KR20210150496A - 개선된 컨쥬게이션 링커 - Google Patents

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KR20210150496A
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게리 더블유. 애슐리
브라이언 헌
숀 폰테인
에릭 엘. 슈나이더
Original Assignee
프로린크스 엘엘시
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Abstract

소분자, 펩타이드, 및 단백질의 컨쥬게이션에 적합한 β제거 링커 및 상기 링커를 포함하는 화합물이 제공된다.

Description

개선된 컨쥬게이션 링커
관련 출원의 상호 참조
[1] 본 출원은 2019년 4월 15일자, 미국 가출원번호 제62/830,280호의 우선권을 주장하며, 상기 문헌은 본 명세서에 그 전체가 참조 문헌으로 포함된다.
서열 목록의 참조에 의한 포함
[2] 본 출원은 전자 형식의 서열 목록과 함께 출원된다. 서열 목록은 2020년 4월 3일 작성된, 2,112 byte 크기의 파일명 670572002140SeqList.txt으로 제공된다. 전자 형식의 서열 목록에 있는 정보는 본 출원에 그 전체가 참조로 포함된다.
분야
[3] 본 발명은 일반적으로 소분자, 펩타이드, 올리고뉴클레오타이드, 및 단백질의 컨쥬게이션에 적합한 β제거 링커, 및 상기 링커를 포함하는 화합물에 관한 것이다.
[4] 약물 분자는 반감기, 안정성, 용해도, 내약성, 및 안전성과 같은 약학적 성질을 향상시키기 위해 거대분자 담체에 공유결합된다. 미국 특허 8,680,315, 8,754,190, 및 9,649,385는 속도가 제어된, 베타-제거 메커니즘을 통해 약물을 방출시키는, β제거 링커를 가지는 약물 컨쥬게이트 시스템을 개시한다. 그러나, 방출된 약물 또는 절단된 가교와 함께, β-제거(β-elimination) 공정은 알케닐 기를 포함하는 거대분자 담체에 결합된 링커 잔기를 생성하는데, 이는 친핵성 첨가에 대해 활성화될 수 있다. 도 1에 도시된 바와 같이, 생리학적 조건하에서 이러한 첨가에 대한 잠재적인 친핵체로는 싸이올 및 아민, 예를 들어, 단백질에 상당한 양으로 존재하는 것들, 또는 더욱 바람직하게 하이드로겔에서 가교 절단으로부터 방출되는 아민을 포함한다. 아민은 양성자화되어 생리학적 pH에서 반응성이 없을 것으로 예상되지만, 이러한 아자-마이클 첨가가 적어도 시험관 내 설정에서 발생한다는 것이 예기치 않게 발견되었다. 이전에 개시된 링커 (즉, 미국 특허 8,680,315 및 8,754,190)는 도 2에 도시된 바와 같이 이탈 산소 (미국 특허 8,680,315에서 화학식(I)의 R5 기에 해당)를 가지는 탄소 상의 알킬 기의 첨가를 통해 이러한 원하지 않는 반응을 완화시키는 수단을 제공한다. 원하지 않는 아자-마이클(Aza-Michael) 첨가를 더욱 효과적으로 억제할 수 있는 개선된 링커가 필요하다.
[5] 하나의 양태에서, 화학식(I)의 링커
Figure pct00001
(I),
가 제공되며, 여기서 n, R1, R2, R4, X, 및 Z는 본 명세서에 개시된 바와 같다. 일부 구현예에서, 링커는 β제거 링커이다. 일부 구현예에서, β제거 링커는 소분자, 펩타이드, 및 단백질 치료제의 컨쥬게이션에 적합하다.
[6] 또 다른 양태에서, 화학식(II)의 링커-약물
Figure pct00002
(II),
이 제공되며, 여기서 n, R1, R2, R4, Y, Z, 및 D는 본 명세서에 개시된 바와 같다. 일부 구현예에서, 화학식(II)의 링커-약물은 화학식(I)의 링커를 소분자, 펩타이드, 또는 단백질 치료제와 같은 약물과 조합하여 제조된다.
[7] 또 다른 양태에서, 화학식(III)의 컨쥬게이트
Figure pct00003
(III),
가 제공되며, 여기서 n, R1, R2, R4, Y, Z*, 및 D는 본 명세서에 개시된 바와 같다. 일부 구현예에서, 화학식(III)의 컨쥬게이트는 화학식(I)의 링커를 통해 거대분자 담체 M에 방출가능하게 연결된 약물 D의 컨쥬게이트이다.
[8] 또 다른 양태에서, 화학식(IV)의 하이드로겔,
Figure pct00004
(IV),
이 제공되며, 여기서 n, r, R1, R2, R4, W, Z*, P1, 및 P2는 본 명세서에 개시된 바와 같다. 일부 구현예에서, 화학식(IV)의 화합물은 분해성 가교 하이드로겔이다. 일부 구현예에서, 분해성 가교 하이드로겔은 화학식(I)의 링커의 잔기를 포함한다.
[9] 또 다른 양태에서, 화학식(I), (II), (III), 및 (IV)의 화합물의 제조 방법, 및 이의 사용 방법이 제공된다. 또 다른 양태에서, 화학식(III)의 컨쥬게이트 또는 화학식(IV)의 하이드로겔을 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
[10] 도 1은 컨쥬게이트에서 미국 특허 9,649,385에 개시된 카바메이트 링커의 절단을 예시한다. 온전한 컨쥬게이트(1)는 pH-의존적 베타-제거 반응을 거쳐, 링커가 절단되고 링커 잔여부(2)와 함께 유리 아민(3)이 형성된다. 이러한 생성물은 후속의 가역적 아자-마이클 반응을 거쳐 상대적으로 안정한 재첨가 부가물(4)을 형성할 수 있다. R이 아민-함유 약물 또는 전구약물인 경우, 링커는 약물-방출 링커이다. R이 제2 PEG 예비중합체인 경우, 링커는 PEG 하이드로겔의 가교제의 일부이다.
[11] 도 2은 두 개의 R5 기 모두가 알킬인 컨쥬게이트에서 미국 특허 9,649,385에 개시된 카바메이트 링커의 절단을 예시한다. R5에서 알킬 기에 의한 입체 장애는 재첨가 공정을 느리게 할것으로 예상된다.
[12] 도 3은 컨쥬게이트에서 본 명세서에서 개시된 γ이치환된 카바메이트 링커의 절단을 예시한다.
[13] 도 4는 다양한 pH 값에서 링커 비닐 설폰에 대한 글리신의 아자-마이클 첨가 속도를 도시한다. Std, β및 젬 diMe 링커에 대한 글리신 부가물 농도 (mM) 대 시간 (h)의 Prism 플롯: A) pH 7.4, 1.0 M 글리신; B) pH 8.4, 1.0 M 글리신; C) pH 9.5, 0.1 M 글리신. kf, kr, 및 Keq를 비롯한 각 실혐의 표 데이터는 방법 섹션에 기재된 바와 같이 계산하였다.
[14] 도 5는 βN-글리실 메틸 설폰으로부터 글리신의 레트로-아자-마이클 제거의 속도를 도시한다. A) 각각의 링커에 대한 레트로-아자-마이클 반응 개략도. B) 글리신 부가물 농도 (μM) 대 시간 (h)의 Prism 플롯. Std 링커, kobs = 0.0030 h-1; β링커, kobs = 0.0050 h-1; 젬 diMe 링커 kobs = 0.0060 h-1. 각각의 링커에 대해, 계산된 [Gly-부가물]equil은 ≤ 1μM이다.
[15] 도 6은 화학식(IV)의 가교 결합을 포함하는 하이드로겔의 예시적인 구조를 도시한다.
[16] 도 7은 화학식(IV)의 가교 결합을 포함하는 약물-방출 하이드로겔의 예시적인 구조를 도시한다. 화학식(II)의 링커-약물 (L-D)은 반응성 B 기를 통해 하이드로겔에 부착된다.
[17] 도 8은 실시예 18의 엑세나타이드-방출 하이드로겔 마이크로스피어 컨쥬게이트로부터 방출된 엑세나타이드[N28Q]의 혈장 농도를 도시한다. 쥐 (n=3)에게 제0일에 9.2 μmol/kg의 엑세나타이드[N28Q]를 포함하는 컨쥬게이트 현탁액을 피하 주사하였다. 플라즈마 샘플을 수득하여 LC/MS으로 분석하였다. 컨쥬게이트는 엑세나타이드[N28Q]에 주사 후 적어도 84일 동안 지속적으로 노출되었으며, 방출 t1/2는 750 시간 (31일)을 나타냈다.
[18] 도 9는 실시예 17의 인슐린 리스프로-방출 하이드로겔 마이크로스피어 컨쥬게이트로 처리된 STZ-유도 당뇨병 마우스에서 측정된 혈당을 도시한다. 당뇨병을 유도하기 위해 마우스를 스트렙토조토신으로 처리한 다음, 제0일 및 제7일에 1.2 μmol/kg (저용량, 사각형) 또는 4.8 μmol/kg (고용량, 삼각형)의 인슐린 리스프로를 포함하는 컨쥬게이트 현탁액을 피하주사하였다. 비히클 대조군 (원)은 비-펩타이드 보유 마이크로스피어로 구성되었다. 혈액 샘플을 채취하여 혈당에 대해 분석하였다. 저용량은 주사 후 1일 동안 혈당을 억제하는 반면, 고용량은 주사 후 5일 동안 혈당을 억제하였다. 효과는 두 번째 투여 시에도 반복되었다.
[19] 도 10은 실시예 17의 인슐린 리스프로-방출 하이드로겔 마이크로스피어 컨쥬게이트로 처리된 STZ-유도 당뇨병 마우스에서 측정된 체중을 도시한다. 당뇨병을 유도하기 위해 마우스를 스트렙토조토신으로 처리한 다음, 제0일 및 제7일에 1.2 μmol/kg (저용량, 사각형) 또는 4.8 μmol/kg (고용량, 삼각형)의 인슐린 리스프로를 포함하는 컨쥬게이트 현탁액을 피하주사하였다. 비히클 대조군 (원)은 비-펩타이드 보유 마이크로스피어로 구성되었다. 저용량 및 고용량 컨쥬게이트 모두 동물 체중유지한 반면, 비히클 대조군은 6 일에 걸쳐 17% 감소하였다.
[20] 이전에 개시된 β제거 링커와 비교하여, 원하지 않는 아자-마이클 첨가가 본 명세서에 개시된 링커에 의해 훨씬 더 효과적으로 억제될 수 있는 것을 발견하였으며, 이러한 링커는 도 3에 도시된 바와 같이, 이탈 산소를 가지는 탄소에 인접한 이중-치환된(geminally-substituted) 탄소, 즉, 감마-탄소를 포함한다. 본 명세서에 개시된 생성된 화학식(I)의 링커는 링커 잔여부(linker remnant)에 대한 친핵체의 첨가 속도가 크게 억제되고, 생성된 평형 상수는 이에 상응하여 상당히 낮은 컨쥬게이트를 제공한다.
정의
[21] 본 명세서에서 사용 시, 달리 명확하게 지시되지 않는 한 단수형 용어 (“a”“an”등)의 사용은 하나 이상을 지칭한다.
[22] 본 명세서에서 사용 시, 달리 명시되지 않는 한, 용어 “약”은 값과 관련되어 사용될 때, 15% 이내, 10% 이내, 5% 이내, 4% 이내, 3% 이내, 2% 이내, 1% 이내, 또는 0.5% 이내의 값을 고려한다.
[23] 용어 “알킬”은 1-20, 1-12, 1-8, 1-6, 또는 1-4개 탄소 원자의 선형, 분지형, 또는 사이클릭 포화 탄화수소 기를 포함한다. 일부 구현예에서, 알킬은 선형 또는 분지형이다. 선형 또는 분지형 알킬 기의 예로는, 메틸, 에틸, n-프로필, 아이소프로필, n-뷰틸, t-뷰틸, 아이소뷰틸, sec-뷰틸, n-펜틸, n-헥실, n-헵틸, n-옥틸, n-노닐, n-데실, 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 알킬은 사이클릭이다. 사이클릭 알킬 기의 예로는 사이클로프로필, 사이클로뷰틸, 사이클로펜틸, 사이클로펜타다이에닐, 사이클로헥실, 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
[24] 용어 “알콕시”는 산소에 결합된 알킬 기를 포함하며, 메톡시, 에톡시, 아이소프로폭시, 사이클로프로폭시, 사이클로뷰톡시, 등을 포함한다.
[25] 용어 “알케닐”은 2-20, 2-12, 2-8, 2-6, 또는　2-4개 탄소 원자의, 탄소-탄소 이중 결합을 가지는 비-방향족 불포화 탄화수소를 포함한다.
[26] 용어 “알키닐”은 2-20, 2-12, 2-8, 2-6, 또는　2-4개 탄소 원자의, 탄소-탄소 삼중 결합을 가지는 비-방향족 불포화 탄화수소를 포함한다.
[27] 용어 “아릴”은 6-18개 탄소, 바람직하게 6-10개 탄소의 방향족 탄화수소 기를 포함하며, 페닐, 나프틸, 및 안트라세닐과 같은 기를 포함한다. 용어 “헤테로아릴”은 N, O 또는 S 원자 중 적어도 하나를 함유하는 3-15개 탄소, 바람직하게 N, O 또는 S 원자 중 적어도 하나를 포함하는　3-7개 탄소를 포함하는 방향족 고리를 포함하며, 피롤릴, 피리딜, 피리미디닐, 이미다졸릴, 옥사졸릴, 아이속사졸릴, 싸이아졸릴, 아이소싸이아졸릴, 퀴놀릴, 인돌릴, 인데닐, 등과 같은 기를 포함한다.
[28] 일부 경우에, 알케닐, 알키닐, 아릴 또는 헤테로아릴 모이어티는 알킬 연결부를 통해 분자의 나머지 부분에 커플링될 수 있다. 이러한 경우, 치환체는 알케닐알킬, 알키닐알킬, 아릴알킬 또는 헤테로아릴알킬로서 지칭될 것이며, 이는 알킬렌 모이어티거 알케닐, 알키닐, 아릴 또는 헤테로아릴 모이어티와, 알케닐, 알키닐, 아릴 또는 헤테로아릴이 커플링되는 분자 사이에 있음을 나타낸다.
[29] 용어 “할로겐” 또는 “할로”는 브로모, 플루오로, 클로로 및 아이오도를 포함한다.
[30] 용어 “헤테로사이클릭 고리” 또는 “헤테로사이클릴”은 N, O, 또는 S 원자 중 적어도 하나를 포함하는 3-15 원 방향족 또는 비방향족 고리를 지칭한다. 예시로는 피페리디닐, 피페라지닐, 테트라하이드로피라닐, 피롤리딘, 및 테트라하이드로퓨라닐, 뿐만 아니라 상기 용어 “헤테로아릴”에 대해 제공된 예시적인 기를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릭 고리 또는 헤테로사이클릴은 비방향족이다. 일부 구현예에서, 헤테로사이클릭 고리 또는 헤테로사이클릴은 방향족이다.
[31] 용어 “거대분자”는 분자량이 5,000 내지 1,000,000 달톤, 바람직하게 10,000 내지 500,000 달톤, 및 더욱 바람직하게 10,000 내지 250,000 달톤인 분자 또는 분자의 잔기를 지칭한다. 거대분자의 예로는 항체, 항체 단편, 및 효소를 비롯한 단백질; 폴리(아미노산) 예컨대 폴리(라이신) 및 폴리(발린) 및 혼합-서열 폴리펩타이드를 비롯한 폴리펩타이드; 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG), 폴리(에틸렌 옥사이드) (PEO), 폴리(에틸렌 이민) (PEI), 및 이의 공중합체를 비롯한 합성 중합체; 및 덱스트란과 같은 다당류를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 거대분자는 천연적으로 또는 화학적 변형 후, 컨쥬게이션에 적합한 적어도 하나의 작용기, 예컨대 상기 기재된 바와 같은 아민, 카복실 산, 알코올, 싸이올, 알킨, 아자이드, 또는 말레이미드 기를 포함한다. 본 발명의 특정 구현예에서, 거대분자는 폴리에틸렌 글리콜이다. 폴리에틸렌 글리콜은 선형 또는 분지형일 수 있으며, 한쪽 말단은 컨쥬게이션에 적합한 작용기로 종결되고 다른 말단 또는 말단들은 캡핑 기 (예를 들어, 메틸)로 종결되거나, 또는 다중 아암(arm)을 포함하여, 각각의 아암이 컨쥬게이션에 적합한 작용기로 종결되는 것일 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 폴리에틸렌 글리콜은 평균 분자량이 20,000 내지 200,000 달톤, 바람직하게 20,000 내지 100,000 달톤, 및 가장 바람직하게 대략 40,000 달톤인 선형, 분지형, 또는 다중-아암 중합체이다. 이러한 폴리에틸렌 글리콜은 기술 분야 내 공지되어 있으며, 예를 들어 NOF Corporation (일본, 도쿄)로부터 상업적으로 입수 가능하다.
[32] 용어 “단백질” 및 “펩타이드”는 사슬 길이와 관계 없이 상호교환적으로 사용되고, 이러한 용어는 슈도펩타이드를 추가적으로 포함할 수 있으며, 이는 아마이드 연결부가 아닌 다른 연결부, 예컨대 CH2NH2 연결부 뿐만 아니라 펩타이드 모방체를 포함한다.
[33] 용어 “핵산” 및 “올리고뉴클레오타이드”는 또한 사슬 길이와 관계없이 상호교환적으로 사용된다. 핵산 또는 올리고뉴클레오타이드는 단일-사슬 또는 이중 가닥일 수 있거나 또는 DNA, RNA, 또는 포스포다이에스터, 포스포라미데이트, 등과 같이 연결부가 변형된 이의 변형된 형태일 수 있다. 본 발명에서 약물로서 유용한 단백질 및 핵산 모두에 대해, 이러한 용어는 또한 단백질의 경우에 자연에서 발견되지 않는 곁사슬을 가지는 것들, 뿐만 아니라 핵산의 경우에 자연에서 발견되지 않는 슈도펩타이드 결합 및 염기, 뿐만 아니라 펩타이드 핵산과 같은 백본 변형체를 포함한다.
[34] 약물의 맥락에서 용어 “소분자”는 기술 분야 내에서 잘 이해되는 용어이며, 합성되거나 또는 천연으로부터 분리되고 일반적으로 단백질 또는 핵산과 유사하지 않은, 단백질 및 핵산이 아닌 다른 화합물을 포함하는 것을 의미한다. 일반적으로, 분자량이 1,000 미만이지만, 특정 컷오프가 인식되지는 않는다. 그럼에도 불구하고, 이러한 용어는 약리학 및 의학 분야에서 잘 이해된다.
[35] “임의 치환된”은, 달리 명시되지 않는 한, 기(group)가 동일하거나 또는 상이한 하나 이상의 (예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5 개의) 치환기로 치환되거나 또는 비치환될 수 있음을 의미한다. 치환기의 예로는, 비제한적으로, 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로겐, -CN, -ORaa, -SRaa, -NRaaRbb, -NO2, -C=NH(ORaa), -C(O)Raa, -OC(O)Raa, -C(O)ORaa, -C(O)NRaaRbb, -OC(O)NRaaRbb, -NRaaC(O)Rbb, -NRaaC(O)ORbb, -S(O)Raa, -S(O)2Raa, -NRaaS(O)Rbb, -C(O)NRaaS(O)Rbb, -NRaaS(O)2Rbb, -C(O)NRaaS(O)2Rbb, -S(O)NRaaRbb, -S(O)2NRaaRbb, -P(O)(ORaa) (ORbb), 헤테로사이클릴, 헤테로아릴, 또는 아릴을 포함하되, 여기서 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 헤테로아릴, 및 아릴은 각각 독립적으로 Rcc으로 임의 치환되고, 여기서
Raa 및 Rbb는 각각 독립적으로 H, 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로사이클릴, 헤테로아릴, 또는 아릴이거나, 또는
Raa 및 Rbb는 이들이 부착되는 질소 원자와 함께 헤테로사이클릴을 형성하는데, 이는 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로겐, 하이드록실, 알콕시, 또는 -CN으로 임의 치환되고, 여기서:
각각의 Rcc는 독립적으로 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로겐, 헤테로사이클릴, 헤테로아릴, 아릴, -CN, 또는 -NO2이다.
[36] 일반적으로, 약물의 활성 형태는 본 발명의 컨쥬게이트로부터 직접적으로 방출되지만, 일부 경우에, 이의 전구약물 형태로 활성 약물을 방출하는 것이 가능하다.
링커
[37] 하나의 양태에서, 본 명세서에는 화학식(I)의 링커,
Figure pct00005
(I),
가 제공되며, 여기서:
n은 0 내지 6의 정수이고;
R1 및 R2는 독립적으로 전자-끄는 기, 알킬, 또는 H이되, 여기서 R1 및 R2 중 적어도 하나는 전자-끄는 기이고;
각각의 R4는 독립적으로 C1-C3 알킬이거나 또는 두 개의 R4는 이들이 부착되는 탄소 원자와 함께 3-6 원 고리를 형성하고;
X는 이탈기이고;
Z는 링커를 거대분자 담체에 연결하기 위한 작용기이다.
