KR20220119421A - 펩타이드 화합물의 합성법 - Google Patents

펩타이드 화합물의 합성법 Download PDF

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KR20220119421A
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Abstract

본 발명자들은, 산 성분의 C말단 활성체와 아민 성분을 축합시키는 것을 포함하는 펩타이드 화합물의 합성에 있어서, 축합 반응 후에 잔존한 C말단 활성체를 포함하는 용액을, 3급 아민과 물 또는 수용액과 혼합함으로써, C말단 활성체를 제거할 수 있음을 발견했다.

Description

펩타이드 화합물의 합성법
본 발명은, 펩타이드 화합물의 합성 과정에서 생기는 불필요한 C말단 활성체를 효율적으로 제거하여, 목적하는 펩타이드 화합물을 효율적으로 제조하는 방법에 관한 것이다.
펩타이드 합성은, 그 일 형태로서, 아미노산, 펩타이드 등의 아민류와 반응하여 아마이드 결합 형성을 가능하게 하도록, 아미노산 또는 펩타이드의 C말단 카복실기를 활성화한 화합물을 이용하여 행해진다. 이 경우, 반응 종료 후의 반응 용액에 카복실기가 활성화된 화합물이 잔존하면, 생성된 펩타이드의 품질 저하와 같은 문제를 야기한다.
이와 같은 C말단이 활성화된 화합물이란, 펩타이드 합성 반응에 이용한 카복실기가 활성화된 화합물뿐만 아니라, 그것이 반응 중에서, 예를 들어, 아즐락톤, NCA(N-카복시무수물(N-carboxyanhydride)) 등으로 변화하여 활성화 상태를 가짐으로써 아민류와 반응할 수 있는 화합물도 포함한다(이후, 이들 화합물을 「C말단 활성체」라고 칭하는 경우가 있다). 또한, 펩타이드 합성 반응에 이용하는 C말단 활성체는, 예를 들어, 비특허문헌 1 또는 비특허문헌 2에 기재되어 있는 바와 같은 펩타이드 축합제를 이용하여 합성되는 활성 에스터, 혼합 산 무수물 및 아실아이소유레아 등으로 한정되는 것은 아니고, 아민류와 반응할 수 있도록 활성화되어 있으면, 임의의 화합물이 포함된다.
생성한 펩타이드의 품질 저하의 예로서는, C말단 활성체의 잔존에 기인하여, 불순물 펩타이드의 부생을 초래하는 것이나, 삽입 서열의 펩타이드가 최종 산물의 불순물로서 혼입되는 것이 알려져 있다(특허문헌 1, 2).
이와 같은 잔존 C말단 활성체의 문제를 해소하는 방법으로서, 알칼리수로 처리하여 활성 에스터를 가수분해하고, 대응하는 아미노산의 알칼리 수용액으로서 제거하는 방법이 알려져 있다(특허문헌 1). 그렇지만, 이 방법에서는, 알칼리수로의 가수분해 처리를 복수회 행할 필요가 있어, 조작이 번잡하다. 더하여, 알칼리수로의 처리 횟수가 증가하여, 그 처리 시간이 길어지면, 생성물의 에피메리화(이성화) 등의 부반응을 야기할 것이 추측되어, 견뢰성을 해칠 수 있다.
또한, 잔존 C말단 활성체를 N,N-다이메틸프로페인-1,3-다이아민 등의 1급 아미노기를 갖는 폴리아민으로 포착하여, 염기성 화합물로 변환한 후, 산성 수용액에 의한 수성 세정으로 잔존 C말단 활성체 유래의 아마이드 화합물을 수층으로 이행시켜 제거하는 방법이 알려져 있다(특허문헌 3, 비특허문헌 3). 그렇지만, 구핵성이 높은 1급 아민류를 이용하면, 목적 펩타이드의 구전자성이 높은 부위와 1급 아민이 반응하여, 공유 결합을 형성한 불순물을 발생시킬 것이 추정되기 때문에, 고순도 펩타이드의 합성에는 적합하지 않다.
또한 잔존 C말단 활성체를, 보호기를 갖는 잠재 음이온을 포함하는 아민인 포착제와 반응시켜, 아마이드 화합물로 변환하여 제거하는 방법이 알려져 있다(특허문헌 2). 그렇지만, 이 방법에서는, 아마이드 화합물을 형성시킨 후에, 수성 추출 단계를 거쳐, 수소화 분해를 행한 후에, 추가로 재차의 수성 추출 단계를 거칠 필요가 있기 때문에, 조작이 번잡하다.
또한, C말단 활성체가 잔존하고 있으면, 생성된 펩타이드의 N말단의 보호기를 탈보호할 때에, 해당 C말단 활성체의 N말단의 보호기의 탈보호도 동시에 일어나는 경우가 있다. 잔존 C말단 활성체의 탈보호체는 불순물이지만, 흡광 계수가 작은 경우에는 범용적인 HPLC로 검출하는 것이 곤란하기 때문에, 품질관리상 바람직하지 않다.
일본 특허 제5171613호 공보 일본 특허 제4142907호 공보 일본 특허 제5212371호 공보
Chem. Rev., 2011, 111, 6557. Organic Process Research & Development, 2016, 20, 140. Tetrahedron Lett., 1974, 15, 1785.
본 발명은, 이와 같은 상황에 비추어 이루어진 것으로, 일 국면에 있어서, 펩타이드 화합물의 합성에 있어서, 잔존하는 C말단 활성체를 효율적으로 제거하는 것을 과제로 한다.
본 발명자들은, 산 성분의 C말단 활성체와 아민 성분을 축합시키는 것을 포함하는 펩타이드 화합물의 합성에 있어서, 반응 혼합액 중의 잔존 C말단 활성체를, 3급 아민과 작용시키는 것을 통해서, 제거할 수 있는 수법을 발견했다.
본 발명은, 비한정의 구체적인 일 태양에 있어서 이하를 포함한다.
〔1〕 펩타이드 화합물을 제조하는 방법으로서,
공정 A: 용매 중에서 산 성분의 C말단 활성체를 아민 성분과 축합시켜 얻어지는 펩타이드 화합물을 포함하는, 반응 혼합액을 얻는 공정, 및
공정 B: 상기 반응 혼합액과 3급 아민과 물 또는 수용액을 혼합하여, 해당 C말단 활성체를 제거하는 공정
을 포함하는, 상기 방법.
〔2〕 펩타이드 화합물을 제조하는 방법으로서,
공정 A: 용매 중에서 산 성분의 C말단 활성체를 아민 성분과 축합시켜 얻어지는 펩타이드 화합물을 포함하는, 반응 혼합액을 얻는 공정, 및
공정 B: 상기 반응 혼합액과 3급 아민과 물 또는 수용액을 혼합하여, 해당 3급 아민을 미반응의 C말단 활성체와 작용시키는 것을 통해서 해당 C말단 활성체를 제거하는 공정
을 포함하는, 상기 방법.
〔3〕 산 성분이, 아미노기가 보호기로 보호된 제 1 아미노산, 또는 N말단의 아미노기가 보호기로 보호된 제 1 펩타이드인, 〔1〕 또는 〔2〕에 기재된 방법.
〔4〕 아민 성분이, 카복실기가 보호기로 보호된 제 2 아미노산, 또는 C말단의 카복실기가 보호기로 보호된 제 2 펩타이드인, 〔1〕∼〔3〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔5〕 공정 A가 축합제의 존재하에서 행해지는, 〔1〕∼〔4〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔6〕 상기 3급 아민이, 상기 C말단 활성체에 대해서 구핵 반응성을 갖는, 〔1〕∼〔5〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔7〕 상기 3급 아민이, 질소 근방의 입체 장애가 작은 아민인, 〔1〕∼〔6〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔8〕 상기 3급 아민이, 하기 식(A), (B), 또는 (C)로 표시되고:
Figure pct00001
식 중,
R1∼R3은, (i) R1 및 R2가 그들이 결합하고 있는 질소 원자와 하나로 되어 5∼6원 비방향족 헤테로환을 형성하고, 또한 R3이 C1-C2 알킬 또는 C2 하이드록시알킬이거나, 또는 (ii) 각각 독립적으로, C1-C2 알킬, 혹은 C2 하이드록시알킬이고,
X는, N 또는 O이고,
R4 및 R5는, 각각 독립적으로, C1-C2 알킬, 혹은 C2 하이드록시알킬이거나, 또는 그들이 결합하고 있는 질소 원자와 하나로 되어 5∼6원 비방향족 헤테로환을 형성하고, 단, X가 O인 경우, R5는 존재하지 않고,
R6 및 R7은, 각각 독립적으로, H, C1-C2 알킬, 또는 메톡시이고,
R8 및 R9는, 각각 독립적으로, H, C1-C2 알킬, 혹은 C2 하이드록시알킬이거나, 또는 R8이 결합하고 있는 질소 원자 및 R9가 결합하고 있는 탄소 원자와 하나로 되어 5∼6원 비방향족 헤테로환을 형성하는, 〔1〕∼〔7〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔9〕 R1∼R3이, 각각 독립적으로, C1-C2 알킬인, 〔8〕에 기재된 방법.
〔10〕 X가 N이고, R4 및 R5가, 각각 독립적으로, C1-C2 알킬이고, R6 및 R7이 H인, 〔8〕에 기재된 방법.
〔11〕 R8 및 R9가, 각각 독립적으로, H 또는 C1-C2 알킬인, 〔8〕에 기재된 방법.
〔12〕 상기 3급 아민이, NMI, DMAP, 또는 트라이메틸아민인, 〔1〕∼〔11〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔13〕 상기 펩타이드 화합물이, 1개 또는 복수의 비천연 아미노산을 포함하는, 〔1〕∼〔12〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔14〕 상기 3급 아민을 상기 C말단 활성체와 작용시킬 때의 온도가, 25℃∼60℃인, 〔1〕∼〔13〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔15〕 상기 아민 성분에 대해서, 상기 3급 아민을 0.5당량 이상 가하는, 〔1〕∼〔14〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔16〕 C말단 활성체의 잔존율이 3% 이하인, 〔1〕∼〔15〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔17〕 공정 B에 있어서, 상기 반응 혼합액을 유기층과 수층으로 분층하고, 그 다음에 해당 유기층을 세정하는 것을 추가로 포함하고, 해당 세정 후의 C말단 활성체의 잔존량이 1.0% 이하인, 〔1〕∼〔16〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔18〕 상기 공정 A에 있어서의 용매가, 톨루엔, 아세토나이트릴, 테트라하이드로퓨란, 2-메틸테트라하이드로퓨란, 아세트산 아이소프로필, 아세트산 에틸, 메틸 tert-뷰틸 에터, 사이클로펜틸 메틸 에터, 혹은 N,N-다이메틸폼아마이드, 또는 그의 혼합 용매인, 〔1〕∼〔17〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔19〕 상기 공정 B에 있어서, 상기 수용액이 알칼리 수용액인, 〔1〕∼〔18〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔20〕 제 1 아미노산의 측쇄가, 1개 이상의 탄소 원자를 포함하는, 〔1〕∼〔19〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔21〕 상기 측쇄가, 치환되어 있어도 되는 알킬, 치환되어 있어도 되는 알켄일, 치환되어 있어도 되는 알킨일, 치환되어 있어도 되는 사이클로알킬, 치환되어 있어도 되는 알콕시알킬, 치환되어 있어도 되는 사이클로알킬알킬, 치환되어 있어도 되는 아르알킬, 또는 치환되어 있어도 되는 헤테로아릴알킬인, 〔20〕에 기재된 방법.
〔22〕 상기 3급 아민을 상기 C말단 활성체와 작용시킬 때의 시간이, 2시간 이하인, 〔1〕∼〔21〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔23〕 상기 3급 아민을 상기 C말단 활성체와 작용시킬 때의 시간이, 2분∼2시간인, 〔1〕∼〔22〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔24〕 상기 3급 아민을 상기 C말단 활성체와 작용시킬 때의 시간이, 5분∼60분인, 〔1〕∼〔23〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔25〕 상기 3급 아민을 상기 C말단 활성체와 작용시킬 때의 시간이, 5분∼50분인, 〔1〕∼〔24〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔26〕 상기 C말단 활성체가 축합제의 존재하에서 형성되고, 해당 축합제가 T3P, HATU, BEP, DMT-MM, EDC와 PfpOH의 조합, EDC와 HOOBt의 조합, 또는 EDC와 HOBt의 조합을 포함하는, 〔1〕∼〔25〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔27〕 공정 C: 상기 펩타이드 화합물의 N말단의 보호기를 탈보호하는 공정을 추가로 포함하는, 〔1〕∼〔26〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔28〕 상기 C말단 활성체를, 상기 3급 아민과 작용시켜 가수분해하여, 제거하는, 〔1〕∼〔27〕에 기재된 방법.
〔29〕 잔존 C말단 활성체를 포함하는 용액에 3급 아민과 물 또는 수용액을 추가하여, 해당 C말단 활성체를 3급 아민과 작용시키는 공정을 포함하는, 해당 C말단 활성체의 가수분해를 촉진하는 방법.
〔30〕 잔존 C말단 활성체의 가수분해체를 포함하는 용액을 수성 세정하는 공정을 포함하는, 해당 가수분해체를 제거하는 방법.
본 발명의 방법을 이용함으로써, 축합 반응 후에 잔존하고 있는 C말단 활성체를, 1회의 가수분해 처리와 그것에 계속되는 수성 세정에 의해, 간편하게 또한 단시간에 효율적으로 제거할 수 있기 때문에, 컬럼 정제하지 않고, 펩타이드 화합물을 순도 좋게 합성할 수 있다.
[도 1] C말단 활성체의 잔존량 상대치를 나타내는 도면이다.
[도 2] C말단 활성체의 잔존량 상대치를 나타내는 도면이다.
[도 3] C말단 활성체의 잔존량 상대치를 나타내는 도면이다.
[도 4] C말단 활성체의 잔존율의 추이를 나타내는 도면이다.
이하에, 본 개시의 바람직한 비한정적인 실시태양을 설명한다.
후술하는 본 실시예에 기재되는 모든 요소(element)는, 본 특허출원의 권리화를 의도하는 국가에 있어서의, 실시예에 기재된 내용을 한정적으로 해석하려고 할 수 있는 어떠한 특허 실무, 관습, 법령 등의 제한에 얽매이지 않고, 본 「발명을 실시하기 위한 구체적인 내용」에 있어서도 동등하게 기재되어 있다고 당연하게 간주될 것을 의도하여 기재된다.
본 개시에 있어서의 어느 것인가에 기재된 1 또는 복수의 요소(element)의 일부 또는 전부를 임의로 조합한 것도, 당업자의 기술 상식에 기초하여 기술적으로 모순되지 않는 한, 본 개시에 포함되는 것이 의도되고, 또한, 당업자에게는 당연하게 이해되는 것으로서 기재된다.
(약어)
본 명세서에 있어서 사용되는 약어를 이하에 기재한다.
아미노산의 약어
Aib: α-메틸알라닌
Ala: 알라닌
Arg: 아르기닌
Asn: 아스파라긴
Asp: 아스파라긴산
Asp(tBu): O-t-뷰틸아스파라긴산
Aze: 아제티딘-2-카복실산
Cys: 시스테인
Glu: 글루타민산
Gln: 글루타민
Gly: 글리신
His: 히스티딘
Hph: 호모페닐알라닌
Ile: 아이소류신
Leu: 류신
Lys: 리신
MeAla: N-메틸알라닌
MeAsp(tBu): N-메틸-O-t-뷰틸아스파라긴산
MeGly: N-메틸글리신
MeIle: N-메틸아이소류신
MeLeu: N-메틸류신
MePhe: N-메틸페닐알라닌
MeVal: N-메틸발린
Met: 메티오닌
Phe: 페닐알라닌
Phe-OtBu: O-t-뷰틸페닐알라닌
Phe(3-F): 3-플루오로페닐알라닌
Pro: 프롤린
Ser: 세린
Ser(tBu): O-t-뷰틸세린
Thr: 트레오닌
Thr(tBu): O-t-뷰틸-트레오닌
Trp: 트립토판
Tyr: 티로신
Val: 발린
시약/용매의 약어
BEP: 테트라플루오로붕산 2-브로모-1-에틸피리디늄
DABCO: 1,4-다이아자바이사이클로[2.2.2]옥테인
DBU: 1,8-다이아자바이사이클로[5.4.0]운데크-7-엔
DCM: 다이클로로메테인
DIPEA: 다이아이소프로필다이에틸아민
DMAP: 다이메틸아미노피리딘
DMT-MM: 4-(4,6-다이메톡시-1,3,5-트라이아진-2-일)-4-메틸모폴리늄 클로라이드
EDC: 1-(3-다이메틸아미노프로필)-3-에틸카보다이이미드
HATU: O-(7-아자벤조트라이아졸-1-일)-N,N,N＇,N＇-테트라메틸유로늄 헥사플루오로인산염
HOAt: 1-아자하이드록시벤조트라이아졸
HOBt: 1-하이드록시벤조트라이아졸
HOOBt: 3,4-다이하이드로-3-하이드록시-4-옥소-1,2,3-벤조트라이아진
HOSu: N-하이드록시석신이미드
MTBE: 메틸-t-뷰틸 에터
NMI: N-메틸이미다졸
NMM: N-메틸모폴린
T3P: 프로필포스폰산 무수물(환상 트라이머)
TBAF: 테트라뷰틸암모늄 플루오라이드
TsOH: p-톨루엔설폰산
작용기의 약어
Bn: 벤질
Boc: t-뷰톡시카보닐
Cbz: 벤질옥시카보닐
Pfp: 펜타플루오로페닐
Teoc: 2-(트라이메틸실릴)에톡시카보닐
(작용기 등의 정의)
본 명세서에 있어서의 「할로젠 원자」로서는, F, Cl, Br 또는 I가 예시된다.
본 명세서에 있어서 「알킬」이란, 지방족 탄화수소로부터 임의의 수소 원자를 1개 제거하여 유도되는 1가의 기이며, 골격 중에 헤테로원자(탄소 및 수소 원자 이외의 원자를 말한다.) 또는 불포화의 탄소-탄소 결합을 함유하지 않고, 수소 및 탄소 원자를 함유하는 하이드로카빌 또는 탄화수소기 구조의 부분 집합을 갖는다. 알킬은 직쇄상의 것뿐만 아니라, 분지쇄상의 것도 포함한다. 알킬로서 구체적으로는, 탄소 원자수 1∼20(C1-C20, 이하 「Cp-Cq」란 탄소 원자수가 p∼q개인 것을 의미한다)의 알킬이며, 바람직하게는 C1-C10 알킬, 보다 바람직하게는 C1-C6 알킬, 더 바람직하게는 C1-C2 알킬을 들 수 있다. 알킬로서 구체적으로는, 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, n-뷰틸, s-뷰틸, t-뷰틸, 아이소뷰틸(2-메틸프로필), n-펜틸, s-펜틸(1-메틸뷰틸), t-펜틸(1,1-다이메틸프로필), 네오펜틸(2,2-다이메틸프로필), 아이소펜틸(3-메틸뷰틸), 3-펜틸(1-에틸프로필), 1,2-다이메틸프로필, 2-메틸뷰틸, n-헥실, 1,1,2-트라이메틸프로필, 1,2,2-트라이메틸프로필, 1,1,2,2-테트라메틸프로필, 1,1-다이메틸뷰틸, 1,2-다이메틸뷰틸, 1,3-다이메틸뷰틸, 2,2-다이메틸뷰틸, 2,3-다이메틸뷰틸, 3,3-다이메틸뷰틸, 1-에틸뷰틸, 2-에틸뷰틸 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서 「알켄일」이란, 적어도 1개의 이중 결합(2개의 인접 SP2 탄소 원자)을 갖는 1가의 기이다. 이중 결합 및 치환분(존재하는 경우)의 배치에 따라, 이중 결합의 기하학적 형태는, 엔트게이겐(E) 또는 추잠멘(Z), 시스 또는 트랜스 배치를 취할 수 있다. 알켄일은, 직쇄상의 것뿐만 아니라, 분지쇄상의 것도 포함한다. 알켄일로서 바람직하게는 C2-C10 알켄일, 보다 바람직하게는 C2-C6 알켄일을 들 수 있고, 구체적으로는, 예를 들어, 바이닐, 알릴, 1-프로펜일, 2-프로펜일, 1-뷰텐일, 2-뷰텐일(시스, 트랜스를 포함한다), 3-뷰텐일, 펜텐일, 3-메틸-2-뷰텐일, 헥센일 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서 「알킨일」이란, 적어도 1개의 삼중 결합(2개의 인접 SP탄소 원자)을 갖는, 1가의 기이다. 알킨일은, 직쇄상의 것뿐만 아니라, 분지쇄상의 것도 포함한다. 알킨일로서 바람직하게는 C2-C10 알킨일, 보다 바람직하게는 C2-C6 알킨일을 들 수 있고, 구체적으로는, 예를 들어, 에틴일, 1-프로핀일, 프로파길, 3-뷰틴일, 펜틴일, 헥신일, 3-페닐-2-프로핀일, 3-(2'-플루오로페닐)-2-프로핀일, 2-하이드록시-2-프로핀일, 3-(3-플루오로페닐)-2-프로핀일, 3-메틸-(5-페닐)-4-펜틴일 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서 「사이클로알킬」이란, 포화 또는 부분적으로 포화된 환상의 1가의 지방족 탄화수소기를 의미하고, 단환, 바이사이클로환, 스파이로환을 포함한다. 사이클로알킬로서 바람직하게는 C3-C8 사이클로알킬을 들 수 있고, 구체적으로는, 예를 들어, 사이클로프로필, 사이클로뷰틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헵틸, 사이클로옥틸, 바이사이클로[2.2.1]헵틸, 스파이로[3.3]헵틸 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서 「아릴」이란, 1가의 방향족 탄화수소환을 의미하고, 바람직하게는 C6-C10 아릴을 들 수 있다. 아릴로서 구체적으로는, 예를 들어, 페닐, 나프틸(예를 들어, 1-나프틸, 2-나프틸) 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서 「헤테로사이클릴」이란, 탄소 원자에 더하여 1∼5개의 헤테로원자를 함유하는, 비방향족의 환상의 1가의 기를 의미한다. 헤테로사이클릴은, 환 중에 이중 및 또는 삼중 결합을 갖고 있어도 되고, 환 중의 탄소 원자는 산화되어 카보닐을 형성해도 되고, 단환이어도 축합환이어도 된다. 환을 구성하는 원자의 수는 바람직하게는 4∼10이며(4∼10원 헤테로사이클릴), 보다 바람직하게는 4∼7이다(4∼7원 헤테로사이클릴). 헤테로사이클릴로서는 구체적으로는, 예를 들어, 아제티딘일, 옥시란일, 옥세탄일, 아제티딘일, 다이하이드로퓨릴, 테트라하이드로퓨릴, 다이하이드로피란일, 테트라하이드로피란일, 테트라하이드로피리딜, 테트라하이드로피리미딜, 모폴린일, 싸이오모폴린일, 피롤리딘일, 피페리딘일, 피페라진일, 피라졸리딘일, 이미다졸린일, 이미다졸리딘일, 옥사졸리딘일, 아이소옥사졸리딘일, 싸이아졸리딘일, 아이소싸이아졸리딘일, 1,2-싸이아지네인, 싸이아다이아졸리딘일, 아제티딘일, 옥사졸리돈, 벤조다이옥산일, 벤즈옥사졸릴, 다이옥솔란일, 다이옥산일, 테트라하이드로피롤로[1,2-c]이미다졸, 싸이에탄일, 3,6-다이아자바이사이클로[3.1.1]헵탄일, 2,5-다이아자바이사이클로[2.2.1]헵탄일, 3-옥소-8-아자바이사이클로[3.2.1]옥탄일, 설탐, 2-옥사스파이로[3.3]헵틸 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서 「헤테로아릴」이란, 탄소 원자에 더하여 1∼5개의 헤테로원자를 함유하는, 방향족성의 환상의 1가의 기를 의미한다. 환은 단환이어도, 다른 환과의 축합환이어도 되고, 부분적으로 포화되어 있어도 된다. 환을 구성하는 원자의 수는 바람직하게는 5∼10(5∼10원 헤테로아릴)이며, 보다 바람직하게는 5∼7(5∼7원 헤테로아릴)이다. 헤테로아릴로서 구체적으로는, 예를 들어, 퓨릴, 싸이엔일, 피롤릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 싸이아졸릴, 아이소싸이아졸릴, 옥사졸릴, 아이속사졸릴, 옥사다이아졸릴, 싸이아다이아졸릴, 트라이아졸릴, 테트라졸릴, 피리딜, 피리미딜, 피리다진일, 피라진일, 트라이아진일, 벤조퓨란일, 벤조싸이엔일, 벤조싸이아다이아졸릴, 벤조싸이아졸릴, 벤즈옥사졸릴, 벤즈옥사다이아졸릴, 벤즈이미다졸릴, 인돌릴, 아이소인돌릴, 인다졸릴, 퀴놀릴, 아이소퀴놀릴, 신놀린일, 퀴나졸린일, 퀴녹살린일, 벤조다이옥솔릴, 인돌리진일, 이미다조피리딜 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서 「알콕시」란, 상기 정의의 「알킬」이 결합한 옥시기를 의미하고, 바람직하게는 C1-C6 알콕시를 들 수 있다. 알콕시로서 구체적으로는, 예를 들어, 메톡시, 에톡시, 1-프로폭시, 2-프로폭시, n-뷰톡시, i-뷰톡시, s-뷰톡시, t-뷰톡시, 펜틸옥시, 3-메틸뷰톡시 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서 「알켄일옥시」란, 상기 정의의 「알켄일」이 결합한 옥시기를 의미하고, 바람직하게는 C2-C6 알켄일옥시를 들 수 있다. 알켄일옥시로서 구체적으로는, 예를 들어, 바이닐옥시, 알릴옥시, 1-프로펜일옥시, 2-프로펜일옥시, 1-뷰텐일옥시, 2-뷰텐일옥시(시스, 트랜스를 포함한다), 3-뷰텐일옥시, 펜텐일옥시, 헥센일옥시 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서 「사이클로알콕시」란, 상기 정의의 「사이클로알킬」이 결합한 옥시기를 의미하고, 바람직하게는 C3-C8 사이클로알콕시를 들 수 있다. 사이클로알콕시로서 구체적으로는, 예를 들어, 사이클로프로폭시, 사이클로뷰톡시, 사이클로펜틸옥시 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서 「아릴옥시」란, 상기 정의의 「아릴」이 결합한 옥시기를 의미하고, 바람직하게는 C6-C10 아릴옥시를 들 수 있다. 아릴옥시로서 구체적으로는, 예를 들어, 페녹시, 1-나프틸옥시, 2-나프틸옥시 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서 「아미노」란, 협의로는 -NH2를 의미하고, 광의로는 -NRR＇를 의미하고, 여기에서 R 및 R＇는 독립적으로, 수소, 알킬, 알켄일, 알킨일, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 아릴, 또는 헤테로아릴로부터 선택되거나, 혹은 R 및 R＇는 그들이 결합하고 있는 질소 원자와 하나로 되어 환을 형성한다. 아미노로서 바람직하게는, -NH2, 모노C1-C6 알킬아미노, 다이C1-C6 알킬아미노, 4∼8원 환상 아미노 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서 「모노알킬아미노」란, 상기 정의의 「아미노」 중, R이 수소이며, 또한 R＇가 상기 정의의 「알킬」인 기를 의미하고, 바람직하게는, 모노C1-C6 알킬아미노를 들 수 있다. 모노알킬아미노로서 구체적으로는, 예를 들어, 메틸아미노, 에틸아미노, n-프로필아미노, i-프로필아미노, n-뷰틸아미노, s-뷰틸아미노, t-뷰틸아미노 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서 「다이알킬아미노」란, 상기 정의의 「아미노」 중, R 및 R＇가 독립적으로 상기 정의의 「알킬」인 기를 의미하고, 바람직하게는, 다이C1-C6 알킬아미노를 들 수 있다. 