparticle); PEG-지질 나노 입자에서 프로타민과 복합된 핵산(Protamine liposome); polyethylenimine, PEI와 같은 양이온성 중합체와 복합된 핵산(Cationic polymer); PEI 및 지질 성분과 같은 양이온성 중합체와 복합된 핵산(Cationic polymer liposome); 키토산 같은 다당류 중합체와 복합된 핵산(Polysaccharide particle); 양이온성 지질 나노 입자 중합체와 복합된 핵산(Cationic lipid nanoparticle); 양이온성 지질 및 콜레스테롤과 복합된 핵산(Cationic lipid-cholesterol nanoparticle); 및 양이온성 지질 및 콜레스테롤 및 PEG-지질과 복합체화 된 핵산(Cationic lipid-cholesterol-PEG nanoparticle).
일 구현예로, 상기 제제화 된 프리온-Fc 영역 융합 단백질을 발현할 수 있는 벡터는 지질 나노 입자(lipid nanoparticles; LNP)를 포함할 수 있다. 상기 구현예에서, 상기 지질 나노 입자는 이온화 가능한 양이온성 지질(cationic lipid), 인지질(phospholipid), 콜레스테롤(cholesterol), 및/또는 지질 고정 폴리에틸렌 글리콜(lipid-anchored polyethylene glycol)일 수 있다. 구체적으로, 상기 이온화 가능한 양이온성 지질은 다음에서 선택된 하나 이상일 수 있다: DLin-DMA; DLin-KC2-DMA; DLin-MC3-DMA; C12-200; cKK-E12; DLin-MC3-DMA 유도체 L319 (Alnylam 및 AlCana Technologies); C12-200 및 cKK-E12 유도체 (Anderson 그룹); COVID-19 백신 지질 ALC-0315 및 SM-102; TT3 및 생분해성 유도체 FTT5 (Dong 's group); 비타민 유래 지질 ssPalmE 및 VcLNP; A9 (Acuitas); L5 (Moderna); A18 Lipid; ATX Lipid (LUNAR® 조성물; Arcturus); 및 LP01 (Intellia Therapeutics). 구체적으로, 상기 인지질은 다음 중 선택된 하나 이상일 수 있다: 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE); 및 1,2-distearoyl-sn-glycero-3- phosphocholine (DSPC).
일 구현예로, 상기 제제화 된 프리온-Fc 영역 융합 단백질을 발현할 수 있는 벡터는 폴리머-기반 전달 시스템(polymer-based delivery system)을 포함할 수 있다. 상기 구현예에서, 상기 폴리머-기반 전달 시스템은 다음 중 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다: 폴리에틸렌이민(polyethylenimine; PEI); 폴리아미도아민(polyamidoamine; PAMAM); 폴리프로필렌이민(polypropylenimine); 및 상기 폴리머 기반 덴드리머.
일 구현예로, 상기 제제화 된 프리온-Fc 영역 융합 단백질을 발현할 수 있는 벡터는 펩타이드-기반 전달 시스템(peptide-based delivery system)을 포함할 수 있다. 상기 구현예에서, 상기 펩타이드-기반 전달 시스템은 프로타민(protamine)을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 제형화 된 암호화 핵산은 프로타민-mRNA 복합체일 수 있다.
일 구현예로, 상기 제제화 된 프리온-Fc 영역 융합 단백질을 발현할 수 있는 벡터는 양이온성 지질 구성 리포솜 (liposome), 리포플렉스 (lipoplex) 및/또는 양이온성 에멀젼 (cationic emulsion, CNE)을 포함할 수 있다. 상기 구현예에서, 상기 양이온성 지질은 DOTMA (1,2-di-O-octadecenyl-3-trimethylammonium propane) 및/또는 DOTAP (1,2-dioleoyl3-trimethylammonium-propane)일 수 있다.
프리온-Fc 영역 융합 단백질의 작용 기전
신경독성이 있는 단백질 응집체는 체내에서 축적되며, 다른 세포들로 전파될 수 있어 퇴행성 신경질환을 악화시키는 것으로 알려져 있다. 본 명세서에서 제공하는 프리온-Fc 영역 융합 단백질의 프리온 단백질 부분은 상기 신경독성이 있는 단백질 응집체와 특이적으로 결합할 수 있고, 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질의 Fc 영역 부분은 대식세포(Macrophage) 및/또는 미세아교세포(Microglia)의 Fc 수용체(Fc receptor)와 결합하여 대식작용(Phagocytosis)을 유도할 수 있다. 따라서, 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질이 상기 신경독성이 있는 단백질 응집체와 접촉하는 경우, i) 상기 프리온 단백질 부분이 상기 신경독성이 있는 단백질 응집체와 결합하여 다른 세포들로 전파되는 것을 막으며, ii) 상기 Fc 영역 부분이 대식세포(Macrophage) 및/또는 미세아교세포(Microglia)의 Fc 수용체(Fc receptor)와 결합하여 대식작용(Phagocytosis)을 유도하므로, 결과적으로 상기 신경독성이 있는 단백질 응집체를 제거하는 효과를 낸다. 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질은 위와 같은 작용 기전을 통해 신경독성이 있는 단백질 응집체의 축적 및 타 세포로의 전파를 방지하여 이와 관련된 질환을 예방, 치료 및/또는 개선시킬 수 있다.
프리온-Fc 영역 융합 단백질 또는 이를 발현할 수 있는 벡터를 포함하는 조성물의 치료 용도
프리온-Fc 영역 융합 단백질 또는 이를 발현할 수 있는 벡터를 포함하는 조성물의 치료 용도 개괄
본 명세서에서는 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질 또는 이를 발현할 수 있는 벡터를 포함하는 조성물의 치료 용도를 개시한다. 상기 조성물은 퇴행성 신경질환 치료 용도로 사용될 수 있으며, 상기 치료 용도를 달성하기 위해 통상의 기술자가 공지된 방법 등을 사용하여 적절한 투여 경로, 투여 용량 및 투여 주기를 택할 수 있다.
프리온-Fc 영역 융합 단백질 또는 이를 발현할 수 있는 벡터를 포함하는 조성물의 치료 용도 1 - 표적 물질
일 구현예로, 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질 또는 이를 발현할 수 있는 벡터를 포함하는 조성물은 신경독성이 있는 단백질 응집체를 제거하는 용도로 사용될 수 있다. 구체적으로, 상기 신경독성이 있는 단백질 응집체는 알파-시뉴클린(α-synuclein) 응집체, 아밀로이드 베타(Amyloid beta) 응집체, 타우(Tau) 응집체, TDP-43 응집체 및/또는 프리온(Prion) 응집체일 수 있다.
프리온-Fc 영역 융합 단백질 또는 이를 발현할 수 있는 벡터를 포함하는 조성물의 치료 용도 2 - 적응증
일 구현예로, 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질 또는 이를 발현할 수 있는 벡터를 포함하는 조성물은 퇴행성 신경질환 치료 용도로 사용될 수 있다. 구체적으로, 상기 퇴행성 신경질환은 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 루이바디병(Lewy bodies disease), 픽병(Pick's disease), 외상성 뇌병증(Traumatic encephalopathy), 근위축성 측삭경화증(Amyotrophic Lateral Sclerosis; ALS), 타우병증(Tauopathy), 전두측두엽치매(Frontotemporal dementia) 중 선택된 것일 수 있다.
프리온-Fc 영역 융합 단백질 또는 이를 발현할 수 있는 벡터를 포함하는 조성물의 치료 용도 3 - 투여 방법
일 구현예로, 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질 또는 이를 발현할 수 있는 벡터를 포함하는 조성물은 대상의 뇌에 투여될 수 있다. 일 구현예로, 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질 또는 이를 발현할 수 있는 벡터를 포함하는 조성물은 뇌내 주사(intracerebral injection), 및 뇌실내 주사(intracerebroventricular injection; ICV) 중 선택된 방법으로 대상에 투여될 수 있다. 일 구현예로, 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질 또는 이를 발현할 수 있는 벡터를 포함하는 조성물은 대상의 흑색질(Substantia Nigra), 뇌실(Cerebral Ventricle), 및 선조체(Striatum) 중 선택된 부위에 투여될 수 있다.
프리온-Fc 영역 융합 단백질 또는 이를 발현할 수 있는 벡터를 포함하는 조성물의 치료 용도 4 - 투여 용량
일 구현예로, 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질 또는 이를 발현할 수 있는 벡터를 포함하는 조성물은 대상의 몸무게 기준, 약 1 unit/kg 내지 약 999 unit/kg 용량으로 투여할 수 있다. 일 구현예로, 상기 투여 용량은 바로 이전 문장의 수치범위에 포함되는 임의의 수치범위일 수 있다. 예를 들어, 상기 투여 용량은 약 5 unit/kg 내지 약 20 unit/kg일 수 있다. 여기서, 상기 unit은 g, mg, μg, 및 ng 중 선택된 것이다.
