CN108504626B - 成人干细胞的体外扩增 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了成人干细胞的体外扩增。具体涉及用于操纵和扩增包括成人干细胞在内的干细胞群体的方法、通过这种方法产生的细胞以及与其相关的各种蛋白质构建体。

Description

成人干细胞的体外扩增
本申请是申请日为2014年3月11日，申请号为201480026147.6，发明名称为“成人干细胞的体外扩增”的发明专利申请的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求2013年3月11日提交的美国临时申请No.61/776,422和2013年3月12日提交的美国发明申请No.13/795,659的权益和优先权，将该临时申请和发明申请以引用方式整体并入本文。
政府利益
本发明是在美国国立卫生研究院(National Institute of Health)授予的编号为5R44HL091740-03的政府资助下作出的。政府在本发明中具有某些权利。
序列表、表格或计算机程序表的引用
本申请随电子格式的序列表一起提交。该序列表作为2014年3月10日创建的标题为“106417-0182_Seq_List.txt”的文件提供，大小为10KB字节。电子格式的该序列表中的信息以引用方式整体并入本文。
技术领域
本文提供涉及长期干细胞、产生这类细胞的方法以及各种蛋白质构建体的实施例。
背景技术
长期造血干细胞(LT-HSC)是存在于成人骨髓中并产生全部成熟红细胞组库的稀有祖细胞。这些细胞对于所有红细胞区室的维持是必要的。在针对恶性血液病、自身免疫性和免疫缺陷等的疗法中，干细胞移植可以是一种有用的辅助疗法。
发明内容
在一些实施例中，提供一种产生条件性无限增殖化成人干细胞群体的方法。该方法可包括向一种或多种成人干细胞提供外源合成的能促进细胞存活或增殖中的一者或多者的Myc多肽和外源合成的能抑制凋亡的Bcl-2结构域多肽。在一些实施例中，该Myc多肽以至少约72小时的时间间隔提供给该一种或多种成人干细胞并且该Bcl-2结构域多肽以至少约96小时的时间间隔提供给该一种或多种成人干细胞，以产生条件性无限增殖化成人干细胞群体。在一些实施例中，供应该Bcl-2结构域多肽和/或该Myc多肽的频率不超过每小时一次。在一些实施例中，供应该Bcl-2结构域多肽和/或该Myc多肽的频率不超过每两小时一次。在一些实施例中，供应该Bcl-2结构域多肽和/或该Myc多肽的频率不超过每三小时一次。在一些实施例中，供应该Bcl-2结构域多肽和/或该Myc多肽的频率不超过每四小时一次。在一些实施例中，供应该Bcl-2结构域多肽和/或该Myc多肽的频率不超过每五小时一次。在一些实施例中，供应该Bcl-2结构域多肽和/或该Myc多肽的频率不超过每六小时一次。在一些实施例中，供应该Bcl-2结构域多肽和/或该Myc多肽的频率不超过每七小时一次。在一些实施例中，供应该Bcl-2结构域多肽和/或该Myc多肽的频率不超过每八小时一次。在一些实施例中，供应该Bcl-2结构域多肽和/或该Myc多肽的频率不超过每九小时一次。在一些实施例中，供应该Bcl-2结构域多肽和/或该Myc多肽的频率不超过每十小时一次。在一些实施例中，供应该Bcl-2结构域多肽和/或该Myc多肽的频率不超过每十一小时一次。在一些实施例中，供应该Bcl-2结构域多肽和/或该Myc多肽的频率不超过每十二小时一次。在一些实施例中，供应该Bcl-2结构域多肽和/或该Myc多肽的频率不超过每十三小时一次。在一些实施例中，供应该Bcl-2结构域多肽和/或该Myc多肽的频率不超过每十四小时一次。在一些实施例中，供应该Bcl-2结构域多肽和/或该Myc多肽的频率不超过每十五小时一次。在一些实施例中，供应该Bcl-2结构域多肽和/或该Myc多肽的频率不超过每十六小时一次。在一些实施例中，供应该Bcl-2结构域多肽和/或该Myc多肽的频率不超过每十七小时一次。在一些实施例中，供应该Bcl-2结构域多肽和/或该Myc多肽的频率不超过每十八小时一次。在一些实施例中，供应该Bcl-2结构域多肽和/或该Myc多肽的频率不超过每十九小时一次。在一些实施例中，供应该Bcl-2结构域多肽和/或该Myc多肽的频率不超过每二十小时一次。在一些实施例中，供应该Bcl-2结构域多肽和/或该Myc多肽的频率不超过每二十一小时一次。在一些实施例中，供应该Bcl-2结构域多肽和/或该Myc多肽的频率不超过每二十二小时一次。在一些实施例中，供应该Bcl-2结构域多肽和/或该Myc多肽的频率不超过每二十三小时一次。在一些实施例中，供应该Bcl-2结构域多肽和/或该Myc多肽的频率不超过每二十四小时一次。在一些实施例中，供应该Bcl-2结构域多肽和/或该Myc多肽的频率不超过每三十六小时一次。在一些实施例中，供应该Bcl-2结构域多肽和/或该Myc多肽的频率不超过每四十八小时一次。
在一些实施例中，提供Myc融合蛋白。该融合蛋白包含蛋白转导结构域、能促进细胞存活或增殖中的一者或多者的Myc多肽、V5结构域和六组氨酸表位标签。
在一些实施例中，提供干细胞扩增培养基。该扩增培养基包含IL3、IL6、干细胞因子、促血小板生成素、Flt3-L和GM-CSF。
在一些实施例中，提供Myc融合蛋白。该Myc融合蛋白包含蛋白转导结构域、能促进细胞存活或增殖中的一者或多者的Myc多肽。该Myc融合蛋白的半寿期超过约60分钟。
在一些实施例中，提供编码本文公开的任何蛋白质的核酸。
在一些实施例中，提供包含本文提供的任何核酸的载体。
在一些实施例中，提供包含本文提供的任何载体或核酸的细胞。
附图说明
各个实施例的特征在所附的权利要求书中以具体特征阐述。通过参考下文的“具体实施方式”和附图，将获得对本发明一些实施例的特征和优点的更好的理解，在“具体实施方式”中阐述利用各个实施例的原理的示例性实施例，而在附图中：
图1A、1B、1C、1D和1E显示Tat融合蛋白的产生和体外表征的示例性实施例。图1A显示Tat-Myc融合蛋白和Tat-Bcl-2融合蛋白的示意图的示例性实施例，包括HIV-1Tat的框内蛋白转导结构域及V5和6xHis标签的位置。图1B显示从大肠杆菌(E.coli)纯化、经SDS-PAGE分离并用考马斯染色后的重组蛋白的示例性实施例。图1C显示暴露于纯化的重组Tat-Myc、Tat-Bcl-2或保持未处理(NT)达两小时，然后用抗V5的单克隆抗体并用Hoechst 9934核染剂固定和染色的汇合3T3细胞的菌苔的示例性实施例。Tat-Myc蛋白在这个时间范围主要定位于核区域，而Tat-Bcl-2保持在细胞质和核周空间。图1D显示经如下处理的源自人脐带血的HSC的SDS-PAGE和蛋白质印迹分析(抗V5和β-肌动蛋白的单克隆抗体)：利用Tat-Myc的单次暴露来冲击致敏1小时，洗涤，然后裂解(在指定的时间点)以将质膜和细胞质级分与核级分分离。图1E显示经如下处理的源自人脐带血的HSC的核级分的SDS-PAGE和蛋白质印迹分析(抗V5和β-肌动蛋白的单克隆抗体)：利用Tat-Myc的单次暴露来冲击致敏2小时，洗涤，然后裂解(在指定的时间点)以将质膜和细胞质级分与核级分分离。该蛋白质的大部分在24小时至48小时之间失去。在72小时后的任何时间点没有剩余可检测的蛋白质。
图2A、2B、2C和2D显示表明重组Tat-Myc和Tat-Bcl-2具有生物活性的示意图的示例性实施例。图2A和2B显示在单独培养基(无处理，NT)、补加有Tat-Cre(Tat对照，TC)或递增浓度的Tat-Myc(TM)(图2A)或Tat-Bcl-2(TB)(图2B)的培养基中再次平板接种48小时的体外活化T细胞的示意图的示例性实施例。还显示了起始细胞群体中的活细胞的频率(浅灰色柱条)。图2C和2D显示进一步用Tat-Myc温育并用CFSE标记的活化T细胞的示意图的示例性实施例，表明该活化T细胞保持母细胞化表型(blasting phenotype)(图2C)并且去除抗原刺激和外源添加的细胞因子后继续增殖(图2D)。
图3A、3B和3C显示鼠HSC在体外用Tat-Myc和Tat-Bcl-2扩增的示意图的示例性实施例。图3A显示具有c-Kit+、Sca-1+表型并且呈现谱系标志物(Mac-1、Gr-1、B220、CD3、Ter-119和Flk-2)阴性的所得细胞群体的FACS分析的坐标图的示例性实施例。图3B显示与在没有添加Tat融合蛋白的培养物中的HSC(浅灰色，最右边的迹线)相比，HSC在体外用Tat-Myc和Tat-Bcl-2进行培养时的增殖(深灰色，最左边的迹线)的示意图的示例性实施例。图3C显示在具有Tat-Myc和Tat-Bcl-2的培养物中体外细胞扩增的动力学的示意图的示例性实施例。
图4A、4B、4C和4D显示用Tat-Myc和Tat-Bcl-2扩增的鼠ptlt-HSC在体内的功能分析的示意图的示例性实施例。几群经亚致死性辐照的Rag-1-/-小鼠被给予103个源自从野生型C57BL/6J小鼠获得的骨髓细胞的ptlt-HSC。图4A显示与Rag-1-/-对照(第一小图)相比，来自ptlt-HSC嵌合小鼠(第二小图)的外周血中成熟B细胞的存在的FACS分析(CD19/B220表达)的示意图的示例性实施例。图4B显示与Rag-1-/-对照(第一小图)相比，Rag-1-/-ptlt-HSC嵌合小鼠(第二小图)的外周血中成熟T细胞的存在的FACS分析(TCRβ/CD4表达)的示意图的示例性实施例。图4C显示来自Rag-1-/-ptlt-HSC嵌合小鼠的淋巴器官(脾脏、胸腺、淋巴结和骨髓)中的发育中的T细胞和B细胞的FACS分析(CD19/IgM和CD8/CD4表达)的示意图的示例性实施例。图4D示出的数据证明成熟淋巴样细胞在经它们的抗原受体活化后能够母细胞化并进行细胞分裂。
图5A、5B、5C、5D和5E显示用Tat-Myc和Tat-Bcl-2扩增源自人脐带血细胞的HSC的示意图的示例性实施例。图5A显示在体外扩增14天的人脐带血细胞的表面表型的FACS分析的示意图的示例性实施例(顶部各小图仅用细胞因子混合物；底部各小图用补加有Tat-Myc和Tat-Bcl-2的细胞因子混合物)。图5B显示在两组条件下CD34+细胞的体外扩增的动力学的示意图的示例性实施例。图5C显示源自人ptlt-HSC的、在甲基纤维素测定法中在支持髓类红细胞分化的条件下发育的三种不同集落类型的图像的示例性实施例。图5D显示在接种了103个用细胞因子混合物培养的脐带血细胞(FCB)、103个用补加Tat-Myc和Tat-Bcl-2的细胞因子混合物培养的脐带血细胞(FCB+TMTB)或104个新鲜的未经操纵的脐带血细胞(10^4新鲜FCB)的甲基纤维素培养物中观察到的每种集落类型的定量的示意图的示例性实施例。图5E显示再次平板接种图5D中所示的细胞时在甲基纤维素培养物中观察到的集落数目的定量的示意图的示例性实施例。
图6A、6B、6C、6D、6E、6F和6G显示源自人脐带血的蛋白转导长期(ptlt)-HSC的体内功能分析的示意图的示例性实施例。图6A显示几群被给予如下移植物的经亚致死性辐照的NSG小鼠的骨髓的FACS分析的示意图的示例性实施例：106个在细胞因子混合物中体外扩增的脐带血细胞(第一小图；FCB)，或106个在补加有Tat-Myc和Tat-Bcl-2的细胞因子混合物中扩增的脐带血细胞(第二小图；FCB TMTB)，或5×106个新鲜的未经操纵的脐带血细胞(第三小图；新鲜FCB)。图6B显示来自异种嵌合小鼠的骨髓、脾脏和胸腺细胞的FACS分析的示意图的示例性实施例。对所有细胞的人CD45进行染色。对CD45+细胞设门，显示出骨髓中的人CD34+CD38lo细胞(第一小图；骨髓)；脾脏中的人CD19+和人CD3+淋巴细胞(第二小图；脾脏)；和胸腺中的人CD3+细胞(第三小图；胸腺)。图6C显示用CFSE标记并在抗人CD40和IgM的单克隆抗体存在下培养的人脾脏B细胞的FACS分析的示意图的示例性实施例。在NSG异种嵌合小鼠中发育的人B细胞在它们的抗原受体刺激后发生增殖。图6D显示来自从NSG异种嵌合小鼠的骨髓获得并在甲基纤维素上平板接种的人CD34+CD38lo细胞的髓类红细胞集落的定量的示意图的示例性实施例。图6E显示再次平板接种后髓类红细胞集落的发育的定量的示意图的示例性实施例。图6F显示在细胞因子混合物(空心圆圈)或补加有Tat-Myc和Tat-Bcl-2的细胞因子混合物(黑色正方形)中体外扩增的CD45阳性骨髓细胞群体中的髓样细胞和淋巴样细胞分化(CD11b、CD33、CD3和CD19表达)的定量的示意图的示例性实施例。图6G显示在细胞因子混合物(空心圆圈)或补加有Tat-Myc和Tat-Bcl-2的细胞因子混合物(黑色正方形)中体外扩增的CD45阳性脾脏细胞群体中的髓样细胞和淋巴样细胞分化(CD11b、CD33、CD3和CD19表达)的定量的示意图的示例性实施例。
