JP6573868B2 - 成体幹細胞のインビトロでの増殖 - Google Patents

Description

（関連出願の相互参照）
本願は、２０１３年３月１１日出願の米国特許仮出願第６１／７７６，４２２号及び２０１３年３月１２日出願の米国実用特許出願第１３／７９５，６５９号の利益と優先権を主張するものであり、これらの全体が参照として本明細書に組み込まれる。

（政府の権利）
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈによる助成（５Ｒ４４ＨＬ０９１７４０−０３）の下に政府の支援を受けてなされた。政府は本発明について一定の権利を有する。

（配列表、表、又はコンピュータープログラム表の参照）
本願は、電子形式の配列表と共に出願されている。配列表は、２０１４年３月１０日に作成された１０ＫＢのサイズの１０６４１７−０１８２＿Ｓｅｑ＿Ｌｉｓｔ．ｔｘｔという名称のファイルとして提供される。配列表の電子形式中の情報は、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。

（発明の分野）
本明細書に提供されるのは、長期幹細胞、かかる細胞の産生方法、及び様々なタンパク質構築物に関する実施形態である。

長期造血幹細胞（ＬＴ−ＨＳＣ）は、成人の骨髄内に存在し、成熟血球の全レパートリーを生じさせるまれな前駆細胞である。これらの細胞は、全ての血球の区分を維持するのに必須である。幹細胞移植は、特に、血液系腫瘍、自己免疫病、及び免疫不全の有用な補助療法となる場合がある。

いくつかの実施形態では、条件的不死化成体幹細胞集団を産生する方法が提供される。この方法は、細胞の生存又は増殖のうち１つ又はそれ以上を促進する外因的に合成されたＭｙｃポリペプチド、及び、アポトーシスを阻害する外因的に合成されたＢｃｌ−２ドメインポリペプチドによって、１つ又はそれ以上の成体幹細胞を提供することを含んでよい。いくつかの実施形態では、Ｍｙｃポリペプチドは、少なくとも約７２時間間隔で１つ又はそれ以上の成体幹細胞に提供され、Ｂｃｌ−２ドメインポリペプチドは、少なくとも約９６時間間隔で１つ又はそれ以上の成体幹細胞に提供されて、条件的不死化成体幹細胞集団を産生する。いくつかの実施形態では、Ｂｃｌ−２ドメインポリペプチド及び／又はＭｙｃポリペプチドは、１時間に１回以下の頻度で供給される。いくつかの実施形態では、Ｂｃｌ−２ドメインポリペプチド及び／又はＭｙｃポリペプチドは、２時間に１回以下の頻度で供給される。いくつかの実施形態では、Ｂｃｌ−２ドメインポリペプチド及び／又はＭｙｃポリペプチドは、３時間に１回以下の頻度で供給される。いくつかの実施形態では、Ｂｃｌ−２ドメインポリペプチド及び／又はＭｙｃポリペプチドは、４時間に１回以下の頻度で供給される。いくつかの実施形態では、Ｂｃｌ−２ドメインポリペプチド及び／又はＭｙｃポリペプチドは、５時間に１回以下の頻度で供給される。いくつかの実施形態では、Ｂｃｌ−２ドメインポリペプチド及び／又はＭｙｃポリペプチドは、６時間に１回以下の頻度で供給される。いくつかの実施形態では、Ｂｃｌ−２ドメインポリペプチド及び／又はＭｙｃポリペプチドは、７時間に１回以下の頻度で供給される。いくつかの実施形態では、Ｂｃｌ−２ドメインポリペプチド及び／又はＭｙｃポリペプチドは、８時間に１回以下の頻度で供給される。いくつかの実施形態では、Ｂｃｌ−２ドメインポリペプチド及び／又はＭｙｃポリペプチドは、９時間に１回以下の頻度で供給される。いくつかの実施形態では、Ｂｃｌ−２ドメインポリペプチド及び／又はＭｙｃポリペプチドは、１０時間に１回以下の頻度で供給される。いくつかの実施形態では、Ｂｃｌ−２ドメインポリペプチド及び／又はＭｙｃポリペプチドは、１１時間に１回以下の頻度で供給される。いくつかの実施形態では、Ｂｃｌ−２ドメインポリペプチド及び／又はＭｙｃポリペプチドは、１２時間に１回以下の頻度で供給される。いくつかの実施形態では、Ｂｃｌ−２ドメインポリペプチド及び／又はＭｙｃポリペプチドは、１３時間に１回以下の頻度で供給される。いくつかの実施形態では、Ｂｃｌ−２ドメインポリペプチド及び／又はＭｙｃポリペプチドは、１４時間に１回以下の頻度で供給される。いくつかの実施形態では、Ｂｃｌ−２ドメインポリペプチド及び／又はＭｙｃポリペプチドは、１５時間に１回以下の頻度で供給される。いくつかの実施形態では、Ｂｃｌ−２ドメインポリペプチド及び／又はＭｙｃポリペプチドは、１６時間に１回以下の頻度で供給される。いくつかの実施形態では、Ｂｃｌ−２ドメインポリペプチド及び／又はＭｙｃポリペプチドは、１７時間に１回以下の頻度で供給される。いくつかの実施形態では、Ｂｃｌ−２ドメインポリペプチド及び／又はＭｙｃポリペプチドは、１８時間に１回以下の頻度で供給される。いくつかの実施形態では、Ｂｃｌ−２ドメインポリペプチド及び／又はＭｙｃポリペプチドは、１９時間に１回以下の頻度で供給される。いくつかの実施形態では、Ｂｃｌ−２ドメインポリペプチド及び／又はＭｙｃポリペプチドは、２０時間に１回以下の頻度で供給される。いくつかの実施形態では、Ｂｃｌ−２ドメインポリペプチド及び／又はＭｙｃポリペプチドは、２１時間に１回以下の頻度で供給される。いくつかの実施形態では、Ｂｃｌ−２ドメインポリペプチド及び／又はＭｙｃポリペプチドは、２２時間に１回以下の頻度で供給される。いくつかの実施形態では、Ｂｃｌ−２ドメインポリペプチド及び／又はＭｙｃポリペプチドは、２３時間に１回以下の頻度で供給される。いくつかの実施形態では、Ｂｃｌ−２ドメインポリペプチド及び／又はＭｙｃポリペプチドは、２４時間に１回以下の頻度で供給される。いくつかの実施形態では、Ｂｃｌ−２ドメインポリペプチド及び／又はＭｙｃポリペプチドは、３６時間に１回以下の頻度で供給される。いくつかの実施形態では、Ｂｃｌ−２ドメインポリペプチド及び／又はＭｙｃポリペプチドは、４８時間に１回以下の頻度で供給される。

いくつかの実施形態では、Ｍｙｃ融合タンパク質が提供される。この融合タンパク質は、タンパク質形質導入ドメインと、細胞の生存又は増殖のうち１つ又はそれ以上を促進するＭｙｃポリペプチドと、Ｖ５ドメインと、６ヒスチジンエピトープタグと、を含む。

いくつかの実施形態では、幹細胞増殖培地が提供される。この増殖培地は、ＩＬ３と、ＩＬ６と、幹細胞因子と、トロンボポエチン（thrombopoeitin）と、Ｆｌｔ３−Ｌと、ＧＭ−ＣＳＦと、を含む。

いくつかの実施形態では、Ｍｙｃ融合タンパク質が提供される。このＭｙｃ融合タンパク質は、タンパク質形質導入ドメインと、細胞の生存又は増殖のうち１つ又はそれ以上を促進するＭｙｃポリペプチドと、を含む。このＭｙｃ融合タンパク質の半減期は、約６０分間より長い。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される任意のタンパク質をコードする核酸が提供される。

いくつかの実施形態では、本明細書に提供される任意の拡散を含むベクターが提供される。

いくつかの実施形態では、本明細書に提供される任意のベクター又は核酸を含む細胞が提供される。
[本発明1001]
ａ）細胞の生存又は増殖のうち1つ又はそれ以上を促進する外因的に合成されたＭｙｃポリペプチドと、
ｂ）アポトーシスを阻害する外因的に合成されたＢｃｌ−2ドメインポリペプチドと、によって、1つ又はそれ以上の成体幹細胞を提供することを含む、条件的不死化成体幹細胞集団を産生する方法であって、
前記Ｍｙｃポリペプチドが、少なくとも約72時間間隔で前記1つ又はそれ以上の成体幹細胞に供給され、
前記Ｂｃｌ−2ドメインポリペプチドが、少なくとも約96時間間隔で前記1つ又はそれ以上の成体幹細胞に供給されて、条件的不死化成体幹細胞集団を産生する、方法。
[本発明1002]
前記Ｍｙｃポリペプチドが、少なくとも約48時間間隔で供給される、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記Ｍｙｃポリペプチドが、少なくとも約24時間間隔で供給される、本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記Ｍｙｃポリペプチドが連続的に供給される、本発明1001の方法。
[本発明1005]
前記Ｂｃｌ−2ドメインポリペプチドが、少なくとも約72時間間隔で供給される、本発明1001〜1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
前記Ｂｃｌ−2ドメインポリペプチドが、少なくとも約48時間間隔で供給される、本発明1001〜1004のいずれかの方法。
[本発明1007]
前記Ｂｃｌ−2ドメインポリペプチドが、少なくとも約24時間間隔で供給される、本発明1001〜1004のいずれかの方法。
[本発明1008]
前記Ｂｃｌ−2ドメインポリペプチドが連続的に供給される、本発明1001〜1004のいずれかの方法。
[本発明1009]
前記Ｍｙｃポリペプチドが、ｎ−Ｍｙｃ、ｃ−Ｍｙｃ、ｌ−Ｍｙｃ、ｖ−Ｍｙｃ、又はｓ−Ｍｙｃのうち1つ又はそれ以上である、本発明1001〜1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
前記Ｍｙｃポリペプチドが、約1μｇ／ｍＬ〜約50μｇ／ｍＬの濃度で供給される、本発明1001〜1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
前記Ｍｙｃポリペプチドが、約5μｇ／ｍＬの濃度で供給される、本発明1001〜1009のいずれかの方法。
[本発明1012]
前記Ｂｃｌ−2ドメインポリペプチドが、約1μｇ／ｍＬ〜約50μｇ／ｍＬの濃度で供給される、本発明1001〜1011のいずれかの方法。
[本発明1013]
前記Ｂｃｌ−2ドメインポリペプチドが、約10μｇ／ｍＬの濃度で供給される、本発明1001〜1011のいずれかの方法。
[本発明1014]
前記Ｂｃｌ−2ドメインポリペプチドが、ＢＨ1、ＢＨ2、ＢＨ3、及びＢＨ4を含む、本発明1001〜1013のいずれかの方法。
[本発明1015]
前記1つ又はそれ以上のＢｃｌ−2ドメインポリペプチドが、Ｂｃｌ−2、Ｂｃｌ−ｗ、Ｂｃｌ−Ｘ、Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｍｃｌ−1のうち1つ又はそれ以上である、本発明1001〜1014のいずれかの方法。
[本発明1016]
前記1つ又はそれ以上のＢｃｌ−2ドメインポリペプチドが、Ｂｃｌ−2である、本発明1001〜1014のいずれかの方法。
[本発明1017]
前記Ｍｙｃポリペプチド又は前記Ｂｃｌ−2ポリペプチドのうち1つ又はそれ以上が、タンパク質形質導入ドメインを含む、本発明1001〜1016のいずれかの方法。
[本発明1018]
前記タンパク質形質導入ドメインがＴａｔである、本発明1017の方法。
[本発明1019]
前記タンパク質形質導入ドメインがＥＰＴＤである、本発明1017の方法。
[本発明1020]
前記タンパク質形質導入ドメインがｖｐｒである、本発明1017の方法。
[本発明1021]
前記1つ又はそれ以上の成体幹細胞が、ＩＬ3、ＩＬ6、及び幹細胞因子を含む培地中で培養される、本発明1001〜1020のいずれかの方法。
[本発明1022]
前記1つ又はそれ以上の成体幹細胞が、ＩＬ3、ＩＬ6、幹細胞因子、トロンボポエチン、及びＦｌｔ3−Ｌを含む培地中で培養される、本発明1001〜1020のいずれかの方法。
[本発明1023]
前記1つ又はそれ以上の成体幹細胞が、ＩＬ3、ＩＬ6、幹細胞因子、トロンボポエチン、Ｆｌｔ3−Ｌ、及びＧＭ−ＣＳＦを含む培地中で培養される、本発明1001〜1020のいずれかの方法。
[本発明1024]
前記1つ又はそれ以上の成体幹細胞が、約28日間かけて約270倍、約14日間かけて約150倍、約21日間かけて100倍、又は約9〜14日間かけて約85倍のうち、1つ又はそれ以上に増殖する、本発明1001〜1023のいずれかの方法。
[本発明1025]
前記1つ又はそれ以上の成体幹細胞が、1つ又はそれ以上の成体造血幹細胞である、本発明1001〜1024のいずれかの方法。
[本発明1026]
前記成体造血幹細胞が、細胞表面の表現型、インビトロ分化能、照射後の造血系統のインビボ再構成能、又は、連続的に移植される能力のうち、1つ又はそれ以上を特徴とする、本発明1025の方法。
[本発明1027]
前記1つ又はそれ以上の成体造血幹細胞が、臍帯血、胎盤、骨髄、末梢血、動員済み末梢血、又は脂肪組織のうち、1つ又はそれ以上から単離される、本発明1001〜1026のいずれかの方法。
[本発明1028]
前記1つ又はそれ以上の成体造血幹細胞が、胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞由来である、本発明1001〜1026のいずれかの方法。
[本発明1029]
前記1つ又はそれ以上の成体幹細胞がヒト細胞である、本発明1001〜1028のいずれかの方法。
[本発明1030]
前記1つ又はそれ以上の成体幹細胞が非ヒト動物細胞である、本発明1001〜1028のいずれかの方法。
[本発明1031]
タンパク質形質導入ドメインと、
細胞の生存又は増殖のうち1つ又はそれ以上を促進するＭｙｃポリペプチドと、
Ｖ5ドメインと、
6ヒスチジンエピトープタグと、
を含む、Ｍｙｃ融合タンパク質。
[本発明1032]
約60分間より長い半減期を有する、本発明1031のＭｙｃ融合タンパク質。
[本発明1033]
約48時間の半減期を有する、本発明1031のＭｙｃ融合タンパク質。
[本発明1034]
約72時間まで検出可能である、本発明1031のＭｙｃ融合タンパク質。
[本発明1035]
約48時間まで検出可能である、本発明1031のＭｙｃ融合タンパク質。
[本発明1036]
細胞の核内に輸送可能である、本発明1031〜1034のいずれかのＭｙｃ融合タンパク質。
[本発明1037]
前記タンパク質形質導入ドメインがＴａｔである、本発明1031〜1035のいずれかのＭｙｃ融合タンパク質。
[本発明1038]
タンパク質形質導入ドメインがＶｐｒである、本発明1031〜1035のいずれかのＭｙｃ融合タンパク質。
[本発明1039]
タンパク質形質導入ドメインがＥＰＴＤである、本発明1031〜1035のいずれかのＭｙｃ融合タンパク質。
[本発明1040]
ａ）Ｍｙｃポリペプチドにインフレームで連結したタンパク質形質導入ドメイン、
ｂ）Ｖ5ドメインにインフレームで連結したＭｙｃポリペプチド、及び
ｃ）6ヒスチジンエピトープタグにインフレームで連結したＶ5ドメイン、
の順の構成要素を有する、本発明1031〜1038のいずれかのＭｙｃ融合タンパク質。
[本発明1041]
ａ）タンパク質形質導入ドメインにインフレームで連結したＭｙｃポリペプチド、
ｂ）Ｖ5ドメインにインフレームで連結したタンパク質形質導入ドメイン、及び、
ｃ）6ヒスチジンエピトープタグにインフレームで連結したＶ5ドメイン、
の順の構成要素を有する、本発明1031〜1038のいずれかのＭｙｃ融合タンパク質。
[本発明1042]
ＩＬ3と、ＩＬ6と、幹細胞因子と、トロンボポエチンと、Ｆｌｔ3−Ｌと、ＧＭ−ＣＳＦと、を含む、幹細胞増殖培地。
[本発明1043]
基本培地を更に含む、本発明1042の幹細胞増殖培地。
[本発明1044]
細胞の生存又は増殖のうち1つ又はそれ以上を促進するＭｙｃポリペプチドを更に含む、本発明1043の幹細胞増殖培地。
[本発明1045]
アポトーシスを阻害するＢｃｌ−2ドメインポリペプチドを更に含む、本発明1041〜1044のいずれかの幹細胞増殖培地。
[本発明1046]
前記基本培地が、ＳｔｅｍＳｐａｎ、Ｉｓｃｏ培地、ＲＰＭＩ、又はＤＭＥＭのうち、1つ又はそれ以上である、本発明1041〜1045のいずれかの幹細胞増殖培地。
[本発明1047]
ａ）タンパク質形質導入ドメインと、
ｂ）細胞の生存又は増殖のうち1つ又はそれ以上を促進するＭｙｃポリペプチドと、
を含む、Ｍｙｃ融合タンパク質であって、約60分間より長い半減期を有する、Ｍｙｃ融合タンパク質。
[本発明1048]
本発明1031〜1041、及び1047のいずれかのタンパク質をコードする核酸。
[本発明1049]
本発明1048の核酸を含むベクター。
[本発明1050]
本発明1049のベクターを含む細胞。
[本発明1051]
8時間にわたって1μｇ／ｍＬ以下のＭｙｃポリペプチドが供給される、本発明1001の方法。
[本発明1052]
16時間にわたって1μｇ／ｍＬ以下のＭｙｃポリペプチドが供給される、本発明1001の方法。
[本発明1053]
24時間にわたって1μｇ／ｍＬ以下のＭｙｃポリペプチドが供給される、本発明1001の方法。
[本発明1054]
前記集団の産生がガス透過性容器内で起こる、本発明1001の方法。
[本発明1055]
タンパク質形質導入ドメインと、
細胞の生存又は増殖のうち1つ又はそれ以上を促進するＭｙｃポリペプチドと、
短いペプチドドメインと、
を含む、Ｍｙｃ融合タンパク質。
[本発明1056]
前記短いペプチドドメインが、ＨＡタグ、ＦＬＡＧタグ、ＣＢＰ、ＣＹＤ、ＳｔｒｅｐＩＩ、又はＨＰＣのうち少なくとも1つから選択される、本発明1055のＭｙｃ融合。
[本発明1057]
ＩＬ3、ＩＬ6、幹細胞因子、トロンボポエチン、Ｆｌｔ3−Ｌ、及びＧＭ−ＣＳＦを含む幹細胞増殖培地と、
細胞の生存又は増殖のうち1つ又はそれ以上を促進するＭｙｃポリペプチドと、
アポトーシスを阻害するＢｃｌ−2ドメインポリペプチドと、
を含む、ガス透過性容器。
[本発明1058]
前記容器がバッグ又はフラスコである、本発明1057のガス透過性容器。