프리온-Fc 영역 융합 단백질 또는 이를 발현할 수 있는 벡터를 포함하는 조성물의 치료 용도 5 - 투여 주기
일 구현예로, 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질 또는 이를 발현할 수 있는 벡터를 포함하는 조성물은 대상에게 1일 1회, 또는 1일 2회 이상 투여할 수 있다. 일 구현예로, 상기 프리온-Fc 영역 융합 단백질 또는 이를 발현할 수 있는 벡터를 포함하는 조성물은 대상에게 약 1 period 내지 약 100 period 주기로 투여할 수 있다. 일 구현예로, 상기 투여 주기는 바로 이전 문장의 수치범위에 포함되는 임의의 수치범위일 수 있다. 예를 들어, 상기 투여 주기는 약 5 period 내지 약 20 period일 수 있다. 여기서, 상기 period는 분, 시간, 일, 주, 월, 및 년 중 선택된 것이다.
발명의 가능한 실시예
프리온-Fc 영역 융합 단백질 1
실시예 1, 융합 단백질, PrP-Fc
다음을 포함하는 프리온-Fc 영역 융합 단백질:
인간 프리온 단백질; 및
면역글로불린 Fc 영역,
여기서, 상기 인간 프리온 단백질의 C 말단 및 상기 면역글로불린 Fc 영역의 N 말단이 연결되어 있음.
실시예 2, 융합 단백질, Fc-PrP
다음을 포함하는 프리온-Fc 영역 융합 단백질:
인간 프리온 단백질; 및
면역글로불린 Fc 영역,
여기서, 상기 인간 프리온 단백질의 N 말단 및 상기 면역글로불린 Fc 영역의 C 말단이 연결되어 있음.
실시예 3, 프리온 단백질 한정, 야생형 인간 프리온 단백질
실시예 1 내지 2 중 어느 하나에 있어서, 상기 인간 프리온 단백질은 자연계에서 발견되는 인간 프리온 단백질의 전부 또는 일부인 융합 단백질.
실시예 4, 야생형 인간 프리온 단백질 서열 한정
실시예 3에 있어서, 상기 인간 프리온 단백질은 서열번호 1로 표현되는 단백질의 전부 또는 일부인 융합 단백질.
실시예 5, 야생형 인간 프리온 단백질 절편 서열 한정
실시예 4에 있어서, 상기 인간 프리온 단백질은 서열번호 1 내지 서열번호 6으로 표현되는 융합 단백질.
실시예 6, 프리온 단백질 한정, 인간 프리온 단백질의 변이체
실시예 1 내지 2 중 어느 하나에 있어서, 상기 인간 프리온 단백질은 자연계에서 발견되는 인간 프리온 단백질의 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산이 부가, 변경, 치환 및/또는 제거된 변이체인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
실시예 7, 인간 프리온 단백질의 변이체 한정
실시예 6에 있어서, 상기 인간 프리온 단백질은 서열번호 1로 표현되는 단백질의 127번째 아미노산, 129번째 아미노산, 및 219번째 아미노산 중 선택된 하나 이상이 다른 것으로 치환된 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
실시예 8, G127V
실시예 7에 있어서, 상기 인간 프리온 단백질은 서열번호 1로 표현되는 단백질의 127번째 아미노산이 발린(Valine)으로 치환된 단백질의 전부 또는 일부인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
실시예 9, G127V 변형체의 절편
실시예 8에 있어서, 상기 인간 프리온 단백질은 서열번호 7 내지 서열번호 10 중 선택되는 융합 단백질.
실시예 10, M129V
실시예 6에 있어서, 상기 인간 프리온 단백질은 서열번호 1로 표현되는 단백질의 129번째 아미노산이 발린(Valine)으로 치환된 단백질의 전부 또는 일부인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
실시예 11, M129V 변형체의 절편
실시예 10에 있어서, 상기 인간 프리온 단백질은 서열번호 11 내지 서열번호 14 중 선택되는 융합 단백질.
실시예 12, E219K
실시예 6에 있어서, 상기 인간 프리온 단백질은 서열번호 1로 표현되는 단백질의 219번째 아미노산이 라이신(Lysine)으로 치환된 단백질의 전부 또는 일부인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
실시예 13, 면역글로불린 Fc 영역 유래 한정
실시예 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 마우스 또는 인간의 면역글로불린 Fc 영역인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
실시예 14, 인간의 면역글로불린 Fc 영역 한정
실시예 13에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 마우스 또는 인간의 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4 중 선택된 면역글로불린의 Fc 영역인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
실시예 15, Fc 서열 한정
실시예 13에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 다음 중 선택된 서열로 표현되는 것을 특징으로 하는 융합 단백질:
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 16); 및
PPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (서열번호 51).
실시예 16, 링커 추가
실시예 1 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 상기 융합 단백질은 링커를 추가로 포함하고, 상기 인간 프리온 단백질 및 상기 면역글로불린 Fc 영역이 링커를 통해 연결된 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
실시예 17, 링커 서열 한정
실시예 16에 있어서, 상기 링커는 다음 중 선택된 서열로 표현되는 것을 특징으로 하는 융합 단백질:
ISA; ISAMVRS(서열번호 18); (G)n; (GGGGS)n (서열번호 19); (EAAAK)n (서열번호 20); 및 (XP)n.
실시예 18, 분비 신호 펩타이드 추가, SS-PrP-Fc
실시예 1 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 상기 융합 단백질은 분비 신호 펩타이드를 추가로 포함하고, 상기 분비 신호 펩타이드의 C 말단 및 상기 인간 프리온 단백질의 N 말단이 연결된 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
실시예 19, 분비 신호 펩타이드 및 링커 추가
실시예 1 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 상기 융합 단백질은 분비 신호 펩타이드, 제1 링커, 및 제2 링커를 추가로 포함하고,
여기서, 상기 분비 신호 펩타이드의 C 말단 및 상기 인간 프리온 단백질의 N 말단이 상기 제1 링커를 통해 연결되어 있고,
상기 인간 프리온 단백질의 C 말단 및 상기 면역글로불린 Fc 영역의 N 말단이 상기 제2 링커를 통해 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
실시예 20, 분비 신호 펩타이드 추가, SS, N말단
실시예 1 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 상기 융합 단백질은 분비 신호 펩타이드를 추가로 포함하고, 상기 분비 신호 펩타이드는 상기 융합 단백질의 아미노산 서열의 N 말단쪽에 위치하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
실시예 21, 분비 신호 펩타이드 추가, SS, C말단
실시예 1 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 상기 융합 단백질은 분비 신호 펩타이드를 추가로 포함하고, 상기 분비 신호 펩타이드는 상기 융합 단백질의 아미노산 서열의 C 말단쪽에 위치하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
실시예 22, 링커 서열 한정
실시예 19에 있어서, 상기 제1 링커 및 상기 제2 링커는 각각 독립적으로 다음 중 선택된 서열로 표현되는 것을 특징으로 하는 융합 단백질:
ISA; ISAMVRS(서열번호 18); (G)n; (GGGGS)n (서열번호 19); (EAAAK)n (서열번호 20); 및 (XP)n.
실시예 23, 용도 추가
실시예 1 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 상기 융합 단백질은 신경독성이 있는 단백질 응집체의 제거를 유도할 수 있는 것을 특징으로 하는 융합단백질.
프리온-Fc 영역 융합 단백질 2
실시예 24, 융합 단백질, 구조식
다음 [화학식 1]로 표현되는 프리온-Fc 영역 융합 단백질:
[화학식 1] S - L1 - hPrP - L2 - Fc
여기서, S는 분비 신호 펩타이드, 또는 부존재하고,
L1은 제1 링커, 또는 부존재하고,
hPrP는 인간 프리온 단백질, 인간 프리온 단백질의 절편, 인간 프리온 단백질 변이체, 또는 인간 프리온 단백질 변이체의 절편이고,
L2는 제2 링커, 또는 부존재하고,
Fc는 인간 또는 마우스 면역글로불린의 crystallizable region임.
실시예 25, 융합 단백질, 마쿠시
실시예 24에 있어서,
상기 분비 신호 펩타이드는 서열번호 17, 서열번호 52 내지 서열번호 53 중 선택된 것이고,
상기 제1 링커는 ISA, ISAMVRS(서열번호 18), (G)n, (GGGGS)n (서열번호 19), (EAAAK)n (서열번호 20), 및 (XP)n 중 선택된 것이고,
상기 hPrP는 서열번호 1 내지 서열번호 15 중 선택된 것이고,
상기 제2 링커는 ISA, ISAMVRS(서열번호 18), (G)n, (GGGGS)n (서열번호 19), (EAAAK)n (서열번호 20), 및 (XP)n 중 선택된 것이고,
상기 Fc는 서열번호 16 및 서열번호 51 중 선택된 것인 융합 단백질.
프리온-Fc 영역 융합 단백질을 발현할 수 있는 벡터
실시예 26, 프리온-Fc 영역 암호화 핵산
실시예 1 내지 실시예 25 중 어느 하나의 융합 단백질을 암호화하는 핵산.
