WO2020045733A1 - 일산화질소 감응성을 갖는 아크릴아마이드계 고분자를 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents

일산화질소 감응성을 갖는 아크릴아마이드계 고분자를 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 Download PDF

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WO2020045733A1
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acrylamide
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meth
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nitrogen monoxide
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김원종
여지원
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포항공과대학교 산학협력단
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    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating an inflammatory disease comprising an acrylamide-based polymer having nitric oxide sensitivity, and more particularly, to a polymer prepared using an acrylamide-based monomer and a crosslinking agent sensitive to nitrogen monoxide.
  • the present invention relates to an acrylamide-based polymer capable of preventing or treating an inflammatory disease or disease caused by overexpression of nitrogen monoxide.
  • Nitric oxide is a highly reactive radical molecule that has a short half-life within a few seconds.It is produced in various cells of the human body and is a defense material that exhibits anticancer and antimicrobial activity in the immune system, a neurotransmitter in the nervous system, and a circulatory system. Is known as a vasodilator.
  • nitrogen monoxide is toxic at high concentrations, it may adversely affect the body, such as rheumatoid arthritis, osteoarthritis, and inflammatory bowel syndrome, when large amounts are released throughout the body.
  • Rheumatoid arthritis is an unknown inflammatory disease characterized by multiple arthritis. Inflammation initially occurs in the synovial lining of the joint, but gradually the inflammation around the cartilage and bones around the joint will cause the destruction and deformation. It is a disease that can invade the whole body such as anemia, dry syndrome, subcutaneous nodule pulmonary fibrosis, vasculitis and skin ulcer as well as joints.
  • rheumatoid arthritis is not yet known, but autoimmune phenomena are known as the main mechanism. Autoimmunity is the phenomenon of attacking the human body rather than the immune system to protect the human body from the outside. In general, genetic predisposition, bacterial or viral infections are thought to be the cause of rheumatoid arthritis. It is known to be prone to onset after physical or mental stress. Rheumatoid arthritis is also a refractory autoimmune disease that involves swelling, inflammation, stiffness, and pain in the joints. That is, it is a systemic disease in which the living body itself recognizes itself as a non-magnetic based on a recognition defect of the non-magnetic, attacks the own tissue, causes an abnormal immune response, and causes inflammation in the connective tissue.
  • nitric oxide in rheumatoid arthritis increases the bone uptake of cytokine-induced osteoclasts and promotes cell death in the joints, which is adversely affected.
  • the present inventors have prepared acrylamide-based polymers having nitric oxide sensitivity, and these polymers can capture nitrogen monoxide in the form of hydrogel and simultaneously capture nitrogen monoxide.
  • the present invention was completed by confirming that it is easy to administer in the body as a nano-sized hydrogel, and furthermore, it can prevent or treat inflammatory diseases caused by high concentration of nitrogen monoxide.
  • an object of the present invention is to provide an acrylamide-based polymer having nitric oxide sensitivity capable of preventing or treating an inflammatory disease or disease caused by overexpression of nitric oxide.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating inflammatory diseases comprising nitric oxide sensitive acrylamide-based polymer.
  • the acrylamide-based polymer is an acrylamide-based monomer; Crosslinking agent having a structure of formula (1); Radical initiators; And it may be a structure of formula 2 prepared using a catalyst.
  • R 1 , R 2 , R 3 , And R 4 are each independently hydrogen, a substituted or unsubstituted alkyl group of C1 to C10, and n is an integer of 1 to 1000.
  • R 1 , R 2 , R 3 , And R 4 may be each independently hydrogen.
  • the acrylamide monomers include acrylamide, (meth) acrylamide, N-isopropylacrylamide, N-tert-butylacrylamide, 3-hydroxypropyl (meth) acrylamide, 4-hydroxybutyl (meth) acryl Amide, 6-hydroxyhexyl (meth) acrylamide, 8-hydroxyoctyl (meth) acrylamide, 2-hydroxyethylhexyl (meth) acrylamide, N-methylol (meth) acrylamide, N, N- It may be at least one selected from the group consisting of dimethylol (meth) acrylamide, N-methoxy methyl (meth) acrylamide and N-propoxy methyl (meth) acrylamide.
  • the polymer may be in the form of a hydrogel, wherein the diameter of the hydrogel may be 10 nm to 500 nm.
  • the pharmaceutical composition may be an injection.
  • the inflammatory disease may be a disease in which nitric oxide in vivo exhibits an overexpression pattern.
  • the inflammatory disease may be rheumatoid arthritis.
  • the pharmaceutical composition may further include a bioactive material, and the nitric oxide sensitive acrylamide-based polymer having the structure of Formula 2 may support the bioactive material.
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating inflammatory diseases including acrylamide-based polymer having nitric oxide sensitivity according to the present invention, may simultaneously capture nitrogen monoxide.
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating inflammatory diseases including acrylamide-based polymer having nitric oxide sensitivity according to the present invention may prevent or treat a disease or disorder caused by overexpression of nitric oxide.
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating inflammatory diseases including acrylamide-based polymer having nitric oxide sensitivity according to the present invention is easy to administer in the body in the form of nano-sized hydrogel, and has high hydrophilicity and excellent biocompatibility.
  • NOCCL nitric oxide-degradable crosslinker
  • FIG. 2 is a 1 H-NMR spectrum for a nitric oxide-degradable crosslinker (NOCCL) according to one embodiment of the present invention.
  • NOCCL nitric oxide-degradable crosslinker
  • Example 3 is a TEM image before and after treating the nitrogen monoxide solution in Example 1 and Comparative Example 1 according to an embodiment of the present invention.
  • Example 4 is a DLS result after treating a nitric oxide solution or water in Example 1 according to an embodiment of the present invention.
  • N nitrogen monoxide-decomposable cross-linking agent
  • BOS N, N'-methylene bis-acrylamide
  • Figure 6 is a result of evaluating the hemolysis phenomenon for Example 1, nitric oxide-degradable crosslinking agent (NOCCL) and acrylamide monomer according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 7 is a photograph of the hind paw (Fig. 7a) and the front paw (Fig. 7b) observed by administering Example 1, Comparative Example 1, dexamethasone and buffer solution to the rheumatoid arthritis experimental animals according to an embodiment of the present invention .
  • Example 8 is a result of evaluating the severity of joint inflammation over time by administering Example 1, Comparative Example 1, dexamethasone and the buffer solution to the rheumatoid arthritis experimental animals for 5 weeks according to an embodiment of the present invention.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating inflammatory diseases including nitric oxide sensitive acrylamide-based polymer.
  • the acrylamide-based polymer is an acrylamide-based monomer; Crosslinking agent having a structure of formula (1); Radical initiators; And it is prepared using a catalyst, a polymer having a structure of formula (2).
  • R 1 , R 2 , R 3 , And R 4 are each independently hydrogen, a substituted or unsubstituted alkyl group of C1 to C10, and n is an integer of 1 to 1000.
  • the acrylamide monomer is a compound having a double bond and an amide functional group, and is a monomer capable of polymerization through radical polymerization.
  • the acrylamide monomers are acrylamide, (meth) acrylamide, N-isopropylacrylamide, N-tert-butylacrylamide, 3-hydroxypropyl (meth) acrylamide, 4-hydroxybutyl (meth) ) Acrylamide, 6-hydroxyhexyl (meth) acrylamide, 8-hydroxyoctyl (meth) acrylamide, 2-hydroxyethylhexyl (meth) acrylamide, N-methylol (meth) acrylamide, N, It may be at least one selected from the group consisting of N-dimethylol (meth) acrylamide, N-methoxy methyl (meth) acrylamide and N-propoxy methyl (meth) acrylamide. Preferably it is acrylamide, (meth) acrylamide, or a combination thereof, More preferably, acrylamide is not limited to this.
  • the physical and chemical properties of the polymer of the present invention may vary depending on the chemical structure of the acrylamide monomer.
  • polymers polymerized with acrylamide-based monomers having hydroxy have more hydrophilicity than polymers polymerized with acrylamide-based monomers, which facilitates swelling when absorbed into hydrogels and absorbs more moisture.
  • a polymer polymerized with an acrylamide monomer having an alkyl group may have a more hydrophobic form than a polymer polymerized with an acrylamide monomer, thereby forming a smaller hydrogel.
  • the crosslinking agent is a crosslinking agent capable of reacting with nitrogen monoxide (nitrogen monoxide-degradable crosslinking agent), which includes acrylamide groups at both ends, and reacts with nitrogen monoxide to produce amide-substituted benzotriazole intermediates, which are hydrolyzed in an aqueous medium. It is preferred that it is a decomposable compound.
  • the crosslinking agent is capable of sensitizing and nitrating nitrogen monoxide by reacting with nitrogen monoxide.
  • the crosslinking agent is preferably a compound containing an o-phenylenediamine moiety reacting with nitrogen monoxide.
  • the compound containing the o-phenylenediamine moiety may form an amide-substituted benzotriazole intermediate residue due to reaction with nitrogen monoxide, and the intermediate residue is hydrolyzed. And decomposed into benzotriazole residues and carboxylic acid residues, respectively.
  • the crosslinking agent may be synthesized as shown in FIG. 1.
  • the crosslinking agent may be synthesized in a four-step process.
  • 4-nitro-o-phenylenediamine is described.
  • the amino group of C-2 of 4-nitro-o-phenylenediamine is either Fmoc- or Boc. -Protected with the same protector.
  • the second step is to reduce 4-NO 2 to 4-NH 2 in 4-nitro-o-phenylenediamine.
  • the third step is to combine two amino groups of C-1 and C-4 with acryloyl chloride to form acrylamide
  • the fourth step is to remove the protecting group of C-2.
  • the solvent or catalyst used in step 4 is not particularly limited as long as it is used in the art.
  • the crosslinking agent has a structure of Formula 1, wherein R 1 and R 2 are each independently hydrogen, a substituted or unsubstituted alkyl group of C1 to C10.
  • the alkyl group may be linear, branched or cyclic.
  • R 1 and R 2 are each independently hydrogen, but are not limited thereto.
  • the radical initiator is a compound that generates a radical, and binds to the double bond portion of the acrylamide monomer to cause the polymerization reaction.
  • the radical initiator may be an oil soluble radical initiator, a water soluble radical initiator or an redox initiator, preferably a water soluble radical initiator, but is not limited thereto.
  • the water-soluble radical initiator is ammonium persulfate, potassium persulfate, sodium persulfate, or sodium bisulfate, sodium formaldehyde sulfoxide ( sodium formaldehyde sulfoxylate).
