JP2005511553A - チモシンアルファ1ペプチド/ポリマー複合体 - Google Patents
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Abstract
物質が結合したチモシンアルファ1(TA1)生理的に活性な複合体を包含している医薬組成物であり、その物質は前記複合体を患者に投与したときに、患者の血清中のTA1ペプチドの半減期を増加させる。その物質は、非抗原性ポリマーでもよい。本発明の方法において実質的非抗原性ポリマーはTA1ペプチドに結合している。本発明による組成物は、免疫刺激が必要な患者へ投与される。
Description
本発明は、チモシンアルファ1ペプチドに関する。
チモシンアルファ1(時々TA1と呼ばれる)は、免疫調節特性を伴う28アミノ酸の胸腺ペプチドであり、元々、仔ウシ胸腺のチモシンフラクション5から単離した天然産物と同一である。その生物学的効果は、Tリンパ球機能の増強を包含し、インターロイキン−2(IL−2)の調整、インターフェロン−γ産生の刺激、Tリンパ球やNK細胞の活性化の誘発及びチモポイエシス(thymopoiesis)の刺激を包含する。チモシンアルファ1はMHCクラスIの発現を上方に調整するものとして示されてきた。
本技術分野において、TA1及び関連するペプチドを含有する改善された組成物の必要性は存続している。
(発明の要旨)
本発明による医薬組成物は、物質が結合したチモシンアルファ1(TA1)生理的に活性な複合体を含み、該物質とは前記複合体を患者に投与した時、患者の血清中のTA1ペプチドの半減期を増加させるものである。その物質は、実質的非抗原性のポリマーであってもよい。本発明の方法により、実質的非抗原性ポリマーは、TA1ペプチドに結合する。本願発明による組成物は、免疫刺激が必要な患者へ投与される。
本発明による医薬組成物は、物質が結合したチモシンアルファ1(TA1)生理的に活性な複合体を含み、該物質とは前記複合体を患者に投与した時、患者の血清中のTA1ペプチドの半減期を増加させるものである。その物質は、実質的非抗原性のポリマーであってもよい。本発明の方法により、実質的非抗原性ポリマーは、TA1ペプチドに結合する。本願発明による組成物は、免疫刺激が必要な患者へ投与される。
(発明の詳細な説明)
本発明は、天然に生成されたTA1と同じく合成TA1及び組み替え体TA1を包含する実用的なTA1ペプチドであり、該合成TA1及び組み替え体TA1は、天然に生成するTA1のアミノ酸配列、実質的に同様なアミノ酸配列、もしくはその要約された配列形態を有し、また、代用、欠損、延長、置換または他の方法で修飾されたTA1と実質的に同様の生物活性を有する配列を有する生物的活性類似体、例えばそれはTA1ペプチドと十分な相同性を有し、TA1と実質的に同じ活性を伴って、同じ活性経路で機能する。
本発明は、天然に生成されたTA1と同じく合成TA1及び組み替え体TA1を包含する実用的なTA1ペプチドであり、該合成TA1及び組み替え体TA1は、天然に生成するTA1のアミノ酸配列、実質的に同様なアミノ酸配列、もしくはその要約された配列形態を有し、また、代用、欠損、延長、置換または他の方法で修飾されたTA1と実質的に同様の生物活性を有する配列を有する生物的活性類似体、例えばそれはTA1ペプチドと十分な相同性を有し、TA1と実質的に同じ活性を伴って、同じ活性経路で機能する。
本願発明による医薬組成物は、ある物質が結合したTA1ペプチドを含む生理的に活性な複合体を含み、前記複合体が患者に投与された場合、患者の血清中のTA1ペプチドの半減期を増加させる。その物質は、非抗原性ポリマーである。適切なポリマーは、約200〜300,000の範囲の分子量を有し、好ましくは約1,000〜100,000の範囲の分子量を有し、最も好ましくは約5,000〜35,000の範囲の分子量を有し、約20,000の分子量が特に好ましい。
また好ましくは、室温で水溶性であるポリマー物質も含まれる。該ポリマーとして非限定的に、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレングリコールのようなポリアルキレンオキシド、そのコポリマー、およびブロックコポリマーが水溶性を維持するという条件でそのブロックコポリマーが包含される。実質的な非抗原性ポリマーの中で、末端単エチルポリエチレングリコール(mPEG's)のような単−活性化アルキル末端ポリアルキレン酸化物(PAO'S)が意図される。mPEGに加え、C1−4アルキル末端ポリマーも有用でありうる。
