JP2017517259A - Lilrb2およびnotchを介した造血前駆細胞の拡大培養 - Google Patents
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Abstract
Description
本開示は、被検体における造血細胞移植のために前駆細胞を拡大培養する方法を記載する。この方法は、固定化された高分子量LILRB2アゴニストまたはLILRB2アゴニストをNotchアゴニストと組み合わせて含有する培地中で前駆細胞を培養する。拡大培養された細胞を使用し、種々の造血障害を治療することができる。
造血幹細胞(HSC)は、多能性であり、最終的に、あらゆる種類の最終的に分化した血液細胞になる。HSCは、自己再生する能力を有するか、または方向性が高まった造血前駆細胞(HPC)へと分化する能力を有し、この前駆細胞は、わずか数種類の血液細胞の祖先であることが不可逆的に決定付けられている。例えば、HSCは、(i)最終的に単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球/血小板、樹状細胞になる骨髄系前駆細胞、または(ii)最終的にT細胞、B細胞、およびナチュラルキラー細胞(NK細胞)と呼ばれるリンパ球様細胞になるリンパ系前駆細胞へと分化する能力を有する。HSCが骨髄系前駆細胞へと分化すると、この子孫は、リンパ球系統の細胞になることはできず、リンパ系細胞は、骨髄系統の細胞になることはできない。造血およびHSC分化の一般的な議論については、Chapter 17,Differentiated Cells and the Maintenance of Tissues,Alberts et al.,1989,Molecular Biology of the Cell,2nd Ed.,Garland Publishing,New York,NY;Chapter 2 of Regenerative Medicine,Department of Health and Human Services,August 5,2006、およびChapter 5 of Hematopoietic Stem Cells,2009,Stem Cell Information,Department of Health and Human Servicesを参照。前駆体細胞は、HSC、HPCおよび/またはHSCとHPCの混合物を含んでいてもよい。
本明細書には、前駆細胞をex vivoで拡大培養する方法であって、前記前駆細胞を、第1の固相に固定化されたLILRB2アゴニストと共に培養することを含み、該固定化されたLILRB2アゴニストは、(i)LILRB2受容体に対する抗体、または(ii)前記抗体の抗原結合フラグメントであり、この前駆細胞は、造血幹細胞または造血前駆細胞である、方法が記載される。特定の実施形態において、本明細書に記載される方法は、固定化されたLILRB2アゴニストをNotchアゴニストと組み合わせ、これと共に前記前駆細胞を培養することを含む。具体的な実施形態において、前駆細胞はヒト細胞である。さらに具体的な実施形態において、前駆細胞は、骨髄、臍帯血、胎盤血またはホウォートンゼリーから得られる。さらに具体的な実施形態において、前駆細胞は、胎児または新生児の血液から得られる。
造血前駆細胞移植は、前駆細胞が移植レシピエントの血液細胞および免疫細胞を元の状態に戻す能力を有するため、重要な治療である。例えば、前駆細胞の移植を使用し、遺伝性の免疫不全または自己免疫疾患および多様な造血障害を患う被検体を治療することができる。長期間にわたる好中球減少症および汎血球減少症は、これらの治療計画の後によく起こるものなので、前駆細胞の移植を使用し、化学療法および放射線治療を受けた患者を治療することもできる。一例として、特に問題となるのは、AMLを化学療法によって治療すると、現在の抗菌治療の設定において、青年期および若年期の大人の20%に達する高い死亡率を有することが一般的な感染性合併症を伴う長期間にわたる深刻な好中球減少症が生じる。ヒト骨髄移植法も、現在、白血病、リンパ腫および他の生命を脅かす疾患の治療法として用いられている。
本開示は、前駆細胞を拡大培養するために、Notchアゴニストと組み合わせた、固定化されたLILRB2アゴニストおよび/またはLILRB2アゴニストの使用を想定する。アゴニストは、LILRB2および/またはNotch経路の機能の活性化を促進する、即ち、生じさせるか、または増加させる薬剤である。「LILRB2経路の機能」は、免疫受容体チロシン依存性抑制モチーフ(ITIM)が介する抑制および/またはホスファターゼSHP−1、SHP−2またはSHIPの動員を含め、LILRB2シグナル伝達(シグナル変換)経路を介する機能を意味する。「Notch経路の機能」は、限定されないが、Notchの細胞内ドメインの核内移行、RBP−JKまたはこのDrosophilaホモログSuppressor of Hairlessの核内移行、例えば、MastermindのようなSplit複合体のエンハンサーのbHLH遺伝子の活性化、HES−1遺伝子またはKBF2(CBF1とも呼ばれる)遺伝子の活性化、Drosophila神経芽細胞分離の抑制、Deltaタンパク質、Jagged/Serrateタンパク質、Fringe、DeltexまたはRBP−JKI Suppressor of HairlessまたはこれらのホモログもしくはアナログへのNotchの結合を含め、Notchシグナル伝達(シグナル変換)経路が介する機能を意味する。Notchシグナル伝達経路および活性化に対するこの影響についての議論に関しては、一般的に、Kopan et al.,2009,Cell 137:216−233による総説文献を参照。Jarriault et al.,1998,Mol.Cell.Biol.18:7423−7431も参照。
