CN113366026B - 放射性同位素标记的可光交联的水凝胶及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种可光交联的水凝胶及其制备方法。水凝胶可包含放射性同位素标记的可光交联的化合物或其药学上可接受的盐，并可用作放疗组合物、放射诊断成像组合物和抗癌治疗组合物。水凝胶高度局部化并停留在需要放疗的部位，因此可以治疗诸如癌症等的疾病并对周围组织具有最小化的损伤。此外，水凝胶可以与抗癌剂组合而用作治疗癌症的药物组合物，因此可以有效地治疗癌症。本发明所述的水凝胶可以用便携式微流体系统立即、快速且方便地即时制造，从而可以实现最大的放疗效果。

Description

放射性同位素标记的可光交联的水凝胶及其制备方法
技术领域
本发明涉及放射性同位素标记的可光交联的水凝胶及其制备方法。
背景技术
癌症是迄今为止人类面临的最致命的疾病之一，尽管在早期诊断和治疗方面取得了许多进展，但癌症仍然占世界死亡人数的30％。化疗是治疗癌症的常用方法之一，但药物浓度难以控制，并具有对肿瘤部位靶向性差的限制。外照射是一种相对可控和规范的治疗方法，该方法通过一个装置在体内诱导放射来破坏肿瘤细胞，然而仍然存在诸如以下的问题：肿瘤附近正常组织的非特异性破坏、离子束路径的缺陷以及待浸润的组织需要高的放射剂量。相比之下，内照射比手术和外照射简单，并能使病人的痛苦最小化。通过静脉注射含有放射性元素(如90Y、67Cu、188Re、177Lu、131I等)的溶液，来诱导肿瘤细胞的破坏。
碘放射性同位素是一种用于内照射的治疗剂，其由于放射电离效应而在甲状腺组织中积聚，并引起癌细胞的细胞凋亡和细胞坏死。然而，注射到体内后会有一种副作用，即迅速扩散到全身并损伤不期望的器官或正常组织。为了解决这个问题，将碘标记或负载在聚合物上以增加停留时间或靶向期望部位。然而，使用生物相容性低或制造时间长的载体会降低功效和在期望部位的有效停留。两亲性聚合物聚L-乳酸(PLLA)中的用131I标记的纳米颗粒会转移到肿瘤组织中，但是由于在靶器官以外的器官中检测到放射，因此难以进行局部递送。此外，其中含有抗癌药物阿霉素的131I-标记的壳聚糖微水凝胶会局部停留在注射部位，但制备微水凝胶的过程复杂，难以将其应用于临床。
发明内容
技术问题
为了解决上述问题，本发明提供了一种可光交联的化合物或其药学上可接受的盐。
本发明提供了一种包含所述化合物或其盐的用于放疗的可光交联的水凝胶及其制备方法。
此外，本发明提供了一种包含所述水凝胶的用于放疗、放射诊断成像或抗癌治疗的药物组合物。
技术手段
化合物或其药学上可接受的盐可由以下化学式1表示：
[化学式1]
Figure BDA0003186363980000021
在化学式1中，X可选自于由可光交联的丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯和乙烯酯组成的组，且Y可为OH或以下化学式2：
[化学式2]
Figure BDA0003186363980000022
在化学式1和化学式2中，R1和R2可各自相同或不同，并且可选自于由以下组成的组：氢；以及能够进行一种或多种放射性同位素标记的咪唑、吡咯、呋喃、噻吩、吲哚和3,4-二羟基苯基，m1和m2可以是0至2的整数，以及n可以是20至4,000。
本发明所述的化合物或其药学上可接受的盐可用放射性同位素标记。
本发明所述的用于放疗的可光交联的水凝胶可包含所述化合物或其药学上可接受的盐作为活性成分。
本发明所述的用于放疗的药物组合物可包含水凝胶作为活性成分。
本发明所述的用于放射诊断成像的组合物可包含水凝胶作为活性成分。
本发明所述的用于抗癌治疗的药物组合物可包含水凝胶和抗癌剂。