  • Oil-soluble radical initiators include amino persulfate, lauroyl peroxide, hydrogen peroxide, benzoyl peroxide, acetyl peroxide, and azobisisobutyronitrile.
  • azobisisobutyronitrile t-butyl hydroperoxide, dibutyl peroxide, benzoyl hydroperoxide, perbenzoic acid, peracetic acid, etc. It may be used alone or in combination with the above-described reducing agent.
  • the catalyst serves as an accelerator or a stabilizer of free radicals in making free radicals from a radical initiator, and the catalyst may be a polar additive.
  • the polar additive is, for example, a base, and in another example, a compound having an amine group, or trimethylamine, triethylamine, tripropylamine, and tetramethylethylenediamine. It is selected from the group consisting of, preferably triethylamine or tetramethylethylenediamine, but is not limited thereto.
  • the polymer according to the present invention may be a polymer in which repeating units of the acrylamide-based monomer and the crosslinking agent are arranged in a random, alternating or sequential manner, and are cross-linked polymers or branched polymers. (Branched Polymer).
  • the acrylamide-based monomer forms a backbone of the polymer
  • the crosslinking agent is a polymer formed by chemical crosslinking with a linker between the skeletons.
  • R 3 and R 4 are each independently hydrogen, a substituted or unsubstituted alkyl group of C1 to C10.
  • the alkyl group may be linear, branched or cyclic.
  • R 3 and R 4 are each independently hydrogen, but is not limited thereto.
  • N is an integer of 1 to 1000, preferably 30 to 500, but is not limited thereto.
  • the polymer according to the present invention may be prepared as a crosslinked polymer within minutes by mixing all of the acrylamide-based monomer, a crosslinking agent having a structure of Formula 1, a radical initiator, and a catalyst.
  • the method for preparing the polymer is very simple, yields high, economically low unit cost for the manufacturing process, and mass production is possible.
  • the temperature at the time of mixing in the manufacturing method of the polymer may be 15 to 25 °C at room temperature.
  • the polymer according to the present invention may have a weight average molecular weight (Mw) in the range of 2000 to 50,000.
  • the weight average molecular weight may be, for example, a conversion value for standard polystyrene measured using a gel permeation chromatograph (GPC), and unless otherwise specified, the term molecular weight may refer to a weight average molecular weight. have.
  • GPC gel permeation chromatograph
  • Such a molecular weight (Mw) may be useful, for example, when the polymer is crosslinked to form a hydrogel and used as a pharmaceutical composition.
  • the polymer may be cross-linked to form a hydrogel, wherein the hydrogel refers to a three-dimensional structure of a hydrophilic polymer having a sufficient amount of water.
  • the polymer is a high molecular compound having a three-dimensional crosslinked structure, it may be in the form of a hydrogel expanded by absorbing the moisture in the presence of moisture.
  • the hydrogel is a nano-sized hydrogel in a 100% swelling state, wherein the diameter of the hydrogel may be 10nm to 500nm. Preferably it is 20 nm-150 nm, More preferably, it is 30-70 nm.
  • the diameter of the hydrogel is less than 10nm, the effect of capturing nitrogen monoxide decreases, and when it exceeds 500nm, it is not easy to administer the body and the retention time in the body may be too short or the possibility of hemolysis may be increased.
  • the polymer may control the size of the hydrogel by adjusting the concentration of acrylamide-based monomers and crosslinking agents.
  • the polymer is a mixture ratio of the acrylamide monomer and the crosslinking agent may be adjusted differently depending on the size, physical properties, etc. of the hydrogel to be prepared.
  • the mixing ratio of the acrylamide-based monomer and the crosslinking agent may be a molar ratio of 1000: 0.3 to 1.0, preferably a molar ratio of 1000: 0.5 to 1.0, but is not limited thereto.
  • the polymer may be formed into a nano-sized hydrogel, and may be rapidly dissociated after swelling effectively after nitric oxide sensitization.
  • the polymer is in the form of a nano-sized hydrogel, very high hydrophilicity, and can carry a drug or protein.
  • conventional macro or micro-sized hydrogels require surgical implantation on the wound site, while the polymers according to the present invention can be administered into the body without injection as a nano-sized hydrogel without surgery. It has an easy advantage.
  • the hydrogel may capture nitrogen monoxide without including other bioactive substances, thereby alleviating or treating inflammation or disease caused by high concentration of nitrogen monoxide. That is, the hydrogel itself can be used as a therapeutic agent.
  • the hydrogel further comprises a bioactive material, it can further increase the effect in treating inflammation or disease caused by high concentration of nitrogen monoxide.
  • bioactive substances mean substances used for the treatment, healing, prevention or diagnosis of diseases, and examples thereof include proteins or peptides such as cells, growth factors and hormones, nucleic acids, extracellular matrix substances, and medicinal therapeutic functions. Drugs, and the like.
  • the bioactive material may be prepared to be included in any one solution, and mixed with the other solution to proceed to synthesize the hydrogel. In this case, the bioactive material is in a form supported on the crosslinked polymer hydrogel to be formed.
  • the polymer of the present invention can be used as a bioactive material carrier, cell carrier or drug carrier by having a hydrogel form. It can also be used as a tissue engineering support or cell therapy.
  • Examples of the drug as a bioactive material supported on the hydrogel include antibiotics, anticancer agents, anti-inflammatory drugs, antiviral agents, antibacterial agents and the like.
  • Antibiotics include derivatives and mixtures of tetracycline, minocycline, doxycycline, opfloxacin, levofloxacin, ciprofloxacin, clarithromycin, erythromycin, cefacller, cefotaxime, imipenem, penicillin, gentamicin, streptomycin, vancomycin and the like. The antibiotic selected can be illustrated.
  • anticancer agent examples include an anticancer agent selected from derivatives and mixtures of methotrexate, carboplatin, taxol, cis-platin, 5-fluorouracil, doxorubicin, etoposide, paclitaxel, camptothecin, cytosine arabinose and the like.
  • the anti-inflammatory agent may be exemplified by an anti-inflammatory agent selected from derivatives and mixtures of indomethacin, ibuprofen, ketoprofen, pyroxicam, flubiprofen, diclofenac and the like.
  • the antiviral agent may be exemplified by an antiviral agent selected from derivatives and mixtures such as acicollover, lovabin and the like.
  • the antimicrobial agent may be exemplified by an antimicrobial agent selected from derivatives and mixtures of ketoconazole, itraconazole, fluconazole, amphotericin-B, griseo fulvin and the like.
  • proteins and peptides that can be delivered to a living body by carrying on the hydrogel include hormones, cytokines, enzymes, antibodies, growth factors, transcriptional regulators, blood factors, vaccines, structural proteins, Various bioactive peptides such as ligand proteins, polysaccharides and receptors, cell surface antigens, receptor antagonists, derivatives and analogs thereof can be exemplified. Specifically, bone growth factor, liver growth hormone, growth hormone releasing hormones and peptides, interferons and interferon receptors (e.g.
  • interferon-alpha, -beta and -gamma, soluble type I interferon receptors, etc. granulocyte colony stimulating factors
  • G-CSF granulocyte colony stimulating factors
  • GM-CSF granulocyte-macrophage colony stimulating factor
  • GLP-1 glucacon-like peptides
  • G-protein-coupled receptors interleukins (e.g. interleukin) -1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, etc., interleukin receptors (e.g.
  • IL-1 receptor IL-4 receptor, etc.
  • enzymes Examples: Glucocerebrosidase, iduronate-2-sulfatase, alpha-galactosidase-A, agalsidase alpha, -beta, Alpha-L-iduronidase, chitinase, butyrylcholinesterase, lipase, glutamate Glutamate decarboxylase, imiglucerase, uricase, platelet-activating factor acetylhydrolase, neutral endopeptidase, myeloperoxidase (myeloperoxidase), interleukin and cytokine binding proteins (e.g.
  • IL-18bp TNF-binding proteins, etc.
  • macrophage activators macrophage peptides, B cell factor, T cell factor, protein A, allergic inhibitors, tumors Tumor Necrosis Factor (TNF) Alpha Inhibitor, Cell Necrosis Glycoprotein, Immunotoxin, Lymphotoxin, Tumor Necrosis Factor, Tumor Suppressor, Metastasis Growth Factor, Alpha-1 Antitrypsin, Albumin, Alpha-Lactalbumin -lactalbumin), apolipoprotein-E, erythropoietin, high glycated erythropoietin, angiopoietin, hemoglobin, thrombin, thrombin receptor activation Peptide, thrombomodulin, blood factor, blood factor a, blood factor XIII, plasminogen activator, fibrin-binding peptide, urokinase, streptokinase, hirudin
  • nerve growth factor ciliary neurotrophic factor, axogenesis factor
  • Axogenesis factor-1 brain-natriuretic peptide, glial derived neurotrophic factor, netrin, neutrophil inhibitor factor, neurotrophic factor, nu Thyroid hormone, relaxin, secretin, somatomedin, insulin-like growth factor, corticosteroids, glucagon, cholecystokinin, pancreatic polypeptide, gastrin releasing peptide, corticotropin releasing factor, thyroid stimulating hormone , Autotaxin, lactoferrin, myostatin, receptors (e.g.
  • TNFR TNFR
  • P55 IL-1 receptor
  • VEGF receptor VEGF receptor
  • B cell activator receptor etc.
  • receptor Antagonists e.g. IL1-Ra
  • cell surface antigens e.g. CD 2, 3, 4, 5, 7, 11a, 11b, 18, 19, 20, 23, 25, 33, 38, 40, 45, 69
  • monoclonal antibodies e.g. CD 2, 3, 4, 5, 7, 11a, 11b, 18, 19, 20, 23, 25, 33, 38, 40, 45, 69
  • monoclonal antibodies e.g. CD 2, 3, 4, 5, 7, 11a, 11b, 18, 19, 20, 23, 25, 33, 38, 40, 45, 69
  • monoclonal antibodies e.g. CD 2, 3, 4, 5, 7, 11a, 11b, 18, 19, 20, 23, 25, 33, 38, 40, 45, 69
  • monoclonal antibodies e.g. CD 2, 3, 4, 5, 7, 11a, 11b, 18, 19, 20, 23, 25, 33, 38, 40, 45, 69
  • monoclonal antibodies e
  • nucleic acids that can be physically supported or chemically coupled to the hydrogel to be delivered in vivo can include DNA, RNA, PNA, oligonucleotides, and the like.
