JP6573868B2 - 成体幹細胞のインビトロでの増殖 - Google Patents
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Description
本願は、2013年3月11日出願の米国特許仮出願第61/776,422号及び2013年3月12日出願の米国実用特許出願第13/795,659号の利益と優先権を主張するものであり、これらの全体が参照として本明細書に組み込まれる。
本発明は、National Institute of Healthによる助成(5R44HL091740−03)の下に政府の支援を受けてなされた。政府は本発明について一定の権利を有する。
本願は、電子形式の配列表と共に出願されている。配列表は、2014年3月10日に作成された10KBのサイズの106417−0182_Seq_List.txtという名称のファイルとして提供される。配列表の電子形式中の情報は、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。
本明細書に提供されるのは、長期幹細胞、かかる細胞の産生方法、及び様々なタンパク質構築物に関する実施形態である。
[本発明1001]
a)細胞の生存又は増殖のうち1つ又はそれ以上を促進する外因的に合成されたMycポリペプチドと、
b)アポトーシスを阻害する外因的に合成されたBcl−2ドメインポリペプチドと、によって、1つ又はそれ以上の成体幹細胞を提供することを含む、条件的不死化成体幹細胞集団を産生する方法であって、
前記Mycポリペプチドが、少なくとも約72時間間隔で前記1つ又はそれ以上の成体幹細胞に供給され、
前記Bcl−2ドメインポリペプチドが、少なくとも約96時間間隔で前記1つ又はそれ以上の成体幹細胞に供給されて、条件的不死化成体幹細胞集団を産生する、方法。
[本発明1002]
前記Mycポリペプチドが、少なくとも約48時間間隔で供給される、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記Mycポリペプチドが、少なくとも約24時間間隔で供給される、本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記Mycポリペプチドが連続的に供給される、本発明1001の方法。
[本発明1005]
前記Bcl−2ドメインポリペプチドが、少なくとも約72時間間隔で供給される、本発明1001〜1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
前記Bcl−2ドメインポリペプチドが、少なくとも約48時間間隔で供給される、本発明1001〜1004のいずれかの方法。
[本発明1007]
前記Bcl−2ドメインポリペプチドが、少なくとも約24時間間隔で供給される、本発明1001〜1004のいずれかの方法。
[本発明1008]
前記Bcl−2ドメインポリペプチドが連続的に供給される、本発明1001〜1004のいずれかの方法。
[本発明1009]
前記Mycポリペプチドが、n−Myc、c−Myc、l−Myc、v−Myc、又はs−Mycのうち1つ又はそれ以上である、本発明1001〜1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
前記Mycポリペプチドが、約1μg/mL〜約50μg/mLの濃度で供給される、本発明1001〜1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
前記Mycポリペプチドが、約5μg/mLの濃度で供給される、本発明1001〜1009のいずれかの方法。
[本発明1012]
前記Bcl−2ドメインポリペプチドが、約1μg/mL〜約50μg/mLの濃度で供給される、本発明1001〜1011のいずれかの方法。
[本発明1013]
前記Bcl−2ドメインポリペプチドが、約10μg/mLの濃度で供給される、本発明1001〜1011のいずれかの方法。
[本発明1014]
前記Bcl−2ドメインポリペプチドが、BH1、BH2、BH3、及びBH4を含む、本発明1001〜1013のいずれかの方法。
[本発明1015]
前記1つ又はそれ以上のBcl−2ドメインポリペプチドが、Bcl−2、Bcl−w、Bcl−X、Bcl−XL、Mcl−1のうち1つ又はそれ以上である、本発明1001〜1014のいずれかの方法。