本明細書に開示される方法は、LILRB2アゴニストを含む。特定の実施形態において、アンジオポエチンおよびアンジオポエチン様タンパク質(Angptl)は、例示的なLILRB2アゴニストを代表するものである。近年まで、Angptlは、受容体が知られていなかったため、「オーファンリガンド」とされていた。2012年に、本願発明者の一部が、幾つかのAngptlの受容体として、ヒト白血球免疫グロブリン様受容体B2(LILRB2)およびこのマウスオルソログと対になるIg様受容体(PirB)を特定した。Zheng et al.、Nature.2012;485:656−660。LILRB2およびPirBは、ヒトおよびマウスのHSCでそれぞれ発現し、ex vivoでの拡大培養を補助することも発見された。Zheng et al.、Nature.2012;485:656−660。LILRB2の配列情報は、寄託番号:NP_001265335.2(配列番号3);寄託番号:NP_001265334.2(配列番号4);寄託番号:NP_001265333.2(配列番号5);寄託番号:NP_001265332.2(配列番号6);および寄託番号:AAH36827.1(配列番号7)を含む。
本開示は、AngptlアゴニストとNotchアゴニストの組み合わせを用い、前駆細胞を安定的で再現性よくex vivoで拡大培養することも記載する。
ある実施形態において、培養する工程中に、前駆細胞は、固定化されたLILRB2および/またはNotchアゴニスト存在下で培養され、特定の実施形態において、アゴニストの細胞外ドメイン存在下で培養され、さらに特定の実施形態において、融合対に融合したアゴニストの細胞外ドメイン存在下で培養される。具体的な実施形態において、培養する工程中に、前駆細胞は、LILRB2および/またはNotchアゴニストでコーティングされた固相の上で培養される。
ある実施形態において、前駆細胞は、1種類以上の成長因子、2種類以上の成長因子、3種類以上の成長因子、または4種類以上の成長因子存在下で拡大培養される(例えば、流体培地中)。
本開示は、前駆細胞が細胞周期休止または非複製期に入るのを回避するか、または遅らせることによって、前駆細胞を不死化し、場合により分化させるための方法を提供する。本開示の不死化のための前駆細胞は、最終的な分化をしない細胞であり、限定されないが、ヒト、動物、植物、哺乳動物、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、家禽、昆虫、DrosophilaおよびC.elegansを含む任意の種に由来するものであってもよい。最も好ましくは、前駆細胞は、脊椎動物であり、さらに好ましくは、哺乳動物であり、最も好ましくは、ヒトである。好ましい実施形態において、前駆細胞は、細胞株に特徴的な「クライシス」または「老化」期(例えば、安定な表現型の変化を生じる形質転換)を経ない(Freshney、1994、「Culture of Animal Cells−−A manual of Basic Technique」、3.sup.rd Editionのp.12、John Wiley&Sons,Inc.を参照)。好ましい実施形態において、前駆細胞は、初代培養細胞である。「初代培養細胞」という用語は、細胞が、組織供給源(例えば、哺乳動物の被検体)からの移植の後に継代培養されていないことを示す。
本明細書に開示される方法は、被検体(ヒト、動物(イヌ、ネコ、爬虫類、鳥類など)、家畜(ウマ、ウシ、ヤギ、ブタ、ニワトリなど)および研究動物(サル、ラット、マウス、魚等)を、本明細書に開示されるように拡大培養された前駆細胞で治療することを含む。被検体の治療は、治療に有効な量を送達することを含む。治療に有効な量は、有効な量の予防的な治療および/または治療的な治療を与える量を含む。
1.前駆細胞を拡大培養する方法であって、少なくとも225kDの分子量を有する固定化されたLILRB2アゴニストを含む培地の存在下で前駆細胞を培養することを含み、この培養は、少なくとも225kDの分子量を有する固定化されたLILRB2アゴニストを含まない培地で培養された前駆細胞が増殖を停止するか、および/または死亡する時間を超えて、前駆細胞の拡大培養を維持するのに効果的である、方法。
7.1 実施例1
外因子とHSCの表面受容体との相互作用のより良い理解は、幹細胞の研究および応用に大きな利益を与えるだろう。近年、数種類のAngptlが、免役阻害性受容体LILRB2に結合し、これを活性化し、HSCのex vivoでの拡大培養を補助することが示された。しかし、AngptlとLILRB2の相互作用に関する分子基盤は不明確であった。実施例1は、哺乳動物細胞で発現するAngptl2が、高分子量(HMW)の分子種を生成し、下流のシグナル伝達のためのLILRB2の活性化のために、リガンドのマルチマー化が必要であることを示す。受容体がAngptl2に結合し、活性化されるのに必要なLILRB2の第1から第4のIgドメインの中の新規モチーフが特定された。LILRB2に対するAngptl2の結合は、別のリガンドHLA−Gの結合よりも強力であり、別のリガンドHLA−Gの結合と全く重なっていない。固定化された抗LILRB2抗体は、Angptl2よりもLILRB2のもっと強力な活性化を誘発する。実施例1は、再増殖するヒトCB HSCの正味の拡大培養を補助する、指定のサイトカインと固定化された抗LILRB2を含有し、血清を含まない培地を記載する。LILRB2に結合するAngptlの態様の解明によって、ヒトHSCのex vivoでの拡大培養への新しい手法の開発が可能になった。
