JP4939806B2 - レーザ走査型蛍光顕微鏡 - Google Patents

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Description

本発明は、細胞の機能の解明やイメージング等のアプリケーションにおいて蛍光観察や共焦点蛍光観察に用いられるレーザ走査型蛍光顕微鏡に関する。
従来、この種のレーザ走査型蛍光顕微鏡は、顕微鏡の一般的な観察に加えて試料の微小スポット領域に集光させたレーザ光をガルバノミラーなどの走査手段によって走査し、試料から発する光を検出し画像を得ている。
図１はレーザ走査型共焦点蛍光顕微鏡の一従来例を示す概略構成図である。
図１のレーザ走査型共焦点蛍光顕微鏡は、レーザ光源部５１と、レーザ光源部５１からの励起光を試料５２上に集光する対物レンズ光学系５３と、レーザ光源部５１からの励起光を試料５２面上で走査させる走査手段５４と、走査手段５４と対物レンズ光学系５３との間に配置された瞳投影レンズ５５と、試料５２から発し対物レンズ光学系５３と瞳投影レンズ５５を経た蛍光を検出する検出光学系５６を備えている。
レーザ光源部５１は、レーザ光源５１ａと、レンズ５１ｂ，５１ｄとピンホール５１ｃからなるコリメート光学系と、ダイクロイックミラー５１ｅを有している。
対物レンズ光学系５３は、対物レンズ５３ａと試料５２の中間像を形成するための結像レンズ５３ｂを有している。また、対物レンズ５３ａの後側焦点位置が、結像レンズ５３ｂと瞳投影レンズ５５とによって走査手段５４の近傍位置で共役になるように構成されている。
走査手段５４は、ガルバノミラー５４ａ，５４ｂを有する近接型ガルバノミラーで構成されている。
検出光学系５６は、ダイクロイックミラー５６ａと、バリアフィルター５６ｂと、レンズ５６ｃと、共焦点ピンホール５６ｄと、フォトマル等の受光センサー５６ｅを有している。
その他、図１の顕微鏡は、光源部５１からの励起光を試料５２に導くとともに試料５２からの蛍光を検出手段５６に導くダイクロイックミラー５７と、瞳投影レンズ５５を経た光を結像レンズ５３ｂへ偏向するミラー５９と、試料５２の像を観察するための接眼光学系６０と、通常の蛍光観察時に用いる蛍光照明光学系６１を有している。
このように構成された図１のレーザ走査型共焦点蛍光顕微鏡では、レーザ光源５１ａから出射した励起光は、レンズ５１ｂによりピンホール５１ｃに集光され、レンズ５１ｄにより平行光に変換される。その後、この励起光は、ダイクロイックミラー５１ｅ、５７を経て、走査手段５４である近接型ガルバノミラー部に導かれ、ガルバノミラー５４ａ，５４ｂのそれぞれの回転により光束を光軸に対し２次元方向にシフトさせられ、瞳投影レンズ５５を経て中間像位置５８に集光して１次像を結像する。中間像位置５８に集光した励起光は、ミラー５９、結像レンズ５３ｂ、対物レンズ５３ａを経て試料５２に微小スポット状に照射される。このとき、試料５２面に照射される励起光は走査手段５４によって走査される。
また、対物レンズ５３ａの後側焦点位置は、結像レンズ５３ｂと瞳投影レンズ５５によって走査手段５４である近接型ガルバノミラー近傍に投影されている。
励起光が照射されることによって試料５２で励起した蛍光は、対物レンズ５３ａ、結像レンズ５３ｂ、瞳投影レンズ５５、走査手段５４、ダイクロイックミラー５７を経て、検出光学系５６に導かれる。そして、ダイクロイックミラー５６ａで波長分離され、バリアフィルター５６ｂ、レンズ５６ｃを経て、共焦点ピンホールを通過した蛍光だけが、フォトマル等の受光センサー５６ｅによって検出される。
また、接眼光学系６０を介して通常の蛍光観察を行う場合には、レーザ光源５１ａとは異なる光源６１ａを備えた蛍光照明光学系６１を用いる。光源６１ａから出射した励起光は、レンズ６１ｂ、フィルター６１ｃを通り、ダイクロイックミラー６１ｄで反射し、対物レンズ５３ａを介して試料５２を照明する。励起光が照射されることによって試料５２で励起した蛍光は、対物レンズ５３ａで集光され、蛍光照明光学系６１に配置されたダイクロイックミラー６１ｄにより波長分離され、バリアフィルター６１ｅを経て、接眼光学系６０のプリズム６０ａ、接眼レンズ６０ｂを介して観察される。
このような従来のレーザ走査型共焦点蛍光顕微鏡は、解像力に優れ、観察する微小スポット以外の光を除去できる利点を備えており、細胞内の機能解明等に役立っている。
しかしながら、レーザ走査型共焦点蛍光顕微鏡においては、対物レンズ５３ａと結像レンズ５３ｂといった通常の蛍光観察に用いる光学系に加えて、上述した瞳投影レンズ５５、走査手段５４等の光学系を付加する必要があるため、装置自体が大きくなる。
即ち、一般に、レーザ走査型共焦点蛍光顕微鏡の光学系は、結像レンズの焦点距離が約１８０ｍｍ前後と長くなっている。このため、試料から対物レンズの瞳の共役位置近傍に配置される走査手段までの全長が４００〜５００mmとなり、装置全体が大型化している。
このため、共焦点蛍光観察や蛍光観察が可能となるのは、顕微鏡のステージ上に試料を配置した場合に限られる。
そして、実際、ラットや小動物あるいは細胞の培養環境下で生きたままの状態（in vivo）で共焦点蛍光観察を行う場合、ステージ上に観察環境を構築しなければならないという制限があった。
さらに、レーザ走査型共焦点蛍光顕微鏡は、一般に、対物レンズの光軸がステージ面に対して垂直となる状態で観察を行うように構成されている。このため、試料に対し斜めの観察方向から観察することは困難である。また、レーザ走査型共焦点蛍光顕微鏡全体を試料に対して傾ける、あるいは試料やステージを傾けて観察を行うことも困難である。
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、従来のレーザ走査型共焦点蛍光顕微鏡と比べて、装置を小型化でき、可視域から近赤外域までの波長でもって、特に細胞を生きたままの状態で観察できる使い勝手のよいレーザ走査型蛍光顕微鏡を提供することを目的としている。
上記目的を達成するため、本発明によるレーザ走査型蛍光顕微鏡は、レーザ光源部と、前記レーザ光源部からの励起光を試料上に集光する対物レンズ光学系と、前記レーザ光源部からの励起光を試料面上に走査する走査手段と、前記走査手段と前記対物レンズ光学系との間に配置された瞳投影レンズと、試料から発し前記対物レンズ光学系と前記瞳投影レンズを経た蛍光を検出する検出光学系を備え、前記対物レンズ光学系が、対物レンズと、試料の中間像を形成するための結像レンズとを有し、前記対物レンズの後側焦点位置が、前記結像レンズと前記瞳投影レンズとによって前記走査手段の近傍位置で共役になるように構成されるレーザ走査型蛍光顕微鏡であって、前記瞳投影レンズが、複数のレンズ群からなり、最も前記走査手段側のレンズ面が前記走査手段側に凹面を向け、最も中間像側のレンズ面が中間像側に凹面を向けており、前記対物レンズの同焦点距離をＤ、試料面から前記走査手段近傍に配置された、前記対物レンズの後側焦点位置の共役位置までの距離をＬ、前記走査手段の近傍に位置する前記対物レンズの瞳の共役位置から前記結像レンズの中間像位置までの距離をＤ３、前記瞳投影レンズの焦点距離をＦｅとするとき、次の条件式（１）,（２）を満足することを特徴としている。
０．１５≦Ｄ／Ｌ≦０．５ ・・・（１）
０．２≦Ｆｅ／Ｄ３≦０．５ ・・・（２）