様々な実施形態の特徴が、特許請求の範囲で詳細に示される。本実施形態の一部の特徴及び利点のより良い理解は、様々な実施形態の原則が利用される、例示的実施形態について記載する以下の詳細な説明と、添付図面を参照することによって得られるであろう。
Ｔａｔ融合タンパク質の作製とインビトロでの特徴についての例示的実施形態を示す。図１Ａは、ＨＩＶ−１ Ｔａｔのインフレームタンパク質形質導入ドメイン及びＶ５及び６×Ｈｉｓタグの位置を含む、Ｔａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ−２融合タンパク質の例示的実施形態の図を示す。 Ｔａｔ融合タンパク質の作製とインビトロでの特徴についての例示的実施形態を示す。図１Ｂは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、クマシーで染色した、Ｅ．ｃｏｌｉから精製した後の組み換えタンパク質の例示的実施形態を示す。 Ｔａｔ融合タンパク質の作製とインビトロでの特徴についての例示的実施形態を示す。図１Ｃは、精製した組み換えＴａｔ−Ｍｙｃ、Ｔａｔ−Ｂｃｌ−２に２時間曝露し、又は未処理のまま（ＮＴ）とし、固定後、Ｖ５に対するモノクローナル抗体と、Ｈｏｅｃｈｓｔ ９９３４核染色液で染色したコンフルエントな３Ｔ３細胞の叢の例示的実施形態を示す。この時間では、Ｔａｔ−Ｍｙｃタンパク質のほとんどは核領域に局在しているが、Ｔａｔ−Ｂｃｌ−２は細胞質及び核周囲空間に留まっている。 Ｔａｔ融合タンパク質の作製とインビトロでの特徴についての例示的実施形態を示す。図１Ｄは、１時間Ｔａｔ−Ｍｙｃに１度曝露して、洗浄し、その後溶解して（示した時点において）、核画分から細胞膜及び細胞質画分を分離したヒト臍帯血由来ＨＳＣのＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット分析（Ｖ５及びβ−アクチンに対するモノクローナル抗体）の例示的実施形態を示す。 Ｔａｔ融合タンパク質の作製とインビトロでの特徴についての例示的実施形態を示す。図１Ｅは、２時間Ｔａｔ−Ｍｙｃに１度曝露して、洗浄し、その後溶解して（示した時点において）、核画分から細胞膜及び細胞質画分を分離したヒト臍帯血由来ＨＳＣの核画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット分析（Ｖ５及びβ−アクチンに対するモノクローナル抗体）の例示的実施形態を示す。タンパク質の大部分は２４時間と４８時間との間になくなっている。７２時間後のいずれのポイントにおいて、検出可能なタンパク質は残っていない。 組み換えＴａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ−２が生物学的に活性であることを示す例示的実施形態の図を示す。図２Ａは、培地のみ（未処理、ＮＴ）、Ｔａｔ−Ｃｒｅ（Ｔａｔ−対照、ＴＣ）を補充、又は、Ｔａｔ−Ｍｙｃ（ＴＭ）（図２Ａ）のいずれかの濃度を増加させて補充した培地に、４８時間で再プレーティングされたインビトロ活性化Ｔ細胞の例示的実施形態の図を示す。開始時の細胞集団中の生細胞の発生頻度も示す（薄灰色のバー）。 組み換えＴａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ−２が生物学的に活性であることを示す例示的実施形態の図を示す。図２Ｂは、培地のみ（未処理、ＮＴ）、Ｔａｔ−Ｃｒｅ（Ｔａｔ−対照、ＴＣ）を補充、又は、Ｔａｔ−Ｂｃｌ−２（ＴＢ）（図２Ｂ）のいずれかの濃度を増加させて補充した培地に、４８時間で再プレーティングされたインビトロ活性化Ｔ細胞の例示的実施形態の図を示す。開始時の細胞集団中の生細胞の発生頻度も示す（薄灰色のバー）。 組み換えＴａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ−２が生物学的に活性であることを示す例示的実施形態の図を示す。図２Ｃは、活性化Ｔ細胞が芽球性の表現型を保持する（図２Ｃ）ことを示している、Ｔａｔ−Ｍｙｃと共に更にインキュベートされ、ＣＦＳＥで標識された活性化Ｔ細胞の例示的実施形態の図を示す。 組み換えＴａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ−２が生物学的に活性であることを示す例示的実施形態の図を示す。図２Ｄは、抗原刺激され、外から追加されたサイトカインが除去された後も増殖し続ける（図２Ｄ）ことを示している、Ｔａｔ−Ｍｙｃと共に更にインキュベートされ、ＣＦＳＥで標識された活性化Ｔ細胞の例示的実施形態の図を示す。 Ｔａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ−２によるマウスＨＳＣのインビトロでの増殖の例示的実施形態の図を示す。図３Ａは、ｃ−Ｋｉｔ＋、Ｓｃａ−１＋、及び系統マーカー（Ｍａｃ−１、Ｇｒ−１、Ｂ２２０、ＣＤ３、Ｔｅｒ−１１９、及びＦｌｋ−２）に陰性である表現型を有する、得られた細胞集団のＦＡＣＳ分析の例示的実施形態の図を示す。 Ｔａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ−２によるマウスＨＳＣのインビトロでの増殖の例示的実施形態の図を示す。図３Ｂは、Ｔａｔ−融合タンパク質を添加せずに培養したＨＳＣ（薄灰色の右側の跡）と比較した、Ｔａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ−２と共に培養したとき（濃灰色の左側の跡）の、ＨＳＣのインビトロでの増殖の例示的実施形態の図を示す。 Ｔａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ−２によるマウスＨＳＣのインビトロでの増殖の例示的実施形態の図を示す。図３Ｃは、Ｔａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ−２を含む培養における、インビトロでの細胞増殖速度の例示的実施形態の図を示す。 Ｔａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ−２で増殖させたマウスｐｔｌｔ−ＨＳＣのインビボでの機能解析の例示的実施形態の図を示す。致死量以下で照射されたＲａｇ−１^−／−マウスのコホートに、野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスから得た骨髄細胞由来のｐｔｌｔ−ＨＳＣを１０^３個与えた。図４Ａは、Ｒａｇ−１^−／−対照（１つ目の図）と比較した、ｐｔｌｔ−ＨＳＣキメラマウスの末梢血中の成熟Ｂ細胞（２つ目の図）の存在についてのＦＡＣＳ分析（ＣＤ１９／Ｂ２２０発現）の例示的実施形態の図を示す。 Ｔａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ−２で増殖させたマウスｐｔｌｔ−ＨＳＣのインビボでの機能解析の例示的実施形態の図を示す。致死量以下で照射されたＲａｇ−１^−／−マウスのコホートに、野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスから得た骨髄細胞由来のｐｔｌｔ−ＨＳＣを１０^３個与えた。図４Ｂは、Ｒａｇ−１^−／−ｐｔｌｔ−ＨＳＣキメラマウス（２つ目の図）の末梢血中の成熟Ｔ細胞の存在についてのＦＡＣＳ分析（ＴＣＲβ／ＣＤ４発現）を、Ｒａｇ−１^−／−対照（１つ目の図）と比較した、例示的実施形態の図を示す。 Ｔａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ−２で増殖させたマウスｐｔｌｔ−ＨＳＣのインビボでの機能解析の例示的実施形態の図を示す。致死量以下で照射されたＲａｇ−１^−／−マウスのコホートに、野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスから得た骨髄細胞由来のｐｔｌｔ−ＨＳＣを１０^３個与えた。図４Ｃは、Ｒａｇ−１^−／−ｐｔｌｔ−ＨＳＣキメラマウスのリンパ系器官（脾臓、胸腺、リンパ節、及び骨髄）における、発生中のＴ細胞及びＢ細胞のＦＡＣＳ分析（ＣＤ１９／ＩｇＭ及びＣＤ８／ＣＤ４発現）の例示的実施形態の図を示す。 Ｔａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ−２で増殖させたマウスｐｔｌｔ−ＨＳＣのインビボでの機能解析の例示的実施形態の図を示す。致死量以下で照射されたＲａｇ−１^−／−マウスのコホートに、野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスから得た骨髄細胞由来のｐｔｌｔ−ＨＳＣを１０^３個与えた。図４Ｄは、抗原受容体を通して活性化された後に、成熟リンパ系細胞が破裂して細胞分裂を起こすことができたことを示すデータを示す。 Ｔａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ−２によるヒト臍帯血細胞由来ＨＳＣの増殖の例示的実施形態の図を示す。図５Ａは、インビトロで１４日間増殖させた、ヒト臍帯血細胞の表面表現型（上図はサイトカイン混合物のみ）のＦＡＣＳ分析の例示的実施形態の図を示す。 Ｔａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ−２によるヒト臍帯血細胞由来ＨＳＣの増殖の例示的実施形態の図を示す。図５Ａは、インビトロで１４日間増殖させた、ヒト臍帯血細胞の表面表現型（下図はＴａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ−２を加えたサイトカイン混合物）のＦＡＣＳ分析の例示的実施形態の図を示す。 Ｔａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ−２によるヒト臍帯血細胞由来ＨＳＣの増殖の例示的実施形態の図を示す。図５Ｂは、両条件下インビトロでのＣＤ３４＋細胞の増殖速度の例示的実施形態の図を示す。 Ｔａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ−２によるヒト臍帯血細胞由来ＨＳＣの増殖の例示的実施形態の図を示す。図５Ｃは、骨髄赤血球分化を補助する条件下でのメチルセルロースアッセイで現像された、ヒトｐｔｌｔ−ＨＳＣ由来の３つの異なるコロニータイプの例示的実施形態の画像を示す。 Ｔａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ−２によるヒト臍帯血細胞由来ＨＳＣの増殖の例示的実施形態の図を示す。図５Ｄは、サイトカイン混合物と共に培養された１０^３個の臍帯血細胞（ＦＣＢ）、Ｔａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ−２を補充したサイトカイン混合物と共に培養された１０^３個の臍帯血細胞（ＦＣＢ＋ＴＭＴＢ）、又は１０^４個の新鮮な未操作の臍帯血細胞（１０＾４新鮮ＦＣＢ）のいずれかを播種した、メチルセルロース培養で観察された各コロニータイプを定量した例示的実施形態の図を示す。 Ｔａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ−２によるヒト臍帯血細胞由来ＨＳＣの増殖の例示的実施形態の図を示す。図５Ｅは、図５Ｄに示す細胞を再プレーティングして、メチルロース培養で観察されたコロニー数を定量した例示的実施形態の図を示す。 インビボでのヒト臍帯血由来タンパク質を形質導入された長期（ｐｔｌｔ）−ＨＳＣの機能解析の例示的実施形態の図を示す。図６Ａは、サイトカイン混合物中においてインビトロで増殖（１つ目の図；ＦＣＢ）、若しくはＴａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ−２を補充したサイトカイン混合物中で増殖（２つ目の図；ＦＣＢ ＴＭＴＢ）された１０^６個の臍帯血細胞、又は、５×１０^６個の新鮮な未操作の臍帯血細胞（３つ目の図；新鮮ＦＣＢ）を移植した、致死量以下で照射されたＮＳＧマウスの骨髄コホートのＦＡＣＳ分析の例示的実施形態の図を示す。 インビボでのヒト臍帯血由来タンパク質を形質導入された長期（ｐｔｌｔ）−ＨＳＣの機能解析の例示的実施形態の図を示す。図６Ｂは、異種キメラマウスの骨髄、脾臓、及び胸腺細胞のＦＡＣＳ分析の例示的実施形態の図を示す。細胞は全てヒトＣＤ４５で染色した。ＣＤ４５＋細胞に対するゲーティングにより、骨髄中にヒトＣＤ３４＋ＣＤ３８^ｌｏ細胞（１つ目の図；ＢＭ）；脾臓中にヒトＣＤ１９＋及びヒトＣＤ３＋リンパ球（２つ目の図；脾臓）；並びに、胸腺中にヒトＣＤ３＋細胞（３つ目の図；胸腺）が示された。 インビボでのヒト臍帯血由来タンパク質を形質導入された長期（ｐｔｌｔ）−ＨＳＣの機能解析の例示的実施形態の図を示す。図６Ｃは、ＣＦＳＥで標識され、ヒトＣＤ４０及びＩｇＭに対するモノクローナル抗体の存在下で培養された、ヒト膵臓Ｂ細胞のＦＡＣＳ分析の例示的実施形態の図を示す。ＮＳＧ異種キメラマウスで発生したヒトＢ細胞は、抗原受容体の刺激後増殖した。 インビボでのヒト臍帯血由来タンパク質を形質導入された長期（ｐｔｌｔ）−ＨＳＣの機能解析の例示的実施形態の図を示す。図６Ｄは、ＮＳＧ異種キメラマウスの骨髄から得られ、メチルセルロース（methycellulose）上にプレーティングされた、ヒトＣＤ３４＋ＣＤ３８^ｌｏ細胞由来の骨髄赤血球コロニーを定量した例示的実施形態の図を示す。 インビボでのヒト臍帯血由来タンパク質を形質導入された長期（ｐｔｌｔ）−ＨＳＣの機能解析の例示的実施形態の図を示す。図６Ｅは、再プレーティング後の骨髄赤血球コロニーの発育を定量した例示的実施形態の図を示す。 インビボでのヒト臍帯血由来タンパク質を形質導入された長期（ｐｔｌｔ）−ＨＳＣの機能解析の例示的実施形態の図を示す。図６Ｆは、インビトロでサイトカイン混合物（白丸）又はＴａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ−２を補充したサイトカイン混合物（黒四角）中で増殖された骨髄細胞のＣＤ４５陽性集団における、骨髄系リンパ系細胞分化（ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３、及びＣＤ１９の発現）を定量した例示的実施形態の図を示す。 インビボでのヒト臍帯血由来タンパク質を形質導入された長期（ｐｔｌｔ）−ＨＳＣの機能解析の例示的実施形態の図を示す。図６Ｇは、インビトロでサイトカイン混合物（白丸）又はＴａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ−２を補充したサイトカイン混合物（黒四角）中で増殖された脾臓細胞のＣＤ４５陽性集団における、骨髄系リンパ系細胞分化（ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３、及びＣＤ１９の発現）を定量した例示的実施形態の図を示す。 Ｔａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ−２による成人型ヒトＧ−ＣＳＦで動員したＨＳＣのインビトロでの増殖の例示的実施形態の図を示す。図７Ａは、ヒトＣＤ３４＋及びＣＤ３８＋画分の濃縮を示すヒトＣＤ４５＋細胞の表面表現型の例示的実施形態の図を示す。 Ｔａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ−２による成人型ヒトＧ−ＣＳＦで動員したＨＳＣのインビトロでの増殖の例示的実施形態の図を示す。図７Ｂは、Ｔａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ−２が存在する培養液中における、インビトロでの１８日間にわたる細胞増殖速度の例示的実施形態の図を示す。 Ｔａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ−２による成人型ヒトＧ−ＣＳＦで動員したＨＳＣのインビトロでの増殖の例示的実施形態の図を示す。図７Ｃは、５×１０^３個の、Ｔａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ−２と共にインビトロで増殖されたヒト成人型Ｇ−ＣＳＦ ＨＳＣが、メチルセルロース中で４種類の形態学的に異なるコロニータイプを生じさせることを示している例示的実施形態の図を示す。 Ｔａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ−２による成人型ヒトＧ−ＣＳＦで動員したＨＳＣのインビトロでの増殖の例示的実施形態の図を示す。図７Ｄは、Ｔａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ−２と共にインビトロで増殖させたヒト成人型Ｇ−ＣＳＦ ＨＳＣが、異種キメラＮＳＧマウスにおいてヒト造血性系統を生じさせたことを示しているＦＡＣＳ分析の例示的実施形態の図を示す。骨髄は、Ｔａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ−２を補充したサイトカイン混合物（１つ目の図；Ｇ−ＣＳＦ＋ＴＭＴＢ）又は新鮮な未操作の臍帯血細胞（２つ目の図；新鮮ＦＣＢ）と共に増殖させたｐｔｌｔ−ＨＳＣを移植したＮＳＧマウス由来のものであった。 Ｔａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ−２による成人型ヒトＧ−ＣＳＦで動員したＨＳＣのインビトロでの増殖の例示的実施形態の図を示す。図７Ｅは、骨髄、脾臓、及び胸腺由来細胞のＦＡＣＳ分析の例示的実施形態の図を示す。骨髄細胞は、ヒトＣＤ３４＋及びＣＤ３８＋でもあるヒトＣＤ４５細胞を含み（１つ目の図）、脾臓細胞はヒトＣＤ３でも染色されるヒトＣＤ４５細胞を含み（２つ目の図）、胸腺細胞はヒトＣＤ４５細胞並びにＣＤ３を含んでいた（３つ目の図）。 Ｔａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ−２による成人型ヒトＧ−ＣＳＦで動員したＨＳＣのインビトロでの増殖の例示的実施形態の図を示す。図７Ｆは、異種キメラマウスコホートに、インビトロでＴａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ−２を補充したサイトカイン混合物中で増殖させた１０^６個のＧ−ＣＳＦ動員細胞（黒四角）を移植し、骨髄系リンパ系細胞分化について評価した例示的実施形態の図を示す。骨髄細胞（図７Ｆ）ＣＤ４５陽性集団を、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３、及びＣＤ１９の発現について解析した。 Ｔａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ−２による成人型ヒトＧ−ＣＳＦで動員したＨＳＣのインビトロでの増殖の例示的実施形態の図を示す。図７Ｇは、異種キメラマウスコホートに、インビトロでＴａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ−２を補充したサイトカイン混合物中で増殖させた１０^６個のＧ−ＣＳＦ動員細胞（黒四角）を移植し、骨髄系リンパ系細胞分化について評価した例示的実施形態の図を示す。脾臓細胞（図７Ｇ）ＣＤ４５陽性集団を、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３、及びＣＤ１９の発現について解析した。 ＣＦＳＥで標識され、それぞれマウスＣＤ３、又は、ＣＤ４０及びＩｇＭに対するモノクローナル抗体の存在下で培養されたマウス脾臓Ｔ細胞及びＢ細胞のＦＡＣＳ分析の例示的実施形態の図を示す。抗原受容体の刺激後に増殖させた５ＦＵ処理Ｃ５７ＢＬ．６由来の増殖済みＨＳＣを移植した、Ｒａｇ１−／−マウスにおいて発生したマウスＴ細胞（薄灰色の左側の線、１つ目の図）及びＢ細胞（薄灰色の左側の線、２つ目の図）を、未刺激細胞（濃灰色の右側の線）と比較した。 活性化Ｔ細胞の生死判別アッセイにおける、様々なＭｙｃ融合タンパク質構築物の活性の例示的実施形態を示す。図９Ａは、Ｍｙｃ融合タンパク質構築物の一部の代表例の例示的配列図を示す。 活性化Ｔ細胞の生死判別アッセイにおける、様々なＭｙｃ融合タンパク質構築物の活性の例示的実施形態を示す。図９Ｂは、代表的なＭｙｃ融合タンパク質構築物による処理４８時間後の生存Ｔ細胞の割合の例示的実施形態の図を示す。 活性化Ｔ細胞生死判別アッセイにおける、様々なＴａｔ−融合タンパク質（それぞれ５０μｇ／ｍＬ）の活性の例示的実施形態を示す。図１０Ａは、未処理細胞（未処理）のＦＡＣＳ分析のライブゲート（前方×側方散乱）の例示的実施形態の図を示す。 活性化Ｔ細胞生死判別アッセイにおける、様々なＴａｔ−融合タンパク質（それぞれ５０μｇ／ｍＬ）の活性の例示的実施形態を示す。図１０Ｂは、Ｔａｔ−Ｃｒｅ処理細胞（Ｔａｔ−Ｃｒｅ対照）のＦＡＣＳ分析のライブゲート（前方×側方散乱）の例示的実施形態の図を示す。 活性化Ｔ細胞生死判別アッセイにおける、様々なＴａｔ−融合タンパク質（それぞれ５０μｇ／ｍＬ）の活性の例示的実施形態を示す。図１０Ｃは、Ｔａｔ−Ｂｃｌ２処理細胞（Ｔａｔ−Ｂｃｌ２）のＦＡＣＳ分析のライブゲート（前方×側方散乱）の例示的実施形態の図を示す。 活性化Ｔ細胞生死判別アッセイにおける、様々なＴａｔ−融合タンパク質（それぞれ５０μｇ／ｍＬ）の活性の例示的実施形態を示す。図１０Ａは、Ｔａｔ−Ｍｙｃ処理細胞（Ｔａｔ−Ｍｙｃ）のＦＡＣＳ分析のライブゲート（前方×側方散乱）の例示的実施形態の図を示す。 ＰＴＤ融合タンパク質を含んで、又は含まずに、様々なサイトカインの存在下で増殖させたＣＤ３４＋細胞数の例示的実施形態の図を示す。 ＦＣＢ培地のみ（上図）又はＴａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ２を補充したＦＣＢ培地（下図左）で増殖させた５×１０＾６個の細胞を投与されたＮＳＧマウス由来の骨髄細胞を、ヒトＣＤ４５で染色した、ＦＡＣＳ分析の例示的実施形態の図を示す。Ｔａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ２で処理された細胞を投与されたマウスにおいて、ヒトＣＤ４５＋細胞が増加していることに留意されたい。ＣＤ４５＋細胞を、ＣＤ３４陽性細胞の存在について、フローサイトメトリーによって更に分析した（下図右）。 ＦＣＢ培地のみ（上図）又はＴａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ２を補充したＦＣＢ培地（下図左）で増殖させた５×１０＾６個の細胞を投与されたＮＳＧマウス由来の脾臓細胞を、ヒトＣＤ４５で染色した、ＦＡＣＳ分析の例示的実施形態の図を示す。Ｔａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ２で処理された細胞を投与されたマウスにおいて、ヒトＣＤ４５＋細胞が増加していることに留意されたい。ＣＤ４５＋細胞を、ＣＤ１９及びＣＤ３陽性細胞の存在について、フローサイトメトリーによって更に分析した（下図右）。 ＦＣＢ培地のみ（上図）又はＴａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ２を補充したＦＣＢ培地（下図左）で増殖させた５×１０＾６個の細胞を投与されたＮＳＧマウス由来の胸腺由来細胞を、ヒトＣＤ４５で染色した、ＦＡＣＳ分析の例示的実施形態の図を示す。Ｔａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ２で処理された細胞を投与されたマウスにおいて、ヒトＣＤ４５＋細胞が増加していることに留意されたい。ＣＤ４５＋細胞を、ＣＤ１９及びＣＤ３陽性細胞の存在について、フローサイトメトリーによって更に分析した（下図右）。 Ｔａｔ−Ｍｙｃポリペプチドのいくつかの実施形態のアミノ酸及び核酸の配列を示す。 Ｔａｔ−Ｍｙｃポリペプチドのいくつかの実施形態のアミノ酸及び核酸の配列を示す。 Ｂｃｌ−２ドメインポリペプチドのいくつかの実施形態のアミノ酸及び核酸の配列を示す。