[38] 화학식(I)의 링커의 일부 구현예에서, n = 1-6이고, R1 및 R2는 독립적으로 전자-끄는 기, 알킬, 또는 H이되, 여기서 R1 및 R2 중 적어도 하나는 전자-끄는 기이고; 각각의 R4는 독립적으로 C1-C3 알킬이거나 또는 함께 3-6 원 고리를 형성할 수 있고; X는 할로겐, 활성 에스터 예컨대 N-석신이미딜옥시, 나이트로페녹시, 또는 펜타할로페녹시, 또는 이미다졸릴, 트라이아졸릴, 테트라졸릴, 또는 N(R6)CH2Cl이되, 여기서 R6는 임의 치환된 C1-C6 알킬, 임의 치환된 아릴, 또는 임의 치환된 헤테로아릴이고; Z는 링커를 거대분자 담체에 연결하기 위한 작용기이다.
[39] 일부 구현예에서, R1 및 R2의 전자-끄는 기는
-CN;
-NO2;
임의 치환된 아릴; 임의 치환된 헤테로아릴;
임의 치환된 알케닐;
임의 치환된 알키닐;
-COR3, -SOR3, 또는 -SO2R3이되,
여기서 R3는 H, 임의 치환된 알킬, 임의 치환된 아릴, 임의 치환된 아릴알킬, 임의 치환된 헤테로아릴, 임의 치환된 헤테로아릴알킬, -OR8 또는 -NR8 2이되 여기서 각각의 R8은 독립적으로 H 또는 임의 치환된　알킬이거나, 또는 두 개의 R8 기 모두 이들이 부착되는 질소 원자와 함께 헤테로사이클릭 고리를 형성하거나; 또는
SR9이되 여기서 R9은 임의 치환된 알킬, 임의 치환된 아릴, 임의 치환된 아릴알킬, 임의 치환된 헤테로아릴, 또는 임의 치환된 헤테로아릴알킬이다.
[40] 일부 구현예에서, R1 및 R2의 전자-끄는 기는 -CN이다. 일부 구현예에서, R1 및 R2의 전자-끄는 기는 -NO2이다. 일부 구현예에서, R1 및 R2의 전자-끄는 기는 6-10개의 탄소를 함유하는 임의 치환된 아릴이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, R1 및 R2의 전자-끄는 기는 임의 치환된 페닐, 나프틸, 또는 안트라세닐이다. 일부 구현예에서, R1 및 R2의 전자-끄는 기는 3-7개의 탄소를 포함하고 N, O, 또는 S 원자 중 적어도 하나를 포함하는 임의 치환된 헤테로아릴이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, R1 및 R2의 전자-끄는 기는 임의 치환된 피롤릴, 피리딜, 피리미디닐, 이미다졸릴, 옥사졸릴, 아이속사졸릴, 싸이아졸릴, 아이소싸이아졸릴, 퀴놀릴, 인돌릴, 또는 인데닐이다. 일부 구현예에서, R1 및 R2의 전자-끄는 기는 2-20개의 탄소 원자를 포함하는 임의 치환된 알케닐이다. 일부 구현예에서, R1 및 R2의 전자-끄는 기는 2-20개의 탄소 원자를 포함하는 임의 치환된 알키닐이다. 일부 구현예에서, R1 및 R2의 전자-끄는 기는 -COR3, -SOR3, 또는 -SO2R3, 이되 여기서 R3는 H, 1-20개의 탄소 원자를 포함하는 임의 치환된 알킬, 임의 치환된 아릴, 임의 치환된 아릴알킬, 임의 치환된 헤테로아릴, 임의 치환된 헤테로아릴알킬, -OR8 또는 -NR8 2이되 각각의 R8은 독립적으로 H 또는 1-20개의 탄소 원자를 포함하는 임의 치환된　알킬이거나, 또는 두 개의 R8 기 모두 이들이 부착되는 질소 원자와 함께 헤테로사이클릭 고리를 형성한다. 일부 구현예에서, R1 및 R2의 전자-끄는 기는 -SR9이되 여기서 R9은 1-20 개의 탄소 원자를 포함하는 임의 치환된 알킬, 임의 치환된 아릴, 임의 치환된 아릴알킬, 임의 치환된 헤테로아릴, 또는 임의 치환된 헤테로아릴알킬이다.
[41] 화학식(I)의 링커의 일부 구현예에서, R1 및 R2 중 적어도 하나는 -CN, -SOR3 또는 -SO2R3이다. 일부 구현예에서, R1 및 R2 중 적어도 하나는 -CN 또는 -SO2R3이다. 일부 구현예에서, R1 및 R2 중 적어도 하나는 -CN 또는 -SO2R3이되 R3는 임의 치환된 알킬, 임의 치환된 아릴, 또는 -NR8 2이다. 일부 구현예에서, R1 및 R2 중 적어도 하나는 -CN, -SO2N(CH3)2, -SO2CH3, -SO2Ph, -SO2PhCl, -SO2N(CH2CH2)2O, -SO2CH(CH3)2, -SO2N(CH3)(CH2CH3), 또는 -SO2N(CH2CH2OCH3)2이다.
[42] 화학식(I)의 링커의 일부 구현예에서, 각각의 R4는 독립적으로 C1-C3 알킬이다. 일부 구현예에서, 두 개의 R4 모두는 메틸이다.
[43] 화학식(I)의 링커의 일부 구현예에서, n은 1 내지 6의 정수이다. 일부 구현예에서, n은 1 내지 3의 정수이다. 일부 구현예에서, n은 0 내지 3의 정수이다. 일부 구현예에서, n은 1이다. 일부 구현예에서, n은 2이다. 일부 구현예에서, n은 3이다.
[44] 화학식(I)의 링커의 일부 구현예에서, X는 할로겐, 활성 에스터 (예를 들어, N-석신이미딜옥시, 나이트로페녹시, 또는 펜타할로페녹시), 임의 치환된 헤테로아릴 (예를 들어, 이미다졸릴, 트라이아졸릴, 또는 테트라졸릴), 또는 -N(R6)CH2Cl이되 R6는 임의 치환된 C1-C6 알킬, 임의 치환된 아릴, 또는 임의 치환된 헤테로아릴이다. 일부 구현예에서, X는 할로겐이다. 일부 구현예에서, X는 석신이미딜옥시와 같은 활성 에스터이다. 일부 구현예에서, X는 -N(R6)CH2Cl이되 R6는 임의 치환된 아릴이다.
[45] 화학식(I)의 링커에 대해, Z는 컨쥬게이션에 대해 기술 분야 내 공지된 임의의 작용기일 수 있다. 이러한 작용기의 예로는 아민, 아미노옥시, 케톤, 알데하이드, 말레이미딜, 싸이올, 알코올, 아자이드, 1,2,4,5-테트라아지닐, 트랜스-사이클로옥테닐, 바이사이클로노니닐, 사이클로옥티닐, 및 이의 보호된 변이체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, Z는 보호된 아민, 보호된 아미노옥시, 케톤 또는 보호된 케톤, 알데하이드 또는 보호된 알데하이드, 말레이미딜, 보호된 싸이올, 보호된 알코올, 아자이드, 1,2,4,5-테트라아지닐, 트랜스-사이클로옥테닐, 바이사이클로노니닐, 또는 사이클로옥티닐이다. 일부 구현예에서, Z는 아자이드, 케톤, 또는 보호된 케톤이다.
[46] 본 명세서의 설명에서, 하나의 모이어티의 모든 설명, 변형, 구현예 또는 양태는 다른 모이어티의 모든 설명, 변형, 구현예 또는 양태와 조합될 수 있으며, 각각의 모든 설명 조합이 구체적으로 및 개별적으로 나열된 것처럼 동일하게 이해해야 한다. 예를 들어, 화학식(I)의 n에 대해 본 명세서에 제공된 모든 설명, 변형, 구현예 또는 양태는 R1, R2, R4, X, 및 Z의 모든 설명, 변형, 구현예 또는 양태와 조합될 수 있으며, 각각의 모든 조합이 구체적으로 및 개별적으로 나열된 것처럼 동일하다. 또한, 화학식(I), (II), (III), (IV), 또는 (V)와 같은 임의의 화학식의 모든 설명, 변형, 구현예 또는 양태는, 적용 가능한 경우, 본 명세서에 설명된 다른 화학식에 동일하게 적용되고, 동일하게 기재되며, 각각의 모든 설명, 변형, 구현예 또는 양태가 모든 화학식에 대해 별도로 및 개별적으로 나열된 것처럼 동일하게 이해된다. 예를 들어, 화학식(I)의 모든 설명, 변형, 구현예 또는 양태는, 적용 가능한 경우, 본 명세서에 설명된 임의의 화학식, 예컨대 화학식(II), (III), (IV), 및 (V)에 동일하게 적용되고, 동일하게 기재되며, 각각의 모든 설명, 변형, 구현예 또는 양태가 모든 화학식에 대해 별도로 및 개별적으로 나열된 것처럼 동일하다.
링커-약물
[47] 또 다른 양태에서, 화학식(II)의 화합물,
Figure pct00006
(II),
이 제공되며, 여기서 n, R1, R2, R4, X, 및 Z는 화학식(I)에 대해 본 명세서에 개시된 바와 같고; D는 약물이고; D가 아민을 통해 연결된 약물인 경우 Y는 부재하거나, 또는 D가 페놀, 알코올, 싸이올, 싸이오페놀, 이미다졸, 또는 비염기성 아민을 통해 연결된 약물인 경우 Y는 -N(R6)CH2-이되; 여기서 R6는 임의 치환된 C1-C6 알킬, 임의 치환된 아릴, 또는 임의 치환된 헤테로아릴이다. 일부 구현예에서, 화학식(II)의 화합물은 화학식(I)의 링커를 소분자, 펩타이드, 또는 단백질 치료제와 같은 약물과 조합하여 제조된 링커-약물이다.
[48] 화학식(II)의 화합물의 일부 구현예에서, Y는 부재한다. 일부 구현예에서, Y는 -N(R6)CH2-이다.
[49] 화학식(II)의 화합물의 일부 구현예에서, 적합한 약물로는 소분자, 펩타이드, 단백질, 및 핵산을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 적합한 약물의 예로는 적합한 약물의 예에는 항당뇨병 약물, 성장 촉진제, 아미노글리코시드, 페니실린, 세팔로스포린, 마크로라이드 및 펩타이드, 트라이메토프림, 피로미딘산, 및 설파메타진을 포함하는 항균제; 진통제 및 항염증제, 항알레르기 및 항천식 약물, 항콜레스테롤혈증 약물, 베타-아드레날린 차단제 및 항고혈압 약물, 항종양 약물 및 항바이러스 약물을 ?l마하지만, 이에 제한되지 않는다.
[50] 이러한 약물의 추가적인 예로는 파클리탁셀(paclitaxel) 및 유사체, 에포틸론(epothilone) 및 유사체와 같은 알코올, 캄토테신(camptothecin) 및 이리노테칸(irinotecan)과 같은 유사체, 및 5-플루오로우라실(5-fluorouracil) 및 카페시타빈(capecitabine)과 같은 뉴클레오사이드를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 약물은 세린 잔기를 포함하는 펩타이드이다. 또 다른 구체예에서, 약물은 아릴올(arylol) 기를 ?l마한느 소분자이며; 이러한 약물의 예로는 SN-38, 에틸레프린(etilefrine), 프레날테롤(prenalterol) 및 에스트라다이올(estradiol)을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 약물은 타이로신 잔기를 포함하는 펩타이드이다. S를 통해 커플링하는 경우, 약물은 싸이올 기를 포함하는 소분자일 수 있다. 이러한 약물의 예로는 페니실라민(penicillamine), 캡토프릴(captopril), 에날라프릴(enalapril)을 포함한다. 약물은 싸이오아릴 또는 싸이오헤테로아릴 기를 포함하는 소분자일 수 있고; 이러한 약물의 예로는 6-머캅토퓨린을 포함한다. 비염기성 N을 통해 커플링하는 경우, 약물은 1차 또는 2차 아마이드 (예컨대 피로글루타메이트 잔기 또는 다른 아마이드) 또는 설폰아마이드, 또는 헤테로아릴 기 예컨대 인돌 (예를 들어, 트립토판) 또는 퓨린을 포함하는 소분자 또는 펩타이드일 수 있다. 예로는 갑상선자극호르몬(thyrotropin) 방출 호르몬, 봄베신(bombesin), 황체 형성 호르몬(luteinizing hormone) 방출 호르몬, 난포 자극 방출 호르몬, 옥트레오타이드(octreotide), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil) 및 알로푸리놀(allopurinol)을 포함한다.
[51] 핵산-기반 약물의 예로는 동물, 특히 포유동물으로부터의 임의의 유전자의 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함한다. 이러한 유전자는 이미 다양한 질병을 치료하기 위한 목적으로 제공된 안티센스 DNA 또는 RNA, 또는 짧은 간섭 RNA의 대상이 된 유전자, 예를 들어 단백질 키네이스 C-알파, BCL-2, ICAM-1, 종양 괴사 인자 알파 등에 대한 유전자일 수 있다. 또한 톨-유사(toll-like) 수용체의 CpG 올리고뉴클레오타이드 작용제가 포함된다. 핵산은 직접적으로 링커에 커플링될 수 있거나 또는 핵산 상의 변형된 기를 통해, 예를 들어 5'- 또는 3'-아민 변형을 포함하거나, 또는 아민-함유 염기를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 통해 커플링될 수 있다.
[52] 화학식(II)의 화합물의 일부 구현예에서, D는 펩타이드이다. 적합한 펩타이드의 예로는 옥트레오타이드 (서열 번호 5), 엑세나타이드(exenatide) 및 [N28Q]엑세나타이드를 포함하는 변이체 (서열 번호 1), 인슐린 리스프로 (A 사슬: 서열 번호 2; B 사슬: 서열 번호 3; 이황화 다리(disulfide bridge): A6-A11, A7-B7, A20-B19), 또는 테두글루타이드(Teduglutide) ([Gly2]GLP-2) (서열 번호 4), 및 이의 서열 변이체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 임의의 서열에 대해, 아미드화된 형태 및 아미드화되지 않은 형태 모두 고려된다. 또 다른 예로서, 임의의 아미노산에 대해, L-형 및 D-형 모두가 고려된다. 일부 구현예에서, 옥트레오타이드는 D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol (Cys2-Cys7 사이클릭 다이설파이드)이다.
서열 번호 1 HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKQGGPSSGAPPPS-NH2 ([N28Q]엑세나타이드)
서열 번호 2 GIVEQCCTSICSLYQLENYCN (인슐린 리스프로의 A 사슬)
서열 번호 3 FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPT (인슐린 리스프로의 B 사슬)
서열 번호 4 HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD (테두글루타이드 ([Gly2]GLP-2))
서열 번호 5 FCFWKTCT (옥트레오타이드; Cys2-Cys7 사이클릭 다이설파이드)
컨쥬게이트
[53] 또 다른 양태에서, 화학식(III)의 컨쥬게이트,
Figure pct00007
(III),
가 제공되며, 여기서 n, R1, R2, R4, D, 및 Y는 화학식(I) 또는 (II)에 대해 본 명세서에 개지된 바와 같고; M은 거대분자 담체이며; M이 가용성 거대분자인 경우 q는 1 내지 10의 정수이거나, 또는 M이 불용성 매트릭스인 경우 q는 다중도(multiplicity)이며; Z*는 M에 대한 커플링을 나타낸다. 일부 구현예에서, 화학식(III)의 화합물은 화학식(I)의 링커를 통해 거대분자 담체 M에 방출가능하게 연결된 약물 D의 컨쥬게이트이다. M이 불용성 매트릭스인 경우, 다수의 링커-약물이 M에 부착될 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, M이 화학식(IV)의 하이드로겔이되 P1 및 P2 모두 4-암형 중합체인 경우, 1, 2, 3, 또는 4 개의 링커-약물이 각 P1-P2 유닛에 부착될 수 있다. 이에 따라, 바람직한 다중도는 링커-약물을 M과 적합한 비율로 반응시킴으로써 달성될 수 있다. 이와 같이, 매트릭스의 부피에서 적합한 약물 농도가 달성될 수 있다.
[54] 화학식(III)의 컨쥬게이트의 일부 구현예에서, 분자 담체 M은 가용성 거대분자이며 q는 1 내지 10의 정수이다. 일부 구현예에서, M은 불용성 매트릭스이며 q는 다중도이다. 일부 구현예에서, M이 불용성 매트릭스인 경우, q는 매트릭스의 부피에서 적합한 약물 농도가 달성될 수 있도록 하는 다중도이다. 가용성 거대분자의 예로는 폴리에틸렌 글리콜 또는 다른 합성 중합체, 덱스트란, 항체, 항체 단편, 알부민 또는 기술 분야에서 이해되는 바와 같이 효율적인 신장 여과를 억제하기에 충분한 분자 크기의 다른 단백질을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 폴리에틸렌 글리콜에 대해, M은 평균 분자량이 1,000 내지 100,000 달톤, 바람직하게 1,000 내지 40,000 달톤인, 단일-사슬, 다중-사슬, 또는 다중-아암일 수 있다. 불용성 매트릭스의 예로는 벌크 또는 미세입자 또는 나노입자로서의 하이드로겔, 임플란트, 또는 수술 장치를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, M은 가용성 거대분자이다. 일부 구현예에서, M은 불용성 매트릭스이다. 일부 구현예에서, M은 본 명세서에 개시된 바와 같은 화학식(IV)의 하이드로겔이다.
[55] 화학식(III)의 컨쥬게이트의 일부 구현예에서, 분자 담체 M은 컨쥬게이션을 가능하게 하는 Z에 대한 적어도 하나의 동족 작용기 Z'를 포함한다. 예를 들어, Z가 아민인 경우, 화학식(III)의 컨쥬게이트를 산출하기 위해 Z'는 카복실 산, 활성 에스터, 또는 활성 카보네이트이며, 여기서 Z*는 아마이드 또는 카바메이트이다. 또 다른 예시로서, Z가 아자이드인 경우, 화학식(III)의 컨쥬게이트를 산출하기 위해 Z'는 알키닐, 바이사이클로노니닐, 또는 사이클로옥티닐이며, 여기서 Z*는 1,2,3-트라이아졸이다. 또 다른 예시로서, Z가 NH2O인 경우, 화학식(III)의 컨쥬게이트를 산출하기 위해 Z'는 케톤 또는 알데하이드이며, 여기서 Z*가 옥심이다. 또 다른 예시로서, Z가 SH인 경우, 화학식(III)의 컨쥬게이트를 산출하기 위해 Z'는 말레이미드 또는 할로카보닐이며, 여기서 Z*가 싸이오석신이미딜 또는 싸이오에터이다. 이와 유사하게, Z 및 Z'의 이러한 역할은 반대 배향의 Z*를 산출하도록 반전될 수 있다. 일부 구현예에서, Z*는 아마이드, 옥심, 1,2,3-트라이아졸, 싸이오에터, 싸이오석신이미드, 또는 에터를 포함한다.
하이드로겔
[56] 또 다른 양태에서, 화학식(IV)의 하이드로겔
Figure pct00008
(IV),
이 제공되며, 여기서 n, R1, R2, R4, 및 Z*는 화학식(I), (II), 또는 (III)에 대해 본 며세서에 개시된 바와 같고;
W는 부재하거나 또는
Figure pct00009
이되,
여기서 x, y, 및 z 각각은 독립적으로 0 내지 6의 정수이고, B는 -NH2, -ONH2, 케톤, 알데하이드, -SH, -OH, -CO2H, 카복스아마이드 기, 또는 사이클로옥틴 또는 바이사이클로노닌을 포함하는 기이고, C*는 카복스아마이드, 싸이오에터, 싸이오석신이미딜, 트라이아졸, 또는 옥심이고;
P1 및 P2는 독립적으로 1-40 kDa 분자량의 r-아암 중합체이되, 여기서 r은 2 내지 8의 정수이다. (CH2)x는 NH에 연결되고 C*는 P2에 연결되는 것으로 이해된다. 일부 구현예에서, 화학식(IV)의 하이드로겔은 분해 가능하다.
[57] 화학식(IV)의 하이드로겔의 일부 구현예에서, P1 및 P2는 폴리에틸렌 글리콜, 덱스트란, 히알루론산, 등과 같은 합성 중합체이다. 이러한 하이드로겔이 예시적인 구조가 도 6에 주어진다. 상기 하이드로겔에서, 화학식(I)의 링커는 중합체 사슬을 가교하여 불용성 3 차원 매트릭스를 형성하는데 사용된다. 가교 결합은 R1 및 R2 기에 의해 제어되는 속도로 비-가수분해성 베타-제거에 의해 천천히 절단되어, 궁극적으로 가용성 중합체 단편을 제공한다. 이러한 하이드로겔은 여러 방식으로 링커-약물의 부착을 가능하게 한다. W가 존재하는 경우, 작용기 B는 각각의 가교결합에 도입된다. 도 6에 예시된 바와 같이, 하이드로겔은 다수의 B가 존재하도록 형성될 수 있다. B가 상기 논의된 동족 Z' 기와 동일한 경우 B 기는 링커 약물의 부착을 위해 직접적으로 사용될 수 있고, 또는 링커-약물을 미리 형성된 하이드로겔에 후속적으로 부착하기 위해 동족 Z' 기를 도입하도록 B가 유도체화될 수 있다. 이것은 하이드로겔이, 예를 들어 마이크로스피어 또는 고정된 차원의 시트와 같은 원하는 형태로 제조함으로써, 생체 외에서 제조되어야 할 때 유리하다. 택일적으로, B 기는 하이드로겔이 제조될 때 화학식(II)의 링커-약물을 포함할 수 있으며; 이것은 겔 형성 이전에 구성 요소의 액체 혼합물을 주입하여 인 시튜 겔화가 바람직할 때 유리하다.