다이알킬아미노로서 구체적으로는, 예를 들어, 다이메틸아미노, 다이에틸아미노 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서 「환상 아미노」란, 상기 정의의 「아미노」 중, R 및 R＇는 그들이 결합하고 있는 질소 원자와 하나로 되어 환을 형성하는 기를 의미하고, 바람직하게는, 4∼8원 환상 아미노를 들 수 있다. 환상 아미노로서 구체적으로는, 예를 들어, 1-아제티딜, 1-피롤리딜, 1-피페리딜, 1-피페라질, 4-모폴린일, 3-옥사졸리딜, 1,1-다이옥사이도싸이오모폴린일-4-일, 3-옥소-8-아자바이사이클로[3.2.1]옥탄-8-일 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서의 「하이드록시알킬」이란, 상기 정의의 「알킬」의 하나, 또는 복수의 수소가 수산기로 치환된 기를 의미하고, C1-C6 하이드록시알킬이 바람직하고, C2 하이드록시알킬이 보다 바람직하다. 하이드록시알킬로서 구체적으로는, 예를 들어, 하이드록시메틸, 1-하이드록시에틸, 2-하이드록시에틸, 2-하이드록시-2-메틸프로필, 5-하이드록시펜틸 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서의 「할로알킬」이란, 상기 정의의 「알킬」의 1개 또는 복수의 수소가 할로젠으로 치환된 기를 의미하고, C1-C6 할로알킬이 바람직하고, C1-C6 플루오로알킬이 보다 바람직하다. 할로알킬로서 구체적으로는, 예를 들어, 다이플루오로메틸, 트라이플루오로메틸, 2,2-다이플루오로에틸, 2,2,2-트라이플루오로에틸, 3,3-다이플루오로프로필, 4,4-다이플루오로뷰틸, 5,5-다이플루오로펜틸 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서의 「사이아노알킬」이란, 상기 정의의 「알킬」의 1개 또는 복수의 수소가 사이아노로 치환된 기를 의미하고, C1-C6 사이아노알킬이 바람직하다. 사이아노알킬로서 구체적으로는, 예를 들어, 사이아노메틸, 2-사이아노에틸 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서의 「아미노알킬」이란, 상기 정의의 「알킬」의 1개 또는 복수의 수소가 상기 정의의 「아미노」로 치환된 기를 의미하고, C1-C6 아미노알킬이 바람직하다. 아미노알킬로서 구체적으로는, 예를 들어, 1-피리딜메틸, 2-(1-피페리딜)에틸, 3-(1-피페리딜)프로필, 4-아미노뷰틸 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서의 「카복시알킬」이란, 상기 정의의 「알킬」의 1개 또는 복수의 수소가 카복시로 치환된 기를 의미하고, C2-C6 카복시알킬이 바람직하다. 카복시알킬로서 구체적으로는, 예를 들어, 카복시메틸 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서의 「알켄일옥시카보닐알킬」이란, 상기 정의의 「알킬」의 1개 또는 복수의 수소가 상기 정의의 「알켄일옥시카보닐」로 치환된 기를 의미하고, C2-C6 알켄일옥시카보닐C1-C6 알킬이 바람직하고, C2-C6 알켄일옥시카보닐C1-C2 알킬이 보다 바람직하다. 알켄일옥시카보닐알킬로서 구체적으로는, 예를 들어, 알릴옥시카보닐메틸, 2-(알릴옥시카보닐)에틸 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서의 「알콕시알킬」이란, 상기 정의의 「알킬」의 1개 또는 복수의 수소가 상기 정의의 「알콕시」로 치환된 기를 의미하고, C1-C6 알콕시C1-C6 알킬이 바람직하고, C1-C6 알콕시C1-C2 알킬이 보다 바람직하다. 알콕시알킬로서 구체적으로는, 예를 들어, 메톡시메틸, 에톡시메틸, 1-프로폭시메틸, 2-프로폭시메틸, n-뷰톡시메틸, i-뷰톡시메틸, s-뷰톡시메틸, t-뷰톡시메틸, 펜틸옥시메틸, 3-메틸뷰톡시메틸, 1-메톡시에틸, 2-메톡시에틸, 2-에톡시에틸 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서의 「사이클로알킬알킬」이란, 상기 정의의 「알킬」의 1개 또는 복수의 수소가 상기 정의의 「사이클로알킬」로 치환된 기를 의미하고, C3-C8 사이클로알킬C1-C6 알킬이 바람직하고, C3-C6 사이클로알킬C1-C2 알킬이 보다 바람직하다. 사이클로알킬알킬로서 구체적으로는, 예를 들어, 사이클로프로필메틸, 사이클로뷰틸메틸, 사이클로펜틸메틸, 사이클로헥실메틸 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서의 「사이클로알콕시알킬」이란, 상기 정의의 「알킬」의 1개 또는 복수의 수소가 상기 정의의 「사이클로알콕시」로 치환된 기를 의미하고, C3-C8 사이클로알콕시C1-C6 알킬이 바람직하고, C3-C6 사이클로알콕시C1-C2 알킬이 보다 바람직하다. 사이클로알콕시알킬로서 구체적으로는, 예를 들어, 사이클로프로폭시메틸, 사이클로뷰톡시메틸 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서의 「헤테로사이클릴알킬」이란, 상기 정의의 「알킬」의 1개 또는 복수의 수소가 상기 정의의 「헤테로사이클릴」로 치환된 기를 의미하고, 4∼7원 헤테로사이클릴C1-C6 알킬이 바람직하고, 4∼7원 헤테로사이클릴C1-C2 알킬이 보다 바람직하다. 헤테로사이클릴알킬로서 구체적으로는, 예를 들어, 2-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)에틸, 2-(아제티딘-3-일)에틸 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서의 「알킬설폰일알킬」이란, 상기 정의의 「알킬」의 1개 또는 복수의 수소가 상기 정의의 「알킬설폰일」로 치환된 기를 의미하고, C1-C6 알킬설폰일C1-C6 알킬이 바람직하고, C1-C6 알킬설폰일C1-C2 알킬이 보다 바람직하다. 알킬설폰일알킬로서 구체적으로는, 예를 들어, 메틸설폰일메틸, 2-(메틸설폰일)에틸 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서의 「아미노카보닐알킬」이란, 상기 정의의 「알킬」의 1개 또는 복수의 수소가 상기 정의의 「아미노카보닐」로 치환된 기를 의미하고, 아미노카보닐C1-C6 알킬이 바람직하고, 아미노카보닐C1-C4 알킬이 보다 바람직하다. 아미노카보닐알킬로서 구체적으로는, 예를 들어, 메틸아미노카보닐메틸, 다이메틸아미노카보닐메틸, t-뷰틸아미노카보닐메틸, 1-아제티딘일카보닐메틸, 1-피롤리딘일카보닐메틸, 1-피페리딘일카보닐메틸, 4-모폴린일카보닐메틸, 2-(메틸아미노카보닐)에틸, 2-(다이메틸아미노카보닐)에틸, 2-(1-아제티딘일카보닐)에틸, 2-(1-피롤리딘일카보닐)에틸, 2-(4-모폴린일카보닐)에틸, 3-(다이메틸아미노카보닐)프로필, 4-(다이메틸아미노카보닐)뷰틸 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서의 「아릴옥시알킬」이란, 상기 정의의 「알킬」의 1개 또는 복수의 수소가 상기 정의의 「아릴옥시」로 치환된 기를 의미하고, C6-C10 아릴옥시C1-C6 알킬이 바람직하고, C6-C10 아릴옥시C1-C2 알킬이 보다 바람직하다. 아릴옥시알킬로서 구체적으로는, 예를 들어, 페녹시메틸, 2-페녹시에틸 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서 「아르알킬(아릴알킬)」이란, 상기 정의의 「알킬」이 적어도 하나의 수소 원자가 상기 정의의 「아릴」로 치환된 기를 의미하고, C7-C14 아르알킬이 바람직하고, C7-C10 아르알킬이 보다 바람직하다. 아르알킬로서 구체적으로는, 예를 들어, 벤질, 펜에틸, 3-페닐프로필 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서 「헤테로아릴알킬」이란, 상기 정의의 「알킬」이 적어도 하나의 수소 원자가 상기 정의의 「헤테로아릴」로 치환된 기를 의미하고, 5∼10원 헤테로아릴C1-C6 알킬이 바람직하고, 5∼10원 헤테로아릴C1-C2 알킬이 보다 바람직하다. 헤테로아릴알킬로서 구체적으로는, 예를 들어, 3-싸이엔일메틸, 4-싸이아졸릴메틸, 2-피리딜메틸, 3-피리딜메틸, 4-피리딜메틸, 2-(2-피리딜)에틸, 2-(3-피리딜)에틸, 2-(4-피리딜)에틸, 2-(6-퀴놀릴)에틸, 2-(7-퀴놀릴)에틸, 2-(6-인돌릴)에틸, 2-(5-인돌릴)에틸, 2-(5-벤조퓨란일)에틸 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서의 「비방향족 헤테로환」이란, 환을 구성하는 원자 중에 1∼5개의 헤테로원자를 함유하는, 비방향족성의 헤테로환을 의미한다. 비방향족 헤테로환은, 환 중에 이중 및 또는 삼중 결합을 갖고 있어도 되고, 환 중의 탄소 원자는 산화되어 카보닐을 형성해도 된다. 또한 비방향족 헤테로환은, 단환이어도, 축합환이어도, 스파이로환이어도 된다. 환을 구성하는 원자의 수는 한정되지 않지만, 바람직하게는 5∼6이다(5∼6원 비방향족 헤테로환). 비방향족 헤테로환으로서 구체적으로는, 예를 들어, 아제티딘, 옥세테인, 싸이에테인, 피롤리딘, 테트라하이드로퓨란, 테트라하이드로싸이오펜, 이미다졸리딘, 피라졸리딘, 옥사졸리딘, 아이속사졸리딘, 싸이아졸리딘, 아이소싸이아졸리딘, 다이옥솔레인, 다이싸이오레인, 피페리딘, 테트라하이드로피란, 싸이에인, 피페라진, 모폴린, 싸이오모폴린, 다이옥세인, 다이싸이에인, 아제페인, 옥세페인, 싸이에페인, 다이아제페인 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서, 「펩타이드쇄」란, 1, 2, 3, 4, 또는 그 이상의 천연 아미노산 및/또는 비천연 아미노산이 아마이드 결합 및/또는 에스터 결합에 의해 연결되어 있는 펩타이드쇄를 말한다.
본 명세서에 있어서 「치환되어 있어도 되는」이란, 어느 기가 임의의 치환기에 의해 치환되어 있어도 됨을 의미한다.
본 명세서에 있어서 「1개 또는 복수의」란, 1개 또는 2개 이상의 수를 의미한다. 「1개 또는 복수의」가, 어느 기의 치환기에 관련되는 문맥에서 이용되는 경우, 이 용어는, 1개로부터 그 기가 허용하는 치환기의 최대수까지의 수를 의미한다. 「1개 또는 복수의」로서 구체적으로는, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 및/또는 그보다 큰 수를 들 수 있다.
본 명세서에 있어서 「C말단 활성체」란, 펩타이드 합성 반응에 이용되는 카복실기가 활성화된 화합물(예를 들어, 목적 펩타이드 화합물의 제조로 연결되는 활성 에스터)뿐만 아니라, 그것이 반응 중에서, 예를 들어, 아즐락톤, NCA(N-카복시무수물(N-carboxyanhydride)) 등으로 변화하여 활성화 상태를 가짐으로써 아민류(예를 들어, 아민 성분)와 반응하여, 목적 펩타이드 화합물을 제공할 수 있는 화합물도 포함한다. 또한, 펩타이드 합성 반응에 이용하는 카복실기가 활성화된 화합물인 C말단 활성체는, 예를 들어, Chem. Rev., 2011, 111, 6557. 또는 Organic Process Research & Development, 2016, 20 (2), 140.에 기재되어 있는 바와 같은 펩타이드 축합제를 이용하여 합성되는 활성 에스터, 혼합 산 무수물 및 아실아이소유레아 등으로 한정되는 것은 아니고, 아민류와 반응할 수 있도록 활성화되어 있는, 임의의 화합물이 포함된다.
본 명세서에 있어서 「활성 에스터」란, 아미노기와 반응하여 아마이드 결합을 형성하는 카보닐기를 포함하는 화합물로서, 해당 카보닐기에, 예를 들어 OBt, OAt, OSu, OPfp 등이 결합한 화합물이며, 아민과의 반응이 촉진되는 화합물이다.
본 명세서에 있어서의 「아미노산」에는, 천연 아미노산, 및 비천연 아미노산이 포함된다. 본 명세서에 있어서의 「천연 아미노산」이란, Gly, Ala, Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, His, Glu, Asp, Gln, Asn, Cys, Met, Lys, Arg, Pro를 가리킨다. 비천연 아미노산은 특별히 한정되지 않지만, β-아미노산, γ-아미노산, D형 아미노산, N치환 아미노산, α,α-이치환 아미노산, 측쇄가 천연과 상이한 아미노산, 하이드록시카복실산 등이 예시된다. 본 명세서에 있어서의 아미노산으로서는, 임의의 입체 배치가 허용된다. 아미노산의 측쇄의 선택은 특별히 제한을 마련하지 않지만, 수소 원자 외에도 예를 들어 알킬기, 알켄일기, 알킨일기, 아릴기, 헤테로아릴기, 아르알킬기, 사이클로알킬기로부터 자유롭게 선택되고, 이들 기 중의 인접하지 않는 1 또는 2개의 메틸렌기는 산소 원자, 카보닐기(-CO-), 또는 설폰일기(-SO2-), 포스포릴기, 포스폰일기로 치환되어 있어도 된다. 각각은 치환기가 부여되어 있어도 되고, 그들 치환기도 제한되지 않고, 예를 들어, 할로젠 원자, O 원자, S 원자, N 원자, B 원자, Si 원자, 또는 P 원자를 포함하는 임의의 치환기 중에서 독립적으로 1개 또는 2개 이상 자유롭게 선택되어도 된다. 즉, 치환되어 있어도 되는 알킬기, 알켄일기, 알킨일기, 아릴기, 헤테로아릴기, 아르알킬기, 사이클로알킬기 등이 예시된다. 비한정의 일 태양에 있어서, 본 명세서에 있어서의 아미노산은, 동일 분자 내에 카복시기와 아미노기를 갖는 화합물이어도 된다.
아미노산의 주쇄 아미노기는, 비치환(NH2기)이어도 되고, 치환되어 있어도 된다(즉, -NHR기: R은 치환기를 갖고 있어도 되는 알킬, 알켄일, 알킨일, 아릴, 헤테로아릴, 아르알킬, 사이클로알킬을 나타내고, 이들 기 중의 인접하지 않는 1 또는 2개의 메틸렌기는 산소 원자, 카보닐기(-CO-), 또는 설폰일기(-SO2-)로 치환되어 있어도 되고, 또한 프롤린과 같이 N 원자에 결합한 탄소쇄와 α위의 탄소 원자가 환을 형성하고 있어도 된다. 이와 같은 주쇄 아미노기가 치환되어 있는 아미노산을, 본 명세서에 있어서 「N치환 아미노산」이라고 칭한다. 본 명세서에 있어서의 「N치환 아미노산」으로서는, 바람직하게는 N-알킬아미노산, N-C1-C6 알킬아미노산, N-C1-C4 알킬아미노산, N-메틸아미노산이 예시되지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에 있어서의 펩타이드 화합물을 구성하는 「아미노산」에는 각각 대응하는 모든 동위체를 포함한다. 「아미노산」의 동위체는, 적어도 1개의 원자가, 원자 번호(양성자수)가 동일하고, 질량수(양성자와 중성자의 수의 합)가 상이한 원자로 치환된 것이다. 본 발명의 펩타이드 화합물을 구성하는 「아미노산」에 포함되는 동위체의 예로서는, 수소 원자, 탄소 원자, 질소 원자, 산소 원자, 인 원자, 황 원자, 불소 원자, 염소 원자 등이 있고, 각각, 2H, 3H, 13C, 14C, 15N, 17O, 18O, 31P, 32P, 35S, 18F, 36Cl 등이 포함된다.
본 명세서에 있어서의 할로젠 원자를 포함하는 치환기로서는, 할로젠을 치환기로 갖는 알킬, 사이클로알킬, 알켄일, 알킨일, 아릴, 헤테로아릴, 아르알킬 등이 예시되고, 보다 구체적으로는, 플루오로알킬, 다이플루오로알킬, 트라이플루오로알킬 등이 예시된다.
O 원자를 포함하는 치환기로서는, 하이드록시(-OH), 옥시(-OR), 카보닐(-C(=O)-R), 카복시(-CO2H), 옥시카보닐(-C(=O)-OR), 카보닐옥시(-O-C(=O)-R), 싸이오카보닐(-C(=O)-SR), 카보닐싸이오(-S-C(=O)-R), 아미노카보닐(-C(=O)-NHR), 카보닐아미노(-NH-C(=O)-R), 옥시카보닐아미노(-NH-C(=O)-OR), 설폰일아미노(-NH-SO2-R), 아미노설폰일(-SO2-NHR), 설팜오일아미노(-NH-SO2-NHR), 싸이오카복실(-C(=O)-SH), 카복실카보닐(-C(=O)-CO2H) 등의 기를 들 수 있다.
옥시(-OR)의 예로서는, 알콕시, 사이클로알콕시, 알켄일옥시, 알킨일옥시, 아릴옥시, 헤테로아릴옥시, 아르알킬옥시 등을 들 수 있다. 알콕시로서는, C1-C4 알콕시, C1-C2 알콕시가 바람직하고, 그 중에서도 메톡시, 또는 에톡시가 바람직하다.
카보닐(-C(=O)-R)의 예로서는, 폼일(-C(=O)-H), 알킬카보닐, 사이클로알킬카보닐, 알켄일카보닐, 알킨일카보닐, 아릴카보닐, 헤테로아릴카보닐, 아르알킬카보닐 등을 들 수 있다.
옥시카보닐(-C(=O)-OR)의 예로서는, 알킬옥시카보닐, 사이클로알킬옥시카보닐, 알켄일옥시카보닐, 알킨일옥시카보닐, 아릴옥시카보닐, 헤테로아릴옥시카보닐, 아르알킬옥시카보닐 등을 들 수 있다.
카보닐옥시(-O-C(=O)-R)의 예로서는, 알킬카보닐옥시, 사이클로알킬카보닐옥시, 알켄일카보닐옥시, 알킨일카보닐옥시, 아릴카보닐옥시, 헤테로아릴카보닐옥시, 아르알킬카보닐옥시 등을 들 수 있다.
싸이오카보닐(-C(=O)-SR)의 예로서는, 알킬싸이오카보닐, 사이클로알킬싸이오카보닐, 알켄일싸이오카보닐, 알킨일싸이오카보닐, 아릴싸이오카보닐, 헤테로아릴싸이오카보닐, 아르알킬싸이오카보닐 등을 들 수 있다.
카보닐싸이오(-S-C(=O)-R)의 예로서는, 알킬카보닐싸이오, 사이클로알킬카보닐싸이오, 알켄일카보닐싸이오, 알킨일카보닐싸이오, 아릴카보닐싸이오, 헤테로아릴카보닐싸이오, 아르알킬카보닐싸이오 등을 들 수 있다.
아미노카보닐(-C(=O)-NHR)의 예로서는, 알킬아미노카보닐(예를 들어, C1-C6 또는 C1-C4 알킬아미노카보닐, 그 중에서도 에틸아미노카보닐, 메틸아미노카보닐 등이 예시된다.), 사이클로알킬아미노카보닐, 알켄일아미노카보닐, 알킨일아미노카보닐, 아릴아미노카보닐, 헤테로아릴아미노카보닐, 아르알킬아미노카보닐 등을 들 수 있다. 이들에 더하여, -C(=O)-NHR 중의 N 원자와 결합한 H 원자가, 알킬, 사이클로알킬, 알켄일, 알킨일, 아릴, 헤테로아릴, 아르알킬로 추가로 치환된 기를 들 수 있다.
카보닐아미노(-NH-C(=O)-R)의 예로서는, 알킬카보닐아미노, 사이클로알킬카보닐아미노, 알켄일카보닐아미노, 알킨일카보닐아미노, 아릴카보닐아미노, 헤테로아릴카보닐아미노, 아르알킬카보닐아미노 등을 들 수 있다. 이들에 더하여 -NH-C(=O)-R 중의 N 원자와 결합한 H 원자가, 알킬, 사이클로알킬, 알켄일, 알킨일, 아릴, 헤테로아릴, 아르알킬로 추가로 치환된 기를 들 수 있다.
옥시카보닐아미노(-NH-C(=O)-OR)의 예로서는, 알콕시카보닐아미노, 사이클로알콕시카보닐아미노, 알켄일옥시카보닐아미노, 알킨일옥시카보닐아미노, 아릴옥시카보닐아미노, 헤테로아릴옥시카보닐아미노, 아르알킬옥시카보닐아미노 등을 들 수 있다. 이들에 더하여, -NH-C(=O)-OR 중의 N 원자와 결합한 H 원자가 알킬, 사이클로알킬, 알켄일, 알킨일, 아릴, 헤테로아릴, 아르알킬로 추가로 치환된 기를 들 수 있다.
설폰일아미노(-NH-SO2-R)의 예로서는, 알킬설폰일아미노, 사이클로알킬설폰일아미노, 알켄일설폰일아미노, 알킨일설폰일아미노, 아릴설폰일아미노, 헤테로아릴설폰일아미노, 아르알킬설폰일아미노 등을 들 수 있다. 이들에 더하여, -NH-SO2-R 중의 N 원자와 결합한 H 원자가 알킬, 사이클로알킬, 알켄일, 알킨일, 아릴, 헤테로아릴, 아르알킬로 추가로 치환된 기를 들 수 있다.
아미노설폰일(-SO2-NHR)의 예로서는, 알킬아미노설폰일, 사이클로알킬아미노설폰일, 알켄일아미노설폰일, 알킨일아미노설폰일, 아릴아미노설폰일, 헤테로아릴아미노설폰일, 아르알킬아미노설폰일 등을 들 수 있다. 이들에 더하여, -SO2-NHR 중의 N 원자와 결합한 H 원자가 알킬, 사이클로알킬, 알켄일, 알킨일, 아릴, 헤테로아릴, 아르알킬로 추가로 치환된 기를 들 수 있다.
설팜오일아미노(-NH-SO2-NHR)의 예로서는, 알킬설팜오일아미노, 사이클로알킬설팜오일아미노, 알켄일설팜오일아미노, 알킨일설팜오일아미노, 아릴설팜오일아미노, 헤테로아릴설팜오일아미노, 아르알킬설팜오일아미노 등을 들 수 있다. 더욱이, -NH-SO2-NHR 중의 N 원자와 결합한 2개의 H 원자는 알킬, 사이클로알킬, 알켄일, 알킨일, 아릴, 헤테로아릴, 및 아르알킬로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 치환되어 있어도 되고, 또한 이들의 2개의 치환기는 환을 형성해도 된다.
S원자를 포함하는 치환기로서는, 싸이올(-SH), 싸이오(-S-R), 설핀일(-S(=O)-R), 설폰일(-SO2-R), 설포(-SO3H) 등의 기를 들 수 있다.
싸이오(-S-R)의 예로서는, 알킬싸이오, 사이클로알킬싸이오, 알켄일싸이오, 알킨일싸이오, 아릴싸이오, 헤테로아릴싸이오, 아르알킬싸이오 등 중에서 선택된다.
설폰일(-SO2-R)의 예로서는, 알킬설폰일, 사이클로알킬설폰일, 알켄일설폰일, 알킨일설폰일, 아릴설폰일, 헤테로아릴설폰일, 아르알킬설폰일 등을 들 수 있다.
N 원자를 포함하는 치환기로서, 아자이도(-N3, 「아자이도기」라고도 한다), 사이아노(-CN), 1급 아미노(-NH2), 2급 아미노(-NH-R; 모노치환 아미노라고도 한다.), 3급 아미노(-NR(R'); 다이치환 아미노라고도 한다.), 아미디노(-C(=NH)-NH2), 치환 아미디노(-C(=NR)-NR'R"), 구아니디노(-NH-C(=NH)-NH2), 치환 구아니디노(-NR-C(=NR''')-NR'R"), 아미노카보닐아미노(-NR-CO-NR'R"), 피리딜, 피페리디노, 모폴리노, 아제티딘일 등의 기를 들 수 있다.
2급 아미노(-NH-R; 모노치환 아미노)의 예로서는, 알킬아미노, 사이클로알킬아미노, 알켄일아미노, 알킨일아미노, 아릴아미노, 헤테로아릴아미노, 아르알킬아미노 등을 들 수 있다.
3급 아미노(-NR(R'); 다이치환 아미노)의 예로서는, 예를 들어 알킬(아르알킬)아미노 등, 알킬, 사이클로알킬, 알켄일, 알킨일, 아릴, 헤테로아릴, 아르알킬등 중에서 각각 독립적으로 선택되는, 임의의 2개의 치환기를 갖는 아미노기를 들 수 있고, 이들의 임의의 2개의 치환기는 환을 형성해도 된다. 구체적으로는, 다이알킬아미노, 그 중에서도 C1-C6 다이알킬아미노, C1-C4 다이알킬아미노, 다이메틸아미노, 다이에틸아미노 등이 예시된다. 본 명세서에 있어서 「Cp-Cq 다이알킬아미노기」란, 아미노기에 Cp-Cq 알킬기가 2개 치환된 기를 말하고, 양 Cp-Cq 알킬기는 동일해도 상이해도 된다.
치환 아미디노(-C(=NR)-NR'R")의 예로서는, N 원자상의 3개의 치환기 R, R', 및 R"가, 알킬, 사이클로알킬, 알켄일, 알킨일, 아릴, 헤테로아릴, 아르알킬 중에서 각각 독립적으로 선택된 기, 예를 들어 알킬(아르알킬)(아릴)아미디노 등을 들 수 있다.
치환 구아니디노(-NR-C(=NR''')-NR'R")의 예로서는, R, R', R", 및 R'''가, 알킬, 사이클로알킬, 알켄일, 알킨일, 아릴, 헤테로아릴, 아르알킬 중에서 각각 독립적으로 선택된 기, 혹은 이들이 환을 형성한 기 등을 들 수 있다.
아미노카보닐아미노(-NR-CO-NR'R")의 예로서는, R, R', 및 R"가, 수소 원자, 알킬, 사이클로알킬, 알켄일, 알킨일, 아릴, 헤테로아릴, 아르알킬 중에서 각각 독립적으로 선택된 기, 혹은 이들은 환을 형성한 기 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서 펩타이드 화합물을 구성하는 「아미노산 잔기」를 간단히 「아미노산」이라고 하는 경우가 있다.
(펩타이드 화합물의 제조 방법)
어느 태양에 있어서, 본 발명은 펩타이드 화합물을 제조하는 방법에 관한 것이고, 해당 방법은 이하의 공정을 포함한다.
공정 A: 용매 중에서 산 성분의 C말단 활성체를 아민 성분과 축합시켜 얻어지는 펩타이드 화합물을 포함하는, 반응 혼합액을 얻는 공정, 및
공정 B: 상기 반응 혼합액과 3급 아민과 물 또는 수용액을 혼합하여, 해당 C말단 활성체를 제거하는 공정.
공정 A는, 용매 중, 산 성분과 아민 성분을 축합제를 이용하여 반응시켜, 펩타이드 화합물을 포함하는 반응 혼합액을 얻는 공정이다. 특정의 이론에 구속되지 않지만, 공정 A에서는 산 성분과 축합제가 반응하여, 산 성분의 C말단 활성체가 형성되고, 그 다음에 해당 C말단 활성체에 아민 성분이 구핵 공격하는 것에 의해 반응이 진행되어, 펩타이드 화합물이 생성된다.
산 성분으로서는, 아미노기가 보호기로 보호된 아미노산, 또는 N말단의 아미노기가 보호기로 보호된 펩타이드를 이용할 수 있다. 본 명세서에 있어서는, 산 성분으로서 이용하는 아미노산을 「제 1 아미노산」, 산 성분으로서 이용하는 펩타이드를 「제 1 펩타이드」라고 칭하는 경우가 있다.
제 1 아미노산은, 특별히 한정되지 않고, 임의의 천연 아미노산 또는 비천연 아미노산을 이용할 수 있다. 또한 제 1 펩타이드도, 특별히 한정되지 않고, 2 이상의 임의의 천연 아미노산 및/또는 비천연 아미노산이 연결된 것을 이용할 수 있다.
제 1 아미노산으로서 바람직하게는, 그 측쇄에 1개 이상의 탄소 원자를 포함하는 것을 들 수 있다. 이와 같은 아미노산으로서, 구체적으로는, 치환되어 있어도 되는 알킬, 치환되어 있어도 되는 알켄일, 치환되어 있어도 되는 알킨일, 치환되어 있어도 되는 사이클로알킬, 치환되어 있어도 되는 알콕시알킬, 치환되어 있어도 되는 사이클로알킬알킬, 치환되어 있어도 되는 아르알킬, 치환되어 있어도 되는 헤테로아릴알킬 등을 측쇄에 갖는 것이 예시된다. 또한, 상기 측쇄가 아미노기, 카복실기, 수산기 등의 펩타이드 결합의 형성 반응에 영향을 줄 수 있는 작용기를 갖는 경우에는, 이들 기를 적절한 보호기로 보호하는 것이 바람직하다. 특정의 이론에 의해 구속되는 것은 아니지만, 아미노산이 그 측쇄에 벌키한 기를 갖는 경우에는, 그 입체 장애에 의해, 해당 아미노산의 잔존 C말단 활성체의 가수분해가 종래의 방법으로는 충분히 진행되지 않는 경우가 있다. 이와 같은 경우에 있어도 본 발명의 방법을 이용하는 것에 의해, 신속하고 또한 효율적으로 잔존 C말단 활성체를 가수분해할 수 있다.
제 1 펩타이드에 포함되는 C말단의 아미노산의 측쇄도, 상기 제 1 아미노산과 마찬가지의 측쇄를 갖는 것일 수 있다.