また、本発明によるレーザ走査型蛍光顕微鏡は、レーザ光源部と、前記レーザ光源部からの励起光を試料上に集光させる対物レンズ光学系と、前記レーザ光源部からの励起光を試料面上で走査させる走査手段と、前記走査手段と前記対物レンズ光学系との間に配置された瞳投影レンズと、試料から発し前記対物レンズ光学系と前記瞳投影レンズを経た蛍光を検出する検出光学系を備え、前記対物レンズ光学系が、対物レンズと、試料の中間像を形成するための結像レンズとを有し、前記対物レンズの後側焦点位置が、前記結像レンズと前記瞳投影レンズとによって前記走査手段の近傍位置で共役になるように構成されるレーザ走査型蛍光顕微鏡であって、前記結像レンズが、前記対物レンズ光学系が、複数のレンズ群からなり、正レンズと負レンズの接合レンズを少なくとも１つ備え、前記対物レンズの同焦点距離をＤ、試料面から前記走査手段近傍に配置された、前記対物レンズの後側焦点位置の共役位置までの距離をＬ、前記接合レンズ中の正レンズのアッベ数をνｐ、前記結像レンズの焦点距離をＦＴＬ、前記対物レンズの胴付き位置から中間像位置までの距離をＤ１とするとき、次の条件式（１）,（３）,（４）を満足することを特徴としている。
０．１５≦Ｄ／Ｌ≦０．５ ・・・（１）
０．４≦ＦＴＬ／Ｄ１≦１ ・・・（３）
８０≦νｐ ・・・（４）
また、本発明によるレーザ走査型蛍光顕微鏡は、レーザ光源部と、前記レーザ光源部からの励起光を試料上に集光させる対物レンズ光学系と、前記レーザ光源部からの励起光を試料面上で走査させる走査手段と、前記走査手段と前記対物レンズ光学系との間に配置された瞳投影レンズと、試料から発し前記対物レンズ光学系と前記瞳投影レンズを経た蛍光を検出する検出光学系を備え、前記対物レンズ光学系が、対物レンズと、試料の中間像を形成するための結像レンズとを有し、前記対物レンズの後側焦点位置が、前記結像レンズと前記瞳投影レンズとによって前記走査手段の近傍位置で共役になるように構成されるレーザ走査型蛍光顕微鏡であって、前記結像レンズが、少なくとも中間像側の前群と対物レンズ側の後群の２つのレンズ群からなり、前記結像レンズの前群のレンズ群は、少なくとも１つの負レンズを有し、前記対物レンズの同焦点距離をＤ、試料面から前記走査手段近傍に配置された、前記対物レンズの後側焦点位置の共役位置までの距離をＬ、前記結像レンズの後群の焦点距離をＦＴＬ１、前記結像レンズの前群と前記結像レンズの後群との間隔をＤ２とするとき、次の条件式（１）,（５）,（６）を満足することを特徴としている。
０．１５≦Ｄ／Ｌ≦０．５ ・・・（１）
０．４≦Ｄ２／ＦＴＬ≦１ ・・・（５）
０．７≦ＦＴＬ１／ＦＴＬ≦１．５ ・・・（６）
また、本発明のレーザ走査型蛍光顕微鏡においては、前記レーザ光源部からの励起光を前記走査手段へ導く光伝送手段を備えるのが好ましい。
また、本発明のレーザ走査型蛍光顕微鏡においては、前記瞳投影レンズが、複数のレンズ群からなり、最も前記走査手段側のレンズ面が前記走査手段側に凹面を向け、最も中間像側のレンズ面が中間像側に凹面を向けており、前記走査手段近傍に位置する前記対物レンズの瞳の共役位置から前記結像レンズの中間像位置までの距離をＤ３、前記瞳投影レンズの焦点距離をＦｅとするとき、次の条件式(2)を満足するのが好ましい。
０．２≦Ｆｅ／Ｄ３≦０．５ …(2)
また、本発明のレーザ走査型蛍光顕微鏡においては、前記対物レンズ光学系が、複数のレンズ群からなり、正レンズと負レンズの接合レンズを少なくとも１つ備え、前記接合レンズ中の正レンズのアッベ数をνｐ、前記結像レンズの焦点距離をＦＴＬ、前記対物レンズの胴付き位置から中間像位置までの距離をＤ１とするとき、次の条件式（３），（４）を満足するのが好ましい。
０．４≦ＦＴＬ／Ｄ１≦１ ・・・（３）
８０≦νｐ ・・・（４）
また、本発明のレーザ走査型蛍光顕微鏡においては、前記結像レンズが、少なくとも中間像側の前群と対物レンズ側の後群の２つのレンズ群からなり、前記結像レンズの前群のレンズ群には、少なくとも１つの負レンズを有し、前記結像レンズの後群の焦点距離をＦＴＬ１、前記結像レンズの前群と前記結像レンズの後群との間隔をＤ２とするとき、次の条件式(5)，(6)を満足するのが好ましい。
０．４≦Ｄ２／ＦＴＬ≦１ …(5)
０．７≦ＦＴＬ１／ＦＴＬ≦１．５ …(6)
また、本発明のレーザ走査型蛍光顕微鏡においては、前記レーザ光源部からの励起光を前記走査手段へ導く第１のマルチモードファイバーと、試料からの蛍光を前記検出光学系へ導く第２のマルチモードファイバーを備えると共に、前記励起光を前記第１のマルチモードファイバーに入射させる第１のレンズと、前記蛍光を前記第２のマルチモードファイバーに入射させる第２のレンズを有し、前記第１のマルチモードファイバーのコア径をΦｅｘ、前記第２のマルチモードファイバーのコア径をΦｅｍ、前記第１のレンズにより前記第１のマルチモードファイバーに入射する開口数をＮＡｅｘ、前記励起波長をλｅｘ、前記第２のレンズにより前記第２のマルチモードファイバーに入射する開口数をＮＡｅｍ、前記蛍光波長をλｅｍとするとき、次の条件式(7)〜(9)を満足するのが好ましい。
２≦Φｅｍ／Φｅｘ≦１２ …(7)
０．６１×（λｅｘ／ＮＡｅｘ）＜Φｅｘ …(8)
０．６１×（λｅｍ／ＮＡｅｍ）＜Φｅｍ …(9)
また、本発明のレーザ走査型蛍光顕微鏡においては、試料からの蛍光を前記検出光学系へ導く光伝送手段を備えるのが好ましい。
本発明のレーザ走査型顕微鏡によれば、条件式(1)を満足することにより、走査手段から試料面までの距離を短くして装置を小型化することができる。
また、レーザ光学系と走査手段との間に光伝送手段を配置することにより、走査手段から対物レンズまでの本体光学系とレーザ光学系の配置に自由度を持たせることができ、生きたままの試料の状態（in vivo）での観察に好適な小型化された本体光学系を構成することができる。
また、走査手段によって偏向された平行光束を中間像位置ヘリレーさせる瞳投影レンズを、複数のレンズ群を備え、最も走査手段側に配置されたレンズ面が走査手段側に凹面を向け、最も中間像側に配置されたレンズ面が中間像側に凹面を備えるように構成することにより、中間像での光学性能を良好に補正することが可能となる。
また、条件式(2)を満足することにより、瞳投影レンズの光学性能を良好にしながら走査手段から中間像位置までの距離を短くして装置を小型化することが可能となる。
また、条件式(3)を満足することにより、対物レンズの胴付き位置から中間像位置までの距離を短くして装置を小型化することが可能となる。
また、条件式(4)を満足することにより、焦点距離を短くすることによって発生する球面収差、軸上色収差の補正を良好に行うことが可能となる。
また、結像レンズを２つのレンズ群で構成することにより、前群での収差を打ち消すように後群で収差を補正することが可能となり、in vivoでの観察により好適なレーザ顕微鏡が得られる。
また、条件式(5)及び(6)を満足することにより、非点収差とコマ収差および倍率色収差をより補正することが可能となる。
また、レーザ光源部からの励起光を走査手段へ導く第１のマルチモードファイバーと、試料からの蛍光を検出光学系へ導く第２のマルチモードファイバーを備えた構成において、条件式(7)〜(9)を満足することにより、光源からの励起光に対して検出される蛍光量の割合が高くなり、より明るい蛍光が検出でき、且つ、試料からの厚さ方向の画像情報が所定厚さにわたって得られるので、試料が生きたままの状態（in vivo）での観察において、操作性が向上する。
