WO2020159080A1 - 방사성 동위원소가 표지된 광가교성 하이드로젤 및 그 제조 방법 - Google Patents

방사성 동위원소가 표지된 광가교성 하이드로젤 및 그 제조 방법 Download PDF

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WO2020159080A1
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hydrogel
hama
photocrosslinkable
compound
microgel
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양승윤
김소담
임상구
쿠마르수짓
찬드라세카란아지시
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부산대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a photocrosslinkable hydrogel labeled with a radioactive isotope and a method for manufacturing the same.
  • Cancer is one of the most fatal diseases humanity faces to date, and although it has made great strides in early diagnosis and treatment, it still accounts for 30% of the world's causes of death.
  • Chemotherapy one of the methods of treating cancer, is popularly used, but it is difficult to control the concentration of drugs and has a limitation of low targeting ability to a tumor site.
  • External radiation therapy is a relatively well controlled and controlled treatment method that induces radiation into the body through a device and destroys tumor cells, but non-specific destruction of normal tissue adjacent to the tumor, poor in the path of the ion beam, and infiltrating tissue Problems, such as the need for high radiation doses, remain.
  • internal radiation therapy is simpler than surgical and external radiation therapy and minimizes patient pain.
  • 90 Y, 67 Cu, 188 Re, 177 Lu, and 131 I have been injected intravenously with a solution containing radioactive elements to induce the destruction of tumor cells.
  • Iodine radioactive isotope is an internal radiation therapy that accumulates in the thyroid tissue due to the radiation ionization effect and causes cell death and necrosis of cancer cells.
  • iodine was labeled or supported on the polymer to increase the retention time or to target the desired site.
  • carrier with low biocompatibility
  • the manufacturing time is long, the efficiency is reduced, and the effective retention at a desired site was low.
  • PLLA poly L-lactic acid
  • the chitosan micro hydrogel labeled with 131 I containing doxorubicin, an anticancer drug is maintained locally at the injection site, but the process of manufacturing the micro hydrogel is complicated and difficult to apply to the clinic. There is this.
  • the present invention provides a photocrosslinkable compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the present invention provides a photocrosslinkable hydrogel for radiation treatment containing the compound or a salt thereof and a method for manufacturing the same.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for radiation treatment, radiation diagnostic imaging or anti-cancer treatment containing the hydrogel.
  • X may be selected from the group consisting of photo-crosslinkable acrylate, methacrylate, glycidyl methacrylate and vinyl ester,
  • Y may be OH or Formula 2
  • R 1 and R 2 may be the same or different, and hydrogen, imidazole, pyrrole, furan, which can label one or more radioactive isotopes, It is selected from the group consisting of thiophene, indole and 3,4-dihydroxyphenyl, m 1 and m 2 are integers from 0 to 2, n is 20 to It can be 4,000.
  • the compounds according to the invention or pharmaceutically acceptable salts thereof may be labeled with radioactive isotopes.
  • the photocrosslinkable hydrogel for radiation treatment according to the present invention may contain the compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition for radiation treatment according to the present invention may contain the hydrogel as an active ingredient.
  • composition for radiographic imaging according to the present invention may contain the hydrogel as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition for anticancer treatment according to the present invention may include the hydrogel and the anticancer agent.
  • a method of manufacturing a photocrosslinkable micro hydrogel for radiation treatment comprises the steps of preparing a photocrosslinkable compound; Dissolving the prepared photocrosslinkable compound in a photoinitiator solution and then injecting it into an inlet of the microfluidic device; Injecting an oil containing a surfactant into the outlet of the microfluidic device; Forming microdroplets using centrifugation; And extracting the formed microdroplets and cross-linking them, followed by washing to form microgels.
  • the hydrogel according to the present invention is a micro-sized hydrogel that imparts light-crosslinking properties to hyaluronic acid and is labeled with radionuclides, and can be treated while minimizing damage to surrounding tissues due to its excellent retention in local areas requiring radiation treatment. . Therefore, the hydrogel can be used as a pharmaceutical composition for radiotherapy and a composition for radiographic imaging. In addition, it can be used in combination with an anti-cancer agent as a pharmaceutical composition for anti-cancer treatment, thereby effectively treating cancer.
  • the hydrogel according to the present invention uses hyaluronic acid having excellent biodegradability and biocompatibility, and thus can be used as a safe therapeutic composition with little immune rejection.
  • the hydrogel according to the present invention can be manufactured and used immediately and conveniently in the field using a portable microfluidic system, thereby maximizing the effect of radiation treatment.
  • HAMA 131 I-labeled photo-crosslinkable methacrylate hyaluronic acid
  • FIG. 2 shows a 1 H NMR spectrum and a chemical structure of a hyaluronic acid-based conjugate according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a schematic diagram of formation of microdroplets during microgel production according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 shows the size of the HAMA microdroplet according to the number of revolutions per minute (RPM) of the centrifuge according to an embodiment of the present invention.
  • RPM revolutions per minute
  • FIG. 6 is a manufacturing process in the field of 131 I-HAMA microgel according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 7 quantifies radiation intensity in a 131 I-HAMA microgel prepared according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 9 is a shape of a microgel manufactured according to an experimental example of the present invention.
  • FIG. 10 is a site in which FITC-HAMA microgel according to an experimental example of the present invention is injected into a rat.
  • 16 is a schematic diagram showing an application example of a microgel according to an embodiment of the present invention.
  • 17 is a manufacturing process of HAMA according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 19 is a graph showing the mechanical properties of a hydrogel according to an experimental example of the present invention.
  • 21 is a 1 H NMR spectrum of HAMA-N-indole and HAMA-N-iodoindole produced according to one production example of the present invention.
  • the present inventors have produced a micro-sized hydrogel using a portable microfluidic system in the field by giving photo-crosslinking properties to hyaluronic acid having excellent biodegradability and biocompatibility and labeling radioactive nuclide 131 I.
  • the present invention was completed by confirming that it was maintained locally in the injected site without spreading to other tissues.
  • radionuclides refers to a phenomenon in which energy is propagated through space or a substance that mediates propagation, and may be emitted by various radionuclides.
  • radiation treatment refers to a treatment that kills cancer cells or the like through an action that causes chemical denaturation of nucleic acids, cell membranes, etc., which are essential for cell proliferation and survival using the high energy radiation.
  • radioactivity refers to the intensity of the radiation.
  • micro hydrogel is a crosslinked particle that swells without dissolving in water at a level of several hundreds to hundreds of micrometers ( ⁇ m) that can be injected using a syringe, and generally refers to swellable spherical or plate-like gel particles. Meaning, and may be expressed in terms such as “microgel” or "microgel”.
  • HAMA refers to hyaluronic acid to which a methacrylate group is bonded, and may be expressed in terms such as hyaluronate methacrylate and methacrylated hyaluronic acid. have.
  • HAMA-A means that various types of cyclic compounds A are conjugated (conjugated) to hyaluronic acid (HAMA) to which a methacrylate group is attached.
  • HAMA-A-B means that the radioisotope (B) is labeled on the cyclic compound A conjugated to the HAMA.
  • the present invention provides a compound represented by Formula 1 below, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • X may be one selected from the group consisting of photo-crosslinkable acrylate, methacrylate, glycidyl methacrylate, and vinyl ester,
  • Y may be OH or Formula 2
  • R 1 and R 2 may be the same or different, and hydrogen, imidazole, pyrrole, furan, which can label one or more radioactive isotopes, It may be a ring compound selected from the group consisting of thiophene, indole and 3,4-dihydroxyphenyl, m 1 and m 2 are integers from 0 to 2 , n may be 20 to 4,000 (number average molecular weight is 10,000 to 2,000,000), preferably 100 to 400 (number average molecular weight is 50,000 to 200,000).
  • the Y is N-(3-aminopropyl)-imidazole (N-(3-Aminopropyl)-imidazole; API), 3-(1H-pyrrole-1-yl)-1-propanamine ( 3-(1H-pyrrol-1-yl)-1-propanamine), 1-(3-furyl)methaneamine (1-(3-Furyl)methanamine), thienylmethylamine, tryptamine, What is selected from the group consisting of dopa (3,4-dihydroxyphenylalanine; DOPA) and derivatives thereof may be combined.
  • DOPA dopa (3,4-dihydroxyphenylalanine
  • the compound may include hyaluronate methacrylate (hereinafter referred to as HAMA)-API, HAMA-DOPA, HAMA-pyrrol, HAMA-furan, HAMA-thiophene, HAMA-indole, and derivatives thereof. .
  • HAMA hyaluronate methacrylate
  • the pharmaceutically acceptable salt according to the present invention may include either a pharmaceutically acceptable basic salt or an acid salt.
  • the basic salt can be used in either organic or inorganic base, sodium salt, potassium salt, calcium salt, lithium salt, magnesium salt, cesium salt, aluminum salt, ammonium salt, triethyl It may be selected from the group consisting of an aluminum salt and a pyridinium salt, but is not limited thereto.
  • an acid addition salt formed by free acid is useful.
  • Inorganic and organic acids can be used as the free acid, hydrochloric acid, bromic acid, sulfuric acid, sulfurous acid, phosphoric acid, double phosphoric acid, nitric acid, etc. can be used as the inorganic acid.
  • Citric acid, acetic acid, maleic acid, malic acid and fumaric acid can be used as the organic acid , Gluconic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, camphorsulfonic acid, oxalic acid, malonic acid, glutaric acid, acetic acid, glycolic acid, succinic acid, tartaric acid, 4-toluenesulfonic acid, galacturonic acid, embonic acid, Glutamic acid, citric acid, aspartic acid, stearic acid, and the like can be used.
  • hydrochloric acid as the inorganic acid and methanesulfonic acid as the organic acid may be used.
  • the compound according to the present invention may include all salts, hydrates and solvates that can be prepared by conventional methods, as well as pharmaceutically acceptable salts.
  • the compound can be prepared by dissolving the compound in a water-miscible organic solvent such as acetone, methanol, ethanol, or acetonitrile, adding excess organic base or adding an aqueous base solution of an inorganic base, followed by precipitation or crystallization.
  • the solvent or excess base may be evaporated from this mixture, followed by drying to obtain an added salt, or the precipitated salt may be filtered by suction filtration.
  • the radioactive isotope may include a halogen radioactive isotope, consisting of 131 I, 125 I, 124 I, 123 I, 18 F, 19 F, 177 Lu and 211 At It may be one or more selected from the group, preferably 131 I, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof, characterized in that the radioisotope is labeled on the compound represented by Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the radioactive isotope may include a halogen radioactive isotope, may be at least one selected from the group consisting of 131 I, 125 I, 124 I, 123 I, 18 F, 19 F, 177 Lu and 211 At, preferably May be 131 I, but is not limited thereto.
  • the radioactive isotopes are imidazole, pyrrole, furan, thiophene, indole and 3,4-dihydroxyphenyl (3,4-diazole) contained in the compound.
  • dihydroxyphenyl) may be labeled with one or more ring compounds selected from the group consisting of, more specifically, N-(3-aminopropyl)-imidazole (N-(3-Aminopropyl)-imidazole; API), 3- (1H-pyrrol-1-yl)-1-propanamine (3-(1H-pyrrol-1-yl)-1-propanamine), 1-(3-furyl)methanamine (1-(3-Furyl)methanamine ), thienylmethylamine (thienylmethylamine), tryptamine (tryptamine), dopa (3,4-dihydroxyphenylalanine; DOPA) and derivatives thereof are labeled with a ring compound selected from the group consisting of HAMA-AP
  • the present invention provides a photocrosslinkable hydrogel for radiation treatment.
  • the photocrosslinkable hydrogel for radiation treatment according to the present invention is a radioactive isotope in the compound represented by Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof, specifically 131 I, 125 I, 124 I, 123 I, 18 F, 19 F, 177 Lu and 211 At may contain at least one compound selected from the group consisting of or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the hydrogel is a highly hydrated material composed of a hydrophilic polymer that forms a three-dimensional network organized in a crosslinking process to form a soft and porous structure.
  • the hydrogel formed through photocrosslinking has the advantage of being soft and excellent in fluidity. have.
  • the hydrogel may have an average particle size of a micrometer ( ⁇ m) unit size, and may be a microgel having an average particle size of 10 to 200 ⁇ m, preferably 50 to 100 ⁇ m. According to one experimental example of the present invention, the microgel may be injected into the human body for radiation treatment.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for radiation treatment.
  • the pharmaceutical composition for radiation treatment according to the present invention may contain the photocrosslinkable hydrogel as an active ingredient.
  • treatment may include, without limitation, a disease such as cancer or any action in which the disease is improved or beneficial.