ＬＴ−ＨＳＣ細胞の治療的有用性は、特にこれらの頻度が低く、エクスビボで増殖できないことによって限定されている。これらの細胞の増殖は、限定するものではないが遺伝子治療などの臨床的応用において特に重要である。

本明細書に記載されるいくつかの実施形態を用いて、任意に自家細胞を用いる、オーダーメイド医療及びその他の用途向けに個別化ＨＳＣを産生できる。

本明細書に提供される実施形態の一部は、インビトロでの増殖に先立って、ＣＤ３４＋画分の単離及び／又は精製を必要としない。したがって、いくつかの実施形態では、かかる細胞の増殖からこの工程を除くことができる。これによってコストを削減でき、臨床診療に対するこの幹細胞増殖法の適応を簡便にすることができる。本明細書に提供される方法のうち任意のものは、任意に、インビトロでの増殖に先立つＣＤ３４＋画分の単離及び／又は精製を含まなくてよい。

本明細書に記載されるいくつかの実施形態は、初代成人ＨＳＣを特定の融合タンパク質と共に培養してタンパク質を形質導入された長期ＨＳＣ（ｐｔｌｔ−ＨＳＣ）を産生することによる、インビトロでサイトカイン依存性ＬＴ−ＨＳＣ集団を増殖する方法を提供する。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、細胞の生存及び／又は増殖を誘導する癌原遺伝子をコードするタンパク質、又はこれらの生物学的に活性な断片若しくはホモログ（例えばＭｙｃポリペプチド）に連結した、タンパク質形質導入ドメインを有する。この方法は、抗アポトーシスタンパク質、又はこれらの生物学的に活性な断片若しくは機能性ホモログ（例えばＢｃｌ−２ドメインポリペプチド）に連結した、タンパク質形質導入ドメインを含む、融合タンパク質を更に含んでよい。いくつかの実施形態では、これは、細胞の生存及び／又は増殖を誘導するＭｙｃポリペプチドに連結したタンパク質形質導入ドメイン、並びに、Ｂｃｌ−２ドメインポリペプチドに連結したタンパク質形質導入ドメインを含む。

一般的定義
本明細書に記載される実施形態の実践又は試験に使用される、本明細書に記載されるものに類似する、又は同等である任意の方法及び材料は、本開示の一部であると見なされる。

本明細書で使用するとき、「幹細胞（例えば、造血幹細胞）」は、当該技術分野において一般に理解されている用語を指す。例えば、幹細胞（例えば、造血幹細胞）は、その供給源に関わらず、長期間にわたって自身を分裂させて複製でき、特殊化されておらず（未分化であり）、特殊化細胞種を生じる（そのような細胞腫に分化する）能力を有する細胞である（例えば、様々な異なる特殊化細胞種の前駆細胞、つまり前駆体細胞である）。本明細書の特定の例では、本明細書に記載される「幹細胞（例えば、造血幹細胞）」は、長期幹細胞（例えば、造血幹細胞）を指す。

用語「長期」は、幹細胞（例えば、造血幹細胞）に関して使用されるとき、特定の種類の幹細胞に応じ長期間にわたって（例えば、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、６ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１２ヶ月、２年、３年）、同一の非特殊化細胞種に分化することによって、自身を複製する幹細胞（例えば、造血幹細胞）の能力を指す。いくつかの実施形態では、幹細胞（例えば、造血幹細胞）は、ｃ−ｋｉｔ＋、Ｓｃａ−１＋、ＣＤ３４ｌｏｗ／−、ＣＤ３８＋、及び／又はＴｈｙ１＋／ｌｏｗといった細胞表面マーカーの存在によって同定される。いくつかの実施形態では、ヒト幹細胞（例えば、造血幹細胞）は、ＣＤ３４＋、ＣＤ３８ｌｏｗ／−、ｃ−ｋｉｔ−／ｌｏｗ及び／又はＴｈｙ１＋といったマーカーの存在によって同定される。いくつかの実施形態では、ヒト及びマウス幹細胞（例えば、造血幹細胞）の両方は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＮＫ１．１、Ｂ２２０、Ｔｅｒ−１１９、及び／又はＧｒ−１などの細胞系統マーカーを欠く。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリペプチドのホモログ、アナログ、又は断片は、そのポリペプチドに、少なくとも４０％〜１００％同一である、例えば、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は、約４０％〜約１００％任意のその他パーセンテージで同一であるアミノ酸配列を含む。

２つのアミノ酸配列又は２つの核酸の相同性割合を決定するため、比較目的で配列を最適に整列させる（例えば、第１のアミノ酸又は核酸配列を第２のアミノ酸又は核酸配列と最適にアライメントするために配列中にギャップを挿入する）。その後、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較してよい。第１の配列中のある位置が、第２の配列中の対応する位置のものと同じアミノ酸残基又はヌクレオチドで占有されるとき、その位置において分子は同一である。２つの配列間の相同性割合は、配列が共有する同一位置数の関数である（同一性％＝同一位置数／総位置数（例えば、重複位置）×１００）。いくつかの実施形態では、２つの配列は同じ長さである。

２つの配列間の相同性割合を決定するため、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４〜２２６８のアルゴリズムを、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３〜５８７７のように修正して用いた。かかるアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて行い、本明細書に記載又は開示される核酸分子に相同するヌクレオチド配列を得る。ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて行う。比較目的のためギャップを有するアライメントを得るため、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２．に記載されるようなＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用する。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用するとき、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトのパラメーターを用いる。詳細は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブサイト（Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂのｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）を参照されたい。本明細書に記載される方法で使用するのに好適なタンパク質は、本明細書に記載される任意のタンパク質のアミノ酸配列と比較して、１〜１５ヶ所のアミノ酸変化、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、若しくは１５ヶ所のアミノ酸置換、欠失、又は付加を有するタンパク質も含む。別の実施形態では、変更アミノ酸配列は、本明細書に記載される任意のタンパク質インヒビターのアミノ酸配列に、少なくとも７５％同一、例えば、７７％、８０％、８２％、８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である。かかる配列変異タンパク質は、変更アミノ酸配列が、本明細書に記載される組成物及び方法において機能するのに十分な生物学的活性を維持している限り、本明細書に記載される方法において好適である。特定の例では、保存的アミノ酸置換が利用される。アミノ酸間の例示の保存的置換は、（１）グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシン、（２）フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン、（３）セリン及びスレオニン、（４）アスパラギン酸及びグルタミン酸、（５）グルタミン及びアスパラギン、並びに、（６）リジン、アルギニン、及びヒスチジン、のそれぞれのグループ内のものである。ＢＬＯＳＵＭ６２の表は、５００超のグループの関連タンパク質の高度保存領域を示す、約２，０００のタンパク質配列セグメントの局所的マルチプルアライメント由来のアミノ酸置換マトリックスである（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（１９９２），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１０９１５〜１０９１９）。ＢＬＯＳＵＭ６２の置換頻度を用いて、いくつかの実施形態では、本明細書に記載又は開示されるアミノ酸配列に挿入される、保存的アミノ酸置換を確定する。（上記のような）化学的特性のみに基づくアミノ酸置換の設計は可能であるが、用語「保存的アミノ酸置換」は、好ましくは、ＢＬＯＳＵＭ６２の値が−１を超えることによって表される置換を指す。例えば、ＢＬＯＳＵＭ６２の値が０、１、２又は３であることを特徴とする置換の場合、アミノ酸置換は保存的である。このシステムによると、好ましい保存的アミノ酸置換は、ＢＬＯＳＵＭ６２の値が少なくとも１（例えば、１、２又は３）であることを特徴とし、一方より好ましい保存的アミノ酸置換は、ＢＬＯＳＵＭ６２の値が少なくとも２（例えば、２又は３）であることを特徴とする。

本明細書で使用するとき、用語「核酸」は、１つ又はそれ以上の核酸の組み合わせ又は挿入によって操作され、それによって、通常自然では同時に起こらない配列を組み合わせている核酸を指す。いくつかの実施形態では、核酸はインデューサー又はエンハンサーを含む。いくつかの実施形態では、核酸は制限酵素部位を含む。いくつかの実施形態では、核酸はポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、核酸は突然変異を含む。

本明細書で使用するとき、用語「ポリペプチド」は、核酸から生成されるポリペプチドを指す。

本明細書で使用するとき、用語「導入遺伝子」は、ポリペプチドをコードする核酸を、動物、細菌、ウイルス又は細胞のゲノムＤＮＡに組み込むことを指す。

本明細書で使用するとき、「過剰発現」は、同じポリペプチド又はタンパク質の同一細胞内での内因性発現レベルと比較して、より高いレベルの発現を指す。特定の例では、「過剰発現」はポリペプチドの発現を指す。いくつかの実施形態では、より高いレベルの発現は、２％〜２００％高いことを含む。いくつかの実施形態では、より高いレベルの発現は、２倍〜１０００倍高いことを含む。いくつかの実施形態では、より高いレベルの発現は、２倍〜１０００倍高いことを含む。いくつかの実施形態では、より高いレベルの発現は、２倍〜１０，０００倍高いことを含む。いくつかの実施形態では、より高いレベルの発現は、事前の検出できないレベルの発現と比較するとき、検出可能なレベルの発現を含む。いくつかの実施形態では、「過剰発現」は、外因性ポリペプチド又はタンパク質の任意の検出可能なレベルの発現を指す。

用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、本明細書で互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、自然発生型アミノ酸ポリマー、並びに、１つ又はそれ以上のアミノ酸残基が非自然発生型アミノ酸、例えば、アミノ酸アナログであるアミノ酸ポリマーに適用する。本明細書で使用されるとき、この用語は、アミノ酸残基が共有結合性ペプチド結合によって連結されている、完全長タンパク質を含む任意の長さのアミノ酸鎖を包含する。

本明細書で使用するとき、当該実施形態における単離タンパク質又はポリペプチドへの言及は、完全長タンパク質、融合タンパク質、キメラタンパク質、又はかかるタンパク質の任意の断片（切断型、部分）若しくはホモログを含む。より具体的には、単離タンパク質は、自然環境から排除されている（すなわち、ヒトによる操作を受けている）タンパク質（ポリペプチド又はペプチドを含む）であってよく、精製タンパク質、部分精製タンパク質、組み換えで生成されたタンパク質、膜結合タンパク質、脂質と複合体化したタンパク質、可溶性タンパク質、合成的に生成されたタンパク質、及び別のタンパク質を伴う単離タンパク質を挙げてよいが、これらに限定されない。このように、「単離」は、タンパク質が精製されている程度を反映しない。好ましくは、単離タンパク質は組み換えで生成される。

好ましくは、単離核酸分子は、組み換えＤＮＡ技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、クローニング）又は化学合成を用いて生成される。単離核酸分子として、天然対立遺伝子多型、並びに、かかる修飾が所望の効果（例えば、本明細書に記載される誘導可能な癌原遺伝子の提供）をもたらすように、ヌクレオチドが挿入、欠失、置換、及び／又は反転されている修飾核酸分子を非限定的に含む、天然核酸分子及びそれらのホモログが挙げられる。

核酸分子ホモログは、当業者に既知である多くの方法を用いて生成できる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｓ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照）。例えば、核酸分子は、古典的な突然変異誘発技術及びＤＮＡ組み換え技術、例えば、部位特異的突然変異誘発、突然変異を誘発するための核酸分子の化学処理、核酸フラグメントの制限酵素による切断、核酸フラグメントのライゲーション、ＰＣＲ増幅及び／又は選択領域の核酸配列の突然変異誘発、オリゴヌクレオチド混合物の合成、並びに、核酸分子の混合物を「構築」するための混合物グループのライゲーション、並びにこれらの組み合わせを非限定的に含む様々な手法を用いて修飾してよい。核酸分子ホモログは、核酸及び／又は野生型遺伝子とのハイブリダイゼーションによってコードされるタンパク質の機能についてスクリーニングすることにより、修飾核酸の混合物から選択できる。

核酸分子又はポリヌクレオチドの最小サイズは、本明細書に提供される実施形態に有用なタンパク質、例えば、癌原遺伝子若しくはそれらの機能性部分（例えば、完全長タンパク質の生物学的活性を有し、本方法で使用するのに十分な部分）によってコードされるタンパク質、又は、抗アポトーシスタンパク質若しくはそれらの機能性部分（例えば、完全長タンパク質の生物学的活性を有し、本方法で使用するのに十分な部分）をコードするのに十分なサイズである。その他有用であり得る核酸分子は、典型的には少なくとも５つのヌクレオチドの長さ、好ましくは、約５〜約５０の範囲、又は約５００以上のヌクレオチドであって、これらの間の整数で増加する任意の長さを含む長さ（すなわち、５、６、７、８、９、１０、．．．３３、３４、．．．２５６、２５７、．．．５００）である、天然タンパク質をコードする核酸分子の相補配列と安定的にハイブリッド形成できる（例えば、中程度の、高い、又は非常に高いストリンジェンシー条件下）プローブ又はオリゴヌクレオチドプライマーを形成するための、十分な最小サイズの核酸分子を含んでよい。実用限界以外に核酸分子の最大サイズの制限はなく、ここでは核酸分子は、本明細書に記載される任意の実施形態において有用であるために十分な配列を含んでよい。