실시예 27, 핵산 한정
실시예 26에 있어서, 상기 핵산은 DNA, mRNA, 및 화학적으로 변형된 핵산에서 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산.
실시예 28, 프리온-Fc 영역 암호화 핵산을 포함하는 벡터
다음을 포함하는 프리온-Fc 영역 융합 단백질을 발현할 수 있는 벡터:
실시예 26의 프리온-Fc 영역 암호화 핵산; 및
프로모터.
실시예 29, 비바이러스 벡터
실시예 28에 있어서, 상기 벡터는 플라스미드, 파지, 네이키드 DNA, DNA 복합체, mRNA 중 선택된 형태인 것을 특징으로 하는 벡터.
실시예 30, 바이러스 벡터
실시예 30에 있어서, 상기 벡터는 바이러스 벡터 형태인 것을 특징으로 하는 벡터.
실시예 31, 바이러스 벡터 예시
실시예 30에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 백시니아바이러스, 폭스바이러스 및 단순포진 바이러스 중에서 선택된 것을 특징으로 하는 벡터.
실시예 32, 아데노-연관 바이러스 벡터
실시예 31에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 아데노-연관 바이러스인 것을 특징으로 하는 벡터.
실시예 33, 아데노-연관 바이러스 항원형
실시예 32에 있어서, 상기 아데노-연관 바이러스는 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV8, 및 AAV9 중 선택된 항원형(Serotype)인 것을 특징으로 하는 벡터.
실시예 34, 아데노-연관 바이러스 캡시드 변형
실시예 32에 있어서, 상기 아데노-연관 바이러스는 바이러스는 중추 신경계(Central Nervous System;CNS)에 더 잘 감염될 수 있도록 그 캡시드 표면이 엔지니어링 된 것을 특징으로 하는 벡터.
프리온-Fc 영역 융합 단백질 또는 이를 발현할 수 있는 벡터를 포함하는 조성물
실시예 35, 조성물
다음을 포함하는 조성물:
실시예 1 내지 25 중 어느 하나의 프리온-Fc 영역 융합 단백질 또는 실시예 28 내지 34 중 어느 하나의 프리온-Fc 영역 융합 단백질을 발현할 수 있는 벡터; 및
약학적으로 허용되는 담체.
실시예 36, 융합 단백질 포함, 담체 한정
실시예 35에 있어서, 상기 조성물은 실시예 1 내지 25 중 어느 하나의 프리온-Fc 영역 융합 단백질을 포함하고, 상기 약학적으로 허용되는 담체는 다음 중 선택된 하나 이상인 조성물:
트로키제 (troches); 로젠지 (lozenge); 정제; 수용성 현탁액; 유성 현탁액; 조제 분말; 과립; 에멀젼; 하드 캡슐; 소프트 캡슐; 시럽; 엘릭시르제; 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴 등과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트 등과 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분 등과 같은 붕해제; 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴 푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌 글리콜 왁스 등과 같은 윤활유; 감미제; 방향제; 시럽제; 멸균된 수용액, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름; 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등의 비수성용제 또는 현탁제; 유제; 동결 건조 제제; 외용제; 안정제; 완충제; 추진제; 첨가제; 동물성 유; 식물성 유; 왁스; 파라핀; 전분; 트라칸트; 셀룰로오스 유도체; 폴리에틸렌 글리콜; 실리콘; 벤토나이트; 실리카; 탈크; 산화 아연; 및 이들의 적절한 혼합물.
실시예 37, 발현 벡터 포함, 담체 한정
실시예 35에 있어서, 상기 조성물은 실시예 28 내지 34 중 어느 하나의 프리온-Fc 영역 융합 단백질을 발현할 수 있는 벡터를 포함하고, 상기 약학적으로 허용되는 담체는 다음 중 선택된 하나 이상인 조성물:
네이키드 핵산(naked nucleic acid); 양이온성 펩티드-복합 핵산(Protamine); 양전하를 띠는 oil-water 양이온 나노에멀젼(Cationic nanoemulsion); 화학적으로 변형된 덴드리머와 결합되고, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol) 및 PEG-지질과 복합체화 된 핵산(Modified dendrimer nanoparticle); PEG-지질 나노 입자에서 프로타민과 복합된 핵산(Protamine liposome); polyethylenimine, PEI와 같은 양이온성 중합체와 복합된 핵산(Cationic polymer); PEI 및 지질 성분과 같은 양이온성 중합체와 복합된 핵산(Cationic polymer liposome); 키토산 같은 다당류 중합체와 복합된 핵산(Polysaccharide particle); 양이온성 지질 나노 입자 중합체와 복합된 핵산(Cationic lipid nanoparticle); 양이온성 지질 및 콜레스테롤과 복합된 핵산(Cationic lipid-cholesterol nanoparticle); 및 양이온성 지질 및 콜레스테롤 및 PEG-지질과 복합체화 된 핵산(Cationic lipid-cholesterol-PEG nanoparticle); 지질 나노 입자(lipid nanoparticles; LNP); 이온화 가능한 양이온성 지질(cationic lipid); 인지질(phospholipid); 콜레스테롤(cholesterol); 지질 고정 폴리에틸렌 글리콜(lipid-anchored polyethylene glycol); DLin-DMA; DLin-KC2-DMA; DLin-MC3-DMA; C12-200; cKK-E12; DLin-MC3-DMA 유도체 L319 (Alnylam 및 AlCana Technologies); C12-200 및 cKK-E12 유도체 (Anderson 그룹); COVID-19 백신 지질 ALC-0315 및 SM-102; TT3 및 생분해성 유도체 FTT5 (Dong 's group); 비타민 유래 지질 ssPalmE 및 VcLNP; A9 (Acuitas); L5 (Moderna); A18 Lipid; ATX Lipid (LUNAR® 조성물; Arcturus); 및 LP01 (Intellia Therapeutics); 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE); 1,2-distearoyl-sn-glycero-3- phosphocholine (DSPC); 폴리머-기반 전달 시스템(polymer-based delivery system); 폴리에틸렌이민(polyethylenimine; PEI); 폴리아미도아민(polyamidoamine; PAMAM); 폴리프로필렌이민(polypropylenimine); 상기 폴리머 기반 덴드리머; 펩타이드-기반 전달 시스템(peptide-based delivery system); 프로타민(protamine); 프로타민-mRNA 복합체; 양이온성 지질 구성 리포솜 (liposome); 리포플렉스 (lipoplex); 양이온성 에멀젼 (cationic emulsion, CNE); DOTMA (1,2-di-O-octadecenyl-3-trimethylammonium propane); DOTAP (1,2-dioleoyl3-trimethylammonium-propane); 및 이들의 적절한 혼합물.
프리온-Fc 영역 융합 단백질 또는 이를 발현할 수 있는 벡터를 포함하는 약학적 조성물
실시예 38, 약학적 조성물
다음을 포함하는 퇴행성 신경질환 치료용 약학적 조성물:
실시예 1 내지 25 중 어느 하나의 프리온-Fc 영역 융합 단백질 또는 실시예 28 내지 34 중 어느 하나의 프리온-Fc 영역 융합 단백질을 발현할 수 있는 벡터; 및
약학적으로 허용되는 담체.
실시예 39, 융합 단백질 포함, 담체 한정
실시예 38에 있어서, 상기 약학적 조성물은 실시예 1 내지 25 중 어느 하나의 프리온-Fc 영역 융합 단백질을 포함하고, 상기 약학적으로 허용되는 담체는 다음 중 선택된 하나 이상인 약학적 조성물:
트로키제 (troches); 로젠지 (lozenge); 정제; 수용성 현탁액; 유성 현탁액; 조제 분말; 과립; 에멀젼; 하드 캡슐; 소프트 캡슐; 시럽; 엘릭시르제; 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴 등과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트 등과 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분 등과 같은 붕해제; 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴 푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌 글리콜 왁스 등과 같은 윤활유; 감미제; 방향제; 시럽제; 멸균된 수용액, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름; 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등의 비수성용제 또는 현탁제; 유제; 동결 건조 제제; 외용제; 안정제; 완충제; 추진제; 첨가제; 동물성 유; 식물성 유; 왁스; 파라핀; 전분; 트라칸트; 셀룰로오스 유도체; 폴리에틸렌 글리콜; 실리콘; 벤토나이트; 실리카; 탈크; 산화 아연; 및 이들의 적절한 혼합물.
