WO2020235319A1 - 軟骨又は骨の前駆細胞の拡大培養方法 - Google Patents

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晋平 小川
真由美 徳山
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味の素株式会社
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    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells

Definitions

  • the present invention relates to a method for expanding and culturing cartilage or bone progenitor cells, and a kit for the expanding culture.
  • Human cartilage is usually not regenerated if it is congenitally deficient or acquired or damaged or deficient. It is estimated that there are about 25 million people with osteoarthritis of the knee, mainly due to aging of articular cartilage, in Japan, and it is expected that the number will increase further in the future as the population ages.
  • As a conventional treatment for such human cartilage disease there is a method of collecting cartilage tissue from another site of its own and transplanting it to a defective site, but the collection site and the amount are limited.
  • chondrocytes have low proliferative potential and poor regenerative ability, it is difficult to proliferate chondrocytes derived from living organisms.
  • chondrocytes for example, pluripotent stem cells
  • a method of inducing chondrocyte differentiation from pluripotent stem cells has been reported (for example, Non-Patent Documents 1 and 2, Patent Document 1 and the like).
  • these methods require a period of at least 12 days to differentiate pluripotent stem cells into chondrocytes, and a sufficient amount of chondrocytes to be used for the treatment of cartilage disease or bone disease. I can't get it.
  • an object of the present invention is to provide a method capable of producing a chondrocyte or the like in a sufficient amount for use in the treatment of a disease while the number of days for differentiation into the chondrocyte or the like is shorter than that of the conventional method.
  • the present inventors improve the differentiation efficiency of chondrocytes from progenitor cells such as pluripotent stem cells by improving the type of cytokine or transcription factor and the timing of addition to the medium. If the progenitor cells of chondrocytes with high proliferative ability can be identified by changing the conventional idea of, the induction time can be shortened by proliferating the progenitor cells and inducing differentiation into chondrocytes. I got the idea that a large amount of chondrocytes could be obtained.
  • chondrocyte or bone progenitor cells with near-infinite proliferative capacity (the present inventors referred to these cells as "iCOP". (Named iPS-derived chondro / osteogenic progenitor) ”) was assumed to exist, and an attempt was made to actually identify iCOP and establish an expanded culture method for the cells.
  • the present inventors first assumed that among the cells contained in the cell population containing the germ layer cells, the cells exhibiting proliferative ability and capable of differentiating into chondrocytes in a short period of time were scleromes (hard nodule cells). ..
  • Non-Patent Document 1 when the method described in Non-Patent Document 1 was improved to induce differentiation of induced pluripotent stem cells into clerotome via mesoderm cells, the cells highly expressed the markers described in Non-Patent Document 1 such as PDGFRA or SOX9. I found that I was doing it. After that, as a result of diligent studies on the culture conditions under which sclerome can grow, by culturing in a medium containing a TGF- ⁇ signal inhibitor and FGF, sclerome can grow at least 5 passages while maintaining the expression of cell markers. It was found to be possible (ie, capable of self-renewal). The above findings were surprising because sclerotome was not known to have self-renewal ability.
  • sclerotome that was expanded and cultured for such a long period of time still had the ability to differentiate into chondrocytes. Therefore, it was concluded that sclerome is the iCOP. As a result of further research based on the above findings, the present inventors have completed the present invention.
  • a method for expanding cartilage or bone progenitor cells which comprises a step of culturing cartilage or bone progenitor cells in a medium containing a TGF- ⁇ signal inhibitor and FGF.
  • the method according to [1], wherein the cartilage or bone progenitor cells are cells expressing PDGFRA, SOX9, or PAX1.
  • the method according to [1] or [2], wherein L-ascorbic acid or a derivative thereof is further contained in the medium.
  • the method according to any one of [1] to [3], wherein the TGF- ⁇ signal inhibitor is SB431542.
  • [5] The method according to any one of [1] to [4], wherein the FGF is bFGF.
  • the concentration of the TGF- ⁇ signal inhibitor in the medium is 1 ⁇ M to 50 ⁇ M.
  • the concentration of the FGF in the medium is 1 ng / mL to 500 ng / mL.
  • the cartilage or bone progenitor cells are cells derived from pluripotent stem cells.
  • cartilage or bone progenitor cells are cells obtained by suspension-culturing pluripotent stem cells.
  • expansion culture is performed by suspension culture.
  • a kit for expanding culture of cartilage or bone progenitor cells which comprises a basal medium, a TGF- ⁇ signal inhibitor, and FGF.
  • the kit according to [11] further comprising L-ascorbic acid or a derivative thereof.
  • the kit according to [11] or [12], wherein the TGF- ⁇ signal inhibitor is SB431542.
  • a method for producing chondrocytes or bone cells which comprises a step of inducing differentiation of cartilage or bone progenitor cells obtained by the method according to any one of [1] to [10] into chondrocytes or bone cells. ..
  • the differentiation-inducing step comprises culturing cartilage or bone progenitor cells in a medium containing a BMP signal activator and / or a TGF- ⁇ signal activator.
  • the TGF- ⁇ signal activator is TGF- ⁇ 3.
  • a method for producing ligament node cells which comprises a step of inducing differentiation of cartilage or bone progenitor cells obtained by the method according to any one of [1] to [10] into ligament node cells.
  • a method for producing a tendon cell or a ligament cell which comprises a step of inducing differentiation of the ligament node cell obtained by the method according to [18] into a tendon cell or a ligament cell.
  • a method for identifying cartilage or bone progenitor cells which comprises the step of detecting or measuring the expression of at least one gene selected from the group consisting of the following genes.
  • a reagent for isolating cartilage or bone progenitor cells which comprises an antibody against each of the proteins encoded by at least one gene selected from the group consisting of the following genes.
  • cartilage or bone progenitor cells such as iCOP. Since the differentiation induction period from chondrocyte or bone progenitor cells to chondrocytes or osteoocytes is less than half of the differentiation induction period from conventional iPS cells to chondrocytes or osteoocytes, iCOP is expanded and cultured in advance and stocked. If this is done, it is possible to significantly shorten the period for inducing differentiation into chondrocytes or osteoocytes.
  • chondrocytes or bone cells can be produced in an extremely large amount by expanding and culturing chondrocytes or bone progenitor cells during the process of differentiation into chondrocytes. According to the present invention, a sufficient amount of chondrocytes can be rapidly produced for use in the treatment of chondrocytes or bone diseases.
  • FIG. 1 shows the results of inducing iCOP differentiation from iPS cells and measuring the positive rate of SOX9 expressed by iCOP with a flow cytometer. It was shown that iPS cells are differentiated into iCOP with high efficiency of about 90%.
  • FIG. 2 shows the growth curve when iCOP was subcultured every 7 days for 5 passages. The growth curve showed that the daily population doubling (PD) was 0.46.
  • FIG. 3 shows the results of verifying the effect of cryopreservation on the cell proliferation ability of iCOP. It was shown that cryopreservation did not reduce daily PD.
  • FIG. 1 shows the results of inducing iCOP differentiation from iPS cells and measuring the positive rate of SOX9 expressed by iCOP with a flow cytometer. It was shown that iPS cells are differentiated into iCOP with high efficiency of about 90%.
  • FIG. 2 shows the growth curve when iCOP was subcultured every 7 days for 5 passages. The growth curve showed that the daily population doubling (PD) was
  • FIG. 4 shows the results of verifying the relative expression level (mRNA amount) of the iCOP marker gene in the cryopreserved iCOP or the non-cryopreserved iCOP. It was shown that cryopreservation did not reduce the relative expression of the iCOP marker gene.
  • FIG. 5 shows the results of inducing differentiation of iCOP into osteoocytes and evaluating the relative expression level (mRNA amount) of the bone cell marker gene. It was shown that iCOP retains the ability to differentiate into bone cells.
  • FIG. 6 shows the results of inducing differentiation from iCOP into ligament node cells (syndetome) and evaluating the relative expression level (mRNA amount) of the ligament node marker gene. It was shown that iCOP retains the ability to differentiate into ligament cells.
  • FIG. 7 shows a growth curve when iCOP was subcultured every 5 days by suspension culture. The growth curve showed that the daily PD was 0.38.
  • the present invention provides a method for expanding and culturing cartilage or bone progenitor cells (hereinafter, may be referred to as “the culture method of the present invention”).
  • the culturing method of the present invention includes culturing cartilage or bone progenitor cells in a medium containing a TGF- ⁇ signal inhibitor and FGF.
  • expansion culture means a culture for the purpose of proliferating cartilage or bone progenitor cells contained in a cell population and increasing the number of cells.
  • the increase in cell number may be achieved by increasing the number of cells by proliferation exceeding the decrease by death, and it is not necessary for all cells in the cell population to proliferate.
  • cartilage or bone progenitor cell means a cell capable of differentiating into chondrocytes and / or bone cells.
  • cartilage or bone progenitor cells express PDGFRA, SOX9, or PAX1, and more preferably PDGFRA, PAX1, and SOX9.
  • a "cartilage or bone progenitor cell” is a somitor cell (sclerotome) that expresses at least one of PDGFRA, SOX9, and PAX1.
  • the cells When differentiating into chondrocytes and / or osteoocytes by at least one of the methods for inducing differentiation into chondrocytes and / or osteoocytes described below, the cells are said to have the ability to differentiate into chondrocytes and / or osteoocytes. Can be evaluated.
  • the expression of PDGFRA, PAX1 and SOX9 in cells can be confirmed by at least one of real-time PCR and flow cytometry.
  • cartilage or bone progenitor cells may have the ability to induce differentiation into cells other than cartilage or bone, such as ligament node cells (syndetome).
  • "expression” is used in the sense of including at least "production of functional protein” unless otherwise specified, but is preferably used in the sense of further including "production of mRNA”. ..
  • “cartilage or bone progenitor cells” are at least one of the following marker genes, preferably two or more (eg, three, four, five, six, seven, eight, nine). , 10 or more genes) may be expressed, but at least one expressing the PDGFRA gene is preferable.
  • the TGF- ⁇ signal inhibitor used in the present invention is not particularly limited as long as it is a substance that inhibits the signal transduction from the binding of TGF- ⁇ to the receptor to SMAD, but for example, the TGF- ⁇ receptor.
  • examples include substances that inhibit binding to a certain ALK family and substances that inhibit the phosphorylation of SMAD by the ALK family.
  • the TGF- ⁇ signal inhibitor is, for example, Lefty-1 (for example, NCBI Accession No., mouse: NM_010094, human: NM_020997), SB431542, SB202190 (above, RKLindemann et al., Mol.
  • SB431542 is preferable.
  • the concentration of the TGF- ⁇ signal inhibitor in the medium is not particularly limited, but is preferably 1 ⁇ M to 50 ⁇ M, for example, when SB431542 is used, for example, 1 ⁇ M, 2 ⁇ M, 3 ⁇ M, 4 ⁇ M, 5 ⁇ M, 6 ⁇ M, 7 ⁇ M, 8 ⁇ M, 9 ⁇ M, 10 ⁇ M, 11 ⁇ M, 12 ⁇ M, 13 ⁇ M, 14 ⁇ M, 15 ⁇ M, 16 ⁇ M, 17 ⁇ M, 18 ⁇ M, 19 ⁇ M, 20 ⁇ M, 25 ⁇ M, 30 ⁇ M, 35 ⁇ M, 40 ⁇ M, 45 ⁇ M, 50 ⁇ M, but not limited to these. More preferably, it is 2 ⁇ M to 20 ⁇ M, and particularly preferably 5 to 10 ⁇ M. Even when a TGF- ⁇ signal inhibitor other than SB431542 is used, the concentration can be appropriately set based on common general knowledge.
  • the FGF used in the present invention is not particularly limited as long as it promotes cell proliferation, but is, for example, FGF-1, bFGF (FGF-2), FGF-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6, FGF. -7, FGF-8 (eg FGF-8b), FGF-9, FGF-10, FGF-11, FGF-12, FGF-13, FGF-14, FGF-15, FGF-16, FGF-17, Examples thereof include FGF-18, FGF-19, FGF-20, FGF-21, FGF-22, and FGF-23. Of these, bFGF is preferable.
  • the above FGF may be derived from any animal (eg, rodents such as mice, rats, hamsters, guinea pigs, primates such as humans, monkeys, orangutans, orangutans), but depending on the type of cells to be cultured. It can be appropriately selected accordingly.
  • human-derived FGF include, for example, human bFGF (eg Endocrine Rev., 8, 95, 1987), bovine bFGF (eg Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6963, 1984), mouse bFGF (eg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6963, 1984). Examples include, but are not limited to, Dev. Biol., 138, 454-463, 1990), rat bFGF (eg, Biochem. Biophys. Res. Communi., 157, 256-263, 1988).
  • the FGF used in the present invention is not only a natural type but also a modified type thereof.
  • a specific region of FGF1 (partial sequence at positions 41 to 83 or partial sequence at positions 62 to 83 of the amino acid sequence of human FGF1 protein) is added to the region of bFGF corresponding to the region. Since the substituted chimeric protein is also known to have the same cell proliferation activity as bFGF (Japanese Patent Laid-Open No. 2012-143234, JP-A-2014-100141), the variant of FGF containing a partial region of bFGF is also described in this article. It can be suitably used for the invention.
  • the FGF used in the present invention can be produced by a method known per se, or can be obtained by purchasing a commercially available product.
  • the medium containing FGF can be prepared by adding soluble FGF to the medium, or a carrier such as beads on which the FGF is immobilized on the surface (eg, StemBeads FGF2, etc.) may be added to the medium. It can also be produced by.
  • the concentration of FGF in the medium is not particularly limited, but for example, when bFGF is used, it is preferably 1 ng / mL to 500 ng / mL, for example, 1 ng / mL, 2 ng / mL, 3 ng / mL, 4 ng.
  • ng / mL 5 ng / mL, 6 ng / mL, 7 ng / mL, 8 ng / mL, 9 ng / mL, 10 ng / mL, 11 ng / mL, 12 ng / mL, 13 ng / mL, 14 ng / mL, 15 ng / mL, 16 ng / mL, 17 ng / mL, 18 ng / mL, 19 ng / mL, 20 ng / mL, 25 ng / mL, 30 ng / mL, 35 ng / mL, 40 ng / mL, 45 ng / mL, 50 ng / mL, 100 ng / mL, but not limited to these.
  • the concentration can be appropriately set based on the common general technical knowledge.
  • basal medium used in the present invention examples include DMEM, EMEM, IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), GMEM (Glasgow's MEM), RPMI-1640, ⁇ -MEM, Ham's Medium F-12, Ham's Medium F-10, Ham's.
  • the medium used in the present invention may contain additives known per se.
  • additives include, for example, growth factors (eg PDGF, insulin, etc.), iron sources (eg, transferrin, etc.), hedgehog signal activators, polyamines (eg, putresin, etc.), minerals (eg, selenic acid).
  • each additive is contained within a concentration range known per se.
  • vitamin Cs mean L-ascorbic acid and its derivatives
  • L-ascorbic acid derivatives mean those that become vitamin C by an enzymatic reaction in the living body.
  • vitamin C phosphate glucoside ascorbic acid, ascorbyl ethyl, vitamin C ester, ascorbyl tetrahexyl decanoate, ascorbyl stearate, -2-phosphate-6 palmitic acid and the like can be used. Illustrated.
  • Vitamin C phosphate eg, Ascorbic acid 2-phosphate
  • Vitamin C phosphate is preferred and is, for example, phosphorus such as sodium phosphate-L-ascorbic acid, Mg phosphate-L-ascorbic acid. Acid-L-ascorbate can be mentioned.
  • the concentration of vitamin Cs in the medium is not particularly limited, but the concentration in the medium when ascorbic acid-2-phosphate is used is typically 20 ⁇ M to 2 mM (eg, 50 ⁇ M, 100 ⁇ M, 150 ⁇ M, 200 ⁇ M, 250 ⁇ M, 300 ⁇ M, 500 ⁇ M, 1 mM, etc.). Even when vitamin Cs other than ascorbic acid-2-phosphoric acid are used, the concentration can be appropriately set based on common general technical knowledge.
  • the PDGF used in the present invention may be PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PDGF-CC, or PDGF-DD that binds to the PDGF receptor, but PDGF-BB is preferable.
  • the concentration of PDGF in the medium is not particularly limited, but the concentration in the medium when PDGF-BB is used is typically 10 ng / mL to 1 ⁇ g / mL (eg, 50 ng / mL, 100 ng / mL, 150 ng / mL, 300 ng / mL, etc.). Even when PDGF other than PDGF-BB is used, the concentration can be appropriately set based on common general technical knowledge.
  • the hedgehog signal activator used in the present invention is not particularly limited as long as it is a substance that activates a signal mediated by a 12-transmembrane type Patched (Ptc) and a 7-transmembrane type Smoothened (Smo).
  • hedgehog proteins eg Hh, Shh, Ihh, Dhh, etc.
  • Smoothened agonists eg SAG (Hh-Ag 1.3), SAG21k (3-chloro-4,7-difluoro-N- (4-) methoxy-3- (pyridin-4-yl) benzyl) -N-((1r, 4r) -4- (methylamino) cyclohexyl) benzo [b] thiophene-2-carboxamide), Hh-Ag 1.1, Hh-Ag 1.5 , Purmorphamine, etc., but a Smoothened agonist is preferable, and SAG is more preferable.
  • the concentration of the hedgehog signal activator in the medium is not particularly limited, but the concentration in the medium when SAG is used is typical. 30 nM to 3 ⁇ M (eg 100 nM, 200 nM, 300 nM, 400 nM, 500 nM, 1 ⁇ M, etc.). Even when using a hedgehog signal activator other than SAG, the technique Based on common wisdom, the concentration can be set as appropriate.
  • the medium used in the present invention may contain serum.
  • the serum is not particularly limited as long as it is animal-derived serum, but is preferably mammalian-derived serum (eg, fetal bovine serum, human serum, etc.).
  • the serum concentration may be within the concentration range known per se.
  • chondrocytes induced to differentiate from the cells, etc. are used for medical purposes, heterologous components may become infection sources or heterologous antigens of blood-borne pathogens. Therefore, it is preferable that it does not contain serum.
  • alternative additives for serum for example, Knockout Serum Replacement (KSR) (Invitrogen), Chemically-defined Lipid concentrated (Gibco), B-27 Supplement (Gibco), etc.
  • KSR Knockout Serum Replacement
  • incubators examples include flasks, tissue culture flasks, dishes, petri dishes, tissue culture dishes, multi-dish, microplates, microwell plates, multi-plates, multi-well plates, microslides, and chamber slides. , Petri dishes, tubes, trays, culture bags, roller bottles, etc.
  • the incubator may be a cell adhesion incubator used for adhesive culture or a cell non-adhesive incubator used for suspension culture, and can be appropriately selected according to the purpose.
  • Cell-adhesive incubators are coated with any cell-supporting substrate such as extracellular matrix (ECM, also called extracellular matrix) for the purpose of improving the adhesion of the surface of the incubator to cells.
  • ECM extracellular matrix
  • the cell-supporting substrate can be any substance intended for cell adhesion.
  • the feeder cells are not used in the culturing method of the present invention, it is preferable to cultivate using an extracellular matrix or an active fragment thereof, or an artificial substance that mimics the functions thereof.
  • the extracellular matrix is not particularly limited as long as it is usually used for culturing cells for the purpose of improving the adhesion between the surface of the incubator and the cells, and for example, laminin (laminin 511, laminin 332, etc.), fibronectin, etc.
  • laminin laminin 511, laminin 332, etc.
  • fibronectin Known substances such as vitronectin, collagen, elastin, and adhesamine can be used.
  • the active fragment of the extracellular matrix may be any fragment thereof having cell adhesion activity equivalent to that of the extracellular matrix, and known ones can also be used.
  • the E8 fragment of laminin 511 eg, iMatrix-511 (Nippi), etc.
  • the E8 fragment of laminin 332 disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No.
  • the extracellular matrix and its active fragment may be commercially available, and are available from, for example, Life Technologies, BD Falcon, Biolamina, Nippi and the like. Two or more kinds of these extracellular matrices and active fragments thereof may be used in combination.
  • Matrigel (trade name) or Geltrex Matrix (trade name), which is a mixture of complex basement membrane components containing proteins and polysaccharides extracted and purified from mouse EHS sarcoma that overproduces the basement membrane, may be used.