[本発明1016]
前記1つ又はそれ以上のBcl−2ドメインポリペプチドが、Bcl−2である、本発明1001〜1014のいずれかの方法。
[本発明1017]
前記Mycポリペプチド又は前記Bcl−2ポリペプチドのうち1つ又はそれ以上が、タンパク質形質導入ドメインを含む、本発明1001〜1016のいずれかの方法。
[本発明1018]
前記タンパク質形質導入ドメインがTatである、本発明1017の方法。
[本発明1019]
前記タンパク質形質導入ドメインがEPTDである、本発明1017の方法。
[本発明1020]
前記タンパク質形質導入ドメインがvprである、本発明1017の方法。
[本発明1021]
前記1つ又はそれ以上の成体幹細胞が、IL3、IL6、及び幹細胞因子を含む培地中で培養される、本発明1001〜1020のいずれかの方法。
[本発明1022]
前記1つ又はそれ以上の成体幹細胞が、IL3、IL6、幹細胞因子、トロンボポエチン、及びFlt3−Lを含む培地中で培養される、本発明1001〜1020のいずれかの方法。
[本発明1023]
前記1つ又はそれ以上の成体幹細胞が、IL3、IL6、幹細胞因子、トロンボポエチン、Flt3−L、及びGM−CSFを含む培地中で培養される、本発明1001〜1020のいずれかの方法。
[本発明1024]
前記1つ又はそれ以上の成体幹細胞が、約28日間かけて約270倍、約14日間かけて約150倍、約21日間かけて100倍、又は約9〜14日間かけて約85倍のうち、1つ又はそれ以上に増殖する、本発明1001〜1023のいずれかの方法。
[本発明1025]
前記1つ又はそれ以上の成体幹細胞が、1つ又はそれ以上の成体造血幹細胞である、本発明1001〜1024のいずれかの方法。
[本発明1026]
前記成体造血幹細胞が、細胞表面の表現型、インビトロ分化能、照射後の造血系統のインビボ再構成能、又は、連続的に移植される能力のうち、1つ又はそれ以上を特徴とする、本発明1025の方法。
[本発明1027]
前記1つ又はそれ以上の成体造血幹細胞が、臍帯血、胎盤、骨髄、末梢血、動員済み末梢血、又は脂肪組織のうち、1つ又はそれ以上から単離される、本発明1001〜1026のいずれかの方法。
[本発明1028]
前記1つ又はそれ以上の成体造血幹細胞が、胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞由来である、本発明1001〜1026のいずれかの方法。
[本発明1029]
前記1つ又はそれ以上の成体幹細胞がヒト細胞である、本発明1001〜1028のいずれかの方法。
[本発明1030]
前記1つ又はそれ以上の成体幹細胞が非ヒト動物細胞である、本発明1001〜1028のいずれかの方法。
[本発明1031]
タンパク質形質導入ドメインと、
細胞の生存又は増殖のうち1つ又はそれ以上を促進するMycポリペプチドと、
V5ドメインと、
6ヒスチジンエピトープタグと、
を含む、Myc融合タンパク質。
[本発明1032]
約60分間より長い半減期を有する、本発明1031のMyc融合タンパク質。
[本発明1033]
約48時間の半減期を有する、本発明1031のMyc融合タンパク質。
[本発明1034]
約72時間まで検出可能である、本発明1031のMyc融合タンパク質。
[本発明1035]
約48時間まで検出可能である、本発明1031のMyc融合タンパク質。
[本発明1036]
細胞の核内に輸送可能である、本発明1031〜1034のいずれかのMyc融合タンパク質。
[本発明1037]
前記タンパク質形質導入ドメインがTatである、本発明1031〜1035のいずれかのMyc融合タンパク質。
[本発明1038]
タンパク質形質導入ドメインがVprである、本発明1031〜1035のいずれかのMyc融合タンパク質。
[本発明1039]
タンパク質形質導入ドメインがEPTDである、本発明1031〜1035のいずれかのMyc融合タンパク質。
[本発明1040]
a)Mycポリペプチドにインフレームで連結したタンパク質形質導入ドメイン、
b)V5ドメインにインフレームで連結したMycポリペプチド、及び
c)6ヒスチジンエピトープタグにインフレームで連結したV5ドメイン、
の順の構成要素を有する、本発明1031〜1038のいずれかのMyc融合タンパク質。
[本発明1041]