また、瞳投影レンズと検出光学系との間に光伝送手段を配置することにより、瞳投影レンズから対物レンズまでの本体光学系と検出光学系の配置に自由度を持たせることができ、in vivoでの観察に好適な小型化された本体光学系を構成することができる。
さらに、光源部からの励起光を走査手段へ導く光伝送手段と、試料からの蛍光を検出光学系へ導く光伝送手段とをそれぞれ別箇の光ファイバーで設ければ、励起光が光ファイバーに入射したときに発生する自家蛍光の影響を検出光学系で受けずに済み、試料で発生した蛍光を高精度に検出できる。
図１はレーザ走査型共焦点蛍光顕微鏡の一従来例を示す概略構成図である。 図２は本発明にかかるレーザ走査型蛍光顕微鏡の第１実施例の概略構成図である。 図３は図２の顕微鏡における顕微鏡本体部に備わる光学系の概略構成を示す要部説明図である。 図４は図３に示した顕微鏡本体部の光学系にレーザ光源部と検出光学系を加えた構成を示す説明図である。 図５は本発明にかかるレーザ走査型蛍光顕微鏡の第２実施例における光学系の概略構成を示す説明図である。 図６は本発明にかかるレーザ走査型蛍光顕微鏡の第３実施例における光学系の概略構成を示す説明図である。 図７は本発明にかかるレーザ走査型蛍光顕微鏡の第４実施例における光学系の概略構成を示す説明図である。 図８は本発明の第１実施例における瞳投影光学系及び対物レンズ光学系の構成を示す光軸に沿う断面図である。 図９は本発明の第２実施例における瞳投影光学系及び対物レンズ光学系の光学構成を示す光軸に沿う断面図である。 図１０は本発明の第３実施例における瞳投影光学系及び対物レンズ光学系の光学構成を示す光軸に沿う断面図である。
図２は本発明にかかるレーザ走査型蛍光顕微鏡の第１実施例の概略構成図、図３は図２の顕微鏡における顕微鏡本体部１１に備わる光学系の概略構成を示す要部説明図、図４は図３に示した顕微鏡本体部１１の光学系にレーザ光源部と検出光学系を加えた構成を示す説明図である。
第１実施例のレーザ走査蛍光顕微鏡は、レーザ光源部１と、交換可能な対物レンズ２と、走査手段としてのスキャナ部３と、瞳投影レンズ６と結像レンズ５とを備えたレンズユニット４と、検出光学系７を顕微鏡本体部１１に備えている。
レーザ光源部１は、半導体レーザを用いることで顕微鏡本体部１１を小型化できるので好ましい。
対物レンズ２は、結像レンズ５とともに対物レンズ光学系８を構成している。対物レンズ光学系８は、レーザ光源部１からの励起光をステージ９上の試料１０に集光する機能を有している。また、対物レンズ２は、後側焦点位置が、結像レンズ５と瞳投影レンズ６とによって、スキャナ部３の近傍位置で共役になるように構成されている。結像レンズ５は、試料１０の中間像を形成する機能を有している。
瞳投影レンズ６は、スキャナ部３と対物レンズ光学系８との間に配置されている。
検出光学系７は、バリアフィルター７ａとレンズ７ｂと共焦点ピンホール７ｃと受光センサー７ｄを有し、試料１０から発し対物レンズ光学系８と瞳投影レンズ６を経た蛍光を受光センサー７ｄで検出するように構成されている。
レーザ光源部１は、レーザ光源１ａと、レンズ１ｂ，１ｄとピンホール１ｃからなるコリメート光学系を有している。
また、スキャナ部３と検出光学系７との間には、光源部１からの励起光を試料１０に導くとともに試料１０からの蛍光を検出手段７に導くためのダイクロイックミラー１６が設けられている。
また、レーザ光源部１には、レーザ光源１ａからのレーザ光の出射を駆動するレーザ駆動部１４が接続されている。
顕微鏡本体部１１には、対物レンズ２の合焦のための準焦機構部１２が設けられている。
その他、レーザ走査型蛍光顕微鏡は、顕微鏡本体部１１を２次元方向に位置調整と標本に対して観察する角度θを調整するためのｘ−ｙ−θ本体移動機構１３を有している。
また、レーザ走査型蛍光顕微鏡は、パーソナルコンピュータなどの処理制御手段１５と接続されている。処理制御手段１５は，レーザ駆動部１４の駆動により出射されるレーザ光源の波長制御、ダイクロイックミラーやフィルター等の波長選択、波長分離素子の制御、レーザ駆動部１４の駆動制御、検出光学系７の受光センサー７ｄで受光された検出情報の解析及び表示制御、スキャナ部３の駆動制御、準焦機構部１２の駆動制御、ｘ−ｙ−θ本体移動機構１３の駆動制御等を行うように構成されている。
第１実施例のレーザ走査型蛍光顕微鏡では、レーザ光源１ａから出射した励起光は、レンズ１ｂによりピンホール１ｃに集光され、レンズ１ｄにより平行光に変換される。その後、ダイクロイックミラー１６を経て、スキャナ部３に導かれ、スキャナ部３のガルバノミラー３ａ，３ｂのそれぞれの回転により光束を光軸に対し２次元方向にシフトさせられ、瞳投影レンズ６を経て中間像位置に集光して１次像を結像する。中間像位置に集光した励起光は、結像レンズ５、対物レンズ２を経て試料１０に微小スポット状に照射される。このとき、試料１０面に照射される励起光はスキャナ部３によって走査される。
また、対物レンズ２の後側焦点位置は、結像レンズ５と瞳投影レンズ８によってスキャナ部３の近傍に投影されている。
励起光が照射されることによって試料１０で励起した蛍光は、対物レンズ２、結像レンズ５、瞳投影レンズ６、スキャナ部３、ダイクロイックミラー１６を経て、検出光学系７に導かれる。そして、バリアフィルター７ａ、レンズ７ｂを経て、共焦点ピンホール７ｃを通過した蛍光だけが、フォトマル等の受光センサー７ｄによって検出される。
ここで、第１実施例のレーザ走査型蛍光顕微鏡は、対物レンズ２の同焦点距離をＤ、試料１０面から走査手段（スキャナ部３）近傍に配置された、対物レンズ２の後側焦点位置の共役位置Ｅまでの距離をＬとしたとき、次の条件式(1)を満足するように構成されている。
０．１５≦Ｄ／Ｌ≦０．５ …(1)
第１実施例のレーザ走査型蛍光顕微鏡のように、条件式(1)を満足すれば、走査手段３から試料１０までの距離を短くして装置を小型化することが可能となる。
条件式(1)の上限値を上回ると、結像レンズ５、瞳投影レンズ６の焦点距離が短くなり、瞳投影レンズ６と走査手段３との間隔が短くなりすぎて干渉してしまう。
一方、条件式(1)の下限値を下回ると、試料１０から走査手段３までの全長が長くなりすぎて装置を小型化することが困難となってしまう。
図５は本発明にかかるレーザ走査型蛍光顕微鏡の第２実施例における光学系の概略構成を示す説明図である。なお、第１実施例と同じ構成の部材については同じ符号を付してある。
第２実施例のレーザ走査型蛍光顕微鏡は、第１実施例の変形例であり、光源部１と走査手段３との間には、ダイクロイックミラー２０と、レンズ１９と、光伝送手段１８と、レンズ１７と、ダイクロイックミラー１６とが設けられている。
光伝送手段１８はシングルモードファイバーあるいはマルチモードファイバー等の光ファイバーで構成されている。光伝送手段１８の光ファイバー端面は、標本面位置と共役であり、ファイバー端面のコア径が共焦点ピンホールとなるので、光源部１’のピンホール１ｃと検出器７’のピンホール７ｃは、光路から外すか、回折径に対して充分に大きな径にしても構わない。光伝送手段１８がマルチモードファイバーの場合、ファイバーコア径は、回折径に対して大きくなるので共焦点効果は弱まるが、蛍光像を明るく取り込むことが可能であるので、観察目的に応じてファイバーを選択すると良い。なお、光伝送手段１８にマルチモードファイバーを用いて、共焦点でない通常の蛍光観察を行う場合には、光源部１’のピンホール１ｃと検出器７’のピンホール７ｃを、光路に備えないで構成するのがよい。