  • the extracellular matrix and its active fragment may be suspended in a suitable solution and applied to a container suitable for culturing cells. Artificial substances that mimic the function of extracellular matrix are also not particularly limited as long as they are usually used for cell culture. For example, Corning's Synthemax (registered trademark), Ultraweb (registered trademark), and Sigma-Aldrich Known products such as Hy-STEM series, polylysine, polyornithine, etc. can be used.
  • the extracellular matrix or active fragment thereof used in the present invention, or an artificial substance that mimics the functions thereof is preferably Matrigel, or an active fragment of laminin 511 or laminin 511, and more preferably an active fragment of laminin 511 (. That is, the E8 fragment of laminin 511).
  • cartilage or bone progenitor cells can be proliferated endlessly (proliferation is possible for at least 5 weeks or more). Can be selected as appropriate.
  • the culture temperature is not particularly limited, but is 30 to 40 ° C., preferably 37 ° C., and the culture is carried out in the presence of CO 2 containing air, and the CO 2 concentration is preferably 2 to 5%.
  • cartilage or bone progenitor cells used in the present invention for example, cells isolated from a biological sample by cell sorting using PDGFRA as an index may be used, or from stem cells such as pluripotent stem cells and mesenchymal stem cells. Differentiation-induced cells may be used, but cells derived from pluripotent stem cells are preferable.
  • pluripotent stem cell refers to embryonic stem cells (ES cells) and similar differentiated pluripotent cells, that is, various tissues of the living body (endoderm, mesodermal, etc.). It means a cell that has the potential to differentiate into (all of the ectoderm).
  • pluripotent stem cells used in the present invention include embryonic stem cells (embryonic stem cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells), pluripotent germ stem cells, and embryonic germ stem cells. (EG cells) and the like, preferably ES cells or iPS cells, and among them, iPS cells are preferable.
  • the pluripotent stem cell is an ES cell or an arbitrary cell derived from a human embryo
  • the cell is a cell produced by destroying an embryo, even if the cell is produced by destroying the embryo. It may be, but preferably cells produced without destroying the embryo.
  • ES cell means a pluripotent stem cell established from the inner cell mass of an early embryo (for example, blastocyst) of a mammal such as a human or a mouse. ES cells were discovered in mice in 1981 (MJ Evans and MH Kaufman (1981), Nature 292: 154-156), and ES cell lines were subsequently established in primates such as humans and monkeys (JA Thomson et). al. (1998), Science 282: 1145-1147; JA Thomson et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 7844-7848; JA Thomson et al. (1996), Biol. Reprod ., 55: 254-259; JA Thomson and VS Marshall (1998), Curr. Top. Dev. Biol., 38: 133-165).
  • induced pluripotent stem cell is a pluripotent stem cell derived from a somatic cell, and by reprogramming the somatic cell, pluripotency similar to that of an embryonic stem cell is artificially created. It means a cell that has been given.
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • differentiated cells such as fibroblasts by expressing genes such as Oct3 / 4, Sox2, Klf4, and Myc can be mentioned. ..
  • Yamanaka et al Established induced pluripotent stem cells from mouse fibroblasts (Cell, 2006, 126 (4), p663-676).
  • induced pluripotent stem cells with pluripotency similar to embryonic stem cells were established from human fibroblasts (Cell, 2007, 131 (5), p861-872; Science, 2007, 318 ( 5858), p1917-1920; Nat Biotechnol., 2008, 26 (1), p101-106).
  • pluripotent stem cells examples include, but are limited to, rodent-derived cells such as mice, rats, hamsters, and guinea pigs, and primate-derived cells such as humans, monkeys, orangutans, and orangutans. Not done. Human-derived cells are preferred.
  • the pluripotent stem cell used in the present invention may be a pre-established and stocked cell, or a newly established cell. Therefore, a step of establishing pluripotent stem cells may be performed prior to the culture method of the present invention.
  • the step of establishing the pluripotent stem cell is not particularly limited as long as it includes a step of introducing a specific reprogramming factor into the somatic cell. For example, a step of collecting somatic cells, introducing reprogramming factors such as Oct3 / 4, Sox2, Klf4, and Myc to artificially express them, and then selecting and expanding the cells that have acquired pluripotency.
  • Step of introducing reprogramming factors (Oct3 / 4, Sox2, Klf4, and c-Myc) into human peripheral blood lymphocytes using a retroviral vector or Sendai viral vector and culturing them can be mentioned.
  • somatic cells from which the induced pluripotent stem cells used in the present invention are derived are not particularly limited.
  • somatic cells include lymphocytes in peripheral blood, fibroblasts such as skin, skin cells, visual cells, brain cells, hairy cells, oral mucosa, lung cells, hepatocytes, gastric mucosal cells, and intestinal cells.
  • Genes included in the reprogramming factors include, for example, Oct3 / 4, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Klf4, Klf2, c-Myc, N-Myc, L-Myc, Nanog, Lin28, Fbx15, ERas, ECAT15-2, Tcl1, beta-catenin, Lin28b, Sall1, Sall4, Esrrb, Nr5a2, Tbx3, Glis1, etc. are exemplified, and these reprogramming factors may be used alone or in combination.
  • the combinations of reprogramming factors include WO2007 / 069666, WO2008 / 118820, WO2009 / 007852, WO2009 / 032194, WO2009 / 058413, WO2009 / 057831, WO2009 / 075119, WO2009 / 079007, WO2009 / 091659, WO2009 / 101084, WO2009 / 101407, WO2009 / 102983, WO2009 / 114949, WO2009 / 117439, WO2009 / 126250, WO2009 / 126251, WO2009 / 126655, WO2009 / 157593, WO2010 / 009015, WO2010 / 033906, WO2010 / 033920, WO2010 / 042800, WO2010 / 050626, WO2010 / 056831, WO2010 / 068955, WO2010 / 098419, WO2010/102267
  • mesenchymal stem cell is derived from bone marrow or bone membrane, peripheral blood, umbilical cord blood, or adipose tissue, and is a tissue of the mesenchymal tissue system (adipose tissue, cartilage tissue, bone tissue). Etc.) means stem cells that can differentiate into.
  • mesenchymal stem cells bone marrow mesenchymal stem cells are preferable because it is easy to collect cells from living tissue and a culture method after collection has been established, and they are collected as surplus tissue from living body.
  • Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells are preferable because they are easy to collect and are less invasive at the time of collection.
  • the method for inducing differentiation of stem cells such as pluripotent stem cells and mesenchymal stem cells into cartilage or bone progenitor cells can be appropriately performed according to a method known per se.
  • pluripotent stem cells can be obtained by the methods described in Patent Document 1, Non-Patent Documents 1 and 2, JP-A-2005-511083 and the like.
  • a cell population in the middle of the process of differentiating from chondrocytes (for example, 4 to 8 days after induction of differentiation) can be used by selecting cells expressing PDGFRA or the like, if necessary.
  • the method described in JP-A-2004-254655 can be appropriately referred to.
  • pluripotent stem cells are cultured in a medium containing a Wnt signal activator, a BMP inhibitor, FGF and / or a TGF- ⁇ signal activator for about 1 to 2 days (preferably).
  • a medium containing TGF- ⁇ signal inhibitor, Wnt signal activator, BMP inhibitor and / or FGF for about 1 to 2 days (preferably 1 day).
  • the cells are cultured in a medium containing a TGF- ⁇ signal inhibitor, a BMP inhibitor, a Wnt signal inhibitor and / or a MAPK / ERK kinase (MEK) inhibitor for about 1 to 2 days (preferably 1 day).
  • MPK MAPK / ERK kinase
  • Wnt signal activator examples include CHIR99021 (6-[[2-[[4- (2,4-Dichlorophenyl) -5- (5-methyl-1H-imidazol-2-yl) -2-pyrimidinyl). ] amino] ethyl] amino] -3-pyridinecarbonitrile), WNT proteins (eg Wnt-1, Wnt-2, Wnt-2b, Wnt-3a, Wnt-4, Wnt-5a, Wnt-5b, Wnt-6, Wnt-7a, Wnt-7a / b, Wnt-7b, Wnt-8a, Wnt-8b, Wnt-9a, Wnt-9b, Wnt-10a, Wnt-10b, Wnt-11, Wnt-16b, etc.), RSPO proteins (Example: RSP02), lithium chloride, TDZD8 (4-Benzyl-2-methyl-1,2,4-thiadiazolidine-3,5-dione), BIO-ace
  • BMP inhibitor examples include NOGGIN, CHORDIN, LDN193189 (4- [6- (4-Piperazin-1-yl-phenyl) -pyrazolo [1,5-a] pyrimidin-3-yl] -quinoline hydrochloride).
  • LDN193189 When used, its concentration in the medium is typically 0.03 ⁇ M to 3 ⁇ M (eg 0.3 ⁇ M, etc.).
  • FGF examples include the same ones used in the above-mentioned culture method of the present invention, but bFGF is preferable.
  • bFGF concentration in the medium is typically 10 ng / mL to 1000 ng / mL (eg, 100 ng / mL, etc.).
  • TGF- ⁇ signal activator examples include TGF- ⁇ (eg, TGF- ⁇ 1, TGF- ⁇ 2, TGF- ⁇ 3), activin A, IDE1 (1- [2-[(2-Carboxyphenyl) methylene]]. hydrazide] heptanoic acid), IDE2 (1- (2-cyclopentylidenehydrazide) -heptanedioic acid), Nodal, etc., but activin A is preferable. When activin A is used, its concentration in the medium is typically between 3 ng / mL and 300 ng / mL (eg, 30 ng / mL, etc.).
  • TGF- ⁇ signal inhibitor examples include the above 1.
  • the same ones listed in (1) can be mentioned, but SB431542 is preferable.
  • SB431542 When SB431542 is used, its concentration in the medium is typically 1 ⁇ M to 100 ⁇ M (eg, 10 ⁇ M, etc.).
  • Wnt signal inhibitor examples include C59 (4- (2-methyl-4-pyridinyl) -N- [4- (3-pyridinyl) phenyl] benzeneacetamide), DKK1, and IWP-2 (N- (6- (6-).
  • Examples of the above MEK inhibitor include PD184352 (2- (2-chloro-4-iodophenylamino) -N-cyclopropylmethoxy-3,4-difluorobenzamide) and PD98059 (2- (2-amino-3-methoxyphenyl) -4H- 1-benzopyran-4-one), U0126, SL327, PD0325901 (N-[(2R) -2,3-Dihydroxypropoxy] -3,4-difluoro-2-[(2-fluoro-4-iodophenyl) amino]- Benzamide), trametinib, cobimetinib, binimetinib and the like, with PD0325901 being preferred.
  • PD0325901 When PD0325901 is used, its concentration in the medium is typically 0.03 ⁇ M to 3 ⁇ M (eg 0.3 ⁇ M, etc.).
  • hedgehog signal activator examples include hedgehog proteins (eg, Hh, Shh, Ihh, Dhh, etc.), Smoothened agonists (eg, SAG (Hh-Ag 1.3), SAG21k (3-chloro-4,7)).
  • -difluoro-N- (4-methoxy-3- (pyridin-4-yl) benzyl) -N-((1r, 4r) -4- (methylamino) cyclohexyl) benzo [b] thiophene-2-carboxamide), Hh -Ag 1.1, Hh-Ag 1.5, purmorphamine, etc. are mentioned, but Smoothened agonists are preferable, and SAG is more preferable.
  • SAG When SAG is used, its concentration in the medium is typically 0.03 ⁇ M to 3 ⁇ M. (Example: 0.3 ⁇ M, etc.).
  • the medium used in step (i) contains CHIR99021, LDN193189, bFGF and activin A
  • the medium used in step (ii) contains SB431542, CHIR99021, LDN193189 and bFGF.
  • SB431542, LDN193189, IWR-1 and PD0325901 are included, and the medium used in the above step (iv) contains IWR-1 and SAG.
  • the cartilage or bone progenitor cells induced to differentiate in this way may be used as they are in the culture method of the present invention, or may be cryopreserved (also referred to as cryopreservation) and thawed before use before the present invention. It may be used as a culture method. In addition, differentiation-induced cartilage or bone progenitor cells may be expanded and cultured before cryopreservation. Therefore, in another aspect of the present invention, a method for cryopreserving the cells, or a frozen stock produced by the method, comprising the step of cryopreserving the progenitor cells of cartilage or bone obtained by the culturing method of the present invention. A manufacturing method is provided.
  • a culture solution in which cells are immersed, a physiological buffer solution, or the like is used as a cryopreservation solution, and a cryoprotectant is added thereto, or the culture solution is replaced with a cryopreservation solution containing a cryoprotectant. You may do it after performing processing such as.
  • the cryopreservation solution may be added after substantially all the culture solution has been removed, or the cryopreservation solution may be added while a part of the culture solution remains.
  • a commercially available solution may be used, and examples thereof include STEM-CELLBANKER (registered trademark) (ZENOAQ).
  • the cells can be thawed by any known cell thawing method.
  • cryopreserved cells are subjected to solid, liquid or gas having a temperature higher than the freezing temperature by using a water bath, an incubator, a thermostat or the like. Achieved by contact with a medium (eg, water, culture).
  • a medium eg, water, culture
  • the basal medium used for inducing differentiation of stem cells into cartilage or bone progenitor cells is not particularly limited, and examples thereof include the same basal medium used in the culture method of the present invention described above.
  • the medium may contain additives, serum and / or serum substitutes, for example, the same as the additives, serum and serum substitutes that can be used in the culture method of the present invention described above.
  • the incubator used for inducing differentiation is not particularly limited, and examples thereof include the same incubator used in the above-mentioned culturing method of the present invention.
  • the incubator may be cell-adherent or non-cell-adhesive, and is appropriately selected according to the purpose.
  • a cell-adhesive incubator is coated with any cell-supporting substrate such as extracellular matrix (ECM, also called extracellular matrix) for the purpose of improving the adhesion of the surface of the incubator to cells.
  • ECM extracellular matrix
  • the cell-supporting matrix may be the same as the cell-supporting substrate that can be used in the above-mentioned culture method of the present invention.
  • the cell culturing method may be adhesive culturing or suspension culturing.
  • "suspension culture” means culturing a target cell or cell mass without adhering it to the bottom surface of the incubator, and even if the cell or cell mass touches the bottom surface, the culture solution is used. Suspension culture also includes culturing in a state in which cells and cell clusters float in the culture solution when shaken lightly.
  • the suspension culture may be a static culture, but cell seeding, medium exchange, cell image acquisition, and cultured cell recovery are automatically performed under mechanical control in a closed environment, and pH, temperature, and oxygen are used.
  • a bioreactor eg, single-use bioreactor, etc.
  • an automatic culturing device capable of culturing at high density while controlling the concentration and the like.
  • Fed-batch culture, continuous culture, and perfusion culture are methods for supplying a new medium in the middle of culture using these devices and supplying the required substances to cells and / or tissues in just proportion.
  • the culture temperature is not particularly limited, but is 30 to 40 ° C., preferably 37 ° C., and the culture is carried out in the presence of CO 2 containing air, and the CO 2 concentration is preferably 2 to 5%.
  • the present invention also provides a cartilage or bone progenitor cell expansion kit (hereinafter sometimes referred to as the "kit of the present invention").
  • the kit of the present invention contains a basal medium, a TGF- ⁇ signal inhibitor and FGF.
  • the basal medium, TGF- ⁇ signal inhibitor and FGF include the above 1.
  • the same ones listed in (1) can be mentioned, but among them, DMEM / F-12 mixed medium is preferable as the basal medium, SB431542 is preferable as the TGF- ⁇ signal inhibitor, and bFGF is preferable as the FGF.
  • the kit of the present invention may also include cartilage or bone precursor cells, media additives, serum, serum substitutes, incubators and / or cell support substrates, and cartilage or bone precursors.
  • Examples of cells, additives to media, serum, serum substitutes, incubators and substrates for supporting cells include the above 1. The same ones listed in.
  • the kit of the present invention may further include a document or instruction manual describing the procedure for expansion culture.
  • kits containing a medium containing a TGF- ⁇ signal inhibitor and / or FGF, or a medium for expanding culture of cartilage or bone progenitor cells containing a TGF- ⁇ signal inhibitor and FGF is provided.
  • the present invention also provides a method for producing chondrocytes or osteoocytes (hereinafter, may be referred to as “method for producing the present invention”).
  • the production method of the present invention comprises a step of inducing differentiation of cartilage or bone progenitor cells (hereinafter sometimes referred to as “progenitor cells of the present invention”) obtained by the culture method of the present invention into chondrocytes or bone cells. Including.
  • the progenitor cells of the present invention are induced to differentiate into chondrocytes by appropriately referring to the methods described in Patent Document 1, Non-Patent Documents 1 and 2, JP-A-2005-511083, and JP-A-2004-254655. can do. More specifically, for example, by culturing the progenitor cells of the present invention in a medium containing a BMP signal activator and / or a TGF- ⁇ signal activator, differentiation can be induced into chondrocytes.
  • the progenitor cells of the present invention may be expanded and cultured again by the method of the present invention before the induction of differentiation is started (for example, after the cryopreserved cells are put to sleep).
  • the medium, TGF- ⁇ signal inhibitor, FGF, medium additive, serum and its substitute, incubator, etc. are described in 1. above. As described in.
  • BMP signal activator examples include bone morphogenetic proteins (BMP) (eg, BMP-2, BMP-4, BMP-7, etc.), Alantolactone, FK506, isoliquiritigenin, 4'-hydroxychalcone and the like. However, it is preferably a bone morphogenetic protein, and BMP-4 is more preferable.
  • BMP-4 bone morphogenetic protein
  • its concentration in the medium is typically between 2 ng / mL and 200 ng / mL (eg, 20 ng / mL, etc.).
  • TGF- ⁇ signal activator examples include the above 1. The same as those listed in the above can be mentioned, but TGF- ⁇ is preferable, and TGF- ⁇ 3 is more preferable.
  • the concentration in the medium is typically 1 ng / mL to 100 ng / mL (eg, 10 ng / mL, etc.).
  • the medium used in the culture contains BMP-4 and TGF- ⁇ 3.
  • chondrocytes induced to differentiate from cartilage or bone progenitor cells express COL2A1, ACAN and EPIPHYCAN at at least mRNA levels. Expression of such markers can be detected by methods known per se, and detection of marker protein expression can be detected by immunological assays using antibodies such as ELISA, immunostaining, Western blotting, flow cytometry. Can be done using. Further, the expression of the marker gene can be detected by using, for example, a nucleic acid amplification method and / or a nucleic acid detection method such as real-time PCR, microarray, biochip and RNAseq.
  • a method for inducing differentiation of the progenitor cells of the present invention into bone cells a method known per se can be used.
  • progenitor cells of the present invention by culturing the progenitor cells of the present invention in a medium containing, for example, dexamethasone, ⁇ -glycerophosphate and vitamin Cs, a Rho kinase inhibitor and a BMP signal activator, and / or a calcium antagonist.
  • each of the additives to the medium is contained within a concentration range known per se.
  • a method of inducing differentiation of progenitor cells into chondrocytes and then differentiating from chondrocytes into bone cells can also be used.
  • Examples of the above-mentioned vitamin Cs include the same ones listed in 1 above.
  • Examples of the Rho kinase inhibitor include (+)-trans-4- (1-aminoethyl) -1- (4-puridylcarbamoyl) cyclohexane and (+)-trans-N- (1H-pyrrolo [2,3-].
  • Examples of the calcium channel blocker include dihydropyridine calcium channel blockers (eg, benidipine, diphedipine, amlodipine, synolenidipine, etc.), phenylalkylamine calcium channel blockers (eg, verapamil, galopamil, bepridil, etc.), and benzothiazem.
  • Calcium channel blockers eg, diltiazem
  • zonisamide fasdil, romelysin, pregavalin, cyclanderate, idebenon, buflomedil, atociban and the like.
  • Confirmation of bone cells can be performed by confirming alkaline phosphatase activity and / or expression of one or more bone markers.
  • the bone marker include RUNX2, COL1A1, Osteopontin (OPN), Osterix, ALP, Osteocalcin and the like.
  • bone cells induced to differentiate from cartilage or bone progenitor cells express COL2A1 and OPN at at least mRNA levels.
  • Alkaline phosphatase activity can be confirmed by methods known per se (eg Kind-King method, Bessey-Lowry method, GSCC method, SSCC method, JSCC method, etc.) and commercially available kits (eg TRACP & ALP Assay Kit (Takara Bio). ) Etc.) can be used.