キメラ受容体レポーター細胞。LILRB2の細胞外ドメインの個々または全てのIg−ドメインまたはこの変異体と、活性化するPILRβの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインとを含むキメラ受容体を、レトロウイルスベクターを用いることによって、NFAT−GFPレポーター遺伝子およびDAP12を有するT細胞ハイブリドーマ細胞に感染させた。hLILRB2のアミノ酸24−458を使用し、全長LILRB2キメラレポーターを構築した。個々のIgドメインまたはIgの組み合わせのためのアミノ酸配列は、Ig1(aa 24−119)、Ig2(aa 120−219)、Ig3(aa 221−320)、Ig4(aa 321−458)、Ig1+2(aa 24−219)およびIg3+4(aa 221−458)である。これらのキメラLILRB2−PILRβ受容体レポーター細胞(5×104/ウェル)を、リガンドと共に所定時間インキュベートし、GFPをフローサイトメトリーによって分析した。トランスフェクトされた293T細胞から集めた馴化培地中のM2樹脂またはAngptl2による精製されたAngptl2−FLAGを、示したように使用した。コーティングされたウェルを用いた実験のために、特に言及されない限り、示される細菌によって発現したGST−Angptl2、抗LILRB2ポリクローナル抗体(pAb、BAF2078番、R&D systems)または抗LILRB2モノクローナル抗体(mAb、16−5149−85番、eBioscience)またはコントロール抗体を、37℃で3時間、96ウェルプレート上でプレコーティングした。抗体が架橋したら、10μg/mLのpAbを10μg/mLのストレプトアビジンと共に4℃で一晩インキュベートした。
マルチマー化されたAngptl2は、LILRB2を活性化させる。LILRBが介在するシグナル伝達のための下流の決定的なレポーターが存在しないため、安定なレポーター細胞系を使用し、Angptl2が、LILRB2に結合し、これを活性化させるかどうかを調べた。このキメラ受容体レポーター系において、LILRB2の細胞外ドメイン(ECD)を、ITAMを含有するアダプタータンパク質DAP12と会合する、対となる免疫グロブリン様受容体β(PILRβ)の膜貫通/細胞内ドメインと融合させる。キメラ受容体が、LILRB2のECDに結合するAngptl2によって活性化される場合、ZAP70またはSykキナーゼが、アダプターDAP12のITAMに再動員され、活性化されたT細胞の核因子(NFAT)を活性化させ、NFAT応答性プロモーターによって発動するGFP発現を促進する(図1A)。このレポーターの確立は、LILRB1レポーター系によって示唆され(Arase et al.、Science.2002;296:1323−1326;Ohtsuka et al.、Proc Natl Acad Sci USA.2004;101:8126−8131)、異なる形態のAngptl2(可溶性、固定化されたもの、モノマーおよびオリゴマーを含む)のシグナル伝達誘発能力の試験を可能にし、さらなるアゴニストおよびアンタゴニストをスクリーニングするための代替となる感受性の高い系として役立つ。
以前の研究によって、造血幹細胞(HSC)のNotchによって誘発されるex vivoでの拡大培養が導かれ、CB幹細胞移植を受ける患者が直面する長期間にわたる移植後の好中球減少症を減らすための首尾良い使用が導かれた(図16および17を参照)。さらに近年、拡大培養された部分的にHLAにマッチするCD34+細胞を注入した数と、好中球減少症が回復するまでの時間との関係が観察され、このことは、初期の好中球減少症回復を信頼性良く高めるためにCB HSPCの大きな拡大培養の必要性が大きいことを示唆している。
細胞の単離。研究のためのヒトCBを、同意を得た後、Swedish Medical Center Institutional Review Board(Seattle)の承認を得て、通常の郵送によって得た。塩化アンモニウム赤血球細胞溶解バッファー中でサンプルをインキュベートし、洗浄し、2%のヒトのAB型血清を含むリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)に懸濁させた。細胞を、CD34+免疫磁気ビーズ(Miltenyi Biotec)と共にインキュベートし、Miltenyi AutoMACSを用いて精製し、次いで凍結させた。次いで、個々の実験のためにCD34+細胞を解凍した。
Delta1とAngptl5を組み合わせた効果は、CBによって誘導されるCD34+細胞の生成を向上させ、造血手技および分化する骨髄細胞を用い、免疫不全マウスの骨髄を迅速に再増殖させた。特に、Delta1とAngptl5を組み合わせた試験において、CD34+前駆体によってNSGマウスの迅速な(2週間の)再増殖が顕著に向上し(p=0.04)、Delta1またはAngptl5のみを用いた場合と比較して、未成熟のCD33+骨髄前駆体による再増殖を向上させる方向への明確な傾向(p=0.08の2標本t検定、p=0.04 可能な非Gaussian分布のためのMann−Whitney試験)がみとめられた(図19)。重要なことに、Delta1のみで培養されたCB HSPCを用いたCD34の同様の全体的な拡大培養でもこの現象が起こった(図20)。さらに、CD34+CD90lo細胞またはCD49f細胞の生成に差はなく、このことは、多数のまれな迅速に再増殖する細胞、または細胞周期、アポトーシス、または転写または後成的特性が改変された細胞の生成を示唆している。注記すべきは、この組み合わせが、複数の系統の生着を移植から8週間維持したことであり、このことは、さらに長い期間、再増殖する細胞の管理または拡大培養を示唆している。
この実験で注目するのは、培養条件だけではなく、Delta1と抗LILRB2抗体の提示も観察することによる、CB造血幹細胞/前駆細胞(HSPC)の生成の最適化である。
Claims (208)
