WO2020196784A1 - 共焦点顕微鏡ユニット及び共焦点顕微鏡 - Google Patents

共焦点顕微鏡ユニット及び共焦点顕微鏡 Download PDF

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WO2020196784A1
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fluorescence
subunit
mirror
confocal microscope
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慈郎 山下
康行 田邊
俊輔 松田
寺田　浩敏
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浜松ホトニクス株式会社
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Definitions

  • the present disclosure relates to a confocal microscope unit and a confocal microscope that constitute a confocal microscope.
  • a confocal microscope capable of obtaining an optical tomographic image of an observation target specimen with high resolution.
  • a microscope connection port connected to a microscope, a stimulation unit that irradiates a sample with light, an observation unit that detects light emitted from the sample, a microscope, a stimulation unit, and an observation unit are described.
  • a microscope connection unit including an optical path synthesizer that synthesizes optical paths that are optically connected is disclosed.
  • This microscope connection unit uses the same optical system that guides light emitted from multiple light sources, a dichroic mirror for detecting the fluorescence generated in response to each of multiple wavelengths, a confocal pinhole, and a photomultiplier tube. It is held in the observation unit of. In such a configuration, by using excitation light of a plurality of wavelengths and detecting the fluorescence generated accordingly, imaging in a plurality of wavelength regions can be realized with the same device.
  • the laser scanner apparatus described in Patent Document 2 below is also known. According to this laser scanner device, two laser beams having different wavelengths focused on a sample are spatially separated, and two emission beams induced by these laser beams are also spatially separated for two detections. Guided toward the vessel.
  • the wavelength distribution of fluorescence emitted by a fluorescent substance is generally wide, when observing a sample containing a plurality of fluorescent substances, the wavelength distribution of fluorescence emitted from each fluorescent substance may overlap.
  • the fluorescence emitted from such a sample there is a problem that not only the fluorescence from the target fluorescent substance but also the fluorescence from other fluorescent substances is detected by the same detector. Generally, such a problem is called Bleed Through.
  • bleed-through is reduced by spatially separating and detecting a plurality of fluorescences using a wedge-shaped dichroic mirror, but confocal using a scan mirror is used. Difficult to apply to microscopes.
  • the embodiment has been made in view of such a problem, and an object of the present invention is to provide a confocal microscope unit that enables fluorescence imaging with less bleed-through in a plurality of wavelength regions by a simple configuration.
  • the cofocal microscope unit is a cofocal microscope unit that constitutes a cofocal microscope by being attached to a connection port of a microscope having a microscope optical system, and outputs a first excitation light.
  • a light source a first aperture member that limits the light beam of the first fluorescence generated from the sample to be observed in response to the first excitation light, and a first aperture member that detects the first fluorescence that has passed through the first aperture member.
  • a second subsystem having a second light detector that detects the second fluorescence that has passed through the second aperture member, and the excitation light output from the first and second subunits are combined with the microscope optical system.
  • the first and second subsystems are provided with a main housing in which the second subunit is fixed, and the first and second subunits are scanned by the angle of incidence of the first excitation light on the scan mirror. It is arranged in the main housing so as to deviate from the incident angle of the second excitation light on the mirror by a predetermined angle.
  • the first excitation light output from the first subunit is scanned onto the sample via the scan mirror, and the first fluorescence generated from the sample accordingly scans the scan mirror. It is incident into the first subunit via the image, and the image is formed on the first diaphragm member in the first subunit and detected by the first photodetector.
  • the second excitation light output from the second subunit is scanned onto the sample via the scan mirror, and the second fluorescence generated from the sample accordingly passes through the scan mirror. It is incident in the subunit of 2, and the image is formed on the second diaphragm member in the second subunit and detected by the second photodetector.
  • these scan mirrors, the first and second subunits are fixed to the main housing, and the first and second excitation lights are incident on the scan mirror from the first and second subunits. Since the angles are offset from each other by a predetermined angle, the spots of the first and second excitation lights scanned on the sample can be separated, and as a result, the first and second subunits are guided. The first and second fluorescence beams can be separated from each other. This makes it possible to observe a plurality of fluorescent images with reduced bleed-through. In addition, by adopting a configuration in which the sample is scanned by a scan mirror, the overall equipment configuration can be simplified.
  • another embodiment of the present disclosure is a confocal microscope comprising the above-mentioned confocal microscope unit and a microscope having a microscope optical system and a connection port to which the confocal microscope unit is attached. According to such a confocal microscope, confocal imaging at a desired excitation wavelength and fluorescence wavelength can be easily performed.
  • 6 is a graph showing a one-dimensional light intensity distribution along the X-axis direction of each of the first excitation light and the second excitation light irradiated on the sample M by the confocal microscope 101.
  • FIG. 1 is a schematic configuration diagram of a confocal microscope 101 according to the first embodiment.
  • the confocal microscope 101 shown in FIG. 1 constitutes a confocal microscope that acquires an image that enables the construction of an optical tomographic image of the sample M to be observed, and the confocal microscope unit 1A is for connecting an external unit of the microscope 50. It is configured to be connected to the connection port P1.
  • the confocal microscope unit 1A according to the first embodiment receives excitation light on a sample M arranged on a stage of the microscope 50 or the like via a microscope optical system such as an imaging lens 51 and an objective lens 52 in the microscope 50.
  • the confocal microscope unit 1A constitutes the main housing 2, a part of the main housing 2, and has a lens barrel 3 detachably connected to the connection port P1 of the microscope 50, and the main housing 2. It is composed of a scan mirror 4 fixed inside, a fixed mirror 5, first and second subunits 6a to 6b, and a scan lens 7 fixed inside the lens barrel 3.
  • a scan mirror 4 fixed inside
  • a fixed mirror 5 fixed inside
  • first and second subunits 6a to 6b a scan lens 7 fixed inside the lens barrel 3.
  • the scan lens 7 in the lens barrel 3 is an optical element having a function of relaying the reflecting surface of the scan mirror 4 to the pupil position of the objective lens 52 and at the same time forming a spot on the primary imaging surface of the microscope optical system of the microscope 50. is there.
  • the exit pupils of the scan mirror 4 and the objective lens 52 have a conjugate relationship, that is, an imaging relationship.
  • the scan lens 7 irradiates the sample M with the excitation light scanned by the scan mirror 4 by guiding the excitation light to the microscope optical system, and guides the fluorescence generated from the sample M to the scan mirror 4 accordingly.
  • the scan mirror 4 in the main housing 2 is, for example, an optical scanning element such as a MEMS (Micro Electro Mechanical System) mirror configured so that the reflector can be tilted in two axes.
  • the scan mirror 4 scans the excitation light output from the first and second subunits 6a to 6b on the sample M by continuously changing the reflection angle, and emits fluorescence generated in response to the excitation light. , It has a role of guiding toward the first and second subunits 6a to 6b.
  • the fixed mirror 5 is a light reflecting element fixed in the main housing 2, and reflects the excitation light output from the first to second subsystems 6a to 6b toward the scan mirror 4 to reflect the excitation light toward the scan mirror 4.
  • the fluorescence reflected by is reflected toward the first and second subsystems 6a to 6b coaxially with the excitation light.
  • the first subsystem 6a includes a base plate 8a, a dichroic mirror (first optical mirror) 9a arranged on the base plate 8a, a light source 10a, a collimating lens 15a, a dichroic mirror 11a, a barrier filter 16a, and a condensing lens. It has a 17a, a pinhole plate (first diaphragm member) 12a, and an optical detector (first optical detector) 13a.
  • the dichroic mirror 9a is fixed in the fluorescence reflection direction of the fixed mirror 5, and the first excitation light of the wavelength ⁇ 1 irradiated by the first subsystem 6a and the first excitation light of the wavelength range ⁇ 1 generated from the sample M accordingly. It is a beam splitter having a property of reflecting the fluorescence of the above and transmitting light having a wavelength longer than that of the first excitation light and the first fluorescence.
  • the dichroic mirror 11a is arranged in the reflection direction of the first fluorescent dichroic mirrors 9a, it passes through the first fluorescence wavelength range [Delta] [lambda] 1, reflects the first excitation light of a shorter wavelength lambda 1 than the wavelength range [Delta] [lambda] 1 It is a beam splitter that has the property of causing.
  • the light source 10a is a light emitting element (for example, a laser diode) that outputs a first excitation light (for example, laser light) having a wavelength ⁇ 1 , and the first excitation light is coaxial with the first fluorescence by the dichroic mirror 11a. It is arranged so as to be reflected toward the dichroic mirror 9a.
  • the collimating lens 15a converts the first excitation light output from the light source 10a into parallel light.
  • the barrier filter 16a is a filter member provided adjacent to the dichroic mirror 11a and cuts noise light other than the first fluorescence transmitted by the dichroic mirror 11a.
  • the condensing lens 17a concentrates the first fluorescence transmitted through the barrier filter 16a on the pinhole of the pinhole plate 12a.
  • the pinhole plate 12a is a diaphragm member whose pinhole position coincides with the conjugate position of the spot of the first excitation light of the sample M and limits the light flux of the first fluorescence, and together with the light source 10a and the like. It constitutes a cofocal optical system.
  • the pinhole plate 12a has a pinhole diameter that can be adjusted from the outside, and the resolution of the image detected by the photodetector 13a and the signal intensity of the image can be changed.
  • the detection surface of the photodetector 13a is arranged to face the pinhole plate 12a, and receives and detects the first fluorescence that has passed through the pinhole plate 12a.
  • the photodetector 13a is a photomultiplier tube, a photodiode, an avalanche photodiode, an MPPC (Multi-Pixel Photon Counter), an HPD (Hybrid Photo Detector), an area image sensor, or the like.
