JP6573868B2 - 成体幹細胞のインビトロでの増殖 - Google Patents

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Description

(関連出願の相互参照)
本願は、2013年3月11日出願の米国特許仮出願第61/776,422号及び2013年3月12日出願の米国実用特許出願第13/795,659号の利益と優先権を主張するものであり、これらの全体が参照として本明細書に組み込まれる。
(政府の権利)
本発明は、National Institute of Healthによる助成(5R44HL091740−03)の下に政府の支援を受けてなされた。政府は本発明について一定の権利を有する。
(配列表、表、又はコンピュータープログラム表の参照)
本願は、電子形式の配列表と共に出願されている。配列表は、2014年3月10日に作成された10KBのサイズの106417−0182_Seq_List.txtという名称のファイルとして提供される。配列表の電子形式中の情報は、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。
(発明の分野)
本明細書に提供されるのは、長期幹細胞、かかる細胞の産生方法、及び様々なタンパク質構築物に関する実施形態である。
長期造血幹細胞(LT−HSC)は、成人の骨髄内に存在し、成熟血球の全レパートリーを生じさせるまれな前駆細胞である。これらの細胞は、全ての血球の区分を維持するのに必須である。幹細胞移植は、特に、血液系腫瘍、自己免疫病、及び免疫不全の有用な補助療法となる場合がある。
いくつかの実施形態では、条件的不死化成体幹細胞集団を産生する方法が提供される。この方法は、細胞の生存又は増殖のうち1つ又はそれ以上を促進する外因的に合成されたMycポリペプチド、及び、アポトーシスを阻害する外因的に合成されたBcl−2ドメインポリペプチドによって、1つ又はそれ以上の成体幹細胞を提供することを含んでよい。いくつかの実施形態では、Mycポリペプチドは、少なくとも約72時間間隔で1つ又はそれ以上の成体幹細胞に提供され、Bcl−2ドメインポリペプチドは、少なくとも約96時間間隔で1つ又はそれ以上の成体幹細胞に提供されて、条件的不死化成体幹細胞集団を産生する。いくつかの実施形態では、Bcl−2ドメインポリペプチド及び/又はMycポリペプチドは、1時間に1回以下の頻度で供給される。いくつかの実施形態では、Bcl−2ドメインポリペプチド及び/又はMycポリペプチドは、2時間に1回以下の頻度で供給される。いくつかの実施形態では、Bcl−2ドメインポリペプチド及び/又はMycポリペプチドは、3時間に1回以下の頻度で供給される。いくつかの実施形態では、Bcl−2ドメインポリペプチド及び/又はMycポリペプチドは、4時間に1回以下の頻度で供給される。いくつかの実施形態では、Bcl−2ドメインポリペプチド及び/又はMycポリペプチドは、5時間に1回以下の頻度で供給される。いくつかの実施形態では、Bcl−2ドメインポリペプチド及び/又はMycポリペプチドは、6時間に1回以下の頻度で供給される。いくつかの実施形態では、Bcl−2ドメインポリペプチド及び/又はMycポリペプチドは、7時間に1回以下の頻度で供給される。いくつかの実施形態では、Bcl−2ドメインポリペプチド及び/又はMycポリペプチドは、8時間に1回以下の頻度で供給される。いくつかの実施形態では、Bcl−2ドメインポリペプチド及び/又はMycポリペプチドは、9時間に1回以下の頻度で供給される。いくつかの実施形態では、Bcl−2ドメインポリペプチド及び/又はMycポリペプチドは、10時間に1回以下の頻度で供給される。いくつかの実施形態では、Bcl−2ドメインポリペプチド及び/又はMycポリペプチドは、11時間に1回以下の頻度で供給される。いくつかの実施形態では、Bcl−2ドメインポリペプチド及び/又はMycポリペプチドは、12時間に1回以下の頻度で供給される。いくつかの実施形態では、Bcl−2ドメインポリペプチド及び/又はMycポリペプチドは、13時間に1回以下の頻度で供給される。いくつかの実施形態では、Bcl−2ドメインポリペプチド及び/又はMycポリペプチドは、14時間に1回以下の頻度で供給される。いくつかの実施形態では、Bcl−2ドメインポリペプチド及び/又はMycポリペプチドは、15時間に1回以下の頻度で供給される。いくつかの実施形態では、Bcl−2ドメインポリペプチド及び/又はMycポリペプチドは、16時間に1回以下の頻度で供給される。いくつかの実施形態では、Bcl−2ドメインポリペプチド及び/又はMycポリペプチドは、17時間に1回以下の頻度で供給される。いくつかの実施形態では、Bcl−2ドメインポリペプチド及び/又はMycポリペプチドは、18時間に1回以下の頻度で供給される。いくつかの実施形態では、Bcl−2ドメインポリペプチド及び/又はMycポリペプチドは、19時間に1回以下の頻度で供給される。いくつかの実施形態では、Bcl−2ドメインポリペプチド及び/又はMycポリペプチドは、20時間に1回以下の頻度で供給される。いくつかの実施形態では、Bcl−2ドメインポリペプチド及び/又はMycポリペプチドは、21時間に1回以下の頻度で供給される。いくつかの実施形態では、Bcl−2ドメインポリペプチド及び/又はMycポリペプチドは、22時間に1回以下の頻度で供給される。いくつかの実施形態では、Bcl−2ドメインポリペプチド及び/又はMycポリペプチドは、23時間に1回以下の頻度で供給される。いくつかの実施形態では、Bcl−2ドメインポリペプチド及び/又はMycポリペプチドは、24時間に1回以下の頻度で供給される。いくつかの実施形態では、Bcl−2ドメインポリペプチド及び/又はMycポリペプチドは、36時間に1回以下の頻度で供給される。いくつかの実施形態では、Bcl−2ドメインポリペプチド及び/又はMycポリペプチドは、48時間に1回以下の頻度で供給される。
いくつかの実施形態では、Myc融合タンパク質が提供される。この融合タンパク質は、タンパク質形質導入ドメインと、細胞の生存又は増殖のうち1つ又はそれ以上を促進するMycポリペプチドと、V5ドメインと、6ヒスチジンエピトープタグと、を含む。
いくつかの実施形態では、幹細胞増殖培地が提供される。この増殖培地は、IL3と、IL6と、幹細胞因子と、トロンボポエチン(thrombopoeitin)と、Flt3−Lと、GM−CSFと、を含む。
いくつかの実施形態では、Myc融合タンパク質が提供される。このMyc融合タンパク質は、タンパク質形質導入ドメインと、細胞の生存又は増殖のうち1つ又はそれ以上を促進するMycポリペプチドと、を含む。このMyc融合タンパク質の半減期は、約60分間より長い。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される任意のタンパク質をコードする核酸が提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される任意の拡散を含むベクターが提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される任意のベクター又は核酸を含む細胞が提供される。
[本発明1001]
a)細胞の生存又は増殖のうち1つ又はそれ以上を促進する外因的に合成されたMycポリペプチドと、
b)アポトーシスを阻害する外因的に合成されたBcl−2ドメインポリペプチドと、によって、1つ又はそれ以上の成体幹細胞を提供することを含む、条件的不死化成体幹細胞集団を産生する方法であって、
前記Mycポリペプチドが、少なくとも約72時間間隔で前記1つ又はそれ以上の成体幹細胞に供給され、
前記Bcl−2ドメインポリペプチドが、少なくとも約96時間間隔で前記1つ又はそれ以上の成体幹細胞に供給されて、条件的不死化成体幹細胞集団を産生する、方法。
[本発明1002]
前記Mycポリペプチドが、少なくとも約48時間間隔で供給される、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記Mycポリペプチドが、少なくとも約24時間間隔で供給される、本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記Mycポリペプチドが連続的に供給される、本発明1001の方法。
[本発明1005]
前記Bcl−2ドメインポリペプチドが、少なくとも約72時間間隔で供給される、本発明1001〜1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
前記Bcl−2ドメインポリペプチドが、少なくとも約48時間間隔で供給される、本発明1001〜1004のいずれかの方法。
[本発明1007]
前記Bcl−2ドメインポリペプチドが、少なくとも約24時間間隔で供給される、本発明1001〜1004のいずれかの方法。
[本発明1008]
前記Bcl−2ドメインポリペプチドが連続的に供給される、本発明1001〜1004のいずれかの方法。
[本発明1009]
前記Mycポリペプチドが、n−Myc、c−Myc、l−Myc、v−Myc、又はs−Mycのうち1つ又はそれ以上である、本発明1001〜1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
前記Mycポリペプチドが、約1μg/mL〜約50μg/mLの濃度で供給される、本発明1001〜1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
前記Mycポリペプチドが、約5μg/mLの濃度で供給される、本発明1001〜1009のいずれかの方法。
[本発明1012]
前記Bcl−2ドメインポリペプチドが、約1μg/mL〜約50μg/mLの濃度で供給される、本発明1001〜1011のいずれかの方法。
[本発明1013]
前記Bcl−2ドメインポリペプチドが、約10μg/mLの濃度で供給される、本発明1001〜1011のいずれかの方法。
[本発明1014]
前記Bcl−2ドメインポリペプチドが、BH1、BH2、BH3、及びBH4を含む、本発明1001〜1013のいずれかの方法。
[本発明1015]
前記1つ又はそれ以上のBcl−2ドメインポリペプチドが、Bcl−2、Bcl−w、Bcl−X、Bcl−XL、Mcl−1のうち1つ又はそれ以上である、本発明1001〜1014のいずれかの方法。
[本発明1016]
前記1つ又はそれ以上のBcl−2ドメインポリペプチドが、Bcl−2である、本発明1001〜1014のいずれかの方法。
[本発明1017]
前記Mycポリペプチド又は前記Bcl−2ポリペプチドのうち1つ又はそれ以上が、タンパク質形質導入ドメインを含む、本発明1001〜1016のいずれかの方法。
[本発明1018]
前記タンパク質形質導入ドメインがTatである、本発明1017の方法。
[本発明1019]
前記タンパク質形質導入ドメインがEPTDである、本発明1017の方法。
[本発明1020]
前記タンパク質形質導入ドメインがvprである、本発明1017の方法。
[本発明1021]
前記1つ又はそれ以上の成体幹細胞が、IL3、IL6、及び幹細胞因子を含む培地中で培養される、本発明1001〜1020のいずれかの方法。
[本発明1022]
前記1つ又はそれ以上の成体幹細胞が、IL3、IL6、幹細胞因子、トロンボポエチン、及びFlt3−Lを含む培地中で培養される、本発明1001〜1020のいずれかの方法。
[本発明1023]
前記1つ又はそれ以上の成体幹細胞が、IL3、IL6、幹細胞因子、トロンボポエチン、Flt3−L、及びGM−CSFを含む培地中で培養される、本発明1001〜1020のいずれかの方法。
[本発明1024]
前記1つ又はそれ以上の成体幹細胞が、約28日間かけて約270倍、約14日間かけて約150倍、約21日間かけて100倍、又は約9〜14日間かけて約85倍のうち、1つ又はそれ以上に増殖する、本発明1001〜1023のいずれかの方法。
[本発明1025]
前記1つ又はそれ以上の成体幹細胞が、1つ又はそれ以上の成体造血幹細胞である、本発明1001〜1024のいずれかの方法。
[本発明1026]
前記成体造血幹細胞が、細胞表面の表現型、インビトロ分化能、照射後の造血系統のインビボ再構成能、又は、連続的に移植される能力のうち、1つ又はそれ以上を特徴とする、本発明1025の方法。
[本発明1027]
前記1つ又はそれ以上の成体造血幹細胞が、臍帯血、胎盤、骨髄、末梢血、動員済み末梢血、又は脂肪組織のうち、1つ又はそれ以上から単離される、本発明1001〜1026のいずれかの方法。
[本発明1028]
前記1つ又はそれ以上の成体造血幹細胞が、胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞由来である、本発明1001〜1026のいずれかの方法。
[本発明1029]
前記1つ又はそれ以上の成体幹細胞がヒト細胞である、本発明1001〜1028のいずれかの方法。
[本発明1030]
前記1つ又はそれ以上の成体幹細胞が非ヒト動物細胞である、本発明1001〜1028のいずれかの方法。
[本発明1031]
タンパク質形質導入ドメインと、
細胞の生存又は増殖のうち1つ又はそれ以上を促進するMycポリペプチドと、
V5ドメインと、
6ヒスチジンエピトープタグと、
を含む、Myc融合タンパク質。
[本発明1032]
約60分間より長い半減期を有する、本発明1031のMyc融合タンパク質。
[本発明1033]
約48時間の半減期を有する、本発明1031のMyc融合タンパク質。
[本発明1034]
約72時間まで検出可能である、本発明1031のMyc融合タンパク質。
[本発明1035]
約48時間まで検出可能である、本発明1031のMyc融合タンパク質。
[本発明1036]
細胞の核内に輸送可能である、本発明1031〜1034のいずれかのMyc融合タンパク質。
[本発明1037]
前記タンパク質形質導入ドメインがTatである、本発明1031〜1035のいずれかのMyc融合タンパク質。
[本発明1038]
タンパク質形質導入ドメインがVprである、本発明1031〜1035のいずれかのMyc融合タンパク質。
[本発明1039]
タンパク質形質導入ドメインがEPTDである、本発明1031〜1035のいずれかのMyc融合タンパク質。
[本発明1040]
a)Mycポリペプチドにインフレームで連結したタンパク質形質導入ドメイン、
b)V5ドメインにインフレームで連結したMycポリペプチド、及び
c)6ヒスチジンエピトープタグにインフレームで連結したV5ドメイン、
の順の構成要素を有する、本発明1031〜1038のいずれかのMyc融合タンパク質。
[本発明1041]
a)タンパク質形質導入ドメインにインフレームで連結したMycポリペプチド、
b)V5ドメインにインフレームで連結したタンパク質形質導入ドメイン、及び、
c)6ヒスチジンエピトープタグにインフレームで連結したV5ドメイン、
の順の構成要素を有する、本発明1031〜1038のいずれかのMyc融合タンパク質。
[本発明1042]
IL3と、IL6と、幹細胞因子と、トロンボポエチンと、Flt3−Lと、GM−CSFと、を含む、幹細胞増殖培地。
[本発明1043]
基本培地を更に含む、本発明1042の幹細胞増殖培地。
[本発明1044]
細胞の生存又は増殖のうち1つ又はそれ以上を促進するMycポリペプチドを更に含む、本発明1043の幹細胞増殖培地。
[本発明1045]
アポトーシスを阻害するBcl−2ドメインポリペプチドを更に含む、本発明1041〜1044のいずれかの幹細胞増殖培地。
[本発明1046]
前記基本培地が、StemSpan、Isco培地、RPMI、又はDMEMのうち、1つ又はそれ以上である、本発明1041〜1045のいずれかの幹細胞増殖培地。
[本発明1047]
a)タンパク質形質導入ドメインと、
b)細胞の生存又は増殖のうち1つ又はそれ以上を促進するMycポリペプチドと、
を含む、Myc融合タンパク質であって、約60分間より長い半減期を有する、Myc融合タンパク質。
[本発明1048]
本発明1031〜1041、及び1047のいずれかのタンパク質をコードする核酸。
[本発明1049]
本発明1048の核酸を含むベクター。
[本発明1050]
本発明1049のベクターを含む細胞。
[本発明1051]
8時間にわたって1μg/mL以下のMycポリペプチドが供給される、本発明1001の方法。
[本発明1052]
16時間にわたって1μg/mL以下のMycポリペプチドが供給される、本発明1001の方法。
[本発明1053]
24時間にわたって1μg/mL以下のMycポリペプチドが供給される、本発明1001の方法。
[本発明1054]
前記集団の産生がガス透過性容器内で起こる、本発明1001の方法。
[本発明1055]
タンパク質形質導入ドメインと、