  • the expression of the bone marker can be detected by the same method as the detection of the expression of the cartilage marker described above.
  • the basal medium used for inducing differentiation of the progenitor cells of the present invention into chondrocytes or osteoocytes is not particularly limited, and examples thereof include the same basal medium used in the above-mentioned culturing method of the present invention.
  • the medium may also contain additives, serum and / or serum substitutes, for example the same additives, serum and serum substitutes that can be used in the culture method of the present invention described above. Can be mentioned.
  • the incubator used for inducing differentiation is not particularly limited, and examples thereof include the same incubator used in the above-mentioned culturing method of the present invention.
  • the incubator may be cell-adherent or non-cell-adhesive, and is appropriately selected according to the purpose.
  • the cell-adhesive incubator is coated with any cell-supporting substrate such as extracellular matrix (ECM, also called extracellular matrix) for the purpose of improving the adhesion of the surface of the incubator to cells.
  • ECM extracellular matrix
  • the cell-supporting matrix may be the same as the cell-supporting substrate that can be used in the above-mentioned culture method of the present invention.
  • the culture period is not particularly limited as long as the chondrocytes can differentiate, but is preferably 3 days or more (eg, 4 days, 5 days or more).
  • the upper limit is not particularly limited, but is preferably 20 days or less (eg, 15 days, 10 days, 9 days, 8 days, 7 days or less). In a preferred embodiment, it is 6 days.
  • the culture period is not particularly limited as long as the bone cells can differentiate, but is 7 days or more (eg, 8 days, 9 days, 10 days, 11 days, 12 days, 13 days or more) is preferable.
  • the upper limit is not particularly limited, but is preferably 30 days or less (eg, 25 days, 20 days, 19 days, 18 days, 17 days, 16 days, 15 days or less, and examples thereof include 14 days.
  • the temperature is not particularly limited, but is 30 to 40 ° C., preferably 37 ° C., and the culture is carried out in the presence of CO 2 containing air, and the CO 2 concentration is preferably 2 to 5%.
  • the culture of the progenitor cells of the present invention may be adhesive culture or suspension culture.
  • the suspension culture may be a static culture, but it can also be performed by the above-mentioned bioreactor or automatic culture device. When culturing using these devices, any of the methods of fed-batch culture, continuous culture and perfusion culture can be used in the present invention.
  • the culture temperature is not particularly limited, but is 30 to 40 ° C., preferably 37 ° C., and the culture is carried out in the presence of CO 2 containing air, and the CO 2 concentration is preferably 2 to 5%.
  • the present invention provides a method for producing ligamentous node cell (hereinafter, may be referred to as "method for producing ligamentous node cell of the present invention”).
  • the method for producing a ligament node cell of the present invention includes a step of inducing differentiation of the progenitor cell of the present invention into a ligament node cell.
  • the ligament node cells produced in this manner may be referred to as "the ligament node cells of the present invention”. It is also possible to produce tendon cells or ligament cells by inducing differentiation of the ligament node cells of the present invention into tendon cells or ligament cells.
  • chondrocytes bone cells, ligament node cells, tendon cells, ligament cells and progenitor cells of the present invention produced as described above are defined as "sclerotome of the present invention”. -lineage cells) "may be used.
  • the progenitor cells of the present invention can be induced to differentiate into ligament node cells by appropriately referring to the method described in Nakajima T. et al., Development, 145 (16): dev165431 (2016). More specifically, for example, (A) a step of culturing the precursor cells of the present invention in a medium containing FGF and / or TGF- ⁇ signal activator, and (B) cells cultured by the step (A).
  • the medium used in steps (A) and (B) preferably contains vitamin Cs, and specific vitamin Cs include, for example, the above 1. The same ones listed in.
  • the concentration of vitamin C in the medium is also the above 1. It is preferable that the concentration is the same as that described in 1.
  • the above FGF includes the above 1. The same as those listed in the above can be mentioned, but FGF-8 (eg, FGF-8b) is preferable.
  • FGF-8 eg, FGF-8b
  • its concentration in the medium is typically 1 ng / mL to 100 ng / mL (eg, 10 ng / mL, etc.).
  • TGF- ⁇ signal activator examples include the above 1. The same as those listed in the above can be mentioned, but TGF- ⁇ is preferable, and TGF- ⁇ 3 is more preferable. When TGF- ⁇ 3 is used, its concentration in the medium is typically 1 ng / mL to 100 ng / mL (eg, 10 ng / mL, etc.).
  • BMP-4 is preferable.
  • its concentration in the medium is typically 1 ng / mL to 100 ng / mL (eg, 10 ng / mL, etc.).
  • TGF- ⁇ 3 and FGF-8 are included when used in step (A) and / or medium used in step (B) contains BMP-4 and TGF- ⁇ 3. Is done.
  • Confirmation that it is a ligament node cell can be performed by confirming the expression of two or more types of ligament node markers.
  • the cells may be cultured while applying mechanical stress.
  • the ligament node marker include two or more types of markers selected from COL1A1, TNMD and SCX.
  • ligament node cells induced to differentiate from cartilage or bone progenitor cells express COL2A1 and TNMD at least at the mRNA level. Expression of such markers can be detected by methods known per se, and detection of marker protein expression can be detected by immunological assays using antibodies such as ELISA, immunostaining, Western blotting, flow cytometry. Can be done using. Further, the expression of the marker gene can be detected by using, for example, a nucleic acid amplification method and / or a nucleic acid detection method such as real-time PCR, microarray, biochip and RNAseq.
  • ligament node cells of the present invention As a method for inducing differentiation of ligament node cells of the present invention into tendon cells or ligament cells, a method known per se can be used.
  • the ligament node cells of the present invention can be induced to differentiate into tendon cells or ligament cells by appropriately referring to the methods described in JP-A-2011-205964 and the like.
  • the basal medium used for inducing differentiation into ligament node cells, tendon cells or ligament cells is not particularly limited, and examples thereof include the same basal medium used in the above-mentioned culture method of the present invention.
  • the medium may also contain additives, serum and / or serum substitutes, for example the same additives, serum and serum substitutes that can be used in the culture method of the present invention described above. Can be mentioned.
  • the incubator used for inducing differentiation is not particularly limited, and examples thereof include the same incubator used in the above-mentioned culturing method of the present invention.
  • the incubator may be cell-adherent or non-cell-adhesive, and is appropriately selected according to the purpose.
  • the cell-adhesive incubator is coated with any cell-supporting substrate such as extracellular matrix (ECM, also called extracellular matrix) for the purpose of improving the adhesion of the surface of the incubator to cells.
  • ECM extracellular matrix
  • the cell-supporting matrix may be the same as the cell-supporting substrate that can be used in the above-mentioned culture method of the present invention.
  • the culture period for differentiating ligament node cells from the progenitor cells of the present invention is not particularly limited as long as the ligament node cells can be differentiated, but is preferably 3 days or more (eg, 4 days, 5 days or more).
  • the upper limit is not particularly limited, but is preferably 20 days or less (eg, 15 days, 10 days, 9 days, 8 days, 7 days or less). In a preferred embodiment, it is 8 days.
  • the culture period of step (A) is preferably 1 to 3 days (example: 2 days), and the period of step (B) is preferably 4 to 8 days (example: 6 days).
  • the culture period for differentiating tendon cells or ligament cells from ligament node cells is also not particularly limited as long as the tendon cells or ligament cells can be differentiated.
  • the culture temperature is not particularly limited, but is 30 to 40 ° C., preferably 37 ° C., and the culture is carried out in the presence of CO 2 containing air, and the CO 2 concentration is preferably 2 to 5%.
  • the culture may be an adhesive culture or a suspension culture.
  • the suspension culture is described in 1. above. It can be carried out in the same manner as described in.
  • the present invention also provides a cell transplantation therapy agent (hereinafter, also referred to as “cell transplantation therapy agent of the present invention”) containing the hardline lineage cells of the present invention and a method for producing the agent. ..
  • the culture method of the present invention can obtain a sufficient amount of chondrocyte or bone precursor cells for use in the treatment or prevention of cartilage disease or bone disease, and by inducing differentiation of the cells.
  • a sufficient amount of chondrocytes or bone cells can be provided for use in the treatment or prevention of cartilage or bone disease.
  • ligament node cells, tendon cells or ligament cells induced to differentiate from the progenitor cells of the present invention can be used for the treatment or prevention of tendon or ligament-related diseases.
  • the culture method of the present invention can obtain a cell population in which the residual risk of undifferentiated cells causing tumors and the like is significantly reduced. Therefore, the hardline lineage cells of the present invention are suitable for use as a raw material for a cell transplantation therapy agent, and the cell transplantation therapy agent is a cartilage disease or bone disease such as osteoarthritis or rheumatoid arthritis, or a ligament injury. It is useful for the treatment or prevention of tendon or ligament-related diseases such as Eras Dunlos's symptoms.
  • the gangular lineage cells of the present invention also include a cell population containing the cells.
  • a step of providing progenitor cells of cartilage or bone by the culture method of the present invention and (2) an effective amount of the present invention provided by the step (1).
  • a method for producing a cell transplantation therapeutic agent of the present invention which comprises the step of preparing a preparation containing progenitor cells, is provided.
  • a method for producing a cell transplantation therapeutic agent of the present invention which comprises a step of preparing a preparation containing cells and the like.
  • a preparation containing ligament node cells, tendon cells or ligament cells can also be prepared in the same manner as described above.
  • a mammal eg, human, mouse, rat, monkey, bovine, horse
  • an effective amount of the gangular lineage cell of the present invention or the cell transplantation therapeutic agent of the present invention is treated or prevented.
  • Pigs, dogs, etc. to treat or prevent cartilage or bone disease.
  • iPS cells established from somatic cells having the same or substantially the same HLA genotype of the transplanted individual from the viewpoint of not causing rejection. It is desirable to use cells derived from.
  • substantially the same means that the transplanted cells have the same HLA genotype to the extent that the immune response can be suppressed by the immunosuppressant, and for example, HLA-A and HLA-B.
  • HLA-A and HLA-B It is a somatic cell having an HLA type in which 3 loci of HLA-DR or 4 loci with HLA-C are matched.
  • the hardline lineage cells of the present invention have gene mutations that cause cartilage disease, bone disease, etc., for example, using a technique such as genome editing (eg, CRISPR system, TALEN, ZFN, etc.), It is preferable to repair the mutation of the gene that causes the disease in advance. If sufficient cells cannot be obtained due to age or constitution, it is possible to implant the cells in a capsule such as polyethylene glycol or silicon, a porous container, etc. to avoid rejection. is there.
  • the hardline lineage cells of the present invention are produced as parenteral preparations such as injections, suspensions, and infusions by mixing with a pharmaceutically acceptable carrier according to conventional means.
  • Pharmaceutically acceptable carriers that can be included in the parenteral preparation include, for example, isotonic solutions containing saline, glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.).
  • An aqueous solution for injection can be mentioned.
  • the cell transplantation therapeutic agent of the present invention is, for example, a buffer (for example, phosphate buffer, sodium acetate buffer), a soothing agent (for example, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), and a stabilizer (for example, human).
  • the transplant therapeutic agent of the present invention may be blended with serum albumin, polyethylene glycol, etc.), preservatives, antioxidants, etc.
  • the transplant therapeutic agent of the present invention is formulated as an aqueous suspension
  • the ganglion lineage cells of the present invention are suspended in the above aqueous solution so as to have a concentration of about 1 ⁇ 10 6 to about 1 ⁇ 10 8 cells / mL. Just let me do it.
  • the dose or the amount of transplantation and the number of administrations or the number of transplants of the nodular lineage cell or the cell transplantation therapeutic agent of the present invention can be appropriately determined depending on the age, body weight, symptoms and the like of the mammal to be administered.
  • the cell transplantation therapeutic agent of the present invention is provided in a cryopreserved state under conditions normally used for cryopreservation of cells, and can be thawed before use.
  • serum or a substitute thereof an organic solvent (eg, DMSO) and the like may be further contained.
  • the concentration of serum or a substitute thereof is not particularly limited, but may be about 1 to about 30% (v / v), preferably about 5 to about 20% (v / v).
  • the concentration of the organic solvent is not particularly limited, but may be 0 to about 50% (v / v), preferably about 5 to about 20% (v / v).
  • the hardline lineage cells of the present invention are useful for screening compounds for the treatment or prevention of cartilage or bone diseases, or tendon or ligament-related diseases.
  • the test compound alone or in combination with other agents may be contacted with the gangular lineage cells of the invention to promote differentiation, proliferation, maturation of the cells, or cartilage or bone matrix by methods known per se.
  • the production amount of the above-mentioned test compound is increased, it can be evaluated that the test compound is useful as a therapeutic compound for the above-mentioned diseases.
  • the cells used for the screening are preferably cells that exhibit the same phenotype as the disease to be treated, and are particularly preferably produced by inducing differentiation of induced pluripotent stem cells prepared from somatic cells derived from disease patients. It is a cell.
  • Examples of the cartilage disease or bone disease include the above 4. The same diseases listed in (1) can be mentioned.
  • test compound examples include peptides, proteins, antibodies, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma and the like.
  • the test compound may form a salt.
  • salts with physiologically acceptable acids eg, inorganic acids, organic acids
  • bases eg, alkali metal salts, alkaline earth metal salts, aluminum salts
  • the salt include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid), or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, tartrate acid).
  • Citric acid malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid
  • sodium salt potassium salt, calcium salt, magnesium salt, barium salt, aluminum salt can be used.
  • the hard node lineage cells of the present invention can also be used for verification of drug discovery targets and analysis of disease mechanisms.
  • cartilage or bone progenitor cells can be identified by detecting or measuring the expression of at least one gene selected from the group consisting of the following genes.
  • at least one of the following genes preferably two or more (eg, three, four, five, six, seven, eight, nine, ten or more)
  • Those in which gene expression is detected can be identified as cartilage or bone progenitor cells, but it is preferable that at least PDGFRA gene expression is detected.
  • the detection or measurement of gene expression can be performed by the same method as the above-mentioned detection or measurement of cartilage marker expression.
  • cell surface antigen genes of the present invention the following cell surface antigen genes (hereinafter sometimes referred to as “cell surface antigen genes of the present invention"), and the antigen encoded by the genes is referred to as "the present At least one, preferably two or more (eg, three, four, five, six, seven, eight, nine, ten) selected from (sometimes referred to as "cell surface antigens of the invention”).
  • the present antigen encoded by one or more genes as an index
  • cartilage or bone progenitor cells can be isolated from a cell population containing cartilage or bone progenitor cells.
  • PDGFRA is preferable as one of the cell surface antigens of the present invention.
  • Cell isolation can be performed by methods known per se (eg, FACS, MACS, etc.).
  • the present invention also comprises at least an antibody against each of one or more of the cell surface antigens of the present invention for isolating cartilage or bone progenitor cells.
  • a reagent (hereinafter sometimes referred to as “reagent of the present invention”) is provided.
  • the reagents of the present invention contain antibodies against two or more antigens, the reagents can be provided as a reagent kit containing each antibody in a separate reagent.
  • Antibodies contained in the reagents of the present invention can be provided, for example, in the form bound to fluorescent dyes, metal isotopes or beads (eg, magnetic beads), depending on the isolation means.
  • the antibody shall also include an antibody fragment or a variant having the ability to bind to a cell surface antigen (eg, Fab fragment, scFab fragment, ScFv fragment, etc.).
  • Example 1 Preparation of iCOP having proliferative ability and chondrogenic ability
  • iCOP iPS cell-induced chondro / osteogenic progenitor
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • the proliferative potential The ability to differentiate into chondrocytes was evaluated.
  • the iPS cells the 1210B2 strain purchased from iPS Academia Japan was used.
  • the medium On the first day of differentiation, the medium was replaced with 5 mL of 2 differentiation medium containing RPMI 1640, 2% B27, 10 ⁇ M SB431542 (ReproCell), 5 ⁇ M CHIR99021, 100 ng / mL bFGF, and 0.3 ⁇ M LDN 193189.
  • the medium On the second day of the following day, the medium was replaced with 5 mL of 3 differentiation medium containing RPMI1640, 2% B27, 10 ⁇ M SB431542, 3 ⁇ M IWR-1 (Sigma), 0.3 ⁇ M PD0325901 (Cayman Chemical), and 0.3 ⁇ M LDN 193189.
  • the medium was replaced with 5 mL of 4 differentiation medium containing RPMI1640, 2% B27, 3 ⁇ M IWR-1, and 0.3 ⁇ M SAG (Cayman Chemical).
  • 4 differentiation medium containing RPMI1640, 2% B27, 3 ⁇ M IWR-1, and 0.3 ⁇ M SAG (Cayman Chemical).
  • 70% of the culture supernatant of the single-use bioreactor was exchanged with 4 differentiation media, and the cells on the 6th day were designated as iCOP.
  • SOX9 expressing iCOP was labeled using Alexa Fluor® 647 Mouse Anti-Sox9 (BD Biosciences), and its positive rate was measured by Attune NxT Flow Cytometer (Thermo Fisher Scientific). As a result, it was confirmed that iCOP can be induced with high efficiency of about 90% (Fig. 1).
  • iCOP was harvested from a single-use bioreactor, centrifuged, suspended in 1 mL of Accumax cell detachment solution (Merck), and allowed to stand for 10 minutes. Suspend and centrifuge again until the cell mass collapses, DMEM / F12 (Thermo Fisher Scientific), 2% B27, 5 ⁇ M SB431542, 10 ng / mL bFGF, 250 ⁇ M L-ascorbic acid-2-phosphate sesquimagnesium salt ( The cells were suspended in iCOP growth medium containing Sigma) and the number of cells was counted.
  • Example 2 Verification of cartilage differentiation ability of iCOP
  • iCOP of each passage number was washed with PBS (-), immersed in Accutase (Nacalai Tesque), and incubated at 37 ° C. for 5 minutes. ..
  • the cells are detached, they are collected in a tube, centrifuged, suspended in 5 differentiation media containing DMEM / F12, 2% B27, 10 ng / mL TGF- ⁇ 3 (PeproTech), and 20 ng / mL BMP4 (R & D systems), and the cells are suspended. The number was measured.
  • Example 3 Verification of cryopreservability of iCOP
  • iCOP prepared from iPS cells was cryopreserved and then thawed to evaluate proliferative ability and differentiation ability into chondrocytes.
  • the iPS cells the 1231A3 strain purchased from iPS Academia Japan was used.
  • iPS cells were seeded on a 10 cm dish (BD FALCON) pre-coated with 0.5 ⁇ g / cm 2 iMatrix-511 (Nippi), and StemFit containing 10 ⁇ M Y-27632 (StemFit). Registered trademark) AK03N was cultured in an incubator at 37 ° C and 5% CO 2 .
  • the medium was replaced with 8 mL of differentiation 1 medium containing RPMI1640, 20% StemFit® For Differentiation®, 30 ng / mL Activin A, 10 ⁇ M CHIR99021, 100 ng / mL bFGF, and 0.3 ⁇ M LDN 193189.
  • the medium was replaced with 8 mL of differentiated 2 medium containing RPMI1640, 20% StemFit® For Differentiation, 10 ⁇ M SB431542, 5 ⁇ M CHIR99021, 100 ng / mL bFGF, 0.3 ⁇ M LDN 193189.
  • the medium was replaced with 8 mL of 3 differentiation medium containing RPMI1640, 20% StemFit® For Differentiation, 10 ⁇ M SB431542, 3 ⁇ M IWR-1, 0.3 ⁇ M PD0325901, 0.3 ⁇ M LDN 193189.
  • the cells were replaced with 8 mL of 4 differentiation medium containing RPMI1640, 20% StemFit® For Differentiation, 3 ⁇ M IWR-1, and 0.3 ⁇ M SAG.
  • the medium was exchanged with 4 differentiation media, and the cells on the 6th day were designated as iCOP.
  • the number of viable cells of iCOP was measured, and 2 ⁇ 10 5 cells of iCOP were seeded in a 10 cm dish pre-coated with 0.5 ⁇ g / cm 2 iMatrix-511, DMEM / F12, 20% StemFit® For Differentiation, Incubated in iCOP growth medium containing 250 ⁇ M L-Ascorbic Acid 2-phosphate, 10 ⁇ M SB431542, 100 ng / mL bFGF, and 0.3 ⁇ M SAG at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • the number of iCOP cells was counted, and the cells were divided into a subculture group and a frozen stock preparation group.