  • the type of the disease targeted for the radiation treatment is not particularly limited, for example, thyroid cancer, breast cancer, biliary cancer, gallbladder cancer, pancreatic cancer, colon cancer, uterine cancer, esophageal cancer, stomach cancer, brain cancer , Rectal cancer, lung cancer, bladder cancer, kidney cancer, ovarian cancer, prostate cancer, uterine cancer, head and neck cancer, skin cancer, blood cancer, and liver cancer, and may be one or more cancers selected from the group, preferably breast cancer, uterine cancer, prostate cancer or skin cancer Can be
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered by parenteral administration, including subcutaneous, intradermal, intravenous, intramuscular, intraarticular, intrasacral, intrasternal, epidural, intralesional and intracranial injection or infusion techniques, preferably It can be administered as an injection formulation.
  • compositions for parenteral administration include sterile aqueous or non-aqueous solutions, dispersants, suspensions, or emulsions, as well as sterile powders that are re-prepared immediately prior to use as sterile solutions or suspensions.
  • suitable sterile aqueous and non-aqueous carriers, diluents, solvents or vehicles include water, saline, ethanol, polyols (e.g. glycerol, propylene glycol, polyethylene glycol, etc.) and mixtures thereof, vegetable oils (e.g. Olive oil), injectable organic esters (eg ethyl oleate).
  • a coating material such as lecithin may be used to maintain an appropriate specific size, and a surfactant may be used to maintain proper fluidity.
  • parenteral compositions may contain adjuvants such as preservatives, wetting agents, emulsifying agents and dispersing agents. Sterilization of the injectable formulation can be used by, for example, filtering through a sterile filter, pre-sterilizing the components of the mixture before mixing, during manufacture or just prior to administration (as in the case of double container syringe packages).
  • the pharmaceutical composition according to the present invention can be used to treat cancer that is injected around the solid cancer alone or remains or is scattered after surgery for the treatment of disease.
  • it can be used in combination with methods of using hormone therapy, drug therapy, and biological response modifiers.
  • the present invention provides a composition for radiographic imaging.
  • the composition for radiographic imaging according to the present invention may contain the photocrosslinkable hydrogel as an active ingredient.
  • the radiation diagnostic image refers to radiation image data generated by radiation being injected into or inside a subject for diagnosis of a disease or illness. Through the image data, it is possible to grasp the presence or absence of disease, the size of cancer, and the like.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for anticancer treatment.
  • the pharmaceutical composition for anticancer treatment according to the present invention may include the photocrosslinkable hydrogel and an anticancer agent.
  • the anticancer agent may be a taxane or a derivative thereof, for example, docetaxel, cabazitaxel, paclitaxel, and in addition, vinblastine, vincristine, cisplain , Actinomycin-D, 5-fluouracil, Cyclophosphamide, Procarbazine, Rituximab, Imatinib, Gefitinib (Gefitinib), erlotinib (Erlotinib), may be one or more selected from the group consisting of their pharmaceutically acceptable salts and hydrates, but is not limited thereto.
  • the radioactive isotope of the hydrogel and the anticancer agent are used in combination to be used for anticancer treatment, whereby it can be treated more effectively.
  • the present invention provides a method of manufacturing a photocrosslinkable micro hydrogel for radiation treatment.
  • the method of manufacturing a micro hydrogel according to the present invention comprises the steps of preparing a photocrosslinkable compound such as the compound; Dissolving the prepared photocrosslinkable compound in a photoinitiator solution and then injecting it into an inlet of the microfluidic device; Injecting an oil containing a surfactant into the outlet of the microfluidic device; Forming microdroplets using centrifugation; And extracting the formed microdroplets and cross-linking them, followed by washing to form microgels.
  • the manufacturing step of the photo-crosslinkable compound comprises: reacting a biodegradable polymer and methacrylate selected from the group consisting of hyaluronic acid, salts thereof, and combinations thereof; Imidazole, pyrrole, furan, thiophene, indole and 3,4-dihyrooxyphenyl capable of labeling one or more radioactive isotopes in the reacted reactant Conjugating one compound selected from the group consisting of (3,4-dihydroxyphenyl); And labeling the conjugated compound with a radioactive isotope.
  • the hyaluronic acid (HA) is a linear polysaccharide found in the extracellular matrix of soft tissue, and is a biopolymer having excellent biocompatibility and biodegradability.
  • the "biodegradable” means a property that can be decomposed when exposed to a physiological solution having a pH of 6 to 8, and is preferably decomposed by body fluids or microorganisms, etc., in vivo in mammals including humans. It means a property that can.
  • the salt of hyaluronic acid may include all of inorganic salts such as sodium hyaluronate, potassium hyaluronate, calcium hyaluronate, magnesium hyaluronate, zinc hyaluronate, cobalt hyaluronate, and organic salts such as tetrabutylammonium hyaluronate, It is not limited to this.
  • hyaluronic acid itself or a salt thereof can be used alone or in combination of two or more types of hyaluronic acid and a salt thereof.
  • the biodegradable polymer may include synthetic polymers such as poly(ethylene glycol) and poly(vinyl alcohol) in addition to the hyaluronic acid; Polysaccharides or carbohydrates such as heparan sulfate, chondroitin sulfate, chitosan, alginate; Natural proteins such as gelatin, collagen, and albumin may be included as components.
  • synthetic polymers such as poly(ethylene glycol) and poly(vinyl alcohol) in addition to the hyaluronic acid
  • Polysaccharides or carbohydrates such as heparan sulfate, chondroitin sulfate, chitosan, alginate
  • Natural proteins such as gelatin, collagen, and albumin may be included as components.
  • the methacrylate is a photocrosslinking agent, and reacts with the hyaluronic acid to obtain a photocrosslinkable hydrogel.
  • the "photocrosslinking agent” means a compound capable of inducing a radical reaction in the reaction system by forming a radical by light irradiation, and a compound commonly used as a photocrosslinking agent or photoinitiator can be used as the photocrosslinking agent of the present invention, but only , It is more preferable to use a light crosslinking agent or a photoinitiator that is not toxic or weak in vivo.
  • the photocrosslinking technology enables crosslinking in the field of the precursor solution and provides better space and time control over crosslinking density than chemical crosslinking technology.
  • the photocrosslinking method using ultraviolet light or visible light can produce a hydrogel having a wide range of mechanical properties and degradability.
  • the methacrylate is 30 minutes to 2 hours, preferably 1 hour to 0 to 10° C., preferably 3 to 7° C., cooled to the biodegradable polymer solution. It can be added dropwise over 1 hour and 30 minutes, and can be carried out by maintaining for 20 to 30 hours in the range of pH 7 to 11, preferably pH 8 to 10, and thus methacrylated hyaluronic acid (hereinafter, HAMA). It can be formed.
  • HAMA methacrylated hyaluronic acid
  • the HAMA formed according to the method of the step may have a degree of methacrylation (DM) of 100% or more, that is, a degree of substitution of a high methacrylate group, and the higher the methacrylation degree, the more mechanical properties and strength will be improved.
  • DM degree of methacrylation
  • the HAMA with improved mechanical properties is biodegraded slowly in vivo, and radiation treatment can be performed for a suitable time.
  • the conjugation step includes imidazole, pyrrole, furan, thiophene, indole and 3,4 that can label one or more radioactive isotopes on the formed HAMA.
  • -It is possible to conjugate one compound selected from the group consisting of 3,4-dihydroxyphenyl.
  • N-(3-aminopropyl)-imidazole N-(3-Aminopropyl)-imidazole; API
  • 3-(1H-pyrrole-1-yl)-1-propanamine 3-( 1H-pyrrol-1-yl)-1-propanamine)
  • 1-(3-furyl)methanamine 1-(3-Furyl)methanamine
  • thienylmethylamine 1-(3-Furyl)methanamine
  • tryptamine dopa (3 ,4-dihydroxyphenylalanine (DOPA) and derivatives thereof.
  • DOPA dopa (3 ,4-dihydroxyphenylalanine
  • the radioactive isotope labeling step is at least one selected from the group consisting of radioactive isotopes, for example, 131 I, 125 I, 124 I, 123 I, 18 F, 19 F, 177 Lu and 211 At to the conjugated compound. By labeling it, a radioactive isotope-labeled photocrosslinkable compound can be formed.
  • the photocrosslinkable compound may be contained in 1 to 20% by weight of the photoinitiator solution, and the centrifugation may be performed at 1000 to 2000 RPM, preferably 1400 to 1600 RPM. Accordingly, an appropriate amount of micro hydrogel can be prepared for radiation treatment.
  • the microgel may be prepared as a gel type injection formulation, and injected into the body to remain at the injection site for 1 to 3 weeks.
  • the manufacturing method can be used immediately by preparing the microgel in the field within 10 to 60 minutes, preferably within 10 to 30 minutes, and can be appropriately prepared and used when radiation treatment is required.
  • Methacrylic anhydride sodium hydroxide, N-(3-aminopropyl)-imidazole (API), 1-ethyl-3-(3 -Dimethylaminopropyl)-carbodiimide (EDC), N-hydroxysuccinimide (NHS), chloramine T, sodium Sodium metabisulfite, sodium iodide, dimethyl sulfoxide (DMSO), acetaldehyde, cyclohexyl isocyanide, fluorescein -amine) was purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis MO, USA). Polydimethylsiloxane (PDMS, Sylgard 184) was purchased from Dow Corning.
  • API N-(3-aminopropyl)-imidazole
  • EDC 1-ethyl-3-(3 -Dimethylaminopropyl)-carbodiimide
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • chloramine T sodium Sodium metabisulfite,
  • Pico-surf(TM) 2 wt% in NovecTM 7500 was purchased from Sphere Fluidics (Cambridge, UK).
  • Novec 7500 oil was purchased from 3M (St Paul, MN).
  • Hyaluronic acid (HA) having a molecular weight of 90 KDa was purchased from Bioland (SK, Korea).
  • HAMA 131 I-labeled photo-crosslinkable methacrylate hyaluronic acid
  • methacrylated hyaluronic acid (Methacrylated hyaluronic acid; hereinafter, HAMA) was prepared through an esterification reaction of a primary hydroxy group of hyaluronic acid (HA). 240 mg of hyaluronic acid was dissolved in 50 mL of deionized water at 25°C. After preparing this solution to pH 9 using 1M NaOH at 4°C, 420 mg of methacrylic anhydride was added and stirred for 24 hours. The completed composite was dialyzed in deionized water for 96 hours while exchanging water every 8 hours. The dialyzed product was lyophilized to obtain HAMA.
  • HAMA methacrylated hyaluronic acid
  • HAMA-API is API to hyaluronic acid through amidation reaction of amine group of carboxyl group of HAMA with amine group of N-(3-aminopropyl)-imidazole (hereinafter, API).
  • API N-(3-aminopropyl)-imidazole
  • EDC 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • the chloramine T method was used to replace iodine in the imidazole ring of HAMA-API.
  • 24 mg of HAMA-API was added to a 2 mL centrifuge tube, dissolved in 500 ⁇ l of PBS, and 100 ⁇ l of NaI (Na 131 I) was added and left for 10 minutes.
  • 10 ⁇ l (5 mg/mL) of chloramine T solution dissolved in PBS was added and vortexed for 10 minutes.
  • 10 ⁇ l (10 mg/mL) of a sodium bisulfite solution dissolved in PBS was added.
  • 1 mL of ethanol was added to the reaction mixture and centrifuged at 5000 RPM for 20 minutes. After removing the supernatant, iodine-labeled HAMA was obtained.
  • the hyaluronic acid-based conjugate was analyzed for chemical properties through 1 H-NMR (600 MHz Agilent NMR System, Palo Alto, USA).
  • FIG. 2 shows a 1 H NMR spectrum and a chemical structure of a hyaluronic acid-based conjugate according to an embodiment of the present invention.
  • the iodized I-HAMA analyzed that the carbon number 5 of the imidazole ring decreased in intensity due to iodine substitution.
  • HAMA microgels were prepared as water-in-oil (W/O) emulsions of 131 I-labeled photocrosslinkable hyaluronic acid through a portable centrifugal microfluidic system.
  • FIG. 3 is a schematic diagram of microdroplet formation during microgel production according to an embodiment of the present invention.
  • a controlled amount of HAMA was dissolved in a solution of 1 wt% irgacure 2959 (water-soluble photoinitiator) of 200 ⁇ l, and then injected into the inlet of the microfluidic device.
  • irgacure 2959 water-soluble photoinitiator
  • 50 ⁇ l of Novec oil in which 2% by weight pico-surf was dissolved was injected.
  • the solution-filled device was coupled to a portable centrifuge (Micro-12, Hanil, Korea) so that the outlet faced the center, and the RPM was adjusted for 3 minutes to form microdroplets. Droplets were formed by the centrifugal force applied in the outlet direction and the capillary phenomenon of the nozzle inside the outlet.