제 1 아미노산의 아미노기의 보호기, 및 제 1 펩타이드의 N말단의 아미노기가 보호기로서는, 본 기술분야에 있어서 일반적인 아미노기의 보호기를 이용할 수 있다. 이와 같은 보호기로서, 구체적으로는, 예를 들어, Cbz, Boc, Teoc, Fmoc, Tfa, Alloc, 노실, 다이나이트로노실, t-Bu, 트라이틸, 및 큐밀 등을 들 수 있다.
어느 태양에 있어서, 산 성분은, 적어도 아민 성분과 동일한 당량, 바람직하게는 아민 성분에 대해서 과잉량으로 이용하는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 예를 들어, 아민 성분에 대해서 1∼1.1당량, 1∼1.2당량, 1∼1.3당량, 1∼1.4당량, 1∼1.5당량, 1∼2.0당량, 1∼3.0당량의 산 성분을 이용할 수 있다.
어느 태양에 있어서, 본 발명에 있어서의 산 성분의 C말단 활성체는, 용매 중, 산 성분을 축합제와 작용시키는 것에 의해 형성할 수 있다. 축합제로서는, 산 성분의 카보닐 탄소의 구전자성을 높일 수 있도록, 해당 산 성분의 카복실기의 하이드록시 부분에 탈리능을 갖는 기를 도입할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 구체적으로는, 예를 들어, T3P, HATU, BEP, 카보다이이미드류(DIC, EDC 등), 카보다이이미드류와 첨가제(oxyma, HOOBt, HOBt 등)의 조합, DMT-MM, CDI 등을 들 수 있다.
C말단 활성체를 아민 성분과 축합시켜 펩타이드 화합물을 얻는 공정(공정 A)은, -20℃∼용매의 비점 부근의 온도, 바람직하게는 0℃∼60℃의 온도에서, 반응 혼합액을 1분∼48시간, 바람직하게는 15분∼4시간 시간, 교반함으로써 행할 수 있다.
공정 A에 있어서, 산 성분과 아민 성분의 축합 반응은 정량적으로 진행할 수 있다.
아민 성분으로서는, 카복실기가 보호기로 보호된 아미노산, 또는 C말단의 카복실기가 보호기로 보호된 펩타이드를 이용할 수 있다. 본 명세서에 있어서는, 아민 성분으로서 이용하는 아미노산을 「제 2 아미노산」, 아민 성분으로서 이용하는 펩타이드를 「제 2 펩타이드」라고 칭하는 경우가 있다.
제 2 아미노산은, 특별히 한정되지 않고, 임의의 천연 아미노산 또는 임의의 비천연 아미노산을 이용할 수 있다. 또한 제 2 펩타이드도, 특별히 한정되지 않고, 2 이상의 임의의 천연 아미노산 및/또는 비천연 아미노산이 연결된 것을 이용할 수 있다.
제 2 아미노산의 카복실기의 보호기, 및 제 2 펩타이드의 C말단의 카복실기의 보호기로서는, 본 기술분야에 있어서 일반적인 카복실기의 보호기를 이용할 수 있다. 이와 같은 보호기로서, 구체적으로는, 예를 들어, 메틸, 알릴, t-뷰틸, 트라이틸, 큐밀, 벤질, 메톡시트라이틸, 1-피페리딘일 등을 들 수 있다.
어느 태양에 있어서, 본 발명에 있어서의 용매로서는, 축합 반응이 진행되어, 펩타이드 화합물을 얻을 수 있는 것이면 임의의 것을 이용할 수 있다. 이와 같은 용매로서 구체적으로는, 예를 들어, 톨루엔, 아세토나이트릴, 테트라하이드로퓨란, 2-메틸테트라하이드로퓨란, 아세트산 아이소프로필, 아세트산 에틸, 메틸 tert-뷰틸 에터, 사이클로펜틸 메틸 에터, N,N-다이메틸폼아마이드나, 이들로부터 선택되는 2종 이상의 용매를 혼합한 용매 등을 들 수 있다.
어느 태양에 있어서, 본 발명에 있어서의, 산 성분의 C말단 활성체를 아민 성분과 축합시켜 얻어지는 「펩타이드 화합물」에는, 2 이상의 아미노산이 연결된, 직쇄상 또는 환상의 펩타이드 화합물이 포함된다. 한편, 환상 펩타이드 화합물은, 「환상부를 갖는 펩타이드 화합물」과 동일한 의의이다.
본 발명에 있어서의 「직쇄상의 펩타이드 화합물」은, 천연 아미노산 및/또는 비천연 아미노산이 아마이드 결합 혹은 에스터 결합으로 연결되는 것에 의해 형성된 것이고, 환상부를 갖지 않는 화합물인 한, 특별히 한정되지 않는다. 직쇄상의 펩타이드 화합물을 구성하는 천연 아미노산 혹은 비천연 아미노산의 총수는, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30개일 수 있고, 바람직한 범위는 6∼20개, 7∼19개, 7∼18개, 7∼17개, 7∼16개, 7∼15개, 8∼14개, 9∼13개이다.
본 발명에 있어서의 「환상 펩타이드 화합물」은, 천연 아미노산 및/또는 비천연 아미노산이 아마이드 결합 혹은 에스터 결합으로 연결되는 것에 의해 형성된 것이고, 환상부를 갖는 화합물인 한, 특별히 한정되지 않는다. 환상 펩타이드 화합물은, 1 이상의 직쇄부를 갖고 있어도 된다. 환상의 펩타이드 화합물을 구성하는 천연 아미노산 혹은 비천연 아미노산의 총수는, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30개일 수 있고, 바람직한 범위는 6∼20개, 7∼19개, 7∼18개, 7∼17개, 7∼16개, 7∼15개, 8∼14개, 9∼13개이다.
환상 펩타이드 화합물의 환상부를 구성하는 아미노산의 수는 한정되지 않지만, 예를 들어, 4 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 11 이상, 12 이상, 20 이하, 18 이하, 16 이하, 15 이하, 14 이하, 13 이하, 12 이하, 11 이하, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 및 16을 들 수 있다. 상기 환상부를 구성하는 아미노산의 수는, 5∼15가 바람직하고, 5∼14, 7∼14, 또는 8∼14가 보다 바람직하고, 8∼13, 9∼13, 8∼12, 8∼11, 또는 9∼12가 더 바람직하고, 9∼11이 특히 바람직하다.
환상 펩타이드의 직쇄부의 아미노산의 수는 0∼8인 것이 바람직하고, 0∼5가 보다 바람직하고, 0∼3이 보다 바람직하다.
펩타이드 화합물은, 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 또는 6개 이상의 비천연 아미노산을 포함할 수 있다. 또한, 펩타이드 화합물은, 20 이하, 15 이하, 14 이하, 13 이하, 12 이하, 10 이하, 9 이하의 비천연 아미노산을 포함할 수 있다. 펩타이드 화합물에 비천연 아미노산이 포함되는 경우, 비천연 아미노산수의 비율로서는, 펩타이드 화합물을 구성하는 총아미노산수의 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상이 예시된다.
펩타이드 화합물은, 전술한 천연 아미노산 및 비천연 아미노산의 총수의 조건에 더하여, 또는 단독으로, N치환 아미노산을 적어도 2개(바람직하게는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30개, 특히 바람직하게는 5, 6 또는 7개, 바람직한 범위는 2∼30개, 3∼30개, 6∼20개, 7∼19개, 7∼18개, 7∼17개, 7∼16개, 7∼15개, 8∼14개, 9∼13개) 포함하고, N치환되어 있지 않은 아미노산을 적어도 1개 포함하는, 직쇄 또는 환상 펩타이드일 수 있다. 「N치환」으로서는 N 원자에 결합한 수소 원자의 메틸기, 에틸기, 프로필기, 뷰틸기, 헥실기로의 치환 등을 들 수 있지만 이것으로 한정되지 않는다. N치환 아미노산으로서 바람직하게는 천연 아미노산에 포함되는 아미노기가 N-메틸화, N-에틸화, N-프로필화, N-뷰틸화, N-펜틸화된 아미노산을 들 수 있고, 이들을, N-메틸아미노산, N-에틸아미노산, N-프로필아미노산, N-뷰틸아미노산, N-펜틸아미노산이라고 한다. N미치환 아미노산을 N치환 아미노산으로 변환하는 것을 N치환화한다고 하고, N-알킬화, N-메틸화, 또는 N-에틸화라고 하는 경우가 있다. 본 발명에 있어서의 펩타이드 화합물에 포함되는 N치환 아미노산수의 비율로서는, 펩타이드 화합물을 구성하는 총아미노산수의 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상이 예시된다.
펩타이드 화합물에는, 그의 염, 또는 이들의 용매화물이 포함되어도 된다.
본 명세서에 있어서 「측쇄」란, 아미노산의 측쇄, 또는 환상 펩타이드 화합물의 환상부의 측쇄 등의 문맥으로 사용되고, 각각의 주쇄 구조에 포함되지 않는 부분을 의미한다.
본 명세서에 있어서 「아미노산의 수」란, 펩타이드 화합물을 구성하는 아미노산 잔기의 수이고, 아미노산을 연결하고 있는 아마이드 결합, 에스터 결합, 및 환화부의 결합을 절단했을 때에 생기는 아미노산 유닛의 수를 의미한다.
공정 B는, 공정 A에서 얻어진 반응 혼합액 중에 포함되는, 미반응의 C말단 활성체를 제거하는 공정이다. 어느 태양에 있어서, 미반응의 C말단 활성체의 제거는, 미반응의 C말단 활성체를 3급 아민과 작용시키는 것을 통해서 행해진다. 본 명세서에서는, 미반응의 C말단 활성체, 구체적으로는, 예를 들어, 축합 과정에서 아민 성분과 반응하지 않고 잔존한 반응 혼합액 중의 C말단 활성체를 「잔존 C말단 활성체」라고 하는 경우가 있다. 공정 B에서는, 공정 A에서 얻어진 반응 혼합액과 3급 아민과 물 또는 수용액을 혼합한다. 공정 A에 있어서 아민 성분에 대해서 과잉량의 산 성분이 이용되었을 경우, 혹은 공정 A에서 충분히 축합 반응이 진행되지 않았던 경우, 아민 성분과 반응하지 않고 잔존한 산 성분의 C말단 활성체가 반응 용매 중에 불순물로서 잔존한다. 이 잔존한 C말단 활성체가, 충분히 분해되지 않고 계 중에 존재하고 있으면, 후속의 펩타이드 화합물의 탈보호 공정이나, 추가적인 펩타이드쇄의 신장 반응에 악영향을 미치기 때문에, 확실히 제거하는 것이 중요하다. 종래의 액상 합성법에서는, 알칼리 수용액을 이용하여 잔존 활성 에스터를 가수분해하는 방법 등이 알려져 있었지만, 특히 그 측쇄에 벌키한 작용기를 갖는 아미노산의 잔존 C말단 활성체의 경우, 혹은 잔존 C말단 활성체의 탈리기의 탈리능이 용이하게 물과 반응할 정도로는 높지 않은 경우에는, 그 분해가 불충분한 경우가 있음이 본 발명자들에 의해 확인되었다. 이에 반해, 미반응의 C말단 활성체를 포함하는 반응 혼합액을, 3급 아민 및 물 또는 수용액과 혼합하는 것을 통해서, 내지는 잔존 C말단 활성체를 3급 아민과 접촉시키는 것을 통해서, C말단 활성체를 가수분해하는 본 발명의 방법을 이용함으로써, 이러한 과제를 해결할 수 있다.
3급 아민으로서는, 산 성분의 잔존 C말단 활성체에 대해서 구핵 반응성을 갖는 것을 바람직하게 이용할 수 있다. 이와 같은 3급 아민으로서는, 질소 근방의 입체 장애가 작은 아민이 바람직하다. 이와 같은 3급 아민으로서 예를 들어, 하기 식(A), (B), 또는 (C)로 표시되는 3급 아민을 들 수 있다.
Figure pct00002
어느 태양에 있어서, 식(A) 중, R1∼R3은, R1 및 R2가 그들이 결합하고 있는 질소 원자와 하나로 되어 5∼6원 비방향족 헤테로환을 형성하고, 또한 R3이 C1-C2 알킬(즉, 메틸, 또는 에틸) 또는 C2 하이드록시알킬이다. 5∼6원 비방향족 헤테로환으로서 바람직하게는, 피롤리딘, 피페리딘, 또는 모폴린이며, C2 하이드록시알킬로서 바람직하게는, 2-하이드록시에틸이다.
다른 태양에 있어서, 식(A) 중, R1∼R3은, 각각 독립적으로, C1-C2 알킬, 또는 C2 하이드록시알킬이다. C2 하이드록시알킬로서 바람직하게는, 2-하이드록시에틸이다.
식(A)로 표시되는 3급 아민으로서 바람직하게는, R1∼R3이, 각각 독립적으로, C1-C2 알킬인 것을 들 수 있다.
식(A)로 표시되는 3급 아민으로서, 구체적으로는, 트라이메틸아민, N,N-다이메틸에틸아민, N,N-다이에틸메틸아민, 트라이에틸아민, 트라이에탄올아민 등을 들 수 있고, 이들 중에서는 트라이메틸아민이 특히 바람직하다.
어느 태양에 있어서, 식(B) 중, X는, N 또는 O이다. X가 N인 경우, R4 및 R5는, 각각 독립적으로, C1-C2 알킬, 혹은 C2 하이드록시알킬이거나, 또는 그들이 결합하고 있는 질소 원자와 하나로 되어 5∼6원 비방향족 헤테로환을 형성한다. X가 O인 경우, R4는, C1-C2 알킬, 또는 C2 하이드록시알킬이며, R5는 존재하지 않는다. 5∼6원 비방향족 헤테로환으로서 바람직하게는, 피롤리딘, 피페리딘, 또는 모폴린이며, C2 하이드록시알킬로서 바람직하게는, 2-하이드록시에틸이다. 또한, 식(B) 중, R6 및 R7은, 각각 독립적으로, H, C1-C2 알킬, 또는 메톡시이다.
식(B)로 표시되는 3급 아민으로서 바람직하게는, X가 N이고, R4 및 R5가, 각각 독립적으로, C1-C2 알킬이고, 또한 R6 및 R7이 H인 것을 들 수 있다.
식(B)로 표시되는 3급 아민으로서, 구체적으로는, DMAP, 4-피페리디노피리딘, 4-모폴리노피리딘 등을 들 수 있고, 이들 중에서는, DMAP가 특히 바람직하다.
어느 태양에 있어서, 식(C) 중, R8 및 R9는, 각각 독립적으로, H, C1-C2 알킬, 혹은 C2 하이드록시알킬이거나, 또는 R8이 결합하고 있는 질소 원자 및 R9가 결합하고 있는 탄소 원자와 하나로 되어 5∼6원 비방향족 헤테로환을 형성한다. 5∼6원 비방향족 헤테로환으로서 바람직하게는, 피롤리딘, 피페리딘, 또는 모폴린이며, C2 하이드록시알킬로서 바람직하게는, 2-하이드록시에틸이다.
식(C)로 표시되는 3급 아민으로서 바람직하게는, R8 및 R9가, 각각 독립적으로, H 또는 C1-C2 알킬인 것을 들 수 있고, R8이 C1-C2 알킬이고, 또한 R9가 H인 것이 보다 바람직하다.
식(C)로 표시되는 3급 아민으로서, 구체적으로는, NMI, 이미다졸-1-에탄올, 5,6,7,8-테트라하이드로이미다조[1,5-α]피리딘 등을 들 수 있고, 이들 중에서는, NMI가 특히 바람직하다.
특정의 이론에 의해 구속되는 것은 아니지만, 본 발명의 3급 아민은, 잔존 C말단 활성체에 대해서 구핵 공격을 행하는 것에 의해, 잔존 C말단 활성체의 가수분해를 촉진할 수 있다. DIPEA와 같은 3급 아민은 벌키한 치환기를 갖기 때문에, 구핵성이 낮아, 바람직하지 않다. 잔존 C말단 활성체의 가수분해물은, 수층으로 이동시켜 제거할 수 있기 때문에, 컬럼 정제 등의 별개의 정제 공정을 거치지 않고서, 생성된 펩타이드 화합물을 다음의 축합 반응에 제공할 수 있다. 본 발명의 방법을 이용하는 것에 의해 신속(예를 들어, 5분 이내)하게, 또한 적은 횟수(예를 들어, 1회만)의 가수분해 처리로 효율적으로 잔존 C말단 활성체를 제거할 수 있는, 어느 태양에서는, 잔존 C말단 활성체의 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상을 제거할 수 있다. 바꾸어 말하면, 본 발명에 의하면, C말단 활성체의 잔존율을 10% 이하, 9% 이하, 8% 이하, 7% 이하, 6% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 1% 이하로 할 수 있다.
3급 아민은, 아민 성분에 대해서 촉매량을 이용해도 되고, 화학량론량 이상의 양을 이용해도 된다. 구체적으로는, 예를 들어, 아민 성분에 대해서 0.1당량∼10당량의 3급 아민을 반응 혼합액에 첨가할 수 있고, 0.5당량∼3당량의 3급 아민을 첨가하는 것이 바람직하다.
3급 아민을 잔존 C말단 활성체와 작용시킬 때는, -20℃∼용매의 비점 부근의 온도, 바람직하게는 25℃∼60℃의 온도에서 반응 혼합액을 1분∼48시간, 바람직하게는 2시간 이하, 예를 들어, 2분∼2시간, 5분∼60분, 5분∼50분, 또는 5∼30분, 교반할 수 있다.
어느 태양에 있어서, 잔존 C말단 활성체를 3급 아민으로 처리하는 공정에는, 물 또는 수용액을 가할 수 있고, 수용액으로서는 알칼리 수용액을 바람직하게 이용할 수 있다. 이와 같은 알칼리 수용액은 특별히 한정되지 않지만, 구체적으로는, 예를 들어, 탄산 칼륨 수용액, 수산화 리튬 수용액, 탄산 나트륨 수용액, 수산화 나트륨, 수산화 칼륨 수용액, 수산화 나트륨 수용액, 또는 탄산 세슘 수용액 등을 들 수 있다. 이들 중에서는, 온화한 염기성을 갖는 탄산 칼륨 수용액 또는 탄산 나트륨 수용액이 바람직하다.
어느 태양에 있어서, 본 발명은, 3급 아민을 잔존 C말단 활성체와 작용시킨 후에, 반응 혼합액을 유기층과 수층으로 분층하여 유기층을 취하고, 그 다음에 해당 유기층을 세정하는 공정을 추가로 포함한다. 일례로서, 산성 수용액과 염기성 수용액에 의한 유기층의 세정을 포함한다. 어느 태양에서는, 이 공정을 거쳤을 경우, 잔존 C말단 활성체의 잔존량을 1.0% 이하, 0.5% 이하, 바람직하게는 0.1% 이하로 할 수 있다.
어느 태양에 있어서, 본 발명은, 상기 펩타이드 화합물의 N말단의 보호기를 탈보호하는 공정(공정 C)을 추가로 포함한다. 보호기의 탈보호는, 예를 들어, 「Greene＇s, “Protective Groups in Organic Synthesis˝(제5판, John Wiley & Sons 2014)」에 기재된 통상적 방법에 의해 행할 수 있다. 종래법에서는, 잔존한 C말단 활성체에 기인하여 탈보호 반응이 충분히 진행되지 않는 경우가 있지만, 본 발명의 방법을 이용함으로써, 생성된 펩타이드 화합물의 탈보호체를 고수율로 얻을 수 있다.
어느 태양에 있어서, 본 발명은, 공정 A와 공정 B를 복수회 반복하는 것을 포함한다. 또한, 어느 태양에 있어서, 본 발명은, 공정 A, 공정 B 및 공정 C를 복수회 반복하는 것을 포함한다. 이와 같은 반복에 의해, 펩타이드쇄를 신장하여, 펩타이드 화합물을 얻을 수 있다.
어느 태양에 있어서, 본 발명은, 잔존 C말단 활성체를 포함하는 용액에 3급 아민과 물 또는 수용액을 추가하여, 해당 C말단 활성체를 3급 아민과 작용시키는 공정을 포함하는, 잔존 C말단 활성체의 가수분해를 촉진하는 방법에 관한 것이다. 이 태양에 있어서, 잔존 C말단 활성체 및/또는 3급 아민은 전술한 것을 이용할 수 있다. 잔존 C말단 활성체를 포함하는 용액에 수용액을 첨가하는 경우, 해당 수용액으로서는 상기 알칼리수가 바람직하다.
어느 태양에 있어서, 본 발명은, 잔존 C말단 활성체의 가수분해체를 포함하는 용액을 수성 세정하는 공정을 포함하는, 해당 가수분해체를 제거하는 방법에 관한 것이다. 이 태양에 있어서, 수성 세정으로서, 물 외에, 알칼리성 수용액에 의한 세정을 실시할 수 있다. 알칼리성 수용액은, 특별히 한정되지 않지만, 탄산 칼륨 수용액 혹은 탄산 나트륨 수용액이 바람직하다. 또한, 다른 태양에 있어서, 사용한 염기가 가수분해체와 염을 형성하여 수층으로 이행하기 어려워지고 있는 경우에는, 그의 염기를 산성 수용액으로 세정하여 제거한 후에, 알칼리 수용액으로 세정할 수도 있다. 산성 수용액은 특별히 한정되지 않지만, 황산수소 칼륨 수용액 혹은 황산수소 나트륨 수용액이 바람직하다. 알칼리성 수용액은, 탄산 칼륨 수용액 혹은 탄산 나트륨 수용액이 바람직하다.
한편, 본 명세서에 있어서 인용된 모든 선행기술문헌은, 참조로서 본 명세서에 원용할 수 있다.
실시예
본 발명은, 이하의 실시예에 의해 추가로 예시되지만, 하기의 실시예로 한정되는 것은 아니다.
펩타이드 화합물(펩타이드 합성에서의 목적물)의 순도, C말단 활성체 잔존량은, QDA, PDA 검출기를 구비한 LCMS(컬럼: Ascentis Express C18, 5cm x 4.6mm, 2.7μm, 이동상: 0.5% 트라이플루오로아세트산 수용액/0.5% 트라이플루오로아세트산 아세토나이트릴 용액=95/5-0/100, 1.0mL/min, 검출기: UV210nm)를 이용하여 측정했다.
C말단 활성체의 잔존량의 평가는, 잔존 C말단 활성체가 분석 조건(LCMS)에서 가수분해를 받을 가능성이 있기 때문에, 잔존 C말단 활성체를 프로필아마이드로 변환하여 행했다.
펩타이드 화합물(펩타이드 합성에서의 목적물)의 순도는, LCMS의 피크 면적 퍼센트로서 기재했다. C말단 활성체 잔존율 및 C말단 활성체 잔존량 상대치는 각 실시예에 기재된 계산식에 의해 산출했다. 한편, 총피크 면적은, 블랭크 피크, 용매 피크의 면적치를 빼서 보정했다.
표 중의 nd는, not detected의 의미를 나타낸다.
(실시예 1) 잔존 C말단 활성체의 가수분해에 있어서의 첨가 아민 효과
(혼합 산 무수물의 조정)
Cbz-Ile-OH 463mg(1.7mmol), 펜타메틸벤젠 31mg(내부 표준 물질: 0.21mmol)을 2-메틸테트라하이드로퓨란 3.0mL에 용해했다. 실온에서 다이아이소프로필에틸아민 1.1mL(6.2mmol), T3P/THF 50% 용액 1.9mL(3.2mmol)를 가하고, 40℃에서 1시간 교반하여 혼합 산 무수물(C말단 활성체) 용액을 조제했다. 조제한 혼합 산 무수물 용액으로부터 5μL를 취하고, 노멀프로필아민 100μL(1.2mmol)와 반응시킨 후, 메탄올 0.9mL로 희석하고, 혼합 산 무수물로의 반응 변환율을 LC/MS의 피크 면적으로부터 구했다(변환율: 97%). Cbz-Ile-NHPr/MS(ESI): m/z 307.1 [M+H]+.
변환율(%) = {Cbz-Ile-NHPr(면적%)/[Cbz-Ile-OH(면적%)+Cbz-Ile-NHPr(면적%)]}×100
(가수분해 처리-아민 비첨가)
조제한 혼합 산 무수물 용액의 전량(6mL)으로부터 1.0mL를 취하고, 알칼리수(5% 수산화 리튬 수용액, 5% 탄산 나트륨 수용액, 5% 탄산 칼륨 수용액, 5% 수산화 칼륨 수용액, 또는 5% 탄산 세슘 수용액) 0.5mL를 가하고, 25℃에서, 교반자로 교반(1200rpm)을 행했다. 교반을 정지한 후, 정치하여, 유기층과 수층을 분층시켰다. 유기층 5μL를 취하고, 노멀프로필아민 100μL(1.2mmol)에 가하여, 잔존하는 C말단 활성체를 프로필아마이드로 변환시킨 후, 메탄올 0.9mL로 희석했다. 본 용액을 LC/MS 분석에 보내어, 피크 면적비[프로필아마이드:펜타메틸벤젠(내부 표준 물질)]을 계산했다.
(가수분해 처리-아민 첨가)
조제한 혼합 산 무수물 용액 전량(6mL)으로부터 1.0mL를 취하고, 아민 첨가제(0.19mmol), 및 5% 탄산 칼륨 수용액 0.5mL를 가하고, 25℃에서, 교반자로 교반(1200rpm)을 행했다. 교반을 정지, 정치하여, 유기층과 수층을 분층시켰다. 유기층 5μL를 취하고, 노멀프로필아민 100μL(1.2mmol)에 가하여, 잔존하는 C말단 활성체를 프로필아마이드로 변환시킨 후, 메탄올 0.9mL로 희석했다. 본 용액을 LC/MS 분석에 보내어, 피크 면적비[프로필아마이드:펜타메틸벤젠(내부 표준 물질)]을 계산했다.
(C말단 활성체의 잔존량 평가)
LC/MS의 피크 면적비[프로필아마이드/펜타메틸벤젠(내부 표준 물질)]을 이용했다. 하기 표의 C말단 활성체 잔존량 상대치는, 아민 첨가제를 가하지 않고 5% 탄산 칼륨 수용액으로 5분간 처리했을 때의 피크 면적비[프로필아마이드/펜타메틸벤젠]의 값 3.5를 100(entry 1의 5min의 컬럼)으로 했을 때 상대치이다.
C말단 활성체 잔존량 상대치(%) = {[프로필아마이드(면적%)/펜타메틸벤젠(면적%)]/3.5(entry 1, 5min에서의 [프로필아마이드(면적%)/펜타메틸벤젠(면적%)])}x100
Figure pct00003
1) Not applicable.
표 1의 C말단 활성체 잔존량 상대치는, 값이 작을수록 잔존 C말단 활성체가 가수분해되고 있음을 나타내고 있다. 알칼리수 단독을 사용했을 경우, 알칼리의 짝양이온을 바꾸어도 가수분해 속도에 거의 변화는 없고, 아민 첨가했을 경우보다 가수분해는 느렸다. 또한, 첨가한 아민 중에서도, DMAP, NMI의 첨가가 잔존 C말단 활성체 가수분해를 극적으로 촉진함을 발견했다.
(실시예 2) 잔존 C말단 활성체의 가수분해에 있어서의 첨가 아민 효과
(활성 에스터의 조정)
Cbz-Ile-OH 701mg(2.64mmol), 펜타메틸벤젠 46mg(0.31mmol)을 2-메틸테트라하이드로퓨란 7.0mL에 용해했다. 실온에서 HATU 1.0g(2.64mmol), 다이아이소프로필에틸아민 1.5mL(8.79mmol)를 가하고, 60℃에서 4시간 교반하여 활성 에스터(C말단 활성체) 용액을 조제했다. 조제한 활성 에스터 용액으로부터 5μL를 취하고, 노멀프로필아민 100μL(1.2mmol)와 반응시킨 후, 메탄올 0.9mL로 희석하고, 활성 에스터로의 반응 변환율을 LC/MS의 피크 면적으로부터 구했다(변환율: 94%). Cbz-Ile-NHPr/MS(ESI): m/z 307.1 [M+H]+.
변환율 (%) = {Cbz-Ile-NHPr(면적%)/[Cbz-Ile-OH(면적%)+Cbz-Ile-NHPr(면적%)]}×100
(알칼리수 단독으로의 가수분해 처리)
조제한 활성 에스터 용액의 전량(9mL)으로부터 1.5mL를 취하고, 알칼리수(5% 탄산 칼륨 수용액) 0.75mL를 가하고, 25℃에서, 교반자로 교반(1200rpm)을 행했다. 교반을 정지한 후, 정치하여, 유기층과 수층을 분층시켰다. 유기층 5μL를 취하고, 노멀프로필아민 100μL(1.2mmol)에 가하여, 잔존하는 C말단 활성체를 프로필아마이드로 변환시킨 후, 메탄올 0.9mL로 희석했다. 본 용액을 LC/MS 분석에 보내어, 피크 면적비[프로필아마이드:펜타메틸벤젠(내부 표준 물질)]을 계산했다.
