WO2022196613A1 - 椎板細胞の製造方法および該椎板細胞の利用 - Google Patents

椎板細胞の製造方法および該椎板細胞の利用 Download PDF

Info

Publication number
WO2022196613A1
WO2022196613A1 PCT/JP2022/011216 JP2022011216W WO2022196613A1 WO 2022196613 A1 WO2022196613 A1 WO 2022196613A1 JP 2022011216 W JP2022011216 W JP 2022011216W WO 2022196613 A1 WO2022196613 A1 WO 2022196613A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
tissue
test substance
cells
vertebral disc
mammal
Prior art date
Application number
PCT/JP2022/011216
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
伸介 大庭
彰一郎 谷
宏徳 北條
雄一 鄭
Original Assignee
国立大学法人 長崎大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立大学法人 長崎大学 filed Critical 国立大学法人 長崎大学
Priority to JP2023507085A priority Critical patent/JPWO2022196613A1/ja
Publication of WO2022196613A1 publication Critical patent/WO2022196613A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing vertebral disc cells from pluripotent stem cells and use of the produced vertebral disc cells.
  • Non-Patent Document 1 A method for efficiently forming osteoblasts through germ layer formation was developed (Non-Patent Document 1). Furthermore, we succeeded in extending this method to a three-dimensional culture system (Non-Patent Document 2).
  • Kanke K et al. Stem Cell Reports. 2014 May 22;2(6):751-60. doi: 10.1016/j.stemcr.2014.04.016. Zujur D et al., Sci Adv. 2017 May 12;3(5):e1602875. doi: 10.1126/sciadv.1602875.
  • a method for producing vertebral disc cells from pluripotent stem cells in a xeno-free and feeder-free culture system comprising the following steps (1) to (4): (1) a step of culturing pluripotent stem cells in a first differentiation medium containing only a Wnt signal activator as an inducer; (2) activating Wnt signals using the cells cultured in step (1) as an inducer (3) the cells cultured in step (2) are treated with a Wnt signal inhibitor and TGF ⁇ as inducers; a step of exchanging to a third differentiation medium containing only a signal inhibitor and a BMP signal inhibitor and culturing, and (4) the cells cultured in step (3) are treated with a hedgehog signal activator as an inducer, and The step of replacing with a fourth differentiation medium containing only at least one selected from the group consisting of BMP signal inhibitors and Wnt signal inhibitors and culturing.
  • the culture period in step (1) is until it is confirmed that the cells express at least one marker selected from the group consisting of TBXT and MIXL1, and the culture period in step (2) is , until it is confirmed that the cells express at least one marker selected from the group consisting of TBX6 and MSGN1, and the culture period in step (3) is longer than the group consisting of PARAXIS, PAX3 and FOXC2. Until it is confirmed that at least one selected marker is expressed, and the culture period in step (4) is that the cells are selected from the group consisting of PAX1, PAX9, SOX9 and NKX3.2.
  • [8] A step of producing vertebral disc cells by the method according to any one of [1] to [6] above, and three-dimensionally culturing the obtained vertebral disc cells in chondrogenic basal medium containing no cartilage-inducing factor.
  • a method for producing cartilage tissue comprising: [9] A step of producing vertebral disc cells by the method according to any one of [1] to [6] above, and treating the obtained vertebral disc cells in a chondrogenic basal medium containing or not containing a cartilage-inducing factor for three-dimensional
  • a method for producing an endochondral ossified tissue comprising the steps of culturing to produce a cartilage tissue, and three-dimensionally culturing the cartilage tissue in an osteogenic basal medium containing or not containing an osteoinductive factor.
  • a method of screening for a chondrogenesis-regulating substance comprising the step of [11] A step of producing vertebral disc cells by the method according to any one of [1] to [6] above, a step of transplanting the obtained vertebral disc cells into a mammal other than human, and a test substance in the mammal and extracting the vertebral disc cell-derived tissue transplanted from the mammal, increasing or decreasing the amount of cartilage in the transplanted tissue compared to the transplanted tissue excised from the mammal to which the test substance has not been administered.
  • a method of screening for a chondrogenesis-regulating substance comprising the step of selecting a test substance that induces cartilage formation.
  • a step of producing vertebral disc cells by the method according to any one of [1] to [6] above, a step of transplanting the obtained vertebral disc cells into a mammal other than human, and a step of transplanting the obtained vertebral disc cells from the mammal A step of extracting a vertebral disc cell-derived tissue and transferring it to a culture system, a step of contacting the implanted tissue with a test substance, and increasing or decreasing the amount of cartilage in the implanted tissue compared to the implanted tissue not in contact with the test substance.
  • a method of screening for a chondrogenesis-regulating substance comprising the step of selecting a test substance that induces cartilage formation.
  • a step of three-dimensional culture in the presence or absence of a substance to form bone tissue, and a test substance that increases or decreases bone mass in the bone tissue compared to the bone tissue formed in the absence of the test substance A method of screening for an osteogenesis-regulating substance, comprising the step of selecting.
  • a method of screening for an osteogenesis-regulating substance comprising the step of selecting a test substance that induces an osteogenesis.
  • a step of producing vertebral disc cells by the method according to any one of [1] to [6] above, a step of transplanting the obtained vertebral disc cells into a mammal other than a human, and a step of transplanting the obtained vertebral disc cells from the mammal A step of extracting a vertebral disc cell-derived tissue and transferring it to a culture system, a step of contacting the implanted tissue with a test substance, and increasing or decreasing the bone mass of the implanted tissue compared to the implanted tissue not in contact with the test substance.
  • a method of screening for an osteogenesis-regulating substance comprising the step of selecting a test substance that induces an osteogenesis.
  • a screening method for an osteogenesis-regulating substance comprising the step of selecting [17] ZEB2 and RUNX2 expression levels, ZEB2 and SP7 expression levels, or ZEB2 and RUNX2 and SP7 in bone tissue formed in the presence of the test substance compared to bone tissue formed in the absence of the test substance
  • the screening method for an osteogenesis-regulating substance according to [16] above which comprises the step of selecting a test substance that simultaneously increases or decreases the expression level of .
  • [18] a step of producing vertebral disc cells by the method according to any one of claims 1 to 6, a step of transplanting the obtained vertebral disc cells into a mammal other than human, and administering a test substance to the mammal; administering, extracting tissue derived from vertebral disc cells transplanted from the mammal, and increasing or decreasing the ZEB2 expression level in the transplanted tissue compared to the transplanted tissue excised from a mammal to which the test substance has not been administered.
  • a method of screening for an osteogenesis-regulating substance comprising the step of selecting a test substance that induces an osteogenesis.
  • the screening method for an osteogenesis-regulating substance according to [18] above which comprises the step of selecting a test substance that simultaneously increases or decreases the expression levels of ZEB2, RUNX2, and SP7.
  • a step of producing vertebral disc cells by the method according to any one of [1] to [6] above, a step of transplanting the obtained vertebral disc cells into a mammal other than human, and a step of transplanting the obtained vertebral disc cells from the mammal A step of removing vertebral disc cell-derived tissue and transferring it to a culture system, a step of contacting the implanted tissue with a test substance, and increasing or increasing the ZEB2 expression level of the implanted tissue compared to the implanted tissue not in contact with the test substance.
  • a method of screening for an osteogenesis-regulating substance comprising the step of selecting a test substance that reduces the test substance.
  • vertebral disc cells can be easily produced from pluripotent stem cells in a xeno-free and feeder-free culture system.
  • the vertebral disc cells produced according to the present invention can be three-dimensionally cultured in a chondrogenic basal medium containing no cartilage-inducing factor to produce cartilage tissue, and furthermore, the basal osteogenic medium containing no osteoinductive factor can be used to produce cartilage tissue.
  • Endochondral ossified tissue can be produced by three-dimensional culturing using.
  • Vertebral disc cells obtained from human iPS cells by the production method of the present invention were transplanted under the renal capsule of NOD SCID mice, and the calcified tissue at the transplantation site was subjected to X-ray micro-CT over time from 4 to 26 weeks after transplantation. It is a figure which shows the image image
  • Vertebral disc cells obtained from human iPS cells by the production method of the present invention were transplanted under the renal capsule of NOD SCID mice, and H-E stained specimens and Safranin O stained specimens of calcified tissue at the transplant site were observed 18 weeks after transplantation. It is a figure which shows a result. Vertebral disc cells obtained from human iPS cells by the production method of the present invention were transplanted under the renal capsule of NOD SCID mice, and 18 weeks after transplantation, the calcified tissue at the transplantation site was immunostained using an anti-human nuclear antibody. It is a figure which shows the result of observation. Fig.
  • FIG. 2 shows the results of transplanting vertebral disc cells obtained from human iPS cells by the production method of the present invention under the renal capsule of NOD SCID mice, and observing Oil Red O-stained specimens of calcified tissue at the transplant site 18 weeks after transplantation. It is a diagram. Vertebral disc cells obtained from human ES cells by the production method of the present invention (Day 5) were cultured in chondrogenic basal medium containing chondrogenic factors or chondrogenic basal medium containing no chondrogenic factors (Day 42). ) is a diagram showing the results of observing an H-E stained specimen.
  • Vertebral disc cells (Day 5) obtained from human ES cells by the production method of the present invention are cultured in a chondrogenic basal medium containing an osteoinductive factor, and on Day 42, the basal osteogenic medium is replaced with an osteoinductive factor-free basal medium.
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of observing Safranin O-stained specimens and von Kossa-stained specimens of cell clusters cultured until Day 70.
  • FIG. Vertebral disc cells (Day 5) obtained from human ES cells by the production method of the present invention are cultured in a chondrogenic basal medium containing or not containing an osteoinductive factor, and on Day 42, the osteogenic basal medium containing an osteoinductive factor is cultured.
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of observation of safranin O-stained specimens and von Kossa-stained specimens of cell masses cultured until Day 70 after exchanging to .
  • Vertebral disc cells Day 5 obtained from human ES cells by the production method of the present invention are cultured in a chondrogenic basal medium containing or not containing a cartilage-inducing factor, and on Day 42 bone cells containing or not containing an osteoinductive factor are cultured.
  • FIG. 10 is a diagram showing an X-ray image of a cell cluster cultured in a formation basal medium on Day 100.
  • Vertebral disc cells obtained by the production method of the present invention from human ES cells using the synthetic medium of Example 1, and the number of vertebral disc cells obtained by inducing differentiation from human ES cells using fetal bovine serum-containing medium It is a figure which shows the result of having compared the number.
  • Vertebral disc cells obtained from human iPS cells or human ES cells by the production method of the present invention were transplanted under the renal capsule of NOD SCID mice. Single-cell RNA sequence analysis was performed on human iPS cell-derived endochondral ossified tissue collected at 7 and 19 weeks after transplantation, and multiohm analysis was performed on human ES cell-derived endochondral ossified tissue collected at 20 weeks after transplantation.
  • FIG. 2 shows the results of searching for novel osteogenic transcription factors.
  • Human mesenchymal stem cells were infected with a lentivirus expressing shRNA against ZEB2 and cultured.
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of comparison with the expression levels of cells in a virus-infected group. Human mesenchymal stem cells were infected with a retrovirus that expresses the ZEB2 gene and cultured, and the expression levels of ZEB2, RUNX2, and SP7 genes at the start of osteoblast differentiation induction and 14 days after differentiation induction were measured by GFP-expressing retrovirus infection.
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of comparison with the expression levels of cells in a group.
  • the present invention provides a method for producing vertebral disc cells from pluripotent stem cells in a xeno-free and feeder-free culture system (hereinafter referred to as "the production method of the present invention").
  • the sclerotome is also called the sclerotome.
  • the production method of the present invention may include the following steps (1) to (4).
  • Pluripotent stem cells that can be used in the production method of the present invention are stem cells that have pluripotency capable of differentiating into all cells existing in a living body and that also have proliferative ability.
  • Potential stem (iPS) cells embryonic stem (ES) cells, cloned embryo-derived embryonic stem (ntES) cells obtained by nuclear transfer, spermatogonial stem (GS) cells, embryonic germ (EG) cells, cultured fibers Blast cells and pluripotent cells (Muse cells) derived from bone marrow stem cells are included.
  • Preferred pluripotent stem cells are iPS cells or ES cells.
  • iPS cells can be produced by introducing specific reprogramming factors into somatic cells in the form of DNA or protein, and have almost the same properties as ES cells, such as pluripotency and self-renewal proliferation ability.
  • ES cells such as pluripotency and self-renewal proliferation ability.
  • iPS cell lines established by the US National Institutes of Health (NIH), RIKEN (RIKEN), Kyoto University, etc. can be used as iPS cells.
  • RIKEN's HiPS-RIKEN-1A, HiPS-RIKEN-2A, HiPS-RIKEN-12A, Nips-B2, etc. Kyoto University's AK5, TkDN-Sev2, 692D2 strain, 253G1 strain, 201B7 strain, 409B2 strain, 454E2 strain, 606A1 strain, 610B1 strain, 648A1 strain, 1231A3 strain, 1390D4 strain, 1390C1 strain, and the like.
  • clinical grade cell lines provided by Kyoto University, Cellular Dynamics International, etc., and research and clinical cell lines produced using these cell lines may be used.
  • ES cells are stem cells with pluripotency and the ability to proliferate through self-renewal, established from the inner cell mass of early mammalian embryos (for example, blastocysts) such as humans and mice.
  • ES cells are embryo-derived stem cells derived from the inner cell mass of the blastocyst, which is the 8-cell stage of a fertilized egg and the post-morula embryo. and have the ability to proliferate by self-renewal.
  • ES cells were discovered in mice in 1981 (M.J. Evans and M.H. Kaufman (1981), Nature 292:154-156), and later ES cell lines were established in primates such as humans and monkeys (J.A. Thomson et al. al.
  • ES cell lines As mouse ES cells, various mouse ES cell lines established by inGenious, RIKEN (RIKEN), etc. can be used.
  • Various human ES cell lines established by the US National Institutes of Health (NIH), RIKEN, Kyoto University, and Cellartis can be used as human ES cells.
  • ES cell lines include CHB-1 to CHB-12 strains, RUES1 strain, RUES2 strain, HUES1 to HUES28 strains of NIH, WA01 (H1) strain, WA09 (H9) strain of WisCell Research Institute, KhES- 1 strain, KhES-2 strain, KhES-3 strain, KhES-4 strain, KhES-5 strain, SSES1 strain, SSES2 strain, SSES3 strain, etc.
  • KhES-1 strain, KhES-2 strain, KhES-3 strain and KthES11 strain are available from Institute for Frontier Medical Sciences, Kyoto University.
  • pluripotent stem cells are cultured in a first differentiation medium containing only Wnt signal activators as inducers.
  • a basal medium of the differentiation medium for example, DMEM/F12, DMEM, etc. can be used, but not limited thereto.
  • the basal medium may be supplemented with insulin-transferrin-sodium selenite (ITS) supplement, non-essential amino acids (NEAA), 2-mercaptoethanol, B27 serum-free supplement, and the like.
  • ITS insulin-transferrin-sodium selenite
  • NEAA non-essential amino acids
  • 2-mercaptoethanol B27 serum-free supplement
  • concentration of ITS supplements is usually between 0% and 2%, preferably about 1%.
  • the concentration of NEAA is usually 0% to 2%, preferably about 1%.
  • the concentration of 2-mercaptoethanol is usually 0 ⁇ M to 100 ⁇ M, preferably about 55 ⁇ M.
  • concentration of the B27 serum-free supplement is usually 0%-2%, preferably about 1%.
  • the same basal medium can be used in steps (1) to (4).
  • Wnt signal activators examples include CHIR99021 (CHIR, CAS No. 252917-06-9), CHIR98014 (CAS No. 252935-94-7), WAY-316606 (CAS No. 915759-45-4), IQ-1 (CAS No. 331001-62-8), QS11 (CAS No. 944328-88-5), SB216763 (CAS No. 280744-09-4), BIO (CAS No. 667463-62-9), LY2090314 (CAS No. 603288-22-8), TWS119 (CAS No. 601514-19-6), Tideglusib (CAS No. 865854-05-3), SB415286 (CAS No. 264218-23-7), etc. be done.
  • the Wnt signal activator is not a recombinant protein.
  • its concentration is usually 0.01 ⁇ M to 30 ⁇ M, preferably about 5 ⁇ M.
  • Pluripotent stem cells maintained and cultured according to a standard method are dispersed into single cells or microclumps, the cell dispersion prepared using maintenance medium is seeded on a plate, cultured overnight, and then the medium is changed to the first differentiation medium. to start step (1).
  • the pluripotent stem cells maintained and cultured according to a standard method are dispersed into single cells or microclumps, and the cell dispersion prepared using the first differentiation medium is seeded on a plate to initiate step (1). good.
  • Step (1) is a step of differentiating a pluripotent stem cell into an anterior primitive streak. Differentiation into the anterior primitive streak can be confirmed by expression of at least one of the anterior primitive streak markers TBXT (T-box transcription factor T) and MIXL1 (Mix paired-like homeobox). . Therefore, step (1) is preferably continued until expression of at least one of TBXT and MIXL1 is confirmed. Marker expression can be confirmed by known methods such as RT-PCR and Western blotting.
  • the nucleotide and amino acid sequences of human TBXT, human TBX6 and human MIXL1 can be obtained under the following NCBI accession numbers.
  • Human TBXT base sequence NM_003181.4
  • Human MIXL1 nucleotide sequence NM_001282402.2, amino acid sequence NP_001269331.1
  • the culture time in step (1) may be 12 hours, 14 hours, 16 hours, 18 hours, 20 hours, 22 hours or more.
  • the culture time in step (1) may be 36 hours, 34 hours, 32 hours, 30 hours, 28 hours, 26 hours or less. Preferably it is about 24 hours.
  • step (2) the cells cultured in step (1) are replaced with a second differentiation medium containing only the Wnt signal activator, TGF ⁇ signal inhibitor and BMP signal inhibitor as inducers and cultured.
  • the same Wnt signal activator as used in the first differentiation medium may be used.
  • TGF ⁇ signal inhibitors include A83-01 (CAS No. 909910-43-6), LY364947 (CAS No. 396129-53-6), SB431542 (CAS No. 301836-41-9), LY2157299 (CAS No. 700874-72-2), LY2109761 (CAS No. 700874-71-1), SB525334 (CAS No. 356559-20-1), SB505124 (CAS No. 694433-59-5), GW788388 (CAS No.
  • BMP signal inhibitors include LDN-193189 (CAS No. 1062368-24-4), Dorsomorphin (CAS No. 866405-64-3), DMH1 (CAS No. 1206711-16-1), K02288 (CAS No. 1431985-92-0) and the like.
  • none of the Wnt signal activators, TGF ⁇ signal inhibitors and BMP signal inhibitors are recombinant proteins.
  • CHIR a Wnt signal activator
  • its concentration is usually 0.01 ⁇ M to 30 ⁇ M, preferably about 5 ⁇ M.
  • A83-01 When used as a TGF ⁇ signal inhibitor, its concentration is usually 0.01 ⁇ M to 10 ⁇ M, preferably about 1 ⁇ M. When using LDN-193189 as a BMP signal inhibitor, its concentration is usually 0.005 ⁇ M to 2 ⁇ M, preferably about 0.25 ⁇ M.
  • Step (2) is initiated by replacing the first differentiation medium with a second differentiation medium.
  • Cells may be washed with PBS or the like at the time of medium exchange.
  • Step (2) is a step of differentiating the anterior primitive streak into paraxial mesoderm. Differentiation into paraxial mesoderm can be confirmed by expression of at least one of paraxial mesoderm markers TBX6 (T-box transcription factor 6) and MSGN1 (mesogenin-1). Therefore, step (2) is preferably continued until expression of at least one of TBX6 and MSGN1 is confirmed. Marker expression can be confirmed by known methods such as RT-PCR and Western blotting.
  • the nucleotide and amino acid sequences of human TBX6 and human MSGN1 can be obtained under the following NCBI accession numbers.
  • Human TBX6 base sequence NM_004608.4, amino acid sequence NP_004599.2
  • Human MSGN1 nucleotide sequence NM_001105569.3, amino acid sequence NP_001099039.1
  • the culture time in step (2) may be 12 hours, 14 hours, 16 hours, 18 hours, 20 hours, 22 hours or more.
  • the culture time in step (2) may be 36 hours, 34 hours, 32 hours, 30 hours, 28 hours, 26 hours or less. Preferably it is about 24 hours.
  • step (3) the cells cultured in step (2) are replaced with a third differentiation medium containing only Wnt signal inhibitors, TGF ⁇ signal inhibitors and BMP signal inhibitors as inducers and cultured. Both the TGF ⁇ signal inhibitor and the BMP signal inhibitor may be the same as those used in the second differentiation medium.
  • Wnt signal inhibitors include Wnt-C59 (C59, CAS No. 1243243-89-1), IWR-1-endo (CAS No. 1127442-82-3), IWP-2 (CAS No. 686770-61- 6), IWP-4 (CAS No. 686772-17-8), XAV-939 (CAS No. 284028-89-3), etc.
  • none of the Wnt signal inhibitors, TGF ⁇ signal inhibitors and BMP signal inhibitors are recombinant proteins.
  • C59 its concentration is usually 10 pM to 2 ⁇ M, preferably about 1 ⁇ M.
  • A83-01 is used as a TGF ⁇ signal inhibitor, its concentration is usually 0.01 ⁇ M to 10 ⁇ M, preferably about 1 ⁇ M.
  • TGF ⁇ signal inhibitor its concentration is usually 0.01 ⁇ M to 10 ⁇ M, preferably about 1 ⁇ M.
  • LDN-193189 as a BMP signal inhibitor
  • its concentration is usually 0.005 ⁇ M to 2 ⁇ M, preferably about 0.25 ⁇ M.
  • Step (3) is initiated by replacing the second differentiation medium with a third differentiation medium.
  • Cells may be washed with PBS or the like at the time of medium exchange.
  • Step (3) is a step of differentiating paraxial mesoderm into somites. Somite differentiation is confirmed by expression of at least one of somite markers PARAXIS (transcription factor 15), MESP2 (mesoderm posterior protein 2), PAX3 (paired box 3) and FOXC2 (forkhead box C2) can do. Therefore, step (3) is preferably continued until expression of at least one of PARAXIS, MESP2, PAX3 and FOXC2 is confirmed. Marker expression can be confirmed by known methods such as RT-PCR and Western blotting.
  • human PARAXIS nucleotide sequence NM_004609.4, amino acid sequence NP_004600.3
  • Human MESP2 nucleotide sequence NM_001039958.2, amino acid sequence NP_001035047.1
  • Human PAX3 base sequence NM_181457.4, amino acid sequence NP_852122.1
  • Human FOXC2 nucleotide sequence NM_005251.3, amino acid sequence NP_005242.1
  • the culture time in step (3) may be 12 hours, 14 hours, 16 hours, 18 hours, 20 hours, 22 hours or more.
  • the culture time in step (3) may be 36 hours, 34 hours, 32 hours, 30 hours, 28 hours, 26 hours or less. Preferably it is about 24 hours.