細胞の生存又は増殖のうち1つ又はそれ以上を促進するMycポリペプチドと、
短いペプチドドメインと、
を含む、Myc融合タンパク質。
[本発明1056]
前記短いペプチドドメインが、HAタグ、FLAGタグ、CBP、CYD、StrepII、又はHPCのうち少なくとも1つから選択される、本発明1055のMyc融合。
[本発明1057]
IL3、IL6、幹細胞因子、トロンボポエチン、Flt3−L、及びGM−CSFを含む幹細胞増殖培地と、
細胞の生存又は増殖のうち1つ又はそれ以上を促進するMycポリペプチドと、
アポトーシスを阻害するBcl−2ドメインポリペプチドと、
を含む、ガス透過性容器。
[本発明1058]
前記容器がバッグ又はフラスコである、本発明1057のガス透過性容器。
様々な実施形態の特徴が、特許請求の範囲で詳細に示される。本実施形態の一部の特徴及び利点のより良い理解は、様々な実施形態の原則が利用される、例示的実施形態について記載する以下の詳細な説明と、添付図面を参照することによって得られるであろう。
Tat融合タンパク質の作製とインビトロでの特徴についての例示的実施形態を示す。図1Aは、HIV−1 Tatのインフレームタンパク質形質導入ドメイン及びV5及び6×Hisタグの位置を含む、Tat−Myc及びTat−Bcl−2融合タンパク質の例示的実施形態の図を示す。 Tat融合タンパク質の作製とインビトロでの特徴についての例示的実施形態を示す。図1Bは、SDS−PAGEで分離し、クマシーで染色した、E.coliから精製した後の組み換えタンパク質の例示的実施形態を示す。 Tat融合タンパク質の作製とインビトロでの特徴についての例示的実施形態を示す。図1Cは、精製した組み換えTat−Myc、Tat−Bcl−2に2時間曝露し、又は未処理のまま(NT)とし、固定後、V5に対するモノクローナル抗体と、Hoechst 9934核染色液で染色したコンフルエントな3T3細胞の叢の例示的実施形態を示す。この時間では、Tat−Mycタンパク質のほとんどは核領域に局在しているが、Tat−Bcl−2は細胞質及び核周囲空間に留まっている。 Tat融合タンパク質の作製とインビトロでの特徴についての例示的実施形態を示す。図1Dは、1時間Tat−Mycに1度曝露して、洗浄し、その後溶解して(示した時点において)、核画分から細胞膜及び細胞質画分を分離したヒト臍帯血由来HSCのSDS−PAGE及びウエスタンブロット分析(V5及びβ−アクチンに対するモノクローナル抗体)の例示的実施形態を示す。 Tat融合タンパク質の作製とインビトロでの特徴についての例示的実施形態を示す。図1Eは、2時間Tat−Mycに1度曝露して、洗浄し、その後溶解して(示した時点において)、核画分から細胞膜及び細胞質画分を分離したヒト臍帯血由来HSCの核画分のSDS−PAGE及びウエスタンブロット分析(V5及びβ−アクチンに対するモノクローナル抗体)の例示的実施形態を示す。タンパク質の大部分は24時間と48時間との間になくなっている。72時間後のいずれのポイントにおいて、検出可能なタンパク質は残っていない。 組み換えTat−Myc及びTat−Bcl−2が生物学的に活性であることを示す例示的実施形態の図を示す。図2Aは、培地のみ(未処理、NT)、Tat−Cre(Tat−対照、TC)を補充、又は、Tat−Myc(TM)(図2A)のいずれかの濃度を増加させて補充した培地に、48時間で再プレーティングされたインビトロ活性化T細胞の例示的実施形態の図を示す。開始時の細胞集団中の生細胞の発生頻度も示す(薄灰色のバー)。 組み換えTat−Myc及びTat−Bcl−2が生物学的に活性であることを示す例示的実施形態の図を示す。図2Bは、培地のみ(未処理、NT)、Tat−Cre(Tat−対照、TC)を補充、又は、Tat−Bcl−2(TB)(図2B)のいずれかの濃度を増加させて補充した培地に、48時間で再プレーティングされたインビトロ活性化T細胞の例示的実施形態の図を示す。開始時の細胞集団中の生細胞の発生頻度も示す(薄灰色のバー)。 組み換えTat−Myc及びTat−Bcl−2が生物学的に活性であることを示す例示的実施形態の図を示す。図2Cは、活性化T細胞が芽球性の表現型を保持する(図2C)ことを示している、Tat−Mycと共に更にインキュベートされ、CFSEで標識された活性化T細胞の例示的実施形態の図を示す。 組み換えTat−Myc及びTat−Bcl−2が生物学的に活性であることを示す例示的実施形態の図を示す。図2Dは、抗原刺激され、外から追加されたサイトカインが除去された後も増殖し続ける(図2D)ことを示している、Tat−Mycと共に更にインキュベートされ、CFSEで標識された活性化T細胞の例示的実施形態の図を示す。 Tat−Myc及びTat−Bcl−2によるマウスHSCのインビトロでの増殖の例示的実施形態の図を示す。図3Aは、c−Kit+、Sca−1+、及び系統マーカー(Mac−1、Gr−1、B220、CD3、Ter−119、及びFlk−2)に陰性である表現型を有する、得られた細胞集団のFACS分析の例示的実施形態の図を示す。 Tat−Myc及びTat−Bcl−2によるマウスHSCのインビトロでの増殖の例示的実施形態の図を示す。図3Bは、Tat−融合タンパク質を添加せずに培養したHSC(薄灰色の右側の跡)と比較した、Tat−Myc及びTat−Bcl−2と共に培養したとき(濃灰色の左側の跡)の、HSCのインビトロでの増殖の例示的実施形態の図を示す。 Tat−Myc及びTat−Bcl−2によるマウスHSCのインビトロでの増殖の例示的実施形態の図を示す。図3Cは、Tat−Myc及びTat−Bcl−2を含む培養における、インビトロでの細胞増殖速度の例示的実施形態の図を示す。 Tat−Myc及びTat−Bcl−2で増殖させたマウスptlt−HSCのインビボでの機能解析の例示的実施形態の図を示す。致死量以下で照射されたRag−1−/−マウスのコホートに、野生型C57BL/6Jマウスから得た骨髄細胞由来のptlt−HSCを10個与えた。図4Aは、Rag−1−/−対照(1つ目の図)と比較した、ptlt−HSCキメラマウスの末梢血中の成熟B細胞(2つ目の図)の存在についてのFACS分析(CD19/B220発現)の例示的実施形態の図を示す。 Tat−Myc及びTat−Bcl−2で増殖させたマウスptlt−HSCのインビボでの機能解析の例示的実施形態の図を示す。致死量以下で照射されたRag−1−/−マウスのコホートに、野生型C57BL/6Jマウスから得た骨髄細胞由来のptlt−HSCを10個与えた。図4Bは、Rag−1−/−ptlt−HSCキメラマウス(2つ目の図)の末梢血中の成熟T細胞の存在についてのFACS分析(TCRβ/CD4発現)を、Rag−1−/−対照(1つ目の図)と比較した、例示的実施形態の図を示す。 Tat−Myc及びTat−Bcl−2で増殖させたマウスptlt−HSCのインビボでの機能解析の例示的実施形態の図を示す。致死量以下で照射されたRag−1−/−マウスのコホートに、野生型C57BL/6Jマウスから得た骨髄細胞由来のptlt−HSCを10個与えた。図4Cは、Rag−1−/−ptlt−HSCキメラマウスのリンパ系器官(脾臓、胸腺、リンパ節、及び骨髄)における、発生中のT細胞及びB細胞のFACS分析(CD19/IgM及びCD8/CD4発現)の例示的実施形態の図を示す。 Tat−Myc及びTat−Bcl−2で増殖させたマウスptlt−HSCのインビボでの機能解析の例示的実施形態の図を示す。致死量以下で照射されたRag−1−/−マウスのコホートに、野生型C57BL/6Jマウスから得た骨髄細胞由来のptlt−HSCを10個与えた。図4Dは、抗原受容体を通して活性化された後に、成熟リンパ系細胞が破裂して細胞分裂を起こすことができたことを示すデータを示す。 Tat−Myc及びTat−Bcl−2によるヒト臍帯血細胞由来HSCの増殖の例示的実施形態の図を示す。図5Aは、インビトロで14日間増殖させた、ヒト臍帯血細胞の表面表現型(上図はサイトカイン混合物のみ)のFACS分析の例示的実施形態の図を示す。 Tat−Myc及びTat−Bcl−2によるヒト臍帯血細胞由来HSCの増殖の例示的実施形態の図を示す。図5Aは、インビトロで14日間増殖させた、ヒト臍帯血細胞の表面表現型(下図はTat−Myc及びTat−Bcl−2を加えたサイトカイン混合物)のFACS分析の例示的実施形態の図を示す。 Tat−Myc及びTat−Bcl−2によるヒト臍帯血細胞由来HSCの増殖の例示的実施形態の図を示す。図5Bは、両条件下インビトロでのCD34+細胞の増殖速度の例示的実施形態の図を示す。 Tat−Myc及びTat−Bcl−2によるヒト臍帯血細胞由来HSCの増殖の例示的実施形態の図を示す。図5Cは、骨髄赤血球分化を補助する条件下でのメチルセルロースアッセイで現像された、ヒトptlt−HSC由来の3つの異なるコロニータイプの例示的実施形態の画像を示す。 Tat−Myc及びTat−Bcl−2によるヒト臍帯血細胞由来HSCの増殖の例示的実施形態の図を示す。図5Dは、サイトカイン混合物と共に培養された10個の臍帯血細胞(FCB)、Tat−Myc及びTat−Bcl−2を補充したサイトカイン混合物と共に培養された10個の臍帯血細胞(FCB+TMTB)、又は10個の新鮮な未操作の臍帯血細胞(10^4新鮮FCB)のいずれかを播種した、メチルセルロース培養で観察された各コロニータイプを定量した例示的実施形態の図を示す。 Tat−Myc及びTat−Bcl−2によるヒト臍帯血細胞由来HSCの増殖の例示的実施形態の図を示す。図5Eは、図5Dに示す細胞を再プレーティングして、メチルロース培養で観察されたコロニー数を定量した例示的実施形態の図を示す。 インビボでのヒト臍帯血由来タンパク質を形質導入された長期(ptlt)−HSCの機能解析の例示的実施形態の図を示す。図6Aは、サイトカイン混合物中においてインビトロで増殖(1つ目の図;FCB)、若しくはTat−Myc及びTat−Bcl−2を補充したサイトカイン混合物中で増殖(2つ目の図;FCB TMTB)された10個の臍帯血細胞、又は、5×10個の新鮮な未操作の臍帯血細胞(3つ目の図;新鮮FCB)を移植した、致死量以下で照射されたNSGマウスの骨髄コホートのFACS分析の例示的実施形態の図を示す。 インビボでのヒト臍帯血由来タンパク質を形質導入された長期(ptlt)−HSCの機能解析の例示的実施形態の図を示す。図6Bは、異種キメラマウスの骨髄、脾臓、及び胸腺細胞のFACS分析の例示的実施形態の図を示す。細胞は全てヒトCD45で染色した。CD45+細胞に対するゲーティングにより、骨髄中にヒトCD34+CD38lo細胞(1つ目の図;BM);脾臓中にヒトCD19+及びヒトCD3+リンパ球(2つ目の図;脾臓);並びに、胸腺中にヒトCD3+細胞(3つ目の図;胸腺)が示された。 インビボでのヒト臍帯血由来タンパク質を形質導入された長期(ptlt)−HSCの機能解析の例示的実施形態の図を示す。図6Cは、CFSEで標識され、ヒトCD40及びIgMに対するモノクローナル抗体の存在下で培養された、ヒト膵臓B細胞のFACS分析の例示的実施形態の図を示す。NSG異種キメラマウスで発生したヒトB細胞は、抗原受容体の刺激後増殖した。 インビボでのヒト臍帯血由来タンパク質を形質導入された長期(ptlt)−HSCの機能解析の例示的実施形態の図を示す。図6Dは、NSG異種キメラマウスの骨髄から得られ、メチルセルロース(methycellulose)上にプレーティングされた、ヒトCD34+CD38lo細胞由来の骨髄赤血球コロニーを定量した例示的実施形態の図を示す。 インビボでのヒト臍帯血由来タンパク質を形質導入された長期(ptlt)−HSCの機能解析の例示的実施形態の図を示す。図6Eは、再プレーティング後の骨髄赤血球コロニーの発育を定量した例示的実施形態の図を示す。 インビボでのヒト臍帯血由来タンパク質を形質導入された長期(ptlt)−HSCの機能解析の例示的実施形態の図を示す。図6Fは、インビトロでサイトカイン混合物(白丸)又はTat−Myc及びTat−Bcl−2を補充したサイトカイン混合物(黒四角)中で増殖された骨髄細胞のCD45陽性集団における、骨髄系リンパ系細胞分化(CD11b、CD33、CD3、及びCD19の発現)を定量した例示的実施形態の図を示す。 インビボでのヒト臍帯血由来タンパク質を形質導入された長期(ptlt)−HSCの機能解析の例示的実施形態の図を示す。図6Gは、インビトロでサイトカイン混合物(白丸)又はTat−Myc及びTat−Bcl−2を補充したサイトカイン混合物(黒四角)中で増殖された脾臓細胞のCD45陽性集団における、骨髄系リンパ系細胞分化(CD11b、CD33、CD3、及びCD19の発現)を定量した例示的実施形態の図を示す。 Tat−Myc及びTat−Bcl−2による成人型ヒトG−CSFで動員したHSCのインビトロでの増殖の例示的実施形態の図を示す。図7Aは、ヒトCD34+及びCD38+画分の濃縮を示すヒトCD45+細胞の表面表現型の例示的実施形態の図を示す。 Tat−Myc及びTat−Bcl−2による成人型ヒトG−CSFで動員したHSCのインビトロでの増殖の例示的実施形態の図を示す。図7Bは、Tat−Myc及びTat−Bcl−2が存在する培養液中における、インビトロでの18日間にわたる細胞増殖速度の例示的実施形態の図を示す。 Tat−Myc及びTat−Bcl−2による成人型ヒトG−CSFで動員したHSCのインビトロでの増殖の例示的実施形態の図を示す。図7Cは、5×10個の、Tat−Myc及びTat−Bcl−2と共にインビトロで増殖されたヒト成人型G−CSF HSCが、メチルセルロース中で4種類の形態学的に異なるコロニータイプを生じさせることを示している例示的実施形態の図を示す。 Tat−Myc及びTat−Bcl−2による成人型ヒトG−CSFで動員したHSCのインビトロでの増殖の例示的実施形態の図を示す。図7Dは、Tat−Myc及びTat−Bcl−2と共にインビトロで増殖させたヒト成人型G−CSF HSCが、異種キメラNSGマウスにおいてヒト造血性系統を生じさせたことを示しているFACS分析の例示的実施形態の図を示す。骨髄は、Tat−Myc及びTat−Bcl−2を補充したサイトカイン混合物(1つ目の図;G−CSF+TMTB)又は新鮮な未操作の臍帯血細胞(2つ目の図;新鮮FCB)と共に増殖させたptlt−HSCを移植したNSGマウス由来のものであった。 Tat−Myc及びTat−Bcl−2による成人型ヒトG−CSFで動員したHSCのインビトロでの増殖の例示的実施形態の図を示す。図7Eは、骨髄、脾臓、及び胸腺由来細胞のFACS分析の例示的実施形態の図を示す。骨髄細胞は、ヒトCD34+及びCD38+でもあるヒトCD45細胞を含み(1つ目の図)、脾臓細胞はヒトCD3でも染色されるヒトCD45細胞を含み(2つ目の図)、胸腺細胞はヒトCD45細胞並びにCD3を含んでいた(3つ目の図)。 Tat−Myc及びTat−Bcl−2による成人型ヒトG−CSFで動員したHSCのインビトロでの増殖の例示的実施形態の図を示す。図7Fは、異種キメラマウスコホートに、インビトロでTat−Myc及びTat−Bcl−2を補充したサイトカイン混合物中で増殖させた10個のG−CSF動員細胞(黒四角)を移植し、骨髄系リンパ系細胞分化について評価した例示的実施形態の図を示す。骨髄細胞(図7F)CD45陽性集団を、CD11b、CD33、CD3、及びCD19の発現について解析した。 Tat−Myc及びTat−Bcl−2による成人型ヒトG−CSFで動員したHSCのインビトロでの増殖の例示的実施形態の図を示す。図7Gは、異種キメラマウスコホートに、インビトロでTat−Myc及びTat−Bcl−2を補充したサイトカイン混合物中で増殖させた10個のG−CSF動員細胞(黒四角)を移植し、骨髄系リンパ系細胞分化について評価した例示的実施形態の図を示す。脾臓細胞(図7G)CD45陽性集団を、CD11b、CD33、CD3、及びCD19の発現について解析した。 CFSEで標識され、それぞれマウスCD3、又は、CD40及びIgMに対するモノクローナル抗体の存在下で培養されたマウス脾臓T細胞及びB細胞のFACS分析の例示的実施形態の図を示す。抗原受容体の刺激後に増殖させた5FU処理C57BL.6由来の増殖済みHSCを移植した、Rag1−/−マウスにおいて発生したマウスT細胞(薄灰色の左側の線、1つ目の図)及びB細胞(薄灰色の左側の線、2つ目の図)を、未刺激細胞(濃灰色の右側の線)と比較した。 活性化T細胞の生死判別アッセイにおける、様々なMyc融合タンパク質構築物の活性の例示的実施形態を示す。図9Aは、Myc融合タンパク質構築物の一部の代表例の例示的配列図を示す。 活性化T細胞の生死判別アッセイにおける、様々なMyc融合タンパク質構築物の活性の例示的実施形態を示す。図9Bは、代表的なMyc融合タンパク質構築物による処理48時間後の生存T細胞の割合の例示的実施形態の図を示す。 