WO2021132545A1 - ペプチド化合物の合成法 - Google Patents

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WO2021132545A1
WO2021132545A1 PCT/JP2020/048651 JP2020048651W WO2021132545A1 WO 2021132545 A1 WO2021132545 A1 WO 2021132545A1 JP 2020048651 W JP2020048651 W JP 2020048651W WO 2021132545 A1 WO2021132545 A1 WO 2021132545A1
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泰博 近藤
健太郎 瀬戸
志央 小宮
増▲華▼ 侯
政利 村形
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Chugai Pharmaceutical Co Ltd
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • the present invention relates to a method for efficiently producing a target peptide compound by efficiently removing unnecessary C-terminal active substances generated in the process of synthesizing the peptide compound.
  • Peptide synthesis is carried out using a compound in which the C-terminal carboxyl group of an amino acid or peptide is activated so as to react with amines such as amino acids and peptides to form an amide bond.
  • the compound in which the carboxyl group is activated remains in the reaction solution after the reaction is completed, it causes a problem that the quality of the produced peptide deteriorates.
  • Such a C-terminal activated compound is not limited to the compound in which the carboxyl group used in the peptide synthesis reaction is activated, but also during the reaction, for example, azlactone and NCA (N-carboxyan anhydride (N-carboxyan anhydride). It also includes compounds that can react with amines by changing to N-carboxyanhydride)) and having an activated state (hereinafter, these compounds may be referred to as "C-terminal active substances").
  • the C-terminal active compound used in the peptide synthesis reaction is, for example, an active ester synthesized using a peptide condensing agent as described in Non-Patent Document 1 or Non-Patent Document 2, mixed acid anhydride and acyliso. It is not limited to rare compounds, and any compound is included as long as it is activated so as to react with amines. As an example of deterioration of the quality of the produced peptide, it is known that the residual C-terminal active substance causes by-production of the impurity peptide, and that the peptide of the insertion sequence is contaminated as an impurity in the final product. (Patent Documents 1 and 2).
  • Patent Document 1 a method of treating with alkaline water to hydrolyze the active ester and removing it as an alkaline aqueous solution of the corresponding amino acid is known (Patent Document 1).
  • Patent Document 1 a method of treating with alkaline water to hydrolyze the active ester and removing it as an alkaline aqueous solution of the corresponding amino acid.
  • this method it is necessary to carry out the hydrolysis treatment with alkaline water a plurality of times, and the operation is complicated.
  • a side reaction such as epimerization (isomerization) of the product is caused, and the robustness may be impaired.
  • the residual C-terminal active substance is captured by a polyamine having a primary amino group such as N, N-dimethylpropan-1,3-diamine, converted into a basic compound, and then the residual C is washed with an aqueous solution with an acidic aqueous solution.
  • a method of transferring an amide compound derived from a terminal active substance to an aqueous layer and removing it is known (Patent Document 3 and Non-Patent Document 3).
  • primary amines with high nucleophilicity it is presumed that the site with high electrophilicity of the target peptide reacts with the primary amine to produce impurities forming a covalent bond, so that a high-purity peptide is produced. It is not suitable for the synthesis of.
  • Patent Document 2 a method of reacting a residual C-terminal active substance with a scavenger which is an amine containing a latent anion having a protecting group to convert it into an amide compound and remove it.
  • a scavenger which is an amine containing a latent anion having a protecting group
  • the deprotection of the N-terminal protecting group of the C-terminal active substance may occur at the same time.
  • the deprotected form of the residual C-terminal active substance is an impurity, but when the extinction coefficient is small, it is difficult to detect it by general-purpose HPLC, which is not preferable in terms of quality control.
  • the present invention has been made in view of such a situation, and in one aspect, it is an object of the present invention to efficiently remove the remaining C-terminal active substance in the synthesis of a peptide compound.
  • the present invention includes the following in a specific non-limiting aspect.
  • a method for producing a peptide compound Step A: A step of obtaining a reaction mixture containing a peptide compound obtained by condensing a C-terminal active substance of an acid component with an amine component in a solvent, and Step B: the reaction mixture, a tertiary amine and water or an aqueous solution. The method comprising mixing with and removing the C-terminal active compound.
  • a method for producing a peptide compound A method for producing a peptide compound.
  • Step A A step of obtaining a reaction mixture containing a peptide compound obtained by condensing a C-terminal active substance of an acid component with an amine component in a solvent
  • Step B the reaction mixture, a tertiary amine and water or an aqueous solution.
  • the method comprising the step of removing the C-terminal active substance by mixing with and reacting the tertiary amine with an unreacted C-terminal active substance.
  • the acid component is the first amino acid in which the amino group is protected by a protecting group, or the first peptide in which the N-terminal amino group is protected by a protecting group, according to [1] or [2]. the method of.
  • tertiary amine is an amine having a small steric hindrance near nitrogen.
  • the tertiary amine is represented by the following formula (A), (B), or (C): During the ceremony In R 1 to R 3 , (i) R 1 and R 2 form a 5- to 6-membered non-aromatic heterocycle together with the nitrogen atom to which they are bonded, and R 3 is C 1 to C.
  • R 4 and R 5 are each independently, C 1 -C 2 alkyl, or C 2 hydroxyalkyl alkyl, or a non-aromatic 5-6 membered together with the nitrogen atom to which they are attached heterocyclic Form a ring, but if X is O, then R 5 does not exist and R 6 and R 7 are each, independently, H, a C 1 -C 2 alkyl or methoxy, R 8 and R 9 are independently H, C 1- C 2 alkyl, or C 2 hydroxyalkyl, or the nitrogen atom to which R 8 is bonded and the carbon atom to which R 9 is bonded.
  • R 1 ⁇ R 3 are each independently C 1 -C 2 alkyl, the method of [8].
  • X is N
  • R 4 and R 5 are each independently a C 1 -C 2 alkyl
  • R 6 and R 7 are H, the method of [8].
  • R 8 and R 9 are independently H or C 1- C 2 alkyl.
  • step B the reaction mixture is further separated into an organic layer and an aqueous layer, and then the organic layer is washed, and the residual amount of the C-terminal active substance after the washing is 1.0%.
  • the method according to any one of [1] to [16] below.
  • the solvent in the step A is toluene, acetonitrile, tetrahydrofuran, 2-methyltetrahydrofuran, isopropyl acetate, ethyl acetate, methyl tert-butyl ether, cyclopentyl methyl ether, or N, N-dimethylformamide, or a mixed solvent thereof. , [1] to [17].
  • aqueous solution is an alkaline aqueous solution in the step B.
  • the side chain of the first amino acid contains one or more carbon atoms.
  • the side chain may be substituted alkyl, optionally substituted alkenyl, optionally substituted alkynyl, optionally substituted cycloalkyl, optionally substituted alkoxyalkyl, The method according to [20], wherein the cycloalkylalkyl may be substituted, the alkoxy which may be substituted, or the heteroarylalkyl which may be substituted.
  • the C-terminal activator is formed in the presence of a condensing agent, the condensing agent being T3P, HATU, BEP, DMT-MM, a combination of EDC and PfpOH, a combination of EDC and HOOBt, or a combination of EDC and HOBt.
  • a condensing agent being T3P, HATU, BEP, DMT-MM, a combination of EDC and PfpOH, a combination of EDC and HOOBt, or a combination of EDC and HOBt.
  • the C-terminal active compound remaining after the condensation reaction can be easily and efficiently removed by a single hydrolysis treatment followed by an aqueous wash, and thus column purification.
  • the peptide compound can be synthesized with high purity without the above.
  • Any element described in this example below may be any patent practice, practice, decree, etc. that may attempt to limitly interpret the content described in the example in the country in which the patent application is intended to be licensed. It is described with the intention that it is naturally regarded as being described in the same manner in the present "mode for carrying out the invention" without being bound by the limitation of.
  • halogen atom examples include F, Cl, Br or I.
  • alkyl is a monovalent group derived from an aliphatic hydrocarbon by removing one arbitrary hydrogen atom, and refers to a hetero atom (an atom other than carbon and a hydrogen atom) in the skeleton. ) Or has a subset of hydrocarbyl or hydrocarbon group structures that do not contain unsaturated carbon-carbon bonds and contain hydrogen and carbon atoms.
  • Alkyl includes not only linear ones but also branched chain ones. Specifically, the alkyl is an alkyl having 1 to 20 carbon atoms (C 1 to C 20 , hereinafter, "C p to C q " means that the number of carbon atoms is p to q).
  • C 1- C 10 alkyl more preferably C 1- C 6 alkyl, and even more preferably C 1- C 2 alkyl.
  • alkyl specifically, methyl, ethyl, n-propyl, i-propyl, n-butyl, s-butyl, t-butyl, isobutyl (2-methylpropyl), n-pentyl, s-pentyl (1-pentyl).
  • Methylbutyl t-pentyl (1,1-dimethylpropyl), neopentyl (2,2-dimethylpropyl), isopentyl (3-methylbutyl), 3-pentyl (1-ethylpropyl), 1,2-dimethylpropyl, 2 -Methylbutyl, n-hexyl, 1,1,2-trimethylpropyl, 1,2,2-trimethylpropyl, 1,1,2,2-tetramethylpropyl, 1,1-dimethylbutyl, 1,2-dimethylbutyl , 1,3-Dimethylbutyl, 2,2-dimethylbutyl, 2,3-dimethylbutyl, 3,3-dimethylbutyl, 1-ethylbutyl, 2-ethylbutyl and the like.
  • Alkenyl as used herein, is a monovalent group having at least one double bond (two adjacent SP 2 carbon atoms). Depending on the arrangement of the double bond and the substitution (if any), the geometry of the double bond can be in the Chrysler (E) or tuzanmen (Z), cis or trans arrangement. Alkenyl includes not only linear ones but also branched chain ones.
  • C 2 -C 10 alkenyl alkenyl more preferably include C 2 -C 6 alkenyl, specifically, for example, vinyl, allyl, 1-propenyl, 2-propenyl, 1-butenyl, 2-butenyl (Including cis and trans), 3-butenyl, pentenyl, 3-methyl-2-butenyl, hexenyl and the like can be mentioned.
  • C 2 -C 6 alkenyl specifically, for example, vinyl, allyl, 1-propenyl, 2-propenyl, 1-butenyl, 2-butenyl (Including cis and trans), 3-butenyl, pentenyl, 3-methyl-2-butenyl, hexenyl and the like can be mentioned.
  • alkynyl is a monovalent group having at least one triple bond (two adjacent SP carbon atoms).
  • Alkynyls include not only linear ones but also branched chain ones.
  • C 2 -C 10 alkynyl as alkynyl more preferably include C 2 -C 6 alkynyl, specifically, for example, ethynyl, 1-propynyl, propargyl, 3-butynyl, pentynyl, hexynyl, 3-phenyl -2-Propynyl, 3- (2'-fluorophenyl) -2-propynyl, 2-hydroxy-2-propynyl, 3- (3-fluorophenyl) -2-propynyl, 3-methyl- (5-phenyl)- 4-Pentynyl and the like can be mentioned.
  • cycloalkyl means a saturated or partially saturated cyclic monovalent aliphatic hydrocarbon group, and includes a monocyclic ring, a bicyclo ring, and a spiro ring.
  • a monocyclic ring Preferably include C 3 -C 8 cycloalkyl the cycloalkyl, specifically, for example, cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, bicyclo [2.2.1] heptyl, spiro [ 3.3] Heptyl and the like can be mentioned.
  • aryl means a monovalent aromatic hydrocarbon ring, preferably C 6- C 10 aryl. Specific examples of the aryl include phenyl and naphthyl (for example, 1-naphthyl and 2-naphthyl).
  • heterocyclyl means a non-aromatic cyclic monovalent group containing 1 to 5 heteroatoms in addition to carbon atoms.
  • the heterocyclyl may have double and / or triple bonds in the ring, and the carbon atom in the ring may be oxidized to form a carbonyl, which may be a monocyclic or fused ring.
  • the number of atoms constituting the ring is preferably 4 to 10 (4 to 10-membered heterocyclyl), more preferably 4 to 7 (4 to 7-membered heterocyclyl).
  • heterocyclyl examples include azetidinyl, oxylanyl, oxetanyl, azetidinyl, dihydrofuryl, tetrahydrofuryl, dihydropyranyl, tetrahydropyranyl, tetrahydropyridyl, tetrahydropyrimidyl, morpholinyl, thiomorpholinyl, pyrrolidinyl, piperidinyl, piperazinyl, and the like.
  • heteroaryl means an aromatic cyclic monovalent group containing 1 to 5 heteroatoms in addition to a carbon atom.
  • the ring may be a single ring, a fused ring with another ring, or may be partially saturated.
  • the number of atoms constituting the ring is preferably 5 to 10 (5 to 10-membered heteroaryl), and more preferably 5 to 7 (5 to 7-membered heteroaryl).
  • heteroaryl for example, frill, thienyl, pyrrolyl, imidazolyl, pyrazolyl, thiazolyl, isothiazolyl, oxazolyl, isooxazolyl, oxadiazolyl, thiadiazolyl, triazolyl, tetrazolyl, pyridyl, pyrimidyl, pyridadinyl, pyrazinyl, triazinyl, benzofuranyl, benzothienyl.
  • Alkoxy as used herein, means an oxy group "alkyl” is bonded defined above, with preference given to C 1 -C 6 alkoxy. Specific examples of the alkoxy include methoxy, ethoxy, 1-propoxy, 2-propoxy, n-butoxy, i-butoxy, s-butoxy, t-butoxy, pentyloxy, 3-methylbutoxy and the like.
  • alkenyloxy as used herein means an oxy group "alkenyl” is bonded defined above, with preference given to C 2 -C 6 alkenyloxy.
  • alkenyloxy include vinyloxy, allyloxy, 1-propenyloxy, 2-propenyloxy, 1-butenyloxy, 2-butenyloxy (including cis and trans), 3-butenyloxy, pentenyloxy, and hexenyloxy. Can be mentioned.
  • cycloalkoxy as used herein, means an oxy group "cycloalkyl" is bonded defined above, with preference given to C 3 -C 8 cycloalkoxy. Specific examples of cycloalkoxy include cyclopropoxy, cyclobutoxy, cyclopentyloxy and the like.
  • aryloxy as used herein means an oxy group "aryl” is bonded defined above, with preference given to C 6 -C 10 aryloxy. Specific examples of the aryloxy include phenoxy, 1-naphthyloxy, 2-naphthyloxy and the like.
  • amino means -NH 2 in a narrow sense and -NRR'in a broad sense, where R and R'are independent of hydrogen, alkyl, alkenyl, alkynyl, cyclo. Selected from alkyl, heterocyclyl, aryl, or heteroaryl, or R and R'form a ring together with the nitrogen atom to which they are attached.
  • Preferred aminos include -NH 2 , mono-C 1- C 6 alkyl aminos, di C 1- C 6 alkyl aminos, 4- to 8-membered cyclic aminos and the like.
  • R is hydrogen and R 'is meant an "alkyl” is group defined above, preferably mono C 1 -C 6 Alkylamino can be mentioned.
  • Specific examples of the monoalkylamino include methylamino, ethylamino, n-propylamino, i-propylamino, n-butylamino, s-butylamino, t-butylamino and the like.
  • dialkylamino as used herein, of the "amino” defined above, and independently R and R 'means an “alkyl” is group defined above, preferably, di-C 1 -C 6 Alkylamino can be mentioned. Specific examples of the dialkylamino include dimethylamino and diethylamino.
  • cyclic amino means a group of the above-defined “amino” in which R and R'combined with the nitrogen atom to which they are attached to form a ring, preferably.
  • examples include 4- to 8-membered cyclic amino acids.
  • the cyclic amino for example, 1-azetidyl, 1-pyrrolidyl, 1-piperidyl, 1-piperazil, 4-morpholinyl, 3-oxazolidyl, 1,1-dioxidethiomorpholinyl-4-yl, 3 -Oxa-8-azabicyclo [3.2.1] octane-8-yl and the like can be mentioned.
  • Hydroalkyl herein means a group wherein one of the "alkyl” definition, or more hydrogens are replaced by hydroxyl, C 1 -C 6 hydroxyalkyl are preferred, C 2 hydroxyalkyl Is more preferable. Specific examples of the hydroxyalkyl include hydroxymethyl, 1-hydroxyethyl, 2-hydroxyethyl, 2-hydroxy-2-methylpropyl, 5-hydroxypentyl and the like.
  • Haloalkyl refers to a group in which one or more hydrogens "alkyl” defined above is substituted with halogen, C 1 -C 6 haloalkyl are preferred, C 1 -C 6 fluoroalkyl Is more preferable. Specifically, as haloalkyl, for example, difluoromethyl, trifluoromethyl, 2,2-difluoroethyl, 2,2,2-trifluoroethyl, 3,3-difluoropropyl, 4,4-difluorobutyl, 5,5 -Difluoropentyl and the like.
  • cyanoalkyl refers to a group in which one or more hydrogens "alkyl” defined above has been substituted with a cyano, C 1 -C 6 cyanoalkyl is preferred. Specific examples of the cyanoalkyl include cyanomethyl and 2-cyanoethyl.
  • aminoalkyl herein, means one or more radicals substituted by “amino” hydrogen the definition of “alkyl” defined above, C 1 -C 6 aminoalkyl are preferred. Specific examples of the aminoalkyl include 1-pyridylmethyl, 2- (1-piperidyl) ethyl, 3- (1-piperidyl) propyl, 4-aminobutyl and the like.
  • carboxyalkyl refers to a group in which one or more hydrogens "alkyl” defined above is substituted with carboxy, C 2 -C 6 carboxyalkyl is preferred. Specific examples of the carboxyalkyl include carboxymethyl and the like.
  • alkenyloxycarbonyl alkyl as used herein, means one or more hydrogens are replaced with “alkenyloxycarbonyl” defined group of "alkyl” defined above, C 2 -C 6 alkenyl Oxycarbonyl C 1- C 6 alkyl is preferred, and C 2- C 6 alkenyl oxycarbonyl C 1- C 2 alkyl is more preferred.
  • Specific examples of the alkenyloxycarbonylalkyl include allyloxycarbonylmethyl and 2- (allyloxycarbonyl) ethyl.
  • alkoxyalkyl as used herein, the one or more hydrogens "alkyl” definition means been substituted with the "alkoxy" defined above, C 1 -C 6 alkoxy C 1 -C 6 alkyl are preferred, C 1 -C 6 alkoxy C 1 -C 2 alkyl is more preferable.
  • alkoxyalkyl for example, methoxymethyl, ethoxymethyl, 1-propoxymethyl, 2-propoxymethyl, n-butoxymethyl, i-butoxymethyl, s-butoxymethyl, t-butoxymethyl, pentyloxymethyl, Examples thereof include 3-methylbutoxymethyl, 1-methoxyethyl, 2-methoxyethyl and 2-ethoxyethyl.
  • cycloalkylalkyl means a group in which one or more hydrogens of the "alkyl” defined above are substituted with the "cycloalkyl” defined above, and C 3- C 8 cycloalkyl C.
  • 1- C 6 alkyl is preferred, and C 3- C 6 cycloalkyl C 1- C 2 alkyl is more preferred.
  • Specific examples of the cycloalkylalkyl include cyclopropylmethyl, cyclobutylmethyl, cyclopentylmethyl, cyclohexylmethyl and the like.
  • cycloalkoxyalkyl means a group in which one or more hydrogens of the "alkyl” in the above definition are substituted with the "cycloalkoxy” in the above definition, and C 3- C 8 cycloalkoxy C.
  • 1- C 6 alkyl is preferred, and C 3- C 6 cycloalkoxy C 1- C 2 alkyl is more preferred.
  • Specific examples of the cycloalkoxyalkyl include cyclopropoxymethyl and cyclobutoxymethyl.
  • heterocyclylalkyl means one or more radicals substituted by "heterocyclyl” hydrogen the definition of "alkyl” defined above, 4-7 membered heterocyclyl C 1 -C 6 alkyl are preferred, 4-7 membered heterocyclyl C 1 -C 2 alkyl is more preferable.
  • Specific examples of the heterocyclylalkyl include 2- (tetrahydro-2H-pyran-4-yl) ethyl and 2- (azetidine-3-yl) ethyl.
  • Alkylsulfonyl alkyl as used herein, means one or more of “alkylsulfonyl” substituted radicals of hydrogen the definition of "alkyl” defined above, C 1 -C 6 alkylsulfonyl C 1- C 6 alkyl is preferred, and C 1- C 6 alkyl sulfonyl C 1- C 2 alkyl is more preferred.
  • Specific examples of the alkylsulfonylalkyl include methylsulfonylmethyl and 2- (methylsulfonyl) ethyl.
  • aminocarbonylalkyl means a group in which one or more hydrogens of the "alkyl” in the above definition are substituted with the “aminocarbonyl” in the above definition, and the aminocarbonyl C 1- C 6 alkyl. It is preferred, more preferably aminocarbonyl C 1 -C 4 alkyl.
  • aminocarbonylalkyl for example, methylaminocarbonylmethyl, dimethylaminocarbonylmethyl, t-butylaminocarbonylmethyl, 1-azetidinylcarbonylmethyl, 1-pyrrolidinylcarbonylmethyl, 1-piperidinylcarbonyl Methyl, 4-morpholinylcarbonylmethyl, 2- (methylaminocarbonyl) ethyl, 2- (dimethylaminocarbonyl) ethyl, 2- (1-azetidinylcarbonyl) ethyl, 2- (1-pyrrolidinylcarbonyl) Examples thereof include ethyl, 2- (4-morpholinylcarbonyl) ethyl, 3- (dimethylaminocarbonyl) propyl, 4- (dimethylaminocarbonyl) butyl and the like.
  • aryloxyalkyl means a group in which one or more hydrogens of the "alkyl” of the above definition are substituted with the "aryloxy” of the above definition, and C 6- C 10 aryloxy C. 1- C 6 alkyl is preferred, and C 6- C 10 aryloxy C 1- C 2 alkyl is more preferred.
  • Specific examples of the aryloxyalkyl include phenoxymethyl and 2-phenoxyethyl.
  • Alkyl (arylalkyl) as used herein, means at least one hydrogen atom is replaced by "aryl" defined group of "alkyl” defined above, preferably C 7 -C 14 aralkyl , C 7- C 10 aryl kills are more preferred.
  • Specific examples of the aralkyl include benzyl, phenethyl, 3-phenylpropyl and the like.
  • heteroarylalkyl means a group in which at least one hydrogen atom of "alkyl” as defined above is substituted with “heteroaryl” as defined above, and 5 to 10-membered heteroaryl C 1-.
  • C 6 alkyl is preferred, and 5-10 membered heteroaryl C 1- C 2 alkyl is more preferred.
  • Specific examples of the heteroarylalkyl include 3-thienylmethyl, 4-thiazolylmethyl, 2-pyridylmethyl, 3-pyridylmethyl, 4-pyridylmethyl, 2- (2-pyridyl) ethyl, and 2- (3-pyridyl).
  • non-aromatic heterocycle in the present specification means a non-aromatic heterocycle containing 1 to 5 heteroatoms in the atoms constituting the ring.
  • the non-aromatic heterocycle may have double and / or triple bonds in the ring, and the carbon atom in the ring may be oxidized to form a carbonyl.
  • the non-aromatic heterocycle may be a monocyclic ring, a condensed ring, or a spiro ring.
  • the number of atoms constituting the ring is not limited, but is preferably 5 to 6 (5- to 6-membered non-aromatic heterocycle).
  • non-aromatic heterocycle for example, azetidine, oxetane, thietan, pyrrolidine, tetrahydrofuran, tetrahydrothiolidine, imidazolidine, pyrazolidine, oxazolidine, isoxazolidine, thiazolidine, isothiazolidine, dioxolane, dithiolane, piperidine, tetrahydropyran, thian , Piperazine, morpholine, thiomorpholine, dioxane, dithiolane, azepane, oxepane, thiepane, diazepane and the like.
  • peptide chain refers to a peptide chain in which 1, 2, 3, 4, or more natural and / or unnatural amino acids are linked by an amide bond and / or an ester bond.
  • one or more means one or two or more numbers.
  • the term means the number from one to the maximum number of substituents the group allows. Specific examples of "one or more” include 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, and / or larger numbers.
  • C-terminal active substance refers not only to a compound in which a carboxyl group is activated used in a peptide synthesis reaction (for example, an active ester leading to the production of a target peptide compound), but also in the reaction.
  • a compound that can give a target peptide compound by reacting with amines for example, an amine component
  • NCA N-carboxyanhydride
  • the C-terminal active compound which is a compound in which the carboxyl group used in the peptide synthesis reaction is activated, is, for example, Chem. Rev., 2011, 111, 6557.
  • active ester is a compound containing a carbonyl group that reacts with an amino group to form an amide bond, and is a compound in which, for example, OBt, OAt, OSu, OPfp, etc. are bound to the carbonyl group. Yes, it is a compound that promotes the reaction with amines.
  • amino acids include natural amino acids and unnatural amino acids.
  • natural amino acid refers to Gly, Ala, Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Ph, Tyr, Trp, His, Glu, Asp, Gln, Asn, Cys, Met, Lys, Arg, Pro. Point to.
  • the unnatural amino acid is not particularly limited, and examples thereof include ⁇ -amino acid, ⁇ -amino acid, D-type amino acid, N-substituted amino acid, ⁇ , ⁇ -disubstituted amino acid, amino acid having a side chain different from that of natural amino acid, and hydroxycarboxylic acid.
  • any configuration is allowed.
  • the selection of the side chain of the amino acid is not particularly limited, but is freely selected from, for example, an alkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, an aryl group, a heteroaryl group, an aralkyl group, and a cycloalkyl group in addition to the hydrogen atom.
  • One or two non-adjacent methylene groups in the group may be substituted with an oxygen atom, a carbonyl group (-CO-), or a sulfonyl group (-SO 2- ), a phosphoryl group, or a phosphonyl group.
  • Substituents may be added to each, and these substituents are not limited, and any substituent including, for example, a halogen atom, an O atom, an S atom, an N atom, a B atom, a Si atom, or a P atom.
  • substituents include, for example, a halogen atom, an O atom, an S atom, an N atom, a B atom, a Si atom, or a P atom.
  • One or two or more may be freely selected independently from the above. That is, an alkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, an aryl group, a heteroaryl group, an aralkyl group, a cycloalkyl group and the like which may be substituted are exemplified.
  • the amino acid herein may be a compound having a carboxy group and an amino group in the same molecule.
  • the main chain amino group of amino acids may also unsubstituted (NH 2 group), optionally substituted (i.e., -NHR radical: R is an optionally substituted alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, Shows heteroaryl, aralkyl, cycloalkyl, and one or two non-adjacent methylene groups among these groups are replaced with an oxygen atom, a carbonyl group (-CO-), or a sulfonyl group (-SO 2- ).
  • a carbon chain bonded to an N atom and a carbon atom at the ⁇ -position may form a ring, such as proline.
  • N-substituted amino acid Such amino acids in which the main chain amino group is substituted are described in the present specification. In the present specification, it is referred to as "N-substituted amino acid".
  • the "N-substituted amino acid” in the present specification is preferably N-alkyl amino acid, NC 1- C 6 alkyl amino acid, NC 1- C 4 alkyl amino acid, N.
  • -Methyl amino acids are exemplified, but not limited to these.
  • amino acids constituting the peptide compounds in the present specification include all the corresponding isotopes.
  • An isotope of an "amino acid” is one in which at least one atom is replaced with an atom having the same atomic number (number of protons) but different mass number (sum of numbers of protons and neutrons).
  • isotopes contained in the "amino acids” constituting the peptide compound of the present invention include hydrogen atom, carbon atom, nitrogen atom, oxygen atom, phosphorus atom, sulfur atom, fluorine atom, chlorine atom and the like, respectively. 2 H, 3 H, 13 C , 14 C, 15 N, 17 O, 18 O, 31 P, 32 P, 35 S, 18 F, 36 Cl and the like are included.
  • substituent containing a halogen atom in the present specification examples include alkyl, cycloalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, and aralkyl having a halogen as a substituent, and more specifically, fluoroalkyl and difluoroalkyl. , Trifluoroalkyl and the like.
  • Examples of oxy ( ⁇ OR) include alkoxy, cycloalkoxy, alkenyloxy, alkynyloxy, aryloxy, heteroaryloxy, aralkyloxy and the like.
  • the alkoxy, C 1 -C 4 alkoxy, is C 1 -C 2 alkoxy preferred, methoxy or ethoxy are preferred.
  • Examples of oxycarbonyl include alkyloxycarbonyl, cycloalkyloxycarbonyl, alkenyloxycarbonyl, alkynyloxycarbonyl, aryloxycarbonyl, heteroaryloxycarbonyl, aralkyloxycarbonyl and the like. ..
  • Examples of carbonyloxy include alkylcarbonyloxy, cycloalkylcarbonyloxy, alkenylcarbonyloxy, alkynylcarbonyloxy, arylcarbonyloxy, heteroarylcarbonyloxy, aralkylcarbonyloxy and the like. Can be mentioned.
  • thiocarbonyl examples include alkylthiocarbonyl, cycloalkylthiocarbonyl, alkenylthiocarbonyl, alkynylthiocarbonyl, arylthiocarbonyl, heteroarylthiocarbonyl, aralkylthiocarbonyl and the like.
  • Examples of carbonylthio include alkylcarbonylthio, cycloalkylcarbonylthio, alkenylcarbonylthio, alkynylcarbonylthio, arylcarbonylthio, heteroarylcarbonylthio, aralkylcarbonylthio and the like. Can be mentioned.
  • alkylaminocarbonyl e.g., C 1 -C 6 or C 1 -C 4 alkylaminocarbonyl, among others ethylaminocarbonyl, etc. are exemplified methylaminocarbonyl
  • Cycloalkylaminocarbonyl alkenylaminocarbonyl, alkynylaminocarbonyl, arylaminocarbonyl, heteroarylaminocarbonyl, aralkylaminocarbonyl and the like.
  • Examples of oxycarbonylamino include alkoxycarbonylamino, cycloalkoxycarbonylamino, alkenyloxycarbonylamino, alkynyloxycarbonylamino, aryloxycarbonylamino, heteroaryloxycarbonylamino, Alkoxy oxycarbonylamino and the like can be mentioned.
  • sulfonylamino examples include alkylsulfonylamino, cycloalkylsulfonylamino, alkenylsulfonylamino, alkynylsulfonylamino, arylsulfonylamino, heteroarylsulfonylamino, aralkylsulfonylamino and the like.
  • H atom bonded to the N atom in the -NH-SO 2 -R is alkyl, cycloalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, include other substituents aralkyl.
  • aminosulfonyl (-SO 2 -NHR), alkylaminosulfonyl, cycloalkyl aminosulfonyl, alkenyl aminosulfonyl, alkynyl aminosulfonyl, arylaminosulfonyl, heteroaryl, aminosulfonyl, and the like aralkylaminosulfonlyaryl is.
  • H atom bonded to the N atom in the -SO 2 -NHR alkyl, cycloalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl include other substituents aralkyl.
  • sulfamoylamino examples include alkylsulfamoylamino, cycloalkylsulfamoylamino, alkenyl sulfamoylamino, alkynylsulfamoylamino, arylsulfamoylamino, hetero.
  • Aryl sulfamoyl amino, alkyne sulfamoyl amino and the like can be mentioned.
  • the two H atoms bonded to the N atom in -NH-SO 2- NHR are substituents independently selected from the group consisting of alkyl, cycloalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, and aralkyl. It may be substituted, and these two substituents may form a ring.
  • thio As an example of thio (-SR), it is selected from alkyl thio, cycloalkyl thio, alkenyl thio, alkynyl thio, aryl thio, hetero aryl thio, aralkyl thio and the like.
  • sulfonyl examples include alkylsulfonyl, cycloalkylsulfonyl, alkenylsulfonyl, alkynylsulfonyl, arylsulfonyl, heteroarylsulfonyl, aralkylsulfonyl and the like.
  • secondary amino examples include alkylamino, cycloalkylamino, alkenylamino, alkynylamino, arylamino, heteroarylamino, aralkylamino and the like.
  • tertiary aminos examples include, for example, alkyl (aralkyl) amino, alkyl, cycloalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, aralkyl, etc., respectively.
  • Amino groups having any two substituents are selected, and these two arbitrary substituents may form a ring.
  • dialkylamino among others C 1 -C 6 dialkylamino, C 1 -C 4 dialkylamino, dimethylamino, diethylamino and the like.
  • C p- C q dialkylamino group refers to a group in which two C p- C q alkyl groups are substituted on an amino group, and both C p- C q alkyl groups are the same. May also be different.
  • the three substituents R, R', and R" on the N atom are alkyl, cycloalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, hetero. Examples thereof include groups independently selected from aryl and aralkyl, such as alkyl (aralkyl) (aryl) amidino.
  • substituted guanidinos are R, R', R", and R "', alkyl, cycloalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl. , Heteroaryl, groups independently selected from alkynes, or groups in which they form a ring.
  • R, R', and R" are among hydrogen atoms, alkyl, cycloalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, and aralkyl. Examples thereof include groups selected independently of each other, or groups forming a ring thereof.
  • amino acid residue constituting the peptide compound may be simply referred to as "amino acid”.
  • the present invention relates to a method of producing a peptide compound, which method comprises the following steps.
  • Step A A step of obtaining a reaction mixture containing a peptide compound obtained by condensing a C-terminal active substance of an acid component with an amine component in a solvent
  • Step B the reaction mixture, a tertiary amine and water or an aqueous solution.
  • the step of removing the C-terminal active compound is a step of obtaining a reaction mixture containing a peptide compound obtained by condensing a C-terminal active substance of an acid component with an amine component in a solvent
  • Step B the reaction mixture, a tertiary amine and water or an aqueous solution.
  • Step A is a step of reacting an acid component and an amine component in a solvent with a condensing agent to obtain a reaction mixture containing a peptide compound.
  • the acid component reacts with the condensing agent to form a C-terminal active substance of the acid component, and then the amine component nucleophilically attacks the C-terminal active substance, so that the reaction occurs. Proceed to produce peptide compounds.
  • an amino acid in which the amino group is protected by a protecting group or a peptide in which the N-terminal amino group is protected by a protecting group can be used.
  • the amino acid used as the acid component may be referred to as "first amino acid”
  • the peptide used as the acid component may be referred to as "first peptide”.
  • the first amino acid is not particularly limited, and any natural amino acid or unnatural amino acid can be used. Further, the first peptide is not particularly limited, and a peptide in which two or more arbitrary natural amino acids and / or unnatural amino acids are linked can be used.
  • the first amino acid is preferably one containing one or more carbon atoms in its side chain.
  • Specific examples of such amino acids include optionally substituted alkyl, optionally substituted alkoxy, optionally substituted alkynyl, optionally substituted cycloalkyl, and optionally substituted. Examples thereof include alkoxyalkyl, optionally substituted cycloalkylalkyl, optionally substituted aralkyl, optionally substituted heteroarylalkyl, and the like in the side chain.