图7A、7B、7C、7D、7E、7F和7G显示用Tat-Myc和Tat-Bcl-2体外扩增成人G-CSF动员的HSC的示意图的示例性实施例。图7A显示人CD45+细胞的表面表型的示意图的示例性实施例，表明了人CD34+级分和CD38+级分的富集。图7B显示在Tat-Myc和Tat-Bcl-2存在下在培养物中进行体外细胞扩增18天时间的动力学的示意图的示例性实施例。图7C显示表明了5×103个用Tat-Myc和Tat-Bcl-2在体外扩增的成人G-CSF HSC在甲基纤维素中产生4种形态学上不同的集落类型的示意图的示例性实施例。图7D显示表明了用Tat-Myc和Tat-Bcl-2在体外扩增的成人G-CSF HSC在异种嵌合NSG小鼠中产生人造血谱系的FACS分析的示意图的示例性实施例。骨髓来自移植了用补加有Tat-Myc和Tat-Bcl-2的细胞因子混合物(第一小图；G-CSF+TMTB)或用新鲜的未经操纵的脐带血细胞(第二小图；新鲜FCB)扩增的ptlt-HSC的NSG小鼠。图7E显示来自骨髓、脾脏和胸腺的细胞的FACS分析的示意图的示例性实施例。骨髓细胞包括人CD45细胞(它们也是人CD34+和CD38+)(第一小图)、脾脏细胞包括人CD45细胞(也对它们的人CD3进行染色)(第二小图)；胸腺细胞包括人CD45细胞及CD3(第三小图)。图7F和7G显示对植入了106个在补加Tat-Myc和Tat-Bcl-2的细胞因子混合物中(黑色正方形)体外扩增的G-CSF动员细胞的一群异种嵌合小鼠进行髓样细胞和淋巴样细胞分化评估的示意图的示例性实施例。对骨髓细胞(图7F)和脾脏细胞(图7G)的CD45阳性群体分析CD11b、CD33、CD3和CD19表达。
图8显示用CFSE标记并分别在抗小鼠CD3或CD40和IgM的单克隆抗体存在下培养的小鼠脾脏T细胞和B细胞的FACS分析的示意图示例性实施例。在移植了来自5FU处理的C57BL.6的扩增HSC的Rag1-/-小鼠中发育的小鼠T细胞(第一小图，最左边的浅灰色线条)和B细胞(第二小图，最左边的浅灰色线条)与未经刺激的细胞(最右边的深灰色线条)相比，在它们的抗原受体刺激后发生增殖。
图9A和9B显示各种Myc融合蛋白构建体在活化T细胞活力测定中的活性的示例性实施例。图9A显示一些代表性的Myc融合蛋白构建体的示例性概略性比对。图9B显示在用代表性的Myc融合蛋白构建体处理后48小时活T细胞百分数的示意图的示例性实施例。
图10A、10B、10C和10D显示各种Tat融合蛋白(各为50μg/ml)在活化T细胞活力测定中的活性的示例性实施例。图10A显示来自未经处理的细胞(无处理)的FACS分析(前向和侧向散射)的活门(live gate)的示意图的示例性实施例。图10B显示来自经Tat-Cre处理的细胞(Tat-Cre对照)的FACS分析(前向和侧向散射)的活门的示意图的示例性实施例。图10C显示来自经Tat-Bcl2处理的细胞(Tat-Bcl2)的FACS分析(前向和侧向散射)的活门的示意图的示例性实施例。图10A显示来自经Tat-Myc处理的细胞(Tat-Myc)的FACS分析(前向和侧向散射)的活门的示意图的示例性实施例。
图11显示在多种细胞因子存在下并且在有或没有PTD融合蛋白的情况下扩增的CD34+细胞的数目的示意图的示例性实施例。
图12显示来自接受了5×10^6个在单独FCB培养基(顶部小图)或补加有Tat-Myc和Tat-Bcl2的FCB培养基(左下小图)中扩增的细胞的NSG小鼠的、对人CD45染色的骨髓细胞的FACS分析的示意图的示例性实施例。注意在接受了用Tat-Myc和Tat-Bcl2处理的细胞的小鼠中人CD45+细胞的增加。CD45+细胞进一步通过流式细胞术进行分析以确定CD34阳性细胞的存在(右下小图)。
图13显示来自接受了5×10^6个在单独FCB培养基(顶部小图)或补加有Tat-Myc和Tat-Bcl2的FCB培养基(左下小图)中扩增的细胞的NSG小鼠的、对人CD45染色的脾脏细胞的FACS分析的示意图的示例性实施例。注意在接受了用Tat-Myc和Tat-Bcl2处理的细胞的小鼠中人CD45+细胞的增加。CD45+细胞进一步通过流式细胞术进行分析以确定CD19和CD3阳性细胞的存在(右下小图)。
图14显示来自接受了5×10^6个在单独FCB培养基(顶部小图)或补加有Tat-Myc和Tat-Bcl2的FCB培养基(左下小图)中扩增的细胞的NSG小鼠的、对人CD45染色的胸腺细胞的FACS分析的示意图的示例性实施例。注意在接受了用Tat-Myc和Tat-Bcl2处理的细胞的小鼠中人CD45+细胞的增加。CD45+细胞进一步通过流式细胞术进行分析以确定CD19和CD3阳性细胞的存在(右下小图)。
图15A示出Tat-Myc多肽的一些实施例的氨基酸序列和核酸序列。
图15B示出Bcl-2结构域多肽的一些实施例的氨基酸序列和核酸序列。
具体实施方式
由于LT-HSC细胞频率低且不能够离体增殖等原因，LT-HSC细胞的治疗效用已受到限制。这些细胞的扩增对于诸如但不限于基因治疗的临床应用是特别重要的。
本文描述的一些实施例可用于产生个别化的HSC(individualized HSC)以供个性化医疗和其他用途，任选地使用自体细胞来产生。
本文提供的一些实施例不要求在进行体外扩增之前先分离和/或纯化CD34+级分。因此，在一些实施例中，可从这类细胞的扩增中取消这个步骤。这可降低成本并简化这个干细胞扩增方法向临床实践的应用。本文提供的任何方法都可任选地不包括在进行体外扩增之前先分离和/或纯化CD34+级分。
本文描述的一些实施例提供一种通过用特定的融合蛋白培养原代成人HSC以产生蛋白转导长期HSC(ptlt-HSC)，来在体外扩增细胞因子依赖性LT-HSC群体的方法。在一些实施例中，该融合蛋白具有与原癌基因编码的、能诱导细胞存活和/或增殖的蛋白质或其生物活性片段或同源物(如Myc多肽)连接的蛋白转导结构域。该方法可进一步包括包含与抗凋亡的蛋白质或其生物活性片段或功能性同源物(如Bcl-2结构域多肽)连接的蛋白转导结构的融合蛋白。在一些实施例中，这涉及与能诱导细胞存活和/或增殖的Myc多肽连接的蛋白转导结构域和与Bcl-2结构域多肽连接的蛋白转导结构域。
通用定义
任何与本文描述的那些用于本文描述的实施例的实践或测试的方法和材料类似或等同的方法或材料，都被认为是本发明的一部分。
如本文所用，“干细胞(例如，造血干细胞)”指本领域通常理解的该术语。例如，干细胞(例如，造血干细胞)无论其来源如何，都是能够长时间自我分裂和更新的、未特化的(未分化的)且具有产生(分化为)特化细胞类型的能力(例如，它们是多种不同的特化细胞类型的祖细胞或前体细胞)的细胞。在本文的某些情况中，本文描述的“干细胞(例如，造血干细胞)”指长期干细胞(例如，造血干细胞)。
术语“长期”当结合干细胞(例如，造血干细胞)使用时，指干细胞(例如，造血干细胞)长时间(例如，1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、8个月、9个月、12个月、2年、3年)通过分裂为相同的非特化细胞类型而自我更新的能力，具体时间取决于具体的干细胞类型。在一些实施例中，干细胞(例如，造血干细胞)通过以下细胞表面标志物的存在来鉴定：c-kit+、Sca-1+、CD34low/-、CD38+和/或Thy1+/low。在一些实施例中，人干细胞(例如，造血干细胞)通过以下标志物的存在来鉴定：CD34+、CD38low/-、c-kit-/low和/或Thy1+。在一些实施例中，人和鼠干细胞(例如，造血干细胞)都缺乏细胞谱系标志物，如CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、NK1.1、B220、Ter-119和/或Gr-1。
在一些实施例中，本文描述的多肽的同源物、类似物或片段包括与该多肽具有至少40％至100％同一性的氨基酸序列，所述同一性百分比例如至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、90％、91％、92％、94％、95％、96％、97％、98％，或约40％至约100％中的任何其他百分比。
为确定两个氨基酸序列或两个核酸的同源性百分比，将两个序列为了最佳比较目的进行比对(例如，在第一个氨基酸或核酸序列中引入空位以便与第二个氨基酸或核酸序列进行最佳比对)。然后可比较在相应的氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当占据第一序列中的某个位置的氨基酸残基或核苷酸与占据第二序列中的相应位置的氨基酸或核苷酸相同时，则这两个分子在该位置是相同的。这两个序列之间的同源性百分比是这两个序列共享的相同位置的数目的函数(％同一性＝相同位置的数目/位置(例如重叠位置)总数目×100)。在一些实施例中，这两个序列具有相同的长度。
为确定两个序列之间的同源性百分比，使用Karlin and Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-2268(Karlin和Altschul，1990年，《美国国家科学院院刊》，第87卷，第2264-2268页)的算法，该算法在Karlin and Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877(Karlin和Altschul，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第5873-5877页)中进行了修改。将这种算法结合到Altschul,et al.(1990)J.Mol Biol.215:403-410(Altschul等人，1990年，《分子生物学杂志》，第215卷，第403-410页)的NBLAST和XBLAST程序中。用NBLAST程序、分数＝100、字长＝12进行BLAST核苷酸检索，以获得与本文描述的或公开的核酸分子同源的核苷酸序列。用XBLAST程序、分数＝50、字长＝3进行BLAST蛋白质检索。为获得带空位的比对以用于比较目的，采用如Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402(Altschul等人，1997年，《核酸研究》，第25卷，第3389-3402页)所述的空位BLAST。当采用BLAST程序和空位BLAST程序时，使用分别的程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。参见美国国家生物技术信息中心(National Centerfor Biotechnology Information)的网站获取更多的细节(互联网上的ncbi.nlm.nih.gov)。适用于本文描述的方法的蛋白质还包括与本文描述的任何蛋白质的氨基酸序列相比具有1至15个氨基酸变化，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸置换、缺失或添加的蛋白质。在其他实施例中，经变更的氨基酸序列与本文描述的任何蛋白质抑制剂的氨基酸序列具有至少75％同一性，例如77％、80％、82％、85％、88％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或100％同一性。只要变更的氨基酸序列保持足够的生物活性从而在本文描述的组合物和方法中具有功能，则这种序列变体蛋白质适合于本文描述的方法。在某些情况中，采用保守氨基酸置换。氨基酸之间的示例性的保守置换在以下各组的每组内：(1)甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，(2)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，(3)丝氨酸和苏氨酸，(4)天冬氨酸和谷氨酸，(5)谷氨酰胺和天冬酰胺，以及(6)赖氨酸、精氨酸和组氨酸。BLOSUM62表是源自蛋白质序列区段的约2000个局部多重比对的氨基酸置换矩阵，代表了超过500组相关蛋白质的高度保守区域(Henikoff et al.(1992),Proc.NatlAcad.Sci.USA,89:10915-10919(Henikoff等人，1992年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第10915-10919页))。使用BLOSUM62置换频率来定义在一些实施例中被引入到本文描述的或公开的氨基酸序列中的保守氨基酸置换。虽然有可能仅基于化学性质(如上所讨论)设计氨基酸置换，但“保守氨基酸置换”这个用语优选指由大于-1的BLOSUM62值所代表的置换。例如，如果某个氨基酸置换以0、1、2或3的BLOSUM62值为特征，则该置换是保守的。根据这个系统，优选的保守氨基酸置换以至少1(例如1、2或3)的BLOSUM62值为特征，而更优选的保守氨基酸置换以至少2(例如2或3)的BLOSUM62值为特征。
