CN112074303A - 通过点击化学反应的用作填充剂或药物载体的注射制剂组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过点击化学反应用作填充剂或药物载体的注射制剂组合物。更具体地，本发明涉及一种注射制剂组合物、用于使用所述组合物制备注射制剂水凝胶的方法以及使用该组合物的医药填充剂、体内注射型支持物或药物载体；所述组合物包括：包含具有引入其中的第一点击化学官能团的第一生物聚合物的第一液体以及包含具有引入其中的第二点击化学官能团的第二生物聚合物的第二液体，其中所述第一点击化学官能团与所述第二点击化学官能团可化学连接。

Description

通过点击化学反应的用作填充剂或药物载体的注射制剂组 合物
技术领域
本发明涉及通过点击化学反应的用作填充剂或药物载体的注射用组合物，更具体地涉及注射用组合物、使用其制备注射用水凝胶的方法、以及使用其的医学填充剂、生物注射用支架或药物载体；所述组合物包括：包含其中引入有第一点击化学官能团的的第一生物聚合物的第一液体和包含其中引入有第二点击化学官能团的第二生物聚合物的第二液体，其中，所述第一点击化学官能团和所述第二点击化学官能团是可化学连接的。
背景技术
近年来，透明质酸注射用水凝胶在医学领域引起了广泛兴趣，并有望广泛用于从医学填充剂到药物(包括生物递质)载体以及使用三维结构的器官/组织再生的领域。这种注射用水凝胶的优点在于，可以使用注射器等将其简单地注射到活体内而无需外科手术。
通常，在注射用水凝胶的情况下，由于其在体外具有流体样性质，并且在注射入体内后胶凝发生，因此可以使用注射器植入用水凝胶。即，在植入后，水凝胶可以用作药物载体，以缓释能够维持细胞生长的药物(生物活性物质)或支架。另外，通过采用各种交联方法，可以控制水凝胶的物理化学性质，例如胶凝时间、溶胀率、分解和机械性质，并且控制这些物理化学性质的可能性为水凝胶在根据应用的药物递送系统或组织工程中的使用提供了很大的优势。因此，重要的是，通过控制适当的交联度来制备具有期望的物理化学性质的水凝胶。
注射用水凝胶可通过非共价键合(疏水键、氢键等)的可逆相互作用或通过化学反应(热、UV)的不可逆键合获得。其中，通过可逆键合制备的注射用水凝胶使用有毒添加剂，例如光引发剂和交联剂，并且具有机械性能弱的问题。
因此，需要一种能够容易地控制生物相容性材料的物理化学性质同时克服上述问题的交联的水凝胶。
发明内容
技术问题
本发明提供了一种注射用组合物，包括：包含其中引入有第一点击化学官能团的的第一生物聚合物的第一液体和包含其中引入有第二点击化学官能团的第二生物聚合物的第二液体，其中，第一点击化学官能团和第二点击化学官能团是可化学连接的。
然而，本发明要解决的技术问题不限于上述技术问题，对于本领域普通技术人员来说根据以下描述，其他未提及的技术问题将变得显而易见。
技术方案
根据本发明的一个方面，提供了注射用组合物，包括：包含其中引入有第一点击化学官能团的的第一生物聚合物的第一液体和包含其中引入有第二点击化学官能团的第二生物聚合物的第二液体，其中，第一点击化学官能团和第二点击化学官能团是可化学连接的。
本发明还提供了制备注射用水凝胶的方法，该方法包括：(a)通过向第一生物聚合物中添加包含第一点击化学官能团的材料来制备第一液体；(b)通过向第二生物聚合物中添加包含第二点击化学官能团的材料来制备第二液体；(c)使第一液体和第二液体反应以化学连接第一点击化学官能团和第二点击化学官能团。
本发明还提供了包括注射用水凝胶的医药填充剂或生物注射用支架。
本发明还提供了使用注射用水凝胶的药物载体和药物。
发明的有益效果
根据本发明的注射用水凝胶可通过点击化学反应简单地由注射用组合物来制备，并且通过调节点击化学官能团的类型和数量、生物聚合物的分子量等，可以很容易地控制注射用水凝胶的物理化学性质。因此，根据本发明的注射用水凝胶适合用作医药填充剂或生物注射用支架，并且可以进一步包含药物(包括生物递质)，因此还可以用作缓释药物载体或药物等。
附图说明
图1示出了根据本发明的通过其中引入有第一点击化学官能团的透明质酸和其中引入有第二点击化学官能团的透明质酸的点击化学反应的特异性交联的透明质酸水凝胶的作用机理的视图。
图2示出了根据本发明的一个实施方案制备的特异性交联的透明质酸水凝胶的1H-NMR结果。
图3是显示根据本发明的实施方案制备的特异性交联的透明质酸水凝胶的流变性质的图。
图4示出了使用扫描电子显微镜观察到的根据本发明的实施方案制备的特异性交联的透明质酸水凝胶的图像。
图5是显示根据本发明的实施方案制备的特异性交联的透明质酸水凝胶相对于水的水溶胀性的图。
图6示出了显示根据本发明的实施方案制备的特异性交联的透明质酸水凝胶的体内凝胶形状保持特性的图像。
图7示出了显示根据本发明的实施方案制备的特异性交联的透明质酸水凝胶的体内保留性能的图像。
图8是显示抗癌剂(阿霉素)从根据本发明的实施方案制备的包含抗癌剂(阿霉素)的特异性交联的透明质酸水凝胶中的累积释放特性的图。