制备用于放疗的可光交联的微水凝胶的方法可包括：制备可光交联的化合物；将制备的可光交联的化合物溶解在光引发剂溶液中，然后将其注入微流体装置的入口；将含有表面活性剂的油注入微流体装置的出口；通过离心形成微滴；并对微滴进行提取、光交联和洗涤，以形成微凝胶。
有益效果
本发明所述的水凝胶是一种微尺寸的水凝胶，其中透明质酸被赋予了光交联特性并标记有放射性核素，并且其在需要放射治疗的局部区域中的停留是优异的，因此，可在使对周围组织的损伤最小化的同时进行治疗。因此，水凝胶可用作用于放疗的药物组合物或用于放射诊断成像的组合物。此外，它可以与抗癌剂组合使用并用作用于抗癌治疗的药物组合物，从而可以有效地治疗癌症。
本发明所述的水凝胶使用在生物降解性和生物相容性方面优异的透明质酸，并且几乎没有免疫排斥，因此它可以用作安全的治疗组合物。
本发明所述的水凝胶可以使用便携式微流体系统立即且方便地即时制造，从而使放射治疗效果最大化。
附图说明
图1示出了显示根据本发明实施例的131I-标记的可光交联的甲基丙烯酸化透明质酸(HAMA)的合成过程的示意图。
图2示出了根据本发明实施例的基于透明质酸的缀合物的1H NMR光谱和化学结构。
图3示出了根据本发明实施例的在微凝胶的制造过程中形成微滴的示意图。
图4示出了根据本发明实施例的根据微凝胶形成溶液的HAMA浓度测量粘度变化的结果。
图5示出了根据本发明实施例的根据离心机每分钟转数(RPM)的HAMA微滴的大小。
图6示出了根据本发明实施例的131I-HAMA微凝胶的即时制备过程。
图7是对根据本发明实施例制备的131I-HAMA微凝胶中的放射强度进行量化的结果。
图8示出了与根据本发明实验实施例制备的荧光物质结合的HAMA。
图9示出了根据本发明实验实施例制备的微凝胶的形状。
图10示出了将根据本发明实验实施例的FITC-HAMA微凝胶注射到大鼠中的部位。
图11示出了图10所述的实验的结果。
图12示出了根据本发明实验实施例的大鼠的SPECT图像。
图13示出了根据本发明实验实施例的131I的流动。
图14示出了根据本发明实验实施例的测量131I溶液转移到其它组织的结果。
图15示出了根据本发明实验实施例的测量131I-HAMA微凝胶溶液转移到其它组织的结果。
图16示出了显示根据本发明实施例的微凝胶的应用实例的示意图。
图17示出了根据本发明实施例的HAMA的制备过程。
图18示出了根据图17制备的HAMA的1H NMR光谱。
图19示出了显示根据本发明实验实施例的水凝胶的机械性能的图。
图20示出了根据本发明制备实施例生成的HAMA和HAMA-N-吲哚的UV/vis光谱。
图21示出了根据本发明制备实施例生成的HAMA-N-吲哚和HAMA-N-碘吲哚的1HNMR光谱。
具体实施方式
在下文中，将详细描述本发明。
本发明人通过向生物降解性和生物相容性优异的透明质酸赋予光交联性质，使用便携式微流体系统即时制备了微尺寸水凝胶，并且进行放射性核素131I标记并在体内注射，确认其不扩散到其它组织并且局部停留在注射部位，从而完成本发明。
如本文所使用的，“放射(radiation)”是指能量通过空间或材料(所述空间或材料对传播进行介导)进行传播的现象，并且能量可以由各种放射性核素发射。
如本文所使用的，“放疗(radiotherapy)”是指通过使用高能辐射使细胞增殖和存活所必需的核酸、细胞膜等发生化学变性的作用来杀死癌细胞等的治疗。
如本文所使用的，“放射能力(radioactivity)”是指放射强度。
如本文所使用的，“微水凝胶”是指可使用注射器注射的、在几微米至几百微米(μm)的水平下溶胀而不溶于水的交联颗粒，并且其通常指可溶胀的球形或板状凝胶颗粒，并且可用术语如“微凝胶(microgel)”来表示。
如本文所使用的，“HAMA”是指键合有甲基丙烯酸酯基团的透明质酸，并且可以用术语如透明质酸甲基丙烯酸酯(hyaluronate methacrylate)、甲基丙烯酸化透明质酸(methacrylated hyaluronic acid)等来表示。