  • the cells cultured in step (3) contain only at least one selected from the group consisting of hedgehog signal activators, BMP signal inhibitors, and Wnt signal inhibitors as inducers.
  • the inducer contained in the fourth differentiation medium may be only the hedgehog signal activator and the BMP signal inhibitor, may be only the hedgehog signal activator and the Wnt signal inhibitor, or may be the hedgehog signal activator and the BMP.
  • a signal inhibitor and a Wnt signal inhibitor alone may be used.
  • the same BMP signal inhibitor as used in the second and third differentiation media may be used, and the same Wnt signal inhibitor as used in the third differentiation medium may be used.
  • Hedgehog signal activators include Smoothened Agonist (SAG, CAS No.
  • none of the hedgehog signal activator, BMP signal inhibitor and Wnt signal inhibitor are recombinant proteins.
  • SAG As a hedgehog signal activator, its concentration is usually 0.001 ⁇ M to 1 ⁇ M, preferably about 1 ⁇ M.
  • LDN-193189 As a BMP signal inhibitor, its concentration is usually 0.005 ⁇ M to 2 ⁇ M, preferably about 0.25 ⁇ M.
  • C59 As a Wnt signal inhibitor, its concentration is usually 10 pM to 2 ⁇ M, preferably about 1 ⁇ M.
  • Step (4) is initiated by replacing the third differentiation medium with a fourth differentiation medium.
  • Cells may be washed with PBS or the like at the time of medium exchange.
  • Step (4) is the step of differentiating the somites into sclerotomes.
  • Disc differentiation was confirmed by the expression of at least one of the vertebral disc markers PAX1 (paired box 1), PAX9 (paired box 9), SOX9 (SRY-box transcription factor 9) and NKX3.2 (NK3 homeobox 2). can be confirmed by Therefore, step (3) is preferably continued until expression of at least one of PAX1, PAX9, FOXC2, SOX9 and Nkx3.2 is confirmed. Marker expression can be confirmed by known methods such as RT-PCR and Western blotting.
  • nucleotide and amino acid sequences of human PAX1, human PAX9, human SOX9 and human NKX3.2 can be obtained under the following NCBI accession numbers.
  • Human PAX1 nucleotide sequence NM_006192.5, amino acid sequence NP_006183.2
  • Human PAX9 nucleotide sequence NM_006194.4, amino acid sequence NP_006185.1
  • Human SOX9 base sequence NM_000346.4
  • Human Nkx3.2 base sequence NM_001189.4, amino acid sequence NP_001180.1
  • the culture time in step (4) may be 36 hours, 38 hours, 40 hours, 42 hours, 44 hours, 46 hours or longer.
  • the culture time in step (2) may be 84 hours, 82 hours, 80 hours, 78 hours, 76 hours, 74 hours or less. Preferably from about 48 to about 72 hours.
  • the production method of the present invention can be carried out in a culture environment that satisfies xeno-free conditions that eliminate heterologous components from the culture system and feeder-free conditions that do not use feeder cells. Therefore, vertebral disc cells produced in a xeno-free and feeder-free culture system using the production method of the present invention are suitable for human transplantation.
  • the present invention provides a method for producing cartilage tissue.
  • the method for producing cartilage tissue of the present invention may comprise a step of three-dimensionally culturing the vertebral disc cells produced by the method of the present invention in a chondrogenic basal medium containing no cartilage-inducing factors.
  • Cartilage-inducing factors include Transforming Growth Factor- ⁇ 1 (TGF- ⁇ 1), Bone Morphogenetic Protein-2 (BMP-2), Bone Morphogenetic Protein-4 (BMP-2).
  • BMP-4 BMP-4
  • Growth Differentiation Factor-5 (GDF-5) insulin, chondrogenic compound TD-198946, etc.
  • the method for producing cartilage tissue of the present invention can be carried out using a chondrogenic basal medium containing no cartilage-inducing factor in a known cartilage-inducing method by three-dimensional culture.
  • Known cartilage induction methods by three-dimensional culture include, for example, Matsuda et al. Method, Yamashita et al. (Stem Cell Reports. 2015 Mar 10;4(3):404-18. doi: 10.1016/j.stemcr.2015.01.016. Epub 2015 Feb 26.), Yamashita et al. 25;513(7519):507-11), Makay et al. (Tissue Eng. 1998;4(4):415-28), Oldershaw et al. (Nat Biotechnol, 2010 Nov;28(11):1187- 94.), the method of Nasu et al. (PLoS One. 2013; 8(1): e53771), the method of Hino et al. etc.
  • the method of cartilage induction by three-dimensional culture may be a partially modified method of Matsuda et al. (Nature. 2020). Specifically, for example, vertebral disc cells produced by the production method of the present invention are suspended in a vertebral disc induction medium containing a ROCK inhibitor, seeded on a low-adhesion surface plate to form three-dimensional cell aggregates, and cartilage. A method of culturing by replacing the medium with a chondrogenic basal medium containing no formation factor may also be used.
  • the method of cartilage induction by three-dimensional culture may be a partially modified method of Yamashita et al. (Stem Cell Reports. 2015).
  • the medium of vertebral disc cells produced by the production method of the present invention is replaced with a chondrogenic basal medium containing no chondrogenic factor and cultured until cartilage nodules are formed.
  • a method of peeling off the plate and transferring to a low-adhesion surface plate for suspension culture may also be used.
  • the chondrogenic basal medium may be appropriately selected from known chondrogenic basal mediums and used.
  • the basal chondrogenic medium used in Example 3 of the present specification the basal chondrogenic medium described in each document exemplified as the known cartilage induction method by three-dimensional culture, etc. can be used.
  • the method for producing cartilage tissue of the present invention can be carried out in a culture environment that satisfies xeno-free conditions and feeder-free conditions. It is suitable as
  • the present invention provides a method for producing endochondral ossified tissue.
  • a first embodiment of the method for producing endochondral ossified tissue of the present invention comprises the steps of transplanting vertebral disc cells produced by the production method of the present invention into a mammal other than human, and transplanting the cells from the mammal. Any method may be used as long as it includes a step of extracting tissue derived from vertebral disc cells. Mammals other than humans are not particularly limited, but immunodeficient animals are preferably used when using vertebral disc cells differentiated from human pluripotent stem cells. As immunodeficient animals, commercially available immunodeficient mice, immunodeficient rats, and immunodeficient pigs can be used.
  • the transplantation site is not particularly limited, but it is preferably a site where the transplanted tissue is likely to be formed. Specific examples include, for example, under the renal capsule, within the subcutaneous tissue, within and around bone/cartilage tissue.
  • Transplantation of vertebral disc cells can be performed by preparing a cell suspension of vertebral disc cells produced by the production method of the present invention and injecting the cell suspension into the implantation site using a syringe or the like.
  • the formation of tissue derived from the transplanted vertebral disc cells can be confirmed by, for example, acquiring images over time by X-ray microcomputed tomography (X-ray microCT) and observing the formation and growth of calcified tissue. can be confirmed by
  • the method of removing tissue derived from vertebral disc cells transplanted from a mammal is not particularly limited, it is preferable to use a general surgical technique under anesthesia or after euthanizing the mammal.
  • a general surgical technique under anesthesia or after euthanizing the mammal.
  • the endochondral ossified tissue may be removed at a time suitable for the purpose of use, based on the degree of formation and growth of the calcified tissue.
  • the excised endochondral ossified tissue can be immersed in an appropriate physiological buffer or medium and used for various purposes.
  • the vertebral disc cells produced by the method of the present invention are three-dimensionally cultured in a chondrogenic basal medium containing or not containing a cartilage-inducing factor. and three-dimensionally culturing the cartilage tissue in an osteogenic basal medium containing or not containing an osteoinductive factor to produce an endochondral ossified tissue.
  • the step of three-dimensionally culturing the vertebral disc cells produced by the production method of the present invention in a chondrogenic basal medium containing or not containing a cartilage-inducing factor to produce cartilage tissue is the same as the method for producing cartilage tissue of the present invention.
  • the method or the method for producing cartilage tissue of the present invention can be carried out by a method using a chondrogenic basal medium containing a cartilage-inducing factor.
  • Cartilage-inducing factors include TGF- ⁇ 1, BMP-2, BMP-4, GDF-5, insulin, TD-198946, and the like.
  • the step of three-dimensionally culturing the obtained cartilage tissue in an osteogenic basal medium containing or not containing an osteoinductive factor to produce an endochondral ossified tissue is a known method for three-dimensionally culturing cartilage tissue to induce osteogenesis.
  • a method of exchanging the basal chondrogenic medium used to form cartilage tissue with a basal osteogenic medium and subsequently three-dimensionally culturing the medium can be used.
  • the basal osteogenic medium may be appropriately selected from known basal osteogenic mediums and used.
  • osteogenic basal medium used in Example 3 herein osteogenic basal medium described in Buttery et al. (Tissue Eng 2001 Feb;7(1):89-99.), Kawaguchi et al. (Bone 2005 May; 36(5):758-69), osteogenic basal medium as described in Ohba et al. (FASEB J. 2007 Jun;21(8):1777-87), Kanke et al. (Stem Cell Reports. 2014 May 22;2(6):751-60) and the like.
  • the osteogenic basal medium may or may not contain an osteoinductive factor.
  • Osteogenic factors include bone morphogenetic protein-2 (BMP-2), hedgehog signal activators (e.g., Smoothened Agonist (SAG), etc.), Wnt protein, fibroblast growth factor-2 (FGF-2), Examples include polyunsaturated fatty acid (PUFA), HMG-CoA reductase inhibitors such as statins, and helioxanthine analogues.
  • BMP-2 bone morphogenetic protein-2
  • hedgehog signal activators e.g., Smoothened Agonist (SAG), etc.
  • Wnt protein fibroblast growth factor-2
  • FGF-2 fibroblast growth factor-2
  • PUFA polyunsaturated fatty acid
  • HMG-CoA reductase inhibitors such as statins
  • helioxanthine analogues helioxanthine analogues.
  • endochondral ossified tissue is produced using a basal chondrogenic medium containing no cartilage-inducing factor and a basal osteogenic medium containing no osteoinductive factor. It has the advantage of being manufacturable. Therefore, the second embodiment of the method for producing endochondral ossified tissue of the present invention has the advantages of being able to reduce costs, simplifying the procedure, and producing homogeneous endochondral ossified tissue.
  • the method for producing endochondral ossified tissue of the present invention can be carried out in a culture environment satisfying xeno-free conditions and feeder-free conditions. Therefore, endochondral ossified tissue produced by the method for producing endochondral ossified tissue of the present invention can be performed.
  • the tissue is suitable for bioimplantation into humans.
  • the endochondral ossified tissue produced by the method for producing an endochondral ossified tissue of the present invention can be used for research on the molecular mechanism of bone formation in the developmental process, research on the pathology of bone diseases, screening for therapeutic agents for bone diseases, and the like. It can be used preferably.
  • the present invention provides a screening method for a chondrogenesis-regulating substance and a screening method for an osteogenesis-regulating substance.
  • the test substance to be subjected to the screening method of the present invention is not particularly limited, and includes nucleic acids, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, cell culture supernatants, plant extracts, mammals. tissue extract, blood plasma, or the like.
  • a test substance may be a novel substance or a known substance. These test substances may form salts.
  • the salt of the test substance is preferably a salt with a physiologically acceptable acid or base.
  • the present invention provides a screening method for a chondrogenesis-regulating substance.
  • the vertebral disc cells produced by the production method of the present invention are treated with a chondrogenic basal medium containing no cartilage-inducing factor to detect the presence of a test substance.
  • a chondrogenic basal medium containing no cartilage-inducing factor to detect the presence of a test substance.
  • a step of three-dimensionally culturing vertebral disc cells produced by the production method of the present invention using a chondrogenic basal medium containing no cartilage-inducing factor in the presence or absence of a test substance to form cartilage tissue ( The first step) can be performed by adding the test substance to the chondrogenic basal medium in the same method as the method for producing cartilage tissue of the present invention.
  • the timing of adding the test substance to the chondrogenic basal medium may be at the same time as the start of the first step, or after a certain period of time has elapsed since the start of the first step.
  • the period during which the vertebral disc cells and the test substance are in contact may be the entire period of the first step or a partial period of the first step.
  • the amount of cartilage in the cartilage tissue formed in the absence of the test substance is selected in the step of selecting a test substance that increases or decreases the amount of cartilage in the cartilage tissue compared to the cartilage tissue formed in the absence of the test substance (second step), the amount of cartilage in the cartilage tissue formed in the absence of the test substance and the amount of cartilage formed in the presence of the test substance.
  • a tissue sample of cartilage tissue is prepared and stained with safranin O, and the area of the stained region is compared. It can be performed by quantification of cartilage volume or the like.
  • a test substance that increases the amount of cartilage in cartilage tissue formed in the presence of the test substance compared to cartilage tissue formed in the absence of the test substance can be selected as a substance that promotes cartilage formation.
  • the extent to which the test substance increases the amount of cartilage is not particularly limited, but is, for example, 120% or more, 130% or more, 140% or more, 150% or more, or 170% or more compared to cartilage tissue formed in the absence of the test substance. , 180% or greater, 190% or greater, or 200% or greater.
  • a test substance that reduces the amount of cartilage in cartilage tissue formed in the presence of the test substance compared to cartilage tissue formed in the absence of the test substance can be selected as a substance that suppresses cartilage formation.
  • the extent to which the test substance reduces the amount of cartilage is not particularly limited, but is, for example, 90% or less, 80% or less, 70% or less, 60% or less, or 50% or less compared to cartilage tissue formed in the absence of the test substance. may be selected to reduce test substances to
  • a second embodiment of the screening method for a chondrogenesis-regulating substance of the present invention comprises a step of transplanting vertebral disc cells produced by the production method of the present invention into a mammal other than human, administering a test substance to the mammal. extracting the vertebral disc cell-derived tissue transplanted from the mammal, and a test substance that increases or decreases the amount of cartilage in the transplanted tissue as compared to the transplanted tissue excised from a mammal to which the test substance has not been administered. It is sufficient if it includes a step of selecting.
  • the step of transplanting the vertebral disc cells produced by the production method of the present invention into mammals other than humans is the same as in the first embodiment of the method for producing endochondral ossified tissue of the present invention. It can be carried out.
  • the step of administering the test substance to the mammal (second step), the test substance is administered to the mammal to which the vertebral disc cells were transplanted in the first step.
  • Administration may be systemic administration such as oral administration, intravenous administration, or intraperitoneal administration, or local administration at or near the site of transplantation.
  • the dose, administration period, administration frequency, administration period, and the like are appropriately set according to the test substance used.
  • the step of extracting tissue derived from vertebral disc cells transplanted from a mammal can be performed by the same method as in the first embodiment of the method for producing endochondral ossified tissue of the present invention.
  • the timing of extraction is not particularly limited, but is preferably when the amount of cartilage in the transplanted vertebral disc cell-derived tissue has increased to a comparable level. It is preferable to set the extraction timing by performing a preliminary examination.
  • step 4 the mammal to which the test substance has not been administered.
  • the amount of cartilage in the transplanted tissue excised from the animal is compared with the amount of cartilage in the transplanted tissue excised from the mammal to which the test substance is administered.
  • the amount of cartilage can be compared in the same manner as in the first embodiment of the screening method for a substance controlling chondrogenesis of the present invention.
  • a test substance that increases and decreases the amount of cartilage in a tissue can be selected as a substance that promotes chondrogenesis and a substance that inhibits chondrogenesis, respectively.
  • the same criteria as in the first embodiment of the screening method for a chondrogenesis-regulating substance of the present invention can be applied to the extent to which the test substance increases cartilage mass and the extent to which the test substance decreases cartilage mass.
  • a third embodiment of the screening method for a chondrogenesis-regulating substance of the present invention is a step of transplanting the vertebral disc cells produced by the production method of the present invention into a mammal other than human, a step of removing the derived tissue and transferring it to a culture system; a step of contacting the transplanted tissue with a test substance; and a test substance that increases or decreases the amount of cartilage in the transplanted tissue compared to the transplanted tissue that has not been in contact with the test substance. It is sufficient if it includes a step of selecting.
  • the step of transplanting the vertebral disc cells produced by the production method of the present invention into mammals other than humans is the same as in the first embodiment of the method for producing endochondral ossified tissue of the present invention. It can be carried out.
  • the extraction of the tissue derived from the transplanted vertebral disc cells is the method for producing an endochondral ossified tissue of the present invention. can be performed in the same manner as in the first embodiment.
  • the time of extraction is not particularly limited, but the time when the amount of cartilage in the transplanted vertebral disc cell-derived tissue is in the process of increasing is preferred.
  • the time when the cartilage mass is in the process of increasing can be set by performing a preliminary examination. Transfer of the excised tissue to the culture system can be performed by culturing the excised tissue using an appropriate medium.
  • Media used include, for example, chondrogenic basal media with or without cartilage-inducing factors.
  • the transplanted tissue transferred to the culture system is brought into contact with the test substance.
  • the contacting method is not particularly limited, but includes, for example, a method of adding the test substance to the medium.
  • the timing of adding the test substance may be immediately after transfer to the culture system in the second step, or after a certain period of time has elapsed after transfer to the culture system.
  • the period during which the transplanted tissue and the test substance are in contact is also not particularly limited, and may be the entire culture period or part of the culture period.
  • the amount of cartilage in the implanted tissue that is not in contact with the test substance Compare the amount of cartilage in the implants that were in contact with the test substance. Comparison of the cartilage amount can be performed in the same manner as in the first embodiment of the screening method for a chondrogenesis-regulating substance of the present invention. Increasing test substances and decreasing test substances can be selected as chondrogenesis-promoting substances and chondrogenesis-inhibiting substances, respectively. The same criteria as in the first embodiment of the screening method for a chondrogenesis-regulating substance of the present invention can be applied to the extent to which the test substance increases cartilage mass and the extent to which the test substance decreases cartilage mass.
  • a test substance selected by the screening method for a chondrogenesis-regulating substance of the present invention is useful as a drug candidate for the prevention and/or treatment of cartilage diseases, or as a research material for understanding the mechanism of chondrogenesis.
  • Cartilage diseases include, for example, congenital diseases showing abnormalities in cartilage such as osteoarthritis, full-thickness/partial cartilage defect, and chondrodysplasia.
  • a first embodiment of the method of screening for an osteogenesis-regulating substance of the present invention is to extract cartilage tissue differentiated from vertebral disc cells produced by the production method of the present invention using an osteogenic basal medium to detect the presence of a test substance.
  • a step of three-dimensionally culturing cartilage tissue differentiated from vertebral disc cells produced by the production method of the present invention in the presence or absence of a test substance using an osteogenic basal medium to form bone tissue ( The first step) can be performed by adding the test substance to the osteogenic basal medium in the same manner as in the second embodiment of the method for producing endochondral ossified tissue of the present invention.
  • the osteogenic basal medium may or may not contain osteogenic factors.
  • the timing of adding the test substance to the osteogenic basal medium may be at the same time as the start of the first step, or after a certain period of time has elapsed since the start of the first step.
  • the period during which the vertebral disc cells and the test substance are in contact may be the entire period of the first step or a partial period of the first step.
  • the bone mass of the bone tissue formed in the absence of the test substance is selected in the step of selecting a test substance that increases or decreases the bone mass in the bone tissue compared to the bone tissue formed in the absence of the test substance. Comparison of bone mass, for example, by preparing a tissue specimen of bone tissue and staining with Kossa, comparing the area of the stained region, quantifying bone mass in X-ray CT images, quantifying bone density, etc. It can be carried out.
  • a test substance that increases bone mass in bone tissue formed in the presence of the test substance compared to bone tissue formed in the absence of the test substance can be selected as a substance that promotes bone formation.
  • the extent to which the test substance increases bone mass is not particularly limited, for example, it is 120% or more, 130% or more, 140% or more, 150% or more, 170% or more compared to bone tissue formed in the absence of the test substance. , 180% or greater, 190% or greater, or 200% or greater.
  • a test substance that reduces bone mass in bone tissue formed in the presence of the test substance compared to bone tissue formed in the absence of the test substance can be selected as a substance that suppresses bone formation.