약제학적 조성물
[58] 또 다른 양태에서, 본 명세서에는 거대분자 담체-약물 컨쥬게이트 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염과 함께 약제학적으로 허용되는 완충제 및/또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 완충제는 링커의 안정성이 저장하는 동안 및 필요한 경우 재구성할 시에 유지되도록 선택되며, 일반적으로 pH가 2 내지 7, 바람직하게 2 내지 6, 및 더욱 바람직하게 2 내지 5이다. 허용되는 완충제로는 아세트산, 시트르산, 인산, 히스티딘, 글루콘산, 아스파르트산, 글루탐산, 락트산, 타르타르산, 숙신산, 말산, 푸마르산, 알파-케토글루타르산 등을 포함한다. 부형제에는 소듐 클로라이드과 같은 장성 및 삼투압 제제; 구연산 또는 구연산염, 및 파라벤과 같은 방부제; 페놀 및 크레졸과 같은 항균제; 뷰틸화 하이드록시톨루엔, 비타민 A, C, E, 시스테인, 메티오닌 등의 항산화제; 자당, 폴리올, 히알루론산 및 카복시메틸셀룰로스와 같은 밀도 조절제. 이러한 제형은 당업자에게 공지된 종래의 방법, 예를 들어 [“'s Pharmaceutical Science,”A.R. Gennaro, ed., 17th edition, 1985, Mack Publishing Company, Easton, PA, USA]에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있다. 약제학적 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로 공급될 수 있거나, 또는 예를 들어 액체 조성물의 동결 건조에 의해, 고체로서 제공될 수 있다. 이러한 동결건조물은 사용 전에 신속하고 효율적인 재구성을 보장하기 위해 증량제를 추가로 포함할 수 있다.
사용 방법
[59] 또 다른 양태에서, 상기 기재된 거대분자 담체-약물 컨쥬게이트 및 이를 포함하는 약제학적 조성물은 개체에서 질병 또는 병태를 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 질병 또는 병태를 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 치료를 필요로 하는 개체에게 본 명세서에 기재된 거대분자 담체-약물 컨쥬게이트 또는 본 명세서에 기재된 거대분자 담체-약물 컨쥬게이트를 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 개체”는 인간, 또는 고양이, 개, 소, 쥐, 마우스, 말, 토끼 또는 기타 가축과 같은 동물일 수 있다.
[60] 또한 질병 또는 병태의 치료에 사용하기 위한 본 명세서에 기재된 거대분자 담체-약물 컨쥬게이트를 포함하는 조성물이 제공된다. 또한 본 명세서에는 질병 또는 병태의 치료를 위한 약제의 제조에서 본 명세서에 기재된 거대분자 담체-약물 컨쥬게이트의 용도가 제공된다.
[61] 치료를 필요로 하는 적용 가능한 질병 또는 병태는 컨쥬게이트 약물의 성질로부터 당업자에 의해 공지될 것이다. 예를 들어, 엑세나타이드 및 인슐린은 당뇨병의 치료에, 옥트레오타이드는 말단비대증 및 다양한 암의 치료에, 테두글루타이드는 단장 증후군의 치료에, 그리고 SN-38 및 TLR9 작용제는 암 치료에 사용될 수 있다. 인간 및 동물에 대한 임의의 적합한 투여 경로는 본 발명에 의해, 예를 들어 정맥내, 척추강내, 안구내, 피하, 관절내, 복강내, 또는 다른 국소 주사를 통해, 또는 경구 투여에 의해, 구상된다.
링커의 제조
[62] 화학식(I)의 링커는 하기 실시예에 예시된 바와 같이 임의의 여러 경로에 의해 제조될 수 있다. 하나의 방법으로, 이중(geminal)-다이알킬 카보닐 화합물 (A)은 염기의 작용을 통해 R1R2CH2와 축합된다.
Figure pct00010
[63] 적합한 염기로는 R1R2CH2를 보호해제할 수 있는 염기, 예컨대 포타슘 tert-뷰톡사이드 또는 tert-펜톡사이드, 뷰틸리튬, 리튬 다이아이소프로필아마이드, NaH, 및 실라자이드 염기 예컨대 LiHMDS, NaHMDS, 또는 KHMDS가 있다. R10은 H, C1-C6 알콕시, 또는 N(Me)OMe일 수 있다. R10가 H인 경우, 알코올 (C)은 직접적으로 생성된다. R10가 H이 아닌 경우, 케톤 (B)이 생성되어, 후속적으로 알코올 (C)로 환원된다. 적합한 환원제로는 보로하이드라이드 예컨대 LiBH4 및 NaBH4를 포함하지만, 기술 분야 내 공지된 기타 환원제가 Z 기의 성질에 따라 사용될 수 있다. 알코올 (C)가 이후 활성화되어 화학식(I)의 링커를 생성한다. 일반적인 활성화 조건으로는 포스진 또는 포스진 등가물 예컨대 다이포스진 또는 트라이포스진의 작용을 통한 클로로포메이트 (X = Cl)로의 전환; N,N'-다이석신이미딜 카보네이트 및 4-(다이메틸아미노)피리딘을 사용하여, 또는 클로로포메이트를 N-하이드록시석신이미드 및 피리딘으로 처리하여 석신이미딜 카보네이트 (X = OSu)로 전환; 및 예를 들어 피리딘과 같은 약한 염기의 존재하에 나이트로페닐 클로로포메이트와의 반응에 의해 활성 카보네이트로의 전환을 포함한다.
[64] X가 -N(R6)CH2Cl인 화학식(I)의 링커는 미국 특허 8,754,190에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다.
[65] Z는 컨쥬게이션에 대해 기술 분야 내에 공지된 임의의 작용기, 예컨대 아민, 아미노옥시, 케톤, 알데하이드, 말레이미딜, 싸이올, 알코올, 아자이드, 1,2,4,5-테트라아지닐, 트랜스-사이클로옥테닐, 바이사이클로노니닐, 사이클로옥티닐, 및 이의 보호된 변이체일 수 있다. 일부 구현예에서, Z는 보호된 아민, 보호된 아미노옥시, 케톤 또는 보호된 케톤, 알데하이드 또는 보호된 알데하이드, 말레이미딜, 보호된 싸이올, 보호된 알코올, 아자이드, 1,2,4,5-테트라아지닐, 트랜스-사이클로옥테닐, 바이사이클로노니닐, 또는 사이클로옥티닐이다. 일부 구현예에서, Z는 아자이드, 케톤, 또는 보호된 케톤이다.
링커-약물의 제조
[66] 화학식(I)의 링커는 약물 D와 반응하여 다음의 화학식(II)의 링커-약물을 생성할 수 있다
Figure pct00011
(II).
[67] 본 발명에 사용하기 적합한 약물로는 소분자, 펩타이드, 단백질, 및 핵산을 포함한다. 염기성 아민 기를 포함하는 약물의 경우, X가 할라이드 또는 활성 에스터인 화학식(I)의 링커는 유기 용매에서 또는 완충 수용액에서 염기의 존재하에 약물과 반응하여 화학식(II)의 링커-약물을 생성한다. 이러한 염기성 아민은 소분자 약물의 일부일 수 있거나, 또는 펩타이드 및 단백질의 N-말단 아민 또는 라이신 e-아민일 수 있다. 여러 염기성 아민을 가지는 약물, 예를 들어 펩타이드 및 단백질의 경우, 하나 이상의 링커가 부착될 수 있다. 합성 펩타이드의 경우에, 링커는 예를 들어 최종 커플링 단계에서 링커를 사용하여 N-말단에, 또는 내부 아미노산 잔기에 대해 선택적으로 제거될 수 있는 임시 차단기의 사용을 통해 합성 동안 특정 위치에 부착될 수 있고; 링커로 아실화된 다음 전체적인 보호해제 및 링커-펩타이드의 정제가 이어질 수 있다. 약물에 대한 링커의 부착을 용이하게 하는데 적합한 염기로는 3차 아민, 예컨대 트라이에틸아민 또는 N,N-다이아이소프로필에틸아민, 및 구아니딘, 예컨대 N,N-다이메틸구아니딘 및 7-메틸-1,5,7-트라이아자바이사이클로[4.4.0]데크-5-엔, 및 기술 분야에 공지된 기타 염기를 포함한다. 수용액에서 수행되는 경우, 반응은 일반적으로 pH 값 7 내지 10 에서 수행된다.
[68] X = N(R6)CH2Cl인 화학식(I)의 링커는 미국 특허 8,754,190에 개시된 방법과 유사하게 알코올, 페놀, 싸이올, 싸이오페놀, 이미다졸, 및 비염기성 질소 원자를 통해 약물에 연결될 수 있다.
[69] 링커-약물이 제조되면, Z 또는 약물에 대한 임의의 보호기는 기술 분야 내 공지된 절차를 사용하여 컨쥬게이션 전에 제거될 수 있다.
컨쥬게이트의 제조
[70] 화학식(II)의 링커-약물은 보호 해제된 작용기 Z와 거대분자 담체 M에 연결된 동족 반응기의 반응으로 다음의 화학식(III)의 컨쥬게이트를 제조하는데 사용될 수 있다
Figure pct00012
(III).
[71] Z는 컨쥬게이션에 대해 기술 분야 내에 공지된 임의의 작용기, 예컨대 아민, 아미노옥시, 케톤, 알데하이드, 말레이미딜, 싸이올, 알코올, 아자이드, 1,2,4,5-테트라아지닐, 트랜스-사이클로옥테닐, 바이사이클로노니닐, 사이클로옥티닐일 수 있다. 연결 작용기의 선택은 약물 D 내 다른 작용기의 존재에 따라 달라질 것이지만, 당업자에게는 명백할 것이다. M은 수용성 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 또는 다른 합성 중합체, 덱스트란, 항체, 항체 단편, 알부민 또는 기술 분야에서 이해되는 바와 같이 효율적인 신장 여과를 억제하기에 충분한 분자 크기의 다른 단백질일 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜에 대해, M은 평균 분자량이 1,000 내지 100,000 달톤, 바람직하게 1,000 내지 40,000 달톤인, 단일-사슬, 다중-사슬, 또는 다중-아암일 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜은 컨쥬게이션을 가능하게 하는 Z에 대한 적어도 하나의 동족 작용기 Z'를 포함한다. 예를 들어, Z가 아민인 경우, 화학식(III)의 컨쥬게이트를 산출하기 위해 Z'는 카복실 산, 활성 에스터, 또는 활성 카보네이트이며, 여기서 Z*는 아마이드 또는 카바메이트이다. 또 다른 예시로서, Z가 아자이드인 경우, 화학식(III)의 컨쥬게이트를 산출하기 위해 Z'는 알키닐, 바이사이클로노니닐, 또는 사이클로옥티닐이며, 여기서 Z*는 1,2,3-트라이아졸이다. 또 다른 예시로서, Z가 NH2O인 경우, 화학식(III)의 컨쥬게이트를 산출하기 위해 Z'는 케톤 또는 알데하이드이며, 여기서 Z*가 옥심이다. 또 다른 예시로서, Z가 SH인 경우, 화학식(III)의 컨쥬게이트를 산출하기 위해 Z'는 말레이미드 또는 할로카보닐이며, 여기서 Z*가 싸이오석신이미딜 또는 싸이오에터이다. 이와 유사하게, Z 및 Z'의 이러한 역할은 반대 배향의 Z*를 산출하도록 반전될 수 있다. 이러한 컨쥬게이션 반응은 기술 분야 내 공지된 조건하에서 수행될 수 있으며, 예를 들어 Z = 아자이드 및 Z' = 사이클로옥틴인 경우 컨쥬게이션은 두 성분 모두가 적합한 용해도를 나타내는 임의의 용매에서 일어나지만, 수용액이 보다 유리한 반응 속도를 나타내는 것으로 알려져 있다.
[72] 이와 유사하게, M은 수불용성 매트릭스, 예를 들어 벌크 또는 미세입자 또는 나노입자로서의 하이드로겔, 임플란트, 또는 수술 장치일 수 있다. 이러한 경우, M은 상기 기재된 바와 같이 다수의 Z 기를 포함하여, 다수의 링커-약물의 부착을 허용한다. 매트릭스는 불용성이지만, 약물-링커를 포함하는 용액과의 반응은 컨쥬게이션이 일어나기에 충분하다. 예를 들어, 불용성 매트릭스가 벌크 형태이거나 또는 마이크로스피어 또는 다른 미립자 형태로서 제조된 하이드로겔인 경우, 링커-약물이 다공성 하이드로겔 매트릭스에 침투하여 컨쥬게이션 반응이 일어나도록 하기에 충분한 시간 동안 링커-약물의 용액은 하이드로겔의 현탁액과 혼합된다.
하이드로겔의 제조
[73] 일부 구현예에서, M은 다음의 화학식(IV)의 생분해성 하이드로겔이며, 여기서 P1, P2, Z*, n, r, R1, R2, R4, 및 W는 본 명세서에 개시된 바와 같다
Figure pct00013
(IV).
[74] 화학식(IV)의 가교 결합을 포함하는 이러한 하이드로겔의 예시적인 구조가 도 6에 주어진다. 상기 하이드로겔에서, 화학식(I)의 링커는 중합체 사슬을 가교하여 불용성 3 차원 매트릭스를 형성하는데 사용된다. 가교 결합은 R1 및 R2 기에 의해 제어되는 속도로 비-가수분해성 베타-제거에 의해 천천히 절단되어, 궁극적으로 가용성 중합체 단편을 제공한다. 이러한 하이드로겔은 여러 방식으로 링커-약물의 부착을 가능하게 한다. W가 존재하는 경우, 작용기 B는 각각의 가교결합에 도입된다. 도 6에 예시된 바와 같이, 하이드로겔이 먼저 형성되어 하이드로겔 중합체를 제공할 수 있으며, 이는 다수의 B가 존재하여 화학식(II)의 링커-약물을 추가로 포함하지 않는 분해성 중합체를 제공한다. B가 상기 논의된 동족 Z' 기와 동일한 경우 B 기는 링커 약물의 부착을 위해 직접적으로 사용될 수 있고, 또는 링커 약물을 미리 형성된 하이드로겔에 후속적으로 부착하기 위해 동족 Z' 기를 도입하도록 B가 유도체화될 수 있다. 이것은 하이드로겔이, 예를 들어 마이크로스피어 또는 고정된 차원의 시트와 같은 원하는 형태로 제조함으로써, 생체 외에서 제조되어야 할 때 유리하다. 택일적으로, B 기는 하이드로겔이 제조될 때 화학식(II)의 링커-약물을 포함할 수 있으며; 이것은 겔 형성 이전에 구성 요소의 액체 혼합물을 주입하여 인 시튜 겔화가 바람직할 때 유리하다.
[75] 이러한 하이드로겔은 두 개의 다중-아암(multi-armed) 예비중합체를 혼합하여 형성될 수 있는데, 하나는 반응성 말단기 Z를 가지는 화학식(I)의 링커의 잔기를 포함하는 기로 종결되는 아암을 가지고, 다른 하나는 동족 반응성 말단기 Z'를 포함하는 기로 종결되는 아암을 가진다. 하나의 구체예에서, 하나의 예비중합체는 다음의 화학식(V)
Figure pct00014
(V)
를 가지며 여기서 기는 상기 정의된 바와 같고, 다른 예비중합체는 화학식 P1-(Z')r를 가진다. 적절한 용매에서, 일반적으로 Z 및 Z'가 아자이드/사이클로옥틴인 경우 pH 2-7의, 또는 Z 및 Z'가 활성화 에스터 및 아민인 경우 pH 6-9의 수성 완충제에서 혼합되는 경우, Z 및 Z' 기가 반응하여 화학식(IV)의 가교 결합을 포함하는 불용성 하이드로겔 매트릭스를 형성한다. 이러한 공정은 주입에 적합한 마이크로스피어와 같은 미세입자 현탁액을 형성하기 위해 벌크 상에서 수행될 수 있거나, 또는 유화 조건 하에서 혼합 유기/수성 시스템에서 수행될 수 있다.
[76] 다음의 특정 예시적인 구현예가 하기에 제공된다:
구현예 1. 화학식(I)의 링커로서
Figure pct00015
(I)
여기서 n = 1-6이고,
R1 및 R2 모두 독립적으로 전자-끄는 기이거나, 또는 R1 및 R2 중 하나가 전자-끄는 기이고 다른 하나는 알킬, 또는 H이고;
각각의 R4는 독립적으로 C1-C3 알킬이거나, 또는 함께 3-6 원 고리를 형성할 수 있고;
Z는 링커를 컨쥬게이션 담체에 부착하기 위한 기이고; X는 이탈기인 링커.
구현예 2. 구현예 1의 링커에 있어서, X는 할로겐, N-석신이미딜옥시, 나이트로페녹시, 펜타할로페녹시, 이미다졸릴, 트라이아졸릴, 또는 테트라졸릴인 것인 링커.
구현예 3. 구현예 1의 링커에 있어서, Z는 보호된 아민, 보호된 아미노옥시, 케톤 또는 보호된 케톤, 알데하이드 또는 보호된 알데하이드, 말레이미딜, 보호된 싸이올, 보호된 알코올, 아자이드, 1,2,4,5-테트라아지닐, 트랜스-사이클로옥테닐, 바이사이클로노니닐, 또는 사이클로옥티닐인 것인 링커.
구현예 4. 화학식(II)의 링커-약물로서,
Figure pct00016
(II)
여기서 D가 아민을 통해 연결된 약물인 경우 Y는 부재하거나, 또는 D가 페놀, 알코올, 싸이올, 싸이오페놀, 이미다졸, 또는 비염기성 아민을 통해 연결된 약물인 경우 Y는 -N(R6)CH2-이되; 여기서 R6는 임의 치환된 C1-C6 알킬, 또는 임의 치환된 아릴, 또는 헤테로아릴인 것인 링커-약물.
구현예 5. 화학식(III)의 컨쥬게이트로서,
Figure pct00017
(III)
여기서 M은 거대분자 담체이고, Z*는 카복실 아마이드, 옥심, 1,2,3-트라이아졸, 싸이오에터, 싸이오석신이미드, 또는 에터를 포함하고, q = 1-다중도인 것인 컨쥬게이트.
구현예 6. 화학식(IV)의 하이드로겔로서,
Figure pct00018
(IV),
여기서 P1 및 P2는 독립적으로 r-아암 중합체이되 r = 2-8이고, W는 부재하거나 또는
Figure pct00019
이되, x, y, 및 z는 각각 독립적으로 0-6이고; B는 NH2, ONH2, 케톤, 알데하이드, SH, OH, CO2H, 또는 카복스아마이드 기이고, C*는 카복스아마이드, 싸이오에터, 싸이오석신이미딜, 트라이아졸, 또는 옥심인 것인 하이드로겔.
[77] 다음의 실시예는 예시를 위해 제공되지만 본 개시를 제한하지 않는다.
실시예 1
화학식(I)의 링커 (Z = 아자이드)의 제조
Figure pct00020
(1) 4-아지도-1-사이아노-3,3-다이메틸-2-뷰틸 석신이미딜 카보네이트 (화학식(I)이되 여기서 n = 1, R 1 = CN, R 2 = H, R 4 = CH 3 , Z = N 3 , 및 X = 석신이미딜옥시).
[78] -30 ℃에서 THF 중의 1 M 포타슘 tert-뷰톡사이드 용액 (3.5 mL, 3.5 mmol)을 7 mL의 THF 중의 메틸 3-아지도-2,2-다이메틸프로피오네이트 ([Kim, Synthetic Communications]에 따라 제조; 300 mg, 1.9 mmol) 및 아세토나이트릴 (0.365 mL, 7.0 mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 -30 ℃에서 30 분간 교반한 다음 1 시간에 걸쳐 주위 온도로 가온시키고 추가적인 30 분 동안 교반하였다. 혼합물을 얼음 위에서 냉각시키고 6 N HCl (0.62 mL, 3.7 mmol)을 첨가하여 켄칭한 다음, EtOAc와 물 사이에 분배하였다. 수상을 2x EtOAc으로 추출하고, 조합된 유기물 염수로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 농축하여 미정제 케톤을 제공하였다.
[79] 소듐 보로하이드라이드 (33 mg, 0.88 mmol)를 7 mL의 메탄올 중의 미정제 케톤 (300 mg, ca. 1.75 mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 15 분간 교반한 다음 켄칭 6 N HCl (0.7 mL)을 첨가하여 켄칭하고, EtOAc와 물 사이에 사이에 분배하였다. 수상을 2x EtOAc으로 추출하고, 및 조합된 유기물 염수로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 농축하여 미정제 알코올을 제공하였다. SiO2 (20-40% EtOAc/헥산)에서 정제하여 4-아지도-1-사이아노-3,3-다이메틸-2-뷰탄올 (142 mg, 0.85 mmol)을 제공하였다. 1H-NMR (CDCl3, 300 MHz) d 3.83-3.92 (m,1H), 3.43 (d, J=12.1 Hz,1H), 3.21 (d, J=12.1 Hz, 1H), 2.41-2.62 (m,3H), 0.97 (s,3H), 및 0.96 (s,3H).