图9是显示通过根据本发明的实施方案制备的包含抗癌剂(阿霉素)的特异性交联的透明质酸水凝胶对癌细胞生长的抑制的图。
图10是显示通过注射根据本发明的实施方案制备的包含抗癌剂(阿霉素)的特异性交联的透明质酸水凝胶来抑制动物中形成的癌症生长的图。
图11是显示比较通过注射根据本发明实施方案制备的包含抗癌剂(阿霉素)的特异性交联的透明质酸水凝胶抑制动物体内形成的肿瘤生长与通过注射包含根据本发明实施方案制备的特异性交联的透明质酸水凝胶的冻干粉状产品中的抗癌剂(阿霉素)的组合物抑制动物体内形成的肿瘤生长的结果。
图12是显示观察到在注射根据本发明实施方案制备的包含抗癌剂(阿霉素)的特异性交联的透明质酸水凝胶后抗癌剂(阿霉素)的荧光出现在动物的各个器官中的结果的一组图像。
图13是显示了定量确认注射包含根据本发明实施方案制备的抗癌剂(阿霉素)的特异性交联的透明质酸水凝胶后动物的各个器官中观察到的抗癌剂(阿霉素)的量的HPLC结果的一组曲线图。
图14是显示了定量确认注射根据本发明的实施方案制备的含胰岛素的特异性交联的透明质酸水凝胶后糖尿病诱导的动物的血糖水平变化的结果的一组曲线图。
具体实施方式
最佳模式
在继续研究填充剂(医药填充剂或生物注射用支架)和药物载体的同时，本发明的发明人证实，通过向生物聚合物中引入不同的点击化学官能团，并通过点击化学反应使官能团化学交联，可以制备易于制备并且具有优异的生物可持续性的水凝胶，从而完成了本发明。
在下文中，将详细描述本发明。
本发明提供了一种注射用组合物，包括：包含其中引入有第一点击化学官能团的的第一生物聚合物的第一液体和包含其中引入有第二点击化学官能团的第二生物聚合物的第二液体，其中，第一点击化学官能团和第二点击化学官能团是可化学连接的。
注射用组合物是用于简单地制备注射用水凝胶的组合物，并且第一液体和第二液体可以在双注射器中以彼此分离的状态存在，然后可以被混合。当混合时，注射用组合物中的第一点击化学官能团和第二点击化学官能团可通过点击化学反应形成特定的交联键，从而以注射用水凝胶的形式制备。水凝胶是使用水作为分散介质的凝胶，并且该凝胶是这种状态：在该状态溶胶失去流动性并被固化且分散相的溶解度降低，从而通过键形成网络结构并且分散介质被包含在其中。
第一点击化学官能团包括选自炔基、环氧基，丙烯酰基和四嗪基中的一种或多种，第二点击化学官能团可以包括选自叠氮基、巯基、氨基和环辛烯基的一种或多种。
具体地，作为第一点击化学官能团，炔基可以源自于包含选自氨基-PEG 4-炔、炔-PEG 5-酸和炔-PEG-胺的第一点击化学官能团的材料；环氧基可源自于包含选自环氧乙胺(oxiranylamine)和2-环氧乙基乙胺(2-oxiranyl-ethylamine)的第一点击化学官能团的材料；所述丙烯酰基可以源自于包含选自丙烯酰胺、丙烯酸和丙烯酰氯的第一点击化学官能团的材料；四嗪基可源自于包含选自甲基四嗪胺、甲基四嗪-PEG4-胺、甲基四嗪丙胺、四嗪-PEG5-NHS酯、甲基四嗪-PEG4-NHS酯、甲基四嗪-磺酸基-NHS酯、甲基四嗪-PEG4-酸、甲基四嗪-PEG12-NHS酯、甲基四嗪-NHS酯、甲基四嗪酸和四嗪酸的第一点击化学官能团的材料。
在本发明的一个实施方案中，作为包含第一点击化学官能团的材料，使用了甲基四嗪-PEG4-胺(Tet)。
另外，作为第二点击化学官能团，叠氮基可以源自于包含选自叠氮-PEG4-胺的第二点击化学官能团的材料；巯基可以源自于包含选自3-氨基-1-丙硫醇、11-巯基十一烷酸、氨基甲硫醇和巯基PEG胺的第二点击化学官能团的材料；氨基可源自于包含选自乙二胺、PEG二胺、(S)-3-氨基-2-(羟甲基)丙酸和氨基乙酸的第二点击化学官能团的材料；所述环辛烯基可以源自于包含选自反式环辛烯胺、反式环辛烯-NHS酯、反式环辛烯-PEG-NHS酯和反式环辛烯-PEG4-酸的第二点击化学官能团的材料。
在本发明的一个实施方案中，作为包含第二点击化学官能团的材料，使用了反式环辛烯胺(TCO)。
第一点击化学官能团和第二点击化学官能团能够彼此化学交联，并且这样的化学键合可以在短时间内，特别是在几秒钟内完成，其优点在于第一液体第二种液体可以在短时间内形成胶体。具体地，第一点击化学官能团和第二点击化学官能团的组合可以选自炔基和叠氮基；炔基和巯基；环氧基和氨基；环氧基和巯基；丙烯酰基和氨基；丙烯酰基和巯基；以及四嗪和环辛烯。
在本发明的一个实施方案中，作为第一点击化学官能团和第二点击化学官能团的组合，使用了四嗪和环辛烯，并且这些基团彼此反应形成特异性交联键。
第一生物聚合物和第二生物聚合物可以彼此相同或不同，并且优选第一生物聚合物和第二生物聚合物各自独立地包括选自透明质酸、小肠粘膜下组织、羧甲基纤维素、藻朊酸盐、壳聚糖、聚丙烯酰胺、聚(N-异丙基丙烯酰胺)和β-甘油磷酸酯中的一种或多种，但本发明不限于此。
更具体地，在引入官能团之前，第一生物聚合物和第二生物聚合物可以具有相同的分子量或不同的分子量，并且其分子量的范围优选为500,000Da至6,000,000Da，但本发明是不限于此。当生物聚合物的分子量小于上述范围时，存在物理性能太低的问题，当分子量超过上述范围时，存在由于粘度的增加而导致的使用中的问题。