- 前駆細胞をex vivoで拡大培養する方法であって、前記前駆細胞を、第1の固相に固定化されたLILRB2アゴニストと共に培養することを含み、該固定化されたLILRB2アゴニストは、(i)LILRB2受容体に対する抗体、または(ii)前記抗体の抗原結合フラグメントであり、前記前駆細胞は、該造血幹細胞または造血前駆細胞である、方法。
- Notchアゴニストと組み合わせた、固定化されたLILRB2アゴニストと共に前記前駆細胞を培養することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前駆細胞がヒト細胞である、請求項1または請求項2に記載の方法。
- 前駆細胞が、骨髄、臍帯血、胎盤血またはホウォートンゼリーから得られる、請求項3に記載の方法。
- 前駆細胞が、胎児または新生児の血液から得られる、請求項3に記載の方法。
- LILRB2受容体に対する抗体がモノクローナル抗体である、請求項1または請求項2に記載の方法。
- LILRB2受容体に対する抗体がポリクローナル抗体である、請求項1または請求項2に記載の方法。
- LILRB2アゴニストが、Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fcまたは単鎖Fvフラグメント(scFv)である、請求項1または請求項2に記載の方法。
- LILRB2に対する抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体、合成抗体またはキメラ抗体である、請求項1または請求項2に記載の方法。
- LILRB2アゴニストが、LILRB2のIg1ドメインに結合する、請求項1または請求項2に記載の方法。
- LILRB2アゴニストが、LILRB2のIg4ドメインに結合する、請求項1または請求項2に記載の方法。
- LILRB2アゴニストが、LILRB2のIg1ドメインおよびIg4ドメインに結合する、請求項1または請求項2に記載の方法。
- 第1の固相が、組織培養皿の表面である、請求項1または請求項2に記載の方法。
- Notchアゴニストが第1の固相に固定化されている、請求項2に記載の方法。
- Notchアゴニストが、第1の固相ではない第2の固相に固定されている、請求項2に記載の方法。
- 第1の固相が、組織培養皿の表面である、請求項14に記載の方法。
- 第1の固相が、組織培養皿または組織培養フラスコの表面であり、第2の固相がビーズである、請求項15に記載の方法。
- 第1の固相がビーズであり、第2の固相が、組織培養皿または組織培養フラスコの表面である、請求項15に記載の方法。
- Notchアゴニストが、Notchと相互作用する、Deltaタンパク質の細胞外ドメインである、請求項2に記載の方法。
- NotchアゴニストがヒトDelta−1である、請求項2に記載の方法。
- NotchアゴニストがDeltaext−IgGである、請求項2に記載の方法。
- Notchアゴニストがダイマー形態である、請求項2に記載の方法。
- Notchアゴニストが、Notchモチーフに特異的に結合する抗体である、請求項2に記載の方法。
- Notchアゴニストが、Notch−1に特異的に結合する抗体である、請求項2に記載の方法。
- Notchアゴニストが、Notch−2に特異的に結合する抗体である、請求項2に記載の方法。
- 培養する工程が、幹細胞因子(SCF)、トロンボポエチン(TPO)およびFlt3−リガンドを含む培地の存在下で行われる、請求項1または請求項2に記載の方法。
- 培養する工程が、10−100ng/mLのSCF、5−100ng/mLのTPO、10−100ng/mLのFlt3−リガンドを含む培地の存在下で行われる、請求項1または請求項2に記載の方法。
- 培地が、50ng/mLのSCFを含む、請求項27に記載の方法。
- 培地が、10ng/mLのTPOを含む、請求項27に記載の方法。
- 培地が、50ng/mLのFlt3−リガンドを含む、請求項27に記載の方法。
- 培養する工程は、50ng/mLのSCF、10ng/mLのTPO、50ng/mLのFlt3−リガンドを含む培地の存在下で行われる、請求項27に記載の方法。
- 培養する工程が、SCF、Flt3−リガンド、インターロイキン−6(IL−6)、TPO、線維芽細胞増殖因子−1(FGF1)およびインターロイキン−3(IL−3)を含む培地の存在下で行われる、請求項2に記載の方法。
- 培地が、SCF、Flt3−リガンド、IL−6、TPO、FGF1、IL−3およびヘパリンを含む、請求項32に記載の方法。
- 培地が、1−100ng/mLのSCF、1−100ng/mLのFlt3−リガンド、1−100ng/mLのIL−6、1−100ng/mLのTPO、1−100ng/mLのFGF1および1−100ng/mLのIL−3を含む、請求項32に記載の方法。
- 培地が、さらに、1−100μg/mLのヘパリンを含む、請求項34に記載の方法。
- 培地が、50ng/mLのSCF、50ng/mLのFlt3−リガンド、50ng/mLのIL−6、50ng/mLのTPO、20ng/mLのFGF1および10ng/mLのIL−3を含む、請求項32に記載の方法。
- 培地が、さらに、10μg/mLのヘパリンを含む、請求項36に記載の方法。
- 培養する工程が、レトロネクチンを含む培地の存在下で行われる、請求項2に記載の方法。
- 培地が、1−100μg/mLのレトロネクチンを含む、請求項38に記載の方法。
- 培地が、5μg/mLのレトロネクチンを含む、請求項39に記載の方法。
- 前駆細胞を拡大培養する方法であって、少なくとも225kDの分子量を有する固定化されたLILRB2アゴニストを含む培地の存在下で前駆細胞を培養することを含み、該培養は、少なくとも225kDの分子量を有する固定化されたLILRB2アゴニストを含まない培地で培養された前駆細胞が増殖を停止するか、および/または死亡する時間を超えて、前駆細胞の拡大培養を維持するのに効果的である、方法。