(아민 첨가한 가수분해 처리)
조제한 활성 에스터 용액 전량(9mL)으로부터 1.5mL를 취하고, 아민 첨가제(0.44mmol), 및 5% 탄산 칼륨 수용액 0.75mL를 가하고, 25℃에서, 교반자로 교반(1200rpm)을 행했다. 교반을 정지, 정치하여, 유기층과 수층을 분층시키고, 유기층 5μL를 취하고, 노멀프로필아민 100μL(1.2mmol)에 가하여, 잔존하는 C말단 활성체를 프로필아마이드로 변환시킨 후, 메탄올 0.9mL로 희석했다. 본 용액을 LC/MS 분석에 보내어, 피크 면적비[프로필아마이드:펜타메틸벤젠(내부 표준 물질)]을 계산했다.
(C말단 활성체의 잔존량 평가)
LC/MS의 피크 면적비[프로필아마이드/펜타메틸벤젠(내부 표준 물질)]을 이용했다. 하기 표의 C말단 활성체 잔존량 상대치는, 아민 첨가제를 가하지 않고 5% 탄산 칼륨 수용액으로 5분간 처리했을 때의 피크 면적비[프로필아마이드/펜타메틸벤젠]의 값 3.0을 100(entry 1의 5 min의 컬럼)으로 했을 때 상대치이다.
C말단 활성체 잔존량 상대치(%) = {[프로필아마이드(면적%)/펜타메틸벤젠(면적%)]/3.0(entry 1, 5min에서의 [프로필아마이드(면적%)/펜타메틸벤젠(면적%)])}x100
Figure pct00004
표 2의 C말단 활성체 잔존량 상대치는, 값이 작을수록 잔존 C말단 활성체가 가수분해되고 있음을 나타내고 있다. 알칼리수만을 사용했을 경우보다도 아민을 첨가한 편이, 잔존 C말단 활성체 가수분해를 촉진함을 발견했다. 즉, DBU, Me3N, NMI, DMAP의 첨가에 효과가 있음이 인정되고, 특히 NMI와 DMAP의 첨가에 극적인 효과가 있음을 발견했다.
(실시예 3) 잔존 C말단 활성체의 가수분해에 있어서의 첨가 아민 효과
Cbz-MeAla-OH 617mg(2.6mmol), 펜타메틸벤젠 46mg(0.31mmol)을 2-메틸테트라하이드로퓨란 4.5mL로 이루어지는 용액에 실온에서 다이아이소프로필에틸아민 1.5mL(8.6mmol), T3P/THF 50% 용액 2.6mL(4.4mmol)를 가하고, 40℃에서 1시간 교반하여 혼합 산 무수물 용액(C말단 활성체)을 조제했다. 조제한 혼합 산 무수물 용액으로부터 5μL를 취하고, 노멀프로필아민 100μL(1.2mmol)와 반응시킨 후, 메탄올 0.9mL로 희석하고, 혼합 산 무수물로의 반응 변환율을 LC/MS의 피크 면적으로부터 구했다(변환율: 90%). Cbz-MeAla-NHPr/MS (ESI): m/z 279.1 [M+H]+.
변환율(%) = {Cbz-MeAla-NHPr(면적%)/[Cbz-MeAla-OH(면적%)+Cbz-MeAla-NHPr(면적%)]}×100
(알칼리수 단독으로의 가수분해 처리)
조제한 혼합 산 무수물 용액의 전량(9mL)으로부터 1.5mL를 취하고, 알칼리수(5% 탄산 나트륨 수용액, 또는 5% 탄산 칼륨 수용액) 0.75mL를 가하고, 25℃에서, 교반자로 교반(1200rpm)을 행했다. 교반을 정지한 후, 정치하여, 유기층과 수층을 분층시켰다. 유기층 5μL를 취하고, 노멀프로필아민 100μL(1.2mmol)에 가하여, 잔존하는 C말단 활성체를 프로필아마이드로 변환시킨 후, 메탄올 0.9mL로 희석했다. 본 용액을 LC/MS 분석에 보내어, 피크 면적비[프로필아마이드:펜타메틸벤젠(내부 표준 물질)]을 계산했다.
(아민 첨가한 가수분해 처리)
조제한 혼합 산 무수물 용액 전량(9mL)으로부터 1.5mL를 취하고, 아민 첨가제(0.43mmol, 0.67당량), 및 5% 탄산 칼륨 수용액 0.75mL를 가하고, 25℃에서, 교반자로 교반(1200rpm)을 행했다. 교반을 정지, 정치하여, 유기층과 수층을 분층시켜, 유기층 5μL를 취하고, 노멀프로필아민 100μL(1.2mmol)에 가하여, 잔존하는 C말단 활성체를 프로필아마이드로 변환시킨 후, 메탄올 0.9mL로 희석했다. 본 용액을 LC/MS 분석에 보내어, 피크 면적비[프로필아마이드:펜타메틸벤젠(내부 표준 물질)]을 계산했다.
(C말단 활성체의 잔존량 평가)
LC/MS의 피크 면적비[프로필아마이드/펜타메틸벤젠(내부 표준 물질)]을 이용했다. 하기 표의 C말단 활성체 잔존량 상대치는, 아민 첨가제를 가하지 않고 5% 탄산 나트륨 수용액으로 5분간 처리했을 때의 피크 면적비[프로필아마이드/펜타메틸벤젠]의 값 1.1을 100(entry 1의 5min의 컬럼)으로 했을 때 상대치이다.
C말단 활성체 잔존량 상대치(%) = {[프로필아마이드(면적%)/펜타메틸벤젠(면적%)]/1.1(entry 1, 5min에서의 [프로필아마이드(면적%)/펜타메틸벤젠(면적%)]}x100
Figure pct00005
표 3의 C말단 활성체 잔존량 상대치는, 값이 작을수록 잔존 C말단 활성체가 가수분해되고 있음을 나타내고 있다. 알칼리수 단독을 사용했을 경우, 알칼리의 짝양이온을 바꾸어도 가수분해 속도에 거의 변화는 없었다. 또한, DMAP, NMI를 첨가하면, 알칼리수 단독을 사용했을 경우보다도, 잔존 C말단 활성체의 가수분해가 촉진됨을 발견했다. DMAP, NMI의 첨가는 5분 이내여도 충분히 효과가 있고, 특히, DMAP 첨가에 있어서는, 완전히 잔존 C말단 활성체를 가수분해함을 발견했다.
(실시예 4) Cbz-Ile-Phe-OtBu의 합성
(축합 반응)
H-Phe-OtBu 염산염 458mg(1.8mmol), Cbz-Ile-OH 699mg(2.7mmol), 및 2-메틸테트라하이드로퓨란 4.5mL로 이루어지는 용액에 실온에서 다이아이소프로필에틸아민 1.6mL(8.9mmol), T3P/THF 50% 용액 2.6mL(4.4mmol)를 가하고, 40℃에서 1시간 교반하여 펩타이드 결합 형성 반응을 행했다. 반응 용액으로부터 5μL를 취하고, 노멀프로필아민 100μL(1.2mmol)와 반응시킨 후, 메탄올 0.9mL로 희석하고, 반응 변환율을 LC/MS의 피크 면적으로부터 구했다(변환율: 100%).
변환율(%)={Cbz-Ile-Phe-OtBu(면적%)/[H-Phe-OtBu(면적%)+Cbz-Ile-Phe-OtBu(면적%)]}×100
(알칼리수 단독으로의 가수분해 처리)
상기 조제한 다이펩타이드 용액 전량(9mL)으로부터 1.5mL를 취하고, 5% 탄산 칼륨 수용액 0.75mL를 가하고, 25℃에서, 교반자로 교반(1200rpm)을 행했다. 교반을 정지한 후, 정치하여, 유기층과 수층을 분층시켰다. 유기층 5μL를 취하고, 노멀프로필아민 100μL(1.2mmol)에 가하여, 잔존하는 C말단 활성체를 프로필아마이드로 변환시킨 후, 메탄올 0.9mL로 희석하고, LC/MS 분석에 보내어, 프로필아마이드와 목적으로 하는 펩타이드의 피크 면적치를 구하여, C말단 활성체 잔존율(%)을 산출했다. 남은 반응액의 수층을 제거하고, 유기층을 5% 황산수소 칼륨 수용액 0.5mL와 5% 탄산 칼륨 수용액 0.5mL로 순차적으로 세정했다. 유기층 5μL를 취하고, 노멀프로필아민 100μL(1.2mmol)에 가하여, 잔존하는 C말단 활성체를 프로필아마이드로 변환시킨 후, 메탄올 0.9mL로 희석했다. 본 용액을 LC/MS 분석에 보내어, 목적으로 하는 펩타이드와 잔존 C말단 활성체(프로필아마이드로의 변환체)의 피크 면적치를 구했다.
C말단 활성체 잔존율(%)={프로필아마이드(면적%)/[프로필아마이드(면적%)+다이펩타이드(면적%)]}×100
(아민 첨가한 가수분해 처리)
조제한 다이펩타이드 용액 전량(9mL)으로부터 1.5mL를 취하고, 아민(0.15mmol 0.5당량, 0.30mmol 1.0당량, 또는 0.89mmol 3당량: 당량은 H-Phe-OtBu 염산염에 대한 것), 및 5% 탄산 칼륨 수용액 0.75mL를 가하고, 25℃에서, 교반자로 교반(1200rpm)을 행했다. 교반을 정지한 후, 정치하여, 유기층과 수층을 분층시켰다. 유기층 5μL를 취하고, 프로필아민 100μL(1.2mmol)에 가하여, 잔존하는 C말단 활성체를 프로필아마이드로 변환시킨 후, 메탄올 0.9mL로 희석하고, LC/MS 분석에 보내어, 프로필아마이드와 목적으로 하는 펩타이드의 피크 면적치를 구하여, C말단 활성체 잔존율(%)을 산출했다. 남은 반응액의 수층을 제거하고, 유기층을 5% 황산수소 칼륨 수용액 0.75mL와 5% 탄산 칼륨 수용액 0.75mL로 순차적으로 세정했다. 유기층 5μL를 취하고, 노멀프로필아민 100μL(1.2mmol)에 가하여, 잔존하는 C말단 활성체를 프로필아마이드로 변환시킨 후, 메탄올 0.9mL로 희석했다. 본 용액을 LC/MS 분석에 보내어, 목적으로 하는 펩타이드와 잔존 C말단 활성체(프로필아마이드로의 변환체)의 피크 면적치를 구했다. MS(ESI): m/z 413.3 [M-tBu+H]+, 469.3 [M+H]+, 491.3 [M+Na]+.
C말단 활성체 잔존율(%)={프로필아마이드(면적%)/[프로필아마이드(면적%)+다이펩타이드(면적%)]}×100
Figure pct00006
1) N말 아미노산 유도체(H-Phe-OtBu 염산염)에 대한 당량
2) LCMS의 피크 면적 비율
첨가 아민 NMI는, N말단의 아미노산 유도체에 대해서 0.5∼3.0당량을 사용함으로써, 알칼리수 단독 처리로의 가수분해보다도 가수분해를 우위로 촉진함을 발견했다. 또한, 첨가 아민 DMAP는, N말 아미노산 유도체에 대해서 0.5∼3.0당량을 사용함으로써, 알칼리수 단독 처리로의 가수분해보다도 가수분해를 우위로 촉진함을 발견했다.
아민을 첨가하여 가수분해 처리를 1회 행한 후, 유기층을 5% KHSO4, 5% K2CO3로 세정하는 것에 의해, 유기층 중의 잔존 C말단 활성체를 완전히 제거할 수 있음을 발견했다. 이 때, 목적물인 펩타이드는, 고순도로 얻어졌다. 한편, 알칼리수로의 단독 처리에서는, C말단 활성체가 잔존하고, 다이펩타이드의 순도도 낮았다.
(실시예 5) Cbz-Ile-Phe-OtBu의 합성
(축합 반응)
H-Phe-OtBu 염산염 452mg(1.8mmol), Cbz-Ile-OH 702mg(2.6mmol), 및 2-메틸테트라하이드로퓨란 4.5mL로 이루어지는 용액에 실온에서 다이아이소프로필에틸아민 1.5mL(8.8mmol), T3P/THF 50% 용액 2.6mL(4.4mmol)를 가하고, 40℃에서 1시간 교반하여 펩타이드 결합 형성 반응을 행했다. 반응 용액으로부터 5μL를 취하고, 노멀프로필아민 100μL(1.2mmol)와 반응시킨 후, 메탄올 0.9mL로 희석하고, 반응 변환율을 LC/MS의 피크 면적으로부터 구했다(변환율: 100%).
변환율(%)={Cbz-Ile-Phe-OtBu(면적%)/[H-Phe-OtBu(면적%)+Cbz-Ile-Phe-OtBu(면적%)]}×100
(알칼리수 단독으로의 가수분해 처리)
상기 조제한 다이펩타이드 용액 전량(9mL)으로부터 1.5mL를 취하고, 5% 탄산 칼륨 수용액 0.75mL를 가하고, 60℃에서, 교반자로 교반(1200rpm)을 행했다. 교반을 정지한 후, 정치하여, 유기층과 수층을 분층시켰다. 유기층 5μL를 취하고, 노멀프로필아민 100μL(1.2mmol)에 가하여, 잔존하는 C말단 활성체를 프로필아마이드로 변환시킨 후, 메탄올 0.9mL로 희석하고, LC/MS 분석에 보내어, 프로필아마이드와 목적으로 하는 펩타이드의 피크 면적치를 구하여, C말단 활성체 잔존율(%)을 산출했다. 남은 반응액의 수층을 제거하고, 유기층을 5% 황산수소 칼륨 수용액 0.75mL와 5% 탄산 칼륨 수용액 0.75mL로 순차적으로 세정했다. 유기층 5μL를 취하고, 노멀프로필아민 100μL(1.2mmol)에 가하여, 잔존하는 C말단 활성체를 프로필아마이드로 변환시킨 후, 메탄올 0.9mL로 희석했다. 본 용액을 LC/MS 분석에 보내어, 목적으로 하는 펩타이드와 잔존 C말단 활성체(프로필아마이드로의 변환체)의 피크 면적치를 구했다.
C말단 활성체 잔존율(%)={프로필아마이드(면적%)/[프로필아마이드(면적%)+다이펩타이드(면적%)]}×100
(아민 첨가한 가수분해 처리)
조제한 다이펩타이드 용액 전량(9mL)으로부터 1.5mL를 취하고, 아민(0.29mmol), 및 5% 탄산 칼륨 수용액 0.75mL를 가하고, 60℃에서, 교반자로 교반(1200rpm)을 행했다. 교반을 정지한 후, 정치하여, 유기층과 수층을 분층시켰다. 유기층 5μL를 취하고, 프로필아민 100μL(1.2mmol)에 가하여, 잔존하는 C말단 활성체를 프로필아마이드로 변환시킨 후, 메탄올 0.9mL로 희석하고, LC/MS 분석에 보내어, 프로필아마이드와 목적으로 하는 펩타이드의 피크 면적치를 구하여, C말단 활성체 잔존율(%)을 산출했다. 남은 반응액의 수층을 제거하고, 유기층을 5% 황산수소 칼륨 수용액 0.75mL와 5% 탄산 칼륨 수용액 0.75mL로 순차적으로 세정했다. 유기층 5μL를 취하고, 노멀프로필아민 100μL(1.2mmol)에 가하여, 잔존하는 C말단 활성체를 프로필아마이드로 변환시킨 후, 메탄올 0.9mL로 희석했다. 본 용액을 LC/MS 분석에 보내어, 목적으로 하는 펩타이드와 잔존 C말단 활성체(프로필아마이드로의 변환체)의 피크 면적치를 구했다. MS(ESI): m/z 413.3 [M-tBu+H]+, 469.3 [M+H]+, 491.3 [M+Na]+.
C말단 활성체 잔존율(%)={프로필아마이드(면적%)/[프로필아마이드(면적%)+다이펩타이드(면적%)]}×100
Figure pct00007
1) LCMS의 피크 면적 비율
잔존 C말단 활성체의 가수분해를, 아민을 첨가하여 60℃에서 행해도, 목적으로 하는 펩타이드가 25℃에서 행했을 때와 동등한 높은 순도로 얻어졌다. 특히, 첨가한 아민이 DMAP 및 NMI인 경우에는, 알칼리수 단독의 경우보다도 가수분해가 빨리 진행되었다. 또한, 첨가한 아민이 DMAP 및 NMI인 경우에는, 1회의 가수분해 처리로, 가수분해가 5분 이내에 효과적으로 진행되어, 계속되는 분액 조작(5% KHSO4, 5% K2CO3 세정)으로 유기층으로부터 잔존 C말단 활성체를 완전히 제거할 수 있음을 발견했다.
(실시예 6) Cbz-MeIle-MePhe-OMe의 합성
(축합 반응)
MePhe-OMe 염산염 300mg(1.3mmol), Cbz-MeIle-OH 442mg(1.6mmol)을 아세토나이트릴 3.0mL에 현탁하고, 다이아이소프로필에틸아민 683μL(3.9mmol)를 가했다. 그 다음에 25℃에서 HATU 594mg(1.6mmol)을 가하고, 25℃하 30분 교반한 후 40℃에서 3시간 교반하고, 추가로 60℃에서 3시간 교반하여 펩타이드 결합 형성 반응을 행했다. 반응액 5μL를 취하고, 노멀프로필아민 100μL(1.2mmol)에 가하여, 잔존하는 C말단 활성체를 프로필아마이드로 변환시킨 후, 메탄올 0.9mL로 희석했다. 본 용액을 LC/MS 분석에 보내어, LC/MS의 피크 면적치로부터 변환율을 구했다(변환율: >99%).
변환율(%)={Cbz-MeIle-MePhe-OMe(면적%)/[MePhe-OMe(면적%)+Cbz-MeIle-MePhe-OMe (면적%)]}×100
(가수분해 처리)
(1) 아민 비첨가의 경우
상기 조제한 펩타이드를 포함하는 반응 용액에 MTBE 3.0mL와 5% 탄산 칼륨 수용액 3.0mL를 가하고, 25℃에서, 교반자로 30분간 교반을 행했다. 교반을 정지하고, 유기층과 수층을 분층시켰다. 유기층 5μL를 취하고, 노멀프로필아민 100μL(1.2mmol)에 가하여, 잔존하는 C말단 활성체를 프로필아마이드로 변환시킨 후, 메탄올 0.9mL로 희석했다. LC/MS의 피크 면적치로부터, 이하의 계산식에 따라 C말단 활성체 잔존율을 계산했다.
C말단 활성체 잔존율(%)={프로필아마이드(면적%)/[프로필아마이드(면적%)+다이펩타이드(면적%)]}×100
(2) 아민 첨가의 경우
상기 조제한 펩타이드를 포함하는 반응 용액에 MTBE 3.0mL, N-메틸이미다졸 103μL(1.3mmol)와 5% 탄산 칼륨 수용액 3.0mL를 가하고, 25℃에서, 교반자로 30분간 교반을 행했다. 교반을 정지하고, 유기층과 수층을 분층시켰다. 유기층 5μL를 취하고, 노멀프로필아민 100μL(1.2mmol)에 가하여, 잔존하는 C말단 활성체를 프로필아마이드로 변환시킨 후, 메탄올 0.9mL로 희석했다. LC/MS의 피크 면적치로부터, 이하의 계산식에 따라 C말단 활성체 잔존율을 계산했다.
C말단 활성체 잔존율(%)={프로필아마이드(면적%)/[프로필아마이드(면적%)+다이펩타이드(면적%)]}×100
(후처리)
교반을 정지한 후, 정치하여, 유기층과 수층을 분층시키고, 수층을 제거했다. 그 다음에 유기층을 10% 황산수소 칼륨 수용액 3mL×2, 5% 탄산 칼륨 수용액 3mL, 상수 1mL×5로 순차적으로 세정했다. 교반을 정지하고, 유기층과 수층을 분층시켰다. 유기층 5μL를 취하고, 노멀프로필아민 100μL(1.2mmol)에 가하여, 잔존하는 C말단 활성체를 프로필아마이드로 변환시킨 후, 메탄올 0.9mL로 희석하고, LC/MS 분석에 보내어, 목적으로 하는 펩타이드와 잔존 C말단 활성체(프로필아마이드로의 변환체)의 피크 면적치를 구했다. 남은 유기층을 농축하여, 펩타이드를 얻었다. 아민 비첨가 가수분해에 의해 얻어진 농축물(펩타이드)은 671.8mg이었다(수율 113%: 농축물에는 불순물(잔존 C말단 활성체)을 포함하지만, 펩타이드만을 포함하는 것으로 하여 계산했다). 아민 첨가로의 가수분해에 의해 얻어진 농축물은 563.7mg이었다(수율 95%). MS(ESI): m/z 455.2 [M+H]+, 477.2 [M+Na]+.
Figure pct00008
1) LCMS의 피크 면적 비율
알칼리수 단독 처리로의 가수분해에서는, 잔존 C말단 활성체가 완전히 가수분해되지 않고, 계속되는 수성 세정으로도 잔존 C말단 활성체를 제거할 수 없었지만, NMI를 첨가하여 가수분해를 행하면, 잔존 C말단 활성체의 가수분해가 완전히 달성되고, 잔존 C말단 활성체의 제거도 완전히 할 수 있음을 발견했다. 게다가 이 때, 목적하는 다이펩타이드가 100%의 순도로 얻어졌다(수율 95%).
(실시예 7) Cbz-MeVal-MeAsp(tBu)-piperidine의 합성
(축합 반응)
MeAsp(tBu)-piperidine 303mg(1.1mmol), Cbz-MeVal-OH 448mg(1.7mmol)을 아세토나이트릴 0.6mL, 사이클로펜틸 메틸 에터 2.4mL 혼합 용매에 현탁하고, 다이아이소프로필에틸아민 586μL(3.4mmol)를 가했다. 그 다음에 25℃에서 HATU 642mg(1.7mmol)을 가하고, 25℃에서 6.5시간 교반하여 펩타이드 결합 형성 반응을 행했다. 반응액 5μL를 취하고, 노멀프로필아민 100μL(1.2mmol)에 가하여, 잔존하는 C말단 활성체를 프로필아마이드로 변환시킨 후, 메탄올 0.9mL로 희석했다. 본 용액을 LC/MS 분석에 보내어, LC/MS의 피크 면적치로부터 변환율을 구했다(변환율: 100%).
변환율(%)={Cbz-MeVal-MeAsp(tBu)-piperidine(면적%)/[MeAsp(tBu)-piperidine(면적%)+Cbz-MeVal-MeAsp(tBu)-piperidine(면적%)]}×100
(가수분해 처리)
(1) 아민 비첨가의 경우
상기 조제한 펩타이드를 포함하는 반응 용액에 5% 탄산 칼륨 수용액 3.0mL를 가하고, 25℃에서, 교반자로 5분간 교반을 행했다. 교반을 정지하고, 유기층과 수층을 분층시켰다. 유기층 5μL를 취하고, 노멀프로필아민 100μL(1.2mmol)에 가하여, 잔존하는 C말단 활성체를 프로필아마이드로 변환시킨 후, 메탄올 0.9mL로 희석했다. LC/MS의 피크 면적치로부터, 이하의 계산식에 따라 C말단 활성체 잔존율을 계산했다.
C말단 활성체 잔존율(%)={프로필아마이드(면적%)/[프로필아마이드(면적%)+다이펩타이드(면적%)]}×100
(2) 아민 첨가의 경우
상기 조제한 펩타이드를 포함하는 반응 용액에 DMAP 136mg(1.1mmol)과 5% 탄산 칼륨 수용액 3.0mL를 가하고, 25℃에서, 교반자로 5분간 교반을 행했다. 교반을 정지하고, 유기층과 수층을 분층시켰다. 유기층 5μL를 취하고, 노멀프로필아민 100μL(1.2mmol)에 가하여, 잔존하는 C말단 활성체를 프로필아마이드로 변환시킨 후, 메탄올 0.9mL로 희석했다. LC/MS의 피크 면적치로부터, 이하의 계산식에 따라 C말단 활성체 잔존율을 계산했다.
C말단 활성체 잔존율(%)={프로필아마이드(면적%)/[프로필아마이드(면적%)+다이펩타이드(면적%)]}×100
(후처리)
교반을 정지한 후, 정치하여, 유기층과 수층을 분층시키고, 수층을 제거했다. 그 다음에 유기층을 10% 황산수소 칼륨 수용액 3mL×2, 5% 탄산 칼륨 수용액 3mL x 2, 상수 1.5mL×3으로 순차적으로 세정했다. 교반을 정지하고, 유기층과 수층을 분층시켰다. 유기층 5μL를 취하고, 노멀프로필아민 100μL(1.2mmol)에 가하여, 잔존하는 C말단 활성체를 프로필아마이드로 변환시킨 후, 메탄올 0.9mL로 희석하고, LC/MS 분석에 보내어, 목적으로 하는 펩타이드와 잔존 C말단 활성체(프로필아마이드로의 변환체)의 피크 면적치를 구했다. 남은 유기층을 농축하여, 펩타이드를 얻었다. 아민 비첨가 가수분해에 의해 얻어진 농축물(펩타이드)은 782.0mg이었다(수율 136%: 농축물에는 불순물(잔존 C말단 활성체)을 포함하지만, 펩타이드만을 포함하는 것으로 하여 계산했다). 아민 첨가로의 가수분해에 의해 얻어진 농축물은 530.6mg이었다(수율 92%). MS(ESI): m/z 518.4 [M+H]+, 540.4 [M+Na]+.
Figure pct00009
1) LCMS의 피크 면적 비율
알칼리수 단독 처리로의 가수분해에서는, 잔존 C말단 활성체가 완전히 가수분해되지 않고, 계속되는 수성 세정으로도 잔존 C말단 활성체를 제거할 수 없었지만, DMAP를 첨가하여 가수분해를 행하면, 잔존 C말단 활성체의 가수분해가 완전히 달성되고, 잔존 C말단 활성체의 제거도 완전히 할 수 있음을 발견했다. 게다가 이 때, 목적하는 다이펩타이드가 100%의 순도로 얻어졌다(수율 92%).
(실시예 8) Cbz-MeVal-MeAsp(tBu)-piperidine의 합성
(축합 반응)
MeAsp(tBu)-piperidine 299mg(1.1mmol), Cbz-MeVal-OH 458mg(1.7mmol)을 2-MeTHF 4.5mL 용매에 현탁하고, 다이아이소프로필에틸아민 775μL(4.4mmol)를 가했다. 그 다음에 25℃에서 50% T3P/THF 용액 1.6mL(2.8mmol)를 가하고, 25℃에서 15시간 교반하여 펩타이드 결합 형성 반응을 행했다. 반응액 5μL를 취하고, 노멀프로필아민 100μL(1.2mmol)에 가하여, 잔존하는 C말단 활성체를 프로필아마이드로 변환시킨 후, 메탄올 0.9mL로 희석했다. 본 용액을 LC/MS 분석에 보내어, LC/MS의 피크 면적치로부터 변환율을 구했다(변환율: 100%).
변환율(%)={Cbz-MeVal-MeAsp(tBu)-piperidine(면적%)/[MeAsp(tBu)-piperidine(면적%)+Cbz-MeVal-MeAsp(tBu)-piperidine(면적%)]}×100
(가수분해 처리)
(1) 아민 비첨가의 경우
상기 조제한 펩타이드를 포함하는 반응 용액에 5% 탄산 칼륨 수용액 3.0mL를 가하고, 25℃에서, 교반자로 5분간 교반을 행했다. 교반을 정지하고, 유기층과 수층을 분층시켰다. 유기층 5μL를 취하고, 노멀프로필아민 100μL(1.2mmol)에 가하여, 잔존하는 C말단 활성체를 프로필아마이드로 변환시킨 후, 메탄올 0.9mL로 희석했다. LC/MS의 피크 면적치로부터, 이하의 계산식에 따라 C말단 활성체 잔존율을 계산했다.
C말단 활성체 잔존율(%)={프로필아마이드(면적%)/[프로필아마이드(면적%)+다이펩타이드(면적%)]}×100
(2) 아민 첨가의 경우
상기 조제한 펩타이드를 포함하는 반응 용액에 DMAP 141mg(1.1mmol)과 5% 탄산 칼륨 수용액 3.0mL를 가하고, 25℃에서, 교반자로 5분간 교반을 행했다. 교반을 정지하고, 유기층과 수층을 분층시켰다. 유기층 5μL를 취하고, 노멀프로필아민 100μL(1.2mmol)에 가하여, 잔존하는 C말단 활성체를 프로필아마이드로 변환시킨 후, 메탄올 0.9mL로 희석했다. LC/MS의 피크 면적치로부터, 이하의 계산식에 따라 C말단 활성체 잔존율을 계산했다.
C말단 활성체 잔존율(%)={프로필아마이드(면적%)/[프로필아마이드(면적%)+다이펩타이드(면적%)]}×100
(후처리)
교반을 정지한 후, 정치하여, 유기층과 수층을 분층시키고, 수층을 제거했다. 그 다음에 유기층을 10% 황산수소 칼륨 수용액 3mL, 5% 탄산 칼륨 수용액 3mL로 순차적으로 세정했다. 교반을 정지하고, 유기층과 수층을 분층시켰다. 유기층 5μL를 취하고, 노멀프로필아민 100μL(1.2mmol)에 가하여, 잔존하는 C말단 활성체를 프로필아마이드로 변환시킨 후, 메탄올 0.9mL로 희석하고, LC/MS 분석에 보내어, 목적으로 하는 펩타이드와 잔존 C말단 활성체(프로필아마이드로의 변환체)의 피크 면적치를 구했다. 남은 유기층을 농축하여, 펩타이드를 얻었다. 아민 비첨가 가수분해에 의해 얻어진 농축물(펩타이드)은 561.6mg이었다(수율 98%: 농축물에는 불순물(잔존 C말단 활성체)을 포함하지만, 펩타이드만을 포함하는 것으로 하여 계산했다). 아민 첨가로의 가수분해에 의해 얻어진 농축물은 501.1mg이었다(수율 87%). MS(ESI): m/z 518.4 [M+H]+, 540.4 [M+Na]+.
