WO2019216744A2 - 클릭화학 반응을 통해 필러 또는 약물전달체로 사용하기 위한 주사제형 조성물 - Google Patents

클릭화학 반응을 통해 필러 또는 약물전달체로 사용하기 위한 주사제형 조성물 Download PDF

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WO2019216744A2
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Definitions

  • the present invention relates to an injectable composition for use as a filler or drug delivery agent through a click chemistry reaction, and more particularly, the present invention comprises a first liquid comprising a first biopolymer to which a first click chemical functional group is introduced; And a second liquid comprising a second biopolymer having a second click chemical functional group introduced therein, wherein the first click chemical functional group and the second click chemical functional group are chemically bondable; Method for preparing an injection-type hydrogel using the same; And it relates to a medical filler, an injectable support or drug delivery system using the same.
  • hyaluronic acid injection-injected hydrogels have received a lot of attention in the medical field, and are expected to be widely used in medical fillers, drug (including biotransmitter) carriers, and organ / tissue regeneration using three-dimensional structures.
  • Such an injection-injectable hydrogel has the advantage that it can be simply injected into a living body using a syringe or the like without a surgical procedure.
  • injection-injectable hydrogels have a fluid-like characteristic in vitro and can be implanted using a syringe, and gelation occurs after injection into the body. That is, after transplantation, it may serve as a support for sustaining the growth of drug carriers or cells for sustained release of drugs (bioactive substances).
  • various cross-linking methods can be used to control physicochemical properties such as gelation time, swelling degree, degradation and mechanical properties of hydrogels. It is a great advantage to use. Therefore, it is important to prepare a hydrogel having desired physicochemical properties by adjusting the degree of appropriate crosslinking.
  • Injection-injectable hydrogels can be obtained through reversible interactions by non-covalent (hydrophobic bonds, hydrogen bonds, etc.) or by irreversible bonds by chemical (thermal, UV) reactions.
  • the injection-injectable hydrogel prepared through a reversible binding reaction uses a toxic additive such as a photo-initiator and a cross-binding agent, and has a weak mechanical property.
  • the present invention includes a first liquid comprising a first biopolymer to which the first click chemical functional group is introduced; And a second liquid including a second biological polymer having a second click chemical functional group introduced therein, wherein the first click chemical functional group and the second click chemical functional group are chemically bondable.
  • the present invention is to solve the above-mentioned problems, the first liquid containing a first biopolymer introduced with a first click chemical functional group; And a second liquid comprising a second biological polymer having a second click chemical functional group introduced therein, wherein the first click chemical functional group and the second click chemical functional group are chemically bondable. do.
  • the present invention also comprises the steps of (a) preparing a first liquid by adding a first click chemical functional group-containing material to the first biopolymer; (b) preparing a second liquid by injecting a second click chemical functional group-containing material into the second biological polymer; And (c) reacting the first liquid and the second liquid to chemically bind the first click chemical functional group and the second click chemical functional group.
  • the present invention also provides a medical filler or injectable support comprising the injectable hydrogel.
  • the present invention also provides a drug delivery system using the injectable hydrogel and the drug.
  • injectable hydrogels according to the present invention are simply prepared from the injectable composition through a click chemical reaction, and the physical and chemical properties of the injectable hydrogel are easily controlled by controlling the type and number of click chemical functional groups and the molecular weight of the biopolymer. It has the advantage of being adjustable. Therefore, the injectable hydrogel according to the present invention is suitable as a medical filler or an injectable support in the body, and may further be used as a sustained release drug carrier by further including a drug (including a biological delivery material).
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the mechanism of action of the specific cross-linked hyaluronic acid hydrogel through the click chemical reaction of hyaluronic acid introduced a first click chemical functional group and a hyaluronic acid introduced a second click chemical functional group according to the present invention.
  • Figure 2 is a specific cross-linked hyaluronic acid hydrogel 1 H-NMR results prepared according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 3 is a graph showing the rheological properties of the specific cross-linked hyaluronic acid hydrogel prepared according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 4 is a photograph of a specific cross-linked hyaluronic acid hydrogel prepared according to an embodiment of the present invention observed with a scanning electron microscope.
  • Figure 5 is a graph showing the swelling characteristics of water of the specific cross-linked hyaluronic acid hydrogel prepared according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 6 is a photograph showing the in vivo gel form retention characteristics of the specific cross-linked hyaluronic acid hydrogel prepared according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 7 is a photograph showing the in vivo maintenance characteristics of the specific cross-linked hyaluronic acid hydrogel prepared according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 8 is a graph showing the cumulative release characteristics of the anticancer agent (doxorubicin) from the anticancer agent (doxorubicin) -containing specific crosslinked hyaluronic acid hydrogel prepared according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 9 is a graph showing growth inhibition of cancer cells by an anticancer agent (doxorubicin) -containing specific crosslinked hyaluronic acid hydrogel prepared according to an embodiment of the present invention.
  • an anticancer agent doxorubicin
  • FIG. 10 is a graph showing growth inhibition of cancer formed in an animal by injection of an anticancer agent (doxorubicin) -containing specific crosslinked hyaluronic acid hydrogel prepared according to an embodiment of the present invention.
  • an anticancer agent doxorubicin
  • doxorubicin an anticancer agent prepared according to an embodiment of the present invention and a specific crosslinked hyaluronic acid hydrogel prepared according to an embodiment of the present invention.
  • Doxorubicin is a graph comparing growth inhibition of cancers formed in animals by injection of a composition containing doxorubicin).
  • Figure 12 is a photograph showing the results of observing the fluorescence of the anticancer agent (doxorubicin) in each organ of the animal after injection of a specific cross-linked hyaluronic acid hydrogel containing an anticancer agent (doxorubicin) prepared according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 13 is a graph showing the results of quantitatively confirming the amount of anticancer agent (doxorubicin) observed in each organ of the animal after injection of a specific crosslinked hyaluronic acid hydrogel containing an anticancer agent (doxorubicin) prepared according to an embodiment of the present invention. .
  • FIG. 14 is a graph showing the results of quantitative changes in blood glucose concentrations in blood of a diabetic-induced animal after injection of an insulin-containing specific crosslinked hyaluronic acid hydrogel prepared according to an embodiment of the present invention.
  • the inventors of the present invention continue to study fillers (medical fillers or in vivo implantable supports) and drug carriers, and are easy to manufacture by introducing different click chemical functional groups into a biopolymer and chemically crosslinking them through a click chemical reaction. And it was confirmed that can produce a hydrogel excellent in biopersistence, and completed the present invention.
  • the present invention includes a first liquid comprising a first biopolymer to which the first click chemical functional group is introduced; And a second liquid comprising a second biological polymer having a second click chemical functional group introduced therein, wherein the first click chemical functional group and the second click chemical functional group are chemically bondable. do.
  • the injectable composition is a composition for easily preparing an injectable hydrogel.
  • the first liquid and the second liquid may be present in a state separated from each other in a dual syringe, and then mixed.
  • the first and second click chemical functional groups in the injectable composition may be prepared in the form of an injectable hydrogel by forming specific crosslinks through a click chemical reaction.
  • the hydrogel is a gel having water as a dispersion medium, and the gel is connected to each other and has a network structure in which the solubility of the disperse phase is lowered while the sol loses fluidity and is solidified.
  • the first click chemical functional group includes at least one selected from an alkane group, an epoxy group, an acroyl group, and a tetrazine group
  • the second click chemical functional group is selected from an azide group, a thiol group, an amine group, and a cyclooctene group. It may include one or more.
  • an alkane group is amino-PEG4-alkyne, amino-PEG4-alkyne, alkyne-PEG5-acid, alkyne-PEG-amine, alkyne -PEG-amine); Epoxy groups in oxiranylamine, 2-oxiranyl-ethylamine; Acroyl groups in acrylamide, acrylic acid, acryloyl chloride;
  • the tetrazine groups are methyltetrazine-amine, methyltetrazine-PEG4-amine, methyltetrazinepropylamine, tetrazine-PEG5-NHS ester (tetrazine-PEG5) -NHS ester, methyltetrazine-PEG4-NHS ester, methyltetrazine-silfo-NHS ester, methyltetrazine-PEG4-acid -acid, methyltetrazine-P
  • methyltetrazine-PEG4-amine (Tet) was used as the first click chemical functional group-containing material.
  • an azide group may be formed from azide-PEG4-amine;
  • the thiol group is 3-amino-1-propanethiol, 11-mercaptoundecanoic acid, amino-methanethiol, thiol In PEG amines;
  • the amine group is ethylene diamine, PEG diamine, (S) -3-amino-2- (hydroxymethyl) propionic acid ((S) -3-amino-2- (hydroxymethyl) propionic acid ), In amino-acetic acid;
  • Cyclooctene groups are trans-cyclooctene-amines, trans-cyclooctene-NHS esters, trans cyclooctene-PEG-NHS esters, It may be derived from a second click chemical functional group-containing material selected from trans cyclooctene-PEG4-acid.
  • TCO trans-cyclooctene-amine
  • the first cyclic chemical functional group and the second cyclic chemical functional group are capable of chemically crosslinking with each other. Such chemical bonding can be achieved within a short time, in particular, within a few seconds, and the first liquid and the second liquid can gel in a short time.
  • the combination of the first chemical functional group and the second chemical functional group is (alkaine group, azide group), (alkaine group, thiol group), (epoxy group, amine group), (epoxy group, thiol group), (acro Diary, amine group), (acroyl group, thiol group) and (tetrazin, cyclooctene) may be one or more.
  • (tetrazine, cyclooctene) was used as a combination of the first and second click chemical functional groups, and they reacted with each other to form specific crosslinks.
  • the first biopolymer and the second biopolymer may be the same or different from each other, and each independently hyaluronic acid, submucosal tissue, carboxymethylcellulose, alginate, chitosan, polyacrylamide, poly (N-isopropylacrylamide). Amide) and ⁇ -glycerophosphate, and preferably include but are not limited to hyaluronic acid.
  • the first biopolymer and the second biopolymer may be the same or different from each other on the basis of the functional group before introduction, the molecular weight thereof is preferably 500,000 Da to 6,000,000 Da, but is not limited thereto. Do not. If the molecular weight of the biopolymer is less than the above range, there is a problem that the physical properties are too low, if the molecular weight exceeds the above range, there is a problem in use due to the viscosity rise.
  • the number of first click chemical functional groups introduced per mole of the first biopolymer; Alternatively, the number of second click chemical functional groups introduced per mole of the second biopolymer may be 100 to 2000, and 100 to 300 is most preferred in terms of easy injection, but is not limited thereto.
  • the biopolymer hydrogel when the biopolymer hydrogel has a low click crosslinking degree, it may be applicable to various soft tissues due to low strength and high swelling degree.
  • the biopolymer hydrogel when the biopolymer hydrogel has an intermediate click crosslink, it may be applied to cartilage tissue and used for the prevention or treatment of arthritis, cartilage damage or cartilage defect.
  • the biopolymer hydrogel when the biopolymer hydrogel has a high click crosslinking degree, it is applied to bone tissue because of high strength and low swelling degree, it can be used for the prevention or treatment of osteoporosis or bone defect disease.