  • the side chain has a functional group such as an amino group, a carboxyl group, or a hydroxyl group that can affect the formation reaction of a peptide bond, it is preferable to protect these groups with an appropriate protecting group.
  • an amino acid has a bulky group in its side chain, its steric hindrance is sufficient to hydrolyze the residual C-terminal active form of the amino acid by conventional methods. It may not progress. Even in such a case, the residual C-terminal active substance can be hydrolyzed quickly and efficiently by using the method of the present invention.
  • the side chain of the C-terminal amino acid contained in the first peptide can also have the same side chain as the first amino acid.
  • protecting group for the amino group of the first amino acid and the N-terminal amino group of the first peptide As the protecting group, a protecting group for an amino group that is common in the art can be used. Specific examples of such protecting groups include Cbz, Boc, Teoc, Fmoc, Tfa, Alloc, Nosyl, Dinitronosyl, t-Bu, Trityl, and Kumil.
  • the acid component is preferably used in at least the same equivalent as the amine component, preferably in excess of the amine component. Specifically, for example, 1 to 1.1 equivalents, 1 to 1.2 equivalents, 1 to 1.3 equivalents, 1 to 1.4 equivalents, 1 to 1.5 equivalents, and 1 to 2 equivalents with respect to the amine component. 0.0 equivalents, 1 to 3.0 equivalents of acid components can be used.
  • the C-terminal active form of the acid component in the present invention can be formed by reacting the acid component with a condensing agent in a solvent.
  • the condensing agent is not particularly limited as long as it can introduce a group having a desorbing ability into the hydroxy portion of the carboxyl group of the acid component in order to enhance the electrophile of the carbonyl carbon of the acid component. Examples thereof include T3P, HATU, BEP, carbodiimides (DIC, EDC, etc.), combinations of carbodiimides and additives (oxyma, HOOBt, HOBt, etc.), DMT-MM, CDI, and the like.
  • step (step A) of condensing the C-terminal active substance with the amine component to obtain a peptide compound the reaction mixture is mixed at a temperature of ⁇ 20 ° C. to near the boiling point of the solvent, preferably 0 ° C. to 60 ° C. for 1 minute. This can be done by stirring for up to 48 hours, preferably 15 minutes to 4 hours.
  • step A the condensation reaction between the acid component and the amine component can proceed quantitatively.
  • an amino acid having a carboxyl group protected by a protecting group or a peptide having a C-terminal carboxyl group protected by a protecting group can be used.
  • the amino acid used as the amine component may be referred to as "second amino acid”
  • the peptide used as the amine component may be referred to as "second peptide”.
  • the second amino acid is not particularly limited, and any natural amino acid or any unnatural amino acid can be used. Further, the second peptide is not particularly limited, and a peptide in which two or more arbitrary natural amino acids and / or unnatural amino acids are linked can be used.
  • protecting group for the carboxyl group of the second amino acid and the protecting group for the C-terminal carboxyl group of the second peptide a protecting group for the carboxyl group that is common in the art can be used.
  • protecting groups include methyl, allyl, t-butyl, trityl, cumyl, benzyl, methoxytrityl, 1-piperidinyl and the like.
  • any solvent can be used as long as the condensation reaction proceeds and a peptide compound can be obtained.
  • a solvent are selected from, for example, toluene, acetonitrile, tetrahydrofuran, 2-methyltetrahydrofuran, isopropyl acetate, ethyl acetate, methyl tert-butyl ether, cyclopentyl methyl ether, N, N-dimethylformamide, and the like.
  • examples thereof include a solvent in which two or more kinds of solvents are mixed.
  • the "peptide compound” obtained by condensing the C-terminal active form of the acid component with the amine component in the present invention comprises a linear or cyclic peptide compound in which two or more amino acids are linked. Is done.
  • the cyclic peptide compound has the same meaning as "a peptide compound having a cyclic portion".
  • linear peptide compound in the present invention is formed by linking a natural amino acid and / or an unnatural amino acid with an amide bond or an ester bond, as long as it is a compound having no cyclic portion.
  • the total number of natural or unnatural amino acids that make up a linear peptide compound is 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20. , 25, 30 and the preferred ranges are 6-20, 7-19, 7-18, 7-17, 7-16, 7-15, 8-14, 9 ⁇ 13 pieces.
  • the "cyclic peptide compound" in the present invention is formed by linking a natural amino acid and / or an unnatural amino acid with an amide bond or an ester bond, and is not particularly limited as long as it is a compound having a cyclic portion.
  • the cyclic peptide compound may have one or more linear moieties.
  • the total number of natural or unnatural amino acids that make up a cyclic peptide compound is 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25. , 30 and the preferred ranges are 6-20, 7-19, 7-18, 7-17, 7-16, 7-15, 8-14, 9-13. It is an individual.
  • the number of amino acids constituting the cyclic portion of the cyclic peptide compound is not limited, but for example, 4 or more, 6 or more, 7 or more, 8 or more, 9 or more, 10 or more, 11 or more, 12 or more, 20 or less, 18 or less, 16
  • 15 or less, 14 or less, 13 or less, 12 or less, 11 or less, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, and 16 can be mentioned.
  • the number of amino acids constituting the cyclic portion is preferably 5 to 15, more preferably 5 to 14, 7 to 14, or 8 to 14, and 8 to 13, 9 to 13, 8 to 12, 8 to 11, or 9 to 12 is more preferable, and 9 to 11 is particularly preferable.
  • the number of amino acids in the linear portion of the cyclic peptide is preferably 0 to 8, more preferably 0 to 5, and even more preferably 0 to 3.
  • the peptide compound can contain one or more, two or more, three or more, four or more, five or more, or six or more unnatural amino acids.
  • the peptide compound can contain 20 or less, 15 or less, 14 or less, 13 or less, 12 or less, 10 or less, and 9 or less unnatural amino acids.
  • the ratio of the number of unnatural amino acids is 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80 of the total number of amino acids constituting the peptide compound. % Or more are exemplified.
  • the peptide compound contains at least two N-substituted amino acids (preferably 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, in addition to or alone the conditions for the total number of natural and unnatural amino acids described above. 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, particularly preferably 5, 6 or 7, the preferred range is 2 to 30, 3 to 30, 6 to 20, 7 to 19. , 7-18, 7-17, 7-16, 7-15, 8-14, 9-13), containing at least one N-unsubstituted amino acid, linear or cyclic It can be a peptide.
  • N substitution examples include, but are not limited to, substitution of a hydrogen atom bonded to an N atom with a methyl group, an ethyl group, a propyl group, a butyl group, a hexyl group and the like.
  • N-substituted amino acid examples include amino acids in which the amino group contained in the natural amino acid is N-methylated, N-ethylated, N-propylated, N-butylated, or N-pentylated, and these are N.
  • N-substituted Converting an N-unsubstituted amino acid to an N-substituted amino acid is called N-substituted, and may be called N-alkylation, N-methylation, or N-ethylation.
  • the ratio of the number of N-substituted amino acids contained in the peptide compound in the present invention is 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more of the total number of amino acids constituting the peptide compound. Illustrated.
  • the peptide compound may contain a salt thereof or a solvate thereof.
  • side chain is used in the context of a side chain of an amino acid or a side chain of a cyclic portion of a cyclic peptide compound, and means a portion not included in the respective main chain structure.
  • the "number of amino acids” is the number of amino acid residues constituting the peptide compound, and when the amide bond, the ester bond, and the cyclization portion linking the amino acids are cleaved. It means the number of amino acid units produced.
  • Step B is a step of removing the unreacted C-terminal active substance contained in the reaction mixture obtained in step A.
  • removal of the unreacted C-terminal active agent is carried out through the action of the unreacted C-terminal active agent with a tertiary amine.
  • the unreacted C-terminal active substance specifically, for example, the C-terminal active substance in the reaction mixture remaining without reacting with the amine component in the condensation process is referred to as "residual C-terminal active substance".
  • residual C-terminal active substance sometimes.
  • step B the reaction mixture obtained in step A, the tertiary amine, and water or an aqueous solution are mixed.
  • the C-terminal activity of the acid component remaining without reacting with the amine component The body remains as an impurity in the reaction solvent. If the remaining C-terminal active substance is present in the system without being sufficiently decomposed, it adversely affects the subsequent deprotection step of the peptide compound and the further extension reaction of the peptide chain, so that it is surely removed. This is very important.
  • tertiary amine one having a nucleophilic reactivity with respect to the residual C-terminal active substance of the acid component can be preferably used.
  • a tertiary amine an amine having a small steric hindrance near nitrogen is preferable.
  • Examples of such a tertiary amine include tertiary amines represented by the following formulas (A), (B), or (C).
  • R 1 ⁇ R 3 , R 1 and R 2 form a non-aromatic heterocyclic 5- to 6-membered together with the nitrogen atom to which they are attached, and R 3 is a C 1- C 2 alkyl (ie, methyl or ethyl) or a C 2 hydroxyalkyl.
  • R 3 is a C 1- C 2 alkyl (ie, methyl or ethyl) or a C 2 hydroxyalkyl.
  • pyrrolidine, a piperidine or morpholine preferably a C 2 hydroxyalkyl, 2-hydroxyethyl.
  • R 1 ⁇ R 3 are each independently C 1 -C 2 alkyl or C 2 hydroxyalkyl.
  • a C 2 hydroxyalkyl is 2-hydroxyethyl.
  • R 1 ⁇ R 3 are each independently include those wherein C 1 -C 2 alkyl.
  • tertiary amine represented by the formula (A) include trimethylamine, N, N-dimethylethylamine, N, N-diethylmethylamine, triethylamine, triethanolamine and the like, and among these, trimethylamine. Is particularly preferable.
  • X is N or O.
  • R 4 and R 5 are each independently, C 1 -C 2 alkyl, or or a C 2 hydroxyalkyl, or they taken together with the nitrogen atom to which they are bonded 5 Form a ⁇ 6-membered non-aromatic heterocycle.
  • R 4 is C 1- C 2 alkyl or C 2 hydroxyalkyl and R 5 is absent.
  • R 6 and R 7 are independently H, C 1- C 2 alkyl, or methoxy, respectively.
  • X is N
  • R 4 and R 5 are each independently a C 1 -C 2 alkyl
  • R 6 and R 7 are H There is one that is.
  • tertiary amine represented by the formula (B) include DMAP, 4-piperidinopyridine, 4-morpholinopyridine and the like, and among these, DMAP is particularly preferable.
  • R 8 and R 9 are independently H, C 1- C 2 alkyl, or C 2 hydroxyalkyl, or nitrogen atoms to which R 8 is attached. And the carbon atom to which R 9 is attached form a 5- to 6-membered non-aromatic heterocycle.
  • pyrrolidine a piperidine or morpholine, preferably a C 2 hydroxyalkyl, 2-hydroxyethyl.
  • the tertiary amine represented by the formula (C) is preferably one in which R 8 and R 9 are independently H or C 1- C 2 alkyl, respectively, and R 8 is C 1- C 2. It is more preferable that it is alkyl and R 9 is H.
  • tertiary amine represented by the formula (C) include NMI, imidazol-1-ethanol, 5,6,7,8-tetrahydroimidazole [1,5- ⁇ ] pyridine, and the like. Of these, NMI is particularly preferable.
  • the tertiary amines of the present invention can promote hydrolysis of the residual C-terminal active substance by nucleophilically attacking the residual C-terminal active substance.
  • Tertiary amines such as DIPEA have bulky substituents and are therefore less nucleophilic and undesirable. Since the hydrolyzate of the residual C-terminal active substance can be removed by moving it to an aqueous layer, the produced peptide compound can be subjected to the next condensation reaction without going through a separate purification step such as column purification.
  • the residual C-terminal active substance can be efficiently removed quickly (for example, within 5 minutes) and with a small number of hydrolysis treatments (for example, only once), which is an embodiment.
  • the residual rate of the C-terminal active substance is 10% or less, 9% or less, 8% or less, 7% or less, 6% or less, 5% or less, 4% or less, 3% or less, 2 It can be less than% and less than 1%.
  • a catalytic amount may be used for the amine component, or an amount equal to or larger than the stoichiometric amount may be used.
  • 0.1 equivalent to 10 equivalents of tertiary amine can be added to the reaction mixture with respect to the amine component, and 0.5 equivalent to 3 equivalents of tertiary amine can be added. preferable.
  • the reaction mixture is mixed at a temperature of ⁇ 20 ° C. to near the boiling point of the solvent, preferably 25 ° C. to 60 ° C. for 1 minute to 48 hours, preferably 2 hours.
  • stirring can be performed for 2 minutes to 2 hours, 5 minutes to 60 minutes, 5 minutes to 50 minutes, or 5 to 30 minutes.
  • water or an aqueous solution can be added to the step of treating the residual C-terminal active substance with a tertiary amine, and an alkaline aqueous solution can be preferably used as the aqueous solution.
  • an alkaline aqueous solution is not particularly limited, but specifically, for example, a potassium carbonate aqueous solution, a lithium hydroxide aqueous solution, a sodium carbonate aqueous solution, sodium hydroxide, a potassium hydroxide aqueous solution, a sodium hydroxide aqueous solution, a cesium carbonate aqueous solution, or the like.
  • aqueous potassium carbonate solution or an aqueous sodium carbonate solution having mild basicity is preferable.
  • the present invention is a step of allowing a tertiary amine to act on a residual C-terminal active agent, then separating the reaction mixture into an organic layer and an aqueous layer to remove the organic layer, and then washing the organic layer. Including further.
  • One example includes cleaning the organic layer with an acidic aqueous solution and a basic aqueous solution.
  • the residual amount of residual C-terminal active form can be 1.0% or less, 0.5% or less, preferably 0.1% or less after this step.
  • the present invention further comprises the step of deprotecting the N-terminal protecting group of the peptide compound (step C).
  • step C deprotection of protecting groups can be performed, for example, by the conventional method described in "Greene's," Protective Groups in Organic Synthesis “(5th edition, John Wiley & Sons 2014)".
  • the deprotection reaction may not proceed sufficiently due to the remaining C-terminal active substance, but by using the method of the present invention, a deprotected substance of the produced peptide compound can be obtained in high yield. be able to.
  • the present invention includes repeating step A and step B a plurality of times. Further, in some embodiments, the present invention includes repeating step A, step B, and step C a plurality of times. By such repetition, the peptide chain can be extended to obtain a peptide compound.
  • the present invention comprises the step of adding a tertiary amine and water or aqueous solution to a solution containing the residual C-terminal active substance to allow the C-terminal active substance to act with the tertiary amine. It relates to a method for promoting hydrolysis of.
  • the residual C-terminal active substance and / or tertiary amine can be used as described above.
  • the aqueous solution is preferably alkaline water.
  • the present invention relates to a method for removing the hydrolyzate, which comprises the step of aqueous washing the solution containing the hydrolyzate of the residual C-terminal active substance.
  • aqueous cleaning cleaning with an alkaline aqueous solution can be carried out in addition to water.
  • the alkaline aqueous solution is not particularly limited, but a potassium carbonate aqueous solution or a sodium carbonate aqueous solution is preferable.
  • the base used forms a salt with a hydrolyzate and is difficult to transfer to the aqueous layer, the base is washed with an acidic aqueous solution to remove it, and then washed with an alkaline aqueous solution.
  • the acidic aqueous solution is not particularly limited, but a potassium hydrogensulfate aqueous solution or a sodium hydrogensulfate aqueous solution is preferable.
  • the alkaline aqueous solution is preferably a potassium carbonate aqueous solution or a sodium carbonate aqueous solution.
  • the present invention is further exemplified by the following examples, but is not limited to the following examples.
  • the residual amount of the C-terminal active substance was evaluated by converting the residual C-terminal active substance into propylamide because the residual C-terminal active substance may be hydrolyzed under analytical conditions (LCMS).
  • the purity of the peptide compound (the object in peptide synthesis) is described as the peak area percent of LCMS.
  • the C-terminal active substance residual rate and the relative value of the C-terminal active substance residual amount were calculated by the formulas described in each Example.
  • the total peak area was corrected by subtracting the area values of the blank peak and the solvent peak.
  • nd represents the meaning of not detected.
  • Example 1 Additive amine effect in hydrolysis of residual C-terminal active substance (adjustment of mixed acid anhydride) 463 mg (1.7 mmol) of Cbz-Ile-OH and 31 mg (internal standard substance: 0.21 mmol) of pentamethylbenzene were dissolved in 3.0 mL of 2-methyltetrahydrofuran. At room temperature, 1.1 mL (6.2 mmol) of diisopropylethylamine and 1.9 mL (3.2 mmol) of a T3P / THF 50% solution were added, and the mixture was stirred at 40 ° C. for 1 hour to prepare a mixed acid anhydride (C-terminal active product) solution.
  • Residual amount of C-terminal active substance Relative value (%) ⁇ [Propylamide (area%) / pentamethylbenzene (area%)] / 3.5 (entry 1, 5 min [propylamide (area%) / pentamethylbenzene) (Area%)]) ⁇ x100
  • the relative value of the residual amount of the C-terminal active substance in Table 1 indicates that the smaller the value, the more the residual C-terminal active substance is hydrolyzed.
  • alkaline water alone there was almost no change in the hydrolysis rate even when the alkali counter cation was changed, and the hydrolysis was slower than when amine was added. It was also found that among the added amines, the addition of DMAP and NMI dramatically promoted the hydrolysis of the residual C-terminal active substance.
  • Residual amount of C-terminal active substance Relative value (%) ⁇ [Propylamide (area%) / pentamethylbenzene (area%)] / 3.0 (entry 1, 5 min [propylamide (area%) / pentamethylbenzene) (Area%)]) ⁇ x100
  • the relative value of the residual amount of the C-terminal active substance in Table 2 indicates that the smaller the value, the more the residual C-terminal active substance is hydrolyzed. It has been found that the addition of amine promotes the hydrolysis of the residual C-terminal active substance than the case of using only alkaline water. That, DBU, Me 3 N, NMI , it is recognized that there is an effect on the addition of DMAP, it was found to be particularly dramatic effect on the addition of NMI and DMAP.
  • Residual amount of C-terminal active substance Relative value (%) ⁇ [Propylamide (area%) / pentamethylbenzene (area%)] / 1.1 ([propylamide (area%) / pentamethylbenzene at entry 1, 5 min) (Area%)] ⁇ x100
  • the relative value of the residual amount of the C-terminal active substance in Table 3 indicates that the smaller the value, the more the residual C-terminal active substance is hydrolyzed.
  • alkaline water alone there was almost no change in the hydrolysis rate even when the alkaline counter cation was changed.
  • DMAP and NMI promoted the hydrolysis of the residual C-terminal active substance as compared with the case of using alkaline water alone. It has been found that the addition of DMAP and NMI is sufficiently effective even within 5 minutes, and in particular, the addition of DMAP completely hydrolyzes the residual C-terminal active substance.
  • Conversion rate (%) ⁇ Cbz-Ile-Phe-OtBu (area%) / [H-Phe-OtBu (area%) + Cbz-Ile-Phe-OtBu (area%)] ⁇ ⁇ 100
  • C-terminal active substance residual rate (%) ⁇ propylamide (area%) / [propylamide (area%) + dipeptide (area%)] ⁇ ⁇ 100
  • the added amine NMI promotes hydrolysis predominantly over hydrolysis by treatment with alkaline water alone by using 0.5 to 3.0 equivalents with respect to the N-terminal amino acid derivative. It was also found that the added amine DMAP promotes hydrolysis predominantly over hydrolysis by treatment with alkaline water alone by using 0.5 to 3.0 equivalents with respect to the N-terminal amino acid derivative.
  • the organic layer can be washed with 5% KHSO 4 and 5% K 2 CO 3 to completely remove the residual C-terminal active substance in the organic layer. I found it. At this time, the target peptide was obtained with high purity. On the other hand, when treated alone with alkaline water, the C-terminal active substance remained and the purity of the dipeptide was low.
  • Conversion rate (%) ⁇ Cbz-Ile-Phe-OtBu (area%) / [H-Phe-OtBu (area%) + Cbz-Ile-Phe-OtBu (area%)] ⁇ ⁇ 100
  • C-terminal active substance residual rate (%) ⁇ propylamide (area%) / [propylamide (area%) + dipeptide (area%)] ⁇ ⁇ 100
  • the peak area value of propylamide and the target peptide was obtained, and the residual rate (%) of the C-terminal active substance was calculated.
  • the aqueous layer of the remaining reaction solution was removed, and the organic layer was washed successively with 0.75 mL of a 5% aqueous potassium hydrogensulfate solution and 0.75 mL of a 5% aqueous potassium carbonate solution. 5 ⁇ L of the organic layer was taken, added to 100 ⁇ L (1.2 mmol) of normal propylamine, the remaining C-terminal active substance was converted to propylamide, and then diluted with 0.9 mL of methanol.
  • C-terminal active substance residual rate (%) ⁇ propylamide (area%) / [propylamide (area%) + dipeptide (area%)] ⁇ ⁇ 100
  • the residual C-terminal active substance was not completely hydrolyzed by the hydrolysis with alkaline water alone, and the residual C-terminal active substance could not be removed by the subsequent aqueous washing. It has been found that the hydrolysis of the residual C-terminal active substance is completely achieved and the residual C-terminal active substance can be completely removed. Moreover, at this time, the target dipeptide was obtained with 100% purity (yield 95%).
  • Example 7 Synthesis of Cbz-MeVal-MeAsp (tBu) -piperidine (condensation reaction) MeAsp (tBu) -piperidine 303 mg (1.1 mmol) and Cbz-MeVal-OH 448 mg (1.7 mmol) were suspended in a mixed solvent of 0.6 mL of acetonitrile and 2.4 mL of cyclopentyl methyl ether, and 586 ⁇ L (3.4 mmol) of diisopropylethylamine was added. It was. Next, HATU 642 mg (1.7 mmol) was added at 25 ° C., and the mixture was stirred at 25 ° C.
  • the residual C-terminal active substance was not completely hydrolyzed by the hydrolysis with alkaline water alone, and the residual C-terminal active substance could not be removed by the subsequent aqueous washing. It has been found that the hydrolysis of the residual C-terminal active substance is completely achieved and the residual C-terminal active substance can be completely removed. Moreover, at this time, the target dipeptide was obtained with 100% purity (yield 92%).
  • Conversion rate (%) ⁇ Cbz-MeVal-MeAsp (tBu) -piperidine (area%) / [MeAsp (tBu) -piperidine (area%) + Cbz-MeVal-MeAsp (tBu) -piperidine (area%)] ⁇ ⁇ 100
  • the residual C-terminal active substance was not completely hydrolyzed by the hydrolysis with alkaline water alone, and the residual C-terminal active substance could not be removed by the subsequent aqueous washing. It has been found that the hydrolysis of the residual C-terminal active substance is completely achieved and the residual C-terminal active substance can be completely removed. Moreover, at this time, the target dipeptide was obtained with 100% purity (yield 87%).
  • Example 9 Synthesis of Cbz-Ile-MeVal-MeAsp (tBu) -piperidine (Cbz deprotection reaction using a dipeptide obtained by hydrolysis treatment without addition of amine) 782 mg of Cbz-MeVal-MeAsp (tBu) -piperidine (containing 17.6 area% of the residual C-terminal active substance) synthesized under the amine-free condition of Example 7 was dissolved in 4.2 mL of cyclopentyl methyl ether. The hydrogen decomposition reaction was carried out with 115 mg of 5% Pd / C (50% wet) and hydrogen gas.
  • reaction conversion rate was determined from the peak area value of LC / MS by taking 5 ⁇ L of the solution, diluting it with 1.0 mL of acetonitrile, and then subjecting the filtered solution to LC / MS analysis.
  • reaction conversion rate was determined from the peak area value of LC / MS by taking 5 ⁇ L of the reaction solution, diluting it with 1.0 mL of acetonitrile, and then subjecting the filter-filtered solution to LC / MS analysis.
  • Conversion rate (%) ⁇ MeVal-MeAsp (tBu) -piperidine (area%) / [MeVal-MeAsp (tBu) -piperidine (area%) + Cbz-MeVal-MeAsp (tBu) -piperidine (area%)] ⁇ ⁇ 100
  • the reaction conversion rate was determined from the peak area value of LC / MS by taking 5 ⁇ L of the reaction solution, adding 100 ⁇ L of normal propylamine, and subjecting the solution diluted with 0.9 mL of methanol to LC / MS analysis.
  • Conversion rate (%) ⁇ Cbz-Phe (3-F) -Phe-OtBu (area%) / [Phe-OtBu (area%) + Cbz-Phe (3-F) -Phe-OtBu (area%)] ⁇ ⁇ 100
  • the reaction conversion rate was determined from the peak area value of LC / MS by taking 5 ⁇ L of the reaction solution, adding 100 ⁇ L of normal propylamine, and subjecting the solution diluted with 0.9 mL of methanol to LC / MS analysis.
  • Conversion rate (%) ⁇ Boc-MeVal-Phe-piperidine (area%) / [Phe-piperidine (area%) + Boc-MeVal-Phe-piperidine (area%)] ⁇ ⁇ 100
  • the reaction solution was washed with 150 mL of a 10% aqueous potassium hydrogen sulfate solution, 150 mL of a 5% aqueous potassium carbonate solution and 9.52 g (101 mmol) of trimethylamine hydrochloride were added, and the mixture was stirred at 40 ° C. for 90 minutes. Stirring was stopped and the organic layer and the aqueous layer were separated. The aqueous layer was removed, and the remaining organic layer was washed with 150 mL of a 5% potassium carbonate aqueous solution, and then the obtained organic layer was concentrated to obtain 17 g of a concentrate (yield: quant.). This concentrate was subjected to LC / MS analysis to determine the peak area percentage of the target Cbz-MeVal-Asp (tBu) -piperidine (99.7 area%).
  • the reaction solution was washed with 140 mL of a 5% aqueous potassium hydrogen sulfate solution, 140 mL of a 5% aqueous potassium carbonate solution and 10.9 g (114 mmol) of trimethylamine hydrochloride were added, and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes. Stirring was stopped and the organic layer and the aqueous layer were separated. The aqueous layer was removed, and the remaining organic layer was washed with 140 mL of a 5% aqueous potassium carbonate solution, and then the obtained organic layer was concentrated to obtain 24.1 g of a concentrate (yield 96%). This concentrate was subjected to LC / MS analysis, and the peak area percentage of the target Cbz-MePhe-MeVal-Asp (tBu) -piperidine was determined (99.6 area%).
  • the reaction mixture was washed with 170 mL of a 5% aqueous potassium hydrogensulfate solution, 170 mL of a 5% aqueous potassium carbonate solution and 9.4 g (98.0 mmol) of trimethylamine hydrochloride were added, and the mixture was stirred at room temperature for 2 hours. Stirring was stopped and the organic layer and the aqueous layer were separated. The aqueous layer was removed, and the remaining organic layer was washed with 170 mL of a 5% potassium carbonate aqueous solution, and then the obtained organic layer was concentrated to obtain 26.5 g of a concentrate (yield: quant.).
  • the reaction solution was washed with 240 mL of a 10% aqueous sodium hydrogensulfate solution, 240 mL of a 5% aqueous potassium carbonate solution and 6.7 g (71.2 mmol) of trimethylamine hydrochloride were added, and the mixture was stirred at 40 ° C. for 1.5 hours. Stirring was stopped and the organic layer and the aqueous layer were separated. The aqueous layer was removed, and the remaining organic layer was washed with 240 mL of a 5% potassium carbonate aqueous solution, and then the obtained organic layer was concentrated to obtain 22.2 g of a concentrate (yield: quant.).
  • the reaction solution was washed with 153 mL of a 5% aqueous potassium hydrogen sulfate solution, 153 mL of a 5% aqueous potassium carbonate solution was added, and the mixture was stirred at room temperature for 5 minutes. Stirring was stopped, the organic layer and the aqueous layer were separated, the aqueous layer was removed, 153 mL of a 5% potassium carbonate aqueous solution was added, and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour. After removing the aqueous layer, the obtained organic layer was concentrated to obtain 19.5 g of a concentrate (yield: quant.).
  • the reaction solution was washed with 128 mL of a 10% aqueous sodium hydrogensulfate solution, 128 mL of a 5% aqueous potassium carbonate solution and 4.2 g (44.8 mmol) of trimethylamine hydrochloride were added, and the mixture was stirred at 40 ° C. for 30 minutes. Stirring was stopped, the organic layer and the aqueous layer were separated to remove the aqueous layer, and then the obtained organic layer was washed with 128 mL of a 5% potassium carbonate aqueous solution and concentrated to obtain 18.0 g of a concentrate (yield). Rate 98%).
  • the reaction solution was washed with 130 mL of a 5% aqueous potassium hydrogen sulfate solution, 130 mL of a 5% aqueous potassium carbonate solution and 3.4 g (35.5 mmol) of trimethylamine hydrochloride were added, and the mixture was stirred at 60 ° C. for 45 minutes. Stirring was stopped, the organic layer and the aqueous layer were separated to remove the aqueous layer, and then the obtained organic layer was washed with 130 mL of a 5% potassium carbonate aqueous solution and concentrated to obtain 15.6 g of a concentrate (yield). Rate 98%).
  • the reaction solution was washed with 105 mL of a 10% aqueous sodium hydrogensulfate solution, 105 mL of a 5% aqueous potassium carbonate solution and 1.7 g (17.3 mmol) of trimethylamine hydrochloride were added, and the mixture was stirred at 40 ° C. for 30 minutes. Stirring was stopped, the organic layer and the aqueous layer were separated to remove the aqueous layer, and then the obtained organic layer was washed with 105 mL of a 5% potassium carbonate aqueous solution and concentrated to obtain 8.6 g of a concentrate (yield). Rate 99%).
  • the reaction mixture was washed with 5.0 mL of a 10% aqueous sodium hydrogensulfate solution, 5.0 mL of a 5% aqueous potassium carbonate solution and 104 mg (1.1 mmol) of trimethylamine hydrochloride were added, and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour. Stirring was stopped, the organic layer and the aqueous layer were separated to remove the aqueous layer, and then the obtained organic layer was washed with 5.0 mL of a 5% aqueous potassium carbonate solution and concentrated to obtain 555 mg of a concentrate (yield).
  • the reaction solution was acidified by adding a 5% aqueous potassium hydrogensulfate solution, extracted with 50 mL of ethyl acetate, and the organic layer was washed with saturated brine.
  • the obtained organic layer was concentrated to dryness, and the concentrate was dissolved in 30 mL of dichloromethane.
  • Pfp-OH 3.10 g (16.2 mmol) and EDC hydrochloride 4.53 g (24.3 mmol) were added, and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes to carry out a Pfp conversion reaction.
  • the aqueous layer was extracted with 50 mL of ethyl acetate.
  • the combined organic layers were concentrated, and the obtained concentrate was purified by column chromatography (ethyl acetate / heptane) to obtain 6.63 g of Teoc-MeLeu-OPfp (yield: 90%).
  • Conversion rate (%) ⁇ Teoc-MeLeu-Phe-OtBu (area%) / [Phe-OtBu (area%) + Teoc-MeLeu-Phe-OtBu (area%)] ⁇ ⁇ 100
  • the peak area of the target peptide and the residual C-terminal active substance (converted to propylamide) was determined.
  • the concentrate (peptide) obtained by non-amine addition hydrolysis was 576.6 mg (yield 150%: the concentrate contained impurities (residual C-terminal active substance), but was calculated as containing only the peptide. ).
  • the concentrate obtained by hydrolysis with the addition of amine was 369.6 mg (yield 96%).
  • Example 16 Synthesis of Cbz-Aib-MeLeu-Phe-OtBu (Teoc deprotection reaction using a dipeptide obtained by hydrolysis treatment without addition of amine) Teoc-MeLeu-Phe-OtBu 576.6 mg (containing 8.9 area% of residual C-terminal active substance) synthesized under the amine-free condition of Example 15 was dissolved in 2.0 mL of 2-methyltetrahydrofuran. After adding 1.5 mL (1.5 mmol) of TBAF in 8.4% hydrous tetrahydrofuran, the mixture was stirred at 50 ° C. for 2.5 hours.
  • HATU 684 mg (1.8 mmol) was added and the temperature was raised to 60 ° C., and the mixture was stirred for 4.5 hours. Further, HATU 455 mg (1.1 mmol) was added, and the mixture was stirred at 60 ° C. for 2 hours, at room temperature for 12 hours, and at 60 ° C. for 2 hours, but no progress of the condensation reaction was observed (conversion rate: 0%).
  • the reaction conversion rate was determined from the peak area value of LC / MS by adding 5 ⁇ L of the reaction solution to 100 ⁇ L of propylamine, diluting with 0.9 mL of methanol, and then subjecting to LC / MS analysis.
  • Teoc deprotection reaction using a dipeptide obtained by hydrolysis treatment with amine addition Teoc-MeLeu-Phe-OtBu 369.6 mg (0.75 mmol) synthesized under the amine addition conditions of Example 15 was dissolved in 2.0 mL of 2-methyltetrahydrofuran. After adding 1.5 mL (1.5 mmol) of TBAF's 8.4% hydrous tetrahydrofuran solution, the mixture was stirred at 50 ° C. for 2.5 hours to obtain a de-Teoc form, MeLeu-Phe-OtBu (conversion rate: 100%).
  • HATU 452 mg (1.1 mmol) was added, and the mixture was stirred at 60 ° C. for 2 hours, at room temperature for 12 hours, and at 60 ° C. for 2 hours (conversion rate 86%).
  • the reaction conversion rate was determined from the peak area value of LC / MS by adding 5 ⁇ L of the reaction solution to 100 ⁇ L of propylamine, diluting with 0.9 mL of methanol, and then subjecting to LC / MS analysis.
  • the target peptide Cbz-Aib-MeLeu-Phe-OtBu was 86.7%, the raw material MeLeu-Phe-OtBu was 13.3%, and Cbz-Aib-NHPr derived from the residual C-terminal active substance was not detected.
  • the remaining organic layer was concentrated to obtain 295.6 mg of a concentrate having the above composition.
  • Example 18 Synthesis of Cbz-Hph-MeAla-Phe-OtBu (Cbz deprotection reaction using a dipeptide obtained by hydrolysis treatment without addition of amine)
  • the MTBE solution of Cbz-MeAla-Phe-OtBu synthesized under the amine-free condition of Example 17 was replaced with 2-methyltetrahydrofuran and concentrated.
  • the hydrogen decomposition reaction was carried out with 101 mg of 5% Pd / C (50% wet) and hydrogen gas. The reaction was not completed after stirring at 25 ° C. for 6 hours (conversion rate 35%).
  • reaction conversion rate was determined from the peak area value of LC / MS by taking 5 ⁇ L of the reaction solution, diluting it with 1.0 mL of acetonitrile, and subjecting it to LC / MS analysis.
  • Conversion rate (%) ⁇ MeAla-Phe-OtBu (area%) / [Cbz-MeAla-Phe-OtBu (area%) + MeALa-Phe-OtBu (area%)] ⁇ ⁇ 100
  • Conversion rate 100%.