活性化T細胞生死判別アッセイにおける、様々なTat−融合タンパク質(それぞれ50μg/mL)の活性の例示的実施形態を示す。図10Aは、未処理細胞(未処理)のFACS分析のライブゲート(前方×側方散乱)の例示的実施形態の図を示す。 活性化T細胞生死判別アッセイにおける、様々なTat−融合タンパク質(それぞれ50μg/mL)の活性の例示的実施形態を示す。図10Bは、Tat−Cre処理細胞(Tat−Cre対照)のFACS分析のライブゲート(前方×側方散乱)の例示的実施形態の図を示す。 活性化T細胞生死判別アッセイにおける、様々なTat−融合タンパク質(それぞれ50μg/mL)の活性の例示的実施形態を示す。図10Cは、Tat−Bcl2処理細胞(Tat−Bcl2)のFACS分析のライブゲート(前方×側方散乱)の例示的実施形態の図を示す。 活性化T細胞生死判別アッセイにおける、様々なTat−融合タンパク質(それぞれ50μg/mL)の活性の例示的実施形態を示す。図10Aは、Tat−Myc処理細胞(Tat−Myc)のFACS分析のライブゲート(前方×側方散乱)の例示的実施形態の図を示す。 PTD融合タンパク質を含んで、又は含まずに、様々なサイトカインの存在下で増殖させたCD34+細胞数の例示的実施形態の図を示す。 FCB培地のみ(上図)又はTat−Myc及びTat−Bcl2を補充したFCB培地(下図左)で増殖させた5×10^6個の細胞を投与されたNSGマウス由来の骨髄細胞を、ヒトCD45で染色した、FACS分析の例示的実施形態の図を示す。Tat−Myc及びTat−Bcl2で処理された細胞を投与されたマウスにおいて、ヒトCD45+細胞が増加していることに留意されたい。CD45+細胞を、CD34陽性細胞の存在について、フローサイトメトリーによって更に分析した(下図右)。 FCB培地のみ(上図)又はTat−Myc及びTat−Bcl2を補充したFCB培地(下図左)で増殖させた5×10^6個の細胞を投与されたNSGマウス由来の脾臓細胞を、ヒトCD45で染色した、FACS分析の例示的実施形態の図を示す。Tat−Myc及びTat−Bcl2で処理された細胞を投与されたマウスにおいて、ヒトCD45+細胞が増加していることに留意されたい。CD45+細胞を、CD19及びCD3陽性細胞の存在について、フローサイトメトリーによって更に分析した(下図右)。 FCB培地のみ(上図)又はTat−Myc及びTat−Bcl2を補充したFCB培地(下図左)で増殖させた5×10^6個の細胞を投与されたNSGマウス由来の胸腺由来細胞を、ヒトCD45で染色した、FACS分析の例示的実施形態の図を示す。Tat−Myc及びTat−Bcl2で処理された細胞を投与されたマウスにおいて、ヒトCD45+細胞が増加していることに留意されたい。CD45+細胞を、CD19及びCD3陽性細胞の存在について、フローサイトメトリーによって更に分析した(下図右)。 Tat−Mycポリペプチドのいくつかの実施形態のアミノ酸及び核酸の配列を示す。 Tat−Mycポリペプチドのいくつかの実施形態のアミノ酸及び核酸の配列を示す。 Bcl−2ドメインポリペプチドのいくつかの実施形態のアミノ酸及び核酸の配列を示す。
LT−HSC細胞の治療的有用性は、特にこれらの頻度が低く、エクスビボで増殖できないことによって限定されている。これらの細胞の増殖は、限定するものではないが遺伝子治療などの臨床的応用において特に重要である。
本明細書に記載されるいくつかの実施形態を用いて、任意に自家細胞を用いる、オーダーメイド医療及びその他の用途向けに個別化HSCを産生できる。
本明細書に提供される実施形態の一部は、インビトロでの増殖に先立って、CD34+画分の単離及び/又は精製を必要としない。したがって、いくつかの実施形態では、かかる細胞の増殖からこの工程を除くことができる。これによってコストを削減でき、臨床診療に対するこの幹細胞増殖法の適応を簡便にすることができる。本明細書に提供される方法のうち任意のものは、任意に、インビトロでの増殖に先立つCD34+画分の単離及び/又は精製を含まなくてよい。
本明細書に記載されるいくつかの実施形態は、初代成人HSCを特定の融合タンパク質と共に培養してタンパク質を形質導入された長期HSC(ptlt−HSC)を産生することによる、インビトロでサイトカイン依存性LT−HSC集団を増殖する方法を提供する。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、細胞の生存及び/又は増殖を誘導する癌原遺伝子をコードするタンパク質、又はこれらの生物学的に活性な断片若しくはホモログ(例えばMycポリペプチド)に連結した、タンパク質形質導入ドメインを有する。この方法は、抗アポトーシスタンパク質、又はこれらの生物学的に活性な断片若しくは機能性ホモログ(例えばBcl−2ドメインポリペプチド)に連結した、タンパク質形質導入ドメインを含む、融合タンパク質を更に含んでよい。いくつかの実施形態では、これは、細胞の生存及び/又は増殖を誘導するMycポリペプチドに連結したタンパク質形質導入ドメイン、並びに、Bcl−2ドメインポリペプチドに連結したタンパク質形質導入ドメインを含む。
一般的定義
本明細書に記載される実施形態の実践又は試験に使用される、本明細書に記載されるものに類似する、又は同等である任意の方法及び材料は、本開示の一部であると見なされる。
本明細書で使用するとき、「幹細胞(例えば、造血幹細胞)」は、当該技術分野において一般に理解されている用語を指す。例えば、幹細胞(例えば、造血幹細胞)は、その供給源に関わらず、長期間にわたって自身を分裂させて複製でき、特殊化されておらず(未分化であり)、特殊化細胞種を生じる(そのような細胞腫に分化する)能力を有する細胞である(例えば、様々な異なる特殊化細胞種の前駆細胞、つまり前駆体細胞である)。本明細書の特定の例では、本明細書に記載される「幹細胞(例えば、造血幹細胞)」は、長期幹細胞(例えば、造血幹細胞)を指す。
用語「長期」は、幹細胞(例えば、造血幹細胞)に関して使用されるとき、特定の種類の幹細胞に応じ長期間にわたって(例えば、1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、6ヶ月、8ヶ月、9ヶ月、12ヶ月、2年、3年)、同一の非特殊化細胞種に分化することによって、自身を複製する幹細胞(例えば、造血幹細胞)の能力を指す。いくつかの実施形態では、幹細胞(例えば、造血幹細胞)は、c−kit+、Sca−1+、CD34low/−、CD38+、及び/又はThy1+/lowといった細胞表面マーカーの存在によって同定される。いくつかの実施形態では、ヒト幹細胞(例えば、造血幹細胞)は、CD34+、CD38low/−、c−kit−/low及び/又はThy1+といったマーカーの存在によって同定される。いくつかの実施形態では、ヒト及びマウス幹細胞(例えば、造血幹細胞)の両方は、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、NK1.1、B220、Ter−119、及び/又はGr−1などの細胞系統マーカーを欠く。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドのホモログ、アナログ、又は断片は、そのポリペプチドに、少なくとも40%〜100%同一である、例えば、少なくとも40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、90%、91%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、又は、約40%〜約100%任意のその他パーセンテージで同一であるアミノ酸配列を含む。
2つのアミノ酸配列又は2つの核酸の相同性割合を決定するため、比較目的で配列を最適に整列させる(例えば、第1のアミノ酸又は核酸配列を第2のアミノ酸又は核酸配列と最適にアライメントするために配列中にギャップを挿入する)。その後、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較してよい。第1の配列中のある位置が、第2の配列中の対応する位置のものと同じアミノ酸残基又はヌクレオチドで占有されるとき、その位置において分子は同一である。2つの配列間の相同性割合は、配列が共有する同一位置数の関数である(同一性%=同一位置数/総位置数(例えば、重複位置)×100)。いくつかの実施形態では、2つの配列は同じ長さである。
2つの配列間の相同性割合を決定するため、Karlin and Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264〜2268のアルゴリズムを、Karlin and Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873〜5877のように修正して用いた。かかるアルゴリズムは、Altschul,et al.(1990)J.Mol Biol.215:403〜410のNBLAST及びXBLASTプログラムに組み込まれている。BLASTヌクレオチド検索を、NBLASTプログラム、スコア=100、ワード長=12を用いて行い、本明細書に記載又は開示される核酸分子に相同するヌクレオチド配列を得る。BLASTタンパク質検索を、XBLASTプログラム、スコア=50、ワード長=3を用いて行う。比較目的のためギャップを有するアライメントを得るため、Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Res.25:3389〜3402.に記載されるようなGapped BLASTを利用する。BLAST及びGapped BLASTプログラムを利用するとき、それぞれのプログラム(例えば、XBLAST及びNBLAST)のデフォルトのパラメーターを用いる。詳細は、National Center for Biotechnology Informationのウェブサイト(World Wide Webのncbi.nlm.nih.gov)を参照されたい。本明細書に記載される方法で使用するのに好適なタンパク質は、本明細書に記載される任意のタンパク質のアミノ酸配列と比較して、1〜15ヶ所のアミノ酸変化、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、若しくは15ヶ所のアミノ酸置換、欠失、又は付加を有するタンパク質も含む。別の実施形態では、変更アミノ酸配列は、本明細書に記載される任意のタンパク質インヒビターのアミノ酸配列に、少なくとも75%同一、例えば、77%、80%、82%、85%、88%、90%、92%、95%、97%、98%、99%、又は100%同一である。かかる配列変異タンパク質は、変更アミノ酸配列が、本明細書に記載される組成物及び方法において機能するのに十分な生物学的活性を維持している限り、本明細書に記載される方法において好適である。特定の例では、保存的アミノ酸置換が利用される。アミノ酸間の例示の保存的置換は、(1)グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシン、(2)フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン、(3)セリン及びスレオニン、(4)アスパラギン酸及びグルタミン酸、(5)グルタミン及びアスパラギン、並びに、(6)リジン、アルギニン、及びヒスチジン、のそれぞれのグループ内のものである。BLOSUM62の表は、500超のグループの関連タンパク質の高度保存領域を示す、約2,000のタンパク質配列セグメントの局所的マルチプルアライメント由来のアミノ酸置換マトリックスである(Henikoff et al.(1992),Proc.Natl Acad.Sci.USA,89:10915〜10919)。BLOSUM62の置換頻度を用いて、いくつかの実施形態では、本明細書に記載又は開示されるアミノ酸配列に挿入される、保存的アミノ酸置換を確定する。(上記のような)化学的特性のみに基づくアミノ酸置換の設計は可能であるが、用語「保存的アミノ酸置換」は、好ましくは、BLOSUM62の値が−1を超えることによって表される置換を指す。例えば、BLOSUM62の値が0、1、2又は3であることを特徴とする置換の場合、アミノ酸置換は保存的である。このシステムによると、好ましい保存的アミノ酸置換は、BLOSUM62の値が少なくとも1(例えば、1、2又は3)であることを特徴とし、一方より好ましい保存的アミノ酸置換は、BLOSUM62の値が少なくとも2(例えば、2又は3)であることを特徴とする。
本明細書で使用するとき、用語「核酸」は、1つ又はそれ以上の核酸の組み合わせ又は挿入によって操作され、それによって、通常自然では同時に起こらない配列を組み合わせている核酸を指す。いくつかの実施形態では、核酸はインデューサー又はエンハンサーを含む。いくつかの実施形態では、核酸は制限酵素部位を含む。いくつかの実施形態では、核酸はポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、核酸は突然変異を含む。
本明細書で使用するとき、用語「ポリペプチド」は、核酸から生成されるポリペプチドを指す。
本明細書で使用するとき、用語「導入遺伝子」は、ポリペプチドをコードする核酸を、動物、細菌、ウイルス又は細胞のゲノムDNAに組み込むことを指す。
本明細書で使用するとき、「過剰発現」は、同じポリペプチド又はタンパク質の同一細胞内での内因性発現レベルと比較して、より高いレベルの発現を指す。特定の例では、「過剰発現」はポリペプチドの発現を指す。いくつかの実施形態では、より高いレベルの発現は、2%〜200%高いことを含む。いくつかの実施形態では、より高いレベルの発現は、2倍〜1000倍高いことを含む。いくつかの実施形態では、より高いレベルの発現は、2倍〜1000倍高いことを含む。いくつかの実施形態では、より高いレベルの発現は、2倍〜10,000倍高いことを含む。いくつかの実施形態では、より高いレベルの発現は、事前の検出できないレベルの発現と比較するとき、検出可能なレベルの発現を含む。いくつかの実施形態では、「過剰発現」は、外因性ポリペプチド又はタンパク質の任意の検出可能なレベルの発現を指す。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、本明細書で互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、自然発生型アミノ酸ポリマー、並びに、1つ又はそれ以上のアミノ酸残基が非自然発生型アミノ酸、例えば、アミノ酸アナログであるアミノ酸ポリマーに適用する。本明細書で使用されるとき、この用語は、アミノ酸残基が共有結合性ペプチド結合によって連結されている、完全長タンパク質を含む任意の長さのアミノ酸鎖を包含する。
本明細書で使用するとき、当該実施形態における単離タンパク質又はポリペプチドへの言及は、完全長タンパク質、融合タンパク質、キメラタンパク質、又はかかるタンパク質の任意の断片(切断型、部分)若しくはホモログを含む。より具体的には、単離タンパク質は、自然環境から排除されている(すなわち、ヒトによる操作を受けている)タンパク質(ポリペプチド又はペプチドを含む)であってよく、精製タンパク質、部分精製タンパク質、組み換えで生成されたタンパク質、膜結合タンパク質、脂質と複合体化したタンパク質、可溶性タンパク質、合成的に生成されたタンパク質、及び別のタンパク質を伴う単離タンパク質を挙げてよいが、これらに限定されない。このように、「単離」は、タンパク質が精製されている程度を反映しない。好ましくは、単離タンパク質は組み換えで生成される。
好ましくは、単離核酸分子は、組み換えDNA技術(例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅、クローニング)又は化学合成を用いて生成される。単離核酸分子として、天然対立遺伝子多型、並びに、かかる修飾が所望の効果(例えば、本明細書に記載される誘導可能な癌原遺伝子の提供)をもたらすように、ヌクレオチドが挿入、欠失、置換、及び/又は反転されている修飾核酸分子を非限定的に含む、天然核酸分子及びそれらのホモログが挙げられる。
核酸分子ホモログは、当業者に既知である多くの方法を用いて生成できる(例えば、Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Labs Press(1989)を参照)。例えば、核酸分子は、古典的な突然変異誘発技術及びDNA組み換え技術、例えば、部位特異的突然変異誘発、突然変異を誘発するための核酸分子の化学処理、核酸フラグメントの制限酵素による切断、核酸フラグメントのライゲーション、PCR増幅及び/又は選択領域の核酸配列の突然変異誘発、オリゴヌクレオチド混合物の合成、並びに、核酸分子の混合物を「構築」するための混合物グループのライゲーション、並びにこれらの組み合わせを非限定的に含む様々な手法を用いて修飾してよい。核酸分子ホモログは、核酸及び/又は野生型遺伝子とのハイブリダイゼーションによってコードされるタンパク質の機能についてスクリーニングすることにより、修飾核酸の混合物から選択できる。