a)タンパク質形質導入ドメインにインフレームで連結したMycポリペプチド、
b)V5ドメインにインフレームで連結したタンパク質形質導入ドメイン、及び、
c)6ヒスチジンエピトープタグにインフレームで連結したV5ドメイン、
の順の構成要素を有する、本発明1031〜1038のいずれかのMyc融合タンパク質。
[本発明1042]
IL3と、IL6と、幹細胞因子と、トロンボポエチンと、Flt3−Lと、GM−CSFと、を含む、幹細胞増殖培地。
[本発明1043]
基本培地を更に含む、本発明1042の幹細胞増殖培地。
[本発明1044]
細胞の生存又は増殖のうち1つ又はそれ以上を促進するMycポリペプチドを更に含む、本発明1043の幹細胞増殖培地。
[本発明1045]
アポトーシスを阻害するBcl−2ドメインポリペプチドを更に含む、本発明1041〜1044のいずれかの幹細胞増殖培地。
[本発明1046]
前記基本培地が、StemSpan、Isco培地、RPMI、又はDMEMのうち、1つ又はそれ以上である、本発明1041〜1045のいずれかの幹細胞増殖培地。
[本発明1047]
a)タンパク質形質導入ドメインと、
b)細胞の生存又は増殖のうち1つ又はそれ以上を促進するMycポリペプチドと、
を含む、Myc融合タンパク質であって、約60分間より長い半減期を有する、Myc融合タンパク質。
[本発明1048]
本発明1031〜1041、及び1047のいずれかのタンパク質をコードする核酸。
[本発明1049]
本発明1048の核酸を含むベクター。
[本発明1050]
本発明1049のベクターを含む細胞。
[本発明1051]
8時間にわたって1μg/mL以下のMycポリペプチドが供給される、本発明1001の方法。
[本発明1052]
16時間にわたって1μg/mL以下のMycポリペプチドが供給される、本発明1001の方法。
[本発明1053]
24時間にわたって1μg/mL以下のMycポリペプチドが供給される、本発明1001の方法。
[本発明1054]
前記集団の産生がガス透過性容器内で起こる、本発明1001の方法。
[本発明1055]
タンパク質形質導入ドメインと、
細胞の生存又は増殖のうち1つ又はそれ以上を促進するMycポリペプチドと、
短いペプチドドメインと、
を含む、Myc融合タンパク質。
[本発明1056]
前記短いペプチドドメインが、HAタグ、FLAGタグ、CBP、CYD、StrepII、又はHPCのうち少なくとも1つから選択される、本発明1055のMyc融合。
[本発明1057]
IL3、IL6、幹細胞因子、トロンボポエチン、Flt3−L、及びGM−CSFを含む幹細胞増殖培地と、
細胞の生存又は増殖のうち1つ又はそれ以上を促進するMycポリペプチドと、
アポトーシスを阻害するBcl−2ドメインポリペプチドと、
を含む、ガス透過性容器。
[本発明1058]
前記容器がバッグ又はフラスコである、本発明1057のガス透過性容器。
本明細書に記載される実施形態の実践又は試験に使用される、本明細書に記載されるものに類似する、又は同等である任意の方法及び材料は、本開示の一部であると見なされる。
長期再増殖造血幹細胞(LT−HSC)集団は、インビボで自己複製し、それぞれの寿命の間、血球新生を支持する。長期HSCは、特に、骨髄幹細胞移植という点で重要である。
いくつかの実施形態では、Bcl−2ドメインポリペプチドは、Bcl−2ファミリーの任意のメンバー及び/又はタンパク質の抗アポトーシス性が機能できるように、十分な相同性を有する任意のタンパク質であってよい。いくつかの実施形態では、Bcl−2ドメインポリペプチドは、Bcl−2のBH1ドメインを含んでよい。いくつかの実施形態では、Bcl−2ドメインポリペプチドは、Bcl−2のBH2ドメインを含んでよい。いくつかの実施形態では、Bcl−2ドメインポリペプチドは、Bcl−2のBH3ドメインを含んでよい。いくつかの実施形態では、Bcl−2ドメインポリペプチドは、Bcl−2のBH4ドメインを含んでよい。いくつかの実施形態では、Bcl−2ドメインポリペプチドは、Bcl−2のBH1及びBH2ドメイン、BH1及びBH3ドメイン、BH1及びBH4ドメイン、BH2及びBH3ドメイン、BH2及びBH4ドメイン、BH3及びBH4ドメイン、BH1、BH2、及びBH3ドメイン、BH2、BH3、及びBH4ドメイン、又はBH1、BH2、BH3、及びBH4ドメインの全てを含んでよい。