KR20240021878A

KR20240021878A - 다능성 줄기 세포로부터 자연 살해 세포를 생산하기 위한 방법

Info

Publication number: KR20240021878A
Application number: KR1020247001035A
Authority: KR
Inventors: 랜 카오; 후이-신 창; 지앤신 후; 위 치앤; 시 스
Original assignee: 다케다 야쿠힌 고교 가부시키가이샤
Priority date: 2021-06-15
Filing date: 2022-06-14
Publication date: 2024-02-19
Also published as: CO2023018654A2; BR112023026141A2; CN117813374A; JP2024523332A; WO2022264033A1; AR126145A1; EP4355861A1; MX2023014979A; AU2022292988A1; US20240108656A1; CA3222770A1; TW202317755A

Abstract

본 개시 내용은 특히, 유도 다능성 세포로부터 자연 살해 세포(NK 세포)가 풍부한 세포 집단을 효율적으로 생산하기 위한 방법을 제공한다.

Description

다능성 줄기 세포로부터 자연 살해 세포를 생산하기 위한 방법

관련 출원

본 출원은 2021년 6월 15일자로 출원된 미국 가출원 제63/210,683호에 대한 우선권을 주장하며, 해당 기초 출원의 내용은 그의 전문이 본 명세서에서 참조로 원용된다.

자연 살해(NK) 세포는 면역계의 세포독성 림프구이다. NK 세포는 암성 세포, 병원체 감염 세포 및 기타 손상된 세포에 대해 세포독성을 가진다. NK 세포는 선천성 림프구 세포(ILC), 구체적으로 면역 반응의 선천성 및 적응성 부문(arm)을 연결하는 대과립 세포독성 림프구이다. 이들은 말초 혈액에서 순환하는 림프구의 10 내지 15%를 차지한다. NK 세포는 또한 면역계 내에서 가장 높은 수준의 세포독성 활성을 나타낸다. 따라서, NK 세포 기능 또는 수의 변화는 감염 및 암에 대한 면역계의 기능에 영향을 미친다.

NK 세포에는 특정 세포 표면 항원 수용체가 없다. 이 때문에, NK 세포는 사전 감작 없이 암성 세포 및 병원체 감염 세포를 사멸시켜 선천성 면역 반응의 일부가 될 수 있다. 이들은 또한 적응성 면역 반응에 직접적으로 영향을 주어 종양 면역 감시에 있어서 역할을 한다. 이러한 특징과 다른 특징들로 인해 NK 세포는 입양 세포 치료에 사용하기에 특히 매력적인 세포 유형이다.

다능성 줄기세포(예컨대, 유도 다능성 줄기세포(iPSC)) 또는 전구 세포로부터 NK 세포를 얻기 위한 다양한 프로토콜이 기술되었다. 그러나, 이전에 기술된 프로토콜은 노동 집약적이고, 세포 단리 단계를 포함하여 다수의 시간 소모적인 단계를 필요로 하며, 이로 인해 결국 NK 세포를 생산하기 위한 제조/생산 시간 및 금전적 비용이 증가한다.

NK 세포 기반 치료제 개발이 탄력을 받기 시작하면서 이러한 세포 치료제를 제조하기 위한 보다 효율적이고 완건성 있는 방법이 필요하다.

본 개시 내용은 특히 NK 세포를 생산하기 위한 개선된 방법을 제공한다. NK 세포는 일반적으로 CD56+/CD3- 세포로 특징지어진다. 본 개시 내용은 적어도 부분적으로, 다능성 줄기 세포(예를 들어, 유도 다능성 줄기 세포(iPSC))로부터 유래된 벌크 세포 집단으로부터의 NK 세포의 효율적이고 완건성 있는 생산에 대한 놀라운 발견을 기반으로 한다. NK 세포의 생산을 위해 본 명세서에 제공되는 방법은 하나 이상의 단리 단계가 수행되는 방법뿐만 아니라 단리 단계 없이 수행되는 방법을 포함한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 개시 내용은 예기치 않게 NK 세포가 계통을 기반으로 한 임의의 세포 유형의 단리를 요하지 않으면서 벌크 세포 집단으로부터 성공적으로 유래될 수 있음을 보여준다. 대안적으로, 일부 실시 형태에서, 상기 방법은 하나 이상의 단리 단계를 사용하여 수행될 수 있다. 본 개시 내용은 NK 세포가 풍부한 세포 집단이 단순히 배양 조건을 변경하거나 NK 세포로 분화하기 위한 중간체로서 CD4- 세포를 포함하는 세포 집단을 단리함으로써 iPSC 또는 조혈 전구 세포(HPC) 벌크로부터 유래될 수 있다는 예상치 못한 놀라운 발견을 기반으로 한다. 본 명세서에 기재된 방법은 예컨대, 비용 및 시간 효율적인 방식으로 대량의 NK 세포를 스케일업 및 생산할 수 있는 능력을 포함하여 종래의 NK 세포 생산 방법에 비해 많은 이점을 가진다. 따라서, 본 명세서에 기재된 방법은 NK 세포 기반 치료제를 위한 효율적이고 완건성 있는 제조 공정을 제시한다.

본 명세서에 기재된 방법에 의해 생산된 iPSC 유래 NK 세포(본 명세서에서 "iNK 세포"로도 지칭됨)는 기능적이며, 예컨대 특정 세포 집단을 표적화하기 위한 CAR의 도입을 통해 추가로 유전적으로 변형 가능하다.

일부 양태에서, NK 세포가 풍부한 세포 집단을 생산하는 방법이 제공되며, 상기 방법은

(A) 제1 조건 세트하에서 다능성 줄기 세포의 집단을 배양하여 적어도 20%의 CD34+ HPC(HPC 벌크)를 포함하는 세포 집단을 생성하는 단계; 및

(B) 상기 제1 조건 세트를 제2 조건 세트로 변경하여 적어도 5%의 CD4- 세포를 포함하는 세포 집단을 생성하는 단계; 및

(C) 상기 제2 조건 세트를 제3 조건 세트로 변경하여 NK 세포가 풍부한 세포 집단을 생성하는 단계를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 상기 방법은 단리 단계 없이 수행된다.

일부 실시 형태에서, 상기 방법은 단리된 세포를 단계 (C)의 제3 조건 세트와 접촉시키기 전 단계(B) 이후에 CD4- 세포를 단리하는 단계를 포함한다.

일부 실시 형태에서, CD4- 세포를 단리하는 단계는 세포 집단으로부터 CD4+ 세포를 제거하거나, 나머지 세포로부터 CD4+ 세포를 분리하고, 내재적으로 CD4 표면 마커가 결여된 나머지 세포를 NK 세포로 분화시키는 단계를 포함한다.

(B) 상기 제1 조건 세트를 제2 조건 세트로 변경하여 적어도 5%의 CD4+ 세포 및 적어도 5%의 CD4- 세포를 포함하는 세포 집단을 생성하는 단계; 및

(C) 상기 제2 조건 세트를 제3 조건 세트로 변경하여 NK 세포가 풍부한 세포 집단을 생성하는 단계를 포함하며, 상기 방법은 단리 단계 없이 수행된다.

일부 실시 형태에서, NK 세포가 풍부한 세포 집단은 적어도 30%의 NK 세포를 포함한다. 예컨대, NK 세포가 풍부한 세포 집단은 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 또는 50% 초과의 NK 세포를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 단계 (B)에서 생성된 세포 집단은 적어도 10%, 15% 또는 20%의 CD4- 세포를 포함한다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 단계 (B)에서 생성된 세포 집단은 적어도 10%의 CD4- 세포를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 단계 (B)에서 생성된 세포 집단은 적어도 15%의 CD4- 세포를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 단계 (B)에서 생성된 세포 집단은 적어도 20%의 CD4- 세포를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 단계 (B)에서 생성된 세포 집단은 또한 CD4+ 세포를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 단계 (B)의 CD4- 세포는 CD8+ 세포이다.

일부 실시 형태에서, 단계 (B)의 CD4- 세포는 CD8-이다.

일부 실시 형태에서, 단계 (B)에서 생성된 세포 집단은 20 내지 55%의 CD4-/CD8+ 세포를 포함한다. 예컨대, 일부 실시 형태에서, 단계 (B)에서 생성된 세포 집단은 20%의 CD4-/CD8+ 세포를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 단계 (B)에서 생성된 세포 집단은 25%의 CD4-/CD8+ 세포를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 단계 (B)에서 생성된 세포 집단은 30%의 CD4-/CD8+ 세포를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 단계 (B)에서 생성된 세포 집단은 35%의 CD4-/CD8+ 세포를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 단계 (B)에서 생성된 세포 집단은 40%의 CD4-/CD8+ 세포를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 단계 (B)에서 생성된 세포 집단은 45%의 CD4-/CD8+ 세포를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 단계 (B)에서 생성된 세포 집단은 50%의 CD4-/CD8+ 세포를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 단계 (B)에서 생성된 세포 집단은 55%의 CD4-/CD8+ 세포를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 단계 (B)에서 생성된 세포 집단은 25 내지 55%의 CD4-/CD8- 세포를 포함한다. 예컨대, 일부 실시 형태에서, 단계 (B)에서 생성된 세포 집단은 약 25%의 CD4-/CD8- 세포를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 단계 (B)에서 생성된 세포 집단은 약 30%의 CD4-/CD8- 세포를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 단계 (B)에서 생성된 세포 집단은 약 35%의 CD4-/CD8- 세포를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 단계 (B)에서 생성된 세포 집단은 약 40%의 CD4-/CD8- 세포를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 단계 (B)에서 생성된 세포 집단은 약 45%의 CD4-/CD8- 세포를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 단계 (B)에서 생성된 세포 집단은 약 50%의 CD4-/CD8- 세포를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 단계 (B)에서 생성된 세포 집단은 약 55%의 CD4-/CD8- 세포를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 단계 (B)에서 생성된 세포 집단은 CD4-/CD8- 세포 및 CD4-/CD8+ 세포의 조합을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 단계 (B)에서 생성된 세포 집단은 CD4+/CD8+ 세포 및/또는 CD4+/CD8- 세포인 적어도 5%의 세포를 추가적으로 포함한다.

일부 실시 형태에서, 상기 NK 세포는 CD56+/CD3- 세포이다.

일부 실시 형태에서, 상기 다능성 줄기 세포는 유도 다능성 줄기 세포(iPSC)이다.

일부 실시 형태에서, 상기 제1 조건 세트는 골 형성 단백질-4(BMP4), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF), 아스코르브산, Flt3 리간드(Flt3L), 트롬보포이에틴(TPO) 및 TGFβ 억제제로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 포함하는 배양 배지를 포함한다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 상기 제1 조건 세트는 BMP4를 포함하는 배양 배지를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 제1 조건 세트는 VEGF를 포함하는 배양 배지를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 제1 조건 세트는 bFGF를 포함하는 배양 배지를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 제1 조건 세트는 아스코르브산을 포함하는 배양 배지를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 제1 조건 세트는 Flt3L을 포함하는 배양 배지를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 제1 조건 세트는 TPO를 포함하는 배양 배지를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 제1 조건 세트는 TGFβ 억제제를 포함하는 배양 배지를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 상기 제1 조건 세트는 5 ng/mL 내지 500 ng/mL 농도의 BMP4를 포함하는 배양 배지를 포함한다. 예컨대, 상기 제1 조건 세트는 5 ng/mL 내지 25 ng/mL, 25 ng/mL 내지 50 ng/mL, 25 ng/mL 내지 75 ng/mL, 25 ng/mL 내지 100 ng/mL, 100 ng/mL 내지 125 ng/mL, 100 ng/mL 내지 250 ng/mL, 또는 250 ng/mL 내지 500 ng/mL 농도의 BMP4를 포함하는 배양 배지를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 상기 BMP4는 50 ng/mL의 농도이다.

일부 실시 형태에서, 상기 제1 조건 세트는 5 ng/mL 내지 500 ng/mL 농도의 VEGF를 포함하는 배양 배지를 포함한다. 예컨대, 일부 실시 형태에서, 상기 제1 조건 세트는 5 ng/mL 내지 25 ng/mL, 25 ng/mL 내지 50 ng/mL, 25 ng/mL 내지 75 ng/mL, 25 ng/mL 내지 100 ng/mL, 100 ng/mL 내지 125 ng/mL, 100 ng/mL 내지 250 ng/mL, 또는 250 ng/mL 내지 500 ng/mL 농도의 VEGF를 포함하는 배양 배지를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 상기 VEGF는 약 50 ng/mL의 농도이다.

일부 실시 형태에서, 제1 조건 세트는 5 ng/mL 내지 500 ng/mL 농도의 bFGF를 포함하는 배양 배지를 포함한다. 예컨대, 일부 실시 형태에서, 상기 제1 조건 세트는 5 ng/mL 내지 25 ng/mL, 25 ng/mL 내지 50 ng/mL, 25 ng/mL 내지 75 ng/mL, 25 ng/mL 내지 100 ng/mL, 100 ng/mL 내지 125 ng/mL, 100 ng/mL 내지 250 ng/mL, 또는 250 ng/mL 내지 500 ng/mL 농도의 bFGF를 포함하는 배양 배지를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 상기 bFGF는 50 ng/mL의 농도이다.

일부 실시 형태에서, 상기 제1 조건 세트는 5 μg/mL 내지 500 μg/mL 농도의 아스코르브산을 포함하는 배양 배지를 포함한다. 예컨대, 일부 실시 형태에서, 상기 제1 조건 세트는 5 ng/mL 내지 25 ng/mL, 25 ng/mL 내지 50 ng/mL, 25 ng/mL 내지 75 ng/mL, 25 ng/mL 내지 100 ng/mL, 100 ng/mL 내지 125 ng/mL, 100 ng/mL 내지 250 ng/mL, 또는 250 ng/mL 내지 500 ng/mL 농도의 아스코르브산을 포함하는 배양 배지를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 상기 아스코르브산은 50 μg/mL의 농도이다.

일부 실시 형태에서, 상기 제1 조건 세트는 1 ng/ml 내지 100 ng/mL 농도의 Flt3L을 포함하는 배양 배지를 포함한다. 예컨대, 일부 실시 형태에서, 상기 제1 조건 세트는 5 ng/mL 내지 25 ng/mL, 25 ng/mL 내지 50 ng/mL, 25 ng/mL 내지 75 ng/mL, 또는 25 ng/mL 내지 100 ng/mL 농도의 Flt3L을 포함하는 배양 배지를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 상기 Flt3L는 50 ng/mL의 농도이다.

일부 실시 형태에서, 상기 제1 조건 세트는 1 ng/mL 내지 200 ng/mL 농도의 TPO를 포함하는 배양 배지를 포함한다. 예컨대, 일부 실시 형태에서, 상기 제1 조건 세트는 5 ng/mL 내지 25 ng/mL, 25 ng/mL 내지 50 ng/mL, 25 ng/mL 내지 75 ng/mL, 25 ng/mL 내지 100 ng/mL, 100 ng/mL 내지 125 ng/mL, 또는 100 ng/mL 내지 200 ng/mL 농도의 TPO를 포함하는 배양 배지를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 상기 TPO는 100 ng/mL의 농도이다.

일부 실시 형태에서, 상기 제2 조건 세트는 아스코르브산, 줄기 세포 인자(SCF), IL-7, Flt3L, 트롬보포이에틴(TPO), p38 억제제 및 SDF-1로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 포함하는 배양 배지를 포함한다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 상기 제2 조건 세트는 아스코르브산을 포함하는 배양 배지를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 제2 조건 세트는 SCF를 포함하는 배양 배지를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 제2 조건 세트는 IL-7을 포함하는 배양 배지를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 제2 조건 세트는 Flt3L을 포함하는 배양 배지를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 제2 조건 세트는 TPO를 포함하는 배양 배지를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 제2 조건 세트는 p38 억제제를 포함하는 배양 배지를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 제2 조건 세트는 SDF-1을 포함하는 배양 배지를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 상기 제2 조건 세트는 5 μg/mL 내지 500 μg/mL 농도의 아스코르브산을 포함하는 배양 배지를 포함한다. 예컨대, 일부 실시 형태에서, 상기 제2 조건 세트는 5 ng/mL 내지 25 ng/mL, 25 ng/mL 내지 50 ng/mL, 25 ng/mL 내지 75 ng/mL, 25 ng/mL 내지 100 ng/mL, 100 ng/mL 내지 125 ng/mL, 100 ng/mL 내지 250 ng/mL, 또는 250 ng/mL 내지 500 ng/mL 농도의 아스코르브산을 포함하는 배양 배지를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 상기 제2 조건 세트는 5 ng/mL 내지 100 ng/mL 농도의 SCF를 포함하는 배양 배지를 포함한다. 예컨대, 일부 실시 형태에서, 상기 제2 조건 세트는 5 ng/mL 내지 25 ng/mL, 25 ng/mL 내지 50 ng/mL, 25 ng/mL 내지 75 ng/mL, 또는 25 ng/mL 내지 100 ng/mL 농도의 SCF를 포함하는 배양 배지를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 상기 SCF는 50 ng/mL의 농도이다.

일부 실시 형태에서, 상기 제2 조건 세트는 1 ng/mL 내지 100 ng/mL 농도의 IL-7을 포함하는 배양 배지를 포함한다. 예컨대, 일부 실시 형태에서, 상기 제2 조건 세트는 1 ng/mL 내지 25 ng/mL, 25 ng/mL 내지 50 ng/mL, 25 ng/mL 내지 75 ng/mL, 또는 25 ng/mL 내지 100 ng/mL 농도의 IL-7을 포함하는 배양 배지를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 상기 IL-7은 50 ng/mL의 농도이다.

일부 실시 형태에서, 상기 제2 조건 세트는 1 ng/mL 내지 100 ng/mL 농도의 Flt3L을 포함하는 배양 배지를 포함한다. 예컨대, 일부 실시 형태에서, 상기 제2 조건 세트는 1 ng/mL 내지 25 ng/mL, 25 ng/mL 내지 50 ng/mL, 25 ng/mL 내지 75 ng/mL, 또는 25 ng/mL 내지 100 ng/mL를 포함하는 배양 배지를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 상기 Flt3L은 50 ng/ml 농도의 Flt3L이다.

일부 실시 형태에서, 상기 제2 조건 세트는 1 ng/mL 내지 200 ng/mL 농도의 TPO를 포함하는 배양 배지를 포함한다. 예컨대, 일부 실시 형태에서, 상기 제2 조건 세트는 1 ng/mL 내지 25 ng/mL, 25 ng/mL 내지 50 ng/mL, 25 ng/mL 내지 75 ng/mL, 25 ng/mL 내지 100 ng/mL, 100 ng/mL 내지 125 ng/mL, 또는 100 ng/mL 내지 200 ng/mL 농도의 TPO를 포함하는 배양 배지를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 상기 TPO는 100 ng/mL의 농도이다.

일부 실시 형태에서, 상기 제2 조건 세트는 0.5 μM 내지 100 μM 농도의 p38 억제제를 포함하는 배양 배지를 포함한다. 예컨대, 일부 실시 형태에서, 상기 제2 조건 세트는 0.5 μM 내지 25 μM, 0.5 μM 내지 50 μM, 0.5 μM 내지 100 μM 농도의 p38 억제제를 포함하는 배양 배지를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 상기 p38 억제제는 SB203580이다.

일부 실시 형태에서, 상기 SB203580은 15 μM의 농도이다.

일부 실시 형태에서, 상기 제2 조건 세트는 10 ng/mL 내지 100 ng/mL 농도의 SDF-1을 포함하는 배양 배지를 포함한다. 예컨대, 일부 실시 형태에서, 상기 제2 조건 세트는 1 ng/mL 내지 25 ng/mL, 25 ng/mL 내지 50 ng/mL, 25 ng/mL 내지 75 ng/mL, 또는 25 ng/mL 내지 100 ng/mL 농도의 SDF-1을 포함하는 배양 배지를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 상기 SDF-1은 30 nM의 농도이다.

일부 실시 형태에서, 상기 제3 조건 세트는 CD3 활성화제, IL-2 및 IL-7로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 포함하는 배양 배지를 포함한다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 상기 제3 조건 세트는 CD3 활성화제를 포함하는 배양 배지를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 제3 조건 세트는 IL-2를 포함하는 배양 배지를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 제3 조건 세트는 IL-7을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 상기 제3 조건 세트는 1 ng/mL 내지 100 ng/mL 농도의 IL-2를 포함한다. 예컨대, 일부 실시 형태에서, 상기 제3 조건 세트는 1 ng/mL 내지 25 ng/mL, 25 ng/mL 내지 50 ng/mL, 25 ng/mL 내지 75 ng/mL, 또는 25 ng/mL 내지 100 ng/mL 농도의 IL-2를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 상기 IL-2은 10 ng/mL의 농도이다.

일부 실시 형태에서, 상기 제3 조건 세트는 1 ng/mL 내지 100 ng/mL 농도의 IL-7을 포함하는 배양 배지를 포함한다. 예컨대, 일부 실시 형태에서, 상기 제3 조건 세트는 1 ng/mL 내지 25 ng/mL, 25 ng/mL 내지 50 ng/mL, 25 ng/mL 내지 75 ng/mL, 또는 25 ng/mL 내지 100 ng/mL 농도의 IL-7을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 상기 IL-7은 10 ng/mL의 농도이다.

일부 실시 형태에서, 상기 각각의 배양 단계는 약 5%의 산소에서 수행된다.

일부 실시 형태에서, 상기 각각의 배양 단계는 14% 초과의 산소에서 수행된다.

일부 실시 형태에서, 상기 각각의 배양 단계는 대기 중 산소에서 수행된다.

일부 실시 형태에서, 상기 각각의 배양 단계는 5% 미만의 산소에서 수행된다. 예컨대, 일부 실시 형태태에서, 상기 배양 단계는 5% 미만의 산소, 4% 미만의 산소, 3% 미만의 산소, 2% 미만의 산소 또는 1% 미만의 산소에서 수행된다.

일부 실시 형태에서, 제1 조건 세트에서 다능성 줄기 세포를 배양하여 HPC 벌크를 수득하는 단계는 10일 초과 동안 지속된다.

일부 실시 형태에서, 제1 조건 세트에서 다능성 줄기 세포를 배양하여 HPC 벌크를 수득하는 단계는 11일 내지 15일 동안 지속된다.

일부 실시 형태에서, 제1 조건 세트에서 다능성 줄기 세포를 배양하여 HPC 벌크를 수득하는 단계는 14일 동안 지속된다.

일부 실시 형태에서, 상기 iPSC는 말초 혈액 단핵 세포로부터 수득된다.

일부 실시 형태에서, 상기 생산된 세포 집단 내 적어도 약 50%, 55%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% 또는 그 이상의 세포는 농축 단계 없이 생산된 CD56+/CD3-NK 세포이다.

일부 실시 형태에서, 상기 생산된 세포의 약 25% 미만은 CD3+ 세포이다.

일부 실시 형태에서, 상기 생산된 세포 집단 내 세포의 백분율은 유세포 분석에 의해 결정된다.

일부 실시 형태에서, 상기 생산된 세포 집단 내 세포의 백분율은 단일 세포 RNA 서열분석(scRNAseq)에 의해 결정된다.

일부 실시 형태에서, 상기 방법은 CD56+/CD3- 세포를 단리하는 단계를 더 포함한다.

일부 실시 형태에서, 상기 단리는 형광 활성화 세포 분류(FACS) 또는 자기 분류를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 상기 NK 세포는 하나 이상의 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 유전적으로 변형된다.

일부 실시 형태에서, 상기 CAR은 CD19 CAR이다.

일부 실시 형태에서, 상기 NK 세포는 IL-15Rα/IL-15 복합체를 발현하도록 추가로 유전적으로 변형된다.

일부 양태에서, 유도 다능성 줄기 세포(iPSC) 유래 NK 세포를 생산하는 방법이 제공되며, 상기 방법은

(1) 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF), 및 아스코르브산으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 포함하는 배지를 포함하는 제1 조건 세트에서 iPSC를 배양하여 적어도 20%의 CD34+ HPC(HPC 벌크)를 포함하는 집단을 수득하는 단계;

(2) 아스코르브산, p38 억제제 및 SDF-1 중 하나 이상을 포함하는 배양 배지를 포함하는 제2 조건 세트에서 단계 (1)에서 수득된 HPC 벌크를 배양하여 적어도 5%의 CD4- 세포를 포함하는 세포 집단을 수득하는 단계; 및

(3) CD3 활성화제, IL-2 및 IL-7로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 포함하는 배양 배지를 포함하는 제3 조건 세트에서 단계 (2)에서 수득된 세포 집단을 배양하는 단계를 포함한다.

(1) 아스코르브산, p38 억제제 및 SDF-1 중 하나 이상을 포함하는 배양 배지를 포함하는 제2 조건 세트에서 조혈 전구 세포(HPC 벌크)를 포함하는 벌크 세포 집단을 배양하여 적어도 5%의 CD4- 세포를 포함하는 세포 집단을 수득하는 단계;

(2) 단계 (1)에서 수득된 CD4- 세포를 단리하는 단계; 및

(3) CD3 활성화제, IL-2 및 IL-7로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 포함하는 NK 유도 배지에서 상기 단리된 CD4- 세포를 배양하는 단계를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 단계 (1)에서 수득된 세포 집단 내 세포의 약 15 내지 30%는 CD4- 세포이다.

일부 실시 형태에서, 단계 (1)에서 수득된 세포 집단 내 세포의 약 20%는 CD4- 세포이다.

일부 실시 형태에서, CD4- 세포를 포함하는 세포 집단은 CD4-/CD8- 세포 및 CD4-/CD8+ 세포를 포함한다.

일부 양태에서, 본 명세서에 개시된 방법을 사용하여 생산된 NK 세포 집단이 제공된다.

일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 방법을 사용하여 생산된 NK 세포 집단은 동결보존 배지에 동결보존된다.

일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 따라 수득된 전체 다능성 줄기 세포 유래 CD56+ 세포의 적어도 60%의 비율로 존재하는, 다능성 줄기 세포 유래 CD56+/CD3- 세포를 포함하는 미분류 세포 집단이 제공된다.

일부 실시 형태에서, 상기 미분류 세포 집단 내 세포의 25% 미만은 CD3+ 세포이다.

일부 실시 형태에서, 상기 미분류 세포 집단 내 세포의 5% 미만은 단핵구이다.

일부 실시 형태에서, 상기 미분류 세포 집단 내 세포의 5% 미만은 B 세포이다.

일부 실시 형태에서, 상기 미분류 세포 집단 내 세포의 백분율은 유세포 분석에 의해 결정된다.

일부 실시 형태에서, 세포의 백분율은 단일 세포 RNA 서열분석(scRNAseq)에 의해 결정된다.

일부 양태에서, 세포 치료가 필요한 대상체를 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 전술한 청구항 중 어느 하나의 NK 세포를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 상기 대상체는 암이 있다.

일부 실시 형태에서, 상기 암은 백혈병 또는 림프종이다.

일부 양태에서, CD34+ 조혈 전구 세포(HPC)를 포함하는 세포 집단을 생산하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF) 및 아스코르브산으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 포함하는 배지를 포함하는 제1 조건 세트에서 다능성 줄기 세포 집단을 배양하여 CD34+ HPC(HPC 벌크)로 구성된 집단을 수득하는 단계를 포함한다.