[80] 피리딘 (136 μL, 1.7 mmol)을 얼음 위에서 냉각된 8 mL의 THF 중의 4-아지도-1-사이아노-3,3-다이메틸-2-뷰탄올 (142 mg, 0.85 mmol) 및 트라이포스진 (425 mg, 1.44 mmol)의 용액에 적가하였다. 생성된 현탁액을 주위 온도로 가온시키고 15 분간 교반한 다음, 여과하고 농축하여 미정제 클로로포메이트를 제공하였다. 이것을 8 mL의 THF에 용해시키고, 얼음 위에서 냉각시키고, N-하이드록시석신이미드 (291 mg, 2.5 mmol) 및 피리딘 (204 μL, 2.53 mmol)으로 처리하였다. 생성된 현탁액을 주위 온도로 가온시키고 15 분간 교반한 다음, EtOAc와 5% KHSO4 사이에 분배하였다. 수상을 2x EtOAc으로 추출하고, 및 조합된 유기물 염수로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 농축하여 미정제 석신이미딜 카보네이트를 제공하였다. SiO2 (20-40% EtOAc/헥산)에서 정제하여 4-아지도-1-사이아노-3,3-다이메틸-2-뷰틸 석신이미딜 카보네이트 (174 mg, 0.56 mmol)를 제공하였다. 1H-NMR (CDCl3, 300 MHz) d 5.03 (dd,J=7.0,5.1,1H), 3.27-3.41 (m,6H), 3.43 (d, J=12.1 Hz,1H), 3.21 (d, J=12.1 Hz, 1H), 2.41-2.62 (m,3H), 0.97 (s,3H), 및 0.96 (s,3H).
(2) 4-아지도-1-((N,N-다이메틸아미노)설포닐)-3,3-다이메틸-2-뷰틸 석신이미딜 카보네이트 (화학식(I)이되 여기서 n = 1, R 1 = SO 2 N(CH 3 ) 2 , R 2 = H, R 4 = CH 3 , Z = N 3 , 및 X = 석신이미딜옥시).
[81] 불활성 분위기 하에서 헥산 중의 1.43 M의 n-뷰틸리튬 용액 (70 mL, 100 mmol)을 -50 ℃로 유지되어 200 mL의 무수 THF 중의 N,N-다이메틸 메탄설폰아마이드 (12.33 g, 100 mmol)의 교반되는 용액에 첨가하였다. 혼합물을 1 시간에 걸쳐 -20 ℃로 가온시킨 다음, -50 ℃로 재냉각시키고, 메틸 3-아지도-2,2,-다이메틸프로피오네이트 ([Kim, Snythetic Communications]에 따라 제조; 7.70 g, 50 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 2 시간에에 걸쳐 +10 ℃로 가온시킨 다음, 20 mL의 6 N HCl을 첨가하여 켄칭하였다. 혼합물을 메틸 t-뷰틸 에터 (MTBE, 200 mL)으로 희석하고, 2x 100 mL의 물 및 1x 100 mL의 염수로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 농축하여 14.05 g의 미정제 케톤 생성물을 산출하였다. SiO2 (220 g) 상에서 0, 20, 30, 40, 및 50% EtOAc/헥산의 단계적 구배를 사용하는 크로마토그래피는, 결정질 고체로서 정제된 4-아지도-1-((N,N-다이메틸아미노)설포닐)-3,3-다이메틸-2-뷰타논 (10.65 g, 86%)을 산출하였다.
[82] 상기 케톤을 200 mL의 메탄올에 용해시키고, 얼음 위에서 냉각하고, 소듐 보로하이드라이드 (0.96 g, 25 mmol)로 15 분간 처리한 후 4 mL의 6 N HCl로 ??칭하고 농축하였다. 생성된 슬러리를 메틸 t-뷰틸 에터 (MTBE, 200 mL)으로 희석하고, 1x 100 mL의 물 및 1x 100 mL의 염수로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 농축하여 10.0 g의 결정질 4-아지도-1-((N,N-다이메틸아미노)설포닐)-3,3-다이메틸-2-뷰탄올을 산출하였다.
[83] 피리딘 (10.6 mL, 132 mmol)을 10 분에 걸쳐 얼음 위에서 냉각된 250 mL의 다이클로로메탄 중의 N-하이드록시석신이미드 (6.90 g, 60 mmol) 및 트라이포스진 (5.93 g, 20 mmol)의 교반 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 얼음 위에서 15 분간 교반한 다음, 30 분에 걸쳐 주위 온도로 가온시켰다. 20 mL의 다이클로로메탄 중의 4-아지도-1-((N,N-다이메틸아미노)설포닐)-3,3-다이메틸-2-뷰탄올 (10.0 g, 40 mmol) 용액을 첨가하고 혼합물을 주위 온도에서에서 추가적인 1 시간 동안 교반하였다. 얼음 위에서 냉각한 후, 혼합물을 100 mL의 물로 처리하고 상을 분리하였다. 유기 상을 2x 물, 1x 5% KHSO4, 및 1x 염수로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 농축하였다. 미정제 생성물을 100 mL의 30% EtOAc/헥산으로부터 결정화하고, 백색 결정질 고체로서 4-아지도-1-((N,N-다이메틸아미노)설포닐)-3,3-다이메틸-2-뷰틸 석신이미딜 카보네이트 (11.1 g, 71%)를 수득하였다.
(3) 이러한 절차에 따라 제조된 화학식(I)의 추가적인 화합물은 다음을 포함한다:
4-아지도-1-(메틸설포닐)-3,3-다이메틸-2-뷰틸 석신이미딜 카보네이트 (화학식 I이되, 여기서 n = 1, R1 = SO2CH3, R2 = H, R4 = CH3, Z = N3, 및 X = 석신이미딜옥시).
4-아지도-1-((4-메틸피페리디닐)설포닐)-3,3-다이메틸-2-뷰틸 석신이미딜 카보네이트 (화학식 I이되, 여기서 n = 1, R1 = SO2N(CH2CH2)2CHCH3, R2 = H, R4 = CH3, Z = N3, 및 X = 석신이미딜옥시). LC/MS는 [M+H]+ = 446.15를 나타낸다.
4-아지도-1-(페닐설포닐)-3,3-다이메틸-2-뷰틸 석신이미딜 카보네이트 (화학식 I이되, 여기서 n = 1, R1 = SO2Ph, R2 = H, R4 = CH3, Z = N3, 및 X = 석신이미딜옥시).
4-아지도-1-(4-클로로페닐설포닐)-3,3-다이메틸-2-뷰틸 석신이미딜 카보네이트 (화학식 I이되, 여기서 n = 1, R1 = SO2PhCl, R2 = H, R4 = CH3, Z = N3, 및 X = 석신이미딜옥시).
4-아지도-1-(4-모폴리노설포닐)-3,3-다이메틸-2-뷰틸 석신이미딜 카보네이트 (화학식 I이되, 여기서 n = 1, R1 = SO2N(CH2CH2)2O, R2 = H, R4 = CH3, Z = N3, 및 X = 석신이미딜옥시).
4-아지도-1-(아이소프로필설포닐)-3,3-다이메틸-2-뷰틸 석신이미딜 카보네이트 (화학식 I이되, 여기서 n = 1, R1 = SO2CH(CH3)2, R2 = H, R4 = CH3, Z = N3, 및 X = 석신이미딜옥시).
4-아지도-1-((N-에틸-N-메틸아미노)설포닐)-3,3-다이메틸-2-뷰틸 석신이미딜 카보네이트 (화학식 I이되, 여기서 n = 1, R1 = SO2N(CH3)(CH2CH3), R2 = H, R4 = CH3, Z = N3, 및 X = 석신이미딜옥시).
4-아지도-1-((N,N-비스(2-메톡시에틸)아미노설포닐)-3,3-다이메틸-2-뷰틸 석신이미딜 카보네이트 (화학식 I이되, 여기서 n = 1, R1 = SO2N(CH2CH2OCH3)2, R2 = H, R4 = CH3, Z = N3, 및 X = 석신이미딜옥시).
4-아지도-1-(4-메틸페닐설포닐)-3,3-다이메틸-2-뷰틸 석신이미딜 카보네이트 (화학식 I이되, 여기서 n = 1, R1 = SO2PhCH3, R2 = H, R4 = CH3, Z = N3, 및 X = 석신이미딜옥시).
실시예 2
화학식(I)의 링커의 제조
Figure pct00021
[84] 화학식(I)의 화합물의 제조에 대한 또 다른 일반적인 방법은 n = 2 또는 3, R1 = CN, R2 = H, 두 개의 R4 모두 = CH3, Z = N3, 및 X = N-석신이미딜옥시인 경우에 대해 예시된다.
(1) 5-아지도-1-사이아노-3,3-다이메틸-2-펜틸 석신이미딜 카보네이트 (화학식 I, 여기서 n = 2, R 1 = CN, R 2 = H, R 4 = CH 3 , Z = N 3, 및 X = 석신이미딜옥시).
(a) 에틸 4-클로로-2,2-다이메틸뷰타노에이트.
[85] 교반 막대, 고무 격막, 질소 주입구, 및 열전대 프로브를 장착하고, 히트 건으로 건조한 500-mL 둥근바닥 플라스크를 iPr2NH (5.30 mL, 37.4 mmol, 1.1 당량, 0.27 M 최종 농도) 및 THF (100 mL)으로 채웠다. 반응 혼합물을 0 ℃에서 냉각시키면서, nBuLi (헥산 중의 1.28 M, 27.8 mL, 35.7 mmol, 1.05 당량, 0.26 M 최종 농도)의 용액을 내부 온도가 +10 ℃를 초과하지 않는 속도로 (~10 분) 실린지를 통해 적가하였다. 반응 혼합물을 15 분간 0 ℃에서 교반하고, -78 ℃로 냉각하고, THF (5 mL) 중의 에틸 아이소뷰티레이트 (4.6 mL, 4.0 g, 34 mmol, 1.0 당량, 0.24 M 최종 농도)의 용액을 내부 온도가 -65 ℃를 초과하지 않는 속도로 (~5 분간) 실린지를 통해 적가하였다. 반응 혼합물을 45 분간 -78 ℃에서 교반한 다음, THF (5 mL) 중의 1-브로모-2-클로로 에탄 (2.8 mL, 34 mmol, 1.0 당량, 0.24 M 최종 농도)의 용액을 내부 온도가 -68 ℃를 초과하지 않는 속도로 첨가하였다. 반응 혼합물을 15 분간 -78 ℃에서 교반하고, 0 ℃로 가온시키고, 15 분간 0 ℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 EtOAc (100 mL) 및 5% KHSO4 (100 mL)으로 희석하였다. 수상을 분리하고 EtOAc (3 x 50 mL)으로 추출하였다. 수상을 분리하고 EtOAc (3 x 50 mL)으로 추출하였다. 조합된 유기 상을 염수로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 톨루엔 (10 mL x 2)으로부터 농축하여 밝은 노란색 오일로서 4.85 g (27 mmol, 79%)의 원하는 클로라이드를 수득하였다:
1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ4.14 (q, J=7.2 Hz, 2 H), 3.43 - 3.57 (m, 2 H), 1.94 - 2.19 (m, 2 H), 1.27 (t, J=7.1 Hz, 3 H), 1.22 (s, 6 H)
(b) 에틸 4-아지도-2,2-다이메틸뷰타노에이트 .
Figure pct00022
[86] 교반 막대, 고무 격막, 및 질소 주입구를 장착한 100-mL의 둥근바닥 플라스크를 에틸 4-클로로-2,2-다이메틸뷰타노에이트 (2-1) (4.85 g, 27 mmol, 1.0 당량, 0.54 M 최종 농도), DMSO (50 mL), 및 소듐 아자이드 (2.28 g, 35 mmol, 1.3 당량, 0.70 M)으로 채웠다. 반응 혼합물을 블라스트 쉴드 뒤에서 70 ℃에서 18 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 주위 온도로 냉각시키고 EtOAc (200 mL) 및 H2O (100 mL)으로 희석하였다. 유기 상을 분리하고, H2O (3 x 100 mL) 및 염수 (100 mL)로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 농축하였다. 컬럼 크로마토그래피 (40 g 실리카 겔 카트리지; 단계적 구배 용리: 0%, 5%, 10%, 20% EtOAc/헥산)를 통해 정제하여, 밝은 노란색 오일로서 4.33 g (23.3 mmol, 87%)의 원하는 아자이드를 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ4.15 (q, J=7.1 Hz, 2 H), 3.22 - 3.35 (m, 2 H), 1.81 - 1.96 (m, 2 H), 1.27 (t, J=7.2 Hz, 3 H), 1.15 - 1.24 (m, 6 H)
(c) 5-아지도-1-사이아노-3,3-다이메틸-2-펜타논 .
Figure pct00023
[87] 교반 막대, 고무 격막, 질소 주입구, 및 열전대 프로브를 장착하고, 히트 건으로 건조한 100-mL 둥근바닥 플라스크를 THF (20 mL) 및 iPr2NH (1.59 mL, 11.3 mmol, 2.1 당량,0.36 M 최종 농도)으로 채웠다. 용액을 0 ℃에서 냉각시키면서, nBuLi (헥산 중의 1.28 M, 8.64 mL, 10.8 mmol, 2.0 당량, 0.34 M 최종 농도)의 용액을 내부 온도가 +10 ℃를 초과하지 않는 속도로 (~5 분) 적가하고, 0 ℃에서 10 분간 교반하고, -78 ℃에서 냉각하였다. 아세토나이트릴 (0.59 mL, 11.3 mmol, 2.1 당량, 0.36 M 최종 농도)의 용액을 내부 온도가 (-65 ℃)를 초과하지 않는 속도로 실린지를 통해 적가하였다. 반응 혼합물을 15 분간 -78 ℃에서 교반한 다음, THF (5 mL) 중의 에틸 4-아지도-2,2-다이메틸뷰타노에이트 (1.0 g, 5.4 mmol, 1.0 당량, 0.17 M 최종 농도)의 용액을 내부 온도가 -65 ℃를 초과하지 않는 속도로 (~3 분간) 실린지를 통해 첨가하였다. 반응 혼합물을 10 분간 -78 ℃에서 교반하고, 0 ℃로 가온시키고, 15 분간 0 ℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 EtOAc (50 mL) 및 5% KHSO4 (50 mL)으로 희석하였다. 수성 층을 분리하고 EtOAc (3 x 50 mL)으로 추출하였다. 조합된 유기 상을 염수 (50 mL)로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 농축하였다. 컬럼 크로마토그래피 (40 g 실리카 겔 카트리지; 단계적 구배 용리: 20%, 30%, 50% EtOAc/헥산)를 통해 정제하여, 밝은 노란색 오일로서 537 mg (2.98 mmol, 55%)의 원하는 케톤을 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ3.66 (s, 2 H), 3.37 (t, J=6.7 Hz, 2 H), 1.86 (t, J=6.8 Hz, 2 H), 1.16 - 1.27 (m, 6 H)
(d) 5-아지도-1-사이아노-3,3-다이메틸-2-펜탄올.
Figure pct00024
[88] 교반 막대, 고무 격막, 및 질소 주입구를 장착한 25-mL의 둥근바닥 플라스크를 5-아지도-1-사이아노-3,3-다이메틸-2-펜타논 (537 mg, 2.98 mmol, 1.0 당량, 0.25 M 최종 농도) 및 MeOH (12 mL)으로 채우고 0 ℃에서 냉각하였다. NaBH4 (56 mg, 1.49 mmol, 0.5 당량, 0.13 M 최종 농도)를 1 회분의 고체로서 첨가하였다. 반응 혼합물을 30 분간 0 ℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 EtOAc (50 mL) 및 5% KHSO4 수용액 (50 mL)으로 희석하였다. 수상을 분리하고 EtOAc (3 x 50 mL)으로 추출하였다. 조합된 유기 상을 염수 (40 mL)로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 농축하였다. 컬럼 크로마토그래피 (40 g 실리카 겔 카트리지; 단계적 구배 용리: 20%, 30%, 40%, 50% EtOAc/헥산)를 통해 정제하여, 밝은 노란색 오일로서 482 mg (2.64 mmol, 89%)의 원하는 알코올을 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ3.76 (ddd, J=9.1, 5.4, 3.4 Hz, 1 H), 3.34 - 3.50 (m, 2 H), 2.38 - 2.64 (m, 3 H), 1.68 - 1.82 (m, 1 H), 1.50 (ddd, J=14.1, 7.4, 6.6 Hz, 1 H), 0.96 (s, 3 H), 0.94 (s, 3 H)
(e) 5-아지도-1-사이아노-3,3-다이메틸-2-펜틸 석신이미딜 카보네이트.
Figure pct00025
[89] 교반 막대, 고무 격막, 및 질소 주입구를 장착하고, 히트 건으로 건조한 50-mL 둥근바닥 플라스크를 NHS (455 mg, 3.96 mmol, 1.5 당량, 211 mM 최종 농도), DCM (17 mL), 및 트라이포스진 (392 mg, 1.32 mmol, 0.5 당량, 70.4 mM 최종 농도)으로 채우고 0 ℃에서 냉각하였다. 반응 혼합물을 0 ℃에서 냉각시키면서, 피리딘 (0.774 mL, 8.71 mmol, 3.3 당량, 464 mM 최종 농도)을 실린지를 통해 적가하였다. 반응 혼합물을 주위 온도로 가온시키고, 30 분간 주위 온도에서 교반하였다. THF (1 mL) 중의 5-아지도-1-사이아노-3,3-다이메틸-2-펜탄올 (482 mg, 2.64 mmol, 1.0 당량, 150 mM 최종 농도)의 용액을 실린지를 통해 적가하였다. 반응 혼합물을 주위 온도에서 1 시간 동안 교반하고, 0 ℃에서 냉각하고, H2O (10 mL)을 첨가하여 켄칭하였다. 반응 혼합물을 추가적으로 EtOAc (50 mL) 및 H2O (50 mL)으로 희석하였다. 유기 상을 분리하고 물 (50 mL), 5% KHSO4 수용액, 염수 (50 mL)로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 농축하였다. 컬럼 크로마토그래피 (40 g 실리카 겔 카트리지; 단계적 구배 용리: 25%, 30%, 35%, 40% 아세톤/헥산)를 통해 정제하여, 백색 고체로서 636 mg (1.96 mmol, 75% 수율)의 원하는 활성화된 링커를 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ4.90 - 4.99 (m, 1 H), 3.32 - 3.50 (m, 2 H), 2.84 - 2.88 (m, 4 H), 2.66 - 2.82 (m, 2 H), 1.58 - 1.80 (m, 2 H), 1.08 (s, 6 H).
(2) 6-아지도-1-사이아노-3,3-다이메틸-2-헥실 석신이미딜 카보네이트 (화학식 I, 여기서 n = 3, R 1 = CN, R 2 = H, R 4 = CH 3 , Z = N 3, 및 X = 석신이미딜옥시).
(a) 에틸 5-클로로-2,2-다이메틸펜타노에이트.
Figure pct00026
[90] 교반 막대, 고무 격막, 질소 주입구, 및 열전대 프로브를 장착하고, 히트 건으로 건조한 500-mL 둥근바닥 플라스크를 iPr2NH (5.30 mL, 37.4 mmol, 1.1 당량, 266 mM 최종 농도) 및 THF (100 mL)으로 채웠다. 반응 혼합물을 0 ℃에서 냉각시키면서, nBuLi 용액(헥산 중의 1.28 M, 27.8 mL, 35.7 mmol, 1.05 당량, 254 mM 최종 농도)의 용액을 내부 온도가 +10 ℃를 초과하지 않는 속도로 (~10 분) 실린지를 통해 적가하였다. 반응 혼합물을 15 분간 0 ℃에서 교반하고, -78 ℃로 냉각하고 THF (5 mL) 중의 에틸 아이소뷰티레이트 (4.60 mL, 4.0 g, 34.0 mmol, 1.0 당량, 242 mM 최종 농도)의 용액을 내부 온도가 -65 ℃를 초과하지 않는 속도로 (~5 분간) 실린지를 통해 적가하였다. 반응 혼합물을 45 분간 -78 ℃에서 교반한 다음, THF (5 mL) 중의 1-브로모-3-클로로 프로판 (3.37 mL, 34.0 mmol, 1.0 당량, 242 mM 최종 농도)의 용액을 내부 온도가 -68 ℃를 초과하지 않는 속도로 첨가하였다. 반응 혼합물을 15 분간 -78 ℃에서 교반하고, 0 ℃로 가온시키고, 15 분간 0 ℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 EtOAc (100 mL) 및 5% KHSO4 (100 mL)으로 희석하였다. 수상을 분리하고 EtOAc (3 x 50 mL)으로 추출하였다. 조합된 유기 상을 염수로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 톨루엔 (10 mL x 2)으로부터 농축하여 밝은 노란색 오일로서 6.17 g (32.0 mmol, 90%)의 원하는 클로라이드를 수득하였다:
1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ4.13 (q, J=7.2 Hz, 2 H), 3.49 - 3.56 (m, 2 H), 1.62 - 1.83 (m, 4 H), 1.26 (t, J=7.1 Hz, 3 H), 1.17 - 1.22 (m, 6 H)
(b) 에틸 5-아지도-2,2-다이메틸펜타노에이트.