通过调节相对于1摩尔的第一生物聚合物引入的第一点击化学官能团的数量或相对于1摩尔的第二生物聚合物引入的第二点击化学官能团的数量，可以控制生物高分子水凝胶的交联程度，因此可以根据水凝胶的使用来优化物理性能。具体地，相对于1摩尔的第一生物聚合物引入的第一点击化学官能团的数量的范围或相对于1摩尔的第二生物聚合物引入的第二点击化学官能团的数量的范围可以为100至2,000，并且就通过注射器的容易注射而言最优选100至300，但是本发明不限于此。
具体地，当生物聚合物水凝胶的点击交联度低时，由于低强度和高溶胀率，该生物聚合物水凝胶可应用于各种软组织。同时，当生物聚合物水凝胶具有中等程度的点击交联度时，该生物聚合物水凝胶可被应用于软骨组织并用于预防或治疗关节炎、软骨损伤或软骨缺陷。另一方面，当生物聚合物水凝胶具有高度点击交联时，由于高强度和低溶胀率，该生物聚合物水凝胶可以应用于骨组织，并用于预防或治疗骨质疏松症或骨缺损疾病。
第一液体和第二液体中可以另外包括药物，在这种情况下，药物是指广义的概念，不仅包括普通药物而且还包括生物递质。已知药物可以用作药物，例如，药物可以包括化学药物、蛋白质药物、肽药物、用于基因治疗的核酸分子和纳米颗粒。例如，该药物包括但不限于抗癌药、糖尿病疾病的治疗药、消炎药、镇痛剂、抗关节炎药、抗痉挛药、抗抑郁药、抑制精神病药、镇定剂、抗焦虑药、麻醉剂拮抗剂、抗帕金森氏病药物、胆碱能激动剂、抗血管生成抑制剂、免疫抑制剂、抗病毒药、抗生素、食欲抑制剂、抗胆碱能药、抗组胺药、抗偏头痛药、激素药、冠状动脉、脑血管或外周血管扩张药、避孕药、抗血栓药、利尿药、抗高血压药、心脏保护药和化妆品成分(例如抗皱药、抗皮肤老化剂和皮肤增白剂)。
具体而言，药物优选包括抗癌剂，所述抗癌剂包含选自阿霉素、顺铂、紫杉醇、长春新碱、拓扑替康、多西他赛、5-氟尿嘧啶(5-FU)、格列卫、卡铂、道诺霉素、戊柔比星、氟他胺和吉西他滨中的一种或多种；或包括胰岛素或促胰岛素肽的糖尿病的治疗剂，但本发明不限于此。
在本发明的一个实施方案中，阿霉素和胰岛素用作药物。
本发明还提供一种制备注射用水凝胶的方法，该方法包括：(a)通过向第一生物聚合物中添加包含第一点击化学官能团的材料来制备第一液体；(b)通过向第二生物聚合物中添加包含第二点击化学官能团的材料来制备第二液体；(c)使第一液体和第二液体反应以化学键合第一点击化学官能团和第二点击化学官能团。
在过程(a)中，包含第一化学官能团的材料可以是选自氨基-PEG4-炔基、炔基-PEG5-酸、炔基-PEG-胺、环氧乙胺、2-环氧乙基乙胺、丙烯酰胺、丙烯酸、丙烯酰氯、甲基四嗪-胺、甲基四嗪-PEG4-胺、甲基四嗪-丙胺、四嗪-PEG5-NHS酯、甲基四嗪-PEG4-NHS酯、甲基四嗪-磺酸基-NHS酯、甲基四嗪-PEG4-酸、甲基四嗪-PEG12-NHS酯、甲基四嗪-NHS酯、甲基四嗪酸和四嗪酸的一种或多种。
在过程(b)中，包含第二点击化学官能团的材料可以是选自叠氮基-PEG4-胺、3-氨基-1-丙硫醇、11-巯基十一烷酸、氨基-甲硫醇、巯基PEG胺、乙烯二胺、PEG二胺、(S)-3-氨基-2-(羟甲基)丙酸、氨基乙酸、反式环辛烯胺、反式环辛烯-NHS酯、反式环辛烯-PEG-NHS酯和反式环辛烯-PEG4-酸中的一种或多种。
任选地，在过程(a)或过程(b)中，可以另外添加缩合剂或药物。具体地，为了将第一点击化学官能团或第二点击化学官能团引入到第一生物聚合物或第二生物聚合物中，优选通过在第一生物聚合物溶液或第二生物聚合物溶液中另外包含缩合剂来进行缩合反应，但是本发明不限于此。作为缩合剂，可以使用4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氯化物(DMTMM)并且可以调节缩合剂的量以控制缩合反应的程度。同时，药物是与上述相同的，并且可以通过注射药物与药物载体一起进行施用。
使用该方法制备的注射用水凝胶不仅为凝胶形式，而且为注射用制剂。
具体地，注射用水凝胶具有高储能模量(G')，并且使用流变仪测量的0.1Hz至10Hz的频率范围内的注射用水凝胶的储能模量(G')的范围可以为2.00×102Pa至2.00×103Pa，优选为2.00×102Pa至4.00×102Pa，但是本发明不限于此。
另外，注射用水凝胶在25℃的复数粘度的范围可以为3.00×101Pa·s至3.0×102Pa·s，优选为3.00×101Pa·s至6.0×101Pa·s，但是本发明不限于此。
另外，注射用水凝胶可以是多孔形式。这意味着交联已发生。
另外，注射用水凝胶相对于水的溶胀率的范围可以为2,000％至10,000％，优选地7,500％至10,000％，但是本发明不限于此。
本发明还提供了包含制备的注射用水凝胶的医药填充剂或生物注射用支架(填充剂)。
本发明还提供了包含制备的注射用水凝胶和药物的药物载体。