일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 의해 생산된 HPC를 포함하는 세포 집단이 제공된다.

일부 실시 형태에서, 상기 세포 집단은 적어도 20%의 CD34+ 세포를 포함한다.

도 1은 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 수득된 NK 세포 벌크 집단의 유세포 분석 결과를 보여주는 일련의 유세포 분석 플롯이다. 간략하게, iPS 세포는 중간 단리 단계 없이 본 명세서에 기재된 바와 같이 배양되었다. 유세포 분석 그래프는 CD56^high인 CD3 음성 세포의 집단(NK 세포 벌크 집단의 대략 63.5%) 및 CD56^dim인 CD3 음성 세포의 집단(NK 세포 벌크 집단의 대략 26.7%)의 존재를 보여준다. 이들 두 집단은 모두 NK 세포이다. 따라서, 수득된 전체 CD56 양성, CD3 음성 NK 세포 집단은 전체 세포 집단의 90%를 초과한다.
도 2는 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 수득된 NK 세포 벌크 집단의 scRNA 분석 결과를 보여준다. 간략하게, iPSC는 중간 단리 단계 없이 본 명세서에 기재된 바와 같이 배양되었다. 세포는 단핵구, B 세포, NK 세포 및 T 세포의 4가지 세포 집단으로 분류되었다. NK 세포 벌크 집단 내 세포의 대략 75%는 NK 세포(CD56+/CD3- 세포)로 확인된 반면, 벌크 세포 집단 내 세포의 대략 25%는 T 세포로 확인되었다. 본 명세서에 기재된 T 세포는 NKT 세포(CD56+/CD3+ 세포)를 포함할 수 있다.
도 3은 루시퍼라제 발현 Nalm6 세포의 투여에 이어, iNK-CAR19 세포를 투여한 NSG(NOD/Shi-scid, IL-2R 감마 널) 마우스에서 항종양 활성 분석의 결과를 보여주는 일련의 사진을 도시한다. Nalm6 세포가 이식된 NSG 마우스는 (a) PBS 완충액 (b) iNK-CAR 세포로 치료되었고, 이러한 치료의 항종양 유효성이 관찰되었다. 데이터는 iNK-CAR 세포가 Nalm6 세포의 증식을 감소시켰음을 나타낸다.

정의

투여: 본 명세서에서 사용되는 경우에, 용어 "투여하다", "투여하는", "투여", "도입하는" 또는 "도입"은 해당 세포의 전달을 초래하는 방법 또는 경로에 의해, 치료적 세포, 예를 들어, iPSC 또는 HPC 유래된 CD56+/CD3- 면역 세포를 대상체 내로 전달하는 맥락에서 상호교환적으로 사용된다. 예를 들어, 정맥내, 국소, 경구, 근육내, 복강내, 척수강내, 피하 또는 경피를 포함하는, 세포를 투여하기 위한 다양한 방법이 해당 기술 분야에 공지되어 있다. 세포는 담체의 유무에 관계없이 투여될 수 있다.

입양 세포 요법: 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되는 경우에, 용어 "입양 세포 요법" 또는 "입양 세포 전달" 또는 "세포 요법" 또는 "ACT"는 세포, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 생성된 CD56+/CD3- 세포 집단의 전달을 지칭하고, 이를 필요로 하는 대상체 또는 환자 내로 투여된다. 일부 실시 형태에서, 상기 세포는 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 제조되고 추가적으로 CAR를 발현하는 CD56+/CD3- 면역 세포이다.

동물: 본 명세서에 사용되는 경우에, 용어 "동물"은 동물 생태계의 모든 구성원을 지칭한다. 일부 실시 형태에서, "동물"은 임의의 발달 단계에 있는 인간을 지칭한다. 일부 실시 형태태에서, "동물"은 임의의 발달 단계에 있는 비인간 동물을 지칭한다. 특정 실시 형태에서, 상기 비인간 동물은 포유동물(예를 들어, 설치류, 마우스, 랫트, 토끼, 원숭이, 개, 고양이, 양, 소, 영장류, 및/또는 돼지)이다. 일부 실시 형태에서, 동물은 포유류, 조류, 파충류, 양서류, 어류, 곤충, 및/또는 벌레를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시 형태에서, 동물은 형질전환 동물, 유전자 조작 동물, 및/또는 클론일 수 있다.

항원 특이적 표적화 도메인: "항원 특이적 표적화 도메인"은 CAR에게 관심 표적 항원에 결합하는 능력을 제공한다. 일부 실시 형태에서, 항원 특이적 표적화 도메인은 종양 사멸을 초래하는 효과기 면역 반응을 유발하는 것이 바람직한 임상적 관심 항원을 표적화한다. 항원 특이적 표적화 도메인은 생물학적 분자(예를 들어, 세포 표면 수용체 또는 종양 단백질, 또는 이들의 구성요소)를 특이적으로 인식하고, 이에 결합하는 능력을 보유하는 임의의 단백질 또는 펩티드일 수 있다. 상기 항원 특이적 표적화 도메인은 관심 있는 생물학적 분자에 대해 임의의 자연 발생, 합성, 반합성, 또는 재조합적으로 생산된 결합 상대를 포함한다.

예시적인 항원 특이적 표적화 도메인은 예를 들어 항체 또는 항체 단편 또는 유도체, 수용체의 세포 외 도메인, 세포 표면 분자/수용체에 대한 리간드, 또는 이의 수용체 결합 도메인, 및 종양 결합 단백질을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 항원 특이적 표적화 도메인은 항체이거나 이로부터 유래된다. 항체 유래 표적화 도메인은 항체의 단편 또는 항체의 하나 이상의 단편의 유전적으로 조작된 생성물일 수 있으며, 이 단편은 항원과의 결합에 관여한다. 예에는 가변 영역(Fv), 상보성 결정 영역(CDR), Fab, 단일 사슬 항체(scFv), 중쇄 가변 영역(VH), 경쇄 가변 영역(VL) 및 낙타과 항체(VHH)가 포함된다.

일부 실시 형태에서, 결합 도메인은 단일 사슬 항체(scFv)이다. scFv는 뮤린, 인간 또는 인간화된 scFv일 수 있다.

동종이계: 본 명세서에서 사용되는 경우에, "동종이계"는 물질이 도입된 개체와 동일한 종의 다른 동물로부터 유래된 임의의 물질을 지칭한다. 둘 이상의 개체는 하나 이상의 유전자좌에서 유전자가 동일하지 않은 경우 서로 동종이계라고 한다. 일부 측면에서, 동일한 종의 개체로부터의 동종이계 물질은 항원적으로 상호작용하기 위해 유전적으로 충분히 상이할 수 있다.

대략 또는 약: 본 명세서에 사용된, 하나 이상의 관심 값에 적용되는 용어 "대략" 또는 "약"은 명시된 기준 값과 유사한 값을 지칭한다. 특정 실시 형태에서, 용어 "대략" 또는 "약"은 달리 명시되거나 문맥상 명백하지 않는 한 명시된 기준 값의 어느 한 방향(초과 또는 미만)으로 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 이하(해당 숫자가 가능한 값의 100%를 초과하는 경우 제외) 내에 속하는 값의 범위를 지칭한다. 용어 "약" 또는 "대략"은 명시된 기준 값을 변형하는 데 사용되는 경우, 명시된 기준 값 자체는 명시된 기준 값의 양쪽에 명시된 기준 값에 가까운 값과 함께 포함되는 것으로 이해된다.

아스코르브산 또는 비타민 C: 본 명세서에서 사용되는 경우에, "아스코르빈산" 또는 "비타민 C"는 L-아스코르빈산 및 이의 유도체를 의미하고, "L-아스코르빈산 유도체"는 생체 내에서 효소 반응에 의해 비타민 C가 되는 유도체를 의미한다. L-아스코르빈산의 유도체의 예는 비타민 C 포스페이트, 아스코르브산 글루코시드, 아스코르빌 에틸, 비타민 C 에스테르, 아스코르빌 테트라헥실데카노에이트, 아스코르빌 스테아레이트 및 아스코르빌 2-포스페이트 6-팔미테이트를 포함한다. 비타민 C 포스페이트의 예는 L-아스코르브산 포스페이트의 염, 예컨대 L-아스코르빈산 포스페이트 Na 및 L-아스코르브산 포스페이트 Mg를 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 비타민 C는 아스코르브산 2-포스페이트일 수 있다.

벌크 세포 집단: 용어 "벌크 세포 집단", "벌크 세포" 등의 용어는 세포의 이종 집단을 지칭한다. 일부 실시 형태에서, 상기 벌크 세포 집단은 조혈 세포를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 벌크 세포 집단은 다능성 세포(예를 들어, 유도 다능성 줄기 세포(iPSC))로부터 수득될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 벌크 세포 집단은 예를 들어, 혈액을 포함하는 공여자 조직으로부터 수득된다.

CD4- 유도 배지 또는 제2 조건 세트: CD4- 유도 배지라는 용어는 "제2 조건 세트"와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에서 사용되는 이들 용어는 CD4- 세포를 포함하는 세포 집단을 수득하는 데 사용되는 세포 배양 배지를 지칭한다. 일부 실시 형태에서, 이 배지는 HP 세포 벌크를 CD4- 세포를 포함하는 세포 집단으로 분화시키는 데 사용된다. 일부 실시 형태에서, CD4- 유도 배지는 아스코르브산, 줄기세포 인자(SCF), 트롬보포이에틴(TPO), Flt3L, IL-7, p38 억제제, 예컨대 SB203580, 및 SDF1, 예컨대 SDF-1α 중 하나 이상, 또는 전부를 포함한다.

키메라 항원 수용체(CAR): 본 명세서에서 사용되는 경우에, 용어 "키메라 항원 수용체" 또는 "CAR" 조작된 수용체는 세포(예를 들어, 면역 세포, 예컨대 NK 세포, T 세포, 예컨대 나이브 T 세포, 중추 기억 T 세포, 효과기 기억 T 세포 또는 이의 조합)에 항원 특이성을 부여할 수 있다. CAR은 인공 T 세포 수용체, 키메라 T 세포 수용체 또는 키메라 면역 수용체로도 알려져 있다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 CAR은 항원 특이적 표적화 도메인, 세포 외 도메인, 막관통 도메인, 선택적으로 하나 이상의 공동자극 도메인, 및 세포 내 신호전달 도메인을 포함한다. 본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, CAR은 원하는 세포 표면 항원 또는 MHC-펩티드 복합체에 대한 특이성을 재유도하도록 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 제조된 NK 세포(예를 들어, CD56+/CD3- 세포) 내로 도입된다. 이러한 합성 수용체는 전형적으로 단일 융합 분자의 가요성 링커를 통해 하나 이상의 신호전달 도메인과 연관되는 표적 결합 도메인을 포함한다. 표적 결합 도메인은 NK 세포를 병리학적 세포(예를 들, 암세포) 표면의 특정 표적으로 유도하는 데 사용되며, 신호전달 도메인은 NK 세포 활성화 및 증식을 위한 분자 기구를 포함한다. 일반적으로 NK 세포막을 통과하는(즉, 막관통 도메인 형성) 가요성 링커는 CAR의 표적 결합 도메인의 세포막 표시(display)를 허용한다. CAR은 면역 세포가 림프종 및 고형 종양을 포함한 다양한 악성 종양의 종양 세포 표면에서 발현된 항원에 대해 재유도되도록 하는 데 성공하였다(Gross 등, (1989) Transplant Proc., 21(1 Pt 1): 127-30; Jena 등, (2010) Blood, 116(7):1035-44). CAR의 세포 외 결합 도메인은 뮤린 또는 인간화 단일클론 항체의 가변 중쇄 및 경쇄 영역의 융합으로부터 유래된 단일 사슬 가변 단편(scFv)으로 구성될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 세포 외 결합 도메인은 단일 도메인 항체를 포함한다. 대안적으로, (예를 들어, Fab 라이브러리로부터 수득된 항체 대신에) Fab로부터 유래된 scFv가 사용될 수 있다. 다양한 실시 형태에서, 이 scFv는 막관통 도메인에 융합된 다음 세포 내 신호전달 도메인에 융합된다. 최소 3세대의 CAR이 개발되었다. 제1세대 CAR은 CD3제타 또는 Fc 수용체 감마 사슬의 세포질 영역으로부터 유래된 신호전달 도메인에 부착된 표적 결합 도메인을 포함하였다. 제1세대 CAR은 면역 세포를 선택된 표적으로 성공적으로 재유도하는 것으로 나타났지만, 생체 내에서 장기간의 확장 및 항종양 활성을 제공하지 못하였다. 제2세대 및 제3세대 CAR은 공동 자극 분자, 예컨대 CD28, OX-40(CD134) 및 4-1BB(CD137)를 포함하여 변형된 세포 생존을 강화하고 증식을 증가시키는 데 중점을 두었다.

배양: 용어 "배양" 또는 "세포 배양" 또는 "배양하는"은 시험관 내 환경에서 세포의 유지, 성장 및/또는 분화를 지칭한다. 본 명세서에 기재된 다양한 방법에서, 세포는 하나의 유형의 세포에서 다른 하나의 유형의 세포로의 성장 또는 분화를 용이하게 하거나 촉진하는 특정 세포 배양 배지(또는 복수형의 경우 "배지(media)")에서 배양된다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 특정 실시 형태에서, 세포 배양 배지에서 iPSC를 배양하면 전체 세포 집단에서 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80%의 세포가 CD34+ 세포(즉, HPC)가 된다. 본 명세서에 기재된 일부 실시 형태에서, 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 또는 80%의 HPC를 포함하는 세포 집단을 배양하면 CD4- 세포를 포함하는 세포 집단이 생성된다. 또 다른 실시 형태에서, CD4- 세포를 포함하는 세포의 세포 집단을 배양하면 농축된 CD56+/CD3- 세포 집단(즉, 전체 세포 집단에서 세포의 적어도 50%가 CD56+/CD3-임)이 생성된다. 세포 배양 배지는 세포의 증식 및/또는 유지에 도움이 되는 영양소, 호르몬 및/또는 기타 인자의 공급원으로 작용한다.

분화: 용어 "분화하는", "유도하는", "전환하는", "유래하는" 등은 하나의 표현형의 세포가 다른 하나의 표현형의 세포로 변화하는 과정을 지칭한다.

조작된(Engineered): 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어, "조작된"은 디자인되거나 변형된 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 세포 및/또는 존재 및 생산에 중재 및/또는 활성이 필요한 세포를 기술한다. 예를 들어, 의도적으로 특정 효과를 유도하도록 디자인된 조작된 세포는 동일한 유형의 자연 발생 세포의 효과와 상이하다. 일부 실시 형태에서, 조작된 세포는 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 iPSC 또는 HPC로부터 유래된 CD56+/CD3- 세포이고, 키메라 항원 수용체를 추가로 발현한다.

농축된(Enriched): 특정 세포 유형과 관련하여 본 명세서에 사용된 "농축된"은 유세포 분석 또는 다른 분석 방법에 의해 결정된 바와 같이 세포 집단 내에서 특정 세포 유형의 적어도 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 또는 90%를 갖는 세포 집단을 의미한다.

생체 외 : 본 명세서에서 사용되는 경우에, 용어 "생체 외"는 세포가 살아있는 유기체로부터 제거되어 유기체 외부(예를 들어, 시험관 내 배양 백 내, 생물 반응기 내)에서 증식되는 과정을 의미한다.

기능적 등가물 또는 유도체: 본 명세서에서 사용되는 경우에, 용어 "기능적 등가물" 또는 "기능적 유도체"는 아미노산 서열의 기능적 유도체와 관련하여 원래 시퀀스와 실질적으로 유사한 생물학적 활성(기능 또는 구조적)을 유지하는 분자를 의미한다. 기능적 유도체 또는 등가물은 천연 유도체일 수 있거나 합성으로 제조된다. 예시적인 기능적 유도체는 단백질의 생물학적 활성이 보존된다면, 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가를 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 치환 아미노산은 바람직하게는 치환된 아미노산과 유사한 물리화학적 특성을 갖는다. 바람직한 유사한 화학적-물리적 특성은 전하, 부피, 소수성, 친수성 등의 유사성을 포함한다.

조혈 전구 세포: 용어 "조혈 전구 세포" 또는 "조혈 전구 세포들" 또는 "HPC" 또는 "HPCs"는 조혈 계통에 전념하지만 추가로 조혈 분화가 가능한 CD34+ 세포를 지칭하며, 조혈 줄기 세포, 다분화능 조혈 줄기 세포, 공통 골수성 전구 세포, 거핵구 전구 세포, 적혈구 전구 세포 및 림프구성 전구 세포를 포함한다.

HPC 벌크: 용어 "HPC 벌크", "조혈 전구 세포 벌크" 또는 "HP 세포 벌크"는 조혈 전구 세포를 포함하는 세포의 이종 집단을 의미한다. 일부 실시 형태에서, HPC 벌크는 iPSC로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, HPC 벌크는 혈액으로부터 유래된다.

HPC 유래 NK 세포: 용어 "HPC 유래 NK 세포"는 세포 배양 배지에서 배양한 후 HPC 벌크 집단으로부터 수득된 CD56+/CD3- 세포(예를 들어, NK 또는 NK 유사 세포)를 의미한다.

HPC 유도 배지 및 제1 조건 세트: 본 명세서에서 사용되는 경우에, 용어 HPC 유도 배지 또는 "제1 조건 세트"는 출발 세포 집단으로부터 조혈 세포를 포함하는 세포 집단을 생성하는 데 사용되는 배양 배지를 지칭한다. 일부 실시 형태에서, 상기 출발 세포 집단은 iPSC를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 HPC 유도 배지는 BMP4, VEGF, bFGF, 아스코르브산, TGFβ 억제제, 줄기 세포 인자(SCF), 트롬보포이에틴(TPO), 및 Flt3L 중 하나 이상을 포함한다.

면역 세포: 본 명세서에서 사용되는 경우에, 용어 "면역 세포" 또는 "면역 세포들"은 이에 제한되지는 않으나, T 세포, NK 세포, T/NK 세포, 수지상 세포, 대식세포, B 세포, 호중구, 적혈구, 단핵구, 호염기구, 호중구, 비만 세포, 호산구, 및 이들의 임의의 조합을 포함하는 면역계의 세포를 지칭한다. 다양한 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 생성된 면역 세포는 CD56+/CD3- 세포로 특징지어지는 NK 세포이다.

유도 다능성 줄기 세포(iPSC): 본 명세서에서 사용되는 경우에, 용어 "유도 다능성 줄기 세포" 또는 "iPSC"는 예를 들어, (이에 제한되지는 않으나, SOX2(유전자 ID; 6657), KLF4(유전자 ID; 9314), cMYC(유전자 ID; 4609), NANOG(유전자 ID; 79923), LIN28/LIN28A(유전자 ID; 79727)와 조합된 POU4F1/OCT4(유전자 ID; 5460)를 포함하는) 하나 이상의 유전자의 발현을 유도함으로써 비다능성 세포, 전형적으로 성체 체세포로부터 인공적으로 유래된(예를 들어, 유도된) 다능성 줄기 세포를 지칭한다. 줄기 세포는 마커 또는 유전자로 임의의 단계에서 유전적으로 변형되어 상기 마커 또는 유전자가 임의의 배양 단계에 걸쳐 전달될 수 있다. 상기 마커는 임의의 배양 단계에서 분화되거나 미분화된 줄기 세포 집단을 정제하거나 풍부하게 하는 데 사용될 수 있다.

유도 배지: 용어 "유도 배지"는 일반적으로 제1 세포 표현형에서 제2 세포 표현형으로 세포 집단을 분화시키는 데 사용되는 세포 배양 배지를 지칭한다. 일부 실시 형태에서, 제1 세포 표현형 및 제2 세포 표현형은 세포의 이종 집단을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 세포 표현형은 세포의 이종 집단을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제2 세포 표현형은 세포의 이종 집단을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 유도 배지는 이종 세포 집단을 실질적으로 균질한 세포 집단으로 분화시키는 데 사용된다.

시험관 내: 본 명세서에서 사용되는 경우에, 용어 "시험관 내"는 다세포 유기체 내에서보다, 인공 환경, 예를 들어, 시험관 또는 반응 용기 내, 세포 배양물 내 등에서 발생하는 사건을 지칭한다.

생체 내: 본 명세서에서 사용되는 경우에, 용어 "생체 내"는 인간 및 비인간 동물과 같은 다세포 유기체 내에서 발생하는 사건을 지칭한다. 세포 기반 시스템의 맥락에서 이 용어는 살아있는 세포(예를 들어, 시험관 내 시스템과 대조적으로) 내에서 발생하는 사건을 지칭하는 데 사용될 수 있다.

단리 단계: 본 명세서에서 사용되는 경우에, 용어 "단리하는", "단리하는 단계", "단리", 또는 "단리 단계", 또는 "세포 단리 단계"는 세포 혼합물로부터 특정 세포 유형을 분리하는 것을 의미한다. 일부 실시 형태에서, 세포 유형은 특정 세포 유형의 세포 표면 상에 존재하거나 부재하는 하나 이상의 마커에 의해 정의될 수 있다. 세포 혼합물로부터 특정 세포 유형을 단리하는 다양한 방법은 해당 기술 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 형광 활성화 세포 분류(FACS), 및 자기 활성화 세포 분류(MACS)와 같은 자기 비드 기반 분류 방법이 포함된다.

자연 살해(NK) 세포: 본 명세서에서 사용되는 경우에, "자연 살해 세포" 또는 NK 세포는 이의 마커 발현 및 기능/활성에 의해 정의되는 림프계 세포이다. 예를 들어, 인간에서 NK 세포는 CD56(CD56+)을 발현한다. 추가 실시 형태에서, 이러한 NK 세포는 CD56 및 CD16(CD56+/CD16+)을 발현할 수 있다. 또 다른 예에서, 이러한 NK 세포는 CD56을 발현하지만 CD3(CD56+/CD3-)은 발현하지 않을 수 있다. NK 세포는 다양한 수준의 CD56을 발현할 수 있다. 예를 들어, NK 세포는 "CD56^high "일 수 있으며, 이는 상기 NK 세포가 해당 기술 분야의 방법, 예를 들어 유세포 분석에 의해 평가된 바와 같이 높은 수준의 CD56을 발현함을 의미한다. 또 다른 예로서, NK 세포는 "CD56^dim"일 수 있으며, 이는 상기 NK 세포가 해당 기술 분야의 방법, 예를 들어 유세포 분석에 의해 평가된 바와 같이 낮지만 검출가능한 수준의 CD56을 발현함을 의미한다.

NK 유도 배지 또는 제3 조건 세트: 일부 실시 형태에서, 용어 "NK 유도 배지" 또는 "제3 조건 세트"는 CD56+/CD3- 세포를 포함하는 세포 집단을 생성하는 데 사용되는 세포 배양 배지를 지칭한다. 일부 실시 형태에서, 상기 NK 세포 유도 배지는 IL-7, IL-2 및 CD3 활성화제(예를 들어, 항CD3 항체) 중 하나 이상을 포함한다.

iPS NK 세포: 본 명세서에서 사용되는 경우에, "iPS NK 세포"는 iPSC 유래 NK 세포, 예를 들어 출발 물질로서 iPSC로부터 유래된 NK 세포이다. 이러한 iPS NK 세포 는 CD56(CD56+)을 발현한다. 추가 실시 형태에서, 이러한 iPS NK 세포는 CD56 및 CD16(CD56+/CD16+)을 발현할 수 있다. 또 다른 예에서, 이러한 iPS NK 세포는 CD56을 발현하고 CD3(CD56+/CD3-)을 발현하지 않을 수 있다. iPS NK 세포는 또한 본 명세서에서 "iNK 세포"로도 지칭된다.

T 세포: 본 명세서에서 사용되는 경우에 "T 세포"는 이의 마커 발현 및 기능/활성에 의해 정의되는 림프계 세포이다. 예를 들어, 인간에서 T 세포는 CD3를 발현한다. CD56+/CD3+ 세포는 NKT 세포로도 알려져 있다.

단일 사슬 Fv 항체" 또는 "scFv"는 직접적으로 또는 펩티드 링커 서열을 통해 서로 연결된 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함하는 조작된 항체를 지칭한다.

대상체: 본 명세서에서 사용되는 경우에, 용어 "대상체"는 인간 또는 임의의 비인간 동물(예를 들어, 마우스, 랫트, 토끼, 개, 고양이, 소, 돼지, 양, 말 또는 영장류)을 의미한다. 인간은 출생 전 및 출생 후 형태를 포함한다. 많은 실시 형태에서, 대상체는 인간이다. 대상체는 환자일 수 있으며, 이는 질병의 진단 또는 치료를 위해 의료 제공자에게 제시되는 인간을 지칭한다. 본 명세서에서 용어 "대상체"는 "환자"와 상호교환적으로 사용된다. 대상체는 질병 또는 장애에 걸리거나 이에 취약할 수 있지만 질병 또는 장애의 증상을 나타내거나 나타내지 않을 수 있다.

를 앓는(suffering from): 질병, 장애 및/또는 병태를 "앓는" 개체는 질병, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 증상으로 진단되거나 이를 나타낸다. 질병은 암, 예를 들어 림프종 및 백혈병을 포함할 수 있다.

치료적 유효량: 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어, 치료제(예를 들어, 세포 요법)의 "치료적 유효량"은 질병, 장애 및/또는 병태를 앓고 있거나 이에 민감한 대상체에게 투여될 때, 질병, 장애 및/또는 병태의 증상(들)을 치료, 진단, 예방, 및/또는 발병을 지연시키기에 충분한 양(예를 들어, 특정 유형 또는 유형의 세포 또는 세포가 특정 비율로 농축된 특정 수의 세포 또는 세포 집단)을 의미한다. 치료적 유효량은 적어도 하나의 단위 용량을 포함하는 투여 요법을 통해 전형적으로 투여된다는 것이 해당 분야의 통상의 기술자에 의해 이해될 것이다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 CD56+/CD3- 세포는 하나 이상의 전이유전자를 발현하도록 변형된다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 CD56+/CD3- 세포는 예를 들어, CD19와 같은 키메라 항원 수용체를 발현하도록 변형된다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 약 1억 내지 9억개의 CD56+/CD3- 세포가 이를 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 약 1억 내지 7억개의 CD56+/CD3- 세포가 이를 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 약 1억 내지 5억개의 CD56+/CD3- 세포가 이를 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 약 2억 내지 9억개의 CD56+/CD3- 세포가 이를 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 약 2억 내지 7억개의 CD56+/CD3- 세포가 이를 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 약 2억 내지 5억개의 CD56+/CD3- 세포가 이를 필요로 하는 대상체에게 투여된다.

치료하는: 본 명세서에서 사용되는 경우에, 용어 "치료하다", "치료" 또는 "치료하는"은 특정 질병, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 증상 또는 특징의 부분적으로 또는 완전히 완화, 개선, 경감, 억제, 예방, 발병 지연, 중증도 감소 및/또는 발병률 감소에 사용되는 임의의 방법을 지칭한다. 질병의 징후를 나타내지 않고/않거나 질병의 초기 징후만 나타내는 대상체에게 질병과 관련된 병리 현상이 발생할 위험을 감소시킬 목적으로 치료제를 투여할 수 있다.