Figure pct00027
[91] 교반 막대, 고무 격막, 및 질소 주입구를 장착한 100-mL 둥근바닥 플라스크를 에틸 5-클로로-2,2-다이메틸펜타노에이트 (6.17 g, 32.0 mmol, 1.0 당량, 533 mM 최종 농도), DMSO (60 mL), 및 소듐 아자이드 (2.7 g, 42 mmol, 1.3 당량, 690 mM)로 채웠다. 반응 혼합물을 블라스트 쉴드 뒤에서 70 ℃에서 18 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 주위 온도로 냉각시키고 EtOAc (200 mL) 및 H2O (100 mL)으로 희석하였다. 유기 상을 분리하고, H2O (3 x 100 mL) 및 염수 (100 mL)로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 농축하였다. 컬럼 크로마토그래피 (40 g 실리카 겔 카트리지; 단계적 구배 용리: 0%, 5%, 10%, 20% EtOAc/헥산)를 통해 정제하여, 밝은 노란색 오일로서 5.40 g (27.1 mmol, 85%)의 원하는 아자이드를 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ4.13 (q, J=7.0 Hz, 2 H), 3.26 (t, J=5.9 Hz, 2 H), 1.46 - 1.65 (m, 4 H), 1.26 (t, J=7.2 Hz, 3 H), 1.19 (s, 6 H).
(c) 6-아지도-1-사이아노-3,3-다이메틸-2-헥사논.
Figure pct00028
[92] 교반 막대, 고무 격막, 질소 주입구, 및 열전대 프로브를 장착하고, 히트 건으로 건조한 100-mL 둥근바닥 플라스크를 THF (40 mL), iPr2NH (3.0 mL, 21 mmol, 2.1 당량, 320 mM 최종 농도)으로 채웠다. 용액울 0 ℃에서 냉각시키면서, nBuLi (헥산 중의 1.28 M, 15.4 mL, 20.0 mmol, 2.0 당량, 305 mM 최종 농도)의 용액을 내부 온도가 +10 ℃를 초과하지 않는 속도로 (~5 분) 적가하고, 0 ℃에서 10 분간 교반하고, -78 ℃에서 냉각하였다. 아세토나이트릴 (1.10 mL, 21.0 mmol, 2.1 당량, 322 mM 최종 농도)를 내부 온도가 (-65 ℃)를 초과하지 않는 속도로 실린지를 통해 적가하였다. 반응 혼합물을 15 분간 -78 ℃에서 교반한 다음, THF (4 mL) 중의 에틸 5-아지도-2,2-다이메틸펜타노에이트 (2.04 g, 10.0 mmol, 1.0 당량, 153 mM 최종 농도)의 용액을 내부 온도가 -65 ℃를 초과하지 않는 속도로 (~3 분간) 실린지를 통해 첨가하였다. 반응 혼합물을 10 분간 -78 ℃에서 교반하고, 0 ℃로 가온시키고, 15 분간 0 ℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 EtOAc (50 mL) 및 5% KHSO4 (50 mL)으로 희석하였다. 수성 층을 분리하고 EtOAc (3 x 50 mL)으로 추출하였다. 조합된 유기 상을 염수 (50 mL)로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 농축하였다. 컬럼 크로마토그래피 (40 g 실리카 겔 카트리지; 단계적 구배 용리: 15%, 20%, 30%, 40% EtOAc/헥산)를 통해 정제하여, 밝은 노란색 오일로서 1.18 g (6.07 mmol, 59%)의 원하는 케톤을 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ3.61 (d, J=0.4 Hz, 2 H), 3.32 (t, J=6.3 Hz, 2 H), 1.42 - 1.68 (m, 5 H), 1.17 - 1.24 (m, 6 H).
(d) 6-아지도-1-사이아노-3,3-다이메틸-2-헥산올 .
Figure pct00029
[93] 교반 막대, 고무 격막, 및 질소 주입구를 장착한 25-mL 둥근바닥 플라스크를 6-아지도-1-사이아노-3,3-다이메틸-2-헥사논 (1.18 g, 6.08 mmol, 1.0 당량, 243 mM 최종 농도) 및 MeOH (25 mL)으로 채우고 0 ℃에서 냉각하였다. NaBH4 (114 mg, 3.04 mmol, 0.5 당량, 122 mM 최종 농도)를 1 회분의 고체로서 첨가하였다. 반응 혼합물을 30 분간 0 ℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 EtOAc (50 mL) 및 5% KHSO4 수용액 (50 mL)으로 희석하였다. 수상을 분리하고 EtOAc (3 x 50 mL)으로 추출하였다. 조합된 유기 상을 염수 (40 mL)로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 농축하였다. 컬럼 크로마토그래피 (40 g 실리카 겔 카트리지; 단계적 구배 용리: 20%, 30%, 40%, 50% EtOAc/헥산)를 통해 정제하여, 밝은 노란색 오일로서 1.1 g (5.61 mmol, 97%)의 원하는 링커 알코올을 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ3.68 - 3.79 (m, 1 H), 3.30 (t, J=6.6 Hz, 2 H), 2.39 - 2.60 (m, 2 H), 2.23 - 2.29 (m, 1 H), 1.20 - 1.68 (m, 4 H), 0.93 (s, 3 H), 0.92 (s, 3 H)
(e) 6-아지도-1-사이아노-3,3-다이메틸-2-헥실 석신이미딜 카보네이트.
Figure pct00030
[94] 교반 막대, 고무 격막, 및 질소 주입구를 장착하고, 히트 건으로 건조한 50-mL 둥근바닥 플라스크를 NHS (440 mg, 3.83 mmol, 1.5 당량, 217 mM 최종 농도), DCM (17 mL), 및 트라이포스진 (378 mg, 1.28 mmol, 0.5 당량, 72 mM 최종 농도)으로 채우고 0 ℃에서 냉각하였다. 반응 혼합물을 0 ℃에서 냉각시키면서, 피리딘 (0.68 mL, 8.4 mmol, 3.3 당량, 48 mM 최종 농도) 실린지를 통해 적가하였다. 반응 혼합물을 주위 온도로 가온시키고, 30 분간 주위 온도에서 교반하였다. THF (1 mL) 중의 6-아지도-1-사이아노-3,3-다이메틸-2-헥산올 (500 mg, 2.55 mmol, 1.0 당량, 144 mM 최종 농도)의 용액을 실린지를 통해 적가하였다. 반응 혼합물을 주위 온도에서 1 시간 동안 교반하고, 0 ℃에서 냉각하고, H2O (10 mL)을 첨가하여 켄칭하였다. 반응 혼합물을 추가적으로 EtOAc (50 mL) 및 H2O (50 mL)으로 희석하였다. 유기 상을 분리하고 물 (50 mL), 5% KHSO4 수용액, 염수 (50 mL)로 세척하고, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 농축하였다. 컬럼 크로마토그래피 (40 g 실리카 겔 카트리지; 단계적 구배 용리: 25%, 30%, 35%, 40% 아세톤/헥산)를 통해 정제하여, 백색 고체로서 638 mg (1.89 mmol, 74% 수율)의 원하는 활성화된 링커를 수득하였다.
1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ4.93 (dd, J=7.1, 5.3 Hz, 1 H), 3.32 (s, 2 H), 2.86 (s, 4 H), 2.71 - 2.79 (m, 2 H), 1.29 - 1.72 (m, 4 H), 1.05 (s., 3 H), 1.04 (s., 3 H).
실시예 3
화학식(I)의 링커 (Z = 보호된 케톤)의 제조
Figure pct00031
[95] 석신이미딜 2,2-다이에톡시프로파노에이트: 진한 H2SO4 (0.5 mL)를 빙냉 피부르산 (8.8 g, 100 mmol) 및 트라이에틸 오쏘포메이트 (40 mL, 240 mmol)의 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 얼음 위에서 30 분간 교반한 다음, CH2Cl2으로 희석하고 2 번의 차가운 물에 이어 염수로 세척한 후, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 농축하여 미정제 2,2-다이에톡시프로판산 (11.16 g, 69 mmol)을 산출하였다. 이를 250 mL의 CH2Cl2에 용해시키고 N-하이드록시석신이미드 (8.7 g, 76 mmol)에 이어 다이사이클로헥실카보다이이미드 (15.6 g, 76 mmol)로 2 시간 동안 처리하였다. 뻑뻑한 백색 슬러리를 여과하여 다이사이클로헥실우레아를 제거한 다음, 실리카 겔 패드를 통과시켜 대부분의 황색을 제거하였다. 실리카 겔을 1:1 EtOAc/헥산으로 세정하고, 조합된 용출액을 농축하였다. 뜨거운 20% EtOAc/헥산으로부터 잔류물을 결정화하여 백색 결정으로서 석신이미딜 에스터의 첫 번째 수확물 (11.73 g, 45 mmol)을 제공하였다. 모액을 SiO2 에서 크로마토그래피한 후 (0 - 60% EtOAc/헥산) 결정화하여 추가적인 생성물을 제공하였고, 전체 13.0 g의 생성물을 수득하였다 (피부르산으로부터 전체 50%).
[96] 에틸 3-[(2,2-다이에톡시프로파노일)아미노]-2,2-다이메틸프로파노에이트 :10 mL의 DMF 중의 에틸 3-아미노-2,2-다이메틸프로파노에이트 (CombiBlocks; 1.82 g, 10 mmol) 및 석신이미딜 2,2-다이에톡시프로파노에이트 (2.6 g, 10 mmol)의 용액을 주위 온도에서 N,N-다이아이소프로필에틸아민 (3.5 mL, 20 mmol)으로 1 시간 동안 처리하였다. 혼합물을 EtOAc으로 희석하고 연속적으로 물, 5% KHSO4, 포화 NaHCO3 수용액, 및 염수로 세척한 다음, MgSO4로 건조하고, 여과하고, 농축하였다. SiO2 (0 - 70% MTBE/헥산)에서 크로마토그래피는 무색 오일로서 생성물 에스터 (2.48 g, 86%)를 제공하였다.
[97] 석신이미딜 카보네이트으로의 전환은 상기 다른 링커에 대해 약술된 절차를 따랐다.
실시예 4
화학식(I)의 링커 (X = N(R 6 )CH 2 Cl)의 제조
Figure pct00032
[98] 단계 1. 4-아지도-1-사이아노-3,3-다이메틸-2-뷰틸 4-(N,N-다이에틸카복스아마이도)페닐카바메이트. 피리딘을 THF 중의 4-아지도-1-사이아노-3,3-다이메틸-2-뷰탄올 및 트라이포스진의 용액에 첨가하였다. 15 분 후, 혼합물을 여과하고 농축하였다. 잔류물을 CH2Cl2에 용해시키고 N,N-다이에틸 4-아미노멘즈아마이드 및 트라이에틸아민으로 처리하였다. 1 시간 후, 혼합물을 CH2Cl2 으로 희석하고 5% KHSO4, 물, 및 염수로 세척한 다음, MgSO4으로 건조하고, 여과하고, 증발시켰다. 생성물을 결정화하였다.
[99] 단계 2. N-클로로메틸 4-아지도-1-사이아노-3,3-다이메틸-2-뷰틸 4-(N,N-다이에틸카복스아마이도)-페닐카바메이트. 단계 1의 카바메이트 (1 mmol), 파라폼알데하이드 (120 mg), 클로로트라이메틸실란 (0.5 mL), 및 1,2-다이클로로에탄 (4 mL)의 혼합물을 스크류 캡 바이알(screw-cap vial)에 밀봉하고 50 ℃에서 12 시간 동안 가열하였다. 냉각 후, 혼합물을 농축하고 잔류물을 10 mL의 MTBE에 재용해시키고, 여과하고 재농축하여, 무색 오일로서 N-클로로메틸 카바메이트를 산출하였다.
실시예 5
화학식(II)의 화합물 (Z = 아자이드)의 제조
Figure pct00033
[100] 화학식(II)의 화합물의 제조 방법은 n = 1, R4 = CH3, Z = N3이며 D는 Phe1의 알파-아미노 기를 통해 연결된 옥트레오타이드인 화합물에 대해 예시된다.
[101] Boc-옥트레오타이드. t-뷰틸 석신이미딜 카보네이트 (385 μL)의 용액 58.4 mg/mL을 아민이 없는(amine-free) 2 mL의 N,N-다이메틸폼아마이드 중의 옥트레오타이드 아세테이트 (128 mg) 및 N,N-다이아이소프로필에틸아민 (0.2 mL)의 혼합물에 첨가하였다. 4 시간 후, HPLC 분석은 91.6% 모노-Boc-옥트레오타이드, 3.0% 다이-Boc-옥트레오타이드, 및 5.4% 옥트레오타이드의 존재를 나타냈다. UV 분광광도계 분석은 43.5mM의 전체 옥트레오타이드 농도를 나타냈다. 이러한 용액을 정제하지 않고 사용하였다.
[102] 일반적인 절차. 화학식(I)의 화합물을 아민이 없는 DMF에 40 mM으로 용해시켰다. 상기 Boc-옥트레오타이드의 분취량 (500 μL, 21.8 μmol 전체 옥트레오타이드)를 화학식(I)의 화합물의 용액 (540 μL, 21.6 μmol)과 혼합하고 16 시간 동안 주위 온도에서 유지하였다. 반응을 5 mL의 빙냉 0.1 M 아세트산으로 희석하고, 침전된 링커-펩타이드를 원심분리로 수집하였다. 펠릿화된 물질을 4 mL의 메탄올에 용해시키고 분취용 HPLC (C18, 20-80% MeCN/H2O/0.1% TFA)으로 정제하였다 . 건조 후, 정제된 물질을 1 mL의 빙냉 95:5 트라이플루오로아세트산/물에 용해시켜 Boc 기를 제거하고, 10 분간 유지한 다음, 10 mL의 차가운 에터를 첨가하여 침전시키고 건조하였다.
[103] 상기 방법에 따라 제조된 화학식(II)의 화합물은 다음을 포함한다:
Nα-[(4-아지도-1-((N,N-다이메틸아미노)설포닐)-3,3-다이메틸-2-뷰톡시)카보닐]옥트레오타이드 (n = 1, R1 = SO2N(CH3)2, R2 = H, R4 = CH3, Z = N3, D = a-아미노 기를 통해 연결된 옥트레오타이드). 생성량 23.6 mg (84%), LC-MS : [M+H]+ = 1295.75 (예상 1295.6).
Nα-[(4-아지도-1-((N-에틸-N-메틸아미노)설포닐)-3,3-다이메틸-2-뷰톡시)카보닐]옥트레오타이드 (n = 1, R1 = SO2N(CH3)(CH2CH3), R2 = H, R4 = CH3, Z = N3, D = a-아미노 기를 통해 연결된 옥트레오타이드). 생성량 21.6 mg, LC-MS : [M+H]+ = 1309.75 (예상 1309.6).
Nα-[(4-아지도-1-((모폴리노설포닐)-3,3-다이메틸-2-뷰톡시)카보닐]옥트레오타이드 (n = 1, R1 = SO2N(CH2CH2)2O, R2 = H, R4 = CH3, Z = N3, D = a-아미노 기를 통해 연결된 옥트레오타이드). 생성량 19.9 mg (84%), LC-MS : [M+H]+ = 1337.7 (예상 1337.6).
Nα-[(4-아지도-1-((N,N-비스(2-메톡시에틸)아미노설포닐)-3,3-다이메틸-2-뷰톡시)카보닐]옥트레오타이드 (n = 1, R1 = SO2N(CH2CH2OCH3)2, R2 = H, R4 = CH3, Z = N3, D = a-아미노 기를 통해 연결된 옥트레오타이드). 생성량 35.4 mg, LC-MS : [M+H]+ = 1383.8 (예상 1383.7).
Nα-[(4-아지도-1-((아이소프로필설포닐)-3,3-다이메틸-2-뷰톡시)카보닐]옥트레오타이드 (n = 1, R1 = SO2CH(CH3)2, R2 = H, R4 = CH3, Z = N3, D = a-아미노 기를 통해 연결된 옥트레오타이드). 생성량 16.8 mg, LC-MS : [M+H]+ = 1294.7 (예상 1294.6).
Nα-[(4-아지도-1-(1-사이아노-3,3-다이메틸-2-뷰톡시)카보닐]옥트레오타이드 (n = 1, R1 = CN, R2 = H, R4 = CH3, Z = N3, D = a-아미노 기를 통해 연결된 옥트레오타이드).
Nα-[(4-아지도-1-(1-(메틸설포닐)-3,3-다이메틸-2-뷰톡시)카보닐]옥트레오타이드 (n = 1, R1 = SO2CH3, R2 = H, R4 = CH3, Z = N3, D = a-아미노 기를 통해 연결된 옥트레오타이드).
N α -링커 -[Gln 28 ]-엑세나타이드
Figure pct00034
[104] N α -{4-아지도-3,3-다이메틸-1-[(N,N-다이메틸)아미노설포닐]-2-뷰틸옥시카보닐}-[Gln 28 ]엑세나타이드. 25 mL 프릿(fritted) SPE 컬럼에서, Rink 아마이드 수지 (0.63 meq/g 치환, 0.12 mmol 펩타이드/g 펩타이드-수지, 1.00 g 펩타이드-수지, 0.12 mmol 펩타이드) 상의 보호된 [Gln28]엑세나타이드 (Fmoc α-아민)를 10 mL의 DMF에서 30 분간 주위 온도에서 팽윤시켰다. F/F Luer 어탭터 및 12 mL 실린지를 사용하는 실린지 여과에 의해 DMF를 제거하고, 팽윤된 수지를 DMF 중의 5% 4-메틸피페리딘으로 처리하였다 (2x 10 mL, 각각 5 분; 이후 2x 10 mL, 각각 20 분). 이후 Fmoc-보호 해제된 수지를 DMF으로 세척하고 (10x 10 mL), 상층액을 실린지 여과로 제거하였다. 세척된 수지를 8.4 mL DMF에 현탁시키고 3.6 mL의 O-{4-아지도-3,3-다이메틸-1-[(N,N-다이메틸)아미노설포닐]-2-뷰틸}-O'-석신이미딜 카보네이트 (DMF 중의 0.10 M, 0.36 mmol, 30 mM 최종 농도) 및 4-메틸모폴린 (40 μL, 0.36 mmol, 30 mM 최종 농도)으로 처리하였다. 반응 혼합물을 오비탈 쉐이커를 사용하여 교반하였다. 20 시간 후, 상등액을 실린지 여과로 제거하고, 수지를 연속적으로 DMF (5x 15 mL) 및 CH2Cl2 (5x 15 mL)으로 세척하였다. Kaiser 테스트는 중간체 링커-변형 수지에서 유리 아민에 의해 음성이었다. 그런 다음 수지를 오비탈 쉐이커에서 부드럽게 교반하면서 10 mL의 미리 냉각된 (0 ℃) 90:5:5 TFA:TIPS:H2O으로 처리하였다. 2 시간 후, 수지를 진공 여과하고 TFA (2x 1.5 mL)으로 세척하였다. 여액을 회전 증발에 의해 ~6 mL으로 농축시켰다. 칭량된 50 mL Falcon 튜브에서 40 mL의 -20 ℃ MTBE에 TFA 농축물을 적가하여 미정제 링커-펩타이드를 침전시켰다. -20 ℃에서 10 분간 인큐베이션한 후, 미정제 링커-펩타이드 현탁액을 원심분리로 펠릿화하고 (3000x g, 2 분, 4 ℃), 상등액을 따라내었다. 생성된 펠릿을 40 mL의 -20 ℃ MTBE에 현탁시키고, 볼텍싱하여 혼합하고, 원심분리하고, 상기와 같이 따라내었다. 고진공 하에서 건조한 후, 펠릿을 회백색 고체 (575 mg)로서 단리하고 이를 8 mL의 5% AcOH (~70 mg/mL)에 용해시켰다. 50 ℃ 수조에서 45 분간 가열한 후, 용액을 분취용 C18 HPLC으로 정제하여 수용액으로서 13 mL의 표제 화합물 (3.33 mM, A280에 의해 43 μmol)을 제공하였다. 동결 건조는 235 mg의 백색 고체를 제공하였다.
280 nm에서 결정된 C18 HPLC 순도: 90.0% (RV = 11.47 mL)
Mav: 계산치 4476.9 ; 관찰치 4476
실시예 6
화학식(II)의 화합물 (Z = 케톤)의 제조
Figure pct00035
[105] Z = 케톤인 화학식(II)의 화합물의 제조는 n = 1, R1 = SO2N(CH3)2, R2 = H, 각각의 R4 = CH3, Z = NH-피루보일, 및 D = N-연결된 옥트레오타이드인 실시예에 의해 예시된다.
[106] DMF 중의 t-뷰틸 석신이미딜 카보네이트(440 μL)의 250 mM 용액을 아민이 없는 2 mL의 DMF 중의 옥트레오타이드 아세테이트 (128 mg) 및 N,N-다이아이소프로필에틸아민 (0.2 mL)의 혼합물에 첨가하였다. 1 시간 후, HPLC 분석은 90% 모노-Boc-옥트레오타이드, 2.5% 다이-Boc-옥트레오타이드, 및 7% 옥트레오타이드의 존재를 나타냈다. 100 μL의 DMF 중의 4-(2-다이에톡시프로피온아마이도)-1-((N,N-다이메틸아미노)설포닐)-3,3-다이메틸-2-뷰틸 석신이미딜 카보네이트 (실시예 3; 54 mg)의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 주위 온도에서 16 시간 동안 유지한 다음, EtOAc으로 희석하고 5% KHSO4에 이어 염수로 세척하였다. Na2SO으로 건조한 후, 혼합물을 여과하고 농축하여 발포체로서 완전히-보호된 중간체를 산출하였다. 이를 1 mL의 CH3CN에 용해시키고 1 mL의 2 N HCl으로 30 분간 50 ℃에서 처리하였다. 용액을 주위 온도로 냉각시키고, 2 mL의 물로 희석하고 5 mL의 1 M NaHCO3에 조심스럽게 첨가하였다. 침전된 생성물을 원심분리로 수집하고, 물 및 다이클로로메탄으로 세척하고, 5 mL의 메탄올에 용해시켰다.