- LILRB2アゴニストは、少なくとも250kDの分子量を有する、請求項41に記載の方法。
- LILRB2アゴニストがマルチマー化されている、請求項41に記載の方法。
- LILRB2アゴニストが、アンジオポエチン様タンパク質(Angptl)またはそのフラグメントである、請求項41に記載の方法。
- Angptlまたはこのフラグメントが、Angptlのコイルドコイルドメインを含む、請求項44に記載の方法。
- LILRB2アゴニストが、Angptl1もしくはそのフラグメント、Angptl2もしくはそのフラグメント、Angptl3もしくはそのフラグメント、Angptl4もしくはそのフラグメント、Angptl5もしくはそのフラグメント、Angptl7もしくはそのフラグメントまたはMfap4もしくはそのフラグメントである、請求項44に記載の方法。
- LILRB2アゴニストが、LILRB2受容体抗体である、請求項41に記載の方法。
- LILRB2抗体がモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である、請求項47に記載の方法。
- LILRB2アゴニストが、LILRB2のIg1ドメインに結合する、請求項41に記載の方法。
- LILRB2アゴニストが、LILRB2のIg4ドメインに結合する、請求項41に記載の方法。
- LILRB2アゴニストが、LILRB2のIg1ドメインおよびIg4ドメインに結合する、請求項41に記載の方法。
- LILRB2アゴニストが、LILRB2のIg1ドメイン内の位置92−100のアミノ酸に結合する、請求項41に記載の方法。
- LILRB2アゴニストが、LILRB2のIg1ドメイン内の位置94、95および/または96のアミノ酸に結合する、請求項41に記載の方法。
- LILRB2アゴニストが、LILRB2のIg4ドメイン内の位置390−396のアミノ酸に結合する、請求項41に記載の方法。
- LILRB2アゴニストが、LILRB2のIg4ドメイン内の位置392および393のアミノ酸に結合する、請求項41に記載の方法。
- 培地が血清を含まない、請求項41に記載の方法。
- 培地が、1−100μg/mLの固定化されたLILRB2アゴニストを含む、請求項41に記載の方法。
- 培地が、25μg/mLの固定化されたLILRB2アゴニストを含む、請求項57に記載の方法。
- 培地が、さらに、SCF、TPOおよびFlt3−リガンドを含む、請求項57に記載の方法。
- 培地は、さらに、10−100ng/mLのSCF、5−100ng/mLのTPO、10−100ng/mLのFlt3−リガンドを含む、請求項57に記載の方法。
- 培地が、10ng/mLのSCFを含む、請求項60に記載の方法。
- 培地が、5ng/mLのTPOを含む、請求項60に記載の方法。
- 培地が、10ng/mLのFlt3−リガンドを含む、請求項60に記載の方法。
- 培地が、以下の成長因子:10ng/mLのSCF;5ng/mLのTPO;および10ng/mLのFlt3−リガンドを含む、請求項60に記載の方法。
- 前駆細胞が造血幹細胞または造血前駆細胞である、請求項41に記載の方法。
- 前駆細胞が造血幹細胞である、請求項41に記載の方法。
- 前駆細胞が、骨髄、臍帯血、胎盤血またはホウォートンゼリーから得られる、請求項41に記載の方法。
- 前駆細胞が、胎児または新生児の血液から得られる、請求項41に記載の方法。
- 前駆細胞を拡大培養する方法であって、LILRB2アゴニストおよびNotchアゴニストを含む培地の存在下で前駆細胞を培養することを含み、該培養は、LILRB2アゴニストおよびNotchアゴニストを含まない培地で培養された前駆細胞が増殖を停止するか、および/または死亡する時間を超えて、前駆細胞の拡大培養を維持するのに効果的である、方法。
- LILRB2アゴニストが培地中で固定化されている、請求項69に記載の方法。
- Notchアゴニストが培地中で固定化されている、請求項69に記載の方法。
- LILRB2アゴニストが、少なくとも225kDまたは少なくとも250kDの分子量を有する、請求項69に記載の方法。
- LILRB2アゴニストがマルチマー化されている、請求項69に記載の方法。
- LILRB2アゴニストが、アンジオポエチン様タンパク質(Angptl)またはこのフラグメントである、請求項69に記載の方法。
- Angptlまたはそのフラグメントが、Angptlのコイルドコイルドメインを含む、請求項74に記載の方法。
- LILRB2アゴニストが、Angptl1もしくはそのフラグメント、Angptl2もしくはそのフラグメント、Angptl3もしくはそのフラグメント、Angptl4もしくはそのフラグメント、Angptl5もしくはそのフラグメント、Angptl7もしくはそのフラグメントまたはMfap4もしくはそのフラグメントである、請求項74に記載の方法。
- LILRB2アゴニストが、LILRB2受容体抗体である、請求項69に記載の方法。
- LILRB2抗体がモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である、請求項77に記載の方法。
- LILRB2アゴニストが、LILRB2のIg1ドメインに結合する、請求項69に記載の方法。
- LILRB2アゴニストが、LILRB2のIg4ドメインに結合する、請求項69に記載の方法。
- LILRB2アゴニストが、LILRB2のIg1ドメインおよびIg4ドメインに結合する、請求項69に記載の方法。
- LILRB2アゴニストが、LILRB2のIg1ドメイン内の位置92−100のアミノ酸に結合する、請求項69に記載の方法。