  • Examples of the extracellular matrix material that can be physically supported or chemically coupled to the hydrogel to be delivered in vivo may include collagen, fibronectin, gelatin, laminin, and vitronectin.
  • Examples of cells that can be physically supported on the hydrogel to be delivered in vivo include stem cells, fibroblasts, vascular endothelial cells, smooth muscle cells, neurons, chondrocytes, bone cells, skin cells, Schwann cells, and the like.
  • the inflammatory disease is a disease in which nitric oxide is overexpressed in vivo, and is preferably any one selected from rheumatoid arthritis, type 1 diabetes, or systemic lupus erythematosus, and more preferably rheumatoid arthritis, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention includes a polymer capable of capturing with sensitivity to nitrogen monoxide, thereby capturing nitrogen monoxide in a high concentration of nitrogen monoxide to inhibit bone absorption of cytokine-induced osteoclasts, Preventing cell death in the joints can alleviate or treat rheumatoid arthritis.
  • the pharmaceutical composition may further include the above-described bioactive material, the nitrogen monoxide sensitive acrylamide-based polymer having a structure of Formula 2 may carry the bioactive material.
  • the pharmaceutical composition means a composition to be administered for a specific purpose.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is an acrylamide-based polymer having a nitric oxide sensitivity, which is used for the purpose of treating a disease or a disease caused by overexpression of nitrogen monoxide, and more preferably has a sensitivity to nitrogen monoxide. It is an acrylamide-based polymer including a cross-linking agent that can be simultaneously and simultaneously collected, and may include a protein and a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent involved therein.
  • Said "pharmaceutically acceptable" carrier or excipient means that which has been approved by the government's regulatory department, or listed in government or other generally approved pharmacopoeia for use in vertebrates, and more particularly in humans. do.
  • compositions suitable for parenteral administration can be in the form of suspensions, solutions or emulsions in oily or aqueous carriers, can be prepared in the form of solids or semisolids, and can be suspensions, stabilizers, solubilizers and / or dispersants.
  • Formulation agents such as may be included.
  • This form may be sterile and may be liquid. It can be stable under the conditions of manufacture and storage and can be preserved against the contaminating action of microorganisms such as bacteria or fungi.
  • the pharmaceutical composition may be in sterile powder form for reconstitution with a suitable carrier prior to use.
  • the pharmaceutical composition may be in unit-dose form, in microneedle patches, in ampoules, or in other unit-dose containers, or in multi-dose containers.
  • compositions may only be stored in a freeze-dried (freeze-dried) state which requires the addition of a sterile liquid carrier, eg, water for injection, just prior to use.
  • a sterile liquid carrier eg, water for injection
  • Immediately injectable solutions and suspensions may be prepared as sterile powders, granules or tablets.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention may be formulated in a liquid or included in the form of microspheres in the liquid.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention comprise the active ingredient of the present invention in a concentration between 0.001 and 100,000 U / kg of a pharmaceutically acceptable compound and / or mixture.
  • excipients suitable for the pharmaceutical compositions of the present invention include preservatives, suspending agents, stabilizers, dyes, buffers, antibacterial agents, antifungal agents, and isotonic agents, for example, sugars or sodium chloride.
  • the term "stabilizer” refers to a compound that is optionally used in the pharmaceutical compositions of the present invention to increase shelf life.
  • the stabilizer can be a sugar, amino acid, compound, or polymer.
  • the pharmaceutical composition may comprise one or more pharmaceutically acceptable carriers.
  • the carrier may be a solvent or a dispersion medium.
  • Non-limiting examples of pharmaceutically acceptable carriers include water, saline, ethanol, polyols (eg glycerol, propylene glycol and liquid polyethylene glycols), oils, and suitable mixtures thereof.
  • Parenteral formulations can also be sterile.
  • sterilization techniques include filtration through bacteriological-suppressing filters, terminal sterilization, incorporation of sterile preparations, irradiation, sterile gas irradiation, heating, vacuum drying and freeze drying.
  • Administration in one embodiment of the invention means introducing the composition of the invention to the patient in any suitable way, the route of administration of the composition of the invention being administered via any general route as long as it can reach the desired tissue.
  • a pharmaceutical composition comprising a nitrogen-sensitive acrylamide-based polymer, since it is a nano-sized hydrogel, since parenteral administration is possible, it may be administered as an injection.
  • the method of treatment of the present invention may comprise administering the pharmaceutical composition in a pharmaceutically effective amount.
  • the effective amount is defined as the type of disease, the severity of the disease, the type and amount of the active ingredient and other ingredients contained in the composition, the type of formulation and the age, weight, general health condition, sex and diet, time of administration, route of administration of the patient. And various factors including the rate of secretion of the composition, the duration of treatment, and the drugs used concurrently.
  • N N- (2-amino-1,4-phenylene) diacrylamide, which is a crosslinking agent that can be decomposed by reaction with nitrogen monoxide, was synthesized. Specifically, the nitric oxide-degradable crosslinking agent was synthesized in the following four steps.
  • step 1 4-nitro-o-phenylenediamine (1 g, 6.53 mmol) and guanidine hydrochloric acid (15 mol%) were dissolved in 20 ml of ethanol in di-t-butyldicarbonate (2.85 mg, 13.06 mmol) was added dropwise thereto, followed by vigorous stirring for 40 hours at 35 to 40 ° C. After completion of the reaction, the organic solvent in the reaction solution was evaporated under reduced pressure, extracted three times with ethyl acetate, dried and purified by silica gel column chromatography (yield: 74% by weight, 1.22g).
  • Step 2 is a carbon catalyst (10% by weight Pd / C) loaded with 10% by weight of palladium in a solution of (0.6 g) anhydrous tetrahydrofuran (dry THF, 10 ml) obtained from step 1 under a nitrogen atmosphere. , 60 mg) was added, followed by switching to a hydrogen atmosphere (40 psi) instead of nitrogen and stirring at 25 ° C. for 36 hours. After completion of the reaction, Pd / C was filtered off using Celite® 545 AW (Celite® 545 AW), and the filtrate was dried to give a further purification (yield: 96% by weight, 423 mg).
  • Step 3 is acryloyl chloride (648.05 mg, 7.16 mmol) in a reaction solution obtained by dissolving compound (400 mg, 1.79 mmol) and triethylamine (723.16 mg, 7.16 mmol) obtained in step 2 in anhydrous THF at 25 ° C. After dropping, the mixture was stirred vigorously at 25 ° C. for 24 hours. After completion of the reaction, the organic solvent in the reaction solution was evaporated under reduced pressure, extracted three times with ethyl acetate, dried and purified by alumina chromatography (yield: 64% by weight, 379 mg).
  • step 4 3 ml of 4M HCl dioxane solution was added to a solution of compound 3 (200 mg, 0.60 mmol) (in anhydrous THF 3 ml) under an ice bath, followed by vigorous treatment at 25 ° C. for 24 hours. Was stirred. After completion of the reaction, the organic solvent in the reaction solution was evaporated under reduced pressure, extracted three times with ethyl acetate, dried and purified by alumina chromatography (yield: 21 wt%, 29.11 mg).
  • the starting material 4-nitro-o-phenylenediamine contains an o-phenylenediamine moiety that reacts with nitrogen monoxide.
  • Guanidine hydrochloride guanidine HCl
  • Two amino groups, C-1 and C-4, were then combined with acryloyl chloride to introduce a vinyl group capable of radical polymerization.
  • Boc of C-2 was removed using hydrochloric acid.
  • the crosslinking agent thus synthesized was confirmed in 1H-NMR and shown in FIG. 2.
  • the size and distribution of the hydrogels were confirmed. It was confirmed that the hydrogel crosslinked with the nitrogen monoxide-degradable crosslinking agent was a nano-sized hydrogel having a diameter of 20 to 100 nm, and the size of the hydrogel was increased when nitrogen monoxide was added to the hydrogel of Example 1 This was confirmed by TEM and DLS, respectively (see FIGS. 3 and 4). On the other hand, Comparative Example 1, which is a hydrogel crosslinked with N, N'-methylene bis-acrylamide (BIS), showed no change in size even when nitrogen monoxide was added, which means that it was not sensitive to nitrogen monoxide. Accordingly, it was confirmed that the polymer according to the present invention has sensitivity to nitrogen monoxide.
  • BIOS N, N'-methylene bis-acrylamide
  • N nitrogen monoxide-degradable crosslinking agent
  • Preparation Example 1 a grease reagent was used and 100 ⁇ M and 10 ⁇ M of nitrogen monoxide were treated. Each capture capacity was confirmed. At this time, N, N'-methylene bis-acrylamide (BIS) was used as a comparison group, and water was used as a control group. The results thereof are shown in FIG. 5.
  • the nitrogen monoxide-degradable crosslinking agent captured nitrogen monoxide more than 30% compared to the comparative group.
  • the nitric oxide-degradable crosslinking agent exhibited a capturing capacity of more than 50% even when treated with a high concentration of 100 uM nitrogen monoxide. Accordingly, it was confirmed that the polymer according to the present invention includes a chemical structure capable of trapping nitrogen monoxide.
  • red blood cells were first isolated from blood collected from mice.
  • the prepared erythrocytes 1 ⁇ 10 8 cells were added with 1 mg / mL of Example 1, a nitrogen monoxide-degradable crosslinker (NOCCL) and a DPBS solution containing acrylamide, respectively, and mixed well. This solution was left for 4 hours in a 37 ° C thermostat. Then, after centrifugation, the supernatant was transferred to a 96 well plate and the absorbance was measured at 450 nm to calculate the degree of hemolysis. The results thereof are shown in FIG. 6.
  • Example 1 and the nitric oxide-degradable crosslinker did not cause hemolysis, whereas acrylamide had 99% hemolysis. Accordingly, the acrylamide-based polymer according to the present invention means having stability in vivo.
  • test animals used male DBA / 1J mice 6 to 7 weeks old.
  • Type II collagen (CII) was dissolved in 0.1N acetic acid solution to 4 mg / ml, and then dialyzed with dialysis buffer (dialysis buffer, 50mM Tris, 0.2N NaCl) to complete Freud's containing M. tuberculosis.
  • dialysis buffer 50mM Tris, 0.2N NaCl
  • the same amount of adjuvant (CFA, Chondrex) was mixed and injected subcutaneously at the base of the tail of the mouse to inject 100 ⁇ l per animal (ie 200 ⁇ g / 100 ⁇ l) (primary injection).