실시예 7
화학식(II)의 링커-약물 (Y = N(R 6 )CH 2 )의 제조
Figure pct00036
[107] 10 mL의 1:1 DMF/THF 중의 SN-38 (100 mg) 용액을 얼음 위에서 냉각하고 1 M 포타슘 tert-뷰톡사이드 (0.26 mL, 1 Eq)를 적가 처리하였다. 생성된 주황색 현탁액을 30 분간 교반한 다음, 1 mL의 THF 중의 N-(클로로메틸)카바메이트 링커 (실시예 4, 1 mmol)의 용액을 첨가하였다. 주황색이 점차 옅어지고 현탁액이 투명해졌다. 혼합물을 10% 시트르산 수용액을 첨가하여 켄칭한 다음, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 추출물을 물 및 염수로 세척한 다음, MgSO4으로 건조하고, 여과하고, 증발시켰다. SiO2 상에서 헥산 중의 0-100% 아세톤의 구배를 사용한 크로마토그래피에 의한 정제는 화학식(II)의 링커-약물이되 n = 1, R1 = CN, R2 = H, 각각의 R4 = Me, D = SN-38, Y = N(R6)CH2 (R6 = 4-(N,N-다이에틸카복스아마이도페닐)), 및 Z = 아자이드인 링커-약물을 제공하였다.
[108] Z = 아민인 상응하는 화합물은 다음과 같이 제조하였다. THF 중의 Z = 아자이드인 화합물의 용액을 THF 중의 1 M 트라이메틸포스핀 및 아세트산의 혼합 V에 첨가하였다. 기체 발생이 중단된 후, 물을 첨가하고 혼합물을 1시간 동안 교반한 후 농축 건조시켰다. 잔연물을 물과 에틸 아세테이트 사이에 분배하고, 수상을 수집하고 건조하였다. 분취용 HPLC에 의한 최종 정제는 0-100% 아세토나이트릴/물/0.1% TFA의 구배를 사용하였다.
실시예 8
M이 가용성 PEG 및 Z* = 1,2,3-트라이아졸인 화학식(III)의 컨쥬게이트 형성
[109] 아세토나이트릴 중의 20-kDa 4-아암 PEG-테트라(사이클로옥틴) (하기 실시예 14에 따라 제조, 예비중합체 B) 및 실시예 5의 Z = 아자이드인 링커-약물의 혼합물을 50 ℃에서 16 시간 동안 유지하였다. 물에 이어 메탄올에 대한 투석 (12-kDa SpectraPor 2)은 M이 가용성 4-아암 PEG이고 Z*가 1,2,3-트라이아졸인 정제된 화학식(III)의 컨쥬게이트를 제공하였다.
실시예 9
M이 가용성 PEG 및 Z* = 옥심인 화학식(III)의 컨쥬게이트 형성
[110] 20-kDa 4-아암 PEG-테트라(아미노옥시아세트아마이드)는 DMF에서 HATU 및 N,N-다이아이소프로필에틸아민의 존재하에 20-kDa 4-아암 PEG-테트라아민 (100 mg, NOF America)을 과량의 (Boc-아미노옥시)아세트산과 반응시켜 제조하였다. 1 시간 후, 교반되는 MTBE에 천천히 첨가하여 PEG를 침전시키고, 원심분리로에 의해 수집하고, 진공하에 건조하였다. 이를 2 mL의 1:1 CH2Cl2/CF3CO2H에 용해시키고, 1 시간 동안 유지하고, 증발 건조시켰다. 잔류물을 2 mL의 THF에 용해시키고, 교반되는 MTBE에 천천히 첨가하여 생성물을 침전시키고, 원심분리로에 의해 수집하고, 진공하에 건조하였다.
[111] 1:1 DMSO/0.1 M 아세트산 중의 20-kDa 4-아암 PEG-테트라(아미노옥시아세트아마이드) 및 실시예 6의 Z = 케톤인 링커-약물의 혼합물을 50 ℃에서 16 시간 동안 유지하였다. 물에 이어 메탄올에 대한 투석 (12-kDa SpectraPor 2)은 M이 가용성 4-아암 PEG이고 Z*가 옥심인 정제된 화학식(III)의 컨쥬게이트를 제공하였다.
실시예 10
M이 가용성 PEG 및 Z* = 카복스아마이드인 화학식(III)의 컨쥬게이트 형성
[112] THF 중의 20-kDa 4-아암 PEG-테트라(석신이미딜 에스터) (JenKem), N,N-다이아이소프로필에틸아민, 및 실시예 7의 Z = 아민인 링커-약물의 혼합물을 1 시간 동안 교반하였다. 물에 이어 메탄올에 대한 투석 (12-kDa SpectraPor 2)은 M이 가용성 4-아암 PEG이고 Z*가 카복스아마이드인 정제된 화학식(III)의 컨쥬게이트를 제공하였다.
실시예 11
M이 불용성 분해성 PEG 마이크로스피어인 화학식(III)의 컨쥬게이트 형성
[113] 화학식(IV)의 PEG 마이크로스피어이되 P1 및 P2 가 모두 10-kDa 4-아암 PEG, Z* = 1,2,3-트라이아졸, n = 1, 각각의 R4 = CH3, R1 = SO2N(CH3)2, R2 = H, 및 W = CH((CH2)4NH2)C(=O)NH (즉, x = 0, y = 4, z = 0, B = NH2, 및 C* = 카복스아마이드) (하기 실시예 14에 따라 제조)인 화학식(IV)의 PEG 마이크로스피어 현탁액 (100 mL)을 4-아세토나이트릴에서 사이클로옥티닐 석신이미딜 카보네이트 및 N,N-다이아이소프로필에틸아민과 반응에 의해 활성화였다. 다수의 반응성 기 Z' = 사이클로옥티닐을 포함하는 생성된 하이드로겔을 pH 5인 50 mM 아세테이트 완충액에 현탁시키고, 화학식(II)의 링커-약물이되 Z = 아자이드, n = 1, 각각의 R4 = CH3, R1 = SO2N(CH3)2, R2 = H, 및 D = -HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKQGGPSSGAP-NH2 (엑세나타이드-[N28Q] (실시예 5)인 링커-약물의 용액과 반응시켰다. 50 ℃에서 48 시간 후, 컨쥬게이션되지 않은 펩타이드를 제거하기 위해 마이크로스피어를 아세테이트 완충액으로 광범위하게 세척하였다. 분석은 패킹된 마이크로스피어 슬러리가 2.1 μmol 연결된 펩타이드/mL 슬러리를 포함하는 것을 나타냈다.
실시예 12
방출 역학
[114] 컨쥬게이트를 100 mM 완충액에 0.25 - 2 mM으로 용해시키고 온도 조절된 HPLC 오토샘플러에서 37 ℃로 유지하였다. 샘플 (5 - 10 μL)을 주기적으로 제거하고 HPLC (Phenomenex Jupiter 5 um 4.6x150 mm C18 역상)에 주입하고 0부터 100% MeCN/H2O/0.1% TFA의 선형 구배로 1 mL/분으로 용출시켰다. 피크는 280 nm (펩타이드) 또는 350 nm (다이나이트로페닐-Lys)에서 검출되었으며 컨쥬게이트 및 방출된 펩타이드에 대해 피크 면적을 제공하기 위해 통합하였다. 약물 방출의 정도는 (방출 약물 면적)/[(방출 약물 면적)+(컨쥬게이트 면적)]으로서 계산하였다. 상기 실시예 5에 기재된 바와 같은 α-아민에 연결된 옥트레오타이드는 실시예 8에 기재된 바와 같은 20-kDa MeO-PEG-사이클로옥틴에 컨쥬게이션된다. pH 7.4에서의 방출에 대한 반감기는 주어진 pH에서 다음의 방정식을 사용하여 수득된 결과로부터 계산하였다
t1/2(pH 7.4) = ln(2)ㆍ10(X-7.4)/kobs
표 1
Figure pct00037
표 1. 다양한 pH 값 및 온도에서 보레이트 완충액에서 가용성 PEG 컨쥬게이트로부터 α-연결된 옥트레오타이드 방출의 역학. a t1/2, 37 ℃ = (t1/2, 38 o C)*1.143 (Santi PNAS 2012, SI의 아레니우스 방정식 참조). 모든 경우에, n = 1, R2 = H, 각각의 R4 = Me, Z = N3, Y는 부재하고, D = N-연결된 옥트레오타이드.
실시예 13
아자-마이클 반응의 역학
[115] 순반응의 역학 : 3개의 1.5 mL 유리 HPLC 바이알 각각에, DMSO 중의 5 mM 표준, β메틸, 또는 젬 다이메틸(gem-dimethyl) 비닐 설폰 (0.1 mL, 0.5 μmol, 0.5 mM 최종 농도)의 용액을 0.9 mL의 미리 데워진 글리신 절단 완충액 A, B, 또는 C에 첨가하였다. 바이알을 가열된 (37 ℃) HPLC 오토샘플러에서 유지하고, 아자-마이클 반응을 C18 HPLC으로 주기적으로 모니터링하였다.
절단 완충액 A: 1.1 M 글리신 (1.0 M 최종 농도), 0.11 M HEPES, pH 7.4 @ 37 ℃.
절단 완충액 B: 1.1 M 글리신 (1.0 M 최종 농도), 0.11 M Bicine, pH 8.4 @ 37 ℃.
절단 완충액 C: 0.11 M 글리신 (0.10 M 최종 농도), pH 9.5 @ 37 ℃.
Keq를 다음의 방정식을 사용하여 계산하였다:
Keq = Keq app / [Gly]
Keq app = [GA]eq/[VS]eq = 플래토/(0.5 mM - 플래토)
[Gly] = 글리신 농도 (M)
[GA] = 글리신 부가물 농도 (mM)
[VS] = 비닐 설폰 농도 (mM)
Prism에서 결정된 플래토(plateau) (mM).
[116] 두 개의 미지수, kf (결합) 및 kr (해리)는 Prism fit 및 상기 정의된 Keq app에 의해 결정된 kobs를 사용하여 하기 두 개의 방정식으로부터 계산된다:
kobs = kf[Gly] + kr
kf[Gly]/kr = Keq app.
[117] 역반응의 역학: 해리성 레트로-아자-마이클 반응의 속도를 (도 2.3A) 단리된 글리신 부가물로부터 직접적으로 측정하였다. 각각의 정제된 글리신 부가물을 37 ℃에서 첨가된 글리신의 부재하에 pH 7.4 HEPES 완충액으로 희석하였다. 출발 글리신 부가물의 농도를 시간에 대해 플롯팅하였으며, 각각의 곡선을 Prism에서 1차 붕괴에 대해 피팅하였다 (도 2.3B). 각각의 반응에 대해, 계산된 무한대 값은 <1 μM이며, 이는 반응이 완료될 때까지 진행되는 것을 나타내므로, kr은 본질적으로 kobs와 동일하다. 3 개의 0.3 mL 플라스틱 원뿔형 HPLC 바이알 각각에, DMSO 중 0.7-3.8 mM의 표준, β메틸, 또는 젬 다이메틸 설포-DIBO 글리신 부가물 (11 nmol, 50 μM 최종 농도) 용액을 미리 데워진 0.2 mL의 0.1 M HEPES (pH 7.0)에 첨가하였으며, 이는 최종 부피를 0.22 mL로 조정하기에 충분한 물을 함유하였다. 반응물 바이알을 가열된 (37 ℃) HPLC 오토샘플러에서 유지하고, 레트로 아자-마이클 반응을 C18 HPLC으로 주기적으로 모니터링하였다. 출발 글리신 부가물 [GA]의 농도 (μM)를 하기 방정식을 사용하여 계산하였으며 Prism을 사용하여 시간에 대해 플롯팅하였다:
[GA] = ga/(ga+vs)*50 μM
[GA] = 글리신 부가물 농도 (μM)
ga = 글리신 부가물 통합 HPLC 피크 영역 (254 nm)
vs = 비닐 설폰 통합 HPLC 피크 영역 (254 nm)
50 μM = [GA] i 및 가능한 최대 [VS]
kr (해리)는 Prism에서 1차 붕괴에 대한 데이터를 피팅하여 결정하였다.
실시예 14
분해성 PEG-하이드로겔의 제조
Figure pct00038
[118] 본 발명의 하이드로겔은 반응하여 연결 작용기, C*를 형성할 수 있는 C 및 C'기를 포함하는 두 가지 예비중합체의 중합에 의해 제조한다. C 또는 C' 중 하나에 대한 예비중합체 연결은 화학식(I)의 분자와의 반응에 의해 유도된 절단가능한 링커를 추가로 포함하여, 하이드로겔의 각 가교에 절단 가능한 링커를 도입할 수 있다.
[119] 하나의 구체예에서, 제1 예비중합체는 4-아암 PEG를 포함하며, 여기서 각각의 아암은 두 개의 상호-비반응성 (“직교”) 작용기 B 및 C를 가지는 어댑터 유닛으로 종결된다. B 및 C는 초기에 보호된 형태로 존재하여, 후속 단계에서 선택적인 화학 작용을 할 수 있다. 특정 구체예에서, 어댑터 유닛은 아미노산 유도체, 구체적으로 라이신, 시스테인, 아스파르테이트, 또는 글루타메이트의 유도체를 비롯하여 알파-아민 기가 아자이드로 전환된 유도체, 예를 들어 2-아자이도글루타르산의 모노에스터이다. 어댑터 유닛은 연결 작용기 A*를 통해 각각의 제1 예비중합체 아암에 연결되고, 이는 각각의 예비중합체 아암 상의 작용기 A와 어댑터 유닛 상의 동족 작용기 A'의 축합에 의해 형성된다. 제2 예비중합체는 4-아암 PEG을 포함하며, 여기서 각각의 아암은 제1 예비중합체의 C 기와 상보적인 반응성을 가지는 작용기 C'로 종결되어, C 및 C'가 반응하여 C*를 형성할 때 두 예비중합체 사이에서 가교가 일어난다.
[120] 예시적인 실시예로서, 제1 예비중합체는 다음과 같이 제조하였다. H-Lys(Boc)-OH를 Z = 아자이드인 화학식(I)의 링커로 아실화하여, A = COOH, B = Boc-보호된 NH2, 및 C = 아자이드인 어댑터 유닛을 제공하였다. 이는 20-kDa 4-아암 PEG-테트라아민에 커플링되며, Boc 기는 제거되어 A* = 아마이드, B = NH2, 및 C = 아자이드인 제1 예비중합체를 제공하고, 여기서 절단 가능한 화학식(I)의 링커는 각각의 아암과 제1 예비중합체의 C 기 사이에 연결부로 혼입된다. 상응하는 제2 예비중합체는 20-kDa 4-아암 PEG-테트라아민을 5-사이클로옥티닐 석신이미딜 카보네이트로 아실화하여 제조하였고, C' = 사이클로옥틴인 제2 예비중합체를 제공한다. 제1 및 제2 예비중합체를 혼합할 때, C = 아자이드 및 C' = 사이클로옥틴 기의 반응은 상응하는 트라이아졸 기를 형성하며 이에 따라 두 예비중합체를 3차원 네트워크로 가교 결합시키고, 각각의 가교 결합은 화학식(I)의 화합물의 혼입으로부터 생성된 절단 가능한 링커를 포함하며, 여기서 제1 예비중합체의 혼입으로부터 생성된 각각의 노드(node)는 나머지 작용기 B = NH2를 포함하는데 이는 추가적인 링커, 약물, 형광단, 금속 킬레이터, 등의 부착을 위해 유도체화될 수 있다.
A* = 아마이드, B = 아민, 및 C = 아자이드인, 예비중합체 A
Figure pct00039
(1) N α -Boc-N ε -{4-아지도-3,3-다이메틸-1-[(N,N-다이메틸)아미노설포닐]-2-뷰틸옥시카보닐}-Lys-OH
[121] 28 mL의 H2O 중의 Boc-Lys-OH (2.96 g, 12.0 mmol) 용액을 1 M NaOH 수용액 (12.0 mL, 12.0 mmol), 1 M NaHCO3 수용액 (10.0 mL, 10.0 mmol), 및 50 mL의 MeCN 중의 O-{4-아지도-3,3-다이메틸-1-[(N,N-다이메틸)아미노설포닐]-2-뷰틸}-O'-석신이미딜 카보네이트 (3.91 g, 10.0 mmol, 0.1 M 최종 농도)의 용액으로 연속적으로 처리하였다. 주위 온도에서 2 시간 동안 교반한 후, C18 HPLC (ELSD)에 의해 반응이 완료된 것으로 판단하였다. 반응을 30 mL의 1 M KHSO4 (aq)으로 켄칭하였다. 혼합물을 500 mL의 1:1 EtOAc:H2O 사이에 분배하였다. 수상을 100 mL의 EtOAc으로 추출하였다. 조합된 유기상을 H2O 및 염수 (각 100 mL)으로 세척한 다음 MgSO4로 건조하고, 여과하고, 회전 증발로 농축하여 백색 발포체로서 미정제 표제 화합물 (5.22 g, 9.99 mmol, 99.9% 미정제 수율)을 제공하였다.
C18 HPLC, ELSD에 의해 계산된 순도: 99.1% (RV = 9.29 mL).
LC-MS (m/z): 계산치, 521.2; 관찰치, 521.3 [M-H]-.
(2) N α -Boc-N ε -{4-아지도-3,3-다이메틸-1-[(N,N-다이메틸)아미노설포닐]-2-뷰틸옥시카보닐}-Lys-OSu.
다이사이클로헥실카보다이이미드 (자일렌 중의 60%, 2.6 M, 4.90 mL, 12.7 mmol)를 98 mL의 CH2Cl2 중의 N α -Boc-N ε -{4-아지도-3,3-다이메틸-1-[(N,N-다이메틸)아미노설포닐]-2-뷰틸옥시카보닐}-Lys -OH (5.11 g, 9.79 mmol, 0.1 M 최종 농도) 및 N-하이드록시석신이미드 (1.46 g, 12.7 mmol) 용액에 첨가하였다. 반응 현탁액을 주위 온도에서 교반하고 C18 HPLC (ELSD)으로 모니터링하였다. 2.5 시간 후, 반응 혼합물을 여과하고, 여액을 SiliaSep 120 g 컬럼에 로딩하였다. 생성물을 헥산 중의 아센톤의 단계적 구배 (각 0%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 240 mL)로 용출시켰다. 깨끗한 생성물-함유 분획을 조합하고 농축하여 백색 발포체로서 표제 화합물 (4.95 g, 7.99 mmol, 81.6% 수율)을 수득하였다.
C18 HPLC, ELSD에 의해 결정된 순도: 99.7% (RV = 10.23 mL).
LC-MS (m/z): 계산치, 520.2; 관찰치, 520.2 [M+H-Boc]+.
(3) (N α -Boc-N ε -{4-아지도-3,3-다이메틸-1-[(N,N-다이메틸)아미노설포닐]-2-뷰틸옥시카보닐}-Lys) 4 -PEG 20kDa .
[122] PEG20kDa-(NH)4 (20.08 g, 0.9996 mmol, 3.998 mmol NH2, 0.02 M NH2 최종 농도)를 145 mL의 MeCN에 용해시켰다. 50 mL의 MeCN 중의 N α -Boc-N ε -{4-아지도-3,3-다이메틸-1-[(N,N-다이메틸)아미노설포닐]-2-뷰틸옥시카보닐}-Lys-OSu (2.976 g, 4.798 mmol) 용액을 첨가하였다. 반응물을 주위 온도에서 교반하고 C18 HPLC (ELSD)으로 분석하였다. 출발 물질은 3 개의 느린 용출 중간체 피크를 통해 단일 생성물 피크로 전환되었다. 1 시간 후, Ac2O (0.37 mL, 4.0 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 교반 30 분 더 교반한 다음 회전 증발로 ~50 mL으로 농축하였다. 반응 농축물을 400 mL의 교반되는 MTBE에 첨가하였다. 혼합물을 교반 주위 온도에서 30 분간 교반한 다음 따라내었다. MTBE (400 mL)를 습윤 고체에 첨가하고, 현탁액을 5 분간 교반하고 따라내었다. 고체를 진공 필터로 옮기고, 3x 100 mL의 MTBE로 세척/분쇄하였다. 필터에서 10분 동안 건조시킨 다음, 무게를 잰 250mL HDPE 포장 병으로 고체를 옮겼다. 잔류 휘발성 물질을 중량이 안정화될 때까지 고진공 하에서 제거하여 백색 고체로서 표제 화합물 (21.23 g, 0.9602 mmol, 96.1% 수율)을 제공하였다.
C18 HPLC, ELSD에 의해 결정된 순도: 89.1% (RV = 10.38 mL) 및 불순물 10.6% (RV = 10.08).
(4) (N ε -{4-아지도-3,3-다이메틸-1-[(N,N-다이메틸)아미노설포닐]-2-뷰틸옥시카보닐}-Lys) 4 -PEG 20kDa .