药物可以存在于水凝胶内部，或者可以以与水凝胶混合的形式存在，但是就有效的药物递送而言，存在于水凝胶内部是优选的，但是本发明不限于此。
所述药物是与上述相同的药物。
该药物载体可以用作缓释的药物载体，并且可以具有在28天内50％至100％的累积释药率。具体地，该药物载体可以具有在16天内50％至80％的累积释药率，并且可以具有在28天内80％至100％的累积释药率，因此药物在长时间段内缓慢释放，以便长时间保持功效。因此，有利的是，可以完全防止单次/重复注射药物引起的副作用的发生。
此外，本发明提供了注射用水凝胶或药物载体在治疗癌症或糖尿病中的用途。
本发明还提供了治疗癌症或糖尿病的方法，包括向个体施用注射用水凝胶或药物载体。
在本发明中，“个体”是指需要治疗疾病的受试者，更具体地，包括哺乳动物，例如人、非人灵长类、小鼠、大鼠、狗、猫、马、牛等。
在下文中，将参考以下实施例更详细地描述本发明。提供这些实施例仅出于说明性目的，并且对于本领域普通技术人员来说将显而易见的是，本发明的范围不解释为受这些实施例的限制。
实施例1至3.制备其中引入有第一点击化学官能团的和第二点击化学官能团的特 异性交联的透明质酸水凝胶
(1)将100mg的透明质酸(HA)(分子量：1,000,000Da)添加到10mL的三次蒸馏水中，然后在25℃搅拌24小时以制备透明质酸溶液，然后将其以5mL/小瓶的量分配到小瓶中。
(2)向作为缩合剂的8.3mg 4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氯化物(DMTMM)和9.93mg甲基四嗪-PEG4-胺(Tet)中添加其中包含透明质酸溶液的小瓶，并在25℃搅拌24小时以使反应发生。接下来，对反应产物透析72小时，然后在-80℃下进行冻干，从而完成其中引入有第一点击化学官能团的HA-Tet的制备。
如下表1所示，通过Flash EA1112装置(CE Instruments，Italy)的元素分析，分析引入到具有引入其中的第一点击化学官能团的HA-Tet中的点击官能团的量。
(3)使用与上述相同的方法制备引入有化学官能团的透明质酸，不同之处在于，添加了7.7mg的反式环辛烯胺(TCO)而不是Tet，从而完成了引入有第二点击化学官能团的HA-TCO的制备。
如下表1所示，通过Flash EA1112装置(CE Instruments，Italy)的元素分析，分析了引入到具有引入其中的第二点击化学官能团的HA-TCO中的点击官能团的量。
(4)将制备的具有引入其中的第一点击化学官能团的HA-Tet和制备的具有引入其中的第二点击化学官能团的HA-TCO分别溶解在2％生理盐水中，然后置于双注射器中以使HA-Tet和HA-TCO被混合，从而引起点击化学反应，最终通过特异性交联制备了本发明的透明质酸水凝胶。
(5)根据引入的第一点击化学官能团或第二点击化学官能团(Tet或TCO)的数量调节如上制备的透明质酸水凝胶的交联度。
[表1]
Figure BDA0002760219500000101
*数目：每摩尔透明质酸(HA)引入的第一点击化学官能团或第二点击化学官能团(Tet或TCO)的数目(250、500、1000)
另外，通过1H-NMR分析，确认HA-Tet具有引入其中的第一点击化学官能团，HA-TCO具有引入其中的第二点击化学官能团(图2)。
实施例4.制备具有用于近红外荧光成像引入的荧光材料的特异性交联的透明质 酸水凝胶
在50mL的圆底烧瓶中，将IR783(80mg，0.11mmol)和4-巯基苯甲酸(51mg，0.33mmol)溶解在DMF(3mL)中，并在室温下搅拌24小时。为了从反应溶液中除去未反应的物质和杂质，将所得溶液在30mL的乙醇和乙醚的混合溶剂(v/v＝1/19)中进行沉淀和过滤。滤液被真空干燥以制备IR783-COOH，获得了绿色固体。
接下来，将根据实施例1制备的具有引入其中的第一点击化学官能团的HA-Tet和具有引入其中的第二点击化学官能团的HA-TCO分别添加到10mL的三次蒸馏水中以制备溶液，并将作为缩合剂的3.3mg 4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氯化物(DMTMM)添加到每个小瓶中。将每种溶液缓慢滴加到5mL含10.5mg IR783-COOH的三次蒸馏水中，同时将所得溶液在25℃搅拌24小时以使反应发生，然后进行透析3天并于-80℃进行冻干，从而完成了具有引入其中的第一点击化学官能团和IR783的NIR-HA-Tet和具有引入其中的第二点击化学官能团和IR783的NIR-HA-TCO的制备。
实施例5.制备包含抗癌剂的特异性交联的透明质酸水凝胶
根据实施例1制备的具有引入其中的第一点击化学官能团的HA-Tet(2mg)和具有引入其中的第二点击化学官能团的HA-TCO(2mg)各自溶解在2％的生理盐水中以制备100μL溶液，并向每种溶液中添加作为抗癌剂的0.2mg阿霉素(Dox)。搅拌1小时后，将搅拌的混合溶液在双注射器中混合，最终获得包含阿霉素(0.4mg)的特异性交联的透明质酸水凝胶(Cx-HA-Dox)。