  • FIG. 5 shows the size of the HAMA microdroplet according to the number of revolutions per minute (RPM) of the centrifuge according to an embodiment of the present invention.
  • RPM revolutions per minute
  • 6 is a manufacturing process in the field of 131 I-HAMA microgel according to an embodiment of the present invention.
  • the second embodiment in accordance with the manufacturing micro-gel process according to disperse the HAMA powder with a 131 I labeled in PBS solution is a 15-minute to produce a 131 I-HAMA microgel, radioisotopes on site Has the advantage of being able to produce labeled micro hydrogels.
  • a cell strainer (pore size: 70 ⁇ L, SPL) was placed in 6 wells at room temperature, and 0.3 mCi 131 I-HAMA microgel was cast on the cell strainer.
  • 131 I-HAMA micro gel is filled into a well filled with PBS (pH 7.4) 5mL of the radiation intensity of 131 I-HAMA microgel remaining in the cell strainer with time CRC015R dose calibrator (dose calibrator, Capintec Inc., Ramsey , USA).
  • FIG. 7 quantifies radiation intensity in a 131 I-HAMA microgel prepared according to an embodiment of the present invention.
  • the prepared radioactive microgel having a size of about 100 ⁇ m can be easily injected into a desired site through a syringe, and a quantitative radiotherapy can be achieved.
  • the rate of decomposition and dissolution of the microgel can vary depending on the degree of crosslinking, radiation treatment can be performed for a desired period, thereby minimizing the dose and maximizing radiation treatment to the local area, which minimizes tissue damage. Can be expected.
  • HAMA fluorescently bound HAMA was prepared. 200 mg of HAMA was dissolved in a solution of 160 mL of DI water and 70 mL of dimethyl sulfoxide (DMSO) at 25°C. To this mixture, 100 ⁇ l of fluorescein-amine, acetaldehyde, and cyclohexyl isocyanide was added, and the amidation reaction was performed for 24 hours.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the carboxyl group of HAMA was conjugated through the amidation reaction of fluorescein-amine.
  • the final mixture was dialyzed in 100 mM NaCl solution for 48 hours, lyophilized, and then a HAMA microgel conjugated with Fluorescein isothiocyanate (FITC) was prepared through a microfluidic system.
  • FITC Fluorescein isothiocyanate
  • FIG. 9 is a shape of a microgel manufactured according to an experimental example of the present invention.
  • FIG. 10 is a site in which FITC-HAMA microgel according to an experimental example of the present invention is injected into a rat.
  • FITC-HAMA microgel according to an experimental example of the present invention is injected into a rat.
  • 0.2 mL of a solution dispersed in PBS (pH 7.4) was injected into the femoral muscle of an active rat to evaluate the biodistribution of FITC-HAMA.
  • FITC-HAMA microgel was stably injected into the rat femoral muscle and was observed to be embedded in the muscle tissue at the injection site, and no inflammation was observed in the tissue due to polymer degradation or retention.
  • a is a Na 131 I solution
  • b is an 131 I-HAMA microgel solution
  • the rats injected with the 131 I-HAMA microgel solution were confirmed to remain locally at the injection site even after 168 h (T: thyroid, S: stomach, B: bladder).
  • FIG. 14 is a measurement of the movement of the 131 I solution according to an experimental example of the present invention to another tissue
  • FIG. 15 shows the movement of the 131 I-HAMA microgel solution according to an experimental example of the present invention to another tissue. It was measured. 14 and 15, the 131 I solution was measured in the thyroid, stomach, and bladder in addition to the injection site, but the 131 I-HAMA microgel solution was hardly found in other sites. In addition, the intensity of radiation decreased rapidly in the 131 I solution, but gradually decreased in hydrolysis of the hydrogel in the 131 I-HAMA microgel solution.
  • radioactive microgels made of photocrosslinkable hyaluronic acid (HA) labeled 131 I may be localized at the injection site, and adhere to muscle tissue after injection and retention time of the radionuclide to the target site Increases, but rapid absorption in body fluids can be minimized.
  • the application of this technique can improve the radiation therapy that periodically injects existing radionuclides into patients, while also retaining the potential as a delivery agent for new injectable radionuclide preparations with low toxicity.
  • hyaluronic acid (HA, Mw: 90 kDa; SNvia, Korea) was dissolved in 12 mL distilled water, and the pH was adjusted to 8 using 1N sodium hydroxide. After the hyaluronic acid solution was cooled to 5°C, 1 or 4 times the equivalent of methacrylic anhydride (MA) relative to the disaccharide unit of hyaluronic acid was added dropwise over 1 hour. At the same time, 1N sodium hydroxide was added to maintain the pH between 8.0 and 10.0.
  • MA methacrylic anhydride
  • the macromer solution was dialyzed with distilled water for 3 days (Cellu Sep, nominal molecular weight cutoff 3500 Da), frozen at -55°C and freeze-dried until used. Stored at 20°C.
  • 17 is a manufacturing process of HAMA according to an embodiment of the present invention.
  • the photocrosslinkable methacrylate group is generally incorporated into the hyaluronic acid polymer backbone by reacting with methacryl anhydride under aqueous basic conditions.
  • the primary hydroxyl group of hyaluronic acid is considered to be the most reactive site for transesterification.
  • Hyaluronic acid has four hydroxyl groups per disaccharide unit, and all four hydroxyl groups can be incorporated with methacrylate groups.
  • HAMAs with different DMs can be synthesized.
  • DM parameters that determine DM, such as the pH and temperature of the reaction mixture.
  • Methacrylic anhydride is hydrolyzed in an aqueous medium, which is catalyzed by hydroxide ions, particularly at pH 10.0 or higher, to form methacrylic acid and does not react further with hyaluronic acid. Hydrolysis of methacrylic anhydride to methacrylic acid at low temperatures is considered to be slower. However, at this temperature, methacrylic anhydride exists as a separate step.
  • FIG. 18 is a 1 H NMR spectrum of HAMA prepared according to FIG. 17.
  • a 1 H NMR experiment was used to determine DM by incorporating methacrylate groups into hyaluronic acid.
  • the 1 H NMR spectrum showed new peaks around 5.6 and 6.0 ppm corresponding to acrylate protons, showing that methacrylate groups were incorporated into hyaluronic acid.
  • DM was calculated from the relative integration of methacrylate protons (5.6 and 6.0 ppm) with methyl protons of hyaluronic acid (1.9 ppm), which is 46 ⁇ 4% and 181 ⁇ 36 per disaccharide for 1 and 4 equivalents of methacryl anhydride. % Value.
  • the molecular weight of hyaluronic acid and its derivatives was estimated with a gel permeation chromatography system. They showed similar polymer molecular weight distribution and did not show premature crosslinking or chain splitting during the reaction. A methacrylation of 100% or more suggests that one or more hydroxyl groups have been substituted when 4 equivalents of methacryl anhydride have been used.
  • Hydrogels were analyzed directly in a mechanical tester (AND 210, Korea). The strain rate was set to 1 mm min -1 for tensile testing. The ultimate tensile strengths of the samples were determined at the break point (tensile fracture) of the hydrogel. Tensile strength was determined at the maximum point of stress in the stress-strain curve.
  • Young's modulus (tensile modulus) was calculated by obtaining the initial 5% of the slope from the strain-stress curve. Elasticity was determined at the maximum point of strain in the stress strain curve.
  • FIG. 19 is a graph showing the mechanical properties of a hydrogel according to an experimental example of the present invention.
  • (B) is a graph of the tensile strength of the hydrogel
  • (C) is a graph of the Young's modulus of the hydrogel
  • (D) is a graph of the elongation of the hydrogel (the asterisk is p ⁇ 0.05).
  • the tensile strength of (B) is increased as the concentration of HAMA solution increases from 5% to 20%, low DM is constant from 3.31 ⁇ 0.61 to 21.22 ⁇ 6.48 kPa, and high DM is constant from 8.83 ⁇ 2.99 to 44.24 ⁇ 7.09 kPa. Appeared to increase.
  • the elongation of (D) was varied in the range of 6 to 17% depending on DM and concentration.
  • Scheme 1 shows the production process of HAMA-DOPA-I.
  • 100 mg of HAMA was dissolved in 10 mL PBS (pH 7.4) solution.
  • PBS pH 7.4
  • 85.5 mg of EDC and 102.7 mg of NHS were added to the solution in the same manner as in the preparation method of HAMA-API of Example 1, and the mixture was stirred for 30 minutes.
  • 126.9 mg of dopamine hydrochloride was added and the pH of the reaction mixture was adjusted to 7 with 1N NaOH, followed by stirring at 25° C. for 24 hours.
  • the reaction mixture was dialyzed for 2 days in a pH 5.0 solution (Cellu Sep, nominal molecular weight cutoff 3500 Da) and then dialyzed for 1 day with distilled water.
  • the obtained solution was freeze-dried to obtain a product, and the resulting HAMA-DOPA solution was prepared, and then labeled 131 I. Since the substitution of 131 I may be more than that of HAMA-API according to Example 1, it is expected that the radiotherapy effect will be higher.
  • Scheme 2 shows the production process of HAMA-pyrrol-I.
  • 100 mg of HAMA was dissolved in 10 mL PBS (pH 7.4) solution.
  • PBS pH 7.4
  • EDC EDC
  • 102.7 mg of NHS were added to the solution in the same manner as in the preparation method of HAMA-API of Example 1, and the mixture was stirred for 30 minutes.
  • 110.7 mg of 3-(1H-pyrrol-1-yl)-1-propanamine (3-(1H-pyrrol-1-yl)-1-propanamine) was added. Stir at 25° C. for 24 hours.
  • the reaction mixture was dialyzed for 2 days in a pH 5.0 solution and then dialyzed for 1 day with distilled water.
  • the obtained solution was freeze-dried to obtain a product, and the produced HAMA-pyrrol solution was prepared, and then labeled 131 I.
  • Scheme 3 shows the preparation of HAMA-furan-I.
  • 100 mg of HAMA was dissolved in 10 mL PBS (pH 7.4) solution.
  • PBS pH 7.4
  • 85.5 mg of EDC and 102.7 mg of NHS were added to the solution in the same manner as in the preparation method of HAMA-API of Example 1, and the mixture was stirred for 30 minutes.
  • 119.2mg of 3-(aminomethyl)furan hydrochloride was added according to the reaction scheme 3 and stirred at 25° C. for 24 hours.
  • the reaction mixture was dialyzed for 2 days in a pH 5.0 solution and then dialyzed for 1 day with distilled water.
  • the obtained solution was freeze-dried to obtain a product, and the produced HAMA-furan solution was prepared, and then labeled 131 I.
  • Scheme 4 shows the preparation of HAMA-thiophene-I.
  • 100 mg of HAMA was dissolved in 10 mL PBS (pH 7.4) solution.
  • PBS pH 7.4
  • 85.5 mg of EDC and 102.7 mg of NHS were added to the solution in the same manner as in the preparation method of HAMA-API of Example 1, and the mixture was stirred for 30 minutes.
  • 100.9 mg of 2-thiophene methylamine was added and stirred at 25° C. for 24 hours.
  • the reaction mixture was dialyzed for 2 days in a pH 5.0 solution and then dialyzed for 1 day with distilled water.
  • the obtained solution was freeze-dried to obtain a product, and the produced HAMA-Thiophene solution was prepared, and then labeled 131 I.
  • Scheme 5 shows the preparation of HAMA-N-iodoindole.
  • the reaction mixture was dialyzed in DMSO solution for 12 hours and then dialyzed with distilled water for 3 days.
  • the obtained solution was freeze-dried to obtain a product, and the produced HAMA-indole solution was prepared, followed by labeling 131 I to prepare HAMA-N-iodoindole.
  • FIG. 20 is a UV/vis spectrum of HAMA and HAMA-N-indole produced according to one manufacturing example of the present invention
  • FIG. 21 is HAMA-N-indole and HAMA-N- produced according to one manufacturing example of the present invention 1 i NMR spectrum of iodoindole.

Abstract

본 발명은 광가교성 하이드로젤 및 그 제조 방법을 제공한다. 상기 하이드로젤은 방사성 동위원소가 표지된 광가교성 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 함유할 수 있고, 이는 방사선 치료용 조성물, 방사선 진단 이미징용 조성물, 및 항암 치료용 조성물로 이용될 수 있다. 상기 하이드로젤은 방사선 치료가 필요한 국소적 부위에 머무름이 우수하여 주변 조직의 손상을 최소화하면서 암 등의 질환을 치료할 수 있다. 또한, 항암제와 병용하여 항암 치료용 약학 조성물로 이용할 수 있어, 효과적으로 암을 치료할 수 있다. 본 발명에 따른 하이드로젤은 휴대용 미세유체 시스템을 이용하여 현장에서 즉시 빠르고 간편하게 제조하여 사용할 수 있고, 이를 통해 방사선 치료 효과를 극대화할 수 있다.