[123] (Nε-{4-아지도-3,3-다이메틸-1-[(N,N-다이메틸)아미노설포닐]-2-뷰틸옥시카보닐}-Lys)4-PEG20kDa (19.00 g, 0.8594 mmol, 3.438 mmol Boc, 0.02 M Boc 최종 농도)를 86 mL의 1,4-다이옥산에 용해시켰다. PEG를 완전히 용해시키기 위해 5 분간 교반한 후, 다이옥산 중의 4 M HCl (86 mL, 344 mmol HCl)를 첨가하였다. 반응물을 주위 온도에서 교반하고 C18 HPLC (ELSD)으로 분석하였다. 출발 물질은 3 개의 빠른 용출 중간체 피크를 통해 단일 생성물 피크로 전환되었다. 2 시간 후, 반응 혼합물을 ~40 mL으로 농축하였다. THF (10 mL)를 농축물에 첨가하고, 용액을 다시 ~40 mL으로 농축하였다. 점성이 있는 오일을 400 mL의 교반되는 Et2O에 부었다. 주위 온도에서 20 분간 교반한 후, 상등액을 침전물로부터 따라내었다. 200 mL Et2O를 사용하여 습윤 고체를 진공 필터로 옮기고 Et2O (3x 75 mL)으로 세척하였다. 고체를 필터에서 10분 동안 건조시킨 다음, 무게를 잰 250mL HDPE 포장 병으로 옮겼다. 잔류 휘발성 물질을 고진공 하에서 밤새 제거하여 백색 고체로서 표제 화합물 (17.52 g, 0.8019 mmol, 93.3% 수율 @ 4 HCl)을 제공하였다.
C18 HPLC, ELSD에 의해 결정된 순도: 99.2% (RV = 9.34 mL).
C' = 사이클로옥티닐인 예비중합체 B.
[124] 4-mL의 스크류 탑 바이알을 PEG20kDa-[NH2]4 (SunBright PTE-200PA; 150 mg, 7.6 μmol PEG, 30.2 μmol NH2, 1.0 당량, 20 mM final 아민 농도), MeCN (1.5 mL), 및 iPr2NEt (7 μL, 40 μmol, 1.3 당량, 27 mM 최종 농도)으로 채웠다. 활성화된 에스터 사이클로옥틴 (39 μmol, 1.3 당량, 27 mM 최종 농도) 용액을 첨가하고 반응 혼합물을 주위 온도에서 교반하였다. 반응을 ELSD에 의한 C18 HPLC (11 분에 걸쳐 20-80%B)으로 모니터링하였다. 완료되면, Ac2O (3 μL, 30 μmol, 출발 NH2 당 1 당량)을 반응 혼합물에 첨가하고 혼합물을 30 분간 교반하였다. 반응 혼합물을 뻑뻑한 오일로 농축하고 MTBE (20 mL)에 현탁시켰다. 생성된 현탁액을 격렬하게 10 분간 교반하였다. 생성된 고체를 격렬하게 혼합하고, 원심분리기에서 펠릿화하고 (2800 rpm, 4 ℃, 10 분), 피펫으로 상등액을 제거하여, MTBE (20 mL)으로 3회 분쇄하였다. 생성된 고체를 진공 하의 주위 온도에서 30 분 이하 동안 건조시켰다. 스톡 용액은 20 mM의 표적 아민 농도 20 mM NaOAc (pH 5)에 제조하였다. 사이클로옥틴 농도는 PEG7-N3 (2 당량)으로 처리 및 반응하지 않은 PEG7-N3를 DBCO-CO2H로 역적정하여 확인하였다.
[125] 이러한 절차를 사용하여 제조된 거대 단량체는, 각각 MFCO 펜타플루오로페닐 에스터, 5-((4-나이트로페녹시-카보닐)옥시)사이클로옥틴, 3-(4-나이트로페녹시카보닐)옥시사이클로옥틴, BCN 하이드록시석신이미딜 카보네이트, DIBO 4-나이트로페닐 카보네이트, 3-(카복시메톡시)사이클로옥틴 석신이미딜 에스터, 및 3-(하이드록시에톡시)사이클로옥틴 4-나이트로페닐 카보네이트를 사용하여 제조된, 사이클로옥틴 기가 MFCO, 5-하이드록시사이클로옥틴, 3-하이드록시사이클로옥틴, BCN, DIBO, 3-(카복시메톡시)사이클로옥틴, 및 3-(2-하이드록시에톡시)사이클로옥틴인 것을 포함한다.
[126] 하이드로겔 마이크로스피어 제조. 하이드로겔 마이크로스피어는 [Schneider et al. (2016) Bioconjugate Chemistry 27: 1210-15]에 기재된 바와 같이 제조하고 활성화하였다.
실시예 15
화학식(II)의 화합물이되 Z = N 3 , n = 1, R 1 = (4-메틸페닐)SO 2 , R 2 = H, 각각의 R 4 = Me, Y = 부재, 및 D = Lys B28 를 통해 부착된 인슐린 리스프로인 화합물
[127] 고체상 펩타이드 합성 (실시예 5 참조)에 의한 화학식(II)의 화합물의 대안적인 제조로서, D가 펩타이드인 화학식(II)의 화합물은 펩타이드의 적어도 하나의 아민 기가 반응에 대해 존재하지 않는 조건하에서 활성화된 화학식(I)의 링커와의 미리 형성된 반응에 의해 형성될 수 있다. 펩타이드가 N-말단 알파-아민 및 하나 이상의 라이신 엡실론-아민 모두를 포함하는 경우, 라이신 엡실론-아민에 대한 링커의 우선적인 부착은 높은 pH에서 또는 과량의 3차 아민의 존재하에 유기 용매에서 반응을 수행함으로써 수득될 수 있다.
[128] 1 개의 Humalog 10-mL 바이알 (100 U/mL)을 0.1 N HCl을 사용하여 pH 5.4로 조정하고, 생성된 침전물을 원심분리하여 수집하고, 펠릿을 2x15 mL의 에탄올, 1x15 mL의 메틸 t-뷰틸 에터 (MTBE)으로 세척하고, 진공하에 건조하였다. 건조된 인슐린 리스프로 (35 mg, 6 μmol)를 3 mL의 다이메틸 폼아마이드 (DMF) 및 30 μL (170 μmol)의 N,N-다이아이소프로필에틸아민 (DIPEA)에 용해시켰다. DMF 중의 100 mM 4-아지도-3,3-다이메틸-1-(4-메틸페닐설포닐)-2-뷰틸 석신이미딜 카보네이트 용액 (84 μL, 8.4 μmol)을 첨가하고 혼합물을 주위 온도에서 1 시간 동안 교반하였다. 혼합물을 진공하에 증발 건조시키고, 잔류물을 10 mL의 3:1 물/아세토나이트릴/0.1% 트라이플루오로아세트산에 용해시켰다. 15 mL/분으로 20 분에 걸쳐 21.2x150 mm Jupiter 5 um 300A C18 역상 컬럼을 사용하고, 30-50% 아세토나이트릴/물/0.1% TFA의 구배를 사용하는 분취용 HPLC에 의한 정제는 링커가 B-사슬 Lys28 의 -아민을 통해 부착된 순수한 아지도-링커-리스프로 (화학식(II)의 화합물이되 Z = N3, n = 1, R1 = (4-메틸페닐)SO2, R2 = H, 각각의 R3 = Me, Y = 부재, 및 D = LysB28 를 통해 부착된 인슐린 리스프로인 화합물)을 제공하였다.
[129] 유사한 화학식(II)의 링커-펩타이드는 펩타이드 테두글루타이드, [Gly2]GLP-2를 사용하여 제조하였다.
실시예 16
PEG 컨쥬게이트 방출 인슐린 리스프로
화학식(III)의 화합물이되, M = 20-kDa MeO-PEG, Z* = 트라이아졸, n = 1, R 1 = (4-메틸페닐)SO 2 , R 2 = H, 각각의 R4 = Me, Y = 부재, D = Lys B28 를 통해 부착된 인슐린 리스프로, 및 q = 1인 화합물.
[130] 1 mL의 아세토나이트릴 중의 20-kDa 메톡시-PEG-아민 (BroadPharm, 100 mg, 5 μmol), DIPEA (3 μL, 17 μmol), 및 (1R,8S,9s)-바이사이클로[6.1.0]논-4-인-9-일메틸 석신이미딜 카보네이트 (BCN-OSu, Sigma, 2 mg, 7 μmol) 용액을 주위 온도에서 1 시간 동안 교반한 다음, 증발 건조하였다. 잔류물을 1 mL의 THF에 용해시키고 용액을 교반하면서 10 mL의 MTBE에 첨가하였다. 침전된 PEG-사이클로옥틴을 수집하고, MTBE으로 세척하고, 진공하에서 건조하였다.
[131] 1 mL의 1:1 아이소프로판올:시트레이트 완충액 (pH 4) 중의 실시예 15 아지도-링커-인슐린 리스프로 (1.1 μmol) 및 PEG-사이클로옥틴 (20 mg, 1 μmol)의 혼합물을 주위 온도에서 4 시간 동안 유지한 다음, 12-14 kDa 컷오프 멤브레인을 사용하여 물에 이어 메탄올에 대해 투석하였다. 투석된 생성물을 증발 건조시켜 화학식(III)의 화합물이되, M = 20-kDa MeO-PEG, Z* = 트라이아졸, n = 1, R1 = (4-메틸페닐)SO2, R2 = H, Y = 부재, D = LysB28를 통해 부착된 인슐린 리스프로, 및 q = 1인 화합물을 제공하였다.
[132] pH 9.4, 37 ℃의 0.1 M 보레이트 완충액에 용해되는 경우, 이러한 컨쥬게이트는 t1/2 = 2.08 시간으로 유리 인슐린 리스프로를 방출하였다. 이는 pH 7.4, 37 ℃에서 t1/2 = 208 시간으로 외삽한다.
[133] R1 = 페닐-SO2인 동족 컨쥬게이트를 유사하게 제조하였으며, pH 9.4, 37 ℃의 0.1 M 보레이트 완충액에 용해되는 경우, t1/2 = 0.8 시간으로 유리 인슐린 리스프로를 방출하였다. 이는 pH 7.4, 37 ℃에서 t1/2 = 80 시간으로 외삽한다.
실시예 17
방출 가능한 인슐린 리스프로를 포함하는 하이드로겔
[134] 실시예 15의 아자이드-링커-인슐린 리스프로를 실시예 14의 분해성 PEG-하이드로겔에 부착하여 인슐린 리스프로의 서방형 데포를 제공하였다. PEG-하이드로겔을 위해, 예비중합체 A는 (Nα-Boc-Nε-{4-아지도-3,3-다이메틸-1-[(N,N-다이메틸)아미노설포닐]-2-뷰틸옥시카보닐}-Lys)4-PEG10kDa, 이었고, 예비중합체 B는 ((4-사이클로옥티닐옥시-카보닐)아미노)4-PEG10kDa이었으며, P1 및 P2 는 모두 10-kDa 4-아암 폴리(에틸렌 글리콜), Z* = 트라이아졸, n = 1, R1 = (N,N-다이메틸아미노)SO2, R2 = H, 각각의 R4 = CH3, 및 W = (CH2)x-CH[(CH2)yB]-(CH2)zC 이되 여기서 x = 4, y = 0, z = 0, B = NH2, 및 C* = 카복스아마이드인, PEG-화학식(IV)의 하이드로겔을 제공하였다. 이러한 PEG-하이드로겔은 이전에 PCT 공보 WO2019/152672에 기재된 바와 같이 마이크로스피어로서 형성되었으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조 문헌으로 포함된다.
[135] 아세토나이트릴 (TNBS 분석에 의해 10.8 μmol의 NH2를 함유하는 3.5 g) 중의 이러한 하이드로겔 마이크로스피어 (B = NH2) 의 패킹된 현탁액을 4.5 시간 동안 BCN-OSu (16.2 μmol) 및 트라이에틸아민 (43.1 μmol)과 반응에 의해 링커-약물 부착에 대해 활성화시켰다. 임의의 반응하지 않은 아민 기를 캡핑하기 위해 아세트산 무수물 (10.8 μmol)을 첨가하고, 2시간 후 슬러리를 11 mL 아세토나이트릴으로 5회 세척한 다음 11 mL의 약물-로딩 용매 (1:1 iPrOH:H2O 중의 100 mM 시트레이트 (pH 3.0))로 5회 세척하였다. 최종 패킹된 슬러리는 ~5.6 mL이었으며 7.3 μmol의 사이클로옥틴 (B = [(1R,8S,9s)-바이사이클로[6.1.0]논-4-인-9-일메톡시카보닐]아미노)를 함유하였다.
[136] 약물-로딩 용매 중의 활성화된 하이드로겔 마이크로스피어 및 아자이드-링커-인슐린 리스프로의 혼합물을 24 시간 동안 부드럽게 혼합한 다음, 현탁액을 반응 완충액으로 반복적으로 세척하여 임의의 반응하지 않은 아지도-링커-인슐린 리스프로 및 반응 부산물을 제거하였다. 최종 마이크로스피어 제제는 1.5 μmol/mL 인슐린 리스프로를 포함하였으며, pH 7.4, 37 ℃에서 t1/2 = 350 h으로 방출하였다.
실시예 18
방출 가능한 엑세나타이드를 포함하는 하이드로겔
[137] 실시예 14의 분해성 하이드로겔이되, P1 및 P2 는 모두 10-kDa 4-아암 폴리(에틸렌 글리콜)를 이고, Z* = 트라이아졸, n = 1, R1 = (N,N-다이메틸아미노)SO2, R2 = H, 각각의 R4 = CH3, 및 W = (CH2)x-CH[(CH2)yB]-(CH2)zC이되 여기서 x = 4, y = 0, z = 0, B = NH2, 및 C* = 카복스아마이드인 하이드로겔을 사이클로옥티닐 석신이미딜 카보네이트 (5HCO-OSu)와의 반응에 의해 활성화시킨 다음, 실시예 5의 아지도-링커-엑세나타이드[N28Q]를 부착하였다. 10.3 μmol 아민을 함유하는, MeCN 중의 패킹된 아미노 마이크로스피어 슬러리 (1.2 mL)를 순수한 트라이에틸아민 (41.1 μmol) 및 5HCO-NHS (15.4 μmol)와 조합하였다. 반응을 18 시간 동안 회전하여 혼합하고 정성적 TNBS 테스트로 아민의 로딩을 확인하였다 (일반적인 방법에 기재됨). 아세트산 무수물 (1 당량, 10.3 μmol)을 첨가하여 임의의 남아있는 유리 아민을 캡핑하고, 반응 2 시간 후 슬러리를 6 mL 아세토나이트릴으로 5 회 세척하였다. 최종 패킹된 슬러리는 1.4 mL이었으며 10.3 μmol 5HCO를 함유하였다. 2 개의 칭량된 10 mL 실린지를 ~9 μmol 5HCO를 함유하는, MeCN 중의 ~1g 5HCO-마이크로스피어 슬러리로 채웠다.. 슬러리를 6.5 mL의 반응 용매 (1:1 DMSO:H2O 중의 100 mM 시트레이트 (pH 3.0))로 4회 세척하였다. N3-펩타이드를 5HCO (11 μmol N3)에 대해 1.2 당량으로 패킹된 슬러리에 첨가하고, 37 ℃에서 18 시간 동안 교반하면서 인큐베이션하였다.
[138] 로딩된 마이크로스피어를 6.5 mL의 반응 용매 (최종 세척의 OD280 는 검출 미만)으로 5회 세척한 후 pH 5.0의 등장성 아세테이트 완충액 (10 mM Na 아세테이트, 143 mM NaCl, 0.05% 폴리소르베이트 20 (w/v)으로 3회 세척하고 및 0.8% Na 카복시메틸 셀룰로스를 함유하는 등장성 아세테이트 완충액으로 2회 세척하였다. 페이로드 농도 및 로딩된 분획은 주변 온도에서 1시간 동안 50mM NaOH의 9부피(~450μL)에 ~50μL의 패킹된 슬러리(~50mg)를 용해시켜 결정하였다. 페이로드 함량은 280 nm에서 [Gln28]엑세나타이드에 대한 흡광도 (E= 5500 M-1cm-1)에 의해 결정하였다. PEG 분석을 동일한 NaOH 가용화된 샘플에서 실행하여 각 구성에 대한 PEG 농도를 측정하고, 펩타이드 농도와 비교하여 분획 로딩을 결정하였다.
[137] 로딩된 마이크로스피어 (~50 mg) 샘플을 1.5 mL 스크류 탑 마이크로 원심분리 튜브에 넣고, 37 ℃에서 19 부피 (0.95 mL)의 100 mM Na 보레이트 완충액 (pH 9.4)을 첨가하여 방출 역학/겔화 해제(degelation) 반응을 시작하였다. 가능한 많은 시점을 포착하기 위해, 각각의 컨쥬게이트에 대한 두 반응을 18 시간 간격으로 시작하였다. 37 ℃의 수조에서 반응을 진탕하면서 인큐베이션하였다. t=0 및 다양한 시점에, 마이크로스피어 슬러리를 20,000 x g으로 펠릿화하고, 마이크로스피어 펠릿의 시각적 존재 또는 부재를 기록하고, 20 μL의 반응 상등액을 제거하고, 4 μL의 4M 아세트산을 첨가하여 켄칭하고, 샘플을 -20 ℃에 보관하였다. 반응 상등액 중의 엑세나타이드[N28Q] 농도를 Nanodrop UV-Vis에서 280nm에서의 흡광도로 결정하였다. 마이크로스피어의 상태를 또한 각각의 시점에 시각적으로 기록하였다 (고체/존재 또는 가용화/사라짐). 상등액 시점의 A280를 플롯팅하고 단일 지수에 대해 피팅하여 각각의 펩타이드에 대한 방출 속도를 결정하였다. 상청액 샘플에 대해 PEG 분석을 실행하여 각 시점에서 가용성 PEG 농도를 측정하고 가용화/역겔화 곡선을 생성하였다. 마이크로스피어 분석은 펩타이드 함량이 5.19 μmol/mL이며, 이는 이용 가능한 B 부위의 95% 로딩에 해당하는 것을 나타냈다. pH 9.4, 37 ℃에서, 이러한 하이드로겔 마이크로스피어 t1/2 = 17.5 시간으로 엑세나타이드[N28Q]를 방출하였으며, 32 시간의 겔화 해제 시간으로 용해하였다.
[140] 유사한 엑세나타이드-방출 하이드로겔은 실시예 17에 예시된 바와 같이 활성화 단계에서 사용하는 사이클로옥티닐 석신이미딜 카보네이트룰 BCN-OSu으로 대체하여 제조하였다.
[141] 이러한 엑세나타이드-방출 하이드로겔 마이크로스피어는 도 7에 도시된 일반 화학식을 가지며, 여기서 P1 및 P2는 각각 4-아암 폴리(에틸렌 글리콜)s이고, Z*는 트라이아졸이고, C*는 카복스아마이드이고, B*는 트라이아졸이고, L-D는 화학식(II)의 링커-약물이다.
실시예 19
링커-올리고뉴클레오타이드의 제조
[142] 포스포로싸이오에이트 CpG 올리고뉴클레오타이드 TLR9 수용체 작용제의 컨쥬게이트를 다음과 같이 제조하였다.
Figure pct00040
Figure pct00041
[143] 단계 1. N-[4-아지도-3,3-다이메틸-1-(4-클로로페닐)설포닐-2-뷰틸옥시카보닐]-Gly-OH. 0.56 mL의 H2O 중의 글리신 (18 mg, 0.24 mmol)의 용액을 1 M NaOH 수용액 (0.24 mL, 0.24 mmol), 1 M NaHCO3 수용액 (0.20 mL, 0.20 mmol), 및 1.0 mL의 MeCN 중의 4-아지도-3,3-다이메틸-1-(4-클로로페닐)설포닐-2-뷰틸 석신이미딜 카보네이트 (92 mg, 0.20 mmol, 0.1 M 최종 농도)의 용액으로 연속적으로 처리하였다. 주위 온도에서 45 분 동안 교반한 후, C18 HPLC (ELSD)에 의해 반응이 완료된 것으로 판단하였다. 반응을 5 mL의 1 M KHSO4 수용액으로 켄칭한 다음 20 mL의 1:1 EtOAc:H2O 사이에 분배하였다. 수상을 5 mL의 EtOAc으로 추출하였다. 조합된 유기상을 H2O 및 염수 (각 10 mL)으로 세척한 다음 MgSO4로 건조하고, 여과하고, 회전 증발로 농축하여 탁한 필름으로서 미정제 표제 화합물 (85 mg, 0.20 , 정량적 미정제 수율)을 제공하였다. C18 HPLC, ELSD에 의해 계산된 순도: 98.6% (RV = 9.42 mL). nLC-MS (m/z): 35Cl에 대한 계산치, 417.1; 관찰치, 417.0 [M-H]-; 37Cl에 대한 계산치, 419.1; 관찰치, 419.1 [M-H]-.
[144] 단계 2. N-[4-아지도-3,3-다이메틸-1-(4-클로로페닐)설포닐-2-뷰틸옥시카보닐]-Gly-OSu. 다이사이클로헥실카보다이이미드 (자일렌 중의 60%, 2.6 M, 100 μL, 0.26 mmol)를 1.9 mL의 CH2Cl2 중의 N-[4-아지도-3,3-다이메틸-1-(4-클로로페닐)설포닐-2-뷰틸옥시카보닐]-Gly-OH (85 mg, 0.20 mmol, 0.1 M 최종 농도) 및 N-하이드록시석신이미드 (30 mg, 0.26 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 현탁액을 주위 온도에서 교반하고 C18 HPLC (ELSD)으로 모니터링하였다. 1 시간 후, 반응 혼합물을 코튼 플러그를 통해 여과하고, 여액을 SiliaSep 4 g 컬럼에 로딩하였다. 생성물을 헥산 중의 아센톤의 단계적 구배 (0%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%; 각 25 mL)로 용출시켰다. 깨끗한 생성물-함유 분획을 조합하고 농축하여 탁한 필름으로서 표제 화합물 (74 mg g, 0.14 mmol, 70% 수율)을 수득하였다. 생성물을 1.4 mL의 MeCN에 용해시키고 -20 ℃에 보관하였다. C18 HPLC, ELSD에 의해 계산된 순도: 92.7% (RV = 10.00 mL). 주요 불순물은 가수분해 생성물이었으며 (7.3% @ 9.42 mL RV), HPLC 크로마토그래피 동안 생성되었을 수 있다.