  • the reaction conversion rate was determined from the peak area value of LC / MS by adding 5 ⁇ L of the reaction solution to 100 ⁇ L of propylamine, diluting with 0.9 mL of methanol, and then subjecting to LC / MS analysis.
  • Conversion rate (%) ⁇ Cbz-Hph-MeAla-Phe-OtBu (area%) / [MeAla-Phe-OtBu (area%) + Cbz-Hph-MeAla-Phe-OtBu (area%)] ⁇ ⁇ 100
  • the remaining organic layer was concentrated to give a peptide.
  • the concentrate (peptide) obtained by hydrolysis without the addition of amine was 653.8 mg (yield 116%: the concentrate contained impurities (residual C-terminal active substance), but contained only peptides. Calculated).
  • the concentrate obtained by hydrolysis with the addition of amine was 549.4 mg (yield 97%).
  • Example 21 Synthesis of Cbz-Leu-Thr (tBu) -Phe-OtBu (Cbz deprotection reaction using a dipeptide obtained by hydrolysis treatment without addition of amine)
  • the MTBE / 2-MeTHF solution of Cbz-Thr (tBu) -Phe-OtBu synthesized under the amine-free condition of Example 20 was replaced with 2-methyltetrahydrofuran and concentrated. It was subjected to a hydrogenolysis reaction with 99 mg of 5% Pd / C (50% wet) and hydrogen gas. The reaction was not completed after stirring at 25 ° C. for 1 hour (conversion rate 53%).
  • Conversion rate 100%.
  • Conversion rate (%) ⁇ Cbz-Leu-Thr (tBu) -Phe-OtBu (Area%) / [Thr (tBu) -Phe-OtBu (Area%) + Cbz-Leu-Thr (tBu) -Phe-OtBu (Area%)] ⁇ ⁇ 100
  • DMAP 128 mg (1.0 mmol) and 3.5 mL of a 5% potassium carbonate aqueous solution were added to the reaction solution prepared above, and the mixture was stirred at 25 ° C. for 3 minutes with a stirrer. After stopping the stirring, the mixture was allowed to stand, and the organic layer and the aqueous layer were separated to remove the aqueous layer. The organic layer was then diluted with 3.5 mL x 2 of a 10% potassium sulfate aqueous solution and 3.5 mL of a 5% potassium carbonate aqueous solution. This solution was subjected to LC / MS analysis to determine the peak area percentages of the peptide of interest and residual C-terminal actives.
  • the target peptide Cbz-Phe-MeGly-Phe-piperidine had a purity of 94.6%, and Cbz-Phe-MeGly-NHPr derived from the residual C-terminal active substance was not detected.
  • the remaining organic layer was concentrated to obtain 520.4 mg of concentrate (yield 94%).
  • C-terminal active substance residual rate (%) ⁇ propylamide (area%) / [propylamide (area%) + dipeptide (area%)] ⁇ ⁇ 100
  • C-terminal active substance residual rate (%) ⁇ propylamide (area%) / [propylamide (area%) + dipeptide area%)] ⁇ ⁇ 100
  • DIPEA slightly promoted the hydrolysis of the residual C-terminal active substance as compared with the case of alkaline water without amine added alone, but no significant effect was observed.
  • DMAP and NMI significantly promotes the hydrolysis of the residual C-terminal active substance as compared with the addition of DIPEA, and the residual C-terminal active substance may be completely hydrolyzed within 5 minutes, especially when DMAP is used. found.
  • amines with less steric hindrance near nitrogen such as DMAP
  • DMT-MM-n hydrate (4- (4,6-dimethoxy-1,3,5-triazine-2-yl) -4-methylmorpholinium chloride n hydrate) 265 mg ( 0.8 mmol, 13 w% water content) was added and stirred at 25 ° C. for 1 hour, then DMT-MM-n hydrate 119 mg (0.4 mmol, 13 w% water content) was added and stirred at 25 ° C. for 1 hour.
  • a peptide bond formation reaction was carried out.
  • the residual C-terminal active substance was not completely hydrolyzed by hydrolysis with alkaline water alone, and the residual C-terminal active substance could not be removed by subsequent aqueous washing. It was found that when DMAP was added and hydrolyzed, the residual C-terminal active substance was completely hydrolyzed and the residual C-terminal active substance could be completely removed. At this time, the target dipeptide was obtained with a purity of 98.6% (yield 98%). It is known that the C-terminal active substance produced from DMT-MM, which is a condensing agent that can be used even in a water-containing solvent, is relatively resistant to hydrolysis. However, if an amine additive is used, even the residual C-terminal active substance prepared using DMT-MM can be completely hydrolyzed in a short time and once, and can be completely removed by the subsequent aqueous washing. I found.
  • Reference example 1 Synthesis method of MeAsp (tBu) -piperidine (condensation reaction) 10.2 g (19.6 mmol) of Cbz-MeAsp (tBu) -OH dicyclohexylamine salt was turbid in 100 mL of ethyl acetate, and 20.6 mL (118 mmol) of diisopropylethylamine and 9.7 mL (98.0 mmol) of piperidine were added. 35.0 mL (58.9 mmol) of a 50% T3P / ethyl acetate solution was added dropwise at 3-10 ° C. over 45 minutes.
  • Conversion rate (%) ⁇ Cbz-MeAsp (tBu) -piperidine (area%) / [Cbz-MeAsp (tBu) -OH (area%) + Cbz-MeAsp (tBu) -piperidine (area%)] ⁇ ⁇ 100
  • a high-purity peptide compound can be produced without column purification by efficiently removing the C-terminal active substance remaining after the condensation reaction when producing the peptide compound.

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Abstract

本発明者らは、酸成分のＣ末端活性体とアミン成分とを縮合させることを含むペプチド化合物の合成において、縮合反応後に残存したＣ末端活性体を含む溶液を、三級アミンと水または水溶液と混合することで、Ｃ末端活性体を除去できることを見出した。

Description

ペプチド化合物の合成法
　本発明は、ペプチド化合物の合成過程で生じる不要なＣ末端活性体を効率的に除去して、目的のペプチド化合物を効率的に製造する方法に関する。
　ペプチド合成は、その一形態として、アミノ酸、ペプチドなどのアミン類と反応してアミド結合形成を可能とするように、アミノ酸またはペプチドのＣ末端カルボキシル基を活性化した化合物を用いて行われる。この場合、反応終了後の反応溶液にカルボキシル基が活性化された化合物が残存すると、生成したペプチドの品質低下という問題を引き起こす。
　このようなＣ末端が活性化された化合物とは、ペプチド合成反応に用いたカルボキシル基が活性化された化合物のみならず、それが反応中で、例えば、アズラクトン、ＮＣＡ（Ｎ－カルボキシ無水物（N-carboxyanhydride））などに変化して活性化状態を有することでアミン類と反応し得る化合物も含む（以後、これら化合物を「Ｃ末端活性体」と称する場合がある）。また、ペプチド合成反応に用いるＣ末端活性体は、例えば、非特許文献１または非特許文献２に記されているようなペプチド縮合剤を用いて合成される活性エステル、混合酸無水物およびアシルイソウレアなどに限られるものではなく、アミン類と反応しうるように活性化されていれば、任意の化合物が含まれる。
　生成したペプチドの品質低下の例としては、Ｃ末端活性体の残存に起因して、不純物ペプチドの副生を招くことや、挿入配列のペプチドが最終産物の不純物として混入することが知られている（特許文献１、２）。
　このような残存Ｃ末端活性体の問題を解消する方法として、アルカリ水で処理して活性エステルを加水分解し、対応するアミノ酸のアルカリ水溶液として除去する方法が知られている（特許文献１）。しかしながら、この方法では、アルカリ水での加水分解処理を複数回行う必要があり、操作が煩雑である。加えて、アルカリ水での処理回数が増え、その処理時間が長くなると、生成物のエピメリ化（異性化）などの副反応を引き起こすことが推測され、堅牢性を損ない得る。
　また、残存Ｃ末端活性体をＮ，Ｎ－ジメチルプロパン－１，３－ジアミンなどの１級アミノ基を有するポリアミンで捕捉し、塩基性化合物へと変換した後、酸性水溶液による水性洗浄で残存Ｃ末端活性体由来のアミド化合物を水層へ移行させて除去する方法が知られている (特許文献３、非特許文献３)。しかしながら、求核性が高い１級アミン類を用いると、目的ペプチドの求電子性が高い部位と１級アミンが反応し、共有結合を形成した不純物を生じることが推定されるため、高純度ペプチドの合成には不向きである。
　また残存Ｃ末端活性体を、保護基を有する潜在アニオンを含むアミンである捕捉剤と反応させて、アミド化合物に変換して除去する方法が知られている（特許文献２）。しかしながら、この方法では、アミド化合物を形成させた後に、水性抽出段階を経て、水素化分解を行った後に、さらに再度の水性抽出段階を経る必要があるため、操作が煩雑である。
　また、Ｃ末端活性体が残存していると、生成したペプチドのＮ末端の保護基を脱保護する際に、該Ｃ末端活性体のＮ末端の保護基の脱保護も同時に起こることがある。残存Ｃ末端活性体の脱保護体は不純物であるが、吸光係数が小さい場合には汎用的なＨＰＬＣで検出することが困難なため、品質管理上好ましくない。
特許第5171613号公報 特許第4142907号公報 特許第5212371号公報
Chem. Rev., 2011, 111, 6557. Organic Process Research & Development, 2016, 20, 140. Tetrahedron Lett., 1974, 15, 1785.
　本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、一局面において、ペプチド化合物の合成において、残存するＣ末端活性体を効率的に除去することを課題とする。
　本発明者らは、酸成分のＣ末端活性体とアミン成分とを縮合させることを含むペプチド化合物の合成において、反応混合液中の残存Ｃ末端活性体を、三級アミンと作用させることを通じて、除去できる手法を見出した。
　本発明は、非限定の具体的な一態様において以下を包含する。
〔１〕ペプチド化合物を製造する方法であって、
工程Ａ：溶媒中で酸成分のＣ末端活性体をアミン成分と縮合させて得られるペプチド化合物を含む、反応混合液を得る工程、および
工程Ｂ：前記反応混合液と三級アミンと水または水溶液とを混合し、該Ｃ末端活性体を除去する工程
を含む、前記方法。
〔２〕ペプチド化合物を製造する方法であって、
工程Ａ：溶媒中で酸成分のＣ末端活性体をアミン成分と縮合させて得られるペプチド化合物を含む、反応混合液を得る工程、および
工程Ｂ：前記反応混合液と三級アミンと水または水溶液とを混合し、該三級アミンを未反応のＣ末端活性体と作用させることを通じて該Ｃ末端活性体を除去する工程
を含む、前記方法。
〔３〕酸成分が、アミノ基が保護基で保護された第１のアミノ酸、またはＮ末端のアミノ基が保護基で保護された第１のペプチドである、〔１〕または〔２〕に記載の方法。
〔４〕アミン成分が、カルボキシル基が保護基で保護された第２のアミノ酸、またはＣ末端のカルボキシル基が保護基で保護された第２のペプチドである、〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕工程Ａが縮合剤の存在下で行われる、〔１〕～〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕前記三級アミンが、前記Ｃ末端活性体に対して求核反応性を有する、〔１〕～〔５〕のいずれかに記載の方法。
〔７〕前記三級アミンが、窒素近傍の立体障害が小さいアミンである、〔１〕～〔６〕のいずれかに記載の方法。
〔８〕前記三級アミンが、下記式（Ａ）、（Ｂ）、または（Ｃ）で表され：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
式中、
　Ｒ１～Ｒ３は、(i)Ｒ１およびＲ２がそれらが結合している窒素原子と一緒になって５～６員非芳香族複素環を形成し、かつＲ３がＣ１－Ｃ２アルキルまたはＣ２ヒドロキシアルキルであるか、または (ii) それぞれ独立して、Ｃ１－Ｃ２アルキル、もしくはＣ２ヒドロキシアルキルであり、
　Ｘは、ＮまたはＯであり、
　Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、Ｃ１－Ｃ２アルキル、もしくはＣ２ヒドロキシアルキルであるか、またはそれらが結合している窒素原子と一緒になって５～６員非芳香族複素環を形成し、但し、ＸがＯである場合、Ｒ５は存在せず、
　Ｒ６およびＲ７は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１－Ｃ２アルキル、またはメトキシであり、
　Ｒ８およびＲ９は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１－Ｃ２アルキル、もしくはＣ２ヒドロキシアルキルであるか、またはＲ８が結合している窒素原子およびＲ９が結合している炭素原子と一緒になって５～６員非芳香族複素環を形成する、〔１〕～〔７〕のいずれかに記載の方法。
〔９〕Ｒ１～Ｒ３が、それぞれ独立して、Ｃ１－Ｃ２アルキルである、〔８〕に記載の方法。
〔１０〕ＸがＮであり、Ｒ４およびＲ５が、それぞれ独立して、Ｃ１－Ｃ２アルキルであり、Ｒ６およびＲ７がＨである、〔８〕に記載の方法。
〔１１〕Ｒ８およびＲ９が、それぞれ独立して、ＨまたはＣ１－Ｃ２アルキルである、〔８〕に記載の方法。
〔１２〕前記三級アミンが、ＮＭＩ、ＤＭＡＰ、またはトリメチルアミンである、〔１〕～〔１１〕のいずれかに記載の方法。
〔１３〕前記ペプチド化合物が、１つまたは複数の非天然アミノ酸を含む、〔１〕～〔１２〕のいずれかに記載の方法。
〔１４〕前記三級アミンを前記Ｃ末端活性体と作用させる際の温度が、２５℃～６０℃である、〔１〕～〔１３〕のいずれかに記載の方法。
〔１５〕前記アミン成分に対して、前記三級アミンを０．５当量以上加える、〔１〕～〔１４〕のいずれかに記載の方法。
〔１６〕Ｃ末端活性体の残存率が３％以下である、〔１〕～〔１５〕のいずれかに記載の方法。
〔１７〕工程Ｂにおいて、前記反応混合液を有機層と水層に分層し、次いで該有機層を洗浄することをさらに含み、該洗浄後のＣ末端活性体の残存量が１．０％以下である、〔１〕～〔１６〕のいずれかに記載の方法。
〔１８〕前記工程Ａにおける溶媒が、トルエン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、酢酸イソプロピル、酢酸エチル、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル、もしくはＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、またはその混合溶媒である、〔１〕～〔１７〕のいずれかに記載の方法。
〔１９〕前記工程Ｂにおいて、前記水溶液がアルカリ水溶液である、〔１〕～〔１８〕のいずれかに記載の方法。
〔２０〕第１のアミノ酸の側鎖が、１個以上の炭素原子を含む、〔１〕～〔１９〕のいずれかに記載の方法。
〔２１〕前記側鎖が、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよいアルコキシアルキル、置換されていてもよいシクロアルキルアルキル、置換されていてもよいアラルキル、または置換されていてもよいヘテロアリールアルキルである、〔２０〕に記載の方法。
〔２２〕前記三級アミンを前記Ｃ末端活性体と作用させる際の時間が、２時間以下である、〔１〕～〔２１〕のいずれかに記載の方法。
〔２３〕前記三級アミンを前記Ｃ末端活性体と作用させる際の時間が、２分～２時間である、〔１〕～〔２２〕のいずれかに記載の方法。
〔２４〕前記三級アミンを前記Ｃ末端活性体と作用させる際の時間が、５分～６０分である、〔１〕～〔２３〕のいずれかに記載の方法。
〔２５〕前記三級アミンを前記Ｃ末端活性体と作用させる際の時間が、５分～５０分である、〔１〕～〔２４〕のいずれかに記載の方法。
〔２６〕前記Ｃ末端活性体が縮合剤の存在下で形成され、該縮合剤がＴ３Ｐ、ＨＡＴＵ、ＢＥＰ、ＤＭＴ－ＭＭ、ＥＤＣとＰｆｐＯＨの組み合わせ、ＥＤＣとＨＯＯＢｔの組み合わせ、またはＥＤＣとＨＯＢｔの組み合わせを含む、〔１〕～〔２５〕のいずれかに記載の方法。
〔２７〕工程Ｃ：前記ペプチド化合物のＮ末端の保護基を脱保護する工程をさらに含む、〔１〕～〔２６〕のいずれかに記載の方法。
〔２８〕前記Ｃ末端活性体を、前記三級アミンと作用させて加水分解し、除去する、〔１〕～〔２７〕に記載の方法。
〔２９〕残存Ｃ末端活性体を含む溶液に三級アミンと水または水溶液を追加して、該Ｃ末端活性体を三級アミンと作用させる工程を含む、該Ｃ末端活性体の加水分解を促進する方法。
〔３０〕残存Ｃ末端活性体の加水分解体を含む溶液を水性洗浄する工程を含む、該加水分解体を除去する方法。
　本発明の方法を用いることで、縮合反応後に残存しているＣ末端活性体を、１回の加水分解処理とそれに続く水性洗浄により、簡便にかつ短時間で効率的に除去できるため、カラム精製することなく、ペプチド化合物を純度よく合成することができる。
Ｃ末端活性体の残存量相対値を示す図である。 Ｃ末端活性体の残存量相対値を示す図である。 Ｃ末端活性体の残存量相対値を示す図である。 Ｃ末端活性体の残存率の推移を示す図である。
　以下に、本開示の好ましい非限定的な実施態様を説明する。
　後述する本実施例に記載されるあらゆる要素(element)は、本特許出願の権利化を意図する国における、実施例に記載の内容を限定的に解釈しようとし得るいかなる特許実務、慣習、法令等の制限に縛られることなく、本「発明を実施するための形態」においても同等に記載されていると当然にみなされることを意図して記載される。
　本開示におけるいずれかに記載の一又は複数の要素(element)の一部又は全部を任意に組み合わせたものも、当業者の技術常識に基づいて技術的に矛盾しない限り、本開示に含まれることが意図され、かつ、当業者には当然に理解されるものとして記載される。
（略語）
　本明細書において使用される略語を以下に記す。
アミノ酸の略語
　Ａｉｂ：α－メチルアラニン
　Ａｌａ：アラニン
　Ａｒｇ：アルギニン
　Ａｓｎ：アスパラギン
　Ａｓｐ：アスパラギン酸
　Ａｓｐ（ｔＢｕ）：Ｏ－ｔ－ブチルアスパラギン酸
　Ａｚｅ：アゼチジン－２－カルボン酸
　Ｃｙｓ：システイン
　Ｇｌｕ：グルタミン酸
　Ｇｌｎ：グルタミン
　Ｇｌｙ：グリシン
　Ｈｉｓ：ヒスチジン
　Ｈｐｈ：ホモフェニルアラニン
　Ｉｌｅ：イソロイシン
　Ｌｅｕ：ロイシン
　Ｌｙｓ：リシン
　ＭｅＡｌａ：Ｎ－メチルアラニン
　ＭｅＡｓｐ（ｔＢｕ）：Ｎ－メチルＯ－ｔ－ブチルアスパラギン酸
　ＭｅＧｌｙ：Ｎ－メチルグリシン
　ＭｅＩｌｅ：Ｎ－メチルイソロイシン
　ＭｅＬｅｕ：Ｎ－メチルロイシン
　ＭｅＰｈｅ：Ｎ－メチルフェニルアラニン
　ＭｅＶａｌ：Ｎ－メチルバリン
　Ｍｅｔ：メチオニン
　Ｐｈｅ：フェニルアラニン
　Ｐｈｅ－ＯｔＢｕ：Ｏ－ｔ－ブチルフェニルアラニン
　Ｐｈｅ（３－Ｆ）：３－フルオロフェニルアラニン
　Ｐｒｏ：プロリン
　Ｓｅｒ：セリン
　Ｓｅｒ（ｔＢｕ）：Ｏ－ｔ－ブチルセリン
　Ｔｈｒ：スレオニン
　Ｔｈｒ（ｔＢｕ）：Ｏ－ｔ－ブチル－スレオニン
　Ｔｒｐ：トリプトファン
　Ｔｙｒ：チロシン
　Ｖａｌ：バリン
試薬／溶媒の略語
　ＢＥＰ：テトラフルオロほう酸２－ブロモ－１－エチルピリジニウム
　ＤＡＢＣＯ：１，４－ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン
　ＤＢＵ：１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ－７－エン
　ＤＣＭ：ジクロロメタン
　ＤＩＰＥＡ：ジイソプロピルジエチルアミン
　ＤＭＡＰ：ジメチルアミノピリジン
　ＤＭＴ－ＭＭ：４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド
　ＥＤＣ：１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド
　ＨＡＴＵ：Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩
　ＨＯＡｔ：１－アザヒドロキシベンゾトリアゾール
　ＨＯＢｔ：１－ヒドロキシベンゾトリアゾール
　ＨＯＯＢｔ：３，４－ジヒドロ－３－ヒドロキシ－４－オキソ－１，２，３－ベンゾトリアジン
　ＨＯＳｕ：Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド
　ＭＴＢＥ：メチル－ｔ－ブチルエーテル
　ＮＭＩ：Ｎ－メチルイミダゾール
　ＮＭＭ：Ｎ－メチルモルホリン
　Ｔ３Ｐ：プロピルホスホン酸無水物（環状トリマー）
　ＴＢＡＦ：テトラブチルアンモニウムフルオリド
　ＴｓＯＨ：ｐ－トルエンスルホン酸
官能基の略語
　Ｂｎ：ベンジル
　Ｂｏｃ：ｔ－ブトキシカルボニル
　Ｃｂｚ：ベンジルオキシカルボニル
　Ｐｆｐ：ペンタフルオロフェニル
　Ｔｅｏｃ：２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル
（官能基等の定義）
　本明細書における「ハロゲン原子」としては、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩが例示される。
　本明細書において「アルキル」とは、脂肪族炭化水素から任意の水素原子を１個除いて誘導される１価の基であり、骨格中にヘテロ原子（炭素及び水素原子以外の原子をいう。）または不飽和の炭素－炭素結合を含有せず、水素及び炭素原子を含有するヒドロカルビルまたは炭化水素基構造の部分集合を有する。アルキルは直鎖状のものだけでなく、分枝鎖状のものも含む。アルキルとして具体的には、炭素原子数１～２０（Ｃ１－Ｃ２０、以下「Ｃｐ－Ｃｑ」とは炭素原子数がｐ～ｑ個であることを意味する）のアルキルであり、好ましくはＣ１－Ｃ１０アルキル、より好ましくはＣ１－Ｃ６アルキル、さらに好ましくはＣ１－Ｃ２アルキルが挙げられる。アルキルとして、具体的には、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉ－プロピル、ｎ－ブチル、ｓ－ブチル、ｔ－ブチル、イソブチル（２－メチルプロピル）、ｎ－ペンチル、ｓ－ペンチル（１－メチルブチル）、ｔ－ペンチル（１，１－ジメチルプロピル）、ネオペンチル（２，２－ジメチルプロピル）、イソペンチル（３－メチルブチル）、３－ペンチル（１－エチルプロピル）、１，２－ジメチルプロピル、２－メチルブチル、ｎ－ヘキシル、１，１，２－トリメチルプロピル、１，２，２－トリメチルプロピル、１，１，２，２－テトラメチルプロピル、１，１－ジメチルブチル、１，２－ジメチルブチル、１，３－ジメチルブチル、２，２－ジメチルブチル、２，３－ジメチルブチル、３，３－ジメチルブチル、１－エチルブチル、２－エチルブチル等が挙げられる。
　本明細書において「アルケニル」とは、少なくとも１個の二重結合（２個の隣接ＳＰ２炭素原子）を有する１価の基である。二重結合および置換分（存在する場合）の配置によって、二重結合の幾何学的形態は、エントゲーゲン（Ｅ）またはツザンメン（Ｚ）、シスまたはトランス配置をとることができる。アルケニルは、直鎖状のものだけでなく、分枝鎖状ものも含む。アルケニルとして好ましくはＣ２－Ｃ１０アルケニル、より好ましくはＣ２－Ｃ６アルケニルが挙げられ、具体的には、たとえば、ビニル、アリル、１－プロペニル、２－プロペニル、１－ブテニル、２－ブテニル（シス、トランスを含む）、３－ブテニル、ペンテニル、３－メチル－２－ブテニル、ヘキセニルなどが挙げられる。
　本明細書において「アルキニル」とは、少なくとも１個の三重結合（２個の隣接ＳＰ炭素原子）を有する、１価の基である。アルキニルは、直鎖状のものだけでなく、分枝鎖状のものも含む。アルキニルとして好ましくはＣ２－Ｃ１０アルキニル、より好ましくはＣ２－Ｃ６アルキニルが挙げられ、具体的には、たとえば、エチニル、１－プロピニル、プロパルギル、３－ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、３－フェニル－２－プロピニル、３－（２'－フルオロフェニル）－２－プロピニル、２－ヒドロキシ－２－プロピニル、３－（３－フルオロフェニル）－２－プロピニル、３－メチル－（５－フェニル）－４－ペンチニルなどが挙げられる。
　本明細書において「シクロアルキル」とは、飽和または部分的に飽和した環状の１価の脂肪族炭化水素基を意味し、単環、ビシクロ環、スピロ環を含む。シクロアルキルとして好ましくはＣ３－Ｃ８シクロアルキルが挙げられ、具体的には、たとえば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、ビシクロ［２．２．１］ヘプチル、スピロ［３．３］ヘプチルなどが挙げられる。
　本明細書において「アリール」とは、１価の芳香族炭化水素環を意味し、好ましくはＣ６－Ｃ１０アリールが挙げられる。アリールとして具体的には、たとえば、フェニル、ナフチル（たとえば、１－ナフチル、２－ナフチル）などが挙げられる。
　本明細書において「ヘテロシクリル」とは、炭素原子に加えて１～５個のヘテロ原子を含有する、非芳香族の環状の１価の基を意味する。ヘテロシクリルは、環中に二重およびまたは三重結合を有していてもよく、環中の炭素原子は酸化されてカルボニルを形成してもよく、単環でも縮合環でもよい。環を構成する原子の数は好ましくは４～１０であり（４～１０員ヘテロシクリル）、より好ましくは４～７である（４～７員ヘテロシクリル）。ヘテロシクリルとしては具体的には、たとえば、アゼチジニル、オキシラニル、オキセタニル、アゼチジニル、ジヒドロフリル、テトラヒドロフリル、ジヒドロピラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピリジル、テトラヒドロピリミジル、モルホリニル、チオモルホリニル、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、１，２－チアジナン、チアジアゾリジニル、アゼチジニル、オキサゾリドン、ベンゾジオキサニル、ベンゾオキサゾリル、ジオキソラニル、ジオキサニル、テトラヒドロピロロ[１,２－ｃ]イミダゾール、チエタニル、３，６－ジアザビシクロ［３．１．１］ヘプタニル、２，５－ジアザビシクロ［２．２．１］ヘプタニル、３－オキサ－８－アザビシクロ[３．２．１]オクタニル、スルタム、２－オキサスピロ[３．３]ヘプチルなどが挙げられる。
　本明細書において「ヘテロアリール」とは、炭素原子に加えて１～５個のヘテロ原子を含有する、芳香族性の環状の１価の基を意味する。環は単環でも、他の環との縮合環でもよく、部分的に飽和されていてもよい。環を構成する原子の数は好ましくは５～１０（５～１０員ヘテロアリール）であり、より好ましくは５～７（５～７員ヘテロアリール）である。ヘテロアリールとして具体的には、たとえば、フリル、チエニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピリジル、ピリミジル、ピリダジニル、ピラジニル、トリアジニル、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾイミダゾリル、インドリル、イソインドリル、インダゾリル、キノリル、イソキノリル、シンノリニル、キナゾリニル、キノキサリニル、ベンゾジオキソリル、インドリジニル、イミダゾピリジルなどが挙げられる。
　本明細書において「アルコキシ」とは、前記定義の「アルキル」が結合したオキシ基を意味し、好ましくはＣ１－Ｃ６アルコキシが挙げられる。アルコキシとして具体的には、たとえば、メトキシ、エトキシ、１－プロポキシ、２－プロポキシ、ｎ－ブトキシ、ｉ－ブトキシ、ｓ－ブトキシ、ｔ－ブトキシ、ペンチルオキシ、３－メチルブトキシなどが挙げられる。
　本明細書において「アルケニルオキシ」とは、前記定義の「アルケニル」が結合したオキシ基を意味し、好ましくはＣ２－Ｃ６アルケニルオキシが挙げられる。アルケニルオキシとして具体的には、たとえば、ビニルオキシ、アリルオキシ、１－プロペニルオキシ、２－プロペニルオキシ、１－ブテニルオキシ、２－ブテニルオキシ（シス、トランスを含む）、３－ブテニルオキシ、ペンテニルオキシ、ヘキセニルオキシなどが挙げられる。
　本明細書において「シクロアルコキシ」とは、前記定義の「シクロアルキル」が結合したオキシ基を意味し、好ましくはＣ３－Ｃ８シクロアルコキシが挙げられる。シクロアルコキシとして具体的には、たとえば、シクロプロポキシ、シクロブトキシ、シクロペンチルオキシなどが挙げられる。
　本明細書において「アリールオキシ」とは、前記定義の「アリール」が結合したオキシ基を意味し、好ましくはＣ６－Ｃ１０アリールオキシが挙げられる。アリールオキシとして具体的には、たとえば、フェノキシ、１－ナフチルオキシ、２－ナフチルオキシなどが挙げられる。
　本明細書において「アミノ」とは、狭義には－ＮＨ２を意味し、広義には－ＮＲＲ’を意味し、ここでＲおよびＲ’は独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールから選択されるか、あるいはＲおよびＲ’はそれらが結合している窒素原子と一緒になって環を形成する。アミノとして好ましくは、－ＮＨ２、モノＣ１－Ｃ６アルキルアミノ、ジＣ１－Ｃ６アルキルアミノ、４～８員環状アミノなどが挙げられる。
　本明細書において「モノアルキルアミノ」とは、前記定義の「アミノ」のうち、Ｒが水素であり、かつＲ’が前記定義の「アルキル」である基を意味し、好ましくは、モノＣ１－Ｃ６アルキルアミノが挙げられる。モノアルキルアミノとして具体的には、たとえば、メチルアミノ、エチルアミノ、ｎ－プロピルアミノ、ｉ－プロピルアミノ、ｎ－ブチルアミノ、ｓ－ブチルアミノ、ｔ－ブチルアミノなどが挙げられる。
　本明細書において「ジアルキルアミノ」とは、前記定義の「アミノ」のうち、ＲおよびＲ’が独立して前記定義の「アルキル」である基を意味し、好ましくは、ジＣ１－Ｃ６アルキルアミノが挙げられる。ジアルキルアミノとして具体的には、たとえば、ジメチルアミノ、ジエチルアミノなどが挙げられる。
　本明細書において「環状アミノ」とは、前記定義の「アミノ」のうち、ＲおよびＲ’はそれらが結合している窒素原子と一緒になって環を形成する基を意味し、好ましくは、４～８員環状アミノが挙げられる。環状アミノとして具体的には、たとえば、１－アゼチジル、１－ピロリジル、１－ピペリジル、１－ピペラジル、４－モルホリニル、３－オキサゾリジル、１，１－ジオキシドチオモルホリニル－４－イル、３－オキサ－８－アザビシクロ［３．２．１］オクタン－８－イルなどが挙げられる。
　本明細書における「ヒドロキシアルキル」とは、前記定義の「アルキル」の１つ、または複数の水素が水酸基で置換された基を意味し、Ｃ１－Ｃ６ヒドロキシアルキルが好ましく、Ｃ２ヒドロキシアルキルがより好ましい。ヒドロキシアルキルとして具体的には、たとえば、ヒドロキシメチル、１－ヒドロキシエチル、２－ヒドロキシエチル、２－ヒドロキシ－２－メチルプロピル、５－ヒドロキシペンチルなどが挙げられる。
　本明細書における「ハロアルキル」とは、前記定義の「アルキル」の１つまたは複数の水素がハロゲンで置換された基を意味し、Ｃ１－Ｃ６ハロアルキルが好ましく、Ｃ１－Ｃ６フルオロアルキルがより好ましい。ハロアルキルとして具体的には、たとえば、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、２，２－ジフルオロエチル、２，２，２－トリフルオロエチル、３，３－ジフルオロプロピル、４，４－ジフルオロブチル、５，５－ジフルオロペンチルなどが挙げられる。
　本明細書における「シアノアルキル」とは、前記定義の「アルキル」の１つまたは複数の水素がシアノで置換された基を意味し、Ｃ１－Ｃ６シアノアルキルが好ましい。シアノアルキルとして具体的には、たとえば、シアノメチル、２－シアノエチルなどが挙げられる。
　本明細書における「アミノアルキル」とは、前記定義の「アルキル」の１つまたは複数の水素が前記定義の「アミノ」で置換された基を意味し、Ｃ１－Ｃ６アミノアルキルが好ましい。アミノアルキルとして具体的には、たとえば、１－ピリジルメチル、２－（１－ピペリジル）エチル、３－（１－ピペリジル）プロピル、４－アミノブチルなどが挙げられる。
　本明細書における「カルボキシアルキル」とは、前記定義の「アルキル」の１つまたは複数の水素がカルボキシで置換された基を意味し、Ｃ２－Ｃ６カルボキシアルキルが好ましい。カルボキシアルキルとして具体的には、たとえば、カルボキシメチルなどが挙げられる。
　本明細書における「アルケニルオキシカルボニルアルキル」とは、前記定義の「アルキル」の１つまたは複数の水素が前記定義の「アルケニルオキシカルボニル」で置換された基を意味し、Ｃ２－Ｃ６アルケニルオキシカルボニルＣ１－Ｃ６アルキルが好ましく、Ｃ２－Ｃ６アルケニルオキシカルボニルＣ１－Ｃ２アルキルがより好ましい。アルケニルオキシカルボニルアルキルとして具体的には、たとえば、アリルオキシカルボニルメチル、２－（アリルオキシカルボニル）エチルなどが挙げられる。
　本明細書における「アルコキシアルキル」とは、前記定義の「アルキル」の１つまたは複数の水素が前記定義の「アルコキシ」で置換された基を意味し、Ｃ１－Ｃ６アルコキシＣ１－Ｃ６アルキルが好ましく、Ｃ１－Ｃ６アルコキシＣ１－Ｃ２アルキルがより好ましい。アルコキシアルキルとして具体的には、たとえば、メトキシメチル、エトキシメチル、１－プロポキシメチル、２－プロポキシメチル、ｎ－ブトキシメチル、ｉ－ブトキシメチル、ｓ－ブトキシメチル、ｔ－ブトキシメチル、ペンチルオキシメチル、３－メチルブトキシメチル、１－メトキシエチル、２－メトキシエチル、２－エトキシエチルなどが挙げられる。
　本明細書における「シクロアルキルアルキル」とは、前記定義の「アルキル」の１つまたは複数の水素が前記定義の「シクロアルキル」で置換された基を意味し、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキルＣ１－Ｃ６アルキルが好ましく、Ｃ３－Ｃ６シクロアルキルＣ１－Ｃ２アルキルがより好ましい。シクロアルキルアルキルとして具体的には、たとえば、シクロプロピルメチル、シクロブチルメチル、シクロペンチルメチル、シクロヘキシルメチルなどが挙げられる。
　本明細書における「シクロアルコキシアルキル」とは、前記定義の「アルキル」の１つまたは複数の水素が前記定義の「シクロアルコキシ」で置換された基を意味し、Ｃ３－Ｃ８シクロアルコキシＣ１－Ｃ６アルキルが好ましく、Ｃ３－Ｃ６シクロアルコキシＣ１－Ｃ２アルキルがより好ましい。シクロアルコキシアルキルとして具体的には、たとえば、シクロプロポキシメチル、シクロブトキシメチルなどが挙げられる。
　本明細書における「ヘテロシクリルアルキル」とは、前記定義の「アルキル」の１つまたは複数の水素が前記定義の「ヘテロシクリル」で置換された基を意味し、４～７員ヘテロシクリルＣ１－Ｃ６アルキルが好ましく、４～７員ヘテロシクリルＣ１－Ｃ２アルキルがより好ましい。ヘテロシクリルアルキルとして具体的には、たとえば、２－（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－４－イル）エチル、２－（アゼチジン－３－イル）エチルなどが挙げられる。
　本明細書における「アルキルスルホニルアルキル」とは、前記定義の「アルキル」の１つまたは複数の水素が前記定義の「アルキルスルホニル」で置換された基を意味し、Ｃ１－Ｃ６アルキルスルホニルＣ１－Ｃ６アルキルが好ましく、Ｃ１－Ｃ６アルキルスルホニルＣ１－Ｃ２アルキルがより好ましい。アルキルスルホニルアルキルとして具体的には、たとえば、メチルスルホニルメチル、２－（メチルスルホニル）エチルなどが挙げられる。
　本明細書における「アミノカルボニルアルキル」とは、前記定義の「アルキル」の１つまたは複数の水素が前記定義の「アミノカルボニル」で置換された基を意味し、アミノカルボニルＣ１－Ｃ６アルキルが好ましく、アミノカルボニルＣ１－Ｃ４アルキルがより好ましい。アミノカルボニルアルキルとして具体的には、たとえば、メチルアミノカルボニルメチル、ジメチルアミノカルボニルメチル、ｔ－ブチルアミノカルボニルメチル、１－アゼチジニルカルボニルメチル、１－ピロリジニルカルボニルメチル、１－ピペリジ二ルカルボニルメチル、４－モルホリニルカルボニルメチル、２－（メチルアミノカルボニル）エチル、２－（ジメチルアミノカルボニル）エチル、２－（１－アゼチジニルカルボニル）エチル、２－（１－ピロリジニルカルボニル）エチル、２－（４－モルホリニルカルボニル）エチル、３－（ジメチルアミノカルボニル）プロピル、４－（ジメチルアミノカルボニル）ブチルなどが挙げられる。
　本明細書における「アリールオキシアルキル」とは、前記定義の「アルキル」の１つまたは複数の水素が前記定義の「アリールオキシ」で置換された基を意味し、Ｃ６－Ｃ１０アリールオキシＣ１－Ｃ６アルキルが好ましく、Ｃ６－Ｃ１０アリールオキシＣ１－Ｃ２アルキルがより好ましい。アリールオキシアルキルとして具体的には、たとえば、フェノキシメチル、２－フェノキシエチルなどが挙げられる。
　本明細書において「アラルキル（アリールアルキル）」とは、前記定義の「アルキル」の少なくとも一つの水素原子が前記定義の「アリール」で置換された基を意味し、Ｃ７－Ｃ１４アラルキルが好ましく、Ｃ７－Ｃ１０アラルキルがより好ましい。アラルキルとして具体的には、たとえば、ベンジル、フェネチル、３－フェニルプロピルなどが挙げられる。