Description

방사성 동위원소가 표지된 광가교성 하이드로젤 및 그 제조 방법
본 발명은 방사성 동위원소가 표지된 광가교성 하이드로젤 및 그 제조 방법에 관한 것이다.
암은 현재까지도 인류가 직면하는 가장 치명적인 질병 중 하나로, 조기 진단과 치료법에 많은 발전을 이루었지만 여전히 암은 전 세계 사망 원인의 30%를 차지한다. 암을 치료하는 방법 중 하나인 화학 요법은 대중적으로 사용되지만, 약물의 농도를 조절하기 어렵고 종양 부위로의 낮은 표적화 능력이라는 한계를 갖는다. 외부 방사선 요법은 기기를 통해 체내에 방사선을 유도하고 종양세포를 파괴하는 방법으로 상대적으로 잘 제어되고 조절되는 치료법이지만, 종양에 인접한 정상 조직의 비특이적 파괴, 이온 빔의 경로에서의 불량, 침투하는 조직에 대한 높은 방사선량의 필요성 등 문제점이 여전히 남아있다. 대조적으로 내부 방사선 요법은 외과적 수술과 외부 방사선 요법에 비해 간편하며, 환자의 고통을 최소화시킨다. 90Y, 67Cu, 188Re, 177Lu, 131I 등과 방사성 원소가 포함된 용액을 정맥 주사하여 종양세포의 파괴를 유도해왔다.
요오드(Iodine) 방사성 동위원소는 방사선 이온화 효과로 갑상선 조직에 축적되어 암세포의 세포사멸과 괴사를 유발하는 내부 방사선 치료제이다. 하지만, 체내 주입 후 빠르게 온몸으로 퍼져 원하지 않는 장기나 정상조직에 손상을 주는 부작용이 있다. 이를 해결하기 위해 아이오딘을 고분자에 표지하거나 담지하여 머무름 시간을 높이거나 원하는 부위에 타겟팅(targeting)하는 효과를 거두었다. 하지만, 생체적합성이 낮은 전달체(carrier)를 사용하거나 제조시간이 길어 효율을 떨어뜨리고 원하는 부위에 효과적으로 머무름이 낮았다. 양친매성 고분자인 폴리 L-라틱 에시드(poly L-lactic acid, PLLA)에 131I를 표지한 나노입자는 종양조직으로 이동은 되었지만, 표적기관을 제외한 기관에서의 방사선 검출로 인해 국소적인 전달에는 어려운 점이 있다. 또한, 항암 치료제인 독소루비신(doxorubicin)을 내포하는 131I이 표지된 키토산(chitosan) 마이크로 하이드로젤은 국소적으로 주입부위에서 유지하고 있지만, 마이크로 하이드로젤을 제작하는 과정이 복잡하여 임상에 적용하는데 어려움이 있다.
상기와 같은 문제점을 해결하기 위해여, 본 발명은 광가교성 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
본 발명은 상기 화합물 또는 이의 염을 함유하는 방사선 치료용 광가교성 하이드로젤 및 그의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 하이드로젤을 함유하는 방사선 치료용, 방사선 진단 이미징용 또는 항암 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 하기 화학식 1로 표시될 수 있고,
[화학식 1]
Figure PCTKR2019018094-appb-I000001
상기 화학식 1에서,
X는 광가교가 가능한 아크릴레이트(acrylate), 메타크릴레이트(methacrylate), 글라이시딜 메타크릴레이트(glycidyl methacrylate) 및 비닐 에스테르(vinyl ester)로 이루어진 군에서 선택될 수 있고,
Y는 OH이거나, 하기 화학식 2일 수 있으며,
[화학식 2]
Figure PCTKR2019018094-appb-I000002
상기 화학식 1 또는 상기 화학식 2에서, R1 및 R2는 각각 동일하거나 다를 수 있고, 수소, 하나 이상의 방사성 동위원소를 표지할 수 있는 이미다졸(imidazole), 피롤(pyrrole), 퓨란(furan), 티오펜(thiophene), 인돌(indole) 및 3,4-디하이록시페닐(3,4-dihydroxyphenyl)로 이루어진 군에서 선택되며, m1 및 m2는 0 내지 2의 정수이고, n은 20 내지 4,000일 수 있다.
본 발명에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 방사성 동위원소가 표지될 수 있다.
본 발명에 따른 방사선 치료용 광가교성 하이드로젤은 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유할 수 있다.
본 발명에 따른 방사선 치료용 약학 조성물은 상기 하이드로젤을 유효성분으로 함유할 수 있다.
본 발명에 따른 방사선 진단 이미징용 조성물은 상기 하이드로젤을 유효성분으로 함유할 수 있다.
본 발명에 따른 항암 치료용 약학 조성물은 상기 하이드로젤 및 항암제를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 방사선 치료용 광가교성 마이크로 하이드로젤 제조 방법은 광가교성 화합물을 제조하는 단계; 상기 제조된 광가교성 화합물을 광개시제 용액에 용해시킨 후 미세유체 디바이스의 인렛(inlet)에 주입하는 단계; 상기 미세유체 디바이스의 아웃렛(outlet)에 계면활성제를 함유한 오일을 주입하는 단계; 원심분리를 이용하여 마이크로드롭렛(microdroplets)을 형성하는 단계; 및 상기 형성된 마이크로드롭렛을 추출하여 광가교시킨 후 세척하여 마이크로젤을 형성하는 단계;를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 하이드로젤은 히알루론산에 광가교적 성질을 부여하고 방사성 핵종을 표지한 마이크로 크기의 하이드로젤로, 방사선 치료가 필요한 국소적 부위에 머무름이 우수하여 주변 조직의 손상을 최소화하면서 치료할 수 있다. 그로 인해, 상기 하이드로젤은 방사선 치료용 약학 조성물, 방사선 진단 이미징용 조성물로 이용될 수 있다. 또한, 항암제와 병용하여 항암 치료용 약학 조성물로 이용할 수 있어, 효과적으로 암을 치료할 수 있다.
본 발명에 따른 하이드로젤은 생분해성, 생체적합성이 우수한 히알루론산을 이용하여 면역 거부 반응이 거의 없어 안전한 치료 조성물로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 하이드로젤은 휴대용 미세유체 시스템을 이용하여 현장에서 즉시 빠르고 간편하게 제조하여 사용할 수 있고, 이를 통해 방사선 치료 효과를 극대화할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 131I-표지된 광가교성 메타크릴레이티트 히알루론산(HAMA)의 합성과정을 나타낸 도식화한 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 히알루론산 기반 콘쥬게이트의 1H NMR 스펙트럼 및 화학적 구조를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로젤 제작 중 마이크로드롭렛(microdroplet) 형성의 개략도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로젤 형성 용액의 HAMA 농도에 따른 점도 변화를 측정한 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 원심분리기의 분당 회전수(RPM)에 따른 HAMA 마이크로드롭렛의 크기를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 131I-HAMA 마이크로젤의 현장에서의 제작 과정이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 131I-HAMA 마이크로젤 내의 방사선 세기를 정량화한 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실험예에 따라 제조된 형광물질이 결합한 HAMA이다.
도 9는 본 발명의 일 실험예에 따라 제조된 마이크로젤의 형상이다.
도 10은 본 발명의 일 실험예에 따른 FITC-HAMA 마이크로젤을 레트에 주사한 부위이다.
도 11은 도 10에 따른 실험의 결과이다.
도 12는 본 발명의 일 실험예에 따른 레트의 SPECT 이미지이다.
도 13은 본 발명의 일 실험예에 따른 131I의 흐름을 나타낸다.
도 14는 본 발명의 일 실험예에 따른 131I 용액의 다른 조직으로의 이동을 측정한 것이다.
도 15는 본 발명의 일 실험예에 따른 131I-HAMA 마이크로젤 용액의 다른 조직으로의 이동을 측정한 것이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로젤의 활용예를 보여주는 개략도이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 HAMA의 제조 과정이다.
도 18은 도 17에 따라 제조된 HAMA의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 19는 본 발명의 일 실험예에 따른 하이드로젤의 기계적 물성을 나타낸 그래프이다.
도 20은 본 발명의 일 제조예에 따라 생성된 HAMA 및 HAMA-N-indole의 UV/vis 스펙트럼이다.
도 21은 본 발명의 일 제조예에 따라 생성된 HAMA-N-indole 및 HAMA-N-iodoindole의 1H NMR 스펙트럼이다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명자는 생분해성 및 생체적합성이 우수한 히알루론산에 광가교적 성질을 부여하고 방사성 핵종인 131I를 표지하여 현장에서 휴대용 미세유체 시스템을 이용해 마이크로 크기의 하이드로젤을 제작하였고, 이에 따라 제작된 마이크로젤을 생체 내 주입하였을 때, 다른 조직으로 퍼지지 않고 주입한 부위에 국소적으로 유지하고 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 명세서에서, "방사선(radiation)"은 에너지가 공간을 통해 전파되는 현상 또는 전파를 매개하는 물질을 의미하고, 다양한 방사성 핵종에 의해 방출될 수 있다.
본 명세서에서, "방사선 치료"는 상기 고에너지 방사선을 이용하여 세포의 증식과 생존에 필수적인 핵산, 세포막 등에 화학적 변성을 초래하는 작용을 통해 암세포 등을 죽이는 치료를 의미한다.
본 명세서에서, "방사능(radioactivity)"은 상기 방사선의 세기를 의미한다.
본 명세서에서, "마이크로 하이드로젤"은 주사기를 이용하여 주입될 수 있는 수 내지 수백 마이크로미터(㎛) 단위 수준으로 물에 녹지 않고 팽윤되는 가교된 입자로, 일반적으로 팽윤성의 구상 또는 판상 젤 입자를 의미하며, "마이크로젤" 또는 "마이크로겔"등의 용어로 표현될 수 있다.
본 명세서에서, "HAMA"는 메타크릴레이트 기가 결합된 히알루론산을 의미하는 것으로, 히알루로네이트 메타크릴레이트(hyaluronate methacrylate), 메타크릴레이티드 히알루론산(methacrylated hyaluronic acid) 등의 용어로 표현될 수 있다.
본 명세서에서, "HAMA-A"는 메타크릴레이트 기가 결합된 히알루론산(HAMA)에 다양한 종류의 고리화합물 A가 접합(콘쥬게이트, conjugate)됨을 의미한다.
본 명세서에서, "HAMA-A-B"는 상기 HAMA에 접합된 고리화합물 A에 방사성 동위원소(B)가 표지된 것을 의미한다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
본 발명에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 하기 화학식 1로 표시될 수 있고,
[화학식 1]
Figure PCTKR2019018094-appb-I000003
상기 화학식 1에서 X는 광가교가 가능한 아크릴레이트(acrylate), 메타크릴레이트(methacrylate), 글라이시딜 메타크릴레이트(glycidyl methacrylate) 및 비닐 에스테르(vinyl ester)로 이루어진 군에서 선택된 하나일 수 있고,
Y는 OH이거나, 하기 화학식 2일 수 있으며,
[화학식 2]
Figure PCTKR2019018094-appb-I000004
상기 화학식 1 또는 상기 화학식 2에서, R1 및 R2는 각각 동일하거나 다를 수 있고, 수소, 하나 이상의 방사성 동위원소를 표지할 수 있는 이미다졸(imidazole), 피롤(pyrrole), 퓨란(furan), 티오펜(thiophene), 인돌(indole) 및 3,4-디하이록시페닐(3,4-dihydroxyphenyl)로 이루어진 군에서 선택되는 고리 화합물일 수 있으며, m1 및 m2는 0 내지 2의 정수이고, n은 20 내지 4,000(수평균 분자량은 10,000 내지 2,000,000), 바람직하게는 100 내지 400(수 평균 분자량은 50,000 내지 200,000)일 수 있다.
보다 상세하게는, 상기 Y에는 N-(3-아미노프로필)-이미다졸(N-(3-Aminopropyl)-imidazole; API), 3-(1H-피롤-1-일)-1-프로판아민(3-(1H-pyrrol-1-yl)-1-propanamine), 1-(3-푸릴)메탄아민(1-(3-Furyl)methanamine), 테닐메틸아민(thienylmethylamine), 트립타민(tryptamine), 도파(3,4-dihydroxyphenylalanine; DOPA) 및 이의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 것이 결합될 수 있다.