  • the drug may further include a drug, wherein the drug is a broad concept including both a conventional drug and a biotransfer material.
  • a drug a known drug may be used.
  • the drug may include a chemical drug, a protein drug, a peptide drug, nucleic acid molecules for gene therapy, nanoparticles, and the like.
  • the drug may be an anticancer agent, an antidiabetic agent, an anti-inflammatory agent, an analgesic agent, an anti-arthritis agent, an antispasmodic agent, an antidepressant agent, an antipsychotic agent, a neurostabilizer, an antianxiety agent, an antagonist, an antiparkin's disease drug, a cholinergic agonist, an antivascular agent Antineoplastic, immunosuppressive, antiviral, antibiotic, appetite suppressant, analgesic, anticholinergic, antihistamine, antimigraine, hormone, coronary, cerebrovascular or peripheral vasodilator, contraceptive, antithrombotic, diuretic, antihypertensive, Cardiovascular diseases treatment agents, cosmetic ingredients (eg, wrinkle improvement, skin aging inhibitors and skin lightening agents) and the like, but are not limited thereto.
  • cosmetic ingredients eg, wrinkle improvement, skin aging inhibitors and skin lightening agents
  • the drug is doxorubicin, cisplatin, cisplatin, paclitaxel, vincristine, topotecan, docetaxel, 5-fluorouracil (5-FU), Gleevec an anticancer agent including at least one selected from gleevec, carboplatin, daunorubicin, valrubicin, flutamide, and gemcitabine; Or it may include, but is not limited to, a therapeutic agent for diabetic diseases, including insulin or insulin-tropic peptides.
  • doxorubicin and insulin were used as the drugs.
  • the present invention comprises the steps of (a) preparing a first liquid by injecting a substance containing a first click chemical functional group into the first biopolymer; (b) preparing a second liquid by injecting a second click chemical functional group-containing material into the second biological polymer; And (c) reacting the first liquid and the second liquid to chemically bind the first click chemical functional group and the second click chemical functional group.
  • the first click chemical functional group-containing material in step (a) is amino-PEG4-alkyne (amino-PEG4-alkyne), alkane-PEG5-acid (alkyne-PEG5-acid), alkane-PEG-amine (alkyne) -PEG-amine, oxiranylamine, 2-oxiranyl-ethylamine, acrylamide, acryllic acid, acryloyl chloride , Methyltetrazine-amine, methyltetrazine-PEG4-amine, methyltetrazine-PEG4-amine, methyltetrazine-propylamine, tetrazine-PEG5-NHS ester (tetrazine-PEG5) -NHS ester, methyltetrazine-PEG4-NHS ester, methyltetrazine-silfo-NHS ester, methyltetrazine-PEG4-acid
  • the second click chemical functional group-containing material includes azide-PEG4-amine, 3-amino-1-propanethiol, and 11-mer.
  • Captodecanoic Acid (11-mercaptoundecanoic acid), amino-methanethiol, thiol PEG amine, ethylene diamine, PEG diamine, (S) -3-amino-2- (hydroxymethyl) propionic acid ((S) -3-amino-2- (hydroxymethyl) propionic acid), amino-acetic acid, trans-cyclooctene amine transcyclooctene-amine, trans-cyclooctene-NHS ester, trans cyclooctene-PEG-NHS ester, and trans cyclooctene-PEG4-acid -PEG4-acid) may be one or more selected from.
  • a condensing agent or drug may be further added in step (a) or step (b).
  • a condensation reaction by further including a condensing agent in the first or second biopolymer solution.
  • the condensing agent 4- (4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl) -4-methylmorpholinium chloride (4- (4,6-Dimethoxy-1,3,5- triazin-2-yl) -4-methylmorpholinium chloride) (DMTMM) can be used and the amount of condensing agent can be adjusted to control the degree of condensation reaction.
  • the drug is as described above, it can be applied to the drug carrier by the injection of the drug.
  • Injectable hydrogels prepared by the method are characterized in that the gel form, but also injectable formulation.
  • the injection hydrogel has a high storage modulus (G ′), characterized in that the storage modulus (G) measured using a rheometer in the frequency range of 0.1 Hz to 10 Hz of the injection hydrogel ') May be 2.00 ⁇ 10 2 Pa to 2.00 ⁇ 10 3 Pa, preferably 2.00 ⁇ 10 2 Pa to 4.00 ⁇ 10 2 Pa, but is not limited thereto.
  • the composite viscosity at 25 °C of the injection-type hydrogel may be 3.00 ⁇ 10 1 Pa ⁇ s to 3.0 ⁇ 10 2 Pa ⁇ s, and 3.00 ⁇ 10 1 Pa ⁇ s to 6.0 ⁇ 10 1 Pa ⁇ s Preferred but not limited thereto.
  • injection-type hydrogel may be in a porous form. This means that crosslinking has taken place.
  • the swelling ratio of the injection-type hydrogel with respect to water may be 2,000% to 10,000%, and preferably 7,500% to 10,000%, but is not limited thereto.
  • a medical filler or injectable support comprising the prepared injection-type hydrogel.
  • the present invention also provides a drug delivery agent comprising the prepared injection-type hydrogel and a drug.
  • the drug may be present in the hydrogel, or may be present in a mixed form with the hydrogel, but is preferably present in the hydrogel in terms of effective drug delivery, but is not limited thereto.
  • the drug is as described above.
  • the drug carrier may be used as a sustained release drug carrier and may have a cumulative drug release rate of 50% to 100% for 28 days.
  • the drug delivery vehicle may have a cumulative drug release rate of 50% to 80% for 16 days, and may have a cumulative drug release rate of 80% to 100% for 28 days, so that the drug is released slowly over a long time. It is characterized by a long-term drug efficacy. Therefore, there is an advantage that can eliminate all the side effects of the single / repeated injection of the drug.
  • the present invention provides the use of the injectable hydrogel or the drug carrier for use in the treatment of cancer, diabetes or disease.
  • the present invention also provides a method for treating cancer or diabetes disease comprising administering the injection-type hydrogel or the drug carrier to a subject.
  • “individual” means a subject in need of treatment for a disease, and more specifically, a human or non-human primate, mouse, rat, dog, cat, horse, cow, and the like. Means mammals.
  • hyaluronic acid (molecular weight: 1,000,000 Da) was added to 10 mL of tertiary distilled water, followed by stirring at 25 ° C. for 24 hours to prepare a hyaluronic acid solution, which was divided by 5 mL into a vial.
  • HA-Tet to which the first click chemical functional group was prepared and HA-TCO to which the second click chemical functional group was introduced were dissolved in 2% physiological saline, and then injected into a double syringe to inject HA-Tet and HA-TCO was mixed to induce a click chemistry reaction, and finally a hyaluronic acid hydrogel was prepared through the specific crosslinking of the present invention.
  • Example 1 Sample C (%) H (%) N (%) C / N mole ratio Injection NO Comparative Example 1 HA 34.7 5.2 2.9 14.0
  • Example 1 HA-Tet 250 39.5 5.5 4.4 10.5 Cx-HA-250 HA-TCO 250 42.6 5.8 4.0 12.4
  • Example 2 HA-Tet 500 39.4 5.9 4.5 10.2 Cx-HA-500 HA-TCO 500 39.5 5.7 3.9 11.8
  • Example 3 HA-Tet 1000 40.6 5.5 5.5 8.5 Cx-HA-1000 HA-TCO 1000 40.6 6.2 4.4 10.7
  • IR783 80 mg, 0.11 mmol
  • 4-mercaptobenzoic acid 51 mg, 0.33 mmol
  • DMF 3 mL
  • HA-Tet introduced with the first click chemical functional group prepared in Example 1 and HA-TCO introduced with the second click chemical functional group were introduced into 10 mL of tertiary distilled water, respectively, to prepare a solution.
  • 4- (4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl) -4-methylmorpholinium chloride (4- (4,6-Dimethoxy-1,3) as a condensing agent in vials of 3.3 mg of, 5-triazin-2-yl) -4-methylmorpholinium chloride) (DMTMM) was added. This was slowly added dropwise to 5 mL of tertiary distilled water containing 10.5 mg of IR783-COOH, stirred at 25 ° C.
  • NIR-HA-Tet with a functional group and IR783 introduced and NIR-HA-TCO with a second click chemical functional group and IR783 introduced were prepared.
  • HA-Tet (2 mg) to which the first click chemical functional group was prepared in Example 1 and HA-TCO (2 mg) to which the second click chemical functional group was introduced were dissolved in 2% physiological saline to 100 ⁇ L solution.
  • doxorubicin (Dox) as an anticancer agent.
  • each stirred mixture was mixed through a dual syringe to finally obtain a specific crosslinked hyaluronic acid hydrogel (Cx-HA-Dox) containing doxorubicin (0.4 mg).
  • HA-Tet (2 mg) to which the first click chemical functional group was prepared in Example 1 and HA-TCO (2 mg) to which the second click chemical functional group was introduced were dissolved in 2% physiological saline to 100 ⁇ L solution.
  • HA-TCO (2 mg) to which the second click chemical functional group was introduced were dissolved in 2% physiological saline to 100 ⁇ L solution.
  • insulin 31.5 IU was added to each solution.
  • each stirred mixture was mixed through a dual syringe to finally obtain a specific crosslinked hyaluronic acid hydrogel (Insulin-Cx-HA) containing insulin (63 IU).
  • hyaluronic acid hydrogel (HA) was finally prepared.
  • the hyaluronic acid hydrogel (4 mg) prepared in Comparative Example 1 was dissolved in 2% physiological saline to prepare a 200 ⁇ L solution, and the hyaluronic acid hydrogel (HA-Dox) containing the anticancer drug doxorubicin (0.4 mg) was finally added through a syringe. Obtained.
  • the hyaluronic acid hydrogel (4 mg) prepared in Comparative Example 1 was dissolved in 2% physiological saline to prepare a 200 ⁇ L solution, and a hyaluronic acid hydrogel (Insulin-Dox) containing insulin (63 IU) was finally added through a syringe. Obtained.
  • Hyaluronic acid hydrogel prepared by the specific chemical cross-linking through the click chemical reaction in Example 1, 50 seconds pre-cooling in liquid nitrogen using a freeze mill (6700, SPEX Inc., USA) / grinding (60 Hz) 240 seconds / cooling 50 seconds to freeze grinding in 3 cycle conditions (Pulverized-HA).
  • Example 1 the hyaluronic acid hydrogel prepared through the specific cross-linking through a click chemistry reaction in Example 1 is Comparative Example 1 It has a loss modulus that is almost equivalent to hyaluronic acid hydrogel prepared in US, but it is confirmed that the storage modulus is significantly increased by the specific cross-linking through the click chemistry reaction. Intensity was found to increase significantly with increasing the degree of click crosslinking.
  • a specific cross-linked hydrogel through a click chemical reaction of HA-Tet introduced with a first click chemical functional group and HA-TCO introduced with a second click chemical functional group was introduced.
  • Loss modulus and storage modulus of (Example 1, Cx-HA-250) were observed to reverse in about 2 seconds. From this it can be seen that the specific cross-linking via the click chemical reaction occurs within 3 seconds.