  • the extent to which the test substance reduces bone mass is not particularly limited, but is, for example, 90% or less, 80% or less, 70% or less, 60% or less, or 50% or less compared to bone tissue formed in the absence of the test substance. may be selected to reduce test substances to
  • a second embodiment of the screening method for an osteogenesis-regulating substance of the present invention comprises a step of transplanting vertebral disc cells produced by the production method of the present invention into a mammal other than human, administering a test substance to the mammal. extracting vertebral disc cell-derived tissue transplanted from the mammal, and a test substance that increases or decreases the bone mass of the transplanted tissue as compared to the transplanted tissue excised from a mammal to which the test substance has not been administered. It is sufficient if it includes a step of selecting.
  • the step of transplanting the vertebral disc cells produced by the production method of the present invention into mammals other than humans is the same as in the first embodiment of the method for producing endochondral ossified tissue of the present invention. It can be carried out.
  • the step of administering the test substance to the mammal (second step), the test substance is administered to the mammal to which the vertebral disc cells were transplanted in the first step.
  • Administration may be systemic administration such as oral administration, intravenous administration, or intraperitoneal administration, or local administration at or near the site of transplantation.
  • the dose, administration period, administration frequency, administration period, and the like are appropriately set according to the test substance used.
  • the step of extracting tissue derived from vertebral disc cells transplanted from a mammal can be performed by the same method as in the first embodiment of the method for producing endochondral ossified tissue of the present invention.
  • the time of extraction is not particularly limited, but the time when the bone mass in the transplanted vertebral disc cell-derived tissue has increased to a comparable level is preferred. It is preferable to set the extraction timing by performing a preliminary examination.
  • step (fourth step) of selecting a test substance that increases or decreases the bone mass of the transplanted tissue as compared with the transplanted tissue excised from the mammal not administered the test substance the mammal not administered the test substance
  • the bone mass of the graft tissue excised from the animal and the bone mass of the graft tissue excised from the mammal to which the test substance is administered are compared.
  • Comparison of bone mass can be carried out in the same manner as in the first embodiment of the method of screening for a substance controlling bone formation of the present invention.
  • Test substances that increase and decrease tissue bone mass can be selected as substances that promote bone formation and substances that inhibit bone formation, respectively.
  • the same criteria as in the first embodiment of the screening method for a substance controlling bone formation of the present invention can be applied to the extent to which a test substance increases bone mass and the extent to which a test substance decreases cartilage mass.
  • a third embodiment of the screening method for an osteogenesis-regulating substance of the present invention is a step of transplanting the vertebral disc cells produced by the production method of the present invention into a mammal other than human, a step of removing the derived tissue and transferring it to a culture system; a step of contacting the transplanted tissue with a test substance; and a test substance that increases or decreases the bone mass of the transplanted tissue compared to the transplanted tissue that has not been in contact with the test substance. It is sufficient if it includes a step of selecting.
  • the step of transplanting the vertebral disc cells produced by the production method of the present invention into mammals other than humans is the same as in the first embodiment of the method for producing endochondral ossified tissue of the present invention. It can be carried out.
  • the extraction of the tissue derived from the transplanted vertebral disc cells is the method for producing an endochondral ossified tissue of the present invention. can be performed in the same manner as in the first embodiment.
  • the time of extraction is not particularly limited, but the time when the tissue derived from the transplanted vertebral disc cells is in the process of increasing bone mass is preferable. It is preferable to set the extraction timing by performing a preliminary examination. Transfer of the excised tissue to the culture system can be performed by culturing the excised tissue using an appropriate medium. Media used include, for example, osteogenic basal media with or without osteoinductive factors.
  • the step of contacting the implanted tissue with the test substance can be performed by the same method as in the third embodiment of the screening method for a chondrogenesis-regulating substance of the present invention.
  • the step of selecting a test substance that increases or decreases the bone mass of the implanted tissue compared to the implanted tissue that is not in contact with the test substance step 4
  • the cartilage amount of the implanted tissue that is not in contact with the test substance step 4
  • Comparison of bone mass can be carried out in the same manner as in the first embodiment of the method of screening for a substance controlling bone formation of the present invention.
  • Test substances that increase and decrease tissue bone mass can be selected as substances that promote bone formation and substances that inhibit bone formation, respectively.
  • the same criteria as in the first embodiment of the screening method for a substance controlling bone formation of the present invention can be applied to the extent to which a test substance increases bone mass and the extent to which a test substance decreases cartilage mass.
  • ZEB2 in bone tissue zinc finger E-box binding homeobox 2 Anything that includes the step of selecting a test substance that increases or decreases the expression level.
  • This step simultaneously increases or decreases the expression levels of ZEB2 and RUNX2 (runt-related transcription factor 2), or ZEB2 and SP7 (Sp7 transcription factor, also known as Osterix), or ZEB2, RUNX2, and SP7. It may be a step of selecting a test substance to be tested.
  • RUNX2 and SP7 are known as transcription factors essential for osteogenesis.
  • the amount of expression may be measured by measuring the amount of protein or the amount of mRNA.
  • protein can be extracted from cells by a known method and quantified using a known method for measuring the amount of protein.
  • known protein amount measurement methods include Western blotting, EIA, ELISA, RIA, and methods using protein measurement reagents.
  • RNA can be extracted from cells by a known method and quantified using a known method for measuring the amount of mRNA.
  • Known methods for measuring mRNA levels include Northern blotting, RT-PCR, quantitative RT-PCR, RNase protection assay and the like.
  • human ZEB2 base sequence NM_001171653.2, amino acid sequence NP_001165124.1
  • Human RUNX2 base sequence NM_001015051.4, amino acid sequence NP_001015051.3
  • Human SP7 nucleotide sequence NM_001173467.3, amino acid sequence NP_001166938.1
  • any procedure may be included as long as it includes the step of selecting a test substance that increases or decreases the ZEB2 expression level in the transplanted tissue.
  • This step may be a step of selecting a test substance that simultaneously increases or decreases the expression levels of ZEB2 and RUNX2, ZEB2 and SP7, or ZEB2, RUNX2, and SP7.
  • the expression level can be measured in the same manner as in the fourth embodiment.
  • a sixth embodiment of the screening method for an osteogenesis-regulating substance of the present invention is to replace the fourth step of the third embodiment with ZEB2 expression in the transplanted tissue as compared with a transplanted tissue not in contact with the test substance.
  • Any method may include a step of selecting a test substance to be increased or decreased in amount. This step may be a step of selecting a test substance that simultaneously increases or decreases the expression levels of ZEB2 and RUNX2, ZEB2 and SP7, or ZEB2, RUNX2, and SP7. The expression level can be measured in the same manner as in the fourth embodiment.
  • a test substance selected by the screening method for a substance controlling bone formation of the present invention is useful as a drug candidate substance for the prevention and/or treatment of bone diseases, or as a research material for understanding the mechanism of bone formation.
  • Bone diseases include, for example, congenital diseases showing bone abnormalities such as osteoporosis and osteogenesis imperfecta, and bone defects due to various causes.
  • Example 1 Induction of differentiation from human pluripotent stem cells to vertebral disc cells
  • 1-1 Experimental method (1) Cells used As human iPS cells, Col2.3-Cherry (COL) strain (obtained from University of Connecticut: Zujur et al. Regen Ther 14:19-31, 2020), 201B7 strain (Rikagaku Obtained from Laboratory: Takahashi et al. Cell 131:861-872, 2007) and NiPS strain (obtained from Rikagaku Kenkyusho: Ono et al. PLOS ONE 7:e42855, 2012) were used. Furthermore, the SEES3 strain (obtained from the National Center for Child Health and Development: Akutsu et al. Regen Ther 1:18-29, 2015) was used as human ES cells.
  • COL Col2.3-Cherry
  • 201B7 strain obtained from Laboratory: Takahashi et al. Cell 131:861-872, 2007
  • NiPS strain obtained from Rikagaku Kenkyusho:
  • a chemically defined medium having the following composition is used.
  • DMEM/F12 Thermo Fisher Scientific; 11330032
  • B27 Supplement Xeno-Free Thermo Fisher Scientific; A148601
  • ITS Liquid Media Supplement Sigma-Aldrich; I3146
  • MEM Non-Essential Amino Acids Solution Thermo Fisher Scientific; 11140050
  • 55 ⁇ M 2-Mercaptoethanol 0.1% of 55 mM 2-Mercaptoethanol in DPBS (Thermo Fisher Scientific; 21985023)
  • This synthetic medium is hereinafter referred to as BIM.
  • CDM2 basal medium As a control medium, use the CDM2 basal medium described in Loh et al.
  • the composition of the CDM2 basal medium is as follows. 50% IMDM (+GlutaMAX, +HEPES, +Sodium Bicarbonate; Gibco, 31980-097), 50% F12 (+GlutaMAX; Gibco, 31765-092), 1mg/mL polyvinyl alcohol (Sigma, P8136-250G), 1% v/v concentrated lipids (Gibco, 11905-031), 450 ⁇ M monothioglycerol (Sigma, M6145), 0.7 ⁇ g/mL insulin (Roche, 1376497), 15 ⁇ g/mL transferrin (Roche, 652202), 1% v/v penicillin/streptomycin (Gibco).
  • ⁇ Step 2 Induction of differentiation into paraxial mesoderm (Day 1) After washing the cells cultured in step 1 with PBS(-), 5 ⁇ M CHIR (Wnt signal activator), 1 ⁇ M A83-01 (TGF ⁇ inhibitor) and 0.25 ⁇ M LDN-193189 (BMP signal inhibitor) were added. Culture in BIM for about 24 hours to differentiate into paraxial mesoderm.
  • ⁇ Step 3 Induction of differentiation into somites (Day 2) After washing the cells cultured in step 2 with PBS(-), 1 ⁇ M C59 (Wnt signal inhibitor), 1 ⁇ M A83-01 (TGF ⁇ inhibitor) and 0.25 ⁇ M LDN-193189 (BMP signal inhibitor) were added to BIM. for about 24 hours to differentiate into somites.
  • Step 4 Induction of differentiation into vertebral discs (Sclerotome) (Day 3) After washing the cells cultured in step 3 with PBS(-), 1 ⁇ M SAG (hedgehog signal activator), 1 ⁇ M C59 (Wnt signal inhibitor) and 0.25 ⁇ M LDN-193189 (BMP signal inhibitor) were added. Culture in BIM for about 2 days to differentiate into vertebral discs.
  • Inducers added in step 3 1 ⁇ M C59, 1 ⁇ M A83-01, 0.25 ⁇ M LDN-193189 and 0.5 ⁇ M PD0325901. • Inducers 1 ⁇ M C59 and 5 nM 21K added in step 4.
  • ISOGEN Natural Gene, 319-90211
  • FSQ-301 ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA remover.
  • reverse transcription and cDNA synthesis were performed on a GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems).
  • PAX1, PAX9 and Nkx3.2 mRNA expression levels were quantified using FastStart Universal SYBR Green Master (Rox) (Roche, 04913850001 ) on the 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Measured by PCR.
  • hPAX1 forward, CGCTATGGAGCAGACGTATGGCGA (sequence number 1)
  • hPAX1 reverse, AATGCGCAACGCGGATGGCGTTG
  • hPAX9 forward, TGGTTATTGTTGCTGGACATGGGTG
  • hPAX9 reverse, GGAAGCCGTGACAGAATGACTACCT
  • hNKX3.2 forward, GGAGGTTAAGACGTGTCGCA (sequence number 5)
  • hNKX3.2 reverse, GCAGAGGGCAGAAGGTAGAC (SEQ ID NO: 6)
  • FIG. 1 shows the results of measurement of vertebral disc cell markers.
  • "conventional method” indicates cells induced to differentiate using the control medium
  • “new method” indicates cells induced to differentiate using the production method of the present invention.
  • the expression level of the vertebral disc cell marker in the cells obtained by the production method of the present invention is the same as the expression level of the vertebral disc cell marker in the cells obtained by the conventional method for all three types. higher expression.
  • Example 2 Transplantation of differentiation-induced human vertebral disc cells under mouse renal capsule
  • 2-1 Experimental method (1) Preparation of human vertebral disc cells for transplantation
  • Human vertebral disc cells differentiated from Col2.3-Cherry (COL) human iPS cell line according to steps 1 to 4 of Example 1 (4-1) (Day 5) are detached with Accutase (Life Tech), centrifuged and resuspended in a small volume of cold BIM (50-250 ⁇ L) depending on cell number.
  • the vertebral disc cell suspension is diluted with an equal volume of cold Matrigel (Corning; 354234) and kept on ice until implantation.
  • NOD SCID mice Male NOD SCID mice (NOD.CB17-Prkdc scid /J, Charles River) aged 8 to 12 weeks were used. Under inhalational anesthesia (2-3% isoflurane), a 1 cm incision is made in the skin just above the left kidney of the mouse using preparative scissors. Subsequently, the kidney was dissected out into the cutaneous area by making a similar incision in the abdominal wall (muscle and peritoneum), a very small incision was made in the renal capsule, and approximately 1.5 ⁇ 10 6 to 15 ⁇ 10 6 human vertebral disc cells were collected.
  • a 26G plastic cannula connected to a syringe from which a few tens to 100 ⁇ l of cell suspension containing is aspirated.
  • the cannula is advanced several millimeters to 1 centimeter under the renal capsule before injecting the cell suspension.
  • the kidney is returned to the abdominal cavity, the abdominal wall is sutured with 6-0 nylon, and finally the skin is sutured in the same way to complete the transplant operation.
  • X-ray microcomputed tomography is performed at 4, 8, 12, 18 and 26 weeks after transplantation, and mice are euthanized at 8 and 18 weeks after transplantation and transplanted kidneys are removed and subjected to histological analysis.
  • X-ray micro-CT X-ray micro-computed tomography
  • R_mCT2-FX X-ray micro-CT device
  • the sections were sufficiently air-dried, and the embedding medium was sufficiently dissolved and removed in a phosphate buffer before being used for staining.
  • the paraffin sections were processed for 21 hours using a sealed automatic fixing and embedding device (Sakura Fine Tech Japan, Tissue Tech VIP5 Jr.) and then embedded in paraffin. Blocks were sectioned to 5 ⁇ m using a microtome. The section was stretched in a constant temperature bath at 42°C, placed on a slide, and then dried at 42°C to remove excess water and dried thoroughly in a constant temperature bath at 37°C. It was immersed in xylene, ethanol, and water step by step to sufficiently remove paraffin and hydrated, and then used for staining.
  • Hematoxylin and eosin staining Hematoxylin and eosin staining (HE staining: Hematoxylin solution for 2 minutes, water for 10 minutes, 95% ethanol for several seconds, eosin solution for 1 minute, 100% ethanol solution for 5 minutes x 3 times, xylene for 1 minute x 3 times, After successive immersion, encapsulation using Marinol) was carried out.
  • tissue sections 18 weeks after transplantation were stained with safranin O (2 minutes in hematoxylin solution, 10 minutes in water, 5 minutes in 0.001% Fast green solution, 10 seconds in 1% acetic acid solution, safranin O staining).
  • FIG. 3 shows an HE-stained image of the calcified tissue at the transplantation site.
  • A Epiphysis of fetal mouse tibia
  • B calcified tissue 8 weeks after transplantation of vertebral disc cells differentiated from human iPS cells
  • C vertebral disc cells differentiated from human iPS cells.
  • D shows HE-stained images of calcified tissue 18 weeks after transplantation, and (D) calcified tissue 18 weeks after transplantation of vertebral disc cells differentiated from human ES cells.
  • FIG. 4 shows an HE-stained image and a safranin-O-stained image of the calcified tissue at the transplantation site 18 weeks after transplantation.
  • (A) is an HE-stained image
  • (B) is a safranin-O-stained image.
  • cartilage matrix proteins were observed to be stained red by Safranin O.
  • bone marrow-like tissue was observed inside the cartilage tissue.
  • FIG. 5 shows an image of calcified tissue at the transplantation site immunostained with an anti-human nuclear antibody 18 weeks after transplantation.
  • A is a low-magnification image
  • B is a medium-magnification image
  • C is a high-magnification image. Staining of cell nuclei at the transplant site revealed that the calcified tissue at the transplant site was differentiated from the transplanted human vertebral disc cells. In the myeloid tissue, the part where the nucleus is not stained is considered to be mouse blood cells and vascular endothelial cells.
  • FIG. 6 shows an oil red 0-stained image of the calcified tissue at the transplantation site 18 weeks after transplantation and an immunostaining image using an anti-human nuclear antibody.
  • A is a low-magnification image of Oil Red O staining
  • B is a medium-magnification image of Oil Red O staining
  • C is a high-magnification image of Oil Red O staining
  • D is the corresponding anti It is an immunostaining image using a human nuclear antibody. It was shown that adipocytes stained red with Oil Red O were present in the myeloid tissue.
  • the nuclei of adipocytes were stained by immunostaining using an anti-human nuclear antibody, indicating that adipocytes are cells differentiated from transplanted human vertebral disc cells.
  • Example 3 In vitro three-dimensional cartilage formation and endochondral ossification of differentiation-induced human vertebral disc cells] 3-1 Experimental method (1) Chondrogenesis induction protocol 1 (Matsuda et al. (Nature. 2020 Apr;580(7801):124-129. doi: 10.1038/s41586-020-2144-9. Epub 2020 Apr 1.) Partially modified, hereinafter referred to as “conventional method 1”.) Human vertebral disc cells (Day 5) differentiated from SEES3 human ES cell line by steps 1 to 4 of Example 1 (4-1) were detached with Accutase (Life Tech), centrifuged, and treated with 10 ⁇ M ROCK inhibitor.
  • non-essential amino acids Invitrogen; 11140050
  • 1 mM Sodium Pyruvate Invitrogen; 11360070
  • 50 U of penicillin 50 ⁇ g/mL of streptomycin
  • 50 ⁇ g/mL ascorbic acid phosphate #A4034; Sigma Aldrich
  • osteogenic basal medium 10% FBS, 50 U of penicillin, 50 mg/ml of streptomycin, 50 mg/ml of ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate (#G9422; Sigma Aldrich), and 0.1 ⁇ M dexamethasone (#41-18861; Wako)).
  • osteogenic basal medium supplemented with polyunsaturated fatty acids (10 ⁇ M linoleic acid, 15 ⁇ M ⁇ -linolenic acid, 10 ⁇ M arachidonic acid, 15 ⁇ M docosahexaenoic acid), 100 ng/mL BMP2, and 1 ⁇ M SAG of osteoinductive factor Exchange. After that, change the medium every 2-3 days.
  • the section was stretched in a constant temperature bath at 42°C, placed on a slide, and then dried at 42°C to remove excess water and dried thoroughly in a constant temperature bath at 37°C. Safranin O staining and von Kossa staining were performed after the paraffin was sufficiently removed and hydrated by stepwise immersion in xylene, ethanol, and water.
  • FIG. (A) is an image obtained by culturing by conventional method 1
  • FIG. (B) is an image obtained by culturing by conventional method 2. Both cell clusters were stained dark red by safranin O compared to the stained image of the cell cluster on Day 42 (Fig. 7), indicating that cartilage differentiation was progressing (upper left, lower). . However, no Kossa-stained calcified tissue was observed (upper right).
  • (A) is an image of a cell mass cultured in a basal osteogenic medium containing osteoinductive factors after being cultured in a basal chondrogenic medium containing no chondrogenic factor in conventional method 1; Image of cell clusters cultured in chondrogenic basal medium containing osteoinductive factors after culturing in chondrogenic basal medium containing osteoinductive factors, (C) is osteoinductive after culturing in chondrogenic basal medium containing osteoinductive factors in conventional method 2 Fig. 3 is an image of cell clusters cultured in osteogenic basal medium containing factors. It was shown that both cell masses had calcified tissue stained black by Kossa staining (upper right, lower). This result indicates that endochondral ossification (endochondral ossification) is reproduced in all cell clusters.
  • FIG. 10 shows X-ray images of cell masses on Day 100 cultured in a chondrogenic basal medium containing or not containing an osteoinductive factor and cultured in an osteogenic basal medium containing or not containing an osteoinductive factor on Day 42.
  • dark black indicates calcified sites. It was shown that calcified sites were present in the cell clusters on Day 100 regardless of the culture conditions. This result indicates that long-term culture induces mineralization of cartilage-forming cell masses regardless of the presence or absence of cartilage-inducing factors and osteoinducing factors.
  • Example 4 Comparison between the production method of the present invention and a method for producing (inducing differentiation) vertebral disc cells using a medium containing fetal bovine serum
  • 4-1 Experimental Method (1) Medium Used The synthetic medium (BIM) described in Example 1 was used in the production method of the present invention. DMEM/F12 containing 10% fetal bovine serum was used as the fetal bovine serum-containing medium. Essential 8 Medium, which is a pluripotent stem cell maintenance medium, was used as a control medium.
  • Example 6 Search for novel osteogenic transcription factor candidates and functional analysis
  • 6-1 Search for novel osteogenic transcription factor candidates Differentiate from human iPS cell COL line or human ES cell H9Zn2.3GFP line under the renal capsule of NOD SCID mouse by the method described in Example 2 (1) and (2). Induced vertebral disc cells were implanted. Human iPS cell-derived endochondral ossified tissue was collected after euthanizing mice at 7 and 19 weeks after transplantation, and single-cell gene expression analysis (single-cell RNA sequence analysis) was performed on all cells that make up the tissue.
  • (A) is a Venn diagram showing the relationships of (i), (ii) and (iii) above, and (B) is a transcription factor that satisfies all of the above conditions (i), (ii) and (iii).
  • ZEB2 whose function in bone tissue is unknown, was found. Therefore, we selected ZEB2 as a novel osteogenic transcription factor candidate.
  • fetal bovine serum 50 ⁇ g/mL ascorbic acid (Sigma-Aldrich, A4034), 10 mM ⁇ -glycerophosphate (Sigma-Aldrich, G9422), 0.1 ⁇ M dexamethasone (Wako, 41-18861) and 100 ng/mL
  • DMEM DMEM containing ml Bone morphogenetic protein-2 (BMP-2: Medtronic, 7510050) to induce osteoblastic differentiation.
  • BMP-2 Bone morphogenetic protein-2
  • FIG. (A) is the result of ZEB2
  • (B) is the result of RUNX2
  • (C) is the result of SP7. Both transcription factors increased their expression levels by overexpressing ZEB2. These results demonstrate that ZEB2 positively regulates osteoblast differentiation.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本発明は、多能性幹細胞からゼノフリーかつフィーダーフリー培養系で椎板細胞を製造する方法であって、（１）多能性幹細胞を誘導因子としてWntシグナル活性化剤のみを含有する第一の分化培地で培養する工程、（２）工程（１）で培養した細胞を、誘導因子としてWntシグナル活性化剤、TGFβシグナル阻害剤およびBMPシグナル阻害剤のみを含有する第二の分化培地に交換して培養する工程、（３）工程（２）で培養した細胞を、誘導因子としてWntシグナル阻害剤、TGFβシグナル阻害剤およびBMPシグナル阻害剤のみを含有する第三の分化培地に交換して培養する工程、および（４）工程（３）で培養した細胞を、誘導因子としてヘッジホッグシグナル活性化剤、ならびにBMPシグナル阻害剤およびWntシグナル阻害剤からなる群より選択される少なくとも1つのみを含有する第四の分化培地に交換して培養する工程、を含む方法を提供する。