核酸分子又はポリヌクレオチドの最小サイズは、本明細書に提供される実施形態に有用なタンパク質、例えば、癌原遺伝子若しくはそれらの機能性部分(例えば、完全長タンパク質の生物学的活性を有し、本方法で使用するのに十分な部分)によってコードされるタンパク質、又は、抗アポトーシスタンパク質若しくはそれらの機能性部分(例えば、完全長タンパク質の生物学的活性を有し、本方法で使用するのに十分な部分)をコードするのに十分なサイズである。その他有用であり得る核酸分子は、典型的には少なくとも5つのヌクレオチドの長さ、好ましくは、約5〜約50の範囲、又は約500以上のヌクレオチドであって、これらの間の整数で増加する任意の長さを含む長さ(すなわち、5、6、7、8、9、10、...33、34、...256、257、...500)である、天然タンパク質をコードする核酸分子の相補配列と安定的にハイブリッド形成できる(例えば、中程度の、高い、又は非常に高いストリンジェンシー条件下)プローブ又はオリゴヌクレオチドプライマーを形成するための、十分な最小サイズの核酸分子を含んでよい。実用限界以外に核酸分子の最大サイズの制限はなく、ここでは核酸分子は、本明細書に記載される任意の実施形態において有用であるために十分な配列を含んでよい。
本明細書で使用するとき、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、類似する核酸分子を同定するために核酸分子が使用される、標準的なハイブリダイゼーション条件を指す。かかる標準的条件は、例えば、Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Labs Press,1989に開示されている。Sambrook et al.の同書は、その全体が参照として本明細書に組み込まれる(特に9.31〜9.62ページ参照)。更に、ヌクレオチドの様々なミスマッチの程度を可能にするハイブリダイゼーションを達成するための、適切なハイブリダイゼーションを算出する式及び洗浄条件は、例えば、Meinkoth et al.,1984,Anal.Biochem.138,267〜284に開示されており、Meinkoth et al.の同書は、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。
より具体的には、中程度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、本明細書で言及されるとき、ハイブリダイゼーション反応においてプローブとして使用されている核酸分子と、少なくとも約70%の核酸配列同一性を有する核酸分子を単離できる条件を指す(例えば、約30%以下のヌクレオチドのミスマッチを可能にする条件)。高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、本明細書で言及されるとき、ハイブリダイゼーション反応においてプローブとして使用されている核酸分子と、少なくとも約80%の核酸配列同一性を有する核酸分子を単離できる条件を指す(例えば、約20%以下のヌクレオチドのミスマッチを可能にする条件)。非常に高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、本明細書で言及されるとき、ハイブリダイゼーション反応においてプローブとして使用されている核酸分子と、少なくとも約90%の核酸配列同一性を有する核酸分子を単離できる条件を指す(例えば、約10%以下のヌクレオチドのミスマッチを可能にする条件)。上で開示されるように、当業者は、Meinkoth et al.の同書における式を用いて、これらのヌクレオチドの特定のミスマッチ程度を達成するため、適切なハイブリダイゼーション及び洗浄条件を算出できる。かかる条件は、DNA:RNA又はDNA:DNAのハイブリッドのいずれが形成されるかによって変わり得る。DNA:DNAハイブリッドの算出される融解温度は10℃であり、DNA:RNAハイブリッドより低い。特定の実施形態では、DNA:DNAハイブリッドのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、イオン強度が6×SSC(0.9M Na)において、約20℃〜約35℃(低ストリンジェンシー)、より好ましくは、約28℃〜約40℃(よりストリンジェント)、更により好ましくは、約35℃〜約45℃(更によりストリンジェント)の温度で、適切な洗浄条件を用いてハイブリダイゼーションすることを含む。特定の実施形態では、DNA:RNAハイブリッドのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、イオン強度が6×SSC(0.9M Na)において、約30℃〜約45℃、より好ましくは、約38℃〜約50℃、更により好ましくは、約45℃〜約55℃の温度で、同程度にストリンジェントな洗浄条件を用いてハイブリダイゼーションすることを含む。これらの値は、約100ヌクレオチドより大きい分子の融解温度の算出、0%ホルムアミド、及び約40%のG+C含量に基づいている。あるいは、Tは、Sambrook et al.(上記)9.31〜9.62ページに記載されるように経験的に算出できる。一般には、洗浄条件はできるだけストリンジェントでなくてはならず、選択されたハイブリダイゼーション条件に適切なものでなくてはならない。例えば、ハイブリダイゼーション条件は、特定のハイブリッドの算出したTより低い、約20〜25℃である塩及び温度条件の組み合わせを含んでよく、洗浄条件は、典型的には、特定のハイブリッドの算出したTより低い、約12〜20℃である塩及び温度条件の組み合わせを含む。DNA:DNAハイブリッドで用いるのに好適なハイブリダイゼーション条件の一例として、6×SSC(50%ホルムアミド)中で約42℃において2〜24時間のハイブリダイゼーション、続いて、室温の約2×SSCで1回又はそれ以上の洗浄すること含む洗浄工程、続いて、より高い温度とより低いイオン強度での追加の洗浄(例えば、約37℃で約0.1×〜0.5×SSCによる少なくとも1回の洗浄、その後、約68℃で約0.1×〜0.5×SSCによる少なくとも1回の洗浄)が挙げられる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される、切断型(断片又は部分)及びかかる配列のホモログを含む任意のアミノ酸配列は、あるアミノ酸配列のC及び/又はN末端のそれぞれに隣接する少なくとも1つの、最大約20個の追加の異種アミノ酸を有して生成されてよい。得られるタンパク質又はポリペプチドは、あるアミノ酸配列「から本質的になる」と称されてよい。異種アミノ酸は、あるアミノ酸配列に隣接する天然に見出されない(すなわち、インビボで天然に見つからない)、又は、自然発生型配列中のかかるヌクレオチドが、あるアミノ酸配列が由来する生物における標準的なコドン使用頻度を用いて翻訳される場合、その遺伝子中で起こるように、あるアミノ酸配列をコードする自然発生型核酸配列に隣接するヌクレオチドによってコードされない、アミノ酸の配列である。同様に、語句「から本質的になる」は、本明細書の核酸配列に関して使用されるとき、あるアミノ酸配列をコードする核酸配列の5'及び/又は3'末端のそれぞれにおいて、少なくとも1つ、最大約60個もの追加の異種ヌクレオチドが隣接し得る、あるアミノ酸配列をコードする核酸配列を指す。異種ヌクレオチドは、天然遺伝子で起こるように、あるアミノ酸配列をコードする核酸配列に隣接して、天然に見出されない(すなわち、インビボで天然に見つからない)。
組み換えベクター(特に関心対象の核酸配列を含む場合、一般に組み換え核酸分子と称することもある)は、選択した核酸配列を操作し、かかる核酸配列を宿主細胞に導入するツールとして使用される、遺伝子操作を受けた(例えば、人工的に生成された)核酸分子である。したがって、組み換えベクターは、選択した核酸配列のクローニング、シークエンシング、並びに/又は別の方法による、例えば、選択した核酸配列を宿主細胞内で発現させ及び/若しくは送達することによる操作において使用するのに好適である。かかるベクターは、典型的には、異種核酸配列、例えば、クローニングされる、又は送達される核酸配列に隣接して天然に又は通常は見つからない核酸配列を含むが、ベクターは、核酸分子に隣接して天然に見出され、又は、核酸分子の発現に有用な(以下で説明する)調節性核酸配列(例えば、プロモーター、非翻訳領域)も含んでよい。ベクターは、RNA又はDNAのいずれか、原核又は真核のいずれかであってよく、典型的にはプラスミド又はウイルスベクターである。ベクターは、染色体外因子(例えば、プラスミド)として維持されてよく、又は、宿主細胞の染色体内に組み込まれてよい。ベクター全体は、宿主細胞内の適所で留まっていてよく、又は、特定の条件下では、プラスミドDNAは除去され、核酸分子を残してもよい。別の条件下では、ベクターは、宿主細胞のゲノムから選択した時間において(以下でより詳細に説明する)切り取られる(除去される)ように設計される。組み込まれた核酸分子は、染色体プロモーターの制御下、天然又はプラスミドプロモーターの制御下、又は、いくつかのプロモーターの組み合わせの制御下であってよい。核酸分子の1つ又は複数のコピーが染色体内に組み込まれてよい。組み換えベクターは、少なくとも1つの選択可能マーカーを含んでよい。
いくつかの実施形態では、幹細胞は、任意の供給源から得られた任意の成体幹細胞を含んでよい。別の実施形態では、幹細胞は胚性幹細胞を含んでよい。幹細胞として、造血幹細胞、間葉系幹細胞(肺間葉系幹細胞、骨髄間質細胞を非限定的に含む)、神経幹細胞、上皮幹細胞(肺上皮幹細胞、乳房上皮幹細胞、血管上皮幹細胞、及び腸上皮幹細胞を非限定的に含む)、腸幹細胞、心筋細胞前駆幹細胞、皮膚幹細胞(表皮幹細胞及び濾胞幹細胞(毛包幹細胞)を非限定的に含む)、骨格筋幹細胞、造骨前駆幹細胞、及び肝幹細胞を挙げてよいが、これらに限定されない。
造血幹細胞は、赤色血液細胞(赤血球)、Bリンパ球、Tリンパ球、ナチュラルキラー細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単級、マクロファージ、及び血小板を非限定的に含む、全ての種類の血球を生じる。
間葉系幹細胞(骨髄間質細胞を含む)は、骨の細胞(骨細胞)、軟骨の細胞(軟骨細胞)、脂肪の細胞(脂肪細胞)、肺細胞、及び腱中のものなどのその他の種類の結合組織細胞を非限定的に含む、様々な細胞の種類を生じる。
脳内の神経幹細胞は、3種類の主要な細胞、つまり、神経細胞(ニューロン)及び2種類の非神経細胞である星状細胞及びオリゴデンドロサイトを生じる。
様々な組織の内側にある上皮幹細胞は、組織内で上皮を形成する様々な種類の細胞を生じる。
皮膚幹細胞は、表皮の基底層中、及び、毛包の基部において生じる。表皮幹細胞は、皮膚の表面に移動し、保護層を形成するケラチノサイトを生じ、濾胞幹細胞は、毛包及び表皮の両方を生じることができる。成体幹細胞のその他の供給源は当業者に既知となるであろう。
胚性幹細胞は、体内の全ての組織及び細胞を生じることができる。
方法
長期再増殖造血幹細胞(LT−HSC)集団は、インビボで自己複製し、それぞれの寿命の間、血球新生を支持する。長期HSCは、特に、骨髄幹細胞移植という点で重要である。
造血幹細胞(HSC)のインビボでの機能は、自己複製、分化系列決定、及び分化を決定する複雑な微小環境シグナルに依存する。HSC集団を増殖させる試みは、自己複製させながら、多能性の維持と分化の阻止が不可能であることから、妨害されてきた(Bernstein,I.D.and Delaney,C.(2012).Cell Stem Cell 10,113〜4)。インビトロでHSCを増殖させようとするこれまでの取り組みには、サイトカイン混合物(Chou,S.,et al.(2010).Cell Stem Cell 7,427〜8)、Notch−1に対するリガンド(Dahlberg,A.,et al(2011).Blood 117,6083〜90)、HoxB4に対するTat−融合タンパク質(Krosl,J.,et al.(2003).Nat Med 9,1428〜32)、NF−Ya(Domashenko,A.D.,et al,(2010).Blood 116,2676〜83)、及びその他転写因子(Yang,J.et al.(2011).J Hematol Oncol 4,38)、並びに、小分子(PGE2及び芳香族炭化水素受容体アンタゴニスト)(North,T.E.,et al.(2007).Nature 447,1007〜11;Boitano,A.E.,et al.(2010).Science 329,1345〜8)の使用を伴った。増殖細胞の性質は、これら異なる方法によって異なり、異種キメラ形質導入マウスの試験、及び臨床試験において一致しない結果が生じている(Walasek,M.A.,et al.(2012).Ann NY Acad Sci,1266,138〜50)。
現在の幹細胞療法における障壁として、必要とされる細胞を十分な数入手することが難しいこと、及び、同種の適切なドナーを識別することが挙げられる。本明細書に記載されるいくつかの実施形態は、大量のHSCの産生能を可能にする。精製した均質の幹細胞集団を移植できることで、同種の壁を越えて、照射された宿主の再構成をも可能にする。
いくつかの実施形態では、条件的不死化成体幹細胞集団(タンパク質を形質導入された長期HSC「ptlt−HSC」)を産生する方法が提供される。この方法は、a)細胞の生存又は増殖のうち1つ又はそれ以上を促進する外因的に合成されたMycポリペプチド、及び、b)アポトーシスを阻害する外因的に合成されたBcl−2ドメインポリペプチドによって、1つ又はそれ以上の成体幹細胞を提供することを含んでよい。いくつかの実施形態では、Mycポリペプチドは、少なくとも約72時間間隔で1つ又はそれ以上の成体幹細胞に供給される。いくつかの実施形態では、Bcl−2ドメインポリペプチドは、少なくとも約96時間間隔で1つ又はそれ以上の成体幹細胞に供給され、条件的不死化成体幹細胞集団を産生する。用語「外因的に合成された」は、タンパク質が作用を及ぼす細胞内で合成されないことを表す。いくつかの実施形態では、外因的に合成されたタンパク質を、単離された形態で(例えば、緩衝液とこれらのタンパク質のみ)で細胞に添加する。いくつかの実施形態では、外因的に合成されたタンパク質は、幹細胞から分離した細胞の第1集団によって産生される。
理論に束縛されるものではないが、癌原遺伝子をコードするタンパク質(例えば、Mycポリペプチド)の機能は、HSCが細胞周期から外れるのを防ぎ、継続的な増殖を推進し、分化を阻害すると考えられる。IL−3、IL−6、SCF及び他のサイトカインを含むサイトカイン混合物によってもたらされるシグナルは、増殖しているptlt−HSC細胞のHSC表現型を維持する。抗アポトーシスタンパク質(例えば、Bcl−2ドメインポリペプチド)によってもたらされる生存機能は、癌原遺伝子をコードするタンパク質の機能がなくなると通常起こり得るアポトーシス死からptlt−HSC細胞を救うことができる。これにより、HSCによるインビボで生理学的に存在する生存シグナルの利用能の回復を可能にすると思われる。したがって、いくつかの実施形態では、この方法は、増殖を推進することと、分化を阻害することと、を含んでよく、Bcl−2ドメインポリペプチド及びMycポリペプチドの両方を適用して、その後に、存在しているある程度の量のBcl−2を維持したままで、Mycポリペプチドを取り除き(又は、その濃度を低下させ)、細胞がMycの除去を生き抜き、引き続いて分化できるようにすることを含んでよい。
理論に束縛されるものではないが、ptlt−HSCを養子移植すると、抗アポトーシスタンパク質の生存機能により、骨髄幹細胞ニッシェによってもたらされた微小環境シグナルに細胞が慣れることを可能にすると考えられる。放射線誘発性リンパ球減少症などの必要とされる症状において、これらのシグナルは、ptlt−HSCの分化を推進し、機能性リンパ系細胞及びその他分化した血球を産生できる。ptlt−HSCで再構成されたマウスでは、白血病は見られなかったことに留意されたい。したがって、いくつかの実施形態では、このような有益な細胞を産生する方法が本明細書において提供される。
いくつかの実施形態では、この方法は、Mycの添加を止め、及び/又は低下させ、培地中のMyc量を徐々に減らすことを含んでよい。このMyc量を減らしている期間中、Bcl−2を適宜追加し続け、許容される濃度のBcl−2を維持してよい。