ダイクロイックミラー２０は、光源部１’からの励起光を試料１０に導くとともに、試料１０からの蛍光を第２の検出光学系７’に導くように構成されている。
そして、光伝送手段１８を介してレーザ光源部１からの励起光を走査手段３へ導くとともに、レンズ１７を経た試料１０からの蛍光を第２の検出手段７’へ導くようになっている。
なお、図４の実施形態では、光源部１’は、光源１ａ〜レンズ１ｄが複数設けられており、それに応じてダイクロイックミラー１ｅが設けられている。
第２実施例のレーザ走査型蛍光顕微鏡のように、レーザ光源部１と走査手段３との間に光伝送手段を配置すれば、スキャナ部３から対物レンズ２までの装置本体部の光学系と、レーザ光源部１との配置に自由度をもたせることが可能となる。このため、顕微鏡本体部の光学系を、生きたままの試料の状態（in vivo）での観察に好適な大きさに小型化することができる。
また第２実施例において、レーザ光源1’に近赤外のフェムト秒パルスレーザを用いると多光子励起の蛍光顕微鏡として観察が可能となる。
この場合、検出器７を多光子励起された蛍光の検出器として使用し、ダイクロイックミラー１ｅ、１６、２０の分光特性を選択し、ピンホール１ｃ、７ｃのピンホール径を回折径より充分に大きくするか、光路から外せば良い。
図６は本発明にかかるレーザ走査型蛍光顕微鏡の第３実施例における光学系の概略構成を示す説明図である。なお、第２実施例と同じ構成の部材については同じ符号を付してある。
第３実施例のレーザ走査型蛍光顕微鏡は、第２実施例の変形例であり、ダイクロイックミラー１６と検出光学系７’との間には、レンズ２２と、シングルモードファイバーあるいはマルチモードファイバー等の光ファイバーで構成された光伝送手段２１と、レンズ２３が設けられている。そして、光伝送手段１８を介して光源部１’’からの励起光を試料１０に導くとともに、光伝送手段２１を介して試料１０からの蛍光を第２の検出光学系７’に導くように構成されている。第２実施例と同様に、光伝送手段１８、２１の光ファイバー端面は、標本面位置と共役であり、ファイバー端面のコア径が共焦点ピンホールとなるので、光源部１’’のピンホール１ｃと検出器７’のピンホール７ｃは、光路から外すか、回折径に対して充分に大きな径にしても構わない。前記光伝送手段１８、２１がマルチモードファイバーの場合、ファイバーコア径は、回折径に対して大きくなるので共焦点効果は弱まるが、蛍光像を明るく取り込むことが可能であるので、観察目的に応じてファイバーを選択すると良い。なお、光伝送手段１８、２１にマルチモードファイバーを用いて、共焦点でない通常の蛍光観察を行う場合には、光源部１’’のピンホール１ｃと検出器７’のピンホール７ｃを、光路に備えないで構成するのがよい。
このように構成すれば、顕微鏡装置の本体部の光学系をより小型化できるので好ましい。
また、第３実施例のレーザ走査型蛍光顕微鏡のように、光源部１’’からの励起光をスキャナ部３へ導く光伝送手段１８を構成する光ファイバーと、瞳投影レンズ６を経た試料１０からの蛍光を第２の検出光学系７’へ導く光伝送手段２１を構成する光ファイバーとをそれぞれ別箇に設ければ、励起光が光ファイバー１８に入射したときに発生する自家蛍光の影響を第２の検出光学系７’で受けずに済み、試料１０で発生した蛍光を高精度に検出できる。
なお、第３実施例のレーザ走査型蛍光顕微鏡において、光伝送手段１８、２１をマルチモードファイバーで構成する場合、マルチモードファイバー１８のコア径をΦｅｘ、マルチモードファイバー２１のコア径をΦｅｍ、レンズ１９によりマルチモードファイバー１８に入射する開口数をＮＡｅｘ、励起波長をλｅｘ、レンズ２２によりマルチモードファイバー２１に入射する開口数をＮＡｅｍ、蛍光波長をλｅｍとするとき、次の条件式(7)〜(9)を満足するのが好ましい。
２≦Φｅｍ／Φｅｘ≦１２ ・・・(7)
０．６１×（λｅｘ／ＮＡｅｘ）＜Φｅｘ ・・・(8)
０．６１×（λｅｍ／ＮＡｅｍ）＜Φｅｍ ・・・(9)
条件式(7)〜(9)を満足すれば、光源からの励起光に対して検出される蛍光量の割合が高くなり、蛍光像を明るく取り込むことが可能となり、且つ、試料からの画像情報を厚さ方向に沿って所定量得ることができるので、試料が生きたままの状態（In vivo）での観察において操作性が向上する。
条件式(7)の下限値を下回ると、光源からの励起光に対して検出される蛍光の割合が低くなり、得られる蛍光像が暗くなり、試料の厚さ方向の画像情報が非常に少なくなるので観察時の操作性が悪くなってしまう。
一方、条件式(7)の上限値を上回ると、試料の厚さ方向にわたる画像情報が入りすぎて、観察したい蛍光以外の画像が見えすぎてしまい、蛍光観察し難くなる。
条件式(8)，(9)を満足しないと、試料への励起光が弱くなったり、検出される蛍光強度が暗く、試料の厚さ方向の画像情報が非常に少なくなるので観察時の操作性が悪くなる。
なお、次の条件式(7-1)を満足すると、より好ましい。
４≦Φｅｍ／Φｅｘ≦１０ ・・・(7-1)
なお、第３実施例の上記条件式(7)〜(9)を満足するレーザ走査型蛍光顕微鏡の構成は、上記条件式(1)を満足しない一般のレーザ走査型蛍光顕微鏡にも適用可能である。
図７は本発明にかかるレーザ走査型蛍光顕微鏡の第４実施例における光学系の概略構成を示す説明図である。なお、第１実施例と同じ構成の部材については同じ符号を付してある。
第４実施例のレーザ走査型蛍光顕微鏡は、第１実施例の変形例であり、光源部１’”がレーザ光源１ａとレンズ１ｄとで構成されている。また、ダイクロイックミラー１６を隔てたガルバノミラー３ｂの反対側には、レンズ２２と、光伝送手段２１と、レンズ２３と、検出光学系７’とが設けられている。
光伝送手段２１はシングルモードファイバーあるいはマルチモードファイバー等の光ファイバーで構成されている。光伝送手段２１の光ファイバー端面は、標本面位置と共役であり、ファイバー端面のコア径が共焦点ピンホールとなるので、光源部１’”のピンホール１ｃと検出器７’のピンホール７ｃは、光路から外すか、回折径に対して充分に大きな径にしても構わない。光伝送手段２１がマルチモードファイバーの場合、ファイバーコア径は、回折径に対して大きくなるので共焦点効果は弱まるが、蛍光像を明るく取り込むことが可能であるので、観察目的に応じてファイバーを選択すると良い。
また、これらの各実施例で示した本発明のレーザ走査型蛍光顕微鏡では、走査手段（スキャナ部３）によって偏向された平行光束を、瞳投影レンズ６を介して中間像位置ヘリレーさせている。
ここで、瞳投影レンズ６を、複数のレンズで構成し、最も走査手段側に配置されたレンズ面が走査手段側に凹面を向き、最も中間像側に配置されたレンズ面が中間像側に凹面を向くように構成すれば、中間像での光学性能を良好に補正することが可能となる。
また、上記各実施例で示した本発明のレーザ走査型蛍光顕微鏡は、走査手段の近傍に位置する対物レンズ２の瞳の共役位置から結像レンズ５の中間像位置までの距離をＤ３、瞳投影レンズ６の焦点距離をＦｅとするとき、次の条件式(2)を満足する。
０．２≦Ｆｅ／Ｄ３≦０．５ …(2)
条件式(2)を満足すれば、瞳投影レンズの光学性能を良好にしながら走査手段から中間像位置までの距離を短くして装置を小型化することが可能となる。
条件式(2)の上限値を上回ると、走査手段と瞳投影レンズとの距離が短くなり、瞳投影レンズと走査手段との間隔が短くなりすぎて干渉してしまう。
一方、条件式(2)の下限値を下回ると、走査手段から中間像位置までの全長が長くなりすぎて装置を小型化することが困難となってしまう。