如本文所使用的，“HAMA-A”是指各种环状化合物A缀合至键合有甲基丙烯酸酯基团的透明质酸(HAMA)的物质。
如本文所使用的，“HAMA-A-B”是指放射性同位素(B)标记在缀合至HAMA的环状化合物A上的物质。
本发明提供了由以下化学式1表示的化合物或其药学上可接受的盐。
所述化合物或其药学上可接受的盐可由以下化学式1表示：
[化学式1]
Figure BDA0003186363980000061
在化学式1中，X可选自于由可光交联的丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯和乙烯酯组成的组，以及Y可为OH或以下化学式2：
[化学式2]
Figure BDA0003186363980000062
在化学式1和化学式2中，R1和R2可各自相同或不同，并且可选自于由以下组成的组：氢；以及能够进行一种或多种放射性同位素标记的咪唑、吡咯、呋喃、噻吩、吲哚和3,4-二羟基苯基，m1和m2可以是0至2的整数，以及n可以是20至4,000(数均分子量为10,000至2,000,000)、优选100至400(数均分子量为50,000至200,000)。
更具体地，Y可以与选自于由N-(3-氨基丙基)-咪唑(API)、3-(1H-吡咯-1-基)-1-丙胺、1-(3-呋喃基)甲胺、噻吩基甲胺、色胺、3,4-二羟基苯丙氨酸(DOPA)以及它们的衍生物组成的组中的任一种结合。
因此，化合物可包含透明质酸甲基丙烯酸酯(以下，HAMA)-API、HAMA-DOPA、HAMA-吡咯、HAMA-呋喃、HAMA-噻吩、HAMA-吲哚以及它们的衍生物。
本发明所述的药学上可接受的盐可包括药学上可接受的碱性盐或酸性盐。
碱性盐可以以有机碱盐或无机碱盐的形式使用，并且可以选自于由钠盐、钾盐、钙盐、锂盐、镁盐、铯盐、铵盐(aminium salt/ammonium salt)、三乙胺盐和吡啶盐组成的组，但不限于此。
作为酸性盐，由游离酸形成的酸加成盐是有用的。无机酸和有机酸可用作游离酸，盐酸、溴酸、硫酸、亚硫酸、磷酸、双磷酸、硝酸等可用作无机酸，并且柠檬酸、乙酸、马来酸、苹果酸、富马酸、葡萄糖酸、甲磺酸、苯磺酸、樟脑磺酸、草酸、丙二酸、戊二酸、乙酸、乙醇酸、琥珀酸、酒石酸、4-甲苯磺酸、半乳糖醛酸、扑酸、谷氨酸、柠檬酸、天冬氨酸、硬脂酸等可用作有机酸。优选地，盐酸可用作无机酸，甲磺酸可用作有机酸。
此外，本发明所述的化合物可包括可通过常规方法制备的所有盐、水合物和溶剂化物、以及药学上可接受的盐。例如，它可以通过常规方法制备，并且加成盐可以通过将化合物溶解在可与水混溶的有机溶剂(如丙酮、甲醇、乙醇或乙腈)中并添加过量的无机碱的碱水溶液或有机碱然后沉淀或结晶来制备。或者，可以通过蒸发溶剂或过量的碱并干燥以获得加成盐，或者通过将沉淀的盐抽吸过滤来制备。
在本发明所述的化合物或盐中，放射性同位素可以包括卤化放射性同位素，并且可以为选自于由131I、125I、124I、123I、18F、19F、177Lu和211At组成的组中的至少一种，优选地，可以是131I，但不限于此。
本发明提供了一种化合物或其药学上可接受的盐，其中，放射性同位素标记在由化学式1表示的化合物或其药学上可接受的盐上。
放射性同位素可以包括卤化放射性同位素，并且可以为选自于由131I、125I、124I、123I、18F、19F、177Lu和211At组成的组中的至少一种，并且优选131I，但不限于此。
放射性同位素可标记在包含在化合物中的选自于由咪唑、吡咯、呋喃、噻吩、吲哚和3,4-二羟基苯基组成的组中的至少一种环状化合物上，更具体地，可标记在选自于由N-(3-氨基丙基)-咪唑(API)、3-(1H-吡咯-1-基)-1-丙胺、1-(3-呋喃基)甲胺、噻吩基甲胺、色胺、DOPA(3,4-二羟基苯丙氨酸)以及它们的衍生物组成的组中的环状化合物上，以形成HAMA-API-I、HAMA-DOPA-I、HAMA-吡咯-I、HAMA-呋喃-I、HAMA-噻吩-I、HAMA-N-碘吲哚以及它们的衍生物。下文将根据以下制备实施例描述更多细节。