실시예 40, 벡터 포함, 담체 한정
실시예 38에 있어서, 상기 조성물은 실시예 28 내지 34 중 어느 하나의 프리온-Fc 영역 융합 단백질을 발현할 수 있는 벡터를 포함하고, 상기 약학적으로 허용되는 담체는 다음 중 선택된 하나 이상인 약학적 조성물:
네이키드 핵산(naked nucleic acid); 양이온성 펩티드-복합 핵산(Protamine); 양전하를 띠는 oil-water 양이온 나노에멀젼(Cationic nanoemulsion); 화학적으로 변형된 덴드리머와 결합되고, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol) 및 PEG-지질과 복합체화 된 핵산(Modified dendrimer nanoparticle); PEG-지질 나노 입자에서 프로타민과 복합된 핵산(Protamine liposome); polyethylenimine, PEI와 같은 양이온성 중합체와 복합된 핵산(Cationic polymer); PEI 및 지질 성분과 같은 양이온성 중합체와 복합된 핵산(Cationic polymer liposome); 키토산 같은 다당류 중합체와 복합된 핵산(Polysaccharide particle); 양이온성 지질 나노 입자 중합체와 복합된 핵산(Cationic lipid nanoparticle); 양이온성 지질 및 콜레스테롤과 복합된 핵산(Cationic lipid-cholesterol nanoparticle); 및 양이온성 지질 및 콜레스테롤 및 PEG-지질과 복합체화 된 핵산(Cationic lipid-cholesterol-PEG nanoparticle); 지질 나노 입자(lipid nanoparticles; LNP); 이온화 가능한 양이온성 지질(cationic lipid); 인지질(phospholipid); 콜레스테롤(cholesterol); 지질 고정 폴리에틸렌 글리콜(lipid-anchored polyethylene glycol); DLin-DMA; DLin-KC2-DMA; DLin-MC3-DMA; C12-200; cKK-E12; DLin-MC3-DMA 유도체 L319 (Alnylam 및 AlCana Technologies); C12-200 및 cKK-E12 유도체 (Anderson 그룹); COVID-19 백신 지질 ALC-0315 및 SM-102; TT3 및 생분해성 유도체 FTT5 (Dong 's group); 비타민 유래 지질 ssPalmE 및 VcLNP; A9 (Acuitas); L5 (Moderna); A18 Lipid; ATX Lipid (LUNAR® 조성물; Arcturus); 및 LP01 (Intellia Therapeutics); 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE); 1,2-distearoyl-sn-glycero-3- phosphocholine (DSPC); 폴리머-기반 전달 시스템(polymer-based delivery system); 폴리에틸렌이민(polyethylenimine; PEI); 폴리아미도아민(polyamidoamine; PAMAM); 폴리프로필렌이민(polypropylenimine); 상기 폴리머 기반 덴드리머; 펩타이드-기반 전달 시스템(peptide-based delivery system); 프로타민(protamine); 프로타민-mRNA 복합체; 양이온성 지질 구성 리포솜 (liposome); 리포플렉스 (lipoplex); 양이온성 에멀젼 (cationic emulsion, CNE); DOTMA (1,2-di-O-octadecenyl-3-trimethylammonium propane); DOTAP (1,2-dioleoyl3-trimethylammonium-propane); 및 이들의 적절한 혼합물.
신경독성이 있는 단백질 응집체 제거방법
실시예 41, 신경독성이 있는 단백질 응집체 제거방법
다음을 포함하는 신경독성이 있는 단백질 응집체 제거방법:
실시예 35 내지 37 중 어느 하나의 조성물 및 대상의 중추 신경계에 존재하는 신경독성이 있는 단백질 응집체의 접촉을 유도하는 것.
실시예 42, 신경독성이 있는 단백질 응집체 한정
실시예 41에 있어서, 상기 신경독성이 있는 단백질 응집체는 알파-시뉴클린(α-synuclein) 응집체, 아밀로이드 베타(Amyloid beta) 응집체, 타우(Tau) 응집체, TDP-43 응집체 및 프리온(Prion) 응집체 중에서 선택된 하나 이상인 방법.
실시예 43, 응집체 형태 한정
실시예 41 내지 42에 있어서, 상기 단백질 응집체는 올리고머(Oligomer), 프로토피브릴(Protofibril), 머추어 피브릴(Mature fibril), 및 루이바디(Lewy body) 중 선택된 형태인 것을 특징으로 하는 방법.
실시예 44, 대상 중추 신경계 위치 한정
실시예 41 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 상기 대상의 중추 신경계는 대상의 뇌조직인 것을 특징으로 하는 방법.
실시예 45, 뇌조직 한정
실시예 44에 있어서, 상기 대상의 뇌조직은 흑색질(Substantia Nigra), 뇌실(Cerebral Ventricle), 및 선조체(Striatum) 중 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
실시예 46, 접촉 유도 방법 한정
실시예 41 내지 45 중 어느 하나에 있어서, 상기 접촉을 유도하는 것은 상기 조성물을 상기 대상에 주사하는 것인 방법.
실시예 47, 접촉 유도 방법 예시
실시예 46에 있어서, 상기 주사는 뇌내 주사(intracerebral injection), 및 뇌실내 주사(intracerebroventricular injection; ICV) 중 선택된 것인 방법.
퇴행성 신경질환 치료방법
실시예 48, 퇴행성 신경질환 치료방법
다음을 포함하는 퇴행성 신경질환 치료방법:
실시예 35 내지 37 중 어느 하나의 조성물을 대상에게 투여하는 것.
실시예 49, 적응증 한정
실시예 48에 있어서, 상기 퇴행성 신경질환은 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 루이바디병(Lewy bodies disease), 픽병(Pick's disease), 외상성 뇌병증(Traumatic encephalopathy), 근위축성 측삭경화증(Amyotrophic Lateral Sclerosis; ALS), 타우병증(Tauopathy), 전두측두엽치매(Frontotemporal dementia) 중 선택된 것인 치료방법.
실시예 50, 투여 부위 한정
실시예 50 내지 49 중 어느 하나에 있어서, 상기 투여는 상기 대상의 중추 신경계에 투여하는 것인 치료방법.
실시예 51, 뇌 투여 한정
실시예 50에 있어서, 상기 중추 신경계는 상기 대상의 뇌조직인 것을 특징으로 하는 치료방법.
실시예 52, 뇌조직 한정
실시예 51에 있어서, 상기 대상의 뇌조직은 흑색질(Substantia Nigra), 뇌실(Cerebral Ventricle), 및 선조체(Striatum) 중 선택된 것을 특징으로 하는 치료방법.
실시예 53, 뇌 투여방법 한정
실시예 51 내지 52 중 어느 하나에 있어서, 상기 투여는 뇌내 주사(intracerebral injection), 및 뇌실내 주사(intracerebroventricular injection; ICV) 중 선택된 방법으로 투여하는 것인 치료방법.
프리온-Fc 영역 융합 단백질 또는 이를 발현할 수 있는 벡터를 포함하는 조성물의 용도
실시예 54, 조성물의 치료제 제조용도
실시예 35 내지 37 중 어느 하나의 조성물의 퇴행성 신경질환 치료제 제조용도.
실시예 55, 적응증 한정
실시예 54에 있어서, 상기 퇴행성 신경질환은 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 루이바디병(Lewy bodies disease), 픽병(Pick's disease), 외상성 뇌병증(Traumatic encephalopathy), 근위축성 측삭경화증(Amyotrophic Lateral Sclerosis; ALS), 타우병증(Tauopathy), 전두측두엽치매(Frontotemporal dementia) 중 선택된 것인 용도.
실시예 56, 조성물의 신경독성이 있는 단백질 응집체 제거용도
실시예 35 내지 37 중 어느 하나의 조성물을 대상 내의 신경독성이 있는 단백질 응집체를 제거하기 위해 사용하는 용도.
실시예 57, 신경독성이 있는 단백질 응집체 종류 한정
실시예 56에 있어서, 상기 신경독성이 있는 단백질 응집체는 알파-시뉴클린(α-synuclein) 응집체, 아밀로이드 베타(Amyloid beta) 응집체, 타우(Tau) 응집체, TDP-43 응집체 및 프리온(Prion) 응집체 중에서 선택된 하나 이상인 용도.
이하, 실험예 및 실시예를 통해 본 명세서가 제공하는 발명에 대해 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 오로지 본 명세서에 의해 개시되는 내용을 예시하기 위한 것으로, 본 명세서에 의해 개시되는 내용의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실험예 1 실험재료 및 실험방법
실험예 1.1 AAV 벡터 제조
IL-2ss-hPrP-Fc 발현 백터는 AAV-백본-플라스미드에서 구축되었다. 상기 발현 벡터는 도 1에 모식적으로 나타나 있으며, 벡터에 포함된 각각의 서열은 표 1에 나타나있다.
[표 1]
이때, 상기 플라스미드의 구성 무결성은 시퀀싱을 통해 확인되었다. 상기 플라스미드는 E.coli-기반 miniprep을 증폭하여 준비하였다. 컨디셔닝 된 배양 배지에서 인간 프리온 단백질에 대한 발현 및 분비 효율은 실험예 1.9에 따른 웨스턴 블롯 분석으로 검증되었으며, 이를 도 2에 도시했다.
실험예 1.2 SH-SY5Y 세포 준비
인간 신경모세포종(Human neuroblastoma) SH-SY5Y 세포를 37℃의 가습된 5% CO2 분위기 하 10%(v/v)의 소태아혈청(FBS) 및 항생제를 포함하는 DMEM에서 성장시켰다.