  • Example 1 Cx-HA-250
  • Comparative Example 2 The hydrogel prepared in Example 1 (Cx-HA-250) and Comparative Example 2 was prepared in a 5 ml vial, and immediately after the preparation and after 2 days, 8 days, 12 days, 28 days, Modular Compact Rheometer (MCR) 102, Anton Paar, Austria) was used to measure the viscosity of each hydrogel.
  • MCR Modular Compact Rheometer
  • each hyaluronic acid hydrogel was subjected to a plasma-sputtering apparatus (Emitech, K575, Kent, UK). After coating, the internal structure of the hydrogel was observed using a scanning electron microscope (FE-SEM; JSM-6700F, JEOL, Tokyo, Japan).
  • Comparative Example 1 was confirmed that the internal hydrogel structures are agglomerated structure without porosity, while Examples 2 and 3 maintain a constant pore form.
  • the hyaluronic acid hydrogel of Comparative Example 1 was liquefied within a few minutes after adding PBS, and thus the swelling degree of water could not be calculated, but the hyaluronic acid prepared in Example 1
  • the hydrogel showed a swelling degree for a very large water, and it was confirmed that the swelling degree for water was significantly decreased as the click-crosslinking degree increased.
  • HA-Tet and HA-TCO prepared above were put in dual syringes, respectively, and injected into the rat subcutaneous 100 ⁇ l to form a hydrogel subcutaneously. Thereafter, the hydrogels were removed and observed at 1 week intervals subcutaneously. As a result, as shown in FIG. 6, it turned out that the gel is formed stably after 4 weeks.
  • the hyaluronic acid hydrogel prepared in Comparative Example 1 was injected to 100 ⁇ L subcutaneously in the same rat subcutaneous to form a hydrogel was to be observed, but after 1 week was not confirmed gel formation.
  • Nude mice male, male, NIR-HA-Tet introduced with the first click chemical functional group and IR783 prepared in Example 4 and NIR-HA-TCO introduced with the second click chemical functional group and IR783 were respectively contained in a dual syringe. 8 weeks old) was injected 0.15 mL under a 1 mL syringe (21 G).
  • NIR-HA prepared in Comparative Example 3 was injected into nude mice in the same manner as described above, followed by fluorescence imaging over each time.
  • the anticancer agent-containing hydrogels prepared in Example 5 and Comparative Example 3 were dissolved in 0.5 mL of PBS, and then injected into an upper chamber of a 24-well transwell plate (SPL Life Science, 0.4 ⁇ m pore size) at 37 ° C., 100 ° C. The release of drug over time was confirmed in a shaker at rpm. 0.5 mL of solution was taken with each hour and 0.5 mL PBS solution was injected again. Doxorubicin release was measured using a high performance liquid chromatography (HPLC) system (Agilent 1200 series, Waldbronn, Germany).
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • doxorubicin To measure the amount of doxorubicin, a wavelength of 479 nm and a CAPCELL PACK C18 column (5 ⁇ m, 4.6 ⁇ 250 mm, Shiseido Co., Ltd., Tokyo, Japan) were used.
  • the mobile phase used a mixed solution of 30:70 (v / v) of 50 mM sodium phosphate and acetonitrile, and the column was extracted at a rate of 0.5 mL / min. Cumulative doxorubicin release in vitro was calculated by comparison with the standard calibration curve.
  • the anticancer agent-containing specific cross-linked hydrogel (Cx-HA-Dox) prepared in Example 5 compared to the anti-cancer agent-containing hydrogel (HA-Dox) prepared in Comparative Example 3, doxorubicin Sustained release is confirmed, and cumulative doxorubicin release rate is about 60-70% for 16 days.
  • the content of doxorubicin remaining in the anticancer agent-containing specific crosslinked hydrogel (Cx-HA-Dox) prepared in Example 5 was determined, and the content was found to be about 10.4%. Accordingly, the actual cumulative doxorubicin release rate is estimated to be about 90%.
  • the upper chamber was covered with wells containing cells and incubated at 37 ° C., 5% CO 2 for 12 hours, 24 hours, 48 hours, and 72 hours. After 12 hours, the medium was initially replaced. MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium to determine the cytotoxicity of each formulation against B16F10 cells in vitro after 12, 24, 48 and 72 hours. bromide; Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) assay. 100 ⁇ L PBS solution containing MTT tetrazolium substrate (50 ⁇ g / mL) was added to each well and incubated at 37 ° C. for 4 hours.
  • the cancer model was made by subcutaneous injection of about 2 ⁇ 10 5 B16F10 melanoma cells suspended in 100 ⁇ L in the abdomen of BALB / c mice (6 weeks, males, 20 g). When the cancer volume is 150-200 mm 3 , 0 d.
  • Cancer-induced animals were divided into six groups (1) Control, (2) Doxorubicin (0.4 mg Dox), (3) Doxorubicin Repeat (0.1 mg Dox), (4) Anti-cancer agent-containing hydrogel prepared in Comparative Example 3 (HA-Dox; 0.4 mg Dox), (5) Anti-cancer agent-containing specific crosslinked hydrogel prepared in Example 5 (Cx-HA-Dox; 0.4 mg Dox), (6) Assigned to a composition (Pulverized-HA; 0.4 mg Dox) containing an anticancer agent (doxorubicin) in the freeze milled product of the specific crosslinked hydrogel prepared in Comparative Example 5 It became.
  • mice were sacrificed on days 1, 6, 12, and 18. Organs (tumor, intestine, lung, kidney, liver, spleen and heart) were obtained immediately and photographed (FIG. 12).
  • Organs tumor, intestine, lung, kidney, liver, spleen and heart
  • T 10 basic ULTRA-TURRAX Homogenizer IKA-Werke GmbH & Co., Staufen, Germany. It was homogenized at a speed of 30,000 rpm and incubated at 37 ° C. for 15 minutes. Each homogeneously mixed samples were incubated again at 37 ° C.
  • the anticancer agent in the case of injection of the anticancer agent-containing hydrogel (HA-Dox) prepared in Comparative Example 3, the anticancer agent is present only at the initial time of the cancer and rapidly dispersed into other organs, and thus it is confirmed that there is little efficacy as a drug carrier.

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Abstract

본 발명은 클릭화학 반응을 통해 필러 또는 약물전달체로 사용하기 위한, 주사제형 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로, 본 발명은 제1 클릭화학 작용기가 도입된 제1 생체 고분자를 포함하는 제1액; 및 제2 클릭화학 작용기가 도입된 제2 생체 고분자를 포함하는 제2액을 포함하고, 상기 제1 클릭화학 작용기 및 상기 제2 클릭화학 작용기가 화학적으로 결합가능한 것을 특징으로 하는 주사제형 조성물; 이를 이용한 주사제형 하이드로겔의 제조방법; 및 이를 이용한 의료용 충진제, 체내 주입형 지지체 또는 약물전달체에 관한 것이다.

Description

클릭화학 반응을 통해 필러 또는 약물전달체로 사용하기 위한 주사제형 조성물
본 발명은 클릭화학 반응을 통해 필러 또는 약물전달체로 사용하기 위한 주사제형 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 제1 클릭화학 작용기가 도입된 제1 생체 고분자를 포함하는 제1액; 및 제2 클릭화학 작용기가 도입된 제2 생체 고분자를 포함하는 제2액을 포함하고, 상기 제1 클릭화학 작용기 및 상기 제2 클릭화학 작용기가 화학적으로 결합가능한 것을 특징으로 하는 주사제형 조성물; 이를 이용한 주사제형 하이드로겔의 제조방법; 및 이를 이용한 의료용 충진제, 체내 주입형 지지체 또는 약물전달체에 관한 것이다.
최근 히알루론산 주사 주입형 하이드로겔은 의료분야에서 많은 관심을 받고 있으며, 의료용 충진제부터 약물(생체 전달 물질 포함) 전달체, 삼차원 구조를 이용한 기관/조직재생에 이르기까지 폭넓게 이용될 수 있을 것으로 기대된다. 이러한 주사 주입형 하이드로겔은 외과적인 수술과정 없이 주사기 등을 사용하여 간단하게 생체 내에 주입될 수 있다는 장점을 가지고 있다.
일반적으로 주사 주입형 하이드로겔의 경우 체외에서는 유체와 같은 특성을 가지고 있어 주사기를 사용하여 이식이 가능하고, 체내에 주입 후에는 겔화가 일어나게 된다. 즉, 이식 후에는 약물(생체 활성 물질)의 지속적인 방출을 위한 약물전달체 또는 세포의 성장을 유지할 수 있는 지지체로서의 역할을 할 수 있다. 또한 다양한 가교 방법을 도입하여 하이드로겔의 젤화 시간, 팽윤 정도, 분해 및 기계적 물성과 같은 물리화학적 특성을 조절할 수 있으며, 이러한 물리화학적 특성의 조절 가능성은 용도에 따라 하이드로겔을 약물전달 시스템이나 조직공학에 이용하는 데 큰 이점이 된다. 따라서 적당한 가교의 정도를 조절하여 원하는 물리화학적 특성을 가지는 하이드로겔을 제조하는 것이 중요하다.
주사 주입형 하이드로겔은 비-공유결합성(소수성 결합, 수소 결합 등)에 의한 가역적 상호작용 또는 화학적(열, UV) 반응에 의한 비가역적 결합을 통해 수득될 수 있다. 이 중 가역적 결합 반응을 통하여 제조된 주사 주입형 하이드로겔은 광-개시제, 교차-결합제와 같은 독성 첨가제를 사용하고, 기계적 물성이 약하다는 문제점이 있다.
이에 상기와 같은 문제점을 극복하면서, 생체 적합성 물질의 물리화학적 특성을 쉽게 조절할 수 있는 가교 하이드로겔이 필요한 실정이다.
본 발명은 제1 클릭화학 작용기가 도입된 제1 생체 고분자를 포함하는 제1액; 및 제2 클릭화학 작용기가 도입된 제2 생체 고분자를 포함하는 제2액을 포함하고, 상기 제1 클릭화학 작용기 및 상기 제2 클릭화학 작용기가 화학적으로 결합가능한 것을 특징으로 하는 주사제형 조성물 등을 제공하고자 한다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위한 것으로, 제1 클릭화학 작용기가 도입된 제1 생체 고분자를 포함하는 제1액; 및 제2 클릭화학 작용기가 도입된 제2 생체 고분자를 포함하는 제2액을 포함하고, 상기 제1 클릭화학 작용기 및 상기 제2 클릭화학 작용기가 화학적으로 결합가능한 것을 특징으로 하는 주사제형 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 제1생체 고분자에 제1 클릭화학 작용기 포함 물질을 투입하여 제1액을 제조하는 단계; (b) 제2생체 고분자에 제2 클릭화학 작용기 포함 물질을 투입하여 제2액을 제조하는 단계; 및 (c) 상기 제1액 및 제2액을 반응시켜, 제1 클릭화학 작용기 및 상기 제2 클릭화학 작용기를 화학적으로 결합시키는 것을 특징으로 하는, 주사제형 하이드로겔의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 주사제형 하이드로겔을 포함하는 의료용 충진제 또는 체내 주입형 지지체를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 주사제형 하이드로겔 및 약물을 이용한 약물전달체를 제공한다.