いくつかの実施形態では、Mycポリペプチドは、少なくとも約72時間間隔で供給される。いくつかの実施形態では、Mycポリペプチドは、より頻繁に、例えば、24、32、40、48、56、又は64時間毎に供給されてよい。
いくつかの実施形態では、Mycポリペプチド及び/又はBcl−2ドメインポリペプチドは、1時間に1回以下の頻度で、例えば、2時間毎に1回、3時間毎に1回、4時間毎に1回、5時間毎に1回、6時間毎に1回、7時間毎に1回、8時間毎に1回、9時間毎に1回、10時間毎に1回、11時間毎に1回、12時間毎に1回、13時間毎に1回、14時間毎に1回、15時間毎に1回、16時間毎に1回、17時間毎に1回、18時間毎に1回、19時間毎に1回、20時間毎に1回、21時間毎に1回、22時間毎に1回、23時間毎に1回、又は、24時間毎に1回投与される。いくつかの実施形態では、Mycポリペプチド及び/又はBcl−2ドメインポリペプチドは、1日に1回以下の頻度で、例えば2日毎に1回、3日毎に1回、又は4日毎に1回投与される。いくつかの実施形態では、これは、本明細書に提供されるMycポリペプチドの様々な実施形態を用いることにより、従来のMycポリペプチドの半減期が短い(例えば36分)にもかかわらず達成できる。いくつかの実施形態では、Mycポリペプチドの低い投与頻度にも関わらず、一度に投与されるMycポリペプチドの量は、約100マイクログラム/mL未満、例えば50〜100マイクログラム/mL、又は20マイクログラム/mL以下になる。このような状況では、半減期が延長されているため、Mycポリペプチドを追加する必要がなく、1つ又はそれ以上の上記期間においてMycが有効で有り続けることができる(例えば、細胞に有効レベルのMyc活性を依然として提供しながら、必要とされる追加のMycポリペプチドを含めない状態で、1、2、3、4、5、6、7、8、12、16、24、又は48時間)。
いくつかの実施形態では、Myc及び/又はBcl−2ドメインポリペプチドの量の全てが、短時間で一度に適用され、例えば、Myc及び/又はBcl−2ドメインポリペプチドの量の全てを、一度に、つまり1、5、10、又は60秒かけて単回的に適用できる。いくつかの実施形態では、Myc及び/又はBcl−2ドメインポリペプチドを、1分間〜60分間かけて、例えば、約1、3、5又は10分間かけて適用できる。
いくつかの実施形態では、Mycポリペプチドは持続的に供給される。いくつかの実施形態では、Mycポリペプチドは、少なくとも約0.1マイクログラム/mL、例えば、5、10、50、又は100マイクログラム/mLの濃度で供給される。いくつかの実施形態では、Mycポリペプチドは、約0.1〜約50マイクログラム/mLの範囲で供給される。いくつかの実施形態では、1マイクログラム/mL以下が、8、12、16、又は24時間の時間で細胞に供給される。
いくつかの実施形態では、Bcl−2ドメインポリペプチドは、少なくとも約72時間間隔で供給される。いくつかの実施形態では、Bcl−2ドメインポリペプチドはより頻繁に、例えば、24、32、40、48、56、又は64時間毎に1回供給されてよい。
いくつかの実施形態では、Bcl−2ドメインポリペプチドは持続的に供給される。いくつかの実施形態では、Bcl−2ドメインポリペプチドは、少なくとも約0.1マイクログラム/mL、例えば、5、10、50、又は100マイクログラム/mLの濃度で供給される。いくつかの実施形態では、Bcl−2ドメインポリペプチドは、約1〜約50マイクログラム/mLの範囲で供給される。いくつかの実施形態では、Bcl−2ドメインポリペプチドは、約1マイクログラム/mLの濃度で供給される。いくつかの実施形態では、Bcl−2ドメインポリペプチドとMycの比は、達成を望む所望のプロセスに依存し得る。いくつかの実施形態では、Bcl−2とMycの比は少なくとも1:1、例えば少なくとも2:1のBcl−2対Mycである。
いくつかの実施形態では、Bcl−2ドメインポリペプチド及びMycポリペプチドを、同時に投与してよい。いくつかの実施形態では、Bcl−2ドメインポリペプチド及びMycポリペプチドを、異なる時間で投与してよい。いくつかの実施形態では、Bcl−2ドメインポリペプチド及びMycポリペプチドを、重複する時間で投与してよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される任意のMycポリペプチド及び/又はBcl−2ドメインポリペプチドを、本明細書に提供される方法において使用してよい。
いくつかの実施形態では、細胞を、様々な温度かつ様々な条件下で培養してよい。いくつかの実施形態では、約37℃で培養してよい。いくつかの実施形態では、細胞を、ガス透過性容器、例えば、ガス透過性フラスコ(例えばG−Rex製のもの)又はガス透過性バッグ(例えばOrigene製のもの)中で培養してよい。いくつかの実施形態では、これにより、プラスチック製のTC容器における静置培養によって行われるものよりも優れた方法が提供される。いくつかの実施形態では、このプロセスを、約5% COのインキュベーター内において、ガス透過性容器中で起こすことができる。いくつかの実施形態では、ガス透過性容器は、迅速増殖培養製品であってよい。いくつかの実施形態では、容器は、ガス交換を可能にするシリコーン膜を側面及び/又は底面に含む。
いくつかの実施形態では、得られたptlt−HSCは、細胞表面の表現型、インビトロ分化能、照射後の造血系統のインビボ再構成能、及び/又は、連続的に移植される能力のうち、1つ又はそれ以上によってHSCに類似する。いくつかの実施形態では、細胞は、少なくとも2回の連続継代、例えば、3、4、5、6回以上の継代を実施できる。
いくつかの実施形態では、ptlt−HSCは、臍帯血、胎盤、動員済み末梢血、及び骨髄を非限定的に含む、任意のHSC、並びに、胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞由来のHSCの供給源から迅速に増殖させてよい。いくつかの実施形態では、ptlt−HSCは、移植後にインビボで自己複製するHSC区画を生じる。いくつかの実施形態では、これは、ptlt−HSCを対象に投与することによって達成できる。
いくつかの実施形態では、成体幹細胞は、一定期間にわたって1倍又はそれ以上増殖する。いくつかの実施形態では、成体幹細胞は、約28日間で約270倍に増殖する(例えば、マウス5FU濃縮化BM)。いくつかの実施形態では、成体幹細胞は、約14日間で約150倍に増殖する(例えば、ヒトFCB由来)。いくつかの実施形態では、成体幹細胞は、約21日間で100倍に増殖する。いくつかの実施形態では、成体幹細胞は、約9〜14日間で約85倍に増殖する(ヒト動員済み)。当業者に認められるように、本開示の場合、Mycポリペプチド及び/又はBcl−2ドメインポリペプチドを少ない頻度で投与できることは、かかる細胞を保存できることに役立つであろう。
当業者に認められるように、本開示の場合、Myc並びにそれらの変異体及び/又はホモログは、本明細書の様々な実施形態で利用できる。いくつかの実施形態では、Mycポリペプチドは、n−Myc、c−Myc、l−Myc、v−Myc、又はs−Mycのうち1つ又はそれ以上である。本明細書で使用するとき、用語「Myc」、「cMyc」、「Mycタンパク質」及び「Mycポリペプチド」は、互換的に使用され、特定の例では、NCBI Accession Number NP002458.2、それらの機能性ホモログ、アナログ、又は断片を指す。いくつかの実施形態では、Mycの同義語として、c−Myc、v−Myc、Myc癌原遺伝子タンパク質、及び転写因子p64が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Mycポリペプチドは、NCBI Accession Numbers NP002458.2の配列に、少なくとも40%〜100%同一である、例えば、少なくとも40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、90%、91%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、又は、約40%〜約100%の任意のその他パーセンテージで同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Mycポリペプチドは、NCBI Accession Numbers NP002458.2の配列に、少なくとも50%〜100%同一である、例えば、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、90%、91%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、又は約50%〜約100%の任意のその他パーセンテージで同一である、長さが40個以上のアミノ酸のポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、Mycポリペプチドは、NCBI Accession Numbers NP002458.2の配列に、少なくとも50%〜100%同一である、例えば、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、90%、91%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、又は約50%〜約100%の任意のその他パーセンテージで同一である、長さが40個以上のアミノ酸のポリペプチド配列を含み、このときMycポリペプチドは、細胞の生存、細胞の不死、細胞の成長及び/又は細胞の増殖を誘導する。
BCL−2ドメイン
いくつかの実施形態では、Bcl−2ドメインポリペプチドは、Bcl−2ファミリーの任意のメンバー及び/又はタンパク質の抗アポトーシス性が機能できるように、十分な相同性を有する任意のタンパク質であってよい。いくつかの実施形態では、Bcl−2ドメインポリペプチドは、Bcl−2のBH1ドメインを含んでよい。いくつかの実施形態では、Bcl−2ドメインポリペプチドは、Bcl−2のBH2ドメインを含んでよい。いくつかの実施形態では、Bcl−2ドメインポリペプチドは、Bcl−2のBH3ドメインを含んでよい。いくつかの実施形態では、Bcl−2ドメインポリペプチドは、Bcl−2のBH4ドメインを含んでよい。いくつかの実施形態では、Bcl−2ドメインポリペプチドは、Bcl−2のBH1及びBH2ドメイン、BH1及びBH3ドメイン、BH1及びBH4ドメイン、BH2及びBH3ドメイン、BH2及びBH4ドメイン、BH3及びBH4ドメイン、BH1、BH2、及びBH3ドメイン、BH2、BH3、及びBH4ドメイン、又はBH1、BH2、BH3、及びBH4ドメインの全てを含んでよい。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、BH1、BH2、BH3、又はBH4のうち少なくとも1つ又はそれ以上に、少なくとも90%同一である、例えば、BH1、BH2、BH3、及び/又はBH4の少なくとも1つに、91、92、93、94、95、96、97、98、99パーセント以上同一である限り、Bcl−2ドメインポリペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、Bcl−2ドメインポリペプチドは、BH1、H2及びBH4ドメインを含む。いくつかの実施形態では、Bcl−2ドメインポリペプチドは、Bcl−2、Bcl−w、Bcl−X、Bcl−XL、又はMcl−1のうち、1つ又はそれ以上を含む。用語「Bcl−2ドメインポリペプチド」は、本明細書で記載するように機能する程度において、それらのホモログを含む。したがって、Bcl−2タンパク質の変異体もこの用語の範囲に含まれる。いくつかの実施形態では、Bcl−2ドメインポリペプチドは、完全長Bcl−2を包含する。いくつかの実施形態では、Bcl−2ドメインポリペプチドは、非構造化ループドメインを欠いている、切断型のヒトBcl−2(Anderson,M.,et al.(1999)Prot Expr.Purif.15,162〜70)を含む。
いくつかの実施形態では、Bcl−2ドメインポリペプチドは、NCBI Accession Numbers:NM_000633.2及び/又はNM_000657.2の配列に、少なくとも40%〜100%同一である、例えば、少なくとも40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、90%、91%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、又は約40%〜約100%の任意のその他パーセンテージで同一であるアミノ酸配列を含む。
形質導入ドメイン
いくつかの実施形態では、Mycポリペプチド及び/又はBcl−2ドメインポリペプチドは、タンパク質形質導入ドメインを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質形質導入ドメインはTatを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質形質導入ドメインはEPTDを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質形質導入ドメインは、vpr、R9、R15、VP16、アンテナペディア、アプタマー法、chariot法、R11などのうち、少なくとも1つを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質形質導入ドメインは、Mycポリペプチド又はBcl−2ドメインポリペプチドに共有結合されている。いくつかの実施形態では、タンパク質形質導入ドメインは、Mycポリペプチド又はBcl−2ドメインポリペプチドに、ペプチド結合を介して結合されている。いくつかの実施形態では、タンパク質形質導入ドメインは、Mycポリペプチド及び/又はBcl−2ドメインポリペプチドに、短い連続中性アミノ酸からなり得るリンカー配列を介して結合されている。
いくつかの実施形態では、Tat−Mycポリペプチドは、図15Aに示されるものであり得る。いくつかの実施形態では、Tat−Bcl−2ドメインポリペプチド、図15Bに示されるものであり得る。
培地
いくつかの実施形態では、成体幹細胞は、IL3、IL6、及び幹細胞因子のうち少なくとも1つを含む培地中で培養される。いくつかの実施形態では、成体幹細胞は、IL3、IL6、及び幹細胞因子を含む培地中で培養される。いくつかの実施形態では、成体幹細胞は、IL3、IL6、幹細胞因子、トロンボポエチン、及びFlt3−Lを含む培地中で培養される。いくつかの実施形態では、成体幹細胞は、IL3、IL6、幹細胞因子、トロンボポエチン、及びFlt3−L、及びGM−CSFを含む培地中で培養される。いくつかの実施形態では、IL3、IL6、幹細胞因子、トロンボポエチン、Flt3−L、及び/又はGM−CSFの量は、10〜500ng/mLの範囲で存在してよい。
細胞の種類
いくつかの実施形態では、成体幹細胞は、1つ又はそれ以上の成体造血幹細胞である。いくつかの実施形態では、成体造血幹細胞は、細胞表面の表現型、インビトロ分化能、照射後の造血系統のインビボ再構成能、又は、連続的に移植される能力のうち、1つ又はそれ以上を特徴とできる。いくつかの実施形態では、成体造血幹細胞は、適切な細胞表面の表現型、インビトロ分化能、照射後の造血系統のインビボ再構成能、及び、連続的に移植される能力を特徴とできる。いくつかの実施形態では、成体造血幹細胞と考えられるマウス細胞において、Sca−1+、c−kit+、系統−のうち1つ又はそれ以上の表面表現型を発現でき、1回の移植当たりわずか10個の細胞によって照射された同系マウスを再構成でき、連続継代後に照射されたレシピエントを救うことができる自己複製するHSC集団を生じる。いくつかの実施形態では、成体造血幹細胞と考えられるヒト細胞において、CD34+、CD38+/lo、系統陰性、flk−2−のうち1つ又はそれ以上の表面表現型を発現でき、合成メチルセルロース分化培地上でいくつかのコロニータイプと形態を生じることができ、併せて、インビトロ分化系において連続的にプレーティング可能な細胞を生じさせることができ、細胞は、NOD/SCID/γ鎖KO、又はその他著しく免疫無防備状態のマウス系統を用いる異種移植試験において、ヒト成熟造血細胞を生じることができるはずであり、この異種移植(xenotrasplant)系において、連続的に移植可能なHSCを生じる。
いくつかの実施形態では、1つ又はそれ以上の成体造血幹細胞は、臍帯血、胎盤、骨髄、末梢血、動員済み末梢血、若しくは脂肪組織のうち、1つ又はそれ以上から単離される。いくつかの実施形態では、成体造血幹細胞は、胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞由来である。