  • the second subunit 6b has the same components as the first subunit 6a.
  • the second subsystem 6b includes a base plate 8b, a dichroic mirror (second optical mirror) 9b, a light source 10b, a collimating lens 15b, a dichroic mirror 11b, a barrier filter 16b, a condensing lens 17b, and a pinhole plate ( It has a second diaphragm member) 12b and a light detector (second light detector) 13b.
  • the dichroic mirror 9b reflects the second excitation light of the wavelength ⁇ 2 (> ⁇ 1 ) irradiated by the second subunit 6b and the second fluorescence of the wavelength range ⁇ 2 generated from the sample M accordingly, and the second It has the property of transmitting light having a wavelength longer than that of the second excitation light and the second fluorescence.
  • the dichroic mirror 9b may be replaced with a simple reflection mirror having no wavelength selectivity.
  • the dichroic mirror 11b passes through a second fluorescence wavelength range [Delta] [lambda] 2, has a property of reflecting the second excitation light of a shorter wavelength lambda 2 from the wavelength range [Delta] [lambda] 2.
  • the light source 10b is a light emitting element that outputs a second excitation light having a wavelength of ⁇ 2 .
  • the collimating lens 15b converts the second excitation light output from the light source 10b into parallel light.
  • the barrier filter 16b is a filter member provided adjacent to the dichroic mirror 11b and cuts noise light other than the second fluorescence.
  • the condensing lens 17b concentrates the second fluorescence transmitted through the barrier filter 16b on the pinhole of the pinhole plate 12b.
  • the pinhole plate 12b is a diaphragm member whose pinhole position is arranged so as to coincide with the conjugate position of the second excitation light spot of the sample M and limits the light flux of the second fluorescence.
  • the detection surface of the photodetector 13b is arranged to face the pinhole plate 12b, and receives and detects the second fluorescence that has passed through the pinhole plate 12b.
  • the photodetector 13b is a photomultiplier tube, a photodiode, an avalanche photodiode, an MPPC (Multi-Pixel Photon Counter), an HPD (Hybrid Photo Detector), an area image sensor, or the like.
  • the Z axis is taken in the direction along the optical axis of the scan lens 7
  • the X axis is taken in the direction perpendicular to the Z axis and along the base plates 8a and 8b of the subunits 6a and 6b.
  • the Y-axis shall be taken in the direction perpendicular to the axis and the X-axis.
  • the first and second subunits 6a and 6b move away from the fixed mirror 5 in this order along the light guide direction (Z-axis direction) of the first and second fluorescence by the scan mirror 4 and the fixed mirror 5.
  • the dichroic mirrors 9a and 9b are fixed on the base plate 14 constituting the main housing 2 so as to be arranged in line with each other and on the first and second fluorescence optical paths.
  • the second subunit 6b is in a direction (X) substantially perpendicular to the light guide direction of the first fluorescence with respect to the first subunit 6a with reference to the center position of the dichroic mirrors 9a and 9b. It is arranged so as to shift in the axial direction).
  • the installation angle of the dichroic mirror 9a is set so that the reflected first excitation light is incident on the center of the reflection surface of the scan mirror 4 via the fixed mirror 5.
  • the installation angle of the dichroic mirror 9b is set so that the reflected second excitation light enters the center of the reflecting surface of the scan mirror 4 via the dichroic mirror 9a and the fixed mirror 5.
  • the shift amount of the first and second subunits 6a and 6b in the X-axis direction and the installation angles of the two dichroic mirrors 9a and 9b are set so as to satisfy the following conditions. That is, the predetermined angle ⁇ S does not allow the Airy disk of the first excitation light spot incident on the sample M to overlap the Airy disk of the second excitation light spot incident on the sample M. It is set to be an angle.
  • the exit pupils of the scan mirror 4 and the objective lens 52 are in a conjugate relationship, the light beams of the first and second excitation lights incident on the center of the reflection surface of the scan mirror 4 are emitted by the objective lens 52. It is incident on the center of the pupil. At that time, the angle of incidence on the objective lens 52 changes according to the imaging magnification of the scan lens 7. Since the objective lens 52 is a telecentric lens, the main rays of the first and second excitation lights are in the direction parallel to the optical axis of the objective lens 52 (Z-axis direction) on the sample M, and the angle of incidence on the exit pupil. The positions of the two excitation light spots shift on the sample M accordingly.
  • the angle ⁇ S of the deviation of the incident angle to the scan mirror 4 is equal to or greater than the angle ⁇ Smin calculated by the following equation (3).
  • ⁇ Smin arctan ( ⁇ d min / f) / mags... (3) It is calculated by.
  • mags is the magnification of the scan lens 7
  • f is the focal length of the objective lens 52.
  • the diameters of the pinholes of the pinhole plates 12a and 12b of the subunits 6a and 6b are smaller than the values of the air unit (AU 1 , AU 2 ) calculated by the following equations (4) and (5).
  • AU 1 mag t ⁇ ⁇ 1 ...
  • AU 2 mag t ⁇ ⁇ 2 ... (5)
  • mag t indicates the total magnification of the optical system for observing fluorescence.
  • Figure 2 shows a first excitation light in the range S 1 and the distribution of the range S 2 of the second excitation light spot Airy disk Airy disks spot on the sample M which is formed by confocal microscopy 101
  • FIG. 3 shows a one-dimensional light intensity distribution along the X-axis direction of each of the first excitation light and the second excitation light irradiated on the sample M by the confocal microscope 101.
  • the range S 1 of the spot the first and second excitation light is focused on the sample M S 2 is such not to overlap each other, the intensity distribution of the two excitation light on the sample M Separation results in reduced interference between the fluorescence images in the two wavelength regions caused by the two excitation lights.
  • the first excitation light output from the first subunit 6a is scanned onto the sample M via the scan mirror 4, and is generated from the sample M accordingly.
  • the first fluorescence is incident on the first subunit 6a via the scan mirror 4, and the image is formed on the pinhole plate 12a in the first subunit 6a and detected by the photodetector 13a.
  • the second excitation light output from the second subunit 6b is scanned onto the sample M via the scan mirror 4, and the second fluorescence generated from the sample M correspondingly is scanned by the scan mirror 4.
  • the confocal microscope 101 is a confocal microscope including the above-mentioned confocal microscope unit 1A and a microscope 50 having a microscope optical system and a connection port P1 to which the confocal microscope unit 1A is attached. According to such a confocal microscope 101, confocal imaging can be easily performed using a microscope 50 which is a general optical microscope.
  • the dichroic mirrors 9a and 9b are main so that the deviation of the incident angles of the first and second excitation lights on the scan mirror 4 is a predetermined angle ⁇ S. It is arranged in the housing 2. With such a configuration, the spots of the first and second excitation lights scanned on the sample M can be separated, and as a result, the first and second units 6a and 6b guided to the first and second subunits 6a and 6b can be separated. The beams of the second fluorescence can be separated from each other. This makes it possible to observe a plurality of fluorescent images with reduced bleed-through.
  • a predetermined angle ⁇ S is set to an angle such that the Airy disk of the first excitation light and the Airy disk of the second excitation light are separated on the sample M. ..
  • the spots of the first and second excitation lights scanned on the sample M can be completely separated.
  • the first and second fluorescence beams guided by the first and second subunits 6a and 6b can be completely separated from each other. This makes it possible to observe a plurality of fluorescent images with reduced bleed-through.
  • the MEMS mirror is adopted as the scan mirror 4. With such a configuration, the unit can be easily miniaturized.
  • the first subunit 6a and the second subunit 6b are fixed to the main housing 2 in a state of being arranged in order along the light guide direction of fluorescence by the scan mirror 4. ing.
  • the second excitation light emitted from the second subunit 6b can be emitted toward the sample M on the microscope 50 side via the first subunit 6a, and can be irradiated to the sample M.
  • the second fluorescence generated from the sample M can be introduced into the second subunit 6b via the first subunit 6a.
  • FIG. 4 is a schematic configuration diagram of the confocal microscope unit 1B according to the second embodiment.
  • the confocal microscope unit 1B shown in FIG. 4 differs from the confocal microscope unit 1A of the first embodiment in that it has four subunits.
  • the configuration of the confocal microscope unit 1B will be described focusing on the differences from the first embodiment.
  • the confocal microscope unit 1B includes first to fourth subunits 6a to 6d in the main housing 2.
  • the third subsystem 6c includes a base plate 8c, a dichroic mirror (third optical mirror) 9c, a light source 10c, a collimating lens 15c, a dichroic mirror 11c, a barrier filter 16c, a condensing lens 17c, and a pinhole plate (third). (Aperture member) 12c and a light detector (third light detector) 13c.
  • the dichroic mirror 9c reflects the third excitation light of the wavelength ⁇ 3 (> ⁇ 2 ) irradiated by the third subsystem 6c and the third fluorescence of the wavelength range ⁇ 3 generated from the sample M accordingly. It has the property of transmitting light having a wavelength longer than that of the excitation light of No. 3 and the third fluorescence.
  • the dichroic mirror 11c is transmitted through the third fluorescence having a wavelength range [Delta] [lambda] 3, has the property of reflecting the third pumping light having a wavelength shorter lambda 3 than the wavelength range [Delta] [lambda] 3.
  • the light source 10c is a light emitting element that outputs a third excitation light having a wavelength of ⁇ 3 .
  • the collimating lens 15c converts the third excitation light output from the light source 10c into parallel light.
  • the barrier filter 16c is a filter member provided adjacent to the dichroic mirror 11c and cuts noise light other than the third fluorescence.
  • the condensing lens 17c concentrates the third fluorescence transmitted through the barrier filter 16c on the pinhole of the pinhole plate 12c.