  • mice After the second injection, the soles of the mice in different doses of 0.25 mg / kg 30 ⁇ l (front foot) and 50 ⁇ l (back foot) of Example 1, Comparative Example 1, and saline solution each at 7 days intervals A dose of 0.0025 ⁇ g / kg 30 ⁇ l (front foot) and 50 ⁇ l (hind foot) of dexamethasone was injected into the soles of different mice, respectively, at 7-day intervals. Next, the hind paw and fore paw of the mouse were observed at weeks 2 and 5 at the time point of administering the first Example 1 (FIG. 7).
  • Example 1 did not cause swelling or redness of the sole, whereas injection of Comparative Example 1 or buffer solution caused severe edema and redness.
  • dexamethasone already known as a treatment for rheumatoid arthritis
  • swelling or redness of the soles rarely occurred at 2 weeks, but mild redness occurred at 5 weeks.
  • Example 1 has a better effect on treating or alleviating rheumatoid arthritis than dexamethasone.
  • Example 1 doses of 0.25 mg / kg 30 ⁇ l (front foot) and 50 ⁇ l (back foot) of collagen-induced arthritis (CIA) animal models prepared as in Experimental Example 4, twice daily at 7 day intervals.
  • Comparative Example 1 a buffer solution (Saline solution) was injected into the soles of different mice, respectively, dexamethasone (0.005 ⁇ g / kg 30 ⁇ l (front foot), 50 ⁇ l (hind foot) doses twice a total of 7 days) Were injected into the soles of different mice.
  • the severity of joint inflammation was evaluated once a week at the time of the first administration and observed for up to 5 weeks. The results are shown in FIG. At this time, the evaluation of arthritis was based on the average arthritis index by Rossolinec et al. The average score divided by 5 on the four scales of the four legs per mari.
  • scores and criteria according to arthritis evaluation are as follows.
  • the best arthritis index per maridang is 4, so the best disease index per rat is 16.
  • Example 1 As shown in FIG. 8, the injection index of Example 1 was lower than that of the other experimental groups, whereas the injection index of Comparative Example 1 or the buffer solution was confirmed to be higher with time. .
  • the injection of dexamethasone already known as a treatment for rheumatoid arthritis has been shown to relieve rheumatoid arthritis in the same manner as in Example 1 until the second week, it was confirmed that the effect is less after two weeks. Thus, it was confirmed that Example 1 has a better effect on treating or alleviating rheumatoid arthritis than dexamethasone.

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Abstract

본 발명은 일산화질소 감응성을 갖는 아크릴아마이드계 고분자에 관한 것으로, 보다 상세하게는 아크릴아마이드계 모노머와 일산화질소에 감응하는 가교제를 이용하여 제조됨으로써, 일산화질소의 과발현에 의해 발병되는 질병 또는 질환을 예방 또는 치료가 가능한 아크릴아마이드계 고분자에 관한 것이다.

Description

일산화질소 감응성을 갖는 아크릴아마이드계 고분자를 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물
본 출원은 2018년 08월 30일자 한국 특허 출원 제10-2018-0102615호에 기초한 우선권의 이익을 주장하며, 해당 한국 특허 출원의 문헌에 개시된 모든 내용은 본 명세서의 일부로서 포함한다.
본 발명은 일산화질소 감응성을 갖는 아크릴아마이드계 고분자를 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 아크릴아마이드계 모노머와 일산화질소에 감응하는 가교제를 이용하여 제조된 고분자를 포함함으로써, 일산화질소의 과발현에 의해 발병되는 염증성 질병 또는 질환을 예방 또는 치료가 가능한 아크릴아마이드계 고분자에 관한 것이다.
일산화질소(Nitric oxide)는 수초 이내의 짧은 반감기를 가지는 반응성이 높은 라디칼 분자이며, 인체의 여러 세포에서 발생하며 면역계에서는 항암 및 항미생물 작용을 나타내는 방어물질로, 신경계에서는 신경전달물질로, 순환기계에서는 혈관확장물질로 알려져 있다.
이에, 일산화질소를 항암치료 등 의약적 용도로 사용하기 위해 일산화질소를 이용 목적에 맞게 더욱 효율적으로 방출할 수 있는 새로운 물질 및 방법에 대한 연구들이 진행되고 있다.
그러나, 환경오염, 스트레스 등으로 우리 몸의 면역시스템이 무너지면, 과활성화된 대식세포가 일산화질소를 많이 분비하여 자가면역질환 또는 염증성 질환을 유발시키게 된다.
또한, 일산화질소는 고농도에서 독성을 갖기 때문에 신체 내에 전반적으로 다량 방출되는 경우 류마티스 관절염, 골관절염, 염증성 장 증후군과 같이 오히려 신체에 악영향을 끼칠 수 있다.
한편, 류마티스 관절염은 다발성 관절염을 특징으로 하는 원인 불명의 만성 염증성 질환이다. 초기에는 관절을 싸고 있는 활막에 염증이 발생하지만 점차주위의 연골과 뼈로 염증이 퍼져 관절의 파괴와 변형을 초래하게 된다. 관절뿐만 아니라 관절 외 증상으로 빈혈， 건조증후군， 피하 결절 폐섬유화증, 혈관염， 피부 궤양 등 전 신을 침범할 수 있는 질환이다.
류마티스 관절염의 정확한 원인은 아직 밝혀지지 않았지만 자가면역현상이 주요 기전으로 알려져 있다. 자가면역이란 외부로부터 인체를 지키는 면역계의 이상으로 오히려 자신의 인체를 공격하는 현상이다. 일반적으로는 유전적 소인, 세균 이나 바이러스 감염 등이 류마티스 관절염의 원인으로 생각되고 있다. 신체적 또는 정신적 스트레스를 받은 후 발병하기 쉽다고 알려져 있다. 또한 ¾절 류마티스 관절염은 관절의 종창， 염증， 경직, 동통을 수반하며， 전신의 다발성 관절염의 병상을 보이는 난치성 자기면역 질환이다. 즉, 생체 자신이 자기-비자기의 인식 결함에 기초하여 자기를 마치 비자기로 인식하여 자기 조직을 공격하고， 이상 면역 응답을 일으켜 결합 조직에 염증을 초래하는 전신성 질환이다.
이로써, 류마티스 관절염에서 일산화질소는 cytokine으로 유도된 파골 세포의 골 흡수를 증가시키고, 관절에서 세포 사멸을 촉진시켜 악영향을 끼친다.
따라서, 자가면역질환을 악화시키거나, 염증성 질환을 악화시킬 수 있는 일산화질소를 감응하여 이를 포집시켜 질병을 완화 또는 치료할 수 있는 새로운 치료제가 필요하다.
본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 일산화질소 감응성을 갖는 아크릴아마이드계 고분자를 제조하였으며, 이러한 고분자는 하이드로겔 형태로 일산화질소를 감응하는 동시에 일산화질소를 포집 할 수 있으며, 또한 상기 하이드로겔은 나노크기의 하이드로겔로써 체내에 투여함에 있어 용이하고, 더 나아가 고농도의 일산화질소에 의해 발생되는 염증성 질환을 예방 또는 치료할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 일산화질소의 과발현에 의해 발병되는 염증성 질병 또는 질환을 예방 또는 치료가 가능한 일산화질소 감응성을 갖는 아크릴아마이드계 고분자를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 일 실시예에 따르면 일산화질소 감응성 아크릴아마이드계 고분자를 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 상기 아크릴아마이드계 고분자는 아크릴아마이드계 모노머; 하기 화학식 1의 구조를 갖는 가교제; 라디칼 개시제; 및 촉매를 이용하여 제조된 하기 화학식 2의 구조일 수 있다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2018011902-appb-I000001
[화학식 2]
Figure PCTKR2018011902-appb-I000002
여기서, R1, R2, R3, 및 R4은 각각 독립적으로 수소, C1 내지 C10의 치환 또는 비치환된 알킬기이고, n은 1~1000의 정수이다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 R1, R2, R3, 및 R4은 각각 독립적으로 수소일 수 있다.
상기 아크릴아마이드계 모노머는 아크릴아마이드, (메타)아크릴아마이드, N-이소프로필아크릴아마이드, N-3차부틸아크릴아마이드, 3-히드록시프로필(메타)아크릴아마이드, 4-히드록시부틸(메타)아크릴아마이드, 6-히드록시헥실(메타)아크릴아마이드, 8-히드록시옥틸(메타)아크릴아마이드, 2-히드록시에틸헥실(메타)아크릴아마이드, N-메틸올(메타)아크릴아마이드, N,N-디메틸올(메타)아크릴아마이드, N-메톡시 메틸(메타)아크릴아마이드 및 N-프로폭시 메틸(메타)아크릴아마이드로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 고분자는 하이드로겔 형태일 수 있으며, 이때 상기 하이드로겔의 직경은 10 nm 내지 500nm일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 약학 조성물은 주사제일 수 있다.
상기 염증성 질환은 생체 내 일산화질소가 과발현 양상을 나타내는 질환일 수 있다.
상기 염증성 질환은 류마티스 관절염일 수 있다.
상기 약학 조성물은 생체활성물질을 더 포함하고, 상기 화학식 2의 구조를 갖는 일산화질소 감응성 아크릴아마이드계 고분자는 상기 생체활성물질을 담지할 수 있다.
본 발명에 따른 일산화질소 감응성을 갖는 아크릴아마이드계 고분자를 포함한 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 일산화질소를 감응하는 동시에 포집할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 일산화질소 감응성을 갖는 아크릴아마이드계 고분자를 포함한 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 일산화질소의 과발현에 의해 발병되는 질병 또는 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 일산화질소 감응성을 갖는 아크릴아마이드계 고분자를 포함한 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 나노크기의 하이드로겔 형태로 체내 투여 시 용이하고, 친수성이 높아 생체적합성이 뛰어나다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 일산화질소-분해가능 가교제(NOCCL)에 대한 반응도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 일산화질소-분해가능 가교제(NOCCL)에 대한 1H-NMR 스펙트럼이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 실시예 1 및 비교예 1에 일산화질소 용액을 처리하기 전과 후의 TEM 이미지이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 실시예 1에 일산화질소 용액 또는 물을 처리한 후 DLS 결과이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 일산화질소-분해가능 가교제(NOCCL) 및 N, N'-methylene bis-acrylamide(BIS)에 100uM 및 10uM 일산화질소 용액을 각각 처리하여 일산화질소 포집능을 확인한 결과이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 실시예 1, 일산화질소-분해가능 가교제(NOCCL) 및 아크릴아마이드 모너머에 대한 용혈현상을 평가한 결과이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 실시예 1, 비교예 1, 덱사메타손 및 완충용액을 류마티스 관절염 실험동물에 투여하여 관찰한 뒷다리 발바닥(도 7 a)과 앞다리 발바닥(도 7b)의 사진이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 실시예 1, 비교예 1, 덱사메타손 및 완충용액을 류마티스 관절염 실험동물에 5주간 투여하여 시간에 따른 관절 염증의 위증도를 평가한 결과이다.