如本文所用，术语“核酸”指这样的核酸，其是通过一个或多个核酸的组合或插入而工程改造得到，从而将在自然界中通常不会在一起出现的序列组合在一起。在一些实施例中，核酸包含诱导子或增强子。在一些实施例中，核酸包含限制性酶切位点。在一些实施例中，核酸编码多肽。在一些实施例中，核酸包含突变。
如本文所用，术语“多肽”指从核酸产生的多肽。
如本文所用，术语“转基因”指编码多肽的核酸整合到动物、细菌、病毒或细胞的基因组DNA中。
如本文所用，“过量表达”指当与同样的多肽或蛋白质在相同的细胞内的内源表达水平比较时更高的表达水平。在某些情况中，“过量表达”指多肽的表达。在一些实施例中，更高的表达水平包括高出2％至200％。在一些实施例中，更高的表达水平包括高出2倍至1000倍。在一些实施例中，更高的表达水平包括高出2倍至1000倍。在一些实施例中，更高的表达水平包括高出2倍至10,000倍。在一些实施例中，更高的表达水平包括当与之前未能检测的表达水平相比可检测的表达水平。在一些实施例中，“过量表达”指外源多肽或蛋白质的任何可检测的表达水平。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换地用来指氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于天然存在的氨基酸聚合物以及其中一个或多个氨基酸残基为非天然存在的氨基酸(例如氨基酸类似物)的氨基酸聚合物。如本文所用，这些术语涵盖任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白质，其中氨基酸残基通过共价肽键连接。
如本文所用，在本发明的实施例中提到分离的蛋白质或多肽时，包括全长蛋白质、融合蛋白、嵌合蛋白或这种蛋白质的任何片段(截短形式、部分)或同源物。更具体地讲，分离的蛋白质可以是已从其天然环境中移出(即已经历人工操纵)的蛋白质(包括多肽或肽)，并且可包括但不限于纯化的蛋白质、部分纯化的蛋白质、重组法产生的蛋白质、膜结合的蛋白质、与脂质复合的蛋白质、可溶性蛋白质、合成法产生的蛋白质以及与其他蛋白质结合的分离蛋白。因此，“分离的”并不反映蛋白质已被纯化的程度。优选地，分离的蛋白质是重组法产生的。
优选地，使用重组DNA技术(例如聚合酶链式反应(PCR)扩增、克隆)或化学合成来产生分离的核酸分子。分离的核酸分子包括天然核酸分子及其同源物，包括但不限于天然等位基因变体以及经修饰的核酸分子，在经修饰的核酸分子中以一定方式发生了核苷酸的插入、缺失、置换和/或倒位，使得这类修饰提供期望的效果(例如，诱导型原癌基因的提供，如本文所描述)。
可使用多种本领域技术人员知道的方法来产生核酸分子同源物(参见例如Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor LabsPress(1989)(Sambrook等人，《分子克隆实验指南》，冷泉港实验室出版社，1989年))。例如，可使用多种技术来修饰核酸分子，包括但不限于经典的诱变技术和重组DNA技术，如定点诱变、对核酸分子进行化学处理以诱导突变、对核酸片段的限制性核酸酶切割、核酸片段的连接、核酸序列的选定区域的PCR扩增和/或诱变、寡核苷酸混合物的合成和混合物基团的连接以“建立”核酸分子的混合物，以及它们的组合。可通过筛选由核酸编码的蛋白质的功能和/或通过与野生型基因杂交，从经修饰的核酸的混合物选择核酸分子同源物。
核酸分子或多核苷酸的最小尺寸是足以编码可用于本文提供的实施例的蛋白质的尺寸，所述蛋白质例如由原癌基因编码的蛋白质或其功能部分(例如，具有该全长蛋白质的生物活性并且足以在本发明方法中使用的部分)或抗凋亡的蛋白质或其功能部分(例如，具有该全长蛋白质的生物活性并且足以在本发明方法中使用的部分)。其他可能有用的核酸分子可包括其最小尺寸足以形成能够与编码天然蛋白质的核酸分子的互补序列形成稳定杂交体(例如在中度、高或极高的严格性条件下)的探针或寡核苷酸引物的核酸分子，该最小尺寸通常为长度至少5个核苷酸，优选在约5至约50或约500个核苷酸或更多个核苷酸范围内，包括这些范围之间以整数递增的任何长度(即，5、6、7、8、9、10、…33、34、…256、257、…500)。对核酸分子的最大尺寸没有限制(不同于实际限制)，因为该核酸分子可包括足以在本文描述的任何实施例中有用的一个或多个序列。
如本文所用，严格杂交条件指使用核酸分子来鉴定类似的核酸分子的标准杂交条件。这种标准条件例如在Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Labs Press,1989(Sambrook等人，《分子克隆实验指南》，冷泉港实验室出版社，1989年)中公开。将Sambrook等人的上述文献以引用方式整体并入本文(具体参见第9.31至9.62页)。另外，用于计算能实现允许不同程度的核苷酸错配的杂交的适当杂交和洗涤条件的公式在例如Meinkoth et al.,1984,Anal.Biochem.138,267-284(Meinkoth等人，1984年，《分析生物化学》，第138卷，第267-284页)中公开；将Meinkoth等人的上述文献以引用方式整体并入本文。
更具体地讲，本文所指的中等严格性杂交和洗涤条件是指允许分离与用来在杂交反应中进行探测的核酸分子具有至少约70％核酸序列同一性的核酸分子的条件(例如允许约30％或更少的核苷酸错配的条件)。本文所指的高严格性杂交和洗涤条件是指允许分离与用来在杂交反应中进行探测的核酸分子具有至少约80％核酸序列同一性的核酸分子的条件(例如允许约20％或更少的核苷酸错配的条件)。本文所指的极高严格性杂交和洗涤条件是指允许分离与用来在杂交反应中进行探测的核酸分子具有至少约90％核酸序列同一性的核酸分子的条件(例如允许约10％或更少的核苷酸错配的条件)。如上所讨论，本领域技术人员可使用Meinkoth等人的上述文献中的公式来计算适当的杂交和洗涤条件以实现这些特定的核苷酸错配水平。这种条件将根据是形成DNA:RNA杂交体还是形成DNA:DNA杂交体而变。DNA:DNA杂交体的计算解链温度比DNA:RNA杂交体低10℃。在特定的实施例中，DNA:DNA杂交体的严格杂交条件包括在6xSSC(0.9M Na+)的离子强度下，在约20℃至约35℃之间(低严格性)、更优选地约28℃至约40℃之间(更严格)、甚至更优选地约35℃至约45℃之间(甚至更严格)的温度下杂交，加上适当的洗涤条件。在特定的实施例中，DNA:RNA杂交体的严格杂交条件包括在6xSSC(0.9M Na+)的离子强度下，在约30℃至约45℃之间、更优选地约38℃至约50℃之间、甚至更优选地约45℃至约55℃之间的温度下杂交，加上相似地严格的洗涤条件。这些值是基于针对大于约100个核苷酸的分子、0％甲酰胺和约40％的G+C含量的解链温度的计算结果。作为另一种选择，可如Sambrook等人的上述文献第9.31至9.62页中所述以经验为根据计算Tm。一般而言，洗涤条件应尽可能严格，并且应适于所选的杂交条件。例如，杂交条件可包括比特定杂交体的计算Tm低大约20-25℃的盐和温度条件的组合，而洗涤条件通常包括比该特定杂交体的计算Tm低大约12-20℃的盐和温度条件的组合。适用于DNA:DNA杂交体的杂交条件的一个例子包括在6xSSC(50％甲酰胺)中在约42℃下进行2至24小时的杂交，然后进行洗涤步骤，所述洗涤步骤包括在约2xSSC中在室温下进行一次或多次洗涤，接着在较高的温度和较低的离子强度下进行另外的洗涤(例如，在约0.1x至0.5xSSC中在约37℃下进行至少一次洗涤，接着在约0.1x至0.5xSSC中在约68℃下进行至少一次洗涤)。
在一些实施例中，任何本文描述的氨基酸序列，包括这类序列的截短形式(片段或部分)和同源物都可被产生成在该给定的氨基酸序列的C末端和/或N末端每一末端的侧翼具有至少一个、最多约20个附加的异源氨基酸。所得的蛋白质或多肽可称为“基本上由给定的氨基酸序列组成”。异源氨基酸是这样的氨基酸的序列，所述氨基酸不天然被发现(即不在自然界中、在体内被发现)位于该给定的氨基酸序列的侧翼，或者不会由位于在基因中出现的编码该给定的氨基酸序列的天然存在核酸序列的侧翼的核苷酸编码，如果该天然存在序列中的这类核苷酸是使用该给定的氨基酸序列所源自的生物体的标准密码子用法翻译的话。类似地，词语“基本上由…组成”当涉及本文的核酸序列而使用时，指这样的编码给定的氨基酸序列的核酸序列，在编码该给定的氨基酸序列的该核酸序列的5'和/或3'末端每一末端的侧翼可以有至少一个、最多达约60个附加的异源核苷酸。所述异源核苷酸不天然被发现(即不在自然界中、在体内被发现)位于在天然基因中出现的编码该给定的氨基酸序列的核酸序列的侧翼。
重组载体(通常也称为重组核酸分子，特别是当它含有目的核酸序列时)是经工程改造的(例如，人工产生的)核酸分子，其被作为工具用于操纵所选的核酸序列和用于将这种核酸序列引入到宿主细胞中。因此，重组载体适用于对该所选的核酸序列进行克隆、测序和/或以别的方式进行操纵，如通过表达和/或递送该所选的核酸序列到宿主细胞中来进行。这种载体通常含有异源核酸序列，如不天然或通常被发现邻近要克隆或递送的核酸序列的核酸序列，不过该载体也可含有天然被发现邻近核酸分子或可用于该核酸分子的表达的调节性核酸序列(例如，启动子、非翻译区)(在下文中详细论述)。载体可以是原核生物或真核生物的RNA或DNA，并且通常是质粒或病毒载体。该载体可作为染色体外元件(例如质粒)维持，或者它可整合到宿主细胞的染色体中。整个载体可在宿主细胞内原位保持，或者在某些条件下，质粒DNA可被删除而留下该核酸分子。在其他条件下，该载体可被设计成在选定的时间从宿主细胞的基因组切除(移去)(在下文中更详细描述)。该被整合的核酸分子可处于染色体启动子控制之下，处于天然或质粒启动子控制之下，或者处于几种启动子控制的组合之下。几个或多个拷贝的该核酸分子可被整合到该染色体中。重组载体可含有至少一种选择性标志物。
在一些实施例中，干细胞可包括从任何来源获得的任何成人干细胞。在另一个实施例中，干细胞可包括胚胎干细胞。干细胞可包括但不限于造血干细胞、间充质干细胞(包括但不限于肺间充质干细胞、骨髓基质细胞)、神经干细胞、上皮干细胞(包括但不限于肺上皮干细胞、乳腺上皮干细胞、血管上皮干细胞和肠上皮干细胞)、肠干细胞、心肌细胞祖细胞干细胞、皮肤干细胞(包括但不限于表皮干细胞和小囊干细胞(毛囊干细胞))、骨骼肌干细胞、成骨细胞前体干细胞和肝干细胞。
造血干细胞产生所有类型的血细胞，包括但不限于红细胞(红血球)、B淋巴细胞、T淋巴细胞、自然杀伤细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和血小板。
间充质干细胞(包括骨髓基质细胞)产生多种细胞类型，包括但不限于骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肺细胞和其他种类的结缔组织细胞，如腱中的那些结缔组织细胞。
脑中的神经干细胞产生其三种主要的细胞类型：神经细胞(神经元)和两类非神经元细胞，即星形胶质细胞和少突神经胶质细胞。
各种组织的衬里中的上皮干细胞产生几种形成组织中的上皮的细胞类型。
皮肤干细胞出现在表皮的基底层中和出现在毛囊的基底处。表皮干细胞产生角质形成细胞，后者迁移到皮肤的表面并形成保护层，小囊干细胞可产生毛囊和表皮两者。成人干细胞的其他来源将是本领域技术人员知道的。