  • 1 ⁇ 10 6 cells were suspended in 1 mL STEM-CELLBANKER® GMP grade (Zenoaq) and dispensed into serum tubes (IWAKI). After that, the serum tube was put into BICELL (Japan Freezer) that had been cooled to 4 ° C in advance, frozen in the -80 ° C deep freezer, and transferred to the -150 ° C deep freezer the next day.
  • Example 4 Verification of bone differentiation ability of iCOP
  • differentiation was induced from iCOP to osteoocyte (Osteocyte), and the gene expression level of the bone cell marker was evaluated.
  • iPS cells 1231A3 strain, 1210B2 strain, and 201B7 strain purchased from iPS Academia Japan were used.
  • the iCOP cryopreserved in the first passage was put to sleep, DMEM / F12, 20% StemFit® For Differentiation, 250 ⁇ M L-Ascorbic Acid 2-phosphate, 10 ⁇ M SB431542, 100 ng / mL bFGF, 0.3.
  • the cells were expanded to the third passage in iCOP growth medium containing ⁇ M SAG and 10 ng / mL PDGF-BB (Peprotech).
  • iCOP When iCOP reaches 90-100% confluence, count the number of viable cells, DMEM containing 4.5 g / L Glucose (Nakarai Tesk), 20% StemFit® For Differentiation, 250 ⁇ M L-Ascorbic Acid 2-phosphate, 100 Suspended in a bone differentiation medium containing nM dexamethasone (Sigma) and 10 mM ⁇ -glycero phosphate (Nakaraitesku). 2 ⁇ 10 5 cells of iCOP were seeded on a 24-well plate (BD FALCON) pre-coated with 0.5 ⁇ g / cm 2 iMatrix-511 and allowed to stand in an incubator at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • BD FALCON BD FALCON
  • Example 5 Verification of ligament node cell differentiation ability of iCOP
  • differentiation was induced from iCOP to ligament node cells (syndetome), and the gene expression level of the ligament node marker was evaluated.
  • iPS cells 1231A3 strain, 1210B2 strain, and 201B7 strain purchased from iPS Academia Japan were used.
  • the iCOP cryopreserved in the first passage was put to sleep, DMEM / F12, 20% StemFit® For Differentiation, 250 ⁇ M L-Ascorbic Acid 2-phosphate, 10 ⁇ M SB431542, 100 ng / mL bFGF, 0.3. It was expanded to the 5th passage in iCOP growth medium containing ⁇ M SAG.
  • iCOP When iCOP reaches 90-100% confluence, count viable cells, DMEM / F12, 20% StemFit® For Differentiation, 250 ⁇ M L-Ascorbic Acid 2-phosphate, 10 ng / mL TGF- ⁇ 3 (Peprotech) ), Suspended in ligament node cell differentiation medium 1 containing 20 ng / mL FGF8b (Peprotech). 2.5 ⁇ 10 5 cells iCOP was seeded on a 24-well plate pre-coated with 0.5 ⁇ g / cm 2 iMatrix-511 and allowed to stand in an incubator at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • Example 6 Expanded culture by suspension culture of iCOP
  • iCOP was grown by suspension culture, and its proliferative potential and ability to differentiate into chondrocytes were evaluated.
  • the iPS cells the 1231A3 strain purchased from iPS Academia Japan was used.
  • the number of viable cells of iCOP prepared from iPS cells was measured, and DMEM / F12, 20% StemFit® For Differentiation, 250 ⁇ M L-Ascorbic Acid 2-phosphate, 10 ⁇ M SB431542, 100 ng / mL bFGF, 0.3 ⁇ M Suspended in iCOP growth medium containing SAG, 10 ng / mL PDGF-BB.
  • the cells were seeded in a 5 mL single-use bioreactor (Biott) at a cell density of 2 ⁇ 10 5 cells / mL and cultured with stirring in an incubator at 37 ° C. and 5% CO 2 at a stirring rate of 80 rpm. 70% medium was exchanged every other day.
  • iCOP was harvested from a single-use bioreactor, centrifuged, suspended in 1 mL of Accumax cell detachment solution (Merck), and allowed to stand for 10 minutes. The cells were suspended again until the cell mass collapsed, centrifuged, suspended in iCOP growth medium, and the number of cells was counted. The same operation was repeated every 5 days, and the growth curve up to the 3rd generation was obtained. As a result, the daily PD was 0.38 (Fig. 7).
  • the gene expression of iCOP markers PAX1, SOX9 and PDGFRA
  • the expression was retained even after 3 passages (Table 3).
  • chondrocyte genes were eventually expressed (Table 4). From the above, it was shown that iCOP can be expanded and cultured in a floating state.
  • Example 7 Identification of iCOP-specific markers
  • iCOP-specific markers prepared from iPS cells were analyzed by the next-generation sequencer (NGS) to identify iCOP-specific markers.
  • NGS next-generation sequencer
  • As iPS cells the 1231A3 strain purchased from iPS Academia Japan was used.
  • iPS cells were seeded in 4 wells of a 24-well plate (BD FALCON) coated with 0.5 ⁇ g / cm 2 iMatrix-511 (Nippi) in advance, and 10 ⁇ M Y-27632 was used. Incubated in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C. in StemFit® AK03N containing.
  • the medium was replaced with 500 ⁇ L of differentiation 3 medium containing RPMI1640, 20% StemFit® For Differentiation, 10 ⁇ M SB431542, 3 ⁇ M IWR-1, 0.3 ⁇ M PD0325901, 0.3 ⁇ M LDN 193189.
  • the cells were replaced with 500 ⁇ L of differentiated 4 medium containing RPMI1640, 20% StemFit® For Differentiation, 3 ⁇ M IWR-1, and 0.3 ⁇ M SAG.
  • the medium was exchanged with 4 differentiation media, and the number of viable cells of iCOP was measured using the cells on the 6th day as iCOP.
  • the iCOP at this point was designated as the 0th passage iCOP, and a cell suspension containing 1 ⁇ 10 6 cells of the acquired cells was collected in a 1.5 mL Eppendorf tube, and the supernatant was removed after centrifugation for NGS analysis. As a sample, it was cryopreserved in the form of pellets.
  • iCOP 3 ⁇ 10 5 cells of iCOP were sown in a 10 cm dish coated with 0.5 ⁇ g / cm 2 iMatrix-511 in advance, and DMEM / F12, 20% StemFit® For Differentiation, 250 ⁇ M L-Ascorbic Acid 2 Incubated in iCOP growth medium containing -phosphate, 10 ⁇ M SB431542, 100 ng / mL bFGF, 0.3 ⁇ M SAG at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • the medium When the medium is changed once every two days and 90 to 100% confluence is reached, the number of iCOP cells is counted, and the iCOP at this point is used as the first passage iCOP, and some of the acquired cells are passaged to 1 ⁇ 10 6 cells were cryopreserved in the form of pellets as a sample for NGS analysis.
  • iCOP frozen samples 0th, 1st, 3rd, 5th, 8th, and 10th passages were obtained. The obtained frozen sample was thawed, and RNA was extracted using a PureLink TM RNA Mini kit (Thermo Fischer Scientific).
  • RNA Integrity Number was measured using a bioanalyzer (Agilent RNA6000 Nano kit, Agilent).
  • the KAPA Stranded mRNA-Seq Kit KAPA Biosystems
  • KAPA Unique Dual-Indexed Adapter Kit KAPA Biosystems
  • a bioanalyzer (Agilent DNA1000 kit, Agilent) was used to check the quality of the prepared library, and Qubit® 2.0 Fluorometer (Thermo Fisher Scientific) and Qubit® dsDNA HS assay kit (registered trademark) were used to measure the concentration. Thermo Fisher Scientific) was used.
  • the prepared library was used for sequencing with the NextSeq 500 System (illumina).
  • FASTQ files were obtained from the BaseSpace® Onsite (illumina) system and trimmed at the 3'end with the Trimmomatic tool on Bio-Linux.
  • On the Jupyter notebook confirm the quality improvement by trimmomatic by FastQC, execute the RNA-seq pipeline consisting of mapping to the human genome, count of reads, and normalization, and use the output read count file.
  • the expression variation gene (DEG) was analyzed using the TCC package. As a result of the analysis, 110 genes extracted as iCOP-specific marker genes are shown below.
  • the gene group that is the cell surface antigen is shown below.
  • the present invention it is possible to expand and culture chondrocytes or bone progenitor cells, and if the progenitor cells are expanded and cultured in advance and stocked, the period for inducing differentiation into chondrocytes or osteoocytes can be significantly shortened.
  • the present invention can rapidly produce a sufficient amount of chondrocytes for use in the treatment of chondrocytes or bone diseases.

Abstract

本発明は、軟骨又は骨の前駆細胞を、TGF-βシグナル阻害剤及びFGFを含む培地中で培養する工程を含む、軟骨又は骨の前駆細胞の拡大培養方法、並びに該方法で得られた軟骨又は骨の前駆細胞を、軟骨細胞又は骨細胞へ分化誘導させる工程を含む、軟骨細胞又は骨細胞の製造方法を提供する。

Description

軟骨又は骨の前駆細胞の拡大培養方法
　本発明は、軟骨又は骨の前駆細胞を拡大培養する方法、及び該拡大培養のためのキットに関する。
　ヒトの軟骨は、先天的に欠損していたり、後天的に損傷あるいは欠損すると、通常は再生されない。主として関節軟骨の老化に起因する変形性膝関節症の有病者数は、日本には約2500万人いると推測されており、高齢化に伴い今後さらに増加することが見込まれる。このようなヒト軟骨疾患に対する従来の治療としては、自己の他部位から軟骨組織を採取し欠損部位に移植する方法があるが、採取部位や量が限定されてしまう。また、軟骨細胞は増殖性が低く、再生能力に乏しいため、生体由来の軟骨細胞を増殖することも困難である。
　そこで、軟骨細胞以外の細胞（例えば、多能性幹細胞）を利用して、生体外で軟骨細胞に分化させて生体内に戻す方法の開発が行われている。かかる方法としては、例えば、多能性幹細胞から軟骨細胞を分化誘導する方法が報告されている（例えば、非特許文献１、２、特許文献１など）。しかしながら、これらの方法は、多能性幹細胞から軟骨細胞へ分化させるのに少なくとも１２日程度の期間が必要であるし、また軟骨疾患又は骨疾患の治療に用いるのに十分な量の軟骨細胞を得ることができない。
国際公開第2016/141084号公報
Yamashita A., et al., Stem Cell Reports, 4(3): 404-418 (2015) Loh K.M., et al., Cell, 166(2): 451-467 (2016)
　従って、本発明の課題は、軟骨細胞等への分化日数が従来法よりも短くてすみ、かつ疾患の治療に用いるのに十分な量の軟骨細胞等を製造できる方法を提供することである。
　本発明者らは、上記課題を解決するために、サイトカイン又は転写因子の種類や培地に添加するタイミングなどを改良することで、多能性幹細胞などの出発細胞から軟骨細胞の分化効率を向上させる、との従来の発想を転換し、増殖能の高い軟骨細胞の前駆細胞を同定することができれば、該前駆細胞を増殖した上で軟骨細胞に分化誘導することで、誘導時間を短縮でき、しかも軟骨細胞を大量に得られるのではないか、との着想を得た。この着想を具体化するにあたり、人工多能性幹細胞から軟骨細胞に分化する過程の中間細胞として、無限に近い増殖能を有する軟骨又は骨の前駆細胞（本発明者らは、この細胞を「iCOP（iPS-derived chondro/osteogenic progenitor）」と命名した）が存在するとの仮定を行い、実際にiCOPを同定し、かつ該細胞の拡大培養法を確立することを試みた。本発明者らは、まず、該胚葉細胞を含む細胞集団に含まれる細胞のうち、増殖能を示し、かつ軟骨細胞へ短期間に分化しうる細胞はsclerotome（硬節細胞）であると仮定した。そこで、非特許文献１に記載の方法を改良し、人工多能性幹細胞から中胚葉細胞を経てsclerotomeへ分化誘導したところ、該細胞はPDGFRAもしくはSOX9など非特許文献１に記載のマーカーを高発現していることを見出した。その後、sclerotomeが増殖できる培養条件について鋭意検討を重ねた結果、TGF-βシグナル阻害剤及びFGFを含む培地中で培養することで、sclerotomeは細胞マーカーの発現を維持しつつ少なくとも5継代増殖が可能である（即ち、自己複製能を有する）ことを見出した。sclerotomeが自己複製能を有することは知られていなかったため、上記知見は驚くべきものであった。しかも、このように長期間拡大培養されたsclerotomeは、軟骨細胞への分化能を依然として有していた。したがって、sclerotomeは該iCOPであると結論づけた。本発明者らは、上記知見に基づきさらに研究を進めた結果、本発明を完成するに至った。
　即ち、本発明は以下に関する。
［１］　軟骨又は骨の前駆細胞を、TGF-βシグナル阻害剤及びFGFを含む培地中で培養する工程を含む、軟骨又は骨の前駆細胞の拡大培養方法。
［２］　前記軟骨又は骨の前駆細胞がPDGFRA、SOX9、若しくはPAX1を発現する細胞である、［１］に記載の方法。
［３］　前記培地中にL-アスコルビン酸又はその誘導体がさらに含まれる、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］　前記TGF-βシグナル阻害剤がSB431542である、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］　前記FGFがbFGFである、［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］　前記TGF-βシグナル阻害剤の培地中での濃度が1μM～50μMである、［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］　前記FGFの培地中での濃度が１ng/mL～500ng/mLである、［１］～［６］のいずれかに記載の方法。
［８］　前記軟骨又は骨の前駆細胞が多能性幹細胞に由来する細胞である、［１］～［７］のいずれかに記載の方法。
［９］　前記軟骨又は骨の前駆細胞が多能性幹細胞を浮遊培養することで得られる細胞である、［１］～［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］　拡大培養が浮遊培養により行われる、［１］～［９］のいずれかに記載の方法。
［１１］　基礎培地、TGF-βシグナル阻害剤及びFGFを含む、軟骨又は骨の前駆細胞の拡大培養用キット。
［１２］　L-アスコルビン酸又はその誘導体をさらに含む、［１１］に記載のキット。
［１３］　前記TGF-βシグナル阻害剤がSB431542である、［１１］又は［１２］に記載のキット。
［１４］　前記FGFがbFGFである、［１１］～［１３］のいずれかに記載のキット。
［１５］　［１］～［１０］のいずれかに記載の方法で得られた軟骨又は骨の前駆細胞を、軟骨細胞又は骨細胞へ分化誘導させる工程を含む、軟骨細胞又は骨細胞の製造方法。
［１６］　前記分化誘導工程が、軟骨又は骨の前駆細胞をBMPシグナル活性化剤及び／又はTGF-βシグナル活性化剤を含む培地で培養する工程を含む、［１５］に記載の方法。