본 명세서에서 끝점에 의한 수치 범위의 언급은 해당 범위 내에 포함된 모든 숫자 및 분수를 포함한다(예컨대, 1 내지 5는 1, 1.5, 2, 2.75, 3, 3.9, 4, 및 5를 포함한다). 또한 이의 모든 숫자와 분수는 "약"이라는 용어에 의해 수정되는 것으로 추정된다는 것이 이해되어야 한다.

본 발명의 다양한 양태는 하기 섹션에서 상세히 설명된다. 섹션의 이용은 본 발명을 제한하기 위한 것이 아니다. 각 섹션은 본 발명의 임의의 양태에 적용될 수 있다. 본 출원에서, “또는”의 사용은 달리 명시되지 않는 한 “및/또는”을 의미한다. 본 명세서에 사용되는 경우에, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥상 명백하게 달리 지시하지 않는 한 단수 및 복수 지시 대상을 모두 포함한다.

본 발명의 다양한 양태는 하기 섹션에서 상세히 설명된다. 섹션의 이용은 본 발명을 제한하기 위한 것이 아니다. 각 섹션은 본 발명의 임의의 양태에 적용될 수 있다. 본 출원에서, “또는”의 사용은 달리 명시되지 않는 한 “및/또는”을 의미한다.

발명을 실시하기 위한 구체적인 내용

본 개시 내용은 다능성 세포, 예컨대 iPS 세포 또는 조혈 전구 세포(HPC) 벌크로부터 NK 세포가 풍부한 세포 집단을 생산하는 방법을 제공한다. 상기 iPSC로부터 생산된 NK 세포는 본 명세서에서 iPS 유래 NK 세포, iPS NK 세포 또는 iNK 세포로 지칭된다. 본 개시 내용은 다능성 세포, 예컨대 iPSC 또는 HPC와 같은 전구세포가 단리 단계 필요 없이 NK 세포 또는 iPS NK 세포로 고효율로 분화될 수 있는 세포 배양 방법을 제공한다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 단리 단계를 포함한다. 단리 단계에서, CD4-인 세포(예를 들어, CD4-/CD8+ 및/또는 CD4-/CD8-를 포함하는 것과 같은 CD4+ 세포 이외의 세포의 집단)를 단리할 수 있으며, 이는 이어서 NK 세포로 분화된다. 본 개시 내용은 또한 본 명세서에 기재된 방법으로 수득된 iPS NK 세포가 기능적이며, 예를 들어, 암과 같은 다양한 질병 또는 장애의 치료에 유용한 키메라 항원 수용체(CAR)의 도입을 통해 유전적으로 추가로 변형될 수 있음을 입증한다.

CD56+/CD3- 세포(NK 세포)를 생산하는 다양한 방법이 이하에서 보다 상세하게 기술된다.

NK 또는 iPSC 유래 NK 세포의 생산 방법

배양 방법 개요

일부 실시 형태에서, NK 세포가 풍부한 세포 집단을 생산하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 (A) 제1 조건 세트하에서 다능성 줄기 세포의 집단을 배양하여 적어도 20%의 CD34+ HPC(HPC 벌크)를 포함하는 세포 집단을 생성하는 단계; 및 (B) 상기 제1 조건 세트를 제2 조건 세트로 변경하여 적어도 5%의 CD4- 세포를 포함하는 세포 집단을 생성하는 단계; 및 (C) 상기 제2 조건 세트를 제3 조건 세트로 변경하여 NK 세포가 풍부한 세포 집단을 생성하는 단계를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 상기 방법은 단리 단계 없이 수행된다. 이 시나리오에서는 단계 (B) 이후에 CD4- 세포의 단리가 없다. 예컨대, 일부 실시 형태에서, NK 세포가 풍부한 세포 집단을 생산하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 (A) 제1 조건 세트하에서 다능성 줄기 세포의 집단을 배양하여 적어도 20%의 CD34+ HPC(HPC 벌크)를 포함하는 세포 집단을 생성하는 단계; 및 (B) 상기 제1 조건 세트를 제2 조건 세트로 변경하여 적어도 5%의 CD4- 세포를 포함하는 세포 집단을 생성하는 단계; 및 (C) 상기 제2 조건 세트를 제3 조건 세트로 변경하여 NK 세포가 풍부한 세포 집단을 생성하는 단계를 포함하며, 상기 방법은 단리 단계 없이 수행된다.

CD4- 세포를 포함하는 세포 집단은 또한 CD4+ 세포를 포함할 수 있음에 유의한다. 예컨대, 일부 실시 형태에서, 5% 이상의 CD4- 세포를 포함하는 세포 집단은 또한 5% 이상의 CD4+ 세포를 포함한다.

본 명세서에 기재된 방법은, 단리 단계를 포함하거나 포함하지 않으면서 NK 세포가 풍부한 집단을 생성한다. 일부 실시 형태에서, 농축된 세포 집단은 적어도 30%의 NK 세포, 적어도 40%의 NK 세포, 또는 적어도 50%의 NK 세포를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 NK 세포는 CD56+/CD3-이다.

일부 실시 형태에서, 단계 (B)로부터 생성된 세포 집단은 CD4- 세포의 집단을 포함한다. 예컨대, 일부 실시 형태에서, 단계 (B)로부터 생성된 세포 집단은 적어도 10%, 15%, 또는 20%의 CD4- 세포를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 단계 (B)로부터 생성된 집단은 CD8+ 세포를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 CD4- 세포는 CD8+이다. 단계 (B)로부터 생성된 세포 집단의 약 20 내지 55%는 CD4-/CD8+이다.

일부 실시 형태에서, 상기 CD4- 세포는 CD8-이다. 일부 실시 형태에서, 단계 (B)로부터 생성된 세포 집단의 약 20 내지 55%는 CD4-/CD8-이다.

일부 실시 형태에서, 상기 방법의 다능성 줄기 세포는 유도 다능성 줄기 세포(iPSC) 또는 배아 줄기 세포(ESC)로부터 수득된다.

HPC 벌크를 수득하기 위한 제1 조건 세트는 골 형성 단백질-4(BMP4), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF), 아스코르브산, Flt3 리간드(Flt3L), 트롬보포이에틴(TPO) 및 TGFβ 억제제로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 포함하는 배양 배지를 포함한다.

CD4- 세포를 포함하는 집단을 수득하기 위한 제2 조건 세트는 아스코르브산, 줄기 세포 인자(SCF), IL-7, Flt3L, 트롬보포이에틴(TPO), p38 억제제 및 SDF-1로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 포함하는 배양 배지를 포함한다.

단계 (B) 이후, 상기 방법은 세포 단리 단계를 진행하거나 세포 단리 단계를 진행하지 않을 수 있다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 상기 방법은 하나 이상의 세포 단리 단계를 포함한다. 예컨대, 일부 실시 형태에서, CD4- 세포를 포함하는 집단은 단계 (B) 이후에 단리된다. 단계 (B)에서 단리된 CD4- 세포는 NK 세포가 풍부한 세포 집단을 생성하기 위해 세 번째 조건 세트에 배치된다.

NK 세포를 생산하는 방법 동안, 방법의 각 단계에 존재하는 세포 표현형이 결정될 수 있다. 세포 분화 과정은 해당 기술 분야에 공지된 다양한 수단에 의해 평가될 수 있다. 예컨대, 일부 실시 형태에서, 배양된 세포의 세포 분화는 배양된 세포의 시료를 수득하고 배양된 세포의 시료를 하나 이상의 분석 방법에 적용하여 세포의 세포 표현형을 확인함으로써 평가될 수 있다. 세포 표현형을 확인하는 공지된 방법에는 예를 들어, 유세포 분석 및 면역형광 영상법이 포함된다. 세포 분화 과정의 진행을 확인하기 위해 임의의 적합한 시료 채취 및 표현형 분석이 본 명세서에 기재된 세포 배양 방법과 함께 사용될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 주어진 시간에 세포 표현형을 결정하기 위한 하나 이상의 시료 채취 단계를 포함한다.

iPSC로부터 HPC 벌크 유도 개요

일부 실시 형태에서, 다능성 세포, 예컨대 iPSC는 제1 조건 세트에서 배양되어 HPC 세포 벌크를 포함하는 집단을 생산한다. 일부 실시 형태에서, HPC 벌크를 수득하기 위한 제1 조건 세트에서 iPSC를 배양하는 단계는 HPC 유도 배지에서 iPSC를 배양하는 단계를 포함한다. 상기 제1 조건 세트는 HP 세포 벌크의 생산을 가능하게 하는 다양한 구성요소를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 제1 조건 세트는 골 형성 단백질-4(BMP4), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF), 아스코르브산, ROCK 억제제, GSK3 억제제, 줄기 세포 인자(SCF), 트롬보포이에틴(TPO), Flt3L, 및 TGFβ 억제제로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 화합물을 포함한다. 따라서, 일부 실시 형태에서, iPSC로부터 HPC를 유도하기 위한 제1 조건 세트는 BMP4를 포함한다. 일부 실시 형태에서, iPSC로부터 HPC를 유도하기 위한 제1 조건 세트는 VEGF를 포함한다. 일부 실시 형태에서, iPSC로부터 HPC를 유도하기 위한 제1 조건 세트는 bFGF를 포함한다. 일부 실시 형태에서, iPSC로부터 HPC를 유도하기 위한 제1 조건 세트는 TGFβ를 포함한다.

상기 iPSC는 HPC 세포 벌크를 생산하기에 충분한 기간 동안 상기 제1 조건 세트에서 배양된다. 일부 실시 형태에서, 상기 iPSC는 약 7 내지 21일, 또는 10 내지 18일, 또는 약 14일의 기간 동안 상기 제1 조건 세트에서 배양된다. 일부 실시 형태에서, 상기 iPSC는 약 13일의 기간 동안 상기 제1 조건 세트에서 배양된다.

일부 실시 형태에서, 상기 세포는 예컨대, 약 3%, 4%, 5%, 또는 6% O₂와 같은 저산소 조건에서 배양된다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 상기 세포는 약 3% O₂에서 배양된다. 일부 실시 형태에서, 상기 세포는 약 4% O₂에서 배양된다. 일부 실시 형태에서, 상기 세포는 약 5% O₂에서 배양된다. 일부 실시 형태에서, 상기 세포는 약 6% O₂에서 배양된다.

HPC 벌크로부터 CD4 세포 집단 확보 개요

일부 실시 형태에서, 상기 HPC 벌크, 또는 달리 수득된 HPC, 예를 들어, 인간 공여자로부터 단리된 일차 HPC 또는 다른 줄기 세포 공급원/유형, 예컨대 배아 줄기 세포 유래로부터 분화된 HPC는 임의의 중간 단리 단계 없이 배지에서 추가로 배양되어 CD4- 세포를 포함하는 세포의 집단(CD4- 세포 집단)을 생성한다. 단계 (B) 이후에 이러한 방법에 의해 수득된 세포 집단은 예컨대, CD4-/CD8- 세포 및 CD4-/CD8+ 세포를 포함하는 CD4- 세포를 포함한다는 것이 이해되어야 한다. 단계 (B) 이후에 수득된 집단은 또한 CD4+/CD8- 세포 및 CD4+/CD8+ 세포를 포함하는 CD4+ 세포를 포함할 수 있다. 상기 세포 집단은 예컨대, 림프구를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 HPC 벌크는 아스코르브산, 줄기 세포 인자(SCF), IL-7, Flt3L, TPO, 피브로넥틴 또는 이의 변이체, Notch 리간드(예컨대, Jag-1, Jag-2, DLL-1, DLL-3, DLL-4), p38 억제제 및 SDF-1로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 갖는 배지를 포함하는 제2 조건 세트에서 배양되어 CD4- 세포를 포함하는 집단을 생성한다. 따라서, 일부 실시 형태에서, HPC 벌크는 아스코르브산을 포함하는 제2 조건 세트에서 배양되어 CD4- 세포를 포함하는 집단을 생성한다. 일부 실시 형태에서, 상기 HPC 벌크는 SCF를 포함하는 제2 조건 세트에서 배양되어 CD4- 세포를 포함하는 집단을 생성한다. 일부 실시 형태에서, 상기 HPC 벌크는 IL-7을 포함하는 제2 조건 세트에서 배양되어 CD4- 세포를 포함하는 집단을 생성한다. 일부 실시 형태에서, 상기 HPC 벌크는 Flt3L을 포함하는 제2 조건 세트에서 배양되어 CD4- 세포를 포함하는 집단을 생성한다. 일부 실시 형태에서, 상기 HPC 벌크는 p38 억제제를 포함하는 제2 조건 세트에서 배양되어 CD4- 세포를 포함하는 집단을 생성한다. 일부 실시 형태에서, 상기 HPC 벌크는 SDF-1을 포함하는 제2 조건 세트에서 배양되어 CD4- 세포를 포함하는 집단을 생성한다.

배양 기간은 CD4- 세포를 포함하는 세포의 집단을 수득하기에 적합한 시간 동안이다. 일부 실시 형태에서, CD4- 세포를 포함하는 세포의 집단을 수득하기 위한 HPC 벌크의 배양 기간은 약 2 내지 6주; 3 내지 5주 또는 약 3주이다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 상기 세포 배양 기간은 약 2 내지 6주 동안이다. 일부 실시 형태에서, 상기 세포 배양 기간은 약 3 내지 5주 동안이다. 일부 실시 형태에서, 상기 세포 배양 기간은 약 3주 동안이다.

일부 실시 형태에서, 생성된 세포 집단 내 CD4- 세포의 백분율이 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 90% 초과인 경우, 상기 제2 조건 세트는 상기 제3 조건 세트로 변경된다.

일부 실시 형태에서, 생성된 세포 집단 내 CD4+ 세포의 백분율이 적어도 약 1%, 5%, 10%, 15%, 20% 또는 20% 초과인 경우, 상기 제2 조건 세트는 상기 제3 조건 세트로 변경된다.

일부 실시 형태에서, 생성된 세포 집단 내 CD4-/CD8+ 세포의 백분율이 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55% 또는 55% 초과인 경우, 상기 제2 조건 세트는 상기 제3 조건 세트로 변경된다.

일부 실시 형태에서, 생성된 세포 집단 내 CD4-/CD8- 세포의 백분율이 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55% 또는 55% 초과인 경우, 상기 제2 조건 세트는 상기 제3 조건 세트로 변경된다.

일부 실시 형태에서, 생성된 세포 집단 내 CD4+/CD8- 세포의 백분율이 적어도 약 1%, 3%, 5%, 10%, 15% 또는 15% 초과인 경우, 상기 제2 조건 세트는 상기 제3 조건 세트로 변경된다.

일부 실시 형태에서, 생성된 세포 집단 내 CD4+/CD8+ 세포의 백분율이 적어도 약 1%, 3%, 5%, 10% 또는 10% 초과인 경우, 상기 제2 조건 세트는 상기 제3 조건 세트로 변경된다.

CD4- 세포, CD4+ 세포, CD4-/CD8+ 세포, CD4-/CD8- 세포, CD4+/CD8- 세포 및 CD4+/CD8+ 세포의 백분율은 유세포 분석과 같은 해당 기술 분야에 공지된 방법에 의해 단계 (B) 또는 그 이후에 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

일부 실시 형태에서, 상기 세포는 예컨대, 약 3%, 4%, 5%, 또는 6% O₂와 같은 저산소 조건에서 배양된다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 상기 세포는 예컨대, 약 3% O₂와 같은 저산소 조건에서 배양된다. 일부 실시 형태에서, 상기 세포는 예컨대, 약 4% O₂와 같은 저산소 조건에서 배양된다. 일부 실시 형태에서, 상기 세포는 예컨대, 약 5% O₂와 같은 저산소 조건에서 배양된다. 일부 실시 형태에서, 상기 세포는 예컨대, 약 6% O₂와 같은 저산소 조건에서 배양된다.

CD4- 세포로부터 CD56+/CD3- 세포 유도 개요

상술한 바와 같이 CD4- 세포를 포함하는 세포의 집단은 세포 배양 배지에서 추가로 배양되어 NK 세포의 집단을 생성할 수 있다. 일부 실시 형태에서, CD4- 세포를 포함하는 세포 집단은 단계 (B) 이후의 방법으로부터 단리된다. 형광 활성화 세포 분류(FACS) 및/또는 자기 기반 세포 분류(MACS)를 포함한 모든 형태의 단리 방법을 이들 방법과 함께 사용할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 방법은 세포 단리 단계를 포함하지 않는다. 일부 실시 형태에서, 상기 배양 배지는 NK 세포를 수득하기 위한 것으로, 제3 조건 세트를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 제3 조건 세트는 IL-7, IL-2 및 CD3 활성화제, 예컨대 항CD3 항체 중 하나 이상을 포함한다.

일부 실시 형태에서, CD4- 세포를 포함하는 세포 집단은 중간 단리 단계 없이 배양 배지에서 추가로 배양되어 CD56+/CD3- 세포가 풍부한 세포 집단을 생성한다. 이러한 CD56+ 세포에는 예컨대, 자연 살해(NK) 세포가 포함된다. 일부 실시 형태에서, CD4- 세포를 포함하는 집단은 CD3 활성화제, IL-2 및/또는 IL-7을 포함하는 배지에서 배양된다. 따라서, 일부 실시 형태에서, CD4- 세포를 포함하는 집단은 CD3 활성화제를 포함하는 배지에서 배양된다. CD3 활성화제는 해당 기술 분야에 공지되어 있으며, 예컨대, CD3 및/또는 CD28 표면 리간드에 결합하는 항체 복합체를 포함한다. 예컨대, 항CD3 항체 또는 이에 결합된 단편을 포함하는 CD3 활성화제가 사용될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항CD3 항체가 사용되는 경우, 상기 항CD3 항체는 다클론 항체 또는 단일클론 항체일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 항CD3 항체는 다클론 항체이다. 일부 실시 형태에서, 상기 항CD3 항체는 단일클론 항체이다. 상기 항체는 IgG, IgA, IgM, IgD, IgE 또는 IgG의 면역글로불린 계열에 속할 수 있다. 다양한 종류의 항CD3 항체가 사용될 수 있으며, 예컨대, OKT3 클론 또는 UCHT1 클론으로부터 생산된 항체가 사용될 수 있다. 배지에서 항CD3 항체의 농도는 예컨대, 10 ng/ml 내지 1000 ng/ml이다.

일부 실시 형태에서, CD4- 세포를 포함하는 집단은 IL-2를 포함하는 배지에서 배양된다. 일부 실시 형태에서, CD4- 세포를 포함하는 집단은 IL-7을 포함하는 배지에서 배양된다. 일부 실시 형태에서, 상기 세포는 예컨대, 약 3%, 4%, 5%, 또는 6% O₂와 같은 저산소 조건에서 배양된다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 상기 세포는 약 3% O₂에서 배양된다. 일부 실시 형태에서, 상기 세포는 약 4% O₂에서 배양된다. 일부 실시 형태에서, 상기 세포는 약 5% O₂에서 배양된다. 일부 실시 형태에서, 상기 세포는 약 6% O₂에서 배양된다.

CD56+ 세포를 포함하는 세포 집단은 제3 조건 세트에서 추가로 배양되어 CD56+/CD3- 세포 집단을 풍부하게 할 수 있다. 일부 실시 형태에서, CD56+ 세포를 포함하는 세포 집단은 IL-7 및/또는 IL-15를 포함하는 제3 조건 세트에서 배양되어 CD56+ 세포를 더 풍부하게 한다. 따라서, 일부 실시 형태에서, CD56+ 세포를 포함하는 세포 집단은 IL-7을 포함하는 제3 조건 세트에서 배양된다. 일부 실시 형태에서, CD56+ 세포를 포함하는 세포 집단은 IL-15를 포함하는 제3 조건 세트에서 배양된다. 일부 실시 형태에서, 상기 세포는 예컨대, 약 3%, 4%, 5%, 또는 6% O₂와 같은 저산소 조건에서 배양된다. 일부 실시 형태에서, 생산된 CD56+/CD3- 세포는 NK 세포이다. 생산된 세포 집단 내 CD56+/CD3- NK 세포의 백분율은 적어도 약 50%, 55%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 95% 초과이다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 상기 방법은 적어도 약 50%의 CD56+/CD3- NK 세포를 생성한다. 일부 실시 형태에서, 상기 방법은 적어도 약 55%의 CD56+/CD3- NK 세포를 생성한다. 일부 실시 형태에서, 상기 방법은 적어도 약 60%의 CD56+/CD3- NK 세포를 생성한다. 일부 실시 형태에서, 상기 방법은 적어도 약 65%의 CD56+/CD3- NK 세포를 생성한다. 일부 실시 형태에서, 상기 방법은 적어도 약 70%의 CD56+/CD3- NK 세포를 생성한다. 일부 실시 형태에서, 상기 방법은 적어도 약 75%의 CD56+/CD3- NK 세포를 생성한다. 일부 실시 형태에서, 상기 방법은 적어도 약 80%의 CD56+/CD3- NK 세포를 생성한다. 일부 실시 형태에서, 상기 방법은 적어도 약 85%의 CD56+/CD3- NK 세포를 생성한다. 일부 실시 형태에서, 상기 방법은 적어도 약 90%의 CD56+/CD3- NK 세포를 생성한다. 일부 실시 형태에서, 상기 방법은 적어도 약 95%의 CD56+/CD3- NK 세포를 생성한다. 일부 실시 형태에서, 상기 방법은 적어도 약 95% 초과의 CD56+/CD3- NK 세포를 생성한다.

일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 방법으로 수득한 농축된 NK 세포 집단은 또한 CD3+ T 세포를 함유할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 이 배양 방법에 의해 생산된 세포의 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 또는 약 30%는 CD3+ T 세포이다. 일부 실시 형태에서, 상기 생산된 세포의 5% 미만은 CD3+ T 세포이다. 일부 실시 형태에서, 상기 생산된 세포의 약 5%는 CD3+ T 세포이다. 일부 실시 형태에서, 상기 생산된 세포의 약 10%는 CD3+ T 세포이다. 일부 실시 형태에서, 상기 생산된 세포의 약 15%는 CD3+ T 세포이다. 일부 실시 형태에서, 상기 생산된 세포의 약 20%는 CD3+ T 세포이다. 일부 실시 형태에서, 상기 생산된 세포의 약 25%는 CD3+ T 세포이다. 일부 실시 형태에서, 상기 생산된 세포의 약 30%는 CD3+ T 세포이다.

일부 실시 형태에서, CD56+/CD3- 세포가 풍부한 집단은 해당 기술 분야에 공지된 방법에 의해 단리된다. 이러한 방법에는 예컨대, 유세포 분석(FACS) 기반 분류 방법 및 자기 기반 분류 방법(MACS)이 포함된다.

일부 실시 형태에서, CD4- 세포를 포함하는 집단으로부터 CD56+/CD3- NK 세포를 수득하기 위한 배양 기간은 약 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일 또는 18일이다. 일부 실시 형태에서, 상기 배양 기간은 약 7일이다.

일부 실시 형태에서, 상기 농축된 CD56+ 세포 집단은 NK 세포를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 농축된 CD56+ 세포는 CD3- 세포를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 농축된 CD56+ 세포는 CD3+ 세포를 포함한다.

CD56+/CD3- 세포로의 분화에 적합한 다능성 세포

일부 실시 형태에서, 임의의 다능성, 다분화능, 또는 환자 유래 HPC가 본 명세서에 기재된 방법과 함께 사용될 수 있다. 예컨대, 일부 실시 형태에서, 상기 세포는 배아 줄기 세포이다. 일부 실시 형태에서, 상기 세포는 성체 줄기 세포이다. 다양한 성체 줄기 세포가 해당 기술 분야에 공지되어 있으며, 예컨대, 중간엽 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 제대 유래 세포, 골수 줄기 세포, 지방 줄기 세포 등이 포함된다. 일부 실시 형태에서, 상기 세포는 유도 다능성 줄기 세포(iPSC)이다. 따라서, 본 명세서에 기재된 방법에 따라 생산된 NK 세포는 임의의 다능성, 다분화능, 또는 환자 유래 HPC, 예컨대 공여자로부터 직접적으로 유래된 일차 HPC로부터 제조될 수 있다.

일부 실시 형태에서, 상기 다능성 세포는 예를 들어, 배아 줄기(ES) 세포, 핵 이식에 의해 수득된 클로닝된 배아로부터 유래된 배아 줄기 세포(ntES 세포), 생식선 줄기 세포("GS 세포"), 배아 생식 세포("EG 세포"), iPS 세포, 및 배양된 섬유모세포 또는 골수 줄기 세포로부터 유래된 다능성 세포(Muse 세포)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 iPS 세포는 건강한 개체의 말초 혈액 단핵 세포로부터 유래될 수 있다. iPS 세포를 생산하기 위한 방법은 해당 기술 분야에 공지되어 있다. 이들 세포는 재프로그래밍 인자를 임의의 체세포에 도입함으로써 생산될 수 있다. 본 명세서에서 재프로그래밍 인자의 예는 유전자, 예컨대 Oct3/4, Sox2, Soxl, Sox3, Sox15, Soxl 7, Kif 4, Klf2, c-Myc, N-Myc, L-Myc, Nanog, Lin28, Fbx15, ERas, ECAT15-2, Tel1, 베타-카테닌, Lin28b, Salll, Sall4, Esrrb, Nr5a2, Tbx3, 및 Glisl와 이의 유전자 산물을 포함한다. 이들 재프로그래밍 인자는 개별적으로 사용될 수 있거나, 이들 중 둘 이상이 조합되어 사용될 수 있다. 재프로그래밍 인자의 조합의 예는 WO2007/069666, WO2008/118820, WO2009/007852, WO2009/032194, WO2009/058413, WO2009/057831, WO2009/075119, WO2009/079007, WO2009/091659, WO2009/101084, WO2009/101407, WO2009/102983, WO2009/114949, WO2009/117439, WO2009/126250, WO2009/126251, WO2009/126655, WO2009/157593, WO2010/009015, WO2010/033906, WO2010/033920, WO2010/042800, WO2010/050626, WO2010/056831, WO2010/068955, WO2010/098419, WO2010/102267, WO2010/111409, WO2010/111422, WO2010/115050, WO2010/124290, WO2010/147395, WO2010/147612, Huangfu D. 등 (2008), Nat. Biotechnol., 26: 795-797, Shi Y. 등 (2008), Cell Stem Cell, 2: 525-528, Eminli S. 등 (2008), Stem Cells. 26: 2467-2474, Eluangfu D. 등 (2008), Nat. Biotechnol. 26: 1269-1275, Shi Y. 등 (2008), Cell Stem Cell, 3, 568-574, Zhao Y. 등 (2008), Cell Stem Cell, 3: 475-479, Marson A, (2008), Cell Stem Cell, 3, 132-135, Feng B. 등 (2009), Nat. Cell Biol. 11: 197-203, R. L. Judson 등 (2009), Nat. Biotechnol., 27: 459-461, Lyssiotis CA. 등 (2009), Proc Natl Acad Sci US A. 106: 8912-8917, Kim J. 등 (2009), Nature. 461: 649-643, Ichida J K. 등 (2009), Cell Stem Cell. 5: 491-503, Heng JC. 등 (2010), Cell Stem Cell. 6: 167-74, Han J. 등 (2010), Nature. 463: 1096-100, Mali P. 등 (2010), Stem Cells. 28: 713-720, 및 Maekawa M. 등 (2011), Nature. 474: 225-9에 기술된 것들을 포함한다.