　本明細書において「ヘテロアリールアルキル」とは、前記定義の「アルキル」の少なくとも一つの水素原子が前記定義の「ヘテロアリール」で置換された基を意味し、５～１０員ヘテロアリールＣ１－Ｃ６アルキルが好ましく、５～１０員ヘテロアリールＣ１－Ｃ２アルキルがより好ましい。ヘテロアリールアルキルとして具体的には、たとえば、３－チエニルメチル、４－チアゾリルメチル、２－ピリジルメチル、３－ピリジルメチル、４－ピリジルメチル、２－（２－ピリジル）エチル、２－（３－ピリジル）エチル、２－（４－ピリジル）エチル、２－（６－キノリル）エチル、２－（７－キノリル）エチル、２－（６－インドリル）エチル、２－（５－インドリル）エチル、２－（５－ベンゾフラニル）エチルなどが挙げられる。
　本明細書における「非芳香族複素環」とは、環を構成する原子中に１～５個のヘテロ原子を含有する、非芳香族性の複素環を意味する。非芳香族複素環は、環中に二重およびまたは三重結合を有していてもよく、環中の炭素原子は酸化されてカルボニルを形成してもよい。また非芳香族複素環は、単環でも、縮合環でも、スピロ環でもよい。環を構成する原子の数は限定されないが、好ましくは５～６である（５～６員非芳香族複素環）。非芳香族複素環として具体的には、たとえば、アゼチジン、オキセタン、チエタン、ピロリジン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロチオフェン、イミダゾリジン、ピラゾリジン、オキサゾリジン、イソキサゾリジン、チアゾリジン、イソチアゾリジン、ジオキソラン、ジチオラン、ピペリジン、テトラヒドロピラン、チアン、ピペラジン、モルホリン、チオモルホリン、ジオキサン、ジチアン、アゼパン、オキセパン、チエパン、ジアゼパンなどが挙げられる。
　本明細書において、「ペプチド鎖」とは、１、２、３、４、またはそれ以上の天然アミノ酸および／または非天然アミノ酸がアミド結合および／またはエステル結合により連結されているペプチド鎖をいう。
　本明細書において「置換されていてもよい」とは、ある基が任意の置換基によって置換されていてもよいことを意味する。
　本明細書において「１つまたは複数の」とは、１つまたは２つ以上の数を意味する。「１つまたは複数の」が、ある基の置換基に関連する文脈で用いられる場合、この用語は、１つからその基が許容する置換基の最大数までの数を意味する。「１つまたは複数の」として具体的には、たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、および／またはそれより大きい数が挙げられる。
　本明細書において「Ｃ末端活性体」とは、ペプチド合成反応に用いられるカルボキシル基が活性化された化合物（例えば、目的ペプチド化合物の製造につながる活性エステル）のみならず、それが反応中で、例えば、アズラクトン、ＮＣＡ（Ｎ－カルボキシ無水物（N-carboxyanhydride））などに変化して活性化状態を有することでアミン類（例えば、アミン成分）と反応して、目的ペプチド化合物を与え得る化合物も含む。また、ペプチド合成反応に用いるカルボキシル基が活性化された化合物であるＣ末端活性体は、例えば、Chem. Rev., 2011, 111, 6557.またはOrganic Process Research & Development, 2016, 20 (2), 140. に記されているようなペプチド縮合剤を用いて合成される活性エステル、混合酸無水物およびアシルイソウレアなどに限られるものではなく、アミン類と反応しうるように活性化されている、任意の化合物が含まれる。
　本明細書において「活性エステル」とは、アミノ基と反応してアミド結合を形成するカルボニル基を含む化合物であって、該カルボニル基に、たとえばＯＢｔ、ＯＡｔ、ＯＳｕ、ＯＰｆｐなどが結合した化合物であり、アミンとの反応が促進される化合物である。
　本明細書における「アミノ酸」には、天然アミノ酸、及び非天然アミノ酸が含まれる。本明細書における「天然アミノ酸」とは、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｐｒｏを指す。非天然アミノ酸は特に限定されないが、β－アミノ酸、γ－アミノ酸、Ｄ型アミノ酸、Ｎ置換アミノ酸、α，α－二置換アミノ酸、側鎖が天然と異なるアミノ酸、ヒドロキシカルボン酸などが例示される。本明細書におけるアミノ酸としては、任意の立体配置が許容される。アミノ酸の側鎖の選択は特に制限を設けないが、水素原子の他にも例えばアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、アラルキル基、シクロアルキル基から自由に選択され、これらの基の中の隣接しない１又は２個のメチレン基は酸素原子、カルボニル基（－ＣＯ－）、又はスルホニル基（－ＳＯ２－）、ホスホリル基、ホスホニル基で置換されていてもよい。それぞれには置換基が付与されていてもよく、それら置換基も制限されず、例えば、ハロゲン原子、Ｏ原子、Ｓ原子、Ｎ原子、Ｂ原子、Ｓｉ原子、又はＰ原子を含む任意の置換基の中から独立して１つ又は２つ以上自由に選択されてよい。すなわち、置換されていてもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、アラルキル基、シクロアルキル基などが例示される。非限定の一態様において、本明細書におけるアミノ酸は、同一分子内にカルボキシ基とアミノ基を有する化合物であってよい。
　アミノ酸の主鎖アミノ基は、非置換（ＮＨ２基）でもよく、置換されていてもよい（即ち、－ＮＨＲ基：Ｒは置換基を有していてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、シクロアルキルを示し、これらの基の中の隣接しない１又は２個のメチレン基は酸素原子、カルボニル基（－ＣＯ－）、又はスルホニル基（－ＳＯ２－）で置換されていてもよく、またプロリンのようにＮ原子に結合した炭素鎖とα位の炭素原子とが環を形成していてもよい。このような主鎖アミノ基が置換されているアミノ酸を、本明細書において「Ｎ置換アミノ酸」と称する。本明細書における「Ｎ置換アミノ酸」としては、好ましくはＮ－アルキルアミノ酸、Ｎ－Ｃ１－Ｃ６アルキルアミノ酸、Ｎ－Ｃ１－Ｃ４アルキルアミノ酸、Ｎ－メチルアミノ酸が例示されるが、これらに限定されるものではない。
　本明細書におけるペプチド化合物を構成する「アミノ酸」にはそれぞれに対応する全ての同位体を含む。「アミノ酸」の同位体は、少なくとも１つの原子が、原子番号（陽子数）が同じで、質量数（陽子と中性子の数の和）が異なる原子で置換されたものである。本発明のペプチド化合物を構成する「アミノ酸」に含まれる同位体の例としては、水素原子、炭素原子、窒素原子、酸素原子、リン原子、硫黄原子、フッ素原子、塩素原子などがあり、それぞれ、２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３１Ｐ、３２Ｐ、３５Ｓ、１８Ｆ、３６Ｃｌ等が含まれる。
　本明細書におけるハロゲン原子を含む置換基としては、ハロゲンを置換基に有するアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルなどが例示され、より具体的には、フルオロアルキル、ジフルオロアルキル、トリフルオロアルキルなどが例示される。
　Ｏ原子を含む置換基としては、ヒドロキシ（－ＯＨ）、オキシ（－ＯＲ）、カルボニル（－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ）、カルボキシ（－ＣＯ２Ｈ）、オキシカルボニル（－Ｃ（＝Ｏ）－ＯＲ）、カルボニルオキシ（－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ）、チオカルボニル（－Ｃ（＝Ｏ）－ＳＲ）、カルボニルチオ（－Ｓ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ）、アミノカルボニル（－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨＲ）、カルボニルアミノ（－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ）、オキシカルボニルアミノ（－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－ＯＲ）、スルホニルアミノ（－ＮＨ－ＳＯ２－Ｒ）、アミノスルホニル（－ＳＯ２－ＮＨＲ）、スルファモイルアミノ（－ＮＨ－ＳＯ２－ＮＨＲ）、チオカルボキシル（－Ｃ（＝Ｏ）－ＳＨ）、カルボキシルカルボニル（－Ｃ（＝Ｏ）－ＣＯ２Ｈ）などの基が挙げられる。
　オキシ（－ＯＲ）の例としては、アルコキシ、シクロアルコキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アラルキルオキシなどが挙げられる。アルコキシとしては、Ｃ１－Ｃ４アルコキシ、Ｃ１－Ｃ２アルコキシが好ましく、なかでもメトキシ、又はエトキシが好ましい。
　カルボニル（－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ）の例としては、ホルミル（－Ｃ（＝Ｏ）－Ｈ）、アルキルカルボニル、シクロアルキルカルボニル、アルケニルカルボニル、アルキニルカルボニル、アリールカルボニル、ヘテロアリールカルボニル、アラルキルカルボニルなどが挙げられる。
　オキシカルボニル（－Ｃ（＝Ｏ）－ＯＲ）の例としては、アルキルオキシカルボニル、シクロアルキルオキシカルボニル、アルケニルオキシカルボニル、アルキニルオキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、ヘテロアリールオキシカルボニル、アラルキルオキシカルボニルなどが挙げられる。
　カルボニルオキシ（－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ）の例としては、アルキルカルボニルオキシ、シクロアルキルカルボニルオキシ、アルケニルカルボニルオキシ、アルキニルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、ヘテロアリールカルボニルオキシ、アラルキルカルボニルオキシなどが挙げられる。
　チオカルボニル（－Ｃ（＝Ｏ）－ＳＲ）の例としては、アルキルチオカルボニル、シクロアルキルチオカルボニル、アルケニルチオカルボニル、アルキニルチオカルボニル、アリールチオカルボニル、ヘテロアリールチオカルボニル、アラルキルチオカルボニルなどが挙げられる。
　カルボニルチオ（－Ｓ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ）の例としては、アルキルカルボニルチオ、シクロアルキルカルボニルチオ、アルケニルカルボニルチオ、アルキニルカルボニルチオ、アリールカルボニルチオ、ヘテロアリールカルボニルチオ、アラルキルカルボニルチオなどが挙げられる。
　アミノカルボニル（－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨＲ）の例としては、アルキルアミノカルボニル（例えば、Ｃ１－Ｃ６又はＣ１－Ｃ４アルキルアミノカルボニル、なかでもエチルアミノカルボニル、メチルアミノカルボニルなどが例示される。）、シクロアルキルアミノカルボニル、アルケニルアミノカルボニル、アルキニルアミノカルボニル、アリールアミノカルボニル、ヘテロアリールアミノカルボニル、アラルキルアミノカルボニルなどが挙げられる。これらに加えて、－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨＲ中のＮ原子と結合したＨ原子が、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルでさらに置換された基が挙げられる。
　カルボニルアミノ（－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ）の例としては、アルキルカルボニルアミノ、シクロアルキルカルボニルアミノ、アルケニルカルボニルアミノ、アルキニルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、ヘテロアリールカルボニルアミノ、アラルキルカルボニルアミノなどが挙げられる。これらに加えて－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ中のＮ原子と結合したＨ原子が、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルでさらに置換された基が挙げられる。
　オキシカルボニルアミノ（－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－ＯＲ）の例としては、アルコキシカルボニルアミノ、シクロアルコキシカルボニルアミノ、アルケニルオキシカルボニルアミノ、アルキニルオキシカルボニルアミノ、アリールオキシカルボニルアミノ、ヘテロアリールオキシカルボニルアミノ、アラルキルオキシカルボニルアミノなどが挙げられる。これらに加えて、－ＮＨ－Ｃ（＝Ｏ）－ＯＲ中のＮ原子と結合したＨ原子がアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルでさらに置換された基が挙げられる。
　スルホニルアミノ（－ＮＨ－ＳＯ２－Ｒ）の例としては、アルキルスルホニルアミノ、シクロアルキルスルホニルアミノ、アルケニルスルホニルアミノ、アルキニルスルホニルアミノ、アリールスルホニルアミノ、ヘテロアリールスルホニルアミノ、アラルキルスルホニルアミノなどが挙げられる。これらに加えて、－ＮＨ－ＳＯ２－Ｒ中のＮ原子と結合したＨ原子がアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルでさらに置換された基が挙げられる。
　アミノスルホニル（－ＳＯ２－ＮＨＲ）の例としては、アルキルアミノスルホニル、シクロアルキルアミノスルホニル、アルケニルアミノスルホニル、アルキニルアミノスルホニル、アリールアミノスルホニル、ヘテロアリールアミノスルホニル、アラルキルアミノスルホニルなどが挙げられる。これらに加えて、－ＳＯ２－ＮＨＲ中のＮ原子と結合したＨ原子がアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルでさらに置換された基が挙げられる。
　スルファモイルアミノ（－ＮＨ－ＳＯ２－ＮＨＲ）の例としては、アルキルスルファモイルアミノ、シクロアルキルスルファモイルアミノ、アルケニルスルファモイルアミノ、アルキニルスルファモイルアミノ、アリールスルファモイルアミノ、ヘテロアリールスルファモイルアミノ、アラルキルスルファモイルアミノなどが挙げられる。さらに、－ＮＨ－ＳＯ２－ＮＨＲ中のＮ原子と結合した２つのＨ原子はアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、およびアラルキルからなる群より独立して選択される置換基で置換されていてもよく、またこれらの２つの置換基は環を形成しても良い。
　Ｓ原子を含む置換基としては、チオール（－ＳＨ）、チオ（－Ｓ－Ｒ）、スルフィニル（－Ｓ（＝Ｏ）－Ｒ）、スルホニル（－ＳＯ２－Ｒ）、スルホ（－ＳＯ３Ｈ）などの基が挙げられる。
　チオ（－Ｓ－Ｒ）の例としては、アルキルチオ、シクロアルキルチオ、アルケニルチオ、アルキニルチオ、アリールチオ、ヘテロアリールチオ、アラルキルチオなどの中から選択される。
　スルホニル（－ＳＯ２－Ｒ）の例としては、アルキルスルホニル、シクロアルキルスルホニル、アルケニルスルホニル、アルキニルスルホニル、アリールスルホニル、ヘテロアリールスルホニル、アラルキルスルホニルなどが挙げられる。
　Ｎ原子を含む置換基として、アジド（－Ｎ３、「アジド基」ともいう）、シアノ（－ＣＮ）、１級アミノ（－ＮＨ２）、２級アミノ（－ＮＨ－Ｒ；モノ置換アミノともいう。）、三級アミノ（－ＮＲ（Ｒ'）；ジ置換アミノともいう。）、アミジノ（－Ｃ（＝ＮＨ）－ＮＨ２）、置換アミジノ（－Ｃ（＝ＮＲ）－ＮＲ'Ｒ"）、グアニジノ（－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）－ＮＨ２）、置換グアニジノ（－ＮＲ－Ｃ（＝ＮＲ'''）－ＮＲ'Ｒ"）、アミノカルボニルアミノ（－ＮＲ－ＣＯ－ＮＲ'Ｒ"）、ピリジル、ピペリジノ、モルホリノ、アゼチジニルなどの基が挙げられる。
　２級アミノ（－ＮＨ－Ｒ；モノ置換アミノ）の例としては、アルキルアミノ、シクロアルキルアミノ、アルケニルアミノ、アルキニルアミノ、アリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、アラルキルアミノなどが挙げられる。
　三級アミノ（－ＮＲ（Ｒ'）；ジ置換アミノ）の例としては、例えばアルキル（アラルキル）アミノなど、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルなどの中からそれぞれ独立して選択される、任意の２つの置換基を有するアミノ基が挙げられ、これらの任意の２つの置換基は環を形成しても良い。具体的には、ジアルキルアミノ、なかでもＣ１－Ｃ６ジアルキルアミノ、Ｃ１－Ｃ４ジアルキルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノなどが例示される。本明細書において「Ｃｐ－Ｃｑジアルキルアミノ基」とは、アミノ基にＣｐ－Ｃｑアルキル基が２個置換された基をいい、両Ｃｐ－Ｃｑアルキル基は同一であっても異なっていてもよい。
　置換アミジノ（－Ｃ（＝ＮＲ）－ＮＲ'Ｒ"）の例としては、Ｎ原子上の３つの置換基Ｒ、Ｒ'、およびＲ"が、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルの中からそれぞれ独立して選択された基、例えばアルキル（アラルキル）（アリール）アミジノなどが挙げられる。
　置換グアニジノ（－ＮＲ－Ｃ（＝ＮＲ'''）－ＮＲ'Ｒ"）の例としては、Ｒ，Ｒ'、Ｒ"、およびＲ'''が、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルの中からそれぞれ独立して選択された基、あるいはこれらが環を形成した基などが挙げられる。
　アミノカルボニルアミノ（－ＮＲ－ＣＯ－ＮＲ'Ｒ"）の例としては、Ｒ、Ｒ'、およびＲ"が、水素原子、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルの中からそれぞれ独立して選択された基、あるいはこれらは環を形成した基などが挙げられる。
　本明細書においてペプチド化合物を構成する「アミノ酸残基」を単に「アミノ酸」ということがある。
（ペプチド化合物の製造方法）
　ある態様において、本発明はペプチド化合物を製造する方法に関し、該方法は以下の工程を含む。
工程Ａ：溶媒中で酸成分のＣ末端活性体をアミン成分と縮合させて得られるペプチド化合物を含む、反応混合液を得る工程、および
工程Ｂ：前記反応混合液と三級アミンと水または水溶液とを混合し、該Ｃ末端活性体を除去する工程。
　工程Ａは、溶媒中、酸成分とアミン成分とを縮合剤を用いて反応させて、ペプチド化合物を含む反応混合液を得る工程である。特定の理論に拘束されないが、工程Ａでは酸成分と縮合剤が反応して、酸成分のＣ末端活性体が形成され、次いで該Ｃ末端活性体にアミン成分が求核攻撃することにより反応が進行し、ペプチド化合物が生成する。
　酸成分としては、アミノ基が保護基で保護されたアミノ酸、またはＮ末端のアミノ基が保護基で保護されたペプチドを用いることができる。本明細書においては、酸成分として用いるアミノ酸を「第１のアミノ酸」、酸成分として用いるペプチドを「第１のペプチド」と称することがある。
　第１のアミノ酸は、特に限定されず、任意の天然アミノ酸または非天然アミノ酸を用いることができる。また第１のペプチドも、特に限定されず、２以上の任意の天然アミノ酸および／または非天然アミノ酸が連結したものを用いることができる。
　第１のアミノ酸として好ましくは、その側鎖に１個以上の炭素原子を含むものが挙げられる。このようなアミノ酸として、具体的には、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよいアルコキシアルキル、置換されていてもよいシクロアルキルアルキル、置換されていてもよいアラルキル、置換されていてもよいヘテロアリールアルキルなどを側鎖に有するものが例示される。また、前記側鎖がアミノ基、カルボキシル基、水酸基などのペプチド結合の形成反応に影響し得る官能基を有する場合には、これらの基を適切な保護基で保護することが好ましい。特定の理論によって拘束されるものではないが、アミノ酸がその側鎖に嵩高い基を有する場合には、その立体障害により、該アミノ酸の残存Ｃ末端活性体の加水分解が従来の方法では十分に進行しないことがある。このような場合にあっても本発明の方法を用いることにより、迅速かつ効率的に残存Ｃ末端活性体を加水分解することができる。
　第１のペプチドに含まれるＣ末端のアミノ酸の側鎖も、前記第１のアミノ酸と同様の側鎖を有するものであることができる。
　第１のアミノ酸のアミノ基の保護基、および第１のペプチドのＮ末端のアミノ基が保護基としては、本技術分野において一般的なアミノ基の保護基を用いることができる。このような保護基として、具体的には、たとえば、Ｃｂｚ、Ｂｏｃ、Ｔｅｏｃ、Ｆｍｏｃ、Ｔｆａ、Ａｌｌｏｃ、ノシル、ジニトロノシル、ｔ－Ｂｕ、トリチル、およびクミルなどが挙げられる。
　ある態様において、酸成分は、少なくともアミン成分と同じ当量、好ましくはアミン成分に対して過剰量で用いることが好ましい。具体的には、例えば、アミン成分に対して１～１．１当量、１～１．２当量、１～１．３当量、１～１．４当量、１～１．５当量、１～２．０当量、１～３．０当量の酸成分を用いることができる。
　ある態様において、本発明における酸成分のＣ末端活性体は、溶媒中、酸成分を縮合剤と作用させることによって形成することができる。縮合剤としては、酸成分のカルボニル炭素の求電子性を高めるべく、該酸成分のカルボキシル基のヒドロキシ部分に脱離能を有する基を導入できるものであれば特に限定されないが、具体的には、たとえば、Ｔ３Ｐ、ＨＡＴＵ、ＢＥＰ、カルボジイミド類（ＤＩＣ、ＥＤＣ等）、カルボジイミド類と添加剤（ｏｘｙｍａ、ＨＯＯＢｔ、ＨＯＢｔ等）の組み合わせ、ＤＭＴ－ＭＭ、ＣＤＩなどが挙げられる。
　Ｃ末端活性体をアミン成分と縮合させてペプチド化合物を得る工程（工程Ａ）は、－２０℃～溶媒の沸点付近の温度、好ましくは０℃～６０℃の温度で、反応混合液を１分～４８時間、好ましくは１５分～４時間時間、攪拌することで行うことができる。
　工程Ａにおいて、酸成分とアミン成分の縮合反応は定量的に進行し得る。
　アミン成分としては、カルボキシル基が保護基で保護されたアミノ酸、またはＣ末端のカルボキシル基が保護基で保護されたペプチドを用いることができる。本明細書においては、アミン成分として用いるアミノ酸を「第２のアミノ酸」、アミン成分として用いるペプチドを「第２のペプチド」と称することがある。
　第２のアミノ酸は、特に限定されず、任意の天然アミノ酸または任意の非天然アミノ酸を用いることができる。また第２のペプチドも、特に限定されず、２以上の任意の天然アミノ酸および／または非天然アミノ酸が連結したものを用いることができる。
　第２のアミノ酸のカルボキシル基の保護基、および第２のペプチドのＣ末端のカルボキシル基の保護基としては、本技術分野において一般的なカルボキシル基の保護基を用いることができる。このような保護基として、具体的には、たとえば、メチル、アリル、ｔ－ブチル、トリチル、クミル、ベンジル、メトキシトリチル、１－ピペリジニルなどが挙げられる。
　ある態様において、本発明における溶媒としては、縮合反応が進行し、ペプチド化合物を得ることができるものであれば任意のものを用いることができる。このような溶媒として具体的には、たとえば、トルエン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、酢酸イソプロピル、酢酸エチル、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドや、これらから選択される２種以上の溶媒を混合した溶媒などが挙げられる。
　ある態様において、本発明における、酸成分のＣ末端活性体をアミン成分と縮合させて得られる「ペプチド化合物」には、２以上のアミノ酸が連結された、直鎖状または環状のペプチド化合物が含まれる。なお、環状ペプチド化合物は、「環状部を有するペプチド化合物」と同意義である。
　本発明における「直鎖状のペプチド化合物」は、天然アミノ酸および／または非天然アミノ酸がアミド結合あるいはエステル結合で連結されることにより形成されたものであり、環状部を有しない化合物である限り、特に限定されない。直鎖状のペプチド化合物を構成する天然アミノ酸あるいは非天然アミノ酸の総数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０個であることができ、好ましい範囲は６～２０個、７～１９個、７～１８個、７～１７個、７～１６個、７～１５個、８～１４個、９～１３個である。
　本発明における「環状ペプチド化合物」は、天然アミノ酸および／または非天然アミノ酸がアミド結合あるいはエステル結合で連結されることにより形成されたものであり、環状部を有する化合物である限り、特に限定されない。環状ペプチド化合物は、１以上の直鎖部を有していてもよい。環状のペプチド化合物を構成する天然アミノ酸あるいは非天然アミノ酸の総数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０個であることができ、好ましい範囲は６～２０個、７～１９個、７～１８個、７～１７個、７～１６個、７～１５個、８～１４個、９～１３個である。
　環状ペプチド化合物の環状部を構成するアミノ酸の数は限定されないが、例えば、４以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、２０以下、１８以下、１６以下、１５以下、１４以下、１３以下、１２以下、１１以下、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、及び１６が挙げられる。前記環状部を構成するアミノ酸の数は、５～１５が好ましく、５～１４、７～１４、又は８～１４がより好ましく、８～１３、９～１３、８～１２、８～１１、又は９～１２がさらに好ましく、９～１１が特に好ましい。
　環状ペプチドの直鎖部のアミノ酸の数は０～８であることが好ましく、０～５がより好ましく、０～３がより好ましい。
　ペプチド化合物は、１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、又は６つ以上の非天然アミノ酸を含むことができる。また、ペプチド化合物は、２０以下、１５以下、１４以下、１３以下、１２以下、１０以下、９以下の非天然アミノ酸を含むことができる。ペプチド化合物に非天然アミノ酸が含まれる場合、非天然アミノ酸数の割合としては、ペプチド化合物を構成する総アミノ酸数の３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上が例示される。
　ペプチド化合物は、上述の天然アミノ酸及び非天然アミノ酸の総数の条件に加えて、又は単独で、Ｎ置換アミノ酸を少なくとも２つ（好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０個、特に好ましくは５、６または７個、好ましい範囲は２～３０個、３～３０個、６～２０個、７～１９個、７～１８個、７～１７個、７～１６個、７～１５個、８～１４個、９～１３個）含み、Ｎ置換されていないアミノ酸を少なくとも１つ含む、直鎖または環状ペプチドであることができる。「Ｎ置換」としてはＮ原子に結合した水素原子のメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ヘキシル基への置換などが挙げられるがこれに限定されない。Ｎ置換アミノ酸として、好ましくは天然アミノ酸に含まれるアミノ基がＮ－メチル化、Ｎ－エチル化、Ｎ－プロピル化、Ｎ－ブチル化、Ｎ－ペンチル化されたアミノ酸が挙げられ、これらを、Ｎ－メチルアミノ酸、Ｎ－エチルアミノ酸、Ｎ－プロピルアミノ酸、Ｎ－ブチルアミノ酸、Ｎ－ペンチルアミノ酸という。Ｎ未置換アミノ酸をＮ置換アミノ酸に変換することをＮ置換化するといい、Ｎ－アルキル化、Ｎ－メチル化、またはＮ－エチル化ということがある。本発明におけるペプチド化合物に含まれるＮ置換アミノ酸数の割合としては、ペプチド化合物を構成する総アミノ酸数の３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上が例示される。
　ペプチド化合物には、その塩、またはこれらの溶媒和物が含まれてもよい。
　本明細書において「側鎖」とは、アミノ酸の側鎖、又は環状ペプチド化合物の環状部の側鎖などの文脈で使用され、それぞれの主鎖構造に含まれない部分を意味する。
　本明細書において「アミノ酸の数」とは、ペプチド化合物を構成するアミノ酸残基の数のことであり、アミノ酸を連結しているアミド結合、エステル結合、及び環化部の結合を切断した際に生じるアミノ酸ユニットの数を意味する。
　工程Ｂは、工程Ａで得られた反応混合液中に含まれる、未反応のＣ末端活性体を除去する工程である。ある態様において、未反応のＣ末端活性体の除去は、未反応のＣ末端活性体を三級アミンと作用させることを通じて行われる。本明細書では、未反応のＣ末端活性体、具体的には、たとえば、縮合過程でアミン成分と反応せずに残存した反応混合液中のＣ末端活性体を「残存Ｃ末端活性体」ということがある。工程Ｂでは、工程Ａで得られた反応混合液と三級アミンと水または水溶液とを混合する。工程Ａにおいてアミン成分に対して過剰量の酸成分が用いられた場合、もしくは工程Ａにて十分に縮合反応が進行しなかった場合、アミン成分と反応せずに残存した酸成分のＣ末端活性体が反応溶媒中に不純物として残存する。この残存したＣ末端活性体が、十分に分解されずに系中に存在していると、後続のペプチド化合物の脱保護工程や、さらなるペプチド鎖の伸長反応に悪影響を及ぼすため、確実に除去することが重要である。従来の液相合成法では、アルカリ水溶液を用いて残存活性エステルを加水分解する方法などが知られていたが、とりわけその側鎖に嵩高い官能基を有するアミノ酸の残存Ｃ末端活性体の場合、あるいは残存Ｃ末端活性体の脱離基の脱離能が容易に水と反応するほどには高くない場合には、その分解が不十分な場合があることが本発明者らによって確認された。これに対し、未反応のＣ末端活性体を含む反応混合液を、三級アミンおよび水または水溶液と混合することを通じて、乃至は残存Ｃ末端活性体を三級アミンと接触させることを通じて、Ｃ末端活性体を加水分解する本発明の方法を用いることで、かかる課題を解決することができる。
　三級アミンとしては、酸成分の残存Ｃ末端活性体に対して求核反応性を有するものを好ましく用いることができる。このような三級アミンとしては、窒素近傍の立体障害が小さいアミンが好ましい。このような三級アミンとして、例えば、下記式（Ａ）、（Ｂ）、または（Ｃ）で表される三級アミンがあげられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
　ある態様において、式（Ａ）中、Ｒ１～Ｒ３は、Ｒ１およびＲ２がそれらが結合している窒素原子と一緒になって５～６員非芳香族複素環を形成し、かつＲ３がＣ１－Ｃ２アルキル（すなわち、メチル、またはエチル）またはＣ２ヒドロキシアルキルである。５～６員非芳香族複素環として好ましくは、ピロリジン、ピペリジン、またはモルホリンであり、Ｃ２ヒドロキシアルキルとして好ましくは、２－ヒドロキシエチルである。
　別の態様において、式（Ａ）中、Ｒ１～Ｒ３は、それぞれ独立して、Ｃ１－Ｃ２アルキル、またはＣ２ヒドロキシアルキルである。Ｃ２ヒドロキシアルキルとして好ましくは、２－ヒドロキシエチルである。
　式（Ａ）で表される三級アミンとして好ましくは、Ｒ１～Ｒ３が、それぞれ独立して、Ｃ１－Ｃ２アルキルであるものが挙げられる。
　式（Ａ）で表される三級アミンとして、具体的には、トリメチルアミン、Ｎ、Ｎ－ジメチルエチルアミン、Ｎ，Ｎ－ジエチルメチルアミン、トリエチルアミン、トリエタノールアミンなどが挙げられ、これらのうちではトリメチルアミンが特に好ましい。
　ある態様において、式（Ｂ）中、Ｘは、ＮまたはＯである。ＸがＮである場合、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、Ｃ１－Ｃ２アルキル、もしくはＣ２ヒドロキシアルキルであるか、またはそれらが結合している窒素原子と一緒になって５～６員非芳香族複素環を形成する。ＸがＯである場合、Ｒ４は、Ｃ１－Ｃ２アルキル、またはＣ２ヒドロキシアルキルであり、Ｒ５は存在しない。５～６員非芳香族複素環として好ましくは、ピロリジン、ピペリジン、またはモルホリンであり、Ｃ２ヒドロキシアルキルとして好ましくは、２－ヒドロキシエチルである。また、式（Ｂ）中、Ｒ６およびＲ７は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１－Ｃ２アルキル、またはメトキシである。
　式（Ｂ）で表される三級アミンとして好ましくは、ＸがＮであり、Ｒ４およびＲ５が、それぞれ独立して、Ｃ１－Ｃ２アルキルであり、かつＲ６およびＲ７がＨであるものが挙げられる。
　式（Ｂ）で表される三級アミンとして、具体的には、ＤＭＡＰ、４－ピペリジノピリジン、４－モルホリノピリジンなどが挙げられ、これらのうちでは、ＤＭＡＰが特に好ましい。
　ある態様において、式（Ｃ）中、Ｒ８およびＲ９は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１－Ｃ２アルキル、もしくはＣ２ヒドロキシアルキルであるか、またはＲ８が結合している窒素原子およびＲ９が結合している炭素原子と一緒になって５～６員非芳香族複素環を形成する。５～６員非芳香族複素環として好ましくは、ピロリジン、ピペリジン、またはモルホリンであり、Ｃ２ヒドロキシアルキルとして好ましくは、２－ヒドロキシエチルである。
　式（Ｃ）で表される三級アミンとして好ましくは、Ｒ８およびＲ９が、それぞれ独立して、ＨまたはＣ１－Ｃ２アルキルであるものが挙げられ、Ｒ８がＣ１－Ｃ２アルキルであり、かつＲ９がＨであるものがより好ましい。
　式（Ｃ）で表される三級アミンとして、具体的には、ＮＭＩ、イミダゾール－１－エタノール、５，６，７，８－テトラヒドロイミダゾ［１，５－α］ピリジンなどが挙げられ、これらのうちでは、ＮＭＩが特に好ましい。
　特定の理論によって拘束されるものではないが、本発明の三級アミンは、残存Ｃ末端活性体に対して求核攻撃を行うことによって、残存Ｃ末端活性体の加水分解を促進することができる。ＤＩＰＥＡのような三級アミンは嵩高い置換基を有するため、求核性が低く、望ましくない。残存Ｃ末端活性体の加水分解物は、水層に移動させて除去できるため、カラム精製などの別個の精製工程を経ることなく、生成したペプチド化合物を次の縮合反応に供することができる。本発明の方法を用いることによって迅速（例えば、５分以内）に、かつ少ない回数（例えば、１回のみ）の加水分解処理で効率的に残存Ｃ末端活性体を除去することができ、ある態様では、残存Ｃ末端活性体の９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上を除去することができる。言い換えると、本発明によれば、Ｃ末端活性体の残存率を１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下にすることができる。
　三級アミンは、アミン成分に対して触媒量を用いてもよく、化学量論量以上の量を用いてもよい。具体的には、たとえば、アミン成分に対して０．１当量～１０当量の三級アミンを反応混合液に添加することができ、０．５当量～３当量の三級アミンを添加することが好ましい。
　三級アミンを残存Ｃ末端活性体と作用させる際は、－２０℃～溶媒の沸点付近の温度、好ましくは２５℃～６０℃の温度で反応混合液を１分～４８時間、好ましくは２時間以下、例えば、２分～２時間、５分～６０分、５分～５０分、または５～３０分、攪拌することができる。
　ある態様において、残存Ｃ末端活性体を三級アミンで処理する工程には、水または水溶液を加えることができ、水溶液としてはアルカリ水溶液を好ましく用いることができる。このようなアルカリ水溶液は特に限定されないが、具体的には、たとえば、炭酸カリウム水溶液、水酸化リチウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム水溶液、水酸化ナトリウム水溶液、または炭酸セシウム水溶液などが挙げられる。これらのうちでは、穏和な塩基性を有する炭酸カリウム水溶液または炭酸ナトリウム水溶液が好ましい。
　ある態様において、本発明は、三級アミンを残存Ｃ末端活性体と作用させた後に、反応混合液を有機層と水層に分層して有機層を取り、次いで該有機層を洗浄する工程をさらに含む。一例として、酸性水溶液と塩基性水溶液による有機層の洗浄を含む。ある態様では、この工程を経た場合、残存Ｃ末端活性体の残存量を１．０％以下、０．５％以下、好ましくは０．１％以下にすることができる。
　ある態様において、本発明は、前記ペプチド化合物のＮ末端の保護基を脱保護する工程（工程Ｃ）をさらに含む。保護基の脱保護は、例えば、「Greene’s,“Protective Groups in Organic Synthesis″（第５版，John Wiley & Sons 2014）」に記載の常法により行うことができる。従来法では、残存したＣ末端活性体に起因して脱保護反応が十分に進行しないことがあるが、本発明の方法を用いることで、生成したペプチド化合物の脱保護体を高収率で得ることができる。
　ある態様において、本発明は、工程Ａと工程Ｂを複数回繰り返すことを含む。また、ある態様において、本発明は、工程Ａ、工程Ｂおよび工程Ｃを複数回繰り返すことを含む。このような繰り返しにより、ペプチド鎖を伸長し、ペプチド化合物を得ることができる。
　ある態様において、本発明は、残存Ｃ末端活性体を含む溶液に三級アミンと水または水溶液を追加して、該Ｃ末端活性体を三級アミンと作用させる工程を含む、残存Ｃ末端活性体の加水分解を促進する方法に関する。この態様において、残存Ｃ末端活性体および／または三級アミンは前述のものを用いることができる。残存Ｃ末端活性体を含む溶液に水溶液を添加する場合、該水溶液としては前記アルカリ水が好ましい。
　ある態様において、本発明は、残存Ｃ末端活性体の加水分解体を含む溶液を水性洗浄する工程を含む、該加水分解体を除去する方法に関する。この態様において、水性洗浄として、水の他に、アルカリ性水溶液による洗浄を実施することができる。アルカリ性水溶液は、特に限定されないが、炭酸カリウム水溶液もしくは炭酸ナトリウム水溶液が好ましい。また、別の態様において、使用した塩基が加水分解体と塩を形成して水層に移行しにくくなっている場合には、その塩基を酸性水溶液で洗浄して除去した後に、アルカリ水溶液で洗浄することもできる。酸性水溶液は特に限定されないが、硫酸水素カリウム水溶液もしくは硫酸水素ナトリウム水溶液が好ましい。アルカリ性水溶液は、炭酸カリウム水溶液もしくは炭酸ナトリウム水溶液が好ましい。
　なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
　本発明は、以下の実施例によってさらに例示されるが、下記の実施例に限定されるものではない。
　ペプチド化合物（ペプチド合成での目的物）の純度、C末端活性体残存量は、QDA, PDA検出器を備えたLCMS（カラム：Ascentis Express C18、5 cm x 4.6 mm、2.7μm、移動相：0.5%トリフルオロ酢酸水溶液/0.5%トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液＝95/5-0/100、1.0 mL/min、検出器：UV210nm）を用いて測定した。
　C末端活性体の残存量の評価は、残存C末端活性体が分析条件（LCMS）で加水分解を受ける可能性があるため、残存C末端活性体をプロピルアミドに変換して行った。
　ペプチド化合物（ペプチド合成での目的物）の純度は、LCMSのピーク面積パーセントとして記した。C末端活性体残存率およびC末端活性体残存量相対値は各実施例に記載の計算式により算出した。尚、総ピーク面積は、ブランクピーク、溶媒ピークの面積値を差し引いて補正した。
　表中のndは、not detectedの意味を表す。
（実施例１）残存C末端活性体の加水分解における添加アミン効果
（混合酸無水物の調整）
　Cbz-Ile-OH 463 mg (1.7 mmol)、ペンタメチルベンゼン 31 mg (内部標準物質：0.21 mmol) を2-メチルテトラヒドロフラン3.0 mLに溶解した。室温でジイソプロピルエチルアミン 1.1 mL (6.2 mmol)、T3P/THF 50%溶液 1.9 mL (3.2 mmol) を加え、40 ℃で1時間撹拌して混合酸無水物（C末端活性体）溶液を調製した。調製した混合酸無水物溶液から5 μLをとり、ノルマルプロピルアミン100 μL (1.2 mmol)と反応させた後、メタノール0.9 mLで希釈して、混合酸無水物への反応変換率をLC/MSのピーク面積より求めた（変換率：97%）。Cbz-Ile-NHPr/MS(ESI)：m/z 307.1 [M+H]+。
変換率 (%) = {Cbz-Ile-NHPr (面積%)/[Cbz-Ile-OH (面積%)+ Cbz-Ile-NHPr (面積%)]}×100
（加水分解処理-アミン非添加）
　調製した混合酸無水物溶液の全量 (6 mL) から1.0 mLをとり、アルカリ水（5%水酸化リチウム水溶液、5%炭酸ナトリウム水溶液、5%炭酸カリウム水溶液、5%水酸化カリウム水溶液、または5%炭酸セシウム水溶液）0.5 mLを加え、25 ℃で、撹拌子にて撹拌（1200 rpm）を行った。撹拌を停止した後、静置し、有機層と水層を分層させた。有機層5 μLをとり、ノルマルプロピルアミン100 μL (1.2 mmol)に加えて、残存するC末端活性体をプロピルアミドへ変換させた後、メタノール0.9 mLで希釈した。本溶液をLC/MS分析に付し、ピーク面積比[プロピルアミド：ペンタメチルベンゼン (内部標準物質)]を計算した。
（加水分解処理-アミン添加）
　調製した混合酸無水物溶液全量 (6 mL) から1.0 mLをとり、アミン添加剤 (0.19 mmol)、及び5%炭酸カリウム水溶液 0.5 mLを加え、25 ℃で、撹拌子にて撹拌（1200 rpm）を行った。撹拌を停止、静置し、有機層と水層を分層させた。有機層5 μLをとり、ノルマルプロピルアミン100 μL (1.2 mmol)に加えて、残存するC末端活性体をプロピルアミドへ変換させた後、メタノール0.9 mLで希釈した。本溶液をLC/MS分析に付し、ピーク面積比[プロピルアミド：ペンタメチルベンゼン (内部標準物質)]を計算した。
（C末端活性体の残存量評価）
　LC/MSのピーク面積比[プロピルアミド/ペンタメチルベンゼン (内部標準物質)]を用いた。下記表のC末端活性体残存量相対値は、アミン添加剤を加えず5%炭酸カリウム水溶液で5分間処理したときのピーク面積比[プロピルアミド/ペンタメチルベンゼン]の値3.5を100（entry 1の5minのカラム）としたとき相対値である。
C末端活性体残存量相対値（％） = {[プロピルアミド(面積%)/ペンタメチルベンゼン(面積%)]/ 3.5（entry 1、5 min での[プロピルアミド(面積%)/ペンタメチルベンゼン(面積%)]）}x100
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 1) Not applicable.