Figure pct00010
1) LCMS의 피크 면적 비율
알칼리수 단독 처리로의 가수분해에서는, 잔존 C말단 활성체가 완전히 가수분해되지 않고, 계속되는 수성 세정으로도 잔존 C말단 활성체를 제거할 수 없었지만, DMAP를 첨가하여 가수분해를 행하면, 잔존 C말단 활성체의 가수분해가 완전히 달성되고, 잔존 C말단 활성체의 제거도 완전히 할 수 있음을 발견했다. 게다가 이 때, 목적하는 다이펩타이드가 100%의 순도로 얻어졌다(수율 87%).
(실시예 9) Cbz-Ile-MeVal-MeAsp(tBu)-piperidine의 합성
(아민 비첨가로 가수분해 처리하여 얻어진 다이펩타이드를 사용한 Cbz 탈보호 반응)
실시예 7에서의 아민 비첨가 조건에서 합성한 Cbz-MeVal-MeAsp(tBu)-piperidine 782mg(잔존 C말단 활성체 17.6면적% 포함)을 사이클로펜틸 메틸 에터 4.2mL에 용해시켰다. 5% Pd/C(50%wet) 115mg과 수소 가스로 가수소분해 반응에 보냈다. 반응이 거의 진행되지 않았기 때문에, 필터를 이용하여 Pd/C를 여과제거한 후, 농축 건고하고, 재차 사이클로펜틸 메틸 에터 4.2mL에 용해시키고, 5% Pd/C(50%wet) 105mg을 가하고, 재차, 가수소분해 반응에 보냈다. 그러나, 합계 3시간 반응시켜도, 반응은 거의 진행되지 않았다(반응 변환율: 1.6%). 반응 변환율은, 반응액 5μL를 취하고, 아세토나이트릴 1.0mL로 희석한 후, 필터로 여과한 용액을 LC/MS 분석에 보내어, LC/MS의 피크 면적치로부터 구했다.
변환율(%)={MeVal-MeAsp(tBu)-piperidine(면적%)/[MeVal-MeAsp(tBu)-piperidine(면적%)+Cbz-MeVal-MeAsp(tBu)-piperidine(면적%)]}×100
(아민 첨가로 가수분해 처리하여 얻어진 다이펩타이드를 사용한 Cbz 탈보호 반응)
실시예 7에서의 아민 첨가 조건에서 합성한 Cbz-MeVal-MeAsp(tBu)-piperidine 543mg(1.0mmol)을 사이클로펜틸 메틸 에터 4.3mL에 용해시켰다. 5% Pd/C(50%wet) 124mg과 수소 가스로 가수소분해 반응에 보냈다. 실온에서 2시간 교반하여, 탈Cbz체인 MeVal-MeAsp(tBu)-piperidine을 얻었다(변환율 100%). 반응 변환율은, 반응액 5μL를 취하고, 아세토나이트릴 1.0mL로 희석한 후, 필터로 여과한 용액을 LC/MS 분석에 보내어, LC/MS의 피크 면적치로부터 구했다. MS(ESI): m/z 384.3 [M+H]+.
변환율(%)={MeVal-MeAsp(tBu)-piperidine(면적%)/[MeVal-MeAsp(tBu)-piperidine(면적%)+Cbz-MeVal-MeAsp(tBu)-piperidine(면적%)]}×100
(축합 반응)
반응액을 필터로 여과하여, Pd/C를 여과제거한 후, 농축 건고했다. 2-메틸테트라하이드로퓨란 4.3mL에 건고물을 용해시키고, Cbz-Ile-OH 362mg(1.3mmol), 다이아이소프로필에틸아민 715μL(4.1mmol)를 가했다. 그 다음에 25℃에서 50% T3P/THF 용액 1.4mL(2.4mmol)를 가하고, 40℃에서 7시간, 추가로 실온에서 14시간 교반하여 펩타이드 결합 형성 반응을 행했다(변환율: 100%). 조제한 반응 용액에 N-메틸이미다졸 81μL(1.0mmol), 20% 탄산 칼륨 수용액 2.6mL를 가하고, 25℃에서, 교반자로 45분간 교반을 행했다. 교반을 정지한 후, 정치하여, 유기층과 수층을 분층시키고, 수층을 제거했다. 그 다음에 유기층을 10% 황산수소 칼륨 수용액 5.2mL, 5% 탄산 칼륨 수용액 5.2mLx2로 순차적으로 세정했다. 얻어진 유기층 5μL를 노멀프로필아민 100μL에 가하여, 메탄올 0.9mL로 희석했다. 이 용액을 LC/MS 분석에 보내어, 목적으로 하는 펩타이드와 잔존 C말단 활성체의 피크 면적 퍼센트를 구했다. 목적으로 하는 펩타이드 Cbz-Ile-MeVal-MeAsp(tBu)-piperidine은 95.1%이고, 잔존 C말단 활성체 유래의 Cbz-Ile-NHPr은 검출되지 않았다. 남은 유기층을 농축하여, 농축물 542.7mg을 얻었다(수율 82%). MS(ESI): m/z 631.5 [M+H]+, 653.4 [M+Na]+.
알칼리수 단독으로 처리한, C말단 활성체가 잔존하고 있는 펩타이드 용액을 이용하면, Cbz 탈보호 반응이 거의 진행되지 않음이 판명되었다. 한편, DMAP를 첨가하여 처리하여 얻어진, 잔존 C말단 활성체가 완전히 제거된 펩타이드 용액을 이용하면, Cbz 탈보호 반응이 순조롭게 진행되어, 계속되는 펩타이드 합성 반응이 가능해짐을 발견했다. 즉, 본 발명의 방법을 이용하는 것에 의해, 생성된 펩타이드 화합물의 N말단의 보호기의 환원적 제거 반응을, 정체시키지 않고 진행시킬 수 있음을 알 수 있었다. 이것에 의해, 소망의 아미노산 서열을 갖는 고순도의 펩타이드 화합물을 효율적으로 제조할 수 있었다.
(실시예 10) Cbz-Phe(3-F)-Phe-OtBu의 합성
Phe-OtBu 염산염 200mg(0.8mmol), Cbz-Phe(3-F)-OH 297mg(0.9mmol)을 톨루엔 3.0mL 현탁하고, 다이아이소프로필에틸아민 407μL(2.3mmol)를 가했다. 그 다음에 25℃에서 50% T3P/THF 용액 0.9mL(1.6mmol)를 가하고, 실온하 30분 교반하여 펩타이드 결합 형성 반응을 행했다(변환율: 100%). 반응 변환율은, 반응액 5μL를 취하고, 노멀프로필아민 100μL에 가하고, 메탄올 0.9mL로 희석한 용액을 LC/MS 분석에 보내어, LC/MS의 피크 면적치로부터 구했다.
변환율(%)={Cbz-Phe(3-F)-Phe-OtBu(면적%)/[Phe-OtBu(면적%)+Cbz-Phe(3-F)-Phe-OtBu(면적%)]}×100
상기의 반응 용액에 DMAP 95mg(0.8mmol), 5% 탄산 칼륨 수용액 2.0mL를 가하고, 25℃에서, 교반자로 5분간 교반을 행했다. 교반을 정지한 후, 정치하여, 유기층과 수층을 분층시키고, 수층을 제거했다. 그 다음에 유기층을 10% 황산수소 칼륨 수용액 1mL, 5% 탄산 칼륨 수용액 1mL, 상수 1mL로 순차적으로 세정했다. 얻어진 유기층 5μL를 노멀프로필아민 100μL에 가하고, 메탄올 0.9mL로 희석했다. 이 용액을 LC/MS 분석에 보내어, 목적으로 하는 펩타이드와 잔존 C말단 활성체의 피크 면적 퍼센트를 구했다. 목적으로 하는 펩타이드 Cbz-Phe(3-F)-Phe-OtBu는 순도 100%이며, 잔존 C말단 활성체 유래의 Cbz-Phe(3-F)-NHPr은 검출되지 않았다. 남은 유기층을 농축하여, 농축물 387.2mg을 얻었다(수율 96%). MS(ESI): m/z 465.2 [M-tBu+H]+, 521.1 [M+H]+, 543.2 [M+Na]+.
DMAP를 첨가하여 가수분해를 행하면, 잔존 C말단 활성체의 제거가 완전히 달성되어, 목적하는 다이펩타이드를 100%의 순도로 얻을 수 있었다(수율 96%).
(실시예 11) Cbz-Ser(OtBu)-Phe-OtBu의 합성
Phe-OtBu 염산염 300mg(1.2mmol), Cbz-Ser(OtBu)-OH 450mg(1.5mmol)을 2-메틸테트라하이드로퓨란 3.6mL 현탁하고, 다이아이소프로필에틸아민 610μL(3.5mmol)를 가했다. 그 다음에 25℃에서 50% T3P/THF 용액 1.4mL(2.3mmol)를 가하고, 실온하 1시간 교반하여 펩타이드 결합 형성 반응을 행했다(변환율: 100%). 반응 변환율은, 반응액 5μL를 취하고, 노멀프로필아민 100μL에 가하고, 메탄올 0.9mL로 희석한 용액을 LC/MS 분석에 보내어, LC/MS의 피크 면적치로부터 구했다.
변환율(%)={Cbz-Ser(tBu)-Phe-OtBu(면적%)/[Phe-OtBu(면적%)+Cbz-Ser(tBu)-Phe-OtBu(면적%)]}×100
상기 반응 용액에 DMAP 143mg(1.2mmol), 20% 탄산 칼륨 수용액 1.5mL를 가하고, 25℃에서, 교반자로 5분간 교반을 행했다. 교반을 정지한 후, 정치하여, 유기층과 수층을 분층시키고, 수층을 제거했다. 그 다음에 유기층을 10% 황산수소 칼륨 수용액 3.0mLx2, 5% 탄산 칼륨 수용액 3.0mL, 상수 3.0mL로 순차적으로 세정했다. 얻어진 유기층 5μL를 노멀프로필아민 100μL에 가하고, 메탄올 0.9mL로 희석했다. 이 용액을 LC/MS 분석에 보내어, 목적으로 하는 펩타이드와 잔존 C말단 활성체의 피크 면적 퍼센트를 구했다. 목적으로 하는 펩타이드 Cbz-Ser(OtBu)-Phe-OtBu는 순도 100%이며, 잔존 C말단 활성체 유래의 Cbz-Ser(OtBu)-NHPr은 검출되지 않았다. 남은 유기층을 농축하여, 농축물 556.4mg을 얻었다(수율 96%). MS(ESI): m/z 387.1 [M-2tBu+H]+, 499.3 [M+H]+, 521.2 [M+Na]+.
DMAP를 첨가하여 가수분해를 행하면, 잔존 C말단 활성체의 제거가 완전히 달성되어, 목적하는 다이펩타이드가 100%의 순도로 얻을 수 있었다(수율 96%).
(실시예 12) Boc-MeVal-Phe-piperidine의 합성
(Boc 탈보호 반응)
Boc-Phe-piperidine 471mg(1.4mmol)을 다이클로로메테인 4.7mL 용해하고, 메테인설폰산 180μL(2.8mmol)를 가했다. 35℃에서 2시간 교반하여, 탈Boc 반응을 행했다(변환율 100%). 반응 변환율은, 반응액 5μL를 취하고, 아세토나이트릴 1.0mL로 희석한 용액을 LC/MS 분석에 보내어, LC/MS의 피크 면적치로부터 구했다.
변환율(%)={Phe-piperidine(면적%)/[Boc-Phe-piperidine(면적%)+Phe-piperidine(면적%)]}×100
(축합 반응)
상기 반응 용액에, 다이아이소프로필에틸아민 742μL(4.3mmol)를 가한 후, 용매를 증류제거했다. 그 다음에 아세토나이트릴 1.4mL, 2-메틸테트라하이드로퓨란 3.3mL, 다이아이소프로필에틸아민 742μL(4.3mmol), Boc-MeVal-OH 492mg(2.1mmol)을 가했다. 25℃에서 HATU 804mg(2.2mmol)을 가하고, 실온에서 1시간 교반하여 펩타이드 결합 형성 반응을 행했다(변환율: 100%). 반응 변환율은, 반응액 5μL를 취하고, 노멀프로필아민 100μL에 가하고, 메탄올 0.9mL로 희석한 용액을 LC/MS 분석에 보내어, LC/MS의 피크 면적치로부터 구했다.
변환율(%)={Boc-MeVal-Phe-piperidine(면적%)/[Phe-piperidine(면적%)+Boc-MeVal-Phe-piperidine(면적%)]}×100
상기 조제한 반응 용액에 DMAP 168mg(1.4mmol), 5% 탄산 칼륨 수용액 4.6mL를 가하고, 25℃에서, 교반자로 5분간 교반을 행했다. 교반을 정지한 후, 정치하여, 유기층과 수층을 분층시키고, 수층을 제거했다. 그 다음에 유기층을 10% 황산수소 칼륨 수용액 4.6mL, 5% 탄산 칼륨 수용액 4.6mL, 상수 1.5mL x 6으로 순차적으로 세정했다. 얻어진 유기층 5μL를 노멀프로필아민 100μL에 가하고, 메탄올 0.9mL로 희석했다. 이 용액을 LC/MS 분석에 보내어, 목적으로 하는 펩타이드와 잔존 C말단 활성체의 피크 면적 퍼센트를 구했다. 목적으로 하는 펩타이드 Boc-MeVal-Phe-OtBu는 순도 99.7%이고, 잔존 C말단 활성체 유래의 Boc-MeVal-NHPr은 검출되지 않았다. 남은 유기층을 농축하여, 농축물 542.3mg을 얻었다(수율 86%). MS(ESI): m/z 346.2 [M-Boc+H]+, 446.3 [M+H]+, 468.3 [M+Na]+.
DMAP를 첨가하여 가수분해를 행하면, 잔존 C말단 활성체의 제거가 완전히 달성되어, N말단의 보호기가 Boc여도, 목적하는 다이펩타이드를 99.7%의 순도로 얻을 수 있었다(수율 86%).
(실시예 13) Cbz-Ile-MeAla-Aze-MePhe-MeGly-OtBu/서열 번호: 1(5mer)의 합성예
(Cbz-MePhe-MeGly-OtBu의 합성)
(축합 반응)
MeGly-OtBu 염산염 2.0g(11.0mmol)을 아세트산 아이소프로필 16mL, 아세토나이트릴 4mL에 현탁하고, 다이아이소프로필다이에틸아민 7.7mL(44.0mmol), Cbz-MePhe-OH 3.6g(11.5mmol)을 가했다. 반응액을 0℃로 냉각하고, T3P/아세트산 에틸 용액 9.7mL(16.5mmol)를 가한 후, 실온에서 30분간 교반하여, 펩타이드 결합 형성 반응을 행했다(변환율: 100%). 반응 변환율은 반응액 3μL를 취하고, 메탄올 1.0mL로 희석한 후, LC/MS 분석에 보내어, LC/MS의 피크 면적치로부터 구했다.
변환율(%)={목적 화합물(면적%)/[원료(면적%)+목적 화합물(면적%)]}×100
그 다음에, NMI 1.7mL(22.0mmol), 5% 탄산 나트륨 수용액 20mL를 가하고, 50℃에서 5분간 교반했다. 교반을 정지하고, 유기층과 수층을 분층시켰다. 수층을 제거하고, 남은 유기층을 5% 황산 칼륨 수용액, 5% 탄산 칼륨 수용액×2로 세정한 후, 얻어진 유기층을 농축하여, 농축물 5.0g을 얻었다(수율 quant.). 본 농축물을 LC/MS 분석에 보내어, 목적으로 하는 Cbz-MePhe-MeGly-OtBu의 피크 면적 퍼센트를 구했다(100면적%). MS(ESI): m/z 441.2 [M+H]+, 463.2 [M+Na]+.
(Cbz-Aze-MePhe-MeGly-OtBu의 합성)
(Cbz 탈보호 반응)
상기 방법으로 얻은 Cbz-MePhe-MeGly-OtBu 전량을 아세트산 아이소프로필 75mL에 용해하고, 10% Pd/C(3% wet) 0.98g과 수소 가스로 가수소분해 반응에 보냈다. 실온에서 2시간 교반하여, 탈Cbz화체를 얻었다(변환율: 100%). 반응 변환율은 반응액 3μL를 취하고, 메탄올 1.0mL로 희석한 용액을 LC/MS 분석에 보내어, LC/MS의 피크 면적치로부터 구했다.
변환율(%)={목적 화합물(면적%)/[원료(면적%)+목적 화합물(면적%)]}×100
(축합 반응)
반응액을 필터로 여과하고, 톨루엔을 가하고 공비 탈수를 행했다. 농축물에 아세트산 아이소프로필 39mL, 아세토나이트릴 9.7mL에 용해시키고, 0℃로 냉각했다. Cbz-Aze-OH 2.6g(11.0mmol), 50% T3P/아세트산 에틸 용액 13.0mL(22.0mmol), 다이아이소프로필에틸아민 7.7mL(44.0mmol)를 가한 후, 실온에서 30분간 교반하여, 펩타이드 결합 형성 반응을 행했다(변환율: >99%). 반응 변환율은 반응액 3μL를 취하고, 메탄올 1.0mL로 희석한 후, LC/MS 분석에 보내어, LC/MS의 피크 면적치로부터 구했다.
변환율(%)={목적 화합물(면적%)/[원료(면적%)+목적 화합물(면적%)]}×100
그 다음에, NMI 1.7mL(22.0mmol), 5% 탄산 나트륨 수용액 34mL를 가하고, 50℃에서 5분간 교반했다. 교반을 정지하고, 유기층과 수층을 분층시켰다. 수층을 제거하고, 남은 유기층을 5% 황산 칼륨 수용액 34mL, 5% 탄산 칼륨 수용액 34mL로 세정한 후, 얻어진 유기층을 농축하여, 농축물 5.5g을 얻었다(수율 96%). 본 농축물을 LC/MS 분석에 보내어, 목적으로 하는 Cbz-Aze-MePhe-MeGly-OtBu의 피크 면적 퍼센트를 구했다(99.8면적%). MS(ESI): m/z 546.2 [M+Na]+.
(Cbz-MeAla-Aze-MePhe-MeGly-OtBu/서열 번호: 2의 합성)
(Cbz 탈보호 반응)
상기 방법으로 얻은 Cbz-Aze-MePhe-MeGly-OtBu 5.5g(10.6mmol)을 아세트산 아이소프로필 75mL에 용해하고, 10% Pd/C(3% wet) 0.95g과 수소 가스로 가수소분해 반응에 보냈다. 50℃에서 2시간 교반하여, 탈Cbz화체를 얻었다(변환율: 100%). 반응 변환율은 반응액 3μL를 취하고, 메탄올 1.0mL로 희석한 용액을 LC/MS 분석에 보내어, LC/MS의 피크 면적치로부터 구했다.
변환율(%)={목적 화합물(면적%)/[원료(면적%)+목적 화합물(면적%)]}×100
(축합 반응)
반응액을 필터로 여과하고, 톨루엔을 가하고 2회 공비 탈수를 행했다. 농축물에 아세트산 아이소프로필 32.8mL, 아세토나이트릴 8.2mL에 용해시켰다. Cbz-MeAla-OH 2.7g(11.1mmol), 다이아이소프로필에틸아민 7.4mL(42.3mmol)를 가한 후, 50% T3P/아세트산 에틸 용액 12.5mL(21.1mmol), 다이아이소프로필에틸아민 7.4mL(42.3mmol)를 가했다. 실온에서 2시간 교반한 후, Cbz-MeAla-OH 0.39g(1.7mmol), T3P/아세트산 에틸 용액 1.9mL(3.2mmol), 다이아이소프로필에틸아민 1.1mL(6.3mmol)를 추가하고, 추가로 실온에서 2시간 교반하여, 펩타이드 결합 형성 반응을 행했다(변환율: 97%). 반응 변환율은 반응액 3μL를 취하고, 메탄올 1.0mL로 희석한 후, LC/MS 분석에 보내어, LC/MS의 피크 면적치로부터 구했다.
변환율(%)={목적 화합물(면적%)/[원료(면적%)+목적 화합물(면적%)]}×100
그 다음에, NMI 1.7mL(21.1mmol), 5% 탄산 나트륨 수용액 41mL를 가하고, 50℃에서 5분간 교반했다. 교반을 정지하고, 유기층과 수층을 분층시켰다. 수층을 제거하고, 남은 유기층을 5% 황산 칼륨 수용액 41mL, 5% 탄산 칼륨 수용액 41mL로 세정한 후, 얻어진 유기층을 농축하여, 농축물 5.8g을 얻었다(수율 91%). 본 농축물을 LC/MS 분석에 보내어, 목적으로 하는 Cbz-MeAla-Aze-MePhe-MeGly-OtBu(서열 번호: 2)의 피크 면적 퍼센트를 구했다(99.5면적%). MS(ESI): m/z 609.3 [M+H]+ 631.3 [M+Na]+.
(Cbz-Ile-MeAla-Aze-MePhe-MeGly-OtBu/서열 번호: 1의 합성)
(Cbz 탈보호 반응)
상기 방법으로 얻은 Cbz-MeAla-Aze-MePhe-MeGly-OtBu(서열 번호: 2) 5.8g(9.6mmol)을 아세트산 아이소프로필 88mL에 용해하고, 10% Pd/C(3% wet) 0.93g과 수소 가스로 가수소분해 반응에 보냈다. 실온에서 5시간 교반한 후, 반응액을 필터로 여과했다(변환율: 100%). 반응 변환율은 반응액 3μL를 취하고, 메탄올 1.0mL로 희석한 용액을 LC/MS 분석에 보내어, LC/MS의 피크 면적치로부터 구했다.
변환율(%)={목적 화합물(면적%)/[원료(면적%)+목적 화합물(면적%)]}×100
여과액을 농축하여, 농축물 4.4g을 얻었다(수율 97%). 본 농축물을 LC/MS 분석에 보내어, 목적으로 하는 MeAla-Aze-MePhe-MeGly-OtBu(서열 번호: 3)의 피크 면적 퍼센트를 구했다(99.7면적%). MS(ESI): m/z 475.3 [M+H]+.
(축합 반응)
상기 농축물 1.5g(3.2mmol)과 Cbz-Ile-OH 1.3g(4.7mmol)을 아세트산 아이소프로필 18mL, 아세토나이트릴 4.5mL에 용해시켰다. 다이아이소프로필에틸아민 2.2mL(12.6mmol), HATU 2.4g(6.3mmol)을 가하고, 실온에서 30분간 교반하여, 펩타이드 결합 형성 반응을 행했다(변환율: >99%). 반응 변환율은 반응액 3μL를 취하고, 메탄올 1.0mL로 희석한 후, LC/MS 분석에 보내어, LC/MS의 피크 면적치로부터 구했다.
변환율(%)={목적 화합물(면적%)/[원료(면적%)+목적 화합물(면적%)]}×100
그 다음에, NMI 0.75mL(9.5mmol), 5% 탄산 나트륨 수용액 22.5mL를 가하고, 50℃에서 20분간 교반했다. 교반을 정지하고, 유기층과 수층을 분층시켰다. 수층을 제거하고, 남은 유기층을 5% 황산 칼륨 수용액 22.5mL×2, 5% 탄산 칼륨 수용액 22.5mL×3으로 세정한 후, 얻어진 유기층을 농축하여, 농축물 2.4g을 얻었다(수율 quant.). 본 농축물을 LC/MS 분석에 보내어, 목적으로 하는 Cbz-Ile-MeAla-Aze-MePhe-MeGly-OtBu(서열 번호: 1)의 피크 면적 퍼센트를 구했다(99.1면적%). MS(ESI): m/z 744.3 [M+Na]+.
NMI를 첨가하여 가수분해를 1회 행하고, 계속해서 수성 세정하는 것에 의해, 잔존 C말단 활성체의 완전한 제거가 달성되어, 목적하는 펜타펩타이드가 99.1%의 순도로 얻어졌다. 그 수율은, 최초의 아미노산으로부터의 통산으로 87%였다. 본 결과는, 연속적인 액상 펩타이드 합성에 있어서, 아민 첨가제를 이용하여 잔존 C말단 활성체를 완전히 제거함으로써, 고순도의 펜타펩타이드 합성을 고수율로 달성했음을 나타내는 것이다.
(실시예 14)
Cbz-MeAla-MePhe-Leu-MeLeu-Val-MeGly-MeIle-Ser(tBu)-MePhe-MeVal-Asp(tBu)-piperidine/서열 번호: 4(11mer)의 합성
(Cbz-MeVal-Asp(tBu)-piperidine의 합성)
(축합 반응)
Asp(tBu)-piperidine 8.6g(33.5mmol)을 사이클로펜틸 메틸 에터 108mL에 용해시켰다. Cbz-MeVal-OH 9.79g(36.9mmol), 다이아이소프로필에틸아민 17.6mL(101mmol)를 가했다. BEP 13.8g(50.3mmol)을 아세토나이트릴 21.5mL에 용해한 후, 반응액에 가하고, 실온에서 3분간 교반하여, 펩타이드 결합 형성 반응을 행했다(변환율: >99%). 반응 변환율은 반응액 5μL를 취하고, 메탄올 1.0mL로 희석한 후, LC/MS 분석에 보내어, LC/MS의 피크 면적치로부터 구했다.
변환율(%)={목적 화합물(면적%)/[원료(면적%)+목적 화합물(면적%)]}×100
반응액을 10% 황산수소 칼륨 수용액 150mL로 세정한 후, 5% 탄산 칼륨 수용액 150mL와 트라이메틸아민 염산염 9.52g(101mmol)을 가하고, 40℃에서 90분간 교반했다. 교반을 정지하고, 유기층과 수층을 분층시켰다. 수층을 제거하고, 남은 유기층을 5% 탄산 칼륨 수용액 150mL로 세정한 후, 얻어진 유기층을 농축하여, 농축물 17g을 얻었다(수율: quant.). 본 농축물을 LC/MS 분석에 보내어, 목적으로 하는 Cbz-MeVal-Asp(tBu)-piperidine의 피크 면적 퍼센트를 구했다(99.7면적%).
(Cbz-MePhe-MeVal-Asp(tBu)-piperidine의 합성)
(Cbz 탈보호 반응)
상기 방법으로 얻은 Cbz-MeVal-Asp(tBu)-piperidine 9.5g(9.6mmol)을 사이클로펜틸 메틸 에터 50mL에 용해하고, 10% Pd/C(3%wet) 1.9g과 수소 가스로 가수소분해 반응에 보내고, 35℃에서 2시간 교반했다(변환율: 100%). 반응 변환율은 반응액 5μL를 취하고, 메탄올 1.0mL로 희석한 후, LC/MS 분석에 보내어, LC/MS의 피크 면적치로부터 구했다.
변환율(%)={목적 화합물(면적%)/[원료(면적%)+목적 화합물(면적%)]}×100
마찬가지의 조작을 재차 행하고, 합한 반응액을 필터로 여과했다. 여과액을 농축하여, 농축물 14.0g을 얻었다(수율: quant.). 본 농축물을 LC/MS 분석에 보내어, 목적으로 하는 MeVal-Asp(tBu)-piperidine의 피크 면적 퍼센트를 구했다(99.5면적%).
(축합 반응)
상기 농축물을 사이클로펜틸 메틸 에터 126mL, 아세토나이트릴 14mL에 용해시켰다. Cbz-MePhe-OH 13.0g(41.7mmol), 다이아이소프로필에틸아민 52.9mL(303mmol)를 가했다. 50% T3P/아세트산 에틸 용액 67.0mL(114mmol)를 가하고, 실온에서 1시간 교반하여, 펩타이드 결합 형성 반응을 행했다(변환율: >99%). 반응 변환율은 반응액 5μL를 취하고, 메탄올 1.0mL로 희석한 후, LC/MS 분석에 보내어, LC/MS의 피크 면적치로부터 구했다.
변환율(%)={목적 화합물(면적%)/[원료(면적%)+목적 화합물(면적%)]}×100
반응액을 5% 황산수소 칼륨 수용액 140mL로 세정한 후, 5% 탄산 칼륨 수용액 140mL와 트라이메틸아민 염산염 10.9g(114mmol)을 가하고, 실온에서 30분간 교반했다. 교반을 정지하고, 유기층과 수층을 분층시켰다. 수층을 제거하고, 남은 유기층을 5% 탄산 칼륨 수용액 140mL로 세정한 후, 얻어진 유기층을 농축하여, 농축물 24.1g을 얻었다(수율 96%). 본 농축물을 LC/MS 분석에 보내어, 목적으로 하는 Cbz-MePhe-MeVal-Asp(tBu)-piperidine의 피크 면적 퍼센트를 구했다(99.6면적%).