本明細書で使用するとき、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、類似する核酸分子を同定するために核酸分子が使用される、標準的なハイブリダイゼーション条件を指す。かかる標準的条件は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｓ Ｐｒｅｓｓ，１９８９に開示されている。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．の同書は、その全体が参照として本明細書に組み込まれる（特に９．３１〜９．６２ページ参照）。更に、ヌクレオチドの様々なミスマッチの程度を可能にするハイブリダイゼーションを達成するための、適切なハイブリダイゼーションを算出する式及び洗浄条件は、例えば、Ｍｅｉｎｋｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８，２６７〜２８４に開示されており、Ｍｅｉｎｋｏｔｈ ｅｔ ａｌ．の同書は、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。

より具体的には、中程度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、本明細書で言及されるとき、ハイブリダイゼーション反応においてプローブとして使用されている核酸分子と、少なくとも約７０％の核酸配列同一性を有する核酸分子を単離できる条件を指す（例えば、約３０％以下のヌクレオチドのミスマッチを可能にする条件）。高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、本明細書で言及されるとき、ハイブリダイゼーション反応においてプローブとして使用されている核酸分子と、少なくとも約８０％の核酸配列同一性を有する核酸分子を単離できる条件を指す（例えば、約２０％以下のヌクレオチドのミスマッチを可能にする条件）。非常に高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、本明細書で言及されるとき、ハイブリダイゼーション反応においてプローブとして使用されている核酸分子と、少なくとも約９０％の核酸配列同一性を有する核酸分子を単離できる条件を指す（例えば、約１０％以下のヌクレオチドのミスマッチを可能にする条件）。上で開示されるように、当業者は、Ｍｅｉｎｋｏｔｈ ｅｔ ａｌ．の同書における式を用いて、これらのヌクレオチドの特定のミスマッチ程度を達成するため、適切なハイブリダイゼーション及び洗浄条件を算出できる。かかる条件は、ＤＮＡ：ＲＮＡ又はＤＮＡ：ＤＮＡのハイブリッドのいずれが形成されるかによって変わり得る。ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドの算出される融解温度は１０℃であり、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドより低い。特定の実施形態では、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、イオン強度が６×ＳＳＣ（０．９Ｍ Ｎａ^＋）において、約２０℃〜約３５℃（低ストリンジェンシー）、より好ましくは、約２８℃〜約４０℃（よりストリンジェント）、更により好ましくは、約３５℃〜約４５℃（更によりストリンジェント）の温度で、適切な洗浄条件を用いてハイブリダイゼーションすることを含む。特定の実施形態では、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、イオン強度が６×ＳＳＣ（０．９Ｍ Ｎａ^＋）において、約３０℃〜約４５℃、より好ましくは、約３８℃〜約５０℃、更により好ましくは、約４５℃〜約５５℃の温度で、同程度にストリンジェントな洗浄条件を用いてハイブリダイゼーションすることを含む。これらの値は、約１００ヌクレオチドより大きい分子の融解温度の算出、０％ホルムアミド、及び約４０％のＧ＋Ｃ含量に基づいている。あるいは、Ｔ_ｍは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（上記）９．３１〜９．６２ページに記載されるように経験的に算出できる。一般には、洗浄条件はできるだけストリンジェントでなくてはならず、選択されたハイブリダイゼーション条件に適切なものでなくてはならない。例えば、ハイブリダイゼーション条件は、特定のハイブリッドの算出したＴ_ｍより低い、約２０〜２５℃である塩及び温度条件の組み合わせを含んでよく、洗浄条件は、典型的には、特定のハイブリッドの算出したＴ_ｍより低い、約１２〜２０℃である塩及び温度条件の組み合わせを含む。ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドで用いるのに好適なハイブリダイゼーション条件の一例として、６×ＳＳＣ（５０％ホルムアミド）中で約４２℃において２〜２４時間のハイブリダイゼーション、続いて、室温の約２×ＳＳＣで１回又はそれ以上の洗浄すること含む洗浄工程、続いて、より高い温度とより低いイオン強度での追加の洗浄（例えば、約３７℃で約０．１×〜０．５×ＳＳＣによる少なくとも１回の洗浄、その後、約６８℃で約０．１×〜０．５×ＳＳＣによる少なくとも１回の洗浄）が挙げられる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される、切断型（断片又は部分）及びかかる配列のホモログを含む任意のアミノ酸配列は、あるアミノ酸配列のＣ及び／又はＮ末端のそれぞれに隣接する少なくとも１つの、最大約２０個の追加の異種アミノ酸を有して生成されてよい。得られるタンパク質又はポリペプチドは、あるアミノ酸配列「から本質的になる」と称されてよい。異種アミノ酸は、あるアミノ酸配列に隣接する天然に見出されない（すなわち、インビボで天然に見つからない）、又は、自然発生型配列中のかかるヌクレオチドが、あるアミノ酸配列が由来する生物における標準的なコドン使用頻度を用いて翻訳される場合、その遺伝子中で起こるように、あるアミノ酸配列をコードする自然発生型核酸配列に隣接するヌクレオチドによってコードされない、アミノ酸の配列である。同様に、語句「から本質的になる」は、本明細書の核酸配列に関して使用されるとき、あるアミノ酸配列をコードする核酸配列の５'及び／又は３'末端のそれぞれにおいて、少なくとも１つ、最大約６０個もの追加の異種ヌクレオチドが隣接し得る、あるアミノ酸配列をコードする核酸配列を指す。異種ヌクレオチドは、天然遺伝子で起こるように、あるアミノ酸配列をコードする核酸配列に隣接して、天然に見出されない（すなわち、インビボで天然に見つからない）。

組み換えベクター（特に関心対象の核酸配列を含む場合、一般に組み換え核酸分子と称することもある）は、選択した核酸配列を操作し、かかる核酸配列を宿主細胞に導入するツールとして使用される、遺伝子操作を受けた（例えば、人工的に生成された）核酸分子である。したがって、組み換えベクターは、選択した核酸配列のクローニング、シークエンシング、並びに／又は別の方法による、例えば、選択した核酸配列を宿主細胞内で発現させ及び／若しくは送達することによる操作において使用するのに好適である。かかるベクターは、典型的には、異種核酸配列、例えば、クローニングされる、又は送達される核酸配列に隣接して天然に又は通常は見つからない核酸配列を含むが、ベクターは、核酸分子に隣接して天然に見出され、又は、核酸分子の発現に有用な（以下で説明する）調節性核酸配列（例えば、プロモーター、非翻訳領域）も含んでよい。ベクターは、ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれか、原核又は真核のいずれかであってよく、典型的にはプラスミド又はウイルスベクターである。ベクターは、染色体外因子（例えば、プラスミド）として維持されてよく、又は、宿主細胞の染色体内に組み込まれてよい。ベクター全体は、宿主細胞内の適所で留まっていてよく、又は、特定の条件下では、プラスミドＤＮＡは除去され、核酸分子を残してもよい。別の条件下では、ベクターは、宿主細胞のゲノムから選択した時間において（以下でより詳細に説明する）切り取られる（除去される）ように設計される。組み込まれた核酸分子は、染色体プロモーターの制御下、天然又はプラスミドプロモーターの制御下、又は、いくつかのプロモーターの組み合わせの制御下であってよい。核酸分子の１つ又は複数のコピーが染色体内に組み込まれてよい。組み換えベクターは、少なくとも１つの選択可能マーカーを含んでよい。

いくつかの実施形態では、幹細胞は、任意の供給源から得られた任意の成体幹細胞を含んでよい。別の実施形態では、幹細胞は胚性幹細胞を含んでよい。幹細胞として、造血幹細胞、間葉系幹細胞（肺間葉系幹細胞、骨髄間質細胞を非限定的に含む）、神経幹細胞、上皮幹細胞（肺上皮幹細胞、乳房上皮幹細胞、血管上皮幹細胞、及び腸上皮幹細胞を非限定的に含む）、腸幹細胞、心筋細胞前駆幹細胞、皮膚幹細胞（表皮幹細胞及び濾胞幹細胞（毛包幹細胞）を非限定的に含む）、骨格筋幹細胞、造骨前駆幹細胞、及び肝幹細胞を挙げてよいが、これらに限定されない。

造血幹細胞は、赤色血液細胞（赤血球）、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単級、マクロファージ、及び血小板を非限定的に含む、全ての種類の血球を生じる。

間葉系幹細胞（骨髄間質細胞を含む）は、骨の細胞（骨細胞）、軟骨の細胞（軟骨細胞）、脂肪の細胞（脂肪細胞）、肺細胞、及び腱中のものなどのその他の種類の結合組織細胞を非限定的に含む、様々な細胞の種類を生じる。

脳内の神経幹細胞は、３種類の主要な細胞、つまり、神経細胞（ニューロン）及び２種類の非神経細胞である星状細胞及びオリゴデンドロサイトを生じる。

様々な組織の内側にある上皮幹細胞は、組織内で上皮を形成する様々な種類の細胞を生じる。

皮膚幹細胞は、表皮の基底層中、及び、毛包の基部において生じる。表皮幹細胞は、皮膚の表面に移動し、保護層を形成するケラチノサイトを生じ、濾胞幹細胞は、毛包及び表皮の両方を生じることができる。成体幹細胞のその他の供給源は当業者に既知となるであろう。

胚性幹細胞は、体内の全ての組織及び細胞を生じることができる。

方法
長期再増殖造血幹細胞（ＬＴ−ＨＳＣ）集団は、インビボで自己複製し、それぞれの寿命の間、血球新生を支持する。長期ＨＳＣは、特に、骨髄幹細胞移植という点で重要である。

造血幹細胞（ＨＳＣ）のインビボでの機能は、自己複製、分化系列決定、及び分化を決定する複雑な微小環境シグナルに依存する。ＨＳＣ集団を増殖させる試みは、自己複製させながら、多能性の維持と分化の阻止が不可能であることから、妨害されてきた（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｉ．Ｄ．ａｎｄ Ｄｅｌａｎｅｙ，Ｃ．（２０１２）．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １０，１１３〜４）。インビトロでＨＳＣを増殖させようとするこれまでの取り組みには、サイトカイン混合物（Ｃｈｏｕ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２０１０）．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ７，４２７〜８）、Ｎｏｔｃｈ−１に対するリガンド（Ｄａｈｌｂｅｒｇ，Ａ．，ｅｔ ａｌ（２０１１）．Ｂｌｏｏｄ １１７，６０８３〜９０）、ＨｏｘＢ４に対するＴａｔ−融合タンパク質（Ｋｒｏｓｌ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２００３）．Ｎａｔ Ｍｅｄ ９，１４２８〜３２）、ＮＦ−Ｙａ（Ｄｏｍａｓｈｅｎｋｏ，Ａ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ，（２０１０）．Ｂｌｏｏｄ １１６，２６７６〜８３）、及びその他転写因子（Ｙａｎｇ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２０１１）．Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ ４，３８）、並びに、小分子（ＰＧＥ２及び芳香族炭化水素受容体アンタゴニスト）（Ｎｏｒｔｈ，Ｔ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．（２００７）．Ｎａｔｕｒｅ ４４７，１００７〜１１；Ｂｏｉｔａｎｏ，Ａ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．（２０１０）．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２９，１３４５〜８）の使用を伴った。増殖細胞の性質は、これら異なる方法によって異なり、異種キメラ形質導入マウスの試験、及び臨床試験において一致しない結果が生じている（Ｗａｌａｓｅｋ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２０１２）．Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，１２６６，１３８〜５０）。

現在の幹細胞療法における障壁として、必要とされる細胞を十分な数入手することが難しいこと、及び、同種の適切なドナーを識別することが挙げられる。本明細書に記載されるいくつかの実施形態は、大量のＨＳＣの産生能を可能にする。精製した均質の幹細胞集団を移植できることで、同種の壁を越えて、照射された宿主の再構成をも可能にする。

いくつかの実施形態では、条件的不死化成体幹細胞集団（タンパク質を形質導入された長期ＨＳＣ「ｐｔｌｔ−ＨＳＣ」）を産生する方法が提供される。この方法は、ａ）細胞の生存又は増殖のうち１つ又はそれ以上を促進する外因的に合成されたＭｙｃポリペプチド、及び、ｂ）アポトーシスを阻害する外因的に合成されたＢｃｌ−２ドメインポリペプチドによって、１つ又はそれ以上の成体幹細胞を提供することを含んでよい。いくつかの実施形態では、Ｍｙｃポリペプチドは、少なくとも約７２時間間隔で１つ又はそれ以上の成体幹細胞に供給される。いくつかの実施形態では、Ｂｃｌ−２ドメインポリペプチドは、少なくとも約９６時間間隔で１つ又はそれ以上の成体幹細胞に供給され、条件的不死化成体幹細胞集団を産生する。用語「外因的に合成された」は、タンパク質が作用を及ぼす細胞内で合成されないことを表す。いくつかの実施形態では、外因的に合成されたタンパク質を、単離された形態で（例えば、緩衝液とこれらのタンパク質のみ）で細胞に添加する。いくつかの実施形態では、外因的に合成されたタンパク質は、幹細胞から分離した細胞の第１集団によって産生される。

理論に束縛されるものではないが、癌原遺伝子をコードするタンパク質（例えば、Ｍｙｃポリペプチド）の機能は、ＨＳＣが細胞周期から外れるのを防ぎ、継続的な増殖を推進し、分化を阻害すると考えられる。ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＳＣＦ及び他のサイトカインを含むサイトカイン混合物によってもたらされるシグナルは、増殖しているｐｔｌｔ−ＨＳＣ細胞のＨＳＣ表現型を維持する。抗アポトーシスタンパク質（例えば、Ｂｃｌ−２ドメインポリペプチド）によってもたらされる生存機能は、癌原遺伝子をコードするタンパク質の機能がなくなると通常起こり得るアポトーシス死からｐｔｌｔ−ＨＳＣ細胞を救うことができる。これにより、ＨＳＣによるインビボで生理学的に存在する生存シグナルの利用能の回復を可能にすると思われる。したがって、いくつかの実施形態では、この方法は、増殖を推進することと、分化を阻害することと、を含んでよく、Ｂｃｌ−２ドメインポリペプチド及びＭｙｃポリペプチドの両方を適用して、その後に、存在しているある程度の量のＢｃｌ−２を維持したままで、Ｍｙｃポリペプチドを取り除き（又は、その濃度を低下させ）、細胞がＭｙｃの除去を生き抜き、引き続いて分化できるようにすることを含んでよい。

理論に束縛されるものではないが、ｐｔｌｔ−ＨＳＣを養子移植すると、抗アポトーシスタンパク質の生存機能により、骨髄幹細胞ニッシェによってもたらされた微小環境シグナルに細胞が慣れることを可能にすると考えられる。放射線誘発性リンパ球減少症などの必要とされる症状において、これらのシグナルは、ｐｔｌｔ−ＨＳＣの分化を推進し、機能性リンパ系細胞及びその他分化した血球を産生できる。ｐｔｌｔ−ＨＳＣで再構成されたマウスでは、白血病は見られなかったことに留意されたい。したがって、いくつかの実施形態では、このような有益な細胞を産生する方法が本明細書において提供される。

いくつかの実施形態では、この方法は、Ｍｙｃの添加を止め、及び／又は低下させ、培地中のＭｙｃ量を徐々に減らすことを含んでよい。このＭｙｃ量を減らしている期間中、Ｂｃｌ−２を適宜追加し続け、許容される濃度のＢｃｌ−２を維持してよい。

いくつかの実施形態では、Ｍｙｃポリペプチドは、少なくとも約７２時間間隔で供給される。いくつかの実施形態では、Ｍｙｃポリペプチドは、より頻繁に、例えば、２４、３２、４０、４８、５６、又は６４時間毎に供給されてよい。

いくつかの実施形態では、Ｍｙｃポリペプチド及び／又はＢｃｌ−２ドメインポリペプチドは、１時間に１回以下の頻度で、例えば、２時間毎に１回、３時間毎に１回、４時間毎に１回、５時間毎に１回、６時間毎に１回、７時間毎に１回、８時間毎に１回、９時間毎に１回、１０時間毎に１回、１１時間毎に１回、１２時間毎に１回、１３時間毎に１回、１４時間毎に１回、１５時間毎に１回、１６時間毎に１回、１７時間毎に１回、１８時間毎に１回、１９時間毎に１回、２０時間毎に１回、２１時間毎に１回、２２時間毎に１回、２３時間毎に１回、又は、２４時間毎に１回投与される。いくつかの実施形態では、Ｍｙｃポリペプチド及び／又はＢｃｌ−２ドメインポリペプチドは、１日に１回以下の頻度で、例えば２日毎に１回、３日毎に１回、又は４日毎に１回投与される。いくつかの実施形態では、これは、本明細書に提供されるＭｙｃポリペプチドの様々な実施形態を用いることにより、従来のＭｙｃポリペプチドの半減期が短い（例えば３６分）にもかかわらず達成できる。いくつかの実施形態では、Ｍｙｃポリペプチドの低い投与頻度にも関わらず、一度に投与されるＭｙｃポリペプチドの量は、約１００マイクログラム／ｍＬ未満、例えば５０〜１００マイクログラム／ｍＬ、又は２０マイクログラム／ｍＬ以下になる。このような状況では、半減期が延長されているため、Ｍｙｃポリペプチドを追加する必要がなく、１つ又はそれ以上の上記期間においてＭｙｃが有効で有り続けることができる（例えば、細胞に有効レベルのＭｙｃ活性を依然として提供しながら、必要とされる追加のＭｙｃポリペプチドを含めない状態で、１、２、３、４、５、６、７、８、１２、１６、２４、又は４８時間）。