본 발명에 따른 주사제형 하이드로겔은 주사제형 조성물로부터 클릭화학 반응을 통하여 간단하게 제조되는 것으로, 클릭화학 작용기의 종류 및 수, 생체 고분자의 분자량 등을 조절함으로써 주사제형 하이드로겔의 물리화학적 특성을 쉽게 조절할 수 있다는 장점이 있다. 따라서, 본 발명에 따른 주사제형 하이드로겔은 의료용 충진제 또는 체내 주입형 지지체로 적합하며, 약물(생체 전달 물질 포함)을 추가로 포함함으로써, 서방형 약물 전달체 등으로도 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 제1 클릭화학 작용기가 도입된 히알루론산 및 제2 클릭화학 작용기가 도입된 히알루론산의 클릭화학 반응을 통한-특이적 가교 히알루론산 하이드로겔의 작용 기작을 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 특이적 가교 히알루론산 하이드로겔 1H-NMR 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 특이적 가교 히알루론산 하이드로겔의 유변학적 특성을 보여주는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 제조된 특이적 가교 히알루론산 하이드로겔을 주사전자현미경으로 관찰한 사진이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 특이적 가교 히알루론산 하이드로겔의 물에 대한 스웰링 특성을 보여주는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 특이적 가교 히알루론산 하이드로겔의 생체내 겔 형태 유지 특성을 보여주는 사진이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 특이적 가교 히알루론산 하이드로겔의 생체내 유지 특성을 보여주는 사진이다.
도 8 은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 항암제(독소루비신) 함유 특이적 가교 히알루론산하이드로겔로부터 항암제(독소루비신)의 누적 방출 특성을 보여주는 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 항암제(독소루비신) 함유 특이적 가교 히알루론산 하이드로겔에 의한 암세포의 성장 억제를 보여주는 그래프이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 항암제(독소루비신) 함유 특이적 가교 히알루론산 하이드로겔의 주입에 의한 동물에 형성된 암의 성장 억제를 보여주는 그래프이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 항암제(독소루비신) 함유 특이적 가교 히알루론산 하이드로겔 및 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 특이적 가교 히알루론산 하이드로겔의 동결 분쇄물에 항암제(독소루비신)를 함유한 조성물의 주입에 의한 동물에 형성된 암의 성장 억제를 비교하는 그래프이다.
도 12 은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 항암제(독소루비신) 함유 특이적 가교 히알루론산 하이드로겔의 주입 후 동물 각 장기에 항암제(독소루비신)의 형광이 나타나는 것을 관찰한 결과를 보여주는 사진이다.
도 13 은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 항암제(독소루비신) 함유 특이적 가교 히알루론산 하이드로겔의 주입 후 동물 각 장기에서 관찰된 항암제(독소루비신)의 양을 HPLC로 정량 확인한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 14 는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 인슐린 함유 특이적 가교 히알루론산 하이드로겔의 주입 후 당뇨 유발 동물의 혈중에서의 혈당 농도 변화를 정량 확인한 결과를 보여주는 그래프이다.
본 발명자들은 필러(의료용 충진체 또는 체내 주입형 지지체) 및 약물전달체에 대한 연구를 지속하던 중, 생체 고분자에 서로 다른 클릭화학 작용기를 도입하고, 클릭화학 반응을 통해 화학적으로 가교 결합시킴으로써 제조가 간편하고 생체 지속성이 뛰어난 하이드로겔을 제조할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 제1 클릭화학 작용기가 도입된 제1 생체 고분자를 포함하는 제1액; 및 제2 클릭화학 작용기가 도입된 제2 생체 고분자를 포함하는 제2액을 포함하고, 상기 제1 클릭화학 작용기 및 상기 제2 클릭화학 작용기가 화학적으로 결합가능한 것을 특징으로 하는 주사제형 조성물을 제공한다.
상기 주사제형 조성물은 주사제형 하이드로겔을 간단하게 제조하기 위한 조성물로서, 상기 제1액 및 상기 제2액이 듀얼실린지 등에서 서로 분리된 상태로 존재하다가, 혼합시킬 수 있다. 혼합시, 상기 주사제형 조성물 내 제1클릭화학 작용기 및 제2클릭화학 작용기가 클릭화학 반응을 통하여 특이적 가교 결합을 형성함으로써 주사제형 하이드로겔 형태로 제조될 수 있다. 상기 하이드로겔은 물을 분산매로 하는 겔로서, 겔은 졸이 유동성을 잃고 고화된 상태로 분산상의 용해도가 저하되어 서로 연결되고 망목구조를 취하며 그 중에 분산모가 포함되어 있는 것이다.
상기 제1클릭화학 작용기는 알카인기, 에폭시기, 아크로일기 및 테트라진기 중에서 선택되는 1종 이상을 포함하고, 상기 제2클릭화학 작용기는 아자이드기, 싸이올기, 아민기 및 사이클로옥텐기 중에서 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 제1 클릭화학 작용기로서, 알카인기는 아미노-PEG4-알카인(amino-PEG4-alkyne), 알카인-PEG5-에시드(alkyne-PEG5-acid), 알카인-PEG-아민(alkyne-PEG-amine) 중에서; 에폭시기는 옥시라닐아민(oxiranylamine), 2-옥시라닐-에틸아민(2-oxiranyl-ethylamine) 중에서; 아크로일기는 아크릴아마이드(acrylamide), 아크릴릭 에시드(acrylic acid), 아크릴로일 클로라이드(acryloyl chloride) 중에서; 테트라진기는 메틸테트라진-아민(methyltetrazine-amine), 메틸테트라진-PEG4-아민(meathyltetrazine-PEG4-amine), 메틸테트라진-프로필아민(methyltetrazinepropylamine), 테트라진-PEG5-NHS 에스터(tetrazine-PEG5-NHS ester), 메틸테트라진-PEG4-NHS 에스터(metylteltrazine-PEG4-NHS ester), 메틸테트라진-실포-NHS 에스터(methyltetrazine-silfo-NHS ester), 메틸테트라진-PEG4-에시드(methlytetrazine-PEG4-acid), 메틸테트라진-PEG12-NHS 에스터(methyltetrazine-PEG12-NHS ester), 메틸테트라진-NHS 에스터(methyltetrazine-NHS ester), 메틸테트라진-에시드(methyltetrazine-acid), 테트라진-에시드(tetrazine-acid) 중에서 선택된 제1 클릭화학 작용기 포함 물질로부터 유래한 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 상기 제1클릭화학 작용기 포함 물질로서, 메틸테트라진-PEG4-아민(methyltetrazine-PEG4-amine, Tet)을 사용하였다.
또한, 상기 제2 클릭화학 작용기로서, 아자이드기는 아자이드-PEG4-아민(azide-PEG4-amine)에서; 싸이올기는 3-아미노-1-프로판싸이올(3-amino-1-propanethiol), 11-메르캅토운데카노익 에시드(11-mercaptoundecanoic acid), 아미노-메탄싸이올(Amino-methanethiol), 싸이올 PEG 아민(thiol PEG amine) 중에서; 아민기는 에틸렌 디아민(ethylene diamine), PEG 디아민(PEG diamine), (S)-3-아미노-2-(히드록시메틸)프로피오닉 에시드((S)-3-amino-2-(hydroxymethyl)propionic acid), 아미노-아세틱 에시드(amino-acetic acid) 중에서; 사이클로옥텐기는 트랜스-사이클로옥텐-아민(trans-cyclooctene-amine), 트랜스-사이클로옥텐-NHS 에스터(trans-cyclooctene-NHSester), 트랜스 사이클로옥텐-PEG-NHS 에스터(trans cyclooctene-PEG-NHS ester), 트랜스 사이클로옥텐-PEG4-에시드(trans cyclooctene-PEG4-acid) 중에서 선택된 제2 클릭화학 작용기 포함 물질로부터 유래한 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 상기 제2클릭화학 작용기 포함 물질로서, 트랜스-사이클로옥텐-아민(trans-cyclooctene-amine, TCO)을 사용하였다.
상기 제1클릭화학 작용기 및 제2클릭화학 작용기는 서로 화학적으로 가교결합이 가능한 것으로서, 이러한 화학적 결합은 짧은 시간, 특히 수 초 이내에 이루어질 수 있는 것으로, 제1액과 제2액이 단시간 안에 겔화 가능한 이점을 가진다. 구체적으로, 상기 제1 화학 작용기 및 상기 제2 화학 작용기의 조합은 (알카인기, 아자이드기), (알카인기, 싸이올기), (에폭시기, 아민기), (에폭시기, 싸이올기), (아크로일기, 아민기), (아크로일기, 싸이올기) 및 (테트라진, 사이클로옥텐) 중에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 상기 제1클릭화학 작용기 및 제2클릭화학 작용기의 조합으로 (테트라진, 사이클로옥텐)을 사용하였고, 이들이 서로 반응하여 특이적 가교 결합을 형성하였다.
상기 제1 생체 고분자 및 상기 제2 생체 고분자는 서로 동일하거나, 상이할 수 있고, 각각 독립적으로 히알루론산, 소장점막하 조직, 카복시메틸셀룰로스, 알지네이트, 키토산, 폴리아크릴아미드, 폴리(N-이소프로필아크릴아미드) 및 β-글리세로포스페이트 중에서 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있고, 히알루론산을 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
보다 구체적으로, 상기 상기 제1생체 고분자 및 제2 생체 고분자는 작용기 도입 전을 기준으로, 분자량이 서로 동일하거나, 상이할 수 있고, 이의 분자량은 500,000 Da 내지 6,000,000 Da인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 생체 고분자의 분자량이 상기 범위 미만인 경우, 물성이 너무 낮아지는 문제점이 있고, 분자량이 상기 범위를 초과하는 경우, 점도 상승에 따른 사용시 문제점이 있다.
상기 제1 생체 고분자 1 몰 당 도입된 제1 클릭화학 작용기의 수; 또는 상기 제2 생체 고분자 1 몰 당 도입된 제2 클릭화학 작용기의 수를 조절함으로써, 상기 생체 고분자 하이드로겔의 가교도를 조절할 수 있으며, 결과적으로 하이드로겔의 용도에 따라 물성을 최적화시킬 수 있다. 구체적으로, 상기 제1 생체 고분자 1 몰 당 도입된 제1 클릭화학 작용기의 수; 또는 상기 제2 생체 고분자 1 몰 당 도입된 제2 클릭화학 작용기의 수는 100개 내지 2000개일 수 있고, 100개 내지 300개인 것이, 용이한 주사 주입 측면에서 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
구체적으로, 상기 생체 고분자 하이드로겔이 낮은 클릭 가교도를 가지는 경우에는, 낮은 강도 및 높은 팽윤도로 인하여 각종 연조직에 적용이 가능할 수 있다. 한편, 상기 생체 고분자 하이드로겔이 중간 클릭가교도를 가지는 경우에는, 연골 조직에 적용되어, 관절염, 연골 손상 또는 연골 결손의 예방 또는 치료 용도로 사용될 수 있다. 한편, 상기 생체 고분자 하이드로겔이 높은 클릭가교도를 가지는 경우에는, 높은 강도 및 낮은 팽윤도로 인하여 골 조직에 적용되어, 골다골증 또는 골결손질환의 예방 또는 치료 용도로 사용될 수 있다.