실험예 1.3 프리온-Fc 융합 단백질을 포함하는 배양 배지 준비
뉴런에서 분비되는 알파-시뉴클린(α-synuclein) 조절 배지를 얻기 위해, 실험예 1.2의 SH-SY5Y 세포에 실험예 1.1에서 제조된 pAAV-IL-2ss-hPrP-Fc로 형질감염 시켰다. 구체적으로, Lipofectamine 2000 transfection 시약 (Thermo-Fisher)을 제조사의 지침에 따라 transient transfection에 사용하였다. 형질감염 2일 후, 배양 배지를 Serum-free Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)으로 교체하고, 추가로 18시간동안 배양하였다. 세포 파편을 제거하기 위해, 배지를 10,000g에서 10분 동안 원심분리했다. 원심분리 후, 회수된 상층액을 10K 컷오프 원심분리 필터를 사용해 농축하였다.
실험예 1.4 Preformed fibrils (PFF)의 제조
단량체 알파-시뉴클린을 7일 간 배양해서 제조한 알파-시뉴클린 피브릴 (50 μM)을 _in vitro_에서, PCIII(100 μM)를 포함, 혹은 미포함하는 아세트산 나트륨 완충액 (100 mM, pH 7.5) 내에서 37℃에서 shaking incubator(300 rpm; Vision Scientific)에서 배양하였다. 배양 1일, 3일, 및 7일차에 각각 샘플을 채취하고, 티오플라빈 T(thioflavin T) 형관 판독을 실시했다.
실험예 1.5 루이 바디(Lewy body) 모델 마우스 제조
알파-시뉴클린을 발현하는 AAV-알파-시뉴클린을 복강내 주사(intranigral injection)으로 마우스에 주입했다. 상기 AAV-알파-시뉴클린은 SN (anteroposterior, 3.2 mm from bregma; mediolateral, 1.3 mm; dorsoventral, 4.3 mm), 및 VTA(anteroposterior, 3.2 mm from bregma; mediolateral, 0.5 mm; dorsoventral 4.3 mm) 위치에 수행되었다. 바이러스 주입 4일 후, 알파-시뉴클린 PFF (5 ug/2 ul)를 상기 SN 및 VTA 좌표에 정위 주입(stereotaxic injection)했다. 최종 주입 후, 주입 캐뉼러(cannula)는 화학 물질 또는 바이러스의 완전한 흡수를 위해 추가로 5분 동안 선조체(Striatum), 또는 VTA 내에 유지시킨 후, 쥐의 뇌에서 천천히 제거되었다.
실험예 1.6 CCK-8 세포 생존율 평가(cell viability assay)
대상 세포를 페니실린/스트렙토마이신 (P/S) 및 10% FBS를 포함하는 100 μl의 DMEM에서 80%의 컨플루언시(confluency)로 96-웰의 흰색 평평한 바닥 플레이트 (Microtiter; Thermo Scientific, USA)에 플레이팅되었다. CCK-8 분석을 이용하여 세포 생존율을 평가했다.
실험예 1.7 대상 세포에 대한 형광 이미징
대상 세포를 세포를 poly-L-리신-코팅된 커버슬립(coverslips)에 10,000 개/cm2로 플레이팅하였다. 그 후, 상기 세포를 PBS 중 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 고정하고, 5% 정상 염소 혈청(normal goat serum), 2% BSA (Sigma), 및 0.1% Triton X-100 (Sigma)을 포함하는 용액에서 실온에서 1 시간 동안 차단했다. 이어서, 상기 세포 샘플을 관심 단백질에 상응하는 1차 항체와 함께 4 ℃에서 하룻밤 배양하였다. 이후, 상기 커버슬립에서 성장한 세포를 0.1% Triton X-100을 함유하는 PBS로 세척하고, 형광-접합된 2차 항체(1:500; Invitrogen)와 함께 실온에서 1 시간 동안 배양했다. 상기 커버슬립은 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)로 장착되었다. 4채널 형광 이미지 획득을 위해 공초점 현미경을 사용하여 형광 이미지를 얻었다.
실험예 1.8 마우스 뇌조직에 대한 형광 이미징
마우스를 마취하고, PBS로 관류시킨 후, PBS 중 4% 파라포름알데히드로 24 시간 동안 후고정한 후 PBS 중 30% 자당으로 포매하였다. 이후, 35 μm의 관상 절편(coronal section)을 절단하고, 매 4번째 절편을 분석에 사용했다. 뇌 절편 세포를 차단 완충액 [PBS 중의 5 % (v/v)의 염소 혈청 및 0.1 % (v/v)의 Triton X-100] 내의 1차 항체 (anti-tyrosine hydroxylase, novus biologicals, NB300-109 or anti-pS129-a-synuclein, biolegend, 825701)로 4℃에서 하룻밤동안 조사했고, 적절한 형광-접합된 2차 항체(Alexa Fluor 488/594-anti rabbit or mouse IgG)와 함께 25℃에서 1 시간 배양했다. Carl Zeiss 공초점 현미경으로 상기 뇌 절편 세포의 면역형광 이미지를 획득했다. 상기 면역형광 이미지에서 TH 또는 pS129-a-synuclein-positive 신호는 ImageJ의 소프트웨어 프로토콜에 따라 수행되었다. TH (초록색) 또는 pS129-a-synuclein-positive 신호 (붉은색)의 면역 형광 이미지를 회색조로 변환하고, 면역 염색에 대한 임계값을 입자 크기에 따라 설정하고, TH, 또는 pS129-a-synuclein-positive 신호의 면적을 정의했다. 상기 정보들을 기반으로 최종적으로 형광 강도 값을 측정하고, 구성하였다.
실험예 1.9 웨스턴 블롯 분석
Triton X-100-용해성 및 -불용성 구획 분리를 위해, 대상 세포를 수확하고, 이를 PBS, 1% Triton X-100, Phosphatase Inhibitor Cocktail II, III 및 a complete protease inhibitor의 혼합물을 함유하는 용해 완충액(lysis buffer)에서 비이온성 세제용해성(detergentsoluble) 및 세제-불용성(detergent-insoluble) 분획으로 처리했다. 상기 용해물을 100,000g, 4℃에서 20분 간 원심분리했다. 원심분리 후 생성된 펠렛 및 상청액 (S1, 용해성) 분획을 수집했다. 상기 펠렛을 비이온성 세제(nonionic detergent, 1% Triton X-100)를 함유하는 용해 완충액에서 1회 세척하고, 1% SDS 및 0.5% 소듐 데옥시콜레이트(sodium deoxycholate)를 함유하는 용해 완충액에 용해시켰다. 상기 균질액을 원심분리하고, 생성된 상청액 (비이온성 세제-불용성)을 수집하였다.
전체 용해물의 경우, 세포를 수확하고, PBS로 2회 세척하고, Pierce RIPA buffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris, pH 8.0, 1% NP40, 1% SDS, and 0.5% sodium deoxycholate, and a protease inhibitor mixture; Thermo Scientific)에 얼음 위에서 30분 동안 용해시켰다. 그 후, 상기 세포 용해물을 22,250g, 4℃에서 20분 간 원심분리했다. 단백질 농도는 BCA 단백질 분석 키트(Thermo Scientific)를 사용하여 측정되었다. 각기 동일한 양의 단백질(10-20 μg)을 8% 내지 16% SDS-PAGE에 용해시키고, 니트로셀룰로오스(NC)막으로 옮겼다. 이를 TBST (Tris-buffer solution-Tween20; 10 mM Tris-HCl [pH 7.6], 150 mM NaCl, and 0.05% Tween-20)로 세척한 후, 상기 NC 막을 5% 탈지유로 1 시간 동안 차단하고, 공급자가 권장하는 적절한 1차 항체의 희석액에서 배양했다. 그 후, 상기 NC 막을 세척했고, 상기 1차 항체를 HRP-컨쥬게이트된 2차 항체로 검출했다. Immunoblot 신호는 Chemiluminescence (Pierce, USA)로 시각화되었다. 면역반응성 밴드의 밀도계 분석(densitomeric analyses)를 NIH ImageJ 소프트웨어로 수행했다. 처리된 샘플과 대조군 샘플 사이의 비율을 각 개별 실험에 대해 계산하고, 대조군과의 상대 값을 표현했다.
실험예 2 프리온-Fc 융합 단백질의 SH-SY5Y 세포에 대한 in vitro 효능 평가
실험예 2.1 프리온-Fc 융합 단백질의 SH-SY5Y 세포에 대한 in vitro 효능 평가를 위한 실시예 준비
실험예 1.2에 따라 배양된 SH-SY5Y 세포에 대해, 배양 조건을 달리하여 배양하여 각 실시예를 준비했다. 각 실시예 별 조건은 표 2에 나타냈다.
[표 2]
실험예 2.2 SH-SY5Y 세포에 대한 생존율 평가 (CCK-8 assay)
실험예 2.1에 따른 각 실시예의 SH-SY5Y 세포를 실험예 1.6에 따라 CCK-8 분석으로 세포 생존율을 평가했다.