  • the pinhole plate 12c is a diaphragm member whose pinhole position is arranged so as to coincide with the conjugate position of the third excitation light spot of the sample M and limits the light flux of the third fluorescence.
  • the detection surface of the photodetector 13c is arranged to face the pinhole plate 12c, and receives and detects the third fluorescence that has passed through the pinhole plate 12c.
  • the photodetector 13c is a photomultiplier tube, a photodiode, an avalanche photodiode, an MPPC (Multi-Pixel Photon Counter), an HPD (Hybrid Photo Detector), an area image sensor, or the like.
  • the fourth subsystem 6d includes a base plate 8d, a total reflection mirror (fourth optical mirror) 9d, a light source 10d, a collimating lens 15d, a dichroic mirror 11d, a barrier filter 16d, a condensing lens 17d, and a pinhole plate (fourth). It has a diaphragm member (4) 12d and a light detector (fourth light detector) 13d.
  • the total reflection mirror 9d reflects the fourth excitation light of the wavelength ⁇ 4 (> ⁇ 3 ) emitted by the fourth subunit 6d and the fourth fluorescence of the wavelength range ⁇ 4 generated from the sample M accordingly.
  • the dichroic mirror 11d is transmitted through the fourth fluorescence wavelength range [Delta] [lambda] 4, have the property of reflecting the fourth pumping light wavelength shorter lambda 4 than the wavelength range [Delta] [lambda] 4.
  • the light source 10d is a light emitting element that outputs a fourth excitation light having a wavelength of ⁇ 4 .
  • the collimating lens 15d converts the fourth excitation light output from the light source 10d into parallel light.
  • the barrier filter 16d is a filter member provided adjacent to the dichroic mirror 11d and cuts noise light other than the fourth fluorescence.
  • the condensing lens 17d concentrates the fourth fluorescence transmitted through the barrier filter 16d on the pinhole of the pinhole plate 12d.
  • the pinhole plate 12d is a diaphragm member whose pinhole position is arranged so as to coincide with the conjugate position of the fourth excitation light spot of the sample M and limits the luminous flux of the fourth fluorescence.
  • the detection surface of the photodetector 13d is arranged to face the pinhole plate 12d, and receives and detects the fourth fluorescence that has passed through the pinhole plate 12d.
  • the photodetector 13d is a photomultiplier tube, a photodiode, an avalanche photodiode, an MPPC (Multi-Pixel Photon Counter), an HPD (Hybrid Photo Detector), an area image sensor, or the like.
  • the first to fourth subsystems 6a to 6d are directed away from the fixed mirror 5 in this order along the light guide direction (Z-axis direction) of the first to fourth fluorescence by the scan mirror 4 and the fixed mirror 5.
  • the dichroic mirrors 9a to 9c and the total reflection mirrors 9d are fixed in the main housing 2 so as to be aligned with each other and on the first to fourth fluorescent light paths.
  • the fourth subunit 6d is arranged so as to shift in the X-axis direction with respect to the third subunit 6c with respect to the center positions of the dichroic mirror 9c and the total reflection mirror 9d.
  • the third and fourth subunits 6c and 6d are in the Y-axis direction with respect to the first and second subunits 6a and 6b with reference to the center positions of the dichroic mirrors 9a to 9c and the total reflection mirror 9d. It is also arranged to shift to. Further, the installation angles of the dichroic mirrors 9a to 9c and the total reflection mirror 9d are set so that the first to fourth excitation lights reflected by each of them are incident on the center of the reflection surface of the scan mirror 4. .. By arranging in this way, the incident angles of the two fluorescence incident on the scan mirror 4 from the two adjacent subunits are set so as to deviate from each other by a predetermined angle ⁇ S or more.
  • FIG. 5 is a perspective view of the structure for shifting the arrangement of the third and fourth subunits 6c and 6d in the Y-axis direction as viewed from the lens barrel 3 side.
  • a structure is adopted in which the flat spacer 21 is arranged on the base plate 14 of the main housing 2 and the third and fourth subunits 6c and 6d are mounted on the spacer 21.
  • the third and fourth subunits 6c and 6d can be arranged by shifting the first and second subunits 6a and 6b by a desired width in the Y-axis direction.
  • Figure 6 shows the locus of the light beam B 1 to B 4 of the first to fourth excitation light beam incident from the first to fourth sub-units 6a-6d in the confocal microscope unit 1B to the scan mirror 4
  • Figure 7 shows the first to fourth pumping light distribution in the range S 1 to S 4 of the Airy disc of the spot on the sample M which is formed by the confocal microscope unit 1B.
  • the outer edges of the luminous fluxes B 1 to B 4 of each excitation light beam are shown by solid lines, and the central BCs 1 to BC 4 of the luminous fluxes B 1 to B 4 of each excitation light beam are shown by a dashed line.
  • the first to fourth excitation light beams are set to be incident on the center of the incident surface RF of the scan mirror 4, and the first to fourth excitation light beams are incident at different angles. It is set to shift in the two-dimensional direction. Further, since the deviation of the incident angles from each other is set to a predetermined angle ⁇ S or more, the ranges S 1 to S 4 of the airy disks of the first to fourth excitation light spots connected on the sample M overlap each other. It is set so that it does not become.
  • the spots of the first to fourth excitation lights scanned on the sample M can be separated, and as a result, the first to fourth spots can be separated.
  • the first to fourth fluorescence beams guided by the subunits 6a to 6d can be separated from each other. This makes it possible to observe the fluorescence image in a state where the bleed-through is reduced even if four kinds of excitation wavelengths are used.
  • FIG. 8 is a schematic configuration diagram of the confocal microscope unit 1C according to the third embodiment.
  • the confocal microscope unit 1C shown in FIG. 8 is different from the confocal microscope unit 1A of the first embodiment in that the arrangement of the dichroic mirrors 9a and 9b on the base plates 8a and 8b of the two subunits 6a and 6b is the same. different.
  • the configuration of the confocal microscope unit 1C will be described focusing on the differences from the first embodiment.
  • Elements other than the dichroic mirror 9a on the base plate 8a in the first subsystem 6a that is, a light source 10a, a collimating lens 15a, a dichroic mirror 11a, a barrier filter 16a, a condenser lens 17a, a pinhole plate 12a, and light detection.
  • the arrangement of the elements including the vessel 13a based on the dichroic mirror 9a is such that the elements other than the dichroic mirror 9b on the base plate 8b in the second subsystem 6b, that is, the light source 10b, the collimating lens 15b, the dichroic mirror 11b, and the barrier.
  • the arrangement of the elements including the filter 16b, the condensing lens 17b, the pinhole plate 12b, and the light detector 13b is adjusted to be different from the arrangement based on the dichroic mirror 9b.
  • the elements other than the dichroic mirror 9a in the first subunit 6a or the elements other than the dichroic mirror 9b in the second subunit 6b are integrally formed on the base plates 8a and 8b. It is realized by making the posture and its position changeable.
  • the incident angle / position of the second excitation light with respect to the dichroic mirror 9b in the unit 6b is the angle of incidence of the first excitation light on the scan mirror 4 and the angle of incidence of the second excitation light on the scan mirror 4. It is set so as to deviate from a predetermined angle ⁇ S.
  • the incident angles of the excitation light on the first and second dichroic mirrors 9a and 9b in the first and second subunits 6a and 6b are set. Allows the spots of the first and second excitation lights scanned on the sample M to be separated, resulting in the first and second fluorescence guided to the first and second subunits 6a, 6b. Beams can be separated from each other. This makes it possible to observe fluorescence images at two fluorescence wavelengths with reduced bleed-through.
  • a pinhole plate is used as a diaphragm member to form a confocal optical system, but the diaphragm member may be an optical element that limits the luminous flux, for example, a color diaphragm or a fiber core. You may.
  • the position of the end face of the fiber core may be the diaphragm position (the position where the luminous flux is limited).
  • a laser light source such as a solid-state laser or a diode laser can also be used.
  • the position of the beam waist of these laser light sources may be set to the diaphragm position (the position where the luminous flux is limited), and the light source itself plays the role of a diaphragm member.
  • a plurality of subunits are arranged in the direction away from the scan mirror 4 side in the order of the shortest wavelength range of the excitation light and the fluorescence to be handled, but they are arranged in the order of the longest wavelength range. You may.
  • the characteristics of the dichroic mirrors 9a to 9c reflect the relatively long-wavelength excitation light and fluorescence handled by each of the subsystems 6a to 6c, and the relatively short-wavelength excitation light handled by the other subsystems. And the characteristics are set to transmit fluorescence.
  • the spots of the excitation light formed on the sample M are not overlapped between the two subunits of all the subunits 6a to 6d, but between the adjacent subunits. It suffices if the spots are configured so that they do not overlap. For example, between the first subunit 6a and the second subunit 6b, between the second subunit 6b and the third subunit 6c, and between the third subunit 6c and the fourth subunit 6d. It suffices if the spots of the excitation light do not overlap with each other. On the other hand, the spots of excitation light overlap between the first subunit 6a and the third subunit 6c, or between the second subunit 6b and the fourth subunit 6d. May be good.
  • the fluorescence of the observation target of one subunit and the fluorescence of the observation target of the other subunit can be easily separated by the dichroic mirror.
  • the third and fourth subunits 6c and 6d are Y with respect to the first and second subunits 6a and 6b. It may be arranged without shifting in the axial direction. Even with such a configuration, since two spots of excitation light having close wavelength regions can be separated on the sample M, it is possible to prevent fluorescent beams in a plurality of detected wavelength ranges from affecting each other. It is possible to observe multiple fluorescent images with reduced bleed-through.
  • the first subsystem has a first optical mirror that reflects the first excitation light and the first fluorescence and transmits the second excitation light and the second fluorescence.