胚胎干细胞可产生身体的所有组织和细胞。
方法
长期再植性造血干细胞(long term repopulating hematopoietic stem cell,LT-HSC)群体在个体的一生中在体内自我更新并支持造血作用。长期HSC在骨髓干细胞移植等情况下具有重要性。
造血干细胞(HSC)在体内的功能依赖于决定自我更新、谱系定向和分化的复杂微环境信号。因为不能够在允许自我更新的同时维持多能性和防止分化，扩增HSC群体的尝试已受到阻碍(Bernstein,I.D.and Delaney,C.(2012).Cell Stem Cell 10,113-4(Bernstein,I.D.和Delaney,C.，2012年，《细胞·干细胞》，第10卷，第113-4页))。先前在体外扩增HSC的努力涉及到使用细胞因子混合物(Chou,S.,et al.(2010).Cell Stem Cell7,427-8(Chou,S.等人，2010年，《细胞·干细胞》，第7卷，第427-8页)、Notch-1的配体(Dahlberg,A.,et al(2011).Blood 117,6083-90(Dahlberg,A.等人，2011年，《血液》，第117卷，第6083-90页)、HoxB4的Tat融合蛋白(Krosl,J.,et al.(2003).Nat Med 9,1428-32(Krosl,J.等人，2003年，《自然·医学》，第9卷，第1428-32页)、NF-Ya(Domashenko,A.D.,etal,(2010).Blood 116,2676-83(Domashenko,A.D.等人，2010年，《血液》，第116卷，第2676-83页)和其他转录因子(Yang,J.et al.(2011).J Hematol Oncol 4,38(Yang,J.等人，2011年，《血液学和肿瘤学杂志》，第4卷，第38页)以及小分子(PGE2和芳烃受体拮抗剂)(North,T.E.,et al.(2007).Nature 447,1007-11(North,T.E.等人，2007年，《自然》，第447卷，第1007-11页)；Boitano,A.E.,et al.(2010).Science 329,1345-8(Boitano,A.E.等人，2010年，《科学》，第329卷，第1345-8页)。扩增的细胞的性质随这些不同的方法而异，从而在异种嵌合移植小鼠研究中和在临床中产生各种各样的结果(Walasek,M.A.,et al.(2012).AnnNY Acad Sci,1266,138-50(Walasek,M.A.等人，2012年，《纽约科学院年报》，第1266卷，第138-50页))。
当前的干细胞疗法中的障碍包括难以获得足够数目的所需细胞，以及同种异体意义上适当的供者的鉴定。本文描述的一些实施例使得能够产生大量的HSC。移植纯的和均质的干细胞群体的能力也使得可以跨越同种异体障碍而重构经辐照的宿主。
在一些实施例中，提供一种产生条件性无限增殖化成人干细胞(蛋白转导长期HSC，“ptlt-HSC”)的群体的方法。该方法包括向一种或多种成人干细胞提供a)外源合成的能促进细胞存活或增殖中的一者或多者的Myc多肽和b)外源合成的能抑制凋亡的Bcl-2结构域多肽。在一些实施例中，该Myc多肽以至少约72小时的时间间隔提供给该一种或多种成人干细胞。在一些实施例中，该Bcl-2结构域多肽以至少约96小时的时间间隔提供给该一种或多种成人干细胞，以产生条件性无限增殖化成人干细胞群体。术语“外源合成的”表示蛋白质不是在它们所作用于的细胞内合成。在一些实施例中，外源合成的蛋白质以分离的形式(例如，缓冲液和仅仅这些蛋白质)添加到细胞。在一些实施例中，外源合成的蛋白质通过与干细胞分开的第一细胞群体产生。
虽然不想受理论的约束，但原癌基因编码的蛋白质(例如，Myc多肽)的功能似乎防止HSC退出细胞周期，驱动它们连续增殖并抑制它们的分化。包含IL-3、IL-6、SCF和其他细胞因子的细胞因子混合物所提供的信号维持增殖中的ptlt-HSC细胞的HSC表型。该抗凋亡的蛋白质(例如，Bcl-2结构域多肽)所提供的存活功能可以挽救ptlt-HSC细胞免于凋亡性死亡，若该原癌基因编码的蛋白质功能撤去则通常会随之发生凋亡性死亡。这似乎让HSC恢复其使用体内的生理上可利用的存活信号的能力。因此，在一些实施例中，该方法可包括驱动增殖和抑制分化并且可包括同时施加Bcl-2结构域多肽和Myc多肽，并随后撤去该Myc多肽(或让其水平下降)，同时保持存在一定量的Bcl-2，使得细胞在Myc的撤去之后还活下来，从而让它们随后得以分化。
虽然不想受理论的约束，但似乎在ptlt-HSC的过继转移时，抗凋亡的蛋白质的存活功能可以使细胞习惯于骨髓干细胞小生境所提供的微环境信号。在需要的情况下，如辐照诱导的淋巴细胞减少，这些信号可驱动ptlt-HSC的分化以产生功能性淋巴样细胞和其他分化的血细胞。要指出的是，在用ptlt-HSC重构的小鼠中没有观察到白血病。因此，在一些实施例中，本文提供用于产生这种有利的细胞的方法。
在一些实施例中，该方法可包括停止和/或减少Myc的添加，使得培养基中的Myc的量随时间推移降低。在Myc的量降低的这个时间段期间，在适当情况下可继续添加Bcl-2以维持可接受的Bcl-2水平。
在一些实施例中，该Myc多肽以至少约72小时的时间间隔提供。在一些实施例中，该Myc多肽可更频繁地提供，例如，每24、32、40、48、56或64小时。
在一些实施例中，给予该Myc多肽和/或Bcl-2结构域多肽的频率不超过每小时一次，例如每两小时一次、每三小时一次、每四小时一次、每五小时一次、每六小时一次、每七小时一次、每八小时一次、每九小时一次、每十小时一次、每十一小时一次、每十二小时一次、每十三小时一次、每十四小时一次、每十五小时一次、每十六小时一次、每十七小时一次、每十八小时一次、每十九小时一次、每二十小时一次、每二十一小时一次、每二十二小时一次、每二十三小时一次或每二十四小时一次。在一些实施例中，给予该Myc多肽和/或Bcl-2结构域多肽的频率不超过每天一次，例如每两天一次、每三天一次或每四天一次。在一些实施例中，这可通过使用本文提供的Myc多肽的各个实施例来实现，尽管传统的Myc多肽的半寿期短(例如36分钟)。在一些实施例中，尽管给予该Myc多肽的频率低，但一次给予的Myc多肽的量将小于约100微克/毫升，例如50至100微克/毫升或20微克/毫升或更少。在这种情况中，由于Myc的半寿期延长，Myc对于以上提到的各个时间段中的一者或多者仍可以是有效的，而不需要额外的Myc多肽(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、12、16、24或48小时而不需要额外的Myc多肽，同时仍向细胞提供有效水平的Myc活性)。
在一些实施例中，Myc和/或Bcl-2结构域多肽的量在短时间里一次性施加，例如，Myc和/或Bcl-2结构域多肽的量可在单次投料(single dump)中一次性或者在1、5、10或60秒时间里施加。在一些实施例中，该Myc和/或Bcl-2结构域多肽可在1分钟至60分钟，例如约1、3、5或10分钟时间里施加。
在一些实施例中，该Myc多肽连续提供。在一些实施例中，该Myc多肽以至少约0.1微克/毫升，例如5、10、50或100微克/毫升的浓度提供。在一些实施例中，该Myc多肽在约0.1至约50微克/毫升的范围提供。在一些实施例中，在8、12、16或24小时时间里向细胞提供不超过1微克/毫升。
在一些实施例中，该Bcl-2结构域多肽以至少约72小时的时间间隔提供。在一些实施例中，该Bcl-2结构域多肽可更频繁地提供，例如每24、32、40、48、56或64小时一次。
在一些实施例中，该Bcl-2结构域多肽连续提供。在一些实施例中，该Bcl-2结构域多肽以至少约0.1微克/毫升，例如5、10、50或100微克/毫升的浓度提供。在一些实施例中，该Bcl-2结构域多肽在约1至约50微克/毫升的范围提供。在一些实施例中，该Bcl-2结构域多肽以约1微克/毫升的浓度提供。在一些实施例中，Bcl-2结构域多肽与Myc之比可取决于希望实现的所期望的过程。在一些实施例中，Bcl-2与Myc之比为至少1:1，例如至少2:1的Bcl-2与Myc之比。
在一些实施例中，该Bcl-2结构域多肽和该Myc多肽可同时给予。在一些实施例中，该Bcl-2结构域多肽和该Myc多肽可在不同时间给予。在一些实施例中，该Bcl-2结构域多肽和该Myc多肽可在重叠的时间给予。
在一些实施例中，本文提供的Myc多肽和/或Bcl-2结构域多肽中的任一者可在本文提供的方法中使用。
在一些实施例中，细胞可在多种温度下和在多种条件下培养。在一些实施例中，它们可在约37℃下培养。在一些实施例中，细胞可在透气容器中培养，如透气烧瓶(如由G-Rex公司生产的那些透气烧瓶)或透气袋(如由傲锐基因公司(Origene)生产的那些透气袋)。在一些实施例中，这提供优于那些在塑料TC容器中的静止培养物中进行的方法。在一些实施例中，该过程可在具有约5％CO2的培养箱内的透气容器中进行。在一些实施例中，该透气容器可为快速扩增培养器皿。在一些实施例中，该容器在其侧面和/或底部包括有机硅膜以便气体交换。
在一些实施例中，所得的ptlt-HSC在以下一个或多个方面类似于HSC：细胞表面表型、体外分化能力、辐照后在体内重构造血谱系的能力和/或以连续方式移植的能力。在一些实施例中，细胞可经历至少两次连续传代，例如3、4、5、6次或更次传代。
在一些实施例中，ptlt-HSC可从任何来源的HSC快速扩增，包括但不限于脐带血、胎盘、动员外周血和骨髓，以及来自胚胎干细胞或来自诱导多能干细胞的HSC。在一些实施例中，ptlt-HSC在移植后在体内产生自我更新的HSC区室。在一些实施例中，这可通过将ptlt-HSC给予受试者来实现。
在一些实施例中，在一段时间里将成人干细胞扩增一次或多次。在一些实施例中，在约28天里将成人干细胞扩增约270倍(例如对于小鼠5FU富集的骨髓)。在一些实施例中，在约14天里将成人干细胞扩增约150倍(例如对于人FCB衍生的)。在一些实施例中，在约21天里将成人干细胞扩增100倍。在一些实施例中，在约9至14天里将成人干细胞扩增约85倍(例如对于人动员的)。本领域技术人员会认识到，根据本发明，能够以较低的频率给予该Myc多肽和/或该Bcl-2结构域多肽将有助于能够保藏这种细胞。
本领域技术人员会认识到，根据本发明，Myc及其变体和/或同源物可以在本文的各个实施例中采用。在一些实施例中，该Myc多肽是n-Myc、c-Myc、l-Myc、v-Myc或s-Myc中的一者或多者。如本文所用，术语“Myc”、“cMyc”、“Myc蛋白”和“Myc多肽”可互换使用，并且在某些情况中指NCBI登录号NP002458.2、其功能性同源物、类似物或片段。在一些实施例中，Myc的同义词包括但不限于c-Myc、v-Myc、Myc原癌基因蛋白和转录因子p64。在一些实施例中，Myc多肽包含与NCBI登录号NP002458.2的序列具有至少40％至100％同一性的氨基酸序列，所述同一性百分比例如至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、90％、91％、92％、94％、95％、96％、97％、98％，或约40％至约100％同一性中的任何其他百分比。在一些实施例中，Myc多肽包含长度为40个或更多个氨基酸且与NCBI登录号NP002458.2的序列具有至少50％至100％的同一性的多肽序列，所述同一性百分比例如至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、90％、91％、92％、94％、95％、96％、97％、98％，或约50％至约100％同一性中的任何其他百分比。在一些实施例中，Myc多肽包含长度为40个或更多个氨基酸且与NCBI登录号NP002458.2的序列具有至少50％至100％的同一性的多肽序列，所述同一性百分比例如至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、90％、91％、92％、94％、95％、96％、97％、98％，或约50％至约100％同一性中的任何其他百分比，并且其中该Myc多肽诱导细胞活力、细胞无限增殖、细胞生长和/或细胞增殖。
BCL-2结构域