- LILRB2アゴニストが、LILRB2のIg1ドメイン内の位置94、95および/または96のアミノ酸に結合する、請求項69に記載の方法。
- LILRB2アゴニストが、LILRB2のIg4ドメイン内の位置390−396のアミノ酸に結合する、請求項69に記載の方法。
- LILRB2アゴニストが、LILRB2のIg4ドメイン内の位置392および393のアミノ酸に結合する、請求項69に記載の方法。
- Notchアゴニストが、Notchと相互作用する、Deltaタンパク質の細胞外ドメインである、請求項69に記載の方法。
- NotchアゴニストがDeltaext−IgGである、請求項69に記載の方法。
- Notchアゴニストがダイマー形態である、請求項69に記載の方法。
- 培地が血清を含まない、請求項69に記載の方法。
- 培地が、0.025−100μg/mLの固定化されたLILRB2アゴニストを含む、請求項69に記載の方法。
- 培地が、25μg/mLの固定化されたLILRB2アゴニストを含む、請求項90に記載の方法。
- 培地が、0.08μg/mLから25μg/mLの固定化されたLILRB2アゴニストを含む、請求項90に記載の方法。
- 培地が、0.025μg/mLから5μg/mLのNotchアゴニストを含む、請求項69に記載の方法。
- 培地が、0.5μg/mLから2.5μg/mLのNotchアゴニストを含む、請求項93に記載の方法。
- 培地が、さらに、SCF、TPOおよびFlt3−リガンドを含む、請求項69に記載の方法。
- 培地が、さらに、10−100ng/mLのSCF、5−100ng/mLのTPOおよび10−100ng/mLのFlt3−リガンドを含む、請求項95に記載の方法。
- 培地が、10ng/mLのSCFを含む、請求項96に記載の方法。
- 培地が、5ng/mLのTPOを含む、請求項96に記載の方法。
- 培地が、10ng/mLのFlt3−リガンドを含む、請求項96に記載の方法。
- 培地が、10ng/mLのSCF、5ng/mLのTPOおよび10ng/mLのFlt3−リガンドを含む、請求項96に記載の方法。
- 培地が、さらに、SCF、Flt3−リガンド、IL−6、TPO、FGF1およびIL−3を含む、請求項69に記載の方法。
- 培地が、SCF、Flt3−リガンド、IL−6、TPO、FGF1、IL−3およびヘパリンを含む、請求項101に記載の方法。
- 培地が、さらに、1−100ng/mLのSCF、1−100ng/mLのFlt3−リガンド、1−100ng/mLのIL−6、1−100ng/mLのTPO、1−100ng/mLのFGF1および1−100ng/mLのIL−3を含む、請求項101に記載の方法。
- 培地が、さらに、1−100μg/mLのヘパリンを含む、請求項103に記載の方法。
- 培地が、さらに、50ng/mLのSCF、50ng/mLのFlt3−リガンド、50ng/mLのIL−6、50ng/mLのTPO、20ng/mLのFGF1および10ng/mLのIL−3を含む、請求項101に記載の方法。
- 培地が、さらに、10μg/mLのヘパリンを含む、請求項105に記載の方法。
- 培地が、さらに、レトロネクチンを含む、請求項69に記載の方法。
- 培地が、さらに、1−100μg/mLのレトロネクチンを含む、請求項107に記載の方法。
- 培地が、さらに、5μg/mLのレトロネクチンを含む、請求項108に記載の方法。
- 前駆細胞が造血幹細胞または造血前駆細胞である、請求項69に記載の方法。
- 前駆細胞が造血幹細胞である、請求項69に記載の方法。
- 前駆細胞が、骨髄、臍帯血、胎盤血またはホウォートンゼリーから得られる、請求項69に記載の方法。
- 前駆細胞が、胎児または新生児の血液から得られる、請求項69に記載の方法。
- 造血細胞移植のための前駆細胞を生産するための方法であって、少なくとも225kDの分子量を有する固定化されたLILRB2アゴニストを含む培地の存在下で前駆細胞を培養することを含み、該培養が、投与のために配合され、有効な量で投与されたときに被検体を適切に治療することができる前駆細胞を生産するのに効果的である、方法。
- LILRB2アゴニストが、少なくとも250kDの分子量を有する、請求項114に記載の方法。
- LILRB2アゴニストがマルチマー化されている、請求項114に記載の方法。
- LILRB2アゴニストが、アンジオポエチン様タンパク質(Angptl)またはそのフラグメントである、請求項114に記載の方法。
- Angptlまたはそのフラグメントが、Angptlのコイルドコイルドメインを含む、請求項117に記載の方法。
- LILRB2アゴニストが、Angptl1もしくはそのフラグメント、Angptl2もしくはそのフラグメント、Angptl3もしくはそのフラグメント、Angptl4もしくはそのフラグメント、Angptl5もしくはそのフラグメント、Angptl7もしくはそのフラグメントまたはMfap4もしくはそのフラグメントである、請求項117に記載の方法。
- LILRB2アゴニストが、LILRB2受容体抗体である、請求項114に記載の方法。
- LILRB2抗体がモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である、請求項120に記載の方法。
- LILRB2アゴニストが、LILRB2のIg1ドメインに結合する、請求項114に記載の方法。
- LILRB2アゴニストが、LILRB2のIg4ドメインに結合する、請求項114に記載の方法。
- LILRB2アゴニストが、LILRB2のIg1ドメインおよびIg4ドメインに結合する、請求項114に記載の方法。
- LILRB2アゴニストが、LILRB2のIg1ドメイン内の位置92−100のアミノ酸に結合する、請求項114に記載の方法。