  • the second subsystem has a second optical mirror that reflects the second excitation light and the second fluorescence, and the first optical mirror and the second optical mirror are the first excitation light to the scan mirror.
  • the incident angle of the light may be arranged in the main housing so as to deviate from the incident angle of the second excitation light to the scan mirror by a predetermined angle.
  • the first subsystem has a first optical mirror that reflects the first excitation light and the first fluorescence and transmits the second excitation light and the second fluorescence, and has a second subsystem.
  • the angle of incidence and the angle of incidence of the second excitation light on the second optical mirror are such that the angle of incidence of the first excitation light on the scan mirror is relative to the angle of incidence of the second excitation light on the scan mirror. It may be set so as to deviate from a predetermined angle.
  • the spots of the first and second excitation lights scanned on the sample are separated by setting the angle of incidence of the excitation light on the first and second optical mirrors in the first and second subunits.
  • the first and second fluorescence beams guided to the first and second subunits can be separated from each other. This makes it possible to observe a plurality of fluorescent images with reduced bleed-through.
  • the above-mentioned predetermined angle is an angle such that the Airy disk of the first excitation light and the Airy disk of the second excitation light are separated on the sample.
  • the spots of the first and second excitation lights scanned on the sample can be completely separated, and as a result, the first and second subunits guided to the first and second subunits can be separated.
  • the beams of the second fluorescence can be completely separated from each other. This makes it possible to observe a plurality of fluorescent images in the absence of bleed-through.
  • the scan mirror may be a MEMS mirror.
  • the device can be easily miniaturized.
  • first subunit and the second subunit are arranged in the main housing in the order of the first subunit and the second subunit along the light guide direction of fluorescence by the scan mirror. It may be fixed. According to such a configuration, the second excitation light emitted from the second subunit can be emitted toward the sample on the microscope side via the first subunit, and from the sample accordingly. The resulting second fluorescence can be introduced into the second subunit via the first subunit. As a result, it is possible to reduce the size of the device that realizes imaging in a plurality of wavelength regions.
  • the embodiment uses a confocal microscope unit and a confocal microscope that constitute a confocal microscope, and can realize fluorescence imaging by multiple fluorescence in a state where bleed-through is reduced by a simple configuration.
  • M ... sample, P1 ... connection port, ⁇ S ... predetermined angle, 10a to 10d ... light source, 12a to 12d ... pinhole plate (aperture member), 13a to 13d ... optical detector, 6a to 6d ... first to first Subunits of 4, 9a to 9c ... Dycroic mirrors (1st to 3rd optical mirrors), 9d ... Total reflection mirrors (4th optical mirrors), 1A, 1B, 1C ... Confocal microscope unit, 2 ... Main case Body, 3 ... lens barrel, 4 ... scan mirror, 7 ... scan lens, 50 ... microscope, 101 ... confocal microscope.

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Abstract

実施形態にかかる共焦点顕微鏡ユニット１Ａは、光源１０ａ、ピンホール板１２ａ、及び、光検出器１３ａを有する第１のサブユニット６ａと、光源１０ｂ、ピンホール板１２ｂ、及び、光検出器１３ｂを有する第２のサブユニット６ｂと、第１及び第２のサブユニット６ａ，６ｂから出力された励起光を、顕微鏡光学系を経由して試料Ｍ上を走査させ、励起光に応じて試料Ｍから生じて顕微鏡光学系によって結像された蛍光を第１及び第２のサブユニット６ａ，６ｂに向けて導くスキャンミラー４と、接続ポートＰ１に取り付け可能に構成され、スキャンミラー４、第１のサブユニット６ａ、及び第２のサブユニット６ｂが固定されたメイン筐体２と、を備え、第１のサブユニット６ａ及び第２のサブユニット６ｂは、スキャンミラー４への２つの励起光の入射角が、所定の角度θＳずれるように、メイン筐体２内に配置される。

Description

共焦点顕微鏡ユニット及び共焦点顕微鏡
　本開示は、共焦点顕微鏡を構成する共焦点顕微鏡ユニット及び共焦点顕微鏡に関する。
　従来から、観察対象の標本の光学断層像を高解像度で得ることが可能な共焦点顕微鏡が知られている。例えば、下記特許文献１には、顕微鏡に接続される顕微鏡接続ポートと、標本に光を照射する刺激ユニットと、標本から発せられる光を検出する観察ユニットと、顕微鏡と刺激ユニット及び観察ユニットとを光学的に接続する光路を合成する光路合成部とを備える顕微鏡接続ユニットが開示されている。この顕微鏡接続ユニットは、複数の光源から発せられた光を導く光学系、それに応じて発生した蛍光を複数波長ごとに検出するためのダイクロイックミラー、共焦点ピンホール、及び光電子増倍管を、同一の観察ユニット内に有している。このような構成では、複数の波長の励起光を用いてそれに応じて生じる蛍光を検出することにより、同一の装置で複数波長領域でのイメージングが実現される。