在一些实施例中，该Bcl-2结构域多肽可以是Bcl-2家族的任何成员和/或任何与其具有足够同源性的蛋白质(具有足够同源性以便该蛋白质以抗凋亡的方式发挥功能)。在一些实施例中，该Bcl-2结构域多肽可包含Bcl-2的BH1结构域。在一些实施例中，该Bcl-2结构域多肽可包含Bcl-2的BH2结构域。在一些实施例中，该Bcl-2结构域多肽可包含Bcl-2的BH3结构域。在一些实施例中，该Bcl-2结构域多肽可包含Bcl-2的BH4结构域。在一些实施例中，该Bcl-2结构域多肽可包含Bcl-2的BH1和BH2结构域，BH1和BH3结构域，BH1和BH4结构域，BH2和BH3结构域，BH2和BH4结构域，BH3和BH4结构域，BH1、BH2和BH3结构域，BH2、BH3和BH4结构域，或者全部BH1、BH2、BH3和BH4结构域。在一些实施例中，多肽可为Bcl-2结构域多肽，只要它与BH1、BH2、BH3或BH4中的至少一者或多者具有至少90％同一性，例如与BH1、BH2、BH3和/或BH4中的至少一者具有91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大百分比的同一性。在一些实施例中，该Bcl-2结构域多肽包含BH1、H2和BH4结构域。在一些实施例中，该Bcl-2结构域多肽包含Bcl-2、Bcl-w、Bcl-X、Bcl-XL或Mcl-1中的一者或多者。术语“Bcl-2结构域多肽”包括其同源物，只要它们如上所述发挥功能。因此，Bcl-2蛋白的变体也包括在该术语的范围内。在一些实施例中，该Bcl-2结构域多肽涵盖全长Bcl-2。在一些实施例中，Bcl-2结构域多肽包含已被缺失了未结构化的(unstructured)环结构域的截短形式的人Bcl-2(Anderson,M.,et al.(1999)Prot Expr.Purif.15,162-70(Anderson,M.等人，1999年，《蛋白质表达与纯化》，第15卷，第162-70页))。
在一些实施例中，Bcl-2结构域多肽包含与NCBI登录号NM_000633.2和/或NM_000657.2的序列具有至少40％至100％同一性的氨基酸序列，所述同一性百分比例如至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、90％、91％、92％、94％、95％、96％、97％、98％，或约40％至约100％同一性中的任何其他百分比。
转导结构域
在一些实施例中，该Myc多肽和/或该Bcl-2结构域多肽包括蛋白转导结构域。在一些实施例中，该蛋白转导结构域包含Tat。在一些实施例中，该蛋白转导结构域包含EPTD。在一些实施例中，该蛋白转导结构域包含vpr、R9、R15、VP16、触角足(Antennapedia)、适体技术(aptamer technology)、战车技术(chariot technology)、R11等中的至少一者。在一些实施例中，该蛋白转导结构域与该Myc多肽或该Bcl-2结构域多肽共价连接。在一些实施例中，该蛋白转导结构域通过肽键与该Myc多肽或该Bcl-2结构域多肽连接。在一些实施例中，该蛋白转导结构域通过接头序列与该Myc多肽和/或该Bcl-2结构域多肽连接，该接头序列可由中性氨基酸的短序列段组成。
在一些实施例中，该Tat-Myc多肽可为图15A中显示的Tat-Myc多肽。在一些实施例中，该Tat-Bcl-2结构域多肽可为图15B中显示的Tat-Bcl-2结构域多肽。
培养基
在一些实施例中，该成人干细胞在包含IL3、IL6和干细胞因子中的至少一者的培养基中培养。在一些实施例中，该成人干细胞在包含IL3、IL6和干细胞因子的培养基中培养。在一些实施例中，该成人干细胞在包含IL3、IL6、干细胞因子、促血小板生成素和Flt3-L的培养基中培养。在一些实施例中，该成人干细胞在包含IL3、IL6、干细胞因子、促血小板生成素和Flt3-L及GM-CSF的培养基中培养。在一些实施例中，IL3、IL6、干细胞因子、促血小板生成素、Flt3-L和/或GM-CSF的量可以在10至500ng/ml的范围内存在。
细胞类型
在一些实施例中，该成人干细胞是一种或多种造血成人干细胞。在一些实施例中，该造血成人干细胞可通过以下一方面或多方面来表征：细胞表面表型、体外分化能力、辐照后在体内重构造血谱系的能力或以连续方式移植的能力。在一些实施例中，该造血成人干细胞可通过以下方面来表征：适当的细胞表面表型、体外分化能力、辐照后在体内重构造血谱系的能力及以连续方式移植的能力。在一些实施例中，小鼠细胞要被认为是造血成体干细胞，则它可表现出以下一方面或多方面：表面表型(Sca-1+、c-kit+、谱系-)，每次转移用少至10个细胞就能够重构经辐照的同系基因小鼠，并且产生能在连续传代后挽救经辐照的接收者的自我更新性HSC群体。在一些实施例中，人细胞要被认为是造血成人干细胞，则它可表现出以下一方面或多方面：CD34+、CD38+/lo、谱系阴性、flk-2-的表面表型；在确定成分的甲基纤维素分化培养基上产生几种集落类型和形态的能力，以及产生可在该体外分化系统中连续接种的细胞的能力；细胞应能够在使用NOD/SCID/γ链敲除(ko)或其他极度免疫受损的小鼠品系进行的异种移植研究中产生人成熟造血细胞，并且在该异种移植系统中产生可连续移植的HSC。
在一些实施例中，该一种或多种造血成人干细胞从脐带血、胎盘、骨髓、外周血、动员外周血或脂肪组织中的一者或多者分离。在一些实施例中，该造血成人干细胞源自胚胎干细胞或诱导多能干细胞。
在一些实施例中，该一种或多种成人干细胞是人细胞。在一些实施例中，该一种或多种成人干细胞是非人动物细胞，例如小鼠、大鼠、狗、马、猫、猪等。
蛋白质
在一些实施例中，提供蛋白质。该蛋白质可为包含蛋白转导结构域、能促进细胞存活或增殖中的一者或多者的Myc多肽(其可为外源合成的)、V5结构域和六组氨酸表位标签的Myc融合蛋白。在一些实施例中，该Myc融合蛋白在水性溶液中、在具有5％CO2的气氛中37℃下的组织培养条件下半寿期超过约60分钟。
在一些实施例中，该Myc融合蛋白半寿期为约48小时。在一些实施例中，该Myc融合蛋白具有足够的半寿期，使得它在长达约48小时、例如72小时里都是可检测的。
在一些实施例中，该Myc融合蛋白被运输到细胞中的细胞核。在一些实施例中，该Myc融合蛋白被定位在细胞中的细胞核中。
在一些实施例中，该蛋白转导结构域可以是任何蛋白转导结构域。在一些实施例中，该蛋白转导结构域包含Tat、Vpr和/或EPTD。在一些实施例中，该蛋白转导结构域包含VP16、R9、R15或其他蛋白转导结构域中的至少一者。
在一些实施例中，该Myc融合蛋白可以任何期望的顺序排列。在一些实施例中，该Myc融合蛋白可以如下的顺序排列：a)该蛋白转导结构域框内连接到该Myc多肽，b)该Myc多肽框内连接到该V5结构域，和c)该V5结构域框内连接到该六组氨酸表位标签。在一些实施例中，该Myc融合蛋白具有如下的组分顺序：a)该Myc多肽框内连接到该蛋白转导结构域，b)该蛋白转导结构域框内连接到该V5结构域，和c)该V5结构域框内连接到该六组氨酸表位标签。在一些实施例中，在每个这些序列之间可包括附加的间插氨基酸序列。在一些实施例中，可在序列的起始和/末端处包括附加的氨基酸序列。
在一些实施例中，该Myc融合蛋白包含蛋白转导结构域、能促进细胞存活或增殖中的一者或多者的Myc多肽和短肽结构域。短肽结构域可变化。在一些实施例中，短肽结构域选自以下至少一者：V5、组氨酸标签、HA(血凝素)标签、FLAG标签、CBP(钙调蛋白结合肽)、CYD(共价但可解离的NorpD肽)、StrepII或HPC(蛋白C的重链)。在一些实施例中，短肽结构域长约10或20个氨基酸。在一些实施例中，短肽结构域长度为2至20个、例如6至20个氨基酸。在一些实施例中，以上所列项目(例如V5和组氨酸标签)中的两者可一起用作短肽结构域。
扩增培养基
在一些实施例中，提供干细胞扩增培养基。扩增培养基可包含a)基础培养基和b)以下至少一者或多者；IL3、IL6、干细胞因子、促血小板生成素、Flt3-L和GM-CSF。在一些实施例中，它包含IL3、IL6、干细胞因子、促血小板生成素、Flt3-L和GM-CSF。在一些实施例中，它包含IL3、IL6、干细胞因子、促血小板生成素和Flt3-L。在一些实施例中，扩增培养基可包含IL3、IL6、干细胞因子、促血小板生成素、Flt3-L和GM-CSF。
在一些实施例中，细胞扩增培养基包含能促进细胞存活或增殖中的一者或多者的Myc多肽。在一些实施例中，细胞扩增培养基包含外源合成的能促进细胞存活或增殖中的一者或多者的Myc多肽。在一些实施例中，细胞扩增培养基包含本文所提供的Myc多肽。
在一些实施例中，干细胞扩增培养基还包含能抑制凋亡的Bcl-2结构域多肽。在一些实施例中，干细胞扩增培养基还包含本文所提供的Bcl-2结构域多肽。在一些实施例中，该干细胞扩增培养基还包含能抑制凋亡的外源合成的Bcl-2结构域多肽。
在一些实施例中，可采用任何基础培养基。在一些实施例中，基础培养基可包括以下一者或多者：StemSpan、Isco培养基、RPMI或DMEM。
另外的方面：
用于获得这种干细胞并提供初始的培养条件(如液体培养基或半固体培养基)的方法是本领域知道的。在一些实施例中，通过将干细胞的来源与能扩增或富集组织来源中或培养物中的这种细胞的合适试剂接触，来在体内或体外初步扩增这种细胞。例如，在造血干细胞的情况中，可用能富集造血干细胞并促使这种细胞增殖而不分化的试剂(如5-氟尿嘧啶)处理供者个体。其他用于扩增期望的干细胞类型的合适试剂将是本领域技术人员知道的。作为另一种选择，从组织来源分离成人干细胞，然后通过暴露于合适的试剂在体外进行扩增或富集。例如，对于造血干细胞，Van Parijs等人(1999年；《免疫学》(Immunity)，第11卷，第763-70页)中描述了一种用于产生成人造血祖细胞的扩增培养物的方法。通过任何合适的用于从动物获得细胞样品的方法从个体获得细胞，包括但不限于骨髓收集、体液(例如血液)收集、脐带血收集，组织环切(tissue punch)和组织解剖(tissue dissection)，具体地讲包括但不限于皮肤、肠、角膜、脊髓、脑组织、头皮、胃、乳腺、肺的任何活组织检查(例如包括灌洗和支气管镜检(bronchioschopy))，骨髓、羊水、胎盘和卵黄囊的细针抽吸。
在一些实施例中，还可从以下获得细胞：新鲜或冻存(保藏)的脐带血、可源自胚胎干(ES)细胞的体外定向分化的造血祖细胞群体、从已被诱导以将其lt-HSC动员到外周血循环的正常的或经粒细胞集落刺激因子(G-CSF)处理的患者的外周血获得的造血干细胞(HSC)。
在一些实施例中，可使用本文产生的细胞来治疗各种失调。在一些实施例中，可使用本文提供的方法来培养细胞供应有需要的受试者。在一些实施例中，细胞来自于要接受该细胞的受试者(自体)。
在一些实施例中，本文产生的或含有一种或多种本文提供的构建体(蛋白质等)的细胞可用于治疗已经历辐照和/或化学疗法的受试者(例如癌症患者，或者已被暴露于高水平的辐照)，用于治疗免疫缺陷和恶性血液病，用于骨髓移植以抵抗衰老对免疫系统的负面效应。在一些实施例中，这可用于治疗心脏病或用于减少移植物抗宿主反应。
在一些实施例中，本文产生的细胞可用于基因矫正方法以治疗单基因遗传病。在一些实施例中，可以使用可用TALEN或其他方法进行基因矫正的自体HSC并将细胞输注回到患者体内。在一些实施例中，这使得可以在进行基因矫正之前和之后进行扩增，特别是因为这些矫正方法将涉及细胞分裂。
在一些实施例中，本发明的方法可应用于其中患者不能被动员或进行G-CSF处理以动员HSC的疾病。在这些情况中，少量的HSC可从外周血获得并通过本文提供的方法扩增，并可实现成功的治疗应用。这些疾病包括但不限于溶酶体贮积病、镰状细胞性贫血、先天性贫血、大疱性表皮松解(4种类型)等。
实例
实例1：生物活性Tat-Myc融合蛋白和Tat-Bcl-2融合蛋白的产生
产生了具有HIV-1Tat蛋白转导结构域(PTD)并具有人Myc的ORF或人Bcl-2的截短形式任一者的融合蛋白，所述人Bcl-2的截短形式已被缺失掉未结构化的环结构域(Anderson,M.,et al.(1999).Prot Expr.Purif.15,162-70(Anderson,M.等人，1999年，《蛋白质表达与纯化》，第15卷，第162-70页))。该重组蛋白还编码V5肽标签和6组氨酸标签，以利于检测和纯化(图1A)。