상기 제1액 및 상기 제2액에, 약물을 추가로 포함할 수 있는데, 이때, 약물은 통상적인 약물뿐만 아니라, 생체 전달 물질을 모두 포함하는 광범위한 개념이다. 상기 약물로는 공지의 약물이 사용가능하고, 예를 들어, 상기 약물은 화학약물, 단백질 의약, 펩타이드 의약, 유전자 치료용 핵산 분자 및 나노입자 등을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 약물은 항암제, 당뇨질환 치료제, 항염증제, 진통제, 항관절염제, 진경제, 항우울증제, 항정신병약물, 신경안정제, 항불안제, 마약길항제, 항파킨스질환 약물, 콜린성 아고니스트, 항혈관신생억제제, 면역억제제, 항바이러스제, 항생제, 식욕억제제, 진통제, 항콜린제, 항히스타민제, 항편두통제, 호르몬제, 관상혈관, 뇌혈관 또는 말초혈관 확장제, 피임약, 항혈전제, 이뇨제, 항고혈압제, 심혈관질환 치료제, 미용성분(예컨대, 주름개선제, 피부노화 억제제 및 피부미백제) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
구체적으로, 상기 약물은 독소루비신(doxorubicin), 시스플라틴(cisplatin), 파클리탁셀(paclitaxel), 빈크리스틴(vincristine), 토포테칸(topotecan), 도세탁셀(docetaxel), 5-플루오로우라실(5-FU), 글리벡(gleevec), 카보플라틴(carboplatin), 두아노루비신(daunorubicin), 발루비신(valrubicin), 플로타미드(flutamide) 및 젬시타빈(gemcitabine) 중에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 항암제; 또는 인슐린 또는 인슐린친화성(insulinotropic) 펩타이드를 포함하는 당뇨 질환 치료제를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서는, 상기 약물로 독소루비신 및 인슐린을 사용하였다.
또한, 본 발명은 (a) 제1생체 고분자에 제1 클릭화학 작용기 포함 물질을 투입하여 제1액을 제조하는 단계; (b) 제2생체 고분자에 제2 클릭화학 작용기 포함 물질을 투입하여 제2액을 제조하는 단계; 및 (c) 상기 제1액 및 제2액을 반응시켜, 제1 클릭화학 작용기 및 상기 제2 클릭화학 작용기를 화학적으로 결합시키는 것을 특징으로 하는, 주사제형 하이드로겔의 제조방법을 제공한다.
상기 (a) 단계에서 제1 클릭화학 작용기 포함 물질은 아미노-PEG4-알카인(amino-PEG4-alkyne), 알카인-PEG5-에시드(alkyne-PEG5-acid), 알카인-PEG-아민(alkyne-PEG-amine), 옥시라닐아민(oxiranylamine), 2-옥시라닐-에틸아민(2-oxiranyl-ethylamine), 아크릴아마이드(acrylamide), 아르킬릭 에시드(acrylic acid), 아크릴로일 클로라이드(acryloyl chloride), 메틸테트라진-아민(methyltetrazine-amine), 메틸테트라진-PEG4-아민(methyltetrazine-PEG4-amine), 메틸테트라진-프로필아민(methyltetrazine-propylamine), 테트라진-PEG5-NHS 에스터(tetrazine-PEG5-NHS ester), 메틸테트라진-PEG4-NHS 에스터(methyltetrazine-PEG4-NHS ester), 메틸테트라진-실포-NHS 에스터(methyltetrazine-silfo-NHS ester), 메틸테트라진-PEG4-에시드(methyltetrazine-PEG4-acid), 메틸테트라진-PEG12-NHS 에스터(methyltetrazine-PEG12-NHS ester), 메틸테트라진-NHS 에스터(methyltetrazine-NHS ester), 메틸테트라진-에시드(methyltetrazine-acid) 및 테트라진-에시드(tetrazine-acid) 중에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
상기 (b) 단계에서 제2 클릭화학 작용기 포함 물질은 아자이드-PEG4-아민(azide-PEG4-amine), 3-아미노-1-프로판싸이올(3-amino-1-propanethiol), 11-메르캅토운데카노익 에시드(11-mercaptoundecanoic acid), 아미노-메탈싸이올(Amino-methanethiol), 싸이올 PEG 아민(thiol PEG amine), 에틸렌 디아민(ethylene diamine), PEG 디아민(PEG diamine), (S)-3-아미노-2-(히드록시메틸)프로피오닉 에시드((S)-3-amino-2-(hydroxymethyl)propionic acid), 아미노-아세틱 에시드(amino-acetic acid), 트랜스-사이클로옥텐 아민(transcyclooctene-amine), 트랜스-사이클로옥텐-NHS 에스터(trans-cyclooctene-NHS ester), 트랜스 사이클로옥텐-PEG-NHS 에스터(trans cyclooctene-PEG-NHS ester) 및 트랜스 사이클로옥텐-PEG4-에시드(trans cyclooctene-PEG4-acid) 중에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
선택적으로, 상기 (a) 단계 또는 상기 (b) 단계에서 축합제 또는 약물을 추가로 투입할 수 있다. 구체적으로, 상기 제1 또는 제2 생체 고분자에 제1 또는 제2 클릭화학 작용기를 도입하기 위해서는 상기 제1 또는 제2 생체 고분자 용액에 축합제를 추가로 포함함으로써 축합 반응을 수행하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 축합제로 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 클로라이드(4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride)(DMTMM)를 사용할 수 있고, 축합제의 양은 축합 반응 정도를 제어하기 위해 조절될 수 있다. 한편, 상기 약물에 대해서는 전술한 바와 같고, 상기 약물의 투입에 의해, 약물전달체로 적용이 가능하다.
상기 방법으로 제조된 주사제형 하이드로겔은 겔 형태이면서도, 주사 가능한 제형인 것을 특징으로 한다.
구체적으로, 상기 주사제형 하이드로겔은 높은 저장탄성률(G')을 가지는 것을 특징으로 하는데, 상기 주사제형 하이드로겔의 0.1 Hz 내지 10 Hz의 주파수 범위에서, 레오미터를 이용하여 측정된 저장탄성률(G')은 2.00 Х 102 Pa 내지 2.00 Х 103 Pa 일 수 있고, 2.00 Х 102 Pa 내지 4.00 Х 102 Pa 인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 주사제형 하이드로겔의 25℃에서 복합 점도는 3.00 Х 101 Pa·s 내지 3.0 Х 102 Pa·s 일 수 있고, 3.00 Х 101 Pa·s 내지 6.0 Х 101 Pa·s인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 주사제형 하이드로겔은 다공 형태일 수 있다. 이는 가교 결합이 이루어졌음을 의미한다.
또한, 상기 주사제형 하이드로겔의 물에 대한 스웰링도(swelling ratio)는 2,000% 내지 10,000%일 수 있고, 7,500% 내지 10,000%인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 제조된 주사제형 하이드로겔을 포함하는 의료용 충진제 또는 체내 주입형 지지체(필러)를 제공한다.
또한, 상기 제조된 주사제형 하이드로겔 및 약물을 포함하는 약물전달체를 제공한다.
상기 약물은 상기 하이드로겔 내부에 존재할 수도 있고, 상기 하이드로겔과 혼합된 형태로 존재할 수도 있는데, 상기 하이드로겔 내부에 존재하는 것이 효과적인 약물전달 측면에서 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 약물에 대해서는 전술한 바와 같다.
상기 약물전달체는 서방형 약물 전달체로 사용될 수 있으며, 28일 동안 50% 내지 100%의 누적 약물 방출율을 가질 수 있다. 구체적으로, 상기 약물 전달체는 16일 동안 50% 내지 80%의 누적 약물 방출율을 가질 수 있고, 28일 동안 80% 내지 100%의 누적 약물 방출율을 가질 수 있으므로, 약물이 오랜시간에 걸쳐 서서히 방출되어 장기간 약효가 유지되는 것을 특징으로 한다. 따라서, 약물의 일회/반복 주입에 의한 부작용을 모두 해소할 수 있는 이점을 가진다.
나아가, 본 발명은 상기 주사제형 하이드로겔 또는 상기 약물전달체를, 암, 당뇨 또는 질환 치료에 사용하기 위한 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 주사제형 하이드로겔 또는 상기 약물전달체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 또는 당뇨 질환 치료 방법을 제공한다.
본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1 내지 3. 제1 및 제 2 클릭반응 작용기가 도입되어 특이적 가교된 히알루론산 하이드로겔 제조
(1) 3차 증류수 10 mL에 히알루론산(HA)(분자량: 1,000,000 Da) 100 mg을 투입한 후, 25℃에서 24시간 동안 교반하여 히알루론산 용액을 제조하였고, 이를 바이알에 5 mL씩 나누었다.
(2) 상기 히알루론산 용액이 담겨 있는 바이알에 축합제로서 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 클로라이드(4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride)(DMTMM) 8.3 mg과 메틸테트라진-PEG4-아민(methyltetrazine-PEG4-amine, Tet) 9.93 mg을 투입하고, 25℃에서 24 시간 동안 교반하여 반응시켰다. 다음으로 72 시간 동안 투석한 후, -80℃에서 동결건조시켜 제1 클릭화학 작용기가 도입된 HA-Tet를 제조하였다.
하기 표 1에 나타난 바와 같이, Flash EA1112 장치(CE Instruments, Italy) 원소분석을 통해 제1 클릭화학 작용기가 도입된 HA-Tet에 클릭반응 작용기의 도입된 양을 분석하였다.
(3) 상기와 동일한 방법으로 화학작용기가 도입된 히알루론산을 제조하되, Tet 대신 트랜스-사이클로옥텐-아민(trans-cyclooctene-amine, TCO) 7.7 mg을 투입하여 제2 클릭화학 작용기가 도입된 HA-TCO를 제조하였다.
하기 표 1에 나타난 바와 같이, Flash EA1112 장치(CE Instruments, Italy) 원소분석을 통해 제2 클릭화학 작용기가 도입된 HA-TCO에 클릭반응 작용기의 도입된 양을 분석하였다.
(4) 상기에서 제조된 제1 클릭화학 작용기가 도입된 HA-Tet와 제2 클릭화학 작용기가 도입된 HA-TCO를 각각 2% 생리식염수에 녹인 후, 듀얼실린지에 넣고 주사함으로써 HA-Tet와 HA-TCO를 혼합하여 클릭화학 반응을 유도하였고, 최종적으로 본 발명의 특이적 가교 결합을 통한 히알루론산 하이드로겔을 제조하였다.
(5) 상기에서 제조된 히알루론산 하이드로겔의 가교도는 TCO 또는 Tet가 도입된 수에 따라 조절된다.