　表１のＣ末端活性体残存量相対値は、値が小さいほど残存Ｃ末端活性体が加水分解されていることを示している。アルカリ水単独を使用した場合、アルカリの対カチオンを変えても加水分解速度にほとんど変化はなく、アミン添加した場合より加水分解は遅かった。また、添加したアミンの中でも、ＤＭＡＰ、ＮＭＩの添加が残存Ｃ末端活性体加水分解を劇的に促進することを見出した。
（実施例２）残存C末端活性体の加水分解における添加アミン効果
（活性エステルの調整）
　Cbz-Ile-OH 701 mg (2.64 mmol)、ペンタメチルベンゼン 46 mg (0.31 mmol) を2-メチルテトラヒドロフラン7.0 mLに溶解した。室温でHATU 1.0 g (2.64 mmol)、ジイソプロピルエチルアミン 1.5 mL (8.79 mmol)を加え、60 ℃で4時間撹拌して活性エステル（C末端活性体）溶液を調製した。調製した活性エステル溶液から5 μLをとり、ノルマルプロピルアミン100 μL (1.2 mmol)と反応させた 後、メタノール0.9 mLで希釈して、活性エステルへの反応変換率をLC/MSのピーク面積より求めた（変換率：94%）。Cbz-Ile-NHPr/MS(ESI)：m/z 307.1 [M+H]+。
変換率 (%) = {Cbz-Ile-NHPr(面積%)/[Cbz-Ile-OH(面積%)+Cbz-Ile-NHPr(面積%)]}×100
（アルカリ水単独での加水分解処理）
　調製した活性エステル溶液の全量 (9 mL) から1.5 mLをとり、アルカリ水（5%炭酸カリウム水溶液）0.75 mLを加え、25 ℃で、撹拌子にて撹拌（1200 rpm）を行った。撹拌を停止した後、静置し、有機層と水層を分層させた。有機層5 μLをとり、ノルマルプロピルアミン100 μL (1.2 mmol) に加えて、残存するC末端活性体をプロピルアミドへ変換させた後、メタノール0.9 mLで希釈した。本溶液をLC/MS分析に付し、ピーク面積比[プロピルアミド：ペンタメチルベンゼン (内部標準物質)]を計算した。
（アミン添加した加水分解処理）
　調製した活性エステル溶液全量 (9 mL) から1.5 mLをとり、アミン添加剤 (0.44 mmol)、及び5%炭酸カリウム水溶液 0.75 mLを加え、25 ℃で、撹拌子にて撹拌（1200 rpm）を行った。撹拌を停止、静置し、有機層と水層を分層させ、有機層5 μLをとり、ノルマルプロピルアミン100 μL (1.2 mmol) に加えて、残存するC末端活性体をプロピルアミドへ変換させた後、メタノール0.9 mLで希釈した。本溶液をLC/MS分析に付し、ピーク面積比[プロピルアミド：ペンタメチルベンゼン (内部標準物質)]を計算した。
（C末端活性体の残存量評価）
　LC/MSのピーク面積比[プロピルアミド/ペンタメチルベンゼン (内部標準物質)]を用いた。下記表のC末端活性体残存量相対値は、アミン添加剤を加えず5%炭酸カリウム水溶液で5分間処理したときのピーク面積比[プロピルアミド/ペンタメチルベンゼン]の値3.0を100（entry 1の5minのカラム）としたとき相対値である。
C末端活性体残存量相対値（％） = {[プロピルアミド(面積%)/ペンタメチルベンゼン(面積%)]/ 3.0（entry 1、5 minでの[プロピルアミド(面積%)/ペンタメチルベンゼン(面積%)]）}x100
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表２のＣ末端活性体残存量相対値は、値が小さいほど残存Ｃ末端活性体が加水分解されていることを示している。アルカリ水のみを使用した場合よりもアミンを添加した方が、残存Ｃ末端活性体加水分解を促進することを見出した。すなわち、ＤＢＵ、Ｍｅ３Ｎ、ＮＭＩ、ＤＭＡＰの添加に効果があることが認められ、特にＮＭＩとＤＭＡＰの添加に劇的な効果があることを見出した。
（実施例３）残存C末端活性体の加水分解における添加アミン効果
　Cbz-MeAla-OH 617 mg (2.6 mmol)、ペンタメチルベンゼン 46 mg (0.31 mmol) を2-メチルテトラヒドロフラン4.5 mLからなる溶液に室温でジイソプロピルエチルアミン1.5 mL (8.6 mmol)、T3P/THF 50%溶液 2.6 mL (4.4 mmol) を加え、40 ℃で1時間撹拌して混合酸無水物溶液（C末端活性体）を調製した。調製した混合酸無水物溶液から5 μLをとり、ノルマルプロピルアミン100 μL (1.2 mmol)と反応させた後、メタノール0.9 mLで希釈して、混合酸無水物への反応変換率をLC/MSのピーク面積より求めた（変換率：90%）。Cbz-MeAla-NHPr/MS (ESI): m/z 279.1 [M+H]+。
変換率 (%) = {Cbz-MeAla-NHPr(面積%)/[Cbz-MeAla-OH(面積%)+Cbz-MeAla-NHPr(面積%)]}×100
（アルカリ水単独での加水分解処理）
　調製した混合酸無水物溶液の全量 (9 mL) から1.5 mLをとり、アルカリ水（5%炭酸ナトリウム水溶液、または5%炭酸カリウム水溶液）0.75 mLを加え、25 ℃で、撹拌子にて撹拌（1200 rpm）を行った。撹拌を停止した後、静置し、有機層と水層を分層させた。有機層5 μLをとり、ノルマルプロピルアミン100 μL (1.2 mmol) に加えて、残存するC末端活性体をプロピルアミドへ変換させた後、メタノール0.9 mLで希釈した。本溶液をLC/MS分析に付し、ピーク面積比[プロピルアミド：ペンタメチルベンゼン (内部標準物質)]を計算した。
（アミン添加した加水分解処理）
　調製した混合酸無水物溶液全量 (9 mL) から1.5 mLをとり、アミン添加剤 (0.43 mmol、0.67当量)、及び5%炭酸カリウム水溶液 0.75 mLを加え、25 ℃で、撹拌子にて撹拌（1200 rpm）を行った。撹拌を停止、静置し、有機層と水層を分層させ、有機層5 μLをとり、ノルマルプロピルアミン100 μL (1.2 mmol) に加えて、残存するC末端活性体をプロピルアミドへ変換させた後、メタノール0.9 mLで希釈した。本溶液をLC/MS分析に付し、ピーク面積比[プロピルアミド：ペンタメチルベンゼン (内部標準物質)]を計算した。
（C末端活性体の残存量評価）
　LC/MSのピーク面積比[プロピルアミド/ペンタメチルベンゼン (内部標準物質)]を用いた。下記表のC末端活性体残存量相対値は、アミン添加剤を加えず5%炭酸ナトリウム水溶液で5分間処理したときのピーク面積比[プロピルアミド/ペンタメチルベンゼン]の値1.1を100（entry 1の5minのカラム）としたとき相対値である。
C末端活性体残存量相対値（％） = {[プロピルアミド(面積%)/ペンタメチルベンゼン(面積%)]/ 1.1（entry 1、5 min での[プロピルアミド(面積%)/ペンタメチルベンゼン(面積%)]}x100
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表３のＣ末端活性体残存量相対値は、値が小さいほど残存Ｃ末端活性体が加水分解されていることを示している。アルカリ水単独を使用した場合、アルカリの対カチオンを変えても加水分解速度にほとんど変化はなかった。また、ＤＭＡＰ、ＮＭＩを添加すると、アルカリ水単独を使用した場合よりも、残存Ｃ末端活性体の加水分解が促進されることを見出した。ＤＭＡＰ、ＮＭＩの添加は５分以内でも十分効果があり、特に、ＤＭＡＰ添加においては、完全に残存Ｃ末端活性体を加水分解することを見出した。
（実施例４）Cbz-Ile-Phe-OtBuの合成
（縮合反応）
　H-Phe-OtBu塩酸塩 458 mg (1.8 mmol)、Cbz-Ile-OH 699 mg (2.7 mmol)、及び2-メチルテトラヒドロフラン4.5 mLからなる溶液に室温でジイソプロピルエチルアミン1.6 mL (8.9 mmol)、T3P/THF 50%溶液 2.6 mL (4.4 mmol) を加え、40 ℃で1時間撹拌してペプチド結合形成反応を行った。反応溶液から5 μLをとり、ノルマルプロピルアミン100 μL (1.2 mmol)と反応させた後、メタノール0.9 mLで希釈して、反応変換率をLC/MSのピーク面積より求めた（変換率：100%）。
変換率(%)={Cbz-Ile-Phe-OtBu(面積%)/[H-Phe-OtBu(面積%)+Cbz-Ile-Phe-OtBu(面積%)]}×100
（アルカリ水単独での加水分解処理）
　上記調製したジペプチド溶液全量 (9 mL) から1.5 mLをとり、5%炭酸カリウム水溶液 0.75 mLを加え、25 ℃で、撹拌子にて撹拌（1200 rpm）を行った。撹拌を停止した後、静置し、有機層と水層を分層させた。有機層5 μLをとり、ノルマルプロピルアミン100 μL (1.2 mmol)に加えて、残存するC末端活性体をプロピルアミドへ変換させた後、メタノール0.9 mLで希釈して、LC/MS分析に付し、プロピルアミドと目的とするペプチドのピーク面積値を求めて、C末端活性体残存率 (%)を算出した。残った反応液の水層を除去し、有機層を5%硫酸水素カリウム水溶液0.5 mLと5%炭酸カリウム水溶液 0.5 mLで順次洗浄した。有機層5 μLをとり、ノルマルプロピルアミン100 μL (1.2 mmol)に加えて、残存するC末端活性体をプロピルアミドへ変換させた後、メタノール0.9 mLで希釈した。本溶液をLC/MS分析に付し、目的とするペプチドと残存C末端活性体（プロピルアミドへの変換体）のピーク面積値を求めた。
C末端活性体残存率(%)={プロピルアミド(面積%)/[プロピルアミド(面積%)+ジペプチド(面積%)]}×100
（アミン添加した加水分解処理）
　調製したジペプチド溶液全量 (9 mL) から1.5 mLをとり、アミン(0.15 mmol 0.5当量、0.30 mmol 1.0当量、または0.89 mmol 3当量：当量はH-Phe-OtBu塩酸塩に対してのもの)、及び5%炭酸カリウム水溶液 0.75 mLを加え、25 ℃で、撹拌子にて撹拌（1200 rpm）を行った。撹拌を停止した後、静置し、有機層と水層を分層させた。有機層5 μLをとり、プロピルアミン100 μL (1.2 mmol)に加えて、残存するC末端活性体をプロピルアミドへ変換させた後、メタノール0.9 mLで希釈して、LC/MS分析に付し、プロピルアミドと目的とするペプチドのピーク面積値を求めて、C末端活性体残存率 (%)を算出した。残った反応液の水層を除去し、有機層を5%硫酸水素カリウム水溶液0.75 mLと5%炭酸カリウム水溶液 0.75 mLで順次洗浄した。有機層5 μLをとり、ノルマルプロピルアミン100 μL (1.2 mmol)に加えて、残存するC末端活性体をプロピルアミドへ変換させた後、メタノール0.9 mLで希釈した。本溶液をLC/MS分析に付し、目的とするペプチドと残存C末端活性体（プロピルアミドへの変換体）のピーク面積値を求めた。MS(ESI)：m/z 413.3 [M-tBu+H]+, 469.3 [M+H]+, 491.3 [M+Na]+。
C末端活性体残存率(%)={プロピルアミド(面積%)/[プロピルアミド(面積%)+ジペプチド(面積%)]}×100
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
 1) N末アミノ酸誘導体（H-Phe-OtBu塩酸塩）に対しての当量
2) LCMSのピーク面積比率
　添加アミンＮＭＩは、Ｎ末端のアミノ酸誘導体に対して０．５～３．０当量を使用することで、アルカリ水単独処理での加水分解よりも加水分解を優位に促進することを見出した。また、添加アミンＤＭＡＰは、Ｎ末アミノ酸誘導体に対して０．５～３．０当量を使用することで、アルカリ水単独処理での加水分解よりも加水分解を優位に促進することを見出した。
　アミンを添加して加水分解処理を１回行った後、有機層を５％ＫＨＳＯ４、５％Ｋ２ＣＯ３で洗浄することにより、有機層中の残存Ｃ末端活性体を完全に除去できることを見出した。このとき、目的物であるペプチドは、高純度で得られた。一方、アルカリ水での単独処理では、Ｃ末端活性体が残存し、ジペプチドの純度も低かった。
（実施例５）Cbz-Ile-Phe-OtBuの合成
（縮合反応）
　H-Phe-OtBu塩酸塩 452 mg (1.8 mmol)、Cbz-Ile-OH 702 mg (2.6 mmol)、及び2-メチルテトラヒドロフラン4.5 mLからなる溶液に室温でジイソプロピルエチルアミン 1.5 mL (8.8 mmol)、T3P/THF 50%溶液 2.6 mL (4.4 mmol) を加え、40 ℃で1時間撹拌してペプチド結合形成反応を行った。反応溶液から5 μLをとり、ノルマルプロピルアミン100 μL (1.2 mmol)と反応させた後、メタノール0.9 mLで希釈して、反応変換率をLC/MSのピーク面積より求めた（変換率：100%）。
変換率(%)={Cbz-Ile-Phe-OtBu(面積%)/[H-Phe-OtBu(面積%)+Cbz-Ile-Phe-OtBu(面積%)]}×100
（アルカリ水単独での加水分解処理）
　上記調製したジペプチド溶液全量 (9 mL) から1.5 mLをとり、5%炭酸カリウム水溶液 0.75 mLを加えて、60 ℃で、撹拌子にて撹拌（1200 rpm）を行った。撹拌を停止した後、静置し、有機層と水層を分層させた。有機層5 μLをとり、ノルマルプロピルアミン100 μL (1.2 mmol)に加えて、残存するC末端活性体をプロピルアミドへ変換させた後、メタノール0.9 mLで希釈して、LC/MS分析に付し、プロピルアミドと目的とするペプチドのピーク面積値を求めて、C末端活性体残存率 (%)を算出した。残った反応液の水層を除去し、有機層を5%硫酸水素カリウム水溶液0.75 mLと5%炭酸カリウム水溶液 0.75 mLで順次洗浄した。有機層5 μLをとり、ノルマルプロピルアミン100 μL (1.2 mmol)に加えて、残存するC末端活性体をプロピルアミドへ変換させた後、メタノール0.9 mLで希釈した。本溶液をLC/MS分析に付し、目的とするペプチドと残存C末端活性体（プロピルアミドへの変換体）のピーク面積値を求めた。
C末端活性体残存率(%)={プロピルアミド(面積%)/[プロピルアミド(面積%)+ジペプチド(面積%)]}×100
（アミン添加した加水分解処理）
　調製したジペプチド溶液全量 (9 mL) から1.5 mLをとり、アミン(0.29 mmol)、及び5%炭酸カリウム水溶液 0.75 mLを加え、60 ℃で、撹拌子にて撹拌（1200 rpm）を行った。撹拌を停止した後、静置し、有機層と水層を分層させた。有機層5 μLをとり、プロピルアミン100 μL (1.2 mmol)に加えて、残存するC末端活性体をプロピルアミドへ変換させた後、メタノール0.9 mLで希釈して、LC/MS分析に付し、プロピルアミドと目的とするペプチドのピーク面積値を求めて、C末端活性体残存率 (%)を算出した。残った反応液の水層を除去し、有機層を5%硫酸水素カリウム水溶液0.75 mLと5%炭酸カリウム水溶液 0.75 mLで順次洗浄した。有機層5 μLをとり、ノルマルプロピルアミン100 μL (1.2 mmol)に加えて、残存するC末端活性体をプロピルアミドへ変換させた後、メタノール0.9 mLで希釈した。本溶液をLC/MS分析に付し、目的とするペプチドと残存C末端活性体（プロピルアミドへの変換体）のピーク面積値を求めた。MS(ESI)：m/z 413.3 [M-tBu+H]+, 469.3 [M+H]+, 491.3 [M+Na]+。
C末端活性体残存率(%)={プロピルアミド(面積%)/[プロピルアミド(面積%)+ジペプチド(面積%)]}×100
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
 1) LCMSのピーク面積比率
　残存Ｃ末端活性体の加水分解を、アミンを添加して６０℃で行っても、目的とするペプチドが２５℃で行ったときと同等の高い純度で得られた。特に、添加したアミンがＤＭＡＰおよびＮＭＩの場合には、アルカリ水単独の場合よりも加水分解が早く進行した。また、添加したアミンがＤＭＡＰおよびＮＭＩの場合には、１回の加水分解処理で、加水分解が５分以内に効果的に進行し、続く分液操作（５％ ＫＨＳＯ４、５％ Ｋ２ＣＯ３洗浄）で有機層から残存Ｃ末端活性体を完全に除去できることを見出した。
（実施例６）Cbz-MeIle-MePhe-OMeの合成
（縮合反応）
　MePhe-OMe塩酸塩 300 mg (1.3 mmol)、Cbz-MeIle-OH 442 mg (1.6 mmol) をアセトニトリル3.0 mLに懸濁し、ジイソプロピルエチルアミン 683 μL (3.9 mmol)を加えた。次いで25 ℃でHATU 594 mg (1.6 mmol) を加えて、25 ℃下30分撹拌した後40 ℃で3時間撹拌し、さらに60 ℃で3時間撹拌してペプチド結合形成反応を行った。反応液5 μLをとり、ノルマルプロピルアミン100 μL (1.2 mmol)に加えて、残存するC末端活性体をプロピルアミドへ変換させた後、メタノール0.9 mLで希釈した。本溶液をLC/MS分析に付し、LC/MSのピーク面積値から変換率を求めた（変換率：>99%）。
変換率(%)={Cbz-MeIle-MePhe-OMe(面積%)/[MePhe-OMe(面積%)+Cbz-MeIle-MePhe-OMe (面積%)]}×100
（加水分解処理）
（１）アミン非添加の場合
　上記調製したペプチドを含む反応溶液にMTBE 3.0 mLと5%炭酸カリウム水溶液3.0 mLを加え、25 ℃で、撹拌子にて30分間撹拌を行った。撹拌を停止し、有機層と水層を分層させた。有機層5 μLをとり、ノルマルプロピルアミン100 μL (1.2 mmol)に加えて、残存するC末端活性体をプロピルアミドへ変換させた後、メタノール0.9 mLで希釈した。LC/MSのピーク面積値から、以下の計算式に従ってC末端活性体残存率を計算した。
C末端活性体残存率(%)={プロピルアミド(面積%)/[プロピルアミド(面積%)+ジペプチド(面積%)]}×100
（２）アミン添加の場合
　上記調製したペプチドを含む反応溶液にMTBE 3.0 mL、N-メチルイミダゾール 103 μL (1.3 mmol)と5%炭酸カリウム水溶液3.0 mLを加え、25 ℃で、撹拌子にて30分間撹拌を行った。撹拌を停止し、有機層と水層を分層させた。有機層5 μLをとり、ノルマルプロピルアミン100 μL (1.2 mmol)に加えて、残存するC末端活性体をプロピルアミドへ変換させた後、メタノール0.9 mLで希釈した。LC/MSのピーク面積値から、以下の計算式に従ってC末端活性体残存率を計算した。
C末端活性体残存率(%)={プロピルアミド(面積%)/[プロピルアミド(面積%)+ジペプチド(面積%)]}×100
（後処理）
　撹拌を停止した後、静置し、有機層と水層を分層させ、水層を除去した。次いで有機層を10%硫酸水素カリウム水溶液3 mL×2、5%炭酸カリウム水溶液3 mL、常水1 mL×5で順次洗浄した。撹拌を停止し、有機層と水層を分層させた。有機層5 μLをとり、ノルマルプロピルアミン100 μL (1.2 mmol)に加えて、残存するC末端活性体をプロピルアミドへ変換させた後、メタノール0.9 mLで希釈して、LC/MS分析に付し、目的とするペプチドと残存C末端活性体（プロピルアミドへの変換体）のピーク面積値を求めた。残った有機層を濃縮し、ペプチドを得た。アミン非添加加水分解により得られた濃縮物（ペプチド）は671.8 mgであった(収率113%：濃縮物には不純物（残存C末端活性体）を含むが、ペプチドのみを含むものとして計算した)。アミン添加での加水分解により得られた濃縮物は563.7 mgであった (収率95%)。MS(ESI)：m/z 455.2 [M+H]+, 477.2 [M+Na]+。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
 １）LCMSのピーク面積比率
　アルカリ水単独処理での加水分解では、残存Ｃ末端活性体が完全に加水分解されず、続く水性洗浄でも残存Ｃ末端活性体を除去できなかったが、ＮＭＩを添加して加水分解を行うと、残存Ｃ末端活性体の加水分解が完全に達成されて、残存Ｃ末端活性体の除去も完全にできることを見出した。しかもこのとき、目的のジペプチドが１００％の純度で得られた（収率９５％）。
（実施例７）Cbz-MeVal-MeAsp(tBu)-piperidineの合成
（縮合反応）
　MeAsp(tBu)-piperidine 303 mg (1.1 mmol)、Cbz-MeVal-OH 448 mg (1.7 mmol) をアセトニトリル0.6 mL、シクロペンチルメチルエーテル2.4 mL混合溶媒に懸濁し、ジイソプロピルエチルアミン 586 μL (3.4 mmol)を加えた。次いで25 ℃でHATU 642 mg (1.7 mmol) を加え、25 ℃で6.5時間撹拌しペプチド結合形成反応を行った。反応液5 μLをとり、ノルマルプロピルアミン100 μL (1.2 mmol)に加えて、残存するC末端活性体をプロピルアミドへ変換させた後、メタノール0.9 mLで希釈した。本溶液をLC/MS分析に付し、LC/MSのピーク面積値から変換率を求めた (変換率:100%)。
変換率(%)={Cbz-MeVal-MeAsp(tBu)-piperidine(面積%)/[MeAsp(tBu)-piperidine(面積%)+Cbz-MeVal-MeAsp(tBu)-piperidine(面積%)]}×100
（加水分解処理）
（１）アミン非添加の場合
　上記調製したペプチドを含む反応溶液に5%炭酸カリウム水溶液3.0 mLを加え、25 ℃で、撹拌子にて5分間撹拌を行った。撹拌を停止し、有機層と水層を分層させた。有機層5 μLをとり、ノルマルプロピルアミン100 μL (1.2 mmol)に加えて、残存するC末端活性体をプロピルアミドへ変換させた後、メタノール0.9 mLで希釈した。LC/MSのピーク面積値から、以下の計算式に従ってC末端活性体残存率を計算した。
C末端活性体残存率(%)={プロピルアミド(面積%)/[プロピルアミド(面積%)+ジペプチド(面積%)]}×100
（２）アミン添加の場合
　上記調製したペプチドを含む反応溶液にDMAP 136 mg (1.1 mmol)と5%炭酸カリウム水溶液3.0 mLを加え、25 ℃で、撹拌子にて5分間撹拌を行った。撹拌を停止し、有機層と水層を分層させた。有機層5 μLをとり、ノルマルプロピルアミン100 μL (1.2 mmol)に加えて、残存するC末端活性体をプロピルアミドへ変換させた後、メタノール0.9 mLで希釈した。LC/MSのピーク面積値から、以下の計算式に従ってC末端活性体残存率を計算した。
C末端活性体残存率(%)={プロピルアミド(面積%)/[プロピルアミド(面積%)+ジペプチド(面積%)]}×100
（後処理）
　撹拌を停止した後、静置し、有機層と水層を分層させ、水層を除去した。次いで有機層を10%硫酸水素カリウム水溶液3 mL×2、5%炭酸カリウム水溶液3 mL x 2、常水1 .5 mL×3で順次洗浄した。撹拌を停止し、有機層と水層を分層させた。有機層5 μLをとり、ノルマルプロピルアミン100 μL (1.2 mmol)に加えて、残存するC末端活性体をプロピルアミドへ変換させた後、メタノール0.9 mLで希釈して、LC/MS分析に付し、目的とするペプチドと残存C末端活性体（プロピルアミドへの変換体）のピーク面積値を求めた。残った有機層を濃縮し、ペプチドを得た。アミン非添加加水分解により得られた濃縮物（ペプチド）は782.0 mgであった (収率136%：濃縮物には不純物（残存C末端活性体）を含むが、ペプチドのみを含むものとして計算した)。アミン添加での加水分解により得られた濃縮物は530.6 mgであった (収率92%)。MS(ESI)：m/z 518.4 [M+H]+, 540.4 [M+Na]+。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
 １）LCMSのピーク面積比率
　アルカリ水単独処理での加水分解では、残存Ｃ末端活性体が完全に加水分解されず、続く水性洗浄でも残存Ｃ末端活性体を除去できなかったが、ＤＭＡＰを添加して加水分解を行うと、残存Ｃ末端活性体の加水分解が完全に達成されて、残存Ｃ末端活性体の除去も完全にできることを見出した。しかもこのとき、目的のジペプチドが１００％の純度で得られた（収率９２％）。
（実施例８）Cbz-MeVal-MeAsp(tBu)-piperidineの合成
（縮合反応）
　MeAsp(tBu)-piperidine 299 mg (1.1 mmol)、Cbz-MeVal-OH 458 mg (1.7 mmol) を2-MeTHF 4.5 mL溶媒に懸濁し、ジイソプロピルエチルアミン 775 μL (4.4 mmol)を加えた。次いで25 ℃で50%T3P/THF溶液1.6 mL (2.8 mmol) を加え、25 ℃で15時間撹拌しペプチド結合形成反応を行った。反応液5 μLをとり、ノルマルプロピルアミン100 μL (1.2 mmol)に加えて、残存するC末端活性体をプロピルアミドへ変換させた後、メタノール0.9 mLで希釈した。本溶液をLC/MS分析に付し、LC/MSのピーク面積値から変換率を求めた (変換率:100%)。
変換率(%)={Cbz-MeVal-MeAsp(tBu)-piperidine(面積%)/[MeAsp(tBu)-piperidine(面積%)+Cbz-MeVal-MeAsp(tBu)-piperidine(面積%)]}×100
（加水分解処理）
（１）アミン非添加の場合
　上記調製したペプチドを含む反応溶液に5%炭酸カリウム水溶液3.0 mLを加え、25 ℃で、撹拌子にて5分間撹拌を行った。撹拌を停止し、有機層と水層を分層させた。有機層5 μLをとり、ノルマルプロピルアミン100 μL (1.2 mmol)に加えて、残存するC末端活性体をプロピルアミドへ変換させた後、メタノール0.9 mLで希釈した。LC/MSのピーク面積値から、以下の計算式に従ってC末端活性体残存率を計算した。
C末端活性体残存率(%)={プロピルアミド(面積%)/[プロピルアミド(面積%)+ジペプチド(面積%)]}×100
（２）アミン添加の場合
　上記調製したペプチドを含む反応溶液にDMAP 141 mg (1.1 mmol)と5%炭酸カリウム水溶液3.0 mLを加え、25 ℃で、撹拌子にて5分間撹拌を行った。撹拌を停止し、有機層と水層を分層させた。有機層5 μLをとり、ノルマルプロピルアミン100 μL (1.2 mmol)に加えて、残存するC末端活性体をプロピルアミドへ変換させた後、メタノール0.9 mLで希釈した。LC/MSのピーク面積値から、以下の計算式に従ってC末端活性体残存率を計算した。
C末端活性体残存率(%)={プロピルアミド(面積%)/[プロピルアミド(面積%)+ジペプチド(面積%)]}×100
（後処理）
　撹拌を停止した後、静置し、有機層と水層を分層させ、水層を除去した。次いで有機層を10%硫酸水素カリウム水溶液3 mL、5%炭酸カリウム水溶液3 mLで順次洗浄した。撹拌を停止し、有機層と水層を分層させた。有機層5 μLをとり、ノルマルプロピルアミン100 μL (1.2 mmol)に加えて、残存するC末端活性体をプロピルアミドへ変換させた後、メタノール0.9 mLで希釈して、LC/MS分析に付し、目的とするペプチドと残存C末端活性体（プロピルアミドへの変換体）のピーク面積値を求めた。残った有機層を濃縮し、ペプチドを得た。アミン非添加加水分解により得られた濃縮物（ペプチド）は561.6 mgであった (収率98%：濃縮物には不純物（残存C末端活性体）を含むが、ペプチドのみを含むものとして計算した)。アミン添加での加水分解により得られた濃縮物は501.1 mgであった (収率87%)。MS(ESI)：m/z 518.4 [M+H]+, 540.4 [M+Na]+。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
 1) LCMSのピーク面積比率
　アルカリ水単独処理での加水分解では、残存Ｃ末端活性体が完全に加水分解されず、続く水性洗浄でも残存Ｃ末端活性体を除去できなかったが、ＤＭＡＰを添加して加水分解を行うと、残存Ｃ末端活性体の加水分解が完全に達成されて、残存Ｃ末端活性体の除去も完全にできることを見出した。しかもこのとき、目的のジペプチドが１００％の純度で得られた（収率８７％）。
（実施例９）Cbz-Ile-MeVal-MeAsp(tBu)-piperidineの合成
（アミン非添加で加水分解処理して得られたジペプチドを使用したCbz脱保護反応）
　実施例7でのアミン非添加条件で合成したCbz-MeVal-MeAsp(tBu)-piperidine 782 mg (残存C末端活性体17.6面積%含む)をシクロペンチルメチルエーテル4.2 mLに溶解させた。5%Pd/C (50%wet) 115 mg と水素ガスにて加水素分解反応に付した。反応がほとんど進行しなかったため、フィルターを用いてPd/Cをろ去した後、濃縮乾固し、再度シクロペンチルメチルエーテル4.2 mLに溶解させて、5%Pd/C (50%wet) 105 mgを加え、再度、加水素分解反応に付した。しかし、合計3時間反応させても、反応は殆ど進行しなかった（反応変換率：1.6%）。反応変換率は、応液5 μLをとり、アセトニトリル1.0 mLで希釈した後、フィルターでろ過した溶液をLC/MS分析に付し、LC/MSのピーク面積値から求めた。
変換率(%)={MeVal-MeAsp(tBu)-piperidine(面積%)/[MeVal-MeAsp(tBu)-piperidine(面積%)+Cbz-MeVal-MeAsp(tBu)-piperidine(面積%)]}×100
（アミン添加で加水分解処理して得られたジペプチドを使用したCbz脱保護反応）
　実施例7でのアミン添加条件で合成したCbz-MeVal-MeAsp(tBu)-piperidine 543 mg (1.0 mmol)をシクロペンチルメチルエーテル4.3 mLに溶解させた。5%Pd/C (50%wet) 124 mg と水素ガスにて加水素分解反応に付した。室温で2時間撹拌し、脱Cbz体であるMeVal-MeAsp(tBu)-piperidineを得た (変換率100%)。反応変換率は、反応液5 μLをとり、アセトニトリル1.0 mLで希釈した後、フィルターでろ過した溶液をLC/MS分析に付し、LC/MSのピーク面積値から求めた。MS(ESI): m/z 384.3 [M+H]+。
変換率(%)={MeVal-MeAsp(tBu)-piperidine(面積%)/[MeVal-MeAsp(tBu)-piperidine(面積%)+Cbz-MeVal-MeAsp(tBu)-piperidine(面積%)]}×100
（縮合反応）
　反応液をフィルターでろ過し、Pd/Cをろ去した後、濃縮乾固した。2-メチルテトラヒドロフラン4.3 mLに乾固物を溶解させ、Cbz-Ile-OH 362 mg (1.3 mmol)、ジイソプロピルエチルアミン 715 μL (4.1 mmol)を加えた。次いで25 ℃で50%T3P/THF溶液 1.4 mL (2.4 mmol) を加え、40 ℃で7時間、さらに室温で14時間撹拌しペプチド結合形成反応を行った (変換率:100%)。調製した反応溶液にN-メチルイミダゾール 81 μL (1.0 mmol)、20%炭酸カリウム水溶液2.6 mLを加え、25 ℃で、撹拌子にて45分間撹拌を行った。撹拌を停止した後、静置し、有機層と水層を分層させ、水層を除去した。次いで有機層を10%硫酸水素カリウム水溶液5.2 mL、5%炭酸カリウム水溶液5.2 mLx2で順次洗浄した。得られた有機層5 μLをノルマルプロピルアミン100 μLに加えて、メタノール0.9 mLで希釈した。この溶液をLC/MS分析に付して、目的とするペプチドと残存C末端活性体のピーク面積パーセントを求めた。目的とするペプチドCbz-Ile-MeVal-MeAsp(tBu)-piperidineは95.1%であり、残存C末端活性体由来のCbz-Ile-NHPrは検出されなかった。残った有機層を濃縮し、濃縮物542.7 mgを得た(収率82%)。MS(ESI): m/z 631.5 [M+H]+、653.4 [M+Na]+。