pTAT-Myc-V5-6xHis(AmpR)和pTAT-Bcl2Δ-V5-6xHis(AmpR)：通过使用编码HIV的框内TAT蛋白转导结构域(RKKRRQRRR)(SEQ ID NO:5)的正向引物对编码人cMyc或人Bcl2的cDNA进行PCR扩增来产生质粒。将PCR产物克隆到pET101/D-Topo(英杰公司(Invitrogen))载体中。使用Quick Change定点诱变试剂盒(Stratagene#200521-5)，从BCL-2编码序列去除未结构化的环(第27至80号氨基酸)。
在大肠杆菌(E.coli)中合成蛋白质并纯化至均质。SDS-PAGE电泳和考马斯染色揭示了用于我们的研究的最终产物的纯度水平(图1B)。将pTAT-Myc-V5-6xHis转化到BL21-STAR(DE3)细胞(英杰公司)中，用0.5mM IPTG在37℃下诱导蛋白质3小时。将细胞在裂解缓冲液(8M尿素、100mM NaH2PO4、10mM Tris pH至7.0、10mM咪唑，pH 7.2)中进行裂解。将裂解物稀释至6M尿素并转至450mM NaCl、50mM NaH2PO4、5mM Tris pH 7.0。用全能核酸酶(Benzonase)(500单位)在室温下处理裂解物1小时，通过在12,000RPM下离心60分钟进行澄清，并滤过0.22μM过滤器。使用GE AKTA纯化器10FPLC，在镍亲和柱(GE)上纯化Myc-V5-6xHis。通过将Myc-V5-6xHis透析到透析缓冲液(450mM NaCl、50mM NaH2PO4、5mM Tris pH7.0、5％甘油、1mM DTT)中使其再折叠。通过使纯化的蛋白质穿过Acticlean Etox柱(Sterogen)减少内毒素。
Bcl2Δ-V5-6xHis蛋白如上所描述进行诱导。将细胞在50mL的裂解缓冲液(200mMNaCl、200mM KCL、50mM NaH2PO4、5mM Tris pH 7.0、5％甘油、1mM DTT)中进行裂解，该裂解缓冲液补加有500单位的全能核酸酶、1mM的PMSF、2μg/ml的亮抑蛋白酶肽、0.015单位/毫升的抑蛋白酶肽(aprotinin)、5uM的鸡卵溶菌酶(HEL)每1L的诱导蛋白，并立即将细胞置于冰上1小时。将细胞在冰上进行超声处理(负载循环＝50％，输出＝5)2次，每次2分钟。裂解物通过在12,000RPM下离心60分钟进行澄清并滤过0.22μM过滤器。在镍亲和柱(GE)上纯化Bcl2Δ-V5-6xHis并如上所描述去除内毒素。
实例2：Tat融合蛋白的适当定位的确认
该融合蛋白定位到适当的胞内区室(图1C)。将NIH 3T3细胞接种到六孔板中的盖玻片上并生长至30至40％汇合度。每个孔用10μg/ml的Tat-Myc或Tat-Bcl-2转导，或者不进行处理以作为阴性对照。在蛋白质转导后2小时，将细胞在4％多聚甲醛-PBS中在室温(RT)下固定10分钟。将细胞在补加有1％牛血清白蛋白(BSA)和0.1％Triton X-100的PBS中在室温下进行透化处理3分钟。将细胞与在PBS-1％BSA中稀释(1:1000)的V5小鼠单克隆抗血清(英杰公司)一起温育45分钟。将细胞洗涤并与山羊抗小鼠Alexa 488二抗(InvitrogenA21121)一起温育30分钟。将盖玻片装到具有10μl的50％甘油滴的载玻片上，该甘油滴含有1μg/ml的Hoechst。在Zeiss Imager Z1荧光显微镜上获取图像。
Tat-Myc快速定位到原代人HSC的细胞核(图1D)。Tat融合蛋白在HSC中72小时后完全降解(图1E)。用Tat-Myc和Tat-Bcl2Δ转导胎儿脐带血细胞1小时，然后进行3次PBS洗涤。转导后两小时，收获5×106个细胞并分离细胞核级分和细胞质级分。接着5天，每24小时收获细胞(5×106个)。通过将细胞在10mM HEPES(pH 7.6)、10mM NaCl2、3mM CaCl2和0.5％NP40中裂解，制备细胞核蛋白和细胞质蛋白。使细胞核沉淀，并用三氯乙酸(TCA)沉淀含细胞质的上清液级分。进行了SDS-PAGE后，用抗V5抗体(英杰公司)、抗人β肌动蛋白(艾博抗公司(abcam))和山羊抗兔IgG-HRP或山羊抗小鼠IgG-HRP(圣克鲁斯生物技术公司(SantaCruz Biotechnology))探测蛋白质印迹。
实例3：使用Tat融合蛋白实现的细胞存活和增殖
在没有处理的情况下，活化的鼠CD4+T细胞在细胞因子丧失后发生凋亡。Tat-Myc和Tat-Bcl-2以剂量依赖性方式挽救活化的原代CD4+T细胞免于因撤去细胞因子而引起的凋亡(图2A和2B)。在Tat-Myc存在下活化的原代鼠CD4+T细胞当与在Tat-Cre存在下活化的细胞比较时显示出旺盛的增殖(图2C和2D)。
所有的小鼠均按照美国科罗拉多大学医学院的机构动物管理与使用委员会(Institutional Animal Care and Users Committee)批准的实验方案(方案编号B-87709(03)1B-1和87709(09)2E)进行操作。从安乐死的C57BL/6J小鼠(杰克逊实验室(JacksonLaboratory))收集脾脏，通过机械解离产生单细胞悬浮物。将细胞用TAC缓冲液(135mMNH4CL,17mM Tris Ph 7.65)处理以裂解红细胞。将T细胞在补加有1mg/ml的抗CD3(单克隆抗体2C11)的C10培养基(500ml瓶装RPMI 1640、10％FBS、100单位/毫升的Pen/Strep、2mML-谷氨酰胺、10mM Hepes、MEM非必需氨基酸、0.55mMβ-巯基乙醇、1mM丙酮酸钠100mM)中活化两天。将活的淋巴母细胞收集在聚蔗糖垫层(Ficoll cushion)上，并在具有或不具有Tat融合蛋白的完全培养基中以每孔1×106个细胞的密度接种在24孔培养皿的各孔中。通过CFSE的流式细胞术分析测定细胞分裂状况。
实例4：用Tat-Myc和Tat-Bcl-2扩增鼠HSC
从缅因州巴港的杰克逊实验室(Jackson Laboratories(Bar Harbor,ME))获得几群4至6周龄雌性C57BL/6J小鼠。通过静脉内给予每只小鼠5mg的5-氟尿嘧啶(5FU)，对小鼠进行处理。在5FU处理后5天，从胫骨和股骨收集骨髓(BM)细胞。通过在5ml无菌TAC缓冲液(135mM NH4CL,17mM Tris Ph 7.65)中温育将红细胞裂解。将骨髓细胞在补加有5μg/ml重组Tat-Myc和10μg/ml重组Tat-Bcl-2的BM培养基(DMEM，含有15％FCS、100单位/毫升的Penn/Strep、MEM NEAA(Gibco)、10mM HEPES、重组鼠IL-3、IL-6和SCF)中扩增。
通过将293FT细胞在D10培养基(DMEM、10％FBS、100单位/毫升的Penn/Strep、MEMNEAA(Gibco)、2mM L-谷氨酰胺(Gibco))中以12×106个细胞/板的密度接种在150mm平板中制备细胞因子。使用磷酸钙，将细胞用30μg总DNA/板进行转染，该30μg总DNA由10μgpcDNA3.1-SCF、10μg pcDNA3.1-IL3和10μg pcDNA3.1-IL6组成或者由10μg pcDNA3.1-TPO、10μg pcDNA3.1-Flt3-L和10μg pcDNA3.1-GM-CSF组成(Young,R.M.,et al.(2008).B-cellreceptor signaling in the genesis and maintenance of B-cell lymphoma.FutureOncology,4,591-4)(Young,R.M.等人，2008年，“B细胞淋巴瘤的起源和维持中的B细胞受体信号转导”，《未来肿瘤学》，第4卷，第591-4页))。第二天，移除培养基并用100ml D10培养基更换。将细胞在37℃/5％CO2下温育4至5天。收集培养基，过滤灭菌，以30ml等分试样在-20℃下冷冻。
将细胞培养28天，每48小时更换BM培养基以更新Tat融合蛋白。作为对照，将骨髓细胞在含有细胞因子和Tat-Cre的培养基中培养。图3A和表1显示培养28天后所得的HSC群体的流式细胞术分析情况。FACS分析显示Sca-1/c-kit群体(lin-)持续富集，而所有其他细胞类型在28天时间里下降。
表1
Figure BDA0001605882520000301
经Tat-Myc和Tat-Bcl-2处理的细胞表达高水平的c-Kit和Sca-1，并且呈现谱系标志物阴性(表2)。
表2
实验编号 c-Kit×Sca-1 Mac-1×Gr-1 Flk2 Ter119
1 99.3 1.5 0 0.2
2 99.2 1.1 0 0.9
3 93.0 0.4 0 0.2
另外，用CFSE对一部分的该细胞进行标记，证明了HSC当在这些培养条件下维持时活跃地增殖(图3B)。HSC的总体扩增状况在图3C和表1中示出，最终在培养28天时间里鼠HSC扩增了269倍。
实例5：Tat-Myc和Tat-Bcl-2扩增的鼠HSC的移植
将递减数目的体外扩增HSC移植到经亚致死性辐照的Rag-1-/-小鼠体内。如针对NSG小鼠所描述进行向Rag1-/-小鼠(杰克逊实验室)体内的移植，例外的是Rag1-/-小鼠在就要经尾静脉注射骨髓细胞之前接受350拉德的辐照。
移植后四周，检查小鼠是否存在成熟T细胞和B细胞。在HSC嵌合小鼠移植了10、100或1000个体外扩增的HSC后，在其外周血中存在成熟的表达B220/CD19的B细胞和表达TCBβ/CD4的T细胞(图4A、4B和表3)。
表3
移植的骨髓细胞的数目 ％T细胞 标准偏差 ％B细胞 标准偏差
10<sup>3</sup>(n＝4) 13.1 6.7 11.5 6.3
10<sup>2</sup>(n＝5) 15.3 5.0 11.0 4.1
10<sup>1</sup>(n＝5) 16.1 4.9 17.5 7.9
野生型(n＝4) 16.5 5.7 20.3 5.9
还在HSC嵌合小鼠的淋巴结、脾脏、胸腺和骨髓中检测到成熟T细胞和B细胞(图4C)。
将从嵌合小鼠的脾脏获得的成熟鼠T细胞和B细胞用CFSE进行标记并用抗CD3(T细胞)或CD40和IgM(B细胞)的单克隆抗体活化。该成熟淋巴样细胞在经它们的抗原受体活化后能够母细胞化并进行细胞分裂(图4D)。另外，将从初始HSC嵌合小鼠组获得的骨髓细胞用于连续移植研究。表4显示以连续方式进行了移植的Rag-1-/-小鼠的外周血中检测到的成熟T细胞和B细胞的频率。
表4
连续移植 ％T细胞 标准偏差 ％B细胞 标准偏差
第1次移植(n＝5) 8.0 4.2 14.3 10.4
第2次移植(n＝5) 6.0 4.0 6.6 5.5
第3次移植(n＝5) 2.7 1.3 10.4 4.7
实例6：用Tat-Myc和Tat-Bcl-2扩增源自人脐带血的HSC
从被本地脐带血库废弃的样品获得新鲜的脐带血细胞。所有的人细胞均去除身份标识，免除机构审查委员会(IRB)的监督。脐带血包括O+、O-、A+、A-、B+、B-和AB+，它们都表现出大约相同的扩增状况。
将总脐带血体积分成20ml等分试样并在PBS中1:1稀释。将经稀释的脐带血(20ml)小心地覆盖在20ml的淋巴细胞分离液(Ficoll-Paque Plus)(安玛西亚生物科技公司(Amersham Biosciences)目录号17-1440-03)上。将细胞在900x重力加速度下离心60分钟。用玻璃吸管移取血沉棕黄层并用PBS洗涤两次。将细胞重新悬浮在FCB培养基(伊思考夫培养基(Gibco))中，该培养基补加有以上描述的10％人血浆、100单位/毫升的Penn/Strep、30ml的含SCF、IL3和IL6的培养基及30ml的含TPO、FLT3-L和GM-CSF的培养基。FCB培养基在就要添加到胎儿脐带血(FCB)细胞之前还补加5μg/ml的重组Tat-Myc和10μg/ml的重组Tat-Bcl-2。在扩增期间每3天更换培养基。
该细胞因子混合物含有IL3、IL6、TPO、Flt3-L、SCF和GM-CSF，这在该六种细胞因子的组合方面不同于先前报道的培养基(Suzuki,T.,et al.(2006).Stem Cells 24,2456-65(Suzuki,T.等人，2006年，《干细胞》，第24卷，第2456-65页))，重组Tat-Myc和Tat-Bcl-2的添加也不同。对体外扩增的人HSC的表面表型的评估表明，人HSC在Tat-Myc和Tat-Bcl-2存在下长期培养后保持其表面特性(图5A)。这组条件导致在培养14天中CD34+细胞的数目增加86.4倍，并且在培养21天中源自未经分级分离的脐带血的人CD34+细胞的数目增加103.8倍(图5B)。