상기 iPSC는 임의의 적합한 조직으로부터 수득될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 iPSC는 말초 혈액 단핵 세포로부터 수득된다.

조혈 전구 세포(HPC)는 혈액 세포, 예컨대 림프구, 호산구, 호중구, 호염기구, 적혈구 및 거핵구로 분화할 수 있는 세포이다. 조혈 전구 세포 또는 조혈 줄기 세포는 예컨대, CD34 및/또는 CD43 표면 항원의 존재를 기반으로 하여 확인될 수 있다.

일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 CD56+/CD3- NK 세포를 생산하는 데 사용되는 세포는 세포 분화의 임의의 단계에서 유전적으로 변형된다. 일부 실시 형태에서, 상기 CD56+/CD3- NK 세포는 원하는 키메라 항원 수용체(CAR), 외인성 T세포 수용체(TCR) 또는 다른 조작된 단백질을 포함하도록 유전적으로 변형된다.

일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 CD56+/CD3- NK 세포를 생산하는 데 사용되는 세포는 다능성, 다분화능 또는 단분화능 단계에서 유전적으로 변형된다. 예컨대, 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 CD56+/CD3- NK 세포를 생산하는 데 사용되는 세포는 다능성 단계에서 유전적으로 변형된다. 예컨대, 상기 세포는 배아 줄기 세포 단계 또는 iPSC 줄기 세포 단계에서 유전적으로 변형될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 CD56+/CD3- NK 세포를 생산하는 데 사용되는 세포는 다분화능 단계에서 유전적으로 변형된다. 예컨대, 상기 세포는 조혈 줄기 세포(HSC) 단계에서 유전적으로 변형될 수 있다.

배양 조건 - iPSC로부터 HPC 세포 벌크 유도

일부 실시 형태에서, iPSC로부터 조혈 전구 세포의 생산을 위한 배지(즉, HPC 유도 배지)는 동물 세포의 배양에 사용되는 기본 배지에 비타민 C를 첨가함으로써 제조될 수 있다. 상기 기본 배지의 예로는 이스코브 변형 둘베코 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium, IMDM), 배지 199, 이글 최소 필수 배지(Eagle's Minimum Essential Medium, EMEM), αMEM 배지, 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's Medium, DMEM), 햄스 F12(Ham's F12) 배지, RPMI 1640 배지, 피셔 배지(Fischer's medium), 및 뉴로베이셜 배지(Neurobasal Medium)(Life Technologies), 및 이들 배지 중 둘 이상의 혼합물이 포함된다. 일부 실시 형태에서, 배지는 혈청을 함유한다. 일부 실시 형태에서, 상기 배지는 혈청을 함유하지 않는다.

일부 실시 형태에서, 제1 조건 세트는 StemPro^TM-34를 포함할 수 있다. StemPro^TM-34는 배양에서 인간 조혈 세포의 발달을 지원하도록 제조된 무혈청 배지이다.

필요한 경우, 일부 실시 형태에서, 상기 제1 조건 세트에는 하나 이상의 물질, 예컨대 알부민, 인간 인슐린, 인간 트랜스페린, 셀레늄 또는 아셀렌산나트륨, 지방산, 미량 원소, 2-메르캅토에탄올, 티올 글리세롤, α-모노티오글리세롤, 지질, 아미노산, L-글루타민, 비필수 아미노산, 비타민, 성장 인자, 저분자량 화합물, 항생제, 항산화제, 피루브산, 완충제, 무기염 및 사이토카인이 포함될 수도 있다.

일부 실시 형태에서, 상기 제1 조건 세트는 혈청, 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄, 티올 글리세롤 또는 α-모노티오글리세롤, L-글루타민 및 아스코르브산을 함유하는 IMDM 배지를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 상기 제1 조건 세트는 골 형성 단백질 4(BMP4) 신호전달 경로의 신호 전달을 유발하는 하나 이상의 물질을 포함한다. 이러한 물질에는 BMP4가 포함되나, 이에 제한되지 않는다.

일부 실시 형태에서, 상기 제1 조건 세트는 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 신호전달 경로의 신호 전달을 유발하는 하나 이상의 물질을 포함한다. 이러한 물질에는 VEGF가 포함되나, 이에 제한되지 않는다.

일부 실시 형태에서, 상기 제1 조건 세트는 섬유모세포 성장 인자(FGF) 경로의 신호 전달을 유발하는 하나 이상의 물질을 포함한다. 이러한 물질에는 bFGF 및 FGF2가 포함되나, 이에 제한되지 않는다.

일부 실시 형태에서, 상기 제1 조건 세트는 줄기 세포 인자/kit 신호전달 경로의 신호 전달을 유발하는 하나 이상의 물질을 포함한다. 이러한 물질에는 SCF가 포함되나, 이에 제한되지 않는다.

일부 실시 형태에서, 상기 제1 조건 세트는 Flt3 리간드 신호전달 경로의 신호 전달을 유발하는 하나 이상의 물질을 포함한다. 이러한 물질에는 Flt3 리간드(Flt3L)가 포함되나, 이에 제한되지 않는다.

일부 실시 형태에서, 상기 제1 조건 세트는 트롬보포이에틴 신호전달 경로의 신호 전달을 유발하는 하나 이상의 물질을 포함한다. 이러한 물질에는 TPO가 포함되나, 이에 제한되지 않는다.

TGFβ 억제제는 TGFβ 패밀리의 신호 전달을 방해하는 저분자 억제제이며, 예를 들어, SB431542, SB202190(both R.K. Lindemann 등, Mol. Cancer 2:20 (2003)), SB505124(GlaxoSmithKline), NPC30345, SD093, SD908, SD208(Scios), LY2109761, LY364947, LY580276(Lilly Research Laboratories) 등을 포함한다.

SB431542는 전환 성장 인자-베타(TGFβ) 슈퍼패밀리 유형 I 액티빈 수용체유사 키나제(ALK) 수용체 ALK4, ALK5 및 ALK7의 강력하고 특이적인 억제제이다.

예컨대, TGFβ 억제제가 SB431542인 경우, 이의 배지 내 농도는 바람직하게는 0.5 μM 내지 100 μM이다.

HP 세포 벌크 집단의 생산을 위한 제1 조건 세트는 BMP4(골 형성 단백질 4), VEGF(혈관 내피 성장 인자), bFGF(염기성 섬유모세포 성장 인자), SCF(줄기 세포 인자), TPO(트롬보포이에틴), 및 Flt3L(Flt3 리간드)로 이루어진 군으로부터 선택되는 사이토카인(들)으로 추가로 보충될 수 있다.

일 실시 형태에서, 상기 제1 조건 세트는 인간 인슐린(약 10 μg/ml), 인간 트랜스페린(약 5.5 μg/ml), 아셀렌산나트륨(약 6.7 ng/ml), L-글루타민(약 2 mM), α-모노티오글리세롤(약 0.4 mM), 및 SB431542(약 6 μM)가 보충된 StemPro34를 포함할 수 있다.

일부 실시 형태에서, 상기 비타민 C는 배양 기간 동안 4일마다, 3일마다, 2일마다, 또는 매일 첨가될 수 있다. 배지에 비타민 C의 첨가는 약 5 μg/ml 내지 약 500 μg/ml에 해당하는 양으로 수행될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 비타민 C는 배지 내에 약 5 μg/ml, 10 μg/ml, 25 μg/ml, 50 μg/ml, 100 μg/ml, 200 μg/ml, 300 μg/ml, 400 μg/ml, 또는 500 μg/ml로 존재한다.

본 명세서에서 "비타민 C"는 L-아스코르빈산 및 이의 유도체를 의미하고, "L-아스코르빈산 유도체"는 생체의 효소적 반응에 의해 비타민 C가 되는 유도체를 의미한다. L-아스코르빈산 유도체의 예는 비타민 C 포스페이트(예컨대, 아스코르브산 2-포스페이트), 아스코르브산 글루코사이드, 아스코르빌 에틸, 비타민 C 에스테르, 아스코르빌 테트라헥실데카노에이트, 아스코르빌 스테아레이트 및 아스코르빌 2-포스페이트 6-팔미테이트를 포함한다. 비타민 C 포스페이트가 바람직하다. 비타민 C 포스페이트(예컨대, 아스코르브산 2-포스페이트)의 예는 L-아스코르브산 포스페이트의 염, 예컨대 L-아스코르브산 포스페이트 Na 및 L-아스코르브산 포스페이트 Mg를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 골 형성 단백질 4(BMP4) 신호전달 경로의 신호 전달을 유발하는 물질이 BMP4인 경우, 조혈 전구 세포 생산을 위한 HPC 유도 배지 내 BMP4의 농도는 약 5 ng/mL 내지 500 ng/mL, 예컨대 5 ng/mL, 10 ng/mL, 20 ng/mL, 30 ng/mL, 40 ng/mL, 50 ng/mL, 60 ng/mL, 70 ng/mL, 80 ng/mL, 90 ng/mL, 100 ng/mL, 150 ng/mL, 200 ng/mL, 250 ng/mL, 300 ng/mL, 350 ng/mL, 400 ng/mL, 450 ng/mL 또는 500 ng/mL이다.

일부 실시 형태에서, 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 신호전달 경로의 신호 전달을 유발하는 물질이 VEGF인 경우, 조혈 전구 세포 생산을 위한 HPC 유도 배지 내 VEGF의 농도는 약 5 ng/mL 내지 500 ng/mL, 예컨대 약 5 ng/mL 10 ng/mL, 20 ng/mL, 30 ng/mL, 40 ng/mL, 50 ng/mL, 60 ng/mL, 70 ng/mL, 80 ng/mL, 90 ng/mL, 100 ng/mL, 150 ng/mL, 200 ng/mL, 250 ng/mL, 300 ng/mL, 350 ng/mL, 400 ng/mL, 450 ng/mL 또는 500 ng/mL이다.

일부 실시 형태에서, 섬유모세포 성장 인자(FGF) 경로의 신호 전달을 유발하는 물질이 bFGF인 경우, 조혈 전구 세포 생산을 위한 HPC 유도 배지 내 bFGF의 농도는 약 5 ng/mL 내지 500 ng/mL, 예컨대 5 ng/mL, 10 ng/mL, 20 ng/mL, 30 ng/mL, 40 ng/mL, 50 ng/mL, 60 ng/mL, 70 ng/mL, 80 ng/mL, 90 ng/mL, 100 ng/mL, 150 ng/mL, 200 ng/mL, 250 ng/mL, 300 ng/mL, 350 ng/mL, 400 ng/mL, 450 ng/mL 또는 500 ng/mL이다.

일부 실시 형태에서, 줄기 세포 인자/kit 신호전달 경로의 신호 전달을 유발하는 물질이 SCR인 경우, 조혈 전구 세포 생산을 위한 HPC 유도 배지 내 SCF의 농도는 약 5 ng/mL 내지 100 ng/mL, 예컨대 5 ng/mL, 10 ng/mL, 20 ng/mL, 30 ng/mL, 40 ng/mL, 50 ng/mL, 60 ng/mL, 70 ng/mL, 80 ng/mL, 90 ng/mL, 또는 100 ng/mL이다.

일부 실시 형태에서, Flt3 리간드 신호전달 경로의 신호 전달을 유발하는 물질이 Flt3L인 경우, 조혈 전구 세포 생산을 위한 HPC 유도 배지 내 Flt3L의 농도는 약 1 ng/mL 내지 100 ng/mL, 예컨대 1 ng/mL, 2 ng/mL, 3 ng/mL, 4 ng/mL, 5 ng/mL, 6 ng/mL, 7 ng/mL, 8 ng/mL, 9 ng/mL, 10 ng/mL, 20 ng/mL, 50 ng/mL, 또는 100 ng/mL이다.

일부 실시 형태에서, 트롬보포이에틴 신호전달 경로의 신호 전달을 유발하는 물질이 TPO인 경우, 조혈 전구 세포 생산을 위한 HPC 유도 배지 내 TPO의 농도는 약 1 ng/mL 내지 200 ng/mL, 예컨대 1 ng/mL, 2 ng/mL, 3 ng/mL, 4 ng/mL, 5 ng/mL, 6 ng/mL, 7 ng/mL, 8 ng/mL, 9 ng/mL, 10 ng/mL, 20 ng/mL, 30 ng/mL, 40 ng/mL, 50 ng/mL, 60 ng/mL, 70 ng/mL, 80 ng/mL, 90 ng/mL, 100, 125 ng/mL, 150 ng/mL, 175 ng/mL, 또는 200 ng/mL이다.

일부 실시 형태에서, 다능성 줄기 세포는 부착성 배양 또는 현탁 배양에 의해 배양될 수 있다. 부착성 배양의 경우, 배양은 코팅제가 코팅된 배양 용기에서 수행될 수 있고/있거나 다른 세포와 공동 배양될 수 있다. 공동 배양을 위한 다른 세포의 예는 C3H10Tl/2 (Takayama N. 등, J Exp Med. 2817-2830, 2010) 및 상이한 종으로부터 유래된 기질 세포(Niwa A 등, J Cell Physiol. 2009 Nov; 221(2): 367-77)를 포함한다. 코팅제의 예는 마트리젤(Nivea A 등, PLoS One. 6(7): e22261, 2011), iMatrix 511(Miyazaki T 등, Nature Communication 2012 ;3 :1236), 젤라틴, 콜라겐, 엘라스틴 등, 글루코사미노글리칸 및 프로테오글리칸, 예컨대 히알루론산, 콘드로이틴 설페이트 등, 세포 접착 단백질, 예컨대 피브로넥틴 또는 이의 변이체, 비트로넥틴, 라미닌 등을 포함한다. 현탁 배양 방법의 예는 Chadwick 등, Blood 2003, 102: 906-15, Vijayaragavan 등, Cell Stem Cell 2009, 4: 248-62, 및 Saeki 등, Stem Cells 2009, 27: 59-67에 기술된 방법을 포함한다.

일부 실시 형태에서, HP 세포 벌크는 또한 다능성 줄기 세포의 배양에 의해 수득된 그물 유사 구조(ES-sac 또는 iPS-sac로도 지칭됨)로부터 제조될 수 있다. 본 명세서에서 "그물 유사 구조"는 다능성 줄기 세포로부터 유래된 3차원 주머니형(sac-shaped) 구조(내부에 공간을 가짐)이다. 상기 구조는 내피 세포 집단 등으로 형성되고, 내부에 조혈 전구 세포를 함유한다.

일부 실시 형태에서, HP 세포 벌크의 생산을 위한 배양 온도 조건은 약 37℃ 내지 약 42℃이다. 일부 실시 형태에서, 상기 온도는 예를 들어, 약 37℃ 내지 약 42℃, 바람직하게는 약 37 내지 약 39℃이다. 배양 기간은 표현형 분석을 위한 세포 배양물로부터 시료를 수득하여 조혈 전구 세포의 수 등을 모니터링함으로써 해당 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 적절하게 결정될 수 있다. 세포 시료의 표현형 분석과 관련된 다양한 종류의 방법이 해당 기술 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 유세포 분석법 및 면역형광법을 포함한다.

HP 세포 벌크를 수득하기 위한 배양 기간은 다양할 수 있으며, 예컨대, 6 내지 14일을 포함할 수 있다. 상기 배양 기간의 예는 적어도 6일, 7일 이상, 8일 이상, 9일 이상, 10일 이상, 11일 이상, 12일 이상, 13일 이상, 14일 이상을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 배양 기간은 6일 동안이다. 일부 실시 형태에서, 상기 배양 기간은 7일이다. 일부 실시 형태에서, 상기 배양 기간은 8일이다. 일부 실시 형태에서, 상기 배양 기간은 9일이다. 일부 실시 형태에서, 상기 배양 기간은 10일이다. 일부 실시 형태에서, 상기 배양 기간은 10일이다. 일부 실시 형태에서, 상기 배양 기간은 11일이다. 일부 실시 형태에서, 상기 배양 기간은 12일이다. 일부 실시 형태에서, 상기 배양 기간은 13일이다. 일부 실시 형태에서, 상기 배양 기간은 14일이다. 일부 실시 형태에서, 상기 배양 기간은 14일 초과 동안이다. 상기 배양은 저산소 조건하에서 수행될 수 있다. 상기 저산소 조건의 예는 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3% 또는 그 미만을 포함한다. 배지 교체의 빈도는 해당 분야의 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 배지는 2일마다 교체될 수 있다. 일부 다른 실시 형태에서, 배지는 3일마다 교체될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 배지는 매일 교체된다.

일부 실시 형태에서, HP 세포 벌크의 생산을 위한 배양은 상기 조건 중 하나 이상을 조합함으로써 수행된다. 예컨대, 일부 실시 형태에서, iPSC로부터 HP 세포 벌크를 수득하는 방법은 (i) 저산소 조건하에서 비타민 C가 보충된 기본 배지에서 C3H10Tl/2 상의 다능성 줄기 세포를 배양하는 단계; 및 (ii) (1)의 배양액에 VEGF, SCF 및 Flt3L을 추가로 첨가하고, 정상 산소 조건 하에서 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 단계 (i)이 수행되는 기간은 적어도 6일 이상, 바람직하게는 7일 이상, 보다 바람직하게는 7일 이상이다. 단계 (ii)가 수행되는 기간은 적어도 6일 이상, 7일 이상 및 7일 동안이다.

일부 실시 형태에서, HP 세포 벌크에서 수득된 조혈 전구 세포는 추가 사용 전에 단리될 수 있다. 일부 다른 실시 형태에서, 수득된 조혈 전구 세포는 또한 다른 세포 종(HP 세포 벌크)을 함유하는 세포 집단으로서 사용될 수 있다. 상기 HP 세포 벌크 집단은 단리되지 않은 세포 제제이다. 일부 실시 형태에서, 상기 방법은 단리 단계를 포함하지 않는다.

배양 조건 - HP 세포 벌크로부터 CD4- 세포 유도

일부 실시 형태에서, 제2 조건 세트는 CD4- 세포, 예컨대 CD4-/CD8- 세포, CD4-/CD8+ 세포를 포함하는 세포 집단을 생성한다. 일부 실시 형태에서, 단계 (B) 이후에 생성된 세포 집단은 또한 CD4+ 세포를 포함한다.

일부 실시 형태에서, CD4- 세포를 포함하는 세포 집단은 CD56+/CD3- 세포로 분화하도록 유도될 수 있다.

일부 실시 형태에서, 다른 세포 중에서 CD4- 세포를 포함하는 세포 집단은 비타민 C가 보충된 배지에서 조혈 전구 세포 또는 HP 세포 벌크를 배양하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생성될 수 있다. 기본 배지에 첨가되는 비타민 C는 전술한 HP 세포 벌크의 유도에서의 것과 동일하다.

일부 실시 형태에서, HP 세포 벌크로부터 CD4- 세포를 포함하는 세포 집단을 생산하는 데 사용되는 배지는 제2 조건 세트이다. 일부 실시 형태에서, 상기 제2 조건 세트는 동물 세포의 배양에 사용되는 기본 배지에 비타민 C를 첨가하여 제조될 수 있다. 상기 기본 배지의 예로는 이스코브 변형 둘베코 배지(IMDM), 배지 199, 이글 최소 필수 배지(EMEM), aMEM 배지(Thermo Fisher Scientific (Gibco)), 둘베코 변형 이글 배지(DMEM), 햄스 F12(Ham's F12) 배지, RPMI 1640 배지, 피셔 배지(Fischer's medium), 및 뉴로베이셜 배지(Life Technologies), 및 이들 배지 중 둘 이상의 혼합물이 포함된다. 상기 배지는 혈청을 함유하거나, 혈청을 함유하지 않을 수 있다.

필요한 경우, 상기 기본 배지에는 하나 이상의 물질, 예컨대 알부민, 인간 인슐린, 인간 트랜스페린, 셀레늄, 아셀렌산나트륨, 지방산, 미량 원소, 2-메르캅토에탄올, 티올 글리세롤, 지질, 아미노산, L-글루타민, 비-필수 아미노산, 비타민, 성장 인자, 저분자량 화합물, 항생제, 항산화제, 피루브산, 완충제, 무기염 및 사이토카인이 함유될 수도 있다.

다른 세포 중에서, CD4- 세포를 포함하는 세포 집단의 생산을 위한 제2 조건 세트는 아스코르브산, SCF, IL-7, Flt3L, TPO, 피브로넥틴 또는 이의 변이체, Notch 리간드, p38 억제제 및 SDF-1로 이루어진 군으로부터 선택되는 사이토카인(들)으로 추가로 보충될 수 있다.

일부 실시 형태에서, 상기 기본 배지는 줄기 세포 인자/kit 신호전달 경로의 신호 전달을 유발하는 하나 이상의 물질을 함유한다. 이러한 물질에는 SCF가 포함되나, 이에 제한되지 않는다.

일부 실시 형태에서, 상기 기본 배지는 Flt3 리간드 신호전달 경로의 신호 전달을 유발하는 하나 이상의 물질을 함유한다. 이러한 물질에는 Flt3 리간드(Flt3L)가 포함되나, 이에 제한되지 않는다.

일부 실시 형태에서, 상기 기본 배지는 트롬보포이에틴 신호전달 경로의 신호 전달을 유발하는 하나 이상의 물질을 함유한다. 이러한 물질에는 TPO가 포함되나, 이에 제한되지 않는다.

일부 실시 형태에서, 상기 기본 배지는 p38α 및 p38β의 억제제인 하나 이상의 p38 억제제를 함유하며, 이는 결국 MAPKAP 키나제-2 및 열 충격 단백질 27의 다운스트림 활성화를 억제한다. 본 발명에서 사용되는 p38의 화학적 억제제의 예로는 SB203580 (4-(4-플루오로페닐)-2-(4-메틸설포닐페닐)-5-(4-피리딜)-1H- 이미다졸), 및 이의 유도체, SB202190 (4-(4-플루오로페닐)-2-(4-하이드록시페닐)-5-(4-피리딜)-1H-이미다졸) 및 이의 유도체, SB239063 (트랜스-4-[4-(4-플루오로페닐)-5-(2-메톡시-4-피리미디닐)-1H-이미다졸-1-일]시클로헥산올) 및 이의 유도체, SB220025 및 이의 유도체, PD169316, RPR200765A, AMG-548, BIRB-796, SClO-469, SCIO-323, VX-702 및 FR167653이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 이들 화합물은 시판 중이며, 예컨대, SB203580, SB202190, SC239063, SB220025 및 PD169316은 Calbiochem로부터 구입 가능하고, SClO-469 및 SCIO-323은 Scios 등으로부터 구입 가능하다. p38 억제제의 다른 예는 p38의 DNA 결합 영역에 위치한 180-위치의 트레오닌을 알라닌으로 점 돌연변이에 의해 수득된 p38T180A, 인간 및 마우스에서 p38의 182-위치의 티로신을 페닐알라닌 등으로 점 돌연변이에 의해 수득된 p38Y182F를 포함하는 p38의 우성 음성 돌연변이체(dominant-negative mutant)를 포함한다. p38 억제제는 예컨대, 약 0.5 μM T 약 50 μM로 배지에 함유된다.

일부 실시 형태에서, 상기 기본 배지는 SDF-1을 함유한다.

일부 실시 형태에서, SDF-1은 SDF-1α 또는 이의 성숙한 형태일 수 있을 뿐만 아니라, SDF-1β, SDF-1γ, SDF-1δ, SDF-1ε, SDF-1φ 등과 같은 동종형 또는 이의 성숙한 형태, 또는 이들의 임의의 비율의 혼합물 등일 수 있다. 바람직하게는 SDF-1α가 사용된다. SDF-1은 때때로 CXCL-12 또는 PBSF로 지칭된다.

일부 실시 형태에서, SDF-1의 아미노산 서열에서 하나 또는 여러 개의 아미노산은 케모카인으로서의 활성을 갖는 한 치환, 결실 및/또는 부가될 수 있고, 유사하게, 당쇄는 치환, 결실 및/또는 부가될 수 있다. 아미노산 돌연변이는 적어도 4개의 시스테인 잔기(인간 SDF-1α에서 Cys30, Cys32, Cys55 및 Cys71)가 유지되고 천연 물질의 아미노산 서열과 90% 이상의 동일성을 나타내는 한 허용 가능하다. SDF-1은 포유동물, 예를 들어, 인간 또는 비인간 포유류, 예컨대, 원숭이, 양, 소, 말, 돼지, 개, 고양이, 토끼, 랫트, 마우스 등으로부터 수득될 수 있다. 예컨대, GenBank 등록번호:NP_954637로 등록된 단백질은 인간 SDF-1α로 사용될 수 있으며, GenBank 등록번호:NP_000600으로 등록된 단백질은 SDF-1β로 사용될 수 있다. 일부 실시 형태에서, Flt3 리간드 신호전달 경로의 신호 전달을 유발하는 물질이 Flt3L인 경우, CD4- 세포를 포함하는 세포 집단의 생산을 위한 배지 내 Flt3L의 농도는 약 1 ng/mL 내지 100 ng/mL, 예컨대 1 ng/mL, 2 ng/mL, 3 ng/mL, 4 ng/mL, 5 ng/mL, 6 ng/mL, 7 ng/mL, 8 ng/mL, 9 ng/mL, 10 ng/mL, 20 ng/mL, 30 ng/mL, 40 ng/mL, 50 ng/mL, 60 ng/mL, 70 ng/mL, 80 ng/mL, 90 ng/mL, 또는 100 ng/mL이다. 일부 실시 형태에서, 줄기 세포 인자/kit 신호전달 경로의 신호 전달을 유발하는 물질이 SCF인 경우, SCF는 전술된 바와 같은 동일한 조건하에서 CD4- 세포를 포함하는 세포 집단의 생산에 사용된다.

일부 실시 형태에서, 트롬보포이에틴 신호전달 경로의 신호 전달을 유발하는 물질이 TPO인 경우, 상기 TPO는 전술된 바와 같은 동일한 조건하에서 CD4- 세포를 포함하는 세포 집단의 생산에 사용된다.

본 발명에서 사용되는 피브로넥틴 또는 이의 변이체는 CD3 양성 세포에 결합할 수 있는 분자라면, 특별히 제한되지 않는다. 피브로넥틴의 변이체는 CD3 양성 세포 표면 상의 VLA-5 및 VLA-4에 결합할 수 있는 분자라면 특별히 제한되지 않으며, 이의 예는 RetroNectin을 포함한다. 피브로넥틴 및 이의 변이체는 상기 배지에 임의의 형태로 존재할 수 있다. 예컨대, 이들은 배양 중에 상기 배지에 함유될 수 있거나, 배양 용기에 고정화될 수 있으며, 이는 바람직하게는 배양 용기에 고정화된다.

피브로넥틴 또는 이의 변이체가 배지에 함유되는 경우, 피브로넥틴 또는 이의 변이체 농도의 하한은 10 ng/ml 이상, 바람직하게는 100 ng/ml 이상이고, 상한은 10000 μg/ml 이하, 바람직하게는 1000 μg/ml 이하일 수 있다.