　アルカリ水単独で処理した、Ｃ末端活性体が残存しているペプチド溶液を用いると、Ｃｂｚ脱保護反応がほとんど進行しないことが判明した。一方、ＤＭＡＰを添加して処理して得られた、残存Ｃ末端活性体が完全に除去されたペプチド溶液を用いれば、Ｃｂｚ脱保護反応がスムーズに進行し、続くペプチド合成反応が可能となることを見出した。すなわち、本発明の方法を用いることにより、生成したペプチド化合物のＮ末端の保護基の還元的除去反応を、停滞させずに進行させることができることが判った。これにより、所望のアミノ酸配列を有する高純度のペプチド化合物を効率的に製造することができた。
（実施例１０）Cbz-Phe(3-F)-Phe-OtBuの合成
　Phe-OtBu塩酸塩 200 mg (0.8 mmol)、Cbz-Phe(3-F)-OH 297 mg (0.9 mmol) をトルエン3.0 mL懸濁し、ジイソプロピルエチルアミン 407 μL (2.3 mmol)を加えた。次いで25 ℃で50%T3P/THF溶液 0.9 mL (1.6 mmol) を加え、室温下30分撹拌しペプチド結合形成反応を行った (変換率:100%)。反応変換率は、反応液5 μLをとり、ノルマルプロピルアミン100 μLに加えて、メタノール0.9 mLで希釈した溶液をLC/MS分析に付し、LC/MSのピーク面積値から求めた。
変換率(%)={Cbz-Phe(3-F)-Phe-OtBu(面積%)/[Phe-OtBu(面積%)+Cbz-Phe(3-F)-Phe-OtBu(面積%)]}×100
　上記の反応溶液にDMAP 95 mg (0.8 mmol)、5%炭酸カリウム水溶液2.0 mLを加え、25 ℃で、撹拌子にて5分間撹拌を行った。撹拌を停止した後、静置し、有機層と水層を分層させて、水層を除去した。次いで有機層を10%硫酸水素カリウム水溶液1 mL、5%炭酸カリウム水溶液1 mL、常水1 mLで順次洗浄した。得られた有機層5 μLをノルマルプロピルアミン100 μLに加え、メタノール0.9 mLで希釈した。この溶液をLC/MS分析に付して、目的とするペプチドと残存C末端活性体のピーク面積パーセントを求めた。目的とするペプチドCbz-Phe(3-F)-Phe-OtBuは純度100%であり、残存C末端活性体由来のCbz-Phe(3-F)-NHPrは検出されなかった。残った有機層を濃縮し、濃縮物387.2 mgを得た(収率96%)。MS(ESI)：m/z 465.2 [M-tBu+H]+, 521.1 [M+H]+, 543.2 [M+Na]+。
　ＤＭＡＰを添加して加水分解を行うと、残存Ｃ末端活性体の除去が完全に達成されて、目的のジペプチドを１００％の純度で得ることが出来た（収率９６％）。
（実施例１１）Cbz-Ser(OtBu)-Phe-OtBuの合成
　Phe-OtBu塩酸塩 300 mg (1.2 mmol)、Cbz-Ser(OtBu)-OH 450 mg (1.5 mmol) を2-メチルテトラヒドロフラン3.6 mL懸濁し、ジイソプロピルエチルアミン 610 μL (3.5 mmol)を加えた。次いで25 ℃で50%T3P/THF溶液 1.4 mL (2.3 mmol) を加え、室温下1時間撹拌しペプチド結合形成反応を行った (変換率:100%)。反応変換率は、反応液5 μLをとり、ノルマルプロピルアミン100 μLに加えて、メタノール0.9 mLで希釈した溶液をLC/MS分析に付し、LC/MSのピーク面積値から求めた。
変換率(%)={Cbz-Ser(tBu)-Phe-OtBu(面積%)/[Phe-OtBu(面積%)+Cbz-Ser(tBu)-Phe-OtBu(面積%)]}×100
　上記反応溶液にDMAP 143 mg (1.2 mmol)、20%炭酸カリウム水溶液1.5 mLを加え、25 ℃で、撹拌子にて5分間撹拌を行った。撹拌を停止した後、静置し、有機層と水層を分層させて、水層を除去した。次いで有機層を10%硫酸水素カリウム水溶液3.0 mLx2、5%炭酸カリウム水溶液3.0 mL、常水3.0 mLで順次洗浄した。得られた有機層5 μLをノルマルプロピルアミン100 μLに加え、メタノール0.9 mLで希釈した。この溶液をLC/MS分析に付して、目的とするペプチドと残存C末端活性体のピーク面積パーセントを求めた。目的とするペプチドCbz-Ser(OtBu)-Phe-OtBuは純度100%であり、残存C末端活性体由来のCbz-Ser(OtBu)-NHPrは検出されなかった。残った有機層を濃縮し、濃縮物556.4 mgを得た(収率96%)。MS(ESI)：m/z 387.1 [M-2tBu+H]+, 499.3 [M+H]+, 521.2 [M+Na]+。
　ＤＭＡＰを添加して加水分解を行うと、残存Ｃ末端活性体の除去が完全に達成されて、目的のジペプチドが１００％の純度で得ることが出来た（収率９６％）。
（実施例１２）Boc-MeVal-Phe-piperidineの合成
（Boc脱保護反応）
　Boc-Phe-piperidine 471 mg (1.4 mmol)をジクロロメタン4.7 mL溶解し、メタンスルホン酸180 μL (2.8 mmol)を加えた。35 ℃で2時間撹拌し、脱Boc反応を行った (変換率100%)。反応変換率は、反応液5 μLをとり、アセトニトリル1.0 mLで希釈した溶液をLC/MS分析に付し、LC/MSのピーク面積値から求めた。
変換率 (%)={Phe-piperidine(面積%)/[Boc-Phe-piperidine(面積%)+Phe-piperidine(面積%)]}×100
（縮合反応）
　上記反応溶液に、ジイソプロピルエチルアミン 742 μL (4.3 mmol)を加えた後、溶媒を留去した。次いでアセトニトリル1.4 mL、2-メチルテトラヒドロフラン3.3 mL、ジイソプロピルエチルアミン742 μL (4.3 mmol)、Boc-MeVal-OH 492 mg (2.1 mmol)を加えた。25 ℃でHATU 804 mg (2.2 mmol) を加えて、室温で1時間撹拌しペプチド結合形成反応を行った (変換率:100%)。反応変換率は、反応液5 μLをとり、ノルマルプロピルアミン100 μLに加えて、メタノール0.9 mLで希釈した溶液をLC/MS分析に付し、LC/MSのピーク面積値から求めた。
変換率(%)={Boc-MeVal-Phe-piperidine(面積%)/[Phe-piperidine(面積%)+Boc-MeVal-Phe-piperidine (面積%)]}×100
　上記調製した反応溶液にDMAP 168mg (1.4 mmol)、5%炭酸カリウム水溶液4.6 mLを加え、25 ℃で、撹拌子にて5分間撹拌を行った。撹拌を停止した後、静置し、有機層と水層を分層させて、水層を除去した。次いで有機層を10%硫酸水素カリウム水溶液4.6 mL、5%炭酸カリウム水溶液4.6 mL、常水1.5mL x 6で順次洗浄した。得られた有機層5 μLをノルマルプロピルアミン100 μLに加え、メタノール0.9 mLで希釈した。この溶液をLC/MS分析に付して、目的とするペプチドと残存C末端活性体のピーク面積パーセントを求めた。目的とするペプチドBoc-MeVal-Phe-OtBuは純度99.7%であり、残存C末端活性体由来のBoc-MeVal-NHPrは検出されなかった。残った有機層を濃縮し、濃縮物542.3mgを得た(収率86%)。MS(ESI)：m/z 346.2 [M-Boc+H]+, 446.3 [M+H]+, 468.3 [M+Na]+。
　ＤＭＡＰを添加して加水分解を行うと、残存Ｃ末端活性体の除去が完全に達成されて、Ｎ末端の保護基がＢｏｃでも、目的のジペプチドを９９．７％の純度で得ることが出来た（収率８６％）。
（実施例１３）Cbz-Ile-MeAla-Aze-MePhe-MeGly-OtBu/配列番号：1（5 mer）の合成例
（Cbz-MePhe-MeGly-OtBuの合成）
（縮合反応）
　MeGly-OtBu塩酸塩 2.0 g (11.0 mmol) を酢酸イソプロピル16 mL、アセトニトリル 4 mLに縣濁させて、ジイソプロピルジエチルアミン7.7 mL (44.0 mmol)、Cbz-MePhe-OH 3.6 g (11.5 mmol)を加えた。反応液を0℃に冷却し、T3P/酢酸エチル溶液 9.7 mL (16.5 mmol)を加えた後、室温で30分間撹拌し、ペプチド結合形成反応を行った (変換率：100%)。反応変換率は反応液3μLをとり、メタノール1.0 mLで希釈した後、LC/MS分析に付し、LC/MSのピーク面積値から求めた。
変換率(%)={目的化合物(面積%)/[原料(面積%)+目的化合物(面積%)]}×100
　次いで、NMI 1.7 mL (22.0 mmol)、5%炭酸ナトリウム水溶液 20 mLを加えて、50℃で5分間撹拌した。撹拌を停止し、有機層と水層を分層させた。水層を除去し、残った有機層を5%硫酸カリウム水溶液、5%炭酸カリウム水溶液×2で洗浄した後、得られた有機層を濃縮し、濃縮物5.0 gを得た（収率quant.）。本濃縮物をLC/MS分析に付し、目的とするCbz-MePhe-MeGly-OtBuのピーク面積パーセントを求めた（100面積%）。MS(ESI)：m/z 441.2 [M+H]+, 463.2 [M+Na]+。
（Cbz-Aze-MePhe-MeGly-OtBuの合成）
（Cbz脱保護反応）
　上記方法で得たCbz-MePhe-MeGly-OtBu全量を酢酸イソプロピル75 mLに溶解し、10％Pd/C (3% wet) 0.98 gと水素ガスにて加水素分解反応に付した。室温で2時間撹拌し、脱Cbz化体を得た（変換率：100%）。反応変換率は反応液3μLをとり、メタノール1.0 mLで希釈した溶液をLC/MS分析に付し、LC/MSのピーク面積値から求めた。
変換率(%)={目的化合物(面積%)/[原料(面積%)+目的化合物(面積%)]}×100
（縮合反応）
　反応液をフィルターでろ過し、トルエンを加えて共沸脱水を行った。濃縮物に酢酸イソプロピル39 mL、アセトニトリル 9.7 mLに溶解させて、0℃に冷却した。Cbz-Aze-OH 2.6 g (11.0 mmol)、50%T3P/酢酸エチル溶液 13.0 mL (22.0 mmol)、ジイソプロピルエチルアミン7.7 mL (44.0 mmol) を加えた後、室温で30分間撹拌し、ペプチド結合形成反応を行った (変換率：>99%)。反応変換率は反応液3μLをとり、メタノール1.0 mLで希釈した後、LC/MS分析に付し、LC/MSのピーク面積値から求めた。
変換率(%)={目的化合物(面積%)/[原料(面積%)+目的化合物(面積%)]}×100
　次いで、NMI 1.7 mL (22.0 mmol)、5%炭酸ナトリウム水溶液 34 mLを加えて、50℃で5分間撹拌した。撹拌を停止し、有機層と水層を分層させた。水層を除去し、残った有機層を5%硫酸カリウム水溶液 34 mL、5%炭酸カリウム水溶液 34 mLで洗浄した後、得られた有機層を濃縮し、濃縮物5.5 gを得た（収率96%）。本濃縮物をLC/MS分析に付し、目的とするCbz-Aze-MePhe-MeGly-OtBuのピーク面積パーセントを求めた（99.8面積%）。MS(ESI)：m/z 546.2 [M+Na]+。
（Cbz-MeAla-Aze-MePhe-MeGly-OtBu/配列番号：2の合成）
（Cbz脱保護反応）
　上記方法で得たCbz-Aze-MePhe-MeGly-OtBu 5.5 g (10.6 mmol) を酢酸イソプロピル75 mLに溶解し、10％Pd/C (3% wet) 0.95 gと水素ガスにて加水素分解反応に付した。50℃で2時間撹拌し、脱Cbz化体を得た（変換率：100%）。反応変換率は反応液3μLをとり、メタノール1.0 mLで希釈した溶液をLC/MS分析に付し、LC/MSのピーク面積値から求めた。
変換率(%)={目的化合物(面積%)/[原料(面積%)+目的化合物(面積%)]}×100
（縮合反応）
　反応液をフィルターでろ過し、トルエンを加えて2回共沸脱水を行った。濃縮物に酢酸イソプロピル32.8 mL、アセトニトリル 8.2 mLに溶解させた。Cbz-MeAla-OH 2.7 g (11.1 mmol)、ジイソプロピルエチルアミン7.4 mL (42.3 mmol) を加えた後、50%T3P/酢酸エチル溶液12.5 mL (21.1 mmol)、ジイソプロピルエチルアミン7.4 mL (42.3 mmol) を加えた。室温で2時間撹拌した後、Cbz-MeAla-OH 0.39 g (1.7 mmol)、T3P/酢酸エチル溶液 1.9 mL (3.2 mmol)、ジイソプロピルエチルアミン1.1 mL (6.3 mmol) を追加し、さらに室温で2時間撹拌し、ペプチド結合形成反応を行った (変換率：97%)。反応変換率は反応液3μLをとり、メタノール1.0 mLで希釈した後、LC/MS分析に付し、LC/MSのピーク面積値から求めた。
変換率(%)={目的化合物(面積%)/[原料(面積%)+目的化合物(面積%)]}×100
　次いで、NMI 1.7 mL (21.1 mmol)、5%炭酸ナトリウム水溶液 41 mLを加えて、50℃で5分間撹拌した。撹拌を停止し、有機層と水層を分層させた。水層を除去し、残った有機層を5%硫酸カリウム水溶液 41 mL、5%炭酸カリウム水溶液 41 mLで洗浄した後、得られた有機層を濃縮し、濃縮物5.8 gを得た（収率91%）本濃縮物をLC/MS分析に付し、目的とするCbz-MeAla-Aze-MePhe-MeGly-OtBu(配列番号：2)のピーク面積パーセントを求めた（99.5面積%）。MS(ESI)：m/z 609.3 [M+H]+ 631.3 [M+Na]+。
（Cbz-Ile-MeAla-Aze-MePhe-MeGly-OtBu/配列番号：1の合成）
（Cbz脱保護反応）
　上記方法で得たCbz-MeAla-Aze-MePhe-MeGly-OtBu(配列番号：2) 5.8 g (9.6 mmol) を酢酸イソプロピル88 mLに溶解し、10％Pd/C (3% wet) 0.93 gと水素ガスにて加水素分解反応に付した。室温で5時間撹拌した後、反応液をフィルターでろ過した（変換率：100%）。反応変換率は反応液3μLをとり、メタノール1.0 mLで希釈した溶液をLC/MS分析に付し、LC/MSのピーク面積値から求めた。
変換率(%)={目的化合物(面積%)/[原料(面積%)+目的化合物(面積%)]}×100
　ろ液を濃縮し、濃縮物4.4 gを得た（収率97%）。本濃縮物をLC/MS分析に付し、目的とするMeAla-Aze-MePhe-MeGly-OtBu(配列番号：3)のピーク面積パーセントを求めた（99.7面積%）。MS(ESI)：m/z 475.3 [M+H]+。
（縮合反応）
　上記濃縮物 1.5 g (3.2 mmol)とCbz-Ile-OH 1.3 g (4.7 mmol)を酢酸イソプロピル18 mL、アセトニトリル 4.5 mLに溶解させた。ジイソプロピルエチルアミン2.2 mL (12.6 mmol)、HATU 2.4 g (6.3 mmol)を加えて、室温で30分間撹拌し、ペプチド結合形成反応を行った (変換率：>99%)。反応変換率は反応液3μLをとり、メタノール1.0 mLで希釈した後、LC/MS分析に付し、LC/MSのピーク面積値から求めた。
変換率(%)={目的化合物(面積%)/[原料(面積%)+目的化合物(面積%)]}×100
　次いで、NMI 0.75 mL (9.5 mmol)、5%炭酸ナトリウム水溶液 22.5 mLを加えて、50℃で20分間撹拌した。撹拌を停止し、有機層と水層を分層させた。水層を除去し、残った有機層を5%硫酸カリウム水溶液 22.5 mL×2、5%炭酸カリウム水溶液 22.5 mL×3で洗浄した後、得られた有機層を濃縮し、濃縮物2.4 gを得た（収率quant.）。本濃縮物をLC/MS分析に付し、目的とするCbz-Ile-MeAla-Aze-MePhe-MeGly-OtBu(配列番号：1)のピーク面積パーセントを求めた（99.1面積%）。MS(ESI)：m/z 744.3 [M+Na]+。
　ＮＭＩを添加して加水分解を１回行い、続いて水性洗浄することにより、残存Ｃ末端活性体の完全な除去が達成されて、目的のペンタペプチドが９９．１％の純度で得られた。その収率は、初めのアミノ酸からの通算で８７％であった。本結果は、連続的な液相ペプチド合成において、アミン添加剤を用いて残存Ｃ末端活性体を完全に除去することで、高純度のペンタペプチド合成を高収率で達成したことを示すものである。
（実施例１４）
Cbz-MeAla-MePhe-Leu-MeLeu-Val-MeGly-MeIle-Ser(tBu)-MePhe-MeVal-Asp(tBu)-piperidine/配列番号：4 (11 mer)の合成
（Cbz-MeVal-Asp(tBu)-piperidineの合成）
（縮合反応）
　Asp(tBu)-piperidine 8.6 g (33.5 mmol) をシクロペンチルメチルエーテル 108 mLに溶解させた。Cbz-MeVal-OH 9.79 g (36.9 mmol)、ジイソプロピルエチルアミン17.6 mL (101 mmol)を加えた。BEP 13.8 g (50.3 mmol)をアセトニトリル 21.5 mLに溶解した後、反応液に加えて、室温で3分間撹拌し、ペプチド結合形成反応を行った (変換率：>99%)。反応変換率は反応液5μLをとり、メタノール1.0 mLで希釈した後、LC/MS分析に付し、LC/MSのピーク面積値から求めた。
変換率(%)={目的化合物(面積%)/[原料(面積%)+目的化合物(面積%)]}×100
　反応液を10%硫酸水素カリウム水溶液 150 mLで洗浄した後、5%炭酸カリウム水溶液 150 mLとトリメチルアミン塩酸塩 9.52 g (101 mmol)を加えて、40℃で90分間撹拌した。撹拌を停止し、有機層と水層を分層させた。水層を除去し、残った有機層を5%炭酸カリウム水溶液 150 mLで洗浄した後、得られた有機層を濃縮し、濃縮物17 gを得た（収率：quant.）。本濃縮物をLC/MS分析に付し、目的とするCbz-MeVal-Asp(tBu)-piperidineのピーク面積パーセントを求めた（99.7面積%）。
（Cbz-MePhe-MeVal-Asp(tBu)-piperidineの合成）
（Cbz脱保護反応）
　上記方法にて得たCbz-MeVal-Asp(tBu)-piperidine 9.5 g (9.6 mmol) をシクロペンチルメチルエーテル50 mLに溶解し、10％Pd/C (3% wet) 1.9 gと水素ガスにて加水素分解反応に付し、35℃で2時間撹拌した (変換率：100%)。反応変換率は反応液5μLをとり、メタノール1.0 mLで希釈した後、LC/MS分析に付し、LC/MSのピーク面積値から求めた。
変換率(%)={目的化合物(面積%)/[原料(面積%)+目的化合物(面積%)]}×100
　同様の操作を再度行い、合わせた反応液をフィルターでろ過した。ろ液を濃縮し、濃縮物14.0 gを得た（収率：quant.）。本濃縮物をLC/MS分析に付し、目的とするMeVal-Asp(tBu)-piperidineのピーク面積パーセントを求めた（99.5面積%）。
（縮合反応）
　上記濃縮物をクロペンチルメチルエーテル 126 mL、アセトニトリル14 mLに溶解させた。Cbz-MePhe-OH 13.0 g (41.7 mmol)、ジイソプロピルエチルアミン52.9 mL (303 mmol)を加えた。50%T3P/酢酸エチル溶液 67.0 mL (114 mmol)を加えて、室温で1時間撹拌し、ペプチド結合形成反応を行った(変換率：>99%)。反応変換率は反応液5μLをとり、メタノール1.0 mLで希釈した後、LC/MS分析に付し、LC/MSのピーク面積値から求めた。
変換率(%)={目的化合物(面積%)/[原料(面積%)+目的化合物(面積%)]}×100
　反応液を5%硫酸水素カリウム水溶液 140 mLで洗浄した後、5%炭酸カリウム水溶液 140 mLとトリメチルアミン塩酸塩 10.9 g (114 mmol)を加えて、室温で30分間撹拌した。撹拌を停止し、有機層と水層を分層させた。水層を除去し、残った有機層を5%炭酸カリウム水溶液 140 mLで洗浄した後、得られた有機層を濃縮し、濃縮物24.1 gを得た（収率96%）。本濃縮物をLC/MS分析に付し、目的とするCbz-MePhe-MeVal-Asp(tBu)-piperidineのピーク面積パーセントを求めた（99.6面積%）。
（Cbz-Ser(tBu)-MePhe-MeVal-Asp(tBu)-piperidine/配列番号：5の合成）
（Cbz脱保護反応）
　上記方法で得たCbz-MePhe-MeVal-Asp(tBu)-piperidine 11.5 g (9.6 mmol) をシクロペンチルメチルエーテル58 mLに溶解し、10％Pd/C 2.3 gと水素ガスにて加水素分解反応に付し、35℃で2時間撹拌した(変換率：100%)。反応変換率は反応液5μLをとり、メタノール1.0 mLで希釈した後、LC/MS分析に付し、LC/MSのピーク面積値から求めた。
変換率(%)={目的化合物(面積%)/[原料(面積%)+目的化合物(面積%)]}×100
　同様の操作を再度行い、合わせた反応液をフィルターでろ過した。ろ液を濃縮し、濃縮物18.1 gを得た（収率99%）。
（縮合反応）
　上記濃縮物17.3 g (32.6 mmol)をクロペンチルメチルエーテル 153 mL、アセトニトリル17mLに溶解させた。Cbz-Ser(tBu)-OH 10.6 g (35.9 mmol)、ジイソプロピルエチルアミン45.5 mL (261 mmol)を加えた。50%T3P/酢酸エチル溶液 57.6 mL (98.0 mmol)を加えて、室温で15分間撹拌し、ペプチド結合形成反応を行った (変換率：>99%)。反応変換率は反応液5μLをとり、メタノール1.0 mLで希釈した後、LC/MS分析に付し、LC/MSのピーク面積値から求めた。
変換率(%)={目的化合物(面積%)/[原料(面積%)+目的化合物(面積%)]}×100
　反応液を5%硫酸水素カリウム水溶液 170 mLで洗浄した後、5%炭酸カリウム水溶液 170 mLとトリメチルアミン塩酸塩 9.4 g (98.0 mmol)を加えて、室温で2時間撹拌した。撹拌を停止し、有機層と水層を分層させた。水層を除去し、残った有機層を5%炭酸カリウム水溶液 170 mLで洗浄した後、得られた有機層を濃縮し、濃縮物26.5 gを得た（収率：quant.）。本濃縮物をLC/MS分析に付し、目的とするCbz-Ser(tBu)-MePhe-MeVal-Asp(tBu)-piperidine(配列番号：5)のピーク面積パーセントを求めた（98.9面積%）。MS (ESI) : 830.4 [M+Na]+。
（Cbz-MeIle-Ser(tBu)-MePhe-MeVal-Asp(tBu)-piperidine/配列番号：6の合成）
（Cbz脱保護反応）
　Cbz-Ser(tBu)-MePhe-MeVal-Asp(tBu)-piperidine(配列番号：5) 12.0 g (14.9 mmol) をシクロペンチルメチルエーテル60 mLに溶解し、10％Pd/C 2.4 gと水素ガスにて加水素分解反応に付し、35℃で2時間撹拌した (変換率：>98%)。反応変換率は反応液5μLをとり、メタノール1.0 mLで希釈した後、LC/MS分析に付し、LC/MSのピーク面積値から求めた。
変換率(%)={目的化合物(面積%)/[原料(面積%)+目的化合物(面積%)]}×100
　同様の操作を再度行い、合わせた反応液をフィルターでろ過した。ろ液を濃縮し、濃縮物19.5 gを得た（収率97%）。
（縮合反応）
　上記濃縮物16.0 g (23.7 mmol) をシクロペンチルメチルエーテル 200 mLに溶解させた。Cbz-MeIle-OH 7.3 g (26.1 mmol)、ジイソプロピルエチルアミン12.4 mL (71.2 mmol)を加えた。BEP 9.8 g (35.6 mmol)をアセトニトリル 40 mLに溶解した後、反応液に加えて、室温で5分間撹拌し、ペプチド結合形成反応を行った (変換率：>99%)。反応変換率は反応液5μLをとり、メタノール1.0 mLで希釈した後、LC/MS分析に付し、LC/MSのピーク面積値から求めた。
変換率(%) = {目的化合物 (面積%)/[原料 (面積%)+目的化合物 (面積%)]}×100
　反応液を10%硫酸水素ナトリウム水溶液 240 mLで洗浄した後、5%炭酸カリウム水溶液 240 mLとトリメチルアミン塩酸塩 6.7 g (71.2 mmol)を加えて、40℃で1.5時間撹拌した。撹拌を停止し、有機層と水層を分層させた。水層を除去し、残った有機層を5%炭酸カリウム水溶液 240 mLで洗浄した後、得られた有機層を濃縮し、濃縮物22.2 gを得た（収率：quant.）。本濃縮物をLC/MS分析に付し、目的とするCbz-MeIle-Ser(tBu)-MePhe-MeVal-Asp(tBu)-piperidine(配列番号：6)のピーク面積パーセントを求めた（99.4面積%）。
（Cbz-MeGly-MeIle-Ser(tBu)-MePhe-MeVal-Asp(tBu)-piperidine/配列番号：7の合成）
（Cbz脱保護反応）
　Cbz-MeIle-Ser(tBu)-MePhe-MeVal-Asp(tBu)-piperidine(配列番号：6) 9.5 g (10.2 mmol) をシクロペンチルメチルエーテル48 mLに溶解し、10％Pd/C 1.9 gと水素ガスにて加水素分解反応に付し、35℃で2時間撹拌した。同様の操作を再度行い、合わせた反応液をフィルターでろ過した。ろ液を濃縮し、濃縮物15.6 gを得た（収率96%）。
（縮合反応）
　上記濃縮物15.3 g (19.1 mmol) をシクロペンチルメチルエーテル 138 mL、アセトニトリル15 mLに溶解させた。Cbz-MeGly-OH 4.7 g (21.0 mmol)、ジイソプロピルエチルアミン26.7 mL (153 mmol)を加えた。50%T3P/酢酸エチル溶液 33.8 mL (57.3 mmol)を加えて、室温で15分間撹拌し、ペプチド結合形成反応を行った (変換率：>99%)。反応変換率は反応液5μLをとり、メタノール1.0 mLで希釈した後、LC/MS分析に付し、LC/MSのピーク面積値から求めた。
変換率(%)={目的化合物(面積%)/[原料(面積%)+目的化合物(面積%)]}×100
　反応液を5%硫酸水素カリウム水溶液 153 mLで洗浄した後、5%炭酸カリウム水溶液 153 mLを加えて、室温で5分間撹拌した。撹拌を停止し、有機層と水層を分層させて、水層を除去した後、5%炭酸カリウム水溶液 153 mLを加えて、室温で1時間撹拌した。水層を除去した後、得られた有機層を濃縮し、濃縮物19.5 gを得た（収率：quant.）。本濃縮物をLC/MS分析に付し、目的とするCbz-MeGly-MeIle-Ser(tBu)-MePhe-MeVal-Asp(tBu)-piperidine(配列番号：7)のピーク面積パーセントを求めた（99.6面積%）。
（Cbz-Val-MeGly-MeIle-Ser(tBu)-MePhe-MeVal-Asp(tBu)-piperidine/配列番号：8の合成）
（Cbz脱保護反応）
　Cbz-MeGly-MeIle-Ser(tBu)-MePhe-MeVal-Asp(tBu)-piperidine(配列番号：7) 9.5 g (10.2 mmol) をシクロペンチルメチルエーテル48 mLに溶解し、10％Pd/C 1.9 gと水素ガスにて加水素分解反応に付し、35℃で3時間撹拌した (変換率：100%)。反応変換率は反応液5μLをとり、メタノール1.0 mLで希釈した後、LC/MS分析に付し、LC/MSのピーク面積値から求めた。
変換率(%)={目的化合物(面積%)/[原料(面積%)+目的化合物(面積%)]}×100
　同様の操作を再度行い、合わせた反応液をフィルターでろ過した。ろ液を濃縮し、濃縮物16.3 gを得た（収率99%）。
（縮合反応）
　上記濃縮物16.0 g (18.4 mmol) をシクロペンチルメチルエーテル 144 mL、アセトニトリル16 mLに溶解させた。Cbz-Val-OH 5.1 g (20.2 mmol)、ジイソプロピルエチルアミン25.6 mL (147 mmol)を加えた。50%T3P/酢酸エチル溶液 32.4 mL (55.0 mmol)を加えて、室温で30分間撹拌し、ペプチド結合形成反応を行った(変換率：>99%)。反応変換率は反応液5μLをとり、メタノール1.0 mLで希釈した後、LC/MS分析に付し、LC/MSのピーク面積値から求めた。
変換率(%)={目的化合物(面積%)/[原料(面積%)+目的化合物(面積%)]}×100
　反応液を5%硫酸水素カリウム水溶液 160 mLで洗浄した後、5%炭酸カリウム水溶液 153 mL、トリメチルアミン塩酸塩 5.3 g (55.0 mmol) を加えて、60℃で1時間撹拌した。撹拌を停止し、有機層と水層を分層させて、水層を除去した後、得られた有機層を5%炭酸カリウム水溶液 160 mL洗浄、濃縮し、濃縮物20.0 gを得た（収率99%）。本濃縮物をLC/MS分析に付し、目的とするCbz-Val-MeGly-MeIle-Ser(tBu)-MePhe-MeVal-Asp(tBu)-piperidine(配列番号：8)のピーク面積パーセントを求めた（99.6面積%）。
（Cbz-MeLeu-Val-MeGly-MeIle-Ser(tBu)-MePhe-MeVal-Asp(tBu)-piperidine/配列番号：9の合成）
（Cbz脱保護反応）
　Cbz-Val-MeGly-MeIle-Ser(tBu)-MePhe-MeVal-Asp(tBu)-piperidine(配列番号：8) 9.2 g (8.3 mmol) をシクロペンチルメチルエーテル46 mLに溶解し、10％Pd/C 1.8 gと水素ガスにて加水素分解反応に付し、35℃で6時間、さらに45℃で4時間撹拌した (変換率：100%)。反応変換率は反応液5μLをとり、メタノール1.0 mLで希釈した後、LC/MS分析に付し、LC/MSのピーク面積値から求めた。
変換率(%)={目的化合物(面積%)/[原料(面積%)+目的化合物(面積%)]}×100
　同様の操作を再度行い、合わせた反応液をフィルターでろ過した。ろ液を濃縮し、濃縮物15.9 gを得た（収率98%）。本濃縮物をLC/MS分析に付し、目的とするVal-MeGly-MeIle-Ser(tBu)-MePhe-MeVal-Asp(tBu)-piperidine(配列番号：10)のピーク面積パーセントを求めた（97.9面積%）。
（縮合反応）
　上記濃縮物14.5 g (14.9 mmol) をシクロペンチルメチルエーテル 181 mLに溶解させた。Cbz-MeLeu-OH 4.6 g (16.4 mmol)、ジイソプロピルエチルアミン7.8 mL (44.8 mmol)を加えた。BEP 4.9 g (17.9 mmol)をアセトニトリル36 mLに溶解させた後、得られたBEP溶液を反応液に加えて、40℃で1分間撹拌し、ペプチド結合形成反応を行った(変換率：>99%)。反応変換率は反応液5μLをとり、メタノール1.0 mLで希釈した後、LC/MS分析に付し、LC/MSのピーク面積値から求めた。
変換率(%)={目的化合物(面積%)/[原料(面積%)+目的化合物(面積%)]}×100