Description

椎板細胞の製造方法および該椎板細胞の利用
　本発明は、多能性幹細胞から椎板細胞を製造する方法、および製造された椎板細胞の利用に関するものである。
　発生の初期段階では、外胚葉・中胚葉・内胚葉という集団に分かれた後に、それぞれが分担する臓器や組織が形成される。骨軟骨組織の由来となる中胚葉は沿軸中胚葉と側板中胚葉である。これらは、原腸形成に続いて発生する原始線条に端を発する。沿軸中胚葉は体節、椎板へと分化し、体幹の骨、軟骨、靭帯、腱へと分化する。したがって、多能性幹細胞から上記の過程をたどる分化誘導系を開発すれば、生理的な骨格発生過程をインビトロで再現できると考えられる。
　一方、多能性幹細胞から目的細胞や組織を作製する場合、正確な組成が不明なもの（例えば、ウシ胎児血清）が添加された培地が使用されること、分化誘導因子として遺伝子導入や組換えタンパク質が使用されること等による安全性やコストに関する懸念が存在する。多能性幹細胞を用いて各種細胞や組織を作製する手法としては、全て既知の成分を用い、経済的かつ安全な低分子化合物を用いる方法が理想的である。
　これまでに、本発明者らは、4種類の低分子化合物のみを誘導剤として用いることで、無血清・無フィーダー細胞系で、マウスおよびヒト多能性幹細胞（iPS細胞、ES細胞）から中胚葉形成を介して骨芽細胞を効率的に形成する方法を開発した（非特許文献１）。さらにこの方法を三次元培養系へ拡張することにも成功した（非特許文献２）。
Kanke K et al., Stem Cell Reports. 2014 May 22;2(6):751-60. doi: 10.1016/j.stemcr.2014.04.016. Zujur D et al., Sci Adv. 2017 May 12;3(5):e1602875. doi: 10.1126/sciadv.1602875.
　本発明は、多能性幹細胞からゼノフリーかつフィーダーフリー培養系で椎板細胞を簡便に製造する方法を提供することを課題とする。また、本発明は、軟骨形成制御物質および骨形成制御物質をスクリーニングする方法を提供することを課題とする。
［１］多能性幹細胞からゼノフリーかつフィーダーフリー培養系で椎板細胞を製造する方法であって、以下の工程（１）～（４）を含む方法：
（１）多能性幹細胞を誘導因子としてWntシグナル活性化剤のみを含有する第一の分化培地で培養する工程、（２）工程（１）で培養した細胞を、誘導因子としてWntシグナル活性化剤、TGFβシグナル阻害剤およびBMPシグナル阻害剤のみを含有する第二の分化培地に交換して培養する工程、（３）工程（２）で培養した細胞を、誘導因子としてWntシグナル阻害剤、TGFβシグナル阻害剤およびBMPシグナル阻害剤のみを含有する第三の分化培地に交換して培養する工程、および（４）工程（３）で培養した細胞を、誘導因子としてヘッジホッグシグナル活性化剤、ならびにBMPシグナル阻害剤およびWntシグナル阻害剤からなる群より選択される少なくとも1つのみを含有する第四の分化培地に交換して培養する工程。
［２］前記誘導因子が、組換えタンパク質でない、前記［１］に記載の方法。
［３］基礎培地として0～2％ITSサプリメント、0～2％NEAA、0～100μM 2-メルカプトエタノールおよび0～2％B27無血清サプリメントを添加したDMEM/F12培地を用いる、前記［１］または［２］に記載の方法。
［４］前記工程（１）の培養期間が、細胞がTBXTおよびMIXL1からなる群より選択される少なくとも1つのマーカーを発現することが確認されるまでであり、前記工程（２）の培養期間が、細胞がTBX6およびMSGN1からなる群より選択される少なくとも1つのマーカーを発現することが確認されるまでであり、前記工程（３）の培養期間が、細胞がPARAXIS、PAX3およびFOXC2からなる群より選択される少なくとも1つのマーカーを発現することが確認されるまでであり、前記工程（４）の培養期間が、細胞がPAX1、PAX9、SOX9およびNKX3.2からなる群より選択される少なくとも1つのマーカーを発現することが確認されるまでである、前記［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］前記工程（１）～（３）の培養時間がそれぞれ12～36時間であり、前記工程（４）の培養時間が36～84時間である、前記［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］前記椎板細胞が生体移植用である、前記［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］前記［１］～［６］のいずれかに記載の方法で椎板細胞を製造する工程、得られた椎板細胞をヒト以外の哺乳動物に移植する工程、および該哺乳動物から移植した椎板細胞由来の組織を摘出する工程を含む、軟骨内骨化組織の製造方法。
［８］前記［１］～［６］のいずれかに記載の方法で椎板細胞を製造する工程、得られた椎板細胞を、軟骨誘導因子を含まない軟骨形成基本培地で三次元培養する工程を含む、軟骨組織の製造方法。
［９］前記［１］～［６］のいずれかに記載の方法で椎板細胞を製造する工程、得られた椎板細胞を、軟骨誘導因子を含むまたは含まない軟骨形成基本培地で三次元培養して軟骨組織を製造する工程、および該軟骨組織を、骨誘導因子を含むまたは含まない骨形成基本培地で三次元培養する工程を含む、軟骨内骨化組織の製造方法。
［１０］前記［１］～［６］のいずれかに記載の方法で椎板細胞を製造する工程、得られた椎板細胞を、軟骨誘導因子を含まない軟骨形成基本培地を用いて、被験物質の存在下または非存在下で三次元培養して軟骨組織を形成させる工程、および被験物質非存在下で形成した軟骨組織と比較して軟骨組織における軟骨量を増加または減少させる被験物質を選択する工程を含む、軟骨形成制御物質のスクリーニング方法。
［１１］前記［１］～［６］のいずれかに記載の方法で椎板細胞を製造する工程、得られた椎板細胞をヒト以外の哺乳動物に移植する工程、該哺乳動物に被験物質を投与する工程、該哺乳動物から移植した椎板細胞由来の組織を摘出する工程、被験物質を投与していない哺乳動物から摘出した移植組織と比較して、移植組織の軟骨量を増加または減少させる被験物質を選択する工程を含む、軟骨形成制御物質のスクリーニング方法。
［１２］前記［１］～［６］のいずれかに記載の方法で椎板細胞を製造する工程、得られた椎板細胞をヒト以外の哺乳動物に移植する工程、該哺乳動物から移植した椎板細胞由来の組織を摘出し培養系に移行する工程、該移植組織と被験物質を接触させる工程、被験物質と接触していない移植組織と比較して、移植組織の軟骨量を増加または減少させる被験物質を選択する工程を含む、軟骨形成制御物質のスクリーニング方法。
［１３］前記［１］～［６］のいずれかに記載の方法で椎板細胞を製造する工程、得られた椎板細胞から分化誘導された軟骨組織を、骨形成基本培地を用いて被験物質の存在下または非存在下で三次元培養して骨組織を形成させる工程、および被験物質非存在下で形成した骨組織と比較して、骨組織における骨量を増加または減少させる被験物質を選択する工程を含む、骨形成制御物質のスクリーニング方法。
［１４］前記［１］～［６］のいずれかに記載の方法で椎板細胞を製造する工程、得られた椎板細胞をヒト以外の哺乳動物に移植する工程、該哺乳動物に被験物質を投与する工程、該哺乳動物から移植した椎板細胞由来の組織を摘出する工程、被験物質を投与していない哺乳動物から摘出した移植組織と比較して、移植組織の骨量を増加または減少させる被験物質を選択する工程を含む、骨形成制御物質のスクリーニング方法。
［１５］前記［１］～［６］のいずれかに記載の方法で椎板細胞を製造する工程、得られた椎板細胞をヒト以外の哺乳動物に移植する工程、該哺乳動物から移植した椎板細胞由来の組織を摘出し培養系に移行する工程、該移植組織と被験物質を接触させる工程、被験物質と接触していない移植組織と比較して、移植組織の骨量を増加または減少させる被験物質を選択する工程を含む、骨形成制御物質のスクリーニング方法。
［１６］前記［１］～［６］のいずれかに記載の方法で椎板細胞を製造する工程、得られた椎板細胞から分化誘導された軟骨組織を、骨形成基本培地を用いて被験物質の存在下または非存在下で三次元培養して骨組織を形成させる工程、および被験物質非存在下で形成した骨組織と比較して、骨組織におけるZEB2発現量を増加または減少させる被験物質を選択する工程を含む、骨形成制御物質のスクリーニング方法。
［１７］被験物質非存在下で形成した骨組織と比較して、被験物質の存在下で形成した骨組織におけるZEB2とRUNX2の発現量、またはZEB2とSP7の発現量、またはZEB2とRUNX2とSP7の発現量を、同時に増加または減少させる被験物質を選択する工程を含む、前記［１６］に記載の骨形成制御物質のスクリーニング方法。
［１８］請求項１～６のいずれか１項に記載の方法で椎板細胞を製造する工程、得られた椎板細胞をヒト以外の哺乳動物に移植する工程、該哺乳動物に被験物質を投与する工程、該哺乳動物から移植した椎板細胞由来の組織を摘出する工程、被験物質を投与していない哺乳動物から摘出した移植組織と比較して、移植組織のZEB2発現量を増加または減少させる被験物質を選択する工程を含む、骨形成制御物質のスクリーニング方法。
［１９］被験物質を投与していない哺乳動物から摘出した移植組織と比較して、被験物質を投与した哺乳動物から摘出した移植組織のZEB2とRUNX2の発現量、またはZEB2とSP7の発現量、またはZEB2とRUNX2とSP7の発現量を、同時に増加または減少させる被験物質を選択する工程を含む、前記［１８］に記載の骨形成制御物質のスクリーニング方法。
［２０］前記［１］～［６］のいずれかに記載の方法で椎板細胞を製造する工程、得られた椎板細胞をヒト以外の哺乳動物に移植する工程、該哺乳動物から移植した椎板細胞由来の組織を摘出し培養系に移行する工程、該移植組織と被験物質を接触させる工程、被験物質と接触していない移植組織と比較して、移植組織のZEB2発現量を増加または減少させる被験物質を選択する工程を含む、骨形成制御物質のスクリーニング方法。
［２１］被験物質と接触していない移植組織と比較して、被験物質と接触した移植組織のZEB2とRUNX2の発現量、またはZEB2とSP7の発現量、またはZEB2とRUNX2とSP7の発現量を、同時に増加または減少させる被験物質を選択する工程を含む、前記［２０］に記載の骨形成制御物質のスクリーニング方法。
　本発明により、多能性幹細胞からゼノフリーかつフィーダーフリー培養系で椎板細胞を簡便に製造することができる。本発明により製造された椎板細胞は、軟骨誘導因子を含まない軟骨形成基本培地を用いて三次元培養することにより軟骨組織を製造することができ、さらに骨誘導因子を含まない骨形成基本培地を用いて三次元培養することにより軟骨内骨化組織を製造することができる。また、本発明により、軟骨形成制御物質および骨形成制御物質をスクリーニングすることができる。
ヒトiPS細胞Col2.3-Cherry（COL）株、201B7株およびNiPS株、ならびにヒトES細胞SEES3株から、本発明の製造方法または従来法（Lohら（Cell. 2016 Jul 14;166(2):451-467. doi: 10.1016/j.cell.2016.06.011.）に記載の方法）で得られた椎板細胞におけるマーカー遺伝子（PAX1、PAX9およびNkx3.2）のmRNA発現量を測定した結果を示す図である。 ヒトiPS細胞から本発明の製造方法で得られた椎板細胞をNOD SCIDマウスの腎被膜下に移植し、移植部位石灰化組織を、移植後4週～26週まで経時的にＸ線マイクロCTで撮影した画像を示す図である。 ヒトiPS細胞またはヒトES細胞から本発明の製造方法で得られた椎板細胞をNOD SCIDマウスの腎被膜下に移植し、移植後8週または18週の移植部位石灰化組織のヘマトキシリン・エオジン染色（H-E染色）標本を観察した結果を示す図である。 ヒトiPS細胞から本発明の製造方法で得られた椎板細胞をNOD SCIDマウスの腎被膜下に移植し、移植後18週の移植部位石灰化組織のH-E染色標本およびサフラニンO染色標本を観察した結果を示す図である。 ヒトiPS細胞から本発明の製造方法で得られた椎板細胞をNOD SCIDマウスの腎被膜下に移植し、移植後18週の移植部位石灰化組織の抗ヒト核抗体を用いた免疫染色標本を観察した結果を示す図である。 ヒトiPS細胞から本発明の製造方法で得られた椎板細胞をNOD SCIDマウスの腎被膜下に移植し、移植後18週の移植部位石灰化組織のオイルレッドO染色標本を観察した結果を示す図である。 ヒトES細胞から本発明の製造方法で得られた椎板細胞（Day 5）を、軟骨形成因子を含む軟骨形成基本培地または軟骨形成因子を含まない軟骨形成基本培地で培養した細胞塊（Day 42）のH-E染色標本を観察した結果を示す図である。 ヒトES細胞から本発明の製造方法で得られた椎板細胞（Day 5）を、骨誘導因子を含む軟骨形成基本培地で培養し、Day 42に骨誘導因子を含まない骨形成基本培地に交換してDay 70まで培養した細胞塊のサフラニンO染色標本およびコッサ（von Kossa）染色染色標本を観察した結果を示す図である。 ヒトES細胞から本発明の製造方法で得られた椎板細胞（Day 5）を、骨誘導因子を含むまたは含まない軟骨形成基本培地で培養し、Day 42に骨誘導因子を含む骨形成基本培地に交換してDay 70まで培養した細胞塊のサフラニンO染色標本およびコッサ（von Kossa）染色染色標本を観察した結果を示す図である。 ヒトES細胞から本発明の製造方法で得られた椎板細胞（Day 5）を、軟骨誘導因子を含むまたは含まない軟骨形成基本培地で培養し、Day 42に骨誘導因子を含むまたは含まない骨形成基本培地で培養したDay 100の細胞塊のＸ線画像を示す図である。 実施例１の合成培地を用いてヒトES細胞から本発明の製造方法で得られた椎板細胞数と、ウシ胎児血清含有培地を用いてヒトES細胞から分化誘導して得られた椎板細胞数を比較した結果を示す図である。 ヒトiPS細胞またはヒトES細胞から本発明の製造方法で得られた椎板細胞をNOD SCIDマウスの腎被膜下に移植した。移植後7週、19週に採取したヒトiPS細胞由来軟骨内骨化組織においてシングルセルRNAシークエンス解析を、移植後20週に採取したヒトES細胞由来軟骨内骨化組織においてマルチオーム解析を行い、新規骨形成転写因子の探索を行った結果を示す図である。 ヒト間葉系幹細胞にZEB2に対するshRNAを発現するレンチウイルスを感染させて培養し、骨芽細胞分化誘導開始時および分化誘導後14日のZEB2、RUNX2、SP7遺伝子の発現量を、コントロールshRNA発現レンチウイルス感染群の細胞の発現量と比較した結果を示す図である。 ヒト間葉系幹細胞にZEB2遺伝子を発現するレトロウイルスを感染させて培養し、骨芽細胞分化誘導開始時および分化誘導後14日のZEB2、RUNX2、SP7遺伝子の発現量を、GFP発現レトロウイルス感染群の細胞の発現量と比較した結果を示す図である。
〔椎板細胞の製造方法〕
　本発明は、多能性幹細胞からゼノフリーかつフィーダーフリー培養系で椎板細胞を製造する方法（以下、「本発明の製造方法」と記す）を提供する。椎板（sclerotome）は硬節とも称される。本発明の製造方法は、以下の工程（１）～（４）を含むものであればよい。
（１）多能性幹細胞を誘導因子としてWntシグナル活性化剤のみを含有する第一の分化培地で培養する工程、
（２）工程（１）で培養した細胞を、誘導因子としてWntシグナル活性化剤、TGFβシグナル阻害剤およびBMPシグナル阻害剤のみを含有する第二の分化培地に交換して培養する工程、
（３）工程（２）で培養した細胞を、誘導因子としてWntシグナル阻害剤、TGFβシグナル阻害剤およびBMPシグナル阻害剤のみを含有する第三の分化培地に交換して培養する工程、および
（４）工程（３）で培養した細胞を、誘導因子としてヘッジホッグシグナル活性化剤、ならびにBMPシグナル阻害剤およびWntシグナル阻害剤からなる群より選択される少なくとも1つのみを含有する第四の分化培地に交換して培養する工程。
　本発明の製造方法で使用可能な多能性幹細胞は、生体に存在するすべての細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞であり、例えば、人工多能性幹（iPS）細胞、胚性幹（ES）細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹（ntES）細胞、精子幹（GS）細胞、胚性生殖（EG）細胞、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性細胞（Muse細胞）などが含まれる。好ましい多能性幹細胞は、iPS細胞またはES細胞である。
　iPS細胞は、特定の初期化因子を、DNAまたはタンパク質の形態で体細胞に導入することによって作製することができ、ES細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能、を有する体細胞由来の人工の幹細胞である（K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126:663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131:861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318:1917-1920; Nakagawa, M.ら,Nat. Biotechnol. 26:101-106 (2008)；国際公開WO 2007/069666）。
　iPS細胞は、米国国立衛生研究所（NIH）、理化学研究所（理研）、京都大学等が樹立した各種iPS細胞株を用いることができる。例えば、ヒトiPS細胞株であれば、理研のHiPS-RIKEN-1A株、HiPS-RIKEN-2A株、HiPS-RIKEN-12A株、Nips-B2株等、京都大学のAK5株、TkDN-Sev2株、692D2株、253G1株、201B7株、409B2株、454E2株、606A1株、610B1株、648A1株、1231A3株、1390D4株、1390C1株等が挙げられる。あるいは、京都大学やCellular Dynamics International等から提供される臨床グレードの細胞株並びにそれらの細胞株を用いて作製された研究用および臨床用の細胞株等を用いてもよい。
　ES細胞は、ヒトやマウスなどの哺乳動物の初期胚（例えば胚盤胞）の内部細胞塊から樹立された、多能性と自己複製による増殖能を有する幹細胞である。ES細胞は、受精卵の8細胞期、桑実胚後の胚である胚盤胞の内部細胞塊に由来する胚由来の幹細胞であり、成体を構成するあらゆる細胞に分化する能力、いわゆる分化多能性と、自己複製による増殖能とを有している。ES細胞は、マウスで1981年に発見され（M.J. Evans and M.H. Kaufman (1981), Nature 292:154-156）、その後、ヒト、サルなどの霊長類でもES細胞株が樹立された（J.A. Thomson et al. (1998), Science 282:1145-1147; J.A. Thomson et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:7844-7848;J.A. Thomson et al. (1996), Biol. Reprod., 55:254-259; J.A. Thomson and V.S. Marshall (1998), Curr. Top. Dev. Biol., 38:133-165）。
　マウスES細胞としては、inGenious社、理化学研究所（理研）等が樹立した各種マウスES細胞株が利用可能である。ヒトES細胞としては、米国国立衛生研究所（NIH）、理研、京都大学、Cellartis社が樹立した各種ヒトES細胞株が利用可能である。たとえばES細胞株としては、NIHのCHB-1～CHB-12株、RUES1株、RUES2株、HUES1～HUES28株等、WisCell Research InstituteのWA01(H1)株、WA09(H9)株、理研のKhES-1株、KhES-2株、KhES-3株、KhES-4株、KhES-5株、SSES1株、SSES2株、SSES3株等を利用することができる。また、KhES-1株、KhES-2株、KhES-3株およびKthES11株は、京都大学ウイルス・再生医科学研究所から入手可能である。
　工程（１）では、多能性幹細胞を、誘導因子としてWntシグナル活性化剤のみを含有する第一の分化培地で培養する。分化培地の基礎培地としては、例えば、DMEM/F12、DMEMなどを用いることができるが、これに限定されない。基礎培地には、インスリン－トランスフェリン－亜セレン酸ナトリウム（ITS）サプリメント、非必須アミノ酸（NEAA）、2-メルカプトエタノール、B27無血清サプリメントなどを添加してもよい。ITSサプリメントの濃度は通常0％～2％であり、好ましくは約1％である。NEAAの濃度は通常0％～2％であり、好ましくは約1％である。2-メルカプトエタノールの濃度は通常0μM～100μMであり、好ましくは約55μMである。B27無血清サプリメントの濃度は通常0％～2％であり、好ましくは約1％である。基礎培地は工程（１）～工程（４）まで同じ培地を使用することができる。
　Wntシグナル活性化剤としては、例えば、CHIR99021（CHIR、CAS No. 252917-06-9）、CHIR98014（CAS No. 252935-94-7）、WAY-316606（CAS No. 915759-45-4）、IQ-1（CAS No. 331001-62-8）、QS11（CAS No. 944328-88-5）、SB216763（CAS No. 280744-09-4）、BIO（CAS No. 667463-62-9）、LY2090314（CAS No. 603288-22-8）、TWS119（CAS No. 601514-19-6）、Tideglusib（CAS No. 865854-05-3）、SB415286（CAS No. 264218-23-7）などが挙げられる。Wntシグナル活性化剤は組換えタンパク質でないことが好ましい。Wntシグナル活性化剤としてCHIRを用いる場合、その濃度は通常0.01μM～30μMであり、好ましくは約5μMである。