(Cbz-Ser(tBu)-MePhe-MeVal-Asp(tBu)-piperidine/서열 번호: 5의 합성)
(Cbz 탈보호 반응)
상기 방법으로 얻은 Cbz-MePhe-MeVal-Asp(tBu)-piperidine 11.5g(9.6mmol)을 사이클로펜틸 메틸 에터 58mL에 용해하고, 10% Pd/C 2.3g과 수소 가스로 가수소분해 반응에 보내고, 35℃에서 2시간 교반했다(변환율: 100%). 반응 변환율은 반응액 5μL를 취하고, 메탄올 1.0mL로 희석한 후, LC/MS 분석에 보내어, LC/MS의 피크 면적치로부터 구했다.
변환율(%)={목적 화합물(면적%)/[원료(면적%)+목적 화합물(면적%)]}×100
마찬가지의 조작을 재차 행하고, 합한 반응액을 필터로 여과했다. 여과액을 농축하여, 농축물 18.1g을 얻었다(수율 99%).
(축합 반응)
상기 농축물 17.3g(32.6mmol)를 사이클로펜틸 메틸 에터 153mL, 아세토나이트릴 17mL에 용해시켰다. Cbz-Ser(tBu)-OH 10.6g(35.9mmol), 다이아이소프로필에틸아민 45.5mL(261mmol)를 가했다. 50% T3P/아세트산 에틸 용액 57.6mL(98.0mmol)를 가하고, 실온에서 15분간 교반하여, 펩타이드 결합 형성 반응을 행했다(변환율: >99%). 반응 변환율은 반응액 5μL를 취하고, 메탄올 1.0mL로 희석한 후, LC/MS 분석에 보내어, LC/MS의 피크 면적치로부터 구했다.
변환율(%)={목적 화합물(면적%)/[원료(면적%)+목적 화합물(면적%)]}×100
반응액을 5% 황산수소 칼륨 수용액 170mL로 세정한 후, 5% 탄산 칼륨 수용액 170mL와 트라이메틸아민 염산염 9.4g(98.0mmol)을 가하고, 실온에서 2시간 교반했다. 교반을 정지하고, 유기층과 수층을 분층시켰다. 수층을 제거하고, 남은 유기층을 5% 탄산 칼륨 수용액 170mL로 세정한 후, 얻어진 유기층을 농축하여, 농축물 26.5g을 얻었다(수율: quant.). 본 농축물을 LC/MS 분석에 보내어, 목적으로 하는 Cbz-Ser(tBu)-MePhe-MeVal-Asp(tBu)-piperidine(서열 번호: 5)의 피크 면적 퍼센트를 구했다(98.9면적%). MS (ESI): 830.4 [M+Na]+.
(Cbz-MeIle-Ser(tBu)-MePhe-MeVal-Asp(tBu)-piperidine/서열 번호: 6의 합성)
(Cbz 탈보호 반응)
Cbz-Ser(tBu)-MePhe-MeVal-Asp(tBu)-piperidine(서열 번호: 5) 12.0g(14.9mmol)을 사이클로펜틸 메틸 에터 60mL에 용해하고, 10% Pd/C 2.4g과 수소 가스로 가수소분해 반응에 보내고, 35℃에서 2시간 교반했다(변환율: >98%). 반응 변환율은 반응액 5μL를 취하고, 메탄올 1.0mL로 희석한 후, LC/MS 분석에 보내어, LC/MS의 피크 면적치로부터 구했다.
변환율(%)={목적 화합물(면적%)/[원료(면적%)+목적 화합물(면적%)]}×100
마찬가지의 조작을 재차 행하고, 합한 반응액을 필터로 여과했다. 여과액을 농축하여, 농축물 19.5g을 얻었다(수율 97%).
(축합 반응)
상기 농축물 16.0g(23.7mmol)를 사이클로펜틸 메틸 에터 200mL에 용해시켰다. Cbz-MeIle-OH 7.3g(26.1mmol), 다이아이소프로필에틸아민 12.4mL(71.2mmol)를 가했다. BEP 9.8g(35.6mmol)을 아세토나이트릴 40mL에 용해한 후, 반응액에 가하고, 실온에서 5분간 교반하여, 펩타이드 결합 형성 반응을 행했다(변환율: >99%). 반응 변환율은 반응액 5μL를 취하고, 메탄올 1.0mL로 희석한 후, LC/MS 분석에 보내어, LC/MS의 피크 면적치로부터 구했다.
변환율(%) = {목적 화합물(면적%)/[원료(면적%)+목적 화합물(면적%)]}×100
반응액을 10% 황산수소 나트륨 수용액 240mL로 세정한 후, 5% 탄산 칼륨 수용액 240mL와 트라이메틸아민 염산염 6.7g(71.2mmol)을 가하고, 40℃에서 1.5시간 교반했다. 교반을 정지하고, 유기층과 수층을 분층시켰다. 수층을 제거하고, 남은 유기층을 5% 탄산 칼륨 수용액 240mL로 세정한 후, 얻어진 유기층을 농축하여, 농축물 22.2g을 얻었다(수율: quant.). 본 농축물을 LC/MS 분석에 보내어, 목적으로 하는 Cbz-MeIle-Ser(tBu)-MePhe-MeVal-Asp(tBu)-piperidine(서열 번호: 6)의 피크 면적 퍼센트를 구했다(99.4면적%).
(Cbz-MeGly-MeIle-Ser(tBu)-MePhe-MeVal-Asp(tBu)-piperidine/서열 번호: 7의 합성)
(Cbz 탈보호 반응)
Cbz-MeIle-Ser(tBu)-MePhe-MeVal-Asp(tBu)-piperidine(서열 번호: 6) 9.5g(10.2mmol)을 사이클로펜틸 메틸 에터 48mL에 용해하고, 10% Pd/C 1.9g과 수소 가스로 가수소분해 반응에 보내고, 35℃에서 2시간 교반했다. 마찬가지의 조작을 재차 행하고, 합한 반응액을 필터로 여과했다. 여과액을 농축하여, 농축물 15.6g을 얻었다(수율 96%).
(축합 반응)
상기 농축물 15.3g(19.1mmol)을 사이클로펜틸 메틸 에터 138mL, 아세토나이트릴 15mL에 용해시켰다. Cbz-MeGly-OH 4.7g(21.0mmol), 다이아이소프로필에틸아민 26.7mL(153mmol)를 가했다. 50% T3P/아세트산 에틸 용액 33.8mL(57.3mmol)를 가하고, 실온에서 15분간 교반하여, 펩타이드 결합 형성 반응을 행했다(변환율: >99%). 반응 변환율은 반응액 5μL를 취하고, 메탄올 1.0mL로 희석한 후, LC/MS 분석에 보내어, LC/MS의 피크 면적치로부터 구했다.
변환율(%)={목적 화합물(면적%)/[원료(면적%)+목적 화합물(면적%)]}×100
반응액을 5% 황산수소 칼륨 수용액 153mL로 세정한 후, 5% 탄산 칼륨 수용액 153mL를 가하고, 실온에서 5분간 교반했다. 교반을 정지하고, 유기층과 수층을 분층시키고, 수층을 제거한 후, 5% 탄산 칼륨 수용액 153mL를 가하고, 실온에서 1시간 교반했다. 수층을 제거한 후, 얻어진 유기층을 농축하여, 농축물 19.5g을 얻었다(수율: quant.). 본 농축물을 LC/MS 분석에 보내어, 목적으로 하는 Cbz-MeGly-MeIle-Ser(tBu)-MePhe-MeVal-Asp(tBu)-piperidine(서열 번호: 7)의 피크 면적 퍼센트를 구했다(99.6면적%).
(Cbz-Val-MeGly-MeIle-Ser(tBu)-MePhe-MeVal-Asp(tBu)-piperidine/서열 번호: 8의 합성)
(Cbz 탈보호 반응)
Cbz-MeGly-MeIle-Ser(tBu)-MePhe-MeVal-Asp(tBu)-piperidine(서열 번호: 7) 9.5g(10.2mmol)를 사이클로펜틸 메틸 에터 48mL에 용해하고, 10% Pd/C 1.9g과 수소 가스로 가수소분해 반응에 보내고, 35℃에서 3시간 교반했다(변환율: 100%). 반응 변환율은 반응액 5μL를 취하고, 메탄올 1.0mL로 희석한 후, LC/MS 분석에 보내어, LC/MS의 피크 면적치로부터 구했다.
변환율(%)={목적 화합물(면적%)/[원료(면적%)+목적 화합물(면적%)]}×100
마찬가지의 조작을 재차 행하고, 합한 반응액을 필터로 여과했다. 여과액을 농축하여, 농축물 16.3g을 얻었다(수율 99%).
(축합 반응)
상기 농축물 16.0g(18.4mmol)을 사이클로펜틸 메틸 에터 144mL, 아세토나이트릴 16mL에 용해시켰다. Cbz-Val-OH 5.1g(20.2mmol), 다이아이소프로필에틸아민 25.6mL(147mmol)를 가했다. 50% T3P/아세트산 에틸 용액 32.4mL(55.0mmol)를 가하고, 실온에서 30분간 교반하여, 펩타이드 결합 형성 반응을 행했다(변환율: >99%). 반응 변환율은 반응액 5μL를 취하고, 메탄올 1.0mL로 희석한 후, LC/MS 분석에 보내어, LC/MS의 피크 면적치로부터 구했다.
변환율(%)={목적 화합물(면적%)/[원료(면적%)+목적 화합물(면적%)]}×100
반응액을 5% 황산수소 칼륨 수용액 160mL로 세정한 후, 5% 탄산 칼륨 수용액 153mL, 트라이메틸아민 염산염 5.3g(55.0mmol)을 가하고, 60℃에서 1시간 교반했다. 교반을 정지하고, 유기층과 수층을 분층시키고, 수층을 제거한 후, 얻어진 유기층을 5% 탄산 칼륨 수용액 160mL세정, 농축하여, 농축물 20.0g을 얻었다(수율 99%). 본 농축물을 LC/MS 분석에 보내어, 목적으로 하는 Cbz-Val-MeGly-MeIle-Ser(tBu)-MePhe-MeVal-Asp(tBu)-piperidine(서열 번호: 8)의 피크 면적 퍼센트를 구했다(99.6면적%).
(Cbz-MeLeu-Val-MeGly-MeIle-Ser(tBu)-MePhe-MeVal-Asp(tBu)-piperidine/서열 번호: 9의 합성)
(Cbz 탈보호 반응)
Cbz-Val-MeGly-MeIle-Ser(tBu)-MePhe-MeVal-Asp(tBu)-piperidine(서열 번호: 8) 9.2g(8.3mmol)을 사이클로펜틸 메틸 에터 46mL에 용해하고, 10% Pd/C 1.8g과 수소 가스로 가수소분해 반응에 보내고, 35℃에서 6시간, 추가로 45℃에서 4시간 교반했다(변환율: 100%). 반응 변환율은 반응액 5μL를 취하고, 메탄올 1.0mL로 희석한 후, LC/MS 분석에 보내어, LC/MS의 피크 면적치로부터 구했다.
변환율(%)={목적 화합물(면적%)/[원료(면적%)+목적 화합물(면적%)]}×100
마찬가지의 조작을 재차 행하고, 합한 반응액을 필터로 여과했다. 여과액을 농축하여, 농축물 15.9g을 얻었다(수율 98%). 본 농축물을 LC/MS 분석에 보내어, 목적으로 하는 Val-MeGly-MeIle-Ser(tBu)-MePhe-MeVal-Asp(tBu)-piperidine(서열 번호: 10)의 피크 면적 퍼센트를 구했다(97.9면적%).
(축합 반응)
상기 농축물 14.5g(14.9mmol)을 사이클로펜틸 메틸 에터 181mL에 용해시켰다. Cbz-MeLeu-OH 4.6g(16.4mmol), 다이아이소프로필에틸아민 7.8mL(44.8mmol)를 가했다. BEP 4.9g(17.9mmol)을 아세토나이트릴 36mL에 용해시킨 후, 얻어진 BEP 용액을 반응액에 가하고, 40℃에서 1분간 교반하여, 펩타이드 결합 형성 반응을 행했다(변환율: >99%). 반응 변환율은 반응액 5μL를 취하고, 메탄올 1.0mL로 희석한 후, LC/MS 분석에 보내어, LC/MS의 피크 면적치로부터 구했다.
변환율(%)={목적 화합물(면적%)/[원료(면적%)+목적 화합물(면적%)]}×100
반응액을 10% 황산수소 나트륨 수용액 128mL로 세정한 후, 5% 탄산 칼륨 수용액 128mL, 트라이메틸아민 염산염 4.2g(44.8mmol)를 가하고, 40℃에서 30분간 교반했다. 교반을 정지하고, 유기층과 수층을 분층시키고, 수층을 제거한 후, 얻어진 유기층을 5% 탄산 칼륨 수용액 128mL 세정, 농축하여, 농축물 18.0g을 얻었다(수율 98%). 본 농축물을 LC/MS 분석에 보내어, 목적으로 하는 Cbz-MeLeu-Val-MeGly-MeIle-Ser(tBu)-MePhe-MeVal-Asp(tBu)-piperidine(서열 번호: 9)의 피크 면적 퍼센트를 구했다(96.0면적%).
(Cbz-Leu-MeLeu-Val-MeGly-MeIle-Ser(tBu)-MePhe-MeVal-Asp(tBu)-piperidine/서열 번호: 11의 합성)
(Cbz 탈보호 반응)
Cbz-MeLeu-Val-MeGly-MeIle-Ser(tBu)-MePhe-MeVal-Asp(tBu)-piperidine(서열 번호: 9) 8.0g(6.5mmol)을 사이클로펜틸 메틸 에터 40mL에 용해하고, 10% Pd/C 1.6g과 수소 가스로 가수소분해 반응에 보내고, 45℃에서 4시간 교반했다(변환율: 100%). 반응 변환율은 반응액 5μL를 취하고, 메탄올 1.0mL로 희석한 후, LC/MS 분석에 보내어, LC/MS의 피크 면적치로부터 구했다.
변환율(%)={목적 화합물(면적%)/[원료(면적%)+목적 화합물(면적%)]}×100
마찬가지의 조작을 재차 행하고, 합한 반응액을 필터로 여과했다. 여과액을 농축하여, 농축물 14.3g을 얻었다(수율 quant.). 본 농축물을 LC/MS 분석에 보내어, 목적으로 하는 MeLeu-Val-MeGly-MeIle-Ser(tBu)-MePhe-MeVal-Asp(tBu)-piperidine(서열 번호: 12)의 피크 면적 퍼센트를 구했다(95.8면적%). MS (ESI): m/z 1098.6 [M+H]+.
(축합 반응)
상기 농축물 13.0g(11.8mmol)을 사이클로펜틸 메틸 에터 117mL, 아세토나이트릴 13mL에 용해시켰다. Cbz-Leu-OH 3.5g(13.0mmol), 다이아이소프로필에틸아민 16.5mL(95.0mmol)를 가했다. 50% T3P/아세트산 에틸 용액 20.9mL(35.5mmol)를 반응액에 가하고, 실온에서 30분간 교반하여, 펩타이드 결합 형성 반응을 행했다(변환율: >99%). 반응 변환율은 반응액 5μL를 취하고, 메탄올 1.0mL로 희석한 후, LC/MS 분석에 보내어, LC/MS의 피크 면적치로부터 구했다.
변환율(%)={목적 화합물(면적%)/[원료(면적%)+목적 화합물(면적%)]}×100
반응액을 5% 황산수소 칼륨 수용액 130mL로 세정한 후, 5% 탄산 칼륨 수용액 130mL, 트라이메틸아민 염산염 3.4g(35.5mmol)을 가하고, 60℃에서 45분간 교반했다. 교반을 정지하고, 유기층과 수층을 분층시키고, 수층을 제거한 후, 얻어진 유기층을 5% 탄산 칼륨 수용액 130mL 세정, 농축하여, 농축물 15.6g을 얻었다(수율 98%). 본 농축물을 LC/MS 분석에 보내어, 목적으로 하는 Cbz-Leu-MeLeu-Val-MeGly-MeIle-Ser(tBu)-MePhe-MeVal-Asp(tBu)-piperidine(서열 번호: 11)의 피크 면적 퍼센트를 구했다(97.2면적%).
(Cbz-MePhe-Leu-MeLeu-Val-MeGly-MeIle-Ser(tBu)-MePhe-MeVal-Asp(tBu)-piperidine/서열 번호: 12의 합성)
(Cbz 탈보호 반응)
Cbz-Leu-MeLeu-Val-MeGly-MeIle-Ser(tBu)-MePhe-MeVal-Asp(tBu)-piperidine(서열 번호: 11) 10.0g(7.4mmol)을 사이클로펜틸 메틸 에터 50mL에 용해하고, 10% Pd/C 2.0g과 수소 가스로 가수소분해 반응에 보내고, 45℃에서 4시간 교반했다(변환율: 100%). 반응액을 필터로 여과한 후, 여과액을 농축하여, 농축물 8.9g을 얻었다(수율 99%). 반응 변환율은 반응액 5μL를 취하고, 메탄올 1.0mL로 희석한 후, LC/MS 분석에 보내어, LC/MS의 피크 면적치로부터 구했다. MS (ESI): m/z 1211.7 [M+H]+, 1233.7 [M+Na]+.
변환율(%)={목적 화합물(면적%)/[원료(면적%)+목적 화합물(면적%)]}×100
(축합 반응)
상기 농축물 7.0g(5.8mmol)을 사이클로펜틸 메틸 에터 87.5mL에 용해시켰다. Cbz-MePhe-OH 2.0g(6.4mmol), 다이아이소프로필에틸아민 3.0mL(17.3mmol)를 가했다. BEP 1.9g(17.9mmol)을 아세토나이트릴 17.5mL에 용해시킨 후, 얻어진 BEP 용액을 반응액에 가하고, 실온에서 3분간 교반하여, 펩타이드 결합 형성 반응을 행했다(변환율: >99%). 반응 변환율은 반응액 5μL를 취하고, 메탄올 1.0mL로 희석한 후, LC/MS 분석에 보내어, LC/MS의 피크 면적치로부터 구했다.
변환율(%) = {목적 화합물(면적%)/[원료(면적%)+목적 화합물(면적%)]}×100
반응액을 10% 황산수소 나트륨 수용액 105mL로 세정한 후, 5% 탄산 칼륨 수용액 105mL, 트라이메틸아민 염산염 1.7g(17.3mmol)을 가하고, 40℃에서 30분간 교반했다. 교반을 정지하고, 유기층과 수층을 분층시키고, 수층을 제거한 후, 얻어진 유기층을 5% 탄산 칼륨 수용액 105mL 세정, 농축하여, 농축물 8.6g을 얻었다(수율 99%). 본 농축물을 LC/MS 분석에 보내어, 목적으로 하는 Cbz-MePhe-Leu-MeLeu-Val-MeGly-MeIle-Ser(tBu)-MePhe-MeVal-Asp(tBu)-piperidine(서열 번호: 12)의 피크 면적 퍼센트를 구했다(97.0면적%).
(Cbz-MeAla-MePhe-Leu-MeLeu-Val-MeGly-MeIle-Ser(tBu)-MePhe-MeVal-Asp(tBu)-piperidine/서열 번호: 4의 합성)
(Cbz 탈보호 반응)
Cbz-MePhe-Leu-MeLeu-Val-MeGly-MeIe-Ser(tBu)-MePhe-MeVal-Asp(tBu)-piperidine(서열 번호: 12) 7.6g(5.0mmol)을 사이클로펜틸 메틸 에터 38mL에 용해하고, 10% Pd/C 2.0g과 수소 가스로 가수소분해 반응에 보내고, 45℃에서 4시간 교반했다(변환율: 100%). 반응액을 필터로 여과한 후, 여과액을 농축하여, 농축물 6.8g을 얻었다(수율 98%). 반응 변환율은 반응액 5μL를 취하고, 메탄올 1.0mL로 희석한 후, LC/MS 분석에 보내어, LC/MS의 피크 면적치로부터 구했다.
변환율(%)={목적 화합물(면적%)/[원료(면적%)+목적 화합물(면적%)]}×100
(축합 반응)
상기 농축물 500mg(0.4mmol)을 사이클로펜틸 메틸 에터 4.5mL, 아세토나이트릴 0.5mL에 용해시켰다. Cbz-MeAla-OH 95.0mg(0.4mmol), 다이아이소프로필에틸아민 509μL(2.9mmol)를 가했다. 50% T3P/아세트산 에틸 용액 644μL(1.1mmol)를 가하고, 실온에서 2시간 교반하여, 펩타이드 결합 형성 반응을 행했다(변환율: >99%). 반응 변환율은 반응액 5μL를 취하고, 메탄올 1.0mL로 희석한 후, LC/MS 분석에 보내어, LC/MS의 피크 면적치로부터 구했다.
변환율(%)={목적 화합물(면적%)/[원료(면적%)+목적 화합물(면적%)]}×100
반응액을 10% 황산수소 나트륨 수용액 5.0mL로 세정한 후, 5% 탄산 칼륨 수용액 5.0mL, 트라이메틸아민 염산염 104mg(1.1mmol)를 가하고, 실온에서 1시간 교반했다. 교반을 정지하고, 유기층과 수층을 분층시키고, 수층을 제거한 후, 얻어진 유기층을 5% 탄산 칼륨 수용액 5.0mL로 세정, 농축하여, 농축물 555mg을 얻었다(수율 96%, Cbz-MeAla-MePhe-Leu-MeLeu-Val-MeGly-MeIle-Ser(tBu)-MePhe-MeVal-Asp(tBu)-piperidine(서열 번호: 4)은 95.3면적%). MS(ESI): m/z 1591.9 [M+H]+, 1613.9 [M+Na]+.
트라이메틸아민을 첨가하여 가수분해를 1회 행하고, 계속해서 수성 세정하는 것에 의해, 잔존 C말단 활성체의 완전한 제거가 달성되어, 11개의 아미노산으로 이루어지는 펩타이드를 고순도 95.3%로 얻을 수 있었다. 그 수율은, 최초의 아미노산으로부터의 통산으로 75.3%였다. 본 결과는, 연속적인 액상 펩타이드 합성에 있어서, 아민 첨가제를 이용하여 잔존 C말단 활성체를 제거함으로써, 고순도의 폴리펩티드 합성을 달성할 수 있음을 나타내는 것이다.
(실시예 15) Teoc-MeLeu-Phe-OtBu의 합성
(Teoc-MeLeu-Opfp의 합성)
MeLeu-OH 2.35g(16.2mmol)을 1,4-다이옥세인 23.5mL에 용해시키고, Teoc-OSu 4.61g(17.8mmol), 물 23.5mL, 트라이에틸아민 4.5mL(32.4mmol)를 가했다. 실온에서 1시간 교반하여, Teoc화 반응을 행했다. 5% 황산수소 칼륨 수용액을 가하여, 반응 용액을 산성으로 한 후, 아세트산 에틸 50mL로 추출하고, 유기층을 포화 식염수로 세정했다. 얻어진 유기층을 농축 건고하고, 농축물을 다이클로로메테인 30mL에 용해시켰다. Pfp-OH 3.10g(16.2mmol), EDC 염산염 4.53g(24.3mmol)을 가하고, 실온에서 30분간 교반하여, Pfp화 반응을 행했다. 반응 용액을 포화 식염수로 세정한 후, 수층을 아세트산 에틸 50mL로 추출했다. 합한 유기층을 농축하고, 얻어진 농축물을 컬럼 크로마토그래피(아세트산 에틸/헵테인)로 정제하여, Teoc-MeLeu-OPfp 6.63g을 얻었다(수율: 90%).
(축합 반응)
Phe-OtBu 염산염 201mg(0.8mmol), Teoc-MeLeu-OPfp 536mg(1.2mmol)을 아세트산 아이소프로필 3.0mL에 현탁하고, 4-메틸모폴린 257μL(2.3mmol)를 가하고, 25℃에서 3시간 교반하여 펩타이드 결합 형성 반응을 행했다. 반응액 5μL를 취하고, 프로필아민 100μL(1.2mmol)에 가하여, 잔존하는 C말단 활성체를 프로필아마이드로 변환시킨 후, 메탄올 0.9mL로 희석했다. 본 용액을 LC/MS 분석에 보내어, LC/MS의 피크 면적치로부터 변환율을 구했다(변환율: 100%).
변환율(%)={Teoc-MeLeu-Phe-OtBu(면적%)/[Phe-OtBu(면적%)+Teoc-MeLeu-Phe-OtBu(면적%)]}×100
(가수분해 처리)
(1) 아민 비첨가의 경우
상기 조제한 펩타이드를 포함하는 반응 용액에 5% 탄산 나트륨 수용액 2.0mL를 가하고, 25℃에서 교반자로 20분간 교반을 행했다. 교반을 정지하고, 유기층과 수층을 분층시켰다. 유기층 5μL를 취하고, 프로필아민 100μL(1.2mmol)에 가하여, 잔존하는 C말단 활성체를 프로필아마이드로 변환시킨 후, 메탄올 0.9mL로 희석했다. LC/MS의 피크 면적치로부터, 이하의 계산식에 따라 C말단 활성체 잔존율을 계산했다.
C말단 활성체 잔존율(%)={프로필아마이드(면적%)/[프로필아마이드(면적%)+다이펩타이드(면적%)]}×100
(2) 아민 첨가의 경우
상기 조제한 펩타이드를 포함하는 반응 용액에 DMAP 95mg(0.8mmol), 5% 탄산 나트륨 수용액 2.0mL를 가하고, 25℃에서 교반자로 20분간 교반을 행했다. 교반을 정지하고, 유기층과 수층을 분층시켰다. 유기층 5μL를 취하고, 프로필아민 100μL(1.2mmol)에 가하여, 잔존하는 C말단 활성체를 프로필아마이드로 변환시킨 후, 메탄올 0.9mL로 희석했다. LC/MS의 피크 면적치로부터, 이하의 계산식에 따라 C말단 활성체 잔존율을 계산했다.
C말단 활성체 잔존율(%) ={프로필아마이드(면적%)/[프로필아마이드(면적%)+다이펩타이드(면적%)]}×100
(후처리)
교반을 정지한 후, 정치하여, 유기층과 수층을 분층시키고, 수층을 제거했다. 그 다음에 유기층을 10% 황산수소 칼륨 수용액 2mL×2, 5% 탄산 나트륨 수용액 2mL로 순차적으로 세정했다. 추가로 5% 탄산 칼륨 수용액 1mL, 상수 1mL×2로의 세정을 3회 반복했다. 얻어진 유기층 5μL를 취하고, 프로필아민 100μL(1.2mmol)에 가하여, 잔존하는 C말단 활성체를 프로필아마이드로 변환시킨 후, 메탄올 0.9mL로 희석하고, LC/MS 분석에 보내어, 목적으로 하는 펩타이드와 잔존 C말단 활성체(프로필아마이드로의 변환체)의 피크 면적을 구했다. 아민 비첨가 가수분해에 의해 얻어진 농축물(펩타이드)은 576.6mg이었다(수율 150%: 농축물에는 불순물(잔존 C말단 활성체)을 포함하지만, 펩타이드만을 포함하는 것으로 하여 계산했다). 아민 첨가로의 가수분해에 의해 얻어진 농축물은, 369.6mg(수율 96%)이었다. MS(ESI): m/z 437.3 [M-tBu+H]+, 493.3 [M+H]+, 515.3 [M+Na]+.
Figure pct00011
1) LCMS의 피크 면적 비율
보호기를 Teoc, C말단 활성체 부위를 Pfp로 한 잔존 C말단 활성체의 알칼리수 단독 처리로의 가수분해에서는, 잔존 C말단 활성체가 완전히 가수분해되지 않고, 계속되는 수성 세정으로도 잔존 C말단 활성체를 제거할 수 없었다. 한편, DMAP를 첨가하여 가수분해를 행하면, 잔존 C말단 활성체의 가수분해가 완전히 달성되고, 잔존 C말단 활성체의 제거도 완전히 할 수 있음을 발견했다. 목적하는 다이펩타이드는 96.3%의 순도로 얻어졌다(수율 96%).
(실시예 16) Cbz-Aib-MeLeu-Phe-OtBu의 합성
(아민 비첨가로 가수분해 처리하여 얻어진 다이펩타이드를 사용한 Teoc 탈보호 반응)
실시예 15에서의 아민 비첨가 조건에서 합성한 Teoc-MeLeu-Phe-OtBu 576.6mg(잔존 C말단 활성체 8.9면적%를 포함한다)을 2-메틸테트라하이드로퓨란 2.0mL에 용해시켰다. TBAF의 8.4% 함수 테트라하이드로퓨란 용액 1.5mL(1.5mmol)를 가한 후, 50℃에서 2.5시간 교반했다. 반응이 완결되지 않았기 때문에, TBAF의 8.4% 함수 테트라하이드로퓨란 용액 0.75mL(0.75mmol)를 가하고, 2.5시간 교반했다. 추가로 TBAF의 8.4% 함수 테트라하이드로퓨란 용액 0.75mL(0.75mmol)를 가하고 30분간 교반하여, 탈Teoc체인 MeLeu-Phe-OtBu를 얻었다(변환율 100%). 반응 변환율은, 반응액 5μL를 취하고, 아세토나이트릴 1.0mL로 희석한 후, LC/MS 분석에 보내어, LC/MS의 피크 면적치로부터 구했다.