いくつかの実施形態では、Ｍｙｃ及び／又はＢｃｌ−２ドメインポリペプチドの量の全てが、短時間で一度に適用され、例えば、Ｍｙｃ及び／又はＢｃｌ−２ドメインポリペプチドの量の全てを、一度に、つまり１、５、１０、又は６０秒かけて単回的に適用できる。いくつかの実施形態では、Ｍｙｃ及び／又はＢｃｌ−２ドメインポリペプチドを、１分間〜６０分間かけて、例えば、約１、３、５又は１０分間かけて適用できる。

いくつかの実施形態では、Ｍｙｃポリペプチドは持続的に供給される。いくつかの実施形態では、Ｍｙｃポリペプチドは、少なくとも約０．１マイクログラム／ｍＬ、例えば、５、１０、５０、又は１００マイクログラム／ｍＬの濃度で供給される。いくつかの実施形態では、Ｍｙｃポリペプチドは、約０．１〜約５０マイクログラム／ｍＬの範囲で供給される。いくつかの実施形態では、１マイクログラム／ｍＬ以下が、８、１２、１６、又は２４時間の時間で細胞に供給される。

いくつかの実施形態では、Ｂｃｌ−２ドメインポリペプチドは、少なくとも約７２時間間隔で供給される。いくつかの実施形態では、Ｂｃｌ−２ドメインポリペプチドはより頻繁に、例えば、２４、３２、４０、４８、５６、又は６４時間毎に１回供給されてよい。

いくつかの実施形態では、Ｂｃｌ−２ドメインポリペプチドは持続的に供給される。いくつかの実施形態では、Ｂｃｌ−２ドメインポリペプチドは、少なくとも約０．１マイクログラム／ｍＬ、例えば、５、１０、５０、又は１００マイクログラム／ｍＬの濃度で供給される。いくつかの実施形態では、Ｂｃｌ−２ドメインポリペプチドは、約１〜約５０マイクログラム／ｍＬの範囲で供給される。いくつかの実施形態では、Ｂｃｌ−２ドメインポリペプチドは、約１マイクログラム／ｍＬの濃度で供給される。いくつかの実施形態では、Ｂｃｌ−２ドメインポリペプチドとＭｙｃの比は、達成を望む所望のプロセスに依存し得る。いくつかの実施形態では、Ｂｃｌ−２とＭｙｃの比は少なくとも１：１、例えば少なくとも２：１のＢｃｌ−２対Ｍｙｃである。

いくつかの実施形態では、Ｂｃｌ−２ドメインポリペプチド及びＭｙｃポリペプチドを、同時に投与してよい。いくつかの実施形態では、Ｂｃｌ−２ドメインポリペプチド及びＭｙｃポリペプチドを、異なる時間で投与してよい。いくつかの実施形態では、Ｂｃｌ−２ドメインポリペプチド及びＭｙｃポリペプチドを、重複する時間で投与してよい。

いくつかの実施形態では、本明細書に提供される任意のＭｙｃポリペプチド及び／又はＢｃｌ−２ドメインポリペプチドを、本明細書に提供される方法において使用してよい。

いくつかの実施形態では、細胞を、様々な温度かつ様々な条件下で培養してよい。いくつかの実施形態では、約３７℃で培養してよい。いくつかの実施形態では、細胞を、ガス透過性容器、例えば、ガス透過性フラスコ（例えばＧ−Ｒｅｘ製のもの）又はガス透過性バッグ（例えばＯｒｉｇｅｎｅ製のもの）中で培養してよい。いくつかの実施形態では、これにより、プラスチック製のＴＣ容器における静置培養によって行われるものよりも優れた方法が提供される。いくつかの実施形態では、このプロセスを、約５％ ＣＯ_２のインキュベーター内において、ガス透過性容器中で起こすことができる。いくつかの実施形態では、ガス透過性容器は、迅速増殖培養製品であってよい。いくつかの実施形態では、容器は、ガス交換を可能にするシリコーン膜を側面及び／又は底面に含む。

いくつかの実施形態では、得られたｐｔｌｔ−ＨＳＣは、細胞表面の表現型、インビトロ分化能、照射後の造血系統のインビボ再構成能、及び／又は、連続的に移植される能力のうち、１つ又はそれ以上によってＨＳＣに類似する。いくつかの実施形態では、細胞は、少なくとも２回の連続継代、例えば、３、４、５、６回以上の継代を実施できる。

いくつかの実施形態では、ｐｔｌｔ−ＨＳＣは、臍帯血、胎盤、動員済み末梢血、及び骨髄を非限定的に含む、任意のＨＳＣ、並びに、胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞由来のＨＳＣの供給源から迅速に増殖させてよい。いくつかの実施形態では、ｐｔｌｔ−ＨＳＣは、移植後にインビボで自己複製するＨＳＣ区画を生じる。いくつかの実施形態では、これは、ｐｔｌｔ−ＨＳＣを対象に投与することによって達成できる。

いくつかの実施形態では、成体幹細胞は、一定期間にわたって１倍又はそれ以上増殖する。いくつかの実施形態では、成体幹細胞は、約２８日間で約２７０倍に増殖する（例えば、マウス５ＦＵ濃縮化ＢＭ）。いくつかの実施形態では、成体幹細胞は、約１４日間で約１５０倍に増殖する（例えば、ヒトＦＣＢ由来）。いくつかの実施形態では、成体幹細胞は、約２１日間で１００倍に増殖する。いくつかの実施形態では、成体幹細胞は、約９〜１４日間で約８５倍に増殖する（ヒト動員済み）。当業者に認められるように、本開示の場合、Ｍｙｃポリペプチド及び／又はＢｃｌ−２ドメインポリペプチドを少ない頻度で投与できることは、かかる細胞を保存できることに役立つであろう。

当業者に認められるように、本開示の場合、Ｍｙｃ並びにそれらの変異体及び／又はホモログは、本明細書の様々な実施形態で利用できる。いくつかの実施形態では、Ｍｙｃポリペプチドは、ｎ−Ｍｙｃ、ｃ−Ｍｙｃ、ｌ−Ｍｙｃ、ｖ−Ｍｙｃ、又はｓ−Ｍｙｃのうち１つ又はそれ以上である。本明細書で使用するとき、用語「Ｍｙｃ」、「ｃＭｙｃ」、「Ｍｙｃタンパク質」及び「Ｍｙｃポリペプチド」は、互換的に使用され、特定の例では、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ ＮＰ００２４５８．２、それらの機能性ホモログ、アナログ、又は断片を指す。いくつかの実施形態では、Ｍｙｃの同義語として、ｃ−Ｍｙｃ、ｖ−Ｍｙｃ、Ｍｙｃ癌原遺伝子タンパク質、及び転写因子ｐ６４が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｍｙｃポリペプチドは、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒｓ ＮＰ００２４５８．２の配列に、少なくとも４０％〜１００％同一である、例えば、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は、約４０％〜約１００％の任意のその他パーセンテージで同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｍｙｃポリペプチドは、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒｓ ＮＰ００２４５８．２の配列に、少なくとも５０％〜１００％同一である、例えば、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は約５０％〜約１００％の任意のその他パーセンテージで同一である、長さが４０個以上のアミノ酸のポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｍｙｃポリペプチドは、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒｓ ＮＰ００２４５８．２の配列に、少なくとも５０％〜１００％同一である、例えば、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は約５０％〜約１００％の任意のその他パーセンテージで同一である、長さが４０個以上のアミノ酸のポリペプチド配列を含み、このときＭｙｃポリペプチドは、細胞の生存、細胞の不死、細胞の成長及び／又は細胞の増殖を誘導する。

ＢＣＬ−２ドメイン
いくつかの実施形態では、Ｂｃｌ−２ドメインポリペプチドは、Ｂｃｌ−２ファミリーの任意のメンバー及び／又はタンパク質の抗アポトーシス性が機能できるように、十分な相同性を有する任意のタンパク質であってよい。いくつかの実施形態では、Ｂｃｌ−２ドメインポリペプチドは、Ｂｃｌ−２のＢＨ１ドメインを含んでよい。いくつかの実施形態では、Ｂｃｌ−２ドメインポリペプチドは、Ｂｃｌ−２のＢＨ２ドメインを含んでよい。いくつかの実施形態では、Ｂｃｌ−２ドメインポリペプチドは、Ｂｃｌ−２のＢＨ３ドメインを含んでよい。いくつかの実施形態では、Ｂｃｌ−２ドメインポリペプチドは、Ｂｃｌ−２のＢＨ４ドメインを含んでよい。いくつかの実施形態では、Ｂｃｌ−２ドメインポリペプチドは、Ｂｃｌ−２のＢＨ１及びＢＨ２ドメイン、ＢＨ１及びＢＨ３ドメイン、ＢＨ１及びＢＨ４ドメイン、ＢＨ２及びＢＨ３ドメイン、ＢＨ２及びＢＨ４ドメイン、ＢＨ３及びＢＨ４ドメイン、ＢＨ１、ＢＨ２、及びＢＨ３ドメイン、ＢＨ２、ＢＨ３、及びＢＨ４ドメイン、又はＢＨ１、ＢＨ２、ＢＨ３、及びＢＨ４ドメインの全てを含んでよい。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ＢＨ１、ＢＨ２、ＢＨ３、又はＢＨ４のうち少なくとも１つ又はそれ以上に、少なくとも９０％同一である、例えば、ＢＨ１、ＢＨ２、ＢＨ３、及び／又はＢＨ４の少なくとも１つに、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９パーセント以上同一である限り、Ｂｃｌ−２ドメインポリペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、Ｂｃｌ−２ドメインポリペプチドは、ＢＨ１、Ｈ２及びＢＨ４ドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｂｃｌ−２ドメインポリペプチドは、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｗ、Ｂｃｌ−Ｘ、Ｂｃｌ−ＸＬ、又はＭｃｌ−１のうち、１つ又はそれ以上を含む。用語「Ｂｃｌ−２ドメインポリペプチド」は、本明細書で記載するように機能する程度において、それらのホモログを含む。したがって、Ｂｃｌ−２タンパク質の変異体もこの用語の範囲に含まれる。いくつかの実施形態では、Ｂｃｌ−２ドメインポリペプチドは、完全長Ｂｃｌ−２を包含する。いくつかの実施形態では、Ｂｃｌ−２ドメインポリペプチドは、非構造化ループドメインを欠いている、切断型のヒトＢｃｌ−２（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｔ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．１５，１６２〜７０）を含む。

いくつかの実施形態では、Ｂｃｌ−２ドメインポリペプチドは、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒｓ：ＮＭ＿０００６３３．２及び／又はＮＭ＿０００６５７．２の配列に、少なくとも４０％〜１００％同一である、例えば、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、９０％、９１％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は約４０％〜約１００％の任意のその他パーセンテージで同一であるアミノ酸配列を含む。

形質導入ドメイン
いくつかの実施形態では、Ｍｙｃポリペプチド及び／又はＢｃｌ−２ドメインポリペプチドは、タンパク質形質導入ドメインを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質形質導入ドメインはＴａｔを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質形質導入ドメインはＥＰＴＤを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質形質導入ドメインは、ｖｐｒ、Ｒ９、Ｒ１５、ＶＰ１６、アンテナペディア、アプタマー法、ｃｈａｒｉｏｔ法、Ｒ１１などのうち、少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質形質導入ドメインは、Ｍｙｃポリペプチド又はＢｃｌ−２ドメインポリペプチドに共有結合されている。いくつかの実施形態では、タンパク質形質導入ドメインは、Ｍｙｃポリペプチド又はＢｃｌ−２ドメインポリペプチドに、ペプチド結合を介して結合されている。いくつかの実施形態では、タンパク質形質導入ドメインは、Ｍｙｃポリペプチド及び／又はＢｃｌ−２ドメインポリペプチドに、短い連続中性アミノ酸からなり得るリンカー配列を介して結合されている。

いくつかの実施形態では、Ｔａｔ−Ｍｙｃポリペプチドは、図１５Ａに示されるものであり得る。いくつかの実施形態では、Ｔａｔ−Ｂｃｌ−２ドメインポリペプチド、図１５Ｂに示されるものであり得る。

培地
いくつかの実施形態では、成体幹細胞は、ＩＬ３、ＩＬ６、及び幹細胞因子のうち少なくとも１つを含む培地中で培養される。いくつかの実施形態では、成体幹細胞は、ＩＬ３、ＩＬ６、及び幹細胞因子を含む培地中で培養される。いくつかの実施形態では、成体幹細胞は、ＩＬ３、ＩＬ６、幹細胞因子、トロンボポエチン、及びＦｌｔ３−Ｌを含む培地中で培養される。いくつかの実施形態では、成体幹細胞は、ＩＬ３、ＩＬ６、幹細胞因子、トロンボポエチン、及びＦｌｔ３−Ｌ、及びＧＭ−ＣＳＦを含む培地中で培養される。いくつかの実施形態では、ＩＬ３、ＩＬ６、幹細胞因子、トロンボポエチン、Ｆｌｔ３−Ｌ、及び／又はＧＭ−ＣＳＦの量は、１０〜５００ｎｇ／ｍＬの範囲で存在してよい。

細胞の種類
いくつかの実施形態では、成体幹細胞は、１つ又はそれ以上の成体造血幹細胞である。いくつかの実施形態では、成体造血幹細胞は、細胞表面の表現型、インビトロ分化能、照射後の造血系統のインビボ再構成能、又は、連続的に移植される能力のうち、１つ又はそれ以上を特徴とできる。いくつかの実施形態では、成体造血幹細胞は、適切な細胞表面の表現型、インビトロ分化能、照射後の造血系統のインビボ再構成能、及び、連続的に移植される能力を特徴とできる。いくつかの実施形態では、成体造血幹細胞と考えられるマウス細胞において、Ｓｃａ−１＋、ｃ−ｋｉｔ＋、系統−のうち１つ又はそれ以上の表面表現型を発現でき、１回の移植当たりわずか１０個の細胞によって照射された同系マウスを再構成でき、連続継代後に照射されたレシピエントを救うことができる自己複製するＨＳＣ集団を生じる。いくつかの実施形態では、成体造血幹細胞と考えられるヒト細胞において、ＣＤ３４＋、ＣＤ３８＋／ｌｏ、系統陰性、ｆｌｋ−２−のうち１つ又はそれ以上の表面表現型を発現でき、合成メチルセルロース分化培地上でいくつかのコロニータイプと形態を生じることができ、併せて、インビトロ分化系において連続的にプレーティング可能な細胞を生じさせることができ、細胞は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γ鎖ＫＯ、又はその他著しく免疫無防備状態のマウス系統を用いる異種移植試験において、ヒト成熟造血細胞を生じることができるはずであり、この異種移植（xenotrasplant）系において、連続的に移植可能なＨＳＣを生じる。

いくつかの実施形態では、１つ又はそれ以上の成体造血幹細胞は、臍帯血、胎盤、骨髄、末梢血、動員済み末梢血、若しくは脂肪組織のうち、１つ又はそれ以上から単離される。いくつかの実施形態では、成体造血幹細胞は、胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞由来である。

いくつかの実施形態では、１つ又はそれ以上の成体幹細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、１つ又はそれ以上の成体幹細胞は、例えば、マウス、ラット、イヌ、ウマ、ネコ、ブタなどの非ヒト動物細胞である。

タンパク質
いくつかの実施形態では、タンパク質が提供される。タンパク質は、タンパク質形質導入ドメインと、細胞の生存又は増殖のうち１つ又はそれ以上を促進するＭｙｃポリペプチド（外因的に合成されてよい）と、Ｖ５ドメインと、６ヒスチジンエピトープタグと、を含む、Ｍｙｃ融合タンパク質であってよい。いくつかの実施形態では、Ｍｙｃ融合タンパク質は、３７℃、５％ ＣＯ_２による雰囲気、水溶液中という組織培養条件において、約６０分より長い半減期を有する。

いくつかの実施形態では、Ｍｙｃ融合タンパク質の半減期は約４８時間である。いくつかの実施形態では、Ｍｙｃ融合タンパク質は、約４８時間まで、例えば７２時間まで検出可能であるような、十分な半減期を有する。

いくつかの実施形態では、Ｍｙｃ融合タンパク質は、細胞内の核に輸送される。いくつかの実施形態では、Ｍｙｃ融合タンパク質は、細胞内の核に位置される。

いくつかの実施形態では、タンパク質形質導入ドメインは、任意のタンパク質形質導入ドメインであってよい。いくつかの実施形態では、タンパク質形質導入ドメインは、Ｔａｔ、Ｖｐｒ、及び／又はＥＰＴＤを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質形質導入ドメインは、ＶＰ１６、Ｒ９、Ｒ１５、又はその他タンパク質形質導入ドメインのうち少なくとも１つを含む。

いくつかの実施形態では、Ｍｙｃ融合タンパク質を任意の所望の順序で配置してよい。いくつかの実施形態では、Ｍｙｃ融合タンパク質は、ａ）Ｍｙｃポリペプチドにインフレームで連結したタンパク質形質導入ドメイン、ｂ）Ｖ５ドメインにインフレームで連結したＭｙｃポリペプチド、及びｃ）６ヒスチジンエピトープタグにインフレームで連結したＶ５ドメインの順で配置されてよい。いくつかの実施形態では、Ｍｙｃ融合タンパク質の構成要素は、ａ）タンパク質形質導入ドメインにインフレームで連結したＭｙｃポリペプチド、ｂ）Ｖ５ドメインにインフレームで連結したタンパク質形質導入ドメイン、及びｃ）６ヒスチジンエピトープタグにインフレームで連結したＶ５ドメインの順で含まれる。いくつかの実施形態では、それぞれの配列間に追加の介在アミノ酸配列を含んでよい。いくつかの実施形態では、配列の最初及び／又は最後に追加のアミノ酸配列を含んでよい。