　定法に従い維持培養した多能性幹細胞を単一細胞または微小クランプに分散し、維持培地を用いて調製した細胞分散液をプレートに播種して一夜培養した後、第一の分化培地に培地交換して工程（１）を開始する。あるいは、定法に従い維持培養した多能性幹細胞を単一細胞または微小クランプに分散し、第一の分化培地を用いて調製した細胞分散液をプレートに播種して工程（１）を開始してもよい。
　工程（１）は、多能性幹細胞を前部原始線条（Anterior Primitive Streak）に分化させる工程である。前部原始線条に分化したことは、前部原始線条マーカーであるTBXT（T-box transcription factor T）およびMIXL1（Mix paired-like homeobox）の少なくとも1つが発現することにより確認することができる。したがって、工程（１）は、TBXTおよびMIXL1の少なくとも1つの発現が確認されるまで継続することが好ましい。マーカーの発現は、RT-PCR、ウエスタンブロッティング等の公知の方法により確認することができる。例えば、ヒトTBXT、ヒトTBX6およびヒトMIXL1の塩基配列およびアミノ酸配列は、以下のNCBIアクセッション番号で取得することができる。
　ヒトTBXT：塩基配列 NM_003181.4、アミノ酸配列 NP_003172.1
　ヒトMIXL1：塩基配列 NM_001282402.2、アミノ酸配列 NP_001269331.1
　工程（１）の培養時間は12時間、14時間、16時間、18時間、20時間、22時間以上であってもよい。また、工程（１）の培養時間は36時間、34時間、32時間、30時間、28時間、26時間以下であってもよい。好ましくは約24時間である。
　工程（２）では、工程（１）で培養した細胞を、誘導因子としてWntシグナル活性化剤、TGFβシグナル阻害剤およびBMPシグナル阻害剤のみを含有する第二の分化培地に交換して培養する。Wntシグナル活性化剤は、第一の分化培地で使用したものと同じものを使用すればよい。TGFβシグナル阻害剤としては、例えば、A83-01（CAS No. 909910-43-6）、LY364947（CAS No. 396129-53-6）、SB431542（CAS No. 301836-41-9）、LY2157299（CAS No. 700874-72-2）、LY2109761（CAS No. 700874-71-1）、SB525334（CAS No. 356559-20-1）、SB505124（CAS No. 694433-59-5）、GW788388（CAS No. 452342-67-5）、616453（CAS No. 356559-13-2）などが挙げられる。BMPシグナル阻害剤としては、LDN-193189（CAS No. 1062368-24-4）、Dorsomorphin（CAS No. 866405-64-3）、DMH1（CAS No. 1206711-16-1）、K02288（CAS No. 1431985-92-0）などが挙げられる。Wntシグナル活性化剤、TGFβシグナル阻害剤およびBMPシグナル阻害剤は、いずれも組換えタンパク質でないことが好ましい。Wntシグナル活性化剤としてCHIRを用いる場合、その濃度は通常0.01μM～30μMであり、好ましくは約5μMである。TGFβシグナル阻害剤としてA83-01を用いる場合、その濃度は通常0.01μM～10μMであり、好ましくは約1μMである。BMPシグナル阻害剤としてLDN-193189を用いる場合、その濃度は通常0.005μM～2μMであり、好ましくは約0.25μMである。
　第一の分化培地を第二の分化培地に交換することにより工程（２）を開始する。培地交換の際にはPBS等で細胞を洗浄してもよい。工程（２）は前部原始線条を沿軸中胚葉（Paraxial Mesoderm）に分化させる工程である。沿軸中胚葉に分化したことは、沿軸中胚葉マーカーであるTBX6（T-box transcription factor 6）およびMSGN1（mesogenin-1）の少なくとも1つが発現することにより確認することができる。したがって、工程（２）は、TBX6およびMSGN1の少なくとも1つの発現が確認されるまで継続することが好ましい。マーカーの発現は、RT-PCR、ウエスタンブロッティング等の公知の方法により確認することができる。例えば、ヒトTBX6およびヒトMSGN1の塩基配列およびアミノ酸配列は、以下のNCBIアクセッション番号で取得することができる。
　ヒトTBX6：塩基配列 NM_004608.4、アミノ酸配列 NP_004599.2
　ヒトMSGN1：塩基配列 NM_001105569.3、アミノ酸配列 NP_001099039.1
　工程（２）の培養時間は12時間、14時間、16時間、18時間、20時間、22時間以上であってもよい。また、工程（２）の培養時間は36時間、34時間、32時間、30時間、28時間、26時間以下であってもよい。好ましくは約24時間である。
　工程（３）では、工程（２）で培養した細胞を、誘導因子としてWntシグナル阻害剤、TGFβシグナル阻害剤およびBMPシグナル阻害剤のみを含有する第三の分化培地に交換して培養する。TGFβシグナル阻害剤およびBMPシグナル阻害剤は、いずれも第二の分化培地で使用したものと同じものを使用すればよい。Wntシグナル阻害剤としては、Wnt-C59（C59、CAS No. 1243243-89-1）、IWR-1-endo（CAS No. 1127442-82-3）、IWP-2（CAS No. 686770-61-6）、IWP-4（CAS No. 686772-17-8）、XAV-939（CAS No. 284028-89-3）などが挙げられる。Wntシグナル阻害剤、TGFβシグナル阻害剤およびBMPシグナル阻害剤は、いずれも組換えタンパク質でないことが好ましい。Wntシグナル阻害剤としてC59を用いる場合、その濃度は通常10pM～2μMであり、好ましくは約1μMである。TGFβシグナル阻害剤としてA83-01を用いる場合、その濃度は通常0.01μM～10μMであり、好ましくは約1μMである。BMPシグナル阻害剤としてLDN-193189を用いる場合、その濃度は通常0.005μM～2μMであり、好ましくは約0.25μMである。
　第二の分化培地を第三の分化培地に交換することにより工程（３）を開始する。培地交換の際にはPBS等で細胞を洗浄してもよい。工程（３）は沿軸中胚葉を体節（Somite）に分化させる工程である。体節に分化したことは、体節マーカーであるPARAXIS（transcription factor 15）、MESP2（mesoderm posterior protein 2）、PAX3（paired box 3）およびFOXC2（forkhead box C2）の少なくとも1つの発現することにより確認することができる。したがって、工程（３）は、PARAXIS、MESP2、PAX3およびFOXC2の少なくとも1つの発現が確認されるまで継続することが好ましい。マーカーの発現は、RT-PCR、ウエスタンブロッティング等の公知の方法により確認することができる。例えば、ヒトPARAXIS、ヒトMESP2、ヒトPAX3およびヒトFOXC2の塩基配列およびアミノ酸配列は、以下のNCBIアクセッション番号で取得することができる。
　ヒトPARAXIS：塩基配列 NM_004609.4、アミノ酸配列 NP_004600.3
　ヒトMESP2：塩基配列 NM_001039958.2、アミノ酸配列 NP_001035047.1
　ヒトPAX3：塩基配列 NM_181457.4、アミノ酸配列 NP_852122.1
　ヒトFOXC2：塩基配列 NM_005251.3、アミノ酸配列 NP_005242.1
　工程（３）の培養時間は12時間、14時間、16時間、18時間、20時間、22時間以上であってもよい。また、工程（３）の培養時間は36時間、34時間、32時間、30時間、28時間、26時間以下であってもよい。好ましくは約24時間である。
　工程（４）では、工程（３）で培養した細胞を、誘導因子としてヘッジホッグシグナル活性化剤、ならびにBMPシグナル阻害剤およびWntシグナル阻害剤からなる群より選択される少なくとも1つのみを含有する第四の分化培地に交換して培養する。第四の分化培地に含まれる誘導因子は、ヘッジホッグシグナル活性化剤とBMPシグナル阻害剤のみでもよく、ヘッジホッグシグナル活性化剤とWntシグナル阻害剤のみでもよく、ヘッジホッグシグナル活性化剤とBMPシグナル阻害剤とWntシグナル阻害剤のみでもよい。BMPシグナル阻害剤は、第二および第三の分化培地で使用したものと同じものを使用すればよく、Wntシグナル阻害剤は第三の分化培地で使用したものと同じものを使用すればよい。ヘッジホッグシグナル活性化剤としては、Smoothened Agonist（SAG、CAS No. 912545-86-9）、Purmorphamine（CAS No. 483367-10-8）、Hh-Ag1.5（CAS No. 612542-14-0）などが挙げられる。ヘッジホッグシグナル活性化剤、BMPシグナル阻害剤およびWntシグナル阻害剤は、いずれも組換えタンパク質でないことが好ましい。ヘッジホッグシグナル活性化剤としてSAGを用いる場合、その濃度は通常0.001μM～1μMであり、好ましくは約1μMである。BMPシグナル阻害剤としてLDN-193189を用いる場合、その濃度は通常0.005μM～2μMであり、好ましくは約0.25μMである。Wntシグナル阻害剤としてC59を用いる場合、その濃度は通常10pM～2μMであり、好ましくは約1μMである。
　第三の分化培地を第四の分化培地に交換することにより工程（４）を開始する。培地交換の際にはPBS等で細胞を洗浄してもよい。工程（４）は体節を椎板（sclerotome）に分化させる工程である。椎板に分化したことは、椎板マーカーであるPAX1（paired box 1）、PAX9（paired box 9）、SOX9（SRY-box transcription factor 9）およびNKX3.2（NK3 homeobox 2）の少なくとも1つの発現することにより確認することができる。したがって、工程（３）は、PAX1、PAX9、FOXC2、SOX9およびNkx3.2の少なくとも1つの発現が確認されるまで継続することが好ましい。マーカーの発現は、RT-PCR、ウエスタンブロッティング等の公知の方法により確認することができる。例えば、ヒトPAX1、ヒトPAX9、ヒトSOX9およびヒトNKX3.2の塩基配列およびアミノ酸配列は、以下のNCBIアクセッション番号で取得することができる。
　ヒトPAX1：塩基配列 NM_006192.5、アミノ酸配列 NP_006183.2
　ヒトPAX9：塩基配列 NM_006194.4、アミノ酸配列 NP_006185.1
　ヒトSOX9：塩基配列 NM_000346.4、アミノ酸配列 NP_000337.1
　ヒトNkx3.2：塩基配列 NM_001189.4、アミノ酸配列 NP_001180.1
　工程（４）の培養時間は36時間、38時間、40時間、42時間、44時間、46時間以上であってもよい。また、工程（２）の培養時間は84時間、82時間、80時間、78時間、76時間、74時間以下であってもよい。好ましくは約48～約72時間である。
　本発明の製造方法は、培養系から異種由来の成分を排除するゼノフリー（Xeno-Free）条件と、フィーダー細胞を使用しないフィーダーフリー条件を満たす培養環境で実施することができる。したがって、本発明の製造方法を用いて、ゼノフリーおよびフィーダーフリーの培養系で製造された椎板細胞は、ヒトへの生体移植用として好適である。
〔軟骨組織の製造方法〕
　本発明は、軟骨組織の製造方法を提供する。本発明の軟骨組織の製造方法は、本発明の製造方法で製造された椎板細胞を、軟骨誘導因子を含まない軟骨形成基本培地で三次元培養する工程を含むものであればよい。軟骨誘導因子としては、トランスフォーミング増殖因子-β1（Transforming Growth Factor-β1：TGF-β1）、骨形成タンパク質-2（Bone Morphogenetic Protein-2：BMP-2）、骨形成タンパク質-4（Bone Morphogenetic Protein-4：BMP-4）、増殖分化因子-5（Growth Differentiation Factor-5：GDF-5）、インスリン、軟骨形成性化合物TD-198946などが知られている。
　本発明の軟骨組織の製造方法は、公知の三次元培養による軟骨誘導方法において、軟骨誘導因子を含まない軟骨形成基本培地を用いて実施することができる。公知の三次元培養による軟骨誘導方法としては、例えば、Matsudaら（Nature. 2020 Apr;580(7801):124-129. doi: 10.1038/s41586-020-2144-9. Epub 2020 Apr 1.）の方法、Yamashitaら（Stem Cell Reports. 2015 Mar 10;4(3):404-18. doi: 10.1016/j.stemcr.2015.01.016. Epub 2015 Feb 26.）の方法、Yamashitaら（Nature. 2014 Sep 25;513(7519):507-11）の方法、Makayら（Tissue Eng. 1998;4(4):415-28）の方法、Oldershawら（Nat Biotechnol, 2010 Nov;28(11):1187-94.）の方法、Nasuら（PLoS One. 2013; 8(1): e53771）の方法、Hinoら（Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 Dec 15; 112(50): 15438-15443）の方法などが挙げられる。
　三次元培養による軟骨誘導方法は、上記Matsudaら（Nature. 2020）の方法を一部改変した方法であってもよい。具体的には、例えば、本発明の製造方法で製造された椎板細胞をROCK阻害剤含有椎板誘導培地に懸濁し、低接着表面プレートに播種して三次元細胞凝集体を形成させ、軟骨形成因子を含有しない軟骨形成基本培地に培地交換して培養する方法であってもよい。三次元培養による軟骨誘導方法は、Yamashitaら（Stem Cell Reports. 2015）の方法を一部改変した方法であってもよい。具体的には、例えば、本発明の製造方法で製造された椎板細胞の培地を、軟骨形成因子を含有しない軟骨形成基本培地に交換して軟骨結節が形成されるまで培養し、軟骨結節をプレートから剥がして低付着表面プレートに移して浮遊培養を行う方法であってもよい。
　軟骨形成基本培地は、公知の軟骨形成基本培地から適宜選択して使用すればよい。例えば、本明細書の実施例３で使用した軟骨形成基本培地、上記の公知の三次元培養による軟骨誘導方法として例示した各文献に記載された軟骨形成基本培地などを使用することができる。
　本発明の軟骨組織の製造方法は、ゼノフリー条件およびフィーダーフリー条件を満たす培養環境で実施することができるので、本発明の軟骨組織の製造方法により製造された軟骨組織は、ヒトへの生体移植用として好適である。
〔軟骨内骨化組織の製造方法〕
　本発明は、軟骨内骨化組織の製造方法を提供する。本発明の軟骨内骨化組織の製造方法の第一の実施形態は、本発明の製造方法で製造された椎板細胞を、ヒト以外の哺乳動物に移植する工程、および該哺乳動物から移植した椎板細胞由来の組織を摘出する工程を含むものであればよい。ヒト以外の哺乳動物は特に限定されないが、ヒト多能性幹細胞から分化させた椎板細胞を用いる場合、免疫不全動物を用いることが好ましい。免疫不全動物としては、市販の免疫不全マウス、免疫不全ラット、免疫不全ブタを用いることができる。
　移植部位は特に限定されないが、移植組織が形成されやすい部位であることが好ましい。具体的には、例えば、腎被膜下、皮下組織内、骨・軟骨組織内部およびその周囲などが挙げられる。椎板細胞の移植は、本発明の製造方法で製造された椎板細胞の細胞懸濁液を調製し、移植部位に注射器等を用いて細胞懸濁液を注入することにより行うことができる。移植した椎板細胞由来の組織が形成されていることは、例えば、Ｘ線マイクロコンピューター断層撮影（Ｘ線マイクロＣＴ）の画像を経時的に取得し、石灰化組織の形成および増大を観察することにより、確認することができる。
　哺乳動物から移植した椎板細胞由来の組織を摘出する方法は特に限定されないが、哺乳動物を麻酔下で、または安楽死させた後に、一般的な外科的手法を用いて行うことが好ましい。移植した椎板細胞由来の組織を摘出する時期は特に限定されない。石灰化組織の形成および増大の程度から、使用目的に適した時期の軟骨内骨化組織を摘出すればよい。摘出した軟骨内骨化組織は、適切な生理的緩衝液または培地に浸漬し、各種用途に用いることができる。
　本発明の軟骨内骨化組織の製造方法の第二の実施形態は、本発明の製造方法で製造された椎板細胞を、軟骨誘導因子を含むまたは含まない軟骨形成基本培地で三次元培養して軟骨組織を製造する工程、および該軟骨組織を、骨誘導因子を含むまたは含まない骨形成基本培地で三次元培養して軟骨内骨化組織を製造する工程を含むものであればよい。
　本発明の製造方法で製造された椎板細胞を、軟骨誘導因子を含むまたは含まない軟骨形成基本培地で三次元培養して軟骨組織を製造する工程は、本発明の軟骨組織の製造方法と同じ方法、または、本発明の軟骨組織の製造方法において、軟骨誘導因子を含む軟骨形成基本培地を用いる方法で実施することができる。軟骨誘導因子としては、TGF-β1、BMP-2、BMP-4、GDF-5、インスリン、TD-198946などが挙げられる。
　得られた軟骨組織を、骨誘導因子を含むまたは含まない骨形成基本培地で三次元培養して軟骨内骨化組織を製造する工程は、軟骨組織を三次元培養して骨分化誘導する公知の方法を用いて実施することができる。例えば、軟骨組織を形成するために使用した軟骨形成基本培地を、骨形成基本培地に交換して引き続き三次元培養を行う方法などが挙げられる。
　骨形成基本培地は、公知の骨形成基本培地から適宜選択して使用すればよい。例えば、本明細書の実施例３で使用した骨形成基本培地、Butteryら（Tissue Eng 2001 Feb;7(1):89-99.）に記載の骨形成基本培地、Kawaguchiら（Bone 2005 May;36(5):758-69）に記載の骨形成基本培地、Ohbaら（FASEB J. 2007 Jun;21(8):1777-87）に記載の骨形成基本培地、Kankeら（Stem Cell Reports. 2014 May 22;2(6):751-60）に記載の骨形成基本培地などが挙げられる。骨形成基本培地は、骨誘導因子を含むものであってもよく、骨誘導因子を含まないものであってもよい。骨誘導因子としては、骨形成タンパク質-2（BMP-2）、ヘッジホッグシグナル活性化剤（例えば、Smoothened Agonist（SAG）等）、Wntタンパク質、線維芽細胞増殖因子-2（FGF-2）、多価不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid：PUFA）、スタチンなどのHMG-CoA還元酵素阻害剤、へリオキサンチン類縁体などが挙げられる。
　本発明の軟骨内骨化組織の製造方法の第二の実施形態は、軟骨誘導因子を含まない軟骨形成基本培地および骨誘導因子を含まない骨形成基本培地を用いて、軟骨内骨化組織を製造できる点に特徴がある。したがって、本発明の軟骨内骨化組織の製造方法の第二の実施形態は、コストを削減できる、手法を簡略化できる、均質な軟骨内骨化組織を製造できるといった利点を有する。
　本発明の軟骨内骨化組織の製造方法は、ゼノフリー条件およびフィーダーフリー条件を満たす培養環境で実施することができるので、本発明の軟骨内骨化組織の製造方法により製造された軟骨内骨化組織は、ヒトへの生体移植用として好適である。また、本発明の軟骨内骨化組織の製造方法により製造された軟骨内骨化組織は、発生過程における骨形成の分子機序の研究、骨疾患の病態研究、骨疾患治療薬のスクリーニング等に好適に用いることができる。
〔スクリーニング方法〕
　本発明は、軟骨形成制御物質のスクリーニング方法および骨形成制御物質のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法に供される被験物質は特に限定されず、核酸、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、細胞培養上清、植物抽出液、哺乳動物の組織抽出液、血漿等であってもよい。被験物質は、新規な物質であってもよいし、公知の物質であってもよい。これら被験物質は塩を形成していてもよい。被験物質の塩としては、生理学的に許容される酸や塩基との塩が好ましい。
（１）軟骨形成制御物質のスクリーニング方法
　本発明は、軟骨形成制御物質のスクリーニング方法を提供する。本発明の軟骨形成制御物質のスクリーニング方法の第一の実施形態は、本発明の製造方法で製造された椎板細胞を、軟骨誘導因子を含まない軟骨形成基本培地を用いて、被験物質の存在下または非存在下で三次元培養して軟骨組織を形成させる工程、および被験物質非存在下で形成した軟骨組織と比較して軟骨組織における軟骨量を増加または減少させる被験物質を選択する工程を含むものであればよい。
　本発明の製造方法で製造された椎板細胞を、軟骨誘導因子を含まない軟骨形成基本培地を用いて、被験物質の存在下または非存在下で三次元培養して軟骨組織を形成させる工程（第１工程）は、本発明の軟骨組織の製造方法と同じ方法において、軟骨形成基本培地に被験物質を添加することにより行うことができる。軟骨形成基本培地に被験物質を添加する時期は、第１工程の開始と同時でもよく、第１工程が開始してから一定時間経過後であってもよい。椎板細胞と被験物質が接触している期間は、第１工程の全期間でもよく、第１工程の一部の期間であってもよい。
　被験物質非存在下で形成した軟骨組織と比較して軟骨組織における軟骨量を増加または減少させる被験物質を選択する工程（第２工程）では、被験物質非存在下で形成した軟骨組織の軟骨量と被験物質存在下で形成した軟骨組織の軟骨量を比較する。軟骨量の比較は、例えば、軟骨組織の組織標本を作製してサフラニンO染色し、染色された領域の面積を比較すること、リンタングステン酸溶液あるいはRuthenium Redで染色した組織のＸ線ＣＴ像における軟骨体積の定量化等により行うことができる。