- LILRB2アゴニストが、LILRB2のIg1ドメイン内の位置94、95および/または96のアミノ酸に結合する、請求項114に記載の方法。
- LILRB2アゴニストが、LILRB2のIg4ドメイン内の位置390−396のアミノ酸に結合する、請求項114に記載の方法。
- LILRB2アゴニストが、LILRB2のIg4ドメイン内の位置392および393のアミノ酸に結合する、請求項114に記載の方法。
- 培地が血清を含まない、請求項114に記載の方法。
- 培地が、1−100μg/mLの固定化されたLILRB2アゴニストを含む、請求項114に記載の方法。
- 培地が、25μg/mLの固定化されたLILRB2アゴニストを含む、請求項130に記載の方法。
- 培地が、さらに、SCF、TPOおよびFlt3−リガンドを含む、請求項114に記載の方法。
- 培地が、さらに、10−100ng/mLのSCF、5−100ng/mLのTPOおよび10−100ng/mLのFlt3−リガンドを含む、請求項132に記載の方法。
- 培地が、10ng/mLのSCFを含む、請求項133に記載の方法。
- 培地が、5ng/mLのTPOを含む、請求項133に記載の方法。
- 培地が、10ng/mLのFlt3−リガンドを含む、請求項133に記載の方法。
- 培地が、10ng/mLのSCF、5ng/mLのTPOおよび10ng/mLのFlt3−リガンドを含む、請求項133に記載の方法。
- 前駆細胞が造血幹細胞または造血前駆細胞である、請求項114に記載の方法。
- 前駆細胞が造血幹細胞である、請求項114に記載の方法。
- 前駆細胞が、骨髄、臍帯血、胎盤血またはホウォートンゼリーから得られる、請求項114に記載の方法。
- 前駆細胞が、胎児または新生児の血液から得られる、請求項114に記載の方法。
- 前駆細胞を拡大培養するための方法であって、LILRB2アゴニストおよびNotchアゴニストを含む培地の存在下で前駆細胞を培養することを含み、該培養は、LILRB2アゴニストおよびNotchアゴニストを含まない培地で培養された前駆細胞が増殖を停止するか、および/または死亡する時間を超えて、前駆細胞の拡大培養を維持するのに効果的である、方法。
- LILRB2アゴニストが培地中で固定化されている、請求項142に記載の方法。
- Notchアゴニストが培地中で固定化されている、請求項142に記載の方法。
- LILRB2アゴニストが、少なくとも225kDまたは少なくとも250kDの分子量を有する、請求項142に記載の方法。
- LILRB2アゴニストがマルチマー化されている、請求項142に記載の方法。
- LILRB2アゴニストが、アンジオポエチン様タンパク質(Angptl)またはそのフラグメントである、請求項142に記載の方法。
- Angptlまたはそのフラグメントが、Angptlのコイルドコイルドメインを含む、請求項142に記載の方法。
- LILRB2アゴニストが、Angptl1もしくはそのフラグメント、Angptl2もしくはそのフラグメント、Angptl3もしくはそのフラグメント、Angptl4もしくはそのフラグメント、Angptl5もしくはそのフラグメント、Angptl7もしくはそのフラグメントまたはMfap4もしくはそのフラグメントである、請求項142に記載の方法。
- LILRB2アゴニストが、LILRB2受容体抗体である、請求項142に記載の方法。
- LILRB2抗体がモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である、請求項150に記載の方法。
- LILRB2アゴニストが、LILRB2のIg1ドメインに結合する、請求項142に記載の方法。
- LILRB2アゴニストが、LILRB2のIg4ドメインに結合する、請求項142に記載の方法。
- LILRB2アゴニストが、LILRB2のIg1ドメインおよびIg4ドメインに結合する、請求項142に記載の方法。
- LILRB2アゴニストが、LILRB2のIg1ドメイン内の位置92−100のアミノ酸に結合する、請求項142に記載の方法。
- LILRB2アゴニストが、LILRB2のIg1ドメイン内の位置94、95および/または96のアミノ酸に結合する、請求項142に記載の方法。
- LILRB2アゴニストが、LILRB2のIg4ドメイン内の位置390−396のアミノ酸に結合する、請求項142に記載の方法。
- LILRB2アゴニストが、LILRB2のIg4ドメイン内の位置392および393のアミノ酸に結合する、請求項142に記載の方法。
- Notchアゴニストが、Notchと相互作用する、Deltaタンパク質の細胞外ドメインである、請求項142に記載の方法。
- NotchアゴニストがDeltaext−IgGである、請求項142に記載の方法。
- Notchアゴニストがダイマー形態である、請求項142に記載の方法。
- 培地が血清を含まない、請求項142に記載の方法。
- 培地が、0.025−100μg/mLの固定化されたLILRB2アゴニストを含む、請求項142に記載の方法。
- 培地が、25μg/mLの固定化されたLILRB2アゴニストを含む、請求項163に記載の方法。
- 培地が、0.08μg/mLから25μg/mLの固定化されたLILRB2アゴニストを含む、請求項142に記載の方法。
- 培地が、0.025μg/mLから5μg/mLのNotchアゴニストを含む、請求項142に記載の方法。
- 培地が、0.5μg/mLから2.5μg/mLのNotchアゴニストを含む、請求項166に記載の方法。
- 培地が、さらに、SCF、TPOおよびFlt3−リガンドを含む、請求項102に記載の方法。
- 培地が、さらに、10−100ng/mLのSCF、5−100ng/mLのTPOおよび10−100ng/mLのFlt3−リガンドを含む、請求項168に記載の方法。