일부 실시 형태에서, CD4- 세포를 포함하는 세포 집단의 생산을 위해 사용되는 배지 내 IL-7의 농도는 약 1 ng/mL 내지 100 ng/mL, 예컨대 1 ng/mL, 2 ng/mL, 3 ng/mL, 4 ng/mL, 5 ng/mL, 6 ng/mL, 7 ng/mL, 8 ng/mL, 9 ng/mL, 10 ng/mL, 20 ng/mL, 30 ng/mL, 40 ng/mL, 50 ng/mL, 60 ng/mL, 70 ng/mL, 80 ng/mL, 90 ng/mL, 또는 100 ng/mL이다.

SDF-1은 상업적으로 구입 가능하거나, 자연에서 정제되거나, 펩티드 합성 또는 유전적 공학 기술에 의해 생산될 수 있다. SDF-1은 예컨대, 약 10 ng/mL 내지 약 100 ng/mL의 범위 내에서 배지에 함유된다. 또한, SDF-1 대신 SDF-1 유사 활성을 갖는 SDF-1 대체물을 사용할 수도 있다. 이러한 SDF-1 대체물의 예는 CXCR4 아고니스트를 포함하고, SDF-1 대신에 CXCR4 아고니스트 활성을 갖는 저분자량 화합물 등을 상기 배지에 첨가할 수 있다.

일부 실시 형태에서, SDF-1이 SDF1α인 경우,CD4- 세포를 포함하는 세포 집단의 생산을 위한 배지 내 SDF-1α의 농도는 약 1 nM 내지 100 nM, 예컨대, 1 nM, 2 nM, 3 nM, 4 nM, 5 nM, 6 nM, 7 nM, 8 nM, 9 nM, 10 nM, 20 nM, 30 nM, 40 nM, 50 nM, 60 nM, 70 nM, 80 nM , 90 nM, 또는 100 nM이다.

일부 실시 형태에서, p38 억제제가 SB203580인 경우, CD4- 세포를 포함하는 세포 집단의 생산을 위한 배지 중 SB203580의 농도는 약 0.5 μM 내지 100 μM, 예컨대, 0.5 μM, 1 μM, 2 μM, 3 μM, 4 μM, 5 μM, 6 μM, 7 μM, 8 μM, 9 μM, 10 μM, 15 μM , 20 μM, 30 μM, 40 μM, 또는 50 μM, 60 μM, 70 μM, 80 μM, 90 μM, 또는 100 μM이다.

일부 실시 형태에서, CD4- 세포를 포함하는 세포 집단의 생산을 위한 기본 배지는 약 15% FBS, 약 4 mM의 L-글루타민, 약 100 U/mL의 페니실린, 약 100 μg/mL의 스트렙토마이신, 약 55 μM의 2-메르캅토에탄올, 약 50 μg/mL의 아스코르브산 2-포스페이트, 약 10 μg/mL의 인간 인슐린, 약 5.5 μg/mL의 인간 트랜스페린, 약 6.7 ng/mL의 아셀렌산나트륨, 약 50 ng/mL의 SCF, 약 50 ng/mL의 IL-7, 약 50 ng/mL의 Flt3L, 약 100 ng/mL의 TPO, 약 15 μM의 SB203580, 약 30 nM의 SDF-1α가 보충된 αMEM 배지를 포함한다.

CD4- 세포를 포함하는 세포 집단의 생산에서, 조혈 전구 세포는 부착성 배양 또는 현탁 배양에 의해 배양될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 배양 배지 또는 배양 용기/접시는 Notch 활성화제를 포함한다. Notch 활성화제는 노치 수용체의 작용제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 Notch 작용제는 Notch 수용체와 결합하고, 또한 예컨대, Notch의 세포 내 도메인이 절단되어 핵으로 전위되도록 하는 것과 같이 Notch 수용체와 관련된 신호전달 이벤트를 개시하거나 매개한다. Notch 활성제는 Jagl, Jag2, DLL1, DLL3 및 DLL4를 포함하나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 Notch 리간드를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 Notch 리간드(들) 중 하나 이상은 가용성 펩티드로서 도입되거나 고체 물질 상에 고정화될 수 있다. 상기 고체 물질은 폴리스티렌 플레이트 또는 비드를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. Notch 리간드를 고정화하기 위한 예시적인 비드는 아가로스 비드, 자기 비드 및 라텍스 비드를 포함한다. 일부 실시 형태에서, Notch 리간드 펩티드는 비드에 접합/고정화된다. 일부 다른 실시 형태에서, 상기 Notch 리간드 펩티드는 폴리스티렌 플레이트의 표면에 접합/고정화된다. 일부 실시 형태에서, 상기 Notch 리간드의 고정화는 비공유 결합성이다. 일부 다른 실시 형태에서, 상기 Notch 리간드 펩티드는 세포에 의해 제시된다. 또 다른 실시 형태에서, 상기 배양 용기/접시는 Notch 리간드로 코팅된다.

일부 실시 형태에서, 상기 배양 용기/접시는 DLL1 또는 DLL4, 또는 DLL4 또는 DLL1의 융합 단백질, 및 Fc 등으로 코팅된다. DLL1 또는 DLL4는 재조합 인간 (rh)-DLL1 또는 rh-DLL4일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 배양 용기/접시는 rh-DLL4/Fc 키메라(Sino Biological) 및 RetroNectin(Takara Bio Inc)으로 코팅된다. 부착성 배양의 경우에, 코팅된 배양 용기가 사용될 수 있고/있거나, 조혈 전구 세포는 피더 세포 등과 공동 배양될 수 있다. 공동 배양을 위한 피더 세포의 예는 골수 기질 세포주, OP9 세포(Riken BioResource Center로부터 입수 가능함)를 포함한다. OP9 세포는 바람직하게는 DIII를 지속적으로 발현하는 OP-DL1 세포일 수 있다(Holmes R I 및 Zuniga-Pflucker JC. Cold Spring Harb Protoc. 2009(2)). 일부 실시 형태에서, OP9 세포가 피더 세포로 사용되는 경우, DIII, 또는 DIII 및 Fc의 융합 단백질 등은 별도로 제조된 배지에 첨가하여 공동 배양을 수행할 수 있다. 일부 실시 형태에서, Dlll은 인간의 경우 NCBI 등록번호 NM#005618, 또는 마우스의 경우 NCBI 등록번호 NM#007865의 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자에 의해 암호화되는 단백질; 및 이들 단백질에 대해 높은 서열 동일성(예를 들어, 90% 이상의 서열 동일성을 가짐)을 갖고 동등한 기능을 갖는 자연 발생 돌연변이체를 포함할 수 있다. 피더 세포가 CD4- 세포를 포함하는 세포 집단을 생산하기 위해 사용되는 경우, 상기 피더 세포는 배양 동안 적절하게 교체될 수 있다. 상기 피더 세포의 교체는 배양 중인 대상체 세포를 사전에 플레이팅된 피더 세포 상에 이동시킴으로써 수행될 수 있다. 상기 교체는 5일마다, 4일마다, 3일마다 또는 2일마다 수행될 수 있다.

일부 실시 형태에서, CD4- 세포를 포함하는 세포 집단의 생산을 위한 HP 세포 벌크 배양의 배양 온도 조건은 약 37℃ 내지 약 42℃, 및 약 37℃ 내지 약 39℃이다. 일부 실시 형태에서, 상기 배양은 저산소 조건하에서 수행될 수 있다. 상기 저산소 조건의 예는 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5% 및 이들보다 낮은 산소 농도를 포함한다. 상기 배양 기간은 CD4- 세포 등을 포함하는 상이한 유형의 세포 수를 모니터링함으로써 해당 분야의 통상의 기술자에 의해 적절하게 결정될 수 있다. 상기 배양 기간의 예는 10일 이상, 12일 이상, 14일 이상, 16일 이상, 18일 이상, 20일 이상, 21일 이상, 23일 이상, 25일 이상, 28일 이상, 30일 이상, 35일 이상 또는 42일 이상을 포함한다.

단계 (B) 이후 세포 집단으로부터 특정 세포 유형(예컨대, CD4- 세포)의 집단을 단리하는 경우, 상기 단리는 단리되는 세포 유형에 따라 CD4, CD8, CD3 및 CD45를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 하나의 지표(index)를 사용하여 수행될 수 있다. 상기 단리 방법은 해당 분야의 통상의 기술자에게 주지된 방법, 예컨대, 세포를 특정 항체(예를 들어, CD4, CD8, CD3, 또는 CD45 항체)로 표지한 후, 유세포 분석기를 사용하여 단리하는 방법, 또는 원하는 항원이 고정화된 친화성 컬럼 등을 사용하여 세포를 정제하는 방법일 수 있다.

CD4- 세포를 포함하는 세포 집단으로부터 CD56+/CD3- 세포를 유도하는 단계

일부 실시 형태에서 NK 세포는 CD56+/CD3- 세포이다.

일부 실시 형태에서, 상기 NK 세포는 비타민 C가 보충된 배지에서 CD4- 세포를 포함하는 세포 집단을 배양하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생산된다. 일부 실시 형태에서, NK 세포를 생산하는 데 제3 조건 세트가 사용된다.

일부 실시 형태에서, 상기 배지는 동물 세포의 배양에 사용되는 기본 배지에 비타민 C를 첨가하여 제조된다. 상기 기본 배지의 예로는 이스코브 변형 둘베코 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium, IMDM), 배지 199, 이글 최소 필수 배지(Eagle's Minimum Essential Medium, EMEM), αMEM 배지, 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's Medium, DMEM), 햄스 F12(Ham's F12) 배지, RPMI 1640 배지, 피셔 배지(Fischer's medium), 및 뉴로베이셜 배지(Neurobasal Medium)(Life Technologies), 및 이들 배지 중 둘 이상의 혼합물이 포함된다. 일부 실시 형태에서, 상기 배지는 혈청을 함유한다. 일부 실시 형태에서, 상기 배지는 혈청을 함유하지 않는다. 필요한 경우, 상기 기본 배지에는 하나 이상의 물질, 예컨대 알부민, 인간 인슐린, 인간 트랜스페린, 셀레늄 또는 아셀렌산나트륨, 지방산, 미량 원소, 2-메르캅토에탄올, 티올 글리세롤, 지질, 아미노산, 글루타민, 비-필수 아미노산, 비타민, 성장 인자, 저분자량 화합물, 항생제, 항산화제, 피루브산, 완충제, 무기염 및 사이토카인이 포함될 수도 있다.

일부 실시 형태에서, CD56 양성 NK 세포의 생산에 사용되는 배지는 항CD3 항체(UCHT1) 및 사이토카인을 추가로 함유한다. 적합한 사이토카인의 예는 IL-2 및 IL-7을 포함한다.

상기 CD3 항체는 CD3를 특이적으로 인식하는 항체라면 제한되지 않는다. 일부 실시 형태에서, 제3 조건 세트에서 CD3 항체의 농도는 약 10 ng/mL 내지 1000 ng/mL, 예컨대, 10 ng/mL, 50 ng/mL, 100 ng/mL, 200 ng/mL, 300 ng/mL, 400 ng/mL, 500 ng/mL, 600 ng/mL, 700 ng/mL, 800 ng/mL, 900 ng/mL, 또는 1000 ng/mL이다.

일부 실시 형태에서, 비타민 C는 전술된 바와 같은 동일한 조건하에서 CD56 양성 K 세포의 생산을 위해 사용된다.

일부 실시 형태에서, NK 세포 생산을 위한 제3 조건 세트에서 IL-2의 농도는 약 1 U/mL 내지 1000 U/mL, 예컨대 약 1 U/mL, 5 U/mL, 10 U/mL, 20 U/mL, 30 U/mL, 40 U/mL, 50 U/mL, 60 U/mL, 70 U/mL, 80 U/mL, 90 U/mL, 100 U/mL, 500 U/mL, 또는 1000 U/mL이다. 일부 실시 형태에서, CD56 양성 NK 세포의 생산을 위한 NK 유도 배지 내 IL-2의 농도는 약 1 ng/mL 내지 100 ng/mL, 예컨대 1 ng/mL, 5 ng/mL, 10 ng/mL, 20 ng/mL, 30 ng/mL, 40 ng/mL, 50 ng/mL, 60 ng/mL, 70 ng/mL, 80 ng/mL, 90 ng/mL, 또는 100 ng/mL이다.

일부 실시 형태에서, NK 세포 생산을 위한 제3 조건 세트에서 IL-7의 농도는 약 1 ng/mL 내지 100 ng/mL, 예컨대, 1 ng/mL, 5 ng/mL, 10 ng/mL, 20 ng/mL, 30 ng/mL, 40 ng/mL, 50 ng/mL, 60 ng/mL, 70 ng/mL, 80 ng/mL, 90 ng/mL, 또는 100 ng/mL이다.

일부 실시 형태에서, NK 세포의 생산을 위한 CD4- 세포를 포함하는 집단의 배양을 위한 배양 온도 조건은 약 37℃ 내지 약 42℃, 또는 약 37℃ 내지 약 39℃이다. 배양 기간은 CD56 양성 NK 세포 수 등을 모니터링함으로써 해당 분야의 통상의 기술자에 의해 적절하게 결정될 수 있다. 배양 일수는 NK 세포가 수득될 수 있는 한 제한되지 않는다. 배양 기간의 예는 적어도 1일 이상, 2일 이상, 3일 이상, 4일 이상, 5일 이상, 6일 이상 또는 7일 이상을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 수득된 NK 세포는 추가로 사용 전에 단리될 수 있다. 일부 다른 실시 형태에서, 수득된 CD56 양성 NK 세포는 T 세포(NK 세포 벌크)를 포함하는 다른 세포 종을 또한 함유하는 세포 집단으로서 사용될 수 있다.

일부 실시 형태에서, 제3 조건 세트에서 CD4- 세포를 포함하는 세포 집단을 배양함으로써 수득한 생성된 세포 집단 또는 또는 NK 세포 벌크는 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 90% 초과의 NK 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, NK 세포 벌크는 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 또는 50%의 T 세포를 포함한다. 일부 실시 형태에서, NK 세포 벌크는 약 75%의 CD56+/CD3-NK 세포 및 약 25%의 CD56+/CD3+ T 세포를 포함한다. 일부 실시 형태에서, NK 세포 벌크는 또한 B 세포 및 단핵구를 포함할 수 있다.

CD56+ NK 세포를 단리하는 경우, 단리 방법은 해당 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려진 방법, 예를 들어, 세포를 항CD56 항체 및 항-CD3 항체로 표지한 후, 유세포 분석기(형광 활성화 세포 분류)를 사용하여 단리하는 방법, 또는 원하는 항원이 고정화된 친화성 컬럼 등을 사용하여 세포를 정제하는 방법일 수 있다.

일부 실시 형태에서, 상기 CD56 양성 NK 세포는 CD56+/CD3+이다. 일부 실시 형태에서, 상기 CD56 양성 NK 세포는 CD56+/CD3-이다.

CAR-NK 세포 제조

일부 실시 형태에서, 상기 NK 세포는 하나 이상의 전이유전자(transgene)를 포함하도록 조작된다. 예컨대, 상기 NK 세포는 종양 유도성 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 유전적으로 조작될 수 있으며, 이에 따라 항종양 효과기 세포를 생산할 수 있다. 일 실시 형태에서, 상기 NK 세포 또는 iPS NK 세포는 CAR를 발현하도록 조작될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 NK 세포에 대한 세포 전구체는 CAR을 발현하도록 조작된다. 예컨대, 일부 실시 형태에서, 상기 iPS 세포는 CAR을 발현하도록 조작된다. 일부 실시 형태에서, 상기 HP 세포 벌크 내 세포는 CAR를 발현하도록 조작된다. 일부 실시 형태에서, 상기 NK 세포는 CAR을 발현하도록 조작된다. 또한, 일부 실시 형태에서, 이들 형질전환 수용체는 단백질 유래가 아닌 종양 관련 항원으로 유도될 수 있다. 특정 실시 형태에서, NK 세포 또는 iPS NK 세포는 적어도 하나의 CAR을 포함하도록 변형된다. 일부 실시 형태에서, 단일 CAR은 2개 이상의 항원을 표적화한다.

일부 실시 형태에서, iNK 세포는 키메라, 비-천연 및 조작된 수용체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 조작된 키메라 항원 수용체(CAR)는 1개, 2개, 3개, 4개 또는 그 이상의 구성요소를 갖고, 일부 실시 형태에서 상기 하나 이상의 구성요소는 하나 이상의 종양 항원을 포함하는 암 세포에 대한 림프구의 표적화 또는 결합을 용이하게 한다.

일부 실시 형태에서, 상기 CAR은 일반적으로 적어도 하나의 세포 외 리간드결합 도메인을 포함하는 적어도 하나의 막횡단 폴리펩티드 및; 적어도 하나의 세포 내 신호전달 도메인을 포함하는 하나의 막횡단 폴리펩티드를 포함하고; 폴리펩티드가 함께 조립되어 키메라 항원 수용체를 형성하도록 한다.

본 명세서에서 사용된 경우의 용어 "세포 외 리간드 결합 도메인"은 리간드에 결합할 수 있는 올리고- 또는 폴리펩티드로 정의된다. 바람직하게는, 상기 도메인은 세포 표면 분자와 상호작용할 수 있을 것이다. 예컨대, 세포 외 리간드 결합 도메인은 특정 질병 상태와 관련된 표적 세포에서 세포 표면 마커로서 작용하는 리간드를 인식하도록 선택될 수 있다.

특히, 세포 외 리간드 결합 도메인은 표적의 항원에 대한 항체로부터 유래된 항원 결합 도메인을 포함할 수 있다.

일부 실시 형태에서, NK 세포 또는 iPS NK 세포는 하나 이상의 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 유전적으로 변형될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 CAR는 다음 중 하나 이상으로부터 선택된 종양 항원을 표적화하는 세포 외 리간드 결합 도메인을 포함한다: CD44, CD19, CD20, CD22, CD23, CD30, CD89, CD123, CS-1, ROR1, 메소텔린, c-Met, PSMA, Her2, GD-2, CEA, MAGE A3 TCR, EGFR, HER2/ERBB2/neu, EPCAM, EphA2, CEA, BCMA. 일부 실시 형태에서, 상기 종양 항원은 CD19이다.

일부 실시 형태에서, 상기 세포 외 리간드 결합 도메인은 가요성 링커에 의해 연결된 표적 항원 특이적 단클론성 항체의 경쇄(VL) 및 중쇄(VH) 가변 단편을 포함하는 단일 사슬 항체 단편(scFv)이다.

일부 실시 형태에서, 상기 CAR은 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 막횡단 도메인은 세포 외 리간드 결합 도메인 및 막횡단 도메인 사이에 줄기 영역(stalk region)을 더 포함한다. 본 명세서에서 사용된 경우의 용어 "줄기 영역"은 일반적으로 막횡단 도메인을 세포 외 리간드 결합 도메인에 연결시키는 기능을 하는 임의의 올리고- 또는 폴리펩티드를 의미한다. 특히, 줄기 영역은 세포 외 리간드 결합 도메인에 대한 더 많은 가요성 및 접근성을 제공하는 데 사용된다. 줄기 영역은 최대 300개의 아미노산, 10 내지 100개의 아미노산, 및/또는 25 내지 50개의 아미노산을 포함할 수 있다. 줄기 영역은 자연 발생 분자의 전부 또는 일부로부터, 예컨대 CD8, CD4 또는 CD28의 세포 외 영역의 전부 또는 일부로부터, 또는 항체 불변 영역의 전부 또는 일부로부터 유래될 수 있다. 대안적으로, 상기 줄기 영역은 자연 발생 줄기 서열에 상응하는 합성 서열일 수 있거나, 완전히 합성 줄기 서열일 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 상기 줄기 영역은 인간 CD8 알파 사슬의 일부이다.

일부 실시 형태에서, 상기 CAR은 iPS NK 세포 및 면역 반응의 활성화를 초래하는 표적에 대한 세포 외 리간드 결합 도메인의 결합 후 세포 내 신호전달에 기여하는 신호 전달 도메인 또는 세포 내 신호전달 도메인을 함유한다. 용어 "신호 전달 도메인"은 효과기 신호 기능 신호를 전달하고, 세포가 특수 기능을 수행하도록 유도하는 단백질의 부분을 지칭한다. 일부 실시 형태에서, iPS NK 세포는 신호 전달 도메인을 포함하는 CAR을 갖는다.

일부 실시 형태에서, 상기 iPS NK 세포는 IL-15Rα/IL-15 복합체를 발현하도록 유전적으로 변형된다.

일부 실시 형태에서, 막횡단 폴리펩티드는 면역 세포의 표면, 예를 들어 iPS NK 세포에서 발현되고, 미리 정의된 표적 세포에 대한 면역 세포의 세포 반응을 유도하기 위해 함께 상호작용하는 능력을 포함한다. 세포 외 리간드 결합 도메인 및/또는 신호 전달 도메인을 포함하는 CAR의 상이한 막횡단 폴리펩티드는 표적 리간드와의 결합 후 신호 전달에 참여하고 면역 반응을 유도하기 위해 함께 상호작용한다. 상기 막횡단 도메인은 천연으로부터 또는 합성 공급원으로부터 유래될 수 있다. 상기 막횡단 도메인은 임의의 막결합 또는 막횡단 단백질로부터 유래될 수 있다.

일부 실시 형태에서, CAR을 발현하기 위한 NK 세포의 유전적 변형은 (1) 특정 CAR에 상응하는 유전자를 합성하는 단계; (2) CAR에 상응하는 유전자를 함유하는 벡터를 준비하는 단계; 및 (3) CAR 유전자를 함유하는 벡터로 CD56+ NK 세포를 형질도입하는 단계를 포함할 수 있다.

CAR을 암호화하는 발현 벡터는 하나 이상의 DNA 분자 또는 작제물로 도입될 수 있으며, 상기 작제물(들)을 함유하는 숙주 세포의 선택을 허용할 적어도 하나의 마커가 있을 수 있다.

상기 작제물은 통상적인 방법으로 제조될 수 있으며, 이때 유전자 및 조절 영역은 적절하게 단리되고, 결찰되고, 적절한 클로닝 숙주에서 클로닝되고, 제한 또는 서열 분석 또는 기타 편리한 수단에 의해 분석될 수 있다. 특히, PCR을 사용하여, 기능적 단위의 전부 또는 일부를 포함하는 개별 단편이 단리될 수 있으며, 이때 하나 이상의 돌연변이는 "프라이머 복구", 결찰, 시험관 내 돌연변이 유발 등을 적절하게 사용하여 도입될 수 있다. 일단 완료되고 적절한 서열을 갖는 것으로 입증된 작제물(들)은 이후 임의의 편리한 수단에 의해 CTL에 도입될 수 있다. 상기 작제물은 세포로의 감염 또는 형질도입을 위해, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스(AAV), 또는 단순포진 바이러스(HSV) 또는 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터를 포함한, 다른 것들과 같은 비복제, 결함성 바이러스 게놈에 통합되고 패키징될 수 있다. 상기 작제물은 원하는 경우, 형질감염을 위한 바이러스 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 상기 작제물은 융합, 전기천공, 유전자충격(biolistics), 형질감염, 리포펙션 등에 의해 도입될 수 있다. 상기 숙주 세포는 작제물(들)의 도입 전에 배양물에서 성장시키고 증식시킬 수 있으며, 뒤이어 작제물(들)의 도입 및 작제물(들)의 통합을 위해 적절하게 처리될 수 있다. 이후, 세포를 증식시키고 작제물에 존재하는 마커를 통해 스크리닝한다. 성공적으로 사용될 수 있는 다양한 마커에는 hprt, 네오마이신 내성, 티미딘 키나제, 히그로마이신 내성 등이 포함된다.

일부 경우에, 작제물은 상동 재조합을 위한 표적 부위를 가질 수 있으며, 이때 작제물은 특정 유전자좌에 통합되는 것이 바람직하다. 예를 들어, 내인성 유전자를 녹아웃시키고, 이를 (동일한 유전자좌 또는 다른 곳에서) 상동 재조합을 위해 해당 기술 분야에 공지된 바와 같은 재료 및 방법을 사용하여 작제물에 의해 암호화되는 유전자로 대체시킬 수 있다. 상동 재조합을 위해, OMEGA. 또는 O-벡터를 사용할 수 있다.

상기 작제물은 적어도 CAR 및 선택적으로 또 다른 유전자를 암호화하는 단일 DNA 분자, 또는 하나 이상의 유전자를 갖는 상이한 DNA 분자로서 도입될 수 있다. 다른 유전자에는 예를 들어, 치료적 분자 또는 자살 유전자를 암호화하는 유전자가 포함된다. 상기 작제물은 각각 동일하거나 상이한 마커를 가지며, 동시에 또는 연속적으로 도입될 수 있다.

작제물 DNA의 스톡(stock)을 제조하고 형질감염을 수행하는 데 사용될 수 있는, 유용한 요소, 예컨대 박테리아 또는 효모의 복제 기점, 선택 가능하고/하거나 증폭 가능한 마커, 원핵생물 또는 진핵생물에서의 발현을 위한 프로모터/인핸서 요소 등을 함유하는 벡터는 해당 기술 분야에 잘 알려져 있으며 다수가 상업적으로 이용가능하다.

사용 방법

본 발명에 따른 세포는 이를 필요로 하는 환자에서 암, 바이러스 감염 또는 자가면역 장애를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 또 다른 실시 형태에서, 본 발명에 따른 상기 단리된 세포는 이를 필요로 하는 환자에서 암, 자가면역 장애의 바이러스 감염의 치료를 위한 약제의 제조에 사용될 수 있다.

본 발명은 이를 필요로 하는 환자를 치료하기 위한 방법에 의존하며, 상기 방법은 (a) 본 발명에 따른 키메라 항원 수용체 세포를 제공하는 단계 및 (b) 상기 환자에게 세포를 투여하는 단계 중 적어도 하나를 포함한다.

상기 치료는 개선, 치유 또는 예방적일 수 있다. 이는 자가 면역요법의 일부 또는 동종 면역요법 치료의 일부일 수 있다. 자가 조직이란, 환자를 치료하기 위해 사용되는 세포, 세포주 또는 세포 집단이 상기 환자 또는 인간 백혈구 항원(HLA) 적합성 공여자로부터 유래된 것임을 의미한다. 동종이계란 환자를 치료하기 위해 사용되는 세포 또는 세포 집단이 상기 환자로부터 유래하는 것이 아니라 기증자로부터 유래된 것임을 의미한다.

일부 실시 형태에서, 상기 기술된 세포는 동종이계이다. 일부 실시 형태에서, 상기 기술된 세포는 자가 조직이다.

치료제는 암, 바이러스 감염, 자가면역 장애 또는 이식편대숙주병(GvHD)으로 진단된 환자를 치료하는 데 사용될 수 있다. 치료될 수 있는 암은 혈관이 형성되지 않았거나, 아직 실질적으로 혈관이 형성되지 않은 종양뿐만 아니라 혈관이 형성된 종양을 포함한다. 상기 암은 비고형 종양(예컨대 혈액 종양, 예를 들어 백혈병 및 림프종)을 포함하거나 고형 종양을 포함할 수 있다. 본 발명의 CAR로 치료되는 암의 유형은 이에 제한되지는 않으나, 암종, 모세포종 및 육종, 및 특정 백혈병 또는 림프구성 악성종양, 양성 및 악성 종양(malignant tumor), 및 악성종양(malignancies), 예를 들어, 육종, 암종 및 흑색종을 포함한다. 성인 종양/암 및 소아 종양/암도 포함된다.