본 발명은 일산화질소 감응성 아크릴아마이드계 고분자를 포함한 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 아크릴아마이드계 고분자는 아크릴아마이드계 모노머; 하기 화학식 1의 구조를 갖는 가교제; 라디칼 개시제; 및 촉매를 이용하여 제조되며, 하기 화학식 2의 구조를 갖는 고분자이다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2018011902-appb-I000003
[화학식 2]
Figure PCTKR2018011902-appb-I000004
여기서, R1, R2, R3, 및 R4은 각각 독립적으로 수소, C1 내지 C10의 치환 또는 비치환된 알킬기이고, n은 1~1000의 정수이다.
상기 아크릴아마이드계 모노머는 이중결합 및 아마이드 작용기(functional group)를 갖는 화합물이며, 라디칼 중합(radical polymerization)을 통해 중합이 가능한 모노머이다.
또한, 상기 아크릴아마이드계 모노머는 아크릴아마이드, (메타)아크릴아마이드, N-이소프로필아크릴아마이드, N-3차부틸아크릴아마이드, 3-히드록시프로필(메타)아크릴아마이드, 4-히드록시부틸(메타)아크릴아마이드, 6-히드록시헥실(메타)아크릴아마이드, 8-히드록시옥틸(메타)아크릴아마이드, 2-히드록시에틸헥실(메타)아크릴아마이드, N-메틸올(메타)아크릴아마이드, N,N-디메틸올(메타)아크릴아마이드, N-메톡시 메틸(메타)아크릴아마이드 및 N-프로폭시 메틸(메타)아크릴아마이드로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다. 바람직하게는 아크릴아마이드, (메타)아크릴아마이드, 또는 이들의 조합이며, 더욱 바람직하게는 아크릴아마이드이나, 이에 제한되지 않는다.
상기 아크릴아마이드계 모노머의 화학구조에 따라 본 발명의 고분자의 물리적 및 화학적 성질이 달라질 수 있다. 예로, 히드록시를 갖는 아크릴아마이드계 모노머로 중합된 고분자의 경우 아크릴아마이드 모노머로 중합된 고분자에 비하여 더욱 친수성을 갖게 되어 하이드로겔로 형성시 스웰링(swelling)이 용이하게 이루어지고 더 많은 수분을 흡수할 수 있으며, 반면에 알킬기를 갖는 아크릴아마이드계 모노머로 중합된 고분자의 경우 아크릴아마이드 모노머로 중합된 고분자에 비하여 더욱 소수성을 갖으므로 크기가 더 작은 하이드로겔을 형성할 수 있다.
상기 가교제는 일산화질소와 반응할 수 있는 가교제(일산화질소-분해가능 가교제)로, 양 말단에 아크릴아미드기를 포함하고, 일산화질소와 반응하여 아미드-치환 벤조트리아졸 중간체를 생성하며, 수성 매질에서 가수분해가능한 화합물인 것이 바람직하다.
또한, 상기 가교제는 일산화질소와 반응함으로써 일산화질소를 감응하는 동시에 포집이 가능하다. 이때, 상기 가교제는 일산화질소와 반응하는 o-페닐렌디아민 모이어티를 함유한 화합물이 바람직하다.
이때, 상기 o-페닐렌디아민 모이어티를 함유한 화합물은 일산화질소와의 반응으로 인하여, 아미드 치환된 벤조트리아졸 중간체(amide-substituted benzotriazole intermediate) 잔기를 형성할 수 있으며, 이 중간체 잔기가 가수분해되어 벤조트리아졸 잔기와 카르복실산 잔기로 각각 분해될 수 있다.
상기 가교제는 도 1에 나타낸 바와 같이 합성될 수 있다. 도 1을 참조하면, 상기 가교제는 4단계의 과정으로 합성할 수 있다. 출발물질로 4-니트로-o-페닐렌디아민(4-nitro-o-phenylenediamine)를 사용하여 설명하자면, 첫번째 단계로 4-니트로-o-페닐렌디아민의 C-2의 아미노기를 Fmoc- 또는 Boc-과 같은 보호기로 보호하는 단계이다. 두번째 단계는 4-니트로-o-페닐렌디아민에서 4-NO2를 4-NH2로 환원시키는 단계이다. 그 다음, 세번째 단계는 C-1 및 C-4의 2개의 아미노기를 아크릴로일 클로라이드와 결합시켜 아크릴아마이드로 형성시키는 단계이며, 마지막으로 네번째 단계는 C-2의 보호기를 제거하는 단계이다. 상기 4단계에서 사용되는 용매 또는 촉매는 당 기술분야에서 사용되는 것이라면 특별히 제한되지 않는다.
상기 가교제는 상기 화학식 1의 구조를 가지고 있으며, 여기서 상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소, C1 내지 C10의 치환 또는 비치환된 알킬기이다. 상기 알킬기는 직쇄형, 분지형 또는 고리형일 수 있다. 바람직하게 상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소이나, 이에 제한되지 않는다.
상기 라디칼 개시제는 라디칼을 생성하는 화합물로, 상기 아크릴아마이드 모노머의 이중결합 부분과 결합하여 중합의 개시반응을 일으킨다.
상기 라디칼 개시제는 유용성 라디칼 개시제, 수용성 라디칼 개시제 또는 산화-환원 개시제일 수 있으며, 바람직하게는 수용성 라디칼 개시제이나, 이에 제한되지 않는다. 이때, 상기 수용성 라디칼 개시제는 암모늄 퍼설페이트(ammonium persulfate), 포타슘 퍼설페이트(potassium persulfate), 소듐 퍼설페이트(sodium persulfate)을 단도으로 이용하거나 소듐 비설파이트(sodium bisulfate), 소듐 포름알데히드 설폭시레이트(sodium formaldehyde sulfoxylate) 등의 환원제와 함께 사용할 수 있다. 한편, 유용성 라디칼 개시제는 아미노 퍼설페이트(amino persulfate), 로로일 퍼옥사이드(lauroyl peroxide), 과산화수소(hydrogen peroxide), 과산화벤조일(benzoyl peroxide), 과산화아세틸(acetyl peroxide), 아조비스이소뷰티로니트릴(azobisisobutyronitrile), t-부틸 하이드로퍼옥사이드(t-butyl hydroperoxide), 디부틸 퍼옥사이드(dibutyl peroxide), 벤조일 하이드로 퍼옥사이드(benzoyl hydroperoxide), 퍼벤조산(perbenzoic acid), 퍼아세트산(peracetic acid) 등이 이용되며, 단독으로 사용될 수도 있고 상기한 환원제와 함께 사용될 수도 있다.
상기 촉매는 라디칼 개시제로부터 자유 라디칼(free radical)을 만드는 것에 있어 촉진제(accelerator) 역할 또는 자유 라디칼의 안정화제 역활을 하는 것으로, 상기 촉매는 극성첨가제 일 수 있다.
여기서, 상기 극성첨가제는 일례로 염기이고, 또 다른 일례로 아민기를 가진 화합물이고, 혹은 트리메틸아민(trimethylamine), 트리에틸아민(triethylamine), 트리프로필아민(tripropylamine), 및 테트라메틸에틸렌디아민(tetramethylethylenediamine)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것이며, 바람직하게는 트리에틸아민 또는 테트라메틸에틸렌디아민이나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 고분자는 상기 아크릴아마이드계 모노머 및 가교제의 반복단위가 랜덤(random), 교차(alternating) 또는 순차적(sequential)으로 배열된 고분자일 수 있으며, 가교 고분자(cross-linked polymer) 또는 분지 고분자(Branched Polymer)일 수 있다.
본 발명에 따른 고분자는 상기 화학식 2와 같이, 아크릴아마이드계 모노머는 고분자의 골격(backbone)을 형성하고, 상기 가교제는 골격 사이에 링커로 화학적으로 가교(chemical crosslinking)되어 형성된 고분자이다.
상기 R3 및 R4는 각각 독립적으로 수소, C1 내지 C10의 치환 또는 비치환된 알킬기이다. 상기 알킬기는 직쇄형, 분지형 또는 고리형일 수 있다. 바람직하게 상기 R3 및 R4는 각각 독립적으로 수소이나, 이에 제한되지 않는다.
상기 n은 1~1000의 정수이며, 바람직하게는 30~500이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 고분자는 상기 아크릴아마이드계 모노머, 화학식 1의 구조를 갖는 가교제, 라디칼 개시제 및 촉매를 모두 혼합하여 수분 내에 가교 고분자로 제조될 수 있다. 이와 같이, 상기 고분자의 제조방법은 매우 단순하여 수율이 높고, 경제적으로 제조공정에 대한 단가가 낮으며, 대량생산이 가능하다.
이때, 상기 고분자의 제조방법에 있어서 혼합 시 온도는 상온으로 15 내지 25℃일 수 있다.
본 발명에 따른 고분자는 중량평균분자량(Mw)이 2000 내지 50,000의 범위 내에 있을 수 있다. 본 출원에서 중량평균분자량은, 예를 들면, GPC(Gel Permeation Chromatograph)를 사용하여 측정한 표준 폴리스티렌에 대한 환산 수치일 수 있고, 특별히 달리 규정하지 않는 한, 용어 분자량은 중량평균분자량을 지칭할 수 있다. 상기와 같은 분자량(Mw)은, 예를 들면, 상기 고분자가 가교되어 하이드로겔로 제조되어 약학 조성물로 사용되는 경우에 유용할 수 있다. 상기 분자량(Mw) 범위에서 상기 고분자를 사용하여 일산화질소에 대한 감응성이 높아지고, 다량의 일산화질소와 반응하여 포집시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 상기 고분자는 가교되어 하이드로겔로 형성될 수 있으며, 여기서, 하이드로겔은 충분한 양의 수분을 보유하고 있는 친수성 고분자의 3차원 구조를 의미하는 것이다. 따라서, 상기 고분자는 3차원 가교 구조를 가지는 고분자 화합물로, 수분이 있는 조건에서 그 수분을 흡수하여 팽창한 하이드로겔 형태일 수 있다.