本发明提供了一种用于放疗的可光交联的水凝胶。
本发明所述的用于放疗的可光交联的水凝胶可包含化合物或其药学上可接受的盐作为活性成分，所述化合物或其药学上可接受的盐用放射性同位素标记，具体而言，选自于由131I、125I、124I、123I、18F、19F、177Lu和211At组成的组的至少一种存在于由化学式1表示的化合物或其药学上可接受的盐上。
水凝胶是由亲水性聚合物组成的高度水化材料，所述亲水性聚合物在交联过程中形成有组织的三维网络，从而形成柔软且多孔的结构。
水凝胶可具有微米(μm)单位的平均粒径，具体而言，可为平均粒径为10μm至200μm、优选50μm至100μm的微凝胶。根据本发明的实验实施例，可将微凝胶注入人体以进行放射治疗。
本发明提供了一种用于放疗的药物组合物。
本发明所述的用于放疗的药物组合物可包含可光交联的水凝胶作为活性成分。
在本发明中，可以包括但不限于“治疗(treatment/therapy)”，只要它是改善或有益于疾病或诸如癌症的疾病的任何动作。
在本发明所述的药物组合物中，待进行放射治疗的疾病类型不受特别限制，但例如可以选自于由甲状腺癌、乳腺癌、胆道癌、胆囊癌、胰腺癌、结肠癌、子宫癌、食管癌、胃癌、脑癌、直肠癌、肺癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、前列腺癌、子宫癌、头颈癌、皮肤癌、血癌和肝癌组成的组的一种或多种癌症，并且优选乳腺癌、子宫癌、前列腺癌或皮肤癌。
可通过肠胃外给药来给予本发明的药物组合物，所述肠胃外给药包括皮下、皮内、静脉内、肌肉内、关节内、滑膜内、胸骨内、囊内、病灶内和颅内注射或输注技术，优选地，可作为注射制剂给予本发明的药物组合物。
用于肠胃外给药的药物组合物包括无菌水溶液或非水溶液、分散剂、混悬剂或乳剂、以及在用作无菌溶液或混悬剂之前即刻制备的无菌粉末。合适的无菌水溶液和非水性载体、稀释剂、溶剂或赋形剂的实例包括水、盐水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)以及它们的混合物、植物油(例如橄榄油)、可注射有机酯(例如油酸乙酯)。例如，在分散剂和悬浮剂的情况下，使用诸如卵磷脂的涂层材料来保持适当的特定尺寸，并且可以使用表面活性剂来保持适当的流动性。
此外，肠胃外组合物可包含佐剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可注射制剂的灭菌可通过例如经过无菌过滤器过滤来进行，或通过在混合之前、在制造时或在即将给药之前对混合物的组分进行预灭菌来进行(如在双容器注射器包装的情况下)。
本发明所述的药物组合物可单独注射在实体癌周围用于治疗疾病，或可用于治疗术后残留或分散的癌症。此外，它还可与激素治疗、药物治疗和使用生物反应调节剂的方法组合使用。
本发明提供了一种用于放射诊断成像的组合物。
本发明所述的用于放射诊断成像的组合物可包含可光交联的水凝胶作为活性成分。放射诊断图像是指通过辐射穿过或注射到受试者中而产生的、用于诊断疾病或者紊乱的放射图像数据。通过图像数据，可以识别疾病的存在或不存在、癌症的大小和位置。
此外，本发明提供了一种用于抗癌治疗的药物组合物。
本发明所述的用于抗癌治疗的药物组合物可包含可光交联的水凝胶和抗癌剂。抗癌剂可以是选自于由紫杉烷或其衍生物(例如多西他赛(docetaxel)、卡巴他赛(cabazitaxel)、紫杉醇)以及除此之外的长春花碱、长春新碱、顺铂、放线菌素-D、5-氟脲嘧啶、环磷酰胺、丙卡巴肼、利妥昔单抗、伊马替尼、吉非替尼、埃罗替尼、它们的药学上可接受的盐以及水合物组成的组的一种或多种，但不限于此。