实例7：Tat-Myc和Tat-Bcl-2扩增的人脐带血HSC在体外和体内具有生物活性
将体外扩增的人HSC接种在MethoCult Optimum(干细胞技术公司(StemCellTechnologies))上，检查其产生特定的集落类型的能力。该体外扩增的人HSC能够产生CFU-G、CFU-M、CFU-GM和BFU-E集落(图5C和5D)。另外，虽然在Tat-Myc和Tat-Bcl-2存在下扩增的HSC的表面表型在培养中保持，但它们的集落形成单位含量在这些条件下显著富集(图5D)。在Tat-Myc和Tat-Bcl-2存在下扩增的CD34+细胞还能够产生新的BFU-E、CFU-M、CFU-G和CFU-GM集落，而在单独培养基中培养的CD34+细胞不产生新的集落(图5E)。
对于测试体外扩增的人CD34+细胞在体内产生成熟人造血谱系的能力的实验，使用NOD/SCID/gc-/-小鼠(NSG)作为接受小鼠。这是有记载的可用于这个目的的小鼠模型(Tanaka,S.,et al.(2012).Development of mature and functional huamn myeloidsubsets in hematopoietic stem cell-engrafted NOD/SCID/IL2rgKO mice.J Immunol188,6145-55(Tanaka,S.等人，2012年，在植入了造血干细胞的NOD/SCID/IL2rgKO小鼠体内发育成熟和功能性人髓样细胞亚群，《免疫学杂志》，第188卷，第6145-55页))。
将胎儿脐带血细胞(FCB)注射到在就要进行注射之前接受了180拉德的辐照的NOD/SCID/gc-/-小鼠(NSG)(杰克逊实验室)体内。将扩增的FCB在PBS中洗涤3次，并在200μlPBS中通过尾静脉注射。移植后八周，小鼠经尾静脉放血，以使用以下抗体通过流式细胞术评估重构情况：抗人CD3(hCD3)(Biolegend目录号300312)、抗人CD19(hCD19)(Biolegend目录号302208)和抗人CD45(hCD45)(Biolegend目录号304028)。
在用1×107个未经分级分离的脐带血细胞产生的NSG嵌合小鼠中观察到表达人CD45+的T细胞和B细胞的短期发育。但是，通过与Tat-Myc和Tat-Bcl-2培养14天在体外产生的1×106个蛋白转导长期(ptlt)-HSC的引入，导致了异种嵌合NSG小鼠中出现更高频率的人CD45+细胞。另外，在移植后在小鼠的外周血中可观察到人CD45+细胞达20周之久(图6A)。在异种嵌合小鼠的骨髓中发现人CD45+、CD34+CD38lo HSC(图6B)，在脾脏中发现人CD45+/CD3+和人CD45+/CD19+淋巴样细胞，并且在胸腺中发现人CD45+、CD3+淋巴样细胞。
用CFSE标记来自异种嵌合NSG小鼠的脾脏的人CD45+CD19+细胞，并用抗人CD40和IgM的单克隆抗体活化。在72小时时通过流式细胞术分析细胞的CFSE稀释情况。图6C显示在异种嵌合NSG小鼠体内发育的人B细胞的增殖状况。
使用来自异种嵌合NSG小鼠的骨髓的人CD45+、CD34+CD38lo HSC在MethoCultOptimum中接种。这些细胞在MethoCult平板中产生集落(图6D)，并且一些集落在连续再次平板接种后仍可观察到(图6E)。在这两种情况下，用与Tat-Myc和Tat-Bcl-2培养14天的人脐带血细胞重构的NSG小鼠的集落数目都比从用新鲜的、未经操纵的人脐带血细胞重构的NSG小鼠获得的细胞要显著地更高。
另外，对一群植入了106个之前在补加有Tat-Myc和Tat-Bcl-2的细胞因子混合物中体外扩增的脐带血细胞的异种嵌合小鼠(黑色正方形)评估了髓样细胞和淋巴样细胞分化。对骨髓细胞(图6F)和脾脏细胞(图6G)的CD45阳性群体分析CD11b、CD33、CD3和CD19表达。在这些异种嵌合小鼠的骨髓和脾脏中都观察到髓样细胞和淋巴样细胞分化。
实例8：用Tat-Myc和Tat-Bcl-2扩增人G-CSF动员的外周血HSC
G-CSF动员的细胞被接收在来自5名为了自体HSC移植而进行了G-CSF动员的患者的1ml体积的经淘洗血液中。所有G-CSF样品均去除身份标识，并且没有另外的身份标识信息与用于这些研究的细胞相关。将细胞滴加到10ml的FCB培养基。将细胞在FCB培养基中洗涤两次，并且用10ml体积的5μg/ml重组Tat-Myc和10μg/ml重组Tat-Bcl-2处理。根据生产商的推荐，将细胞(5×106个)接种在G-Rex 100细胞扩增装置(Wilson Wolf Manufacturing)中。
将细胞在补加有细胞因子加上Tat-Myc和Tat-Bcl2的培养基中扩增14天。扩增的HSC的FACS谱显示hCD45+、CD34+、CD38hi、CD133+细胞的独特群体(图7A)。细胞扩增的动力学在图7B中示出。
然后将扩增的成人GCS-F动员的HSC接种在MethoCult Optimum上以表征它们的体外分化潜力。获得了四种通常在支持髓类红细胞分化的培养基中观察到的集落类型(图7C)，并且这些集落类型中的一些在连续再次平板接种时也观察到。
扩增的成人HSC能够重构经亚致死性辐照的NSG小鼠。图7D显示12周前用106个扩增的G-CSF和Tat-Myc/Tat-Bcl-2动员的HSC(第一小图)或5×106个新鲜的未经操纵的脐带血细胞(第二小图)移植的NSG小鼠的骨髓的CD45+染色的FACS分析。
将由用Tat-Myc和Tat-Bcl-2培养的G-CSF动员细胞所产生的NSG异种嵌合小鼠行安乐死，收集骨髓、脾脏和胸腺作进一步分析。对来自用扩增的成人HSC重构的异种嵌合NSG小鼠的淋巴器官的分析表明，在这些小鼠的骨髓中有人CD45+、CD34+CD38lo细胞(图7E；第一小图)；在脾脏(图7E；第二小图)和胸腺(图7E；第三小图)中有人CD45+、CD3+淋巴样细胞。这些数据合在一起证明了可以成功地扩增从人G-CSF动员的成人血液获得的HSC群体。
对植入了106个在补加有Tat-Myc和Tat-Bcl-2的细胞因子混合物中(黑色正方形)体外扩增的G-CSF动员的细胞的一群异种嵌合小鼠评估髓样细胞和淋巴样细胞分化。对骨髓细胞(图7F)和脾脏细胞(图7G)的CD45阳性群体分析CD11b、CD33、CD3和CD19表达。在这些异种嵌合小鼠的骨髓和脾脏中都观察到髓样细胞和淋巴样细胞分化。另外，源自原代异种移植物的成熟人B细胞在体外响应抗原受体的刺激，如通过流式细胞术测得的CSFE稀释所确定(图6C)。当将从第一连续移植物发育的成熟人B细胞在体外用抗IgM和CD40的抗体活化时，得到类似的观察结果(图8)。
这个方法能够产生根据当前的方法移植中等体形成人(Sideri,A.,et al.(2011).An overview of the progress on double umbilical cord bloodtransplantation.Hematologica 96,1213-20)(Sideri,A.等人，2011年，“双脐带血移植进展综述”，《血液学》，第96卷，第1213-20页))所需的足够数量的HSC。
实例9：生物活性Myc融合蛋白的产生
除了实例1中描述的Tat-Myc融合蛋白以外，还使用本文描述的相同方法产生并纯化了五种Myc融合蛋白。通过使用含有框内N末端PTD氨基酸序列的正向引物和移除终止密码子的反向引物对编码区进行PCR扩增来制备质粒。然后将PCR产物克隆到pET101/D-Topo(英杰公司)载体中，该载体包括C末端V5表位和6x组氨酸纯化标签。图9A显示与实例1的Tat-Myc相比该Myc融合蛋白的示意图。在每个融合蛋白中，蛋白转导(PTD)在Myc多肽之前或之后框内融合。
蛋白转导结构域包括Tat、EPTD和Vpr。EPTD是经优化的蛋白转导结构域(YARAAARQARA SEQ ID NO:6)，取自Ho,A.等人(Synthetic protein transductiondomains:enhanced transduction potential in vitro and in vivo.Cancer Res.(2001)61:474-477)(合成的蛋白转导结构域：在体外和体内的增强的转导潜力，《癌症研究》，2001年，第61卷，第474-477页)。Vpr转导结构域由Taguchi,T.等人鉴定(Nucleartrafficking of macromolecules by an oligopeptide derived from Vpr of humanimmunodeficiency virus type-1.Biochem.Biophys.Res.Commun.(2004)320(1):18-26(“通过源自人免疫缺陷病毒1型的Vpr的寡肽进行大分子的核运输”，《生物化学与生物物理学研究通讯》，2004年，第320卷，第1期，第18-26页))。
Myc为实例1中描述的多肽的ORF，或者为先前由Huang,Z.等人(Negative controlof the Myc protein by the stress-responsive kinase Pak-2.Mol Cell Biol(2004)24(4):1582-94(“胁迫响应性激酶Pak-2对Myc蛋白的负控制”，《分子细胞生物学》，2004年，第24卷，第4期，第1582-94页))描述的3AMyc序列的ORF。该重组蛋白还编码V5肽标签和6组氨酸标签以利于检测和纯化。(图9A)。
实例10：活化T细胞存活测定
在活化T细胞存活测定中测试了实例9中描述的Myc融合蛋白(Tat-Myc、Tat-3AMyc、EPTD-Myc、Vpr-Myc和Myc-Vpr)的Myc生物活性(图9B)。从一只C57BL.6j(Jackson)小鼠收获脾脏，并通过金属丝网进行机械解离。去除红细胞，用1μg/ml抗CD3(2c11)活化T细胞。将细胞以每孔1ml培养基中3×10^6个细胞的密度接种到24孔的簇培养皿(clusterdish)中。48小时后，将活细胞捕集在聚蔗糖垫层上，洗涤并以每孔1至1.5×10^6个细胞的密度接种在24孔的簇培养皿中。将PTD-Myc蛋白以0.5、1、5、10、25或50μg/ml滴定到T细胞上。PTD-Myc蛋白处理后48小时，通过流式细胞术(前向加侧向散射)评估细胞的活力。在图9B中，给出的数据是针对25μg/ml蛋白处理。
如图9B中所示，除了Tat-3AMyc以外，所有经测试的构建体在48小时后均导致比未经处理的对照更大的T细胞活力。但是，没有一个构建体导致比实例1中描述的Tat-Myc更大的T细胞活力。
在类似的实验中，下表5中显示了不同浓度的Tat-Myc和Tat-Bcl-2的活性。用1μg/ml的抗CD3(2c11)活化来自C57BL.6j(Jackson)小鼠的脾脏的T细胞。活化后(48小时后)，将细胞洗涤，以约1至1.5×106个细胞/孔的密度接种，并添加不同浓度(0.5、1、5、10、25或50μg/ml)的融合蛋白(Tat-Myc或Tat-Bcl-2)。48小时后，通过流式细胞术(前向加侧向散射)测定活细胞的百分比，如下表5中所示。
表5
浓度[μg/ml] Tat-Myc(活细胞％) Tat-Bcl2(活细胞％)
0 8.5 3.1
0.5 9.5 5
1 11.4 7.68
5 21.1 14.3
10 22.4 24.4
25 31.9 25
50 32.8 19.8
对于Tat-Myc和Tat-Bcl-2两者，并且在所有的测试浓度下，与在任一融合蛋白不存在下温育的细胞相比，细胞活力和/或增殖提高。
在使用相同方法的另一实验中，图10提供了用50μg/ml的融合蛋白处理的活化T细胞的活门(live gate)的FACS数据；Tat-Bcl-2和Tat-Myc与对照(Tat-Cre或无处理)比较。如图所示，Tat-Myc处理和Tat-Bcl-2处理均导致显著改进的T细胞存活和/或增殖。
实例11：用于CD34+扩增的细胞因子混合物的评估
测试了多种在基础培养基中的细胞因子混合物支持干细胞存活和/或增殖的能力。