생존율 평가 결과를 도 4에 나타냈다. 생존율 평가 결과, 알파-시뉴클린 PFF만을 첨가한 환경에서 배양한 SH-SY5Y세포(Comparative example 2.3)에 비해 프리온-Fc 융합 단백질이 존재하는 환경에서 배양한 SH-SY5Y세포(Example 2.1)가 유의미하게 생존율이 높은 결과가 나타났다.
실험예 2.3 SH-SY5Y 세포에 대한 면역 형광 이미지 관찰
상기 각 실시예에 따른 세포에 대해 실험예 1.7에 따라 면역 형광 이미지를 획득하였다. 실험예 1.8에서, 상기 대상 세포는 각 실시예에 따른 SH-SY5Y세포, 상기 1차 항체는 pS129- a-Synuclein(abcam, ab51253); tyrosine hydroxylase(Novus Biologicals, NB300-109)를 사용하였다.
획득된 면역 형광 이미지를 도 5 내지 도 6에 나타냈다.
상기 면역 형광 이미지에서, 형광이 나타나는 부분은 SH-SY5Y세포 주변의 프리온-Fc 영역 융합 단백질, 알파-시뉴클린 PFF 및 올리고머를 나타낸다. 상기 면역 형광 이미지에서 pS219 알파-시뉴클린에 대한 상대적인 형광 세기를 비교한 결과, 프리온-Fc 융합 단백질이 존재하는 환경에서 배양한 SH-SY5Y세포(Example 2.1) pS219 주변의 알파-시뉴클린 표지 형광이 유의미하게 낮은 결과가 나타났다 (도 7).
실험예 3 프리온-Fc 영역 융합 단백질의 미아교세포(Microglia) 활성 평가
실험예 3.1 프리온-Fc 융합 단백질의 미아교세포(Microglia) 활성 효과를 평가하기 위한 실시예 준비
프리온-Fc 융합 단백질의 미아교세포 활성 효과를 평가하기 위해, 배양 조건을 달리하여 실시예를 준비했다. 실시예에 따른 조건을 표 3에 나타냈다.
[표 3]
실험예 3.2 SIM-A9 세포에 대한 면역 형광 이미지 관찰
실험예 3.1에 따른 각 실시예에 대해, 실시예 1.7에 따라 면역 형광 이미지를 획득하였다. 실험예 1.8에서, 상기 대상 세포는 각 실시예에 따른 SIM-A9세포, 상기 1차 항체는 Iba-I (abcam, ab15690); a-Synuclein (BD bioscience, #610787)를 사용했다.
획득된 면역 형광 이미지를 도 8 내지 도 9에 나타냈다.
상기 면역 형광 이미지에서, 형광이 나타나는 부분은 SIM-A9 미세아교세포(Microglia) 내로 대식작용을 통해 함입된 알파-시뉴클린을 나타낸다.
실험예 3.3 SIM-A9 세포에 대한 활성 평가
실험예 3.2에 따른 면역 형광 이미지를 분석하여 프리온-Fc 영역 융합 단백질이 SIM-A9 세포의 활성에 미치는 영향을 측정했다. 실시예 EX01 내지 EX02의 알파-시뉴클린에 대한 평균 형광 강도를 측정했고, 이를 알파-시뉴클린만을 첨가한 SIM-A9세포 및 알파-시뉴클린 및 프리온-Fc 융합 단백질을 모두 첨가한 SIM-A9세포에 대해 각각 도시하여 도 10에 나타냈다. 실시예 EX03 내지 EX04의 알파-시뉴클린에 대한 평균 형광 강도를 측정했고, 이를 알파-시뉴클린만을 첨가한 SIM-A9세포 및 알파-시뉴클린 및 프리온-Fc 융합 단백질을 모두 첨가한 SIM-A9세포에 대해 각각 도시하여 도 11에 나타냈다.
실험 결과, 알파-시뉴클린 PFF 및 프리온-Fc 융합 단백질이 모두 첨가된 환경에서, SIM-A9세포가 알파-시뉴클린 PFF에 대한 대식작용이 빠르게 일어나는 결과가 나타났다.
실험예 4 프리온-Fc 융합 단백질의 루이바디(Lewy body) 마우스 모델에 대한 in vivo 효능 평가
실험예 4.1 모델 마우스에 프리온-Fc 융합 단백질을 발현하는 AAV 벡터 주입
프리온-Fc 융합 단백질의 효과를 확인하기 위해, 실험예 1.5에 따라 제조된 루이바디 모델 마우스에 프리온-Fc 융합 단백질을 발현할 수 있는 AAV-PrP-Fc 바이러스를 정위 주입(stereotaxic injection)했다. 구체적으로, 주입 캐뉼러(cannula) (26.5 게이지)를 선조체 (intrastriatal: anteroposterior, 0.5 mm from bregma; mediolateral, 2.0 mm; dorsoventral, 3.0 mm), SN 좌표 내 (intranigral injection: anteroposterior, 3.2 mm from bregma; mediolateral, 1.3 mm; dorsoventral, 4.3 mm), 또는 Ventricular zone (For intracerebroventricular: anteroposterior, -1.0 mm, mediolateral, 0.6 mm, dorsoventral, 2.0 mm from bregma)에 삽입하여 AAV-PrP-Fc 바이러스를 정위 주입(stereotaxic injection)했다.
실험예 4에서 사용한 실시예는 다음 표 4에 나타냈다.
[표 4]
실험예 4.2 폴 테스트
폴 테스트를 위해, 실험예 4.1의 실시예에 따른 각 마우스를 최소 30분간 행동 절차 케이지에 적응시켰다. 상기 폴은 직경 10mm, 길이 58cm의 금속 막대로, 기둥 주위에 붕대 거즈를 감아 사용했다. 상기 행동 절차 케이지 내에 상기 폴을 놓고, 마우스는 머리가 아래를 향하도록 기둥 상단 부분에 놓았다. 이후, 마우스가 기둥 바닥에 도달하는 데 걸린 총 시간을 기록했다. 이를 3회에 걸쳐 평가하고, 평균 시간을 기록했다.
상기 폴 테스트 결과는 도 12에 나타냈다. 폴 테스트 결과, 프리온-Fc 융합 단백질 발현 벡터를 마우스의 substantia nigra pars compacta (SNpc) 부위에 주사한 경우(Example 4.3) 정상 마우스(Comparative example 4.1)에 가까운 소요 시간을 보였다.
실험예 4.3 뒷다리 신전 반사 테스트
뒷다리 신전 반사 테스트를 위해, 상기 각 실시예에 따른 마우스를 그 꼬리로 매달았다. 그 후 뒷다리 신전 반사를 0에서 2까지의 척도(0: 완전 마비; 0.5: 뒷다리 신전 없음; 1.0: 뒷다리 한 쪽만 신전 반사; 1.5: 뒷다리의 불균형 신전; 2.0: 정상적인 양쪽 뒷다리의 신전반사)로 기재했다.
실험예 4.4 마우스 뇌조직에 대한 웨스턴 블롯 분석
상기 각 실시예 마우스의 뇌를 실험예 1.9에 따라 웨스턴 블롯 분석하였다.
웨스턴 블롯 분석 결과는 도 13에 나타냈다.
실험예 4.5 마우스 뇌조직에 대한 면역 형광 이미지 관찰
상기 각 실시예 마우스의 뇌를 실험예 1.8에 따라 형광 이미지를 획득했다.
획득된 면역 형광 이미지는 도 14 및 도 15에 나타냈다. 관찰 결과, 프리온-Fc 영역 융합 단백질 발현 AAV 벡터를 마우스의 substantia nigra pars compacta (SNpc) 부위에 주사한 경우(Example 4.3), 루이바디 모델 마우스(Comparative example 4.2)의 결과에 비해 마우스의 Dopaminergic neuron이 잘 보호되었음을 볼 수 있다.
각 실시예에 따른 형광 세기를 측정한 결과를 도 16 내지 도 20에 나타냈다. 측정 결과, 루이바디 모델 마우스(Comparative example 4.2, LB)의 결과에 비해 마우스의 substantia nigra pars compacta (SNpc) 부위에 주사한 경우(Example 4.3, SNpc) 상대적인 TH 형광 세기가 유의미하게 높아진 결과를 보였고, 이는 마우스의 Dopaminergic neuron이 생존해있음을 나타낸다(도 16 및 도 17). 반면, pS219 알파-시뉴클린 표지 형광의 경우, 루이바디 모델 마우스(Comparative example 4.2, LB)에 비해 프리온-Fc 영역을 발현하는 AAV 벡터를 주입한 마우스에서 형광 신호가 유의미하게 감소한 결과를 보였고, 이는 상기 프리온-Fc 영역이 알파-시뉴클린 응집체 제거 효과를 보이는 것을 의미한다(도 18 및 도 19).