いくつかの実施形態では、Ｍｙｃ融合タンパク質は、タンパク質形質導入ドメインと、細胞の生存又は増殖のうち１つ又はそれ以上を促進するＭｙｃポリペプチドと、短いペプチドドメインと、を含む。この短いペプチドドメインは可変であってよい。いくつかの実施形態では、短いペプチドドメインは、Ｖ５、ヒスチジンタグ、ＨＡ（赤血球凝集素）タグ、ＦＬＡＧタグ、ＣＢＰ（カルモジュリン結合ペプチド）、ＣＹＤ（ｃｏｖａｌｅｎｔ ｙｅｔ ｄｉｓｓｏｃｉａｂｌｅ ＮｏｒｐＤペプチド）、ＳｔｒｅｐＩＩ、又はＨＰＣ（プロテインＣの重鎖）のうち少なくとも１つから選択される。いくつかの実施形態では、短いペプチドドメインは、約１０又は２０のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、短いペプチドドメインは、２〜２０、例えば６〜２０個のアミノ酸の長さである。いくつかの実施形態では、短いペプチドドメインとして上記のうち２つ（例えば、Ｖ５及びｈｉｓタグ）を一緒に用いてよい。

増殖培地
いくつかの実施形態では、幹細胞増殖培地が提供される。増殖培地は、ａ）基本培地と、ｂ）ＩＬ３、ＩＬ６、幹細胞因子、トロンボポエチン、Ｆｌｔ３−Ｌ、及びＧＭ−ＣＳＦのうち少なくとも１つ又はそれ以上と、を含んでよい。いくつかの実施形態では、ＩＬ３、ＩＬ６、幹細胞因子、トロンボポエチン、Ｆｌｔ３−Ｌ、及びＧＭ−ＣＳＦを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ３、ＩＬ６、幹細胞因子、トロンボポエチン、及びＦｌｔ３−Ｌを含む。いくつかの実施形態では、増殖培地は、ＩＬ３、ＩＬ６、幹細胞因子、トロンボポエチン、Ｆｌｔ３−Ｌ、及びＧＭ−ＣＳＦを含んでよい。

いくつかの実施形態では、細胞増殖培地は、細胞の生存又は増殖のうち１つ又はそれ以上を促進するＭｙｃポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、細胞増殖培地は、細胞の生存又は増殖のうち１つ又はそれ以上を促進する外因的に合成されたＭｙｃポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、細胞増殖培地は、本明細書に提供されるＭｙｃポリペプチドを含む。

いくつかの実施形態では、幹細胞増殖培地は、アポトーシスを阻害するＢｃｌ−２ドメインポリペプチドを更に含む。いくつかの実施形態では、幹細胞増殖培地は、本明細書に提供されるＢｃｌ−２ドメインポリペプチドを更に含む。いくつかの実施形態では、幹細胞増殖培地は、アポトーシスを阻害する外因的に合成されたＢｃｌ−２ドメインポリペプチドを更に含む。

いくつかの実施形態では、任意の基本培地を利用できる。いくつかの実施形態では、基本培地は、ＳｔｅｍＳｐａｎ、Ｉｓｃｏ培地、ＲＰＭＩ、又はＤＭＥＭのうち１つ又はそれ以上を含んでよい。

追加の態様：
かかる幹細胞を得て、液体培地又は半固形培地などの初期培養条件を提供する方法は、当該技術分野において既知である。いくつかの実施形態では、幹細胞源を、組織源中又は培養中でかかる細胞を増殖又は濃縮する好適な試薬と接触させることによって、細胞をまずインビボ又はインビトロで増殖する。例えば、造血幹細胞の場合、ドナーそれぞれを、造血幹細胞を濃縮し、かかる細胞を分化せずに増殖するよう促進する薬剤、例えば５−フルオロウラシルで処理してよい。所望の幹細胞種の増殖に好適なその他の薬剤は、当業者に既知であろう。あるいは、成体幹細胞を組織源から単離して、好適な薬剤に曝露することによって、インビトロで増殖又は濃縮する。例えば、造血幹細胞に関して、成体造血系前駆細胞の増殖培養を生じさせる方法は、Ｖａｎ Ｐａｒｉｊｓ ｅｔ ａｌ．（１９９９；Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１１，７６３〜７０）に記載されている。細胞は、骨髄の採取、体液（例えば、血液）の採取、臍帯血の採取、組織パンチ、及び組織解剖を非限定的に含み、特に、皮膚、腸、角膜、脊髄、脳組織、頭皮、胃、乳房、肺（例えば、洗浄及び気管支鏡（bronchioschopy）を含む）、骨髄の細針吸引液、羊水、胎盤、及び卵黄嚢の任意の生検を非限定的に含む、任意の好適な動物から細胞サンプルを得る方法によって固体から得られる。

いくつかの実施形態では、細胞は、新鮮な、又は凍結保存された（保管された）臍帯血、胚性幹（ＥＳ）細胞のインビトロでの分化誘導によって得られ得る造血前駆細胞集団、正常の、又はｌｔ−ＨＳＣを末梢循環に動員するために誘導を受けた顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）で処理した患者の末梢血から得られた造血幹細胞（ＨＳＣ）、からも得られ得る。

いくつかの実施形態では、本明細書で産生される細胞を用いて、様々な疾患を治療できる。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法を用いて、必要とされるもののために細胞を培養できる。いくつかの実施形態では、細胞は、細胞を受け取る対象由来である（自家）。

いくつかの実施形態では、本明細書で産生される、又は、本明細書に提供される１つ又はそれ以上の構築物（タンパク質など）を含む細胞は、放射線療法及び／又は化学療法を受けた対象（例えば癌患者、又は、高線量の放射線に曝露されたもの）の治療、免疫不全症及び血液系腫瘍の治療、免疫系への老化の悪影響と戦うための骨髄移植において使用できる。いくつかの実施形態では、心疾患の治療に、又は、移植片対宿主反応の低減に使用できる。

いくつかの実施形態では、本明細書で産生される細胞は、単一遺伝子疾患の治療のための遺伝子修復法に使用できる。いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥＮ又は他の方法で遺伝子修復を受け得た自家ＨＳＣを用いて、細胞を患者に注入して戻すことができる。いくつかの実施形態では、特にこれらの修復法が細胞分裂を含むことから、遺伝子修復前後の増幅が可能である。

いくつかの実施形態では、本方法は、患者を動員できない、つまり、ＨＳＣを動員するためにＧ−ＣＳＦ処理を受けさせられない場合の疾患に適応できる。これらの場合では、少数のＨＳＣを末梢血から得て、本明細書に提供される方法によって増幅でき、うまく治療に応用することができる。これらの疾患として、リソソーム蓄積症、鎌状赤血球貧血、先天性貧血、表皮水疱症（Epidermylysis Bullosa）（４種類）などが挙げられるが、これらに限定されない。

実施例１：生物学的に活性なＴａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ−２融合タンパク質の作製
ＨＩＶ−１ Ｔａｔタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）と、ヒトＭｙｃのＯＲＦ、又は非構造化ループドメインを欠いている切断型のヒトＢｃｌ−２（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（１９９９）．Ｐｒｏｔ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．１５，１６２〜７０）のいずれかと、を有する、融合タンパク質を作製した。組み換えタンパク質は、Ｖ５ペプチドタグ及び６−Ｈｉｓタグもコードしており、検出及び精製を促進した（図１Ａ）。

ｐＴＡＴ−Ｍｙｃ−Ｖ５−６ｘＨｉｓ（Ａｍｐ^Ｒ）及びｐＴＡＴ−Ｂｃｌ２Δ−Ｖ５−６ｘＨｉｓ（Ａｍｐ^Ｒ）：ＨＩＶのインフレームＴＡＴタンパク質形質導入ドメイン（ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ）（配列番号：５）をコードするフォワードプライマーを用いて、ヒトｃＭｙｃ又はヒトＢｃｌ２をコードするｃＤＮＡのＰＣＲ増幅によって、プラスミドを作製した。ＰＣＲ産物をｐＥＴ１０１／Ｄ−Ｔｏｐｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクターにクローニングした。Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＃２００５２１−５）を用いて、ＢＣＬ−２コード配列から非構造化ループ（Ａ．Ａ．＃２７−８０）を取り出した。

タンパク質をＥ．ｃｏｌｉ内で合成し、均一になるまで精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動及びクマシー染色により、我々の実験で用いた最終産物の純度が明らかとなった（図１Ｂ）。ｐＴＡＴ−Ｍｙｃ−Ｖ５−６×Ｈｉｓで、ＢＬ２１−ＳＴＡＲ（ＤＥ３）細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換し、０．５ｍＭ ＩＰＴＧを用いて３７℃において３時間、タンパク質を誘導した。細胞を、溶解用緩衝液（８Ｍ尿素、１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭトリスｐＨ ７．０まで、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ ７．２）中で溶解した。溶解物を６Ｍ尿素で希釈し、４５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、５ｍＭトリスｐＨ ７．０にした。溶解物を、室温にて１時間、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（５００単位）で処理し、１２，０００ＲＰＭで６０分間、遠心分離によって清浄化し、２２μＭのフィルターを通した。Ｍｙｃ−Ｖ５−６×Ｈｉｓを、ＧＥ ＡＫＴＡ ｐｕｒｉｆｉｅｒ １０ ＦＰＬＣを用いてニッケルアフィニティカラム（ＧＥ）で精製した。Ｍｙｃ−Ｖ５−６×Ｈｉｓを、透析用緩衝液（４５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、５ｍＭトリスｐＨ ７．０、５％グリセロール、１ｍＭ ＤＴＴ）に透析することによってリフォールディングした。精製タンパク質をＡｃｔｉｃｌｅａｎ Ｅｔｏｘカラム（Ｓｔｅｒｏｇｅｎ）に通すことによって、エンドトキシンを減少させた。

Ｂｃｌ２Δ−Ｖ５−６×Ｈｉｓタンパク質を上記のように誘導した。細胞を、１Ｌの誘導タンパク質当たり、５００単位のＢｅｎｚｏｎａｓｅ、１ｍＭのＰＭＳＦ、２μｇ／ｍＬのロイペプチン、０．０１５単位／ｍＬのアプロチニン、５μＭの鶏卵リゾチーム（ＨＥＬ）を補充した、５０ｍＬの溶解用緩衝液（２００ｍＭ ＮａＣＬ、２００ｍＭ ＫＣＬ、５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、５ｍＭトリスｐＨ ７．０、５％グリセロール、１ｍＭ ＤＴＴ）に溶解し、直ちに氷上に１時間置いた。細胞を、２分間ずつ２回、氷上で超音波処理した（デューティー比＝５０％、出力＝５）。溶解物を、１２，０００ＲＰＭで６０分間、遠心分離によって澄明にし、０．２２μＭのフィルターを通した。Ｂｃｌ２Δ−Ｖ５−６×Ｈｉｓをニッケルアフィニティカラム（ＧＥ）で精製し、上述のようにエンドトキシンを除去した。

実施例２：Ｔａｔ−融合タンパク質の適切な局在性の確認
融合タンパク質は、適切な細胞内区画（図１Ｃ）に局在する。ＮＩＨ ３Ｔ３細胞を、６ウェルプレート中でカバーガラス上に播種し、３０〜４０％のコンフルエンスまで増殖した。各ウェルを、１０μｇ／ｍＬのＴａｔ−Ｍｙｃ若しくはＴａｔ−Ｂｃｌ−２で形質導入し、又は陰性対照として処理しなかった。タンパク質形質導入の２時間後、細胞を、４％パラホルムアルデヒド−ＰＢＳ中で１０分間室温（ＲＴ）にて固定した。細胞を、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を補充したＰＢＳ中で、ＲＴにて３分間透過処理した。Ｖ５マウスモノクローナル抗血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＰＢＳ−１％ ＢＳＡで希釈したもの（１：１，０００）で、細胞を４５分間インキュベートした。細胞を洗浄し、ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ ４８８二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａ２１１２１）と共に３０分間インキュベートした。カバーガラスを、５０％グリセロールの１０μＬの液滴と、１μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔと共に、スライドガラス上に乗せた。Ｚｅｉｓｓ Ｉｍａｇｅｒ Ｚ１蛍光顕微鏡で画像を得た。

Ｔａｔ−Ｍｙｃは、迅速に初代ヒトＨＳＣの核に局在した（図１Ｄ）。Ｔａｔ−融合タンパク質は、ＨＳＣ中で７２時間後に完全に分解される（図１Ｅ）。胎児臍帯血細胞に、Ｔａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ２Δを１時間形質導入し、その後３回ＰＢＳで洗浄した。形質導入２時間後、５×１０^６個の細胞を回収し、核及び細胞質画分を単離した。続く５日間、２４時間毎に細胞（５×１０^６個）を回収した。核及び細胞質タンパク質を、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ７．６）、１０ｍＭ ＮａＣｌ_２、３ｍＭ ＣａＣｌ_２、及び０．５％ ＮＰ４０に細胞を溶解することによって調製した。核を沈殿させ、細胞質を含有する上清画分をトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）と共に沈殿させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥに続き、抗Ｖ５抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、抗ヒトβ−アクチン（ａｂｃａｍ）、及びヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ又はヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いるウエスタンブロットによって検査した。

実施例３：Ｔａｔ−融合タンパク質を用いる細胞の生存及び増殖
処理を行わずに、活性化マウスＣＤ４＋Ｔ細胞を、サイトカイン欠乏後のアポトーシスに進める。Ｔａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ−２は、活性化初代ＣＤ４＋Ｔ細胞を、サイトカイン休薬によって誘発されたアポトーシスから用量依存的に救済する（図２Ａ及び２Ｂ）。Ｔａｔ−Ｍｙｃの存在下で活性化された初代マウスＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｔａｔ−Ｃｒｅ存在下で活性化された細胞と比較するとき、しっかりとした増殖を示した（図２Ｃ及び２Ｄ）。

全てのマウスは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｏｌｏｒａｄｏ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ ＭｅｄｉｃｉｎｅのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅｒｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された実験プロトコール（プロトコール番号Ｂ−８７７０９（０３）１Ｂ−１及び８７７０９（０９）２Ｅ）に従って処理した。安楽死させたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）から脾臓を採取し、機械的に分離させることによって単一の細胞懸濁液を得た。細胞を、ＴＡＣ緩衝液（１３５ｍＭ ＮＨ_４ＣＬ、１７ｍＭトリスｐＨ ７．６５）で処理して、赤血球を溶解した。Ｔ細胞を、１ｍｇ／ｍＬの抗ＣＤ３（モノクローナル抗体２Ｃ１１）を補充したＣ１０培地（５００ｍＬ瓶のＲＰＭＩ １６４０、１０％ ＦＢＳ、１００単位／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ＭＥＭ非必須アミノ酸０．５５ｍＭ、β−メルカプトエタノール１ｍＭ、ピルビン酸ナトリウム１００ｍＭ）中で、２日間活性化した。リンパ芽球の生細胞をＦｉｃｏｌクッション上に回収し、Ｔａｔ融合タンパク質を含む、又は含まない完全培地中で１ウェル当たり１×１０^６個の細胞として、２４ウェルのディッシュウェル内に播種した。ＣＦＳＥのフローサイトメトリー分析によって細胞分裂特性を判定した。

実施例４：Ｔａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ−２によるマウスＨＳＣの増殖
４〜６週齢の雌性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスのコホートを、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から入手した。５ｍｇ／マウスの５−フルオロウラシル（５ＦＵ）を用いて、マウスの静脈内に投与した。５ＦＵ処理５日後に、頚骨及び大腿骨から骨髄（ＢＭ）細胞を採取した。５ｍＬの無菌ＴＡＣ緩衝液（１３５ｍＭ ＮＨ４ＣＬ、１７ｍＭトリスｐＨ ７．６５）中でインキュベートすることによって、赤血球を溶解した。５μｇ／ｍＬの組み換えＴａｔ−Ｍｙｃ及び１０μｇ／ｍＬの組み換えＴａｔ−Ｂｃｌ−２を補充したＢＭ培地（１５％ ＦＣＳ、１００単位／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン、ＭＥＭ ＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ）、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、組み換えマウスＩＬ−３、ＩＬ−６、及びＳＣＦを含むＤＭＥＭ）中で、骨髄細胞を増殖させた。

Ｄ１０培地（ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１００単位／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン、ＭＥＭ ＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ））中、プレート当たり１２×１０６個の細胞において、１５０ｍｍのプレートに２９３ＦＴ細胞をプレーティングすることによって、サイトカインを調製した。リン酸カルシウムを用いて、１０μｇのｐｃＤＮＡ３．１−ＳＣＦ、１０μｇのｐｃＤＮＡ３．１−ＩＬ３、及び１０μｇのｐｃＤＮＡ３．１−ＩＬ６、又は１０μｇのｐｃＤＮＡ３．１−ＴＰＯ、１０μｇのｐｃＤＮＡ３．１−Ｆｌｔ３−Ｌ、及び１０μｇのｐｃＤＮＡ３．１−ＧＭ−ＣＳＦからなる、プレート当たり合計３０μｇのＤＮＡを細胞に形質移入した（Ｙｏｕｎｇ，Ｒ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２００８）．Ｂ−ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｏｆ Ｂ−ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｆｕｔｕｒｅ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，４，５９１〜４．）。翌日、培地を除去して、１００ｍＬのＤ１０培地に交換した。３７℃／５％ ＣＯ２で、細胞を４〜５日間インキュベートした。培地を回収し、濾過滅菌して、３０ｍＬの部分標本にして−２０℃で凍結した。

Ｔａｔ−融合タンパク質を新しくするために４８時間毎にＢＭ培地を交換しながら、２８日間細胞を培養した。対照として、サイトカイン及びＴａｔ−Ｃｒｅを含む培地中で、骨髄細胞を培養した。図３Ａ及び表１は、培養２８日間後に得られたＨＳＣ集団のフローサイトメトリーによる特性を示す。ＦＡＣＳ分析は、Ｓｃａ−１／ｃ−ｋｉｔ集団（ｌｉｎ−）が引き続き濃縮されているが、他の全ての細胞種は２８日間で減少したことを示す。

Ｔａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ−２処理細胞は、高レベルのｃ−Ｋｉｔ及びＳｃａ−１を発現し、系統マーカーに陰性である（表２）。

加えて、ＣＦＳＥによる細胞画分の標識化によって、これらの培養条件下で維持されるとき、ＨＳＣが活発に増殖することを示す（図３Ｂ）。ＨＳＣの全体的な増殖特性を図３Ｃ及び表１に示すが、最終的には２８日間培養するとマウスＨＳＣの２６９倍の増殖が得られる。