이때, 상기 하이드로겔은 100% 스웰링 상태에서 나노크기의 하이드로겔이며, 이때 하이드로겔의 직경은 10nm 내지 500nm일 수 있다. 바람직하게는 20nm 내지 150nm이며, 더욱 바람직하게는 30 내지 70nm이다. 상기 하이드로겔의 직경이 10nm 미만일 경우에는 일산화질소를 포집하는 효과가 떨어지고, 500nm 초과할 경우에는 체내 투여가 용이하지 못하고 체내 체류시간이 너무 짧아지거나 용혈현상의 가능성이 높아질 수 있다.
또한, 상기 고분자는 아크릴아마이드계 모노머 및 가교제의 농도를 조절하여 하이드로겔의 크기를 조절할 수 있다.
또한, 상기 고분자는 상기 아크릴아마이드계 모노머와 가교제의 혼합비율은 제조하고자 하는 하이드로젤의 크기, 물성 등에 따라 달리 조절될 수 있다.
상기 아크릴아마이드계 모너머 및 가교제의 혼합비는 1000:0.3~1.0의 몰비일 수 있으며, 바람직하게는 1000:0.5~1.0의 몰비이나, 이에 제한되지 않는다. 해당 범위에서 고분자는 나노크기의 하이드로겔로 형성될 수 있으며, 일산화질소 감응 후 효과적으로 팽윤되어 빠르게 해리될 수 있다.
상기 고분자는 나노크기의 하이드로겔 형태로, 친수성이 매우 높으며, 약물이나 단백질을 담지할 수 있다. 또한, 종래의 매크로(macro) 또는 마이크로(micro) 크기의 하이드로겔은 상처부위에 수술을 통한 이식이 필요한 반면 본 발명에 따른 고분자는 나노크기의 하이드로겔로써 수술없이 주사제로 체내에 투여될 수 있어 용이한 장점을 가진다.
또한, 상기 하이드로겔은 다른 생채활성물질을 포함하지 않아도 일산화질소를 포집할 수 있어 고농도의 일산화질소에 의하여 발생된 염증 또는 질환을 완화시키거나 치료할 수 있다. 즉, 상기 하이드로겔 자체만으로 치료제로 사용될 수 있다.
한편, 상기 하이드로겔은 생체활성물질을 더 포함함으로써, 고농도의 일산화질소에 의하여 발생된 염증 또는 질환을 치료하는 것에 있어 더욱 효과를 높일 수 있다. 이러한 생체활성물질은 질병의 치료, 치유, 예방 또는 진단 등에 사용되는 물질을 의미하고, 그 예로는 세포, 성장인자 및 호르몬과 같은 단백질 또는 펩타이드, 핵산, 세포외기질 물질 및 의약적 치료기능을 가지는 약물 등을 들 수 있다. 하이드로겔이 생체활성물질을 포함하도록 제조하기 위하여, 생체활성물질은 어떤 한 용액에 포함되도록 용액을 제조하고, 다른 한 용액과 혼합하여 하이드로겔을 합성하도록 진행할 수 있다. 이 경우 생체활성물질은 형성되는 가교화된 고분자 하이드로겔에 담지된 형태가 된다. 또한, 생체활성물질이 포함된 두 가지 용액을 주사기에 혼합시켜, 주사기를 사용하여 질병, 상처부위에 전달함으로써, 시간에 따라 생체활성물질이 포함된 하이드로겔 제조를 유도할 수 있다. 그러므로 본 발명의 고분자는 하이드로겔의 형태를 가짐으로써 생체활성물질 전달체, 세포전달체 또는 약물전달체로 사용할 수 있다. 또한, 조직공학 지지체 또는 세포치료제로 사용될 수 있다.
상기 하이드로겔에 담지되는 생체활성물질로서 약물의 예는 항생제, 항암제, 소염진통제, 항바이러스제, 항균제 등을 들 수 있다. 항생제로는 테트라사이클린, 미노사이클린, 독시사이클린, 오플록사신, 레보플록사신, 시프로플록사신, 클라리스로마이신, 에리쓰로마이신, 세파클러, 세포탁심, 이미페넴, 페니실린, 겐타마이신, 스트렙토마이신, 반코마이신 등의 유도체 및 혼합물에서 선택되는 항생제를 예시할 수 있다. 항암제로는 메토트렉세이트, 카보플라틴, 탁솔, 시스-플라틴, 5-플루오로우라실, 독소루비신, 에트포사이드, 파클리탁셀, 캄토테신, 사이토신 아라비노스 등의 유도체 및 혼합물에서 선택되는 항암제를 예시할 수 있다. 소염제로는 인도메타신, 이부프로펜, 케토프로펜, 피록시캄, 플루비프로펜, 디클로페낙 등의 유도체 및 혼합물에서 선택되는 소염제를 예시할 수 있다. 항바이러스제로는 아시콜로버, 로바빈 등의 유도체 및 혼합물에서 선택되는 항바이러스제를 예시할 수 있다. 항균제로는 케토코나졸, 이트라코나졸, 플루코나졸, 암포테리신-B, 그리세오 풀빈 등의 유도체 및 혼합물에서 선택되는 항균제를 예시할 수 있다.
또한, 상기 하이드로겔에 담지하여 생체 내로 전달할 수 있는 단백질, 펩타이드에는 질병을 치료 또는 예방할 목적으로 사용되는 호르몬, 사이토카인, 효소, 항체, 성장인자, 전사조절인자, 혈액인자, 백신, 구조단백질, 리간드 단백질, 다당류 및 수용체, 세포표면항원, 수용체 길항물질과 같은 다양한 생리활성 펩타이드, 이들의 유도체 및 유사체를 예시할 수 있다. 구체적으로, 골 성장인자, 간 성장호르몬, 성장호르몬 방출 호르몬과 펩타이드, 인터페론류와 인터페론 수용체류(예: 인터페론-알파, -베타 및 -감마, 수용성 타입 I 인터페론 수용체 등), 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF), 과립구-마크로파지 콜로니 자극인자(GM-CSF), 글루카콘-유사 펩타이드류(GLP-1 등), 지프로테인 관련된 수용체(G-protein-coupled receptor), 인터루킨류(예: 인터루킨-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9 등)와 인터루킨 수용체류(예: IL-1 수용체, IL-4 수용체 등), 효소류(예: 글루코세레브로시데이즈(glucocerebrosidase), 이두로네이트-2-설파테이즈(iduronate-2-sulfatase), 알파-갈락토시데이즈-A, 아갈시데이즈-알파(agalsidase alpha), -베타, 알파-L-이두로니데이즈(alpha-L-iduronidase), 키티네이즈(chitinase), 뷰티릴콜린에스터데이즈(butyrylcholinesterase), 리페이즈(lipase), 글루타메이트 디카르복실레이즈(glutamate decarboxylase), 이미글루세레이즈(imiglucerase), 유리케이즈(uricase), 혈소판-활성인자 아세틸하이드롤레이즈(platelet-activating factor acetylhydrolase), 중성 엔도펩티데이즈(neutralendopeptidase), 마이엘로퍼옥시데이즈(myeloperoxidase) 등), 인터루킨 및 사이토카인 결합 단백질류(예: IL-18bp, TNF-결합 단백질 등), 마크로파지 활성인자, 마크로파지 펩타이드, B 세포인자, T 세포인자, 단백질 A, 알러지 억제인자, 종양괴사인자(TNF, Tumor Necrosis Factor) 알파 억제인자, 세포 괴사 당단백질, 면역독소, 림포독소, 종양 괴사인자, 종양 억제인자, 전이 성장인자, 알파-1 안티트립신, 알부민, 알파-락트알부민(alpha-lactalbumin), 아포리포단백질-E, 적혈구 생성인자, 고 당쇄화 적혈구 생성인자, 안지오포이에틴류(angiopoietin), 헤모글로빈, 트롬빈(thrombin), 트롬빈 수용체 활성 펩타이드, 트롬보모듈린(thrombomodulin), 혈액인자, 혈액인자 a, 혈액인자 XIII, 플라즈미노겐 활성인자, 피브린-결합 펩타이드, 유로키네이즈, 스트렙토키네이즈, 히루딘(hirudin), 단백질 C, C-반응성 단백질, 레닌 억제제, 콜라게네이즈 억제제, 수퍼옥사이드 디스 뮤테이즈, 렙틴, 혈소판 유래 성장인자, 상피세포 성장인자, 표피세포 성장인자, 안지오스타틴(angiostatin), 안지오텐신(angiotensin), 골 형성 성장인자(bonemorphogenic protein), 골 형성 촉진 단백질, 칼시토닌, 인슐린, 아트리오펩틴, 연골 유도인자, 엘카토닌(elcatonin), 결합조직 활성인자, 조직인자 경로 억제제(tissue factor pathway inhibitor), 여포 자극 호르몬, 황체 형성 호르몬, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬, 신경 성장인자류(예: 신경 성장인자, 모양체 신경영양인자(cilliary neurotrophic factor), 악소제네시스 인자-1(axogenesis factor-1), 뇌-나트륨 이뇨 펩타이드(brain-natriuretic peptide), 신경교 유래 신경영양인자(glial derived neurotrophic factor), 네트린(netrin), 중성구 억제인자(neurophil inhibitor factor), 신경영양인자, 뉴트린(neuturin) 등), 부갑상선호르몬, 릴랙신, 시크레틴, 소마토메딘, 인슐린 유사 성장인자, 부신피질 호르몬, 글루카곤, 콜레시스토키닌, 췌장 폴리펩타이드, 가스트린 방출 펩타이드, 코티코트로핀 방출인자, 갑상선 자극호르몬, 오토탁신(autotaxin), 락토페린(lactoferrin), 미오스타틴(myostatin), 수용체류(예: TNFR(P75), TNFR(P55), IL-1 수용체, VEGF 수용체, B 세포 활성인자 수용체 등), 수용체 길항물질(예: IL1-Ra 등), 세포표면항원(예: CD 2, 3, 4, 5, 7, 11a, 11b, 18, 19, 20, 23, 25, 33, 38, 40, 45, 69등), 단일클론 항체, 다중클론 항체, 항체 단편류(예: scFv, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fd), 바이러스 유래 백신 항원 등을 예시할 수 있다.
상기 하이드로겔에 물리적으로 담지 혹은 화학적으로 결합하여 생체 내로 전달할 수 있는 핵산으로는 DNA, RNA, PNA, 올리고뉴클레오티드 등을 예시할 수 있다.