　被験物質非存在下で形成した軟骨組織と比較して、被験物質存在下で形成した軟骨組織の軟骨量を増加させた被験物質を、軟骨形成を促進する物質として選択することができる。被験物質が軟骨量を増加させる程度は特に限定されないが、例えば、被験物質非存在下で形成した軟骨組織と比較して120％以上、130％以上、140％以上、150％以上、170％以上、180％以上、190％以上、200％以上増加させる被験物質を選択してもよい。
　被験物質非存在下で形成した軟骨組織と比較して、被験物質存在下で形成した軟骨組織の軟骨量を減少させた被験物質を、軟骨形成を抑制する物質として選択することができる。被験物質が軟骨量を減少させる程度は特に限定されないが、例えば、被験物質非存在下で形成した軟骨組織と比較して90％以下、80％以下、70％以下、60％以下、50％以下に減少させる被験物質を選択してもよい。
　本発明の軟骨形成制御物質のスクリーニング方法の第二の実施形態は、本発明の製造方法で製造された椎板細胞をヒト以外の哺乳動物に移植する工程、該哺乳動物に被験物質を投与する工程、該哺乳動物から移植した椎板細胞由来の組織を摘出する工程、被験物質を投与していない哺乳動物から摘出した移植組織と比較して、移植組織の軟骨量を増加または減少させる被験物質を選択する工程を含むものであればよい。
　本発明の製造方法で製造された椎板細胞をヒト以外の哺乳動物に移植する工程（第１工程）は、本発明の軟骨内骨化組織の製造方法の第一の実施形態と同じ方法で行うことができる。哺乳動物に被験物質を投与する工程（第２工程）では、第１工程で椎板細胞を移植した哺乳動物に被験物質を投与する。投与は、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与等の全身投与であってもよく、移植部位またはその近傍への局所投与であってもよい。投与量、投与時期、投与回数、投与期間等は、用いる被験物質に応じて適宜設定される。
　哺乳動物から移植した椎板細胞由来の組織を摘出する工程（第３工程）は、本発明の軟骨内骨化組織の製造方法の第一の実施形態と同じ方法で行うことができる。摘出時期は特に限定されないが、移植した椎板細胞由来の組織において、軟骨量が比較可能なレベルに増大した時期が好ましい。摘出時期は、予備検討を行うことにより設定することが好ましい。
　被験物質を投与していない哺乳動物から摘出した移植組織と比較して、移植組織の軟骨量を増加または減少させる被験物質を選択する工程（第４工程）では、被験物質を投与していない哺乳動物から摘出した移植組織の軟骨量と被験物質を投与した哺乳動物から摘出した移植組織の軟骨量を比較する。軟骨量の比較は、本発明の軟骨形成制御物質のスクリーニング方法の第一の実施形態と同じように行うことができ、被験物質を投与していない哺乳動物から摘出した移植組織と比較して移植組織の軟骨量を増加させる被験物質および減少させる被験物質を、それぞれ軟骨形成を促進する物質および軟骨形成を抑制する物質として選択することができる。被験物質が軟骨量を増加させる程度および被験物質が軟骨量を減少させる程度も、本発明の軟骨形成制御物質のスクリーニング方法の第一の実施形態と同じ基準を適用することができる。
　本発明の軟骨形成制御物質のスクリーニング方法の第三の実施形態は、本発明の製造方法で製造された椎板細胞をヒト以外の哺乳動物に移植する工程、該哺乳動物から移植した椎板細胞由来の組織を摘出し培養系に移行する工程、該移植組織と被験物質を接触させる工程、被験物質と接触していない移植組織と比較して、移植組織の軟骨量を増加または減少させる被験物質を選択する工程を含むものであればよい。
　本発明の製造方法で製造された椎板細胞をヒト以外の哺乳動物に移植する工程（第１工程）は、本発明の軟骨内骨化組織の製造方法の第一の実施形態と同じ方法で行うことができる。哺乳動物から移植した椎板細胞由来の組織を摘出し培養系に移行する工程（第２工程）における、移植した椎板細胞由来の組織を摘出は、本発明の軟骨内骨化組織の製造方法の第一の実施形態と同じ方法で行うことができる。摘出時期は特に限定されないが、移植した椎板細胞由来の組織において、軟骨量が増大の過程にある時期が好ましい。軟骨量が増大の過程にある時期は、予備検討を行うことにより設定することができる。摘出した組織の培養系への移行は、摘出した組織を適当な培地を用いて培養することにより行うことができる。用いる培地としては、例えば、軟骨誘導因子を含むまたは含まない軟骨形成基本培地が挙げられる。
　移植組織と被験物質を接触させる工程（第３工程）では、培養系に移行した移植組織と被験物質を接触させる。接触させる方法は特に限定されないが、例えば、培地に被験物質を添加する方法が挙げられる。被験物質を添加する時期は、第２工程において培養系に移行した直後でもよく、培養系に移行した後一定時間経過後であってもよい。移植組織と被験物質が接触している期間も特に限定されず、培養期間の全部であってもよく、培養期間の一部であってもよい。
　被験物質と接触していない移植組織と比較して、移植組織の軟骨量を増加または減少させる被験物質を選択する工程（第４工程）では、被験物質と接触していない移植組織の軟骨量と被験物質と接触した移植組織の軟骨量を比較する。軟骨量の比較は、本発明の軟骨形成制御物質のスクリーニング方法の第一の実施形態と同じように行うことができ、被験物質と接触していない移植組織と比較して移植組織の軟骨量を増加させる被験物質および減少させる被験物質を、それぞれ軟骨形成を促進する物質および軟骨形成を抑制する物質として選択することができる。被験物質が軟骨量を増加させる程度および被験物質が軟骨量を減少させる程度も、本発明の軟骨形成制御物質のスクリーニング方法の第一の実施形態と同じ基準を適用することができる。
　本発明の軟骨形成制御物質のスクリーニング方法により選択された被験物質は、軟骨疾患の予防および／または治療用医薬の候補物質、あるいは軟骨形成メカニズムを理解するための研究用材料として有用である。軟骨疾患としては、例えば、変形性関節症、軟骨全層・部分欠損、軟骨異形成症などの軟骨に異常を示す先天性疾患などが挙げられる。
（２）骨形成制御物質のスクリーニング方法
　本発明は、骨形成制御物質のスクリーニング方法を提供する。本発明の骨形成制御物質のスクリーニング方法の第一の実施形態は、本発明の製造方法で製造された椎板細胞から分化誘導された軟骨組織を、骨形成基本培地を用いて被験物質の存在下または非存在下で三次元培養して骨組織を形成させる工程、および被験物質非存在下で形成した骨組織と比較して、骨組織における石灰化量を増加または減少させる被験物質を選択する工程を含むものであればよい。
　本発明の製造方法で製造された椎板細胞から分化誘導された軟骨組織を、骨形成基本培地を用いて被験物質の存在下または非存在下で三次元培養して骨組織を形成させる工程（第１工程）は、本発明の軟骨内骨化組織の製造方法の第二の実施形態と同じ方法において、骨形成基本培地に被験物質を添加することにより行うことができる。骨形成基本培地は、骨誘導因子を含んでいてもよく、骨形成因子を含んでいなくてもよい。骨形成基本培地に被験物質を添加する時期は、第１工程の開始と同時でもよく、第１工程が開始してから一定時間経過後であってもよい。椎板細胞と被験物質が接触している期間は、前記第１工程の全期間でもよく、前記第１工程の一部の期間であってもよい。
　被験物質非存在下で形成した骨組織と比較して骨組織における骨量を増加または減少させる被験物質を選択する工程（第２工程）では、被験物質非存在下で形成した骨組織の骨量と被験物質存在下で形成した骨組織の骨量を比較する。骨量の比較は、例えば、骨組織の組織標本を作製してコッサ染色し、染色された領域の面積を比較すること、Ｘ線ＣＴ像における骨量の定量化、骨密度の定量化等により行うことができる。
　被験物質非存在下で形成した骨組織と比較して、被験物質存在下で形成した骨組織の骨量を増加させた被験物質を、骨形成を促進する物質として選択することができる。被験物質が骨量を増加させる程度は特に限定されないが、例えば、被験物質非存在下で形成した骨組織と比較して120％以上、130％以上、140％以上、150％以上、170％以上、180％以上、190％以上、200％以上増加させる被験物質を選択してもよい。
　被験物質非存在下で形成した骨組織と比較して、被験物質存在下で形成した骨組織の骨量を減少させた被験物質を、骨形成を抑制する物質として選択することができる。被験物質が骨量を減少させる程度は特に限定されないが、例えば、被験物質非存在下で形成した骨組織と比較して90％以下、80％以下、70％以下、60％以下、50％以下に減少させる被験物質を選択してもよい。
　本発明の骨形成制御物質のスクリーニング方法の第二の実施形態は、本発明の製造方法で製造された椎板細胞をヒト以外の哺乳動物に移植する工程、該哺乳動物に被験物質を投与する工程、該哺乳動物から移植した椎板細胞由来の組織を摘出する工程、被験物質を投与していない哺乳動物から摘出した移植組織と比較して、移植組織の骨量を増加または減少させる被験物質を選択する工程を含むものであればよい。
　本発明の製造方法で製造された椎板細胞をヒト以外の哺乳動物に移植する工程（第１工程）は、本発明の軟骨内骨化組織の製造方法の第一の実施形態と同じ方法で行うことができる。哺乳動物に被験物質を投与する工程（第２工程）では、第１工程で椎板細胞を移植した哺乳動物に被験物質を投与する。投与は、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与等の全身投与であってもよく、移植部位またはその近傍への局所投与であってもよい。投与量、投与時期、投与回数、投与期間等は、用いる被験物質に応じて適宜設定される。
　哺乳動物から移植した椎板細胞由来の組織を摘出する工程（第３工程）は、本発明の軟骨内骨化組織の製造方法の第一の実施形態と同じ方法で行うことができる。摘出時期は特に限定されないが、移植した椎板細胞由来の組織において、骨量が比較可能なレベルに増大した時期が好ましい。摘出時期は、予備検討を行うことにより設定することが好ましい。
　被験物質を投与していない哺乳動物から摘出した移植組織と比較して、移植組織の骨量を増加または減少させる被験物質を選択する工程（第４工程）では、被験物質を投与していない哺乳動物から摘出した移植組織の骨量と被験物質を投与した哺乳動物から摘出した移植組織の骨量を比較する。骨量の比較は、本発明の骨形成制御物質のスクリーニング方法の第一の実施形態と同じように行うことができ、被験物質を投与していない哺乳動物から摘出した移植組織と比較して移植組織の骨量を増加させる被験物質および減少させる被験物質を、それぞれ骨形成を促進する物質および骨形成を抑制する物質として選択することができる。被験物質が骨量を増加させる程度および被験物質が軟骨量を減少させる程度も、本発明の骨形成制御物質のスクリーニング方法の第一の実施形態と同じ基準を適用することができる。
　本発明の骨形成制御物質のスクリーニング方法の第三の実施形態は、本発明の製造方法で製造された椎板細胞をヒト以外の哺乳動物に移植する工程、該哺乳動物から移植した椎板細胞由来の組織を摘出し培養系に移行する工程、該移植組織と被験物質を接触させる工程、被験物質と接触していない移植組織と比較して、移植組織の骨量を増加または減少させる被験物質を選択する工程を含むものであればよい。
　本発明の製造方法で製造された椎板細胞をヒト以外の哺乳動物に移植する工程（第１工程）は、本発明の軟骨内骨化組織の製造方法の第一の実施形態と同じ方法で行うことができる。哺乳動物から移植した椎板細胞由来の組織を摘出し培養系に移行する工程（第２工程）における、移植した椎板細胞由来の組織を摘出は、本発明の軟骨内骨化組織の製造方法の第一の実施形態と同じ方法で行うことができる。摘出時期は特に限定されないが、移植した椎板細胞由来の組織において、骨量が増大の過程にある時期が好ましい。摘出時期は予備検討を行うことにより設定することが好ましい。摘出した組織の培養系への移行は、摘出した組織を適当な培地を用いて培養することにより行うことができる。用いる培地としては、例えば、骨誘導因子を含むまたは含まない骨形成基本培地が挙げられる。
　移植組織と被験物質を接触させる工程（第３工程）は、本発明の軟骨形成制御物質のスクリーニング方法の第三の実施形態と同じ方法で行うことができる。被験物質と接触していない移植組織と比較して、移植組織の骨量を増加または減少させる被験物質を選択する工程（第４工程）では、被験物質と接触していない移植組織の軟骨量と被験物質と接触した移植組織の軟骨量を比較する。骨量の比較は、本発明の骨形成制御物質のスクリーニング方法の第一の実施形態と同じように行うことができ、被験物質を投与していない哺乳動物から摘出した移植組織と比較して移植組織の骨量を増加させる被験物質および減少させる被験物質を、それぞれ骨形成を促進する物質および骨形成を抑制する物質として選択することができる。被験物質が骨量を増加させる程度および被験物質が軟骨量を減少させる程度も、本発明の骨形成制御物質のスクリーニング方法の第一の実施形態と同じ基準を適用することができる。
　本発明の骨形成制御物質のスクリーニング方法の第四の実施形態は、第一の実施形態の第２工程に代えて、被験物質非存在下で形成した骨組織と比較して骨組織におけるZEB2（zinc finger E-box binding homeobox 2）発現量を増加または減少させる被験物質を選択する工程を含むものであればよい。この工程は、ZEB2とRUNX2（runt-related transcription factor 2）の発現量、またはZEB2とSP7（Sp7 transcription factor、別名Osterix）の発現量、またはZEB2とRUNX2とSP7の発現量を、同時に増加または減少させる被験物質を選択する工程であってもよい。なお、RUNX2およびSP7は、骨形成に必須の転写因子として公知である。
　発現量の測定は、タンパク質量を測定してもよく、mRNA量を測定してもよい。タンパク質量を測定する場合は、公知の方法で細胞からタンパク質を抽出し、公知のタンパク質量測定方法を用いて定量することができる。公知のタンパク質量測定方法としては、例えば、ウエスタンブロット法、EIA法、ELISA法、RIA法、タンパク質測定試薬を用いる方法などが挙げられる。mRNA量を測定する場合は、公知の方法で細胞からRNAを抽出し、公知のmRNA量測定方法を用いて定量することができる。公知のmRNA量測定方法としては、ノーザンブロット法、RT-PCR法、定量RT-PCR法、RNaseプロテクションアッセイなどが挙げられる。
　例えば、ヒトZEB2、ヒトRUNX2およびヒトSP7の塩基配列およびアミノ酸配列は、以下のNCBIアクセッション番号で取得することができる。
　ヒトZEB2：塩基配列 NM_001171653.2、アミノ酸配列 NP_001165124.1
　ヒトRUNX2：塩基配列 NM_001015051.4、アミノ酸配列 NP_001015051.3
　ヒトSP7：塩基配列 NM_001173467.3、アミノ酸配列 NP_001166938.1
　本発明の骨形成制御物質のスクリーニング方法の第五の実施形態は、第二の実施形態の第４工程に代えて、被験物質を投与していない哺乳動物から摘出した移植組織と比較して、移植組織のZEB2発現量を増加または減少させる被験物質を選択する工程を含むものであればよい。この工程は、ZEB2とRUNX2の発現量、またはZEB2とSP7の発現量、またはZEB2とRUNX2とSP7の発現量を、同時に増加または減少させる被験物質を選択する工程であってもよい。発現量の測定は、上記第四の実施形態と同様に行うことができる。
　本発明の骨形成制御物質のスクリーニング方法の第六の実施形態は、第三の実施形態の第４工程に代えて、被験物質と接触していない移植組織と比較して、移植組織のZEB2発現量を増加または減少させる被験物質を選択する工程を含むものであればよい。この工程は、ZEB2とRUNX2の発現量、またはZEB2とSP7の発現量、またはZEB2とRUNX2とSP7の発現量を、同時に増加または減少させる被験物質を選択する工程であってもよい。発現量の測定は、上記第四の実施形態と同様に行うことができる。
　本発明の骨形成制御物質のスクリーニング方法により選択された被験物質は、骨疾患の予防および／または治療用医薬の候補物質、あるいは骨形成メカニズムを理解するための研究用材料として有用である。骨疾患としては、例えば、骨粗鬆症、骨形成不全症などの骨に異常を示す先天性疾患、種々の原因による骨欠損などが挙げられる。
　以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
〔実施例１：ヒト多能性幹細胞から椎板細胞への分化誘導〕
１－１　実験方法
（１）使用細胞
　ヒトiPS細胞として、Col2.3-Cherry（COL）株（University of Connecticutより入手：Zujurら. Regen Ther 14:19-31, 2020）、201B7株（理科学研究所より入手：Takahashiら. Cell 131:861-872, 2007）およびNiPS株（理科学研究所より入手：Onoら. PLOS ONE 7:e42855, 2012）使用した。さらに、ヒトES細胞としてSEES3株（国立成育医療研究センターより入手：Akutsuら. Regen Ther 1:18-29, 2015）を使用した。
（２）使用培地
　以下の組成の合成培地（chemically defined medium）を使用する。DMEM/F12（Thermo Fisher Scientific; 11330032）、1% B27 Supplement Xeno-Free（Thermo Fisher Scientific; A148601）、1% ITS Liquid Media Supplement（Sigma-Aldrich; I3146）、1% MEM Non-Essential Amino Acids Solution（Thermo Fisher Scientific; 11140050）、55μM 2-Mercaptoethanol（0.1% of 55 mM 2-Mercaptoethanol in DPBS（Thermo Fisher Scientific; 21985023））。以下この合成培地をBIMと記載する。
　対照培地として、Lohら（Cell. 2016 Jul 14;166(2):451-467. doi: 10.1016/j.cell.2016.06.011.）に記載のCDM2基礎培地を使用する。CDM2基礎培地の組成は以下のとおりである。50% IMDM（+GlutaMAX, +HEPES, +Sodium Bicarbonate; Gibco, 31980-097）、50% F12（+GlutaMAX; Gibco, 31765-092）、1mg/mL polyvinyl alcohol（Sigma, P8136-250G）、1% v/v concentrated lipids（Gibco, 11905-031）、450μM monothioglycerol（Sigma, M6145）、0.7μg/mL insulin（Roche, 1376497）、15μg/mL transferrin（Roche, 652202）、1% v/v penicillin/streptomycin（Gibco）。
（３）細胞の準備
　70～80％コンフルエントになるようにヒトiPS細胞またはヒトES細胞を培養し、ピペッティングを約10回繰り返して、微小クランプを調製する。1μMチアゾビビン（Thiazovivin, ROCK阻害剤）を含むEssential 8 Medium（Thermo Fisher Scientific; A1517001）を用いて、調製した微小クランプを約1:16～約1:24に希釈し、ビトロネクチン（VTN-N：Thermo Fisher Scientific; A14700）でコーティングされた新しい培養プレートにまばらに継代して一夜培養する。
（４）椎板細胞への分化誘導
　椎板細胞への分化誘導は、無血清、ゼノフリー、フィーダーフリー、単層培養の条件で実施する。
（4-1）本発明の製造方法による椎板細胞への分化誘導
　培地に上記BIMを用い、以下の工程1～4で椎板細胞に分化させる。
●工程1：前部原始線条（Anterior Primitive Streak）への分化誘導（Day 0）
　準備したヒトiPS細胞またはヒトES細胞をPBS(-)で洗浄した後、5μM CHIR（Wntシグナル活性化剤）を添加したBIMで約24時間培養し、前部原始線条に分化させる。
●工程2：沿軸中胚葉（Paraxial Mesoderm）への分化誘導（Day 1）
　工程1で培養した細胞をPBS(-)で洗浄した後、5μM CHIR（Wntシグナル活性化剤）、1μM A83-01（TGFβ阻害剤）および0.25μM LDN-193189（BMPシグナル阻害剤）を添加したBIMで約24時間培養し、沿軸中胚葉に分化させる。
●工程3：体節（Somite）への分化誘導（Day 2）
　工程2で培養した細胞をPBS(-)で洗浄した後、1μM C59（Wntシグナル阻害剤）、1μM A83-01（TGFβ阻害剤）および0.25μM LDN-193189（BMPシグナル阻害剤）を添加したBIMで約24時間培養し、体節に分化させる。
●工程4：椎板（Sclerotome）への分化誘導（Day 3）
　工程3で培養した細胞をPBS(-)で洗浄した後、1μM SAG（ヘッジホッグシグナル活性化剤）、1μM C59（Wntシグナル阻害剤）および0.25μM LDN-193189（BMPシグナル阻害剤）を添加したBIMで約2日間培養し、椎板に分化させる。
（4-2）対照培地を用いる方法による椎板細胞への分化誘導
　対照培地（Lohら（Cell. 2016 Jul 14;166(2):451-467. doi: 10.1016/j.cell.2016.06.011.）に記載のCDM2基礎培地）を使用し、上記各工程において以下の誘導因子を添加して椎板細胞に分化させる。
●工程1で添加する誘導因子
　4μM CHIR、0.1μM PIK90、20 ng/mL FGF2および30 ng/mL Activin A。
●工程2で添加する誘導因子
　3μM CHIR、1μM A83-01、0.25μM LDN-193189および20 ng/mL FGF2。
●工程3で添加する誘導因子