［１７］　前記TGF-βシグナル活性化剤がTGF-β3である、［１５］又は［１６］に記載の方法。
［１８］　［１］～［１０］のいずれかに記載の方法で得られた軟骨又は骨の前駆細胞を、靭帯節細胞へ分化誘導させる工程を含む、靭帯節細胞の製造方法。
［１９］　［１８］に記載の方法で得られた靭帯節細胞を腱細胞又は靭帯細胞へ分化誘導させる工程を含む、腱細胞又は靭帯細胞の製造方法。
［２０］　［１５］～［１９］のいずれかに記載の方法で得られた細胞を含有してなる、細胞移植療法剤。
［２１］　以下の遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を検出又は測定する工程を含む、軟骨又は骨の前駆細胞を同定する方法。
A2M, ABCA9, ACAT2, ADAMTS9, ADGRF5, AGTR2, AMER1, AMOT, ANGPT1, ARHGAP5-AS1, ARHGEF26, ATP8A1, BCHE, BEGAIN, BOC, C3ORF52, CACNA1G, CELF2, CLSPN, COL25A1, COL26A1, CORO1A, CRISPLD1, CTTNBP2, CYB5B, DLGAP1, DNAJC12, DUSP9, EBF1, EBF2, EFEMP1, ESCO2, EYA1, FAM35A, FAM78A, FAR2, FGFBP2, FGFR4, FKBP4, FRZB, GCNT4, GNG11, HAAO, HMGCS1, HS3ST5, ID4, IGDCC3, IRF8, KCNA6, KCNB2, KITLG, LGR5, LHCGR, LHFP, LPPR5, LUM, MAPK8IP2, MECOM, MEF2C, MEOX2, METTL7A, NAB1, NCALD, NGF, NGFR, NKAIN2, NPR1, NR2F1, OLFML1, PCDH18, PCDH19, PCSK9, PDE4D, PDGFRA, PEG10, PLVAP, PRELP, PRRT4, RARRES2, RBMS3, RBPMS2, RSPO3, RUNX1T1, SAMD5, SCARA5, SKIDA1, SLC12A2, SLC27A3, SLC39A8, SLC7A2, SLC8A3, SLCO1C1, SOX8, SPRED2, STARD8, STOM, SYNPO, TBX18, TMC6, TNRC6C-AS1, TRIM2, TRIM9, TRIP13, TSPAN15, UBE2N, UHRF1, UNC5C, VIT, ZBTB46及びZNF488
［２２］　軟骨又は骨の前駆細胞を含む細胞集団から、以下の遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子を発現する細胞を単離する工程を含む、軟骨又は骨の前駆細胞の単離方法。
ABCA9, ATP8A1, BOC, KITLG, NKAIN2, ADGRF5, AGTR2, CACNA1G, C3ORF52, COL25A1, CYB5B, FAR2, FGFR4, GCNT4, HS3ST5, IGDCC3, LGR5, LHFP, LHCGR, NPR1, NGFR, PLVAP, PDGFRA, KCNA6, KCNB2, PCDH18, PCDH19, SCARA5, SLC12A2, SLC27A3, SLC39A8, SLC7A2, SLC8A3, SLCO1C1, STOM, TSPAN15, TMC6及びUNC5C
［２３］　以下の遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子にコードされるタンパク質の各々に対する抗体を含んでなる、軟骨又は骨の前駆細胞の単離用試薬。
ABCA9, ATP8A1, BOC, KITLG, NKAIN2, ADGRF5, AGTR2, CACNA1G, C3ORF52, COL25A1, CYB5B, FAR2, FGFR4, GCNT4, HS3ST5, IGDCC3, LGR5, LHFP, LHCGR, NPR1, NGFR, PLVAP, PDGFRA, KCNA6, KCNB2, PCDH18, PCDH19, SCARA5, SLC12A2, SLC27A3, SLC39A8, SLC7A2, SLC8A3, SLCO1C1, STOM, TSPAN15, TMC6及びUNC5C
　本発明によれば、上記のiCOPなどの軟骨又は骨の前駆細胞の拡大培養が可能となる。軟骨又は骨の前駆細胞から軟骨細胞又は骨細胞への分化誘導期間は、従来法のiPS細胞から軟骨細胞又は骨細胞への分化誘導期間の半分以下となるため、予めiCOPを拡大培養し、ストックしておけば、軟骨細胞又は骨細胞への分化誘導期間を大幅に短縮することが可能となる。また、軟骨又は骨の前駆細胞を拡大培養することで、拡大培養前に細胞集団内に残存し得る多能性幹細胞などの未分化細胞が占める割合は相対的に減少するし、また該多能性幹細胞は軟骨又は骨の前駆細胞などに分化してその数が減少すると考えられるため、細胞集団における腫瘍などの原因となる未分化細胞の残存リスクを顕著に低下させることができる。また、上記従来法で製造できる軟骨細胞数と比較して、軟骨細胞への分化過程の途中で軟骨又は骨の前駆細胞を拡大培養することで、軟骨細胞又は骨細胞を極めて多量に製造できるため、本発明により、軟骨疾患又は骨疾患の治療に用いるのに十分な量の軟骨細胞を迅速に製造することができる。
図１は、iPS細胞からiCOPを分化誘導し、iCOPが発現するSOX9の陽性率をフローサイトメーターにより測定した結果を示す。約9割の高効率でiPS細胞がiCOPへと分化されることが示された。 図２は、iCOPを7日ごとに5継代増殖させた際の増殖曲線を示す。増殖曲線から、一日当たりのpopulation doubling (PD)は0.46であることが示された。 図３は、凍結保存によるiCOPの細胞増殖能への影響を検証した結果を示す。凍結保存によっては、一日当たりのPDは減少しないことが示された。 図４は、凍結保存したiCOP又は凍結保存をしていないiCOPにおける、iCOPマーカー遺伝子の相対発現量（mRNA量）を検証した結果を示す。凍結保存によっては、iCOPマーカー遺伝子の相対発現量は減少しないことが示された。 図５は、iCOPから骨細胞（Osteocyte）へ分化誘導し、骨細胞マーカー遺伝子の相対発現量（mRNA量）を評価した結果を示す。iCOPは骨細胞への分化能を保持していることが示された。 図６は、iCOPから靱帯節細胞（syndetome）へ分化誘導し、靱帯節マーカー遺伝子の相対発現量（mRNA量）を評価した結果を示す。iCOPは靭帯細胞への分化能を保持していることが示された。 図７は、浮遊培養により、iCOPを5日ごとに3継代増殖させた際の増殖曲線を示す。増殖曲線から、一日当たりのPDは0.38であることが示された。
１．軟骨又は骨の前駆細胞の拡大培養方法
　本発明は、軟骨又は骨の前駆細胞を拡大培養する方法（以下「本発明の培養方法」と称することがある）を提供する。本発明の培養方法は、軟骨又は骨の前駆細胞を、TGF-βシグナル阻害剤及びFGFを含む培地中で培養する工程を含む。
　本明細書において、「拡大培養」とは、細胞集団に含まれる軟骨又は骨の前駆細胞を増殖し、細胞数を増加させることを目的とした培養を意味する。細胞数の増加は、細胞の増殖による増数が死滅による減数を超えることによって達成されるものであればよく、細胞集団の全ての細胞が増殖することは要さない。
　本明細書において、「軟骨又は骨の前駆細胞」とは、軟骨細胞及び／又は骨細胞への分化能を有する細胞を意味する。好ましくは、軟骨又は骨の前駆細胞はPDGFRA、SOX9、若しくはPAX1を発現し、より好ましくはPDGFRA、PAX1、及びSOX9を発現する。典型的には、「軟骨又は骨の前駆細胞」は、PDGFRA、SOX9、及びPAX1の内の少なくとも１種を発現する硬節細胞（sclerotome）である。下述する軟骨細胞及び／又は骨細胞への分化誘導方法の少なくともいずれかにより、軟骨細胞及び／又は骨細胞へ分化する場合に、細胞は軟骨細胞及び／又は骨細胞への分化能を有すると評価することができる。また、細胞のPDGFRA、PAX1及びSOX9の発現は、real-time PCRやフローサイトメトリーの少なくともいずれかにより確認することができる。また、軟骨又は骨の前駆細胞は、軟骨又は骨以外の細胞、例えば靭帯節細胞（syndetome）、への分化誘導能を有していてもよい。本明細書において、「発現」とは、特にことわらない限り、少なくとも「機能的なタンパク質の産生」を含む意味で用いられるが、好ましくは、さらに「mRNAの産生」をも含む意味で用いられる。
　また、「軟骨又は骨の前駆細胞」は、以下のマーカー遺伝子のうちの少なくとも１つ、好ましくは２つ以上（例：３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０つ又はそれ以上）の遺伝子を発現するものであってもよいが、少なくともPDGFRA遺伝子を発現するものが好ましい。
A2M, ABCA9, ACAT2, ADAMTS9, ADGRF5, AGTR2, AMER1, AMOT, ANGPT1, ARHGAP5-AS1, ARHGEF26, ATP8A1, BCHE, BEGAIN, BOC, C3ORF52, CACNA1G, CELF2, CLSPN, COL25A1, COL26A1, CORO1A, CRISPLD1, CTTNBP2, CYB5B, DLGAP1, DNAJC12, DUSP9, EBF1, EBF2, EFEMP1, ESCO2, EYA1, FAM35A, FAM78A, FAR2, FGFBP2, FGFR4, FKBP4, FRZB, GCNT4, GNG11, HAAO, HMGCS1, HS3ST5, ID4, IGDCC3, IRF8, KCNA6, KCNB2, KITLG, LGR5, LHCGR, LHFP, LPPR5, LUM, MAPK8IP2, MECOM, MEF2C, MEOX2, METTL7A, NAB1, NCALD, NGF, NGFR, NKAIN2, NPR1, NR2F1, OLFML1, PCDH18, PCDH19, PCSK9, PDE4D, PDGFRA, PEG10, PLVAP, PRELP, PRRT4, RARRES2, RBMS3, RBPMS2, RSPO3, RUNX1T1, SAMD5, SCARA5, SKIDA1, SLC12A2, SLC27A3, SLC39A8, SLC7A2, SLC8A3, SLCO1C1, SOX8, SPRED2, STARD8, STOM, SYNPO, TBX18, TMC6, TNRC6C-AS1, TRIM2, TRIM9, TRIP13, TSPAN15, UBE2N, UHRF1, UNC5C, VIT, ZBTB46及びZNF488。
　本発明に用いるTGF-βシグナル阻害剤としては、TGF-βの受容体への結合からSMADへと続くシグナル伝達を阻害する物質である限り特に限定されないが、例えば、TGF-βの受容体であるALKファミリーへの結合を阻害する物質、ALKファミリーによるSMADのリン酸化を阻害する物質などが挙げられる。本発明において、TGF-βシグナル阻害剤は、例えば、Lefty-1（NCBI Accession Noとして、マウス：NM_010094、ヒト：NM_020997が例示される）、SB431542、SB202190(以上、R.K.Lindemann et al., Mol. Cancer, 2003, 2:20)、SB505124 (GlaxoSmithKline)、NPC30345、SD093、SD908、SD208(Scios)、LY2109761、LY364947、LY580276 (Lilly Research Laboratories)、A-83-01(WO 2009146408)及びこれらの誘導体などが例示される。中でも、SB431542が好ましい。
　培地中におけるTGF-βシグナル阻害剤の濃度は、特に限定されないが、例えばSB431542を用いる場合には、1μM～50μMが好ましく、例えば、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、16μM、17μM、18μM、19μM、20μM、25μM、30μM、35μM、40μM、45μM、50μMであるがこれらに限定されない。より好ましくは、2μM～20μM、特に好ましくは5～10μMである。TGF-βシグナル阻害剤としてSB431542以外のものを用いる場合にも、技術常識に基づき、適宜濃度を設定することができる。
　本発明に用いるFGFとしては、細胞の増殖を促進する限り特に限定されないが、例えば、FGF-1、bFGF（FGF-2）、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6、FGF-7、FGF-8（例：FGF-8b）、FGＦ-9、FGF-10、FGF-11、FGF-12、FGF-13、FGF-14、FGF-15、FGF-16、FGF-17、FGF-18、FGF-19、FGF-20、FGF-21、FGF-22、FGF-23などが挙げられる。中でも、bFGFが好ましい。また、上記FGFは任意の動物（例：マウス、ラット、ハムスター、モルモットなどのげっ歯類、ヒト、サル、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類）由来であってよいが、培養される細胞の種類に応じて適宜選択することができる。ヒト由来の細胞を培養する場合には、ヒト由来のFGFを用いることが好ましい。具体的なFGFとしては、例えば、ヒトbFGF（例：Endocrine Rev., 8, 95, 1987）、ウシbFGF（例：Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6963, 1984）、マウスbFGF（例：Dev. Biol., 138, 454-463, 1990）、ラットbFGF（例：Biochem. Biophys. Res. Commun., 157, 256-263, 1988）などが挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明に用いるFGFは、天然型だけでなく、その改変型であってもよい。例えば、FGFの改変体として、FGF1の特定の領域（ヒトFGF1タンパク質のアミノ酸配列の41位～83位の部分配列、又は62～83位の部分配列）を、該領域に対応するbFGFの領域に置換したキメラタンパク質も、bFGFと同様の細胞増殖活性を有することが知られている（特開2012-143234、特開2014-100141）ため、上記bFGFの部分領域を含むFGFの改変体も、本発明に好適に用いることができる。また、本発明に用いるFGFは、自体公知の方法により作製することができるし、あるいは市販品を購入することなどにより入手することができる。さらに、FGFを含む培地は、可溶性のFGFを培地に添加して作製することもでき、あるいは、該FGFが表面に固定されたビーズ等の担体（例：StemBeads FGF2等）を培地に添加することにより作製することもできる。
　培地中におけるFGFの濃度は、特に限定されないが、例えばbFGFを用いる場合には、１ng/mL～500ng/mLが好ましく、例えば、1 ng/mL、2 ng/mL、3 ng/mL、4 ng/mL、5 ng/mL、6 ng/mL、7 ng/mL、8 ng/mL、9 ng/mL、10 ng/mL、11 ng/mL、12 ng/mL、13 ng/mL、14 ng/mL、15 ng/mL、16 ng/mL、17 ng/mL、18 ng/mL、19 ng/mL、20 ng/mL、25 ng/mL、30 ng/mL、35 ng/mL、40 ng/mL、45 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mLであるがこれらに限定されない。より好ましくは、2 ng/mL～100 ng/mL、特に好ましくは10 ng/mLである。FGFとしてbFGF以外のものを用いる場合にも、技術常識に基づき、適宜濃度を設定することができる。
　本発明に用いる基礎培地としては、例えば、DMEM、EMEM、IMDM（Iscove's Modified Dulbecco's Medium）、GMEM（Glasgow's MEM）、RPMI-1640、α-MEM、Ham's Medium F-12、Ham's Medium F-10、Ham's Medium F12K、Medium 199、ATCC-CRCM30、DM-160、DM-201、BME、Fischer、McCoy's 5A、Leibovitz's L-15、RITC80-7、MCDB105、MCDB107、MCDB131、MCDB153、MCDB201、NCTC109、NCTC135、Waymouth's MB752/1、CMRL-1066、Williams' medium E、Brinster's BMOC-3 Medium、E8 medium（Nature Methods, 2011, 8, 424-429）、ReproFF2培地（リプロセル社）、及びこれらの混合培地（例：DMEM/F-12混合培地等）などが挙げられる。
　本発明に用いる培地には、自体公知の添加物が含まれていてもよい。かかる添加物としては、例えば、成長因子（例：PDGF、インスリン等）、鉄源（例：トランスフェリン等）、ヘッジホッグシグナル活性化剤、ポリアミン類（例：プトレシン等）、ミネラル（例：セレン酸ナトリウム等）、糖類（例：グルコース等）、有機酸（例：ピルビン酸、乳酸等）、血清タンパク質（例：アルブミン等）、アミノ酸（例：Ｌ-グルタミン等）、還元剤（例：２-メルカプトエタノール等）、ビタミン類（例：ビタミンC類、ｄ-ビオチン等）、ステロイド（例：β-エストラジオール、プロゲステロン等）、抗生物質（例：ストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシン等）、緩衝剤（例：ＨＥＰＥＳ等）等が挙げられる。添加物は、それぞれ自体公知の濃度範囲内で含まれることが好ましい。
　本明細書において、ビタミンC類とは、L-アスコルビン酸及びその誘導体を意味し、L-アスコルビン酸誘導体とは、生体内で酵素反応によりビタミンCとなるものを意味する。本発明に用いるL-アスコルビン酸の誘導体として、リン酸ビタミンC、アスコルビン酸グルコシド、アスコルビルエチル、ビタミンCエステル、テトラヘキシルデカン酸アスコビル、ステアリン酸アスコビル、アスコルビン酸-2-リン酸-6パルミチン酸などが例示される。好ましくは、リン酸ビタミンC（例：アスコルビン酸-2-リン酸（Ascorbic acid 2-phosphate））であり、例えば、リン酸-L-アスコルビン酸Na、リン酸-L-アスコルビン酸Mgなどのリン酸-L-アスコルビン酸塩が挙げられる。培地中におけるビタミンC類の濃度は、特に限定されないが、アスコルビン酸-2-リン酸を用いる場合の培地中の濃度は、典型的には20 μM～2 mM（例：50 μM、100 μM、150 μM、200 μM、250 μM、300 μM、500 μM、1 mM等）である。ビタミンC類としてアスコルビン酸-2-リン酸以外のものを用いる場合にも、技術常識に基づき、適宜濃度を設定することができる。
　本発明に用いるPDGFとしては、PDGF受容体へ結合するPDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PDGF-CC、PDGF-DDのいずれでもよいが、好ましくはPDGF-BBである。培地中におけるPDGFの濃度は、特に限定されないが、PDGF-BBを用いる場合の培地中の濃度は、典型的には10ng/mL～1μg/mL（例：50 ng/mL、100 ng/mL、150 ng/mL、300 ng/mL等）である。PDGFとしてPDGF-BB以外のものを用いる場合にも、技術常識に基づき、適宜濃度を設定することができる。
　本発明に用いるヘッジホッグシグナル活性化剤としては、12回膜貫通型のPatched（Ptc）と7回膜貫通型の１つSmoothened（Smo）を介するシグナルを活性化する物質である限り特に限定されないが、例えば、ヘッジホッグタンパク質(例：Hh、Shh、Ihh、Dhh等)、Smoothenedアゴニスト（例：SAG(Hh-Ag 1.3)、SAG21k(3-chloro-4,7-difluoro-N-(4-methoxy-3-(pyridin-4-yl)benzyl)-N-((1r,4r)-4-(methylamino)cyclohexyl)benzo[b]thiophene-2-carboxamide)、Hh-Ag 1.1、Hh-Ag 1.5、purmorphamineなどが挙げられるが、Smoothenedアゴニストが好ましく、中でもSAGがより好ましい。培地中におけるヘッジホッグシグナル活性化剤の濃度は、特に限定されないが、SAGを用いる場合の培地中の濃度は、典型的には30 nM～3 μM（例：100 nM、200 nM、300 nM、400 nM、500 nM、1 μM等）である。ヘッジホッグシグナル活性化剤としてSAG以外のものを用いる場合にも、技術常識に基づき、適宜濃度を設定することができる。
　本発明に用いる培地には、血清が含まれていてもよい。血清としては、動物由来の血清であれば特に限定されないが、好ましくは哺乳動物由来の血清（例：ウシ胎仔血清、ヒト血清等）である。血清の濃度は、自体公知の濃度範囲内であればよい。本発明の培養方法により増殖させた細胞や、該細胞から分化誘導した軟骨細胞等を医療目的で使用する場合には、異種由来成分は血液媒介病原菌の感染源や異種抗原となる可能性があるため、血清を含まないことが好ましい。血清を含まない場合、血清の代替添加物（例えばKnockout Serum Replacement（KSR）（Invitrogen）、Chemically-defined Lipid concentrated（Gibco）、B-27 Supplement(Gibco)等）を用いてもよい。
　本発明に用いる培養器としては、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトルなどが挙げられる。
　培養器は、接着培養に用いられる細胞接着性培養器であってもよく、浮遊培養に用いられる細胞非接着性培養器であってもよく、目的に応じて適宜選択することができる。細胞接着性の培養器は、培養器の表面の細胞との接着性を向上させる目的で、細胞外マトリックス（ECM、細胞外基質ともいう）等の任意の細胞支持用基質でコーティングされたものであってもよい。細胞支持用基質は、細胞の接着を目的とする任意の物質であり得る。本発明の培養方法において、フィーダー細胞を使用しない場合には、細胞外基質若しくはその活性断片、又はそれらの機能をミミックする人工物を使用して培養を行うことが好ましい。細胞外基質は、培養器の表面と細胞との接着を改善する目的で細胞の培養に通常使用されるものであれば特に限定されず、例えば、ラミニン（ラミニン５１１、ラミニン３３２等）、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン、エラスチン、アドへサミン等の公知のものを使用することができる。また細胞外基質の活性断片は、該細胞外基質と同等の細胞接着活性を有するその断片であればよく、これらも公知のものを使用することができる。例えば、特開2011-78370号公報に開示されている、ラミニン５１１のＥ８フラグメント（例：iMatrix-511（ニッピ）等）、ラミニン３３２のＥ８フラグメントなどが挙げられる。細胞外基質及びその活性断片は、市販品であってもよく、例えば、ライフテクノロジーズ、BDファルコン、バイオラミナ、ニッピ等から入手可能である。これらの細胞外基質及びその活性断片は、２種類以上を組み合わせて使用してもよい。また基底膜を過剰産生するマウスEHS肉腫から抽出、精製した、タンパク質や多糖類を含む複雑な基底膜成分の混合物であるマトリゲル（商品名）やGeltrex Matrix（商品名）を使用してもよい。