실험예 5 인간 프리온 단백질 변형체 및 절편에 대한 in vitro 효능 평가 1
실험예 5.1 인간 프리온 단백질 변형체 및 절편을 포함하는 프리온-Fc 영역 융합 단백질 제조
인간 프리온 단백질 절편, 변형체, 또는 변형체의 절편을 포함하는 프리온-Fc 영역 융합 단백질에 대한 in vitro 효능 평가를 위해, 우선 실험예 1.1에 따라 프리온-Fc 융합 단백질을 발현하는 벡터를 제조하되, 표 1에서 PrP(E/C)로 기재된 인간 프리온 단백질을 다음 표 5와 같이 변경하여 제조하였다.
[표 5]
실험예 1.3에 따라 알파-시뉴클린 조절 배지를 제조하되, 실험예 1.2의 SH-SY5Y 세포에 표 5에 따른 AAV 벡터를 형질감염 시켜 각각의 프리온-Fc 융합 단백질을 포함하는 배양 배지를 제조했다.
인간 프리온 단백질 절편, 변형체, 또는 변형체의 절편을 포함하는 프리온-Fc 영역 융합 단백질에 대한 in vitro 효능 평가를 위해, 각 실시예 별로 배양 조건을 달리하여 다음 표 6와 같은 실시예를 준비했다.
[표 6]
실험예 5.2 인간 프리온 단백질 변형체 및 절편 발현 확인
실험예 5.1에 따른 각 실시예에 대해, 실험예 1.10에 따라 웨스턴 블롯 분석을 실시했다. 실험예 1.10에서, 상기 대상 세포는 각 실시예에 따른 SH-SY5Y세포를 사용했다.
웨스턴 블롯 분석 결과를 도 21에 나타냈다.
실험예 5.3 SH-SY5Y 세포에 대한 in vitro 효능 평가
실험예 5.1에 따른 각 실시예에 대해, 실험예 1.7에 따라 CCK-8 분석으로 세포 생존율을 평가했다.
생존율 평가 결과를 도 22에 나타냈다. 생존율 평가 결과, Example 5.4의 프리온-Fc 영역 융합 단백질 존재 하 SH-SY5Y세포의 생존율이 Comparative example 5.3의 프리온-Fc 영역 융합 단백질 존재 하 SH-SY5Y세포의 생존율과 비슷한 결과를 나타냈다. 따라서, 인간 프리온 단백질의 절편 및 그 변형체를 포함하는 프리온-Fc 영역 융합 단백질이 야생형의 인간 프리온 단백질을 포함하는 프리온-Fc 영역 융합 단백질과 동일한 효과를 나타냄을 알 수 있다.
실험예 6 1차 해마 뉴런 세포(Primary hippocampal neuron)에 대한 in vitro 효능 평가
실험예 6.1 1차 해마 뉴런 세포 준비
마우스 배아(P1 내지 P2)에서 해부된 해마로부터 신경전구세포(NPCs)를 분리했다. 분리된 상기 신경전구세포를 폴리-L-오르니틴(poly-L-ornithine)으로 코팅된 유리에 플레이팅한 후, 혈청이 보충된 신경 세포 배양 배지(37℃)에서 증식시켰다. 상기 신경전구세포는 3일 간 증식시켰으며, 매일 새로운 배양 배지로 교체했다. 그 후, 상기 신경전구세포를 5일 내지 7일 동안 Neuronal Growth Supplement가 포함된 Serum-free Neuronal Culture -Medium(37℃)에서 배양하여 뉴런으로 분화시켰다.
실험예 6.2 인간 프리온 단백질 변형체 및 절편을 포함하는 프리온-Fc 영역 융합 단백질 제조
인간 프리온 단백질 절편, 변형체, 또는 변형체의 절편을 포함하는 프리온-Fc 영역 융합 단백질의 알파-시뉴클린 PFF 및 타우 단백질 응집체에 대한 in vitro 효능 평가를 위해, 실험예 5.1을 참조하여 다음 표 7과 같은 실시예를 준비했다.
[표 7]
구체적으로, 실험예 6.1에서 배양된 뉴런 세포를 표 7의 조건 하 48시간 배양시켜 각 실시예를 준비했다.
실험예 6.3 1차 해마 뉴런 세포에 대한 in vitro 효능 평가
실험예 6.2에 따른 각 실시예에 대해, 실험예 1.7에 따라 CCK-8 분석으로 세포 생존율을 평가했다.
생존율 평가 결과를 도 23 및 도 24에 나타냈다.
실험 결과, 프리온-Fc 영역 융합 단백질을 포함하는 배지에서 배양한 상기 1차 해마 뉴런 세포가(Example 6.1 내지 Example 6.4)가 알파-시뉴클린 PFF, 또는 타우 PFF만을 포함한 배지에서 배양된 세포(Comparative example 6.3, 및 Comparative example 6.4)보다 생존율이 높게 나타났다.
따라서, 1차 해마 뉴런 세포에 대해, 상기 실시예의 프리온-Fc 영역 융합 단백질이 알파-시뉴클린 PFF 및 타우 단백질 응집체의 독성을 제거하는 효과를 가지는 것을 볼 수 있으며, 인간 프리온 단백질의 절편 및 그 변형체를 포함하는 프리온-Fc 영역 융합 단백질이 야생형의 인간 프리온 단백질을 포함하는 프리온-Fc 영역 융합 단백질과 동일한 효과를 나타냄을 알 수 있다.
실험예 7 인간 프리온 단백질 변형체 및 절편에 대한 in vitro 효능 평가 2
실험예 7.1 인간 프리온 단백질 변형체 및 절편에 대한 in vitro 효능 평가를 위한 실시예 준비
인간 프리온 단백질의 절편, 변형체, 또는 변형체의 절편을 포함하는 프리온-Fc 영역 융합 단백질의 in vitro 효능 평가를 위해, 실험예 1.1, 실험예 1.3, 및 실험예 5.1을 참조하여, 서열번호 2 내지 15로 표현되는 인간 프리온 단백질을 포함하는 프리온-Fc 영역 융합 단백질을 포함하는 배양 배지를 각각 준비한다.
실험예 1.4에 따른 알파-시뉴클린 PFF 및 상기 각각의 프리온-Fc 융합 단백질을 포함하는 배양 배지를 첨가하여, 실험예 2.1을 참조하여 배양 조건을 달리한 각 실시예를 제조한다. 추가적으로, 아무것도 첨가하지 않은 배지, 알파-시뉴클린 PFF만을 첨가한 배지, 및 프리온-Fc 융합 단백질을 포함하는 배양 배지만을 포함하는 배지를 대조군으로 사용한다.
실험예 7.2 SH-SY5Y 세포에 대한 생존율 평가 (CCK-8 assay)
실험예 7.1에 따른 각 실시예에 대해, 실험예 2.2에 따라 SH-SY5Y 세포에 대한 생존율을 평가한다.
실험예 7.3 SH-SY5Y 세포에 대한 면역 형광 이미지 관찰
실험예 7.1에 따른 각 실시예에 대해, 실험예 2.3에 따라 SH-SY5Y 세포에 대한 면역 형광 이미지를 획득하고, 관찰한다.
실험예 7.4 각 실시예에 대한 웨스턴 블롯 분석
실험예 7.1에 따른 각 실시예에 대해, 실험예 1.9에 따라 웨스턴 블롯 분석을 실시한다.
실험예 7.5 미아교세포 활성 평가
실험예 7.1에 따른 각 실시예에 대해, 실험예 3.2에 따라 SIM-A9 세포에 대한 면역 형광 이미지를 획득하고, 관찰하여 미아교세포의 활성을 평가한다.
실험예 8 인간 프리온 단백질 변형체 및 절편에 대한 in vivo 효능 평가
실험예 8.1 프리온-Fc 융합 단백질의 루이바디(Lewy body) 마우스 모델에 대한 in vivo 효능 평가를 위한 실시예 준비
인간 프리온 단백질의 절편, 변형체, 또는 변형체의 절편을 포함하는 프리온-Fc 영역 융합 단백질의 in vivo 효능 평가를 위해, 실험예 1.1 및 실험예 5.1을 참조하여, 서열번호 2 내지 15로 표현되는 인간 프리온 단백질을 포함하는 프리온-Fc 영역 융합 단백질을 발현할 수 있는 AAV 벡터를 각각 제조한다.
실험예 4.1을 참조하여, 각각의 상기 AAV 벡터를 루이바디 모델 마우스에 표 4을 참조하여 정위 주입하여 각 실시예를 준비한다. 여기서, 정상 마우스, 및 아무것도 주입하지 않은 루이바디 모델 마우스를 대조군으로 사용한다.
실험예 8.2 폴 테스트
실험예 8.1에 따른 각 실시예에 대해, 실험예 4.2에 따른 폴 테스트를 실시한다.
실험예 8.3 뒷다리 신전 반사 테스트
실험예 8.1에 따른 각 실시예에 대해, 실험예 4.3에 따른 뒷다리 신전 반사 테스트를 한다.
실험예 8.4 마우스의 뇌조직에 대한 면역 형광 이미지 관찰
실험예 8.1에 따른 각 실시예에 대해, 실험예 4.4에 따라 마우스 뇌조직에 대한 면역 형광 이미지를 획득하고, 관찰한다.