また、上記各実施例のレーザ走査型蛍光顕微鏡は、結像レンズ５が、複数のレンズ群からなり、正レンズと負レンズの接合レンズを少なくとも１つ備え、この接合レンズ中の正レンズのアッべ数をνｐ、結像レンズ５の焦点距離をＦＴＬ、対物レンズ２の胴付き位置から中間像位置までの距離をＤ１とするとき、次の条件式(3)，(4)を満足する。
０．４≦ＦＴＬ／Ｄ１≦１ …(3)
８０≦νｐ …(4)
条件式(3)を満足すれば、対物レンズの胴付き位置から中間像位置までの距離を短くして装置を小型化することが可能となる。また、条件式(4)を満足すれば、焦点距離を短くすることによって発生する球面収差、軸上色収差の補正を良好に行い可視域〜近赤外域での共焦点蛍光観察が可能となる。
ここで本発明において共焦点蛍光顕微鏡を構成した場合、実際には取得された画像に、球面収差や軸上色収差が画像として得られるのではなく、各波長および観察領域での波面収差に影響を及ぼす。本発明の光学系の波面収差が良好であれば、検出器から得られる画像は高解像、高Ｓ/Ｎとなる。従って球面収差や軸外収差を良好に補正することで、結果として波面収差を良好に補正することになり、下記条件式で記述される各収差についても同様である。
条件式(3)の上限値を上回ると、対物レンズと結像レンズとの間隔が短くなりすぎて、対物レンズの作動距離を変化させる準焦機構部を配置することが困難になる。
一方、条件式(3)の下限値を下回ると、試料から走査手段までの全長が長くなりすぎて装置を小型化することが困難となってしまう。
条件式(4)の下限値を下回ると、対物レンズ光学系で発生する軸上色収差、球面収差の補正が困難になり、励起光の波長が可視域から近赤外光での共焦点蛍光観察が困難になってしまうので好ましくない。
また、上記各実施例のレーザ走査型顕微鏡は、結像レンズ５が、少なくとも中間像側の前群と対物レンズ側の後群の２つのレンズ群からなり、結像レンズ５の前群のレンズ群には、少なくとも１つの負レンズを有し、結像レンズ５の後群の焦点距離をＦＴＬ１、結像レンズ５の前群と結像レンズ５の後群との間隔をＤ２とするとき、次の条件式(5)，(6)を満足する。
０．４≦Ｄ２／ＦＴＬ≦１ …(5)
０．７≦ＦＴＬ１／ＦＴＬ≦１．５ …(6)
このように、結像レンズ５を２つのレンズ群で構成すれば、前群での収差を打ち消すように後群で収差を補正することが可能となり、in vivoでの観察により好適なレーザ走査型蛍光顕微鏡が得られる。
また、条件式(5)及び(6)を満足すれば、非点収差とコマ収差および倍率色収差をより補正することが可能となる。
条件式(5)の上限値を上回ると、前群のレンズ群が中間像位置に近くなりすぎてレンズ面の傷やゴミによる影響により像質を劣化させるので好ましくない。
一方、条件式(5)の下限値を下回ると、軸上色収差と軸外コマ収差が悪化するので好ましくない。
条件式(6)の上限値を上回ると、後群のパワーが弱くなりすぎて、色球面収差、コマ収差の補正をするのが困難になる。
一方、条件式(6)の下限値を上回ると、後群のパワーが強くなりすぎて、軸上色収差とコマ収差の補正が困難になる。
以下、本発明のレーザ走査型顕微鏡の瞳投影レンズ及び対物レンズ光学系（結像レンズ及び対物レンズ）の実施例について説明する。なお、各実施例の光学系は、図２〜図７に示した各実施例のレーザ走査型蛍光顕微鏡に適用される。また、各実施例の説明においては、説明の便宜上、図２〜図７に示した光学系の向きと逆向きに示してある。
 第１実施例
図８は本発明の第１実施例にかかるレーザ走査型蛍光顕微鏡における瞳投影光学系及び対物レンズ光学系の構成を示す光軸に沿う断面図である。
第１実施例のレーザ走査型蛍光顕微鏡では、瞳投影光学系６は、走査手段側（紙面の左側）から順に、走査手段側に凹面を向けた平凹レンズＬ６１と中間像側に凸面を向けた平凸レンズＬ６２のパワーの弱い接合正レンズと、両凸レンズＬ６３と、走査手段側に凹面を向けた負メニスカスレンズＬ６４の接合正レンズと、両凸レンズＬ６５と、両凸レンズＬ６６と、両凹レンズＬ６７とで構成されている。
結像レンズ５は、中間像側から順に、前群Ｇ５１と後群Ｇ５２とで構成されている。
前群Ｇ５１は、中間像側から順に、中間像側に凹面を向けた正メニスカスレンズＬ５１と、中間像側に凸面を向けた負メニスカスレンズＬ５２とで構成されている。
後群Ｇ５２は、中間像側から順に、両凸レンズＬ５３と、試料１０側に凹面を向けた平凹レンズＬ５４と両凸レンズＬ５５との接合正レンズとで構成されている。
対物レンズ２は、中間像側から順に、両凸レンズＬ２１と両凹レンズＬ２２の接合負メニスカスレンズと、両凹レンズＬ２３と両凸レンズＬ２４の接合正メニスカスレンズと、負メニスカスレンズＬ２５と両凸レンズＬ２６と負メニスカスレンズＬ２７の接合負レンズと、両凸レンズＬ２８と両凹レンズＬ２９と両凸レンズＬ３０の接合正レンズと、正メニスカスレンズＬ３１と、正メニスカスレンズＬ３２と正メニスカスレンズＬ３３の接合正レンズとで構成されている。
前記対物レンズは水浸対物レンズで、開口数０．８、作動距離３．３ｍｍ、同焦点距離４５ｍｍの対物レンズである。
対物レンズ２は、本発明のレーザ走査型蛍光顕微鏡に対して交換可能に構成されており、対物レンズの倍率を変えることで観察範囲を変更可能である。
さらに対物レンズ２は、水浸対物レンズであるので、In vivo下での本発明のレーザ走査型蛍光顕微鏡と組み合わせることで、標本を生かしたままの状態でかつ明るい蛍光像が得られるので好適である。
例えばマウス等の脳の神経細胞を観察する場合、マウス頭部に脳の神経細胞を観察できる程度の穴をあけ、穴をあけた頭部を平行平面板のガラス等の光学部材でふさぎ、頭部の穴を通して本発明のレーザ走査型蛍光顕微鏡に水浸対物レンズを組み合わせて観察することで、脳の神経細胞からの蛍光画像を得ることが可能である。しかもマウス頭部に観察用の穴はガラス等の光学部材でふさいであるので、マウスを生かしたままの観察が可能となり、がん細胞等の成長や細胞の機能解明等の様々なアプリケーションに有効である。
また標本によって対物レンズの倍率や用途を変えることで、In vivo観察だけでなく様々な用途に小型化されたレーザ走査型蛍光顕微鏡としても使用可能である。
次に、第１実施例の光学系を構成する光学部材の数値データを示す。なお、第１実施例の数値データにおいて、ｒ1、ｒ2、…は各レンズ面の曲率半径、ｄ1、ｄ2、…は各レンズの肉厚または空気間隔、ｎd1、ｎd2、…は各レンズのｄ線での屈折率、νd1、νd2、…は各レンズのアッべ数を表している。第１面は対物レンズの瞳共役位置であり、物点無限遠からの光束が入射する。対物レンズは水浸対物レンズで、開口数０．８、作動距離３．３mm、同焦点距離４５mmである。
これらの記号は、以下の各実施例においても共通である。
数値データ１
ｒ1＝∞ ｄ1＝14.3728
ｒ2＝-6.588 ｄ2＝3.9 ｎd2＝1.48749 νd2＝70.23
ｒ3＝∞ ｄ3＝3.48 ｎd3＝1.497 νd3＝81.54
ｒ4＝-9.162 ｄ4＝0.2
ｒ5＝125.679 ｄ5＝3.52 ｎd5＝1.43875 νd5＝94.93
ｒ6＝-8.85 ｄ6＝1 ｎd6＝1.7725 νd6＝49.6
ｒ7＝-20.953 ｄ7＝0.2
ｒ8＝21.356 ｄ8＝3.62 ｎd8＝1.43875 νd8＝94.93
ｒ9＝-21.356 ｄ9＝1.91
ｒ10＝13.127 ｄ10＝2.39 ｎd10＝1.497 νd10＝94.93