　また、異なる波長の励起光を用いて蛍光サンプルを画像化する装置としては、下記特許文献２に記載のレーザスキャナ装置も知られている。このレーザスキャナ装置によれば、サンプルに集光される波長の異なる２つのレーザビームが空間的に分離され、それらのレーザビームによって誘起された２つの発光ビームも空間的に分離されて２つの検出器に向けて導光される。
特開２０１１－９０２４８号公報 特開２００９－１０４１３６号公報
　蛍光物質が発する蛍光の波長分布は、一般的に広いため、複数の蛍光物質を含んだサンプルを観察する場合、それぞれの蛍光物質から発せられる蛍光の波長分布が重複することがある。このようなサンプルから発せられる蛍光を同時に検出する際に、目的とした蛍光物質からの蛍光だけでなく、他の蛍光物質からの蛍光も同じ検出器で検出してしまう問題がある。一般的に、このような問題をブリードスルー（Bleed　Through）という。
　引用文献２に記載のレーザスキャナ装置では、ウェッジ形状のダイクロイックミラーを用いて複数の蛍光を空間的に分離させて検出することで、ブリードスルーを低減しているが、スキャンミラーを用いた共焦点顕微鏡には応用が難しい。
　実施形態は、かかる課題に鑑みてなされたものであり、簡易な構成により複数波長領域でのブリードスルーの少ない蛍光イメージングを可能にする共焦点顕微鏡ユニットを提供することを課題とする。
　本開示の一形態に係る共焦点顕微鏡ユニットは、顕微鏡光学系を有する顕微鏡の接続ポートに取り付けられることにより、共焦点顕微鏡を構成する共焦点顕微鏡ユニットであって、第１の励起光を出力する光源、第１の励起光に応じて観察対象の試料から生じる第１の蛍光の光束を制限する第１の絞り部材、及び、第１の絞り部材を通過した第１の蛍光を検出する第１の光検出器を有する第１のサブユニットと、第２の励起光を出力する光源、第２の励起光に応じて試料から生じる第２の蛍光の光束を制限する第２の絞り部材、及び、第２の絞り部材を通過した第２の蛍光を検出する第２の光検出器を有する第２のサブユニットと、第１及び第２のサブユニットから出力された励起光を、顕微鏡光学系を経由して試料上を走査させ、励起光に応じて試料から生じる蛍光を第１及び第２のサブユニットに向けて導くスキャンミラーと、接続ポートに取り付け可能に構成され、スキャンミラー、第１のサブユニット、及び第２のサブユニットが固定されたメイン筐体と、を備え、第１のサブユニット及び第２のサブユニットは、スキャンミラーへの第１の励起光の入射角が、スキャンミラーへの第２の励起光の入射角に対して所定の角度ずれるように、メイン筐体内に配置される。
　上記一形態によれば、第１のサブユニットから出力された第１の励起光がスキャンミラーを経由して試料上に走査され、それに応じて試料上から生じた第１の蛍光がスキャンミラーを経由して第１のサブユニット内に入射し、第１のサブユニット内の第１の絞り部材にその像が結ばれて第１の光検出器で検出される。加えて、第２のサブユニットから出力された第２の励起光がスキャンミラーを経由して試料上に走査され、それに応じて試料上から生じた第２の蛍光がスキャンミラーを経由して第２のサブユニット内に入射し、第２のサブユニット内の第２の絞り部材にその像が結ばれて第２の光検出器で検出される。ここで、これらのスキャンミラー、第１及び第２のサブユニットは、メイン筐体に固定されており、第１及び第２のサブユニットからスキャンミラーへの第１及び第２の励起光の入射角が互いに所定の角度ずらされているので、試料上に走査される第１及び第２の励起光のスポットを分離することができ、その結果、第１及び第２のサブユニットに導かれる第１及び第２の蛍光のビームを互いに分離することができる。これにより、ブリードスルーを低減した状態で複数の蛍光像の観察が可能にされる。加えて、スキャンミラーにより試料をスキャンする構成を採用することにより、全体の装置構成を簡素化することができる。
　あるいは、本開示の他の形態は、上述の共焦点顕微鏡ユニットと、顕微鏡光学系及び共焦点顕微鏡ユニットが取り付けられる接続ポートを有する顕微鏡を備える共焦点顕微鏡である。このような共焦点顕微鏡によれば、所望の励起波長及び蛍光波長における共焦点イメージングを容易に行うことができる。
　本開示の一側面によれば、簡易な構成によりブリードスルーを低減した状態で複数蛍光による蛍光イメージングを実現することができる。
第１実施形態にかかる共焦点顕微鏡１０１の概略構成図である。 共焦点顕微鏡１０１により形成される試料Ｍ上の第１の励起光のスポットのエアリディスクの範囲Ｓ１及び第２の励起光のスポットのエアリディスクの範囲Ｓ２の分布を示す図である。 共焦点顕微鏡１０１により試料Ｍ上に照射される第１の励起光及び第２の励起光のそれぞれのＸ軸方向に沿った一次元の光強度分布を示すグラフである。 第２実施形態にかかる共焦点顕微鏡ユニット１Ｂの概略構成図である。 第３及び第４のサブユニット６ｃ，６ｄの配置をＹ軸方向にシフトさせるための構造の一例を示す透視図である。 共焦点顕微鏡ユニット１Ｂにおけるスキャンミラー４に入射する励起光ビームの光束の軌跡を示す図である。 共焦点顕微鏡ユニット１Ｂにより形成される試料Ｍ上の励起光のスポットのエアリディスクの範囲の分布を示す図である。 第３実施形態にかかる共焦点顕微鏡ユニット１Ｃの概略構成図である。
　以下、添付図面を参照して、本開示の実施形態について詳細に説明する。なお、説明において、同一要素又は同一機能を有する要素には、同一符号を用いることとし、重複する説明は省略する。
［第１実施形態］
　図１は、第１実施形態にかかる共焦点顕微鏡１０１の概略構成図である。図１に示す共焦点顕微鏡１０１は、観察対象の試料Ｍの光学断層像の構築を可能とする画像を取得する共焦点顕微鏡を構成し、共焦点顕微鏡ユニット１Ａが顕微鏡５０の外部ユニット接続用の接続ポートＰ１に接続されて構成される。第１実施形態にかかる共焦点顕微鏡ユニット１Ａは、顕微鏡５０内の結像レンズ５１、対物レンズ５２等の顕微鏡光学系を経由して、顕微鏡５０のステージ上等に配置された試料Ｍに励起光を照射し、その励起光に応じて試料Ｍから生じた蛍光を、顕微鏡５０の顕微鏡光学系を経由して結像および受光（検出）して光学的断層像を生成して出力する装置である。
　詳細には、共焦点顕微鏡ユニット１Ａは、メイン筐体２と、メイン筐体２の一部を構成し、顕微鏡５０の接続ポートＰ１に着脱可能に接続される鏡筒３と、メイン筐体２内に固定されたスキャンミラー４、固定ミラー５、第１～第２のサブユニット６ａ～６ｂと、鏡筒３内に固定されたスキャンレンズ７とを含んで構成される。以下、共焦点顕微鏡ユニット１Ａの各構成要素について詳細に説明する。
　鏡筒３内のスキャンレンズ７は、スキャンミラー４の反射面を対物レンズ５２の瞳位置にリレーすると同時に、顕微鏡５０の顕微鏡光学系の１次結像面にスポットを結ぶ機能を有する光学素子である。これにより、スキャンミラー４と対物レンズ５２の射出瞳は共役関係つまり結像関係となる。スキャンレンズ７は、スキャンミラー４によって走査された励起光を顕微鏡光学系に導光することにより試料Ｍに照射させ、それに応じて試料Ｍから生じた蛍光をスキャンミラー４に導光する。
　メイン筐体２内のスキャンミラー４は、例えば、反射板を２軸で傾動可能に構成されたＭＥＭＳ（Micro Electro Mechanical System）ミラー等の光走査素子である。スキャンミラー４は、反射角度を連続的に変更することにより、第１～第２のサブユニット６ａ～６ｂから出力された励起光を試料Ｍ上に走査させ、その励起光に応じて生じる蛍光を、第１～第２のサブユニット６ａ～６ｂに向けて導く役割を有する。
　固定ミラー５は、メイン筐体２内に固定された光反射素子であり、第１～第２のサブユニット６ａ～６ｂから出力された励起光をスキャンミラー４に向けて反射させ、スキャンミラー４で反射された蛍光を励起光と同軸で第１～第２のサブユニット６ａ～６ｂに向けて反射する。
　第１のサブユニット６ａは、ベース板８ａと、ベース板８ａ上に配置されたダイクロイックミラー（第１の光学ミラー）９ａ、光源１０ａ、コリメートレンズ１５ａ、ダイクロイックミラー１１ａ、バリアフィルタ１６ａ、集光レンズ１７ａ、ピンホール板（第１の絞り部材）１２ａ、及び光検出器（第１の光検出器）１３ａとを有する。
　ダイクロイックミラー９ａは、固定ミラー５の蛍光の反射方向に固定され、第１のサブユニット６ａが照射する波長λ１の第１の励起光及びそれに応じて試料Ｍから生じる波長範囲Δλ１の第１の蛍光を反射し、第１の励起光及び第１の蛍光よりも長波長の光を透過させる性質を有するビームスプリッタである。ダイクロイックミラー１１ａは、ダイクロイックミラー９ａの第１の蛍光の反射方向に設けられ、波長範囲Δλ１の第１の蛍光を透過し、波長範囲Δλ１より短い波長λ１の第１の励起光を反射させる性質を有するビームスプリッタである。光源１０ａは、波長λ１の第１の励起光（例えば、レーザ光）を出力する発光素子（例えば、レーザダイオード）であり、第１の励起光がダイクロイックミラー１１ａによって第１の蛍光と同軸でダイクロイックミラー９ａに向けて反射されるように配置される。コリメートレンズ１５ａは、光源１０ａから出力された第１の励起光を平行光に変換する。
　バリアフィルタ１６ａは、ダイクロイックミラー１１ａに隣接して設けられ、ダイクロイックミラー１１ａによって透過された第１の蛍光以外のノイズ光をカットするフィルタ部材である。集光レンズ１７ａは、バリアフィルタ１６ａを透過した第１の蛍光をピンホール板１２ａのピンホールに集光する。ピンホール板１２ａは、そのピンホール位置が試料Ｍの第１の励起光のスポットの共役位置に一致するように配置され、第１の蛍光の光束を制限する絞り部材であり、光源１０ａ等とともに共焦点光学系を構成する。このピンホール板１２ａは、ピンホールの径を外部から調整可能にされ、光検出器１３ａによって検出される画像の解像度と画像の信号強度を変更可能とする。
　光検出器１３ａは、その検出面がピンホール板１２ａに対向して配置され、ピンホール板１２ａを通過した第１の蛍光を受光および検出する。なお、光検出器１３ａは、光電子増倍管、フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、ＭＰＰＣ（Multi-Pixel　Photon　Counter）、ＨＰＤ（Hybrid　Photo　Detector）、或いはエリアイメージセンサ等である。