実施例５：Ｔａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ−２で増殖させたマウスＨＳＣの移植
少数のインビトロで増殖させたＨＳＣを、致死量以下で照射されたＲａｇ−１^−／−マウスに移植した。Ｒａｇ１^−／−マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）への移植は、Ｒａｇ１^−／−マウスが、ＢＭ細胞を尾静脈から注入される直前に、３５０ラドの放射線を照射された以外は、ＮＳＧマウスについて記載された方法で行った。

移植４週間後、成熟Ｔ及びＢ細胞の存在についてマウスを調べた。１０、１００、又は１０００個のインビトロで増殖させたＨＳＣの移植後、成熟した、Ｂ２２０／ＣＤ１９を発現しているＢ細胞、及びＴＣＢβ／ＣＤ４を発現しているＴ細胞が、ＨＳＣキメラマウスの末梢血中に存在していた（図４Ａ、４Ｂ、及び表３）。

成熟Ｔ及びＢ細胞は、ＨＳＣキメラマウスのリンパ節、脾臓、胸腺及び骨髄中にも検出された（図４Ｃ）。

キメラマウスの脾臓から得られた成熟マウスＴ及びＢ細胞をＣＦＳＥで標識し、ＣＤ３（Ｔ細胞）又はＣＤ４０及びＩｇＭ（Ｂ細胞）に対するモノクローナル抗体で活性化した。抗原受容体を通して活性化された後に、成熟リンパ系細胞が破裂して細胞分裂を起こすことができた（図４Ｄ）。更に、初期セットのＨＳＣキメラマウスから得られた骨髄細胞を、連続移植実験に用いた。表４は、連続的に移植されたＲａｇ−１^−／−マウスの末梢血中に検出された、成熟Ｔ及びＢ細胞の頻度を示す。

実施例６：Ｔａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ−２によるヒト臍帯血由来ＨＳＣの増殖
地元の臍帯血バンクが廃棄したサンプルから、新鮮な臍帯血細胞を入手した。ヒト細胞を全て匿名化し、ＩＲＢの監視を免除した。臍帯血は、Ｏ＋、Ｏ−、Ａ＋、Ａ−、Ｂ＋、Ｂ−、及びＡＢ＋を含んでおり、これらの全てはほぼ同じ増殖特性を示した。

総臍帯量を２０ｍＬの一定分量に分け、ＰＢＳで１：１に希釈した。希釈した臍帯血（２０ｍＬ）を、２０ｍＬのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃａｔ＃ １７−１４４０−０３）に静かに重層した。細胞を９００×ｇで６０分間遠心した。ガラス製ピペットでバフィーコートを除去し、ＰＢＳで２回洗浄した。細胞を、ＦＣＢ培地（１０％のヒト血漿、１００単位／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン、３０ｍＬのＳＣＦ、ＩＬ３及びＩＬ６を含有する培地、並びに、３０ｍＬのＴＰＯ、ＦＬＴ３−Ｌ、及び上記ＧＭ−ＣＳＦを含有する培地を補充したイスコフ培地（Ｇｉｂｃｏ））に再懸濁した。胎児臍帯血（ＦＣＢ）細胞に添加する直前、ＦＣＢ培地に、５μｇ／ｍＬの組み換えＴａｔ−Ｍｙｃ、及び１０μｇ／ｍＬの組み換えＴａｔ−Ｂｃｌ−２を更に補充した。増殖期間中、３日毎に培地を交換した。

サイトカイン混合物は、ＩＬ３、ＩＬ６、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３−Ｌ、ＳＣＦ、及びＧＭ−ＣＳＦを含んでおり、これら６つのサイトカインを組み合わせる以前に報告された培地（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２４，２４５６〜６５）と、並びに、組み換えＴａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ−２を添加することによって異なっている。インビトロで増殖させたヒトＨＳＣの表面表現型を評価すると、Ｔａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ−２の存在下で長期間培養した後に、ヒトＨＳＣがその表面特性を維持していることがわかった（図５Ａ）。この条件群は、培養１４日間でＣＤ３４＋細胞の数が８６．４倍に上昇し、培養２１日間で未分画臍帯血由来のヒトＣＤ３４＋細胞の数が１０３．８倍に上昇する結果をもたらした（図５Ｂ）。

実施例７：Ｔａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ−２によって増殖させたヒトＣＢ ＨＳＣは、インビトロ及びインビボで生物学的に活性である
インビトロで増殖させたヒトＨＳＣを、ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ Ｏｐｔｉｍｕｍ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にプレーティングし、特定のコロニータイプを生じさせる能力について調べた。インビトロで増殖させたヒトＨＳＣは、ＣＦＵ−Ｇ、ＣＦＵ−Ｍ、ＣＦＵ−ＧＭ及びＢＦＵ−Ｅコロニーを生じさせることができる（図５Ｃ及び５Ｄ）。加えて、Ｔａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ−２の存在下で増殖したＨＳＣの表面表現型は、培養中保存されていたが、これらの条件下では、コロニー形成単位の量が顕著に濃縮された（図５Ｄ）。Ｔａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ−２の存在下で増殖したＣＤ３４＋細胞は、新たなＢＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−Ｍ、ＣＦＵ−Ｇ及びＣＦＵ−ＧＭコロニーを生じさせることもできたが、一方、培地のみで培養されたＣＤ３４＋細胞は新たなコロニーを生じさせなかった（図５Ｅ）。

インビトロで増殖したヒトＣＤ３４＋細胞の、インビボで成熟ヒト造血性系統を生じさせる能力を検査する実験のため、レシピエントとしてＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ｇｃ−／−マウス（ＮＳＧ）マウスを使用した。これは、この目的で有用な、確認されたマウスモデルである（Ｔａｎａｋａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２０１２）．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｍａｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｈｕｍａｎ ｍｙｅｌｏｉｄ ｓｕｂｓｅｔｓ ｉｎ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ−ｅｎｇｒａｆｔｅｄ ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２ｒｇＫＯ ｍｉｃｅ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８８，６１４５〜５５。）。

胎児臍帯血細胞（ＦＣＢ）を、投与直前に１８０ラドの照射を受けたＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ｇｃ−／−マウス（ＮＳＧ）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に投与した。増殖したＦＣＢをＰＢＳで３回洗浄し、２００μＬのＰＢＳにおいて尾静脈から投与した。移植８週間後、マウスの尾静脈から出血させ、抗ヒトＣＤ３（ｈＣＤ３）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ Ｃａｔ＃ ３００３１２）、抗ヒトＣＤ１９（ｈＣＤ１９）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ Ｃａｔ＃ ３０２２０８）、及び抗ヒトＣＤ４５（ｈＣＤ４５）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ Ｃａｔ＃ ３０４０２８）を用いて、フローサイトメトリーによって再構成について評価した。

１×１０７個の未分画臍帯血細胞を用いて、ＮＳＧキメラマウス中で産生されたヒトＣＤ４５＋を発現するＴ及びＢ細胞が、短時間で成長することが観察された。しかしながら、Ｔａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ−２と共に１４日間培養することによってインビトロで産生された、１×１０６個のタンパク質を形質導入した長期（ｐｔｌｔ）−ＨＳＣを誘導すると、異種キメラＮＳＧマウスにおいてヒトＣＤ４５＋細胞がより高頻度であるという結果となった。加えて、ヒトＣＤ４５＋細胞は、移植後２０週間までマウスの末梢血中に観察できた（図６Ａ）。ヒトＣＤ４５＋、ＣＤ３４＋ＣＤ３８^ｌｏ ＨＳＣは骨髄中に見られ（図６Ｂ）、ヒトＣＤ４５＋／ＣＤ３＋及びヒトＣＤ４５＋／ＣＤ１９＋リンパ系細胞は脾臓中に見られ、ヒトＣＤ４５＋、ＣＤ３＋リンパ系細胞は異種キメラマウスの胸腺中に見られた。

異種キメラＮＳＧマウスの脾臓由来のヒトＣＤ４５＋ＣＤ１９＋細胞を、ＣＦＳＥで標識し、ヒトＣＤ４０及びＩｇＭに対するモノクローナル抗体で活性化した。７２時間目に、フローサイトメトリーでＣＦＳＥの希釈について細胞を分析した。図６Ｃは、異種キメラＮＳＧマウスにおいてインビボで発生したヒトＢ細胞の増殖特性を示す。

異種キメラＮＳＧマウスの骨髄由来のヒトＣＤ４５＋、ＣＤ３４＋ＣＤ３８^ｌｏ ＨＳＣを用いて、ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ Ｏｐｔｉｍｕｍに播種した。これらの細胞は、ＭｅｔｈｏＣｕｌｔプレートにおいてコロニーを生じ（図６Ｄ）、一部のコロニーは、連続して再プレーティングした後でも観察できた（図６Ｅ）。両方の場合においてコロニー数は、Ｔａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ−２と共に１４日間培養されたヒト臍帯血細胞で再構成されたＮＳＧマウスの方が、新鮮な未操作のヒト臍帯血細胞で再構成されたＮＳＧマウスで観察された細胞よりも顕著に高かった。

加えて、Ｔａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ−２を加えたサイトカイン混合物中において、インビトロで予め増殖させた１０６個の臍帯血細胞（黒四角）を移植された異種キメラマウスコホートを、骨髄系リンパ系細胞分化について評価した。骨髄細胞（図６Ｆ）及び脾臓細胞（図６Ｇ）のＣＤ４５陽性集団を、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３、及びＣＤ１９の発現について解析した。これら異種キメラマウスの骨髄及び脾臓中で、骨髄系及びリンパ系の両方の細胞において分化が観察された。

実施例８：Ｔａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ−２によるヒトＧ−ＣＳＦ動員済み末梢血ＨＳＣの増殖
自家ＨＳＣ移植のためにＧ−ＣＳＦ動員を受けた５人の患者の浄化血液１ｍＬから、Ｇ−ＣＳＦ動員細胞を入手した。全てのＧ−ＣＳＦサンプルを再識別し、これらの試験に用いた細胞に関する更なる識別情報を関連付けなかった。１０ｍＬのＦＣＢ培地に細胞を滴下した。この細胞をＦＣＢ培地で２回洗浄し、１０ｍＬ量中、５μｇ／ｍＬの組み換えＴａｔ−Ｍｙｃ及び１０μｇ／ｍＬの組み換えＴａｔ−Ｂｃｌ−２で処理した。細胞（５×１０^６個）を、Ｇ−Ｒｅｘ １００細胞増殖用容器（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ）に、製造業者の推奨に従って播種した。

この細胞を、サイトカインにＴａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ２を加えた培地中で１４日間増殖させた。増殖したＨＳＣのＦＡＣＳ特性は、ｈＣＤ４５＋、ＣＤ３４＋、ＣＤ３８ｈｉ、ＣＤ１３３＋の、異なった細胞集団を示す（図７Ａ）。細胞の増殖速度を図７Ｂに示す。

成人型ＧＣＳ−Ｆで動員したＨＳＣの増殖したものを、ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ Ｏｐｔｉｍｕｍにプレーティングし、インビトロでの分化能の特徴を確認した。骨髄赤血球分化を支持する培地において通常見られる４種類のコロニータイプが観察され（図７Ｃ）、これらのコロニータイプのうち一部は、連続して再プレーティングしても見られた。

増殖した成人ＨＳＣは、致死量以下で照射されたＮＳＧマウスを再構成することができた。図７Ｄは、１２週間前に、１０６個の増殖したＧ−ＣＳＦ及びＴａｔ−Ｍｙｃ／Ｔａｔ−Ｂｃｌ−２動員ＨＳＣ（１つ目の図）、又は５×１０６個の新鮮な未操作臍帯血細胞（２つ目の図）のいずれかを移植されたＮＳＧマウスの骨髄における、ＣＤ４５＋染色のＦＡＣＳ分析を示す。

Ｔａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ−２と共に培養されたＧ−ＣＳＦ動員細胞によって作製されたＮＳＧ異種キメラマウスを安楽死させ、更なる分析のために骨髄、脾臓及び胸腺を採取した。増殖させた成人ＨＳＣで再構成した異種キメラＮＳＧマウス由来のリンパ系器官を分析すると、これらマウスの骨髄（図７Ｅ；１つ目の図）中にヒトＣＤ４５＋、ＣＤ３４＋ＣＤ３８^ｌｏ細胞があり、脾臓（図７Ｅ；２つ目の図）及び胸腺（図７Ｅ；３つ目の図）中にヒトＣＤ４５＋、ＣＤ３＋リンパ系細胞があることを示した。これらのデータを合わせると、ヒトＧ−ＣＳＦで動員した成人の血液から得られたＨＳＣ集団の増殖に成功できることが示される。

Ｔａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ−２を加えたサイトカイン混合物中においてインビトロで増殖させた１０^６個の増殖済みのＧ−ＣＳＦ動員細胞（黒四角）を移植した異種キメラマウスのコホートを、骨髄系リンパ系細胞分化について評価した。骨髄細胞（図７Ｆ）及び脾臓細胞（図７Ｇ）ＣＤ４５陽性集団を、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３、及びＣＤ１９の発現について解析した。これら異種キメラマウスの骨髄及び脾臓中で、骨髄系及びリンパ系の両方の細胞において分化が観察された。更に、フローサイトメトリーでＣＦＳＥの希釈によって特定されたように（図６Ｃ）、初代異種移植（xenotranplant）由来の成熟ヒトＢ細胞は、インビトロで抗原受容体の刺激に応答した。初期連続移植によって発生した成熟ヒトＢ細胞を、インビトロにおいてＩｇＭ及びＣＤ４０に対する抗体で活性化したとき、同様の観察結果が得られた（図８）。

この方法は、現状の方法（Ｓｉｄｅｒｉ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２０１１）．Ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｎ ｄｏｕｂｌｅ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ ９６，１２１３〜２０。）による平均的な大きさの成人の移植に必要な、十分な数のＨＳＣを産生できる。

実施例９：生物学的に活性なＭｙｃ融合タンパク質の作製
実施例１に記載されるＴａｔ−Ｍｙｃ融合タンパク質に加え、同実施例に記載のものと同じ方法を使用して、５種類のＭｙｃ融合タンパク質を作製して精製した。インフレームＮ末端ＰＴＤ−アミノ酸配列を含むフォワードプライマー及び終止コドンを除去したリバースプライマーを用いて、コード領域をＰＣＲ増幅することによって、プラスミドを作製した。その後、Ｃ末端Ｖ５エピトープ及び６×ヒスチジン精製タグを含む、ｐＥＴ１０１／Ｄ−Ｔｏｐｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクターに、ＰＣＲ産物をクローニングした。図９Ａは、実施例１のＴａｔ−Ｍｙｃと比較した、Ｍｙｃ融合タンパク質の図式表示を示す。それぞれにおいて、タンパク質形質導入（ＰＴＤ）を、Ｍｙｃポリペプチドの前又は後にインフレームで融合する。

タンパク質形質導入ドメインは、Ｔａｔ、ＥＰＴＤ、及びＶｐｒを含んだ。ＥＰＴＤは、Ｈｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎｓ：ｅｎｈａｎｃｅｄ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２００１）６１：４７４〜４７７）が選び取った最適化タンパク質形質導入ドメイン（ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ、配列番号：６）である。Ｖｐｒ形質導入ドメインは、Ｔａｇｕｃｈｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．（Ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ ｏｆ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｂｙ ａｎ ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄｅ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ Ｖｐｒ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ−１．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（２００４）３２０（１）：１８〜２６）によって同定された。

Ｍｙｃは、実施例１に記載されるポリペプチドのＯＲＦ、又は、以前Ｈｕａｎｇ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．（Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｙｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｙ ｔｈｅ ｓｔｒｅｓｓ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｋｉｎａｓｅ Ｐａｋ−２．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ（２００４）２４（４）：１５８２〜９４）によって説明された３ＡＭｙｃ配列のいずれかとした。組み換えタンパク質は、Ｖ５ペプチドタグ及び６−Ｈｉｓタグもコードしており、検出及び精製を促進した（図９Ａ）。

実施例１０：活性化Ｔ細胞の生存アッセイ
実施例９に記載されるＭｙｃ融合タンパク質（Ｔａｔ−Ｍｙｃ、Ｔａｔ−３ＡＭｙｃ、ＥＰＴＤ−Ｍｙｃ、Ｖｐｒ−Ｍｙｃ、及びＭｙｃ−Ｖｐｒ）のＭｙｃの生物学的活性について、活性化Ｔ細胞生死判別アッセイにおいて調べた（図９Ｂ）。Ｃ５７ＢＬ．６ｊ（Ｊａｃｋｓｏｎ）マウスから脾臓を回収し、ワイヤーメッシュ（wire mess）を通して機械的に分離した。赤血球を除去し、１μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３（２ｃ１１）でＴ細胞を活性化した。細胞を、２４ウェル多穴ディッシュに、１ｍＬの培地中１ウェル当たり３×１０＾６個の細胞でプレーティングした。４８時間後、生細胞をＦｉｃｏｌクッション上に捕捉して洗浄し、２４ウェル多穴ディッシュに、１ウェル当たり１〜１．５×１０＾６個の細胞でプレーティングした。ＰＴＤ−Ｍｙｃタンパク質を、Ｔ細胞に対して、０．５、１、５、１０、２５、又は５０μｇ／ｍＬでタイトレーションした。ＰＴＤ−Ｍｙｃタンパク質処理４８時間後、細胞をフローサイトメトリーによって生存率について評価した（前方×側方錯乱）。図９Ｂにおいて示されるデータは、２５μｇ／ｍＬタンパク質処理のものである。

図９Ｂに示されるように、Ｔａｔ−３ＡＭｙｃ以外の調べた構築物は全て、未処理対照よりも４８時間後のＴ細胞の生存率が高かった。しかしながら、実施例１に記載したＴａｔ−ＭｙｃよりもＴ細胞の生存率が高い構築物は得られなかった。

同様の実験における、様々な濃度におけるＴａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ−２の活性を、以下の表５に示す。Ｃ５７ＢＬ．６ｊ（Ｊａｃｋｓｏｎ）マウスの脾臓由来のＴ細胞を、１μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３（２ｃ１１）で活性化する。活性化後（４８時間後）、細胞を洗浄して約１〜１．５×１０^６個の細胞／ウェルでプレーティングし、融合タンパク質（Ｔａｔ−Ｍｙｃ又はＴａｔ−Ｂｃｌ−２）を様々な濃度（０．５、１、５、１０、２５、又は５０μｇ／ｍＬ）で加えた。４８時間後、以下の表５に示すように、生細胞の割合をフローサイトメトリー（前方×側方散乱）で決定した。

Ｔａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ−２の両方で、並びに調べた全ての濃度において、いずれの融合タンパク質も含まずにインキュベートした細胞と比較して、細胞生存率及び／又は増殖が上昇する。

同じ方法を用いた別の実験において、図１０は、５０μｇ／ｍＬの融合タンパク質で処理した活性化Ｔ細胞に関するライブゲートのＦＡＣＳデータを示し、Ｔａｔ−Ｂｃｌ−２及びＴａｔ−Ｍｙｃを対照（ＴＡＴ−Ｃｒｅ又は未処理）と比較する。示されるように、Ｔａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ−２の処理両方によって、Ｔ細胞の生存及び／又は増殖を顕著に改善する結果が得られる。

実施例１１：ＣＤ３４＋増殖に対するサイトカイン混合物の評価
基本培地中の様々なサイトカイン混合物の、幹細胞の生存及び／又は増殖を支持する能力について試験を行った。

０日目、単核性細胞を濃縮して赤血球を除去するために、臍帯血をＦｉｃｏｌｌ勾配に重層した。その後細胞を洗浄し、ＳｔｅｍＳｐａｎ培地のみ、又は以下の表６に示す様々なサイトカインの組み合わせを含めてインキュベートした。

サイトカインを産生させるため、Ｄ１０培地（ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１００単位／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン、ＭＥＭ ＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ））中、プレート当たり１２×１０６個の細胞において、１５０ｍｍのプレートに２９３ＦＴ細胞をプレーティングした。リン酸カルシウムを用いて、１０μｇのｐｃＤＮＡ３．１−ＳＣＦ、１０μｇのｐｃＤＮＡ３．１−ＩＬ３、及び１０μｇのｐｃＤＮＡ３．１−ＩＬ６、又は１０μｇのｐｃＤＮＡ３．１−ＴＰＯ、１０μｇのｐｃＤＮＡ３．１−Ｆｌｔ３−Ｌ、及び１０μｇのｐｃＤＮＡ３．１−ＧＭ−ＣＳＦからなる、プレート当たり合計３０μｇのＤＮＡを細胞に形質移入した。翌日、培地を除去して、１００ｍＬのＤ１０培地に交換した。３７℃／５％ ＣＯ_２で、細胞を４〜５日間インキュベートした。培地を回収し、濾過滅菌して、３０ｍＬの部分標本にして−２０℃で凍結した。培地ボトル５００ｍＬ当たり、３０ｍＬの、ＩＬ３、ＩＬ６、ＳＣＦの３種のサイトカインを含む条件培地、及び、３０ｍＬの、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３−Ｌ、ＧＭ−ＣＳＦを含む条件培地を加えることによって、増殖培地にサイトカインを添加した。

４、７、１０、１３、１６、及び１９日目、サンプルを採取し、標準的な手法を用いてフローサイトメトリーでＣＤ３４＋細胞の割合を決定した。０日目の後は、サイトカインを再補充しなかった。表６に示されるように、ＳｔｅｍＳｐａｎ培地＋Ｉｌ−３、Ｉｌ−６、ＴＰＯ（トロンボポエチン）、Ｆｌｔ３−Ｌ、及びＧＭ−ＣＳＦの組み合わせは、最も良好な細胞の生存及び増殖を示した（例えば１３日目を参照）。

Ｔａｔ融合タンパク質（ＴＭＴＢ）を含む又は含まない、基本培地中の様々なサイトカイン混合物の、幹細胞の生存及び／又は増殖を支持する能力について試験を行った。

臍帯血をＦｉｃｏｌ密度勾配上で調製し、赤血球を除去した。２０，０００個の有核細胞を、２４ウェルディッシュのウェル内にプレーティングした。幹細胞因子、ＩＬ３、及びＩＬ６（Ｓ３６）；Ｓ３６＋５μｇ／ｍＬのＴａｔ−Ｍｙｃ及び５μｇ／ｍＬのＴａｔ−Ｂｃｌ２；ＴＰＯ、幹細胞因子（Stem Cell Fact）、Ｆｌｔ３−Ｌ、ＩＬ３、及びＩＬ６（ＴＳＦ３６）；ＴＳＦ３６＋５μｇ／ｍＬのＴａｔ−Ｍｙｃ及び５μｇ／ｍＬのＴａｔ−Ｂｃｌ２；ＴＰＯ、幹細胞因子、Ｆｌｔ３−Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ６、ＧＭ−ＣＳＦ（ＴＳＦ３６Ｇ）；並びに、ＴＳＦ３６Ｇ＋５μｇ／ｍＬのＴａｔ−Ｍｙｃ及び５μｇ／ｍＬのＴａｔ−Ｂｃｌ２、を含むＳｔｅｍＳｐａｎに、細胞を播種した。培地及びＴａｔ−融合タンパク質を３日毎に交換した。１３日目にフローサイトメトリーによって、ＣＤ３４陽性系統陰性ＨＳＣについて細胞を評価した。

図１１に示されるように、ＴＳＦ３６Ｇ＋融合タンパク質は、最も高い生存率及び増殖をもたらした。別の実験では、このサイトカイン＋融合タンパク質の組み合わせは、コロニー形成アッセイ及び異種キメラマウスのインビボ再構成において、融合タンパク質を含まないサイトカイン混合物から得られた細胞よりも、顕著に優れた細胞を産生することが示された（図１２〜１４）。

異種キメラマウスのインビボ再構成実験では、臍帯血細胞をＦｉｃｏｌ勾配上で調製した。バフィーコートを除去し、細胞をＰＢＳで３回洗浄した。１０％のヒト血漿、１００単位／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン、３０ｍＬのＳＣＦ、ＩＬ３及びＩＬ６を含有する培地、並びに、３０ｍＬのＴＰＯ、ＦＬＴ３−Ｌ、及びＧＭ−ＣＳＦを含有する培地、を補充したイスコフ培地（Ｇｉｂｃｏ）からなるＦＣＢ（胎児臍帯血）培地に、臍帯血細胞の半分を播種した。上記に加え、５μｇ／ｍＬの組み換えＴａｔ−Ｍｙｃ及び５μｇ／ｍＬの組み換えＴａｔ−Ｂｃｌ−２を更に補充したＦＣＢ培地に、細胞の残りの半分を播種した。

細胞を１１日間増殖させた。１３日目、細胞を遠心し、１０ｍＬの新しいＦＣＢ培地に再懸濁した。元々Ｔａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ２で処理した細胞を、５μｇ／ｍＬの組み換えＴａｔ−Ｍｙｃ及び５μｇ／ｍＬの組み換えＴａｔ−Ｂｃｌ−２によって、３７度で１時間再度処理した。両方のＦＣＢ細胞集団を、マウスに投与するためにＰＢＳで３回洗浄した。

増殖させた細胞を、投与直前に１８０ラドの照射を受けたＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ｇｃ^−／−マウス（ＮＳＧ）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に投与した。２００μＬのＰＢＳ中の増殖させた細胞を、尾静脈からＮＳＧマウスに投与した。移植８週後、骨髄（ＢＭ）、脾臓、及び胸腺のヒトＨＳＣの再構成について、フローサイトメトリーによって評価した（図１２〜１４）。移植に先立ってＴａｔ−Ｍｙｃ及びＴａｔ−Ｂｃｌ２で前処理した各組織由来の細胞は、融合タンパク質で前処理しなかった細胞と比較して、ヒトＣＤ４５＋細胞の顕著な増加を示した。

実施例１２：Ｂｃｌ−２の評価
３Ｔ３細胞に、Ｔａｔ−Ｂｃｌ２を１時間形質導入し、その後３回ＰＢＳで洗浄した。形質導入２時間後、細胞をトリプシン処理し、数えてから、５×１０^６個を回収した。核及び細胞質画分を単離した。続く５日間、２４時間毎に５×１０^６個の細胞を回収した。核及び細胞質タンパク質を、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ７．６）、１０ｍＭ ＮａＣｌ_２、３ｍＭ ＣａＣｌ_２、及び０．５％ ＮＰ４０に細胞を溶解することによって調製した。核を沈殿させ、細胞質を含有する上清画分をトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）と共に沈殿させた。抗Ｖ５抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いてウエスタンブロットを調べた。

２４及び４８時間において、細胞質画分中にＴａｔ−Ｂｃｌ２が観察された。そのシグナルは、形質導入７２時間後までに減少し始め、９６時間時点では見られなかった。

Ｔａｔ−Ｂｃｌ２、Ｔａｔ−Ｂｃｌ２Δ、ＥＰＴＤ−Ｂｃｌ２、ＶＰＲ−Ｂｃｌ２、ＶＰＲ−Ｂｃｌ２Δ、及びＶＰＲ−ＢｃｌＸＬを発現するプラスミドを作製した。ｐＰＴＤ−Ｂｃｌ２−Ｖ５−６×Ｈｉｓ（Ａｍｐ^Ｒ）：インフレームＰＴＤ（Ｔａｔ、ＥＰＴＤ又はＶＰＲ）タンパク質形質導入ドメインをコードするフォワードプライマーを用いて、ヒトＢｃｌ２をコードするｃＤＮＡをＰＣＲ増幅することによって、プラスミドを作製した。ＰＣＲ産物をｐＥＴ１０１／Ｄ−Ｔｏｐｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクターにクローニングした。Ｂｃｌ２を産生するため、Δ Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＃２００５２１−５）を用いて、ＢＣＬ−２コード配列から非構造化ループ（Ａ．Ａ．＃２７−８０）を取り出した。上記ＰＴＤ−Ｂｃｌ２と同様の方法であるが、Ｂｃｌ２ではなくヒトＢｃｌＸＬのｃＤＮＡを用いて、ＶＰＲ−ＢｃｌＸＬを作製した。

本願では、本開示の観点から当業者には当然のことながら、特に定めのない限り、又はその単数形が唯一の機能的実施形態でない限り、単数形の使用は複数形を含み得る。したがって、例えば、「ａ」は２つ以上を意味する場合があり、「一実施形態」は、その説明を複数の実施形態に適用することを意味する場合がある。

参照による組み込み
特許、特許出願、論文、教科書などを含む、本明細書に引用される全ての参考文献、及びその中で引用されている参考文献は、既に引用されていない限り、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。定義された用語、用語の用法、記載された技術などを非限定的に含む、組み込まれた文献及び同様の資料のうち１つ又はそれ以上が本願と異なる又は矛盾する場合、本願が優先する。

等価物
上記説明及び実施例は、特定の実施形態について詳述している。しかしながら、上記内容が本文中でいかに詳細に見えようとも、本発明は多くの様式で実施され得ること、並びに本発明は添付の請求項及びその任意の等価物に従うと解釈されるべきであることが理解されるであろう。

Claims (22)

1. ａ）細胞の生存又は増殖のうち１つ又はそれ以上を促進する外因的に合成されたＭｙｃ融合ポリペプチドと、
   ｂ）アポトーシスを阻害する外因的に合成されたＢｃｌ−２ドメイン融合ポリペプチドと共に、
   １つ又はそれ以上の成体造血幹細胞を培養培地中に提供することを含む、条件的不死化成体造血幹細胞集団を産生する方法であって、
   前記Ｍｙｃ融合ポリペプチド及び前記Ｂｃｌ−２ドメイン融合ポリペプチドが、少なくとも２４時間の間隔で前記１つ又はそれ以上の成体造血幹細胞に供給され、前記Ｍｙｃ融合ポリペプチドが、少なくとも２４時間、前記細胞に連続的に供給されて、条件的不死化成体造血幹細胞集団を産生し、
   前記Ｍｙｃ融合ポリペプチドが、タンパク質形質導入ドメインと融合したｃ−Ｍｙｃポリペプチドを含み、前記ｃ−Ｍｙｃポリペプチドが、細胞の生存、細胞の不死、細胞の成長及び／又は細胞の増殖を誘導し、
   ここで、前記Ｂｃｌ−２ドメイン融合ポリペプチドが、タンパク質形質導入ドメインと融合しており、かつ、非構造化ループドメインを欠いている切断型のＢｃｌ−２ポリペプチドを含む、方法。
2. 前記Ｍｙｃ融合ポリペプチドが、少なくとも７２時間の間隔で供給され、かつ前記Ｂｃｌ−２ドメイン融合ポリペプチドが、少なくとも７２時間の間隔で供給される、請求項１に記載の方法。
3. 前記Ｍｙｃ融合ポリペプチドが、培養培地中に約１μｇ／ｍＬ〜約５０μｇ／ｍＬの濃度で供給される、請求項１に記載の方法。
4. 前記Ｂｃｌ−２ドメイン融合ポリペプチドが、培養培地中に約１μｇ／ｍＬ〜約５０μｇ／ｍＬの濃度で供給される、請求項１に記載の方法。
5. 前記Ｂｃｌ−２ドメイン融合ポリペプチドが、ＢＨ１、ＢＨ２、ＢＨ３、及びＢＨ４を含む、請求項１に記載の方法。
6. 前記Ｍｙｃ融合ポリペプチド及び／又はＢｃｌ−２ドメイン融合ポリペプチドのタンパク質形質導入ドメインが、Ｔａｔ、ＥＰＴＤ、及びｖｐｒからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
7. 前記Ｍｙｃ融合ポリペプチド及び／又はＢｃｌ−２ドメイン融合ポリペプチドのタンパク質形質導入ドメインがＴａｔである、請求項１に記載の方法。
8. 前記Ｍｙｃ融合ポリペプチド及び／又はＢｃｌ−２ドメイン融合ポリペプチドのタンパク質形質導入ドメインがＥＰＴＤである、請求項１に記載の方法。
9. 前記Ｍｙｃ融合ポリペプチド及び／又はＢｃｌ−２ドメイン融合ポリペプチドのタンパク質形質導入ドメインがｖｐｒである、請求項１に記載の方法。
10. 前記１つ又はそれ以上の成体造血幹細胞が、ＩＬ３、ＩＬ６、及び幹細胞因子を含む培地中で培養される、請求項１に記載の方法。
11. 前記１つ又はそれ以上の成体造血幹細胞が、ＩＬ３、ＩＬ６、幹細胞因子、トロンボポエチン、Ｆｌｔ３−Ｌ、及びＧＭ−ＣＳＦを含む培地中で培養される、請求項１に記載の方法。
12. 前記１つ又はそれ以上の成体造血幹細胞が、約２８日間かけて約２７０倍、約１４日間かけて約１５０倍、約２１日間かけて１００倍、又は約９〜１４日間かけて約８５倍のうち、１つ又はそれ以上に増殖する、請求項１に記載の方法。
13. ８時間にわたって１μｇ／ｍＬ以下のＭｙｃ融合ポリペプチドが培養培地中に供給される、請求項１に記載の方法。
14. 前記集団の産生がガス透過性容器内で起こる、請求項１に記載の方法。
15. 前記Ｍｙｃ融合ポリペプチドが、少なくとも７２時間の間隔で供給され、かつ前記Ｂｃｌ−２ドメイン融合ポリペプチドが、少なくとも９６時間の間隔で供給される、請求項１に記載の方法。
16. 前記Ｍｙｃ融合ポリペプチドが、前記１つ又はそれ以上の成体造血幹細胞に供給された４８時間後に前記細胞において検出可能である、請求項１に記載の方法。
17. 前記Ｍｙｃ融合ポリペプチドが、少なくとも４８時間の間隔で供給され、かつ前記Ｂｃｌ−２ドメイン融合ポリペプチドが、少なくとも４８時間の間隔で供給される、請求項１に記載の方法。
18. ａ）細胞の生存又は増殖のうち１つ又はそれ以上を促進する外因的に合成されたＭｙｃ融合ポリペプチドであって、培養培地中に約１μｇ／ｍＬ〜約５０μｇ／ｍＬの濃度で供給されるＭｙｃ融合ポリペプチドと、
    ｂ）アポトーシスを阻害する外因的に合成されたＢｃｌ−２ドメイン融合ポリペプチドであって、培養培地中に約１μｇ／ｍＬ〜約５０μｇ／ｍＬの濃度で供給されるＢｃｌ−２ドメイン融合ポリペプチドと共に、
    １つ又はそれ以上の成体造血幹細胞を培養培地中に提供することを含む、条件的不死化成体造血幹細胞集団を産生する方法であって、
    前記Ｍｙｃ融合ポリペプチド及び前記Ｂｃｌ−２ドメイン融合ポリペプチドが、少なくとも２４時間の間隔で前記１つ又はそれ以上の成体造血幹細胞に供給され、前記Ｍｙｃ融合ポリペプチドが、少なくとも２４時間、前記細胞に連続的に供給されて、条件的不死化成体造血幹細胞集団を産生し、
    前記Ｍｙｃ融合ポリペプチドが、タンパク質形質導入ドメインと融合したｃ−Ｍｙｃポリペプチドを含み、前記ｃ−Ｍｙｃポリペプチドが、細胞の生存、細胞の不死、細胞の成長及び／又は細胞の増殖を誘導し、
    ここで、前記Ｂｃｌ−２ドメイン融合ポリペプチドが、タンパク質形質導入ドメインと融合しており、かつ、非構造化ループドメインを欠いている切断型のＢｃｌ−２ポリペプチドを含む、方法。
19. 前記Ｍｙｃ融合ポリペプチドが、少なくとも４８時間の間隔で供給され、かつ前記Ｂｃｌ−２ドメイン融合ポリペプチドが、少なくとも４８時間の間隔で供給される、請求項１８に記載の方法。
20. 前記Ｍｙｃ融合ポリペプチドが、少なくとも７２時間の間隔で供給され、かつ前記Ｂｃｌ−２ドメイン融合ポリペプチドが、少なくとも７２時間の間隔で供給される、請求項１８に記載の方法。
21. 前記Ｍｙｃ融合ポリペプチドのタンパク質形質導入ドメインがＴａｔである、請求項１８に記載の方法。
22. 前記Ｂｃｌ−２ドメイン融合ポリペプチドのタンパク質形質導入ドメインがＴａｔである、請求項１８に記載の方法。

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