일부 실시 형태에서, 치료제는 항체 요법, 화학요법, 사이토카인 요법, 수지상 세포 요법, 유전자 요법, 호르몬 요법, 레이저 광 요법 및 방사선 요법의 군으로부터 선택된 암에 대한 하나 이상의 요법과 조합된다.

일부 실시 형태에서, 상기 치료제는 면역억제 치료를 받는 환자에게 투여될 수 있다.

추가 실시 형태에서, 상기 세포 조성물은 하나 이상의 추가 요법과 조합하여 환자에게 투여된다. 예컨대, 일부 실시 형태에서, 상기 세포 조성물은 골수 이식, 플루다라빈과 같은 화학요법제, 외부 빔 방사선 요법(XRT), 시클로포스파미드, 또는 항체, 예컨대 OKT3 또는 CAM PATH를 사용하는 T 세포 절제 요법과 함께 (예를 들어, 이전에, 동시에 또는 이후에) 환자에게 투여된다. 또 다른 실시 형태에서, 본 발명의 세포 조성물은 CD20, 예를 들어 리툭산과 반응하는 제제와 같은 B 세포 절제 요법 이후에 투여된다. 예컨대, 일 실시 형태에서, 대상체는 고용량 화학요법에 이어 말초 혈액 줄기 세포 이식을 포함하는 표준 치료를 받을 수 있다. 특정 실시 형태에서, 대상체는 상기 이식 후 본 발명의 증식된 면역 세포의 주입을 받는다. 추가 실시 형태에서, 증식된 세포는 수술 전 또는 후에 투여된다. 본 명세서에 기재된 방법 중 임의의 하나에 의해 수득된 상기 변형된 세포는 숙주대이식편(HvG) 거부 및 이식편대숙주질환(GvHD)에 대해 이를 필요로 하는 환자를 치료하기 위해 본 발명의 특정 측면에서 사용될 수 있다; 따라서 본 발명의 범위는 불활성화된 TCR 알파 및/또는 TCR 베타 유전자를 포함하는 변형된 세포의 유효량을 상기 환자에게 투여함으로써 상기 환자를 치료하는 단계를 포함하는, 숙주대이식편(HvG) 거부 및 이식편대숙주질환(GvHD)에 대해 이를 필요로 하는 환자를 치료하는 방법이다.

세포의 투여

일부 실시 형태에서, 상기 세포는 매우 다양한 방법으로 숙주 유기체, 예를 들어, 포유동물 내로 도입될 수 있다. 상기 세포는 특정 실시 형태에서 종양 부위에 도입될 수 있지만, 대안적인 실시 형태에서 상기 세포는 암에 대해 집중되거나 암에 대해 집중되도록 변형된다. 적용되는 세포의 수는 여러 상황, 도입 목적, 세포의 수명, 사용되는 프로토콜, 예를 들어, 투여 횟수, 증식하는 세포의 능력, 재조합 작제물의 안정성 등에 따라 달라질 것이다. 상기 세포는 일반적으로 관심 부위 또는 그 근처에 주입되는 분산물로 적용될 수 있다. 상기 세포는 생리학적으로 허용 가능한 배지에 있을 수 있다. 일 실시 형태에서, 본 발명의 NK 세포 또는 iPS NK 세포는 하나 이상의 CAR, TCR, 또는 고친화성 CD16과 같은 임의의 다른 조작된 단백질 또는 폴리펩티드 도메인을 발현할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 세포는 면역 인식을 억제하기 위해 캡슐화되어 종양 부위에 배치된다.

상기 세포는 원하는 바에 따라 투여될 수 있다. 원하는 반응, 투여 방식, 세포의 수명, 존재하는 세포의 수에 따라 다양한 프로토콜이 적용될 수 있다. 투여 횟수는 적어도 부분적으로 전술한 인자에 따라 달라질 것이다.

본 발명에 따른 세포 또는 세포 집단의 투여는 에어로졸 흡입, 주입, 섭취, 수혈, 착상 또는 이식을 포함하는, 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 본 명세서에 기재된 조성물은 환자에게 피하로, 피내로, 종양 내로, 결절 내로, 척수 내로, 근육 내로, 정맥 내 또는 림프관 내 주사에 의해, 또는 복강 내로 투여될 수 있다. 일 실시 형태에서, 본 발명의 세포 조성물은 바람직하게는 정맥 내 주사에 의해 투여된다.

핵산 기반 발현 시스템

일부 실시 형태에서, 본 발명의 NK 세포 또는 iPS NK 세포는 하나 이상의 CAR, TCR, 또는 고친화성 CD16 또는 CD19와 같은 임의의 다른 조작된 단백질 또는 폴리펩티드 도메인을 발현하도록 조작된다. 이들 폴리펩티드를 포함하는 발현 벡터를 생성하기 위한 재조합 기술은 해당 기술 분야에 주지되어 있으며, 일반적으로 이하에서 기술된다.

벡터

용어 "벡터"는 핵산 서열이 복제될 수 있는 세포 내로의 도입을 위해 삽입될 수 있는 운반체 핵산 분자를 지칭하기 위해 사용된다. 핵산 서열은 "외인성"일 수 있으며, 이는 벡터가 도입되는 세포에 대해 이질적이거나, 서열이 일반적으로 발견되지 않는 숙주 세포 핵산 내의 위치에 있지만 서열이 세포 내의 서열과 상동임을 의미한다. 벡터에는 플라스미드, 코스미드, 바이러스(박테리오파지, 동물 바이러스 및 식물 바이러스) 및 인공 염색체(예를 들어, YAC)가 포함된다. 해당 분야의 통상의 기술자는 표준 재조합 기술을 통해 벡터를 구축하는 데 능숙할 것이다(예를 들어, Maniatis 등, 1988 및 Ausubel 등, 1994 참조, 둘 다 본 명세서에 참조로 포함됨).

용어 "발현 벡터"는 전사될 수 있는 RNA를 암호화하는 핵산을 포함하는 임의의 유형의 유전적 작제물을 지칭한다. 일부 경우에, RNA 분자는 이후 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드로 번역된다. 다른 경우에, 이들 서열은 예를 들어, 안티센스 분자 또는 리보자임의 생산에서 번역되지 않는다. 발현 벡터는 다양한 "제어 서열"을 함유할 수 있으며, 이는 특정 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 암호화 서열의 전사 및 가능하게는 번역에 필요한 핵산 서열을 지칭한다. 전사 및 번역을 통제하는 제어 서열뿐만 아니라, 벡터 및 발현 벡터는 또한 다른 기능을 제공하는 핵산 서열을 포함할 수 있고 이하에서 기술된다.

프로모터 및 인핸서

"프로모터"는 전사의 개시 및 속도가 제어되는 핵산 서열의 영역인 제어 서열이다. 이는 RNA 중합효소 및 기타 전사 인자와 같이 조절 단백질 및 분자가 결합하여, 핵산 서열의 특정 전사를 개시할 수 있는 유전학적 요소를 함유할 수 있다. 문구 "작동 가능하게 위치된", "작동 가능하게 연결된", "제어하에", 및 "전사 제어하에"는 프로모터가 핵산 서열과 관련하여 정확한 기능적 위치 및/또는 방향(orientation)에 있어서 해당 서열의 전사 개시 및/또는 발현을 제어한다는 것을 의미한다.

프로모터는 일반적으로 RNA 합성을 위한 시작 부위를 위치시키는 기능을 하는 서열을 포함한다. 이것의 가장 잘 알려진 예는 TATA 박스이지만, 예를 들어 포유류 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 유전자에 대한 프로모터 및 SV40 후기 유전자에 대한 프로모터와 같은 TATA 박스가 없는 일부 프로모터에서는 시작 부위 자체를 오버레이하는 개별 요소가 개시 위치를 고정시키는 데 도움이 된다. 부가적인 프로모터 요소는 전사 개시의 빈도를 조절한다. 전형적으로, 이들은 시작 부위의 30 110 bp 업스트림 영역에 위치하지만, 다수의 프로모터가 시작 부위의 다운스트림에도 기능적 요소를 함유하는 것으로 나타났다. 프로모터의 "제어하에" 암호화하는 서열을 가져오기 위해, 선택된 프로모터의 "다운스트림"(즉, 3')에 전사 판독 프레임의 전사 개시 부위의 5' 말단을 위치시킨다. "업스트림" 프로모터는 DNA의 전사를 자극하고 암호화된 RNA의 발현을 촉진한다.

프로모터 요소 사이의 공간은 주로 유연해서, 요소가 서로에 대해 반전되거나 이동할 때 프로모터 기능이 보존된다. tk 프로모터에서, 프로모터 요소 사이의 공간은 활성도가 감소하기 시작하기 전에 50 bp 까지 증가될 수 있다. 프로모터에 따라, 개별 요소는 전사를 활성화하기 위해 협력적으로 또는 독립적으로 기능할 수 있는 것으로 나타난다. 프로모터는 핵산 서열의 전사 활성화에 관여하는 시스 작용 조절 서열을 지칭하는 "인핸서"와 함께 사용되거나 사용되지 않을 수 있다.

프로모터는 암호화 세그먼트 및/또는 엑손의 업스트림에 위치한 5' 비암호화 서열을 단리함으로써 수득될 수 있는 바와 같이, 핵산 서열과 자연적으로 연관된 것일 수 있다. 이러한 프로모터는 "내인성"으로 지칭될 수 있다. 유사하게, 인핸서는 그 서열의 다운스트림 또는 업스트림에 위치한 핵산 서열과 자연적으로 연관된 것일 수 있다. 대안적으로, 재조합 또는 이종 프로모터의 제어하에 암호화 핵산 세그먼트를 위치시킴으로써 특정 이점을 얻을 수 있으며, 이는 자연 환경에서 핵산 서열과 정상적으로 연관되지 않는 프로모터를 지칭한다. 재조합 또는 이종 인핸서는 또한 이의 자연 환경에서 핵산 서열과 정상적으로 연관되지 않는 인핸서를 지칭한다. 이러한 프로모터 또는 인핸서는 다른 유전자의 프로모터 또는 인핸서, 및 임의의 다른 바이러스, 또는 원핵 세포 또는 진핵 세포로부터 단리된 프로모터 또는 인핸서, 및 "자연적으로 발생하는"이 아닌, 즉, 상이한 전사 조절 영역의 상이한 요소를 함유하는 프로모터 또는 인핸서, 및/또는 발현을 변경하는 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 재조합 DNA 작제물에 가장 일반적으로 사용되는 프로모터는 락타마제(페니실리나제), 락토스 및 트립토판(trp) 프로모터 시스템을 포함한다. 프로모터 및 인핸서의 핵산 서열을 합성적으로 생성하는 것 이외에도, 서열은 본 명세서에 개시된 조성물과 관련하여, PCR.TM.을 비롯한 재조합 클로닝 및/또는 핵산 증폭 기술을 사용하여 생성될 수 있다(미국특허번호 제4,683,202호 및 제5,928,906호 참조, 각각 참조로서 본 명세서에 포함됨). 또한, 미토콘드리아, 엽록체 등과 같은 비핵 소기관 내 서열의 전사 및/또는 발현을 유도하는 제어 서열이 또한 사용될 수 있는 것으로 고려된다.

자연적으로, 발현을 위해 선택된 소기관, 세포 유형, 조직, 기관 또는 유기체에서 DNA 세그먼트의 발현을 효과적으로 유도하는 프로모터 및/또는 인핸서를 사용하는 것이 중요할 것이다. 분자 생물학 분야의 숙련가는 일반적으로 단백질 발현을 위한 프로모터, 인핸서 및 세포 유형 조합의 사용을 알고 있다(예를 들어, 본 명세서에 참조로 포함된 Sambrook 등 1989 참조). 사용된 프로모터는 재조합 단백질 및/또는 펩티드의 대규모 생산에 유리한 것과 같은, 도입된 DNA 세그먼트의 고수준의 발현을 유도하는 적절한 조건 하에서 구성적이고, 조직-특이적이며, 유도할 수 있고/있거나 유용할 수 있다. 상기 프로모터는 이종 또는 내인성일 수 있다.

추가적으로, 임의의 프로모터/인핸서 조합이 또한 발현을 유도하는 데 사용될 수 있다. T3, T7 또는 SP6 세포질 발현 시스템의 사용은 또 다른 가능한 실시 형태이다. 진핵 세포는 적절한 박테리아 중합효소가 전달 복합체의 일부로서 또는 추가 유전적 발현 작제물로서 제공되는 경우 특정 박테리아 프로모터로부터 세포질 전사를 지원할 수 있다.

조직 특이적 프로모터 또는 요소의 정체(identity), 뿐만 아니라 이들의 활성을 특성화하는 분석은 해당 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다.

특정 개시 신호는 또한 암호화 서열의 효율적인 번역을 위해 필요할 수 있다. 이러한 신호에는 ATG 개시 코돈 또는 인접 서열이 포함된다. ATG 개시 코돈을 포함하는 외인성 번역 제어 신호가 제공될 필요가 있다. 해당 분야의 통상의 기술자는 이를 쉽게 결정하고, 필요한 신호를 제공할 수 있을 것이다.

본 발명의 특정 실시 형태에서, 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 요소의 용도는 다중 유전자 또는 폴리시트로닉(polycistronic) 메시지를 생성하는 데 사용되며, 이들은 본 발명에서 사용될 수 있다.

벡터는 다중 제한 효소 부위를 함유하는 핵산 영역인, 다중 클로닝 부위(MCS)를 포함할 수 있으며, 이들 중 임의의 부위는 벡터를 소화하기 위해 표준 재조합 기술과 함께 사용될 수 있다. "제한 효소 소화"는 핵산 분자의 특정 위치에서만 작용하는 효소를 갖는 핵산 분자의 촉매적 절단을 지칭한다. 이러한 제한 효소의 대부분은 상업적으로 이용 가능하다. 이러한 효소의 사용은 해당 분야의 통상의 기술자에 의해 널리 이해된다. 흔히, 벡터는 외인성 서열이 벡터에 결찰될 수 있도록 MCS 내에서 절단하는 제한 효소를 사용하여 선형화되거나 단편화된다. "결찰"은 서로 인접하거나 인접하지 않을 수 있는, 2개의 핵산 단편 사이에 포스포디에스테르 결합을 형성하는 과정을 지칭한다. 제한 효소 및 결찰 반응을 수반하는 기술은 재조합 기술 분야의 숙련가에게 잘 알려져 있다.

스플라이싱 부위, 종결 신호, 복제 기점 및 선택 가능한 마커가 또한 사용될 수 있다.

플라스미드 벡터

특정 실시 형태에서, 플라스미드 벡터는 숙주 세포를 형질전환시키는 데 사용하기 위해 고려된다. 일반적으로, 숙주 세포와 양립성인 종으로부터 유래되는 레플리콘 및 제어 서열을 내포하는 플라스미드 벡터가 이들 숙주와 관련하여 이용된다. 벡터는 일반적으로 복제 부위, 뿐만 아니라 형질전환된 세포에서 표현형 선택을 제공할 수 있는 마킹 서열을 운반한다 비제한적 예에서, E. coli는 종종 E. coli 종에서 유래된 플라스미드인 pBR322의 유도체를 사용하여 형질전환된다. pBR322는 암피실린 및 테트라사이클린 내성 유전자를 함유하고, 따라서 형질전환된 세포를 식별하기 위한 용이한 수단을 제공한다. pBR 플라스미드, 또는 기타 미생물 플라스미드 또는 파지는 또한 예를 들어, 그 자체 단백질의 발현을 위해 미생물 유기체에 의해 사용될 수 있는 프로모터를 함유하거나 함유하도록 변형되어야 한다.

이에 더하여, 숙주 미생물과 양립하는 레플리콘 및 제어 서열을 내포하는 파지 벡터는 이들 숙주와 관련하여 형질전환 벡터로서 이용될 수 있다. 예를 들어, 파지 람다 GEM.TM. 11은 예를 들어, E. coli LE392와 같은 숙주 세포를 형질전환하는 데 사용될 수 있는 재조합 파지 벡터를 제조하는 데 활용될 수 있다.

추가로 유용한 플라스미드 벡터에는 추후 정제 및 분리 또는 절단을 위해 글루타티온 S 트랜스퍼라제 (GST) 가용성 융합 단백질을 생성하는 데 사용하기 위한, pIN 벡터 (Inouye 등, 1985); 및 pGEX 벡터가 포함된다. 다른 적합한 융합 단백질은 갈락토시다제, 유비퀴틴 등을 갖는 것들이다.

발현 벡터를 포함하는 박테리아 숙주 세포, 예를 들어 E. coli는 다수의 적합한 배지 중 임의의 것, 예를 들어 LB에서 성장된다, LB. 특정 벡터에서 재조합 단백질의 발현은 해당 분야의 통상의 기술자에 의해 이해될 수 있는 바와 같이, 숙주 세포를 특정 프로모터에 특이적인 제제와 접촉시킴으로써, 예를 들어, 배지에 IPTG를 첨가함으로써 또는 배양을 더 높은 온도로 전환함으로써 유도될 수 있다. 일반적으로 2 내지 24시간 사이의 추가 기간 동안 박테리아를 배양한 후, 세포를 원심단리로 수집하고 세척하여 잔류 배지를 제거한다.

바이러스 벡터

수용체 매개된 엔도시토시스(endocytosis)를 통해 세포를 감염시키거나 세포에 진입하고, 숙주 세포 게놈에 통합되어 바이러스 유전자를 안정적이고 효율적으로 발현시키는 특정 바이러스의 능력은 외래 핵산을 세포(예를 들어, 포유류 세포)로 전달하기 위한 매력적인 후보로 만들었다. 본 발명의 구성요소는 하나 이상의 CAR, TCR, 또는 본 발명의 고친화성 CD16과 같은 임의의 다른 조작된 단백질 또는 폴리펩티드 도메인을 암호화하는 바이러스 벡터일 수 있다. 본 발명의 핵산을 전달하는 데 사용될 수 있는 바이러스 벡터의 비제한적인 예는 이하에 기술된다.

아데노바이러스 벡터

핵산의 전달을 위한 특정 방법은 아데노바이러스 발현 벡터의 사용을 수반한다. 아데노바이러스 벡터는 게놈 DNA 내에 통합하기 위한 낮은 능력을 갖는 것으로 알려져 있지만, 이 특징은 이러한 벡터에 의해 제공되는 유전자 전달의 높은 효율로 균형을 이룬다. "아데노바이러스 발현 벡터"는 (a) 작제물의 패키징을 지원하고 (b) 궁극적으로 그 안에 클로닝된 조직 또는 세포 특이적 작제물을 발현하기에 충분한 아데노바이러스 서열을 함유하는 작제물을 포함하는 것을 의미한다. 36 kb, 선형, 이중 가닥 DNA 바이러스인, 아데노바이러스 또는 유전학적 구조에 대한 지식은 아데노바이러스 DNA의 큰 부분을 외래 서열로의 대체를 최대 7 kb까지 허용한다(Grunhaus 및 Horwitz, 1992).

AAV 벡터

핵산은 아데노바이러스 관련된 형질감염을 사용하여 세포 내로 도입될 수 있다. 아데노바이러스 결합 시스템을 사용한 세포 시스템에서 증가된 형질감염 효율이 보고되었다(Kelleher 및 Vos, 1994; Cotten 등, 1992; Curiel, 1994). 아데노 관련된 바이러스(AAV)는 높은 통합 빈도를 가지며 비분열 세포를 감염시킬 수 있기 때문에 본 발명의 세포에 사용하기에 매력적인 벡터 시스템이며, 따라서 예를 들어, 조직 배양(Muzyczka, 1992)에서 또는 생체내에서 유전자를 포유류 세포로 전달하는 데 유용하게 만든다. AAV는 감염에 대한 광범위한 숙주 범위를 가지고 있다(Tratschin 등, 1984; Laughlin 등, 1986; Lebkowski 등, 1988; McLaughlin 등, 1988). rAAV 벡터의 생성 및 사용에 관한 세부 사항은 미국특허번호 제5,139,941호 및 제4,797,368호에 기재되어 있으며, 각각은 본 명세서에 참조로 포함된다.

레트로바이러스 벡터

레트로바이러스는 그들의 유전자를 숙주 게놈에 통합시키고, 다량의 외래 유전 물질을 전달하고, 광범위한 종 및 세포 유형을 감염시키고, 특수 세포주에 패키징되는 그들의 능력 때문에 전달 벡터로서 유용하다(Miller , 1992).

레트로바이러스 벡터를 구축하기 위해, 핵산(예를 들어, 원하는 서열을 암호화하는 것)을 특정 바이러스 서열 대신에 바이러스 게놈에 삽입하여 복제 결함이 있는 바이러스를 생성한다. 비리온을 생산하기 위해, gag, pol 및 env 유전자를 함유하지만 LTR 및 패키징 구성요소가 없는 패키징 세포주가 구축된다(Mann 등, 1983). 레트로바이러스 LTR 및 패키징 서열과 함께, cDNA를 함유하는 재조합 플라스미드가 특수 세포주에 (예를 들어, 인산칼슘 침전에 의해) 도입될 때, 패키징 서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사체가 바이러스 입자로 패키징될 수 있도록 하고, 이는 이후 배양 배지로 분비된다(Nicolas 및 Rubenstein, 1988; Temin, 1986; Mann 등, 1983). 재조합 레트로바이러스를 함유하는 배지는 수집된 다음, 선택적으로 농축되고, 유전자 전달에 사용된다. 레트로바이러스 벡터는 다양한 세포 유형을 감염시킬 수 있다. 그러나, 통합 및 안정적인 발현은 숙주 세포의 분열을 필요로 한다(Paskind 등, 1975).

렌티바이러스는 복합 레트로바이러스이며, 이는 일반적인 레트로바이러스 유전자 gag, pol 및 env 이외에 조절 또는 구조적 기능을 갖는 다른 유전자를 함유한다. 렌티바이러스 벡터는 해당 기술 분야에 잘 알려져 있다(예를 들어, aldini 등, 1996; Zufferey 등, 1997; Blomer 등, 1997; 미국특허번호 제6,013,516호 및 제5,994,136호 참조). 렌티바이러스의 일부 예는 인간 면역결핍 바이러스: HIV-1, HIV-2 및 원숭이 면역결핍 바이러스(Simian Immunodeficiency Virus): SIV를 포함한다. 렌티바이러스 벡터는 HIV 독성 유전자, 예를 들어, 유전자 env, vif, vpr, vpu 및 nef가 삭제되어 벡터를 생물학적으로 안전하게 만드는 다중 약독화에 의해 생성되었다.

재조합 렌티바이러스 벡터는 비분열 세포를 감염시킬 수 있고, 생체 내 및 생체 외 유전자 전달 및 핵산 서열의 발현 모두에 사용될 수 있다. 예를 들어, 적합한 숙주 세포가 패키징 기능, 즉 gag, pol 및 env, 뿐만 아니라 rev 및 tat를 운반하는 2개 이상의 벡터로 형질감염된 비-분열 세포를 감염시킬 수 있는 재조합 렌티바이러스는 본 명세서에 참조로 포함된 미국특허번호 제5,994,136호에 기술되어 있다. 특정 세포-유형의 수용체에 표적화하기 위한 항체 또는 특정 리간드와 외피 단백질의 연결에 의해 재조합 바이러스를 표적화할 수 있다. 예를 들어, 특정 표적 세포 상의 수용체에 대한 리간드를 암호화하는 다른 유전자와 함께 (조절 영역을 포함하는) 관심 서열을 바이러스 벡터에 삽입함으로써, 벡터는 이제 표적-특이적이 된다.

병용 요법

본 발명의 특정 실시 형태에서, 임상적 측면을 위한 본 발명의 방법은 과증식성 질환의 치료에 효과적인 다른 제제, 예컨대 항암제와 조합된다. "항암" 제제는 예를 들어, 암 세포를 사멸시키고, 암 세포에서 아폽토시스를 유도하고, 암 세포의 성장 속도를 감소시키고, 전이의 발생 또는 수를 감소시키고, 종양 크기를 감소시키고, 종양 성장을 억제시키고, 종양 또는 암 세포로의 혈액 공급을 감소시키고, 암 세포 또는 종양에 대한 면역 반응을 촉진시키고, 암의 진행을 예방하거나 억제키고, 또는 암에 걸린 대상체의 수명을 연장시킴으로써 대상체의 암에 부정적인 영향을 미칠 수 있다. 보다 일반적으로, 이들 다른 조성물은 세포를 사멸시키거나 증식을 억제하는 데 효과적인 조합량으로 제공될 것이다. 이 과정은 암 세포를 발현 작제물 및 작용제(들) 또는 다중 인자(들)와 동시에 접촉시키는 것을 수반할 수 있다. 이는 두 제제를 모두 포함하는 단일 조성물 또는 약리학적 제제와 세포를 접촉시키거나, 세포를 동시에 2개의 별개의 조성물 또는 제제와 접촉시킴으로써 달성될 수 있으며, 이때 하나의 조성물은 발현 작제물을 포함하고 다른 조성물은 제2 제제(들)를 포함한다.

화학요법 및 방사선요법 제제에 대한 종양 세포 내성은 임상 종양학에서 주요 문제를 나타낸다. 현재 암 연구의 한 가지 목표는 다른 치료법과 결합하여 화학요법 및 방사선요법의 효능을 향상시키는 방법을 찾는 것이다. 본 발명의 맥락에서, 세포 요법은 화학요법제, 방사선요법제 또는 면역요법제 중재뿐만 아니라 프로-아폽토틱(pro-apoptotic) 또는 세포 주기 조절제와 함께 유사하게 사용될 수 있는 것으로 고려된다.

대안적으로, 상기 요법은 수분 내지 수주 범위의 간격으로 다른 제제 치료를 선행하거나 후속할 수 있다. 다른 제제와 본 발명이 개별적으로 개체에게 적용되는 실시 형태에서, 상기 제제와 본 발명의 요법이 여전히 세포에 유리하게 조합된 효과를 발휘할 수 있도록, 일반적으로 각 전달 시간 사이에 상당한 기간이 만료되지 않았음을 보장할 것이다. 이러한 경우에, 이는 서로 약 12-24시간 이내, 보다 바람직하게는 서로 약 6-12시간 이내에 두 가지 양식 모두로 세포와 접촉할 수 있는 것으로 고려된다. 그러나, 일부 상황에서, 각 투여 사이에 수일 (2일, 3일, 4일, 5일, 6일 또는 7일) 내지 수주 (1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주 또는 8주)가 경과되는 경우, 이는 치료 기간을 상당히 연장하는 것이 바람직할 수 있다.

일부 실시 형태에서, 상기 치료 주기는 필요에 따라 반복된다. 외과적 중재뿐만 아니라 다양한 표준 요법이 본 발명의 세포 요법과 조합하여 적용될 수 있음이 또한 고려된다.