实施例6.制备包含糖尿病治疗剂的特异性交联的透明质酸水凝胶
根据实施例1制备的具有引入其中的第一点击化学官能团的HA-Tet(2mg)和具有引入其中的第二点击化学官能团的HA-TCO(2mg)各自溶解在2％的生理盐水中以制备100μL溶液，并向每种溶液中添加31.5IU胰岛素。搅拌1小时后，将搅拌的混合溶液在双注射器中混合，最终获得包含胰岛素(63IU)的特异性交联的透明质酸水凝胶(胰岛素-Cx-HA)。
比较例1.制备透明质酸水凝胶
将透明质酸溶解在2％的生理盐水中，从而最终制备出透明质酸水凝胶(HA)。
比较例2.制备其中引入有荧光物质的透明质酸水凝胶
将作为缩合剂的3.3mg 4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氯化物(DMTMM)添加到其中用2％生理盐水溶解的玻尿酸的小瓶中，然后将其缓慢滴加至根据实施例4制备的5mL含10.5mg IR783-COOH的三次蒸馏水中，将所得溶液在25℃搅拌24小时以使反应发生，然后进行透析3天并于-80℃进行冻干，从而完成了具有引入其中的IR783的NIR-HA的制备。
比较例3.制备包含抗癌剂的透明质酸水凝胶
将根据比较例1制备的透明质酸水凝胶(4mg)溶解在2％生理盐水中以制备200μL溶液，并且通过注射器，最终获得包含作为抗癌剂的阿霉素(0.4mg)的透明质酸水凝胶(HA-Dox)。
比较例4.制备包含糖尿病治疗剂的透明质酸水凝胶
将根据比较例1制备的透明质酸水凝胶(4mg)溶于2％生理盐水中以制备200μL溶液，并通过注射器，最终获得包含胰岛素(63IU)的透明质酸水凝胶(胰岛素-Dox)。
比较例5.制备通过引入第一点击化学官能团和第二点击化学官能团交联的透明 质酸水凝胶的冷冻干燥粉状产物。
将根据实施例1通过点击化学反应制备的特异性交联的透明质酸水凝胶冷冻干燥并在预冷50秒/研磨(60Hz)240秒/冷却50秒(粉碎的-HA)三次循环的条件下，在液氮中使用深冷粉碎机(6700,SPEX Inc.，USA)进行粉碎。
实验实施例1.水凝胶的流变性质的评价
为了评估实施例1中通过点击化学反应特异性交联制备的透明质酸水凝胶的流变特性和根据比较例1制备的透明质酸水凝胶的流变特性，使用模块化紧凑型流变仪(MCR102，Anton Paar，Austria)测量模量和粘度。此时，所使用的平行板具有25mm的直径，距底面的距离为0.3mm，并且在25℃2％应变和1Hz的条件下进行测量，其结果如图3所示。
对于所制备的水凝胶的模量值，如图3(a)所示，证实根据实施例1中通过点击化学反应特异性交联而制备的透明质酸水凝胶表现出与根据比较例1中制备的透明质酸水凝胶几乎相同的损耗模量，同时表现出由通过点击化学反应的特异性交联而显著增强的储能模量，并且还证实了随着点击交联程度的增加，储能模量的强度也显著增加。
另外，相对于所制备的水凝胶的粘度，如图3(b)所示，证实根据实施例1制备的透明质酸水凝胶表现出与根据比较例1制备的透明质酸水凝胶相比高得多的粘度，并且还证实随着交联程度的增加，粘度也显著增加。
另外，关于使用模块化紧凑型流变仪(MCR 102，Anton Paar，Austria)测量的制备的水凝胶的弹性，如图3(c)所示，证实根据实施例1制备的透明质酸水凝胶表现出与根据比较例1制备的透明质酸水凝胶相比高得多的弹性，并且还证实随着点击交联程度的增加，弹性也显著增加。
如图3(d)和3(e)所示，观察到通过具有引入其中的第一点击化学官能团的HA-Tet和具有引入其中的第二点击化学官能团的HA-TCO的点击化学反应而特异性交联的水凝胶(实施例1，Cx-HA-250)的损失模量和储能模量在约2秒内逆转。从结果可以看出，通过点击化学反应的特异性交联在3秒内发生。
同时，观察到Cx-HA-500(实施例2)和Cx-HA-100(实施例3)的损失模量和储能模量与测量同时逆转，可以看出点击反应太快而无法测量。
此外，实施例1、2和3中制备的具有引入其中的第一点击化学官能团的HA-Tet和具有引入其中的第二点击化学官能团的NIR-HA-TCO各自放置在双注射器中并通过注射器注射的情况下，在实施例1的情况下通过按压注射器容易地进行注射，而在实施例3的情况下需要更强的力进行注射。从结果可以看出，随着引入的Tet或TCO的量增加，交联程度增加，并且点击反应进行得非常快。
实验实施例2.水凝胶的粘度性质的评价
将根据实施例1(Cx-HA-250)和比较例2制备的水凝胶各自放入5ml小瓶中，并在制备后立即以及制备后第2天、第8天、第12天和第28天使用模块化紧凑型流变仪(MCR 102，Anton Paar，Austria)测量每种水凝胶的粘度。
结果，如图3(f)所示，证实根据实施例2制备的通过点击化学反应特异性交联的水凝胶将保持粘度28天或更长，而根据比较例2制备的普朗尼克水凝胶将保持粘度1天，并且从第2天开始表现出非常低的粘度，在第3天后变成粘度无法测量的溶液。