이에 따라, 상기 화합물은 히알루로네이트 메타크릴레이트(hyaluronate methacrylate; 이하, HAMA)-API, HAMA-DOPA, HAMA-pyrrol, HAMA-furan, HAMA-thiophene, HAMA-indole 및 이의 유도체 등이 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 상기 약학적으로 허용가능한 염은 약학적으로 허용가능한 염기성 염 또는 산성염 중 어느 하나의 형태를 포함할 수 있다.
염기성 염은 유기염기염, 무기염기염 중 어느 하나의 형태로 사용할 수 있으며, 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염, 리튬염, 마그네슘염, 세슘염, 아미늄(aminium)염, 암모늄염, 트리에칠아미늄염 및 피리디늄염으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
산성 염은 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 황산, 아황산, 인산, 이중 인산, 질산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 구연산, 초산, 말레산, 말산, 퓨마르산, 글루코산, 메탄설폰산, 벤젠설폰산, 캠퍼설폰산, 옥살산, 말론산, 글루타릭산, 아세트산, 글리콘산, 석신산, 타타르산, 4-톨루엔설폰산, 갈락투론산, 엠본산, 글루탐산, 시트르산, 아스파르탄산, 스테아르산 등을 사용할 수 있다. 바람직하게는 무기산으로는 염산, 유기산으로는 메탄설폰산을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 상기 화합물은 약학적으로 허용되는 염뿐만 아니라, 통상의 방법에 의해 제조될 수 있는 모든 염, 수화물 및 용매화물을 모두 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 화합물을 아세톤, 메탄올, 에탄올, 또는 아세토니트릴 등의 수혼화성 유기용매에 녹이고 과량의 유기 염기를 가하거나 무기 염기의 염기 수용액을 가한 후 침전시키거나 결정화시켜서 제조할 수 있다. 또는 이 혼합물에서 용매나 과량의 염기를 증발시킨 후 건조시켜서 부가염을 얻거나 또는 석출된 염을 흡입 여과시켜 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 화합물 또는 염에 있어서, 상기 방사성 동위원소는 할로겐족 방사성 동위원소를 포함할 수 있고, 131I, 125I, 124I, 123I, 18F, 19F, 177Lu 및 211At로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으며, 바람직하게는 131I일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염에 방사성 동위원소가 표지된 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
상기 방사성 동위원소는 할로겐족 방사성 동위원소를 포함할 수 있고, 131I, 125I, 124I, 123I, 18F, 19F, 177Lu 및 211At로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으며, 바람직하게는 131I일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 방사성 동위원소는 상기 화합물에 포함된 이미다졸(imidazole), 피롤(pyrrole), 퓨란(furan), 티오펜(thiophene), 인돌(indole) 및 3,4-디하이록시페닐(3,4-dihydroxyphenyl)로 이루어진 군에서 선택되는 고리 화합물에 하나 이상 표지될 수 있고, 보다 상세하게는, N-(3-아미노프로필)-이미다졸(N-(3-Aminopropyl)-imidazole; API), 3-(1H-피롤-1-일)-1-프로판아민(3-(1H-pyrrol-1-yl)-1-propanamine), 1-(3-푸릴)메탄아민(1-(3-Furyl)methanamine), 테닐메틸아민(thienylmethylamine), 트립타민(tryptamine), 도파(3,4-dihydroxyphenylalanine; DOPA) 및 이의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 고리 화합물에 표지되어, HAMA-API-I, HAMA-DOPA-I, HAMA-pyrrol-I, HAMA-furan-I, HAMA-thiophene-I, HAMA-N-iodoindole 및 이의 유도체 등을 형성할 수 있다. 보다 상세한 것은 하기 제조예에 따라 후술될 것이다.
본 발명은 방사선 치료용 광가교성 하이드로젤을 제공한다.
본 발명에 따른 방사선 치료용 광가교성 하이드로젤은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염에 방사성 동위원소, 상세하게는 131I, 125I, 124I, 123I, 18F, 19F, 177Lu 및 211At로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 표지하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유할 수 있다.
상기 하이드로젤은 연질 및 다공성 구조를 형성하기 위해 가교결합 과정에서 조직화된 3차원 네트워크를 형성하는 친수성 고분자로 구성된 고도로 수화된 물질로, 특히 광가교를 통해 형성된 상기 하이드로젤은 부드럽고 유동성이 뛰어난 장점이 있다.
상기 하이드로젤은 마이크로 미터(㎛) 단위 크기의 평균 입자를 가질 수 있고, 상세하게는 10 내지 200㎛, 바람직하게는 50 내지 100㎛의 평균 입자를 갖는 마이크로젤일 수 있다. 본 발명의 일 실험예에 따르면, 상기 마이크로젤은 방사선 치료를 위해 인체 내 주입될 수 있다.
본 발명은 방사선 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 방사선 치료용 약학 조성물은 상기 광가교성 하이드로젤을 유효성분으로 함유할 수 있다.
본 발명에 있어서, "치료"는 암 등과 같은 질환 또는 질병이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위라면 제한없이 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물에 있어서, 상기 방사선 치료의 대상이 되는 질환의 종류는 특별히 제한하지 않으나, 예를 들면, 갑상선암, 유방암, 담도암, 담낭암, 췌장암, 대장암, 자궁암, 식도암, 위암, 뇌암, 직장암, 폐암, 방광암, 신장암, 난소암, 전립선암, 자궁암, 두경부암, 피부암, 혈액암 및 간암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 암일 수 있고, 바람직하게는 유방암, 자궁암, 전립선암 또는 피부암일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입 기술을 포함하는 비경구 투여로 투여될 수 있고, 바람직하게는 주사제 제형으로 투여될 수 있다.
상기 비경구 투여를 위한 약학 조성물은 멸균 수성 또는 비수성 액제, 분산제, 현탁제, 또는 유제 뿐만 아니라 멸균 액제 또는 현탁제로 사용하기 직전에 재조제하는 멸균 산제가 있다. 적합한 멸균 수성 및 비수성 담체, 희석제, 용매 또는 비히클의 예로는 물, 생리식염수, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 혼합물, 식물성 오일(예를 들어, 올리브 오일), 주사가능한 유기 에스터(예를 들어, 에틸올레이트)가 있다. 예를 들어, 분산제 및 현탁제의 경우에는 레시틴과 같은 피복재를 사용하여 적절한 특정 크기를 유지하며, 계면활성제를 사용하여 적절한 유동성을 유지할 수 있다.
또한, 비경구 조성물은 방부제, 습화제, 유화제 및 분산제와 같은 보조제를 함유할 수 있다. 주사용 제형의 멸균은 예를 들어, 멸균 필터를 통하여 여과시키거나, 혼합하기 전, 제조시 또는 투여 직전(이중 용기 주사기 패키지의 경우에서와 같이)에 혼합물의 성분을 미리 멸균하여 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 질병의 치료를 위하여 단독으로 고형암 주변에 주입되거나 또는 수술 후 잔존 또는 산재된 암을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 뿐만 아니라, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명은 방사선 진단 이미징용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 방사선 진단 이미징용 조성물은 상기 광가교성 하이드로젤을 유효성분으로 함유할 수 있다. 상기 방사선 진단 이미지는 질환 또는 질병의 진단을 위해 방사선이 피사체를 통과하거나 내부에 주입되어 생성된 방사선 이미지 데이터를 의미한다. 상기 이미지 데이터를 통해 질병 유무, 암의 크기, 위치 등을 파악할 수 있다.
또한, 본 발명은 항암 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 항암 치료용 약학 조성물은 상기 광가교성 하이드로젤 및 항암제를 포함할 수 있다. 상기 항암제는 탁산 또는 그의 유도체, 예를 들어, 도세탁셀(docetaxel), 카바지탁셀(cabazitaxel), 파클리탁셀(paclitaxel)일 수 있고, 그 외에도 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 시스플라틴(cisplain), 액티노마이신-D(actinomycin-D), 5-플로오우라실(5-fluouracil), 사이클로포스파마이드(Cyclophosphamide), 프로카바진(Procarbazine), 리툭시맵(Rituximab), 이마티닙(Imatinib), 게피티닙(Gefitinib), 엘로티닙(Erlotinib), 이들의 약학적으로 허용가능한 염 및 수화물로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 하이드로젤의 방사성 동위원소와 상기 항암제를 병용하여 항암 치료에 이용함으로써, 보다 효과적으로 치료할 수 있다.
본 발명은 방사선 치료용 광가교성 마이크로 하이드로젤 제조 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 마이크로 하이드로젤 제조 방법은 상기 화합물과 같은 광가교성 화합물을 제조하는 단계; 상기 제조된 광가교성 화합물을 광개시제 용액에 용해시킨 후 미세유체 디바이스의 인렛(inlet)에 주입하는 단계; 상기 미세유체 디바이스의 아웃렛(outlet)에 계면활성제를 함유한 오일을 주입하는 단계; 원심분리를 이용하여 마이크로드롭렛(microdroplets)을 형성하는 단계; 및 상기 형성된 마이크로드롭렛을 추출하여 광가교시킨 후 세척하여 마이크로젤을 형성하는 단계;를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 제조 방법에 있어서, 상기 광가교성 화합물 제조 단계는 히알루론산(hyaluronic acid), 이의 염 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 생분해성 고분자 및 메타크릴레이트를 반응시키는 단계; 상기 반응시킨 반응물에 하나 이상의 방사성 동위원소를 표지할 수 있는 이미다졸(imidazole), 피롤(pyrrole), 퓨란(furan), 티오펜(thiophene), 인돌(indole) 및 3,4-디하이록시페닐(3,4-dihydroxyphenyl)로 이루어진 군에서 선택된 하나의 화합물을 접합시키는 단계; 및 상기 접합된 화합물에 방사성 동위원소를 표지하는 단계;를 포함할 수 있다.
상기 히알루론산(HA)은 연조직의 세포 외 기질에서 발견되는 선형 폴리사카 라이드로, 우수한 생체 적합성 및 생분해성을 가지는 생체 고분자이다. 상기 "생분해성"은 pH가 6 내지 8인 생리적 용액(physiological solution)에 노출되었을 때 분해될 수 있는 성질을 의미하며, 바람직하게는 인간을 포함한 포유동물의 생체 내에서 체액 또는 미생물 등에 의해서 분해될 수 있는 성질을 의미한다.
상기 히알루론산의 염은 히알루론산 나트륨, 히알루론산 칼륨, 히알루론산 칼슘, 히알루론산 마그네슘, 히알루론산 아연, 히알루론산 코발트 등의 무기염과, 히알루론산 테트라부틸암모늄 등의 유기염이 모두 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서는, 히알루론산 자체, 또는 이의 염을 단독으로, 또는 히알루론산 및 이의 염을 2종 이상 조합하여 사용할 수 있다.
상기 생분해성 고분자는 상기 히알루론산 외에도 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(비닐 알콜) 등 같은 합성고분자; 헤파란 설페이트(heparan sulfate), 콘드로틴 설페이트(chondrotin sulfate), 키토산, 알지네이트 같은 다당류 또는 탄수화물; 젤라틴, 콜라겐, 알부민 등과 같은 천연단백질을 구성 요소로 포함할 수 있다.
상기 메타크릴레이트는 광가교제로, 상기 히알루론산과 반응하여 광가교성의 하이드로젤을 수득할 수 있다. 상기 "광가교제"는 광조사에 의해서 라디칼이 형성됨으로써 반응계 내에서 라디칼 반응을 유발할 수 있는 화합물을 의미하고, 통상적으로 광가교제 또는 광개시제로 사용되는 화합물은 본 발명의 광가교제로 사용될 수 있으나, 다만, 생체 내 독성이 없거나 미약한 광가교제 또는 광개시제를 사용하는 것이 보다 바람직하다.
상기 광가교 기술은 전구체 용액의 현장에서의 가교결합을 가능하게 하고, 화학적 가교결합 기술보다 가교 밀도에 대한 더 나은 공간 및 시간 제어를 제공한다. 자외선 또는 가시광을 사용하는 광가교 결합 방법은 넓은 범위의 기계적 성질 및 분해성을 갖는 하이드로젤을 제조할 수 있다.
상기 고분자 및 메타크릴레이트를 반응시키는 단계는, 0 내지 10℃, 바람직하게는 3 내지 7℃로 냉각시킨 상기 생분해성 고분자 용액에 상기 메타크릴레이트를 30분 내지 2시간, 바람직하게는 1시간 내지 1시간 30분에 걸쳐 적가하고, pH 7 내지 11, 바람직하게는 pH 8 내지 10의 범위로 20 내지 30 시간 동안 유지시켜 수행될 수 있고, 이에 따라 메타크릴레이티드된 히알루론산(이하, HAMA)이 형성될 수 있다. 상기 단계의 방법에 따라 형성된 HAMA는 100% 이상의 메타크릴화도(degree of methacrylation; DM), 즉 높은 메타크릴레이트기 치환 정도를 가질 수 있고, 상기 메타크릴화도가 높을수록 기계적 물성, 강도 또한 향상될 수 있다. 상기 기계적 물성이 향상된 HAMA는 생체 내에서 생분해가 천천히 일어나, 적절한 시간동안 방사선 치료가 이루어질 수 있다.