通过将水凝胶的放射性同位素与用于抗癌治疗的抗癌剂组合使用，可以更有效地进行治疗。
本发明提供了一种制备用于放疗的可光交联的微水凝胶的方法。本发明所述的制备用于放疗的可光交联的微水凝胶的方法包括：制备可光交联的化合物(例如上述化合物)；将可光交联的化合物溶解在光引发剂溶液中，然后将其注入微流体装置的入口；将含有表面活性剂的油注入微流体装置的出口；通过离心形成微滴；对微滴进行提取、光交联和洗涤，以形成微凝胶。
在本发明所述的制备方法中，制备可光交联的化合物的步骤包括：使选自于由透明质酸、其盐及其组合组成的组的可生物降解的聚合物与甲基丙烯酸酯反应；缀合选自于由咪唑、吡咯、呋喃、噻吩、吲哚和3,4-二羟基苯基组成的组的一种或多种化合物，所述化合物能够在反应的反应物中进行一种或多种放射性同位素标记；在缀合的化合物上标记放射性同位素。
透明质酸(HA)是一种线性多糖，存在于软组织的细胞外基质中，并且是一种具有良好的生物相容性和生物降解性的生物聚合物。“生物降解性”是指当暴露于pH值为6至8的生理溶液时可降解的性质，并且优选地，是指可被包括人类在内的哺乳动物活体中的体液或微生物降解的性质。
透明质酸的盐可包括：无机盐，例如透明质酸钠、透明质酸钾、透明质酸钙、透明质酸镁、透明质酸锌、透明质酸钴；以及有机盐，例如透明质酸四丁基铵，但不限于此。在本发明中，透明质酸本身或其盐可单独使用，或者两种或多种类型的透明质酸及其盐可组合使用。
除透明质酸外，可生物降解的聚合物作为组成元素可包括：合成聚合物，例如聚(乙二醇)和聚(乙烯醇)；多糖或碳水化合物，例如硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、壳聚糖和海藻酸盐；天然蛋白质，例如明胶、胶原蛋白、白蛋白等。
甲基丙烯酸酯是一种光交联剂，与透明质酸反应得到可光交联的水凝胶。“光交联剂”是指能够通过光辐照形成自由基而在反应体系中诱导自由基反应的化合物，通常用作光交联剂或光引发剂的化合物可以用作本发明的光交联剂，但更优选使用在体内无毒或低毒的光交联剂或光引发剂。
与化学交联技术相比，光交联技术能够对前体溶液进行即时交联，并且对交联密度提供了更好的时空控制。使用紫外光或可见光的光交联方法可以产生具有宽范围机械性能和降解性的水凝胶。
聚合物和甲基丙烯酸酯的反应步骤可通过以下来进行：将甲基丙烯酸酯在30分钟至2小时、优选1小时至1小时30分钟内逐滴添加至冷却到0℃至10℃、优选3℃至7℃的可生物降解的聚合物溶液中，并在pH7至11、优选pH8至10的范围内保持20小时至30小时，从而可形成甲基丙烯酸化透明质酸(以下，HAMA)。根据上述步骤的方法形成的HAMA可具有100％或更高的甲基丙烯酸化程度(DM)(即高取代度的甲基丙烯酸酯基团)，并且甲基丙烯酸化程度越高，机械性能和强度越好。机械性能得到改进的HAMA可以在活体内缓慢降解，以便在适当的时间内进行放射治疗。
接着，在缀合步骤中，可缀合能够在形成的HAMA上进行一个或多个放射性同位素标记的化合物，所述化合物选自于由咪唑、吡咯、呋喃、噻吩、吲哚和3,4-二羟基苯基组成的组。更具体地，可缀合选自于由N-(3-氨基丙基)-咪唑(API)、3-(1H-吡咯-1-基)-1-丙胺、1-(3-呋喃基)甲胺、噻吩基甲胺、色胺、DOPA(3,4-二羟基苯丙氨酸)以及它们的衍生物组成的组的环状化合物。
在放射性同位素标记步骤中，缀合的化合物可以用放射性同位素标记以形成可光交联的化合物，所述放射性同位素例如选自于由131I、125I、124I、123I、18F、19F、177Lu和211At组成的组中的至少一种。
在本发明所述的制备方法中，可以以光引发剂溶液的1wt％至20wt％包含可光交联的化合物，并且离心可在1000RPM至2000RPM、优选1400RPM至1600RPM下进行。因此，可以制备适当量的用于放射治疗的微水凝胶。