いくつかの実施形態では、1つ又はそれ以上の成体幹細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、1つ又はそれ以上の成体幹細胞は、例えば、マウス、ラット、イヌ、ウマ、ネコ、ブタなどの非ヒト動物細胞である。
タンパク質
いくつかの実施形態では、タンパク質が提供される。タンパク質は、タンパク質形質導入ドメインと、細胞の生存又は増殖のうち1つ又はそれ以上を促進するMycポリペプチド(外因的に合成されてよい)と、V5ドメインと、6ヒスチジンエピトープタグと、を含む、Myc融合タンパク質であってよい。いくつかの実施形態では、Myc融合タンパク質は、37℃、5% COによる雰囲気、水溶液中という組織培養条件において、約60分より長い半減期を有する。
いくつかの実施形態では、Myc融合タンパク質の半減期は約48時間である。いくつかの実施形態では、Myc融合タンパク質は、約48時間まで、例えば72時間まで検出可能であるような、十分な半減期を有する。
いくつかの実施形態では、Myc融合タンパク質は、細胞内の核に輸送される。いくつかの実施形態では、Myc融合タンパク質は、細胞内の核に位置される。
いくつかの実施形態では、タンパク質形質導入ドメインは、任意のタンパク質形質導入ドメインであってよい。いくつかの実施形態では、タンパク質形質導入ドメインは、Tat、Vpr、及び/又はEPTDを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質形質導入ドメインは、VP16、R9、R15、又はその他タンパク質形質導入ドメインのうち少なくとも1つを含む。
いくつかの実施形態では、Myc融合タンパク質を任意の所望の順序で配置してよい。いくつかの実施形態では、Myc融合タンパク質は、a)Mycポリペプチドにインフレームで連結したタンパク質形質導入ドメイン、b)V5ドメインにインフレームで連結したMycポリペプチド、及びc)6ヒスチジンエピトープタグにインフレームで連結したV5ドメインの順で配置されてよい。いくつかの実施形態では、Myc融合タンパク質の構成要素は、a)タンパク質形質導入ドメインにインフレームで連結したMycポリペプチド、b)V5ドメインにインフレームで連結したタンパク質形質導入ドメイン、及びc)6ヒスチジンエピトープタグにインフレームで連結したV5ドメインの順で含まれる。いくつかの実施形態では、それぞれの配列間に追加の介在アミノ酸配列を含んでよい。いくつかの実施形態では、配列の最初及び/又は最後に追加のアミノ酸配列を含んでよい。
いくつかの実施形態では、Myc融合タンパク質は、タンパク質形質導入ドメインと、細胞の生存又は増殖のうち1つ又はそれ以上を促進するMycポリペプチドと、短いペプチドドメインと、を含む。この短いペプチドドメインは可変であってよい。いくつかの実施形態では、短いペプチドドメインは、V5、ヒスチジンタグ、HA(赤血球凝集素)タグ、FLAGタグ、CBP(カルモジュリン結合ペプチド)、CYD(covalent yet dissociable NorpDペプチド)、StrepII、又はHPC(プロテインCの重鎖)のうち少なくとも1つから選択される。いくつかの実施形態では、短いペプチドドメインは、約10又は20のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、短いペプチドドメインは、2〜20、例えば6〜20個のアミノ酸の長さである。いくつかの実施形態では、短いペプチドドメインとして上記のうち2つ(例えば、V5及びhisタグ)を一緒に用いてよい。
増殖培地
いくつかの実施形態では、幹細胞増殖培地が提供される。増殖培地は、a)基本培地と、b)IL3、IL6、幹細胞因子、トロンボポエチン、Flt3−L、及びGM−CSFのうち少なくとも1つ又はそれ以上と、を含んでよい。いくつかの実施形態では、IL3、IL6、幹細胞因子、トロンボポエチン、Flt3−L、及びGM−CSFを含む。いくつかの実施形態では、IL3、IL6、幹細胞因子、トロンボポエチン、及びFlt3−Lを含む。いくつかの実施形態では、増殖培地は、IL3、IL6、幹細胞因子、トロンボポエチン、Flt3−L、及びGM−CSFを含んでよい。
いくつかの実施形態では、細胞増殖培地は、細胞の生存又は増殖のうち1つ又はそれ以上を促進するMycポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、細胞増殖培地は、細胞の生存又は増殖のうち1つ又はそれ以上を促進する外因的に合成されたMycポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、細胞増殖培地は、本明細書に提供されるMycポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、幹細胞増殖培地は、アポトーシスを阻害するBcl−2ドメインポリペプチドを更に含む。いくつかの実施形態では、幹細胞増殖培地は、本明細書に提供されるBcl−2ドメインポリペプチドを更に含む。いくつかの実施形態では、幹細胞増殖培地は、アポトーシスを阻害する外因的に合成されたBcl−2ドメインポリペプチドを更に含む。
いくつかの実施形態では、任意の基本培地を利用できる。いくつかの実施形態では、基本培地は、StemSpan、Isco培地、RPMI、又はDMEMのうち1つ又はそれ以上を含んでよい。
追加の態様:
かかる幹細胞を得て、液体培地又は半固形培地などの初期培養条件を提供する方法は、当該技術分野において既知である。いくつかの実施形態では、幹細胞源を、組織源中又は培養中でかかる細胞を増殖又は濃縮する好適な試薬と接触させることによって、細胞をまずインビボ又はインビトロで増殖する。例えば、造血幹細胞の場合、ドナーそれぞれを、造血幹細胞を濃縮し、かかる細胞を分化せずに増殖するよう促進する薬剤、例えば5−フルオロウラシルで処理してよい。所望の幹細胞種の増殖に好適なその他の薬剤は、当業者に既知であろう。あるいは、成体幹細胞を組織源から単離して、好適な薬剤に曝露することによって、インビトロで増殖又は濃縮する。例えば、造血幹細胞に関して、成体造血系前駆細胞の増殖培養を生じさせる方法は、Van Parijs et al.(1999;Immunity,11,763〜70)に記載されている。細胞は、骨髄の採取、体液(例えば、血液)の採取、臍帯血の採取、組織パンチ、及び組織解剖を非限定的に含み、特に、皮膚、腸、角膜、脊髄、脳組織、頭皮、胃、乳房、肺(例えば、洗浄及び気管支鏡(bronchioschopy)を含む)、骨髄の細針吸引液、羊水、胎盤、及び卵黄嚢の任意の生検を非限定的に含む、任意の好適な動物から細胞サンプルを得る方法によって固体から得られる。
いくつかの実施形態では、細胞は、新鮮な、又は凍結保存された(保管された)臍帯血、胚性幹(ES)細胞のインビトロでの分化誘導によって得られ得る造血前駆細胞集団、正常の、又はlt−HSCを末梢循環に動員するために誘導を受けた顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)で処理した患者の末梢血から得られた造血幹細胞(HSC)、からも得られ得る。
いくつかの実施形態では、本明細書で産生される細胞を用いて、様々な疾患を治療できる。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法を用いて、必要とされるもののために細胞を培養できる。いくつかの実施形態では、細胞は、細胞を受け取る対象由来である(自家)。
いくつかの実施形態では、本明細書で産生される、又は、本明細書に提供される1つ又はそれ以上の構築物(タンパク質など)を含む細胞は、放射線療法及び/又は化学療法を受けた対象(例えば癌患者、又は、高線量の放射線に曝露されたもの)の治療、免疫不全症及び血液系腫瘍の治療、免疫系への老化の悪影響と戦うための骨髄移植において使用できる。いくつかの実施形態では、心疾患の治療に、又は、移植片対宿主反応の低減に使用できる。
いくつかの実施形態では、本明細書で産生される細胞は、単一遺伝子疾患の治療のための遺伝子修復法に使用できる。いくつかの実施形態では、TALEN又は他の方法で遺伝子修復を受け得た自家HSCを用いて、細胞を患者に注入して戻すことができる。いくつかの実施形態では、特にこれらの修復法が細胞分裂を含むことから、遺伝子修復前後の増幅が可能である。
いくつかの実施形態では、本方法は、患者を動員できない、つまり、HSCを動員するためにG−CSF処理を受けさせられない場合の疾患に適応できる。これらの場合では、少数のHSCを末梢血から得て、本明細書に提供される方法によって増幅でき、うまく治療に応用することができる。これらの疾患として、リソソーム蓄積症、鎌状赤血球貧血、先天性貧血、表皮水疱症(Epidermylysis Bullosa)(4種類)などが挙げられるが、これらに限定されない。
実施例1:生物学的に活性なTat−Myc及びTat−Bcl−2融合タンパク質の作製
HIV−1 Tatタンパク質形質導入ドメイン(PTD)と、ヒトMycのORF、又は非構造化ループドメインを欠いている切断型のヒトBcl−2(Anderson,M.,et al.(1999).Prot Expr.Purif.15,162〜70)のいずれかと、を有する、融合タンパク質を作製した。組み換えタンパク質は、V5ペプチドタグ及び6−Hisタグもコードしており、検出及び精製を促進した(図1A)。
pTAT−Myc−V5−6xHis(Amp)及びpTAT−Bcl2Δ−V5−6xHis(Amp):HIVのインフレームTATタンパク質形質導入ドメイン(RKKRRQRRR)(配列番号:5)をコードするフォワードプライマーを用いて、ヒトcMyc又はヒトBcl2をコードするcDNAのPCR増幅によって、プラスミドを作製した。PCR産物をpET101/D−Topo(Invitrogen)ベクターにクローニングした。Quick Change部位特異的突然変異誘発キット(Stratagene #200521−5)を用いて、BCL−2コード配列から非構造化ループ(A.A.#27−80)を取り出した。
タンパク質をE.coli内で合成し、均一になるまで精製した。SDS−PAGE電気泳動及びクマシー染色により、我々の実験で用いた最終産物の純度が明らかとなった(図1B)。pTAT−Myc−V5−6×Hisで、BL21−STAR(DE3)細胞(Invitrogen)を形質転換し、0.5mM IPTGを用いて37℃において3時間、タンパク質を誘導した。細胞を、溶解用緩衝液(8M尿素、100mM NaH2PO4、10mMトリスpH 7.0まで、10mMイミダゾール、pH 7.2)中で溶解した。溶解物を6M尿素で希釈し、450mM NaCl、50mM NaHPO、5mMトリスpH 7.0にした。溶解物を、室温にて1時間、Benzonase(500単位)で処理し、12,000RPMで60分間、遠心分離によって清浄化し、22μMのフィルターを通した。Myc−V5−6×Hisを、GE AKTA purifier 10 FPLCを用いてニッケルアフィニティカラム(GE)で精製した。Myc−V5−6×Hisを、透析用緩衝液(450mM NaCl、50mM NaHPO、5mMトリスpH 7.0、5%グリセロール、1mM DTT)に透析することによってリフォールディングした。精製タンパク質をActiclean Etoxカラム(Sterogen)に通すことによって、エンドトキシンを減少させた。
Bcl2Δ−V5−6×Hisタンパク質を上記のように誘導した。細胞を、1Lの誘導タンパク質当たり、500単位のBenzonase、1mMのPMSF、2μg/mLのロイペプチン、0.015単位/mLのアプロチニン、5μMの鶏卵リゾチーム(HEL)を補充した、50mLの溶解用緩衝液(200mM NaCL、200mM KCL、50mM NaHPO、5mMトリスpH 7.0、5%グリセロール、1mM DTT)に溶解し、直ちに氷上に1時間置いた。細胞を、2分間ずつ2回、氷上で超音波処理した(デューティー比=50%、出力=5)。溶解物を、12,000RPMで60分間、遠心分離によって澄明にし、0.22μMのフィルターを通した。Bcl2Δ−V5−6×Hisをニッケルアフィニティカラム(GE)で精製し、上述のようにエンドトキシンを除去した。
実施例2:Tat−融合タンパク質の適切な局在性の確認
融合タンパク質は、適切な細胞内区画(図1C)に局在する。NIH 3T3細胞を、6ウェルプレート中でカバーガラス上に播種し、30〜40%のコンフルエンスまで増殖した。各ウェルを、10μg/mLのTat−Myc若しくはTat−Bcl−2で形質導入し、又は陰性対照として処理しなかった。タンパク質形質導入の2時間後、細胞を、4%パラホルムアルデヒド−PBS中で10分間室温(RT)にて固定した。細胞を、1%ウシ血清アルブミン(BSA)及び0.1% Triton X−100を補充したPBS中で、RTにて3分間透過処理した。V5マウスモノクローナル抗血清(Invitrogen)をPBS−1% BSAで希釈したもの(1:1,000)で、細胞を45分間インキュベートした。細胞を洗浄し、ヤギ抗マウスAlexa 488二次抗体(Invitrogen A21121)と共に30分間インキュベートした。カバーガラスを、50%グリセロールの10μLの液滴と、1μg/mLのHoechstと共に、スライドガラス上に乗せた。Zeiss Imager Z1蛍光顕微鏡で画像を得た。
Tat−Mycは、迅速に初代ヒトHSCの核に局在した(図1D)。Tat−融合タンパク質は、HSC中で72時間後に完全に分解される(図1E)。胎児臍帯血細胞に、Tat−Myc及びTat−Bcl2Δを1時間形質導入し、その後3回PBSで洗浄した。形質導入2時間後、5×10個の細胞を回収し、核及び細胞質画分を単離した。続く5日間、24時間毎に細胞(5×10個)を回収した。核及び細胞質タンパク質を、10mM HEPES(pH 7.6)、10mM NaCl、3mM CaCl、及び0.5% NP40に細胞を溶解することによって調製した。核を沈殿させ、細胞質を含有する上清画分をトリクロロ酢酸(TCA)と共に沈殿させた。SDS−PAGEに続き、抗V5抗体(Invitrogen)、抗ヒトβ−アクチン(abcam)、及びヤギ抗ウサギIgG−HRP又はヤギ抗マウスIgG−HRP(Santa Cruz Biotechnology)を用いるウエスタンブロットによって検査した。
実施例3:Tat−融合タンパク質を用いる細胞の生存及び増殖
処理を行わずに、活性化マウスCD4+T細胞を、サイトカイン欠乏後のアポトーシスに進める。Tat−Myc及びTat−Bcl−2は、活性化初代CD4+T細胞を、サイトカイン休薬によって誘発されたアポトーシスから用量依存的に救済する(図2A及び2B)。Tat−Mycの存在下で活性化された初代マウスCD4+T細胞は、Tat−Cre存在下で活性化された細胞と比較するとき、しっかりとした増殖を示した(図2C及び2D)。
全てのマウスは、University of Colorado School of MedicineのInstitutional Animal Care and Users Committeeによって承認された実験プロトコール(プロトコール番号B−87709(03)1B−1及び87709(09)2E)に従って処理した。安楽死させたC57BL/6Jマウス(Jackson Laboratory)から脾臓を採取し、機械的に分離させることによって単一の細胞懸濁液を得た。細胞を、TAC緩衝液(135mM NHCL、17mMトリスpH 7.65)で処理して、赤血球を溶解した。T細胞を、1mg/mLの抗CD3(モノクローナル抗体2C11)を補充したC10培地(500mL瓶のRPMI 1640、10% FBS、100単位/mLのペニシリン/ストレプトマイシン、2mM L−グルタミン、10mM Hepes、MEM非必須アミノ酸0.55mM、β−メルカプトエタノール1mM、ピルビン酸ナトリウム100mM)中で、2日間活性化した。リンパ芽球の生細胞をFicolクッション上に回収し、Tat融合タンパク質を含む、又は含まない完全培地中で1ウェル当たり1×10個の細胞として、24ウェルのディッシュウェル内に播種した。CFSEのフローサイトメトリー分析によって細胞分裂特性を判定した。
実施例4:Tat−Myc及びTat−Bcl−2によるマウスHSCの増殖
4〜6週齢の雌性C57BL/6Jマウスのコホートを、Jackson Laboratories(Bar Harbor、ME)から入手した。5mg/マウスの5−フルオロウラシル(5FU)を用いて、マウスの静脈内に投与した。5FU処理5日後に、頚骨及び大腿骨から骨髄(BM)細胞を採取した。5mLの無菌TAC緩衝液(135mM NH4CL、17mMトリスpH 7.65)中でインキュベートすることによって、赤血球を溶解した。5μg/mLの組み換えTat−Myc及び10μg/mLの組み換えTat−Bcl−2を補充したBM培地(15% FCS、100単位/mLのペニシリン/ストレプトマイシン、MEM NEAA(Gibco)、10mM HEPES、組み換えマウスIL−3、IL−6、及びSCFを含むDMEM)中で、骨髄細胞を増殖させた。