　第２のサブユニット６ｂは、第１のサブユニット６ａと同様な構成要素を有する。
　すなわち、第２のサブユニット６ｂは、ベース板８ｂと、ダイクロイックミラー（第２の光学ミラー）９ｂ、光源１０ｂ、コリメートレンズ１５ｂ、ダイクロイックミラー１１ｂ、バリアフィルタ１６ｂ、集光レンズ１７ｂ、ピンホール板（第２の絞り部材）１２ｂ、及び光検出器（第２の光検出器）１３ｂとを有する。
　ダイクロイックミラー９ｂは、第２のサブユニット６ｂが照射する波長λ２（＞λ１）の第２の励起光及びそれに応じて試料Ｍから生じる波長範囲Δλ２の第２の蛍光を反射し、第２の励起光及び第２の蛍光よりも長波長の光を透過させる性質を有する。なお、このダイクロイックミラー９ｂは、波長選択性を有さない単なる反射ミラーに置換されてもよい。ダイクロイックミラー１１ｂは、波長範囲Δλ２の第２の蛍光を透過し、波長範囲Δλ２より短い波長λ２の第２の励起光を反射させる性質を有する。光源１０ｂは、波長λ２の第２の励起光を出力する発光素子である。コリメートレンズ１５ｂは、光源１０ｂから出力された第２の励起光を平行光に変換する。
　バリアフィルタ１６ｂは、ダイクロイックミラー１１ｂに隣接して設けられ、第２の蛍光以外のノイズ光をカットするフィルタ部材である。集光レンズ１７ｂは、バリアフィルタ１６ｂを透過した第２の蛍光をピンホール板１２ｂのピンホールに集光する。ピンホール板１２ｂは、そのピンホール位置が試料Ｍの第２の励起光のスポットの共役位置に一致するように配置され、第２の蛍光の光束を制限する絞り部材である。
　光検出器１３ｂは、その検出面がピンホール板１２ｂに対向して配置され、ピンホール板１２ｂを通過した第２の蛍光を受光および検出する。なお、光検出器１３ｂは、光電子増倍管、フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、ＭＰＰＣ（Multi-Pixel　Photon　Counter）、ＨＰＤ（Hybrid　Photo　Detector）、或いはエリアイメージセンサ等である。
　上記構成の第１～第２のサブユニット６ａ～６ｂの配置について説明する。以下の説明では、スキャンレンズ７の光軸に沿った方向にＺ軸をとり、Ｚ軸に垂直で、かつサブユニット６ａ，６ｂのベース板８ａ，８ｂに沿った方向にＸ軸をとり、Ｚ軸及びＸ軸に垂直な方向にＹ軸をとるものとする。
　第１及び第２のサブユニット６ａ，６ｂは、スキャンミラー４及び固定ミラー５による第１及び第２の蛍光の導光方向（Ｚ軸方向）に沿って、この順番で固定ミラー５から離れる方向に並ぶように、かつ、第１及び第２の蛍光の光路上にダイクロイックミラー９ａ，９ｂが位置するように、メイン筐体２を構成するベース板１４上に固定されている。詳細には、第２のサブユニット６ｂは、第１のサブユニット６ａに対して、ダイクロイックミラー９ａ，９ｂの中心位置を基準にして、第１の蛍光の導光方向に略垂直な方向（Ｘ軸方向）にシフトするように、配置されている。さらに、ダイクロイックミラー９ａは、反射する第１の励起光が固定ミラー５を経由してスキャンミラー４の反射面の中心に入射するように、その設置角が設定されている。同様に、ダイクロイックミラー９ｂは、反射する第２の励起光がダイクロイックミラー９ａ及び固定ミラー５を経由してスキャンミラー４の反射面の中心に入射するように、その設置角が設定されている。このように配置されることにより、第１の励起光のスキャンミラー４への入射角が、第２の励起光のスキャンミラー４への入射角に対して所定の角度θＳずれるように設定される。
　上記の第１及び第２のサブユニット６ａ，６ｂのＸ軸方向のシフト量、及び、２つのダイクロイックミラー９ａ，９ｂの設置角は、次の条件を満たすように設定される。つまり、上記の所定の角度θＳが、試料Ｍ上に入射する第１の励起光のスポットのエアリディスクが、試料Ｍ上に入射する第２の励起光のスポットのエアリディスクに重ならないような角度となるように設定される。一般に、エアリディスクの径φは、入射する励起光の波長をλと仮定し、対物レンズ５２の開口数をＮＡと仮定すると、下記式（１）；
φ＝１．２２×λ／ＮＡ　　　…（１）
により計算される。そのため、２つの励起光のスポットが重ならないようにするための試料Ｍ上の第１及び第２の励起光のスポット間のずらし量Δｄの最小値Δｄｍｉｎは、下記式（２）；
Δｄｍｉｎ＝φ１／２＋φ２／２，
φ１＝１．２２×λ１／ＮＡ，
φ２＝１．２２×λ２／ＮＡ　　　…（２）
で計算できる。
　ここで、スキャンミラー４と対物レンズ５２の射出瞳は共役の関係にあるので、スキャンミラー４の反射面の中心に入射する第１及び第２の励起光のそれぞれの光束は対物レンズ５２の射出瞳中心に入射する。その際に、対物レンズ５２への入射角は、スキャンレンズ７の結像倍率に従って変わる。対物レンズ５２はテレセントリックレンズであるため、試料Ｍ上においては第１及び第２の励起光の主光線が対物レンズ５２の光軸に平行な方向（Ｚ軸方向）となり、射出瞳への入射角に応じて２つの励起光のスポットの位置が試料Ｍ上でシフトする。この２つの励起光のスポットが試料Ｍ上で重ならないようにするために、スキャンミラー４への入射角のずれの角度θＳが、下記式（３）によって計算される角度θＳｍｉｎ以上となるように設定される。
θＳｍｉｎ＝ａｒｃｔａｎ（Δｄｍｉｎ／ｆ）／ｍａｇｓ　　…（３）
で計算される。なお、ｍａｇｓはスキャンレンズ７の倍率、ｆは対物レンズ５２の焦点距離である。
　また、各サブユニット６ａ，６ｂのピンホール板１２ａ、１２ｂのピンホールの径は、下記式（４）及び下記式（５）により計算されるエアリユニット（ＡＵ１，ＡＵ２）の値より小さく設定される。このように設定することで、蛍光像における波長間のクロストークを有効に防ぐことができる。
ＡＵ１＝ｍａｇｔ×φ１　　　…（４）
ＡＵ２＝ｍａｇｔ×φ２　　　…（５）
ここで、ｍａｇｔは、蛍光を観察するための光学系のトータルの倍率を示す。
　図２には、共焦点顕微鏡１０１により形成される試料Ｍ上の第１の励起光のスポットのエアリディスクの範囲Ｓ１及び第２の励起光のスポットのエアリディスクの範囲Ｓ２の分布を示し、図３には、共焦点顕微鏡１０１により試料Ｍ上に照射される第１の励起光及び第２の励起光のそれぞれのＸ軸方向に沿った一次元の光強度分布を示している。このように、試料Ｍ上に結ばれる第１及び第２の励起光のスポットの範囲Ｓ１，Ｓ２が互いに重ならないようにされることで、試料Ｍ上における２つの励起光の強度分布が分離され、その結果、２つの励起光によって生じる２つの波長域の蛍光像間の干渉が低減されることになる。
　以上説明した共焦点顕微鏡ユニット１Ａによれば、第１のサブユニット６ａから出力された第１の励起光がスキャンミラー４を経由して試料Ｍ上に走査され、それに応じて試料Ｍ上から生じた第１の蛍光がスキャンミラー４を経由して第１のサブユニット６ａ内に入射し、第１のサブユニット６ａ内のピンホール板１２ａにその像が結ばれて光検出器１３ａで検出される。加えて、第２のサブユニット６ｂから出力された第２の励起光がスキャンミラー４を経由して試料Ｍ上に走査され、それに応じて試料Ｍ上から生じた第２の蛍光がスキャンミラー４を経由して第２のサブユニット６ｂ内に入射し、第２のサブユニット６ｂ内のピンホール板１２ｂにその像が結ばれて光検出器１３ｂで検出される。ここで、これらのスキャンミラー４、第１及び第２のサブユニット６ａ，６ｂは、メイン筐体２に固定されており、第１及び第２のサブユニット６ａ，６ｂからスキャンミラー４への第１及び第２の励起光の入射角が互いに所定の角度θＳずらされているので、試料Ｍ上に走査される第１及び第２の励起光のスポットを分離することができ、その結果、第１及び第２のサブユニット６ａ，６ｂに導かれる第１及び第２の蛍光のビームを互いに分離することができる。これにより、ブリードスルーを低減した状態で複数の蛍光像の観察が可能にされる。加えて、スキャンミラー４により試料Ｍをスキャンする構成を採用することにより、全体の装置構成を簡素化することができる。
　あるいは、共焦点顕微鏡１０１は、上述の共焦点顕微鏡ユニット１Ａと、顕微鏡光学系及び共焦点顕微鏡ユニット１Ａが取り付けられる接続ポートＰ１を有する顕微鏡５０を備える共焦点顕微鏡である。このような共焦点顕微鏡１０１によれば、一般的な光学顕微鏡である顕微鏡５０を用いて、共焦点イメージングを容易に行うことができる。
　上記実施形態にかかる共焦点顕微鏡ユニット１Ａにおいては、ダイクロイックミラー９ａ，９ｂが、スキャンミラー４への第１及び第２の励起光の入射角のずれが所定の角度θＳとなるように、メイン筐体２内に配置されている。このような構成により、試料Ｍ上に走査される第１及び第２の励起光のスポットを分離することができ、その結果、第１及び第２のサブユニット６ａ，６ｂに導かれる第１及び第２の蛍光のビームを互いに分離することができる。これにより、ブリードスルーを低減した状態で複数の蛍光像の観察が可能にされる。
　また、共焦点顕微鏡ユニット１Ａにおいては、所定の角度θＳが試料Ｍ上において第１の励起光のエアリディスクと第２の励起光のエアリディスクとが分離されるような角度に設定されている。このような角度設定により、試料Ｍ上に走査される第１及び第２の励起光のスポットを完全に分離することができる。その結果、第１及び第２のサブユニット６ａ，６ｂに導かれる第１及び第２の蛍光のビームを互いに完全に分離することができる。これにより、ブリードスルーを低減した状態で複数の蛍光像の観察が可能にされる。
　上記実施形態においては、スキャンミラー４はＭＥＭＳミラーが採用されている。このような構成により、ユニットの小型化を容易に実現することができる。