在本发明所述的制备方法中，微凝胶可以作为凝胶型注射制剂制备，并且可以注射到体内并在注射部位停留1周至3周。此外，根据制备方法，可通过在10分钟～60分钟内、优选在10分钟～30分钟内即时制备出微凝胶而立即使用，并且需要放射治疗时可适当制备和使用。
实施例
在下文中，将通过实施例更详细地描述本发明。这些实施例仅旨在更详细地说明本发明，并且对于本领域技术人员显而易见的是，根据本发明的要点，本发明的范围不受这些实施例的限制。提供本发明的实施例是为了向本领域的普通技术人员更全面地解释本发明。
<制备实施例1>
甲基丙烯酸酐、氢氧化钠、N-(3-氨基丙基)-咪唑(API)、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、氯胺T、焦亚硫酸钠、碘化钠、二甲基亚砜(DMSO)、乙醛、环己基异腈、荧光素-胺购自Sigma-Aldrich(St.Louis MO，USA)。聚二甲基硅氧烷(PDMS，Sylgard 184)购自Dow Corning。Pico-surfTM 2wt％(NovecTM 7500)购自Sphere Fluidics(Cambridge，UK)。Novec 7500油购自3M(St Paul，MN)。分子量为90KDa的透明质酸(HA)购自Bioland(SK，韩国)。
<实施例1>131I-标记的甲基丙烯酸化透明质酸(HAMA)的制备
图1示出了显示根据本发明实施例的131I-标记的可光交联的甲基丙烯酸化透明质酸(HAMA)的合成过程的示意图。
参考图1，通过透明质酸(HA)的伯羟基的酯化反应制备甲基丙烯酸化透明质酸(以下，HAMA)。在25℃下将240mg透明质酸溶于50mL去离子水中。在4℃下使用1M NaOH将该溶液制备至pH9，然后添加420mg甲基丙烯酸酐，随后搅拌24小时。将最终化合物在去离子水中透析96小时，每8小时进行水交换。将透析产物冷冻干燥以获得HAMA。
通过HAMA的羧基和N-(3-氨基丙基)-咪唑(以下，API)的胺基的酰胺化反应将API与透明质酸缀合，来制备HAMA-API。在25℃下将240mg HAMA溶于40mL PBS(磷酸盐缓冲盐水，pH7.4)中4小时。添加230mg、1.2mmol 1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺(以下，EDC)和276mg、2.4mmol的N-羟基琥珀酰亚胺(以下，NHS)，搅拌30分钟以活化羧基。将溶于10mL PBS中的API(150mg，1.2mmol)逐滴添加到该化合物中，反应进行12小时。将最终化合物在PBS中透析，冷冻干燥以得获得HAMA-API。
采用氯胺T法进行HAMA-API的咪唑环中的碘取代。向2mL离心管中添加24mg HAMA-API，溶于500μL PBS中，添加100μL NaI(Na131I)，静置10分钟。添加溶解在PBS中的10μL(5mg/mL)氯胺T溶液并旋转10分钟。为终止反应，添加溶解在PBS中的10μL(10mg/mL)亚硫酸氢钠溶液。为了除去残余物，向反应物中添加1mL乙醇并以5000RPM离心20分钟。去除上清液后，得到碘标记的HAMA。
通过1H-NMR(600MHz Agilent NMR系统，Palo Alto,USA)分析基于透明质酸的缀合物的化学性质。
图2示出了根据本发明实施例的基于透明质酸的缀合物的1H NMR光谱和化学结构。参考图2，分别在5.5ppm-6.5ppm和7.0ppm-8.5ppm的范围内清楚地观察到甲基丙烯酸酯基团和API基团。此外，经过分析，由于碘的取代，碘化的I-HAMA降低了咪唑环碳5的强度。
<实施例2>可光交联的HAMA微凝胶的制备