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、BH1、BH2、BH3、又はBH4のうち少なくとも1つ又はそれ以上に、少なくとも90%同一である、例えば、BH1、BH2、BH3、及び/又はBH4の少なくとも1つに、91、92、93、94、95、96、97、98、99パーセント以上同一である限り、Bcl−2ドメインポリペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、Bcl−2ドメインポリペプチドは、BH1、H2及びBH4ドメインを含む。いくつかの実施形態では、Bcl−2ドメインポリペプチドは、Bcl−2、Bcl−w、Bcl−X、Bcl−XL、又はMcl−1のうち、1つ又はそれ以上を含む。用語「Bcl−2ドメインポリペプチド」は、本明細書で記載するように機能する程度において、それらのホモログを含む。したがって、Bcl−2タンパク質の変異体もこの用語の範囲に含まれる。いくつかの実施形態では、Bcl−2ドメインポリペプチドは、完全長Bcl−2を包含する。いくつかの実施形態では、Bcl−2ドメインポリペプチドは、非構造化ループドメインを欠いている、切断型のヒトBcl−2(Anderson,M.,et al.(1999)Prot Expr.Purif.15,162〜70)を含む。
いくつかの実施形態では、Mycポリペプチド及び/又はBcl−2ドメインポリペプチドは、タンパク質形質導入ドメインを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質形質導入ドメインはTatを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質形質導入ドメインはEPTDを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質形質導入ドメインは、vpr、R9、R15、VP16、アンテナペディア、アプタマー法、chariot法、R11などのうち、少なくとも1つを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質形質導入ドメインは、Mycポリペプチド又はBcl−2ドメインポリペプチドに共有結合されている。いくつかの実施形態では、タンパク質形質導入ドメインは、Mycポリペプチド又はBcl−2ドメインポリペプチドに、ペプチド結合を介して結合されている。いくつかの実施形態では、タンパク質形質導入ドメインは、Mycポリペプチド及び/又はBcl−2ドメインポリペプチドに、短い連続中性アミノ酸からなり得るリンカー配列を介して結合されている。
いくつかの実施形態では、成体幹細胞は、IL3、IL6、及び幹細胞因子のうち少なくとも1つを含む培地中で培養される。いくつかの実施形態では、成体幹細胞は、IL3、IL6、及び幹細胞因子を含む培地中で培養される。いくつかの実施形態では、成体幹細胞は、IL3、IL6、幹細胞因子、トロンボポエチン、及びFlt3−Lを含む培地中で培養される。いくつかの実施形態では、成体幹細胞は、IL3、IL6、幹細胞因子、トロンボポエチン、及びFlt3−L、及びGM−CSFを含む培地中で培養される。いくつかの実施形態では、IL3、IL6、幹細胞因子、トロンボポエチン、Flt3−L、及び/又はGM−CSFの量は、10〜500ng/mLの範囲で存在してよい。
いくつかの実施形態では、成体幹細胞は、1つ又はそれ以上の成体造血幹細胞である。いくつかの実施形態では、成体造血幹細胞は、細胞表面の表現型、インビトロ分化能、照射後の造血系統のインビボ再構成能、又は、連続的に移植される能力のうち、1つ又はそれ以上を特徴とできる。いくつかの実施形態では、成体造血幹細胞は、適切な細胞表面の表現型、インビトロ分化能、照射後の造血系統のインビボ再構成能、及び、連続的に移植される能力を特徴とできる。いくつかの実施形態では、成体造血幹細胞と考えられるマウス細胞において、Sca−1+、c−kit+、系統−のうち1つ又はそれ以上の表面表現型を発現でき、1回の移植当たりわずか10個の細胞によって照射された同系マウスを再構成でき、連続継代後に照射されたレシピエントを救うことができる自己複製するHSC集団を生じる。いくつかの実施形態では、成体造血幹細胞と考えられるヒト細胞において、CD34+、CD38+/lo、系統陰性、flk−2−のうち1つ又はそれ以上の表面表現型を発現でき、合成メチルセルロース分化培地上でいくつかのコロニータイプと形態を生じることができ、併せて、インビトロ分化系において連続的にプレーティング可能な細胞を生じさせることができ、細胞は、NOD/SCID/γ鎖KO、又はその他著しく免疫無防備状態のマウス系統を用いる異種移植試験において、ヒト成熟造血細胞を生じることができるはずであり、この異種移植(xenotrasplant)系において、連続的に移植可能なHSCを生じる。