もう一方のPAOベースのポリマーとして、デキストラン、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、炭水化物ベースのポリマーなどの有効な非抗原性物質が意図される。当業者は、先に挙げたものは単に例示であること、および、ここで記載する性質を有する全てのポリマー物質が意図されていることは理解するであろう。本発明の趣旨として、「有効な非抗原性」とは、すべての物質が、本技術分野で、非毒性であり、かつホ乳類における感知可能な免疫反応を誘発しないものと解されることを意図する。
ポリマーは直鎖であってもよく、分枝していてもよい。ポリエチレングリコール(PEG)が特に好ましい。
ポリマーはいかなる適切な方法によってTA1ペプチドと結合し得る。ポリマーをTA1ペプチドに結合するための典型的な方法は、米国特許No.4179337、4766106、4917888、5122614および6177074、また、PCT国際公開番号No.WO95/13090に開示されており、これらを全て引用して本願明細書の一部とする。チモシンアルファ1は、5つの離れたポリマーのアミノ基結合可能な部位を有し、ポリマーは1もしくは複数の部位で結合し得る。ひとつの実施形態として、分子量20,000のPEGがTA1のN-末端に結合されて、PEG-TA1を作り上げる。これは、不溶性ポリマーの支持(support)ビーズ上で、本技術分野で既知の固相ペプチド合成により、適切な側鎖保護基を伴って作られる。ビーズ上のTA1ペプチドの合成が終了した後に、保護されたTA1はビーズから切り離され、N−末端がフリーのアミノ基の状態になる。これが分子量20,000のPEGと反応する。それから、側鎖保護基が取り除かれて、今回の発明の具体的態様による複合体を作る。
本発明による組成物は、免疫刺激を必要とする患者の治療に使用することが可能である。そのような患者には、癌患者、肝炎B型または肝炎C型ウィルスに感染した患者を包含している肝炎患者、HIV患者等も包含し得る。本発明による生理的活性複合体の免疫刺激有効量を患者に投与する方法も伴っている。
TA1ペプチドの単離、特性および使用は、例えば、米国特許No.4079127、米国特許No.4353821、米国特許No.4148788および米国特許No.4116951に記載されている。TA1の免疫刺激有効量は、日常業務の投与測定(dose-titration)実験により決定することが可能である。TA1は16mg/kg体重/日の高い用量を投与した場合に、ヒトに安全であることが見出されている。好ましいTA1ペプチドの服用量は0.001mg/kg体重/日から10mg/kg体重/日の範囲内であり、典型的な投与量としては0.02 mg/kg体重/日である。1つの実施態様として、免疫刺激有効量は、約0.1-10mgの範囲内の量にあるTA1を包含する服用量である。好ましい服用量は約1-5mgの範囲内の量にあるTA1を包含する。上記服用量は、組成物にTA1ペプチドのみが存在した場合を反映しており、TA1に結合されたポリマーの重さは反映していない。
好ましい実施態様として、TA1ペプチドが、注射のための水、生理的濃度である食塩水または類似物のような医薬上許容可能な液体担体に存在する。
皮下注射されたTA1は、血清半減期が約2時間のみである。しかしながら、本発明によるTA1ペプチドへのポリマー複合体は、実質的に血清ペプチドの半減期を増加する。
本発明は、さらに以下の実施例により例証されるが、制限されるものではない。
(実施例1)
ラットに5-フルオロウラシル(5-fluorouracil)(5-FU)を、免疫抑制を生じさせるために注射し、その後、チモシンアルファ1(200ug/kg)、またはPEGを結合した(pegylate)チモシンアルファ1(20,000MW PEG-Thymosin alpha 1、これはチモシン分子の200ug/kgの質量を基礎として等価である。)、を注射して処置し、免疫パラメーターへの効果を決定した。(1)5-FUによる抑制後、NK活性の復帰が、チモシンアルファ1よりもPEG-チモシンアルファ1を注射された動物で大きかった。そして(2)活性化T-細胞CD25+の復帰がチモシンアルファ1よりもPEG-チモシンアルファ1を注射された動物で大きかった。
(実施例1)