实验例3.根据水凝胶的交联度观察水凝胶的内部
为了评估根据实施例2和3以及比较例1制备的透明质酸水凝胶的内部交联程度，使用等离子溅射设备(Emitech，K575，Kent，UK)涂覆每种透明质酸水凝胶，然后使用扫描电子显微镜(FE-SEM；JSM-6700F,JEOL,Tokyo,Japan)观察每个水凝胶的内部结构。
结果，如图4所示，证实比较例1由于内部水凝胶结构的凝集而具有无孔的结构，而实施例2和3保持一定的多孔形式。还证实了第一点击化学官能团和第二点击化学官能团(Tet和TCO)的数目越多，孔径越小且Tet和TCO之间的交联程度越高。
实验例4.观察水凝胶相对于水的溶胀率
为了评估根据实施例1、2和3和比较例1制备的每种透明质酸水凝胶相对于水的水溶胀性，将200μL的每种透明质酸水凝胶置于20mL的小瓶并向其中添加10mL PBS，然后测量各水凝胶随时间的重量以获得相对于水的溶胀率。使用以下公式计算相对于水的溶胀率：
相对于水的溶胀率(％)＝[(吸收水的水凝胶的重量-干燥的水凝胶的重量)/(干燥的水凝胶的重量)]×100
结果，如图5所示，证实比较例1的透明质酸水凝胶在添加PBS后数分钟内变为溶液，因此无法算出相对于水的溶胀率，而实施例1中制备的透明质酸水凝胶表现出更大的相对于水的溶胀率，并且随着点击交联程度的增加，相对于水的溶胀率显著降低。
实施例5.观察水凝胶形成
将制备的HA-Tet和HA-TCO各自添加到双注射器中，并将100μl每种水凝胶皮下注射到小鼠中以形成皮肤下的水凝胶。此后，每隔1周从每只小鼠的皮肤下提取水凝胶并进行观察。结果，如图6所示，可以看出，即使在4周后，仍稳定地形成凝胶。
同时，将比较例1中制备的100μl透明质酸水凝胶皮下注射到每只小鼠中以形成水凝胶并进行观察，但是1周后仍不能确认凝胶形成。
实验实施例6.通过近红外荧光成像观察水凝胶形成
将根据实施例4制备的具有引入其中的第一点击化学官能团和IR783的NIR-HA-Tet和具有引入其中的第二点击化学官能团和IR783的NIR-HA-TCO分别放入双注射器中，通过1mL注射器(21G)将其0.15mL皮下注射到每只裸鼠(8周大的雄性)中。为了进行比较实验，使用与上述相同的方法将根据比较例3制备的NIR-HA注射到每只裸鼠中，然后观察随时间的荧光成像。
结果，如图7所示，根据实施例4制备的透明质酸水凝胶的荧光成像被保持40天或更长时间(图7B)，而根据比较例3制备的注射的透明质酸水凝胶的荧光成像被保持达12小时，并且在1天后不再被观察到(图7C)。
实验例7.包含抗癌剂的水凝胶的药物释放效果
将根据实施例5和比较例3制备的含抗癌剂的水凝胶分别溶解在0.5mL的PBS中，然后注入24孔Transwell板(SPL Life Sciences，0.4μm孔径)的上腔室中以确认在37℃和100rpm在摇床中随着时间的药物释放。根据每个时间点收集0.5mL溶液，然后再次注入0.5mL PBS溶液。使用高效液相色谱(HPLC)系统(Agilent 1200 series,Waldbronn,Germany)测量阿霉素的释放。为了测量阿霉素的量，使用479nm的波长和CAPCELL PACK C18色谱柱(5μm，4.6×250mm，Shiseido Co.,Ltd.,Tokyo,Japan)。体积比为30:70(v/v)的50mM磷酸钠和乙腈的混合溶液用作流动相，流速为0.5mL/min。通过与标准校准曲线比较，计算体外阿霉素累积释放率。
结果，如图8所示，证实与根据比较例3制备的含抗癌剂的水凝胶相比，根据实施例5制备的含抗癌剂的特异性交联的水凝胶(Cx-HA-Dox)表现出阿霉素的缓释，并且证实16天内阿霉素累积释放率为约60％至约70％。
在28天的释放试验之后，作为测量残留在根据实施例5制备的含抗癌剂的特异性交联的水凝胶(Cx-HA-Dox)中的阿霉素的含量的结果，该含量被证实为约10.4％。因此，确定实际的阿霉素累积释放率为约90％。
实验实施例8.包含抗癌剂的水凝胶的细胞抗癌作用
将2×104个B16F10黑素瘤细胞接种在24孔Transwell板(SPL Life Sciences，0.4μm孔径)的每个下腔中，并在5％CO2中于37℃孵育一天。然后，200μLPBS、阿霉素(Dox；0.4mgDox/200μL)、阿霉素重复(0.1mg Dox/200μL)、根据比较例1制备的水凝胶(HA；4mg HA/200μL)、根据比较例3制备的含抗癌剂的水凝胶(HA-Dox；4mg HA、0.4mg Dox/200μL)、根据实施例1制备的特异性交联的水凝胶(Cx-HA；2mg TET-HA、2mg TCO-HA/200μL)和根据实施例5制备的含抗癌剂的特异性交联的水凝胶(Cx-HA-Dox；2mg TET-HA、2mg TCO-HA、0.4mg Dox/200μL)添加到24孔Transwell板的各自上腔室中。