　反応液を10%硫酸水素ナトリウム水溶液 128 mLで洗浄した後、5%炭酸カリウム水溶液 128 mL、トリメチルアミン塩酸塩 4.2 g (44.8 mmol) を加えて、40℃で30分間撹拌した。撹拌を停止し、有機層と水層を分層させて、水層を除去した後、得られた有機層を5%炭酸カリウム水溶液 128 mL洗浄、濃縮し、濃縮物18.0 gを得た（収率98%）。本濃縮物をLC/MS分析に付し、目的とするCbz-MeLeu-Val-MeGly-MeIle-Ser(tBu)-MePhe-MeVal-Asp(tBu)-piperidine(配列番号：9)のピーク面積パーセントを求めた（96.0面積%）。
（Cbz-Leu-MeLeu-Val-MeGly-MeIle-Ser(tBu)-MePhe-MeVal-Asp(tBu)-piperidine/配列番号：11の合成）
（Cbz脱保護反応）
　Cbz-MeLeu-Val-MeGly-MeIle-Ser(tBu)-MePhe-MeVal-Asp(tBu)-piperidine(配列番号：9) 8.0 g (6.5 mmol) をシクロペンチルメチルエーテル40 mLに溶解し、10％Pd/C 1.6 gと水素ガスにて加水素分解反応に付し、45℃で4時間撹拌した (変換率：100%)。反応変換率は反応液5μLをとり、メタノール1.0 mLで希釈した後、LC/MS分析に付し、LC/MSのピーク面積値から求めた。
変換率(%)={目的化合物(面積%)/[原料(面積%)+目的化合物(面積%)]}×100
　同様の操作を再度行い、合わせた反応液をフィルターでろ過した。ろ液を濃縮し、濃縮物14.3 gを得た（収率quant.）。本濃縮物をLC/MS分析に付し、目的とするMeLeu-Val-MeGly-MeIle-Ser(tBu)-MePhe-MeVal-Asp(tBu)-piperidine(配列番号：12)のピーク面積パーセントを求めた（95.8面積%）。MS (ESI) : m/z 1098.6 [M+H]+。 
（縮合反応）
　上記濃縮物13.0 g (11.8 mmol) をシクロペンチルメチルエーテル 117 mL、アセトニトリル13 mLに溶解させた。Cbz-Leu-OH 3.5 g (13.0 mmol)、ジイソプロピルエチルアミン16.5 mL (95.0 mmol)を加えた。50%T3P/酢酸エチル溶液 20.9 mL (35.5 mmol)を反応液に加えて、室温で30分間撹拌し、ペプチド結合形成反応を行った (変換率：>99%)。反応変換率は反応液5μLをとり、メタノール1.0 mLで希釈した後、LC/MS分析に付し、LC/MSのピーク面積値から求めた。
変換率(%)={目的化合物(面積%)/[原料(面積%)+目的化合物(面積%)]}×100
　反応液を5%硫酸水素カリウム水溶液 130 mLで洗浄した後、5%炭酸カリウム水溶液 130 mL、トリメチルアミン塩酸塩 3.4 g (35.5 mmol) を加えて、60℃で45分間撹拌した。撹拌を停止し、有機層と水層を分層させて、水層を除去した後、得られた有機層を5%炭酸カリウム水溶液 130 mL洗浄、濃縮し、濃縮物15.6 gを得た（収率98%）。本濃縮物をLC/MS分析に付し、目的とするCbz-Leu-MeLeu-Val-MeGly-MeIle-Ser(tBu)-MePhe-MeVal-Asp(tBu)-piperidine(配列番号：11)のピーク面積パーセントを求めた（97.2面積%）。
（Cbz-MePhe-Leu-MeLeu-Val-MeGly-MeIle-Ser(tBu)-MePhe-MeVal-Asp(tBu)-piperidine/配列番号：12の合成）
（Cbz脱保護反応）
　Cbz-Leu-MeLeu-Val-MeGly-MeIle-Ser(tBu)-MePhe-MeVal-Asp(tBu)-piperidine(配列番号：11) 10.0 g (7.4 mmol) をシクロペンチルメチルエーテル50 mLに溶解し、10％Pd/C 2.0 gと水素ガスにて加水素分解反応に付し、45℃で4時間撹拌した (変換率：100%)。反応液をフィルターでろ過した後、ろ液を濃縮し、濃縮物8.9 gを得た（収率99%）。反応変換率は反応液5μLをとり、メタノール1.0 mLで希釈した後、LC/MS分析に付し、LC/MSのピーク面積値から求めた。MS (ESI) : m/z 1211.7 [M+H]+、1233.7 [M+Na]+。
変換率(%)={目的化合物(面積%)/[原料(面積%)+目的化合物(面積%)]}×100
（縮合反応）
　上記濃縮物7.0 g (5.8 mmol) をシクロペンチルメチルエーテル 87.5 mLに溶解させた。Cbz-MePhe-OH 2.0 g (6.4 mmol)、ジイソプロピルエチルアミン3.0 mL (17.3 mmol)を加えた。BEP 1.9 g (17.9 mmol)をアセトニトリル17.5 mLに溶解させた後、得られたBEP溶液を反応液に加えて、室温で3分間撹拌し、ペプチド結合形成反応を行った (変換率：>99%)。反応変換率は反応液5μLをとり、メタノール1.0 mLで希釈した後、LC/MS分析に付し、LC/MSのピーク面積値から求めた。
変換率(%) = {目的化合物 (面積%)/[原料 (面積%)+目的化合物 (面積%)]}×100
　反応液を10%硫酸水素ナトリウム水溶液 105 mLで洗浄した後、5%炭酸カリウム水溶液 105 mL、トリメチルアミン塩酸塩 1.7 g (17.3 mmol) を加えて、40℃で30分間撹拌した。撹拌を停止し、有機層と水層を分層させて、水層を除去した後、得られた有機層を5%炭酸カリウム水溶液 105 mL洗浄、濃縮し、濃縮物8.6 gを得た（収率99%）。本濃縮物をLC/MS分析に付し、目的とするCbz-MePhe-Leu-MeLeu-Val-MeGly-MeIle-Ser(tBu)-MePhe-MeVal-Asp(tBu)-piperidine(配列番号：12)のピーク面積パーセントを求めた（97.0面積%）。
（Cbz-MeAla-MePhe-Leu-MeLeu-Val-MeGly-MeIle-Ser(tBu)-MePhe-MeVal-Asp(tBu)-piperidine/配列番号：4の合成）
（Cbz脱保護反応）
Cbz-MePhe-Leu-MeLeu-Val-MeGly-MeIe-Ser(tBu)-MePhe-MeVal-Asp(tBu)-piperidine(配列番号：12) 7.6 g (5.0 mmol) をシクロペンチルメチルエーテル38 mLに溶解し、10％Pd/C 2.0 gと水素ガスにて加水素分解反応に付し、45℃で4時間撹拌した (変換率：100%)。反応液をフィルターでろ過した後、ろ液を濃縮し、濃縮物6.8 gを得た（収率98%）。反応変換率は反応液5μLをとり、メタノール1.0 mLで希釈した後、LC/MS分析に付し、LC/MSのピーク面積値から求めた。
変換率(%)={目的化合物(面積%)/[原料(面積%)+目的化合物(面積%)]}×100
（縮合反応）
　上記濃縮物500 mg (0.4 mmol) をシクロペンチルメチルエーテル 4.5 mL、アセトニトリル0.5 mLに溶解させた。Cbz-MeAla-OH 95.0 mg (0.4 mmol)、ジイソプロピルエチルアミン509 μL (2.9 mmol)を加えた。50%T3P/酢酸エチル溶液 644 μL (1.1 mmol) を加えて、室温で2時間撹拌し、ペプチド結合形成反応を行った (変換率：>99%)。反応変換率は反応液5μLをとり、メタノール1.0 mLで希釈した後、LC/MS分析に付し、LC/MSのピーク面積値から求めた。
変換率(%)={目的化合物(面積%)/[原料(面積%)+目的化合物(面積%)]}×100
　反応液を10%硫酸水素ナトリウム水溶液 5.0 mLで洗浄した後、5%炭酸カリウム水溶液 5.0 mL、トリメチルアミン塩酸塩 104 mg (1.1 mmol) を加えて、室温で1時間撹拌した。撹拌を停止し、有機層と水層を分層させて、水層を除去した後、得られた有機層を5%炭酸カリウム水溶液 5.0 mL洗浄、濃縮し、濃縮物555 mgを得た（収率96%、Cbz-MeAla-MePhe-Leu-MeLeu-Val-MeGly-MeIle-Ser(tBu)-MePhe-MeVal-Asp(tBu)-piperidine(配列番号：4)は95.3面積%）。MS(ESI)：m/z 1591.9 [M+H]+, 1613.9 [M+Na]+。
　トリメチルアミンを添加して加水分解を１回行い、続いて水性洗浄することにより、残存Ｃ末端活性体の完全な除去が達成されて、１１個のアミノ酸からなるペプチドを高純度９５．３％で得ることができた。その収率は、初めのアミノ酸からの通算で７５．３％であった。本結果は、連続的な液相ペプチド合成において、アミン添加剤を用いて残存Ｃ末端活性体を除去することで、高純度のポリペプチド合成を達成できることを示すものである。
（実施例１５）Teoc-MeLeu-Phe-OtBuの合成
（Teoc-MeLeu-Opfpの合成）
　MeLeu-OH 2.35 g (16.2 mmol) を1,4-ジオキサン23.5 mLに溶解させて、Teoc-OSu 4.61 g (17.8 mmol)、水23.5 mL、トリエチルアミン 4.5 mL (32.4 mmol)を加えた。室温で1時間撹拌し、Teoc化反応を行った。5%硫酸水素カリウム水溶液を加えて、反応溶液を酸性にした後、酢酸エチル50 mLで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄した。得られた有機層を濃縮乾固し、濃縮物をジクロロメタン30 mLに溶解させた。Pfp-OH 3.10 g (16.2 mmol)、EDC塩酸塩 4.53 g (24.3 mmol)を加えて、室温で30分間撹拌し、Pfp化反応を行った。反応溶液を飽和食塩水で洗浄した後、水層を酢酸エチル50 mLで抽出した。合わせた有機層を濃縮し、得られた濃縮物をカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘプタン)で精製し、Teoc-MeLeu-OPfp 6.63gを得た（収率：90%）。
（縮合反応）
　Phe-OtBu塩酸塩 201 mg (0.8 mmol)、Teoc-MeLeu-OPfp 536 mg (1.2 mmol)を酢酸イソプロピル3.0 mLに懸濁し、4-メチルモルホリン 257 μL (2.3 mmol) を加えて、25 ℃で3時間撹拌しペプチド結合形成反応を行った。反応液5μLをとり、プロピルアミン100μL (1.2 mmol) に加えて、残存するC末端活性体をプロピルアミドへ変換させた後、メタノール0.9 mLで希釈した。本溶液をLC/MS分析に付し、LC/MSのピーク面積値から変換率を求めた (変換率:100%)。
変換率(%)={Teoc-MeLeu-Phe-OtBu(面積%)/[Phe-OtBu(面積%)+Teoc-MeLeu-Phe-OtBu(面積%)]}×100
（加水分解処理）
（１）アミン非添加の場合
　上記調製したペプチドを含む反応溶液に5%炭酸ナトリウム水溶液2.0 mLを加えて、25 ℃で撹拌子にて20分間撹拌を行った。撹拌を停止し、有機層と水層を分層させた。有機層5μLをとり、プロピルアミン100μL (1.2 mmol) に加えて、残存するC末端活性体をプロピルアミドへ変換させた後、メタノール0.9 mLで希釈した。LC/MSのピーク面積値から、以下の計算式に従ってC末端活性体残存率を計算した。
C末端活性体残存率(%)={プロピルアミド(面積%)/[プロピルアミド(面積%)+ジペプチド(面積%)]}×100
（２）アミン添加の場合
　上記調製したペプチドを含む反応溶液にDMAP 95 mg (0.8 mmol)、5%炭酸ナトリウム水溶液2.0 mLを加えて、25 ℃で撹拌子にて20分間撹拌を行った。撹拌を停止し、有機層と水層を分層させた。有機層5μLをとり、プロピルアミン100μL (1.2 mmol) に加えて、残存するC末端活性体をプロピルアミドへ変換させた後、メタノール0.9 mLで希釈した。LC/MSのピーク面積値から、以下の計算式に従ってC末端活性体残存率を計算した。
C末端活性体残存率 (%) ={プロピルアミド(面積%)/[プロピルアミド(面積%)+ジペプチド(面積%)]}×100
（後処理）
　撹拌を停止した後、静置し、有機層と水層を分層させて、水層を除去した。次いで有機層を10%硫酸水素カリウム水溶液2 mL×2、5%炭酸ナトリウム水溶液 2 mLで順次洗浄した。さらに5%炭酸カリウム水溶液 1 mL、常水1 mL×2での洗浄を3回繰り返した。得られた有機層5μLをとり、プロピルアミン100μL (1.2 mmol) に加えて、残存するC末端活性体をプロピルアミドへ変換させた後、メタノール0.9 mLで希釈して、LC/MS分析に付し、目的とするペプチドと残存C末端活性体(プロピルアミドへの変換体)のピーク面積を求めた。アミン非添加加水分解により得られた濃縮物（ペプチド）は576.6 mgであった (収率150%：濃縮物には不純物(残存C末端活性体)を含むが、ペプチドのみを含むものとして計算した)。アミン添加での加水分解により得られた濃縮物は、369.6 mg (収率96%)であった。MS(ESI)：m/z 437.3 [M-tBu+H]+, 493.3 [M+H]+, 515.3 [M+Na]+。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
 １）LCMSのピーク面積比率
　保護基をＴｅｏｃ、Ｃ末端活性体部位をＰｆｐとした残存Ｃ末端活性体のアルカリ水単独処理での加水分解では、残存Ｃ末端活性体が完全に加水分解されず、続く水性洗浄でも残存Ｃ末端活性体を除去できなかった。一方、ＤＭＡＰを添加して加水分解を行うと、残存Ｃ末端活性体の加水分解が完全に達成されて、残存Ｃ末端活性体の除去も完全にできることを見出した。目的のジペプチドは９６．３％の純度で得られた（収率９６％）。
（実施例１６） Cbz-Aib-MeLeu-Phe-OtBuの合成
（アミン非添加で加水分解処理して得られたジペプチドを使用したTeoc脱保護反応）
　実施例15でのアミン非添加条件で合成したTeoc-MeLeu-Phe-OtBu 576.6 mg (残存C末端活性体8.9面積%を含む) を2-メチルテトラヒドロフラン2.0 mLに溶解させた。TBAFの8.4%含水テトラヒドロフラン溶液 1.5 mL (1.5 mmol) を加えた後、50℃で2.5時間撹拌した。反応が完結しなかったため、TBAFの8.4%含水テトラヒドロフラン溶液 0.75 mL (0.75 mmol) を加えて、2.5時間撹拌した。さらにTBAFの8.4%含水テトラヒドロフラン溶液 0.75 mL (0.75 mmol) を加えて30分間撹拌し、脱Teoc体であるMeLeu-Phe-OtBuを得た (変換率100%)。反応変換率は、反応液5μLをとり、アセトニトリル1.0 mLで希釈した後、LC/MS分析に付し、LC/MSのピーク面積値から求めた。
変換率(%)={MeLeu-Phe-OtBu(面積%)/[Teoc-MeLeu-Phe-OtBu(面積%)+MeLeu-Phe-OtBu(面積%)]}×100
（縮合反応）
　内容量が約1 mLになるまで濃縮した後、2-メチルテトラヒドロフランを2 mLを加えた。本操作をさらに2回繰り返し、得られた2-メチルテトラヒドロフラン溶液にアセトニトリル0.5 mL、Cbz-Aib-OH 276 mg (1.1 mmol)、ジイソプロピルエチルアミン 0.66 mL (3.8 mmol)を加えた。次いで25℃でHATU 441 mg (1.1 mmol)を加えて、室温で14時間撹拌した。HATU 579 mg (1.5 mmol)を加えて、40℃で1時間撹拌した後、HATU 684 mg (1.8 mmol)を加えて60℃に昇温し、4.5時間撹拌した。さらにHATU 455 mg (1.1 mmol)を加えて、60℃で2時間、室温で12時間、60℃で2時間撹拌したが、縮合反応の進行は観察されなかった(変換率0%)。反応変換率は、反応液5μLをプロピルアミン100 μLに加えて、メタノール0.9 mLで希釈した後、LC/MS分析に付し、LC/MSのピーク面積値から求めた。
変換率(%)={Cbz-Aib-MeLeu-Phe-OtBu(面積%)/[MeLeu-Phe-OtBu(面積%)+Cbz-Aib-MeLeu-Phe-OtBu(面積%)]}×100
（アミン添加で加水分解処理して得られたジペプチドを使用したTeoc脱保護反応）
　実施例15でのアミン添加条件で合成したTeoc-MeLeu-Phe-OtBu 369.6 mg (0.75 mmol) を2-メチルテトラヒドロフラン2.0 mLに溶解させた。TBAFの8.4%含水テトラヒドロフラン溶液 1.5 mL (1.5 mmol) を加えた後、50℃で2.5時間撹拌し、脱Teoc体であるMeLeu-Phe-OtBuを得た (変換率100%)。反応変換率は、反応液5μLをとり、アセトニトリル1.0 mLで希釈した後、LC/MS分析に付し、LC/MSのピーク面積値から求めた。
変換率(%)={MeLeu-Phe-OtBu(面積%)/[Teoc-MeLeu-Phe-OtBu(面積%)+MeLeu-Phe-OtBu(面積%)]}×100
（縮合反応）
　内容量が約1 mLになるまで濃縮した後、2-メチルテトラヒドロフランを2 mLを加えた。本操作をさらに2回繰り返し、得られた2-メチルテトラヒドロフラン溶液にアセトニトリル0.5 mL、Cbz-Aib-OH 273 mg (1.1 mmol)、ジイソプロピルエチルアミン 0.66 mL (3.8 mmol)を加えた。次いで25℃でHATU 439 mg (1.1 mmol)を加えて、室温で14時間撹拌した。HATU 576 mg (1.5 mmol)を加えて、40℃で5.5時間撹拌した。さらにHATU 452 mg (1.1 mmol)を加えて、60℃で2時間、室温で12時間、60℃で2時間撹拌した(変換率86%)。反応変換率は、反応液5μLをプロピルアミン100 μLに加えて、メタノール0.9 mLで希釈した後、LC/MS分析に付し、LC/MSのピーク面積値から求めた。変換率(%)={Cbz-Aib-MeLeu-Phe-OtBu(面積%)/[MeLeu-Phe-OtBu(面積%)+Cbz-Aib-MeLeu-Phe-OtBu(面積%)]}×100
　調製した反応液にDMAP 92 mg (0.75 mmol)、10%炭酸カリウム水溶液4.0 mLを加えて、25℃で撹拌子にて1時間撹拌を行った。撹拌を停止した後、静置し、有機層と水層を分層させて、水層を除去した。得られた有機層5 μLをプロピルアミン100 μLに加えて、メタノール0.9 mLで希釈した。この溶液をLC/MS分析に付して、目的とするペプチドと残存C末端活性体のピーク面積パーセントを求めた。目的とするペプチドCbz-Aib-MeLeu-Phe-OtBuは86.7%、原料のMeLeu-Phe-OtBuは13.3%、残存C末端活性体由来のCbz-Aib-NHPrは検出されなかった。残った有機層を濃縮し、上記組成の濃縮物295.6 mgを得た。MS(ESI)：m/z 568.4 [M+H]+, 590.4 [M+Na]+。
　Ｎ末端が保護されたペプチドの溶液にＣ末端活性体が残存していると、ペプチドのＮ末端の保護基（Ｔｅｏｃ）を含水フッ素試薬で脱保護する際に、大過剰の試薬が必要なことが判明した。脱保護試薬が残存Ｃ末端活性体とも反応するからであると推定される。
　また、脱保護に続く、次工程での別のＣ末端活性体との縮合反応（ペプチド結合形成反応）が、全く進行しないことが明らかになった。おそらく、前行程（Ｎ末端の脱保護）で使用した過剰の試薬がＣ末端活性体を分解したと推定される。このように、Ｃ末端活性体が残存するとＮ末端の脱保護の際に、大過剰の試薬が必要となり、そのことが、続く縮合反応の進行を妨げることにつながることを見出した。一方、残存Ｃ末端活性体が完全に除去されたペプチド溶液を原料として用いれば、適量の脱保護試薬で脱保護反応が完結し、次工程の縮合反応も実施可能であることを見出した。
（実施例１７） Cbz-MeAla-Phe-OtBuの合成
（縮合反応）
　Phe-OtBu塩酸塩 302 mg (1.2 mmol)、Cbz-MeAla-OH 417 mg (1.7 mmol)、HOOBt 290 mg (1.8 mmol) をアセトニトリル0.9 mL、MTBE 3.6 mLに懸濁し、ジイソプロピルエチルアミン1.0 mL (5.8 mmol) を加えた。次いで、EDC塩酸塩 443 mg (2.3 mmol) を加えて、25 ℃で30分間撹拌しペプチド結合形成反応を行った。反応液5μLをとり、プロピルアミン100μL (1.2 mmol) に加えて、残存するC末端活性体をプロピルアミドへ変換させた後、メタノール0.9 mLで希釈した。本溶液をLC/MS分析に付し、LC/MSのピーク面積値から変換率を求めた (変換率:100%)。
変換率(%)={Cbz-MeAla-Phe-OtBu(面積%)/[Phe-OtBu(面積%)+Cbz-MeALa-Phe-OtBu(面積%)]}×100
（加水分解処理）
（１）アミン非添加の場合
　上記調製したペプチドを含む反応溶液に5%炭酸ナトリウム水溶液3.0 mLを加えて、25 ℃で撹拌子にて5分間撹拌を行った。撹拌を停止し、有機層と水層を分層させた。有機層5μLをとり、プロピルアミン100μL (1.2 mmol) に加えて、残存するC末端活性体をプロピルアミドへ変換させた後、メタノール0.9 mLで希釈した。LC/MSのピーク面積値から、以下の計算式に従ってC末端活性体残存率を計算した。
C末端活性体残存率(%)={プロピルアミド(面積%)/[プロピルアミド(面積%)+ジペプチド(面積%)]}×100
（２）アミン添加の場合
　上記調製したペプチドを含む反応溶液にDMAP 147 mg (1.1 mmol)、5%炭酸ナトリウム水溶液3.0 mLを加えて、25 ℃で撹拌子にて5分間撹拌を行った。撹拌を停止し、有機層と水層を分層させた。有機層5μLをとり、プロピルアミン100μL (1.2 mmol) に加えて、残存するC末端活性体をプロピルアミドへ変換させた後、メタノール0.9 mLで希釈した。LC/MSのピーク面積値から、以下の計算式に従ってC末端活性体残存率を計算した。
C末端活性体残存率(%)={プロピルアミド(面積%)/[プロピルアミド(面積%)+ジペプチド(面積%)]}×100
（後処理）
　撹拌を停止した後、静置し、有機層と水層を分層させて、水層を除去した。次いで有機層を10%硫酸水素ナトリウム水溶液3 mL×2、5%炭酸ナトリウム水溶液 3 mLで順次洗浄した。得られた有機層5 μLをプロピルアミン100 μLに加えて、メタノール0.9 mLで希釈した。この溶液をLC/MS分析に付して、目的とするペプチドと残存C末端活性体のピーク面積パーセントを求めた。MS(ESI)：m/z 385.2 [M-tBu+H]+, 441.3 [M+H]+, 463.2 [M+Na]+。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
 １）LCMSのピーク面積比率
　置換基の小さなアミノ酸であるアラニンでも、アルカリ水単独処理での加水分解では、残存Ｃ末端活性体が完全に加水分解されず、続く分液操作（水性洗浄）でも残存Ｃ末端活性体を十分に除去できなかった。一方、ＤＭＡＰを添加して加水分解を行うと、残存Ｃ末端活性体の加水分解が完全に達成されて、残存Ｃ末端活性体の除去も完全にできることを見出した。しかもこのとき、目的のジペプチドが９８．４％の純度で得られた。
（実施例１８）Cbz-Hph-MeAla-Phe-OtBuの合成
（アミン非添加で加水分解処理して得られたジペプチドを使用したCbz脱保護反応）
　実施例17でのアミン非添加条件で合成したCbz-MeAla-Phe-OtBuのMTBE溶液を2-メチルテトラヒドロフランに置換濃縮した。5%Pd/C (50%wet) 101 mgと水素ガスにて加水素分解反応に付した。25 ℃で6時間撹拌したが、反応は完結しなかった (変換率35%)。反応変換率は、反応液5μLをとり、アセトニトリル1.0 mLで希釈した後、LC/MS分析に付し、LC/MSのピーク面積値から求めた。
変換率(%)={MeAla-Phe-OtBu(面積%)/[Cbz-MeAla-Phe-OtBu(面積%)+MeALa-Phe-OtBu(面積%)]}×100
（アミン添加で加水分解処理して得られたジペプチドを使用したCbz脱保護反応）
　実施例17でのアミン添加条件で合成したCbz-MeAla-Phe-OtBuのMTBE溶液を2-メチルテトラヒドロフランに置換濃縮した。5%Pd/C (50%wet) 102 mgと水素ガスにて加水素分解反応に付した。25 ℃で3時間撹拌し、脱Cbz化体であるMeAla-Phe-OtBuを得た (変換率100%)。反応変換率は、反応液5μLをとり、アセトニトリル1.0 mLで希釈した後、LC/MS分析に付し、LC/MSのピーク面積値から求めた。MS(ESI):m/z 307.2 [M+H]+。
変換率(%)={MeAla-Phe-OtBu(面積%)/[Cbz-MeAla-Phe-OtBu(面積%)+MeALa-Phe-OtBu(面積%)]}×100
（縮合反応）
　アミン添加で加水分解処理して得られたジペプチドのCbz脱保護体反応液を、フィルターでろ過し、Pd/Cをろ去した後、濃縮乾固した。2-メチルテトラヒドロフラン2.5 mLに乾固物を溶解させ、Cbz-Hph-OH 474 mg (1.5 mmol)、ジイソプロピルエチルアミン 610 μL (3.5 mmol)を加えた。次いでT3P/2-メチルテトラヒドロフラン溶液 1.37 mL (2.33 mmol)を加えて25℃で1.5時間撹拌し、ペプチド結合形成反応を行った（変換率：100%）。反応変換率は、反応液5μLをプロピルアミン100 μLに加えて、メタノール0.9 mLで希釈した後、LC/MS分析に付し、LC/MSのピーク面積値から求めた。
変換率(%)={Cbz-Hph-MeAla-Phe-OtBu(面積%)/[MeAla-Phe-OtBu(面積%)+Cbz-Hph-MeAla-Phe-OtBu (面積%)]}×100
　調製した反応液にDMAP 74 mg (0.6 mmol)、5%炭酸ナトリウム水溶液3.0 mLを加えて、25℃で15分間撹拌を行った。撹拌を停止し、静置した後、有機層と水層を分層させ、水層を除去した。次いで有機層を10%硫酸水素ナトリウム水溶液 3 mL、5%炭酸ナトリウム水溶液 3 mL、常水3 mLで順次洗浄した。得られた有機層5 μuLをプロピルアミン100 μLに加えて、メタノール0.9 mLで希釈した。この溶液をLC/MS分析に付して、目的とするペプチドと残存C末端活性体のピーク面積パーセントを求めた。目的とするペプチドCbz-Hph-MeAla-Phe-OtBuは99.0%であり、残存C末端活性体由来のCbz-Hph-NHPrは検出されなかった。残った有機層を濃縮し、濃縮物618.4 mgを得た（実施例１７のPhe-OtBuから収率88%）。MS(ESI)：m/z 602.4 [M+H]+, 624.4 [M+Na]+。
　ＥＤＣおよびＨＯＯＢｔ由来のＣ末端活性体が残存していると、ペプチド伸長後のＣｂｚ脱保護反応がほとんど進行しないことが明らかになった。一方、残存Ｃ末端活性体が完全に除去されたペプチド溶液を原料として用いれば、Ｃｂｚ脱保護反応がスムーズに進行し、ペプチド合成反応が可能となることを見出した。すなわち、実施例９の場合と同様に、本発明の方法を用いることにより、生成したペプチド化合物のＮ末端の保護基の還元的除去反応を、停滞させずに進行させることができることが判った。
（実施例１９） Cbz-Aib-D-Val-OBnの合成
（縮合反応）
　D-Val-OBn TsOH塩 502 mg (1.3 mmol)、Cbz-Aib-OH 478 mg (2.0 mmol) を2-MeTHF 6.0 mLに縣濁し、ジイソプロピルエチルアミン 1.2 mL (6.9 mmol)を加えた。次いで25℃で50%T3P/2-メチルテトラヒドロフラン溶液 1.9 mL (3.3 mmol)を加えて、25℃で15時間撹拌しペプチド結合形成反応を行った。反応液5μLをとり、プロピルアミン100 μL (1.2 mmol)に加えて、残存するC末端活性体をプロピルアミドへ変換させた後、メタノール0.9 mLで希釈した。本溶液をLC/MS分析に付し、LC/MSのピーク面積から変換率を求めた (変換率：100%)。
変換率(%)={Cbz-Aib-D-Val-OBn(面積%)/[D-Val-OBn(面積%)+Cbz-Aib-D-Val-OBn(面積%)]}×100
（加水分解処理）
（１）アミン非添加の場合
　上記調製したペプチドを含む反応溶液に5%炭酸カリウム水溶液 5.0 mLを加えて25℃で撹拌子にて30分間撹拌を行った。撹拌を停止し、有機層と水層を分層させた。有機層5μLをとり、プロピルアミン100μL (1.2 mmol)に加えて、残存するC末端活性体をプロピルアミドへ変換させた後、メタノール0.9 mLで希釈した。LC/MSのピーク面積値から、以下の計算式に従ってC末端活性体残存率を計算した。
C末端活性体残存率(%)={プロピルアミド(面積%)/[プロピルアミド(面積%)+ジペプチド(面積%)]}×100
（２）アミン添加の場合
　上記調製したペプチドを含む反応溶液にDMAP 484 mg (4.0 mmol)と5%炭酸カリウム水溶液 5.0 mLを加えて25℃で撹拌子にて30分間撹拌を行った。撹拌を停止し、有機層と水層を分層させた。有機層5μLをとり、プロピルアミン100μL (1.2 mmol)に加えて、残存するC末端活性体をプロピルアミドへ変換させた後、メタノール0.9 mLで希釈した。LC/MSのピーク面積値から、以下の計算式に従ってC末端活性体残存率を計算した。
C末端活性体残存率(%)={プロピルアミド(面積%)/[プロピルアミド(面積%)+ジペプチド(面積%)]}×100
（後処理）
　撹拌を停止した後、静置し、有機層と水層を分層させて、水層を除去した。次いで有機層を10%硫酸水素カリウム水溶液 5 mLと5%炭酸カリウム水溶液2.5 mLで順次洗浄した。有機層5 μLをとり、プロピルアミン100μL (1.2 mmol)に加えて、残存するC末端活性体をプロピルアミドへ変換させた後、メタノール0.9 mLで希釈してLC/MS分析に付し、目的とするペプチドと残存C末端活性体(プロピルアミドへの変換体)のピーク面積値を求めた。残った有機層を濃縮し、ペプチドを得た。アミン非添加での加水分解により得られた濃縮物（ペプチド）は653.8 mgであった (収率116%：濃縮物には不純物(残存C末端活性体)を含むが、ペプチドのみを含むものとして計算した)。アミン添加での加水分解により得られた濃縮物は549.4 mgであった (収率97%)。MS(ESI)：m/z 427.3 [M+H]+, 449.2 [M+Na]+。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
 １）LCMSのピーク面積比率
　アルカリ水単独処理での加水分解では、残存Ｃ末端活性体が完全に加水分解されず、続く水性洗浄でも残存Ｃ末端活性体を十分に除去できなかったが、ＤＭＡＰを添加して加水分解を行うと、残存Ｃ末端活性体の加水分解が完全に達成されて、残存Ｃ末端活性体を完全に除去できることを見出した。このとき、目的のジペプチドは純度９８．６％で得られた（収率９７％）。
（実施例２０） Cbz-Thr(tBu)-Phe-OtBuの合成
（縮合反応）