다음, 상기 접합 단계는 상기 형성된 HAMA에 하나 이상의 방사성 동위원소를 표지할 수 있는 이미다졸(imidazole), 피롤(pyrrole), 퓨란(furan), 티오펜(thiophene), 인돌(indole) 및 3,4-디하이록시페닐(3,4-dihydroxyphenyl)로 이루어진 군에서 선택된 하나의 화합물을 접합시킬 수 있다. 보다 상세하게는, N-(3-아미노프로필)-이미다졸(N-(3-Aminopropyl)-imidazole; API), 3-(1H-피롤-1-일)-1-프로판아민(3-(1H-pyrrol-1-yl)-1-propanamine), 1-(3-푸릴)메탄아민(1-(3-Furyl)methanamine), 테닐메틸아민(thienylmethylamine), 트립타민(tryptamine), 도파(3,4-dihydroxyphenylalanine; DOPA) 및 이의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 고리 화합물이 접합될 수 있다.
상기 방사성 동위원소 표지 단계는 상기 접합된 화합물에 방사성 동위원소, 예를 들어, 131I, 125I, 124I, 123I, 18F, 19F, 177Lu 및 211At로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 표지하여 방사성 동위원소가 표지된 광가교성 화합물을 형성할 수 있다.
본 발명에 따른 제조 방법에 있어서, 상기 광가교성 화합물은 상기 광개시제 용액 중 1 내지 20 중량% 함유될 수 있고, 상기 원심분리는 1000 내지 2000 RPM, 바람직하게는 1400 내지 1600RPM에서 수행될 수 있다. 이에 따라 방사선 치료에 적절한 양의 마이크로 하이드로젤을 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 제조 방법에 있어서, 상기 마이크로젤은 젤(gel) 타입의 주사 제형으로 제조될 수 있고, 체내에 주입되어 1 내지 3주 동안 주입 부위에 머무를 수 있다. 또한, 상기 제조 방법은 현장에서 10 내지 60분 이내, 바람직하게는 10 내지 30분 이내에 상기 마이크로젤을 제조하여 즉시 사용될 수 있어, 방사선 치료가 필요할 때 적절하게 제조하여 사용될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<준비예 1>
메타크릴 무수물(Methacrylic anhydride), 소듐 하이드록사이드(sodium hydroxide), N-(3-아미노프로필)-이미다졸(N-(3-Aminopropyl)-imidazole; API), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide; EDC), N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide; NHS), 클로라민 T(chloramine T), 소듐 메타바이설파이트(sodium metabisulfite), 소듐 아이오디드(sodium iodide), 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide; DMSO), 아세트알데하이드(acetaldehyde), 사이클로헥실 이소시아니드(cyclohexyl isocyanide), 플루오레세인-아민(fluorescein-amine)은 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich, St. Louis MO, USA)에서 구매하였다. 폴리디메틸실록산(Polydimethylsiloxane; PDMS, Sylgard 184)는 다우코닝(Dow Corning)에서 구매하였다. Pico-surf(TM) 2 wt% in NovecTM 7500은 스피어 플루이딕스(Sphere Fluidics, Cambridge, UK)에서 구매하였다. Novec 7500 oil은 3M(St Paul, MN)에서 구매하였다. 분자량 90KDa의 히알루론산(hyaluronic acid; HA)은 바이오랜드(Bioland, SK, Korea)에서 구매하였다.
<실시예 1> 131 I-표지된 메타크릴레이티드 히알루론산(HAMA)의 제조
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 131I-표지된 광가교성 메타크릴레이티트 히알루론산(HAMA)의 합성과정을 나타낸 도식화한 것이다.
도 1을 참조하면, 메타크릴레이티트 히알루론산(Methacrylated hyaluronic acid; 이하, HAMA)은 히알루론산(hyaluronic acid; HA)의 1차 하이드록시기의 에스터화(esterification) 반응을 통해 제조되었다. 25℃에서 탈 이온수 50mL에 히알루론산 240mg을 녹였다. 이 용액을 4℃에서 1M NaOH를 이용하여 pH 9로 제조한 뒤, 메타크릴무수물(methacrylic anhydride) 420mg을 넣고, 24시간 동안 교반하였다. 완료된 합성물을 8시간 마다 물을 교환하면서 96시간 동안 탈 이온수에서 투석하였다. 투석된 생성물을 동결 건조하여 HAMA를 얻었다.
HAMA-API는 HAMA의 카르복시기와 N-(3-아미노프로필)-이미다졸(N-(3-Aminopropyl)-imidazole; 이하, API)의 아민기의 아미드화(amidation) 반응을 통해 히알루론산에 API가 접합(conjugate)되었다. HAMA 240mg을 25℃에서 40mL PBS(phosphate buffered saline, pH 7.4)에 4시간 동안 녹였다. 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide; 이하, EDC) 230mg, 1.2mmol과 N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide; 이하, NHS) 276mg, 2.4mmol을 넣고 30분 동안 카르복시기를 활성화시키기 위해 교반하였다. 이 화합물에 PBS 10mL에 녹인 API(150mg, 1.2 mmol)를 한 방울씩 첨가하고, 12시간 동안 반응을 수행하였다. 완료된 합성물은 PBS에서 투석되었고, 동결 건조하여 HAMA-API를 얻었다.
HAMA-API의 이미다졸 고리(imidazole ring)에 요오드(iodine)를 치환하기 위해 클로라민 T(chloramine T) 방법을 사용하였다. 2mL 원심분리용 튜브에 HAMA-API 24mg을 넣어 PBS 500㎕에 녹이고, NaI(Na131I) 100㎕를 넣고 10분 동안 두었다. PBS에 녹인 클로라민 T 용액 10㎕(5mg/mL)를 넣고 10분간 볼텍싱하였다. 반응을 종결하기 위해 PBS에 녹인 소듐 바이설파이트(sodium bisulfite) 용액 10㎕(10mg/mL)를 넣었다. 잔여물을 제거하기 위해 에탄올 1mL를 반응물에 넣고 20분간 5000RPM에서 원심분리하였다. 상등액은 제거한 후 요오드가 표지된 HAMA를 얻었다.
히알루론산 기반 콘쥬게이트는 1H-NMR(600MHz Agilent NMR System, Palo Alto, USA)을 통해 화학적 특성을 분석하였다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 히알루론산 기반 콘쥬게이트의 1H NMR 스펙트럼 및 화학적 구조를 나타낸다. 도 2를 참조하면, 메타크릴레이트 기(Methacrylate group)는 5.5 - 6.5 ppm, API 기는 7.0 - 8.5 ppm 범위에서 선명하게 관찰되었다. 그리고 아이오딘화 된 I-HAMA는 이미다졸 고리의 5번 탄소가 요오드 치환으로 인해 강도(intensity)가 줄어든 것으로 분석하였다.
<실시예 2> 광가교성 HAMA 마이크로젤의 제작
동위원소로 표지된 고분자의 방사능(radioactivity) 저하를 최소화하기 위해서는 현장에서 빠르게 마이크로젤(microgels)을 만들어야 한다. 이를 위해, 131I-표지된 광가교성 히알루론산을 휴대용 원심 미세 유체 시스템(Portable Centrifugal Microfluidic System)을 통해 유중수형(water-in-oil; W/O) 에멀젼으로 HAMA 마이크로젤을 제작하였다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로젤 제작 중 마이크로드롭렛 형성의 개략도이다.
도 3을 참조하면, 먼저 조절된 양의 HAMA를 200㎕의 1 중량% 이르가큐어(irgacure) 2959(수용성 광개시제) 용액에 녹인 후 미세유체 장치의 인렛(inlet)에 주입하였다. 이 장치의 아웃렛(outlet)에는 2 중량% pico-surf를 녹인 노벡 오일(novec oil)을 50㎕ 주입하였다. 용액이 채워진 장치를 휴대용 원심 분리기(Micro-12, Hanil, Korea)에 아웃렛이 중심을 향하도록 결합하고, 3분간 RPM을 조절하여 마이크로드롭렛(microdroplets)을 형성시켰다. 아웃렛 방향으로 가해지는 원심력과 아웃렛 내부의 노즐의 모세혈관 현상에 의해 드롭렛(droplets)이 형성되었다.
아웃렛에 형성된 마이크로젤을 파이펫으로 추출 후, 마이크로튜브(microtube)에 옮기고 UV 광(350-500nm, OhmiCure S1500, Exclitas, USA)을 통해 마이크로드롭렛을 형성하는 HAMA의 가교를 완료했다. 가교된 마이크로젤의 오일(oil)을 제거하기 위해 미니 셀 스트레이너(mini cell strainer, pore size: 40㎛, Bio-Rev, Japan)에 넣고 에탄올로 1000 RPM에서 3분간 원심 분리를 반복하여 오일 및 광가교제를 씻었다. 이어서, 세척된 HAMA 마이크로젤을 PBS에 분산시켰다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로젤 형성 용액의 HAMA 농도에 따른 점도 변화를 측정한 것이다. 도 4를 참조하면, HAMA 용액의 농도가 높아질수록 마이크로젤 형성 용액의 점도도 높아졌고, 그에 따른 점도는 7 cP부터 135 cP까지로 측정되었다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 원심분리기의 분당 회전수(RPM)에 따른 HAMA 마이크로드롭렛의 크기를 나타낸다. 도 5를 참조하면, HAMA 용액의 농도와 RPM에 따른 HAMA 마이크로드롭렛의 크기는 70-90㎛로 크기의 변화는 뚜렷하게 나타나지 않았으며 생성된 드롭렛의 크기는 RPM과 무관하다는 결과를 얻었다. 하지만, 같은 농도에서 RPM이 변화되면 생성되는 HAMA 마이크로드롭렛 양의 차이가 발생하기에, 현장에서 원하는 양의 HAMA 마이크로젤을 제작하기 위해서는 1500 RPM 조건에서 3 내지 6 중량%의 HAMA를 적용하는 것이 적합하다고 사료된다.
<실시예 3> 131 I-HAMA 마이크로젤의 현장에서의 제작
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 131I-HAMA 마이크로젤의 현장에서의 제작 과정이다. 도 6을 참조하면, 상기 실시예 2에 따른 마이크로젤 제작 방법에 따라 131I이 표지된 HAMA 분말을 PBS 용액에 분산시켜 131I-HAMA 마이크로젤을 제작하는데 15분이 소요되며, 현장에서 방사성 동위원소가 표지된 마이크로 하이드로젤을 제작할 수 있는 장점을 가진다.
<실험예 1> 생체외(In Vitro) 131 I 방출 실험
상온에서 6 웰(well)에 셀 스트레이너(pore size: 70㎕, SPL)를 넣고, 셀 스트레이너 위에 0.3mCi의 131I-HAMA 마이크로젤을 캐스팅하였다. 131I-HAMA 마이크로젤이 채워진 웰에 5mL의 PBS(pH 7.4)를 채워 넣고 시간에 따라 셀 스트레이너에 남아있는 131I-HAMA 마이크로젤의 방사선 세기를 CRC015R 도즈 캘리브레이터(dose calibrator, Capintec Inc., Ramsey, USA)로 측정하였다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 131I-HAMA 마이크로젤 내의 방사선 세기를 정량화한 것이다.
도 7을 참조하면, 시간에 따른 131I-HAMA 마이크로젤 내에 머무르는 131I의 세기를 나타낸 것으로, 초기 1시간 동안은 미표지된 131I이나 가교 반응에 참여하지 못한 131I-HAMA 마이크로젤 내 131I-HAMA의 방출로 방사선의 세기가 35% 감소된 것으로 관찰되었지만, 그 이후에는 이론적인 방사성 붕괴(theoretical radioactive decay)인 131I의 반감기(half-life of 131I = 8.02 day)와 비슷한 감소 경향을 보였다. 삽입된 그림의 눈금은 20㎛를 나타낸다.
즉, 제조된 100㎛ 정도의 크기를 갖는 방사성 마이크로젤은 주사기를 통해 손쉽게 원하는 부위에 주입될 수 있고, 정량의 방사선 치료(radiotherapy)를 달성할 수 있다. 게다가, 마이크로젤의 분해 및 용해 속도는 가교도에 따라 달라질 수 있기 때문에 원하는 기간동안 방사선 치료가 가능하고 이를 통해 투여 용량(dose)을 최소화하면서 국소부위에 방사선 치료를 극대화할 수 있고 이는 조직 손상의 최소화를 기대할 수 있다.