화학요법

암 치료법은 또한 화학 및 방사선 기반 치료법을 모두 갖는 다양한 조합 치료법을 포함한다. 조합 화학요법에는 예를 들어, 아브락산, 알트레타민, 도세탁셀, 허셉틴, 메토트렉세이트, 노반트론, 졸라덱스, 시스플라틴(CDDP), 카보플라틴, 프로카바진, 메클로레타민, 시클로포스파미드, 캄토테신, 이포스파미드, 멜팔란, 클로람부실, 부술판, 니트로우레아, 닥티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 블레오마이신, 플리코마이신, 미토마이신, 에토포사이드(VP16), 타목시펜, 랄록시펜, 에스트로겐 수용체 결합제, 탁솔, 젬시타비엔, 나벨빈, 파르네실-단백질 탄스페라제 억제제, 트랜스플라티늄, 5-플루오로우라실, 빈크리스틴, 빈블라스틴 및 메토트렉세이트, 또는 전술한 것 중 임의의 유사체 또는 유도체 변이체 및 또한 이들의 조합이 포함된다.

특정 실시 형태에서, 개체에 대한 화학요법은 예를 들어 본 발명의 투여 전, 투여 중 및/또는 투여 후에 본 발명과 함께 적용된다.

방사선 요법

DNA 손상을 유발하고 광범위하게 사용되어 온 다른 인자에는 감마선, X-선으로 통상적으로 공지된 것들, 및/또는 종양 세포에 대한 방사성 동위원소의 직접 전달이 포함된다. 마이크로파 및 UV-조사와 같은 DNA를 손상시키는 요인의 다른 형태가 또한 고려된다. 이러한 인자들 모두 DNA에, DNA의 전구물질에, DNA의 복제 및 복원에, 그리고 염색체의 어셈블리 및 유지에 광범위한 손상을 줄 가능성이 크다. X-선의 선량 범위는 연장된 기간 동안 (3 내지 4주)에 50 내지 200 뢴트겐의 일일 선량 내지 2000 내지 6000 뢴트겐의 단일 선량의 범위이다. 방사성 동위원소의 선량 범위는 폭넓게 달라지고, 동위원소의 반감기, 방출되는 방사선의 강도 및 유형, 및 신생물 세포에 의한 섭취에 의존한다.

세포에 적용될 때 용어 "접촉된" 및 "노출된"은 치료적 작제물 및 화학요법제 또는 방사선요법제를 표적 세포로 전달하거나 표적 세포와의 근접위치에 직접 넣는 과정을 기술하기 위하여 본 명세서에서 사용된다. 세포 사멸 또는 정체를 달성하기 위하여, 제제 둘 다는 세포를 사멸시키거나 세포 분열을 방지하는 데 효과적인 조합량으로 세포에 전달된다.

면역요법

면역치료제는 일반적으로 면역 효과기 세포 및 분자의 사용에 의존하여 암 세포를 표적화하고 파괴한다. 면역 효과기는, 예를 들어, 종양 세포의 표면에서 일부 마커에 특이적인 항체일 수 있다. 항체 단독은 요법의 효과기로서 작용할 수 있거나, 이는 다른 세포를 모집하여 세포 사멸에 실제로 영향을 미칠 수 있다. 항체는 또한 약물 또는 독소(화학요법, 방사선핵종, 라이신 A쇄, 콜레라 독소, 백일해 독소 등)에 접합되어 단순히 표적화 제제로서 제공될 수 있다. 대안적으로, 효과기는 종양 세포 표적과 직접적 또는 간접적으로 상호작용하는 표면 분자를 수반하는 림프구일 수 있다. 다양한 효과기 세포에 세포독성 T 세포 및 NK 세포가 포함된다.

따라서, 본 명세서에 기재된 본 발명의 요법 이외의 면역요법은 본 세포 요법과 함께 조합 요법의 일부로서 사용될 수 있다. 복합 요법에 대한 일반적인 접근법은 이하에서 논의된다. 일반적으로, 종양 세포는 표적화할 수 있는, 즉, 대부분의 다른 세포에는 존재하지 않는 일부 마커를 보유해야 한다. 다수의 종양 마커가 존재하고 이들 중 임의의 것들은 본 발명의 맥락에서 표적화시키기에 적합하다. 일반적인 종양 마커는 PD-1, PD-L1, CTLA4, 암태아성 항원, 전립선 특이적 항원, 비뇨기 종양 관련 항원, 태아 항원, 티로시나제(p97), gp68, TAG-72, HMFG, 시알릴 루이스 항원, MucA, MucB, PLAP, 에스트로겐 수용체, 라미닌 수용체, erb B 및 p155를 포함한다.

유전자

또 다른 실시 형태에서, 2차 치료는 치료적 폴리뉴클레오티드가 본 발명의 임상 실시 형태 이전, 이후 또는 동시에 투여되는 유전자 요법이다. 세포성 증식의 유도제, 세포성 증식의 억제제, 또는 프로그래밍된 세포 사멸의 조절제를 포함하는 다양한 발현 생성물이 본 발명 내에 포함된다.

수술

암에 걸린 사람의 대략 60%는 예방, 진단 또는 병기결정, 치유 및 완화 수술을 포함하는 일부 유형의 수술을 받게 될 것이다. 치유 수술은 본 발명의 치료, 화학요법, 방사선요법, 호르몬요법, 유전자요법, 면역요법 및/또는 대체 요법과 같은 다른 요법과 함께 사용될 수 있는 암 치료이다.

치유 수술은 암성 조직의 전부 또는 일부를 물리적으로 제거하고, 절개하고/하거나 파괴하는 절제를 포함한다. 종양 절제는 종양의 적어도 일부분의 물리적 제거를 지칭한다. 종양 절제술 외에도, 수술에 의한 치료는 레이저 수술, 동결 수술, 전기 수술, 및 현미경적으로 제어된 수술(모스 수술)을 포함한다. 본 발명이 표재성(superficial) 암, 전암, 또는 부수적 양의 정상 조직의 제거와 함께 사용될 수 있음이 추가로 고려된다.

암성 세포, 조직 또는 종양 전체의 일부를 절제하는 경우, 체내에 공동(cavity)이 형성될 수 있다. 치료는 추가적인 항암 요법으로 관류, 직접 주사 또는 국소 부위 적용에 의해 달성될 수 있다. 이러한 치료는, 예를 들어 매 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7일마다, 또는 매 1, 2, 3, 4, 및 5주마다 또는 매 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개월마다 반복될 수 있다. 이들 치료는 또한 용량을 달리하여 이루어질 수 있다.

NK 세포와 CAR-NK 세포의 동결 보존

본 명세서에 개시된 NK 세포 및 CAR-NK 세포는 해동 후 세포 표현형을 유지하기 위해 동결보존될 수 있다.

세포의 동결보존을 위한 조성물

본 명세서에 참조로 포함된 출원 번호 PCT/US21/13591에 기술된 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 면역 세포에 적합한 임의의 동결보존 배지가 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 상기 동결보존 배지는 디메틸설폭사이드(DMSO), 이당류, 사이토카인을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 동결보존 배지는 또한 인간 혈청 알부민 또는 인간 혈청을 포함한다.

NK 세포 및 CAR-NK 세포의 용도

본 명세서에 기재된 방법으로 생산된 NK 세포는 다양한 용도로 사용될 수 있다. 예컨대, 본 명세서에 기재된 동결보존 배지 내에 함유된 CAR-NK 세포 조성물을 포함하는 본 명세서에 기재된 조성물은 입양 세포 치료법에 적합하다. 입양 세포 치료법은 예컨대, 암을 비롯한 다양한 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 동결보존 배지 내에 함유된 CAR-NK 세포 조성물은 암 또는 종양의 치료에 유용하다. 특정 실시 형태에서, 상기 암은 유방, 심장, 폐, 소장, 결장, 비장, 신장, 방광, 머리, 목, 난소, 전립선, 뇌, 췌장, 피부, 뼈, 골수, 혈액, 흉선, 자궁, 고환, 및 간 종양을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 암은 혈액암이다. 일부 실시 형태에서, 상기 혈액암은 B 세포 악성종양(예컨대, 미만성 거대 B 세포 림프종)이다.

일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 동결보존 배지는 입양 세포 치료법에 사용되는 세포를 현탁시키는 데 사용된다. 따라서, 일부 실시 형태에서, CAR-NK 세포 조성물은 본 명세서에 기재된 동결보존 배지에 현탁된다.

일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 동결보존 매질에 현탁된 CAR-NK 세포 조성물은 암에 걸린 대상체를 치료하는 데 사용된다. 일부 실시 형태에서, 상기 대상체는 본 명세서에 기재된 동결보존 배지 내에 CAR-NK 세포를 포함하는 조성물을 투여받는다. 일부 실시 형태에서, 상기 CAR-NK 세포는 항-CD19 CAR 유전자 및 IL-15 유전자를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 CAR-NK 세포는 항-CD19 CAR 유전자, IL-15 유전자 및 iCaspase9를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 CAR-NK 세포는 필요로 하는 대상체에게 투여되기 전에 세척되지 않는다. 일부 실시 형태에서, 상기 CAR-NK 세포는 필요로 하는 대상체에게 투여되기 전에 동결보존 배지가 세척된다. 일부 실시 형태에서, 해동된 세포는 세포 해동으로부터 약 30분 및 2시간 이내에 필요로 하는 환자에게 투여된다. 일부 실시 형태에서, 대상체로의 정맥 내 주입 속도는 약 2 내지 3분이다.

일부 실시 형태에서, 상기 입양 세포 치료법은 예를 들어 림프구 고갈 화학요법과 같은 하나 이상의 추가 암 치료와 조합하여 사용된다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 암이 있는 대상체는 본 명세서에 기재된 동결보존 배지에 제제화된 CAR-NK 세포 치료제의 투여 전에 림프구 고갈 화학요법을 투여받는다.

일부 실시 형태에서, CAR-NK 세포 치료제는 본 명세서에 기재된 바와 같이 동결보존되고 후속적으로 필요로 하는 환자에게 투여하기 전에 해동된다. 예컨대, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CAR-NK 세포 치료제는 본 명세서에 기재된 바와 같이 동결보존, 수송, 해동되고, 이를 필요로 하는 환자에게 투여된다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 상기 CAR-NK 세포 치료제는 본 명세서에 기재된 바와 같은 제형으로 동결보존되고 후속적으로 B- 세포 악성 종양을 치료하기 위한 환자에게 투여되기 전에 해동된다.

일부 실시 형태에서, 동결된 CAR-NK 세포 치료제는 본 명세서에 기재된 동결보존 매질에서 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 바이알(예를 들어, 50 ml AT 바이알)에서 동결되고, 동일한 바이알에서 -140℃ 내지 -196℃ 범위의 온도에서 환자가 있는 위치로 수송 또는 운송되어, 환자가 있는 위치에서 세포가 해동될 수 있고 바이알 어댑터가 달린 바이알(즉, 정맥으로 전달하기 위한 바이알)에 연결된 주사기를 사용하여 환자에게 직접 무균 방식으로 투여될 수 있도록 한다. 예컨대, 일부 실시 형태에서, 세포 치료제를 수송하는 방법은 (a) 본 명세서에 기재된 바와 같은 동결보존 매질에 CAR-NK 세포를 제공하는 단계; (b) CAR-NK 세포를 -80°C의 온도로 냉각시켜 포유동물 세포를 동결보존하는 단계; 및 (c) 동결보존된 포유동물 세포를 약 -20℃ 내지 약 -140℃ 이하의 온도에서 상이한 위치로 수송하는 단계를 포함한다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 상기 동결보존된 포유동물 세포는 -140℃ 이하의 온도로 유지되는 용기에서 상이한 위치로 수송된다. 일부 실시 형태에서, 상기 동결보존된 포유동물 세포는 -140℃ 내지 -196℃의 온도로 유지되는 용기에서 상이한 위치로 수송된다. 일부 실시 형태에서, 상기 동결보존된 포유동물 세포는 크라이오쉬퍼(cryoshipper)에서 상이한 위치로 수송된다. 일부 실시 형태에서, 상기 수송된 세포는 환자에게 투여될 때까지 크라이오쉬퍼에 저장될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 수송된 세포는 상이한 위치에서 -140℃ 이하의 온도에서 저장된다. 일부 실시 형태에서, 상기 수송된 세포는 상이한 위치에서 -140℃ 내지 -196℃의 온도에서 저장된다. 일부 실시 형태에서, 상기 수송된 세포는 상이한 위치에서 수령한 시점부터 향후 사용 시점까지 액체 질소 증기상에서 저장된다. 따라서, 저장은 액체 질소의 증기상에서 온도를 -140℃ 이하로 유지하는 임상 현장 냉동고 또는 탱크를 사용하여 수행될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 세포 치료제는 IL-15 및 iCaspase9를 추가로 포함하는 CD19-CAR-NK 세포의 집단이다. 일부 실시 형태에서, 상기 세포 치료제는 밀리리터당 약 6백만 내지 1억 2천만 개 세포의 농도로 용기에서 동결보존된다. 일부 실시 형태에서, 상기 세포 치료제는 밀리리터당 약 6백만 내지 1억 2천만 개 세포의 농도로 50 mL 용기에 동결보존된다. 일부 실시 형태에서, 상기 세포 치료제는 밀리리터당 약 3백만 내지 1억 5천만 개 세포의 농도로 50 mL 용기에 동결보존된다. 일부 실시 형태에서, 상기 세포 치료제는 밀리리터당 약 1백만 내지 2억 5천만 개 세포의 농도로 50 mL 용기에 동결보존된다. 일부 실시 형태에서, 상기 세포 치료제는 밀리리터당 약 1백만 내지 3억 5천만 개 세포의 농도로 50 mL 용기에 동결보존된다. 일부 실시 형태에서, 상기 세포 치료제는 밀리리터당 약 1백만 내지 5억 개 세포의 농도로 50 mL 용기에 동결보존된다.

일부 실시 형태에서, 상기 세포 치료제는 50 mL 용기에 약 20×10⁶및 100×10⁷ 개의 세포를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 세포 치료제는 50 mL 용기에 약 100×10⁶ 및 900×10⁶ 개의 세포를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 세포 치료제는 50 mL 용기에 약 50×10⁶ 개를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 세포 치료제는 50 mL 용기에 약 100×10⁶ 개의 세포를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 세포 치료제는 50 mL 용기에 약 200×10⁶ 개의 세포를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 세포 치료제는 50 mL 용기에 약 200×10⁶ 개의 세포를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 세포 치료제는 50 mL 용기에 약 300×10⁶ 개의 세포를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 세포 치료제는 50 mL 용기에 약 400×10⁶ 개의 세포를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 세포 치료제는 50 mL 용기에 약 500×10⁶ 개의 세포를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 세포 치료제는 50 mL 용기에 약 600×10⁶ 개의 세포를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 세포 치료제는 50 mL 용기에 약 700×10⁶ 개의 세포를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 세포 치료제는 50 mL 용기에 약 800×10⁶ 개의 세포를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 세포 치료제는 50 mL 용기에 약 900×10⁶ 개의 세포를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 세포 치료제는 50 mL 용기에 약 1000×10⁶ 개의 세포를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 세포 치료제는 50 mL 용기에 약 1500×10⁶ 개의 세포를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 세포 치료제는 50 mL 용기에 약 2000×10⁶ 개의 세포를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 세포 치료제는 50 mL 용기에 약 2500×10⁶ 개의 세포를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 세포 치료제는 50 mL 용기에 약 3000×10⁶ 개의 세포를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 세포 치료제는 50 mL 용기에 약 3500×10⁶ 개의 세포를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 세포 치료제는 50 mL 용기에 약 4000×10⁶ 개의 세포를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 세포 치료제는 50 mL 용기에 약 4500×10⁶ 개의 세포를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 세포 치료제는 50 mL 용기에 약 5000×10⁶ 개의 세포를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 상기 세포 치료제는 약 20 내지 45 mL의 충전 부피로 50 mL 용기에 담겨 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 세포 치료제는 약 36 mL의 충전 부피로 50 mL 용기에 담겨 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 세포 치료제는 NK 세포, T 세포 또는 B 세포와 같은 면역 세포이다. 일부 실시 형태에서, 상기 면역 세포는 하나 이상의 전이유전자, 예를 들어 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하도록 조작된다. 일부 실시 형태에서, 상기 세포는 CAR-NK+ 세포이다. 일부 실시 형태에서, 상기 세포 치료제는 CD19-CAR, IL-15 전이유전자 및 iCaspase9를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 세포 치료제는 50-ml 용기에 약 100×10⁶ 및 900×10⁶ 개의 CAR-NK+ 세포를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 존재하는 세포 치료제는 50-ml 용기에 담긴 200×10⁶ 개의 CAR-NK+ 세포이다. 일부 실시 형태에서, 존재하는 세포 치료제는 50-ml 용기에 담긴 300×10⁶ 개의 CAR-NK+ 세포이다. 일부 실시 형태에서, 존재하는 세포 치료제는 50-ml 용기에 담긴 400×10⁶ 개의 CAR-NK+ 세포이다. 일부 실시 형태에서, 존재하는 세포 치료제는 50-ml 용기에 담긴 500×10⁶ 개의 CAR-NK+ 세포이다. 일부 실시 형태에서, 존재하는 세포 치료제는 50-ml 용기에 담긴 600×10⁶ 개의 CAR-NK+ 세포이다. 일부 실시 형태에서, 존재하는 세포 치료제는 50-ml 용기에 담긴 700×10⁶ 개의 CAR-NK+ 세포이다. 일부 실시 형태에서, 존재하는 세포 치료제는 50-ml 용기에 담긴 800×10⁶ 개의 CAR-NK+ 세포이다. 일부 실시 형태에서, 존재하는 세포 치료제는 50 ml 용기에 담긴 900×10⁶ 개의 CAR-NK+ 세포이다.

수송된 세포 치료제는 본 명세서에 기재된 바와 같이 해동된 후 이를 필요로 하는 환자에게 투여될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 세포 치료제는 환자의 침상에서 해동된다. 일부 실시 형태에서, 상기 세포 치료제는 이를 필요로 하는 환자에게 투여하기 전에 세척되지 않는다.

일부 실시 형태에서, 수송된 세포 치료제는 상이한 위치에서 추가 저장을 위해 동결된 상태로 유지된다. 일부 실시 형태에서, 해동된 세포는 세포와 동결보존 용액을 분리하지 않고 이를 필요로 하는 대상체에게 도입된다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 해동된 세포는 사용 전에 세척되지 않는다. 해동된 세포 및 수반되는 동결보존 용액은 바람직하게는 대상체에 도입되기 전에 체온(즉, 약 37℃)으로 가온된다. 이러한 상황에서 세포 용량은 동결 전 세포 수를 기준으로 한다.

일부 실시 형태에서, 해동된 세포는 추가로 배양된다. 일부 실시 형태에서, 배양은 상기 세포를 배양기에 배치하는 단계; 완충 용액을 제거하는 단계; 및 완충 용액을 세포의 성장 및/또는 분화를 위해 설계된 배양 배지로 대체하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 세포는 배양기에서 약 6 내지 7 시간 동안 배양된다. 일부 실시 형태에서, 세포의 성장 및/또는 분화를 위해 설계된 배양 배지는 Kubota 배지 및/또는 세포 분화를 위한 호르몬 한정 배지(HDM)를 포함한다.

해동된 세포의 생존력은 해당 기술 분야에 공지된 다양한 방법을 사용하여 시험관 내 및 생체 내에서 평가될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 시험관 내 세포 생존력 시험은 트립판 블루 배제 분석을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상이한 동결보존 배지로 냉동된 해동 세포의 세포 생존력, 예컨대 유전자 발현을 평가하기 위해 RT-qPCR 등의 사용을 통한 다른 분석 방법이 사용될 수 있다. 해당 분야의 통상의 기술자는 달리 신선한 세포의 세포 생존력을 평가하기 위해 적용될 수 있는 해동된 세포의 생존력을 평가하는 임의의 분석 방법을 선택할 수 있다.

일반적으로, 생체 내 세포의 생존력은 생체 내 투여된 세포의 기능적 특징을 평가하여 평가할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 세포의 생체 내 생존력은 필요로 하는 대상체에 도입된 세포의 세포 수를 평가함으로써 평가될 수 있다. 세포를 추적하고 투여된 세포의 생존력을 결정하기 위한 다양한 방법이 해당 기술 분야에 공지되어 있다.

본 명세서에 기재된 동결보존 배지를 사용하는 동결보존 및 해동된 세포는 1차 세포 또는 신선한 세포 단리물이 사용될 수 있는 임의의 목적에 대해 세포를 사용할 수 있게 한다. 동결보존 및 해동된 세포는 높은 생존력(예를 들어, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 95% 초과)을 유지하고 이들의 자연 상태의 생리학적 특성을 보유하여 세포의 유전자 조작 및 예를 들어 입양 세포 치료법 적용예와 같은 세포 치료법 목적과 같은 다양한 적용예에 세포가 사용될 수 있게 한다.

CAR-NK 세포 투여

본 발명의 CAR 변형 NK 세포는 단독으로 투여되거나, 희석제 및/또는 다른 성분, 예컨대 IL-2 또는 기타 사이토카인 또는 세포 집단과 병용하여 약제학적 조성물로서 투여될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 하나 이상의 약제학적 또는 생리학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 조합하여 본 명세서에 기재된 바와 같은 표적 세포 집단을 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 완충액, 예컨대, 중성 완충된 식염수, 및 포스페이트 완충된 식염수 등; 탄수화물, 예컨대, 글루코스, 만노스, 수크로스 또는 덱스트란, 만니톨; 단백질; 폴리펩티드 또는 아미노산, 예컨대, 글리신; 항산화제; 킬레이팅제, 예컨대, EDTA 또는 글루타티온; 아쥬반트 (예컨대, 알루미늄 하이드록시드); 및 보존제를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 조성물은 정맥 내 투여용으로 제제화된다.

본 발명의 약제학적 조성물은 치료(또는 예방)하려는 질병에 적절한 방식으로 투여될 수 있다. 투여의 수량 및 빈도는 환자의 병태, 환자의 질환의 유형 및 중증도의 이러한 인자에 의해 결정될 것이나, 적절한 투여량은 임상 시험에 의해 결정될 수 있다.

"면역학적 유효량", "항종양 유효량", "종양 억제 유효량", 또는 "치료량"이 지시된 경우, 투여하고자 하는 본 발명의 조성물의 정확한 양은 연령, 체중, 종양 크기, 감염 또는 전이 정도, 환자(대상체)의 상태의 개인차를 고려하여 의사가 결정할 수 있다. 본 명세서에 기재된 NK 세포를 포함하는 약제학적 조성물은 일반적으로 약 10⁴ 내지 10⁹ cells/kg 체중, 예컨대 약 10⁵ 내지 10⁶cells/kg 체중의 용량으로 투여될 수 있다고 말할 수 있다. NK 세포 조성물은 또한 이들 용량으로 다회 투여될 수 있다. 상기 세포는 면역요법에서 일반적으로 공지된 주입 기법을 사용하여 투여될 수 있다. 특정 환자에 대한 최적 용량 및 치료 섭생은 환자를 질환의 징후에 대해 모니터링하고, 따라서 치료를 조정함으로써 약학 분야의 통상의 기술자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.

대상 조성물의 투여는 에어로졸 흡입, 주사, 섭취, 수혈, 착상 또는 이식을 포함하는 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 본 명세서에 기재된 조성물은 피하, 피내, 종양 내, 결절 내, 골수 내, 근육 내, 정맥 내(i.v.) 주사 또는 복강 내로 환자에 투여될 수 있다. 일 실시 형태에서, 본 발명의 NK 세포 조성물은 피내 또는 피하 주사에 의해 환자에게 투여된다. 또 다른 실시 형태에서, 본 발명의 NK 세포 조성물은 바람직하게는 i. v. 주사에 의해 투여된다. NK 세포의 조성물은 종양, 림프절 또는 감염 부위에 직접 주입될 수 있다.

본 발명의 특정 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 활성화 및 증식된 세포는 항바이러스 치료제, 시도포비르 및 인터루킨-2, 시타라빈(ARA-C라고도 알려짐) 또는 나탈리지트맙 치료제 또는 에파이주맙 치료제와 같은 제제를 사용한 치료를 포함하되 이에 제한되지 않는 임의의 수의 관련 치료 방법과 함께(예컨대, 이전, 동시 또는 이후에) 환자에게 투여된다. 추가 실시 형태에서, 본 발명의 NK 세포는 화학요법, 방사선요법, 면역억제제, 예컨대 사이클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 미코페놀레이트, 및 FK506, 항체, 또는 다른 면역제거제, 예컨대 CAM PATH, 항CD3 항체 또는 기타 항체 치료제, 사이톡신, 플리다리빈, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코페놀산, 스테로이드, FR901228, 사이토카인, 및 방사선 조사와 병용될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 세포 조성물은 골수 이식, 플루다라빈과 같은 화학요법제를 사용한 T 세포 절제 요법, 외부 빔 방사선 요법(XRT), 사이클로포스파미드 또는 OKT3 또는 CAMPATH와 같은 항체와 함께(예컨대, 이전에, 동시에 또는 이후에) 환자에 투여된다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 세포 조성물은 CD20과 반응하는 약제, 예컨대, 리툭산과 같은 B 세포 절제 요법 후에 투여된다. 예컨대, 일부 실시 형태에서, 대상체는 고용량 화학요법에 이어 말초 혈액 줄기 세포 이식을 포함하는 표준 치료를 받을 수 있다. 특정 실시 형태에서, 대상체는 상기 이식 후 본 발명의 증식된 면역 세포의 주입을 받는다. 추가 실시 형태에서, 증식된 세포는 수술 전 또는 후에 투여된다.

환자에게 투여되는 상기 치료법의 투여량은 치료 중인 병태의 정확한 특성 및 치료를 받는 사람에 따라 달라진다. 인간 투여를 위한 용량의 스케일링은 해당 분야에서 인정되는 관행에 따라 수행될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 약 1 내지 약 100 mg의 용량이 성인 환자에게 투여된다. 일부 실시 형태에서, CAR-NK 세포 치료제는 1일 내지 30일의 기간 동안 매일 투여된다. 일부 실시 형태에서, 하루당 1 내지 10 mg이 매일 투여된다. 일부 실시 형태에서, 하루당 약 40 mg이 투여된다.

실시예

본 발명의 다른 특질, 목적 및 이점은 하기 실시예에서 명확해진다. 다만, 하기 실시예가 본 발명의 실시 형태를 지시하기는 하지만, 제한이 아닌 단지 예시로서 제공되는 것임이 이해되어야 한다. 본 발명의 범위 내에서 다양한 변경 및 변형은 하기 실시예로부터 해당 기술 분야의 통상의 기술자에게 명백해질 것이다.