用上腔室覆盖包含细胞的每个孔，并将细胞在37℃，5％CO2中孵育12小时、24小时、48小时和72小时，并在12小时后替换最初添加的培养基。为了确认每种制剂在体外分别对B16F10细胞的12小时、24小时、48小时和72小时的细胞毒性，进行MTT(3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基四氮唑鎓溴化物；Sigma-Aldrich Co.,St.Louis,MO,USA)测定。向每个孔中加入100μL包含MTT四唑底物(50μg/mL)的PBS溶液，然后在37℃孵育4小时。此时，为了溶解所产生的紫色甲瓒，注入500μL/孔的DMSO并摇动30分钟，然后将溶液转移至96孔板。使用酶标仪(E-max，Molecular Devices，Sunnyvale，CA，USA)测量590nm波长下溶液的光密度。
结果，如图9所示，证实了，当包含抗癌剂时，细胞抗癌效果优异。然而，也证实了，即使不包含抗癌剂，根据实施例1制备的特异性交联的水凝胶(Cx-HA)也表现出与根据比较例制备的水凝胶(HA)相比增强的细胞抗癌作用。
实验实施例9.当含抗癌剂的水凝胶应用于动物时癌症大小的比较
通过将100μL约2×105B16F10黑素瘤细胞的悬液皮下注射到BALB/c小鼠的腹部(6周大，雄性，20g)中产生癌症模型。假定肿瘤体积变为150-200mm3的情况为0d，将癌症诱导的动物分为六个实验组：(1)对照组；(2)阿霉素(Dox；0.4mg Dox)；(3)Dox重复(0.1mgDox)；(4)根据比较例3制备的含抗癌剂的水凝胶(HA-Dox；0.4mg Dox)；(5)根据实施例5制备的含抗癌剂的特异性交联的水凝胶(Cx-HA-Dox；0.4mg Dox)；(6)根据比较例5制备的特异性交联的水凝胶的冷冻干燥的粉碎产物中的包含抗癌剂(阿霉素)的组合物(粉碎的HA；0.4mg Dox)。当肿瘤体积达到150-200mm3时，使用1mL注射器和21号针头将每种溶液注入肿瘤。此时，溶液的注射速率保持在10μL/s，以防止溶液流入周围的组织。通过在预定日期使用游标卡尺二维测量肿瘤直径来评估抗肿瘤活性。使用以下等式计算肿瘤体积(V)：V＝[长度×(宽度)2]/2。
结果，如图10和11所示，证实了当包含抗癌剂时，抗肿瘤活性显著提高。特别地，证实了根据实施例5制备的含抗癌剂的特异性交联的水凝胶(Cx-HA-Dox)表现出与根据比较例3制备的含抗癌剂的水凝胶(HA-Dox)和根据比较例5制备的含抗癌剂的水凝胶(粉碎的HA-Dox)相比进一步增强的抗肿瘤活性，因此，实施例5的水凝胶预期可作为有效的药物载体使用。
实验实施例10.含抗癌剂的水凝胶应用于动物时的抗癌药代动力学作用。
为了进行药代动力学实验，在第1天、第6天、第12天和第18天处死小鼠。立即获取器官(肿瘤、肠、肺、肾、肝、脾和心脏)并进行拍照(图12)。为了测量每个器官中残留的阿霉素量，使用T10碱性ULTRA-TURRAX均质器(IKA-Werke GmbH&Co.，Staufen，Germany)在0.3NHCl/70％乙醇溶液中以25,000rpm至30,000rpm均质每个器官，然后在37℃下孵育15分钟。将每个均匀混合的样品与相同体积的40％ZnSO4和流动相混合，并在37℃再次孵育15分钟。当孵育结束后，将每个样品以2,000rpm离心10分钟，并参照标准校准曲线计算上清液中阿霉素的含量。通过UV可见分光光度计(V-770,JASCO Inc.,Tokyo,Japan)测量每个器官中所含的阿霉素的量(图13)。
结果，如图13所示，证实了，在单独注射阿霉素(Dox)的情况下，存在这样的问题：抗癌剂被更快地分布至各器官而非肿瘤。同时，已经证实，在Dox重复注射的情况下，大量抗癌剂存在于肿瘤中，并且与单独注射阿霉素相比，大量抗癌剂残留在各个器官中并且影响这些器官，因此反复注射抗癌剂可导致抗癌治疗，但也会引起由于抗癌剂的各种副作用。
还证实了，在注射根据比较例3制备的含抗癌剂的水凝胶(HA-Dox)的情况下，该抗癌剂仅在肿瘤的早期存在并且被迅速分布到其他器官，因此没有作为药物载体的功效。
相比之下，证实了，在注射根据实施例5制备的含抗癌剂的特异性交联的水凝胶(Cx-HA-Dox)的情况下，存在于肿瘤中的抗癌剂的量和停留时间大于其他实验组的抗癌剂的量和停留时间，并且由于抗癌剂引起的对各种器官的各种副作用的发生可以被预防或降低，因此，实施例5的水凝胶预期可作为有效的药物载体使用。
实验实施例11.制备包含糖尿病治疗剂的水凝胶
通过将链脲佐菌素(40mg/kg)溶解在柠檬酸盐缓冲液(pH4.5)中并经由尾巴注射所得缓冲液来产生糖尿病模型，在注射后第2天，确认血糖水平为380至420。通过皮下注射施用根据实施例6和比较例4制备的包含糖尿病治疗剂的水凝胶，并在早晨(约10a.m.)收集血液18天，并使用Accu-Chek Advantage仪表测量血糖水平。