在第0天，将脐带血覆盖在聚蔗糖(Ficoll)梯度上以富集单核细胞和去除红细胞。然后将细胞洗涤并在单独的StemSpan培养基或具有各种细胞因子组合的StemSpan培养基中温育，如下表6中所示。
为产生细胞因子，将293FT细胞在D10培养基(DMEM、10％FBS、100单位/毫升的Penn/Strep、MEM NEAA(Gibco)、2mM L-谷氨酰胺(Gibco))中以12×106个细胞/板的密度接种在150mm平板中。使用磷酸钙，将细胞用30μg总DNA/板进行转染，该30μg总DNA由pcDNA3.1-SCF、10μg pcDNA3.1-IL3和10μg pcDNA3.1-IL6组成或者由10μg pcDNA3.1-TPO、10μg pcDNA3.1-Flt3-L和10μg pcDNA3.1-GM-CSF组成。第二天，移除培养基并用100ml D10培养基更换。将细胞在37℃/5％CO2下温育4至5天。收集培养基，过滤灭菌，以30ml等分试样在-20℃下冷冻。通过每500ml瓶子的培养基加入30ml的含有三种细胞因子IL3、IL6、SCF的经调理的培养基和30ml的含有TPO、Flt3-L、GM-CSF的经调理的培养基，将细胞因子添加到扩增培养基。
在第4、7、10、13、16和19天，使用标准的技术获取样品，通过流式细胞术测定CD34+细胞的百分比。在第0天后不补充细胞因子。如表6中所示，StemSpan培养基加上Il-3、Il-6、TPO(促血小板生成素)、Flt3-L和GM-CSF的组合对细胞显示最佳的存活和增殖(参见例如第13天)。
表6
Figure BDA0001605882520000371
测试了在具有或不具有Tat融合蛋白(TMTB)的基础培养基中的多种细胞因子混合物支持干细胞存活和/或增殖的能力。
在聚蔗糖密度梯度上制备脐带血以移除红细胞。将20,000个有核细胞平板接种到24孔平皿的各孔中。细胞接种在含有以下成分的StemSpan中：干细胞因子、IL3和IL6(S36)；S36加上5μg/ml Tat-Myc和5μg/ml Tat-Bcl2；TPO、干细胞因子、Flt3-L、IL3和IL6(TSF36)；TSF36加上5μg/ml Tat-Myc和5μg/ml Tat-Bcl2；TPO、干细胞因子、Flt3-L、IL3、IL6、GM-CSF(TSF36G)；及TSF36G加上5μg/ml Tat-Myc和5μg/ml Tat-Bcl2。每三天更换培养基和Tat融合蛋白。在第13天，通过流式细胞术评估细胞寻找CD34阳性谱系阴性HSC。
如图11中所示，TSF36G加上融合蛋白提供最高的活力和增殖。在其他实验中，细胞因子加上融合蛋白的这一组合被证实在集落形成测定法中和在异种嵌合小鼠的体内重构中产生比从不具有融合蛋白的细胞因子混合物产生的细胞明显更胜一筹的细胞(图12至14)。
对于异种嵌合小鼠体内重构实验，在聚蔗糖梯度上制备脐带血细胞。移取血沉棕黄层，将细胞在PBS中洗涤3次。将一半的脐带血细胞接种在由补加有以下成分的伊思考夫培养基(Gibco)组成的FCB(胎儿脐带血)培养基中：10％人血浆、100单位/毫升的Penn/Strep、30ml的含SCF、IL3和IL6的培养基及30ml的含TPO、FLT3-L和GM-CSF的培养基。将另一半的细胞接种在包含上述添加物且进一步补加有5μg/ml的重组Tat-Myc和5μg/ml的重组Tat-Bcl-2的FCB培养基中。
将细胞扩增11天。在第13天，将细胞离心沉淀并重新悬浮在10ml的新鲜FCB培养基中。将原先用Tat-Myc和Tat-Bcl2处理的细胞再次用5μg/ml的重组Tat-Myc和5μg/ml的重组Tat-Bcl-2在37℃下处理1小时。将两个FCB细胞群体在PBS中洗涤3次以便注射到小鼠体内。
将扩增的细胞注射到在就要进行注射之前接受了180拉德的辐照的NOD/SCID/gc-/-小鼠(NSG)(杰克逊实验室)体内。扩增的细胞是在200μl PBS中经尾静脉注射到NSG小鼠体内。移植后八周，通过流式细胞术评估骨髓(BM)、脾脏和胸腺的人HSC重构情况(图12至14)。来自在输注之前已用Tat-Myc和Tat-Bcl2预处理的每种组织的细胞与没有用该融合蛋白预处理的细胞相比显示出人CD45+细胞显著增加。
实例12：Bcl-2的评估
用Tat-Bcl2转导3T3细胞1小时，然后进行3次PBS洗涤。转导后两小时，将细胞进行胰蛋白酶消化，计数，并收获5×106个细胞。分离细胞核级分和细胞质级分。接着5天，每24小时收获5×106个细胞。通过将细胞在10mM HEPES(pH 7.6)、10mM NaCl2、3mM CaCl2和0.5％NP40中裂解，制备细胞核蛋白和细胞质蛋白。使细胞核沉淀，并用三氯乙酸(TCA)沉淀含细胞质的上清液级分。用抗V5抗体(英杰公司)和山羊抗小鼠IgG-HRP(圣克鲁斯生物技术公司)探测蛋白质印迹。
在24和48小时，在细胞质级分中观察到Tat-Bcl2。到转导后72小时为止，信号开始减弱，并且在96小时时间点不再观察到信号。
产生了表达Tat-Bcl2、Tat-Bcl2Δ、EPTD-Bcl2、VPR-Bcl2、VPR-Bcl2Δ和VPR-BclXL的质粒。pPTD-Bcl2-V5-6xHis(AmpR)：通过使用编码框内PTD(Tat、EPTD或VPR)蛋白转导结构域的正向引物对编码人Bcl2的cDNA进行PCR扩增来产生质粒。将PCR产物克隆到pET101/D-Topo(英杰公司)载体中。为产生Bcl2Δ，使用Quick Change定点诱变试剂盒(Stratagene#200521-5)从BCL-2编码序列去除未结构化的环(第27至80号氨基酸)。VPR-BclXL按与以上描述的PTD-Bcl2相似的方式制备，但使用人BclXL的cDNA而不是Bcl2的cDNA。
在本申请中，单数的使用可包括复数，除非另有明确说明，或者除非如本领域技术人员根据本公开内容将会理解的，该单数是唯一的功能性实施例。因此，例如，“一个(种)可意指超过一个(种)，并且”一个实施例“可意指该描述适用于多个实施例。
以引用方式并入
本文引述的所有参考文献，包括专利、专利申请、文章、教科书等，以及其中引述的参考文献，只要未曾被并入本文中，都以引用方式整体并入本文。倘若所并入的文献和类似资料中的一者或多者与本申请不同或抵触，包括但不限于所定义的术语、术语用法、所描述的技术等，则以本申请为准。
等同物
前文的描述和实例详细说明了某些实施例。但是，应认识到，无论前述内容在文本上可能看起来有多详细，本发明都可以按多种方式来实施，并且本发明应按照所附的权利要求及其任何等同物来解释。

Claims (24)

1.一种从成人干细胞的混合群体中富集CD34阳性成人造血干细胞的方法，所述方法包括：
向体外的成人造血干细胞的混合群体提供：
a)外源合成的能促进细胞存活或增殖中的一者或多者的Myc融合多肽，其中所述Myc融合多肽包括融合至蛋白转导结构域的Myc多肽并且以1μg/ml至50μg/ml的浓度提供；和
b)外源合成的能抑制凋亡的Bcl-2结构域多肽，其中所述Bcl-2结构域多肽以1μg/ml至50μg/ml的浓度提供；并且
其中所述Myc融合多肽以至少24小时的时间间隔提供给所述成人造血干细胞的混合群体；并且其中所述Myc融合多肽连续提供给所述细胞至少24小时；并且
其中所述Bcl-2结构域多肽以至少24小时的时间间隔提供给所述成人造血干细胞的混合群体，以产生CD34阳性富集的成人造血干细胞群体，
其中所述成人造血干细胞的混合群体是源自骨髓的造血干细胞，或G-CSF动员的外周血造血干细胞，或源自脐带血的造血干细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述Myc融合多肽以至少72小时的时间间隔提供；以及所述Bcl-2结构域多肽以至少72小时的时间间隔提供。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述Myc融合多肽的所述Myc多肽是n-Myc、c-Myc、l-Myc、v-Myc或s-Myc中的一者或多者。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述Bcl-2结构域多肽包括BH1、BH2、BH3和BH4。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种Bcl-2结构域多肽是Bcl-2、Bcl-w、Bcl-X、Bel-XL、Mcl-1中的一者或多者。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种Bcl-2结构域多肽是Bcl-2。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述Bcl-2多肽包含选自由Tat、EPTD和vpr组成的群组的蛋白转导结构域。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白转导结构域是Tat。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白转导结构域是EPTD。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白转导结构域是vpr。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述成人造血干细胞的混合群体在包含白细胞介素-3(IL3)、白细胞介素-6(IL6)和干细胞因子(SCF)的培养基中培养。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述成人造血干细胞的混合群体在包含IL3、IL6、干细胞因子、促血小板生成素和Flt3-L及GM-CSF的培养基中培养。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述成人造血干细胞的混合群体的扩增情况为以下一种或多种情况：在28天里扩增270倍、在14天里扩增150倍、在21天里扩增100倍或者在9至14天里扩增85倍。
14.根据权利要求1所述的方法，其中在8小时时间里提供不超过1μg/ml的Myc融合多肽。
15.根据权利要求1所述的方法，其中产生所述群体是在透气容器内进行。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述Myc融合多肽以至少96小时的时间间隔提供；以及所述Bcl-2结构域多肽以至少96小时的时间间隔提供。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述Myc融合多肽在提供到成人造血干细胞的混合群体后48小时，在细胞中是可检测的。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述Myc融合多肽以至少48小时的时间间隔提供；以及所述Bcl-2结构域多肽以至少48小时的时间间隔提供。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述Myc多肽是c-Myc以及所述蛋白转导结构域是Tat。
20.根据权利要求1所述的方法，其中所述成人造血干细胞的混合群体在包含至少一种细胞因子的培养基中培养，其中所述细胞因子选自IL3、IL6和SCF。
21.根据权利要求1所述的方法，其中所述成人造血干细胞的混合群体在包含至少一种细胞因子的培养基中培养，其中所述细胞因子选自IL3、IL6、SCF、促血小板生成素(TPO)、Flt3-L和GM-CSF。
22.根据权利要求1所述的方法，其中提供所述Bcl-2结构域多肽和/或所述Myc融合多肽的频率不超过每三十六小时一次或不超过每四十八小时一次。
23.根据权利要求1所述的方法，其中所述Myc融合多肽以0.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml或25μg/ml的浓度提供。
24.根据权利要求1所述的方法，其中所述Bcl-2结构域多肽以0.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml或25μg/ml的浓度提供。
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