ラットに5-フルオロウラシル(5-fluorouracil)(5-FU)を、免疫抑制を生じさせるために注射し、その後、チモシンアルファ1(200ug/kg)、またはPEGを結合した(pegylate)チモシンアルファ1(20,000MW PEG-Thymosin alpha 1、これはチモシン分子の200ug/kgの質量を基礎として等価である。)、を注射して処置し、免疫パラメーターへの効果を決定した。(1)5-FUによる抑制後、NK活性の復帰が、チモシンアルファ1よりもPEG-チモシンアルファ1を注射された動物で大きかった。そして(2)活性化T-細胞CD25+の復帰がチモシンアルファ1よりもPEG-チモシンアルファ1を注射された動物で大きかった。
以下の実施例は、これに制限されるものではないが、TA1の継続的な注入が、外科的に移植した浸透性の小型ポンプを使用した癌治療モデルにおいて評価され、一定の流量速度で5日間液体を送った。ラットは免疫抑制を生じさせるために5-フルオロウラシル(5-FU)を与えられ、そしてその後、8日後にTA1を注射または注入(infused)した(5-FU投与後の白血球(white cell)数が最低値である。)。処置群、8匹のラットはそれぞれ、対照群(食塩水を小型ポンプで注入)、低投与量TA1(0.2mg/Kg 皮下注射;小型ポンプ注入無し);高投与量TA1(3.5mg/Kg 皮下注射;小型ポンプ注入無し)、および高注入量TA1(小型ポンプによる3.5mg/Kgの注入)。免疫パラメーターは、基線と5-FU処置8日後(TA1処置後1日目)で、またTA1処置後5、12、20、および27日後でも決定された。
(実施例2)
10週齢ラット、体重250-300g、免疫抑制のために100mg/kgの5−フルオロウラシルを受けている。5-FU処置後8日目に、以下の群のひとつに、無作為に割り当てた。(n=8)
・対照群(食塩水を小型ポンプで注入)
・0.2mg/Kg皮下注射による低投与量TA1群(小型ポンプの注入無し)
・3.5mg/Kg皮下注射による高投与量TA1群(小型ポンプの注入無し)
・3.5mg/Kg・5日を小型ポンプで供給される、継続的注入TA1群
免疫パラメーターは、基線と5-FU処置後8日(TA1処置後1日目)で、またTA1処置後5、12、20、および27日後でも決定された。
10週齢ラット、体重250-300g、免疫抑制のために100mg/kgの5−フルオロウラシルを受けている。5-FU処置後8日目に、以下の群のひとつに、無作為に割り当てた。(n=8)
・対照群(食塩水を小型ポンプで注入)
・0.2mg/Kg皮下注射による低投与量TA1群(小型ポンプの注入無し)
・3.5mg/Kg皮下注射による高投与量TA1群(小型ポンプの注入無し)
・3.5mg/Kg・5日を小型ポンプで供給される、継続的注入TA1群
免疫パラメーターは、基線と5-FU処置後8日(TA1処置後1日目)で、またTA1処置後5、12、20、および27日後でも決定された。
評価としてNK活性(PBMCに4時間曝したYAC-1細胞から放出されるLDH)、総白血球数(モノクローナル抗体で特異性を実証した後、理学的細胞蛍光パラメーター(physical cytofluorimetric parameters)で判断される。)、総リンパ球(フローサイトメトリーによるCD3+)および活性化リンパ球(フローサイトメトリーによるCD25+CD3+)が含まれる。
NK活性は、基線で42±5%で、5-FU後は9±2%まで抑制された。低投与量TA1処置では、NK活性が12日後に有意に回復し、一方で高投与量TA1は5日のみで有意に回復した。しかしながら、TA1の継続的注入では5日で2倍の応答があり、32±4%であった(対応する注射による高投与量では16±2、注射による低投与量では12±3、および対照群では11±1である。)。TA1の継続的な注入により処置された動物のみが、NK細胞活性の基線濃度へ完全に回復した。
総白血球数は(これは形態学により決定されるが)、14,590±2,710 細胞数/mm3から5-FU処置後に2,597±582に低下した。注射による低もしくは高投与量TA1で処置された動物は、非処置動物と比較して、すぐに増加して回復する傾向にあった。TA1の継続的注入されたものは、統計学的に有意性を与え、わずか5日後に基線濃度まで完全に回復した。
活性化したリンパ球(CD3+CD25+)は、5-FU処置で有意に減少しなかった(65±21細胞数/mm3から37±10細胞数/mm3)。しかしながら、12日および20日後の高投与量TA1で処置したものは劇的に増加した(それぞれ297±136および321±75細胞数/mm3、166±70および212±77)。継続的注入によりTA1を与えられたものは更に増加して422±105および446±73細胞数/mm3であった。