　細胞外基質及びその活性断片は、適当な溶液中に懸濁し、細胞を培養するのに適した容器に塗布すればよい。細胞外基質の機能をミミックする人工物も、細胞の培養に通常使用されるものであれば特に限定されず、例えば、コーニング社のシンセマックス（登録商標）やウルトラウェブ（登録商標）、シグマアルドリッチ社のHy-STEMシリーズ、ポリリジン、ポリオルニチン等の公知のものを使用することができる。本発明において使用される細胞外基質若しくはその活性断片、又はそれらの機能をミミックする人工物は、好ましくはマトリゲル、又はラミニン５１１若しくはラミニン５１１の活性断片であり、より好ましくはラミニン５１１の活性断片（即ち、ラミニン５１１のＥ８フラグメント）である。
　本発明の培養方法によれば、軟骨又は骨の前駆細胞を際限なく増殖させ得る（少なくとも５週間以上は増殖が可能である）ため、培養期間は特に制限はなく、所望の細胞数となる期間を適宜選択することができる。培養温度は、特に限定されないが、30～40℃、好ましくは37℃であり、CO2含有空気の存在下で培養が行われ、CO2濃度は、好ましくは2～5％である。
　本発明に用いる軟骨又は骨の前駆細胞は、例えば、PDGFRAを指標としたセルソーティングなどにより生体試料から単離した細胞を用いてもよいし、多能性幹細胞や間葉系幹細胞などの幹細胞から分化誘導した細胞を用いてもよいが、好ましくは、多能性幹細胞由来の細胞である。
　本明細書において、「多能性幹細胞（pluripotent stem cell）」とは、胚性幹細胞（ES細胞）及びこれと同様の分化多能性、即ち、生体の様々な組織（内胚葉、中胚葉、外胚葉の全て）に分化する能力を潜在的に有する細胞を意味する。本発明に用いる多能性幹細胞としては、例えば、胚性幹細胞（embryonic stem cell：ES細胞）、人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell：iPS細胞）、多能性生殖幹細胞、胚性生殖幹細胞（EG細胞）などが挙げられ、好ましくはES細胞又はiPS細胞であり、中でもiPS細胞が好ましい。上記多能性幹細胞がES細胞又はヒト胚に由来する任意の細胞である場合、その細胞は胚を破壊して作製された細胞であっても、胚を破壊することなく作製された細胞であってもよいが、好ましくは、胚を破壊することなく作製された細胞である。
　本明細書において、「ES細胞」とは、ヒトやマウスなどの哺乳動物の初期胚（例えば胚盤胞）の内部細胞塊から樹立された、多能性幹細胞を意味する。ES細胞は、マウスで1981年に発見され（M.J. Evans and M.H. Kaufman（1981）, Nature 292:154-156）、その後、ヒト、サルなどの霊長類でもES細胞株が樹立された（J.A. Thomson et al.（1998）, Science 282:1145-1147; J.A. Thomson et al.（1995）, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:7844-7848; J.A. Thomson et al.（1996）, Biol. Reprod., 55:254-259; J.A. Thomson and V.S. Marshall（1998）, Curr. Top. Dev. Biol., 38:133-165）。
　本明細書において、「人工多能性幹細胞」とは、体細胞から誘導された多能性幹細胞であり、体細胞を初期化することにより、胚性幹細胞に似た多能性を人工的に持たせた細胞を意味する。例えば、線維芽細胞等の分化した細胞をOct3/4、Sox2、Klf4、Myc等の遺伝子の発現により初期化して樹立した多分化能を有するiPS細胞（induced pluripotent stem cell）等を挙げることができる。2006年、山中らによりマウス線維芽細胞から人工多能性幹細胞が樹立された（Cell, 2006, 126(4), p663-676）。2007年にはヒト線維芽細胞から、胚性幹細胞と同様に多分化能を有する人工多能性幹細胞が樹立された（Cell, 2007, 131(5),p861-872; Science, 2007, 318(5858), p1917-1920; Nat Biotechnol., 2008, 26(1), p101-106）。
　多能性幹細胞の由来としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモットなどのげっ歯類由来の細胞、及びヒト、サル、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類由来の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくはヒト由来の細胞である。
　本発明に用いる多能性幹細胞は、あらかじめ樹立され、ストックされた細胞でもよく、又は新たに樹立された細胞でもよい。従って、本発明の培養方法に先立って、多能性幹細胞を樹立する工程を行ってもよい。多能性幹細胞を樹立する工程としては、多能性幹細胞が人工多能性幹細胞の場合には、体細胞に特定の初期化因子を導入する工程を含む限り特に限定されない。例えば、体細胞を採取し、Oct3/4、Sox2、Klf4、Myc等の初期化因子を導入して人工的に発現させた後、多能性を獲得した細胞を選択して拡大培養する工程、レトロウイルスベクター又はセンダイウイルスベクターを用いて初期化因子（Oct3/4、Sox2、Klf4、及びc-Myc）をヒト末梢血リンパ球に導入し培養する工程（Nishimura, T. et al. Cell Stem Cell 2013, 12, 114-126）等を挙げることができる。
　本発明に用いる人工多能性幹細胞の由来となる体細胞は特に限定されない。体細胞としては、例えば、末梢血中のリンパ球、皮膚等の線維芽細胞、皮膚細胞、視覚細胞、脳細胞、有毛細胞、口腔粘膜、肺細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞、腎細胞、神経幹細胞、造血幹細胞、智歯などに由来する間葉系幹細胞、組織幹細胞、組織前駆細胞、血液細胞（例、末梢血単核球細胞（T細胞及び非T細胞を含む）、臍帯血細胞等）、上皮細胞、内皮細胞（例、血管内皮細胞）、筋肉細胞等が挙げられるが、これに限定されるものではない。
　初期化因子に含まれる遺伝子としては、例えば、Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3又はGlis1等が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。初期化因子の組み合わせとしては、WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/050626、WO 2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO 2010/111409、WO 2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395、WO2010/147612、Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 795-797、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 2: 525-528、Eminli S, et al. (2008), Stem Cells. 26:2467-2474、Huangfu D, et al. (2008), Nat Biotechnol. 26:1269-1275、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3, 568-574、Zhao Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3:475-479、Marson A, (2008), Cell Stem Cell, 3, 132-135、Feng B, et al. (2009), Nat Cell Biol. 11:197-203、Judson R.L. et al., (2009), Nat. Biotech., 27:459-461、Lyssiotis CA, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:8912-8917、Kim JB, et al. (2009), Nature. 461:649-643、Ichida JK, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:491-503、Heng JC, et al. (2010), Cell Stem Cell. 6:167-74、Han J, et al. (2010), Nature. 463:1096-100、Mali P, et al. (2010), Stem Cells. 28:713-720、Maekawa M, et al. (2011), Nature. 474:225-229に記載の組み合わせが例示される。
　本明細書において、「間葉系幹細胞」とは、骨髄や骨膜由来、末梢血由来、臍帯血、又は脂肪組織由来であり、かつ間充織組織系の組織（脂肪組織、軟骨組織、骨組織など）に分化可能な幹細胞を意味する。かかる間葉系幹細胞としては、生体組織からの細胞の採取が容易であり、採取した後の培養方法が確立されている点から、骨髄間葉系幹細胞が好ましく、また、生体から余剰組織として採取することが容易であり、採取する際の侵襲性が低いという点から、脂肪組織由来間葉系幹細胞が好ましい。
　多能性幹細胞や間葉系幹細胞などの幹細胞から、軟骨又は骨の前駆細胞への分化誘導方法は、自体公知の方法に従い適宜行うことができる。例えば、多能性幹細胞を軟骨又は骨の前駆細胞に分化誘導する方法として、特許文献１、非特許文献１、２、特開2005-511083号公報などに記載された方法により、多能性幹細胞から軟骨細胞へ分化させる過程の途中（例えば、分化誘導後４～８日目）の細胞集団を、必要に応じてPDGFRA等を発現する細胞を選別して、用いることができる。また、間葉系幹細胞から軟骨又は骨の前駆細胞への分化誘導方法は、例えば、特開2004-254655号公報に記載の方法などを適宜参酌することができる。
　より具体的には、例えば、(i)多能性幹細胞をWntシグナル活性化剤、BMP阻害剤、FGF及び／又はTGF-βシグナル活性化剤を含む培地で細胞を１～２日間程度（好ましくは１日間）培養し、(ii)TGF-βシグナル阻害剤、Wntシグナル活性化剤、BMP阻害剤及び／又はFGFを含む培地で細胞を１～２日間程度（好ましくは１日間）培養し、(iii) TGF-βシグナル阻害剤、BMP阻害剤、Wntシグナル阻害剤及び／又はMAPK/ERKキナーゼ（MEK）阻害剤を含む培地で細胞を１～２日間程度（好ましくは１日間）培養し、(iv) Wntシグナル阻害剤及び／又はヘッジホッグシグナル活性化剤を含む培地で細胞を1～５日間程度（好ましくは３日間）培養することで、軟骨又は骨の前駆細胞へと分化誘導することができる。
　上記Wntシグナル活性化剤としては、例えば、CHIR99021 (6-[[2-[[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(5-methyl-1H-imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethyl]amino]-3-pyridinecarbonitrile)、WNTタンパク質(例： Wnt-1、Wnt-2、Wnt-2b、Wnt-3a、Wnt-4、Wnt-5a、Wnt-5b、Wnt-6、Wnt-7a、Wnt-7a/b、Wnt-7b、Wnt-8a、Wnt-8b、Wnt-9a、Wnt-9b、Wnt-10a、Wnt-10b、Wnt-11、Wnt-16b等)、RSPOタンパク質(例：RSP02)、塩化リチウム、TDZD8 (4-Benzyl-2-methyl-1,2,4-thiadiazolidine-3,5-dione)、BIO-acetoxime ((2'Z,3'E)-6-Bromoindirubin-3'-acetoxime)、A1070722 (1-(7-Methoxyquinolin-4-yl)-3-[6-(trifluoromethyl)pyridin-2-yl]urea)、HLY78 (4-ethyl-5-methyl-5,6-dihydro-[1,3]dioxolo[4,5-j]phenanthridine), CID 11210285 hydrochloride (2-Amino-4-(3,4- (methylenedioxy)benzylamino)-6-(3-methoxyphenyl)pyrimidine hydrochloride)、WAY-316606、（ヘテロ）アリールピリミジン、IQ-1、QS-11、SB-216763、DCAなどが挙げられるが、好ましくはCHIR99021である。CHIR99021を用いる場合には、培地中でのその濃度は、典型的には0.5μM～100μM（例：5μM、10μM等）である。
　上記BMP阻害剤としては、例えば、NOGGIN、CHORDIN、LDN193189(4-[6-(4-Piperazin-1-yl-phenyl)-pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl]-quinoline hydrochloride)、DMH1(4-[6-[4-(1-methylethoxy)phenyl]pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl]-quinoline)、Dorsomorphin(6-[4-[2-(1-piperidinyl)ethoxy]phenyl]-3-(4-pyridinyl)-pyrazolo[1,5-a]pyrimidine dihydrochloride)、K02288(3-[(6-Amino-5-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-3-pyridinyl]phenol)、ML347(5-[6-(4-Methoxyphenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl]quinoline)、DMH-1などが挙げられるが、好ましくはLDN193189である。LDN193189を用いる場合には、培地中でのその濃度は、典型的には0.03μM～3μM（例：0.3μM等）である。
　上記FGFとしては、例えば、上述の本発明の培養方法で用いられるものと同一のものが挙げられるが、好ましくはbFGFである。bFGFを用いる場合には、培地中でのその濃度は、典型的には10 ng/mL～1000 ng/mL（例：100 ng/mL等）である。
　上記TGF-βシグナル活性化剤としては、例えば、TGF-β(例：TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3)、アクチビンA、IDE1(1-[2-[(2-Carboxyphenyl)methylene]hydrazide]heptanoic acid)、IDE2（1-(2-cyclopentylidenehydrazide)-heptanedioic acid）、Nodalなどが挙げられるが、好ましくはアクチビンAである。アクチビンAを用いる場合には、培地中でのその濃度は、典型的には3 ng/mL～300 ng/mL（例：30 ng/mL等）である。
　上記TGF-βシグナル阻害剤としては、例えば、上記１．で列挙したものと同一のものが挙げられるが、好ましくはSB431542である。SB431542を用いる場合には、培地中でのその濃度は、典型的には1 μM～100 μM（例：10μM等）である。
　上記Wntシグナル阻害剤としては、例えば、C59(4-(2-methyl-4-pyridinyl)-N-[4-(3-pyridinyl)phenyl]benzeneacetamide)、DKK1、IWP-2(N-(6-methyl-2-benzothiazolyl)-2-[(3,4,6,7-tetrahydro-4-oxo-3-phenylthieno[3,2-d]pyrimidin-2-yl)thio]-acetamide)、Ant1 .4Br、 Ant1 .4CI、ニクロサミド、アピクラレン、バフィロマイシン、XAV939(3,5,7,8-tetrahydro-2-[4-(trifluoromethyl)phenyl]-4H-thiopyrano[4,3-d]pyrimidin-4-one)、IWR-1(4-(1,3,3a,4,7,7a-hexahydro-1,3-dioxo-4,7-methano-2H-isoindol-2-yl)-N-8-quinolinyl-benzamide)、NSC668036(N-[(1,1-Dimethylethoxy)carbonyl]-L-alanyl-(2S)-2-hydroxy-3-methylbutanoyl-L-Alanine-(1S)-1-carboxy-2-methylpropyl ester hydrate)、2,4-diamino-quinazoline、クェルセチン、ICG-001 ((6S,9aS)-hexahydro-6-[(4-hydroxyphenyl)methyl]-8-(1-naphthalenylmethyl)-4,7-dioxo-N-(phenylmethyl)-2H-pyrazino[1,2-a]pyrimidine-1(6H)-carboxamide)、PKF115-584、BML-284(2-amino-4-[3,4-(methylenedioxy)benzylamino]-6-(3-methoxyphenyl)pyrimidine)、FH-535、iCRT-14、JW-55、JW-67などが挙げられるが、好ましくはIWR-1である。IWR-1を用いる場合には、培地中でのその濃度は、典型的には0.3μM～30μM（例：3μM等）である。
　上記MEK阻害剤としては、例えば、PD184352(2-(2-chloro-4-iodophenylamino)-N-cyclopropylmethoxy-3,4-difluorobenzamide)、PD98059(2-(2-amino-3-methoxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-one)、U0126、SL327、PD0325901(N-[(2R)-2,3-Dihydroxypropoxy]-3,4-difluoro-2-[(2-fluoro-4-iodophenyl)amino]-benzamide)、トラメチニブ、コビメチニブ、ビニメチニブなどが挙げられるが、好ましくはPD0325901である。PD0325901を用いる場合には、培地中でのその濃度は、典型的には0.03μM～3μM（例：0.3μM等）である。
　上記ヘッジホッグシグナル活性化剤としては、例えば、ヘッジホッグタンパク質(例：Hh、Shh、Ihh、Dhh等)、Smoothenedアゴニスト（例：SAG(Hh-Ag 1.3)、SAG21k(3-chloro-4,7-difluoro-N-(4-methoxy-3-(pyridin-4-yl)benzyl)-N-((1r,4r)-4-(methylamino)cyclohexyl)benzo[b]thiophene-2-carboxamide)、Hh-Ag 1.1、Hh-Ag 1.5、purmorphamineなどが挙げられるが、Smoothenedアゴニストが好ましく、中でもSAGがより好ましい。SAGを用いる場合には、培地中でのその濃度は、典型的には0.03μM～3μM（例：0.3μM等）である。
　好ましい実施態様において、上記工程（i）で用いる培地には、CHIR99021、LDN193189、bFGF及びアクチビンAが含まれ、上記工程(ii)で用いる培地には、SB431542、CHIR99021、LDN193189及びbFGFが含まれ、上記工程(iii)で用いる場合には、SB431542、LDN193189、IWR-1及びPD0325901が含まれ、上記工程(iv)で用いる培地には、IWR-1及びSAGが含まれる。
　このようにして分化誘導した軟骨又は骨の前駆細胞は、そのまま本発明の培養方法に用いてもよく、あるいは凍結保存（冷凍保存ともいう）しておき、使用前に解凍してから本発明の培養方法に用いてもよい。また、凍結保存を行う前に、分化誘導した軟骨又は骨の前駆細胞を拡大培養してもよい。従って、本発明の別の態様において、本発明の培養方法により得られた軟骨又は骨の前駆細胞を凍結保存する工程を含む、該細胞の凍結保存方法、あるいは該方法により作製された凍結ストックの製造方法が提供される。細胞の凍結操作は、細胞を浸漬させた培養液や生理緩衝液などを凍結保存液として用い、これに凍結保護剤を添加したり、培養液を、凍結保護剤を含む凍結保存液と置換するなどの処理を施したうえで行ってもよい。培養液を凍結保存液に置換する場合、培養液を実質的に全て除去してから凍結保存液を添加しても、培養液を一部残したまま凍結保存液を添加してもよい。凍結保存液は、市販のものを用いてもよく、例えば、STEM-CELLBANKER（登録商標）（ZENOAQ）が挙げられる。細胞の解凍は、公知の任意の細胞解凍手法により行うことができ、例えば、凍結保存された細胞を、ウォーターバス、インキュベーター、恒温器などを用いて、凍結温度より高い温度の固形、液状若しくはガス状の媒体（例：水、培養液）と接触させることにより達成される。
　幹細胞から軟骨又は骨の前駆細胞への分化誘導に用いる基礎培地としては、特に制限されないが、上述した本発明の培養方法で用いる基礎培地と同一のものが挙げられる。また、培地には添加物、血清及び／又は血清代替物が含まれていてもよく、例えば、上述した本発明の培養方法で用いることができる添加物、血清、血清代替物と同一のものが挙げられる。また、上記分化誘導に用いる培養器としては、特に制限されないが、上述した本発明の培養方法で用いる培養器と同一のものが挙げられる。培養器は、細胞接着性であっても細胞非接着性であってもよく、目的に応じて適宜選ばれる。細胞接着性の培養器は、培養器の表面の細胞との接着性を向上させる目的で、細胞外マトリックス（ECM、細胞外基質ともいう）等の任意の細胞支持用基質でコーティングされたものであってもよく、かかる細胞支持用基質としては、上述した本発明の培養方法で用いることができる細胞支持用基質と同一のものが挙げられる。
　細胞の培養方法（本発明の培養方法を含む）は、接着培養であっても浮遊培養であってもよい。本明細書において、「浮遊培養」とは、目的の細胞や細胞塊を培養器の底面に接着させずに培養することを意味し、細胞や細胞塊が底面に触れていても、培養液を軽く揺らすと細胞や細胞塊が培養液中に浮かんでくるような状態で培養することも、浮遊培養に包含される。浮遊培養は、静置培養であってもよいが、機械的な制御下のもと閉鎖環境下で細胞播種、培地交換、細胞画像取得、培養細胞回収を自動で実行し、pH、温度、酸素濃度などを制御しながら、高密度での培養が可能なバイオリアクター（例：シングルユースバイオリアクター等）や自動培養装置によって行うこともできる。これらの装置を用いて培養の途中に新しい培地を補給し、要求する物質を過不足なく細胞及び／又は組織に供給する手法として、流加培養、連続培養及び灌流培養があるが、いずれの手法も本発明に用いることができる。培養温度は、特に限定されないが、30～40℃、好ましくは37℃であり、CO2含有空気の存在下で培養が行われ、CO2濃度は、好ましくは2～5％である。
２．軟骨又は骨の前駆細胞の拡大培養用キット
　本発明はまた、軟骨又は骨の前駆細胞の拡大培養用キット（以下「本発明のキット」と称することがある）を提供する。本発明のキットには、基礎培地、TGF-βシグナル阻害剤及びFGFが含まれる。かかる基礎培地、TGF-βシグナル阻害剤及びFGFとしては、例えば、上記１．で列挙したものと同一のものが挙げられるが、中でも、基礎培地としてはDMEM/F-12混合培地が好ましく、TGF-βシグナル阻害剤としてはSB431542が好ましく、FGFとしてはbFGFが好ましい。
　また、本発明のキットには、軟骨又は骨の前駆細胞、培地への添加物、血清、血清代替物、培養器及び／又は細胞支持用基質が含まれていてもよく、軟骨又は骨の前駆細胞、培地への添加物、血清、血清代替物、培養器及び細胞支持用基質としては、例えば、上記１．で列挙したものと同一のものが挙げられる。本発明のキットには、さらに拡大培養の手順を記載した書面や説明書を含んでもよい。