<실험예 2> 광 가교성 HAMA 마이크로젤의 생체 내(In Vivo) 생분해성 실험
수컷 레트(rat, 12-13주령)는 샘타코(SamTacho, Osan, Republic of Korea)에서 구매하였다. 모든 레트들은 부산대학교 동물 자원 센터(Animal Resources Center, Busan, Korea)에서 관리되었다.
생체 내에서 HAMA 마이크로젤의 안정성을 평가하기 위해 형광물질이 결합된 HAMA를 제조하였다. HAMA 200mg을 25℃에서 초순수물(DI water) 160mL와 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide; DMSO) 70mL 용액에 녹였다. 이 혼합물에 플루오레세인-아민(fluorescein-amine), 아세트알데하이드(acetaldehyde), 사이클로헥실 이소시아니드(cyclohexyl isocyanide) 100㎕를 넣어 아미드화 반응을 24시간 진행하였다.
도 8은 본 발명의 일 실험예에 따라 제조된 형광물질이 결합한 HAMA이다.
도 8을 참조하면, HAMA의 카르복실기와 플루오레세인-아민의 아미드화 반응을 통해 컨쥬게이션 되었다. 최종 혼합물을 100mM NaCl 용액에서 48시간 동안 투석하고, 동결 건조한 뒤, 미세 유체 시스템을 통해 플루오레세인 이소티오시아네이트(Fluorescein isothiocyanate; 이하, FITC)가 콘쥬게이트된 HAMA 마이크로젤을 제작하였다.
도 9는 본 발명의 일 실험예에 따라 제조된 마이크로젤의 형상이다.
도 9를 참조하면, 형광현미경을 통해 안정적으로 콘쥬게이트된 FITC-HAMA 마이크로젤의 형상을 확인할 수 있었다.
도 10은 본 발명의 일 실험예에 따른 FITC-HAMA 마이크로젤을 레트에 주사한 부위이다. 도 10을 참조하면, FITC-HAMA의 생체 분포를 평가하기 위해 움직임이 활발한 레트의 대퇴부 근육 안으로 PBS(pH 7.4)에 분산된 용액을 0.2mL를 주입하였다.
도 11은 도 10에 따른 실험의 결과이다.
도 11을 참조하면, FITC-HAMA 마이크로젤을 주입한지 1, 168시간이 지난 후 레트의 대퇴부 근육을 적출하고, 0.1cm 두께로 자른 조직을 형광현미경(Eclipse TS100, Nikon, Japan)을 통해 분석하였다. FITC-HAMA 마이크로젤은 레트 대퇴 근육 내로 안정적으로 주입되어 주입 부위의 근육 조직에 박혀 있는 형태로 관찰되었고 고분자 분해 또는 머무름에 따른 조직에서의 염증은 관찰되지 않았다.
<실험예 3> 131 I-HAMA 마이크로젤의 생체 내(In Vivo) 국소적 머무름(retention) 실험
131I-HAMA 마이크로젤이 생체 내에 주입된 부위에서 얼마나 유지되고 131I의 분포를 확인하기 위해 실험을 진행하였다. PBS에 분산된 Na131I과 131I-HAMA 마이크로젤(1mCi/mL) 용액을 레트의 대퇴부 근육안에 0.2mL를 주입한 후, SPECT 이미징 시스템(Infinia Hawkeye 4, GE Healthcare, USA)으로 시간에 따라 감마 이미지를 얻었다. 주입한 직후부터 30분 이내에는 동적 모드(dynamic mode)로 주입 부분에서의 방사능(radioactivity)을 초당 카운터로 측정하였다. 30분 이후부터는 정적 모드(static mode)로 시간에 따라 131I가 주입된 레트 전체의 이미지를 얻었고, 주입 부위, 갑상선, 위와 같은 주요 조직의 감마 카운터를 측정하였다.
도 12는 본 발명의 일 실험예에 따른 레트의 SPECT 이미지이다.
도 12를 참조하면, a는 Na131I 용액, b는 131I-HAMA 마이크로젤 용액을 주입한 것으로, 200 μCi의 방사성을 갖는 131I 용액을 근육질 안으로 주입한 레트는 30분만에 몸 전체로 흘러갔고, 131I-HAMA 마이크로젤 용액을 주입한 레트는 168 h이 지나도 주입 부위에 국소적으로 머무름을 확인할 수 있었다.(T: 갑상선, S: 위, B: 방광)
도 13은 본 발명의 일 실험예에 따른 131I의 흐름을 나타낸다.
도 13을 참조하면, 주입 부위에서의 131I의 흐름을 동적 영상을 통해 분석한 결과, 131I 용액의 체내에서의 퍼지는 속도가 131I-HAMA 마이크로젤보다 더 빠른 것으로 나타났다.
도 14는 본 발명의 일 실험예에 따른 131I 용액의 다른 조직으로의 이동을 측정한 것이고, 도 15는 본 발명의 일 실험예에 따른 131I-HAMA 마이크로젤 용액의 다른 조직으로의 이동을 측정한 것이다. 도 14 및 도 15를 참조하면, 131I 용액은 주입 부위 외에 갑상선, 위 그리고 방광에서도 측정되었지만, 131I-HAMA 마이크로젤 용액은 다른 부위에서 거의 발견되지 않았다. 또한, 131I 용액에서는 방사선 세기가 급격하게 감소했으나, 131I-HAMA 마이크로젤 용액에서는 하이드로젤의 분해와 함께 서서히 감소되었다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로젤의 활용예를 보여주는 개략도이다. 도 16을 참조하면, 131I로 표지된 광가교 결합성 히알루론산(HA)으로 제조 된 방사성 마이크로젤은 주사 부위에 국한될 수 있고, 주입 후 근육 조직에 붙어 방사성 핵종의 표적 부위로의 체류 시간은 증가하지만 체액에서의 빠른 흡수는 최소화할 수 있다. 이러한 기술을 적용하면, 기존 방사성 핵종을 주기적으로 환자에게 주사하는 방사선 치료법을 개선할 수 있으며, 아울러 낮은 독성을 갖는 새로운 주사가능한 방사능 핵종 제재의 전달제로의 잠재력을 보유한다.
<실시예 4> 메타크릴레이트 치환이 향상된 히알루론산 제조
약 1.0g 히알루론산(HA, Mw: 90 kDa; SNvia, Korea)을 12mL 증류수에 용해시켰고, 1N 소듐 하이드록사이드(sodium hydroxide)를 이용하여 pH를 8까지 조정하였다. 히알루론산 용액은 5℃까지 냉각시킨 후, 히알루론산의 이당 단위에 대해 1배 또는 4배 당량의 메타크릴 무수물(MA)을 1시간에 걸쳐 적가하였다. 동시에, 1N 소듐 하이드록사이드를 첨가하여 pH를 8.0에서 10.0 사이로 유지시켰다. 온도와 pH는 23시간 더 유지시킨 후, 메크로머(macromer) 용액을 3일 동안 증류수로 투석(Cellu Sep, nominal molecular weight cutoff 3500 Da)하였고 -55℃에서 냉동하여 동결 건조시키고, 사용하기 전까지 -20℃에서 보관하였다. 1H NMR 스펙트럼은 Bruker 600-NMR 분광기(spectrometer)를 이용하여 획득하였다. 이것은 메타크릴레이트 기(methacrylate group)의 히알루론산으로의 결합을 확인하고, 메타크릴화도(degree of methacrylation, 이하, DM)를 계산하는데 이용되었다.(n=3)
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 HAMA의 제조 과정이다.
광가교성 메타크릴레이트 기는 일반적으로 수성 염기성 조건하에서 메타크릴 무수물과 반응시켜 히알루론산 중합체 주쇄(backbone)에 혼입된다. 히알루론산의 1차 히드록실기(hydroxyl group)는 에스테르 교환 반응에 가장 반응성이 있는 부위로 여겨진다. 히알루론산는 이당류 단위당 4개의 히드록실기를 가지며, 4개의 히드록실기 모두는 메타크릴레이트 기와 혼입될 수 있다.
히알루론산의 분자량, 히알루론산에 대한 메타크릴 무수물의 몰비 및 반응 시간을 변화시킴으로써, 상이한 DM을 갖는 HAMA가 합성될 수 있다. 반응 혼합물의 pH 및 온도와 같이 DM을 결정하는 다른 매개 변수도 있다. 메타크릴 무수물은 수성 매질에서 가수 분해되는데, 특히 pH 10.0 이상에서 수산화 이온에 의해 촉매화되어 메타크릴산을 형성하고 히알루론산과 더 반응하지 않는다. 저온에서 메타크릴 무수물의 메타크릴산으로의 가수분해는 더 느린 것으로로 간주된다. 그러나 이 온도에서 메타크릴 무수물은 별도의 단계로 존재한다.
도 17을 참조하면, 생물학적 활성과 보다 우수한 용액 가공성을 고려할 때, 90 kDa 히알루론산이 선택되었다. 상이한 DM으로 HAMA를 합성하기 위해, 이당류 단위에 대하여 메타크릴 무수물의 1배 및 4배 당량을 히알루론산과 반응시켰다. 또한, 메타크릴 무수물의 과도한 가수 분해를 최소화하고 반응 중 상분리를 감소시키기 위해, 격렬하게 교반하면서 1시간에 걸쳐 적가하였다. 동시에, pH는 5℃에서 24시간 동안 8.0 내지 10.0으로 유지되었다.
도 18은 도 17에 따라 제조된 HAMA의 1H NMR 스펙트럼이다. 1H NMR 실험은 메타크릴레이트 기를 히알루론산에 혼입시켜 DM을 결정하는데 사용되었다.
도 18을 참조하면, 1H NMR 스펙트럼은 아크릴레이트 양성자에 상응하는 δ 5.6 및 6.0 ppm 부근에 새로운 피크를 나타내어 메타크릴레이트 기가 히알루론산에 혼입되었음을 보여주었다. DM은 메타크릴레이트 양성자(5.6 및 6.0 ppm)와 히알루론산의 메틸 양성자(1.9 ppm)의 상대적인 통합으로부터 계산되었고, 이는 메타크릴 무수물의 1 및 4 당량에 대해 이당 당 46±4% 및 181±36%의 값을 나타내었다.
히알루론산 및 그의 유도체의 분자량은 겔 투과 크로마토그래피 시스템으로 추정되었다. 이들은 유사한 중합체 분자량 분포를 보여주었고, 반응 중에 조기의 가교 결합 또는 사슬 분열을 나타내지 않았다. 100% 이상의 메타크릴화는 4 당량의 메타크릴 무수물이 사용되었을 때 하나 이상의 히드록실기가 치환되었음을 시사한다.
즉, 상기 실시예 4에 따라 1 시간에 걸쳐 메타크릴 무수물을 천천히 첨가함으로써 메타크릴 무수물의 과도한 가수 분해를 최소화하였고, 5℃에서 24 시간 동안 pH 8.0과 10.0 사이에서 격렬히 교반하고 유지시켜, 4배 초과된 메타크릴 무수물로 100% 이상의 높은 DM을 얻었다.
<실험예 4> 메타크릴레이트 치환 향상된 HAMA 하이드로젤의 기계적 물성
간략하게, 5%(w/v), 10%(w/v) 및 20%(w/v)의 상이한 농도의 고분자 전구체 용액을 광가교 결합시켜 너비는 5mm, 길이는 20mm, 두께는 1.5mm의 인장 시험 구조로 제조하였다.
하이드로젤은 기계적 테스터(AND 210, Korea)에서 직접 분석하였다. 변형 속도(strain rate)는 인장 시험을 위해 1 mm min-1로 설정되었다. 샘플의 극한 인장 강도(ultimate tensile strengths)는 하이드로젤의 파단점(인장 파단)에서 결정되었다. 인장 강도(tensile strength)는 응력-변형률 곡선에서 응력의 최대 점에서 결정되었다.
영률(Young’s modulus; 인장 탄성률)은 변형률-응력 곡선에서 기울기의 초기 5%를 구하여 계산하였다. 탄성(elasticity)은 응력 변형률 곡선의 변형률의 최대 점에서 결정되었다.