D10培地(DMEM、10%FBS、100単位/mLのペニシリン/ストレプトマイシン、MEM NEAA(Gibco)、2mM L−グルタミン(Gibco))中、プレート当たり12×106個の細胞において、150mmのプレートに293FT細胞をプレーティングすることによって、サイトカインを調製した。リン酸カルシウムを用いて、10μgのpcDNA3.1−SCF、10μgのpcDNA3.1−IL3、及び10μgのpcDNA3.1−IL6、又は10μgのpcDNA3.1−TPO、10μgのpcDNA3.1−Flt3−L、及び10μgのpcDNA3.1−GM−CSFからなる、プレート当たり合計30μgのDNAを細胞に形質移入した(Young,R.M.,et al.(2008).B−cell receptor signaling in the genesis and maintenance of B−cell lymphoma.Future Oncology,4,591〜4.)。翌日、培地を除去して、100mLのD10培地に交換した。37℃/5% CO2で、細胞を4〜5日間インキュベートした。培地を回収し、濾過滅菌して、30mLの部分標本にして−20℃で凍結した。
Tat−融合タンパク質を新しくするために48時間毎にBM培地を交換しながら、28日間細胞を培養した。対照として、サイトカイン及びTat−Creを含む培地中で、骨髄細胞を培養した。図3A及び表1は、培養28日間後に得られたHSC集団のフローサイトメトリーによる特性を示す。FACS分析は、Sca−1/c−kit集団(lin−)が引き続き濃縮されているが、他の全ての細胞種は28日間で減少したことを示す。
Figure 0006573868
Tat−Myc及びTat−Bcl−2処理細胞は、高レベルのc−Kit及びSca−1を発現し、系統マーカーに陰性である(表2)。
Figure 0006573868
加えて、CFSEによる細胞画分の標識化によって、これらの培養条件下で維持されるとき、HSCが活発に増殖することを示す(図3B)。HSCの全体的な増殖特性を図3C及び表1に示すが、最終的には28日間培養するとマウスHSCの269倍の増殖が得られる。
実施例5:Tat−Myc及びTat−Bcl−2で増殖させたマウスHSCの移植
少数のインビトロで増殖させたHSCを、致死量以下で照射されたRag−1−/−マウスに移植した。Rag1−/−マウス(Jackson Laboratory)への移植は、Rag1−/−マウスが、BM細胞を尾静脈から注入される直前に、350ラドの放射線を照射された以外は、NSGマウスについて記載された方法で行った。
移植4週間後、成熟T及びB細胞の存在についてマウスを調べた。10、100、又は1000個のインビトロで増殖させたHSCの移植後、成熟した、B220/CD19を発現しているB細胞、及びTCBβ/CD4を発現しているT細胞が、HSCキメラマウスの末梢血中に存在していた(図4A、4B、及び表3)。
Figure 0006573868
成熟T及びB細胞は、HSCキメラマウスのリンパ節、脾臓、胸腺及び骨髄中にも検出された(図4C)。
キメラマウスの脾臓から得られた成熟マウスT及びB細胞をCFSEで標識し、CD3(T細胞)又はCD40及びIgM(B細胞)に対するモノクローナル抗体で活性化した。抗原受容体を通して活性化された後に、成熟リンパ系細胞が破裂して細胞分裂を起こすことができた(図4D)。更に、初期セットのHSCキメラマウスから得られた骨髄細胞を、連続移植実験に用いた。表4は、連続的に移植されたRag−1−/−マウスの末梢血中に検出された、成熟T及びB細胞の頻度を示す。
Figure 0006573868
実施例6:Tat−Myc及びTat−Bcl−2によるヒト臍帯血由来HSCの増殖
地元の臍帯血バンクが廃棄したサンプルから、新鮮な臍帯血細胞を入手した。ヒト細胞を全て匿名化し、IRBの監視を免除した。臍帯血は、O+、O−、A+、A−、B+、B−、及びAB+を含んでおり、これらの全てはほぼ同じ増殖特性を示した。
総臍帯量を20mLの一定分量に分け、PBSで1:1に希釈した。希釈した臍帯血(20mL)を、20mLのFicoll−Paque Plus(Amersham Biosciences Cat# 17−1440−03)に静かに重層した。細胞を900×gで60分間遠心した。ガラス製ピペットでバフィーコートを除去し、PBSで2回洗浄した。細胞を、FCB培地(10%のヒト血漿、100単位/mLのペニシリン/ストレプトマイシン、30mLのSCF、IL3及びIL6を含有する培地、並びに、30mLのTPO、FLT3−L、及び上記GM−CSFを含有する培地を補充したイスコフ培地(Gibco))に再懸濁した。胎児臍帯血(FCB)細胞に添加する直前、FCB培地に、5μg/mLの組み換えTat−Myc、及び10μg/mLの組み換えTat−Bcl−2を更に補充した。増殖期間中、3日毎に培地を交換した。
サイトカイン混合物は、IL3、IL6、TPO、Flt3−L、SCF、及びGM−CSFを含んでおり、これら6つのサイトカインを組み合わせる以前に報告された培地(Suzuki,T.,et al.(2006)Stem Cells 24,2456〜65)と、並びに、組み換えTat−Myc及びTat−Bcl−2を添加することによって異なっている。インビトロで増殖させたヒトHSCの表面表現型を評価すると、Tat−Myc及びTat−Bcl−2の存在下で長期間培養した後に、ヒトHSCがその表面特性を維持していることがわかった(図5A)。この条件群は、培養14日間でCD34+細胞の数が86.4倍に上昇し、培養21日間で未分画臍帯血由来のヒトCD34+細胞の数が103.8倍に上昇する結果をもたらした(図5B)。
実施例7:Tat−Myc及びTat−Bcl−2によって増殖させたヒトCB HSCは、インビトロ及びインビボで生物学的に活性である
インビトロで増殖させたヒトHSCを、MethoCult Optimum(StemCell Technologies)にプレーティングし、特定のコロニータイプを生じさせる能力について調べた。インビトロで増殖させたヒトHSCは、CFU−G、CFU−M、CFU−GM及びBFU−Eコロニーを生じさせることができる(図5C及び5D)。加えて、Tat−Myc及びTat−Bcl−2の存在下で増殖したHSCの表面表現型は、培養中保存されていたが、これらの条件下では、コロニー形成単位の量が顕著に濃縮された(図5D)。Tat−Myc及びTat−Bcl−2の存在下で増殖したCD34+細胞は、新たなBFU−E、CFU−M、CFU−G及びCFU−GMコロニーを生じさせることもできたが、一方、培地のみで培養されたCD34+細胞は新たなコロニーを生じさせなかった(図5E)。
インビトロで増殖したヒトCD34+細胞の、インビボで成熟ヒト造血性系統を生じさせる能力を検査する実験のため、レシピエントとしてNOD/SCID/gc−/−マウス(NSG)マウスを使用した。これは、この目的で有用な、確認されたマウスモデルである(Tanaka,S.,et al.(2012).Development of mature and functional human myeloid subsets in hematopoietic stem cell−engrafted NOD/SCID/IL2rgKO mice.J Immunol 188,6145〜55。)。
胎児臍帯血細胞(FCB)を、投与直前に180ラドの照射を受けたNOD/SCID/gc−/−マウス(NSG)マウス(Jackson Laboratory)に投与した。増殖したFCBをPBSで3回洗浄し、200μLのPBSにおいて尾静脈から投与した。移植8週間後、マウスの尾静脈から出血させ、抗ヒトCD3(hCD3)(Biolegend Cat# 300312)、抗ヒトCD19(hCD19)(Biolegend Cat# 302208)、及び抗ヒトCD45(hCD45)(Biolegend Cat# 304028)を用いて、フローサイトメトリーによって再構成について評価した。
1×107個の未分画臍帯血細胞を用いて、NSGキメラマウス中で産生されたヒトCD45+を発現するT及びB細胞が、短時間で成長することが観察された。しかしながら、Tat−Myc及びTat−Bcl−2と共に14日間培養することによってインビトロで産生された、1×106個のタンパク質を形質導入した長期(ptlt)−HSCを誘導すると、異種キメラNSGマウスにおいてヒトCD45+細胞がより高頻度であるという結果となった。加えて、ヒトCD45+細胞は、移植後20週間までマウスの末梢血中に観察できた(図6A)。ヒトCD45+、CD34+CD38lo HSCは骨髄中に見られ(図6B)、ヒトCD45+/CD3+及びヒトCD45+/CD19+リンパ系細胞は脾臓中に見られ、ヒトCD45+、CD3+リンパ系細胞は異種キメラマウスの胸腺中に見られた。
異種キメラNSGマウスの脾臓由来のヒトCD45+CD19+細胞を、CFSEで標識し、ヒトCD40及びIgMに対するモノクローナル抗体で活性化した。72時間目に、フローサイトメトリーでCFSEの希釈について細胞を分析した。図6Cは、異種キメラNSGマウスにおいてインビボで発生したヒトB細胞の増殖特性を示す。
異種キメラNSGマウスの骨髄由来のヒトCD45+、CD34+CD38lo HSCを用いて、MethoCult Optimumに播種した。これらの細胞は、MethoCultプレートにおいてコロニーを生じ(図6D)、一部のコロニーは、連続して再プレーティングした後でも観察できた(図6E)。両方の場合においてコロニー数は、Tat−Myc及びTat−Bcl−2と共に14日間培養されたヒト臍帯血細胞で再構成されたNSGマウスの方が、新鮮な未操作のヒト臍帯血細胞で再構成されたNSGマウスで観察された細胞よりも顕著に高かった。
加えて、Tat−Myc及びTat−Bcl−2を加えたサイトカイン混合物中において、インビトロで予め増殖させた106個の臍帯血細胞(黒四角)を移植された異種キメラマウスコホートを、骨髄系リンパ系細胞分化について評価した。骨髄細胞(図6F)及び脾臓細胞(図6G)のCD45陽性集団を、CD11b、CD33、CD3、及びCD19の発現について解析した。これら異種キメラマウスの骨髄及び脾臓中で、骨髄系及びリンパ系の両方の細胞において分化が観察された。
実施例8:Tat−Myc及びTat−Bcl−2によるヒトG−CSF動員済み末梢血HSCの増殖
自家HSC移植のためにG−CSF動員を受けた5人の患者の浄化血液1mLから、G−CSF動員細胞を入手した。全てのG−CSFサンプルを再識別し、これらの試験に用いた細胞に関する更なる識別情報を関連付けなかった。10mLのFCB培地に細胞を滴下した。この細胞をFCB培地で2回洗浄し、10mL量中、5μg/mLの組み換えTat−Myc及び10μg/mLの組み換えTat−Bcl−2で処理した。細胞(5×10個)を、G−Rex 100細胞増殖用容器(Wilson Wolf Manufacturing)に、製造業者の推奨に従って播種した。
この細胞を、サイトカインにTat−Myc及びTat−Bcl2を加えた培地中で14日間増殖させた。増殖したHSCのFACS特性は、hCD45+、CD34+、CD38hi、CD133+の、異なった細胞集団を示す(図7A)。細胞の増殖速度を図7Bに示す。
成人型GCS−Fで動員したHSCの増殖したものを、MethoCult Optimumにプレーティングし、インビトロでの分化能の特徴を確認した。骨髄赤血球分化を支持する培地において通常見られる4種類のコロニータイプが観察され(図7C)、これらのコロニータイプのうち一部は、連続して再プレーティングしても見られた。
増殖した成人HSCは、致死量以下で照射されたNSGマウスを再構成することができた。図7Dは、12週間前に、106個の増殖したG−CSF及びTat−Myc/Tat−Bcl−2動員HSC(1つ目の図)、又は5×106個の新鮮な未操作臍帯血細胞(2つ目の図)のいずれかを移植されたNSGマウスの骨髄における、CD45+染色のFACS分析を示す。
Tat−Myc及びTat−Bcl−2と共に培養されたG−CSF動員細胞によって作製されたNSG異種キメラマウスを安楽死させ、更なる分析のために骨髄、脾臓及び胸腺を採取した。増殖させた成人HSCで再構成した異種キメラNSGマウス由来のリンパ系器官を分析すると、これらマウスの骨髄(図7E;1つ目の図)中にヒトCD45+、CD34+CD38lo細胞があり、脾臓(図7E;2つ目の図)及び胸腺(図7E;3つ目の図)中にヒトCD45+、CD3+リンパ系細胞があることを示した。これらのデータを合わせると、ヒトG−CSFで動員した成人の血液から得られたHSC集団の増殖に成功できることが示される。
Tat−Myc及びTat−Bcl−2を加えたサイトカイン混合物中においてインビトロで増殖させた10個の増殖済みのG−CSF動員細胞(黒四角)を移植した異種キメラマウスのコホートを、骨髄系リンパ系細胞分化について評価した。骨髄細胞(図7F)及び脾臓細胞(図7G)CD45陽性集団を、CD11b、CD33、CD3、及びCD19の発現について解析した。これら異種キメラマウスの骨髄及び脾臓中で、骨髄系及びリンパ系の両方の細胞において分化が観察された。更に、フローサイトメトリーでCFSEの希釈によって特定されたように(図6C)、初代異種移植(xenotranplant)由来の成熟ヒトB細胞は、インビトロで抗原受容体の刺激に応答した。初期連続移植によって発生した成熟ヒトB細胞を、インビトロにおいてIgM及びCD40に対する抗体で活性化したとき、同様の観察結果が得られた(図8)。
この方法は、現状の方法(Sideri,A.,et al.(2011).An overview of the progress on double umbilical cord blood transplantation.Hematologica 96,1213〜20。)による平均的な大きさの成人の移植に必要な、十分な数のHSCを産生できる。
実施例9:生物学的に活性なMyc融合タンパク質の作製
実施例1に記載されるTat−Myc融合タンパク質に加え、同実施例に記載のものと同じ方法を使用して、5種類のMyc融合タンパク質を作製して精製した。インフレームN末端PTD−アミノ酸配列を含むフォワードプライマー及び終止コドンを除去したリバースプライマーを用いて、コード領域をPCR増幅することによって、プラスミドを作製した。その後、C末端V5エピトープ及び6×ヒスチジン精製タグを含む、pET101/D−Topo(Invitrogen)ベクターに、PCR産物をクローニングした。図9Aは、実施例1のTat−Mycと比較した、Myc融合タンパク質の図式表示を示す。それぞれにおいて、タンパク質形質導入(PTD)を、Mycポリペプチドの前又は後にインフレームで融合する。
タンパク質形質導入ドメインは、Tat、EPTD、及びVprを含んだ。EPTDは、Ho,A.et al.(Synthetic protein transduction domains:enhanced transduction potential in vitro and in vivo.Cancer Res.(2001)61:474〜477)が選び取った最適化タンパク質形質導入ドメイン(YARAAARQARA、配列番号:6)である。Vpr形質導入ドメインは、Taguchi,T.et al.(Nuclear trafficking of macromolecules by an oligopeptide derived from Vpr of human immunodeficiency virus type−1.Biochem.Biophys.Res.Commun.(2004)320(1):18〜26)によって同定された。
Mycは、実施例1に記載されるポリペプチドのORF、又は、以前Huang,Z.et al.(Negative control of the Myc protein by the stress−responsive kinase Pak−2.Mol Cell Biol(2004)24(4):1582〜94)によって説明された3AMyc配列のいずれかとした。組み換えタンパク質は、V5ペプチドタグ及び6−Hisタグもコードしており、検出及び精製を促進した(図9A)。
実施例10:活性化T細胞の生存アッセイ