　本発明のキットに含まれるTGF-βシグナル阻害剤及び／又はFGF、並びに必要に応じて上記の培地への添加物、血清、血清代替物等は、基礎培地に予め添加された状態で提供されてもよい。従って、一態様において、TGF-βシグナル阻害剤及び／又はFGFを含む培地を含むキット、あるいはTGF-βシグナル阻害剤及びFGFを含む軟骨又は骨の前駆細胞の拡大培養用培地が提供される。
３．軟骨細胞又は骨細胞の製造方法
　本発明はまた、軟骨細胞又は骨細胞の製造方法（以下「本発明の製造方法」と称することがある）を提供する。本発明の製造方法は、本発明の培養方法で得られた軟骨又は骨の前駆細胞（以下「本発明の前駆細胞」と称することがある）を、軟骨細胞又は骨細胞へ分化誘導させる工程を含む。
　本発明の前駆細胞を軟骨細胞へ分化誘導させる方法としては、自体公知の方法を用いることができる。例えば、特許文献１、非特許文献１、２、特開2005-511083号公報、特開2004-254655号公報に記載の方法などを適宜参照して、本発明の前駆細胞を軟骨細胞へ分化誘導することができる。より具体的には、例えば、BMPシグナル活性化剤及び／又はTGF-βシグナル活性化剤を含む培地で本発明の前駆細胞を培養することにより、軟骨細胞へ分化誘導することができる。
　分化誘導を開始する前（例えば、凍結保存された細胞を起眠させた後）に、本発明の方法により、本発明の前駆細胞を再度拡大培養してもよく、具体的な方法や用いる基礎培地、TGF-βシグナル阻害剤、FGF、培地添加物、血清及びその代替物、培養器などは、上記１．に記載の通りである。
　上記BMPシグナル活性化剤として、例えば、骨形成タンパク質(BMP)（例：BMP-2、BMP-4、BMP-7等）、Alantolactone、FK506、イソリキリチゲニン、4'-ヒドロキシカルコンなどが挙げられるが、好ましくは骨形成タンパク質であり、中でもBMP-4がより好ましい。BMP-4を用いる場合には、培地中でのその濃度は、典型的には2 ng/mL～200 ng/mL（例：20 ng/mL等）である。上記TGF-βシグナル活性化剤としては、例えば、上記１．で列挙したものと同一のものが挙げられるが、好ましくはTGF-βであり、中でもTGF-β3がより好ましい。TGF-β3を用いる場合には、培地中でのその濃度は、典型的には1 ng/mL～100 ng/mL（例：10 ng/mL等）である。好ましい実施態様において、上記培養で用いる培地には、BMP-4及びTGF-β3が含まれる。
　軟骨細胞であることの確認は、アルシアンブルー染色及び／又は１種以上の軟骨マーカーの発現を確認することにより行うことができる。前記軟骨マーカーとしては、例えば、初期軟骨マーカー（例：COL2A1等）、軟骨マーカー（例：ACAN、EPIPHYCAN等）などが挙げられる。本発明の好ましい実施態様において、軟骨又は骨の前駆細胞から分化誘導した軟骨細胞は、COL2A1、ACAN及びEPIPHYCANを、少なくともmRNAレベルで発現する。かかるマーカーの発現は、自体公知の方法により検出することができ、マーカータンパク質の発現の検出は、抗体を用いた免疫学的アッセイ、例えば、ELISA法、免疫染色法、ウエスタンブロット法、フローサイトメトリーを利用して行うことができる。また、マーカー遺伝子の発現の検出は、例えば、real-time PCR、マイクロアレイ、バイオチップ及びRNAseq等の核酸増幅方法及び／又は核酸検出方法を利用して行うことができる。
　本発明の前駆細胞を骨細胞へ分化誘導させる方法としては、自体公知の方法を用いることができる。例えば、Mahmood A. et al., J. Bone Miner. Res., 25:1216-1233 (2010)、Lee K.W. et al., Stem Cells Dev., 19:557-568 (2010)、Hu J. et al., Tissue Eng. Part A 16:3507-3514 (2010)、Zou L. et al., Sci. Rep., 3:2243 (2013)、WO 2001/017562、WO 2006/123699に記載の方法などを適宜参照して、本発明の前駆細胞を骨細胞へ分化誘導することができる。より具体的には、例えば、デキサメタゾン、β-グリセロリン酸及びビタミンC類、Rhoキナーゼ阻害剤及びBMPシグナル活性化剤、並びに／又はカルシウム拮抗薬を含む培地で本発明の前駆細胞を培養することにより、骨細胞へ分化誘導することができる。上記培地への添加物は、それぞれ自体公知の濃度範囲内で含まれることが好ましい。あるいは、前駆細胞を軟骨細胞へ分化誘導後、軟骨細胞から骨細胞へ分化させる方法を用いることもできる。
　上記ビタミンC類としては、例えば、上記１で列挙したものと同一のものが挙げられる。上記Rhoキナーゼ阻害剤としては、例えば、(+)-trans-4-(1-aminoethyl)-1-(4-puridylcarbamoyl)cyclohexane、(+)-trans-N-(1H-pyrrolo[2,3-b]pyridine-4-yl)-4-(1-aminoethyl)cyclohexanecarboxamide、(R)-(+)-N-(4-pyridyl)-4-(1-aminoethyl)benzamide、(R)-(+)-N-(1H-pyrrolo[2,3-b]pyridine-4-yl)-4-(1-aminoethyl)benzamideなどが挙げられる。上記BMPシグナル活性化剤としては、例えば、上記で列挙したものと同一のものが挙げられるが、好ましくは骨形成タンパク質であり、中でもBMP-2がより好ましい。上記カルシウム拮抗薬としては、例えば、ジヒドロピリジン系カルシウム拮抗薬（例：ベニジピン、二フエジピン、アムロジピン、シノレニジピン等）、フェニルアルキルアミン系カルシウム拮抗薬（例：ベラパミル、ガロパミル、べプリジル等）、ベンゾチアゼピン系カルシウム拮抗薬（例：ジルチアゼム）、ゾニサミド、ファスジル、ロメリジン、プレガバリン、シクランデレート、イデベノン、ブフロメジル、アトシバンなどが挙げられる。
　骨細胞であることの確認は、アルカリホスファターゼ活性、及び／又は１種以上の骨マーカーの発現を確認することにより行うことができる。前記骨マーカーとしては、例えば、RUNX2、COL1A1、Osteopontin（OPN）、Osterix、ALP、Osteocalcinなどが挙げられる。本発明の好ましい実施態様において、軟骨又は骨の前駆細胞から分化誘導した骨細胞は、COL2A1及びOPNを、少なくともmRNAレベルで発現する。アルカリホスファターゼ活性の確認は、自体公知の方法(例：Kind-King法、Bessey-Lowry法、GSCC法、SSCC法、JSCC法等)や、市販のキット（例：TRACP & ALP Assay Kit（Takara Bio）等）を用いて行うことができる。骨マーカーの発現の検出は、上述の軟骨マーカーの発現の検出と同様の方法により行うことができる。
　本発明の前駆細胞から軟骨細胞又は骨細胞への分化誘導に用いる基礎培地としては、特に制限されないが、上述した本発明の培養方法で用いる基礎培地と同一のものが挙げられる。また、培地には添加物、血清及び／又は血清代替物が含まれていてもよく、例えば、上述した本発明の培養方法で用いることができる添加物、血清、血清代替物と同一のものが挙げられる。また、上記分化誘導に用いる培養器としては、特に制限されないが、上述した本発明の培養方法で用いる培養器と同一のものが挙げられる。培養器は、細胞接着性であっても細胞非接着性であってもよく、目的に応じて適宜選ばれる。細胞接着性の培養器は、培養器の表面の細胞との接着性を向上させる目的で、細胞外マトリックス（ECM、細胞外基質ともいう）等の任意の細胞支持用基質でコーティングされたものであってもよく、かかる細胞支持用基質としては、上述した本発明の培養方法で用いることができる細胞支持用基質と同一のものが挙げられる。
　本発明の前駆細胞から軟骨細胞を分化誘導させる場合には、培養期間は、軟骨細胞が分化できる限り特に制限はないが、３日間以上（例：４日、５日又はそれ以上）が好ましい。上限についても特に制限はないが、２０日間以下（例：１５日、１０日、９日、８日、７日又はそれ以下）が好ましい。好ましい実施態様においては６日間である。本発明の前駆細胞から骨細胞を分化誘導させる場合には、培養期間は、骨細胞が分化できる限り特に制限はないが、７日間以上（例：８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日又はそれ以上）が好ましい。上限についても特に制限はないが、３０日間以下（例：２５日、２０日、１９日、１８日、１７日、１６日、１５日又はそれ以下が好ましく、例えば、１４日間が挙げられる。培養温度は、特に限定されないが、30～40℃、好ましくは37℃であり、CO2含有空気の存在下で培養が行われ、CO2濃度は、好ましくは2～5％である。
　本発明の前駆細胞の培養は、接着培養であっても浮遊培養であってもよい。浮遊培養は、静置培養であってもよいが、上述のバイオリアクターや自動培養装置によって行うこともできる。これらの装置を用いて培養する場合には、流加培養、連続培養及び灌流培養のいずれの手法も本発明に用いることができる。培養温度は、特に限定されないが、30～40℃、好ましくは37℃であり、CO2含有空気の存在下で培養が行われ、CO2濃度は、好ましくは2～5％である。
４．靭帯節細胞の製造方法
　さらに、本発明は、靭帯節細胞の製造方法（以下「本発明の靭帯節細胞の製造方法」と称することがある）を提供する。本発明の靭帯節細胞の製造方法は、本発明の前駆細胞を、靭帯節細胞へ分化誘導させる工程を含む。以下では、このようにして製造された靭帯節細胞を、「本発明の靭帯節細胞」と称することがある。本発明の靭帯節細胞を、腱細胞（tendon cell）又は靭帯細胞（ligament cell）に分化誘導させることで、腱細胞又は靭帯細胞を製造することもできる。本明細書において、上記のようにして製造された軟骨細胞、骨細胞、靭帯節細胞、腱細胞、靭帯細胞及び本発明の前駆細胞を包含するものとして、「本発明の硬節系譜細胞（sclerotome-lineage cells）」との用語を用いることがある。
　本発明の前駆細胞を靭帯節細胞へ分化誘導させる方法としては、自体公知の方法を用いることができる。例えば、Nakajima T. et al., Development, 145(16): dev165431 (2018)に記載の方法などを適宜参照して、本発明の前駆細胞を靭帯節細胞へ分化誘導することができる。より具体的には、例えば、(A)FGF及び／又はTGF-βシグナル活性化剤を含む培地で本発明の前駆細胞を培養する工程、及び(B)前記工程(A)により培養された細胞を、BMPシグナル活性化剤及び／又はTGF-βシグナル活性化剤を含む培地で培養することにより、靭帯節細胞へ分化誘導することができる。また、工程(A)及び(B)で用いる培地には、ビタミンC類が含まれることが好ましく、具体的なビタミンC類としては、例えば、上記１．で列挙したものと同一のものが挙げられる。培地におけるビタミンC類の濃度も、上記１．で記載したものと同様の濃度とすることが好ましい。
　上記FGFとしては、上記１．で列記したものと同一のものが挙げられるが、好ましくはFGF-8（例：FGF-8b）である。FGF-8を用いる場合には、培地中でのその濃度は、典型的には1 ng/mL～100 ng/mL（例：10 ng/mL等）である。
　上記TGF-βシグナル活性化剤としては、例えば、上記１．で列挙したものと同一のものが挙げられるが、好ましくはTGF-βであり、中でもTGF-β3がより好ましい。TGF-β3を用いる場合には、培地中でのその濃度は、典型的には1 ng/mL～100 ng/mL（例：10 ng/mL等）である。
　上記BMPシグナル活性化剤として、上記３．で列記したものと同一のものが挙げられるが、好ましくはBMP-4である。BMP-4を用いる場合には、培地中でのその濃度は、典型的には1 ng/mL～100 ng/mL（例：10 ng/mL等）である。
　好ましい実施態様において、上記工程(A)で用いる場合には、TGF-β3及びFGF-8が含まれ、並びに／又は上記工程(B)で用いる培地には、BMP-4及びTGF-β3が含まれる。
　靭帯節細胞であることの確認は、２種以上の靭帯節マーカーの発現を確認することにより行うことができる。靭帯節マーカーの発現を確認する場合には、細胞に機械的ストレスを与えながら培養してもよい。前記靭帯節マーカーとしては、例えば、COL1A1、TNMD及びSCXから選択される２種類以上のマーカーなどが挙げられる。本発明の好ましい実施態様において、軟骨又は骨の前駆細胞から分化誘導した靭帯節細胞は、COL2A1及びTNMDを、少なくともmRNAレベルで発現する。かかるマーカーの発現は、自体公知の方法により検出することができ、マーカータンパク質の発現の検出は、抗体を用いた免疫学的アッセイ、例えば、ELISA法、免疫染色法、ウエスタンブロット法、フローサイトメトリーを利用して行うことができる。また、マーカー遺伝子の発現の検出は、例えば、real-time PCR、マイクロアレイ、バイオチップ及びRNAseq等の核酸増幅方法及び／又は核酸検出方法を利用して行うことができる。
　本発明の靭帯節細胞を腱細胞又は靭帯細胞へ分化誘導させる方法としては、自体公知の方法を用いることができる。例えば、特開2011-205964に記載の方法などを適宜参照して、本発明の靭帯節細胞を腱細胞又は靭帯細胞へ分化誘導することができる。
　靭帯節細胞、腱細胞又は靭帯細胞への分化誘導に用いる基礎培地としては、特に制限されないが、上述した本発明の培養方法で用いる基礎培地と同一のものが挙げられる。また、培地には添加物、血清及び／又は血清代替物が含まれていてもよく、例えば、上述した本発明の培養方法で用いることができる添加物、血清、血清代替物と同一のものが挙げられる。また、上記分化誘導に用いる培養器としては、特に制限されないが、上述した本発明の培養方法で用いる培養器と同一のものが挙げられる。培養器は、細胞接着性であっても細胞非接着性であってもよく、目的に応じて適宜選ばれる。細胞接着性の培養器は、培養器の表面の細胞との接着性を向上させる目的で、細胞外マトリックス（ECM、細胞外基質ともいう）等の任意の細胞支持用基質でコーティングされたものであってもよく、かかる細胞支持用基質としては、上述した本発明の培養方法で用いることができる細胞支持用基質と同一のものが挙げられる。
　本発明の前駆細胞から靭帯節細胞を分化させる場合の培養期間は、靭帯節細胞が分化できる限り特に制限はないが、３日間以上（例：４日、５日又はそれ以上）が好ましい。上限についても特に制限はないが、２０日間以下（例：１５日、１０日、９日、８日、７日又はそれ以下）が好ましい。好ましい実施態様においては８日間である。工程(A)の培養期間は、１～３日間（例：２日間）が好ましく、工程(B)の期間は、４～８日間（例：６日間）が好ましい。靭帯節細胞から腱細胞又は靭帯細胞を分化させる場合の培養期間も、腱細胞又は靭帯細胞に分化できる限り特に制限はない。培養温度は、特に限定されないが、30～40℃、好ましくは37℃であり、CO2含有空気の存在下で培養が行われ、CO2濃度は、好ましくは2～5％である。また、前記培養は、接着培養であっても浮遊培養であってもよい。浮遊培養は、上記１．で記載の方法と同様に行うことができる。
５．細胞移植療法剤
　本発明はまた、本発明の硬節系譜細胞を含有してなる、細胞移植療法剤（以下、「本発明の細胞移植療法剤」ともいう）及び該剤の製造方法を提供する。上述の通り、本発明の培養方法により、軟骨疾患又は骨疾患の治療又は予防に用いるのに十分な量の軟骨又は骨の前駆細胞を得ることができ、また、該細胞を分化誘導することにより、軟骨疾患又は骨疾患の治療又は予防に用いるのに十分な量の軟骨細胞又は骨細胞を提供することができる。同様に、本発明の前駆細胞から分化誘導した靭帯節細胞、腱細胞又は靭帯細胞は、腱又は靭帯関連疾患の治療又は予防に用いることができる。また、本発明の培養方法により、腫瘍などの原因となる未分化細胞の残存リスクが顕著に低下された細胞集団が得られる。よって、本発明の硬節系譜細胞は、細胞移植療法剤の原料として用いることに適しており、該細胞移植療法剤は、変形性関節症や関節リウマチなどの軟骨疾患又は骨疾患、あるいは靭帯損傷やエーラスダンロス症候などの腱又は靭帯関連疾患の治療又は予防に有用である。本明細書において、本発明の硬節系譜細胞には、該細胞を含む細胞集団も包含される。
　従って、本発明の一実施態様において、（１）本発明の培養方法により、軟骨又は骨の前駆細胞を提供する工程、及び（２）工程（１）によって提供された、有効量の本発明の前駆細胞を含む製剤を調製する工程を含む、本発明の細胞移植療法剤を製造する方法が提供される。また、別の態様において、（１’）本発明の製造方法により、軟骨細胞又は骨細胞を提供する工程、及び（２’）工程（１’）によって提供された、有効量の本発明の軟骨細胞等を含む製剤を調製する工程を含む、本発明の細胞移植療法剤を製造する方法が提供される。靭帯節細胞、腱細胞又は靭帯細胞を含む製剤についても、上記と同様に調製することができる。また、別の実施態様において、本発明の硬節系譜細胞又は本発明の細胞移植療法剤の有効量を治療又は予防の対象とする哺乳動物（例：ヒト、マウス、ラット、サル、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ等）に投与又は移植する、軟骨疾患又は骨疾患の治療又は予防方法が提供される。
　本発明の硬節系譜細胞を、細胞移植療法剤に用いる場合、拒絶反応が起こらないという観点から、移植先の個体のHLA遺伝子型が同一若しくは実質的に同一である体細胞から樹立したiPS細胞に由来する細胞を用いることが望ましい。ここで、「実質的に同一」とは、移植した細胞に対して免疫抑制剤により免疫反応が抑制できる程度にHLA遺伝子型が一致していることであり、例えば、HLA-A、HLA-B及びHLA-DRの3遺伝子座或いはHLA-Cを加えた4遺伝子座が一致するHLA型を有する体細胞である。本発明の硬節系譜細胞が、軟骨疾患又は骨疾患等の起因となる遺伝子変異を有する場合には、例えば、ゲノム編集（例:CRISPRシステム、TALEN、ZFN等）などの手法を用いて、該疾患の原因となる遺伝子の変異を予め修復しておくことが好ましい。年齢や体質などの理由から充分な細胞が得られない場合には、ポリエチレングリコールやシリコンのようなカプセル、多孔性の容器などに包埋して拒絶反応を回避した状態で移植することも可能である。
　本発明の硬節系譜細胞は、常套手段にしたがって医薬上許容される担体と混合するなどして、注射剤、懸濁剤、点滴剤等の非経口製剤として製造される。当該非経口製剤に含まれ得る医薬上許容される担体としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、D-ソルビトール、D-マンニトール、塩化ナトリウムなど）などの注射用の水性液を挙げることができる。本発明の細胞移植療法剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤、酸化防止剤などと配合してもよい。本発明の移植療法剤を水性懸濁液剤として製剤化する場合、上記水性液に約1×106～約1×108細胞/mLとなるように、本発明の硬節系譜細胞を懸濁させればよい。また、本発明の硬節系譜細胞又は細胞移植療法剤の投与量又は移植量及び投与回数又は移植回数は、投与される哺乳動物の年齢、体重、症状などによって適宜決定することができる。
　本発明の細胞移植療法剤は、細胞の凍結保存に通常使用される条件で凍結保存された状態で提供され、用時融解して用いることもできる。その場合、血清若しくはその代替物、有機溶剤（例、DMSO）等をさらに含んでいてもよい。この場合、血清若しくはその代替物の濃度は、特に限定されるものではないが約1～約30%(v/v)、好ましくは約5～約20%(v/v)であり得る。有機溶剤の濃度は、特に限定されるものではないが0～約50%(v/v)、好ましくは約5～約20%(v/v)であり得る。
５．その他の用途
　さらに、本発明の硬節系譜細胞は、軟骨疾患若しくは骨疾患、あるいは腱若しくは靭帯関連疾患の治療又は予防用化合物のスクリーニングに有用である。例えば、試験化合物を単独で又は他の薬剤と組み合わせて、本発明の硬節系譜細胞と接触させ、自体公知の方法により、当該細胞の分化、増殖、成熟を促進する、あるいは軟骨基質又は骨基質の産生量を増加する場合には、当該試験化合物が上記疾患の治療用化合物として有用であると評価することができる。上記スクリーニングに用いる細胞は、治療対象となる疾患と同様の表現型を呈する細胞が好ましく、特に好ましくは、疾患患者由来の体細胞から作製された人工多能性幹細胞を分化誘導することにより製造された細胞である。上記軟骨疾患又は骨疾患としては、上記４．で列挙した疾患と同一のものが挙げられる。
　試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などが挙げられる。ここで試験化合物は塩を形成していてもよい。該塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アルミニウム塩）などとの塩が用いられ、この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、又は有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩、アルミニウム塩が用いられ得る。
　本発明の硬節系譜細胞は、さらに、創薬ターゲットの検証や疾患メカニズムの解析などにも使用することができる。
６．軟骨又は骨の前駆細胞の同定方法
　以下の実施例で示す通り、軟骨又は骨の前駆細胞であるiCOPが、以下の遺伝子を発現することが実証された。従って、以下の遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を検出又は測定することで、軟骨又は骨の前駆細胞を同定することができる。該方法では、以下の遺伝子のうちの少なくとも１つ、好ましくは２つ以上（例：３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０つ又はそれ以上）の遺伝子の発現が検出されたものを軟骨又は骨の前駆細胞として同定することができるが、少なくともPDGFRA遺伝子の発現が検出されることが好ましい。遺伝子の発現の検出又は測定は、上述の軟骨マーカーの発現の検出又は測定と同様の方法により行うことができる。
A2M, ABCA9, ACAT2, ADAMTS9, ADGRF5, AGTR2, AMER1, AMOT, ANGPT1, ARHGAP5-AS1, ARHGEF26, ATP8A1, BCHE, BEGAIN, BOC, C3ORF52, CACNA1G, CELF2, CLSPN, COL25A1, COL26A1, CORO1A, CRISPLD1, CTTNBP2, CYB5B, DLGAP1, DNAJC12, DUSP9, EBF1, EBF2, EFEMP1, ESCO2, EYA1, FAM35A, FAM78A, FAR2, FGFBP2, FGFR4, FKBP4, FRZB, GCNT4, GNG11, HAAO, HMGCS1, HS3ST5, ID4, IGDCC3, IRF8, KCNA6, KCNB2, KITLG, LGR5, LHCGR, LHFP, LPPR5, LUM, MAPK8IP2, MECOM, MEF2C, MEOX2, METTL7A, NAB1, NCALD, NGF, NGFR, NKAIN2, NPR1, NR2F1, OLFML1, PCDH18, PCDH19, PCSK9, PDE4D, PDGFRA, PEG10, PLVAP, PRELP, PRRT4, RARRES2, RBMS3, RBPMS2, RSPO3, RUNX1T1, SAMD5, SCARA5, SKIDA1, SLC12A2, SLC27A3, SLC39A8, SLC7A2, SLC8A3, SLCO1C1, SOX8, SPRED2, STARD8, STOM, SYNPO, TBX18, TMC6, TNRC6C-AS1, TRIM2, TRIM9, TRIP13, TSPAN15, UBE2N, UHRF1, UNC5C, VIT, ZBTB46及びZNF488。
７．軟骨又は骨の前駆細胞の単離方法