도 19는 본 발명의 일 실험예에 따른 하이드로젤의 기계적 물성을 나타낸 그래프이다. 도 19를 참조하면, (A)는 낮은 DM 및 높은 DM에서 HAMA 용액(n = 5)의 다양한 농도(5%, 10%, 20%[w/v])로부터 생성된 HAMA 하이드로젤의 응력 - 변형 곡선이고, (B)는 상기 하이드로젤의 인장 강도 그래프, (C)는 상기 하이드로젤의 영률 그래프, 및 (D)는 상기 하이드로젤의 연신율(elongation) 그래프를 나타낸다.(별표는 p <0.05 (*), p <0.01 (**) 및 p <0.001 (***)의 통계적 유의 수준을 나타낸다.)
상기 (A)의 응력-변형 곡선은 높은 DM의 HAMA 용액의 농도가 높을수록 곡선의 기울기도 큰 것으로 나타났다.
상기 (B)의 인장 강도는 HAMA 용액의 농도가 5%에서 20%로 증가함에 따라, 낮은 DM은 3.31±0.61에서 21.22±6.48 kPa로, 높은 DM은 8.83±2.99에서 44.24±7.09 kPa로 일정하게 증가하는 것으로 나타났다.
상기 (C)의 영률 또한 DM 및 농도가 높을수록 증가하는 것으로 나타났다.
상기 (D)의 연신율은 DM 및 농도에 따라 6 내지 17% 범위에서 다양하게 나타났다.
<제조예 1> HAMA-DOPA-I
[반응식 1]
[규칙 제91조에 의한 정정 10.02.2020]　
Figure WO-DOC-FIGURE-196
반응식 1은 HAMA-DOPA-I의 제조과정을 나타낸다. 상기 실시예 4에 따라 메타크릴레이트 치환이 향상된 HAMA를 제조한 후, 100mg의 HAMA를 10mL PBS(pH 7.4) 용액에 용해시켰다. 1N HCl을 사용하여 pH를 5.5로 조정한 후, 상기 실시예 1의 HAMA-API의 제조 방법과 동일한 방법으로, EDC 85.5mg과 NHS 102.7mg을 용액에 첨가하고 30분간 교반하였다. 이 후 상기 API 대신 상기 반응식 1에 따라, 126.9mg의 도파민 염산염을 첨가하고 1N NaOH를 사용하여 반응 혼합물의 pH를 7로 조정한 뒤, 25℃에서 24시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 pH 5.0 용액에서 2일 동안 투석(Cellu Sep, nominal molecular weight cutoff 3500 Da)하고, 이어서 1일 동안 증류수로 투석하였다. 얻어진 용액을 동결 건조하여 생성물을 얻었으며, 생성된 HAMA-DOPA 용액을 제조한 후, 131I를 표지하였다. 상기 실시예 1에 따른 HAMA-API보다 131I 치환이 더 많이 될 수 있어, 방사선 치료효과도 더 높을 것으로 예상되었다.
<제조예 2> HAMA-pyrrol-I
[반응식 2]
[규칙 제91조에 의한 정정 10.02.2020]　
Figure WO-DOC-FIGURE-201
반응식 2는 HAMA-pyrrol-I의 제조과정을 나타낸다. 상기 실시예 4에 따라 메타크릴레이트 치환이 향상된 HAMA를 제조한 후, 100mg의 HAMA를 10mL PBS(pH 7.4) 용액에 용해시켰다. 1N HCl을 사용하여 pH를 5.5로 조정한 후, 상기 실시예 1의 HAMA-API의 제조 방법과 동일한 방법으로, EDC 85.5mg과 NHS 102.7mg을 용액에 첨가하고 30분간 교반하였다. 이 후 상기 API 대신 상기 반응식 2에 따라, 110.7mg의 3-(1H-피롤-1-일)-1-프로판아민(3-(1H-pyrrol-1-yl)-1-propanamine)을 첨가하여 25℃에서 24시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 pH 5.0 용액에서 2일 동안 투석하고, 이어서 1일 동안 증류수로 투석하였다. 얻어진 용액을 동결 건조하여 생성물을 얻었으며, 생성된 HAMA-pyrrol 용액을 제조한 후, 131I를 표지하였다.
<제조예 3> HAMA-furan-I
[반응식 3]
[규칙 제91조에 의한 정정 10.02.2020]　
Figure WO-DOC-FIGURE-206
반응식 3은 HAMA-furan-I의 제조과정을 나타낸다. 상기 실시예 4에 따라 메타크릴레이트 치환이 향상된 HAMA를 제조한 후, 100mg의 HAMA를 10mL PBS(pH 7.4) 용액에 용해시켰다. 1N HCl을 사용하여 pH를 5.5로 조정한 후, 상기 실시예 1의 HAMA-API의 제조 방법과 동일한 방법으로, EDC 85.5mg과 NHS 102.7mg을 용액에 첨가하고 30분간 교반하였다. 이 후 상기 API 대신 상기 반응식 3에 따라, 119.2mg의 3-(아미노메틸)푸란 하이드로클로라이드(3-(aminomethyl)furan hydrochloride)를 첨가하여 25℃에서 24시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 pH 5.0 용액에서 2일 동안 투석하고, 이어서 1일 동안 증류수로 투석하였다. 얻어진 용액을 동결 건조하여 생성물을 얻었으며, 생성된 HAMA-furan 용액을 제조한 후, 131I를 표지하였다.
<제조예 4> HAMA-thiophene-I
[반응식 4]
[규칙 제91조에 의한 정정 10.02.2020]　
Figure WO-DOC-FIGURE-211
반응식 4는 HAMA-thiophene-I의 제조과정을 나타낸다. 상기 실시예 4에 따라 메타크릴레이트 치환이 향상된 HAMA를 제조한 후, 100mg의 HAMA를 10mL PBS(pH 7.4) 용액에 용해시켰다. 1N HCl을 사용하여 pH를 5.5로 조정한 후, 상기 실시예 1의 HAMA-API의 제조 방법과 동일한 방법으로, EDC 85.5mg과 NHS 102.7mg을 용액에 첨가하고 30분간 교반하였다. 이 후 상기 API 대신 상기 반응식 4에 따라, 100.9mg의 2-티오펜 메틸아민(2-thiophene methylamine)을 첨가하여 25℃에서 24시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 pH 5.0 용액에서 2일 동안 투석하고, 이어서 1일 동안 증류수로 투석하였다. 얻어진 용액을 동결 건조하여 생성물을 얻었으며, 생성된 HAMA-Thiophene 용액을 제조한 후, 131I를 표지하였다.
<제조예 5> HAMA-N-iodoindole(유도체 1)
[반응식 5]
[규칙 제91조에 의한 정정 10.02.2020]　
Figure WO-DOC-FIGURE-216
반응식 5는 HAMA-N-iodoindole의 제조과정을 나타낸다. 상기 실시예 4에 따라 메타크릴레이트 치환이 향상된 HAMA를 제조한 후, 100mg의 HAMA를 20mL 디메틸설폭시드(dimethyl sulfoxide; 이하, DMSO) 용액에 용해시켰다. 그 다음 상기 실시예 1의 HAMA-API의 제조 방법과 동일한 방법으로, EDC 115.1mg과 NHS 138.1mg을 용액에 첨가하고 2시간 동안 교반하였다. 이 후 상기 API 대신 상기 반응식 5에 따라, 77.5mg의 N-에틸디이소프로필아민(N-ethyldiisopropylamine)을 상기 혼합물에 첨가한 다음, 96.1mg의 트립타민(tryptamine)을 첨가하였다. 반응물을 36시간 동안 질소 하에서 교반하였다. 반응 혼합물을 DMSO 용액에서 12시간 동안 투석하고, 이어서 3일 동안 증류수로 투석하였다. 얻어진 용액을 동결 건조하여 생성물을 얻었으며, 생성된 HAMA-indole 용액을 제조한 후, 131I를 표지하여 HAMA-N-iodoindole을 제조하였다.
도 20은 본 발명의 일 제조예에 따라 생성된 HAMA 및 HAMA-N-indole의 UV/vis 스펙트럼이고, 도 21은 본 발명의 일 제조예에 따라 생성된 HAMA-N-indole 및 HAMA-N-iodoindole의 1H NMR 스펙트럼이다.
이제까지 본 발명에 대한 구체적인 실시예들을 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (16)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2019018094-appb-I000010
    상기 화학식 1에서,
    X는 광가교가 가능한 아크릴레이트(acrylate), 메타크릴레이트(methacrylate), 글라이시딜 메타크릴레이트(glycidyl methacrylate) 및 비닐 에스테르(vinyl ester)로 이루어진 군에서 선택되고,
    Y는 OH이거나, 하기 화학식 2일 수 있고,
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2019018094-appb-I000011
    상기 화학식 1 또는 상기 화학식 2에서,
    R1 및 R2는 각각 동일하거나 다를 수 있고, 수소, 하나 이상의 방사성 동위원소를 표지할 수 있는 이미다졸(imidazole), 피롤(pyrrole), 퓨란(furan), 티오펜(thiophene), 인돌(indole) 및 3,4-디하이록시페닐(3,4-dihydroxyphenyl)로 이루어진 군에서 선택되고,
    m1 및 m2는 0 내지 2의 정수이며,
    n은 20 내지 4,000 임.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 방사성 동위원소는,
    131I, 125I, 124I, 123I, 18F, 19F, 177Lu 및 211At로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  3. 제 1 항에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염에 방사성 동위원소가 표지된 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 방사성 동위원소는,
    131I, 125I, 124I, 123I, 18F, 19F, 177Lu 및 211At로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  5. 제 3 항 또는 제 4 항에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 방사선 치료용 광가교성 하이드로젤.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 하이드로젤은,
    10 내지 200㎛의 평균 입자를 갖는 마이크로젤인 것을 특징으로 하는 방사선 치료용 광가교성 하이드로젤.
  7. 제 5 항에 따른 하이드로젤을 유효성분으로 함유하는 방사선 치료용 약학 조성물.
  8. 제 5 항에 따른 하이드로젤을 유효성분으로 함유하는 방사선 진단 이미징용 조성물.
  9. 제 5 항에 따른 하이드로젤 및 항암제를 포함하는 항암 치료용 약학 조성물.
  10. 제 1 항에 따른 광가교성 화합물을 제조하는 단계;
    상기 제조된 광가교성 화합물을 광개시제 용액에 용해시킨 후 미세유체 디바이스의 인렛(inlet)에 주입하는 단계;
    상기 미세유체 디바이스의 아웃렛(outlet)에 계면활성제를 함유한 오일을 주입하는 단계;
    원심분리를 이용하여 마이크로드롭렛(microdroplets)을 형성하는 단계; 및
    상기 형성된 마이크로드롭렛을 추출하여 광가교시킨 후 세척하여 마이크로젤을 형성하는 단계;를 포함하는, 방사선 치료용 광가교성 마이크로 하이드로젤 제조 방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 광가교성 화합물 제조 단계는,
    히알루론산(hyaluronic acid), 이의 염 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 생분해성 고분자 및 메타크릴레이트를 반응시키는 단계;
    상기 반응시킨 반응물에 하나 이상의 방사성 동위원소를 표지할 수 있는 이미다졸(imidazole), 피롤(pyrrole), 퓨란(furan), 티오펜(thiophene), 인돌(indole) 및 3,4-디하이록시페닐(3,4-dihydroxyphenyl)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 화합물을 접합시키는 단계; 및
    상기 접합된 화합물에 방사성 동위원소를 표지하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방사선 치료용 광가교성 마이크로 하이드로젤 제조 방법.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 반응 단계는,
    0 내지 10℃로 냉각시킨 상기 생분해성 고분자 용액에 상기 메타크릴레이트를 30분 내지 2시간에 걸쳐 적가하고, pH 7 내지 11의 범위로 20 내지 30 시간 동안 유지시켜 수행되는 것을 특징으로 하는, 방사선 치료용 광가교성 마이크로 하이드로젤 제조 방법.
  13. 제 10 항에 있어서,
    상기 광가교성 화합물은,
    상기 광개시제 용액 중 1 내지 20 중량%로 함유되는 것을 특징으로 하는, 방사선 치료용 광가교성 마이크로 하이드로젤 제조 방법.
  14. 제 10 항에 있어서,
    상기 제조 방법은,
    현장에서 10 내지 60분 이내에 상기 마이크로젤을 제조하여 즉시 사용되는 것을 특징으로 하는, 방사선 치료용 광가교성 마이크로 하이드로젤 제조 방법.
  15. 제 10 항에 있어서,
    상기 마이크로젤은,
    젤(gel) 타입의 주사 제형으로 제조되는 것을 특징으로 하는, 방사선 치료용 광가교성 마이크로 하이드로젤 제조 방법.
  16. 제 10 항에 있어서,
    상기 마이크로젤은,
    체내에 주입되어 1 내지 3주 동안 주입 부위에 머무르는 것을 특징으로 하는, 방사선 치료용 광가교성 마이크로 하이드로젤 제조 방법.
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