본 명세서에서는 프리온-Fc 영역 융합 단백질 및 이를 발현할 수 있는 벡터를 개시하며, 이는 신경독성을 가진 단백질 응집체와 관련된 질병의 치료 용도로 이용 가능하다.
Claims (25)
- 다음 [화학식 1]로 표현되는, 신경독성이 있는 단백질 응집체 제거를 유도할 수 있는 융합 단백질:[화학식 1] hPrP - L1 - Fc상기 hPrP는 인간 프리온 단백질 전체, 인간 프리온 단백질 절편, 인간 프리온 단백질 변이체, 및 인간 프리온 단백질 변이체의 절편 중 선택된 것이고,상기 L1은 링커, 또는 부존재하고,상기 Fc는 인간 또는 마우스 면역글로불린의 Fc 영역이며,상기 신경독성이 있는 단백질 응집체는 알파-시뉴클린(α-synuclein) 응집체, 아밀로이드 베타(Amyloid beta) 응집체, 타우(Tau) 응집체, TDP-43 응집체 및 프리온(Prion) 응집체 중 선택된 하나 이상이다.
- 제1항에 있어서, 상기 hPrP는 다음 중 선택되는 서열로 표현되는 융합 단백질:MANLGCWMLVLFVATWSDLGLCKKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAMSRPIIHFGSDYEDRYYRENMHRYPNQVYYRPMDEYSNQNNFVHDCVNITIKQHTVTTTTKGENFTETDVKMMERVVEQMCITQYERESQAYYQRGSSMVLFSSPPVILLISFLIFLIVG (서열번호 1);PQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKH (서열번호 30);PQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAM (서열번호 31);KKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKH (서열번호 32);KKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAM (서열번호 33);THSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAM (서열번호 34);MANLGCWMLVLFVATWSDLGLCKKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGVYMLGSAMSRPIIHFGSDYEDRYYRENMHRYPNQVYYRPMDEYSNQNNFVHDCVNITIKQHTVTTTTKGENFTETDVKMMERVVEQMCITQYERESQAYYQRGSSMVLFSSPPVILLISFLIFLIVG (서열번호 35);PQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGVYMLGSAM (서열번호 36);KKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGVYMLGSAM (서열번호 37);THSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGVYMLGSAM (서열번호 38);MANLGCWMLVLFVATWSDLGLCKKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGGYVLGSAMSRPIIHFGSDYEDRYYRENMHRYPNQVYYRPMDEYSNQNNFVHDCVNITIKQHTVTTTTKGENFTETDVKMMERVVEQMCITQYERESQAYYQRGSSMVLFSSPPVILLISFLIFLIVG (서열번호 39);KKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGGYVLGSAM (서열번호 40);PQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGGYVLGSAM (서열번호 41);THSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGGYVLGSAM (서열번호 42);MANLGCWMLVLFVATWSDLGLCKKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAMSRPIIHFGSDYEDRYYRENMHRYPNQVYYRPMDEYSNQNNFVHDCVNITIKQHTVTTTTKGENFTETDVKMMERVVEQMCITQYKRESQAYYQRGSSMVLFSSPPVILLISFLIFLIVG (서열번호 43); 및DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 44).
- 제1항에 있어서, 상기 제1 링커는 다음 중 선택된 서열로 표현되는 융합단백질:ISA; 및ISAMVRS (서열번호 18).
- 제1항에 있어서, 상기 Fc는 인간 면역글로불린 G의 Fc 영역인 융합 단백질.
- 제4항에 있어서, 상기 인간 면역글로불린 G는 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4 중 선택된 것인 융합 단백질.
- 제4항에 있어서, 상기 Fc는 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 16)으로 표현되는 융합단백질.
- 제1항에 있어서, 상기 융합 단백질은 분비 신호 펩타이드를 추가로 포함하고, 상기 분비 신호 펩타이드의 C 말단은 상기 hPrP의 N 말단에 연결된 융합 단백질.
- 제7항에 있어서, 상기 융합 단백질은 제2 링커를 추가로 포함하고, 상기 분비 신호 펩타이드의 C 말단 및 상기 hPrP의 N 말단이 상기 제2 링커를 통해 연결된 융합 단백질.
- 제7항에 있어서, 상기 제2 링커는 다음 중 선택된 서열로 표현되는 융합 단백질:ISA; 및ISAMVRS (서열번호 18).
- 제1항에 있어서, 상기 융합 단백질은 다음 중 선택된 서열로 표현되는 것을 특징으로 하는 융합 단백질:MANLGCWMLVLFVATWSDLGLCKKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAMSRPIIHFGSDYEDRYYRENMHRYPNQVYYRPMDEYSNQNNFVHDCVNITIKQHTVTTTTKGENFTETDVKMMERVVEQMCITQYERESQAYYQRGSSMVLFSSPPVILLISFLIFLIVGISADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 21);PQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGVYMLGSAMISADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 22);PQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHISADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 23);KKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHISADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 24);KKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGVYMLGSAMISADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 25); 및THSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGVYMLGSAMISADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 26).
- 제7항에 있어서, 상기 융합 단백질은 다음 중 선택된 서열로 표현되는 것을 특징으로 하는 융합 단백질:MYRMQLLSCIALSLALVTNSISAMVRSMANLGCWMLVLFVATWSDLGLCKKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGGYMLGSAMSRPIIHFGSDYEDRYYRENMHRYPNQVYYRPMDEYSNQNNFVHDCVNITIKQHTVTTTTKGENFTETDVKMMERVVEQMCITQYERESQAYYQRGSSMVLFSSPPVILLISFLIFLIVGISADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 36);MYRMQLLSCIALSLALVTNSISAMVRSPQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGVYMLGSAMISADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 37);MYRMQLLSCIALSLALVTNSISAMVRSPQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHISADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 38);MYRMQLLSCIALSLALVTNSISAMVRSKKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHISADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 39);MYRMQLLSCIALSLALVTNSISAMVRSKKRPKPGGWNTGGSRYPGQGSPGGNRYPPQGGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQPHGGGWGQGGGTHSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGVYMLGSAMISADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 40); 및MYRMQLLSCIALSLALVTNSISAMVRSTHSQWNKPSKPKTNMKHMAGAAAAGAVVGGLGVYMLGSAMISADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 41).
- 제1항의 융합 단백질을 암호화하는 DNA.
- 제12항에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열번호 21 내지 서열번호 26, 및 서열번호 36 내지 서열번호 41 중 선택된 서열로 표현되는 DNA.
- 다음을 포함하는 프리온-Fc 영역 융합 단백질을 발현할 수 있는 벡터:제1항의 융합 단백질을 암호화하는 DNA; 및프로모터.
- 제14항에 있어서, 상기 벡터는 아데노-연관 바이러스(Adeno-Associate Virus)인 것을 특징으로 하는 벡터.
- 다음을 포함하는 퇴행성 신경질환 치료용 약학적 조성물:제1항의 융합 단백질 또는 제14항의 벡터; 및약학적으로 허용되는 담체.
- 제16항에 있어서, 상기 퇴행성 신경질환은 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 루이바디병(Lewy bodies disease), 픽병(Pick's disease), 외상성 뇌병증(Traumatic encephalopathy), 근위축성 측삭경화증(Amyotrophic Lateral Sclerosis; ALS), 타우병증(Tauopathy), 전두측두엽치매(Frontotemporal dementia) 중 선택된 하나 이상인 약학적 조성물.
- 다음을 포함하는 퇴행성 신경질환 치료방법:제1항의 융합 단백질 또는 제14항의 벡터, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 대상의 중추 신경계에 투여하는 것.
- 제18항에 있어서, 상기 대상의 중추 신경계는 대상의 뇌 조직인 치료방법.
- 제19항에 있어서, 상기 대상의 뇌 조직은 흑색질(Substantia Nigra), 뇌실(Cerebral Ventricle), 및 선조체(Striatum) 중에서 선택되는 치료방법.
- 제19항에 있어서, 상기 조성물을 대상의 중추 신경계에 투여하는 것은 뇌내 주사(intracerebral injection), 및 뇌실내 주사(intracerebroventricular injection; ICV) 중 선택된 투여방법으로 투여하는 것인 치료방법.
- 다음을 포함하는 대상 내의 신경독성을 가지는 단백질 응집체 제거방법:제1항의 융합 단백질 또는 제14항의 벡터, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 상기 대상의 중추 신경계에 투여하는 것.
- 제22항에 있어서, 상기 대상의 중추 신경계는 대상의 뇌 조직인 방법.
- 제23항에 있어서, 상기 조성물을 대상의 중추 신경계에 투여하는 것은 뇌내 주사(intracerebral injection), 및 뇌실내 주사(intracerebroventricular injection; ICV) 중 선택된 투여방법으로 투여하는 것인 방법.
- 다음을 포함하는 조성물의 퇴행성 신경질환 치료제 제조 용도:제1항의 융합 단백질 또는 제14항의 벡터; 및약학적으로 허용되는 담체.
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