结果，如图14所示，证实了，在根据实施例6制备的包含糖尿病治疗剂的特异性交联的水凝胶(Insulin-Cx-HA)的情况下，与根据比较例4制备的含胰岛素的水凝胶(胰岛素-HA)相比，血糖水平被稳定地维持，因此实施例6的水凝胶预期可作为有效的药物载体使用。

Claims (18)

1.一种注射用组合物，包括：
包含其中引入有第一点击化学官能团的的第一生物聚合物的第一液体，和
包含其中引入有第二点击化学官能团的第二生物聚合物的第二液体，
其中，所述第一点击化学官能团和所述第二点击化学官能团是可化学连接的。
2.根据权利要求1所述的注射用组合物，其中，所述第一点击化学官能团包含选自炔基、环氧基、丙烯酰基和四嗪基中的一种或多种，所述第二点击化学官能团包含选自叠氮基、巯基、氨基和环辛烯基的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的注射用组合物，其中，所述第一点击化学官能团和所述第二点击化学官能团的组合包含选自炔基和叠氮基；炔基和巯基；环氧基和氨基；环氧基和巯基；丙烯酰基和氨基；丙烯酰基和巯基；和四嗪和环辛烯的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的注射用组合物，其中，所述第一生物聚合物和所述第二生物聚合物彼此相同或不同，并且各自独立地包括选自透明质酸、小肠粘膜下组织、羧甲基纤维素、藻朊酸盐、壳聚糖、普朗尼克、聚丙烯酰胺、聚(N-异丙基丙烯酰胺)和β-甘油磷酸酯的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的注射用组合物，其中，所述第一液体和所述第二液体中另外包含药物。
6.根据权利要求5所述的注射用组合物，其中，所述药物包含抗癌剂，所述抗癌剂包含选自阿霉素、顺铂、紫杉醇、长春新碱、拓扑替康、多西他赛、5-氟尿嘧啶(5-FU)、格列卫、卡铂、道诺霉素、戊柔比星、氟他胺和吉西他滨的一种或多种；或包含胰岛素或促胰岛素肽的糖尿病治疗剂。
7.根据权利要求1所述的注射用组合物，其中，相对于1摩尔的所述第一生物聚合物引入的第一点击化学官能团的数量的范围或相对于1摩尔的所述第二生物聚合物引入的第二点击化学官能团的数量的范围为100至2,000。
8.一种制备注射用水凝胶的方法，所述方法包括：
(a)通过向第一生物聚合物中添加包含第一点击化学官能团的材料制备第一液体；
(b)通过向第二生物聚合物中添加包含第二点击化学官能团的材料制备第二液体；以及
(c)使所述第一液体和所述第二液体反应以化学连接所述第一点击化学官能团与所述第二点击化学官能团。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，在过程(a)中，所述包含第一点击化学官能团的材料包括选自以下的一种或多种：氨基-PEG4-炔、炔-PEG5-酸、炔-PEG-胺、环氧乙胺、2-环氧乙基乙胺、丙烯酰胺、丙烯酸、丙烯酰氯、甲基四嗪-胺、甲基四嗪-PEG4-胺、甲基四嗪-丙胺、四嗪-PEG5-NHS酯、甲基四嗪-PEG4-NHS酯、甲基四嗪-磺酸基-NHS酯、甲基四嗪-PEG4-酸、甲基四嗪-PEG12-NHS酯、甲基四嗪-NHS酯、甲基四嗪酸和四嗪酸，以及在过程(b)中，所述包含第二点击化学官能团的材料包括选自以下的一种或多种：叠氮-PEG4-胺、3-氨基-1-丙硫醇、11-巯基十一烷酸、氨基-甲硫醇、巯基PEG胺、乙二胺、PEG二胺、(S)-3-氨基-2-(羟甲基)丙酸、氨基乙酸、反式环辛烯胺、反式环辛烯-NHS酯、反式环辛烯-PEG-NHS酯、和反式环辛烯-PEG4-酸。
10.根据权利要求8所述的方法，其中，在过程(a)或(b)中，进一步添加缩合剂或药物。
11.根据权利要求8所述的方法，其中，所述注射用水凝胶具有在0.1Hz至10Hz的频率范围内2.00×102Pa至2.00×103Pa的储能模量(G')，所述储能模量(G')使用流变仪进行测量。
12.根据权利要求8所述的方法，其中，所述注射用水凝胶具有在25℃3.00×101Pa·s至3.0×102Pa·s的复数粘度。
13.根据权利要求8所述的方法，其中，所述注射用水凝胶为多孔形式。
14.根据权利要求8所述的方法，其中，所述注射用水凝胶相对于水的溶胀率的范围为2,000％至10,000％。
15.一种医药填充剂或生物注射用支架，包含根据权利要求8所述的方法制备的注射用水凝胶。
16.一种药物载体，包含根据权利要求8所述的方法制备的注射用水凝胶和药物。
17.根据权利要求16所述的药物载体，其中，所述药物包含抗癌剂，所述抗癌剂包含选自以下的一种或多种：阿霉素、顺铂、紫杉醇、长春新碱、拓扑替康、多西他赛、5-氟尿嘧啶(5-FU)、格列卫、卡铂、道诺霉素、戊柔比星、氟他胺和吉西他滨；或包含胰岛素或促胰岛素肽的糖尿病治疗剂。
18.根据权利要求16所述的药物载体，其中，所述药物载体具有28天内50％至100％的累积释药率。
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