Sample㈜ C (%) H (%) N (%) C/N mole ratio 주사제 NO
비교예 1 HA 34.7 5.2 2.9 14.0
실시예 1 HA-Tet250 39.5 5.5 4.4 10.5 Cx-HA-250
HA-TCO250 42.6 5.8 4.0 12.4
실시예 2 HA-Tet500 39.4 5.9 4.5 10.2 Cx-HA-500
HA-TCO500 39.5 5.7 3.9 11.8
실시예 3 HA-Tet1000 40.6 5.5 5.5 8.5 Cx-HA-1000
HA-TCO1000 40.6 6.2 4.4 10.7
* 숫자: 히알루론산(HA) 1몰당 도입된 TCO 또는 Tet 수(250, 500, 1000개)
또한 1H-NMR 분석을 통해 제1 클릭화학 작용기가 도입된 HA-Tet와 제2 클릭화학 작용기가 도입된 HA-TCO의 작용기 도입을 확인하였다(도 2).
실시예 4. 근적외선 형광이미징을 위한 형광물질이 도입된 특이적 가교 히알루론산 하이드로겔 제조
50 mL 둥근바닥 플라스크에서 IR783(80 mg, 0.11 mmol) 및 4-머캅토벤조산(4-mercaptobenzoic acid, 51 mg, 0.33 mmol)을 DMF (3 mL) 에 용해시키고, 실온에서 24 시간 동안 교반하였다. 반응시킨 용액으로부터 미반응 물질 및 불순물을 제거하기 위하여 에탄올과 디에틸에테르(diethyl ether) 혼합 용매(v/v = 1/19) 30 mL에 침전시키고 여과하였다. 여과물로 얻어진 초록색 고체를 진공 건조하여 IR783-COOH를 제조하였다.
다음으로, 상기 실시예 1에서 제조된 제1 클릭화학 작용기가 도입된 HA-Tet 및 제2 클릭화학 작용기가 도입된 HA-TCO를 각각 3차 증류수 10 mL에 투입한 후 용액을 제조하였고, 각각의 바이알에 축합제로서 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 클로라이드(4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride)(DMTMM) 3.3 mg을 투입하였다. 이를 각각 IR783-COOH 10.5 mg이 포함된 3차 증류수 5 mL에 천천히 적하시키면서, 25℃에서 24 시간 동안 교반하여 반응시킨 후, 3일 동안 투석한 다음, -80℃에서 동결건조시켜 제1 클릭화학 작용기와 IR783이 도입된 NIR-HA-Tet 및 제2 클릭화학 작용기와 IR783이 도입된 NIR-HA-TCO를 제조하였다.
실시예 5. 항암제가 함유된 특이적 가교 히알루론산 하이드로겔 제조
상기 실시예 1에서 제조된 제1 클릭화학 작용기가 도입된 HA-Tet(2 mg) 와 제2 클릭화학 작용기가 도입된 HA-TCO(2 mg)를 각각 2% 생리식염수에 녹여 100 μL 용액으로 제조하고, 각각의 용액에 항암제 0.2 mg의 독소루비신(Dox)를 첨가하였다. 1 시간 동안 교반한 후, 각각 교반된 혼합액을, 듀얼실린지를 통해 혼합하여 독소루비신(0.4 mg)이 함유된 특이적 가교 히알루론산 하이드로겔(Cx-HA-Dox)을 최종적으로 수득하였다.
실시예 6. 당뇨질환 치료제가 함유된 특이적 가교 히알루론산 하이드로겔 제조
상기 실시예 1에서 제조된 제1 클릭화학 작용기가 도입된 HA-Tet(2 mg) 와 제2 클릭화학 작용기가 도입된 HA-TCO(2 mg)를 각각 2% 생리식염수에 녹여 100 μL 용액으로 제조하고, 각각의 용액에 인슐린 31.5 IU를 첨가하였다. 1 시간 동안 교반한 후, 각각 교반된 혼합액을, 듀얼실린지를 통해 혼합하여 인슐린(63 IU)이 함유된 특이적 가교 히알루론산 하이드로겔(Insulin-Cx-HA)을 최종적으로 수득하였다.
비교예 1. 히알루론산 하이드로겔 제조
히알루론산을 2% 생리식염수에 녹인 후, 히알루론산 하이드로겔(HA)을 최종 제조하였다.
비교예 2. 형광물질이 도입된 히알루론산 하이드로겔 제조
히알루론산을 2% 생리식염수에 녹인 바이알에 축합제로서 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 클로라이드(4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride)(DMTMM) 3.3 mg을 투입한 후, 상기 실시예 4에서 제조된 IR783-COOH 10.5 mg 포함하는 포함하는 3차 증류수 5 mL에 천천히 적하시키면서, 25℃에서 24 시간 동안 교반하여 반응시킨 후, 3일 동안 투석한 다음, -80℃에서 동결건조시켜 IR783이 도입된 NIR-HA 를 제조하였다.
비교예 3. 항암제가 함유된 히알루론산 하이드로겔 제조
비교예 1에서 제조된 히알루론산 하이드로겔(4 mg)을 2% 생리식염수에 녹여 200 μL 용액으로 제조하고 실린지를 통해 항암제 독소루비신(0.4 mg) 이 함유된 히알루론산 하이드로겔(HA-Dox)을 최종적으로 수득하였다.
비교예 4. 당뇨질환 치료제가 함유된 히알루론산 하이드로겔 제조
비교예 1에서 제조된 히알루론산 하이드로겔 (4 mg)을 2% 생리식염수에 녹여 200 μL 용액으로 제조하고 실린지를 통해 인슐린(63 IU)이 함유된 히알루론산하이드로겔(Insulin-Dox)을 최종적으로 수득하였다.
비교예 5. 제1 및 제 2 클릭반응 작용기가 도입되어 가교된 히알루론산 하이드로겔의 동결 분쇄물 제조
상기 실시예 1에서 클릭화학 반응을 통한-특이적 가교 결합을 통해 제조된 히알루론산 하이드로겔을 대상으로, 동결분쇄기(6700, SPEX Inc., USA)를 이용하여 액체질소 내에서 pre-cooling 50 초/grinding(60 Hz) 240 초/cooling 50초로 3 cycle 조건으로 동결 분쇄하였다(Pulverized-HA).
실험예 1. 하이드로겔의 유변학적 특성 평가
상기 실시예 1에서 클릭화학 반응을 통한-특이적 가교 결합을 통해 제조된 히알루론산 하이드로겔 및 비교예 1에서 제조된 히알루론산 하이드로겔의 유변학적 특성을 평가하고자, Modular Compact Rheometer(MCR 102, Anton Paar, Austria)를 이용하여 모듈러스 및 점도를 측정하였다. 이때, 사용한 평행판(parallel plate)은 직경 25 mm이고, 바닥 면과의 간격은 0.3 mm이며, 25℃에서 strain 2%, 1 Hz 조건으로 수행하였으며, 그 결과는 도 3에 나타내었다.
제조된 하이드로겔의 모듈러스(modulus) 값과 관련하여, 도 3(a)에 나타난 바와 같이, 실시예 1에서 클릭화학 반응을 통한-특이적 가교 결합을 통해 제조된 히알루론산 하이드로겔은 비교예 1에서 제조된 히알루론산 하이드로겔과 거의 동등의 손실 모듈러스(loss modulus)를 가지나, 클릭화학 반응을 통한-특이적 가교 결합을 함으로써 저장 모듈러스(storage modulus)가 현저히 증가하는 것을 확인하였고, 또한 저장 모듈러스의 세기는 클릭 가교도의 증가에 따라 매우 크게 증가하는 것을 알 수 있었다.
또한, 제조된 하이드로겔의 점도와 관련하여, 도 3(b)에 나타난 바와 같이, 실시예 1에서 제조된 히알루론산 하이드로겔은 비교예 1의 히알루론산 하이드로겔 보다 점도가 매우 크게 상승한 것을 확인하였고, 또한 클릭 가교도의 증가에 따라 점도가 현저히 증가함을 확인하였다.
또한, 제조된 하이드로겔을 Modular Compact Rheometer(MCR 102, Anton Paar, Austria)를 이용하여 측정한 탄성과 관련하여, 도 3(c)에 나타난 바와 같이, 실시예 1에서 제조된 히알루론산 하이드로겔은 비교예 1에서 제조된 히알루론산 하이드로겔 보다 매우 큰 탄성을 나타내었고, 또한 클릭 가교도의 증가에 따라 탄성이 현저히 증가함을 확인하였다.
도 3(d)(e)에 나타난 바와 같이, 제1 클릭화학 작용기가 도입된 HA-Tet와 제2 클릭화학 작용기가 도입된 HA-TCO의 클릭화학 반응을 통한-특이적 가교 결합된 하이드로겔(실시예 1, Cx-HA-250)의 손실 모듈러스와 저장 모듈러스는 약 2초에 역전되는 것이 관찰되었다. 이로부터 클릭화학 반응을 통한-특이적 가교 결합은 3초 이내에 발생하는 것을 알 수 있었다.
한편, Cx-HA-500(실시예 2) 및 Cx-HA-100(실시예 3)은 손실 모듈러스와 저장 모듈러스의 역전이 측정과 동시에 관찰되었으며, 클릭반응이 매우 빨라 측정할 수 없는 것을 알 수 있었다.
또한 상기 실시예 1,2,3 에서 제조된 제1 클릭화학 작용기가 도입된 HA-Tet 및 제2 클릭화학 작용기가 도입된 NIR-HA-TCO를 듀얼실린지에 각기 함유하여 주사주입을 하면 실시예 1은 쉽게 주사기를 눌러 주입을 할 수 있으나, 실시예 3의 경우 주입에 더 큰 힘이 필요하였으며, 이로부터 Tet 또는 TCO의 도입량이 증가할수록 가교도가 증가하며 클릭반응이 매우 빠르게 진행되는 것을 알 수 있었다.
실험예 2. 하이드로겔의 점도 특성 평가
상기 실시예 1(Cx-HA-250)과 비교예 2에서 제조된 하이드로겔을 5 ml 바이알에 제조하고, 제조 직후와 2일, 8일, 12일, 28일 경과 된 후 Modular Compact Rheometer(MCR 102, Anton Paar, Austria)를 이용하여 각 하이드로겔의 점도를 측정하였다.
그 결과, 도 3(f)에 나타난 바와 같이, 실시예 1에 따른 클릭화학 반응을 통한-특이적 가교 결합된 하이드로겔은 28일 이상 점도를 유지하나, 비교예 2에서 제조된 플루로닉 하이드로겔은 1일간 점도 유지 후 2일부터 점도가 매우 낮아지고, 3일 이후에는 점도 측정이 되지 않는 용액으로 변화되는 것을 확인하였다.
실험예 3. 하이드로겔의 가교도에 따른 하이드로겔 내부 관찰
상기 실시예 2, 3 및 비교예 1에서 제조된 히알루론산 하이드로겔의 내부 가교도를 평가하기 위하여, 각각의 히알루론산 하이드로겔을 플라즈마 스퍼터링 장치(Plasma-sputtering apparatus, Emitech, K575, Kent, UK)를 이용하여 코팅한 후, 주사전자현미경(FE-SEM; JSM-6700F, JEOL, Tokyo, Japan)으로 하이드로겔 내부 구조를 관찰하였다.