(実施例3)
10週齢ラット、体重250-300g、免疫抑制のために100mg/kgの5-FUを受けている。5-FU処置後8日目に、以下の群のひとつに、無作為に割り当てた。(n=15)
・対照群(食塩水を小型ポンプで注入)
・3.5mg/Kg皮下注射による高投与量TA1群(小型ポンプの注入無し)
・3.5mg/Kg/5日 を小型ポンプで供給される、継続的注入TA1群
免疫パラメーターは、基線と5-FU処置後8日(TA1処置後1日目)で、またTA1処置後5および14日後でも決定された。
10週齢ラット、体重250-300g、免疫抑制のために100mg/kgの5-FUを受けている。5-FU処置後8日目に、以下の群のひとつに、無作為に割り当てた。(n=15)
・対照群(食塩水を小型ポンプで注入)
・3.5mg/Kg皮下注射による高投与量TA1群(小型ポンプの注入無し)
・3.5mg/Kg/5日 を小型ポンプで供給される、継続的注入TA1群
免疫パラメーターは、基線と5-FU処置後8日(TA1処置後1日目)で、またTA1処置後5および14日後でも決定された。
評価として、総白血球数(モノクローナル抗体で特異性を実証した後、理学的細胞蛍光パラメーターで判断される。)、顆粒球(FITC抗ラット顆粒球HIS-48を用いたフローサイトメトリー)、総リンパ球(フローサイトメトリーによるCD3+)、ヘルパーT−細胞(フローサイトメトリーによるCD4+)、活性化リンパ球(フローサイトメトリーによるCD25+CD3+)、および血清中のサイトカイン発現(ELISAによるIL-2およびIFN-γ)が含まれる。
実施例2で、TA1の継続的注入が、皮下注射した場合と比較して総白血球数において劇的に効果があることを確認後、どのタイプの白血球が増加の原因となっているかを確認することは興味深いものである。顆粒球は、継続的注入により供給されるTA1により最も影響される白血球細胞のサブセット (subset)と思われる。顆粒級数は5-FU処置後に4,485±1,116から1,249±432に減少した。(TA1を注射したときは9,924±3,218、もしくはTA1がないときは6,954±1,519であるのと比較して)継続的注入TA1で処置した場合は、5日間で14,652±2,463に増加し、この濃度は14日後でもなお最も高かった。
興味深いことに、この研究で、注射(3.5mg/Kg)およびさらに継続的注入(3.5mg/Kg)によってTA1を提供されたある動物がいた。この動物は、有害事象もなく、健康かつ活発であるばかりではなく、TA1の測定された免疫パラメーターへの効果もまた他の動物のものよりも非常に大きなものであった。顆粒球に関して、5日後で他の注入した動物で平均値が14,652±2,463であるのと比較して、この研究動物は19,376細胞数/mm3と大きく増加した。
総リンパ球数は5-FU処置により劇的に減少した(10,904±1,973細胞数/mm3から1,740±560)。TA1処置後、基線濃度まで回復した。これは、TA1が継続的注入で供給されてわずか5日後に起こるが、TA1を注射したときは14日後まで認められなかった。
注射および注入の双方でTA1を提供された動物は、他の動物とあまり相違のないリンパ球濃度であった(平均値が9,644±961であるのと比較して、9,765細胞数/mm3)。しかし、活性化されたこれらのリンパ球の割合は、大きく増加した(注入によってTA1を提供した動物では、428±89もしくはリンパ球の4%であり、注入に続きTA1の高投与量注射の動物では、976もしくはリンパ球の10%である)。
ヘルパーT−リンパ球(CD3+CD4+)もまた5-FU処置で、5,411±1,084細胞数/mm3から1,710±449まで減少した。これらのT−細胞の減少した濃度は、実験の14日間TA1処置なしでは増加しなかった。顆粒球で見られた結果とは対照的に、そこでは、継続的注入により提供されたTA1が注射により提供されたTA1よりも細胞数の回復に関し優れていたが、どちらの投与方法でも、提供されたTA1は、T−ヘルパー細胞の濃度を基線まで十分に回復させた。