　また、共焦点顕微鏡ユニット１Ａにおいては、第１のサブユニット６ａと第２のサブユニット６ｂとは、スキャンミラー４による蛍光の導光方向に沿って順に並んだ状態でメイン筐体２に固定されている。このような構成により、第２のサブユニット６ｂから照射された第２の励起光を、第１のサブユニット６ａを経由して顕微鏡５０側の試料Ｍに向けて照射することができるとともに、それに応じて試料Ｍから生じる第２の蛍光を、第１のサブユニット６ａを経由して第２のサブユニット６ｂ内に導入することできる。その結果、複数波長領域での共焦点イメージングを実現するユニットの小型化が可能となる。
［第２実施形態］
　図４は、第２実施形態にかかる共焦点顕微鏡ユニット１Ｂの概略構成図である。図４に示す共焦点顕微鏡ユニット１Ｂは、４つのサブユニットを有する点が第１実施形態の共焦点顕微鏡ユニット１Ａと異なる。以下、共焦点顕微鏡ユニット１Ｂの構成について、第１実施形態との相違点を中心に説明する。
　すなわち、共焦点顕微鏡ユニット１Ｂは、メイン筐体２内に第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄを備えている。
　第３のサブユニット６ｃは、ベース板８ｃと、ダイクロイックミラー（第３の光学ミラー）９ｃ、光源１０ｃ、コリメートレンズ１５ｃ、ダイクロイックミラー１１ｃ、バリアフィルタ１６ｃ、集光レンズ１７ｃ、ピンホール板（第３の絞り部材）１２ｃ、及び光検出器（第３の光検出器）１３ｃとを有する。
　ダイクロイックミラー９ｃは、第３のサブユニット６ｃが照射する波長λ３（＞λ２）の第３の励起光及びそれに応じて試料Ｍから生じる波長範囲Δλ３の第３の蛍光を反射し、第３の励起光及び第３の蛍光よりも長波長の光を透過させる性質を有する。ダイクロイックミラー１１ｃは、波長範囲Δλ３の第３の蛍光を透過し、波長範囲Δλ３より短い波長λ３の第３の励起光を反射させる性質を有する。光源１０ｃは、波長λ３の第３の励起光を出力する発光素子である。コリメートレンズ１５ｃは、光源１０ｃから出力された第３の励起光を平行光に変換する。
　バリアフィルタ１６ｃは、ダイクロイックミラー１１ｃに隣接して設けられ、第３の蛍光以外のノイズ光をカットするフィルタ部材である。集光レンズ１７ｃは、バリアフィルタ１６ｃを透過した第３の蛍光をピンホール板１２ｃのピンホールに集光する。ピンホール板１２ｃは、そのピンホール位置が試料Ｍの第３の励起光のスポットの共役位置に一致するように配置され、第３の蛍光の光束を制限する絞り部材である。
　光検出器１３ｃは、その検出面がピンホール板１２ｃに対向して配置され、ピンホール板１２ｃを通過した第３の蛍光を受光および検出する。なお、光検出器１３ｃは、光電子増倍管、フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、ＭＰＰＣ（Multi-Pixel　Photon　Counter）、ＨＰＤ（Hybrid　Photo　Detector）、或いはエリアイメージセンサ等である。
　第４のサブユニット６ｄは、ベース板８ｄと、全反射ミラー（第４の光学ミラー）９ｄ、光源１０ｄ、コリメートレンズ１５ｄ、ダイクロイックミラー１１ｄ、バリアフィルタ１６ｄ、集光レンズ１７ｄ、ピンホール板（第４の絞り部材）１２ｄ、及び光検出器（第４の光検出器）１３ｄとを有する。
　全反射ミラー９ｄは、第４のサブユニット６ｄが照射する波長λ４（＞λ３）の第４の励起光及びそれに応じて試料Ｍから生じる波長範囲Δλ４の第４の蛍光を反射する。ダイクロイックミラー１１ｄは、波長範囲Δλ４の第４の蛍光を透過し、波長範囲Δλ４より短い波長λ４の第４の励起光を反射させる性質を有する。光源１０ｄは、波長λ４の第４の励起光を出力する発光素子である。コリメートレンズ１５ｄは、光源１０ｄから出力された第４の励起光を平行光に変換する。
　バリアフィルタ１６ｄは、ダイクロイックミラー１１ｄに隣接して設けられ、第４の蛍光以外のノイズ光をカットするフィルタ部材である。集光レンズ１７ｄは、バリアフィルタ１６ｄを透過した第４の蛍光をピンホール板１２ｄのピンホールに集光する。ピンホール板１２ｄは、そのピンホール位置が試料Ｍの第４の励起光のスポットの共役位置に一致するように配置され、第４の蛍光の光束を制限する絞り部材である。
　光検出器１３ｄは、その検出面がピンホール板１２ｄに対向して配置され、ピンホール板１２ｄを通過した第４の蛍光を受光および検出する。なお、光検出器１３ｄは、光電子増倍管、フォトダイオード、アバランシェフォトダイオード、ＭＰＰＣ（Multi-Pixel　Photon　Counter）、ＨＰＤ（Hybrid　Photo　Detector）、或いはエリアイメージセンサ等である。
　第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄは、スキャンミラー４及び固定ミラー５による第１～第４の蛍光の導光方向（Ｚ軸方向）に沿って、この順番で固定ミラー５から離れる方向に並ぶように、かつ、第１～第４の蛍光の光路上にダイクロイックミラー９ａ～９ｃ及び全反射ミラー９ｄが位置するように、メイン筐体２内に固定される。詳細には、第４のサブユニット６ｄは、第３のサブユニット６ｃに対して、ダイクロイックミラー９ｃ及び全反射ミラー９ｄの中心位置を基準に、Ｘ軸方向にシフトするように配置されている。また、第３及び第４のサブユニット６ｃ，６ｄは、第１及び第２のサブユニット６ａ，６ｂに対して、ダイクロイックミラー９ａ～９ｃ及び全反射ミラー９ｄの中心位置を基準に、Ｙ軸方向にシフトするようにも配置されている。さらに、ダイクロイックミラー９ａ～９ｃ及び全反射ミラー９ｄは、それぞれが反射する第１～第４の励起光がスキャンミラー４の反射面の中心に入射するように、それぞれの設置角が設定されている。このように配置されることにより、隣接する２つのサブユニットからスキャンミラー４に入射する２つの蛍光の入射角が、互いに所定の角度θＳ以上ずれるように設定される。
　図５は、第３及び第４のサブユニット６ｃ，６ｄの配置をＹ軸方向にシフトさせるための構造を、鏡筒３側から見た透視図である。このように、本実施形態では、メイン筐体２のベース板１４上に平板状のスペーサ２１を配置し、そのスペーサ２１上に第３及び第４のサブユニット６ｃ，６ｄを搭載する構造を採用する。このような構造により、第３及び第４のサブユニット６ｃ，６ｄを第１及び第２のサブユニット６ａ，６ｂに対してＹ軸方向に所望の幅だけシフトさせて配置することができる。
　図６には、共焦点顕微鏡ユニット１Ｂにおける第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄからスキャンミラー４に入射する第１～第４の励起光ビームの光束Ｂ１～Ｂ４の軌跡を示し、図７には、共焦点顕微鏡ユニット１Ｂにより形成される試料Ｍ上の第１～第４の励起光のスポットのエアリディスクの範囲Ｓ１～Ｓ４の分布を示している。図６には、各励起光ビームの光束Ｂ１～Ｂ４の外縁を実線で示し、各励起光ビームの光束Ｂ１～Ｂ４の中心ＢＣ１～ＢＣ４を一点鎖線で示している。共焦点顕微鏡ユニット１Ｂによれば、第１～第４の励起光ビームがスキャンミラー４の入射面ＲＦの中心に入射するように設定され、第１～第４の励起光ビームが互いに入射角が２次元方向にずれるように設定される。また、互いの入射角のずれが所定の角度θＳ以上とされることにより、試料Ｍ上に結ばれる第１～第４の励起光のスポットのエアリディスクの範囲Ｓ１～Ｓ４が互いに重ならないように設定される。
　上記の第２実施形態に係る共焦点顕微鏡ユニット１Ｂによれば、試料Ｍ上に走査される第１～第４の励起光のスポットを分離することができ、その結果、第１～第４のサブユニット６ａ～６ｄに導かれる第１～第４の蛍光のビームを互いに分離することができる。これにより、４種類の励起波長を用いてもブリードスルーを低減した状態で蛍光像の観察が可能にされる。
［第３実施形態］
　図８は、第３実施形態にかかる共焦点顕微鏡ユニット１Ｃの概略構成図である。図８に示す共焦点顕微鏡ユニット１Ｃは、２つのサブユニット６ａ，６ｂのベース板８ａ，８ｂ上におけるダイクロイックミラー９ａ，９ｂの配置が同一である点で第１実施形態の共焦点顕微鏡ユニット１Ａと異なる。以下、共焦点顕微鏡ユニット１Ｃの構成について、第１実施形態との相違点を中心に説明する。
　第１のサブユニット６ａ内のベース板８ａ上におけるダイクロイックミラー９ａ以外の要素、すなわち、光源１０ａ、コリメートレンズ１５ａ、ダイクロイックミラー１１ａ、バリアフィルタ１６ａ、集光レンズ１７ａ、ピンホール板１２ａ、及び光検出器１３ａを含む要素のダイクロイックミラー９ａを基準にした配置が、第２のサブユニット６ｂ内のベース板８ｂ上におけるダイクロイックミラー９ｂ以外の要素、すなわち、光源１０ｂ、コリメートレンズ１５ｂ、ダイクロイックミラー１１ｂ、バリアフィルタ１６ｂ、集光レンズ１７ｂ、ピンホール板１２ｂ、及び光検出器１３ｂを含む要素のダイクロイックミラー９ｂを基準にした配置と異なるように調整されている。この調整は、例えば、第１のサブユニット６ａ内のダイクロイックミラー９ａ以外の要素、あるいは、第２のサブユニット６ｂ内のダイクロイックミラー９ｂ以外の要素が、ベース板８ａ，８ｂ上で一体的にその姿勢及びその位置を変更可能にされることで実現される。
　詳細には、第１及び第２のサブユニット６ａ，６ｂの上記構成により、第１のサブユニット６ａ内におけるダイクロイックミラー９ａに対する第１の励起光の入射角・入射位置、及び、第２のサブユニット６ｂ内におけるダイクロイックミラー９ｂに対する第２の励起光の入射角・入射位置が、第１の励起光のスキャンミラー４への入射角と第２の励起光のスキャンミラー４への入射角とが所定の角度θＳずれるように、設定される。
　上記の第２実施形態に係る共焦点顕微鏡ユニット１Ｃによれば、第１及び第２のサブユニット６ａ，６ｂにおける第１及び第２のダイクロイックミラー９ａ，９ｂに対する励起光の入射角を設定することにより、試料Ｍ上に走査される第１及び第２の励起光のスポットを分離することができ、その結果、第１及び第２のサブユニット６ａ，６ｂに導かれる第１及び第２の蛍光のビームを互いに分離することができる。これにより、ブリードスルーを低減した状態で２つの蛍光波長における蛍光像の観察が可能にされる。