상기 하이드로겔에 물리적으로 담지 혹은 화학적으로 결합하여 생체 내로 전달할 수 있는 세포외기질 물질에는 콜라겐, 피브로넥틴, 젤라틴, 라미닌, 비트로넥틴 등을 예시할 수 있다.
상기 하이드로겔에 물리적으로 담지하여 생체 내로 전달할 수 있는 세포에는 줄기세포, 섬유아세포, 혈관내피세포, 평활근세포, 신경세포, 연골세포, 골세포, 피부세포, 슈반세포 등을 예시할 수 있다.
상기 염증성 질환은 생체 내 일산화질소가 과발현 양상을 나타내는 질환이며, 바람직하게는 류마티스 관절염, 제1 타입 당뇨병 또는 전신성 홍반성 루프스로부터 선택된 어느 하나이며, 더욱 바람직하게는 류마티스 관절염이나, 이에 제한되지 않는다.
이때 류마티스 관절염은 자가면역질환 중 하나로, 고농도의 일산화질소에 의하여 발병되는 질환이다. 따라서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 일산화질소에 대하여 감응성을 가지면서 포집할 수 있는 고분자를 포함함으로써, 고농도의 일산화질소 환경에서 일산화질소를 포집하여 cytokine으로 유도된 파골 세포의 골 흡수를 억제하고, 관절에서 세포 사멸을 막아 류마티스 관절염을 완화 또는 치료할 수 있다.
또한, 상기 약학 조성물은 앞서 서술한 생체활성물질을 더 포함할 수 있으며, 상기 화학식 2의 구조를 갖는 일산화질소 감응성 아크릴아마이드계 고분자는 상기 생체활성물질을 담지할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 약학 조성물이란, 특정한 목적을 위해 투여되는 조성물을 의미한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 약학조성물은 일산화질소의 과발현에 의한 질환 또는 질병을 치료하는 목적으로 사용되고, 일산화질소 감응성을 갖는 아크릴아마이드계 고분자인 것이며, 보다 바람직하게는 일산화질소에 감응성을 가지면서 동시에 포집할 수 있는 가교제를 포함한 아크릴아마이드계 고분자인 것이며, 이에 관여하는 단백질 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.
상기의 "약학적 허용될 가능한" 담체 또는 부형제는 정부의 규제부에 의해 승인된 것이나, 또는 척추 동물, 그리고 보다 특별하게는 인간에게 사용을 위한 정부 또는 기타 일반적으로 승인된 약전에서 리스트된 것을 의미한다.
비경구적인 투여에 적절하도록 약학조성물은 유성 또는 수성 담체에 있는 현탁액, 용액 또는 에멀젼의 형태로 될 수 있고, 고체 또는 반고체의 형태로 제조될 수 있으며, 현탁제, 안정화제, 용해제 및/또는 분산제와 같은 제형화제를 포함할 수 있다. 본 형태는 멸균될 수 있고, 액체일 수 있다. 이것은 제조 및 저장의 조건 하에서 안정할 수 있고 그리고 세균이나 곰팡이와 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존될 수 있다. 대안적으로, 약학조성물은 사용 전에 적절한 담체와 재구성을 위해 멸균 분말 형태일 수 있다. 약학조성물은 단위-복용량 형태로, 마이크로니들 패치에, 앰플에, 또는 기타 단위-복용량 용기에, 또는 다-복용량 용기에 존재할 수 있다. 또한, 약학적 조성물은 단지 멸균 액체 담체, 예를 들어 사용 바로 전에 주사용 물의 부가함을 요하는 동결-건조된(냉동건조) 상태로 보관될 수 있다. 즉시 주사용액 및 현탁액은 멸균 분말, 그래뉼 또는 타블렛으로 제조될 수 있다.
몇몇 비 제한적인 실시형태에 있어서, 본 발명의 약학조성물은 액체로 제형화되어 질 수 있고, 또는 액체 속에 미립구의 형태로 포함될 수 있다. 어떤 비 제한적인 실시형태에 있어서, 본 발명의 약학조성물은 본 발명의 유효성분을 약학적으로 허용될 수 있는 화합물 및/또는 혼합물을 0.001 내지 100,000 U/kg 사이의 농도로 포함한다. 또한 어떤 비 제한적인 실시형태에 있어서, 본 발명의 약학조성물에 적절한 부형제는 보존제, 현탁제, 안정화제, 염료, 완충제, 항균제, 항진균제, 및 등장화제, 예를 들어, 설탕 또는 염화나트륨을 포함한다. 여기서 사용된 것으로, 용어 "안정화제"는 보존 수명을 증가하기 위해 본 발명의 약학적 조성물에 선택적으로 사용된 화합물을 언급한다. 비-제한적인 실시에 있어서, 안정화제는 당, 아미노산, 화합물, 또는 폴리머일 수 있다. 약학적 조성물은 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함할 수 있다. 담체는 용매 또는 분산 배지일 수 있다. 약학적으로 허용될 수 있는 담체의 비-제한적인 예는 물, 식염수, 에탄올, 폴리올 (예, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜), 오일, 및 이들의 적절한 혼합물을 포함한다. 또한 비경구용 제형은 멸균될 수 있다. 멸균 기술의 비-제한적인 예는 세균-억제 필터를 통한 여과, 터미날 멸균화, 멸균 제제의 합체, 방사선 조사, 멸균 가스 조사, 가열, 진공 건조 및 동결 건조를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에서 투여란, 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 경구 투여, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여, 강내 투여, 복강 내 투여, 경막 내 투여가 이루어질 수 있으나, 본 발명의 일산화질소 감응성 아크릴아마이드계 고분자를 포함하는 약학 조성물의 경우, 나노 크기의 하이드로겔이므로 비경구 투여 적용이 가능하므로 주사제로 투여될 수 있다.
본 발명의 치료 방법은 상기 약학조성물을 약제학적 유효량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명에서 유효량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.
이하 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 통상의 기술자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변경 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.
제조예 1: 일산화질소와의 반응에 의해 분해될 수 있는 가교제 (일산화질소-분해가능 가교제; NO-Cleavable Crosslinker) 합성
도 1과 같이, 일산화질소와의 반응에 의해 분해될 수 있는 가교제인 N, N-(2-amino-1,4-phenylene) diacrylamide을 합성하였다. 구체적으로, 일산화질소-분해가능 가교제는 하기 4단계의 과정으로 합성하였다.
1단계는 25℃에서, 4-니트로-o-페닐렌디아민(1g, 6.53mmol)과 구아니딘 염산(15mol%)를 에탄올 20 ㎖에 용해시킨 반응용액에 디-t-부틸디카보네이트(2.85㎎, 13.06mmol)를 적하(dropping)한 후, 35~40℃를 유지하여 40시간동안 격렬하게 교반하였다. 반응완료 후 반응용액 내 유기용매를 감압 증발시키고, 에틸아세테이트로 3회 추출하여 건조한 후 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다(수율: 74 중량%, 1.22g).
2단계는 질소 분위기 하에서, 1단계로부터 얻은 화합물(0.6g)의 용액(in 무수 테트라히드로푸란(dry THF), 10㎖)에 10 중량%의 팔라듐이 로딩된 탄소 촉매(10 중량% Pd/C, 60㎎)를 첨가한 후, 질소 대신 수소 분위기(40psi)로 전환하여 25℃에서 36시간 동안 교반하였다. 반응완료 후 셀라이트® 545 AW(Celite® 545 AW)를 사용하여 Pd/C를 여과 제거하고, 여과액을 건조하여 추가 정제 없이 수득하였다(수율: 96 중량%, 423㎎).
3단계는 25℃에서, 2단계로부터 얻은 화합물(400㎎, 1.79 mmol)과 트리에틸아민(723.16㎎, 7.16mmol)을 무수 THF에 용해시킨 반응용액에 아크릴로일 클로라이드(648.05㎎, 7.16mmol)를 적하한 후, 25℃에서 24시간 동안 격렬하게 교반하였다. 반응완료 후 반응용액 내 유기용매를 감압 증발시키고, 에틸아세테이트로 3회 추출하여 건조한 후 알루미나 크로마토그래피로 정제하였다(수율: 64 중량%, 379㎎).
4단계는 얼음 욕조(ice bath) 하에서, 화합물 3(200㎎, 0.60mmol)의 용액(in 무수 THF 3㎖)에 4M HCl 디옥산 용액 3㎖를 첨가한 후, 25℃에 서 24시간 동안 격렬하게 교반하였다. 반응완료 후 반응용액 내 유기용매를 감압 증발시키고, 에틸아세테이트로 3회 추출하여 건조한 후 알루미나 크로마토그래피로 정제하였다(수율: 21 중량%, 29.11㎎).
출발물질인 4-니트로-o-페닐렌디아민(4-nitro-o-phenylenediamine)은 일산화질소와 반응하는 o-페닐렌디아민 모이어티를 함유하고 있다. 구아니딘 염산염(guanidine HCl)을 촉매로 사용하여 4-니트로-o-페닐렌디아민의 C-2의 아미노기를 선택적으로 Boc-보호시켰다. 다음으로, 4-니트로-o-페닐렌디아민에서 4-NO2를 4-NH2로 환원시켰다. 그 다음, C-1 및 C-4의 2개의 아미노기를 아크릴로일 클로라이드와 결합시켜 라디컬 중합이 가능한 바이닐기를 도입하였다. 그 후, 염산을 이용하여 C-2의 Boc을 제거하였다. 이와 같이 합성된 가교제는 1H-NMR을 통해 구조를 확인하여 도 2에 나타냈다.
제조예 2: 일산화질소에 감응하는 하이드로겔 제조
상기 제조예 1을 통해 제조된 일산화질소-분해가능 가교제 0.0312 5%(w/v) 10㎕와, 아크릴아마이드 모노머 20%(w/v) 10㎕, 개시제로 암모늄 퍼설페이트(ammonium persulfate) 10%(w/v) 1㎕, 촉매로 테트라메틸에틸렌디아민(tetramethylethylenediamine) 5%(w/v) 1㎕를 사용하여 중합시켰다. 이때 중합은 25℃에서 3분동안 중합하였다. 중합된 고분자는 나노크기의 하이드로겔로 형성되었다.
실시예 1: 상기 제조예 2에 따라 제조된 나노크기의 하이드로겔.
비교예 1: 상기 제조예 2에서, 일산화질소-분해가능 가교제를 대신하여 N, N'-methylene bis-acrylamide(BIS)를 넣어 중합하여 제조된 하이드로겔.