　1μM C59、1μM A83-01、0.25μM LDN-193189および0.5μM PD0325901。
●工程4で添加する誘導因子
　1μM C59および5 nM 21K。
（５）椎板細胞マーカーの発現確認
　工程4の培養を行った細胞を回収し、ISOGEN（Nippon Gene, 319-90211）を用いて定法に従いRNA抽出を行い、ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA remover（TOYOBO, FSQ-301）を用いて、GeneAmp PCR System 9700（Applied Biosystems）上で逆転写、cDNA合成を行った。
椎板細胞マーカーとして、PAX1、PAX9およびNkx3.2のmRNA発現量を、FastStart Universal SYBR Green Master (Rox)（Roche, 04913850001）を用いて、7500 Fast Real-Time PCR System（Applied Biosystems）上で定量PCRにより測定した。対照として、分化誘導開始前の各細胞株についても、椎板細胞マーカー発現量を測定した。定量PCRで使用したプライマーは以下の通り：
hPAX1: forward, CGCTATGGAGCAGACGTATGGCGA（配列番号1）
hPAX1: reverse, AATGCGCAAGCGGATGGCGTTG（配列番号2）
hPAX9: forward, TGGTTATGTTGCTGGACATGGGTG（配列番号3）
hPAX9: reverse, GGAAGCCGTGACAGAATGACTACCT（配列番号4）
hNKX3.2: forward, GGAGGTTAAGACGTGTCGCA（配列番号5）
hNKX3.2: reverse, GCAGAGGGCAGAAGGTAGAC（配列番号6）
１－２　結果
　椎板細胞マーカーを測定した結果を図１に示した。図１中、「従来法」は対照培地を用いて分化誘導した細胞を示し、「新法」は本発明の製造方法を用いて分化誘導した細胞を示す。4種類のいずれの細胞を用いた場合も、本発明の製造方法で得られた細胞の椎板細胞マーカーの発現量は、3種類とも従来法で得られた細胞の椎板細胞マーカーの発現量より高発現であった。
〔実施例２：分化誘導したヒト椎板細胞のマウス腎被膜下への移植〕
２－１　実験方法
（１）移植用ヒト椎板細胞の調製
　実施例１（4-1）の工程1～4によりCol2.3-Cherry（COL）ヒトiPS細胞株から分化誘導したヒト椎板細胞（Day 5）をAccutase（Life Tech）で剥離し、遠心分離し、細胞数に応じて少量の冷BIM（50～250μL）に再懸濁する。椎板細胞懸濁液を等量の冷マトリゲル（Corning; 354234）で希釈し、移植するまで氷上で保持する。
（２）使用動物、移植および腎臓摘出
　8～12週齢の雄のNOD SCIDマウス（NOD.CB17-Prkdcscid/J、チャールズリバー）を使用した。吸入麻酔（2-3％イソフルレン）下にマウスの左腎直上の皮膚を1cm程度形成剪刀で切開する。続いて腹壁（筋および腹膜）を同程度切開することで腎臓を皮切部へ剖出し、腎被膜にごくわずかな切開を行い、約1.5×106～15×106個のヒト椎板細胞を含有する細胞懸濁液を数十～百μl吸引した状態の注射器に接続した26Gプラスチックカニューレを挿入する。カニューレは腎被膜下を数ミリメートル～1センチメートル程度進めた上で細胞懸濁液を注入する。腎臓を腹腔内へ還納し、腹壁を6-0ナイロンで縫合、最後に皮膚も同様に縫合して移植手術を終了する。移植後4、8、12、18および26週目にＸ線マイクロコンピューター断層撮影を行い、移植後8、18週でマウスを安楽死させ移植した腎臓を摘出し、組織学的分析に供する。
（３）Ｘ線マイクロコンピューター断層撮影（Ｘ線マイクロCT）
　Ｘ線マイクロCT装置（リガク、R_mCT2-FX）を用いて、腎臓の移植部位の画像を取得した。
（４）組織学的分析
　移植部位から石灰化組織を採取し、4％パラホルムアルデヒド／リン酸緩衝液中に4℃で16時間浸漬し、固定処理を行った。次に0.5M EDTA溶液中に4℃で1～2週間浸漬し、脱灰処理を行った。凍結切片については30%スクロース／リン酸緩衝液中に4℃で12時間浸漬し、凍結組織切片作製用包埋剤（サクラファインテックジャパン、ティシュー・テック O.C.T.コンパウンド）を用いて-80℃で包埋・凍結した。クライオトームを用いて10μmの厚さでブロックを薄切した。十分に切片を風乾し、リン酸緩衝液中で包埋剤を十分に溶解除去した後に染色に用いた。パラフィン切片については密閉式自動固定包埋装置（サクラファインテックジャパン、ティシュー・テック VIP5 ジュニア）を用いて21時間処理を行った後にパラフィン包埋を行った。ミクロトームを用いて5μmにブロックを薄切した。42℃の恒温水槽にて切片を延伸し、スライドへ設置、さらに42℃で余剰な水分を除き、37℃の恒温槽で十分に乾燥を行った。キシレン、エタノール、水に段階的に浸漬しパラフィンを十分に除去・水和した後に染色に用いた。ヘマトキシリン・エオジン染色（H-E染色：ヘマトキシリン溶液へ2分、水へ10分、95%エタノールへ数秒、エオジン溶液へ1分、100%エタノール溶液へ5分×3回、キシレンへ1分×3回、順々に浸漬した後にマリノールを用いて封入した）を行った。また、移植後18週目の組織切片について、H-E染色以外に、サフラニンO染色（ヘマトキシリン溶液へ2分、水へ10分、0.001％Fast green溶液へ5分、１％酢酸溶液へ10秒、サフラニン溶液へ5分、100%エタノール溶液へ5分×3回、キシレンへ1分×3回、順々に浸漬した後にマリノールを用いて封入した）、オイルレッドO染色（60％プロパノール溶液へ1分、オイルレッドO溶液へ15分、60％プロパノール溶液へ1分、ヘマトキシリン溶液へ数秒、水へ10分浸漬した後にグリセリン溶液を用いて封入した）および抗ヒト核抗体（Millipore、MAB1281）を用いた免疫染色を行った。比較のために、マウス胎児（胎齢18.5日）の脛骨を採取し、その骨端部の組織切片を作製して、H-E染色を行った。
２－２　結果
（１）Ｘ線マイクロCT画像
　移植部位のＸ線マイクロCT画像の観察結果を図２に示した。不透過像（白影）は石灰化組織を示す。移植したヒト椎板細胞は、マウスの腎被膜下で石灰化組織を形成しながら成長することが示された。
（２）H-E染色による移植部位石灰化組織の観察
　移植部位石灰化組織のH-E染色画像を図３に示した。（A）がマウス胎児脛骨骨端部、（B）がヒトiPS細胞から分化誘導した椎板細胞を移植後8週の石灰化組織、（C）がヒトiPS細胞から分化誘導した椎板細胞を移植後18週の石灰化組織、（D）がヒトES細胞から分化誘導した椎板細胞を移植後18週の石灰化組織の各H-E染色画像である。（A）のマウス胎児脛骨骨端部では、骨端部（図の上部）に周関節部増殖軟骨細胞の層、その下部に円柱状増殖軟骨細胞の層、その下部に肥大軟骨細胞の層が観察された。（B）、（C）および（D）の移植部位石灰化組織においても同様に周関節部増殖軟骨細胞の層、円柱状増殖軟骨細胞の層および肥大軟骨細胞の層が観察された。また（C）では、画像の下部に骨髄様組織が観察された。この結果は、移植したヒト椎板細胞がマウス体内で軟骨内骨化（内軟骨性骨化）を模倣するように成長したことを示す。
（３）サフラニンO染色による移植部位石灰化組織の観察
　移植後18週の移植部位石灰化組織のH-E染色画像およびサフラニンO染色画像を図４に示した。（A）がH-E染色画像、（B）がサフラニンO染色画像である。（B）では、軟骨基質タンパク質がサフラニンOにより赤く染色されていることが観察された。また、軟骨組織の内部には骨髄様組織が観察された。
（４）抗ヒト核抗体を用いた免疫染色による移植部位石灰化組織の観察
　移植後18週の移植部位石灰化組織の抗ヒト核抗体を用いた免疫染色画像を図５に示した。（A）が弱拡大画像、（B）が中拡大画像、（C）が強拡大画像である。移植部位の細胞核が染色されたことから、移植部位石灰化組織は移植したヒト椎板細胞から分化したことが明らかになった。なお、骨髄様組織において核が染色されていない部分はマウスの血球細胞および血管内皮細胞と考えられる。
（５）オイルレッドO染色による移植部位石灰化組織の観察
　移植後18週の移植部位石灰化組織のオイルレッドO染色画像および抗ヒト核抗体を用いた免疫染色画像を図６に示した。（A）がオイルレッドO染色の弱拡大画像、（B）がオイルレッドO染色の中拡大画像、（C）がオイルレッドO染色の強拡大画像、（D）が（C）に対応する抗ヒト核抗体を用いた免疫染色画像である。骨髄様組織中に、オイルレッドOにより赤く染色される脂肪細胞が存在することが示された。また、脂肪細胞の核が抗ヒト核抗体を用いた免疫染色により染色されたことから、脂肪細胞は移植したヒト椎板細胞から分化した細胞であることが示された。
〔実施例３：分化誘導したヒト椎板細胞のインビトロ三次元軟骨形成および軟骨内骨化〕
３－１　実験方法
（１）軟骨形成誘導プロトコル1（Matsudaら（Nature. 2020 Apr;580(7801):124-129. doi: 10.1038/s41586-020-2144-9. Epub 2020 Apr 1.）の一部改変、以下「従来法１」と記載する。）
　実施例１（4-1）の工程1～4によりSEES3ヒトES細胞株から分化誘導したヒト椎板細胞（Day 5）をAccutase（Life Tech）で剥離し、遠心分離し、10μMのROCK阻害剤Y-27632（Wako; 036-24023）を含む椎板誘導培地に再懸濁し、96ウェル低接着表面プレートに播種する（2.0～10×105個/ウェル）。一夜インキュベーションして、三次元細胞凝集体が形成されたことを確認した後、培地を軟骨形成基本培地（DMEM、1% ITS、1% FBS、2mM L-Glutamine (Invitrogen; 35050061)、0.1 mM MEM non-essential amino acids (Invitrogen; 11140050)、1 mM Sodium Pyruvate (Invitrogen; 11360070)、50 U of penicillin、50μg/mL of streptomycin、および50μg/mL ascorbic acid phosphate (#A4034; Sigma Aldrich)）、または軟骨形成因子（10 ng/ mLのBMP2、10 ng/ mLのTGFβ1、10 ng/ mLのGDF5）を添加した軟骨形成基本培地に交換する。その後2～3日ごとに培地交換する。
（２）軟骨形成誘導プロトコル2（Yamashitaら（Stem Cell Reports. 2015 Mar 10;4(3):404-18. doi: 10.1016/j.stemcr.2015.01.016. Epub 2015 Feb 26.）を改変、以下「従来法２」と記載する。）
　実施例１（4-1）の工程1～4によりSEES3ヒトES細胞株から分化誘導したヒト椎板（Day 5）の培地を、軟骨形成因子（10 ng/ mLのBMP2、10 ng/ mLのTGFβ1、10 ng/ mLのGDF5）を添加した上記の軟骨形成基本培地に交換する。その後2～3日ごとに培地交換する。9日後（Day 14）、軟骨結節をプレートから物理的に剥がし、ペトリ皿またはコーティングされていない低付着表面プレートに移して浮遊培養を行う。その後2～3日ごとに培地交換する。
（３）骨形成誘導
　Day 42（軟骨形成基本培地で37日間培養後）に、培地を骨形成基本培地（DMEM、10% FBS、50 U of penicillin、50 mg/ml of streptomycin、50 mg/ml of ascorbic acid、10 mM b-glycerophosphate (#G9422; Sigma Aldrich)、および0.1μM dexamethasone (#41-18861; Wako)）と交換する。これとは別に、多価不飽和脂肪酸（10μMリノール酸、15μMα-リノレン酸、10μMアラキドン酸、15μMドコサヘキサエン酸）、100 ng/ mL BMP2、および1μM SAGの骨誘導因子を添加した骨形成基本培地と交換する。その後2～3日ごとに培地交換する。
（４）軟骨形成基本培地で培養した細胞塊の組織学的分析
　軟骨形成基本培地に交換して培養したDay 42の細胞塊を採取し、4％パラホルムアルデヒド／リン酸緩衝液中に4℃で16時間浸漬し、固定処理を行った。密閉式自動固定包埋装置（サクラファインテックジャパン、ティシュー・テック VIP5 ジュニア）を用いて21時間処理を行った後にパラフィン包埋を行った。ミクロトームを用いて5μmにブロックを薄切した。42℃の恒温水槽にて切片を延伸し、スライドへ設置、さらに42℃で余剰な水分を除き、37℃の恒温槽で十分に乾燥を行った。キシレン、エタノール、水に段階的に浸漬しパラフィンを十分に除去・水和した後にサフラニンO染色を行った。
（５）軟骨形成基本培地および骨形成基本培地で培養した細胞塊の組織学的分析
　軟骨形成基本培地で培養した後、骨形成基本培地に交換して培養したDay 70の細胞塊を採取し、4％パラホルムアルデヒド／リン酸緩衝液中に4℃で16時間浸漬し、固定処理を行った。密閉式自動固定包埋装置（サクラファインテックジャパン、ティシュー・テック VIP5 ジュニア）を用いて21時間処理を行った後にパラフィン包埋を行った。ミクロトームを用いて5μmにブロックを薄切した。42℃の恒温水槽にて切片を延伸し、スライドへ設置、さらに42℃で余剰な水分を除き、37℃の恒温槽で十分に乾燥を行った。キシレン、エタノール、水に段階的に浸漬しパラフィンを十分に除去・水和した後にサフラニンO染色およびコッサ（von Kossa）染色を行った。
（６）軟骨誘導因子および骨誘導因子の有無による細胞塊の石灰化の確認
　軟骨形成基本培地で培養した後、骨形成基本培地に交換してDay 100まで培養し、細胞塊を含むウェルのＸ線画像（ソフテックス、M-60型）を撮影した。
３－２　結果
（１）軟骨形成基本培地で培養した細胞塊のサフラニンO染色
　Day 42の細胞塊の組織切片をサフラニンO染色した画像を図７に示した。（A）が従来法１の軟骨誘導因子なしの画像、（B）が従来法１の軟骨誘導因子ありの画像、（C）が従来法２の軟骨誘導因子ありの画像の画像である。いずれの細胞塊もサフラニンOで染色されており、軟骨に分化していることが確認された。この結果は、本発明の製造方法で得られた椎板細胞は、軟骨誘導因子を使用しなくても軟骨を形成できることを示す。
（２）軟骨形成基本培地で培養後、骨誘導因子を含まない骨形成基本培地で培養した細胞塊のサフラニンO染色およびコッサ染色
　軟骨誘導因子を添加した軟骨形成基本培地で培養した後、Day 42に骨誘導因子を含まない骨形成基本培地で培養したDay 70の細胞塊の組織切片をサフラニンO染色およびコッサ染色した画像を図８に示した。（A）が従来法１で培養した画像、（B）が従来法２で培養した画像である。どちらもの細胞塊もDay 42の細胞塊の染色像（図７）と比較してサフラニンOにより濃い赤色に染色されており、軟骨分化が進行していることが示された（上左、下）。しかし、コッサ染色された石灰化組織は観察されなかった（上右）。
（３）軟骨形成基本培地で培養後、骨誘導因子を含む骨形成基本培地で培養した細胞塊のサフラニンO染色およびコッサ染色
　本発明の製造方法で得られた椎板細胞を軟骨形成基本培地で培養し、Day 42以降は骨誘導因子を含む骨形成基本培地で培養したDay 70の細胞塊の組織切片をサフラニンO染色およびコッサ染色した画像を図９に示した。（A）が従来法１で軟骨誘導因子を含まない軟骨形成基本培地で培養した後骨誘導因子を含む骨形成基本培地で培養した細胞塊の画像、（B）が従来法１で軟骨誘導因子を含む軟骨形成基本培地で培養した後骨誘導因子を含む骨形成基本培地で培養した細胞塊の画像、（C）が従来法２で軟骨誘導因子を含む軟骨形成基本培地で培養した後骨誘導因子を含む骨形成基本培地で培養した細胞塊の画像である。いずれの細胞塊もコッサ染色により黒く染色される石灰化組織が存在していることが示された（上右、下）。この結果は、いずれの細胞塊も軟骨内骨化（内軟骨性骨化）が再現されていることを示す。
（４）軟骨形成基本培地で培養後、骨誘導因子を含むまたは含まない骨形成基本培地で培養した細胞塊のＸ線画像
　本発明の製造方法で得られた椎板細胞を、軟骨誘導因子を含むまたは含まない軟骨形成基本培地で培養し、Day 42に骨誘導因子を含むまたは含まない骨形成基本培地で培養したDay 100の細胞塊のＸ線画像を図１０に示した。図中、濃い黒色が石灰化部位を示す。いずれの条件で培養した場合も、Day 100の細胞塊には石灰化部位が存在することが示された。この結果は、長期培養することにより、軟骨誘導因子および骨誘導因子の有無に関わらず、軟骨を形成した細胞塊の石灰化が誘導されることを示す。
〔実施例４：本発明の製造方法とウシ胎児血清含有培地を用いて椎板細胞を製造（分化誘導）する方法との比較〕
４－１　実験方法
（１）使用培地
　本発明の製造方法には、実施例１に記載の合成培地（BIM）を使用した。ウシ胎仔血清含有培地として、10％ウシ胎児血清を含有するDMEM/F12を使用した。対照培地として、多能性幹細胞維持培地であるEssential 8 Mediumを使用した。
（２）細胞培養（椎板誘導）
　ヒトES細胞H9Zn2.3GFP株（University of Connecticutより入手：Xinら. Stem Cells Transl Med 3(10):1125-1137, 2014）を10～20%の播種密度で播種し、実施例1に記載の合成培地（BIM）あるいは10％ウシ胎児血清含有DMEM/F12中で、実施例１の（４）（4-1）に記載の工程に従って誘導因子を添加し、5日間培養した。培養終了後に、Cell Counting Kit-8（Dojindo, 341-07761）を用いて、細胞数を反映する吸光度を測定し、培養開始時の値に対する比として算出した。多重比較検定はDunnett法により行った。対照として、多能性幹細胞維持培地であるEssential 8 Medium中で誘導因子を加えずに5日間培養した。
４－２　結果
　結果を図１１に示した。合成培地（BIM）を使用した本発明の製造方法により、ヒトES細胞から椎板細胞に分化誘導した場合の細胞増殖（生存率）は、合成培地（BIM）をウシ胎児血清含有培地に変更してヒトES細胞から椎板細胞に分化誘導した場合の細胞増殖（生存率）と同等であった。
〔実施例６：新規骨形成転写因子候補の探索および機能解析〕
６－１　新規骨形成転写因子候補の探索
　実施例２（１）および（２）に記載の方法で、NOD SCIDマウスの腎被膜下にヒトiPS細胞COL株またはヒトES細胞H9Zn2.3GFP株から分化誘導した椎板細胞を移植した。移植後7週、19週でマウスを安楽死させヒトiPS細胞由来軟骨内骨化組織を採取し、同組織を構成する全細胞に対して、単一細胞遺伝子発現解析（シングルセルRNAシークエンス解析）を行った。また、移植後20週でヒトES細胞由来由来軟骨内骨化組織を採取し、オープンクロマチン領域と遺伝子発現を1細胞単位で同時に解析する単一細胞多層解析（マルチオーム解析）を行った。続いて、(i)単一細胞遺伝子発現解析において骨芽細胞特異的な発現を示した遺伝子、(ii)マルチオーム解析において骨芽細胞特異的な発現を示した遺伝子、(iii)マルチオーム解析において骨芽細胞特異的なオープンクロマチン領域に有意に結合モチーフが濃縮していた転写因子、をそれぞれ抽出した。
　結果を図１２に示した。（A）が上記(i)、(ii)および(iii)の関係を示すベン図であり、（B）が上記(i)、(ii)および(iii)の条件を全て満たす転写因子である。（B）に記載の10種の転写因子中に、骨組織における機能が不明なZEB2が見出された。そこで、ZEB2を新規骨形成性転写因子候補として選択した。
６－２　ZEB2のノックダウンによる機能解析
　ZEB2に対するshort hairpin RNA（shRNA）またはコントロールshRNAを発現するレンチウイルスを作製し、ヒト間葉系幹細胞（LONZA、PT-2501）に感染させた。感染後2日間、10% ウシ胎児血清および2μg/ml Puromycin（Sigma-Aldrich、P9620）を含むDMEMで培養し、感染細胞の選択を行った。その後、10％ ウシ胎児血清、50 μg/mL アスコルビン酸（Sigma-Aldrich、A4034）、10 mM β-グリセロリン酸（Sigma-Aldrich、G9422）、0.1 μM デキサメタゾン（Wako、41-18861）および100 ng/ml Bone morphogenetic protein-2 （BMP-2：Medtronic、7510050）をふくむDMEMで培養し、骨芽細胞分化誘導を行った。誘導開始時点（d0）および誘導後14日（d14）で、コントロールshRNA群（ctrl）および ZEB2 shRNA群（ZEB2）からmRNAを回収し、RT-qPCR法によって、ZEB2、RUNX2、SP7遺伝子の発現量を解析した。
　結果を図１３に示した。（A）がZEB2の結果、（B）がRUNX2の結果、（C）がSP7の結果である。いずれの転写因子もZEB2をノックダウンすることにより、発現量が減少した。
６－３　ZEB2の過剰発現による機能解析
　ZEB2遺伝子またはGFP遺伝子を発現するレトロウイルスを作製し、ヒト間葉系幹細胞（LONZA、PT-2501）に感染させた。上記と同様に、感染後2日間、10% ウシ胎児血清および2μg/ml Blasticidin（Wako、029-18701）を含むDMEMで培養し、感染細胞の選択を行った。続いて、骨芽細胞分化誘導を行い、誘導開始時点（d0）および誘導後14日（d14）で、GFP導入群（ctrl）およびZEB2導入群（ZEB2）からmRNAを回収し、RT-qPCR法によって、ZEB2、RUNX2、SP7遺伝子の発現量を解析した。
　結果を図１４に示した。（A）がZEB2の結果、（B）がRUNX2の結果、（C）がSP7の結果である。いずれの転写因子もZEB2を過剰発現させることにより、発現量が増加した。
　以上の結果から、ZEB2は骨芽細胞分化を正に制御することが明らかになった。
　なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。