변환율(%)={MeLeu-Phe-OtBu(면적%)/[Teoc-MeLeu-Phe-OtBu(면적%)+MeLeu-Phe-OtBu(면적%)]}×100
(축합 반응)
내용량이 약 1mL가 될 때까지 농축한 후, 2-메틸테트라하이드로퓨란을 2mL를 가했다. 본 조작을 추가로 2회 반복하고, 얻어진 2-메틸테트라하이드로퓨란 용액에 아세토나이트릴 0.5mL, Cbz-Aib-OH 276mg(1.1mmol), 다이아이소프로필에틸아민 0.66mL(3.8mmol)를 가했다. 그 다음에 25℃에서 HATU 441mg(1.1mmol)을 가하고, 실온에서 14시간 교반했다. HATU 579mg(1.5mmol)을 가하고, 40℃에서 1시간 교반한 후, HATU 684mg(1.8mmol)을 가하고 60℃로 승온하고, 4.5시간 교반했다. 추가로 HATU 455mg(1.1mmol)을 가하고, 60℃에서 2시간, 실온에서 12시간, 60℃에서 2시간 교반했지만, 축합 반응의 진행은 관찰되지 않았다(변환율 0%). 반응 변환율은, 반응액 5μL를 프로필아민 100μL에 가하고, 메탄올 0.9mL로 희석한 후, LC/MS 분석에 보내어, LC/MS의 피크 면적치로부터 구했다.
변환율(%)={Cbz-Aib-MeLeu-Phe-OtBu(면적%)/[MeLeu-Phe-OtBu(면적%)+Cbz-Aib-MeLeu-Phe-OtBu(면적%)]}×100
(아민 첨가로 가수분해 처리하여 얻어진 다이펩타이드를 사용한 Teoc 탈보호 반응)
실시예 15에서의 아민 첨가 조건에서 합성한 Teoc-MeLeu-Phe-OtBu 369.6mg(0.75mmol)을 2-메틸테트라하이드로퓨란 2.0mL에 용해시켰다. TBAF의 8.4% 함수 테트라하이드로퓨란 용액 1.5mL(1.5mmol)를 가한 후, 50℃에서 2.5시간 교반하여, 탈Teoc체인 MeLeu-Phe-OtBu를 얻었다(변환율 100%). 반응 변환율은, 반응액 5μL를 취하고, 아세토나이트릴 1.0mL로 희석한 후, LC/MS 분석에 보내어, LC/MS의 피크 면적치로부터 구했다.
변환율(%)={MeLeu-Phe-OtBu(면적%)/[Teoc-MeLeu-Phe-OtBu(면적%)+MeLeu-Phe-OtBu(면적%)]}×100
(축합 반응)
내용량이 약 1mL가 될 때까지 농축한 후, 2-메틸테트라하이드로퓨란을 2mL를 가했다. 본 조작을 추가로 2회 반복하고, 얻어진 2-메틸테트라하이드로퓨란 용액에 아세토나이트릴 0.5mL, Cbz-Aib-OH 273mg(1.1mmol), 다이아이소프로필에틸아민 0.66mL(3.8mmol)를 가했다. 그 다음에 25℃에서 HATU 439mg(1.1mmol)을 가하고, 실온에서 14시간 교반했다. HATU 576mg(1.5mmol)을 가하고, 40℃에서 5.5시간 교반했다. 추가로 HATU 452mg(1.1mmol)을 가하고, 60℃에서 2시간, 실온에서 12시간, 60℃에서 2시간 교반했다(변환율 86%). 반응 변환율은, 반응액 5μL를 프로필아민 100μL에 가하고, 메탄올 0.9mL로 희석한 후, LC/MS 분석에 보내어, LC/MS의 피크 면적치로부터 구했다. 변환율(%)={Cbz-Aib-MeLeu-Phe-OtBu(면적%)/[MeLeu-Phe-OtBu(면적%)+Cbz-Aib-MeLeu-Phe-OtBu(면적%)]}×100
조제한 반응액에 DMAP 92mg(0.75mmol), 10% 탄산 칼륨 수용액 4.0mL를 가하고, 25℃에서, 교반자로 1시간 교반을 행했다. 교반을 정지한 후, 정치하여, 유기층과 수층을 분층시키고, 수층을 제거했다. 얻어진 유기층 5μL를 프로필아민 100μL에 가하고, 메탄올 0.9mL로 희석했다. 이 용액을 LC/MS 분석에 보내어, 목적으로 하는 펩타이드와 잔존 C말단 활성체의 피크 면적 퍼센트를 구했다. 목적으로 하는 펩타이드 Cbz-Aib-MeLeu-Phe-OtBu는 86.7%, 원료의 MeLeu-Phe-OtBu는 13.3%, 잔존 C말단 활성체 유래의 Cbz-Aib-NHPr은 검출되지 않았다. 남은 유기층을 농축하여, 상기 조성의 농축물 295.6mg을 얻었다. MS(ESI): m/z 568.4 [M+H]+, 590.4 [M+Na]+.
N말단이 보호된 펩타이드의 용액에 C말단 활성체가 잔존하고 있으면, 펩타이드의 N말단의 보호기(Teoc)를 함수 불소 시약으로 탈보호할 때에, 대과잉의 시약이 필요함이 판명되었다. 탈보호 시약이 잔존 C말단 활성체와도 반응하기 때문이라고 추정된다.
또한, 탈보호에 계속되는, 다음 공정에서의 다른 C말단 활성체와의 축합 반응(펩타이드 결합 형성 반응)이, 전혀 진행되지 않음이 밝혀졌다. 아마, 전(前) 행정(N말단의 탈보호)에서 사용한 과잉의 시약이 C말단 활성체를 분해했다고 추정된다. 이와 같이, C말단 활성체가 잔존하면 N말단의 탈보호 시에, 대과잉의 시약이 필요하고, 그것이, 계속되는 축합 반응의 진행을 방해하는 것으로 이어짐을 발견했다. 한편, 잔존 C말단 활성체가 완전히 제거된 펩타이드 용액을 원료로서 이용하면, 적당량의 탈보호 시약으로 탈보호 반응이 완결되고, 다음 공정의 축합 반응도 실시 가능함을 발견했다.
(실시예 17) Cbz-MeAla-Phe-OtBu의 합성
(축합 반응)
Phe-OtBu 염산염 302mg(1.2mmol), Cbz-MeAla-OH 417mg(1.7mmol), HOOBt 290mg(1.8mmol)을 아세토나이트릴 0.9mL, MTBE 3.6mL에 현탁하고, 다이아이소프로필에틸아민 1.0mL(5.8mmol)를 가했다. 그 다음에, EDC 염산염 443mg(2.3mmol)을 가하고, 25℃에서 30분간 교반하여 펩타이드 결합 형성 반응을 행했다. 반응액 5μL를 취하고, 프로필아민 100μL(1.2mmol)에 가하여, 잔존하는 C말단 활성체를 프로필아마이드로 변환시킨 후, 메탄올 0.9mL로 희석했다. 본 용액을 LC/MS 분석에 보내어, LC/MS의 피크 면적치로부터 변환율을 구했다(변환율: 100%).
변환율(%)={Cbz-MeAla-Phe-OtBu(면적%)/[Phe-OtBu(면적%)+Cbz-MeALa-Phe-OtBu(면적%)]}×100
(가수분해 처리)
(1) 아민 비첨가의 경우
상기 조제한 펩타이드를 포함하는 반응 용액에 5% 탄산 나트륨 수용액 3.0mL를 가하고, 25℃에서 교반자로 5분간 교반을 행했다. 교반을 정지하고, 유기층과 수층을 분층시켰다. 유기층 5μL를 취하고, 프로필아민 100μL(1.2mmol)에 가하여, 잔존하는 C말단 활성체를 프로필아마이드로 변환시킨 후, 메탄올 0.9mL로 희석했다. LC/MS의 피크 면적치로부터, 이하의 계산식에 따라 C말단 활성체 잔존율을 계산했다.
C말단 활성체 잔존율(%)={프로필아마이드(면적%)/[프로필아마이드(면적%)+다이펩타이드(면적%)]}×100
(2) 아민 첨가의 경우
상기 조제한 펩타이드를 포함하는 반응 용액에 DMAP 147mg(1.1mmol), 5% 탄산 나트륨 수용액 3.0mL를 가하고, 25℃에서 교반자로 5분간 교반을 행했다. 교반을 정지하고, 유기층과 수층을 분층시켰다. 유기층 5μL를 취하고, 프로필아민 100μL(1.2mmol)에 가하여, 잔존하는 C말단 활성체를 프로필아마이드로 변환시킨 후, 메탄올 0.9mL로 희석했다. LC/MS의 피크 면적치로부터, 이하의 계산식에 따라 C말단 활성체 잔존율을 계산했다.
C말단 활성체 잔존율(%)={프로필아마이드(면적%)/[프로필아마이드(면적%)+다이펩타이드(면적%)]}×100
(후처리)
교반을 정지한 후, 정치하여, 유기층과 수층을 분층시키고, 수층을 제거했다. 그 다음에 유기층을 10% 황산수소 나트륨 수용액 3mL×2, 5% 탄산 나트륨 수용액 3mL로 순차적으로 세정했다. 얻어진 유기층 5μL를 프로필아민 100μL에 가하고, 메탄올 0.9mL로 희석했다. 이 용액을 LC/MS 분석에 보내어, 목적으로 하는 펩타이드와 잔존 C말단 활성체의 피크 면적 퍼센트를 구했다. MS(ESI): m/z 385.2 [M-tBu+H]+, 441.3 [M+H]+, 463.2 [M+Na]+.
Figure pct00012
1) LCMS의 피크 면적 비율
치환기가 작은 아미노산인 알라닌이어도, 알칼리수 단독 처리로의 가수분해에서는, 잔존 C말단 활성체가 완전히 가수분해되지 않고, 계속되는 분액 조작(수성 세정)에서도 잔존 C말단 활성체를 충분히 제거할 수 없었다. 한편, DMAP를 첨가하여 가수분해를 행하면, 잔존 C말단 활성체의 가수분해가 완전히 달성되고, 잔존 C말단 활성체의 제거도 완전히 할 수 있음을 발견했다. 게다가 이 때, 목적하는 다이펩타이드가 98.4%의 순도로 얻어졌다.
(실시예 18) Cbz-Hph-MeAla-Phe-OtBu의 합성
(아민 비첨가로 가수분해 처리하여 얻어진 다이펩타이드를 사용한 Cbz 탈보호 반응)
실시예 17에서의 아민 비첨가 조건에서 합성한 Cbz-MeAla-Phe-OtBu의 MTBE 용액을 2-메틸테트라하이드로퓨란으로 치환 농축했다. 5% Pd/C(50%wet) 101mg과 수소 가스로 가수소분해 반응에 보냈다. 25℃에서 6시간 교반했지만, 반응은 완결되지 않았다(변환율 35%). 반응 변환율은, 반응액 5μL를 취하고, 아세토나이트릴 1.0mL로 희석한 후, LC/MS 분석에 보내어, LC/MS의 피크 면적치로부터 구했다.
변환율(%)={MeAla-Phe-OtBu(면적%)/[Cbz-MeAla-Phe-OtBu(면적%)+MeALa-Phe-OtBu(면적%)]}×100
(아민 첨가로 가수분해 처리하여 얻어진 다이펩타이드를 사용한 Cbz 탈보호 반응)
실시예 17에서의 아민 첨가 조건에서 합성한 Cbz-MeAla-Phe-OtBu의 MTBE 용액을 2-메틸테트라하이드로퓨란으로 치환 농축했다. 5% Pd/C(50%wet) 102mg과 수소 가스로 가수소분해 반응에 보냈다. 25℃에서 3시간 교반하여, 탈Cbz화체인 MeAla-Phe-OtBu를 얻었다(변환율 100%). 반응 변환율은, 반응액 5μL를 취하고, 아세토나이트릴 1.0mL로 희석한 후, LC/MS 분석에 보내어, LC/MS의 피크 면적치로부터 구했다. MS(ESI) : m/z 307.2 [M+H]+.
변환율(%)={MeAla-Phe-OtBu(면적%)/[Cbz-MeAla-Phe-OtBu(면적%)+MeALa-Phe-OtBu(면적%)]}×100
(축합 반응)
아민 첨가로 가수분해 처리하여 얻어진 다이펩타이드의 Cbz 탈보호체 반응액을, 필터로 여과하여, Pd/C를 여과제거한 후, 농축 건고했다. 2-메틸테트라하이드로퓨란 2.5mL에 건고물을 용해시키고, Cbz-Hph-OH 474mg(1.5mmol), 다이아이소프로필에틸아민 610μL(3.5mmol)를 가했다. 그 다음에 T3P/2-메틸테트라하이드로퓨란 용액 1.37mL(2.33mmol)를 가하고, 25℃에서 1.5시간 교반하여, 펩타이드 결합 형성 반응을 행했다(변환율: 100%). 반응 변환율은, 반응액 5μL를 프로필아민 100μL에 가하고, 메탄올 0.9mL로 희석한 후, LC/MS 분석에 보내어, LC/MS의 피크 면적치로부터 구했다.
변환율(%)={Cbz-Hph-MeAla-Phe-OtBu(면적%)/[MeAla-Phe-OtBu(면적%)+Cbz-Hph-MeAla-Phe-OtBu(면적%)]}×100
조제한 반응액에 DMAP 74mg(0.6mmol), 5% 탄산 나트륨 수용액 3.0mL를 가하고, 25℃에서 15분간 교반을 행했다. 교반을 정지하고, 정치한 후, 유기층과 수층을 분층시키고, 수층을 제거했다. 그 다음에 유기층을 10% 황산수소 나트륨 수용액 3mL, 5% 탄산 나트륨 수용액 3mL, 상수 3mL로 순차적으로 세정했다. 얻어진 유기층 5μuL를 프로필아민 100μL에 가하고, 메탄올 0.9mL로 희석했다. 이 용액을 LC/MS 분석에 보내어, 목적으로 하는 펩타이드와 잔존 C말단 활성체의 피크 면적 퍼센트를 구했다. 목적으로 하는 펩타이드 Cbz-Hph-MeAla-Phe-OtBu는 99.0%이고, 잔존 C말단 활성체 유래의 Cbz-Hph-NHPr은 검출되지 않았다. 남은 유기층을 농축하여, 농축물 618.4mg을 얻었다(실시예 17의 Phe-OtBu로부터 수율 88%). MS(ESI): m/z 602.4 [M+H]+, 624.4 [M+Na]+.
EDC 및 HOOBt 유래의 C말단 활성체가 잔존하고 있으면, 펩타이드 신장 후의 Cbz 탈보호 반응이 거의 진행되지 않음이 밝혀졌다. 한편, 잔존 C말단 활성체가 완전히 제거된 펩타이드 용액을 원료로서 이용하면, Cbz 탈보호 반응이 순조롭게 진행되고, 펩타이드 합성 반응이 가능해짐을 발견했다. 즉, 실시예 9의 경우와 마찬가지로, 본 발명의 방법을 이용하는 것에 의해, 생성된 펩타이드 화합물의 N말단의 보호기의 환원적 제거 반응을, 정체시키지 않고 진행시킬 수가 있음을 알 수 있었다.
(실시예 19) Cbz-Aib-D-Val-OBn의 합성
(축합 반응)
D-Val-OBn TsOH염 502mg(1.3mmol), Cbz-Aib-OH 478mg(2.0mmol)을 2-MeTHF 6.0mL에 현탁하고, 다이아이소프로필에틸아민 1.2mL(6.9mmol)를 가했다. 그 다음에 25℃에서 50% T3P/2-메틸테트라하이드로퓨란 용액 1.9mL(3.3mmol)를 가하고, 25℃에서 15시간 교반하여 펩타이드 결합 형성 반응을 행했다. 반응액 5μL를 취하고, 프로필아민 100μL(1.2mmol)에 가하여, 잔존하는 C말단 활성체를 프로필아마이드로 변환시킨 후, 메탄올 0.9mL로 희석했다. 본 용액을 LC/MS 분석에 보내어, LC/MS의 피크 면적으로부터 변환율을 구했다(변환율: 100%).
변환율(%)={Cbz-Aib-D-Val-OBn(면적%)/[D-Val-OBn(면적%)+Cbz-Aib-D-Val-OBn(면적%)]}×100
(가수분해 처리)
(1) 아민 비첨가의 경우
상기 조제한 펩타이드를 포함하는 반응 용액에 5% 탄산 칼륨 수용액 5.0mL를 가하고, 25℃에서, 교반자로 30분간 교반을 행했다. 교반을 정지하고, 유기층과 수층을 분층시켰다. 유기층 5μL를 취하고, 프로필아민 100μL(1.2mmol)에 가하여, 잔존하는 C말단 활성체를 프로필아마이드로 변환시킨 후, 메탄올 0.9mL로 희석했다. LC/MS의 피크 면적치로부터, 이하의 계산식에 따라 C말단 활성체 잔존율을 계산했다.
C말단 활성체 잔존율(%)={프로필아마이드(면적%)/[프로필아마이드(면적%)+다이펩타이드(면적%)]}×100
(2) 아민 첨가의 경우
상기 조제한 펩타이드를 포함하는 반응 용액에 DMAP 484mg(4.0mmol)과 5% 탄산 칼륨 수용액 5.0mL를 가하고 25℃에서 교반자로 30분간 교반을 행했다. 교반을 정지하고, 유기층과 수층을 분층시켰다. 유기층 5μL를 취하고, 프로필아민 100μL(1.2mmol)에 가하여, 잔존하는 C말단 활성체를 프로필아마이드로 변환시킨 후, 메탄올 0.9mL로 희석했다. LC/MS의 피크 면적치로부터, 이하의 계산식에 따라 C말단 활성체 잔존율을 계산했다.
C말단 활성체 잔존율(%)={프로필아마이드(면적%)/[프로필아마이드(면적%)+다이펩타이드(면적%)]}×100
(후처리)
교반을 정지한 후, 정치하여, 유기층과 수층을 분층시키고, 수층을 제거했다. 그 다음에 유기층을 10% 황산수소 칼륨 수용액 5mL와 5% 탄산 칼륨 수용액 2.5mL로 순차적으로 세정했다. 유기층 5μL를 취하고, 프로필아민 100μL(1.2mmol)에 가하여, 잔존하는 C말단 활성체를 프로필아마이드로 변환시킨 후, 메탄올 0.9mL로 희석하고 LC/MS 분석에 보내어, 목적으로 하는 펩타이드와 잔존 C말단 활성체(프로필아마이드로의 변환체)의 피크 면적치를 구했다. 남은 유기층을 농축하여, 펩타이드를 얻었다. 아민 비첨가로의 가수분해에 의해 얻어진 농축물(펩타이드)은 653.8mg이었다(수율 116%: 농축물에는 불순물(잔존 C말단 활성체)을 포함하지만, 펩타이드만을 포함하는 것으로 하여 계산했다). 아민 첨가로의 가수분해에 의해 얻어진 농축물은 549.4mg이었다(수율 97%). MS(ESI): m/z 427.3 [M+H]+, 449.2 [M+Na]+.
Figure pct00013
1) LCMS의 피크 면적 비율
알칼리수 단독 처리로의 가수분해에서는, 잔존 C말단 활성체가 완전히 가수분해되지 않고, 계속되는 수성 세정으로도 잔존 C말단 활성체를 충분히 제거할 수 없었지만, DMAP를 첨가하여 가수분해를 행하면, 잔존 C말단 활성체의 가수분해가 완전히 달성되고, 잔존 C말단 활성체를 완전히 제거할 수 있음을 발견했다. 이 때, 목적하는 다이펩타이드는 순도 98.6%로 얻어졌다(수율 97%).
(실시예 20) Cbz-Thr(tBu)-Phe-OtBu의 합성
(축합 반응)
Phe-OtBu 염산염 300mg(1.2mmol), Cbz-Thr(tBu)-OH다이사이클로헥실아민염 855mg(1.7mmol), HOBt 237mg(1.8mmol)을 2-MeTHF 4.2mL, 아세토나이트릴 0.9mL에 현탁하고, 다이아이소프로필에틸아민 813μL(4.6mmol)를 가했다. 그 다음에 25℃에서 EDC 염산염 447mg(2.3mmol)을 가하고, 25℃에서 3시간 교반하여 펩타이드 결합 형성 반응을 행했다. 반응액 5μL를 취하고, 프로필아민 100μL(1.2mmol)에 가하여, 잔존하는 C말단 활성체를 프로필아마이드로 변환시킨 후, 메탄올 0.9mL로 희석했다. 본 용액을 LC/MS 분석에 보내어, LC/MS의 피크 면적으로부터 변환율을 구했다(변환율: 100%).
변환율(%)={Cbz-Thr(tBu)-Phe-OtBu(면적%)/[Phe-OtBu(면적%)+Cbz-Thr(tBu)-Phe-OtBu(면적%)]}×100
(가수분해 처리)
(1) 아민 비첨가의 경우
상기 조제한 펩타이드를 포함하는 반응 용액에 5% 탄산 칼륨 수용액 3.0mL를 가하고, 25℃에서, 교반자로 5분간 교반을 행했다. 교반을 정지하고, 유기층과 수층을 분층시켰다. 유기층 5μL를 취하고, 프로필아민 100μL(1.2mmol)에 가하여, 잔존하는 C말단 활성체를 프로필아마이드로 변환시킨 후, 메탄올 0.9mL로 희석했다. LC/MS의 피크 면적치로부터, 이하의 계산식에 따라 C말단 활성체 잔존율을 계산했다.
C말단 활성체 잔존율(%)={프로필아마이드(면적%)/[프로필아마이드(면적%)+다이펩타이드(면적%)]}×100
(2) 아민 첨가의 경우
상기 조제한 펩타이드를 포함하는 반응 용액에 DMAP 142mg(1.2mmol)과 5% 탄산 칼륨 수용액 3.0mL를 가하고, 25℃에서, 교반자로 5분간 교반을 행했다. 교반을 정지하고, 유기층과 수층을 분층시켰다. 유기층 5μL를 취하고, 프로필아민 100μL(1.2mmol)에 가하여, 잔존하는 C말단 활성체를 프로필아마이드로 변환시킨 후, 메탄올 0.9mL로 희석했다. LC/MS의 피크 면적치로부터, 이하의 계산식에 따라 C말단 활성체 잔존율을 계산했다.
C말단 활성체 잔존율(%)={프로필아마이드(면적%)/[프로필아마이드(면적%)+다이펩타이드(면적%)]}×100
(후처리)
교반을 정지한 후, 정치하여, 유기층과 수층을 분층시키고, 수층을 제거했다. 그 다음에 유기층을 10% 황산수소 칼륨 수용액 3mL, 5% 탄산 칼륨 수용액 3mL, 물 1.5mL로 순차적으로 세정했다. 유기층 5μL를 취하고, 프로필아민 100μL(1.2mmol)에 가하여, 잔존하는 C말단 활성체를 프로필아마이드로 변환시킨 후, 메탄올 0.9mL로 희석하고 LC/MS 분석에 보내어, 목적으로 하는 펩타이드와 잔존 C말단 활성체(프로필아마이드로의 변환체)의 피크 면적치를 구했다. 남은 유기층을 농축하여, 펩타이드를 얻었다. MS(ESI): m/z 401.2 [M-2tBu+H]+, 457.2 [M-tBu+H]+, 513.3 [M+H]+, 535.3 [M+Na]+.
Figure pct00014
1) LCMS의 피크 면적 비율
알칼리수 단독 처리로의 가수분해에서는, 잔존 C말단 활성체가 완전히 가수분해되지 않고, 계속되는 수성 세정으로도 잔존 C말단 활성체를 충분히 제거할 수 없었지만, DMAP를 첨가하여 가수분해를 행하면, 잔존 C말단 활성체의 가수분해가 완전히 달성되고, 잔존 C말단 활성체를 완전히 제거할 수 있음을 발견했다. 이 때, 목적하는 다이펩타이드는 순도 98.4%로 얻어졌다.
(실시예 21) Cbz-Leu-Thr(tBu)-Phe-OtBu의 합성
(아민 비첨가로 가수분해 처리하여 얻어진 다이펩타이드를 사용한 Cbz 탈보호 반응)
실시예 20에서의 아민 비첨가 조건에서 합성한 Cbz-Thr(tBu)-Phe-OtBu의 MTBE/2-MeTHF 용액을 2-메틸테트라하이드로퓨란으로 치환 농축했다. 5% Pd/C(50%wet) 99mg과 수소 가스로 가수소분해 반응에 보냈다. 25℃에서 1시간 교반했지만, 반응은 완결되지 않았다(변환율 53%). 반응 변환율은, 반응액 5μL를 취하고, 아세토나이트릴 1.0mL로 희석한 후, LC/MS 분석에 보내어, LC/MS의 피크 면적치로부터 구했다.
변환율(%)={Thr(tBu)-Phe-OtBu(면적%)/[Cbz-Thr(tBu)-Phe-OtBu(면적%)+Thr(tBu)-Phe-OtBu(면적%)]}×100
(아민 첨가로 가수분해 처리하여 얻어진 다이펩타이드를 사용한 Cbz 탈보호 반응)
실시예 20에서의 아민 첨가 조건에서 합성한 Cbz-Thr(tBu)-Phe-OtBu의 MTBE/2-MeTHF 용액을 2-메틸테트라하이드로퓨란으로 치환 농축했다. 5% Pd/C(50%wet) 104mg과 수소 가스로 가수소분해 반응에 보냈다. 25℃에서 1시간 교반하여, 탈Cbz화체인 Thr(tBu)-Phe-OtBu를 얻었다(변환율 100%). 반응 변환율은, 반응액 5μL를 취하고, 아세토나이트릴 1.0mL로 희석한 후, LC/MS 분석에 보내어, LC/MS의 피크 면적치로부터 구했다.
변환율(%)={Thr(tBu)-Phe-OtBu(면적%)/[Cbz-Thr(tBu)-Phe-OtBu(면적%)+Thr(tBu)-Phe-OtBu(면적%)]}×100
(축합 반응)
아민 첨가로 가수분해 처리하여 얻어진 다이펩타이드의 Cbz 탈보호체 반응액을, 필터로 여과하여, Pd/C를 여과제거한 후, 농축 건고했다. 2-메틸테트라하이드로퓨란 5.0mL에 건고물을 용해시키고, Cbz-Leu-OH 382mg(1.4mmol), 다이아이소프로필에틸아민 814μL(4.7mmol)를 가했다. 그 다음에 50% T3P/2-메틸테트라하이드로퓨란 용액 1.37mL(2.3mmol)를 가하고, 25℃에서 30분간 교반하여, 펩타이드 결합 형성 반응을 행했다(변환율: 100%). 반응 변환율은, 반응액 5μL를 프로필아민 100μL에 가하고, 메탄올 0.9mL로 희석한 후, LC/MS 분석에 보내어, LC/MS의 피크 면적치로부터 구했다.
변환율(%)={Cbz-Leu-Thr(tBu)-Phe-OtBu(면적%)/[Thr(tBu)-Phe-OtBu(면적%)+Cbz-Leu-Thr(tBu)-Phe-OtBu(면적%)]}×100
조제한 반응액에 DMAP 139mg(1.1mmol), 10% 탄산 나트륨 수용액 3.0mL를 가하고, 25℃에서 5분간 교반을 행했다. 교반을 정지하고, 정치한 후, 유기층과 수층을 분층시키고, 수층을 제거했다. 그 다음에 유기층을 10% 황산수소 나트륨 수용액 3mL×2, 5% 탄산 나트륨 수용액 3mL, 상수 3mL로 순차적으로 세정했다. 얻어진 유기층 5μL를 프로필아민 100μL에 가하고, 메탄올 0.9mL로 희석했다. 이 용액을 LC/MS 분석에 보내어, 목적으로 하는 펩타이드와 잔존 C말단 활성체의 피크 면적 퍼센트를 구했다. 목적으로 하는 펩타이드 Cbz-Leu-Thr(tBu)-Phe-OtBu는 98.3%이고, 잔존 C말단 활성체 유래의 Cbz-Leu-NHPr은 검출되지 않았다. 남은 유기층을 농축하여, 농축물 638.0mg을 얻었다(실시예 20의 Phe-OtBu로부터 수율 88%). MS (ESI): m/z 514.3 [M-2tBu+H]+, 570.3 [M-tBu+H]+, 626.5 [M+H]+, 648.4 [M+Na]+.
EDC 및 HOBt 유래의 C말단 활성체가 잔존하고 있으면, 잔존 C말단 활성체를 완전히 제거했을 경우에 비해 Cbz 탈보호 반응 진행이 느림을 알 수 있었다. 잔존 C말단 활성체가 완전히 제거된 펩타이드 용액을 원료로서 이용하면, Cbz 탈보호 반응이 순조롭게 진행되어, 펩타이드 합성 반응이 가능해짐을 발견했다. 즉, 본 발명의 방법을 이용하는 것에 의해, 실시예 9, 실시예 18의 경우와 마찬가지로, 생성된 펩타이드 화합물의 N말단의 보호기의 환원적 제거 반응을, 정체시키지 않고 진행시킬 수 있음을 알 수 있었다. 이것에 의해, 소망의 아미노산 서열을 갖는 고순도의 펩타이드 화합물을 효율적으로 제조할 수 있었다.