ｒ11＝-282.633 ｄ11＝3.8
ｒ12＝-27.852 ｄ12＝1 ｎd12＝1.755 νd12＝52.32
ｒ13＝12.42 ｄ13＝10.1024
ｒ14＝∞（中間像） ｄ14＝9
ｒ15＝-11.68 ｄ15＝1.85 ｎd15＝1.497 νd15＝81.54
ｒ16＝-7.6 ｄ16＝0.25
ｒ17＝24.968 ｄ17＝0.78 ｎd17＝1.51742 νd17＝52.43
ｒ18＝13.675 ｄ18＝67.5334
ｒ19＝186.465 ｄ19＝3.5 ｎd19＝1.43875 νd19＝94.93
ｒ20＝-126.462 ｄ20＝0.25
ｒ21＝∞ ｄ21＝3.5 ｎd21＝1.741 νd21＝52.64
ｒ22＝52.265 ｄ22＝2.98 ｎd22＝1.43875 νd22＝94.93
ｒ23＝-37.182 ｄ23＝16.23
ｒ24＝∞（ob胴付き）ｄ24＝-2.2345
ｒ25＝7.1701 ｄ25＝2.2311 ｎd25＝1.51884 νd25＝40.75
ｒ26＝-40.9891 ｄ26＝2.8243 ｎd26＝1.50378 νd26＝66.81
ｒ27＝3.3957 ｄ27＝4.9475
ｒ28＝-6.0168 ｄ28＝1.7182 ｎd28＝1.52944 νd28＝51.72
ｒ29＝9.3327 ｄ29＝7.3934 ｎd29＝1.497 νd29＝81.54
ｒ30＝-7.1338 ｄ30＝0.2
ｒ31＝40.7756 ｄ31＝1.1467 ｎd31＝1.755 νd31＝52.32
ｒ32＝8.0004 ｄ32＝5.7699 ｎd32＝1.43875 νd32＝94.93
ｒ33＝-9.8515 ｄ33＝1 ｎd33＝1.59551 νd33＝39.26
ｒ34＝-18.0562 ｄ34＝0.2
ｒ35＝18.8453 ｄ35＝3.783 ｎd35＝1.43875 νd35＝94.93
ｒ36＝-13.4657 ｄ36＝1.3 ｎd36＝1.7725 νd36＝49.6
ｒ37＝38.9003 ｄ37＝3.2938 ｎd37＝1.497 νd37＝81.54
ｒ38＝-12.2456 ｄ38＝0.2
ｒ39＝8.6474 ｄ39＝2.9067 ｎd39＝1.56907 νd39＝71.3
ｒ40＝15.3871 ｄ40＝0.2
ｒ41＝6.2872 ｄ41＝3.3861 ｎd41＝1.7725 νd41＝49.6
ｒ42＝5.4004 ｄ42＝1.4337 ｎd42＝1.51633 νd42＝64.14
ｒ43＝80 ｄ43＝3.3 ｎd43＝1.33304 νd43＝55.79
ｒ44＝∞ ｄ44＝0 ｎd44＝1.33304 νd44＝55.79
第２実施例
図９は本発明の第２実施例にかかるレーザ走査型蛍光顕微鏡における瞳投影光学系及び対物レンズ光学系の光学構成を示す光軸に沿う断面図である。
第２実施例のレーザ走査型蛍光顕微鏡では、瞳投影光学系６は、走査手段側（紙面の左側）から順に、走査手段側に凹面を向けた平凹レンズＬ６１と中間像側に凸面を向けた平凸レンズＬ６２とのパワーの弱い接合正レンズと、両凸レンズＬ６３と走査手段側に凹面を向けた負メニスカスレンズＬ６４との接合正レンズと、両凸レンズＬ６５と、両凸レンズＬ６６と、両凹レンズＬ６７とで構成されている。
結像レンズ５は、中間像側から順に、前群Ｇ５１と後群Ｇ５２とで構成されている。
前群Ｇ５１は、中間像側から順に、中間像側に凹面を向けた正メニスカスレンズＬ５１と、中間像側に凸面を向けた負メニスカスレンズＬ５２とで構成されている。
後群Ｇ５２は、中間像側から順に、両凹レンズＬ５３’と両凸レンズＬ５４’との接合負レンズと、両凸レンズＬ５５とで構成されている。
対物レンズ２は、第１実施例と同様に、中間像側から順に、両凸レンズＬ２１と両凹レンズＬ２２の接合負メニスカスレンズと、両凹レンズＬ２３と両凸レンズＬ２４の接合正メニスカスレンズと、負メニスカスレンズＬ２５と両凸レンズＬ２６と負メニスカスレンズＬ２７の接合負レンズと、両凸レンズＬ２８と両凹レンズＬ２９と両凸レンズＬ３０の接合正レンズと、正メニスカスレンズＬ３１と、正メニスカスレンズＬ３２と正メニスカスレンズＬ３３の接合正レンズとで構成されている。前記対物レンズは水浸対物レンズで、開口数０．８、作動距離３．３ｍｍ、同焦点距離４５ｍｍの対物レンズである。
次に、第２実施例の光学系を構成する光学部材の数値データを示す。
数値データ２
ｒ1＝∞ ｄ1＝9.7843
ｒ2＝-4.624 ｄ2＝1 ｎd2＝1.48749 νd2＝70.23
ｒ3＝∞ ｄ3＝3.04 ｎd3＝1.497 νd3＝81.54
ｒ4＝-6.051 ｄ4＝0.2
ｒ5＝38.988 ｄ5＝3.8 ｎd5＝1.43875 νd5＝94.93
ｒ6＝-6.186 ｄ6＝1.2 ｎd6＝1.7725 νd6＝49.6
ｒ7＝-13.818 ｄ7＝0.2
ｒ8＝12.667 ｄ8＝3.19 ｎd8＝1.43875 νd8＝94.93
ｒ9＝-15.719 ｄ9＝1.75
ｒ10＝8.402 ｄ10＝2.44 ｎd10＝1.497 νd10＝81.54
ｒ11＝-79.63 ｄ11＝0.98
ｒ12＝-19.748 ｄ12＝1.1 ｎd12＝1.741 νd12＝52.64
ｒ13＝6.843 ｄ13＝5.8022
ｒ14＝∞(中間像) ｄ14＝8.4919
ｒ15＝-22.689 ｄ15＝3.82 ｎd15＝1.48749 νd15＝70.23
ｒ16＝-9.23 ｄ16＝0.15
ｒ17＝20.762 ｄ17＝0.8 ｎd17＝1.51742 νd17＝52.43
ｒ18＝11.803 ｄ18＝37.613
ｒ19＝-30.848 ｄ19＝1.8 ｎd19＝1.7725 νd19＝49.6
ｒ20＝188.334 ｄ20＝3.11 ｎd20＝1.43875 νd20＝94.93
ｒ21＝-21.518 ｄ21＝0.25
ｒ22＝852.75 ｄ22＝3.05 ｎd22＝1.497 νd22＝81.54
ｒ23＝-26.986 ｄ23＝11.122
ｒ24＝∞（ob胴付き）ｄ24＝-2.2345
ｒ25＝7.1701 ｄ25＝2.2311 ｎd25＝1.51884 νd25＝40.75
ｒ26＝-40.9891 ｄ26＝2.8243 ｎd26＝1.50378 νd26＝66.81
ｒ27＝3.3957 ｄ27＝4.9475
ｒ28＝-6.0168 ｄ28＝1.7182 ｎd28＝1.52944 νd28＝51.72
ｒ29＝9.3327 ｄ29＝7.3934 ｎd29＝1.497 νd29＝81.54
ｒ30＝-7.1338 ｄ30＝0.2
ｒ31＝40.7756 ｄ31＝1.1467 ｎd31＝1.755 νd31＝52.32
ｒ32＝8.0004 ｄ32＝5.7699 ｎd32＝1.43875 νd32＝94.93
ｒ33＝-9.8515 ｄ33＝1 ｎd33＝1.59551 νd33＝39.26
ｒ34＝-18.0562 ｄ34＝0.2
ｒ35＝18.8453 ｄ35＝3.783 ｎd35＝1.43875 νd35＝94.93
ｒ36＝-13.4657 ｄ36＝1.3 ｎd36＝1.7725 νd36＝49.6
ｒ37＝38.9003 ｄ37＝3.2938 ｎd37＝1.497 νd37＝81.54
ｒ38＝-12.2456 ｄ38＝0.2
ｒ39＝8.6474 ｄ39＝2.9067 ｎd39＝1.56907 νd39＝71.3
ｒ40＝15.3871 ｄ40＝0.2