いくつかの実施形態では、タンパク質が提供される。タンパク質は、タンパク質形質導入ドメインと、細胞の生存又は増殖のうち1つ又はそれ以上を促進するMycポリペプチド(外因的に合成されてよい)と、V5ドメインと、6ヒスチジンエピトープタグと、を含む、Myc融合タンパク質であってよい。いくつかの実施形態では、Myc融合タンパク質は、37℃、5% CO2による雰囲気、水溶液中という組織培養条件において、約60分より長い半減期を有する。
いくつかの実施形態では、幹細胞増殖培地が提供される。増殖培地は、a)基本培地と、b)IL3、IL6、幹細胞因子、トロンボポエチン、Flt3−L、及びGM−CSFのうち少なくとも1つ又はそれ以上と、を含んでよい。いくつかの実施形態では、IL3、IL6、幹細胞因子、トロンボポエチン、Flt3−L、及びGM−CSFを含む。いくつかの実施形態では、IL3、IL6、幹細胞因子、トロンボポエチン、及びFlt3−Lを含む。いくつかの実施形態では、増殖培地は、IL3、IL6、幹細胞因子、トロンボポエチン、Flt3−L、及びGM−CSFを含んでよい。
かかる幹細胞を得て、液体培地又は半固形培地などの初期培養条件を提供する方法は、当該技術分野において既知である。いくつかの実施形態では、幹細胞源を、組織源中又は培養中でかかる細胞を増殖又は濃縮する好適な試薬と接触させることによって、細胞をまずインビボ又はインビトロで増殖する。例えば、造血幹細胞の場合、ドナーそれぞれを、造血幹細胞を濃縮し、かかる細胞を分化せずに増殖するよう促進する薬剤、例えば5−フルオロウラシルで処理してよい。所望の幹細胞種の増殖に好適なその他の薬剤は、当業者に既知であろう。あるいは、成体幹細胞を組織源から単離して、好適な薬剤に曝露することによって、インビトロで増殖又は濃縮する。例えば、造血幹細胞に関して、成体造血系前駆細胞の増殖培養を生じさせる方法は、Van Parijs et al.(1999;Immunity,11,763〜70)に記載されている。細胞は、骨髄の採取、体液(例えば、血液)の採取、臍帯血の採取、組織パンチ、及び組織解剖を非限定的に含み、特に、皮膚、腸、角膜、脊髄、脳組織、頭皮、胃、乳房、肺(例えば、洗浄及び気管支鏡(bronchioschopy)を含む)、骨髄の細針吸引液、羊水、胎盤、及び卵黄嚢の任意の生検を非限定的に含む、任意の好適な動物から細胞サンプルを得る方法によって固体から得られる。
HIV−1 Tatタンパク質形質導入ドメイン(PTD)と、ヒトMycのORF、又は非構造化ループドメインを欠いている切断型のヒトBcl−2(Anderson,M.,et al.(1999).Prot Expr.Purif.15,162〜70)のいずれかと、を有する、融合タンパク質を作製した。組み換えタンパク質は、V5ペプチドタグ及び6−Hisタグもコードしており、検出及び精製を促進した(図1A)。
融合タンパク質は、適切な細胞内区画(図1C)に局在する。NIH 3T3細胞を、6ウェルプレート中でカバーガラス上に播種し、30〜40%のコンフルエンスまで増殖した。各ウェルを、10μg/mLのTat−Myc若しくはTat−Bcl−2で形質導入し、又は陰性対照として処理しなかった。タンパク質形質導入の2時間後、細胞を、4%パラホルムアルデヒド−PBS中で10分間室温(RT)にて固定した。細胞を、1%ウシ血清アルブミン(BSA)及び0.1% Triton X−100を補充したPBS中で、RTにて3分間透過処理した。V5マウスモノクローナル抗血清(Invitrogen)をPBS−1% BSAで希釈したもの(1:1,000)で、細胞を45分間インキュベートした。細胞を洗浄し、ヤギ抗マウスAlexa 488二次抗体(Invitrogen A21121)と共に30分間インキュベートした。カバーガラスを、50%グリセロールの10μLの液滴と、1μg/mLのHoechstと共に、スライドガラス上に乗せた。Zeiss Imager Z1蛍光顕微鏡で画像を得た。