注射もしくは注入どちらでも提供されたTA1はCD4ヘルパーT−リンパ球を増加させるので、この増加がヘルパーT−細胞のTh1もしくはTh2サブセットへの影響であるのかを確認することは興味深い。以前のin vitroおよびin vivoのデータは、TA1がTh1サブセットを増加させることを立証しており、この研究で同じ効果が見られた。継続的注入によりTA1を提供すると、皮下注射で見られるよりも、Th1サイトカインIL−2の血清濃度において、その増加が非常に大きい(TA1注射で21±16pg/ml、対照動物で10±16と比較して、TA1の継続的注入14日後で42±7pg/ml)。
TA1による処置はTh1サイトカインIL−2の増加を導き、そしてもう1つのTh1サイトカインであるIFN−γも増加する。処置後5日までその濃度は低いが、皮下注射TA1は、IFN-γのより高い血清濃度にする。処置後14日までに、継続的注入で提供されたTA1を伴う動物が最も濃度が高い(注射で10±1pg/ml、対照で8±8と比較して、14±5pg/ml)。
注射および継続的注入の双方でTA1を受け入れた動物で、測定したTh1サイトカインの双方の濃度で非常に大きく、特にIFN−γは、14日後、他の動物で14±5pg/mlと比較して、45pg/mlであった。
結論
血液循環(circulation)における複数日にわたって一定のTA1濃度の維持が測定した免疫効果を増加する。
この投薬量の規制が顆粒球において、予期せぬ肯定的な効果を導き、TA1注射後にみられる単球においても同様に肯定的な効果を導く。
有害事象は、通常の15倍の用量で観察されなかった。(そして、ある動物では通常の30倍以上でも観察されなかった)。
血液循環(circulation)における複数日にわたって一定のTA1濃度の維持が測定した免疫効果を増加する。
この投薬量の規制が顆粒球において、予期せぬ肯定的な効果を導き、TA1注射後にみられる単球においても同様に肯定的な効果を導く。
有害事象は、通常の15倍の用量で観察されなかった。(そして、ある動物では通常の30倍以上でも観察されなかった)。
Claims (23)
- 生理学的に活性な複合体を含む医薬組成物であって、前記複合体を患者に投与した時に患者の血清中でのチモシンアルファ1(TA1)ペプチドの半減期を増加させる物質に結合されたTA1ペプチドを含む医薬組成物。
- 前記物質が実質的に非抗原性ポリマーである請求項1記載の医薬組成物。
- 前記ポリマーがPEGである請求項2記載の医薬組成物。
- 前記PEGが分子量約200−300,000の範囲内である請求項3記載の医薬組成物。
- 前記分子量が約5,000−35,000である請求項4記載の医薬組成物。
- 前記分子量が約20,000である請求項5記載の医薬組成物。
- 前記ポリマーがTA1ペプチドのN末端部に結合された請求項2記載の医薬組成物。
- 前記TA1がTA1である請求項1記載の医薬組成物。
- チモシンアルファ1ペプチドに実質的に非抗原性のポリマーを結合することを含む請求項2に係る医薬組成物の製造方法。
- ポリマーがチモシンアルファ1ペプチドのN末端部に結合する請求項9記載の製造方法。
- ポリマーがPEGである請求項9記載の製造方法。
- 前記PEGが分子量約200−300,000の範囲内である請求項9記載の製造方法。
- 前記分子量が約5,000−35,000である請求項12記載の製造方法。
- 前記分子量が約20,000である請求項13記載の製造方法。
- 前記チモシンアルファ1ペプチドがTA1である請求項9記載の製造方法。
- 請求項1記載の医薬組成物を投与する方法あって、免疫を刺激する必要がある患者に免疫刺激有効量の医薬組成物を投与することにより、患者を処置することを含み、該医薬組成物は複合体を患者に投与した時に患者の血清中でのTA1ペプチドの半減期を増加させる物質に結合されたチモシンアルファ1(TA1)ペプチドを含む生理学的に活性な複合体を含む、請求項1記載の医薬組成物を投与する方法。
- 前記物質が実質的に非抗原性ポリマーである請求項16記載の方法。
- 前記ポリマーがPEGである請求項16記載の方法。
- 前記PEGが分子量約200−300,000の範囲内である請求項18記載の方法。
- 前記分子量が約5,000−35,000である請求項19記載の方法。
- 前記分子量が約20,000である請求項20記載の方法。
- 前記ポリマーがTA1ペプチドのN末端部に結合された請求項17記載の方法。
- 前記TA1ペプチドがTA1である請求項16記載の方法。
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