그 결과 도 4에 나타낸 바와 같이, 비교예 1은 내부 하이드로겔 구조들이 뭉쳐서 다공성이 없는 구조인 반면, 실시예 2 및 3 은 일정 다공형태를 유지하고 있는 것을 확인할 수 있었다. 또한 Tet 및 TCO 수가 높아 질수록 다공 사이즈가 작아지고, Tet와 TCO 사이의 가교도가 높아짐을 확인하였다.
실험예 4. 하이드로겔의 물에 대한 스웰링 관찰
상기 실시예 1, 2, 3 및 비교예 1에서 제조된 히알루론산 하이드로겔의 물에 대한 스웰링 특성을 평가하기 위하여, 각각의 히알루론산 하이드로겔 200 μL씩 20 mL 바이알에 넣고 10 mL PBS를 넣은 후 37℃에서 시간별로 하이드로겔의 무게를 측정하여 물에 대한 스웰링도(swelling ratio)를 구하였다. 물에 대한 스웰링도는 하기와 같은 식으로 계산하였다.
물에 대한 스웰링도[Swelling ratio (%)] = [(물을 흡수한 하이드로겔 무게-건조된 하이드로겔 무게)/(건조된 하이드로겔 무게)] x 100
그 결과 도 5에 나타낸 바와 같이, 비교예 1의 히알루론산 하이드로겔은 PBS를 가해 준 후 수 분 이내에 용액화 되어서 물에 대한 스웰링도를 산출할 수 없었으나, 실시예 1에서 제조된 히알루론산 하이드로겔은 매우 큰 물에 대한 스웰링도를 나타내었으며, 클릭가교도의 증가에 따라 물에 대한 스웰링도가 현저히 감소하는 것을 확인하였다.
실험예 5. 하이드로겔 형성 관찰
상기 제조된 HA-Tet 및 HA-TCO를 듀얼실린지에 각각 넣고 쥐의 피하에 100㎕씩 주입하여 피하에서 하이드로겔을 형성시켰다. 그 후 1주일 간격으로 쥐의 피하에서 하이드로겔을 적출하여 관찰하였다. 그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이 4 주 경과 후에도 안정정으로 겔을 형성하고 있는 것을 알 수 있었다.
한편, 비교예 1에서 제조된 히알루론산 하이드로겔을 같은 쥐의 피하에 100㎕씩 주입하여 하이드로겔을 형성시킨 후 관찰하고자 하였으나, 1주 이후부터 겔 형성을 확인할 수 없었다.
실험예 6. 근적외선 형광이미징을 통한 하이드로겔 형성 관찰
상기 실시예 4에서 제조된 제1 클릭화학 작용기와 IR783이 도입된 NIR-HA-Tet 및 제2 클릭화학 작용기와 IR783이 도입된 NIR-HA-TCO를 듀얼실린지에 각기 함유하여 누드 마우스(male, 8주령)의 피하에 1 mL 주사기(21 G)로 0.15 mL 주입하였다. 비교 실험을 위해 비교예 3에서 제조된 NIR-HA을 상기와 동일한 방법으로 누드 마우스에 주입한 후, 각 시간에 따른 형광이미징을 관찰하였다.
그 결과 도 7에 나타낸 바와 같이, 실시예 4에서 제조된 히알루론산 하이드로겔의 형광이미징은 40일 이상 유지(도 7b)되는 반면, 비교예 3에서 제조 주입된 히알루론산 하이드로겔의 형광이미징은 12시간까지 유지되고, 1일 경과 후에는 전혀 관찰되지 않음을 알 수 있었다(도 7c).
실험예 7. 항암제가 함유된 하이드로겔로부터 약물 방출 효과
상기 실시예 5 및 비교예 3에서 제조된 항암제 함유 하이드로겔을 0.5 mL의 PBS에 녹여준 후 24-well Transwell　 plate (SPL Life Science, 0.4 μm pore size)의 upper chamber에 주입한 후 37 ℃, 100 rpm의 shaker에서 시간에 따른 약물의 방출을 확인하였다. 각 시간에 따라 0.5 mL의 용액을 채취 한 후 0.5 mL PBS 용액을 다시 주입하였다. 독소루비신의 방출은 high performance liquid chromatography (HPLC) system (Agilent 1200 series, Waldbronn,Germany)을 사용하여 측정되었다. 독소루비신의 양을 측정하기 위해 479 nm의 파장과 CAPCELL PACK C18 column (5 μm, 4.6 Х 250 mm, Shiseido Co., Ltd., Tokyo, Japan)을 사용하였다. 이동상은 50 mM sodium phosphate와 acetonitrile 를 30:70 (v/v) 으로 혼합한 혼합 용액을 사용하였으며 컬럼은 0.5 mL/min 속도로 추출되었다. In vitro에서 누적 독소루비신 방출율은 standard calibration curve와 비교하여 계산되었다.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 실시예 5에서 제조된 항암제 함유 특이적 가교 하이드로겔(Cx-HA-Dox)은 비교예 3에서 제조된 항암제 함유 하이드로겔(HA-Dox)에 비해, 독소루비신의 서방출이 이루어지는 것으로 확인되며, 16일 동안 누적 독소루비신 방출율이 약 60~70% 정도인 것으로 확인된다.
28일 동안 방출실험 후, 실시예 5에서 제조된 항암제 함유 특이적 가교 하이드로겔(Cx-HA-Dox) 내 남아있는 독소루비신의 함량을 측정한 결과, 그 함량은 약 10.4%인 것으로 확인된다. 그에 따라, 실제 누적 독소루비신 방출율은 약 90%인 것으로 판단된다.
실험예 8. 항암제가 함유된 하이드로겔의 세포 항암 효과
2 x 104 개의 B16F10 melanoma 세포를 24-well Transwell　 plate(SPL Life Science, 0.4 μm pore size)의 각각의 lower chamber에 뿌려준 후 37 ℃, 5% CO2 조건에서 하루동안 인큐베이션하였다. 이후 24-well Transwell　 plate의 upper chamber에 PBS 200 μL, 독소루비신(Dox; 0.4 mg Dox/200 μL), 독소루비신 반복(Dox repeat; 0.1 mg Dox/200 μL), 비교예 1에서 제조된 하이드로겔(HA; 4 mg HA/200 μL), 비교예 3에서 제조된 항암제 함유 하이드로겔(HA-Dox; 4 mg HA, 0.4 mg Dox/200 μL), 실시예 1에서 제조된 특이적 가교 하이드로겔(Cx-HA; 2 mg TET-HA, 2 mg TCO-HA/200 μL), 실시예 5에서 제조된 항암제 함유 특이적 가교 하이드로겔(Cx-HA-Dox; 2 mg TET-HA, 2 mg TCO-HA, 0.4 mg Dox/200 μL)를 넣어주었다. Upper chamber를 세포가 있는 well에 덮어주고 37 ℃, 5% CO2에서 12시간, 24시간, 48시간, 72시간 동안 인큐베이션 하였으며, 12시간 후 초기에 넣어주었던 배지를 교체하였다. 12시간, 24시간, 48시간, 72시간 이후에 in vitro에서 B16F10 세포에 대한 각 제형들의 세포독성을 확인하기 위해 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide; Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) assay를 진행하였다. MTT tetrazolium substrate (50 μg/mL)를 포함하고 있는 100 μL PBS 용액을 각 well에 넣어준 후 37 ℃에서 4시간 동안 인큐베이션 하였다. 이 때 생성된 보라색의 formazan을 녹이기 위해 각 well 당 500 μL DMSO를 주입하고 30분 동안 흔들어 준 후 용액을 96-well plate에 옮긴다. 590 nm의 파장에서 용액의 optical density는 microplate reader (E-max, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 측정되었다.
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 항암제를 함유한 경우, 세포 항암 효과가 탁월히 우수한 것으로 확인된다. 그러나, 항암제를 함유하지 않더라도, 실시예 1에서 제조된 특이적 가교 하이드로겔(Cx-HA)의 경우, 비교예 1에서 제조된 하이드로겔(HA)에 비해, 세포 항암 효과가 향상된 것으로 확인된다.
실험예 9. 항암제가 함유된 하이드로겔의 동물 적용 암 사이즈 비교
암 모델은 BALB/c 마우스(6주, 수컷, 20 g)의 복부에 약 2 Х 105 B16F10 melanoma cells을 100 μL에 현탁시켜 피하 주사하여 만들어졌다. 암의 부피가 150 - 200 mm3 가 되었을 때를 0 d로 하고, 암이 유발된 동물들은 6개 실험군 (1) 대조군(Control), (2) 독소루비신(Dox; 0.4 mg Dox), (3) 독소루비신 반복(Dox repeat; 0.1 mg Dox), (4) 비교예 3에서 제조된 항암제 함유 하이드로겔 (HA-Dox; 0.4 mg Dox), (5) 실시예 5에서 제조된 항암제 함유 특이적 가교 하이드로겔(Cx-HA-Dox; 0.4mg Dox), (6) 비교예 5에서 제조된 특이적 가교 하이드로겔의 동결 분쇄물에 항암제(독소루비신)를 함유한 조성물(Pulverized-HA; 0.4mg Dox)에 할당되었다. 암의 부피가 150 내지 200 mm3 가 되었을 때, 각각의 용액들은 1 mL 실린지와 21-게이지 니들을 사용하여 암 내부로 주입되었다. 이때, 용액의 주입 속도는 주변의 조직으로 용액이 유입되는 것을 막기 위해 10 μL/s 유지하였다. 항 종양 활성도는 사전 정의된 날짜에 Vernier calipers로 2 차원에서 종양 직경을 측정하여 평가하였다. 암의 부피(V)는 V = [length Х (width)2]/2을 사용하여 계산되었다.
그 결과, 도 10 및 11에 나타난 바와 같이, 항암제를 함유한 경우, 항 종양 활성도가 탁월하게 향상된 것으로 확인된다. 특히, 실시예 5에서 제조된 항암제 함유 특이적 가교 하이드로겔(Cx-HA-Dox)의 경우, 비교예 3 에서 제조된 항암제 함유 하이드로겔(HA-Dox) 및 비교에 5에 제조된 항암제 함유 하이드로겔(Pulverized-HA-Dox) 비해, 항 종양 활성도가 더욱 향상되는 것으로 확인되는바, 효과적인 약물전달체로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
실험예 10. 항암제가 함유된 하이드로겔의 동물 적용 항암 약동력학 효과
약물동력학 실험을 진행하기 위해, 1 일, 6 일, 12 일, 18 일에 마우스들을 희생시켰다. 장기(종양, 장, 폐, 신장, 간, 비장 및 심장)들을 즉시 획득하였으며 또한 사진으로 촬영하였다(도 12). 그리고 각 장기들에 남아있는 독소루비신의 양을 측정하기 위해 각 장기들을 T 10 basic ULTRA-TURRAX Homogenizer (IKA　-Werke GmbH & Co., Staufen, Germany)를 사용하여 0.3N HCl/ 70 % ethanol 용액에서 25,000 - 30,000 rpm의 속도로 균일화 한 후 37 ℃ 에서 15분 동안 인큐베이션 시켰다. 균일하게 혼합된 각 샘플들은 동일한 부피의 40% ZnSO4와 이동상을 혼합하여 37 ℃ 에서 15분 동안 다시 인큐베이션시켰다. 인큐베이션이 완료되면 각 샘플들을 2000 rpm의 속도로 10분간 원심분리 한 후 상층액에 포함되어 있는 독소루비신의 양을 standard calibration curve를 참조하여 계산하였다. 각 장기에 포함되어 있는 독소루비신의 양은 UV-visible Spectrophotometers (V-770, JASCO Inc., Tokyo, Japan)을 통하여 측정되었다(도 13).