処理を行わずに、活性化マウスCD4+T細胞を、サイトカイン欠乏後のアポトーシスに進める。Tat−Myc及びTat−Bcl−2は、活性化初代CD4+T細胞を、サイトカイン休薬によって誘発されたアポトーシスから用量依存的に救済する(図2A及び2B)。Tat−Mycの存在下で活性化された初代マウスCD4+T細胞は、Tat−Cre存在下で活性化された細胞と比較するとき、しっかりとした増殖を示した(図2C及び2D)。
4〜6週齢の雌性C57BL/6Jマウスのコホートを、Jackson Laboratories(Bar Harbor、ME)から入手した。5mg/マウスの5−フルオロウラシル(5FU)を用いて、マウスの静脈内に投与した。5FU処理5日後に、頚骨及び大腿骨から骨髄(BM)細胞を採取した。5mLの無菌TAC緩衝液(135mM NH4CL、17mMトリスpH 7.65)中でインキュベートすることによって、赤血球を溶解した。5μg/mLの組み換えTat−Myc及び10μg/mLの組み換えTat−Bcl−2を補充したBM培地(15% FCS、100単位/mLのペニシリン/ストレプトマイシン、MEM NEAA(Gibco)、10mM HEPES、組み換えマウスIL−3、IL−6、及びSCFを含むDMEM)中で、骨髄細胞を増殖させた。
少数のインビトロで増殖させたHSCを、致死量以下で照射されたRag−1−/−マウスに移植した。Rag1−/−マウス(Jackson Laboratory)への移植は、Rag1−/−マウスが、BM細胞を尾静脈から注入される直前に、350ラドの放射線を照射された以外は、NSGマウスについて記載された方法で行った。
地元の臍帯血バンクが廃棄したサンプルから、新鮮な臍帯血細胞を入手した。ヒト細胞を全て匿名化し、IRBの監視を免除した。臍帯血は、O+、O−、A+、A−、B+、B−、及びAB+を含んでおり、これらの全てはほぼ同じ増殖特性を示した。
インビトロで増殖させたヒトHSCを、MethoCult Optimum(StemCell Technologies)にプレーティングし、特定のコロニータイプを生じさせる能力について調べた。インビトロで増殖させたヒトHSCは、CFU−G、CFU−M、CFU−GM及びBFU−Eコロニーを生じさせることができる(図5C及び5D)。加えて、Tat−Myc及びTat−Bcl−2の存在下で増殖したHSCの表面表現型は、培養中保存されていたが、これらの条件下では、コロニー形成単位の量が顕著に濃縮された(図5D)。Tat−Myc及びTat−Bcl−2の存在下で増殖したCD34+細胞は、新たなBFU−E、CFU−M、CFU−G及びCFU−GMコロニーを生じさせることもできたが、一方、培地のみで培養されたCD34+細胞は新たなコロニーを生じさせなかった(図5E)。
自家HSC移植のためにG−CSF動員を受けた5人の患者の浄化血液1mLから、G−CSF動員細胞を入手した。全てのG−CSFサンプルを再識別し、これらの試験に用いた細胞に関する更なる識別情報を関連付けなかった。10mLのFCB培地に細胞を滴下した。この細胞をFCB培地で2回洗浄し、10mL量中、5μg/mLの組み換えTat−Myc及び10μg/mLの組み換えTat−Bcl−2で処理した。細胞(5×106個)を、G−Rex 100細胞増殖用容器(Wilson Wolf Manufacturing)に、製造業者の推奨に従って播種した。
実施例1に記載されるTat−Myc融合タンパク質に加え、同実施例に記載のものと同じ方法を使用して、5種類のMyc融合タンパク質を作製して精製した。インフレームN末端PTD−アミノ酸配列を含むフォワードプライマー及び終止コドンを除去したリバースプライマーを用いて、コード領域をPCR増幅することによって、プラスミドを作製した。その後、C末端V5エピトープ及び6×ヒスチジン精製タグを含む、pET101/D−Topo(Invitrogen)ベクターに、PCR産物をクローニングした。図9Aは、実施例1のTat−Mycと比較した、Myc融合タンパク質の図式表示を示す。それぞれにおいて、タンパク質形質導入(PTD)を、Mycポリペプチドの前又は後にインフレームで融合する。