　また、上記タンパク質のうち、下記の細胞表面抗原遺伝子（以下「本発明の細胞表面抗原遺伝子」と称することがあり、該遺伝子にコードされる抗原を「本発明の細胞表面抗原」と称することがある）から選択される少なくとも１つ、好ましくは２つ以上（例：３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０つ又はそれ以上）の遺伝子にコードされる抗原を指標として、軟骨又は骨の前駆細胞を含む細胞集団から、軟骨又は骨の前駆細胞を単離することができる。本発明の細胞表面抗原の１つとしては、PDGFRAが好ましい。細胞の単離は、自体公知の方法（例：FACS、MACS等）により行うことができる。
ABCA9, ATP8A1, BOC, KITLG, NKAIN2, ADGRF5, AGTR2, CACNA1G, C3ORF52, COL25A1, CYB5B, FAR2, FGFR4, GCNT4, HS3ST5, IGDCC3, LGR5, LHFP, LHCGR, NPR1, NGFR, PLVAP, PDGFRA, KCNA6, KCNB2, PCDH18, PCDH19, SCARA5, SLC12A2, SLC27A3, SLC39A8, SLC7A2, SLC8A3, SLCO1C1, STOM, TSPAN15, TMC6及びUNC5C。
８．軟骨又は骨の前駆細胞の単離用試薬
　本発明はまた、本発明の細胞表面抗原のうちの１つ以上の抗原の各々に対する抗体を少なくとも含んでなる、軟骨又は骨の前駆細胞の単離用試薬（以下「本発明の試薬」と称することがある）を提供する。本発明の試薬が２つ以上の抗原に対する抗体を含む場合、該試薬は、各抗体を別個の試薬中に含む試薬キットとして提供され得る。本発明の試薬に含まれる抗体は、単離手段に応じて、例えば、蛍光色素、金属同位体又はビーズ（例：磁気ビーズ）に結合した形態で提供され得る。本明細書において、該抗体には、細胞表面抗原への結合能を有する抗体断片や改変体(例:Fab断片、scFab断片、ScFv断片等)も含まれるものとする。
　以下に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。
実施例１：増殖能と軟骨分化能を有するiCOPの作製
　以下の実施例では、人工多能性幹細胞（iPS細胞）からiCOP（iPS cell-induced chondro/osteogenic progenitor）を作製し、その増殖性と軟骨細胞への分化能を評価した。iPS細胞として、iPSアカデミアジャパン社より購入した1210B2株を用いた。
　5 mLシングルユースバイオリアクター（Biott）を用いて、分化開始2日前に10 μM Y-27632（Wako）を含むStemFit（登録商標） AK03N（味の素）にiPS細胞を2×105cells/mLの細胞密度で播種し、37℃、5%CO2のインキュベーター内で80 rpmの攪拌速度で攪拌培養した。なお、生細胞数の測定にはVi-CELLL（登録商標）XR（Beckman Coulter）を用いた。その後、RPMI1640（ナカライテスク）、2% B27（Thermo Fisher Scientific）、30 ng/mL Activin A（味の素）、10 μM CHIR99021（Miltenyi Biotech）、100 ng/mL bFGF（PeproTech）、0.3 μM LDN193189 （Wako）を含む分化1培地5 mLに交換した。分化開始1日目にRPMI1640、2% B27、10 μM SB431542（ReproCell）、5 μM CHIR99021、100 ng/mL bFGF、0.3 μM LDN193189を含む分化2培地5 mLに交換した。翌2日目にRPMI1640、2% B27、10 μM SB431542、3 μM IWR-1（Sigma）、0.3 μM PD0325901（Cayman Chemical）、0.3μM LDN193189を含む分化3培地5 mLに交換した。翌3日目にRPMI1640、2% B27、3 μM IWR-1、0.3 μM SAG（Cayman Chemical）を含む分化4培地5 mLに交換した。翌4、5日目にシングルユースバイオリアクターの培養上清70%を分化4培地で交換し、6日目の細胞をiCOPとした。Alexa Fluor（登録商標） 647 Mouse Anti-Sox9（BD Biosciences）を用いてiCOPが発現するSOX9を標識し、その陽性率をAttune NxT Flow Cytometer（Thermo Fisher Scientific）により測定した。その結果、9割前後の高効率でiCOPを誘導できることが確認された（図1）。
　iCOPの増殖能を評価するため、iCOPをシングルユースバイオリアクターから回収して遠心し、Accumax cell detachment solution（Merck） 1 mLに懸濁し、10分間静置した。細胞塊が崩れるまで再び懸濁して遠心し、DMEM/F12（Thermo Fisher Scientific）、2% B27、5 μM SB431542、10 ng/mL bFGF、250 μM L-アスコルビン酸-2-リン酸セスキマグネシウム塩（Sigma）を含むiCOP増殖培地に懸濁し、細胞数を計測した。2×105 cellsのiCOPを8 mLのiCOP増殖培地を含む100 mmディッシュに播種し、37℃、5%CO2条件下でインキュベーションした。播種3、5日後に新鮮培地8 mLに交換し、7日ごとに継代した。以下の図及び表では、継代をしていないものをP0、1回継代したものをP1、2回継代したものをP2、3回継代したものをP3、4回継代したものをP4、5回継代したものをP5として示す。5継代を繰り返し、iCOPの増殖曲線を求めた。その結果、一日当たりのpopulation doubling (PD)は0.46であった（図2）。また、iCOPマーカー（PAX1、SOX9、PDGFRA）の遺伝子発現を測定したところ、5継代しても発現を保持していた（表１）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
実施例２：iCOPの軟骨分化能の検証
　iCOPの軟骨分化能を検証するため、各継代数のiCOPをPBS（-）で洗浄後、Accutase（ナカライテスク）に浸して37℃、5分間インキュベーションした。細胞が剥離したらチューブに回収して遠心し、DMEM/F12、2% B27、10 ng/mL TGF-β3（PeproTech）、20 ng/mL BMP4（R&D systems）を含む分化5培地に懸濁し、細胞数を計測した。1×106cellsのiCOPを1 mLの分化5培地を含むElplasiaTM Non-adherent surface 24 well plate（Kuraray）に播種し、37℃、5% CO2条件下でインキュベーションした。培養上清を毎日半量交換し、6日目に細胞を回収した。培養後の軟骨細胞の遺伝子発現をreal-time PCR法により評価した結果、5継代したiCOPは軟骨細胞への分化能が保持していた（表２）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
実施例３：iCOPの凍結保存性の検証
　以下の実験例では、iPS細胞から作製したiCOPを凍結保存し、その後解凍して増殖能と軟骨細胞への分化能を評価した。iPS細胞として、iPSアカデミアジャパン社より購入した1231A3株を用いた。
　分化開始1日前に、あらかじめ0.5 μg/cm2 iMatrix-511（ニッピ）でコーティングした10 cm dish（BD FALCON）に4×106 cellsのiPS細胞を播種し、10 μM Y-27632を含むStemFit（登録商標） AK03Nにて37℃、5% CO2のインキュベーター内で培養した。翌日、RPMI1640、20% StemFit（登録商標） For Differentiation（味の素）、30 ng/mL Activin A、10 μM CHIR99021、100 ng/mL bFGF、0.3 μM LDN193189を含む分化1培地8 mLに交換した。翌日、RPMI1640、20% StemFit（登録商標） For Differentiation、10 μM SB431542、5 μM CHIR99021、100 ng/mL bFGF、0.3 μM LDN193189を含む分化2培地8 mLに交換した。翌日、RPMI1640、20% StemFit（登録商標） For Differentiation、10 μM SB431542、3 μM IWR-1、0.3 μM PD0325901、0.3 μM LDN193189を含む分化3培地8 mLに交換した。翌日、RPMI1640、20% StemFit（登録商標） For Differentiation、3 μM IWR-1、0.3 μM SAGを含む分化4培地8 mLに交換した。翌4、5日目に分化4培地で培地交換し、6日目の細胞をiCOPとした。iCOPの生細胞数を計測し、あらかじめ0.5 μg/cm2 iMatrix-511でコーティングした10 cm dishに2×105cellsのiCOPを播種し、DMEM/F12、20% StemFit（登録商標） For Differentiation、250 μM L-Ascorbic Acid 2-phosphate、10 μM SB431542、100 ng/mL bFGF、0.3 μM SAGを含むiCOP増殖培地にて37℃、5% CO2の条件でインキュベーションした。2日に1回培地交換して90～100%コンフルエントに到達したらiCOPの細胞数を計測し、そのまま継代した群と凍結ストックを作製する群に分けた。凍結ストックを作製するため、1×106 cellsを1 mL STEM-CELLBANKER（登録商標） GMP grade（Zenoaq）に懸濁してセラムチューブ（IWAKI）に分注した。その後、あらかじめ4℃に冷やしていたBICELL（日本フリーザー）にセラムチューブを入れて－80℃ディープフリーザー内で凍結させ、翌日－150℃ディープフリーザーに移した。一週間後、凍結させたセラムチューブを37℃湯浴内で解凍し、あらかじめ0.5 μg/cm2 iMatrix-511でコーティングした10 cm dishに3×105 cellsのiCOPを播種し、iCOP増殖培地を用いて培養した。2日に1回培地交換して90～100%コンフルエントに到達したらiCOPの細胞を継代し、さらに5日間同様の条件で培養してP3 iCOPを得た。その結果、iCOPを凍結保存してもiCOPの増殖能が低下せず（図３）、またP3 iCOP におけるiCOPマーカーも低下しなかった（図４）。以上の結果から、iCOPを凍結保存することが可能であることが示された。
実施例４：iCOPの骨分化能の検証
　以下の実験例では、iCOPから骨細胞（Osteocyte）へ分化誘導し、骨細胞マーカーの遺伝子発現量を評価した。iPS細胞として、iPSアカデミアジャパン社より購入した1231A3株、1210B2株、及び201B7株を用いた。
　1継代目で凍結保存していたiCOPを起眠し、DMEM/F12、20% StemFit（登録商標） For Differentiation、250 μM L-Ascorbic Acid 2-phosphate、10 μM SB431542、100 ng/mL bFGF、0.3 μM SAG、10 ng/mL PDGF-BB（Peprotech）を含むiCOP増殖培地で3継代目まで拡大培養した。iCOPが90～100%コンフルエントに到達したら生細胞数を計測し、4.5 g/L Glucose含有DMEM（ナカライテスク）、20% StemFit（登録商標） For Differentiation、250 μM L-Ascorbic Acid 2-phosphate、100 nM dexamethasone（Sigma）、10 mM β-glycero phosphate（ナカライテスク）を含む骨分化培地に懸濁した。2×105 cellsのiCOPをあらかじめ0.5 μg/cm2 iMatrix-511でコーティングした24 well plate（BD FALCON）に播種し、37℃、5% CO2のインキュベーター内に静置した。隔日で培地交換を行い、18日間培養後に細胞を回収し、Osteocyteの遺伝子発現量をreal-time PCR法により評価した。その結果、いずれの細胞株においても骨細胞マーカー（COL1A1及びOPN）遺伝子を発現していたことから、iCOPは骨細胞への分化能を保持していることが示された（図５）。
実施例５：iCOPの靱帯節細胞分化能の検証
　以下の実験例では、iCOPから靱帯節細胞（syndetome）へ分化誘導し、靱帯節マーカーの遺伝子発現量を評価した。iPS細胞として、iPSアカデミアジャパン社より購入した1231A3株、1210B2株、及び201B7株を用いた。
　1継代目で凍結保存していたiCOPを起眠し、DMEM/F12、20% StemFit（登録商標） For Differentiation、250 μM L-Ascorbic Acid 2-phosphate、10 μM SB431542、100 ng/mL bFGF、0.3 μM SAGを含むiCOP増殖培地で5継代目まで拡大培養した。iCOPが90～100%コンフルエントに到達したら生細胞数を計測し、DMEM/F12、20% StemFit（登録商標） For Differentiation、250 μM L-Ascorbic Acid 2-phosphate、10 ng/mL TGF-β3（Peprotech）、20 ng/mL FGF8b（Peprotech）を含む靱帯節細胞分化培地1に懸濁した。2.5×105 cellsのiCOPをあらかじめ0.5 μg/cm2 iMatrix-511でコーティングした24 well plateに播種し、37℃、5% CO2のインキュベーター内に静置した。2日後、DMEM/F12、20% StemFit（登録商標） For Differentiation、250 μM L-Ascorbic Acid 2-phosphate、10 ng/mL TGF-β3、10 ng/mL BMP-4（R&D）を含む靱帯節細胞分化培地2に置換し、さらに6日間培養した。培地交換は隔日で行った。培養終了後に細胞を回収し、靭帯節細胞の遺伝子発現量をreal-time PCR法により評価した。その結果、いずれの細胞株においても靱帯節マーカー（COL1A1及びTNMD）遺伝子を発現していたことから、iCOPは靭帯節細胞への分化能を保持していることが示された（図６）。
実施例６：iCOPの浮遊培養による拡大培養
　以下の実験例では、iCOPを浮遊培養により増殖させ、その増殖性と軟骨細胞への分化能を評価した。iPS細胞として、iPSアカデミアジャパン社より購入した1231A3株を用いた。
　iPS細胞から作製したiCOPの生細胞数を計測し、DMEM/F12、20% StemFit（登録商標） For Differentiation、250 μM L-Ascorbic Acid 2-phosphate、10 μM SB431542、100 ng/mL bFGF、0.3 μM SAG、10 ng/mL PDGF-BBを含むiCOP増殖培地に懸濁した。2×105 cells/mLの細胞密度で5 mLシングルユースバイオリアクター（Biott）に播種し、37℃、5% CO2のインキュベーター内で80 rpmの攪拌速度で攪拌培養した。1日おきに7割培地交換を行った。iCOPの増殖能を評価するため、iCOPをシングルユースバイオリアクターから回収して遠心し、Accumax cell detachment solution（Merck） 1 mLに懸濁し、10分間静置した。細胞塊が崩れるまで再び懸濁して遠心し、iCOP増殖培地に懸濁し、細胞数を計測した。5日ごとに同様の操作を繰り返し、3継代目までの増殖曲線を求めた。その結果、一日当たりのPDは0.38であった（図７）。また、iCOPマーカー（PAX1、SOX9及びPDGFRA）の遺伝子発現を測定したところ、3継代しても発現を保持していた（表３）。さらに、3継代目のiCOPを軟骨細胞へ分化させたところ、いずれ軟骨細胞遺伝子も発現していた（表４）。以上より、iCOPを浮遊状態で拡大培養できることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
実施例７：iCOPの特異的マーカーの同定
　以下の実験例では、iPS細胞から作製したiCOPの次世代シーケンサー（NGS）による解析を実施し、iCOP特異的マーカーの同定を行った。iPS細胞として、iPSアカデミアジャパン社より購入した1231A3株を使用した。
　分化開始1日前に、あらかじめ0.5 μg/cm2 iMatrix-511（ニッピ）でコーティングした24 well plate（BD FALCON）の4ウェルに1.6×105 cellsのiPS細胞を播種し、10 μM Y-27632を含むStemFit（登録商標） AK03Nにて37℃、5% CO2のインキュベーター内で培養した。翌日、培地を除去後、RPMI1640、20% StemFit（登録商標） For Differentiation（味の素）、30 ng/mL Activin A、10 μM CHIR99021、100 ng/mL bFGF、0.3 μM LDN193189を含む分化1培地を1ウェルあたり500 μL添加した。翌日、RPMI1640、20% StemFit（登録商標） For Differentiation、10 μM SB431542、5 μM CHIR99021、100 ng/mL bFGF、0.3 μM LDN193189を含む分化2培地500 μLに交換した。翌日、RPMI1640、20% StemFit（登録商標） For Differentiation、10 μM SB431542、3 μM IWR-1、0.3 μM PD0325901、0.3 μM LDN193189を含む分化3培地500 μLに交換した。翌日、RPMI1640、20% StemFit（登録商標） For Differentiation、3 μM IWR-1、0.3 μM SAGを含む分化4培地500 μLに交換した。翌4、5日目に分化4培地で培地交換し、6日目の細胞をiCOPとして、iCOPの生細胞数を計測した。この時点でのiCOPを0継代目のiCOPとし、取得した細胞のうち1×106 cells の細胞を含む細胞懸濁液を1.5 mLエッペンドルフチューブに回収し、遠心後上清を除去しNGS解析用サンプルとしてペレットの状態で凍結保存した。また、あらかじめ0.5 μg/cm2 iMatrix-511でコーティングした10 cm dishに3×105 cellsのiCOPを播種し、DMEM/F12、20% StemFit（登録商標） For Differentiation、250 μM L-Ascorbic Acid 2-phosphate、10 μM SB431542、100 ng/mL bFGF、0.3 μM SAGを含むiCOP増殖培地にて37℃、5% CO2の条件でインキュベーションした。2日に1回培地交換して90～100%コンフルエントに到達したらiCOPの細胞数を計測し、この時点でのiCOPを１継代目のiCOPとして、取得した細胞の一部は継代し、1×106 cellsをNGS解析用サンプルとしてペレットの状態で凍結保存した。継代とNGS用細胞サンプル取得を繰り返し、0継代目、1継代目、3継代目、5継代目、8継代目、10継代目のiCOP凍結サンプルを得た。得られた凍結サンプルを解凍し、PureLinkTM RNA Mini kit（Thermo Fischer Scientific）を用いてRNA抽出を行った。抽出したRNAのクオリティチェックのため、バイオアナライザ（Agilent RNA6000 Nano kit, Agilent）を用いてRIN（RNA Integrity Number）の測定を実施した。NGS解析用サンプルのライブラリー調製には、KAPA Stranded mRNA-Seq Kit（KAPA Biosystems）及びKAPA Unique Dual-Indexed Adapter Kit（KAPA Biosystems）を使用した。調製したライブラリーのクオリティチェックにはバイオアナライザ（Agilent DNA1000 kit, Agilent）を使用し、濃度測定には、Qubit（登録商標） 2.0 Fluorometer（Thermo Fisher Scientific）及びQubit（登録商標） dsDNA HS assay kit（Thermo Fisher Scientific）を使用した。調製したライブラリーを使用し、NextSeq 500 System （illumina）によるシーケンシングを実施した。BaseSpace（登録商標） Onsite （illumina）システム上からFASTQファイルを取得し、Bio-Linux上にてTrimmomaticツールによる3’末端のトリミングを実施した。Jupyter notebook上にて、FastQCによるtrimmomaticによるクオリティ向上を確認し、ヒトゲノムへのマッピング、リード数のカウント、正規化からなるRNA-seqパイプラインを実行し、出力されたリード数カウントファイルを用いて、TCCパッケージを用いた発現変動遺伝子（DEG）の解析を行った。解析の結果、iCOP特異的マーカー遺伝子として抽出された110遺伝子を、以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
　また、110遺伝子のうち、細胞表面抗原である遺伝子群を、以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006
　本発明により、軟骨又は骨の前駆細胞の拡大培養が可能となり、予め該前駆細胞を拡大培養し、ストックしておけば、軟骨細胞又は骨細胞への分化誘導期間を大幅に短縮することが可能となり、また、軟骨細胞又は骨細胞を極めて多量に製造できるため、本発明により、軟骨疾患又は骨疾患の治療に用いるのに十分な量の軟骨細胞を迅速に製造することができる。
　本出願は、日本で出願された特願２０１９－０９４８７８（出願日：２０１９年５月２０日）を基礎としておりその内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (12)

  1. 　軟骨又は骨の前駆細胞を、TGF-βシグナル阻害剤及びFGFを含む培地中で培養する工程を含む、軟骨又は骨の前駆細胞の拡大培養方法。
  2. 　前記軟骨又は骨の前駆細胞がPDGFRA、SOX9、若しくはPAX1を発現する細胞である、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記TGF-βシグナル阻害剤がSB431542である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記FGFがbFGFである、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　前記軟骨又は骨の前駆細胞が多能性幹細胞に由来する細胞である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　前記軟骨又は骨の前駆細胞が多能性幹細胞を浮遊培養することで得られる細胞である、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　拡大培養が浮遊培養により行われる、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　基礎培地、TGF-βシグナル阻害剤及びFGFを含む、軟骨又は骨の前駆細胞の拡大培養用キット。
  9. 　前記TGF-βシグナル阻害剤がSB431542である、請求項８に記載のキット。
  10. 　前記FGFがbFGFである、請求項８又は９に記載のキット。
  11. 　請求項１～７のいずれか１項に記載の方法で得られた軟骨又は骨の前駆細胞を、軟骨細胞又は骨細胞へ分化誘導させる工程を含む、軟骨細胞又は骨細胞の製造方法。
  12. 　請求項１～７のいずれか１項に記載の方法で得られた軟骨又は骨の前駆細胞を、靭帯節細胞へ分化誘導させる工程を含む、靭帯節細胞の製造方法。
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