ｒ41＝6.2872 ｄ41＝3.3861 ｎd41＝1.7725 νd41＝49.6
ｒ42＝5.4004 ｄ42＝1.4337 ｎd42＝1.51633 νd42＝64.14
ｒ43＝80 ｄ43＝3.3 ｎd43＝1.33304 νd43＝55.79
ｒ44＝∞ ｄ44＝0 ｎd44＝1.33304 νd44＝55.79
第３実施例
図１０は本発明の第３実施例にかかるレーザ走査型蛍光顕微鏡における瞳投影光学系及び対物レンズ光学系の光学構成を示す光軸に沿う断面図である。
第３実施例のレーザ走査型蛍光顕微鏡では、瞳投影光学系６は、走査手段側（紙面の左側）から順に、走査手段側に凹面を向けた負メニスカスレンズＬ６１’と走査手段側に凹面を向けた正メニスカスレンズＬ６２’の弱いパワーの接合正レンズと、両凸レンズＬ６３と両凹レンズＬ６４と両凸レンズＬ６５との接合正レンズと、両凸レンズＬ６６と、走査手段側に凸面を向けた負メニスカスレンズＬ６７’と両凸レンズＬ６８と両凹レンズＬ６９との接合負レンズとで構成されている。
結像レンズ５は、中間像側から順に、前群Ｇ５１と後群Ｇ５２とで構成されている。
前群Ｇ５１は、中間像側から順に、中間像側に凹面を向けた正メニスカスレンズＬ５１と、中間像側に凸面を向けた負メニスカスレンズＬ５２とで構成されている。
後群Ｇ５２は、中間像側から順に、両凹レンズＬ５３’と両凸レンズＬ５４’との接合レンズと、両凸レンズＬ５５とで構成されている。
対物レンズ２は、第１実施例と同様に、中間像側から順に、両凸レンズＬ２１と両凹レンズＬ２２の接合負メニスカスレンズと、両凹レンズＬ２３と両凸レンズＬ２４の接合正メニスカスレンズと、負メニスカスレンズＬ２５と両凸レンズＬ２６と負メニスカスレンズＬ２７の接合負レンズと、両凸レンズＬ２８と両凹レンズＬ２９と両凸レンズＬ３０の接合正レンズと、正メニスカスレンズＬ３１と、正メニスカスレンズＬ３２と正メニスカスレンズＬ３３の接合正レンズとで構成されている。前記対物レンズは水浸対物レンズで、開口数０．８、作動距離３．３ｍｍ、同焦点距離４５ｍｍの対物レンズである。
次に、第３実施例の光学系を構成する光学部材の数値データを示す。
数値データ３
ｒ1＝∞ ｄ1＝7.4167
ｒ2＝-4.0824 ｄ2＝1.0919 ｎd2＝1.603 νd2＝65.44
ｒ3＝-8.3801 ｄ3＝1.7878 ｎd3＝1.7725 νd3＝49.6
ｒ4＝-5.7535 ｄ4＝0.2
ｒ5＝25.6339 ｄ5＝2.8925 ｎd5 ＝1.43875 νd5 ＝94.93
ｒ6＝-6.4112 ｄ6＝1 ｎd6＝1.7725 νd6＝49.6
ｒ7＝137.8602 ｄ7＝2.3153 ｎd7＝1.497 νd7＝81.54
ｒ8＝-9.4621 ｄ8＝0.2
ｒ9＝10.6954 ｄ9＝2.4857 ｎd9＝1.497 νd9＝81.54
ｒ10＝-26.6514 ｄ10＝0.15
ｒ11＝6.9368 ｄ11＝1.5367 ｎd11＝1.7725 νd11＝49.6
ｒ12＝3.8697 ｄ12＝3.2119 ｎd12＝1.497 νd12＝81.54
ｒ13＝-11.1848 ｄ13＝1.8514 ｎd13＝1.755 νd13＝52.32
ｒ14＝6.5045 ｄ14＝3.935
ｒ15＝∞ ｄ15＝5
ｒ16＝-63.258 ｄ16＝7.6 ｎd16＝1.603 νd16＝65.44
ｒ17＝-14.383 ｄ17＝0.15
ｒ18＝21.994 ｄ18＝1.2 ｎd18＝1.51742 νd18＝52.43
ｒ19＝13.279 ｄ19＝23.5638
ｒ20＝-26.882 ｄ20＝1.6 ｎd20＝1.788 νd20＝47.37
ｒ21＝75.482 ｄ21＝3.42 ｎd21＝1.43875 νd21＝94.93
ｒ22＝-18.536 ｄ22＝0.15
ｒ23＝141.209 ｄ23＝7 ｎd23＝1.497 νd23＝81.54
ｒ24＝-22.954 ｄ24＝9
ｒ25＝∞（ob胴付き）ｄ25＝-2.2345
ｒ26＝7.1701 ｄ26＝2.2311 ｎd26＝1.51884 νd26＝40.75
ｒ27＝-40.9891 ｄ27＝2.8243 ｎd27＝1.50378 νd27＝66.81
ｒ28＝3.3957 ｄ28＝4.9475
ｒ29＝-6.0168 ｄ29＝1.7182 ｎd29＝1.52944 νd29＝51.72
ｒ30＝9.3327 ｄ30＝7.3934 ｎd30＝1.497 νd30＝81.54
ｒ31＝-7.1338 ｄ31＝0.2
ｒ32＝40.7756 ｄ32＝1.1467 ｎd32＝1.755 νd32＝52.32
ｒ33＝8.0004 ｄ33＝5.7699 ｎd33＝1.43875 νd33＝94.93
ｒ34＝-9.8515 ｄ34＝1 ｎd34＝1.59551 νd34＝39.26
ｒ35＝-18.0562 ｄ35＝0.2
ｒ36＝18.8453 ｄ36＝3.783 ｎd36＝1.43875 νd36＝94.93
ｒ37＝-13.4657 ｄ37＝1.3 ｎd37＝1.7725 νd37＝49.6
ｒ38＝38.9003 ｄ38＝3.2938 ｎd38＝1.497 νd38＝81.54
ｒ39＝-12.2456 ｄ39＝0.2
ｒ40＝8.6474 ｄ40＝2.9067 ｎd40＝1.56907 νd40＝71.3
ｒ41＝15.3871 ｄ41＝0.2
ｒ42＝6.2872 ｄ42＝3.3861 ｎd42＝1.7725 νd42＝49.6
ｒ43＝5.4004 ｄ43＝1.4337 ｎd43＝1.51633 νd43＝64.14
ｒ44＝80 ｄ44＝3.3 ｎd44＝1.33304 νd44＝55.79
ｒ45＝∞ ｄ45＝0 ｎd45＝1.33304 νd45＝55.79
次に、上記各実施例のレーザ走査型顕微鏡の条件式に用いる数値パラメータを表１に示す。また各実施例における各波長での波面収差を表２に示す。対物レンズの開口数は０．８、焦点距離４．５ｍｍ、観察範囲は標本側で像高０．１５の水浸対物レンズである。また、各実施例のレーザ走査顕微鏡を、図６に示した第３実施例における光伝送手段１８、２１にマルチモードファイバーを用いたレーザ走査型顕微鏡として構成した場合における数値パラメータを表３に示す。なお、励起光と蛍光の波長との差が僅かであるため、表３では、便宜上、励起光と蛍光の波長が同じであるとして扱っている。
本発明のレーザ走査型蛍光顕微鏡は、小型で、操作性が良く、可視域から近赤外域までの波長でもって、生きたままの試料の状態（in vivo）での観察を高精度で行うことができ、実用上極めて有用である。

Claims (14)

  1. レーザ光源部と、前記レーザ光源部からの励起光を試料上に集光させる対物レンズ光学系と、前記レーザ光源部からの励起光を試料面上で走査させる走査手段と、前記走査手段と前記対物レンズ光学系との間に配置された瞳投影レンズと、試料から発し前記対物レンズ光学系と前記瞳投影レンズを経た蛍光を検出する検出光学系を備え、前記対物レンズ光学系が、対物レンズと、試料の中間像を形成するための結像レンズとを有し、前記対物レンズの後側焦点位置が、前記結像レンズと前記瞳投影レンズとによって前記走査手段の近傍位置で共役になるように構成されるレーザ走査型蛍光顕微鏡であって、
    前記瞳投影レンズが、複数のレンズ群からなり、最も前記走査手段側のレンズ面が前記走査手段側に凹面を向け、最も中間像側のレンズ面が中間像側に凹面を向けており、