실험예 1: 일산화질소에 감응하는 하이드로겔의 크기 및 분포 확인
TEM과 DLS를 이용하여, 하이드로겔의 크기 및 분포를 확인하였다. 일산화질소-분해가능 가교제와 함께 가교된 하이드로겔은 20 내지 100nm의 직경을 갖는 나노크기의 하이드로겔인 것을 확인하였으며, 또한 실시예 1의 하이드로겔에 일산화질소를 추가하였을 때 하이드로겔의 크기가 커지는 것을 TEM과 DLS로 각각 확인하였다(도 3 및 도 4 참조). 반면에 N, N'-methylene bis-acrylamide(BIS)와 함께 가교된 하이드로겔인 비교예 1은 일산화질소를 추가하여도 크기의 변화가 없었으며, 이는 일산화질소에 감응하지 않는 것을 의미한다. 이에 따라, 본 발명에 따른 고분자는 일산화질소에 감응성을 가지는 것을 확인하였다.
실험예 2: 일산화질소-분해가능 가교제의 일산화질소 포집능 확인
상기 제조예 1에 따라 제조된 일산화질소-분해가능 가교제(NOCCL)가 실제로 일산화질소를 포집 할 수 있는 지에 대하여 확인하기 위해, 그리스 시약(griess reagent)을 이용하였으며 100uM 및 10uM의 일산화질소를 처리하여 각각의 포집능을 확인하였다. 이때, 비교군으로 N, N'-methylene bis-acrylamide(BIS)를 이용하였으며, 대조군으로 물을 사용하였다. 이의 결과를 도 5에 나타냈다.
도 5에 나타난 바와 같이, 비교군에 비해 일산화질소-분해가능 가교제가 30%이상 일산화질소를 포집하는 것을 확인하였다. 특히, 일산화질소-분해가능 가교제는 고농도인 100uM의 일산화질소를 처리하더라도 50%이상의 포집능을 나타냈다. 이에 따라, 본 발명에 따른 고분자는 일산화질소를 포집할 수 있는 화학구조를 포함하고 있음을 확인하였다.
실험예 3: 일산화질소에 감응하는 하이드로겔의 용혈현상(Hemolysis) 평가
체내 투여 후 일산화질소에 감응하는 하이드로겔이 체내안정성을 갖는지 확인하기 위해, 먼저 쥐(mice)에서 채취한 혈액으로부터 적혈구를 분리하였다. 준비된 적혈구 1Х108 개의 세포에 1mg/mL의 실시예 1, 일산화질소-분해가능 가교제(NOCCL) 및 아크릴아마이드가 각각 포함된 DPBS 용액을 넣고 잘 혼합하였다. 이 용액을 섭씨 37℃ 항온조에서 4시간동안 방치하였다. 그 다음 원심분리 후, 상층액을 96 well plate에 옮긴 뒤에 450nm에서 흡광도를 측정하여 용혈정도를 계산하였다. 이의 결과를 도 6에 나타냈다.
도 6에 나타난 바와 같이, 실시예 1 및 일산화질소-분해가능 가교제는 용혈현상이 일어나지 않은 반면, 아크릴아마이드는 99%의 용혈현상이 일어났다. 이에 따라, 본 발명에 따른 아크릴아마이드계 고분자는 in vivo에서의 안정성을 가지는 것을 의미한다.
실험예 4: 일산화질소에 감응하는 하이드로겔을 이용한 류마티스 관절염 치료효과 확인
먼저, 동물모델을 준비하기 위해, 시험동물은 6~7 주령의 수컷 DBA/1J계 마우스를 사용하였다. 제2형 콜라겐(CII)을 4 mg/ml이 되도록 0.1N 아세트산 용액에 녹인 후 투석 완충액 (dialysis buffer, 50mM Tris, 0.2N NaCl)으로 투석하여 M. 투배루쿨로시스(tuberculosis)를 함유하는 Complete Freud's 애주번트 (CFA, Chondrex)와 동량으로 섞은 후 마우스의 꼬리 기저부에 피하 주사하여 면역원을 마리당 100㎕(즉 200㎍/100㎕)으로 주사하였다(1차 주사). 이로부터 2주 후 동일한 제2형콜라겐을 동량의 imcomplete Freud's 애주번트 (IFA, Chondrex)와 섞은 후 100㎕(즉 200㎍/100㎕)를 한쪽 뒷다리 및 앞다리(발바닥(foot pad))에 주사하였다(2차 주사). 2차 주사 후, 7일 간격으로 총 2번 0.25mg/kg 30㎕(앞발), 50㎕(뒷발) 용량의 실시예 1, 비교예 1, 완충용액(Saline solution)을 각각 서로 다른 마우스의 발바닥에 주사하였고, 7일 간격으로 총 2번 0.0025㎍/kg 30㎕(앞발), 50㎕(뒷발) 용량의 덱사메타손(Dexamethasone)을 각각 서로 다른 마우스의 발바닥에 주사하였다. 그 다음, 첫번째 실시예 1를 투여한 시점으로 하여 2주 및 5주차 때 마우스의 뒷다리 발바닥 및 앞다리 발바닥을 관찰하였다(도 7).
각 군은 5마리씩을 대상으로 진행하였으며 류마티스 관절염 평가는 5주까지 평가하였고, 시험관내(in vitro) 시험을 위해 관절염 지수가 유의성 있게 차이나는 시기에 각 동물을 치사시켜, 혈액, 관절조직 내에서 관절염의 병의 활성 정도를 조사하였다.
도 7에 나타난 바와 같이, 실시예 1을 주사투여시 발바닥의 부종 또는 발적이 일어나지 않은 반면, 비교예 1 또는 완충용액을 주사투여시 심한 부종과 발적이 일어났다. 한편, 이미 류마티스 관절염 치료제로 알려진 덱사메타손을 주사투여한 경우 2주차에는 발바닥의 부종 또는 발적이 거의 일어나지 않았으나 5주차에는 경미한 발적이 일어나는 것을 확인했다. 따라서, 실시예 1이 덱사메타손보다 류마티스 관절염을 치료 또는 완화시키는 것에 더 우수한 효과가 있음을 확인했다.
실험예 5: 일산화질소에 감응하는 하이드로겔을 이용한 류마티스 관절염 치료효과 확인(2)
상기 실험예 4와 같이 준비된 콜라겐에 의해 유도되는 관절염 (collagen induced arthritis, CIA) 동물 모델에 7일 간격으로 총 2번 0.25mg/kg 30㎕(앞발), 50㎕(뒷발) 용량의 실시예 1, 비교예 1, 완충용액(Saline solution)을 각각 서로 다른 마우스의 발바닥에 주사하였고, 7일 간격으로 총 2번 0.0025㎍/kg 30㎕(앞발), 50㎕(뒷발) 용량의 덱사메타손(Dexamethasone)을 각각 서로 다른 마우스의 발바닥에 주사하였다. 그 다음, 첫번째 투여한 시점으로 일주일에 한번씩 관절 염증의 위증도를 평가하여 5주까지 관찰하였다. 이의 결과는 도 8에 나타냈다. 이때 관절염의 평가는 Rossoliniec 등에 의한 평균 관절염 지수에 기준하여 마리당 네 다리에서 아래의 척도에 따라 매긴 점수(Medical score)를 합하여 5로 나눈 평균치를 얻었다. 여기서, 관절염 평가에 따른 점수와 기준은 다음과 같다.
0점 : 부족이나 종창이 없다.
1점 : 발 또는 발목관절에 국한된 경한 부종과 발적
2점 : 발목관절에서 족근골(metatarsal)에 걸친 경한 부종과 발적
3점 : 발목관절에서 족근골에 걸친 중등도의 부종과 발적
4점 : 발목에서 다리 전체에 걸쳐 부종과 발적
마리당 최고의 관절염 지수는 4점이므로 쥐 1마리당 최고의 질병지수는 16이다.
도 8에 나타난 바와 같이, 실시예 1을 주사투여시 질병지수가 다른 실험군에 비해 가장 낮았으며 반면에, 비교예 1 또는 완충용액을 주사투여시 질병지수가 시간이 지남에 따라 더욱 높아지는 것을 확인했다. 한편, 이미 류마티스 관절염 치료제로 알려진 덱사메타손을 주사투여한 경우 2주차까지는 실시예 1과 동일하게 류마티스 관절염을 완화시키는 것으로 나타났으나, 2주 이후부터는 효과가 떨어지는 것을 확인했다. 따라서, 실시예 1이 덱사메타손보다 류마티스 관절염을 치료 또는 완화시키는 것에 더 우수한 효과가 있음을 확인했다.

Claims (10)

  1. 일산화질소 감응성 아크릴아마이드계 고분자를 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 아크릴아마이드계 고분자는
    아크릴아마이드계 모노머;
    하기 화학식 1의 구조를 갖는 가교제;
    라디칼 개시제; 및
    촉매를 이용하여 제조되며,
    하기 화학식 2의 구조인, 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2018011902-appb-I000005
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2018011902-appb-I000006
    여기서,
    R1, R2, R3, 및 R4은 각각 독립적으로 수소, C1 내지 C10의 치환 또는 비치환된 알킬기이고,
    n은 1~1000의 정수이다.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 R1, R2, R3, 및 R4은 각각 독립적으로 수소인, 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 제 2항에 있어서,
    상기 아크릴아마이드계 모노머는 아크릴아마이드, (메타)아크릴아마이드, N-이소프로필아크릴아마이드, N-3차부틸아크릴아마이드, 3-히드록시프로필(메타)아크릴아마이드, 4-히드록시부틸(메타)아크릴아마이드, 6-히드록시헥실(메타)아크릴아마이드, 8-히드록시옥틸(메타)아크릴아마이드, 2-히드록시에틸헥실(메타)아크릴아마이드, N-메틸올(메타)아크릴아마이드, N,N-디메틸올(메타)아크릴아마이드, N-메톡시 메틸(메타)아크릴아마이드 및 N-프로폭시 메틸(메타)아크릴아마이드로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인, 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 고분자는 하이드로겔 형태인, 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 하이드로겔의 직경은 10nm 내지 500nm 인, 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 약학 조성물은 주사제인, 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 염증성 질환은 생체 내 일산화질소가 과발현 양상을 나타내는 질환인, 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 염증성 질환은 류마티스 관절염인, 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  10. 제 1항에 있어서,
    상기 약학 조성물은 생체활성물질을 더 포함하고,
    상기 일산화질소 감응성 아크릴아마이드계 고분자는 상기 생체활성물질을 담지하는 것인, 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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