그 결과, 도 13에 나타난 바와 같이, 독소루비신(Dox) 단독 주입의 경우, 암보다 각종 장기에 빠르게 항암제가 분포되는 문제점이 있는 것으로 확인된다. 한편, 독소루비신 반복 주입(Dox repeat)의 경우, 암에 많은 양의 항암제가 존재하고 또한 독소루비신의 단독 주입에 비해, 각종 장기에 많은 항암제가 잔존하여 영향을 미치는바, 항암제의 반복 주입이 암치료도 동반하지만, 항암제에 의한 각종 부작용을 유발하는 것으로 확인된다.
또한, 비교예 3에서 제조된 항암제 함유 하이드로겔(HA-Dox) 주입의 경우, 항암제가 암의 초기 시간에만 존재하고 빠르게 다른 장기로 분산되는바, 약물전달체로서의 효능이 거의 없는 것으로 확인된다.
그에 반해, 실시예 5에서 제조된 항암제 함유 특이적 가교 하이드로겔(Cx-HA-Dox) 주입의 경우, 항암제가 암에 존재하는 양과 유지하시는 시간이 다른 실험군에 높음이 확인되고, 항암제에 의한 각종 장기에 대한 여러 부작용을 유발하지 않거나 작음이 확인되는바, 효과적인 약물전달체로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
실험예 11. 당뇨질환 치료제가 함유된 하이드로겔 제조
당뇨질환 모델은 streptozotocin (40 mg/kg)을 cirtate buffer (pH 4.5)에 용해하여 꼬리를 통해 주입하였고, 주입후 2일에 380 내지 420의 혈당을 확인하여 당뇨 모델 제조를 확인하였다. 상기 실시예 6 및 비교예 4에서 제조된 당뇨질환 치료제 함유 하이드로겔을 피하에 주사로 주입하였고, 혈중의 피를 아침(10시경)에 18일간 채취하였고, AccuCheck Adcantage meter를 사용하여 혈중 혈당을 측정하였다.
그 결과, 도 14에 나타난 바와 같이, 실시예 6에서 제조된 당뇨질환 치료제 함유 특이적 가교 하이드로겔(Insulin-Cx-HA)의 경우, 비교예 3에서 제조된 항암제 함유 하이드로겔(Insulin-HA)에 비해, 혈중 혈당이 안정적으로 유지되는 것으로 확인되는바, 효과적인 약물전달체로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

Claims (18)

  1. 제1 클릭화학 작용기가 도입된 제1 생체 고분자를 포함하는 제1액; 및
    제2 클릭화학 작용기가 도입된 제2 생체 고분자를 포함하는 제2액을 포함하고,
    상기 제1 클릭화학 작용기 및 상기 제2 클릭화학 작용기가 화학적으로 결합가능한 것을 특징으로 하는
    주사제형 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제1클릭화학 작용기는 알카인기, 에폭시기, 아크로일기 및 테트라진기 중에서 선택되는 1종 이상이고, 상기 제2클릭화학 작용기는 아자이드기, 싸이올기, 아민기 및 사이클로옥텐기 중에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 주사제형 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 제1 클릭화학 작용기 및 상기 제2 클릭화학 작용기의 조합은 (알카인기, 아자이드기), (알카인기, 싸이올기), (에폭시기, 아민기), (에폭시기, 싸이올기), (아크로일기, 아민기), (아크로일기, 싸이올기) 및 (테트라진, 사이클로옥텐) 중에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 주사제형 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 제1 생체 고분자 및 상기 제2 생체 고분자는 서로 동일하거나, 상이하고, 각각 독립적으로 히알루론산, 소장점막하 조직, 카복시메틸셀룰로스, 알지네이트, 키토산, 플루로닉, 폴리아크릴아미드, 폴리(N-이소프로필아크릴아미드) 및 β-글리세로포스페이트 중에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 주사제형 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 제1 액 및 상기 제2액에, 약물을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 주사제형 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 약물은 독소루비신(doxorubicin), 시스플라틴(cisplatin), 파클리탁셀(paclitaxel), 빈크리스틴(vincristine), 토포테칸(topotecan), 도세탁셀(docetaxel), 5-플루오로우라실(5-FU), 글리벡(gleevec), 카보플라틴(carboplatin), 두아노루비신(daunorubicin), 발루비신(valrubicin), 플로타미드(flutamide) 및 젬시타빈(gemcitabine) 중에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 항암제; 또는 인슐린 또는 인슐린친화성(insulinotropic) 펩타이드를 포함하는 당뇨질환 치료제를 포함하는 것을 특징으로 하는, 주사제형 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 제1 생체 고분자 1 몰 당 도입된 제1 클릭화학 작용기의 수; 또는 상기 제2 생체 고분자 1 몰 당 도입된 제2 클릭화학 작용기의 수는 100개 내지 2000개인 것을 특징으로 하는, 주사제형 조성물.
  8. (a) 제1생체 고분자에 제1 클릭화학 작용기 포함 물질을 투입하여 제1액을 제조하는 단계;
    (b) 제2생체 고분자에 제2 클릭화학 작용기 포함 물질을 투입하여 제2액을 제조하는 단계; 및
    (c) 상기 제1액 및 제2액을 반응시켜, 제1 클릭화학 작용기 및 상기 제2 클릭화학 작용기를 화학적으로 결합시키는 것을 특징으로 하는, 주사제형 하이드로겔의 제조방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서 제1 클릭화학 작용기 포함 물질은 아미노-PEG4-알카인(amino-PEG4-alkyne), 알카인-PEG5-에시드(alkyne-PEG5-acid), 알카인-PEG-아민(alkyne-PEG-amine), 옥시라닐아민(oxiranylamine), 2-옥시라닐-에틸아민(2-oxiranyl-ethylamine), 아크릴아마이드(acrylamide), 아르킬릭 에시드(acrylic acid), 아크릴로일 클로라이드(acryloyl chloride), 메틸테트라진-아민(methyltetrazine-amine), 메틸테트라진-PEG4-아민(methyltetrazine-PEG4-amine), 메틸테트라진-프로필아민(methyltetrazine-propylamine), 테트라진-PEG5-NHS 에스터(tetrazine-PEG5-NHS ester), 메틸테트라진-PEG4-NHS 에스터(methyltetrazine-PEG4-NHS ester), 메틸테트라진-실포-NHS 에스터(methyltetrazine-silfo-NHS ester), 메틸테트라진-PEG4-에시드(methyltetrazine-PEG4-acid), 메틸테트라진-PEG12-NHS 에스터(methyltetrazine-PEG12-NHS ester), 메틸테트라진-NHS 에스터(methyltetrazine-NHS ester), 메틸테트라진-에시드(methyltetrazine-acid) 및 테트라진-에시드(tetrazine-acid) 중에서 선택되는 1종 이상이고,
    상기 (b) 단계에서 제2 클릭화학 작용기 포함 물질은 아자이드-PEG4-아민(azide-PEG4-amine), 3-아미노-1-프로판싸이올(3-amino-1-propanethiol), 11-메르캅토운데카노익 에시드(11-mercaptoundecanoic acid), 아미노-메탈싸이올(Amino-methanethiol), 싸이올 PEG 아민(thiol PEG amine), 에틸렌 디아민(ethylene diamine), PEG 디아민(PEG diamine), (S)-3-아미노-2-(히드록시메틸)프로피오닉 에시드((S)-3-amino-2-(hydroxymethyl)propionic acid), 아미노-아세틱 에시드(amino-acetic acid), 트랜스-사이클로옥텐 아민(transcyclooctene-amine), 트랜스-사이클로옥텐-NHS 에스터(trans-cyclooctene-NHS ester), 트랜스 사이클로옥텐-PEG-NHS 에스터(trans cyclooctene-PEG-NHS ester) 및 트랜스 사이클로옥텐-PEG4-에시드(trans cyclooctene-PEG4-acid) 중에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 주사제형 하이드로겔의 제조방법.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 (a) 단계 또는 상기 (b) 단계에서 축합제 또는 약물을 추가로 투입하는 것을 특징으로 하는, 주사제형 하이드로겔의 제조방법.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 주사제형 하이드로겔의 0.1 Hz 내지 10 Hz의 주파수 범위에서, 레오미터를 이용하여 측정된 저장탄성률(G')은 2.00 Х 102 Pa 내지 2.00 Х 103 Pa 인 것을 특징으로 하는, 주사제형 하이드로겔의 제조방법.
  12. 제8항에 있어서,
    상기 주사제형 하이드로겔의 25℃에서 복합 점도는 3.00 Х 101 Pa·s 내지 3.0 Х 102 Pa·s 인 것을 특징으로 하는, 주사제형 하이드로겔의 제조방법.
  13. 제8항에 있어서,
    상기 주사제형 하이드로겔은 다공 형태인 것을 특징으로 하는, 주사제형 하이드로겔의 제조방법.
  14. 제8항에 있어서,
    상기 주사제형 하이드로겔의 물에 대한 스웰링도(swelling ratio)는 2,000% 내지 10,000%인 것을 특징으로 하는, 주사제형 하이드로겔의 제조방법.
  15. 제8항에 따라 제조된 주사제형 하이드로겔을 포함하는 의료용 충진제 또는 체내 주입형 지지체.
  16. 제8항에 따라 제조된 주사제형 하이드로겔 및 약물을 포함하는 약물전달체.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 약물은 독소루비신(doxorubicin), 시스플라틴(cisplatin), 파클리탁셀(paclitaxel), 빈크리스틴(vincristine), 토포테칸(topotecan), 도세탁셀(docetaxel), 5-플루오로우라실(5-FU), 글리벡(gleevec), 카보플라틴(carboplatin), 두아노루비신(daunorubicin), 발루비신(valrubicin), 플로타미드(flutamide) 및 젬시타빈(gemcitabine) 중에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 항암제; 또는 인슐린 또는 인슐린친화성(insulinotropic) 펩타이드를 포함하는 당뇨 질환 치료제를 포함하는 것을 특징으로 하는, 약물전달체.
  18. 제16항에 있어서,
    상기 약물전달체는 28일 동안 50% 내지 100%의 누적 약물 방출율을 가지는 것을 특징으로 하는, 약물전달체.
PCT/KR2019/007631 2018-05-08 2019-06-25 클릭화학 반응을 통해 필러 또는 약물전달체로 사용하기 위한 주사제형 조성물 WO2019216744A2 (ko)

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