　以上、本開示の種々の実施形態について説明したが、本開示は上記実施形態に限定されるものではなく、各請求項に記載した要旨を変更しない範囲で変形し、又は他のものに適用したものであってもよい。
　上記実施形態は、共焦点光学系を構成するために絞り部材としてピンホール板を用いているが、絞り部材は光束を制限する光学素子であればよく、例えば、色彩絞りやファイバコアなどであってもよい。ファイバ出力タイプの光源を用いる場合、ファイバコア端面の位置を絞り位置（光束が制限される位置）とすればよい。
　また、上記実施形態は、固体レーザやダイオードレーザなどのレーザ光源を用いることもできる。この場合、これらのレーザ光源のビームウェストの位置を絞り位置（光束が制限される位置）とすればよく、光源自体が絞り部材の役割を果たすことになる。
　上記第１～第３実施形態においては、扱う励起光及び蛍光の波長範囲が短い順番でスキャンミラー４側から離れる方向に複数のサブユニットが配置されていたが、波長範囲が長い順番で配置されてもよい。ただし、この場合、ダイクロイックミラー９ａ～９ｃの特性は、各サブユニット６ａ～６ｃのそれぞれで扱う比較的長波長の励起光及び蛍光を反射し、他のサブユニットで扱う比較的短波長の励起光及び蛍光を透過するような特性に設定される。
　上記第２実施形態においては、全てのサブユニット６ａ～６ｄのうちの２つのサブユニット間で試料Ｍ上に結ばれる励起光のスポットが重ならないように構成されていたが、隣り合うサブユニット間でスポットが重ならないように構成されていればよい。例えば、第１のサブユニット６ａと第２のサブユニット６ｂとの間、第２のサブユニット６ｂと第３のサブユニット６ｃとの間、及び第３のサブユニット６ｃと第４のサブユニット６ｄとの間で、励起光のスポットが重ならないように構成されていればよい。これに対して、第１のサブユニット６ａと第３のサブユニット６ｃとの間、あるいは、第２のサブユニット６ｂと第４のサブユニット６ｄとの間では、励起光のスポットが重なっていてもよい。この場合であっても、ダイクロイックミラーによって、一方のサブユニットの観察対象の蛍光と他方のサブユニットの観察対象の蛍光とを容易に分離することができる。具体的な構成としては、第２の実施形態にかかる共焦点顕微鏡ユニット１Ｂにおいては、第３及び第４のサブユニット６ｃ，６ｄは、第１及び第２のサブユニット６ａ，６ｂに対してＹ軸方向にずらすことなく配置されていてもよい。このような構成でも、波長領域の近い２つの励起光のスポットを試料Ｍ上で分離することができるので、検出される複数の波長範囲の蛍光ビームが互いに影響しあうことを防ぐことができ、ブリードスルーを低減した状態で複数の蛍光像の観察が可能にされる。
　上記実施形態においては、第１のサブユニットは、第１の励起光及び第１の蛍光を反射し、第２の励起光及び第２の蛍光を透過する第１の光学ミラーを有し、第２のサブユニットは、第２の励起光及び第２の蛍光を反射する第２の光学ミラーを有し、第１の光学ミラー及び第２の光学ミラーが、スキャンミラーへの第１の励起光の入射角が、スキャンミラーへの第２の励起光の入射角に対して所定の角度ずれるように、メイン筐体内に配置されてもよい。これにより、第１及び第２の光学ミラーのメイン筐体内での配置を設定することにより、試料上に走査される第１及び第２の励起光のスポットを分離することができ、その結果、第１及び第２のサブユニットに導かれる第１及び第２の蛍光のビームを互いに分離することができる。これにより、ブリードスルーを低減した状態で複数の蛍光像の観察が可能にされる。
　また、第１のサブユニットは、第１の励起光及び第１の蛍光を反射し、第２の励起光及び第２の蛍光を透過する第１の光学ミラーを有し、第２のサブユニットは、第２の励起光及び第２の蛍光を反射する第２の光学ミラーを有し、第１のサブユニット及び第２のサブユニットは、第１の光学ミラーへの第１の励起光の入射角と、第２の光学ミラーへの第２の励起光の入射角とが、スキャンミラーへの第１の励起光の入射角が、スキャンミラーへの第２の励起光の入射角に対して所定の角度ずれるように、設定されてもよい。この場合、第１及び第２のサブユニットにおける第１及び第２の光学ミラーに対する励起光の入射角を設定することにより、試料上に走査される第１及び第２の励起光のスポットを分離することができ、その結果、第１及び第２のサブユニットに導かれる第１及び第２の蛍光のビームを互いに分離することができる。これにより、ブリードスルーを低減した状態で複数の蛍光像の観察が可能にされる。
　さらに、上記の所定の角度は、試料上において、第１の励起光のエアリディスクと第２の励起光のエアリディスクとが分離されるような角度である、ことが好適である。このような角度にすれば、試料上に走査される第１及び第２の励起光のスポットを完全に分離することができ、その結果、第１及び第２のサブユニットに導かれる第１及び第２の蛍光のビームを互いに完全に分離することができる。これにより、ブリードスルーがない状態で複数の蛍光像の観察が可能にされる。
　上記実施形態においては、スキャンミラーはＭＥＭＳミラーであってもよい。この場合、装置の小型化を容易に実現することができる。
　また、第１のサブユニットと第２のサブユニットとは、スキャンミラーによる蛍光の導光方向に沿って、第１のサブユニットおよび第２のサブユニットの順で並んだ状態でメイン筐体に固定されてもよい。かかる構成によれば、第２のサブユニットから照射された第２の励起光を、第１のサブユニットを経由して顕微鏡側の試料に向けて照射することができるとともに、それに応じて試料から生じる第２の蛍光を、第１のサブユニットを経由して第２のサブユニット内に導入することできる。その結果、複数波長領域でのイメージングを実現する装置の小型化が可能となる。
　実施形態は、共焦点顕微鏡を構成する共焦点顕微鏡ユニット及び共焦点顕微鏡を使用用途とし、簡易な構成によりブリードスルーを低減した状態で複数蛍光による蛍光イメージングを実現できるものである。
　Ｍ…試料、Ｐ１…接続ポート、θＳ…所定の角度、１０ａ～１０ｄ…光源、１２ａ～１２ｄ…ピンホール板（絞り部材）、１３ａ～１３ｄ…光検出器、６ａ～６ｄ…第１～第４のサブユニット、９ａ～９ｃ…ダイクロイックミラー（第１～第３の光学ミラー）、９ｄ…全反射ミラー（第４の光学ミラー）、１Ａ，１Ｂ，１Ｃ…共焦点顕微鏡ユニット、２…メイン筐体、３…鏡筒、４…スキャンミラー、７…スキャンレンズ、５０…顕微鏡、１０１…共焦点顕微鏡。

Claims (7)

  1. 　顕微鏡光学系を有する顕微鏡の接続ポートに取り付けられることにより、共焦点顕微鏡を構成する共焦点顕微鏡ユニットであって、
    　第１の励起光を出力する光源、前記第１の励起光に応じて観察対象の試料から生じる第１の蛍光の光束を制限する第１の絞り部材、及び、前記第１の絞り部材を通過した第１の蛍光を検出する第１の光検出器を有する第１のサブユニットと、
    　第２の励起光を出力する光源、前記第２の励起光に応じて前記試料から生じる第２の蛍光の光束を制限する第２の絞り部材、及び、前記第２の絞り部材を通過した第２の蛍光を検出する第２の光検出器を有する第２のサブユニットと、
    　前記第１及び第２のサブユニットから出力された励起光を、前記顕微鏡光学系を経由して前記試料上を走査させ、前記励起光に応じて前記試料から生じる蛍光を前記第１及び第２のサブユニットに向けて導くスキャンミラーと、
    　前記接続ポートに取り付け可能に構成され、前記スキャンミラー、前記第１のサブユニット、及び前記第２のサブユニットが固定されたメイン筐体と、
    を備え、
    　前記第１のサブユニット及び前記第２のサブユニットは、前記スキャンミラーへの前記第１の励起光の入射角が、前記スキャンミラーへの第２の励起光の入射角に対して所定の角度ずれるように、前記メイン筐体内に配置される、
    共焦点顕微鏡ユニット。
  2. 　前記第１のサブユニットは、前記第１の励起光及び前記第１の蛍光を反射し、前記第２の励起光及び前記第２の蛍光を透過する第１の光学ミラーを有し、
    　前記第２のサブユニットは、前記第２の励起光及び前記第２の蛍光を反射する第２の光学ミラーを有し、
    　前記第１の光学ミラー及び前記第２の光学ミラーが、前記スキャンミラーへの前記第１の励起光の入射角が、前記スキャンミラーへの第２の励起光の入射角に対して所定の角度ずれるように、前記メイン筐体内に配置される、
    請求項１に記載の共焦点顕微鏡ユニット。
  3. 　前記第１のサブユニットは、前記第１の励起光及び前記第１の蛍光を反射し、前記第２の励起光及び前記第２の蛍光を透過する第１の光学ミラーを有し、
    　前記第２のサブユニットは、前記第２の励起光及び前記第２の蛍光を反射する第２の光学ミラーを有し、
    　前記第１のサブユニット及び前記第２のサブユニットは、前記第１の光学ミラーへの前記第１の励起光の入射角と、前記第２の光学ミラーへの第２の励起光の入射角とが、前記スキャンミラーへの前記第１の励起光の入射角が前記スキャンミラーへの第２の励起光の入射角に対して所定の角度ずれるように、設定される、
    請求項１に記載の共焦点顕微鏡ユニット。
  4. 　前記所定の角度は、前記試料上において、前記第１の励起光のエアリディスクと前記第２の励起光のエアリディスクとが分離されるような角度である、
    請求項１～３のいずれか１項に記載の共焦点顕微鏡ユニット。
  5. 　前記スキャンミラーはＭＥＭＳミラーである、
    請求項１～４のいずれか１項に記載の共焦点顕微鏡ユニット。
  6. 　前記第１のサブユニットと前記第２のサブユニットとは、前記スキャンミラーによる前記蛍光の導光方向に沿って、前記第１のサブユニットおよび前記第２のサブユニットの順で並んだ状態で前記メイン筐体に固定されている、
    請求項１～５のいずれか１項に記載の共焦点顕微鏡ユニット。
  7. 　請求項１～６のいずれか１項に記載の共焦点顕微鏡ユニットと、
    　前記顕微鏡光学系及び前記共焦点顕微鏡ユニットが取り付けられる接続ポートを有する顕微鏡を備える、共焦点顕微鏡。
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