実施例9に記載されるMyc融合タンパク質(Tat−Myc、Tat−3AMyc、EPTD−Myc、Vpr−Myc、及びMyc−Vpr)のMycの生物学的活性について、活性化T細胞生死判別アッセイにおいて調べた(図9B)。C57BL.6j(Jackson)マウスから脾臓を回収し、ワイヤーメッシュ(wire mess)を通して機械的に分離した。赤血球を除去し、1μg/mLの抗CD3(2c11)でT細胞を活性化した。細胞を、24ウェル多穴ディッシュに、1mLの培地中1ウェル当たり3×10^6個の細胞でプレーティングした。48時間後、生細胞をFicolクッション上に捕捉して洗浄し、24ウェル多穴ディッシュに、1ウェル当たり1〜1.5×10^6個の細胞でプレーティングした。PTD−Mycタンパク質を、T細胞に対して、0.5、1、5、10、25、又は50μg/mLでタイトレーションした。PTD−Mycタンパク質処理48時間後、細胞をフローサイトメトリーによって生存率について評価した(前方×側方錯乱)。図9Bにおいて示されるデータは、25μg/mLタンパク質処理のものである。
基本培地中の様々なサイトカイン混合物の、幹細胞の生存及び/又は増殖を支持する能力について試験を行った。
3T3細胞に、Tat−Bcl2を1時間形質導入し、その後3回PBSで洗浄した。形質導入2時間後、細胞をトリプシン処理し、数えてから、5×106個を回収した。核及び細胞質画分を単離した。続く5日間、24時間毎に5×106個の細胞を回収した。核及び細胞質タンパク質を、10mM HEPES(pH 7.6)、10mM NaCl2、3mM CaCl2、及び0.5% NP40に細胞を溶解することによって調製した。核を沈殿させ、細胞質を含有する上清画分をトリクロロ酢酸(TCA)と共に沈殿させた。抗V5抗体(Invitrogen)及びヤギ抗マウスIgG−HRP(Santa Cruz Biotechnology)を用いてウエスタンブロットを調べた。
特許、特許出願、論文、教科書などを含む、本明細書に引用される全ての参考文献、及びその中で引用されている参考文献は、既に引用されていない限り、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。定義された用語、用語の用法、記載された技術などを非限定的に含む、組み込まれた文献及び同様の資料のうち1つ又はそれ以上が本願と異なる又は矛盾する場合、本願が優先する。
上記説明及び実施例は、特定の実施形態について詳述している。しかしながら、上記内容が本文中でいかに詳細に見えようとも、本発明は多くの様式で実施され得ること、並びに本発明は添付の請求項及びその任意の等価物に従うと解釈されるべきであることが理解されるであろう。
Claims (22)
- a)細胞の生存又は増殖のうち1つ又はそれ以上を促進する外因的に合成されたMyc融合ポリペプチドと、
b)アポトーシスを阻害する外因的に合成されたBcl−2ドメイン融合ポリペプチドと共に、
1つ又はそれ以上の成体造血幹細胞を培養培地中に提供することを含む、条件的不死化成体造血幹細胞集団を産生する方法であって、
前記Myc融合ポリペプチド及び前記Bcl−2ドメイン融合ポリペプチドが、少なくとも24時間の間隔で前記1つ又はそれ以上の成体造血幹細胞に供給され、前記Myc融合ポリペプチドが、少なくとも24時間、前記細胞に連続的に供給されて、条件的不死化成体造血幹細胞集団を産生し、
前記Myc融合ポリペプチドが、タンパク質形質導入ドメインと融合したc−Mycポリペプチドを含み、前記c−Mycポリペプチドが、細胞の生存、細胞の不死、細胞の成長及び/又は細胞の増殖を誘導し、
ここで、前記Bcl−2ドメイン融合ポリペプチドが、タンパク質形質導入ドメインと融合しており、かつ、非構造化ループドメインを欠いている切断型のBcl−2ポリペプチドを含む、方法。 - 前記Myc融合ポリペプチドが、少なくとも72時間の間隔で供給され、かつ前記Bcl−2ドメイン融合ポリペプチドが、少なくとも72時間の間隔で供給される、請求項1に記載の方法。
- 前記Myc融合ポリペプチドが、培養培地中に約1μg/mL〜約50μg/mLの濃度で供給される、請求項1に記載の方法。
- 前記Bcl−2ドメイン融合ポリペプチドが、培養培地中に約1μg/mL〜約50μg/mLの濃度で供給される、請求項1に記載の方法。