(실시예 22) Cbz-Ile-Phe-OtBu의 합성
(축합 반응)
Phe-OtBu 염산염 301mg(1.2mmol), Cbz-Ile-OH 465mg(1.8mmol)을 MTBE 3.6mL, 아세토나이트릴 0.9mL에 현탁하고, 다이아이소프로필에틸아민 610μL(3.5mmol)를 가했다. 그 다음에 25℃에서 BEP 479mg(1.8mmol)을 가하고, 25℃에서 45분간 교반하여 펩타이드 결합 형성 반응을 행했다. 반응액 5μL를 취하고, 프로필아민 100μL(1.2mmol)에 가하여, 잔존하는 C말단 활성체를 프로필아마이드로 변환시킨 후, 메탄올 0.9mL로 희석했다. 본 용액을 LC/MS 분석에 보내어, LC/MS의 피크 면적으로부터 변환율을 구했다(변환율: 100%).
변환율(%)={Cbz-Ile-Phe-OtBu(면적%)/[Phe-OtBu(면적%)+Cbz-Ile-Phe-OtBu(면적%)]}×100
(가수분해 처리)
(1) 아민 비첨가의 경우
상기 조제한 펩타이드를 포함하는 반응 용액에 5% 탄산 칼륨 수용액 3.0mL를 가하고, 25℃에서, 교반자로 3분간 교반을 행했다. 교반을 정지하고, 유기층과 수층을 분층시켰다. 유기층 5μL를 취하고, 프로필아민 100μL(1.2mmol)에 가하여, 잔존하는 C말단 활성체를 프로필아마이드로 변환시킨 후, 메탄올 0.9mL로 희석했다. LC/MS의 피크 면적치로부터, 이하의 계산식에 따라 C말단 활성체 잔존율을 계산했다.
C말단 활성체 잔존율(%)={프로필아마이드(면적%)/[프로필아마이드(면적%)+다이펩타이드(면적%)]}×100
(2) 아민 첨가의 경우
상기 조제한 펩타이드를 포함하는 반응 용액에 DMAP 139mg(1.1mmol)과 5% 탄산 칼륨 수용액 3.0mL를 가하고, 25℃에서, 교반자로 3분간 교반을 행했다. 교반을 정지하고, 유기층과 수층을 분층시켰다. 유기층 5μL를 취하고, 프로필아민 100μL(1.2mmol)에 가하여, 잔존하는 C말단 활성체를 프로필아마이드로 변환시킨 후, 메탄올 0.9mL로 희석했다. LC/MS의 피크 면적치로부터, 이하의 계산식에 따라 C말단 활성체 잔존율을 계산했다.
C말단 활성체 잔존율(%)={프로필아마이드(면적%)/[프로필아마이드(면적%)+다이펩타이드(면적%)]}×100
(후처리)
교반을 정지한 후, 정치하여, 유기층과 수층을 분층시키고, 수층을 제거했다. 그 다음에 유기층을 10% 황산수소 칼륨 수용액 3mL, 5% 탄산 칼륨 수용액 3mL로 순차적으로 세정했다. 2-MeTHF 2mL를 가한 후, 물 1.5mL로 세정했다. 유기층 5μL를 취하고, 프로필아민 100μL(1.2mmol)에 가하여, 잔존하는 C말단 활성체를 프로필아마이드로 변환시킨 후, 메탄올 0.9mL로 희석하고 LC/MS 분석에 보내어, 목적으로 하는 펩타이드와 잔존 C말단 활성체(프로필아마이드로의 변환체)의 피크 면적치를 구했다. 남은 유기층을 농축하여, 펩타이드를 얻었다. MS (ESI): m/z 413.3 [M-tBu+H]+, 469.3 [M+H]+, 491.3 [M+Na]+.
Figure pct00015
1) LCMS의 피크 면적 비율
알칼리수 단독 처리로의 가수분해에서는, 잔존 C말단 활성체가 완전히 가수분해되지 않고, 계속되는 수성 세정으로도 잔존 C말단 활성체를 충분히 제거할 수 없었지만, DMAP를 첨가하여 가수분해를 행하면, 잔존 C말단 활성체의 가수분해가 완전히 달성되고, 잔존 C말단 활성체를 완전히 제거할 수 있음을 발견했다. 이 때, 목적하는 다이펩타이드는 순도 96.3%로 얻어졌다.
(실시예 23) Cbz-Phe-MeGly-Phe-piperidine
(Boc탈보호 반응)
Boc-Phe-piperidine1 334mg(1.0mmol)을 다이클로로메테인 3.4mL에 용해하고, 메테인설폰산 131μL(2.0mmol)를 가했다. 35℃에서 3시간 교반하여, 탈Boc 반응을 행했다(변환율: 100%). 반응 변환율은 반응액 5μL를 취하고, 아세토나이트릴 1.0mL로 희석한 용액을 LCMS 분석에 보내어, LC/MS의 피크 면적치로부터 구했다.
변환율(%)={Phe-piperidine(면적%)/[Boc-Phe-piperidine(면적%)+Phe-piperidine(면적%)]}×100
(축합 반응)
상기 반응 용액에, 다이아이소프로필에틸아민 528μL(3.0mmol)를 가한 후, 용매를 증류제거했다. 그 다음에 아세토나이트릴 1.0mL, 2-메틸테트라하이드로퓨란 3.4mL, 다이아이소프로필에틸아민 528μL(3.0mmol), Cbz-Phe-MeGly-OH2 505mg(1.5mmol), HOOBt 256mg(1.6mmol)를 가했다. 25℃에서 EDC 염산염 388mg(2.0mmol)을 가하고, 25℃에서 1시간 교반하여 펩타이드 결합 형성 반응을 행했다. 반응액 5μL를 취하고, 프로필아민 100μL(1.2mmol)에 가하여, 잔존하는 C말단 활성체를 프로필아마이드로 변환시킨 후, 메탄올 0.9mL로 희석했다. 본 용액을 LC/MS 분석에 보내어, LC/MS의 피크 면적으로부터 변환율을 구했다(변환율: 100%)
변환율(%)={Cbz-Phe-MeGly-Phe-piperidine(면적%)/[Phe-piperidine(면적%)+Cbz-Phe-MeGly-Phe-piperidine(면적%)]}×100
상기 조제한 반응 용액에 DMAP 128mg(1.0mmol), 5% 탄산 칼륨 수용액 3.5mL를 가하고, 25℃에서 교반자로 3분간 교반을 행했다. 교반을 정지한 후, 정치하여, 유기층과 수층을 분층시키고 수층을 제거했다. 그 다음에 유기층을 10% 황산 칼륨 수용액 3.5mL×2, 5% 탄산 칼륨 수용액 3.5mL로 희석했다. 이 용액을 LC/MS 분석에 보내어, 목적으로 하는 펩타이드와 잔존 C말단 활성체의 피크 면적 퍼센트를 구했다. 목적으로 하는 펩타이드 Cbz-Phe-MeGly-Phe-piperidine은 순도 94.6%이고, 잔존 C말단 활성체 유래의 Cbz-Phe-MeGly-NHPr은 검출되지 않았다. 남은 유기층을 농축하여, 농축물 520.4mg을 얻었다(수율 94%).
DMAP를 첨가하여 가수분해를 행하면, 펩타이드 프래그먼트 유래의 잔존 C말단 활성체의 분해·제거가 완전히 달성되어, 목적하는 트라이펩타이드를 94.6%의 순도로 얻을 수 있었다(수율 94%).
1) J. Org. Chem., 2003, 68, 7505-7508.
2) Bull. Chem. Soc. Jpn., 2004, 77, 1187-1193.
(실시예 24) Cbz-Val-Phe-OtBu의 합성
(축합 반응)
Phe-OtBu 염산염 200mg(0.8mmol), Cbz-Val-OH 294mg(1.2mmol)을 2-메틸테트라하이드로퓨란 2.4mL, 아세토나이트릴 0.6mL에 현탁하고, N-에틸모폴린 294μL(2.3mmol)를 가했다. 그 다음에, 25℃에서 HATU 447mg(1.2mmol)을 가하고, 25℃하에서 2.5시간 교반하여, 펩타이드 결합 형성 반응을 행했다. 반응액 5μL를 취하고, 프로필아민 100μL(1.2mmol)에 가하여, 잔존하는 C말단 활성체를 프로필아마이드로 변환시킨 후, 메탄올 0.9mL로 희석했다. 본 용액을 LC/MS 분석에 보내어, LC/MS의 피크 면적으로부터 변환율을 구했다(변환율: 100%). MS (ESI): m/z 399.3 [M-tBu+H]+, 455.3 [M+H]+
변환율(%)={Cbz-Val-Phe-OtBu(면적%)/[Phe-OtBu(면적%)+Cbz-Val-Phe-OtBu(면적%)]}×100
(가수분해 처리)
(1) 아민 비첨가의 경우
상기 조제한 펩타이드를 포함하는 반응 용액에 5% 탄산 칼륨 수용액 2.0mL를 가하고, 25℃에서, 교반자로 교반을 행했다. 교반을 정지하고, 유기층과 수층을 분층시켰다. 유기층 5μL를 취하고, 프로필아민 100μL(1.2mmol)에 가하여, 잔존하는 C말단 활성체를 프로필아마이드로 변환시킨 후, 메탄올 0.9mL로 희석했다. 본 용액을 LC/MS 분석에 보내어, LC/MS의 피크 면적치로부터, 이하의 계산식에 따라 C말단 활성체 잔존율을 계산했다(아래 표).
C말단 활성체 잔존율(%)={프로필아마이드(면적%)/[프로필아마이드(면적%)+다이펩타이드(면적%)]}×100
(2) 아민 첨가의 경우
상기 조제한 펩타이드를 포함하는 반응 용액에 아래 표에 나타내는 아민 첨가제(0.8mmol)와 5% 탄산 칼륨 수용액 2.0mL를 가하고, 25℃에서, 교반자로 교반을 행했다. 교반을 정지하고, 유기층과 수층을 분층시켰다. 유기층 5μL를 취하고, 프로필아민 100μL(1.2mmol)에 가하여, 잔존하는 C말단 활성체를 프로필아마이드로 변환시킨 후, 메탄올 0.9mL로 희석했다. 본 용액을 LC/MS 분석에 보내어, LC/MS의 피크 면적치로부터, 이하의 계산식에 따라 C말단 활성체 잔존율을 계산했다(아래 표).
C말단 활성체 잔존율(%)={프로필아마이드(면적%)/[프로필아마이드(면적%)+다이펩타이드 면적%)]}×100
Figure pct00016
DIPEA의 첨가는, 아민을 첨가하지 않는 알칼리수 단독의 경우보다도 약간 잔존 C말단 활성체의 가수분해를 촉진했지만, 큰 효과는 보이지 않았다. 한편, DMAP 및 NMI의 첨가는 DIPEA의 첨가보다도 현저하게 잔존 C말단 활성체의 가수분해를 촉진하고, 특히 DMAP 사용 시는 5분 이내에서 잔존 C말단 활성체가 완전히 가수분해됨이 판명되었다. 이것에 의해, DIPEA와 같은 질소 근방에 입체 장애가 있는 아민과 비교하여, DMAP와 같은 질소 근방의 입체 장애가 작은 아민이 보다 잔존 C말단 활성체의 가수분해를 촉진함이 판명되었다.
(실시예 25) Cbz-Ile-Val-OBn의 합성
(축합 반응)
Val-OBn 염산염 300mg(1.2mmol), Cbz-Ile-OH 495mg(1.9mmol)을 사이클로펜틸 메틸 에터 3.0mL, 아세토나이트릴 0.9mL에 현탁하고, 다이아이소프로필에틸아민 859μL(4.9mmol)를 가했다. 그 다음에 25℃에서 HATU 705mg(1.9mmol)을 가하고, 25℃에서 1시간 교반하여 펩타이드 결합 형성 반응을 행했다. 반응액 5μL를 취하고, 프로필아민 100μL(1.2mmol)에 가하여, 잔존하는 C말단 활성체를 프로필아마이드로 변환시킨 후, 메탄올 0.9mL로 희석했다. 본 용액을 LC/MS 분석에 보내어, LC/MS의 피크 면적으로부터 변환율을 구했다(변환율: 100%).
변환율(%)={Cbz-Ile-Val-OBn(면적%)/[Val-OBn(면적%)+Cbz-Ile-Val-OBn(면적%)]}×100
(가수분해 처리)
(1) 아민 비첨가의 경우
상기 조제한 펩타이드를 포함하는 반응 용액에 중성수 3.0mL를 가하고 25℃에서 교반자로 5분간 교반을 행했다. 교반을 정지하고, 유기층과 수층을 분층시켰다. 유기층 5μL를 취하고, 프로필아민 100μL(1.2mmol)에 가하여, 잔존하는 C말단 활성체를 프로필아마이드로 변환시킨 후, 메탄올 0.9mL로 희석했다. LC/MS의 피크 면적치로부터, 이하의 계산식에 따라 C말단 활성체 잔존율을 계산했다.
C말단 활성체 잔존율(%)={프로필아마이드(면적%)/[프로필아마이드(면적%)+다이펩타이드(면적%)]}×100
(2) 아민 첨가의 경우
상기 조제한 펩타이드를 포함하는 반응 용액에 DMAP 91mg(0.7mmol)과 중성수 3.0mL를 가하고 25℃에서 교반자로 5분간 교반을 행했다. 교반을 정지하고, 유기층과 수층을 분층시켰다. 유기층 5μL를 취하고, 프로필아민 100μL(1.2mmol)에 가하여, 잔존하는 C말단 활성체를 프로필아마이드로 변환시킨 후, 메탄올 0.9mL로 희석했다. LC/MS의 피크 면적치로부터, 이하의 계산식에 따라 C말단 활성체 잔존율을 계산했다.
C말단 활성체 잔존율(%)={프로필아마이드(면적%)/[프로필아마이드(면적%)+다이펩타이드(면적%)]}×100
(후처리)
교반을 정지한 후, 정치하여, 유기층과 수층을 분층시키고, 수층을 제거했다. 그 다음에 유기층을 10% 황산수소 나트륨 수용액 3mL와 5% 탄산 나트륨 수용액 3mL×2, 상수 1.5mL×3으로 순차적으로 세정했다. 유기층 5μL를 취하고, 프로필아민 100μL(1.2mmol)에 가하여, 잔존하는 C말단 활성체를 프로필아마이드로 변환시킨 후, 메탄올 0.9mL로 희석하고 LC/MS 분석에 보내어, 목적으로 하는 펩타이드와 잔존 C말단 활성체(프로필아마이드로의 변환체)의 피크 면적치를 구했다. 남은 유기층을 농축하여, 펩타이드를 얻었다. 아민 비첨가로의 가수분해에 의해 얻어진 농축물(펩타이드)은 744mg이었다(수율 132%: 농축물에는 불순물(잔존 C말단 활성체)을 포함하지만, 펩타이드만을 포함하는 것으로 하여 계산했다). 아민 첨가로의 가수분해에 의해 얻어진 농축물은 528mg이었다(수율 94%). MS(ESI): m/z 455.3 [M+H]+, 477.3 [M+Na]+.
Figure pct00017
1) LCMS의 피크 면적 비율
중성수 단독 처리로의 가수분해에서는, 잔존 C말단 활성체가 완전히 가수분해되지 않고, 계속되는 수성 세정으로도 잔존 C말단 활성체를 제거할 수 없었지만, DMAP를 첨가하여 가수분해를 행하면, 잔존 C말단 활성체의 가수분해가 완전히 달성되고, 잔존 C말단 활성체의 제거도 완전히 할 수 있음을 발견했다. 이 때, 목적하는 다이펩타이드가 99.5%의 순도로 얻어졌다(수율 94%).
(실시예 26) Cbz-MeAla-Phe-OtBu의 합성
(축합 반응)
Phe-OtBu 염산염 200mg(0.8mmol), Cbz-MeAla-OH 260mg(1.2mmol)을 2-메틸테트라하이드로퓨란 2.4mL, 아세토나이트릴 0.6mL에 현탁하고, 다이아이소프로필에틸아민 271μL(1.6mmol)를 가했다. 그 다음에 25℃에서 DMT-MM-n수화물(4-(4,6-다이메톡시-1,3,5-트라이아진-2-일)-4-메틸모폴리늄 클로라이드 n수화물) 265mg(0.8mmol, 13w% 함수)을 가하고, 25℃에서 1시간 교반한 후, DMT-MM-n수화물 119mg(0.4mmol, 13w% 함수)을 가하고, 25℃에서 1시간 교반하여, 펩타이드 결합 형성 반응을 행했다. 반응액 5μL를 취하고, 프로필아민 100μL(1.2mmol)에 가하여, 잔존하는 C말단 활성체를 프로필아마이드로 변환시킨 후, 메탄올 0.9mL로 희석했다. 본 용액을 LC/MS 분석에 보내어, LC/MS의 피크 면적으로부터 변환율을 구했다(변환율: 100%).
변환율(%)={Cbz-MeAla-Phe-OtBu(면적%)/[Phe-OtBu(면적%)+Cbz-MeAla-Phe-OtBu(면적%)]}×100
(가수분해 처리)
(1) 아민 비첨가의 경우
상기 조제한 펩타이드를 포함하는 반응 용액에 5% 탄산 칼륨 수용액 2.0mL를 가하고 25℃에서 교반자로 10분간 교반을 행했다. 교반을 정지하고, 유기층과 수층을 분층시켰다. 유기층 5μL를 취하고, 프로필아민 100μL(1.2mmol)에 가하여, 잔존하는 C말단 활성체를 프로필아마이드로 변환시킨 후, 메탄올 0.9mL로 희석했다. LC/MS의 피크 면적치로부터, 이하의 계산식에 따라 C말단 활성체 잔존율을 계산했다.
C말단 활성체 잔존율(%)={프로필아마이드(면적%)/[프로필아마이드(면적%)+다이펩타이드(면적%)]}×100
(2) 아민 첨가의 경우
상기 조제한 펩타이드를 포함하는 반응 용액에 DMAP 96mg(0.8mmol)과 5% 탄산 칼륨 수용액 2.0mL를 가하고 25℃에서 교반자로 10분간 교반을 행했다. 교반을 정지하고, 유기층과 수층을 분층시켰다. 유기층 5μL를 취하고, 프로필아민 100μL(1.2mmol)에 가하여, 잔존하는 C말단 활성체를 프로필아마이드로 변환시킨 후, 메탄올 0.9mL로 희석했다. LC/MS의 피크 면적치로부터, 이하의 계산식에 따라 C말단 활성체 잔존율을 계산했다.
C말단 활성체 잔존율(%)={프로필아마이드(면적%)/[프로필아마이드(면적%)+다이펩타이드(면적%)]}×100
(후처리)
교반을 정지한 후, 정치하여, 유기층과 수층을 분층시키고, 수층을 제거했다. 그 다음에 유기층을 10% 황산수소 칼륨 수용액 2mL와 5% 탄산 칼륨 수용액 2mL, 상수 1mL×2로 순차적으로 세정했다. 유기층 5μL를 취하고, 프로필아민 100μL(1.2mmol)에 가하여, 잔존하는 C말단 활성체를 프로필아마이드로 변환시킨 후, 메탄올 0.9mL로 희석하고 LC/MS 분석에 보내어, 목적으로 하는 펩타이드와 잔존 C말단 활성체(프로필아마이드로의 변환체)의 피크 면적치를 구했다. 남은 유기층을 농축하여, 펩타이드를 얻었다. 아민 비첨가로의 가수분해에 의해 얻어진 농축물(펩타이드)은 387mg이었다(수율 114%: 농축물에는 불순물(잔존 C말단 활성체)을 포함하지만, 펩타이드만을 포함하는 것으로 하여 계산했다). 아민 첨가로의 가수분해에 의해 얻어진 농축물은 336mg이었다(수율 98%). MS(ESI): m/z 385.2 [M-tBu+H]+, 441.3 [M+H]+, 463.3 [M+Na]+.
Figure pct00018
1) LCMS의 피크 면적 비율
축합제로서 DMT-MM를 이용했을 경우, 알칼리수 단독 처리로의 가수분해에서는, 잔존 C말단 활성체가 완전히 가수분해되지 않고, 계속되는 수성 세정으로도 잔존 C말단 활성체를 제거할 수 없었지만, DMAP를 첨가하여 가수분해를 행하면, 잔존 C말단 활성체의 가수분해가 완전히 달성되고, 잔존 C말단 활성체의 제거도 완전히 할 수 있음을 발견했다. 이 때, 목적하는 다이펩타이드가 98.6%의 순도로 얻어졌다(수율 98%). 함수 용매 중에서도 사용 가능한 축합제인 DMT-MM으로부터 생성되는 C말단 활성체는, 비교적 가수분해를 받기 어려움이 알려져 있다. 그러나, 아민 첨가제를 사용하면, DMT-MM을 이용하여 조제된 잔존 C말단 활성체여도, 단시간에 또한 한 번의 처리로 완전히 가수분해되어, 계속되는 수성 세정으로 완전히 제거할 수 있음을 발견했다.
참고예 1: MeAsp(tBu)-piperidine의 합성법
(축합 반응)
Cbz-MeAsp(tBu)-OH 다이사이클로헥실아민염 10.2g(19.6mmol)을 아세트산 에틸 100mL에 현탁하고, 다이아이소프로필에틸아민 20.6mL(118mmol), 피페리딘 9.7mL(98.0mmol)를 가했다. 3∼10℃에서 50% T3P/아세트산 에틸 용액 35.0mL(58.9mmol)를 45분에 걸쳐 적하했다. 적하 종료 후, 반응액 5μL를 취하고, 메탄올 1.0mL로 희석한 용액을 LCMS 분석에 보내어, LC/MS의 피크 면적치로부터 반응 변환율을 구했다(변환율: 100%).
변환율(%)={Cbz-MeAsp(tBu)-piperidine(면적%)/[Cbz-MeAsp(tBu)-OH(면적%)+Cbz-MeAsp(tBu)-piperidine(면적%)]}×100
반응액을 10% 황산수소 칼륨 수용액 100mL, 10% 탄산 칼륨 100mL로 세정한 후, 얻어진 유기층을 황산 마그네슘으로 건조하고, 여과, 농축했다. MS (ESI) m/z 349.1 [M-tBu+H]+, 405.2 [M+H]+, 427.3 [M+Na]+.
(Cbz 탈보호 반응)
상기 농축액을 사이클로펜틸 메틸 에터 100mL에 용해하고, 5% Pd/C(50% wet) 2.0g과 수소 가스로 가수소분해 반응에 보냈다. 실온에서 5시간 교반자, 목적물인 MeAsp(tBu)-piperidine을 얻었다(변환율 100%). 반응 변환율은 반응액 5μL를 취하고, 아세토나이트릴 1.0mL로 희석한 용액을 LCMS 분석에 보내어, LC/MS의 피크 면적치로부터 반응 변환율을 구했다.
변환율(%)={MeAsp(tBu)-piperidine(면적%)/[Cbz-MeAsp(tBu)-piperidine(면적%)+MeAsp(tBu)-piperidine(면적%)]}×100
반응액을 필터로 여과한 후, 여과액을 농축하여 농축물 5.69g을 얻었다(수율 quant.). 본 농축물을 LC/MS 분석에 보내어, 목적으로 하는 MeAsp(tBu)-piperidine의 피크 면적 퍼센트를 구했다(99.2면적%). MS (ESI): m/z 215.1 [M-tBu+H]+, 271.1 [M+H]+.
본 발명은, 펩타이드 화합물을 제조함에 있어서, 축합 반응 후에 잔존한 C말단 활성체를 효율적으로 제거하는 것에 의해, 컬럼 정제하지 않고, 고순도의 펩타이드 화합물을 제조할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA <120> A method for systhesizing peptide compound <130> C1-A1926P <150> JP 2019-238793 <151> 2019-12-27 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa = Cbz-Ile <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = MeAla <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa = Aze <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa = MePhe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa = MeGly-OtBu <400> 1 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa = Cbz-MeAla <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = Aze <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa = MePhe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa = MeGly-OtBu <400> 2 Xaa Xaa Xaa Xaa 1 <210> 3 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa = MeAla <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = Aze <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa = MePhe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa = MeGly-OtBu <400> 3 Xaa Xaa Xaa Xaa 1 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa = Cbz-MeAla <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = MePhe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa = MeLeu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa = MeGly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa = MeIle <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa = Ser(tBu) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa = MePhe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa = MeVal <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa = Asp(tBu)-piperidine <400> 4 Xaa Xaa Leu Xaa Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 5 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa = Cbz-Ser(tBu) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = MePhe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa = MeVal <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa = Asp(tBu)-piperidine <400> 5 Xaa Xaa Xaa Xaa 1 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa = Cbz-MeIle <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = Ser(tBu) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa = MePhe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa = MeVal <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa = Asp(tBu)-piperidine <400> 6 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa = Cbz-MeGly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = MeIle <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa = Ser(tBu) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa = MePhe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa = MeVal <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa = Asp(tBu)-piperidine <400> 7 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa = Cbz-Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = MeGly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa = MeIle <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa = Ser(tBu) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa = MePhe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa = MeVal <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa = Asp(tBu)-piperidine <400> 8 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 9 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa = Cbz-MeLeu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa = MeGly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa = MeIle <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa = Ser(tBu) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa = MePhe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa = MeVal <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa = Asp(tBu)-piperidine <400> 9 Xaa Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = MeGly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa = MeIle <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa = Ser(tBu) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa = MePhe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa = MeVal <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa = Asp(tBu)-piperidine <400> 10 Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa = Cbz-Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa = MeLeu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa = MeGly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa = MeIle <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa = Ser(tBu) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa = MePhe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa = MeVal <400> 11 Xaa Xaa Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp 1 5 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa = Cbz-MePhe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa = MeLeu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa = MeGly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa = MeIle <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa = Ser(tBu) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa = MePhe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa = MeVal <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa = Asp(tBu)-piperidine <400> 12 Xaa Leu Xaa Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10

Claims (15)

  1. 펩타이드 화합물을 제조하는 방법으로서,
    공정 A: 용매 중에서 산 성분의 C말단 활성체를 아민 성분과 축합시켜 얻어지는 펩타이드 화합물을 포함하는, 반응 혼합액을 얻는 공정, 및
    공정 B: 상기 반응 혼합액과 3급 아민과 물 또는 수용액을 혼합하여, 해당 C말단 활성체를 제거하는 공정
    을 포함하는, 상기 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 3급 아민이, 상기 C말단 활성체에 대해서 구핵 반응성을 갖는, 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 3급 아민이, 질소 근방의 입체 장애가 작은 아민인, 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 3급 아민이, NMI, DMAP, 또는 트라이메틸아민인, 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 펩타이드 화합물이, 1개 또는 복수의 비천연 아미노산을 포함하는, 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 3급 아민을 상기 C말단 활성체와 작용시킬 때의 온도가, 25℃∼60℃인, 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 아민 성분에 대해서, 상기 3급 아민을 0.5당량 이상 가하는, 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 C말단 활성체를, 상기 3급 아민과 작용시켜 가수분해하여, 제거하는, 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    공정 B에 있어서, 상기 반응 혼합액을 유기층과 수층으로 분층하고, 그 다음에 해당 유기층을 세정하는 것을 추가로 포함하고, 해당 세정 후의 C말단 활성체의 잔존량이 1.0% 이하인, 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 공정 A에 있어서의 용매가, 톨루엔, 아세토나이트릴, 테트라하이드로퓨란, 2-메틸테트라하이드로퓨란, 아세트산 아이소프로필, 아세트산 에틸, 메틸 tert-뷰틸 에터, 혹은 사이클로펜틸 메틸 에터, N,N-다이메틸폼아마이드 또는 그의 혼합 용매인, 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 공정 B에 있어서, 상기 수용액이 탄산 칼륨 수용액 또는 탄산 나트륨 수용액인, 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    산 성분이, 아미노기가 보호기로 보호된 제 1 아미노산이며, 해당 제 1 아미노산의 측쇄가, 1개 이상의 탄소 원자를 포함하는, 방법.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 측쇄가, 치환되어 있어도 되는 알킬, 치환되어 있어도 되는 알켄일, 치환되어 있어도 되는 알킨일, 치환되어 있어도 되는 사이클로알킬, 치환되어 있어도 되는 알콕시알킬, 치환되어 있어도 되는 사이클로알킬알킬, 치환되어 있어도 되는 아르알킬, 또는 치환되어 있어도 되는 헤테로아릴알킬인, 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 3급 아민을 상기 C말단 활성체와 작용시킬 때의 시간이, 2시간 이하인, 방법.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 C말단 활성체가 축합제의 존재하에서 형성되고, 해당 축합제가 T3P, HATU, BEP, DMT-MM, EDC와 PfpOH의 조합, EDC와 HOOBt의 조합, 또는 EDC와 HOBt의 조합을 포함하는, 방법.
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