Claims (21)

  1. 　多能性幹細胞からゼノフリーかつフィーダーフリー培養系で椎板細胞を製造する方法であって、以下の工程（１）～（４）を含む方法：
    （１）多能性幹細胞を誘導因子としてWntシグナル活性化剤のみを含有する第一の分化培地で培養する工程、
    （２）工程（１）で培養した細胞を、誘導因子としてWntシグナル活性化剤、TGFβシグナル阻害剤およびBMPシグナル阻害剤のみを含有する第二の分化培地に交換して培養する工程、
    （３）工程（２）で培養した細胞を、誘導因子としてWntシグナル阻害剤、TGFβシグナル阻害剤およびBMPシグナル阻害剤のみを含有する第三の分化培地に交換して培養する工程、および
    （４）工程（３）で培養した細胞を、誘導因子としてヘッジホッグシグナル活性化剤、ならびにBMPシグナル阻害剤およびWntシグナル阻害剤からなる群より選択される少なくとも1つのみを含有する第四の分化培地に交換して培養する工程。
  2. 　前記誘導因子が、組換えタンパク質でない、請求項１に記載の方法。
  3. 　基礎培地として0％～2％ITSサプリメント、0％～2％NEAA、0μM～100μM 2-メルカプトエタノールおよび0％～2％B27無血清サプリメントを添加したDMEM/F12培地を用いる、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　前記工程（１）の培養期間が、細胞がTBXTおよびMIXL1からなる群より選択される少なくとも1つのマーカーを発現することが確認されるまでであり、前記工程（２）の培養期間が、細胞がTBX6およびMSGN1からなる群より選択される少なくとも1つのマーカーを発現することが確認されるまでであり、前記工程（３）の培養期間が、細胞がPARAXIS、PAX3およびFOXC2からなる群より選択される少なくとも1つのマーカーを発現することが確認されるまでであり、前記工程（４）の培養期間が、細胞がPAX1、PAX9、SOX9およびNKX3.2からなる群より選択される少なくとも1つのマーカーを発現することが確認されるまでである、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　前記工程（１）～（３）の培養時間がそれぞれ12～36時間であり、前記工程（４）の培養時間が36～84時間である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　前記椎板細胞が生体移植用である、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　請求項１～６のいずれか１項に記載の方法で椎板細胞を製造する工程、得られた椎板細胞をヒト以外の哺乳動物に移植する工程、および該哺乳動物から移植した椎板細胞由来の組織を摘出する工程を含む、軟骨内骨化組織の製造方法。
  8. 　請求項１～６のいずれか１項に記載の方法で椎板細胞を製造する工程、得られた椎板細胞を、軟骨誘導因子を含まない軟骨形成基本培地で三次元培養する工程を含む、軟骨組織の製造方法。
  9. 　請求項１～６のいずれか１項に記載の方法で椎板細胞を製造する工程、得られた椎板細胞を、軟骨誘導因子を含むまたは含まない軟骨形成基本培地で三次元培養して軟骨組織を製造する工程、および該軟骨組織を、骨誘導因子を含むまたは含まない骨形成基本培地で三次元培養する工程を含む、軟骨内骨化組織の製造方法。
  10. 　請求項１～６のいずれか１項に記載の方法で椎板細胞を製造する工程、得られた椎板細胞を、軟骨誘導因子を含まない軟骨形成基本培地を用いて、被験物質の存在下または非存在下で三次元培養して軟骨組織を形成させる工程、および被験物質非存在下で形成した軟骨組織と比較して軟骨組織における軟骨量を増加または減少させる被験物質を選択する工程を含む、軟骨形成制御物質のスクリーニング方法。
  11. 　請求項１～６のいずれか１項に記載の方法で椎板細胞を製造する工程、得られた椎板細胞をヒト以外の哺乳動物に移植する工程、該哺乳動物に被験物質を投与する工程、該哺乳動物から移植した椎板細胞由来の組織を摘出する工程、被験物質を投与していない哺乳動物から摘出した移植組織と比較して、移植組織の軟骨量を増加または減少させる被験物質を選択する工程を含む、軟骨形成制御物質のスクリーニング方法。
  12. 　請求項１～６のいずれか１項に記載の方法で椎板細胞を製造する工程、得られた椎板細胞をヒト以外の哺乳動物に移植する工程、該哺乳動物から移植した椎板細胞由来の組織を摘出し培養系に移行する工程、該移植組織と被験物質を接触させる工程、被験物質と接触していない移植組織と比較して、移植組織の軟骨量を増加または減少させる被験物質を選択する工程を含む、軟骨形成制御物質のスクリーニング方法。
  13. 　請求項１～６のいずれか１項に記載の方法で椎板細胞を製造する工程、得られた椎板細胞から分化誘導された軟骨組織を、骨形成基本培地を用いて被験物質の存在下または非存在下で三次元培養して骨組織を形成させる工程、および被験物質非存在下で形成した骨組織と比較して、骨組織における骨量を増加または減少させる被験物質を選択する工程を含む、骨形成制御物質のスクリーニング方法。
  14. 　請求項１～６のいずれか１項に記載の方法で椎板細胞を製造する工程、得られた椎板細胞をヒト以外の哺乳動物に移植する工程、該哺乳動物に被験物質を投与する工程、該哺乳動物から移植した椎板細胞由来の組織を摘出する工程、被験物質を投与していない哺乳動物から摘出した移植組織と比較して、移植組織の骨量を増加または減少させる被験物質を選択する工程を含む、骨形成制御物質のスクリーニング方法。
  15. 　請求項１～６のいずれか１項に記載の方法で椎板細胞を製造する工程、得られた椎板細胞をヒト以外の哺乳動物に移植する工程、該哺乳動物から移植した椎板細胞由来の組織を摘出し培養系に移行する工程、該移植組織と被験物質を接触させる工程、被験物質と接触していない移植組織と比較して、移植組織の骨量を増加または減少させる被験物質を選択する工程を含む、骨形成制御物質のスクリーニング方法。
  16. 　請求項１～６のいずれか１項に記載の方法で椎板細胞を製造する工程、得られた椎板細胞から分化誘導された軟骨組織を、骨形成基本培地を用いて被験物質の存在下または非存在下で三次元培養して骨組織を形成させる工程、および被験物質非存在下で形成した骨組織と比較して、骨組織におけるZEB2発現量を増加または減少させる被験物質を選択する工程を含む、骨形成制御物質のスクリーニング方法。
  17. 　被験物質非存在下で形成した骨組織と比較して、被験物質の存在下で形成した骨組織におけるZEB2とRUNX2の発現量、またはZEB2とSP7の発現量、またはZEB2とRUNX2とSP7の発現量を、同時に増加または減少させる被験物質を選択する工程を含む、請求項１６に記載の骨形成制御物質のスクリーニング方法。
  18. 　請求項１～６のいずれか１項に記載の方法で椎板細胞を製造する工程、得られた椎板細胞をヒト以外の哺乳動物に移植する工程、該哺乳動物に被験物質を投与する工程、該哺乳動物から移植した椎板細胞由来の組織を摘出する工程、被験物質を投与していない哺乳動物から摘出した移植組織と比較して、移植組織のZEB2発現量を増加または減少させる被験物質を選択する工程を含む、骨形成制御物質のスクリーニング方法。
  19. 　被験物質を投与していない哺乳動物から摘出した移植組織と比較して、被験物質を投与した哺乳動物から摘出した移植組織のZEB2とRUNX2の発現量、またはZEB2とSP7の発現量、またはZEB2とRUNX2とSP7の発現量を、同時に増加または減少させる被験物質を選択する工程を含む、請求項１８に記載の骨形成制御物質のスクリーニング方法。
  20. 　請求項１～６のいずれか１項に記載の方法で椎板細胞を製造する工程、得られた椎板細胞をヒト以外の哺乳動物に移植する工程、該哺乳動物から移植した椎板細胞由来の組織を摘出し培養系に移行する工程、該移植組織と被験物質を接触させる工程、被験物質と接触していない移植組織と比較して、移植組織のZEB2発現量を増加または減少させる被験物質を選択する工程を含む、骨形成制御物質のスクリーニング方法。
  21. 　被験物質と接触していない移植組織と比較して、被験物質と接触した移植組織のZEB2とRUNX2の発現量、またはZEB2とSP7の発現量、またはZEB2とRUNX2とSP7の発現量を、同時に増加または減少させる被験物質を選択する工程を含む、請求項２０に記載の骨形成制御物質のスクリーニング方法。
PCT/JP2022/011216 2021-03-15 2022-03-14 椎板細胞の製造方法および該椎板細胞の利用 WO2022196613A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2023507085A JPWO2022196613A1 (ja) 2021-03-15 2022-03-14

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2021-041384 2021-03-15
JP2021041384 2021-03-15

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2022196613A1 true WO2022196613A1 (ja) 2022-09-22

Family

ID=83320394

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2022/011216 WO2022196613A1 (ja) 2021-03-15 2022-03-14 椎板細胞の製造方法および該椎板細胞の利用

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JPWO2022196613A1 (ja)
WO (1) WO2022196613A1 (ja)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20180030410A1 (en) * 2015-03-03 2018-02-01 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Producing mesodermal cell types and methods of using the same
WO2019177118A1 (ja) * 2018-03-15 2019-09-19 国立大学法人京都大学 多能性幹細胞から各種細胞への段階的製造方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20180030410A1 (en) * 2015-03-03 2018-02-01 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Producing mesodermal cell types and methods of using the same
WO2019177118A1 (ja) * 2018-03-15 2019-09-19 国立大学法人京都大学 多能性幹細胞から各種細胞への段階的製造方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HAIBIN XI, WAKANA FUJIWARA, KAREN GONZALEZ, MAJIB JAN, SIMONE LIEBSCHER, BEN VAN HANDEL, KATJA SCHENKE-LAYLAND, APRIL D. PYLE: "In Vivo Human Somitogenesis Guides Somite Development from hPSCs", CELL REPORTS, ELSEVIER INC, US, vol. 18, no. 6, 1 February 2017 (2017-02-01), US , pages 1573 - 1585, XP055606866, ISSN: 2211-1247, DOI: 10.1016/j.celrep.2017.01.040 *

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2022196613A1 (ja) 2022-09-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11591569B2 (en) Methods for epicardial differentiation of human pluripotent stem cells
US8507275B2 (en) Method of inducing differentiation of embryonic stem cells into hemangioblast
EP2273996B1 (en) Human cardiovascular progenitor cells
Malpeli et al. Serum-free growth medium sustains commitment of human articular chondrocyte through maintenance of Sox9 expression
JP7341433B2 (ja) 腸管神経前駆細胞の製造方法
KR102456031B1 (ko) 생체 내 혈관 형성 능력을 갖는 중배엽 및/또는 내피 콜로니 형성 세포-유사 세포를 생성시키기 위한 방법
KR102162505B1 (ko) 만능성 줄기 세포의 장의 중장 내배엽 세포로의 분화
WO2023106122A1 (ja) 間葉系譜への分化に特化した神経堤細胞の製造方法
US20200231933A1 (en) Human pluripotent stem cell derived endocardial endothelium
KR100948170B1 (ko) 배아줄기세포를 혈관모세포로 분화 유도하는 방법
JP7274683B2 (ja) 多能性幹細胞から樹状分岐した集合管を伴う腎臓構造を作製する方法
Kurisaki et al. In vitro organogenesis using multipotent cells
EP3747991A1 (en) Cell induction method
WO2019107485A1 (ja) 細胞の培養方法
US20220313733A1 (en) Method for producing renal interstitial cell
WO2022196613A1 (ja) 椎板細胞の製造方法および該椎板細胞の利用
Wei et al. Lateral Mesoderm-derived mesenchymal stem cells with robust osteochondrogenic potential and hematopoiesis-supporting ability
WO2020235319A1 (ja) 軟骨又は骨の前駆細胞の拡大培養方法
Smith et al. Directed differentiation of hPSCs through lateral plate mesoderm for generation of articular cartilage progenitors
CN111918961B (zh) 心肌细胞成熟促进剂
KR20190130394A (ko) 전구세포 배양액 및 다층 그래핀 필름을 포함하는 줄기세포 분화 촉진용 조성물 및 이의 용도
JP2020115771A (ja) 多能性幹細胞から軟骨組織を製造する方法
Thelen Alternatives for Improving the Adipogenic Potential in Cellular Models of Perivascular Adipose Tissue
Lundin Evaluating and Optimizing a Protocol for Mesodermal Differentiation of Pluripotent Stem Cells towards Cardiomyocytes and Adipocytes
KR20110088260A (ko) 인간 배아줄기세포를 심근세포로 분화 유도하는 방법

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22771359

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2023507085

Country of ref document: JP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 22771359

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1