실시예 1. iPS 세포의 HP 세포 벌크로의 분화

iPS 세포주인 FfI-01s04 세포주는 건강한 개체의 말초 혈액 단핵 세포로부터 유래하였다. StemFit 완전 배지에 분산된 FfI-01s04 세포를 저산소(5% O₂) 조건("제0일") 하에서 초저(ultra-low) 접착 처리된 6웰 플레이트에 6 x 10⁵ 개 세포/웰로 시딩하였다. StemFit 완전 배지에는 10 μM의 CHIR99021 및 50 μM의 Y-27632가 포함되었다. 다음 날(즉, 제1일), FfI-01s04 세포를 BMP4(50 ng/mL), VEGF(50 ng/ml), bFGF(50 ng/mL), 및 아스코르브산 2-포스페이트(50 μg/mL)를 함유하는 조혈 전구 세포(HPC) 분화 배지에 분산시켰다. HPC 유도 배지 배지에는 인간 인슐린(10 μg/mL), 인간 트랜스페린(5.5 μg/mL), 아셀렌산나트륨(6.7 ng/mL), L-글루타민(2 mM) 및 α-모노티오글리세롤(0.4 mM)이 보충된 StemPro34가 포함되었다. 제2일에, SB431542(배지 중 6 μM)를 배양 배지(즉, 세포를 함유하는 HPC 분화 배지)에 첨가하고, 세포를 2일 동안 배양하였다. 제4일에, 세포를 VEGF(50 ng/mL), bFGF(50 ng/mL), SCF(50 ng/mL), 및 아스코르브산 2-포스페이트(50 μg/mL)를 함유하는 다른 배지에 재분산시키고, 추가로 3일 동안 배양하였다. 제7일에, 세포를 VEGF(50 ng/mL), bFGF(50 ng/mL), SCF(50 ng/mL), 아스코르브산 2-포스페이트(50 μg/mL), TPO(30 ng/mL) 및 Flt3L(10 ng/mL)을 함유하는 다른 배지에 노출시키고, 상기 배지를 사용하여 추가로 7일 동안 배양하였다. 상기 7일의 배양 기간 동안 매 2 내지 3일마다 배지를 변경하였다.

실시예 2. HP 세포 벌크의 CD4- 세포를 포함하는 집단으로의 분화

제14일에, 임의의 세포 단리도 거치지 않고 실시예 1로부터 수득된 세포 집단("HP 세포 벌크")을 15 cm 디쉬에 3.12 x 10⁶ 개 세포/디쉬로 시딩하고, 5% O₂하에 37^oC에서 배양하였다. 다양한 시딩 밀도가 사용될 수 있으며, 전술한 시딩 밀도는 일 실시 형태임에 유의한다. 각 15 cm 디쉬를 rh-DLL4/Fc 키메라(Sino Biological) 및 RetroNectin(Takara Bio Inc)으로 코팅하였다. 상기 배양 기간 동안 매 2 내지 3일마다 배지를 변경하였다. 15% FBS, 4 mM L-글루타민, 100 U/mL 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신, 55 μM 2-메르캅토에탄올, 50 μg/mL 아스코르브산 2-포스페이트, 10 μg/mL 인간 인슐린, 5.5 μg/mL 인간 트랜스페린, 6.7 ng/mL 아셀렌산나트륨, 50 ng/mL SCF, 50 ng/mL IL-7, 50 ng/mL Flt3L, 100 ng/mL TPO, 15 μM SB203580, 30 nM SDF-1α가 보충된 MEMα(Thermo Fisher Scientific (Gibco))를 배지로 사용하여 상기 세포를 배양하였다. 제21일에, 상기 세포를 hDLL4/RetroNectin으로 새로 코팅된 새로운 15 cm 디쉬에 계대배양하였다. 제28일에, 상기 세포를 hDLL4/RetroNectin으로 새로 코팅된 새로운 15 cm 디쉬에 추가로 계대배양하였다. 제35일에, 특히, CD4- 세포를 포함한 모든 세포를 수확하였다.

실시예 3. 벌크의 NK 세포 벌크로의 분화

제35일에, CD4- 세포, 즉 어느 세포 단리 단계도 거치지 않고 실시예 2로부터 수득된 세포를 포함하는 집단을 48 웰 플레이트에 1 x 10⁶ 개 세포/웰로 시딩하고, 5% CO₂하에 37°C에서 3일 동안 배양하였다. 15% FBS, 4 mM L-글루타민, 100 U/mL 페니실린, 100 ng/mL 스트렙토마이신, 50 μg/mL 아스코르브산 2-포스페이트, 10 μg/mL 인간 인슐린, 5.5 μg/mL 인간 트랜스페린, 6.7 ng/mL 아셀렌산나트륨, 500 ng/mL 항CD3 항체(UCHT1), 10 ng/mL IL-2, 및 10 ng/mL IL-7이 보충된 MEMα 배지를 배양 배지로 사용하였다. 제38일에, 세포를 15% FBS, 4 mM L-글루타민, 100 U/mL 페니실린, 100 ng/mL 스트렙토마이신, 50 μg/mL 아스코르브산 2-포스페이트, 10 μg/mL 인간 인슐린, 5.5 μg/mL 인간 트랜스페린, 6.7 ng/mL 아셀렌산나트륨, 10 ng/mL IL-2, 및 10 ng/mL IL-7이 보충된 다른 MEMα 배지에 분산시키고, 이를 배양 배지로 사용하였다. 제42일에, NK 세포("NK 세포 벌크")를 포함하는 모든 세포를 수확하였다.

실시예 4. 벌크의 NK 세포 벌크로의 분화 ? CD4- 세포 농축

일부 실시 형태에서, 실시예 2로부터 수득된 세포의 집단은 CD4-인 세포를 농축하기 위해 처리된다. 이는 예컨대, CD4+ 세포를 고갈시키는 방법(즉, CD4+ 세포 고갈)을 사용하여 수행할 수 있다. 예시적인 방법들이 이하에서 논의된다.

CD4+ 세포 고갈

일부 실시 형태에서, 제35일에, 실시예 2에서 수득된 집단에서 CD4 항원을 발현하는 세포를 고갈시킨다. 구체적으로, 실시예 2에서 수득된 세포 집단에 세포 고갈법, 예컨대 형광 활성화 세포 분류(FACS) 또는 자기 기반 분류 방법(MACS)을 적용하여 CD4 항원을 발현하는 집단의 세포를 고갈시키고, 이를 통해 실시예 2에서 수득된 세포 집단에서 CD4+ 세포를 고갈시킨다. 이러한 방식으로, CD4- 세포가 풍부한 세포들을 수득한다.

CD4+ 세포 고갈 후, 농축된 CD4- 세포를 48웰 플레이트에 1 x 10⁶ 개 세포/웰로 시딩하고, 5% CO₂하에 37°C에서 3일 동안 배양한다. 15% FBS, 4 mM L-글루타민, 100 U/mL 페니실린, 100 ng/mL 스트렙토마이신, 50 μg/mL 아스코르브산 2-포스페이트, 10 μg/mL 인간 인슐린, 5.5 μg/mL 인간 트랜스페린, 6.7 ng/mL 아셀렌산나트륨, 500 ng/mL 항CD3 항체(UCHT1), 10 ng/mL IL-2, 및 10 ng/mL IL-7이 보충된 MEMα 배지를 배양 배지로 사용한다. 제38일에, 세포를 15% FBS, 4 mM L-글루타민, 100 U/mL 페니실린, 100 ng/mL 스트렙토마이신, 50 μg/mL 아스코르브산 2-포스페이트, 10 μg/mL 인간 인슐린, 5.5 μg/mL 인간 트랜스페린, 6.7 ng/mL 아셀렌산나트륨, 10 ng/mL IL-2, 및 10 ng/mL IL-7이 보충된 다른 MEMα 배지에 분산시키고, 이를 배양 배지로 사용한다. 제42일에, NK 세포("NK 세포 벌크")를 포함하는 모든 세포를 수확한다.

실시예 5. 유세포 분석기 분석

이후, NK 세포 벌크를 표 1에 나열된 항체 세트로 염색하고, 유세포 분석기로 분석하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, CD3 음성 NK 세포 벌크의 일부는 CD56("CD56+/CD3- 세포")을 발현하였다. 상기 CD56+/CD3- 세포는 자연살해 세포(NK 세포)이다. 따라서, CD56+/CD3- 세포는 iPSCs(FfI-01s04 세포주)로부터 유래한 HPC 벌크로부터 제조되었다. 상기 과정에서 수득된 CD56을 발현하는 세포는 때때로 iPS NK 세포로도 지칭된다. 유세포 분석에 사용된 항체는 표 1에 제시된다.

항CD3 항체	CD3 BioLegend APC/Cy7
항CD56 항체	CD56 Biolegend PE

실시예 6. 단일 세포 RNA 서열(scRNAseq) 분석

NK 세포 벌크 집단(즉, 실시예 3 또는 실시예 4에서 수득된 세포)에서 상이한 세포 유형을 확인하기 위해, 비선형 차원 축소 기법(단일 세포 RNA-seq(scRNAseq)을 기반으로 하는 균일 매니폴드 근사 및 투영법(uniform manifold approximation 및 projection, UMAP)을 적용하였다.

NK 세포 벌크로부터의 수만 개의 세포는 제네위즈(Genewiz)의 IIumina NextSeq 500으로 단일 세포 RNA-시퀀싱이 수행되었다. SingleR 알고리즘 및 수동 클러스터 라벨링을 사용하여, 이벤트를 PBMC 시료에서 4가지 광범위한 세포 집단 - 단핵구, B 세포, NK 세포 및 T 세포로 분류하였다. 10X Genomics로부터 자유롭게 이용 가능한, PBMC의 데이터 세트를 데이터 분석을 위한 대조군으로 사용하였다.

도 2에 나타낸 바와 같이, NK 세포 벌크 내 세포의 약 75%는 NK 세포로 확인된 반면, NK 세포 벌크 내 세포의 약 25%는 T 세포로 확인되었다. 따라서, NK 세포 벌크는 단일 세포 RNA-시퀀싱에 의한 mRNA 프로파일링을 기반으로 NK 세포 및 T 세포 둘 다를 포함하였다.

실시예 7. CAR-NK 세포 제조

NK 세포는 하나 이상의 CAR을 발현하도록 추가로 변형되었다. NK 세포의 변형은 (1) 항CD19 CAR 유전자 및 IL-15Rα/IL-15 유전자를 합성하는 단계; (2) 항CD19 CAR 유전자 및 IL-15Rα/IL-15 유전자를 함유하는 레트로바이러스 벡터를 제조하는 단계; 및 (3) 항CD19 CAR 유전자 및 IL-15Rα/IL-15 유전자를 함유하는 레트로바이러스 벡터로 NK 세포를 형질도입하는 단계를 포함한다.

CAR/IL15-NK 세포 제조

항CD19 CAR 유전자는 표 2에나타낸 바와 같이 N-말단부터 배열되도록 디자인된 올리고펩티드를 합성하여 제조하였다.

N-말단으로부터의 서열	유전자	아미노산 수
1	면역글로불린 중쇄의 리드 서열	22
2	항CD19 항체(FMC60) 경쇄의 가변 도메인	104
3	GGGGS 링커	15
4	항-CD19 항체(FMC60) 중쇄의 가변 도메인	120
5	CD8 유래된 서열(막관통 도메인 함유)	83
6	4-1BB의 세포 내 도메인	47
7	CD3 제타의 세포 내 도메인	112

항CD19 CAR는 WO2014/153270호에 따라 구축되었으며, 이의 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.

IL-15Rα/IL-15 유전자의 제조

IL-15Rα/IL-15 유전자는 N-말단부터 배열되도록 디자인된 올리고펩티드를 합성하여 제조하였다. IL-15Rα/IL-15는 Mortier 등, 2006, The Journal of Biological Chemistry, Vol 281, No 3, 페이지 1612-1619, 2006년 1월 20일; Chertova 등, The Journal of Biological Chemistry, Vol. 288, No. 25, 페이지 18093-18103, 2013년 6월 21일; 및 Rowley 등, Eur J Immunol, 2009년 2월; 39(2):491-506에 따라 구축되었으며, 이들 각각은 이의 전문이 참조로 포함된다.

N-말단으로부터의 서열	유전자	아미노산 수
1	인간 IL-2의 리드 서열	23
2	인간 IL-15의 C-말단 서열	114
3	GGGGS 링커	24
4	인간 IL-15RA의 C-말단 서열	239

항CD19 CAR 유전자를 함유하는 레트로바이러스 벡터의 제조

항CD19 CAR 유전자는 pMY 레트로바이러스 벡터의 다중-클로닝 부위에 통합시켰다. 레트로바이러스 벡터 생산을 위해, FRY-RD18 세포를 사용하여 레트로바이러스 벡터를 생성하였다.

IL-15Rα/IL-15 유전자를 함유하는 레트로바이러스 벡터의 제조

IL-15Rα/IL-15 유전자는 다른 pMY 레트로바이러스 벡터의 다중 클로닝 부위에 통합시켰다. 레트로바이러스 벡터 생산을 위해, FRY-RD18 세포를 사용하여 레트로바이러스 벡터를 생성하였다.

항-CD19 CAR 유전자 및 IL-15Rα/IL-15 유전자의 iPS NK 세포로의 형질도입

iPS NK 세포는 항CD19 CAR 유전자를 함유하는 레트로바이러스 벡터 및 IL-15Rα/IL-15 유전자를 함유하는 레트로바이러스 벡터로 형질도입되어 항CD19 CAR를 발현하는 iPS NK 세포("iNK-CAR19")를 생성하였다.

실시예 8. iNK-CAR19의 생체 내 항종양 활성

루시퍼라제를 발현하는 Nalm6 세포(ATCC; 암세포)(5x 10⁵ 개 세포)를 꼬리 정맥을 통해 NOD/Shi-scid, IL-2R 감마 널 마우스("NSG 마우스")에 이식하였다. 4 내지 5주령의 수컷 NSG 마우스는 Jackson Laboratory에서 공급되었다. Nalm6 세포의 이식 4일 후, 0.2 ml PBS에 분산된 iNK-CAR19(1x 10⁷ 개 세포) 또는 세포 없이 0.2 ml의 PBS만을 꼬리 정맥을 통해 Nalm6 이식된 NSG 마우스에 투여하였다. iNK-CAR19 세포 또는 PBS의 투여 후, 꼬리 정맥을 통해 마우스에 루시페린을 투여하였다. 루시퍼라제 활성은 IVIS 이미징 시스템(PerkinElmer)을 사용하여 70일 이상 동안 측정되었다.

도 3은 미처리(완충액만으로 처리됨) 및 iNK-CAR19 세포 처리된 Nalm6 이식 NSG 마우스의 항종양 효능을 나타낸다. 3일 직후에, D-PBS 완충액으로 처리된 모든 마우스에서 발광(luminescence)이 검출되었다. 대조적으로, 다른 마우스(일차 CAR T 세포 또는 iNK-CAR 세포로 처리됨)에서는 투여 후 28일까지 발광이 검출되지 않았고, iNK-CAR19 세포로 처리된 마우스에서는 처리 후 70일에도 발광이 검출되지 않았다. 따라서, iNK-CAR19 세포는 Nalm6 암세포에 대한 향상된 독성을 명확히 입증하였다.

등가물 및 범위

해당 분야의 통상의 기술자는 통상적인 실험을 통해 본 명세서에 기재된 본 발명의 구체적인 실시 형태에 대한 다수의 등가물을 인식하거나 알아낼 수 있을 것이다. 본 발명의 범위는 상기 설명에 의해 제한되는 것으로 의도되지 않으며, 하기 청구범위에 제시된 바와 같다.

Claims

NK 세포가 풍부한 세포 집단을 생산하는 방법으로서,
(A) 제1 조건 세트하에서 다능성 줄기 세포의 집단을 배양하여 적어도 20%의 CD34+ HPC(HPC 벌크)를 포함하는 세포 집단을 생성하는 단계; 및
(B) 상기 제1 조건 세트를 제2 조건 세트로 변경하여 적어도 5%의 CD4- 세포를 포함하는 세포 집단을 생성하는 단계; 및
(C) 상기 제2 조건 세트를 제3 조건 세트로 변경하여 NK 세포가 풍부한 세포 집단을 생성하는 단계를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 방법은 단리 단계 없이 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 단리된 세포를 단계 (C)의 제3 조건 세트와 접촉시키기 전, 단계(B) 이후에 CD4- 세포를 단리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제3항에 있어서, 상기 CD4- 세포를 단리하는 단계는 상기 세포 집단으로부터 CD4+ 세포를 제거하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
NK 세포가 풍부한 세포 집단을 생산하는 방법으로서,
(A) 제1 조건 세트하에서 다능성 줄기 세포의 집단을 배양하여 적어도 20%의 CD34+ HPC(HPC 벌크)를 포함하는 세포 집단을 생성하는 단계; 및
(B) 상기 제1 조건 세트를 제2 조건 세트로 변경하여 적어도 5%의 CD4- 세포를 포함하는 세포 집단을 생성하는 단계; 및
(C) 상기 제2 조건 세트를 제3 조건 세트로 변경하여 NK 세포가 풍부한 세포 집단을 생성하는 단계를 포함하고, 상기 방법은 단리 단계 없이 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 5%의 CD4- 세포를 포함하는 세포 집단은 적어도 5%의 CD4+ 세포를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NK 세포가 풍부한 세포 집단은 적어도 30%의 NK 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (B)에서 생성된 세포 집단은 적어도 10%, 15% 또는 20%의 CD4- 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (B)의 CD4- 세포는 CD8+ 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (B)의 CD4- 세포는 CD8- 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (B)에서 생성된 세포 집단은 20 내지 55%의 CD4-/CD8+ 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제11항에 있어서, 상기 생성된 세포 집단은 25 내지 55%의 CD4-/CD8- 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 NK세포는 CD56+/CD3- 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다능성 줄기 세포는 유도 다능성 줄기 세포(iPSC)인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 조건 세트는 골 형성 단백질-4(BMP4), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF), 아스코르브산, Flt3 리간드(Flt3L), 트롬보포이에틴(TPO) 및 TGFβ 억제제로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 포함하는 배양 배지를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제15항에 있어서, 상기 제1 조건 세트는 5 ng/mL 내지 500 ng/mL 농도의 BMP4를 포함하는 배양 배지를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제16항에 있어서, 상기 BMP4는 50 ng/mL의 농도인 것을 특징으로 하는 방법.
제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 조건 세트는 5 ng/mL 내지 500 ng/mL 농도의 VEGF를 포함하는 배양 배지를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제18항에 있어서, 상기 VEGF는 약 50 ng/mL의 농도인 것을 특징으로 하는 방법.
제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 조건 세트는 5 ng/mL 내지 500 ng/mL 농도의 bFGF를 포함하는 배양 배지를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제20항에 있어서, 상기 bFGF는 50 ng/mL의 농도인 것을 특징으로 하는 방법.
제15항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 조건 세트는 5 μg/mL 내지 500 μg/mL 농도의 아스코르브산을 포함하는 배양 배지를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제22항에 있어서, 상기 아스코르브산은 50 μg/mL의 농도인 것을 특징으로 하는 방법.
제15항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 조건 세트는 1 ng/mL 내지 100 ng/mL 농도의 Flt3L을 포함하는 배양 배지를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제24항에 있어서, 상기 Flt3L은 50 ng/mL의 농도인 것을 특징으로 하는 방법.
제15항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 조건 세트는 1 ng/mL 내지 200 ng/mL 농도의 TPO를 포함하는 배양 배지를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제26항에 있어서, 상기 TPO는 100 ng/mL의 농도인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제27항 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 조건 세트는 아스코르브산, 줄기 세포 인자(SCF), IL-7, Flt3L, 트롬보포이에틴(TPO), p38 억제제 및 SDF-1로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 포함하는 배양 배지를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제28항에 있어서, 상기 제2 조건 세트는 5 μg/mL 내지 500 μg/mL 농도의 아스코르브산을 포함하는 배양 배지를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제29항에 있어서, 상기 아스코르브산은 50 μg/mL의 농도인 것을 특징으로 하는 방법.
제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 조건 세트는 5 ng/mL 내지 100 ng/mL 농도의 SCF를 포함하는 배양 배지를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제31항에 있어서, 상기 SCF는 50 ng/mL의 농도인 것을 특징으로 하는 방법.
제28항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 조건 세트는 1 ng/mL 내지 100 ng/mL 농도의 IL-7을 포함하는 배양 배지를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제33항에 있어서, 상기 IL-7은 50 ng/mL의 농도인 것을 특징으로 하는 방법.
제28항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 조건 세트는 1 ng/mL 내지 100 ng/mL 농도의 Flt3L을 포함하는 배양 배지를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제35항에 있어서, 상기 Flt3L은 50 ng/mL의 농도인 것을 특징으로 하는 방법.
제28항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 조건 세트는 1 ng/mL 내지 200 ng/mL 농도의 TPO를 포함하는 배양 배지를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제37항에 있어서, 상기 TPO는 100 ng/mL의 농도인 것을 특징으로 하는 방법.
제28항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 조건 세트는 0.5 μM 내지 100 μM 농도의 p38 억제제를 포함하는 배양 배지를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제39항에 있어서, 상기 p38 억제제는 SB203580인 것을 특징으로 하는 방법.
제40항에 있어서, 상기 SB203580은 15 μM의 농도인 것을 특징으로 하는 방법.
제28항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 조건 세트는 10 ng/mL 내지 100 ng/mL 농도의 SDF-1을 포함하는 배양 배지를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제42항에 있어서, 상기 SDF-1은 30 nM의 농도인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제3 조건 세트는 CD3 활성화제, IL-2 및 IL-7로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 포함하는 배양 배지를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제44항에 있어서, 상기 제3 조건 세트는 1 ng/mL 내지 100 ng/mL 농도의 IL-2를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제45항에 있어서, 상기 IL-2은 10 ng/mL의 농도인 것을 특징으로 하는 방법.
제44항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제3 조건 세트는 1 ng/mL 내지 100 ng/mL 농도의 IL-7을 포함하는 배양 배지를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제47항에 있어서, 상기 IL-7은 10 ng/mL의 농도인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 각각의 배양 단계는 약 5%의 산소에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 각각의 배양 단계는 14% 초과의 산소에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 각각의 배양 단계는 대기 중 산소에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 각각의 배양 단계는 5% 미만의 산소에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 조건 세트에서 다능성 줄기 세포를 배양하여 HPC 벌크를 수득하는 단계는 10일 초과 동안 지속되는 것을 특징으로 하는 방법.
제53항에 있어서, 상기 제1 조건 세트에서 다능성 줄기 세포를 배양하여 HPC 벌크를 수득하는 단계는 11일 내지 15일 동안 지속되는 것을 특징으로 하는 방법.
제54항에 있어서, 상기 제1 조건 세트에서 다능성 줄기 세포를 배양하여 HPC 벌크를 수득하는 단계는 14일 동안 지속되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 iPSC는 말초 혈액 단핵 세포로부터 수득되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 농축 단계 없이 생산된 세포의 적어도 약 50%, 55%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% 또는 그 이상은 CD56+/CD3- NK 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제57항에 있어서, 상기 생산된 세포의 약 25% 미만은 CD3+ 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제57항 또는 제58항에 있어서, 상기 생산된 세포의 백분율은 유세포 분석에 의해 결정되는 것을 특징으로 하는 방법.
제57항 또는 제58항에 있어서, 상기 생산된 세포의 백분율은 단일 세포 RNA 시퀀싱(scRNAseq)에 의해 결정되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, CD56+/CD3- 세포를 단리하는 단계를 더 포함하는 방법.
제3항, 제4항 및 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리 단계는 형광 활성화 세포 분류(FACS) 또는 자기 분류를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NK 세포는 하나 이상의 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 유전적으로 변형된 것을 특징으로 하는 방법.
제63항에 있어서, 상기 항원은 CD19인 것을 특징으로 하는 방법.
제63항 또는 제64항에 있어서, 상기 NK세포는 IL-15Rα/IL-15 복합체를 발현하도록 추가로 유전적으로 변형된 것을 특징으로 하는 방법.
유도 다능성 줄기 세포(iPSC) 유래 NK세포를 생산하는 방법으로서,
(1) 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF), 및 아스코르브산으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 포함하는 배지를 포함하는 제1 조건 세트에서 iPSC를 배양하여 적어도 20%의 CD34+ HPC(HPC 벌크)를 포함하는 집단을 수득하는 단계;
(2) 아스코르브산, p38 억제제 및 SDF-1 중 하나 이상을 포함하는 배양 배지를 포함하는 제2 조건 세트에서 단계 (1)에서 수득된 HPC 벌크를 배양하여 적어도 5%의 CD4- 세포를 포함하는 세포 집단을 수득하는 단계; 및
(3) CD3 활성화제, IL-2 및 IL-7로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 포함하는 배양 배지를 포함하는 제3 조건 세트에서 단계 (2)에서 수득된 세포 집단을 배양하는 단계를 포함하는 방법.
유도 다능성 줄기 세포(iPSC) 유래 NK세포를 생산하는 방법으로서,
(1) 아스코르브산, p38 억제제 및 SDF-1 중 하나 이상을 포함하는 배양 배지를 포함하는 제2 조건 세트에서 조혈 전구 세포(HPC 벌크)를 포함하는 벌크 세포 집단을 배양하여 적어도 5%의 CD4- 세포를 포함하는 세포 집단을 수득하는 단계;
(2) 단계 (1)에서 수득된 CD4- 세포를 단리하는 단계; 및
(3) CD3 활성화제, IL-2 및 IL-7로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 포함하는 NK 유도 배지에서 상기 단리된 CD4- 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법.
제66항 또는 제67항에 있어서, 상기 단계 (1)에서 수득된 세포 집단 내 세포의 약 15 내지 30%는 CD4- 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제68항에 있어서, 상기 단계 (1)에서 수득된 세포 집단 내 세포의 약 20%는 CD4- 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CD4- 세포를 포함하는 세포 집단은 CD4-/CD8- 세포 및 CD4-/CD8+ 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제70항 중 어느 한 항의 방법을 사용하여 생산된 NK 세포 집단.
제71항에 있어서, 상기 NK 세포 집단은 동결보존 배지에서 동결보존되는 것을 특징으로 하는 NK 세포 집단.
전체 다능성 줄기 세포 유래 CD56+ 세포의 적어도 60%의 비율로 다능성 줄기 세포 유래 CD56+/CD3- 세포를 포함하는 미분류 세포 집단.
제73항에 있어서, 상기 미분류 세포 집단 내 세포의 25% 미만은 CD3+ 세포인 것을 특징으로 하는 미분류 세포 집단.
제73항 또는 제74항에 있어서, 상기 미분류 세포 집단 내 세포의 5% 미만은 단핵구인 것을 특징으로 하는 미분류 세포 집단.
제73항 또는 제74항에 있어서, 상기 미분류 세포 집단 내 세포의 5% 미만은 B 세포인 것을 특징으로 하는 미분류 세포 집단.
제73항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미분류 세포 집단 내 세포의 백분율은 유세포 분석에 의해 결정되는 것을 특징으로 하는 미분류 집단.
제73항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포의 백분율은 단일 세포 RNA 시퀀싱(scRNAseq)에 의해 결정되는 것을 특징으로 하는 미분류 집단.
세포 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제78항 중 어느 한 항의 NK 세포를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
제79항에 있어서, 상기 대상체는 암이 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제80항에 있어서, 상기 암은 백혈병 또는 림프종인 것을 특징으로 하는 방법.
CD34+ 조혈 전구 세포(HPC)를 포함하는 세포 집단을 생산하는 방법으로서, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF) 및 아스코르브산으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 포함하는 배지를 포함하는 제1 조건 세트에서 다능성 줄기 세포 집단을 배양하여 CD34+ HPC(HPC 벌크)를 포함하는 집단을 수득하는 단계를 포함하는 방법.
제82항의 방법에 의해 생산된 HPC를 포함하는 세포 집단.
제83항에 있어서, 상기 세포 집단은 적어도 20%의 CD34+ 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 집단.