- 前記Bcl−2ドメイン融合ポリペプチドが、BH1、BH2、BH3、及びBH4を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記Myc融合ポリペプチド及び/又はBcl−2ドメイン融合ポリペプチドのタンパク質形質導入ドメインが、Tat、EPTD、及びvprからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記Myc融合ポリペプチド及び/又はBcl−2ドメイン融合ポリペプチドのタンパク質形質導入ドメインがTatである、請求項1に記載の方法。
- 前記Myc融合ポリペプチド及び/又はBcl−2ドメイン融合ポリペプチドのタンパク質形質導入ドメインがEPTDである、請求項1に記載の方法。
- 前記Myc融合ポリペプチド及び/又はBcl−2ドメイン融合ポリペプチドのタンパク質形質導入ドメインがvprである、請求項1に記載の方法。
- 前記1つ又はそれ以上の成体造血幹細胞が、IL3、IL6、及び幹細胞因子を含む培地中で培養される、請求項1に記載の方法。
- 前記1つ又はそれ以上の成体造血幹細胞が、IL3、IL6、幹細胞因子、トロンボポエチン、Flt3−L、及びGM−CSFを含む培地中で培養される、請求項1に記載の方法。
- 前記1つ又はそれ以上の成体造血幹細胞が、約28日間かけて約270倍、約14日間かけて約150倍、約21日間かけて100倍、又は約9〜14日間かけて約85倍のうち、1つ又はそれ以上に増殖する、請求項1に記載の方法。
- 8時間にわたって1μg/mL以下のMyc融合ポリペプチドが培養培地中に供給される、請求項1に記載の方法。
- 前記集団の産生がガス透過性容器内で起こる、請求項1に記載の方法。
- 前記Myc融合ポリペプチドが、少なくとも72時間の間隔で供給され、かつ前記Bcl−2ドメイン融合ポリペプチドが、少なくとも96時間の間隔で供給される、請求項1に記載の方法。
- 前記Myc融合ポリペプチドが、前記1つ又はそれ以上の成体造血幹細胞に供給された48時間後に前記細胞において検出可能である、請求項1に記載の方法。
- 前記Myc融合ポリペプチドが、少なくとも48時間の間隔で供給され、かつ前記Bcl−2ドメイン融合ポリペプチドが、少なくとも48時間の間隔で供給される、請求項1に記載の方法。
- a)細胞の生存又は増殖のうち1つ又はそれ以上を促進する外因的に合成されたMyc融合ポリペプチドであって、培養培地中に約1μg/mL〜約50μg/mLの濃度で供給されるMyc融合ポリペプチドと、
b)アポトーシスを阻害する外因的に合成されたBcl−2ドメイン融合ポリペプチドであって、培養培地中に約1μg/mL〜約50μg/mLの濃度で供給されるBcl−2ドメイン融合ポリペプチドと共に、
1つ又はそれ以上の成体造血幹細胞を培養培地中に提供することを含む、条件的不死化成体造血幹細胞集団を産生する方法であって、
前記Myc融合ポリペプチド及び前記Bcl−2ドメイン融合ポリペプチドが、少なくとも24時間の間隔で前記1つ又はそれ以上の成体造血幹細胞に供給され、前記Myc融合ポリペプチドが、少なくとも24時間、前記細胞に連続的に供給されて、条件的不死化成体造血幹細胞集団を産生し、
前記Myc融合ポリペプチドが、タンパク質形質導入ドメインと融合したc−Mycポリペプチドを含み、前記c−Mycポリペプチドが、細胞の生存、細胞の不死、細胞の成長及び/又は細胞の増殖を誘導し、
ここで、前記Bcl−2ドメイン融合ポリペプチドが、タンパク質形質導入ドメインと融合しており、かつ、非構造化ループドメインを欠いている切断型のBcl−2ポリペプチドを含む、方法。 - 前記Myc融合ポリペプチドが、少なくとも48時間の間隔で供給され、かつ前記Bcl−2ドメイン融合ポリペプチドが、少なくとも48時間の間隔で供給される、請求項18に記載の方法。
- 前記Myc融合ポリペプチドが、少なくとも72時間の間隔で供給され、かつ前記Bcl−2ドメイン融合ポリペプチドが、少なくとも72時間の間隔で供給される、請求項18に記載の方法。
- 前記Myc融合ポリペプチドのタンパク質形質導入ドメインがTatである、請求項18に記載の方法。
- 前記Bcl−2ドメイン融合ポリペプチドのタンパク質形質導入ドメインがTatである、請求項18に記載の方法。
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