- 培地が、10ng/mLのSCFを含む、請求項169に記載の方法。
- 培地が、5ng/mLのTPOを含む、請求項169に記載の方法。
- 培地が、10ng/mLのFlt3−リガンドを含む、請求項169に記載の方法。
- 培地が、10ng/mLのSCF、5ng/mLのTPOおよび10ng/mLのFlt3−リガンドを含む、請求項169に記載の方法。
- 培地が、さらに、SCF、Flt3−リガンド、IL−6、TPO、FGF1およびIL−3を含む、請求項142に記載の方法。
- 培地が、SCF、Flt3−リガンド、IL−6、TPO、FGF1、IL−3およびヘパリンを含む、請求項174に記載の方法。
- 培地が、さらに、1−100ng/mLのSCF、1−100ng/mLのFlt3−リガンド、1−100ng/mLのIL−6、1−100ng/mLのTPO、1−100ng/mLのFGF1および1−100ng/mLのIL−3を含む、請求項142に記載の方法。
- 培地が、さらに、1−100μg/mLのヘパリンを含む、請求項176に記載の方法。
- 培地が、さらに、50ng/mLのSCF、50ng/mLのFlt3−リガンド、50ng/mLのIL−6、50ng/mLのTPO、20ng/mLのFGF1および10ng/mLのIL−3を含む、請求項176に記載の方法。
- 培地が、さらに、10μg/mLのヘパリンを含む、請求項178に記載の方法。
- 培地が、さらに、レトロネクチンを含む、請求項142に記載の方法。
- 培地が、さらに、1−100μg/mLのレトロネクチンを含む、請求項180に記載の方法。
- 培地が、さらに、5μg/mLのレトロネクチンを含む、請求項181に記載の方法。
- 前駆細胞が造血幹細胞または造血前駆細胞である、請求項142に記載の方法。
- 前駆細胞が造血幹細胞である、請求項142に記載の方法。
- 前駆細胞が、骨髄、臍帯血、胎盤血またはホウォートンゼリーから得られる、請求項142に記載の方法。
- 前駆細胞が、胎児または新生児の血液から得られる、請求項142に記載の方法。
- キメラ受容体レポーター系であって、LILRB2の少なくとも1つの細胞外ドメインとPILRβの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインとを含む融合タンパク質を発現する細胞を含み、LILRB2の細胞外ドメインへの活性化リガンドの結合が、レポーター遺伝子の発現をもたらす、キメラ受容体レポーター系。
- LILRB2の少なくとも1つの細胞外ドメインが、Ig1ドメイン、Ig2ドメイン、Ig3ドメインおよび/またはIg4ドメインである、請求項187に記載のキメラ受容体レポーター系。
- LILRB2の少なくとも1つの細胞外ドメインがIg1ドメインである、請求項187に記載のキメラ受容体レポーター系。
- Ig1ドメインが、LILB2のアミノ酸24−119を含む、請求項187に記載のキメラ受容体レポーター系。
- LILRB2の少なくとも1つの細胞外ドメインがIg2ドメインである、請求項187に記載のキメラ受容体レポーター系。
- Ig2ドメインが、LILB2のアミノ酸120−219を含む、請求項187に記載のキメラ受容体レポーター系。
- LILRB2の少なくとも1つの細胞外ドメインがIg3ドメインである、請求項187に記載のキメラ受容体レポーター系。
- Ig3ドメインは、LILB2のアミノ酸221−320を含む、請求項187に記載のキメラ受容体レポーター系。
- LILRB2の少なくとも1つの細胞外ドメインがIg4ドメインである、請求項187に記載のキメラ受容体レポーター系。
- Ig4ドメインが、LILB2のアミノ酸321−458を含む、請求項187に記載のキメラ受容体レポーター系。
- LILRB2の少なくとも1つの細胞外ドメインが、Ig1ドメインおよびIg2ドメインを含む、請求項187に記載のキメラ受容体レポーター系。
- Ig1ドメインおよびIg2ドメインが、LILB2のアミノ酸24−219を含む、請求項187に記載のキメラ受容体レポーター系。
- LILRB2の少なくとも1つの細胞外ドメインが、Ig3ドメインおよびIg4ドメインを含む、請求項187に記載のキメラ受容体レポーター系。
- Ig3ドメインおよびIg4ドメインが、LILB2のアミノ酸221−458を含む、請求項187に記載のキメラ受容体レポーター系。
- 融合タンパク質が、LILRB2のアミノ酸24−458を含む、請求項187に記載のキメラ受容体レポーター系。
- 細胞が、T細胞ハイブリドーマ細胞である、請求項187に記載のキメラ受容体レポーター系。
- レポーター遺伝子の発現がNFAT活性化から生じる、請求項202に記載のキメラ受容体レポーター系。
- レポーター遺伝子の発現が、NFAT応答性プロモーターの制御下にある、請求項203に記載のキメラ受容体レポーター系。
- 前駆細胞が、胚性幹細胞、胚性幹細胞から誘導されるHSCの造血前駆体、誘発された多能性幹細胞、またはリプログラミングによって誘導されるHSCまたは造血前駆体である、請求項41に記載の方法。
- 前駆細胞が、胚性幹細胞、胚性幹細胞から誘導されるHSCの造血前駆体、誘発された多能性幹細胞、またはリプログラミングによって誘導されるHSCまたは造血前駆体である、請求項69に記載の方法。
- 前駆細胞が、胚性幹細胞、胚性幹細胞から誘導されるHSCの造血前駆体、誘発された多能性幹細胞、またはリプログラミングによって誘導されるHSCまたは造血前駆体である、請求項114に記載の方法。
- 前駆細胞が、胚性幹細胞、胚性幹細胞から誘導されるHSCの造血前駆体、誘発された多能性幹細胞、またはリプログラミングによって誘導されるHSCまたは造血前駆体である、請求項142に記載の方法。
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