    前記対物レンズの同焦点距離をＤ、試料面から前記走査手段近傍に配置された、前記対物レンズの後側焦点位置の共役位置までの距離をＬ、前記走査手段の近傍に位置する前記対物レンズの瞳の共役位置から前記結像レンズの中間像位置までの距離をＤ３、前記瞳投影レンズの焦点距離をＦｅとするとき、下記条件を満足することを特徴とするレーザ走査型蛍光顕微鏡。
    ０．１５≦Ｄ／Ｌ≦０．５
    ０．２≦Ｆｅ／Ｄ３≦０．５
  2. レーザ光源部と、前記レーザ光源部からの励起光を試料上に集光させる対物レンズ光学系と、前記レーザ光源部からの励起光を試料面上で走査させる走査手段と、前記走査手段と前記対物レンズ光学系との間に配置された瞳投影レンズと、試料から発し前記対物レンズ光学系と前記瞳投影レンズを経た蛍光を検出する検出光学系を備え、前記対物レンズ光学系が、対物レンズと、試料の中間像を形成するための結像レンズとを有し、前記対物レンズの後側焦点位置が、前記結像レンズと前記瞳投影レンズとによって前記走査手段の近傍位置で共役になるように構成されるレーザ走査型蛍光顕微鏡であって、
    前記対物レンズ光学系が、複数のレンズ群からなり、正レンズと負レンズの接合レンズを少なくとも１つ備え、
    前記対物レンズの同焦点距離をＤ、試料面から前記走査手段近傍に配置された、前記対物レンズの後側焦点位置の共役位置までの距離をＬ、前記接合レンズ中の正レンズのアッベ数をνｐ、前記結像レンズの焦点距離をＦＴＬ、前記対物レンズの胴付き位置から中間像位置までの距離をＤ１とするとき、下記条件を満足することを特徴とするレーザ走査型蛍光顕微鏡。
    ０．１５≦Ｄ／Ｌ≦０．５
    ０．４≦ＦＴＬ／Ｄ１≦１
    ８０≦νｐ
  3. レーザ光源部と、前記レーザ光源部からの励起光を試料上に集光させる対物レンズ光学系と、前記レーザ光源部からの励起光を試料面上で走査させる走査手段と、前記走査手段と前記対物レンズ光学系との間に配置された瞳投影レンズと、試料から発し前記対物レンズ光学系と前記瞳投影レンズを経た蛍光を検出する検出光学系を備え、前記対物レンズ光学系が、対物レンズと、試料の中間像を形成するための結像レンズとを有し、前記対物レンズの後側焦点位置が、前記結像レンズと前記瞳投影レンズとによって前記走査手段の近傍位置で共役になるように構成されるレーザ走査型蛍光顕微鏡であって、
    前記結像レンズが、少なくとも中間像側の前群と対物レンズ側の後群の２つのレンズ群からなり、前記結像レンズの前群のレンズ群は、少なくとも１つの負レンズを有し、
    前記対物レンズの同焦点距離をＤ、試料面から前記走査手段近傍に配置された、前記対物レンズの後側焦点位置の共役位置までの距離をＬ、前記結像レンズの後群の焦点距離をＦＴＬ１、前記結像レンズの前群と前記結像レンズの後群との間隔をＤ２とするとき、下記条件を満足することを特徴とするレーザ走査型蛍光顕微鏡。
    ０．１５≦Ｄ／Ｌ≦０．５
    ０．４≦Ｄ２／ＦＴＬ≦１
    ０．７≦ＦＴＬ１／ＦＴＬ≦１.５
  4. 前記レーザ光源部からの励起光を前記走査手段へ導く光伝送手段を備えたことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のレーザ走査型蛍光顕微鏡。
  5. 前記瞳投影レンズが、複数のレンズ群からなり、最も前記走査手段側のレンズ面が前記走査手段側に凹面を向け、最も中間像側のレンズ面が中間像側に凹面を向けており、
    前記走査手段の近傍に位置する前記対物レンズの瞳の共役位置から前記結像レンズの中間像位置までの距離をＤ３、前記瞳投影レンズの焦点距離をＦｅとするとき、下記条件を満足することを特徴とする請求項２、３、請求項２又は３に従属する請求項４のいずれかに記載のレーザ走査型蛍光顕微鏡。
    ０．２≦Ｆｅ／Ｄ３≦０．５
  6. 前記対物レンズ光学系が、複数のレンズ群からなり、正レンズと負レンズの接合レンズを少なくとも１つ備え、
    前記接合レンズ中の正レンズのアッベ数をνｐ、前記結像レンズの焦点距離をＦＴＬ、前記対物レンズの胴付き位置から中間像位置までの距離をＤ１とするとき、下記条件を満足することを特徴とする請求項１、３、請求項１又は３に従属する請求項４、請求項３又は請求項３に従属する請求項４に従属する請求項５のいずれかに記載のレーザ走査型蛍光顕微鏡。
    ０．４≦ＦＴＬ／Ｄ１≦１
    ８０≦νｐ
  7. 前記結像レンズが、少なくとも中間像側の前群と対物レンズ側の後群の２つのレンズ群からなり、前記結像レンズの前群のレンズ群は、少なくとも１つの負レンズを有し、
    前記結像レンズの後群の焦点距離をＦＴＬ１、前記結像レンズの前群と前記結像レンズの後群との間隔をＤ２とするとき、下記条件を満足することを特徴とする請求項１、２、請求項１又は２に従属する請求項４、請求項２又は請求項２に従属する請求項４に従属する請求項５、請求項１又は請求項１に従属する請求項４に従属する請求項６のいずれかに記載のレーザ走査型蛍光顕微鏡。
    ０．４≦Ｄ２／ＦＴＬ≦１
    ０．７≦ＦＴＬ１／ＦＴＬ≦１.５
  8. 前記レーザ光源部からの励起光を前記走査手段へ導く第１のマルチモードファイバーと、試料からの蛍光を前記検出光学系へ導く第２のマルチモードファイバーと、前記励起光を前記第１のマルチモードファイバーに入射させる第１のレンズと、前記蛍光を前記第２のマルチモードファイバーに入射させる第２のレンズを備え、
    前記第１のマルチモードファイバーのコア径をΦｅｘ、前記第２のマルチモードファイバーのコア径をΦｅｍ、前記第１のレンズにより前記第１のマルチモードファイバーに入射する開口数をＮＡｅｘ、前記励起波長をλｅｘ、前記第２のレンズにより前記第２のマルチモードファイバーに入射する開口数をＮＡｅｍ、前記蛍光波長をλｅｍとするとき、下記条件を満足することを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載のレーザ走査型蛍光顕微鏡。
    ２≦Φｅｍ／Φｅｘ≦１２
    ０．６１×（λｅｘ／ＮＡｅｘ）＜Φｅｘ
    ０．６１×（λｅｍ／ＮＡｅｍ）＜Φｅｍ
  9. 前記瞳投影レンズを経た、試料からの蛍光を前記検出光学系へ導く光伝送手段を備えたことを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載のレーザ走査型蛍光顕微鏡。
  10. 前記レーザ光源部からの励起光を前記走査手段へ導くとともに、前記試料からの蛍光を前記検出光学系へ導く光伝送光学系を備えたことを特徴とする請求項１乃至９のいずれかに記載のレーザ走査型蛍光顕微鏡。
  11. 前記レーザ光源部からの励起光を前記走査手段へ導く第１の光伝送手段と、前記試料からの蛍光を前記検出光学系へ導く第２の光伝送手段を備えたことを特徴とする請求項１乃至９のいずれかに記載のレーザ走査型蛍光顕微鏡。
  12. 前記対物レンズが、水浸対物レンズであることを特徴とする請求項１乃至１１のいずれかに記載のレーザ走査型蛍光顕微鏡。
  13. レーザ光源が半導体レーザで構成されたことを特徴とする請求項１乃至９のいずれかに記載のレーザ走査型蛍光顕微鏡。
  14. 前記検出器が顕微鏡本体部に構成されていることを特徴とする請求項１乃至９のいずれかに記載のレーザ走査型蛍光顕微鏡。
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