実施例9に記載されるMyc融合タンパク質(Tat−Myc、Tat−3AMyc、EPTD−Myc、Vpr−Myc、及びMyc−Vpr)のMycの生物学的活性について、活性化T細胞生死判別アッセイにおいて調べた(図9B)。C57BL.6j(Jackson)マウスから脾臓を回収し、ワイヤーメッシュ(wire mess)を通して機械的に分離した。赤血球を除去し、1μg/mLの抗CD3(2c11)でT細胞を活性化した。細胞を、24ウェル多穴ディッシュに、1mLの培地中1ウェル当たり3×10^6個の細胞でプレーティングした。48時間後、生細胞をFicolクッション上に捕捉して洗浄し、24ウェル多穴ディッシュに、1ウェル当たり1〜1.5×10^6個の細胞でプレーティングした。PTD−Mycタンパク質を、T細胞に対して、0.5、1、5、10、25、又は50μg/mLでタイトレーションした。PTD−Mycタンパク質処理48時間後、細胞をフローサイトメトリーによって生存率について評価した(前方×側方錯乱)。図9Bにおいて示されるデータは、25μg/mLタンパク質処理のものである。
図9Bに示されるように、Tat−3AMyc以外の調べた構築物は全て、未処理対照よりも48時間後のT細胞の生存率が高かった。しかしながら、実施例1に記載したTat−MycよりもT細胞の生存率が高い構築物は得られなかった。
同様の実験における、様々な濃度におけるTat−Myc及びTat−Bcl−2の活性を、以下の表5に示す。C57BL.6j(Jackson)マウスの脾臓由来のT細胞を、1μg/mLの抗CD3(2c11)で活性化する。活性化後(48時間後)、細胞を洗浄して約1〜1.5×10個の細胞/ウェルでプレーティングし、融合タンパク質(Tat−Myc又はTat−Bcl−2)を様々な濃度(0.5、1、5、10、25、又は50μg/mL)で加えた。48時間後、以下の表5に示すように、生細胞の割合をフローサイトメトリー(前方×側方散乱)で決定した。
Figure 0006573868
Tat−Myc及びTat−Bcl−2の両方で、並びに調べた全ての濃度において、いずれの融合タンパク質も含まずにインキュベートした細胞と比較して、細胞生存率及び/又は増殖が上昇する。
同じ方法を用いた別の実験において、図10は、50μg/mLの融合タンパク質で処理した活性化T細胞に関するライブゲートのFACSデータを示し、Tat−Bcl−2及びTat−Mycを対照(TAT−Cre又は未処理)と比較する。示されるように、Tat−Myc及びTat−Bcl−2の処理両方によって、T細胞の生存及び/又は増殖を顕著に改善する結果が得られる。
実施例11:CD34+増殖に対するサイトカイン混合物の評価
基本培地中の様々なサイトカイン混合物の、幹細胞の生存及び/又は増殖を支持する能力について試験を行った。
0日目、単核性細胞を濃縮して赤血球を除去するために、臍帯血をFicoll勾配に重層した。その後細胞を洗浄し、StemSpan培地のみ、又は以下の表6に示す様々なサイトカインの組み合わせを含めてインキュベートした。
サイトカインを産生させるため、D10培地(DMEM、10%FBS、100単位/mLのペニシリン/ストレプトマイシン、MEM NEAA(Gibco)、2mM L−グルタミン(Gibco))中、プレート当たり12×106個の細胞において、150mmのプレートに293FT細胞をプレーティングした。リン酸カルシウムを用いて、10μgのpcDNA3.1−SCF、10μgのpcDNA3.1−IL3、及び10μgのpcDNA3.1−IL6、又は10μgのpcDNA3.1−TPO、10μgのpcDNA3.1−Flt3−L、及び10μgのpcDNA3.1−GM−CSFからなる、プレート当たり合計30μgのDNAを細胞に形質移入した。翌日、培地を除去して、100mLのD10培地に交換した。37℃/5% COで、細胞を4〜5日間インキュベートした。培地を回収し、濾過滅菌して、30mLの部分標本にして−20℃で凍結した。培地ボトル500mL当たり、30mLの、IL3、IL6、SCFの3種のサイトカインを含む条件培地、及び、30mLの、TPO、Flt3−L、GM−CSFを含む条件培地を加えることによって、増殖培地にサイトカインを添加した。
4、7、10、13、16、及び19日目、サンプルを採取し、標準的な手法を用いてフローサイトメトリーでCD34+細胞の割合を決定した。0日目の後は、サイトカインを再補充しなかった。表6に示されるように、StemSpan培地+Il−3、Il−6、TPO(トロンボポエチン)、Flt3−L、及びGM−CSFの組み合わせは、最も良好な細胞の生存及び増殖を示した(例えば13日目を参照)。
Figure 0006573868
Tat融合タンパク質(TMTB)を含む又は含まない、基本培地中の様々なサイトカイン混合物の、幹細胞の生存及び/又は増殖を支持する能力について試験を行った。
臍帯血をFicol密度勾配上で調製し、赤血球を除去した。20,000個の有核細胞を、24ウェルディッシュのウェル内にプレーティングした。幹細胞因子、IL3、及びIL6(S36);S36+5μg/mLのTat−Myc及び5μg/mLのTat−Bcl2;TPO、幹細胞因子(Stem Cell Fact)、Flt3−L、IL3、及びIL6(TSF36);TSF36+5μg/mLのTat−Myc及び5μg/mLのTat−Bcl2;TPO、幹細胞因子、Flt3−L、IL3、IL6、GM−CSF(TSF36G);並びに、TSF36G+5μg/mLのTat−Myc及び5μg/mLのTat−Bcl2、を含むStemSpanに、細胞を播種した。培地及びTat−融合タンパク質を3日毎に交換した。13日目にフローサイトメトリーによって、CD34陽性系統陰性HSCについて細胞を評価した。
図11に示されるように、TSF36G+融合タンパク質は、最も高い生存率及び増殖をもたらした。別の実験では、このサイトカイン+融合タンパク質の組み合わせは、コロニー形成アッセイ及び異種キメラマウスのインビボ再構成において、融合タンパク質を含まないサイトカイン混合物から得られた細胞よりも、顕著に優れた細胞を産生することが示された(図12〜14)。
異種キメラマウスのインビボ再構成実験では、臍帯血細胞をFicol勾配上で調製した。バフィーコートを除去し、細胞をPBSで3回洗浄した。10%のヒト血漿、100単位/mLのペニシリン/ストレプトマイシン、30mLのSCF、IL3及びIL6を含有する培地、並びに、30mLのTPO、FLT3−L、及びGM−CSFを含有する培地、を補充したイスコフ培地(Gibco)からなるFCB(胎児臍帯血)培地に、臍帯血細胞の半分を播種した。上記に加え、5μg/mLの組み換えTat−Myc及び5μg/mLの組み換えTat−Bcl−2を更に補充したFCB培地に、細胞の残りの半分を播種した。
細胞を11日間増殖させた。13日目、細胞を遠心し、10mLの新しいFCB培地に再懸濁した。元々Tat−Myc及びTat−Bcl2で処理した細胞を、5μg/mLの組み換えTat−Myc及び5μg/mLの組み換えTat−Bcl−2によって、37度で1時間再度処理した。両方のFCB細胞集団を、マウスに投与するためにPBSで3回洗浄した。
増殖させた細胞を、投与直前に180ラドの照射を受けたNOD/SCID/gc−/−マウス(NSG)マウス(Jackson Laboratory)に投与した。200μLのPBS中の増殖させた細胞を、尾静脈からNSGマウスに投与した。移植8週後、骨髄(BM)、脾臓、及び胸腺のヒトHSCの再構成について、フローサイトメトリーによって評価した(図12〜14)。移植に先立ってTat−Myc及びTat−Bcl2で前処理した各組織由来の細胞は、融合タンパク質で前処理しなかった細胞と比較して、ヒトCD45+細胞の顕著な増加を示した。
実施例12:Bcl−2の評価
3T3細胞に、Tat−Bcl2を1時間形質導入し、その後3回PBSで洗浄した。形質導入2時間後、細胞をトリプシン処理し、数えてから、5×10個を回収した。核及び細胞質画分を単離した。続く5日間、24時間毎に5×10個の細胞を回収した。核及び細胞質タンパク質を、10mM HEPES(pH 7.6)、10mM NaCl、3mM CaCl、及び0.5% NP40に細胞を溶解することによって調製した。核を沈殿させ、細胞質を含有する上清画分をトリクロロ酢酸(TCA)と共に沈殿させた。抗V5抗体(Invitrogen)及びヤギ抗マウスIgG−HRP(Santa Cruz Biotechnology)を用いてウエスタンブロットを調べた。
24及び48時間において、細胞質画分中にTat−Bcl2が観察された。そのシグナルは、形質導入72時間後までに減少し始め、96時間時点では見られなかった。
Tat−Bcl2、Tat−Bcl2Δ、EPTD−Bcl2、VPR−Bcl2、VPR−Bcl2Δ、及びVPR−BclXLを発現するプラスミドを作製した。pPTD−Bcl2−V5−6×His(Amp):インフレームPTD(Tat、EPTD又はVPR)タンパク質形質導入ドメインをコードするフォワードプライマーを用いて、ヒトBcl2をコードするcDNAをPCR増幅することによって、プラスミドを作製した。PCR産物をpET101/D−Topo(Invitrogen)ベクターにクローニングした。Bcl2を産生するため、Δ Quick Change部位特異的突然変異誘発キット(Stratagene #200521−5)を用いて、BCL−2コード配列から非構造化ループ(A.A.#27−80)を取り出した。上記PTD−Bcl2と同様の方法であるが、Bcl2ではなくヒトBclXLのcDNAを用いて、VPR−BclXLを作製した。
本願では、本開示の観点から当業者には当然のことながら、特に定めのない限り、又はその単数形が唯一の機能的実施形態でない限り、単数形の使用は複数形を含み得る。したがって、例えば、「a」は2つ以上を意味する場合があり、「一実施形態」は、その説明を複数の実施形態に適用することを意味する場合がある。
参照による組み込み
特許、特許出願、論文、教科書などを含む、本明細書に引用される全ての参考文献、及びその中で引用されている参考文献は、既に引用されていない限り、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。定義された用語、用語の用法、記載された技術などを非限定的に含む、組み込まれた文献及び同様の資料のうち1つ又はそれ以上が本願と異なる又は矛盾する場合、本願が優先する。
等価物
上記説明及び実施例は、特定の実施形態について詳述している。しかしながら、上記内容が本文中でいかに詳細に見えようとも、本発明は多くの様式で実施され得ること、並びに本発明は添付の請求項及びその任意の等価物に従うと解釈されるべきであることが理解されるであろう。

Claims (22)

  1. a)細胞の生存又は増殖のうち1つ又はそれ以上を促進する外因的に合成されたMyc融合ポリペプチドと、
    b)アポトーシスを阻害する外因的に合成されたBcl−2ドメイン融合ポリペプチドと共に、
    1つ又はそれ以上の成体造血幹細胞を培養培地中に提供することを含む、条件的不死化成体造血幹細胞集団を産生する方法であって、
    前記Myc融合ポリペプチド及び前記Bcl−2ドメイン融合ポリペプチドが、少なくとも24時間の間隔で前記1つ又はそれ以上の成体造血幹細胞に供給され、前記Myc融合ポリペプチドが、少なくとも24時間、前記細胞に連続的に供給されて、条件的不死化成体造血幹細胞集団を産生し
    前記Myc融合ポリペプチドが、タンパク質形質導入ドメインと融合したc−Mycポリペプチドを含み、前記c−Mycポリペプチドが、細胞の生存、細胞の不死、細胞の成長及び/又は細胞の増殖を誘導し、
    ここで、前記Bcl−2ドメイン融合ポリペプチドが、タンパク質形質導入ドメインと融合しており、かつ、非構造化ループドメインを欠いている切断型のBcl−2ポリペプチドを含む、方法。
  2. 前記Myc融合ポリペプチドが、少なくとも72時間の間隔で供給され、かつ前記Bcl−2ドメイン融合ポリペプチドが、少なくとも72時間の間隔で供給される、請求項1に記載の方法。
  3. 前記Myc融合ポリペプチドが、培養培地中に約1μg/mL〜約50μg/mLの濃度で供給される、請求項1に記載の方法。
  4. 前記Bcl−2ドメイン融合ポリペプチドが、培養培地中に約1μg/mL〜約50μg/mLの濃度で供給される、請求項1に記載の方法。
  5. 前記Bcl−2ドメイン融合ポリペプチドが、BH1、BH2、BH3、及びBH4を含む、請求項1に記載の方法。
  6. 前記Myc融合ポリペプチド及び/又はBcl−2ドメイン融合ポリペプチドのタンパク質形質導入ドメインが、Tat、EPTD、及びvprからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
  7. 前記Myc融合ポリペプチド及び/又はBcl−2ドメイン融合ポリペプチドのタンパク質形質導入ドメインがTatである、請求項1に記載の方法。
  8. 前記Myc融合ポリペプチド及び/又はBcl−2ドメイン融合ポリペプチドのタンパク質形質導入ドメインがEPTDである、請求項1に記載の方法。
  9. 前記Myc融合ポリペプチド及び/又はBcl−2ドメイン融合ポリペプチドのタンパク質形質導入ドメインがvprである、請求項1に記載の方法。
  10. 前記1つ又はそれ以上の成体造血幹細胞が、IL3、IL6、及び幹細胞因子を含む培地中で培養される、請求項1に記載の方法。
  11. 前記1つ又はそれ以上の成体造血幹細胞が、IL3、IL6、幹細胞因子、トロンボポエチン、Flt3−L、及びGM−CSFを含む培地中で培養される、請求項1に記載の方法。
  12. 前記1つ又はそれ以上の成体造血幹細胞が、約28日間かけて約270倍、約14日間かけて約150倍、約21日間かけて100倍、又は約9〜14日間かけて約85倍のうち、1つ又はそれ以上に増殖する、請求項1に記載の方法。
  13. 8時間にわたって1μg/mL以下のMyc融合ポリペプチドが培養培地中に供給される、請求項1に記載の方法。
  14. 前記集団の産生がガス透過性容器内で起こる、請求項1に記載の方法。
  15. 前記Myc融合ポリペプチドが、少なくとも72時間の間隔で供給され、かつ前記Bcl−2ドメイン融合ポリペプチドが、少なくとも96時間の間隔で供給される、請求項1に記載の方法。
  16. 前記Myc融合ポリペプチドが、前記1つ又はそれ以上の成体造血幹細胞に供給された48時間後に前記細胞において検出可能である、請求項1に記載の方法。
  17. 前記Myc融合ポリペプチドが、少なくとも48時間の間隔で供給され、かつ前記Bcl−2ドメイン融合ポリペプチドが、少なくとも48時間の間隔で供給される、請求項1に記載の方法。
  18. a)細胞の生存又は増殖のうち1つ又はそれ以上を促進する外因的に合成されたMyc融合ポリペプチドであって、培養培地中に約1μg/mL〜約50μg/mLの濃度で供給されるMyc融合ポリペプチドと、
    b)アポトーシスを阻害する外因的に合成されたBcl−2ドメイン融合ポリペプチドであって、培養培地中に約1μg/mL〜約50μg/mLの濃度で供給されるBcl−2ドメイン融合ポリペプチドと共に、
    1つ又はそれ以上の成体造血幹細胞を培養培地中に提供することを含む、条件的不死化成体造血幹細胞集団を産生する方法であって、
    前記Myc融合ポリペプチド及び前記Bcl−2ドメイン融合ポリペプチドが、少なくとも24時間の間隔で前記1つ又はそれ以上の成体造血幹細胞に供給され、前記Myc融合ポリペプチドが、少なくとも24時間、前記細胞に連続的に供給されて、条件的不死化成体造血幹細胞集団を産生し
    前記Myc融合ポリペプチドが、タンパク質形質導入ドメインと融合したc−Mycポリペプチドを含み、前記c−Mycポリペプチドが、細胞の生存、細胞の不死、細胞の成長及び/又は細胞の増殖を誘導し、
    ここで、前記Bcl−2ドメイン融合ポリペプチドが、タンパク質形質導入ドメインと融合しており、かつ、非構造化ループドメインを欠いている切断型のBcl−2ポリペプチドを含む、方法。
  19. 前記Myc融合ポリペプチドが、少なくとも48時間の間隔で供給され、かつ前記Bcl−2ドメイン融合ポリペプチドが、少なくとも48時間の間隔で供給される、請求項18に記載の方法。
  20. 前記Myc融合ポリペプチドが、少なくとも72時間の間隔で供給され、かつ前記Bcl−2ドメイン融合ポリペプチドが、少なくとも72時間の間隔で供給される、請求項18に記載の方法。
  21. 前記Myc融合ポリペプチドのタンパク質形質導入ドメインがTatである、請求項18に記載の方法。
  22. 前記Bcl−2ドメイン融合ポリペプチドのタンパク質形質導入ドメインがTatである、請求項18に記載の方法。
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