[145] 단계 3 . 3'-{N-[4-아지도-3,3-다이메틸-1-(4-클로로페닐)설포닐-2-뷰틸옥시카보닐]-Gly-아미노알킬}-CpG-5'. 15 mL Falcon 튜브에, 22 ℃에서 0.11 M HEPES (pH 7.65) 중의 0.78 mM CpG-3'-NH2 (900 μL, 0.70 μmol, 0.5 mM 최종 농도) 용액을 340 μL의 0.11 M HEPES (100 mM HEPES 최종, pH 7.4, 37 ℃)으로 희석하였다. 용액을 37 ℃ 수조에서 30 분간 가온한 후 DMF 중의 100 mM N-[4-아지도-3,3-다이메틸-1-(4-클로로페닐)설포닐-2-뷰틸옥시카보닐]-Gly-OSu (140 μL, 14 μmol, 10 mM 최종 농도) 용액으로 처리하였다. 반응을 37 ℃에서 유지하고 C18 HPLC으로 주기적으로 모니터링하였다. 출발 물질은 30 분 이내에 ~90%의 단일 생성물 피크로 전환되었다. 반응을 Milli-Q 물으로 10 mL으로 희석하고, 2.5 mL의 용액을 4 개의 NAP-25 컬럼 각각에 로딩하였다. 올리고뉴클레오타이드는 제조업체의 프로토콜에 따라 각각의 컬럼으로부터 3.5 mL의 Milli-Q 물로 용출시키고, 용출액을 조합하여, A260H2O [농도 = 0.65/(290300)*100/5]에 의해 판단되는 바와 같이, 전체 45 μM의 올리고뉴클레오타이드의 용액 (14.0 mL, 0.63 μmol 전체 올리고; C18 HPLC에 의한 91% 링커-올리고)를 제공하였다. 올리고 용액을 2 개의 Amicon Ultra-4, 10 kDa 스핀 필터를 사용하여 1.4 mL으로 농축하여, A260H2O [농도 = 0.64/(290300)*1000/5]으로 판단되는 바와 같이, 0.44 mM의 전체 올리고뉴클레오타이드 (1.4 mL, 0.62 μmol 전체 올리고)를 함유하는 용액을 제공하였다. 260 nm에서 결정된 C18 HPLC 순도: 90.9% (RV = 5.98 mL) . Mav, 10284 (계산치); 관찰치, 10282 Da (ESI).
[146] R1 = 메틸설포닐 및 R1 = 페닐설포닐인 상응하는 링커-올리고뉴클레오타이드를 유사하게 제조하였다.
실시예 20
컨쥬게이션된 링커-올리고뉴클레오타이드의 제조
Figure pct00042
[147] 3'-[4-분지형-PEG 40kDa -BCN/N 3 -(GDM 4-ClPhSO 2 )-Gly-아미노알킬]-CpG-5', 134BH32. 1.5 mL 스크류 캡 Eppendorf 튜브에, 3'-{N-[4-아지도-3,3-다이메틸-1-(4-클로로페닐)-설포닐-2-뷰틸옥시카보닐]-Gly-아미노알킬}-CpG-5' (0.44 mM 전체 올리고, 1.00 mL, 0.44 μmol 전체 올리고)의 용액을 121 μL의 0.3 M MES 완충액 (pH 6.0, 30 mM 최종 완충 농도)로 희석하였다. 그 다음, MeCN 중 5 mM 4-분지형-PEG40kDa-BCN (88 μL, 0.44 μmol, 0.36 mM 최종 농도) 용액을 첨가하였다. 반응을 주위 온도에서 유지하고 C18 HPLC으로 모니터링하였다. 출발 물질은 단일 느린 용출 생성물 피크로 전환되었다. 18 시간 후, 반응 혼합물은 ~60% 생성물을 함유하였다. 반응 튜브를 32 ℃ 가열 블록에 두고 24 시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물이 ~67% 생성물을 함유하였다. 혼합물을 Phenomenex Jupiter C18 분취용 컬럼 (150 x 21.2 mm)에 로딩하고, 생성물을 20 분에 걸쳐 (8 mL/분)으로 50 mM Et3NㆍHOAc 중의 20%-95% MeCN (pH 7.0)으로 용출시켰다. 깨끗한, 생성물-함유 분획을 조합하고 MeCN를 회전 증발로 제거하여, A260H2O [농도 = 0.80/290300)/0.2 cm의 경로]에 의해 판단되는 바와 같이, 14 μM의 전체 올리고 (15 mL, 0.21 μmol)를 함유하는 수용액을 제공하였다. 수용액을 2 개의 Amicon Ultra-15, 10 kDa 스핀 필터를 사용하여 더욱 농축하여, A260H2O [농도 = 0.26/(290300)*1000/5]에 의해 판단되는 바와 같이, 0.18 mM의 전체 올리고뉴클레오타이드 (1.4 mL, 0.25 μmol, 71% 수율)를 함유하는 용액을 제공하였다. 260 nm에서 결정된 C18 HPLC 순도: 97.2% (RV = 8.26 mL).
실시예 21
컨쥬게이트로부터 올리고뉴클레오타이드 방출 역학
[148] 이중 격막으로 캡핑된 1.5 mL 유리 HPLC 바이알에, 800 μL의 125 mM 보레이트 완충액 (pH 9.0 @ 37 ℃), 및 182 μL의 H2O를 37 ℃ 오토샘플러에서 ≥30 분 동안 가온하였다. R1 = (4-클로로페닐)설포닐 (110 μM 전체 올리고, 18 μL, 2 μM 전체 올리고 최종 농도)인 실시예 19의 컨쥬게이트의 수용액을 각각 첨가하고, 절단가능한 반응을 C18 HPLC으로 주기적으로 모니터링하였다. 생성물 형성, 전체 260 nm 영역의 일부로서 CpG-3'-NH2 HPLC 피크 영역 (260 nm)을 시간에 대해 플롯팅하여, 평균 t1/2 = 1.2 시간을 제공하였으며, 이는 pH 7.4에서 48시간으로 외삽된다.
[149] 본 명세서에 개시된 모든 참조 문헌은 그 전체가 참조 문헌으로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> PROLYNX LLC ASHLEY, Gary W. HEARN, Brian FONTAINE, Shaun SCHNEIDER, Eric L. <120> IMPROVED CONJUGATION LINKERS <130> 670572002140 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> US 62/830,280 <151> 2019-04-05 <160> 5 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> [N28Q]exenatide <220> <221> AMIDATION <222> 39 <223> NH2 <400> 1 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu 1 5 10 15 Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Gln Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 2 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A chain of insulin lispro <400> 2 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asn Tyr Cys Asn 20 <210> 3 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B chain of insulin lispro <400> 3 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Lys Pro Thr 20 25 30 <210> 4 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Teduglutide ([Gly2]GLP-2) <400> 4 His Gly Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn 1 5 10 15 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 20 25 30 Asp <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> octreotide; Cys2-Cys7 cyclic disulfide <400> 5 Phe Cys Phe Trp Lys Thr Cys Thr 1 5

Claims (32)

  1. 화학식(I)의 링커로서,
    Figure pct00043
    (I),
    여기서:
    n은 0 내지 6의 정수이고;
    R1 및 R2는 독립적으로 전자-끄는 기, 알킬, 또는 H이되, R1 및 R2 중 적어도 하나는 전자-끄는 기이고;
    각각의 R4는 독립적으로 C1-C3 알킬이거나 또는 두 개의 R4는 이들이 부착되는 탄소 원자와 함께 3-6 원 고리를 형성하고;
    X는 이탈기이고;
    Z는 링커를 거대분자 담체에 연결하기 위한 작용기인 것인 링커.
  2. 제1항에 있어서, X는 할로겐, 활성 에스터, 임의 치환된 헤테로아릴, 또는 -N(R6)CH2Cl이되, R6는 임의 치환된 C1-C6 알킬, 임의 치환된 아릴, 또는 임의 치환된 헤테로아릴인 것인 링커.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, X는 할로겐, N-석신이미딜옥시, 나이트로페녹시, 펜타할로페녹시, 이미다졸릴, 트라이아졸릴, 테트라졸릴, 또는 -N(R6)CH2Cl인 것인 링커.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, Z는 아민, 아미노옥시, 케톤, 알데하이드, 말레이미딜, 싸이올, 알코올, 아자이드, 1,2,4,6-테트라아지닐, 트랜스-사이클로옥테닐, 바이사이클로노니닐, 사이클로옥티닐, 및 이의 보호된 변이체로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 링커.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, R1 및 R2의 전자-끄는 기는
    -CN;
    -NO2;
    임의 치환된 아릴;
    임의 치환된 헤테로아릴;
    임의 치환된 알케닐;
    임의 치환된 알키닐;
    -COR3, -SOR3, 또는 -SO2R3이되,
    여기서 R3는 H, 임의 치환된 알킬, 임의 치환된 아릴, 임의 치환된 아릴알킬, 임의 치환된 헤테로아릴, 임의 치환된 헤테로아릴알킬, -OR8 또는 -NR8 2이되 여기서 각각의 R8은 독립적으로 H 또는 임의 치환된　알킬이거나, 또는 두 개의 R8 기 모두 이들이 부착되는 질소 원자와 함께 헤테로사이클릭 고리를 형성하거나; 또는
    SR9이되, 여기서 R9은 임의 치환된 알킬, 임의 치환된 아릴, 임의 치환된 아릴알킬, 임의 치환된 헤테로아릴, 또는 임의 치환된 헤테로아릴알킬인 것인 링커.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, R1 및 R2 중 적어도 하나는 -CN 또는 -SO2R3인 것인 링커.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 R4는 독립적으로 C1-C3 알킬인 것인 링커.
  8. 화학식(II)의 링커-약물로서,
    Figure pct00044
    (II),
    여기서:
    n은 0 내지 6의 정수이고;
    R1 및 R2는 독립적으로 전자-끄는 기, 알킬, 또는 H이되, R1 및 R2 중 적어도 하나는 전자-끄는 기이고;
    각각의 R4는 독립적으로 C1-C3 알킬이거나 또는 두 개의 R4는 이들이 부착되는 탄소 원자와 함께 3-6 원 고리를 형성하고;
    Z는 링커-약물을 거대분자 담체에 연결하기 위한 작용기이고;
    D는 약물이고;
    D가 아민을 통해 연결된 약물인 경우 Y는 부재하거나, 또는 D가 페놀, 알코올, 싸이올, 싸이오페놀, 이미다졸, 또는 비염기성 아민을 통해 연결된 약물인 경우 Y는 -N(R6)CH2-이되; 여기서 R6는 임의 치환된 C1-C6 알킬, 또는 임의 치환된 아릴, 또는 헤테로아릴인 것인 링커-약물.
  9. 제8항에 있어서, Z는 아민, 아미노옥시, 케톤, 알데하이드, 말레이미딜, 싸이올, 알코올, 아자이드, 1,2,4,6-테트라아지닐, 트랜스-사이클로옥테닐, 바이사이클로노니닐, 사이클로옥티닐, 및 이의 보호된 변이체로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 링커-약물.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, D는 옥트레오타이드 (서열 번호 5), [N28Q]엑세나타이드 (서열 번호 1), 인슐린 리스프로 (A 사슬: 서열 번호 2; B 사슬: 서열 번호 3; 이황화 다리: A6-A11, A7-B7, A20-B19), 및 테두글루타이드 ([Gly2]GLP-2) (서열 번호 4)으로 구성된 군으로부터 선택된 펩타이드인 것인 링커-약물.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, R1 및 R2의 전자-끄는 기는
    -CN;
    -NO2;
    임의 치환된 아릴;
    임의 치환된 헤테로아릴;
    임의 치환된 알케닐;
    임의 치환된 알키닐;
    -COR3, -SOR3, 또는 -SO2R3이되,
    여기서 R3는 H, 임의 치환된 알킬, 임의 치환된 아릴, 임의 치환된 아릴알킬, 임의 치환된 헤테로아릴, 임의 치환된 헤테로아릴알킬, -OR8 또는 -NR8 2이되 여기서 각각의 R8은 독립적으로 H 또는 임의 치환된　알킬이거나, 또는 두 개의 R8 기 모두 이들이 부착되는 질소 원자와 함께 헤테로사이클릭 고리를 형성하거나; 또는
    SR9이되, 여기서 R9은 임의 치환된 알킬, 임의 치환된 아릴, 임의 치환된 아릴알킬, 임의 치환된 헤테로아릴, 또는 임의 치환된 헤테로아릴알킬인 것인 링커-약물.
  12. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, R1 및 R2 중 적어도 하나는 -CN 또는 -SO2R3인 것인 링커-약물.
  13. 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 R4는 독립적으로 C1-C3 알킬인 것인 링커-약물.
  14. 화학식(III)의 컨쥬게이트로서,
    Figure pct00045
    (III),
    여기서:
    n은 0 내지 6의 정수이고;
    R1 및 R2는 독립적으로 전자-끄는 기, 알킬, 또는 H이되, 여기서 R1 및 R2 중 적어도 하나는 전자-끄는 기이고;
    각각의 R4는 독립적으로 C1-C3 알킬이거나 또는 두 개의 R4는 이들이 부착되는 탄소 원자와 함께 3-6 원 고리를 형성하고;
    D는 약물이고;
    D가 아민을 통해 연결된 약물인 경우 Y는 부재하거나, 또는 D가 페놀, 알코올, 싸이올, 싸이오페놀, 이미다졸, 또는 비염기성 아민을 통해 연결된 약물인 경우 Y는 -N(R6)CH2-이되; 여기서 R6는 임의 치환된 C1-C6 알킬, 또는 임의 치환된 아릴, 또는 헤테로아릴이고;
    M은 거대분자 담체이고;
    M이 가용성 거대분자인 경우 q는 1 내지 10의 정수이거나, 또는 M이 불용성 매트릭스인 경우 q는 다중도(multiplicity)이며;
    Z*는 M에 대한 커플링을 나타내는 것인 컨쥬게이트.
  15. 제14항에 있어서, M은 가용성 거대분자이고, q는 1 내지 10의 정수인 것인 컨쥬게이트.
  16. 제14항에 있어서, M은 불용성 매트릭스이고, q는 다중도인 것인 컨쥬게이트.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, Z*는 카복실 아마이드, 옥심, 1,2,3-트라이아졸, 싸이오에터, 싸이오석신이미드, 또는 에터를 포함하는 것인 컨쥬게이트.
  18. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, R1 및 R2의 전자-끄는 기는
    -CN;
    -NO2;
    임의 치환된 아릴;
    임의 치환된 헤테로아릴;
    임의 치환된 알케닐;
    임의 치환된 알키닐;
    -COR3, -SOR3, 또는 -SO2R3이되,
    여기서 R3는 H, 임의 치환된 알킬, 임의 치환된 아릴, 임의 치환된 아릴알킬, 임의 치환된 헤테로아릴, 임의 치환된 헤테로아릴알킬, -OR8 또는 -NR8 2이되 여기서 각각의 R8은 독립적으로 H 또는 임의 치환된　알킬이거나, 또는 두 개의 R8 기 모두 이들이 부착되는 질소 원자와 함께 헤테로사이클릭 고리를 형성하거나; 또는
    SR9이되, 여기서 R9은 임의 치환된 알킬, 임의 치환된 아릴, 임의 치환된 아릴알킬, 임의 치환된 헤테로아릴, 또는 임의 치환된 헤테로아릴알킬인 것인 컨쥬게이트.
  19. 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, R1 및 R2 중 적어도 하나는 -CN 또는 -SO2R3인 것인 컨쥬게이트.
  20. 제14항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 R4는 독립적으로 C1-C3 알킬인 것인 컨쥬게이트.
  21. 화학식(IV)의 하이드로겔로서,
    Figure pct00046
    (IV),
    여기서:
    n은 0 내지 6의 정수이고;
    R1 및 R2는 독립적으로 전자-끄는 기, 알킬, 또는 H이되, 여기서 R1 및 R2 중 적어도 하나는 전자-끄는 기이고;
    각각의 R4는 독립적으로 C1-C3 알킬이거나 또는 두 개의 R4는 이들이 부착되는 탄소 원자와 함께 3-6 원 고리를 형성하고;
    W는 부재하거나 또는
    Figure pct00047
    이되,
    여기서 x, y, 및 z 각각은 독립적으로 0 내지 6의 정수이고, B는 -NH2, -ONH2, 케톤, 알데하이드, -SH, -OH, -CO2H, 카복스아마이드 기, 또는 사이클로옥틴 또는 바이사이클로노닌을 포함하는 기이고, C*는 카복스아마이드, 싸이오에터, 싸이오석신이미딜, 트라이아졸, 또는 옥심이고;
    P1 및 P2는 독립적으로 r-아암(r-armed) 중합체이되, 여기서 r은 2 내지 8의 정수인 것인 하이드로겔.
  22. 제21항에 있어서, P1 및 P2 는 모두 4-아암 중합체인 것인 하이드로겔.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, R1 및 R2의 전자-끄는 기는
    -CN;
    -NO2;
    임의 치환된 아릴;
    임의 치환된 헤테로아릴;
    임의 치환된 알케닐;
    임의 치환된 알키닐;
    -COR3, -SOR3, 또는 -SO2R3이되,
    여기서 R3는 H, 임의 치환된 알킬, 임의 치환된 아릴, 임의 치환된 아릴알킬, 임의 치환된 헤테로아릴, 임의 치환된 헤테로아릴알킬, -OR8 또는 -NR8 2이되 여기서 각각의 R8은 독립적으로 H 또는 임의 치환된　알킬이거나, 또는 두 개의 R8 기 모두 이들이 부착되는 질소 원자와 함께 헤테로사이클릭 고리를 형성하거나; 또는
    SR9이되, 여기서 R9은 임의 치환된 알킬, 임의 치환된 아릴, 임의 치환된 아릴알킬, 임의 치환된 헤테로아릴, 또는 임의 치환된 헤테로아릴알킬인 것인 하이드로겔.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, R1 및 R2 중 적어도 하나는 -CN 또는 -SO2R3인 것인 하이드로겔.
  25. 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 R4는 독립적으로 C1-C3 알킬인 것인 하이드로겔.
  26. 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 제8항 내지 제13항 중 어느 한 항의 링커-약물을 통해 하이드로겔에 부착된 약물을 추가적으로 포함하는 것인 하이드로겔.
  27. 제26항에 있어서, 약물은 옥트레오타이드 (서열 번호 5), [N28Q]엑세나타이드 (서열 번호 1), 인슐린 리스프로 (A 사슬: 서열 번호 2; B 사슬: 서열 번호 3; 이황화 다리: A6-A11, A7-B7, A20-B19), 및 테두글루타이드 ([Gly2]GLP-2) (서열 번호 4)으로 구성된 군으로부터 선택된 펩타이드인 것인 하이드로겔.
  28. 다음의 단계를 포함하는, 제8항 내지 제13항 중 어느 한 항의 링커-약물의 제조 방법:
    링커-약물이 형성되는 조건 하에서, 약물을 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 링커와 접촉시키는 단계, 및
    선택적으로 링커-약물을 단리하는 단계.
  29. 제14항 내지 20항 중 어느 한 항의 컨쥬게이트의 제조 방법으로서, 제8항 내지 제13항 중 어느 한 항의 링커-약물을, Z 및 Z' 기가 반응하여 잔여 연결 작용기 Z*를 형성하는 조건하에서, 동족 반응기 Z'를 포함하는 거대분자 담체와 반응시키는 단계를 포함하는 방법.
  30. 다음의 단계를 포함하는, 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항의 하이드로겔 제조 방법:
    (a) 화학식(V)의 제1 예비중합체로서, 다중-아암 중합체이되 각각의 아암은 반응성 작용기 Z를 포함하는 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 링커로 종결되는 것인 중합체를 포함하는 제1 예비중합체를 제공하는 단계,
    Figure pct00048
    (V);
    (b) 제2 예비중합체로서, 다중-아암 중합체이되 각각의 아암은 Z와 반응하는 동족 반응성 작용기 Z'로 종결되는 것인 중합체를 포함하는 제2 예비중합체를 제공하는 단계;
    (c) Z 및 Z'가 반응하여 잔여 연결 작용기 Z*를 형성하는 조건하에서 두 중합체를 혼합하는 단계; 및 선택적으로
    (d) 생성된 하이드로겔을 단리하는 단계.
  31. 약물-방출 분해성 하이드로겔 컨쥬게이트의 제조 방법으로서 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항의 하이드로겔을 제8항 내지 제13항 중 어느 한 항의 링커-약물과 반응시키는 단계를 포함하며, 여기서 하이드로겔의 작용기 B는 링커-약물의 Z 기와 반응하여 컨쥬게이트를 형성하는 것인 방법.
  32. 제30항에 있어서, 단계 (a)는
    화학식(V)의 제1 예비중합체를, 링커-약물의 Z 기가 B 기와의 반응을 통해 제1 예비중합체에 부착되는 조건하에서, 제8항 내지 제13항 중 어느 한 항의 링커-약물과 반응시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
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