　Phe-OtBu塩酸塩 300 mg (1.2 mmol)、Cbz-Thr(tBu)-OHジシクロヘキシルアミン塩 855 mg (1.7 mmol) 、HOBt 237 mg (1.8 mmol)を2-MeTHF 4.2 mL、アセトニトリル 0.9 mLに縣濁し、ジイソプロピルエチルアミン 813 μL (4.6 mmol)を加えた。次いで25℃でEDC 塩酸塩447 mg (2.3 mmol)を加えて、25℃で3時間撹拌しペプチド結合形成反応を行った。反応液5μLをとり、プロピルアミン100 μL (1.2 mmol)に加えて、残存するC末端活性体をプロピルアミドへ変換させた後、メタノール0.9 mLで希釈した。本溶液をLC/MS分析に付し、LC/MSのピーク面積から変換率を求めた (変換率：100%)。
変換率(%)={Cbz-Thr(tBu)-Phe-OtBu(面積%)/[Phe-OtBu(面積%)+Cbz-Thr(tBu)-Phe-OtBu(面積%)]}×100
（加水分解処理）
（１）アミン非添加の場合
　上記調製したペプチドを含む反応溶液に5%炭酸カリウム水溶液 3.0 mLを加えて25℃で撹拌子にて5分間撹拌を行った。撹拌を停止し、有機層と水層を分層させた。有機層5μLをとり、プロピルアミン100μL (1.2 mmol)に加えて、残存するC末端活性体をプロピルアミドへ変換させた後、メタノール0.9 mLで希釈した。LC/MSのピーク面積値から、以下の計算式に従ってC末端活性体残存率を計算した。
C末端活性体残存率(%)={プロピルアミド(面積%)/[プロピルアミド(面積%)+ジペプチド(面積%)]}×100
（２）アミン添加の場合
　上記調製したペプチドを含む反応溶液にDMAP 142 mg (1.2 mmol)と5%炭酸カリウム水溶液 3.0 mLを加えて25℃で撹拌子にて5分間撹拌を行った。撹拌を停止し、有機層と水層を分層させた。有機層5μLをとり、プロピルアミン100μL (1.2 mmol)に加えて、残存するC末端活性体をプロピルアミドへ変換させた後、メタノール0.9 mLで希釈した。LC/MSのピーク面積値から、以下の計算式に従ってC末端活性体残存率を計算した。
C末端活性体残存率(%)={プロピルアミド(面積%)/[プロピルアミド(面積%)+ジペプチド(面積%)]}×100
（後処理）
　撹拌を停止した後、静置し、有機層と水層を分層させて、水層を除去した。次いで有機層を10%硫酸水素カリウム水溶液 3 mL、5%炭酸カリウム水溶液3 mL、水1.5 mLで順次洗浄した。有機層5 μLをとり、プロピルアミン100μL (1.2 mmol)に加えて、残存するC末端活性体をプロピルアミドへ変換させた後、メタノール0.9 mLで希釈してLC/MS分析に付し、目的とするペプチドと残存C末端活性体(プロピルアミドへの変換体)のピーク面積値を求めた。残った有機層を濃縮し、ペプチドを得た。MS(ESI)：m/z 401.2 [M-2tBu+H]+、457.2 [M-tBu+H]+、513.3 [M+H]+、535.3 [M+Na]+。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
 １）LCMSのピーク面積比率
　アルカリ水単独処理での加水分解では、残存Ｃ末端活性体が完全に加水分解されず、続く水性洗浄でも残存Ｃ末端活性体を十分に除去できなかったが、ＤＭＡＰを添加して加水分解を行うと、残存Ｃ末端活性体の加水分解が完全に達成されて、残存Ｃ末端活性体を完全に除去できることを見出した。このとき、目的のジペプチドは純度９８．４％で得られた。
（実施例２１）Cbz-Leu-Thr(tBu)-Phe-OtBuの合成
（アミン非添加で加水分解処理して得られたジペプチドを使用したCbz脱保護反応）
　実施例20でのアミン非添加条件で合成したCbz-Thr(tBu)-Phe-OtBuのMTBE/2-MeTHF溶液を2-メチルテトラヒドロフランに置換濃縮した。5%Pd/C (50%wet) 99 mgと水素ガスにて加水素分解反応に付した。25 ℃で1時間撹拌したが、反応は完結しなかった (変換率53%)。反応変換率は、反応液5μLをとり、アセトニトリル1.0 mLで希釈した後、LC/MS分析に付し、LC/MSのピーク面積値から求めた。
変換率(%)={Thr(tBu)-Phe-OtBu(面積%)/[Cbz-Thr(tBu)-Phe-OtBu(面積%)+Thr(tBu)-Phe-OtBu(面積%)]}×100
（アミン添加で加水分解処理して得られたジペプチドを使用したCbz脱保護反応）
　実施例20でのアミン添加条件で合成したCbz-Thr(tBu)-Phe-OtBuのMTBE/2-MeTHF溶液を2-メチルテトラヒドロフランに置換濃縮した。5%Pd/C (50%wet) 104 mgと水素ガスにて加水素分解反応に付した。25 ℃で1時間撹拌し、脱Cbz化体であるThr(tBu)-Phe-OtBuを得た (変換率100%)。反応変換率は、反応液5μLをとり、アセトニトリル1.0 mLで希釈した後、LC/MS分析に付し、LC/MSのピーク面積値から求めた。
変換率(%)={Thr(tBu)-Phe-OtBu(面積%)/[Cbz-Thr(tBu)-Phe-OtBu(面積%)+Thr(tBu)-Phe-OtBu(面積%)]}×100
（縮合反応）
　アミン添加で加水分解処理して得られたジペプチドのCbz脱保護体反応液を、フィルターでろ過し、Pd/Cをろ去した後、濃縮乾固した。2-メチルテトラヒドロフラン5.0 mLに乾固物を溶解させ、Cbz-Leu-OH 382 mg (1.4 mmol)、ジイソプロピルエチルアミン 814 μL (4.7 mmol)を加えた。次いで50%T3P/2-メチルテトラヒドロフラン溶液 1.37 mL (2.3 mmol)を加えて25℃で30分間撹拌し、ペプチド結合形成反応を行った（変換率：100%）。反応変換率は、反応液5μLをプロピルアミン100 μLに加えて、メタノール0.9 mLで希釈した後、LC/MS分析に付し、LC/MSのピーク面積値から求めた。
変換率(%)={Cbz-Leu-Thr(tBu)-Phe-OtBu(面積%)/[Thr(tBu)-Phe-OtBu(面積%)+Cbz-Leu-Thr(tBu)-Phe-OtBu(面積%)]}×100
　調製した反応液にDMAP 139 mg (1.1 mmol)、10%炭酸ナトリウム水溶液3.0 mLを加えて、25℃で5分間撹拌を行った。撹拌を停止し、静置した後、有機層と水層を分層させ、水層を除去した。次いで有機層を10%硫酸水素ナトリウム水溶液 3 mL×2、5%炭酸ナトリウム水溶液 3 mL、常水3 mLで順次洗浄した。得られた有機層5 μLをプロピルアミン100 μLに加えて、メタノール0.9 mLで希釈した。この溶液をLC/MS分析に付して、目的とするペプチドと残存C末端活性体のピーク面積パーセントを求めた。目的とするペプチドCbz-Leu-Thr(tBu)-Phe-OtBuは98.3%であり、残存C末端活性体由来のCbz-Leu-NHPrは検出されなかった。残った有機層を濃縮し、濃縮物638.0 mgを得た（実施例20のPhe-OtBuから収率88%）。MS (ESI)：m/z 514.3 [M-2tBu+H]+、570.3 [M-tBu+H]+, 626.5 [M+H]+, 648.4 [M+Na]+。
　ＥＤＣおよびＨＯＢｔ由来のＣ末端活性体が残存していると、残存Ｃ末端活性体を完全に除去した場合に比べてＣｂｚ脱保護反応進行が遅いことが分かった。残存Ｃ末端活性体が完全に除去されたペプチド溶液を原料として用いれば、Ｃｂｚ脱保護反応がスムーズに進行し、ペプチド合成反応が可能となることを見出した。すなわち、本発明の方法を用いることにより、実施例９、実施例１８の場合と同様に、生成したペプチド化合物のＮ末端の保護基の還元的除去反応を、停滞させずに進行させることができることが判った。これにより、所望のアミノ酸配列を有する高純度のペプチド化合物を効率的に製造することができた。
（実施例２２） Cbz-Ile-Phe-OtBuの合成
（縮合反応）
　Phe-OtBu塩酸塩 301 mg (1.2 mmol)、Cbz-Ile-OH 465 mg (1.8 mmol)をMTBE 3.6 mL、アセトニトリル 0.9 mLに縣濁し、ジイソプロピルエチルアミン 610 μL (3.5 mmol)を加えた。次いで25℃でBEP 479 mg (1.8 mmol)を加えて、25℃で45分間撹拌しペプチド結合形成反応を行った。反応液5μLをとり、プロピルアミン100 μL (1.2 mmol)に加えて、残存するC末端活性体をプロピルアミドへ変換させた後、メタノール0.9 mLで希釈した。本溶液をLC/MS分析に付し、LC/MSのピーク面積から変換率を求めた (変換率：100%)。
変換率(%)={Cbz-Ile-Phe-OtBu(面積%)/[Phe-OtBu(面積%)+Cbz-Ile-Phe-OtBu(面積%)]}×100
（加水分解処理）
（１）アミン非添加の場合
　上記調製したペプチドを含む反応溶液に5%炭酸カリウム水溶液 3.0 mLを加えて25℃で撹拌子にて3分間撹拌を行った。撹拌を停止し、有機層と水層を分層させた。有機層5μLをとり、プロピルアミン100μL (1.2 mmol)に加えて、残存するC末端活性体をプロピルアミドへ変換させた後、メタノール0.9 mLで希釈した。LC/MSのピーク面積値から、以下の計算式に従ってC末端活性体残存率を計算した。
C末端活性体残存率(%)={プロピルアミド(面積%)/[プロピルアミド(面積%)+ジペプチド(面積%)]}×100
（２）アミン添加の場合
　上記調製したペプチドを含む反応溶液にDMAP 139 mg (1.1 mmol)と5%炭酸カリウム水溶液 3.0 mLを加えて25℃で撹拌子にて3分間撹拌を行った。撹拌を停止し、有機層と水層を分層させた。有機層5μLをとり、プロピルアミン100μL (1.2 mmol)に加えて、残存するC末端活性体をプロピルアミドへ変換させた後、メタノール0.9 mLで希釈した。LC/MSのピーク面積値から、以下の計算式に従ってC末端活性体残存率を計算した。
C末端活性体残存率(%)={プロピルアミド(面積%)/[プロピルアミド(面積%)+ジペプチド(面積%)]}×100
（後処理）
　撹拌を停止した後、静置し、有機層と水層を分層させて、水層を除去した。次いで有機層を10%硫酸水素カリウム水溶液 3 mL、5%炭酸カリウム水溶液3 mLで順次洗浄した。2-MeTHF 2 mLを加えた後、水1.5 mLで洗浄した。有機層5 μLをとり、プロピルアミン100μL (1.2 mmol)に加えて、残存するC末端活性体をプロピルアミドへ変換させた後、メタノール0.9 mLで希釈してLC/MS分析に付し、目的とするペプチドと残存C末端活性体(プロピルアミドへの変換体)のピーク面積値を求めた。残った有機層を濃縮し、ペプチドを得た。MS (ESI)：m/z 413.3 [M-tBu+H]+, 469.3 [M+H]+, 491.3 [M+Na]+。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
 １）LCMSのピーク面積比率
　アルカリ水単独処理での加水分解では、残存Ｃ末端活性体が完全に加水分解されず、続く水性洗浄でも残存Ｃ末端活性体を十分に除去できなかったが、ＤＭＡＰを添加して加水分解を行うと、残存Ｃ末端活性体の加水分解が完全に達成されて、残存Ｃ末端活性体を完全に除去できることを見出した。このとき、目的のジペプチドは純度９６．３％で得られた。
（実施例２３） Cbz-Phe-MeGly-Phe-piperidine 
（Boc脱保護反応）
　Boc-Phe-piperidine1 334 mg (1.0 mmol) をジクロロメタン3.4 mLに溶解し、メタンスルホン酸 131μL (2.0 mmol) を加えた。35 ℃で3時間撹拌し、脱Boc反応を行った (変換率：100%)。反応変換率は反応液5 μLをとり、アセトニトリル1.0 mLで希釈した溶液をLCMS分析に付し、LC/MSのピーク面積値から求めた。
変換率(%)={Phe-piperidine(面積%)/[Boc-Phe-piperidine(面積%)+Phe-piperidine(面積%)]}×100
（縮合反応）
　上記反応溶液に、ジイソプロピルエチルアミン 528 μL (3.0 mmol) を加えた後、溶媒を留去した。次いでアセトニトリル 1.0 mL、2-メチルテトラヒドロフラン3.4 mL、ジイソプロピルエチルアミン 528 μL (3.0 mmol)、Cbz-Phe-MeGly-OH2 505 mg (1.5 mmol)、HOOBt 256 mg (1.6 mmol) を加えた。25℃でEDC塩酸塩 388 mg (2.0 mmol)を加えて、25℃で1時間撹拌しペプチド結合形成反応を行った。反応液5μLをとり、プロピルアミン100 μL (1.2 mmol)に加えて、残存するC末端活性体をプロピルアミドへ変換させた後、メタノール0.9 mLで希釈した。本溶液をLC/MS分析に付し、LC/MSのピーク面積から変換率を求めた (変換率：100%)
変換率(%)={Cbz-Phe-MeGly-Phe-piperidine(面積%)/[Phe-piperidine(面積%)+Cbz-Phe-MeGly-Phe-piperidine(面積%)]}×100
　上記調製した反応溶液にDMAP 128 mg (1.0 mmol)、5%炭酸カリウム水溶液3.5 mLを加え、25 ℃で撹拌子にて3分間撹拌を行った。撹拌を停止した後、静置し、有機層と水層を分層させて水層を除去した。次いで有機層を10%硫酸カリウム水溶液3.5 mL×2、5%炭酸カリウム水溶液3.5 mLで希釈した。この溶液をLC/MS分析に付して、目的とするペプチドと残存C末端活性体のピーク面積パーセントを求めた。目的とするペプチドCbz-Phe-MeGly-Phe-piperidineは純度94.6%であり、残存C末端活性体由来のCbz-Phe-MeGly-NHPrは検出されなかった。残った有機層を濃縮し、濃縮物520.4 mgを得た (収率94%)。
　ＤＭＡＰを添加して加水分解を行うと、ペプチドフラグメント由来の残存Ｃ末端活性体の分解・除去が完全に達成されて、目的のトリペプチドを９４．６％の純度で得ることができた。（収率９４％）
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（実施例２４） Cbz-Val-Phe-OtBuの合成
（縮合反応）
　Phe-OtBu塩酸塩 200 mg (0.8 mmol)、Cbz-Val-OH 294 mg (1.2 mmol) を2-メチルテトラヒドロフラン2.4 mL、アセトニトリル0.6 mLに縣濁し、N-エチルモルホリン294 μL (2.3 mmol) を加えた。次いで、25℃でHATU 447 mg (1.2 mmol) を加えて、25℃下で2.5時間撹拌し、ペプチド結合形成反応を行った。反応液5 μLをとり、プロピルアミン100μL (1.2 mmol) に加えて、残存するC末端活性体をプロピルアミドへ変換させた後、メタノール0.9 mLで希釈した。本溶液をLC/MS分析に付し、LC/MSのピーク面積から変換率を求めた（変換率：100%）。MS (ESI)：m/z 399.3 [M-tBu+H]+、455.3 [M+H]+
変換率(%)={Cbz-Val-Phe-OtBu(面積%)/[Phe-OtBu(面積%)+Cbz-Val-Phe-OtBu(面積%)]}×100
（加水分解処理）
（１）アミン非添加の場合
　上記調製したペプチドを含む反応溶液に5%炭酸カリウム水溶液2.0 mLを加えて、25℃で撹拌子にて撹拌を行った。撹拌を停止し、有機層と水層を分層させた。有機層5μLをとり、プロピルアミン100μL (1.2 mmol) に加えて、残存するC末端活性体をプロピルアミドへ変換させた後、メタノール0.9 mLで希釈した。本溶液をLC/MS分析に付し、LC/MSのピーク面積値から、以下の計算式に従ってC末端活性体残存率を計算した（下表）。
C末端活性体残存率(%)={プロピルアミド(面積%)/[プロピルアミド(面積%)+ジペプチド(面積%)]}×100
（２）アミン添加の場合
　上記調製したペプチドを含む反応溶液に下表に示すアミン添加剤 (0.8 mmol) と5%炭酸カリウム水溶液2.0 mLを加えて、25℃で撹拌子にて撹拌を行った。撹拌を停止し、有機層と水層を分層させた。有機層5μLをとり、プロピルアミン100μL (1.2 mmol) に加えて、残存するC末端活性体をプロピルアミドへ変換させた後、メタノール0.9 mLで希釈した。本溶液をLC/MS分析に付し、LC/MSのピーク面積値から、以下の計算式に従ってC末端活性体残存率を計算した（下表）。
C末端活性体残存率(%)={プロピルアミド(面積%)/[プロピルアミド(面積%)+ジペプチド面積%)]}×100
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　ＤＩＰＥＡの添加は、アミンを添加しないアルカリ水単独の場合よりもわずかに残存Ｃ末端活性体の加水分解を促したが、大きな効果は見られなかった。一方、ＤＭＡＰおよびＮＭＩの添加はＤＩＰＥＡの添加よりも顕著に残存Ｃ末端活性体の加水分解を促進し、特にＤＭＡＰ使用時は５分以内で残存Ｃ末端活性体が完全に加水分解されることが判明した。これにより、ＤＩＰＥＡのような窒素近傍に立体障害があるアミンと比較して、ＤＭＡＰのような窒素近傍の立体障害が小さいアミンの方がより残存Ｃ末端活性体の加水分解を促進することが判明した。
（実施例２５） Cbz-Ile-Val-OBnの合成
（縮合反応）
　Val-OBn 塩酸塩 300 mg (1.2 mmol)、Cbz-Ile-OH 495 mg (1.9 mmol) をシクロペンチルメチルエーテル 3.0 mL、アセトニトリル0.9 mLに縣濁し、ジイソプロピルエチルアミン 859 μL (4.9 mmol)を加えた。次いで25℃でHATU 705 mg (1.9 mmol)を加えて、25℃で1時間撹拌しペプチド結合形成反応を行った。反応液5μLをとり、プロピルアミン100 μL (1.2 mmol)に加えて、残存するC末端活性体をプロピルアミドへ変換させた後、メタノール0.9 mLで希釈した。本溶液をLC/MS分析に付し、LC/MSのピーク面積から変換率を求めた (変換率：100%)。
変換率(%)={Cbz-Ile-Val-OBn(面積%)/[Val-OBn(面積%)+Cbz-Ile-Val-OBn(面積%)]}×100
（加水分解処理）
（１）アミン非添加の場合
　上記調製したペプチドを含む反応溶液に中性水3.0 mLを加えて25℃で撹拌子にて5分間撹拌を行った。撹拌を停止し、有機層と水層を分層させた。有機層5μLをとり、プロピルアミン100μL (1.2 mmol)に加えて、残存するC末端活性体をプロピルアミドへ変換させた後、メタノール0.9 mLで希釈した。LC/MSのピーク面積値から、以下の計算式に従ってC末端活性体残存率を計算した。
C末端活性体残存率(%)={プロピルアミド(面積%)/[プロピルアミド(面積%)+ジペプチド(面積%)]}×100
（２）アミン添加の場合
　上記調製したペプチドを含む反応溶液にDMAP 91 mg (0.7 mmol)と中性水3.0 mLを加えて25℃で撹拌子にて5分間撹拌を行った。撹拌を停止し、有機層と水層を分層させた。有機層5μLをとり、プロピルアミン100μL (1.2 mmol)に加えて、残存するC末端活性体をプロピルアミドへ変換させた後、メタノール0.9 mLで希釈した。LC/MSのピーク面積値から、以下の計算式に従ってC末端活性体残存率を計算した。
C末端活性体残存率(%)={プロピルアミド(面積%)/[プロピルアミド(面積%)+ジペプチド(面積%)]}×100
（後処理）
　撹拌を停止した後、静置し、有機層と水層を分層させて、水層を除去した。次いで有機層を10%硫酸水素ナトリウム水溶液 3 mLと5%炭酸ナトリウム水溶液3 mL×2、常水1.5 mL×3で順次洗浄した。有機層5 μLをとり、プロピルアミン100μL (1.2 mmol)に加えて、残存するC末端活性体をプロピルアミドへ変換させた後、メタノール0.9 mLで希釈してLC/MS分析に付し、目的とするペプチドと残存C末端活性体(プロピルアミドへの変換体)のピーク面積値を求めた。残った有機層を濃縮し、ペプチドを得た。アミン非添加での加水分解により得られた濃縮物（ペプチド）は744 mgであった (収率132%：濃縮物には不純物(残存C末端活性体)を含むが、ペプチドのみを含むものとして計算した)。アミン添加での加水分解により得られた濃縮物は528 mgであった (収率94%)。MS(ESI)：m/z 455.3 [M+H]+, 477.3 [M+Na]+。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
 １）LCMSのピーク面積比率
　中性水単独処理での加水分解では、残存Ｃ末端活性体が完全に加水分解されず、続く水性洗浄でも残存Ｃ末端活性体を除去できなかったが、DMAPを添加して加水分解を行うと、残存Ｃ末端活性体の加水分解が完全に達成されて、残存Ｃ末端活性体の除去も完全にできることを見出した。このとき、目的のジペプチドが９９．５％の純度で得られた（収率９４％）。
（実施例２６） Cbz-MeAla-Phe-OtBuの合成
（縮合反応）
　Phe-OtBu 塩酸塩 200 mg (0.8 mmol)、Cbz-MeAla-OH 260 mg (1.2 mmol) を２－メチルテトラヒドロフラン2.4 mL、アセトニトリル0.6 mLに縣濁し、ジイソプロピルエチルアミン 271 μL (1.6 mmol)を加えた。次いで25℃でDMT-MM-n水和物 (4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリニウムクロリドn水和物) 265 mg (0.8 mmol, 13w%含水)を加えて、25℃で1時間撹拌した後、DMT-MM-n水和物119 mg (0.4 mmol, 13w%含水)を加えて、25℃で1時間撹拌し、ペプチド結合形成反応を行った。反応液5μLをとり、プロピルアミン100 μL (1.2 mmol)に加えて、残存するC末端活性体をプロピルアミドへ変換させた後、メタノール0.9 mLで希釈した。本溶液をLC/MS分析に付し、LC/MSのピーク面積から変換率を求めた (変換率：100%)。
変換率(%)={Cbz-MeAla-Phe-OtBu(面積%)/[Phe-OtBu(面積%)+Cbz-MeAla-Phe-OtBu(面積%)]}×100
（加水分解処理）
（１）アミン非添加の場合
　上記調製したペプチドを含む反応溶液に5%炭酸カリウム水溶液2.0 mLを加えて25℃で撹拌子にて10分間撹拌を行った。撹拌を停止し、有機層と水層を分層させた。有機層5μLをとり、プロピルアミン100μL (1.2 mmol)に加えて、残存するC末端活性体をプロピルアミドへ変換させた後、メタノール0.9 mLで希釈した。LC/MSのピーク面積値から、以下の計算式に従ってC末端活性体残存率を計算した。
C末端活性体残存率(%)={プロピルアミド(面積%)/[プロピルアミド(面積%)+ジペプチド(面積%)]}×100
（２）アミン添加の場合
　上記調製したペプチドを含む反応溶液にDMAP 96 mg (0.8 mmol)と5%炭酸カリウム水溶液2.0 mLを加えて25℃で撹拌子にて10分間撹拌を行った。撹拌を停止し、有機層と水層を分層させた。有機層5μLをとり、プロピルアミン100μL (1.2 mmol)に加えて、残存するC末端活性体をプロピルアミドへ変換させた後、メタノール0.9 mLで希釈した。LC/MSのピーク面積値から、以下の計算式に従ってC末端活性体残存率を計算した。
C末端活性体残存率(%)={プロピルアミド(面積%)/[プロピルアミド(面積%)+ジペプチド(面積%)]}×100
（後処理）
　撹拌を停止した後、静置し、有機層と水層を分層させて、水層を除去した。次いで有機層を10%硫酸水素カリウム水溶液 2 mLと5%炭酸カリウム水溶液2 mL、常水1 mL×2で順次洗浄した。有機層5 μLをとり、プロピルアミン100μL (1.2 mmol)に加えて、残存するC末端活性体をプロピルアミドへ変換させた後、メタノール0.9 mLで希釈してLC/MS分析に付し、目的とするペプチドと残存C末端活性体(プロピルアミドへの変換体)のピーク面積値を求めた。残った有機層を濃縮し、ペプチドを得た。アミン非添加での加水分解により得られた濃縮物（ペプチド）は387 mgであった (収率114%：濃縮物には不純物(残存C末端活性体)を含むが、ペプチドのみを含むものとして計算した)。アミン添加での加水分解により得られた濃縮物は336 mgであった (収率98%)。MS(ESI)：m/z 385.2 [M-tBu+H]+, 441.3 [M+H]+, 463.3 [M+Na]+。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
 １）LCMSのピーク面積比率
　縮合剤としてDMT-MMを用いた場合、アルカリ水単独処理での加水分解では、残存Ｃ末端活性体が完全に加水分解されず、続く水性洗浄でも残存Ｃ末端活性体を除去できなかったが、DMAPを添加して加水分解を行うと、残存Ｃ末端活性体の加水分解が完全に達成されて、残存Ｃ末端活性体の除去も完全にできることを見出した。このとき、目的のジペプチドが９８．６％の純度で得られた（収率９８％）。含水溶媒中でも使用可能な縮合剤であるDMT-MMから生成するＣ末端活性体は、比較的加水分解を受けにくいことが知られている。しかし、アミン添加剤を使用すれば、DMT-MMを用いて調製された残存Ｃ末端活性体であっても、短時間かつ一度の処理で完全に加水分解し、続く水性洗浄で完全に除去できることを見出した。
参考例１： MeAsp(tBu)-piperidineの合成法
（縮合反応）
　Cbz-MeAsp(tBu)-OHジシクロへキシルアミン塩 10.2 g (19.6 mmol)を酢酸エチル100 mLに縣濁し、ジイソプロピルエチルアミン 20.6 mL (118 mmol)、ピペリジン 9.7 mL (98.0 mmol)を加えた。3～10℃で50%T3P/酢酸エチル溶液 35.0 mL (58.9 mmol)を45分かけて滴下した。滴下終了後、反応液5 μLをとり、メタノール1.0 mLで希釈した溶液をLCMS分析に付し、LC/MSのピーク面積値から反応変換率を求めた (変換率：100%)。
変換率(%)={Cbz-MeAsp(tBu)-piperidine(面積%)/[Cbz-MeAsp(tBu)-OH(面積%)+Cbz-MeAsp(tBu)-piperidine (面積%)]}×100
　反応液を10％硫酸水素カリウム水溶液 100 mL、10%炭酸カリウム 100 mLで洗浄した後、得られた有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過、濃縮した。MS (ESI) m/z 349.1 [M-tBu+H]+、405.2 [M+H]+、427.3 [M+Na]+。
（Cbz脱保護反応）
　上記濃縮液をシクロペンチルメチルエーテル100 mLに溶解し、5%Pd/C (50% wet) 2.0 gと水素ガスにて加水素分解反応に付した。室温で5時間撹拌子、目的物であるMeAsp(tBu)-piperidineを得た（変換率100%）。反応変換率は反応液5 μLをとり、アセトニトリル1.0 mLで希釈した溶液をLCMS分析に付し、LC/MSのピーク面積値から反応変換率を求めた。
変換率(%)={MeAsp(tBu)-piperidine(面積%)/[Cbz-MeAsp(tBu)-piperidine(面積%)+MeAsp(tBu)-piperidine(面積%)]}×100
　反応液をフィルターでろ過した後、ろ液を濃縮し濃縮物5.69 gを得た（収率 quant.）。本濃縮物をLC/MS分析に付し、目的とするMeAsp(tBu)-piperidineのピーク面積パーセントを求めた（99.2面積%）。MS (ESI)：m/z 215.1 [M-tBu+H]+、271.1 [M+H]+。
　本発明は、ペプチド化合物を製造するに際し、縮合反応後に残存したＣ末端活性体を効率的に除去することによって、カラム精製することなく、高純度のペプチド化合物を製造することができる。

Claims (15)

  1. 　ペプチド化合物を製造する方法であって、
    工程Ａ：溶媒中で酸成分のＣ末端活性体をアミン成分と縮合させて得られるペプチド化合物を含む、反応混合液を得る工程、および
    工程Ｂ：前記反応混合液と三級アミンと水または水溶液とを混合し、該Ｃ末端活性体を除去する工程
    を含む、前記方法。
  2. 　前記三級アミンが、前記Ｃ末端活性体に対して求核反応性を有する、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記三級アミンが、窒素近傍の立体障害が小さいアミンである、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　前記三級アミンが、ＮＭＩ、ＤＭＡＰ、またはトリメチルアミンである、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
  5. 　前記ペプチド化合物が、１つまたは複数の非天然アミノ酸を含む、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
  6. 　前記三級アミンを前記Ｃ末端活性体と作用させる際の温度が、２５℃～６０℃である、請求項１～５のいずれかに記載の方法。
  7. 　前記アミン成分に対して、前記三級アミンを０．５当量以上加える、請求項１～６のいずれかに記載の方法。
  8. 　前記Ｃ末端活性体を、前記三級アミンと作用させて加水分解し、除去する、請求項１～７のいずれかに記載の方法。
  9. 　工程Ｂにおいて、前記反応混合液を有機層と水層に分層し、次いで該有機層を洗浄することをさらに含み、該洗浄後のＣ末端活性体の残存量が１．０％以下である、請求項１～８のいずれかに記載の方法。
  10. 　前記工程Ａにおける溶媒が、トルエン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、２－メチルテトラヒドロフラン、酢酸イソプロピル、酢酸エチル、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル、もしくはシクロペンチルメチルエーテル、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドまたはその混合溶媒である、請求項１～９のいずれかに記載の方法。
  11. 　前記工程Ｂにおいて、前記水溶液が炭酸カリウム水溶液または炭酸ナトリウム水溶液である、請求項１～１０のいずれかに記載の方法。
  12. 　酸成分が、アミノ基が保護基で保護された第１のアミノ酸であり、該第１のアミノ酸の側鎖が、１個以上の炭素原子を含む、請求項１～１１のいずれかに記載の方法。
  13. 　前記側鎖が、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよいアルコキシアルキル、置換されていてもよいシクロアルキルアルキル、置換されていてもよいアラルキル、または置換されていてもよいヘテロアリールアルキルである、請求項１２に記載の方法。
  14. 　前記三級アミンを前記Ｃ末端活性体と作用させる際の時間が、２時間以下である、請求項１～１３のいずれかに記載の方法。
  15. 　前記Ｃ末端活性体が縮合剤の存在下で形成され、該縮合剤がＴ３Ｐ、ＨＡＴＵ、ＢＥＰ、ＤＭＴ－ＭＭ、ＥＤＣとＰｆｐＯＨの組み合わせ、ＥＤＣとＨＯＯＢｔの組み合わせ、またはＥＤＣとＨＯＢｔの組み合わせを含む、請求項１～１４のいずれかに記載の方法。
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