为了使同位素标记的聚合物的放射能力的降低最小化，必须即时快速制备微凝胶。为此，通过便携式离心微流体系统，采用131I-标记的可光交联的透明质酸将HAMA微凝胶制备为油包水(W/O)乳液。
图3示出了根据本发明实施例的在微凝胶制造过程中形成微滴的示意图。
参考图3，首先，将控制量的HAMA溶于200μL 1wt％irgacure 2959(光引发剂水溶液)溶液中，然后注入微流体装置的入口。将50μL novec油(其中溶解了2wt％的pico-surf)注入该装置的出口。将装有该溶液的装置连接到便携式离心机(Micro-12，Hanil，韩国)上，出口朝向中心，并将RPM调节3分钟以形成微滴。液滴是由施用在出口方向的离心力和出口内喷嘴的毛细现象形成的。
在用移液管将出口中形成的微凝胶提取出来之后，将其转移到微管中，并且通过UV灯(350nm-500nm，OhmiCure S1500，Exclitas，USA)完成HAMA的交联以形成微滴。为了去除交联的微凝胶中的油，将其引入微型细胞过滤器(孔径：40μm，Bio-Rev，日本)，并在1000RPM下用乙醇重复离心3分钟，以洗掉油和光交联剂。随后，将洗涤后的HAMA微凝胶分散在PBS中。
图4示出了根据本发明实施例的根据微凝胶形成溶液的HAMA浓度测量粘度变化的结果。参考图4，随着HAMA溶液浓度的增加，微凝胶形成溶液的粘度也增加，并且测量相应粘度为从7cP至135cP。
图5示出了根据本发明实施例的根据离心机每分钟转数(RPM)的HAMA微滴的大小。参考图5，根据HAMA溶液的浓度和RPM，HAMA微滴的大小为70μm-90μm，表明HAMA微滴的大小没有明显变化，并且生成的液滴的大小与RPM无关。然而，当在相同浓度下改变RPM时，生成的HAMA微滴的数量会发生差异。因此，为了即时制备所需量的HAMA微凝胶，认为在1500RPM条件下施用3wt％至6wt％的HAMA是合适的。
<实施例3>即时制备131I-HAMA微凝胶
图6示出了根据本发明实施例的131I-HAMA微凝胶的即时制备过程。参考图6，根据实施例2的制备微凝胶的方法，通过将131I-标记的HAMA粉末分散在PBS溶液中花费15分钟来制备131I-HAMA微凝胶，并且其优点是能够即时制备放射性同位素标记的微水凝胶。
<实验实施例1>体外131I释放实验
在室温下将细胞过滤器(孔径：70μL，SPL)置于6孔中，并将0.3mCi131I-HAMA微凝胶浇注在细胞过滤器上。在填充有131I-HAMA微凝胶的孔中填充5mL的PBS(pH7.4)，并通过CRC015R剂量校准器(Capintec Inc.，Ramsey，USA)测量留在细胞过滤器中的131I-HAMA微凝胶的随时间的放射强度。
图7是对根据本发明实施例制备的131I-HAMA微凝胶中的放射强度进行量化的结果。
参考图7，示出了留在131I-HAMA微凝胶中的131I随时间的强度，并且观察到由于131I-HAMA微凝胶中131I-HAMA(其在第一小时内未标记或不能参与交联反应)的释放，放射强度降低了35％，但此后，其显示出与理论放射性衰减相似的下降趋势，131I的半衰期(＝8.02天)。插图的比例尺表示20μm。
即，所制备的具有约100μm大小的放射性微凝胶可以容易地通过注射器注射到期望部位，并且可以实现定量放疗。此外，由于微凝胶的分解和溶解速率可根据交联程度而变化，因此可在期望时间段内进行放射治疗，从而使剂量最小化并使对局部区域的放射治疗最大化，可预期地将组织损伤最小化。
<实验实施例2>可光交联的HAMA微凝胶的体内生物降解性实验
雄性大鼠(12-13周龄)购自SamTacho(Osan，大韩民国)。所有大鼠都在釜山国立大学动物资源中心(Animal Resources Center at Pusan National University)(Busan，韩国)进行管理。
为了评价HAMA微凝胶的体内稳定性，制备了与荧光物质结合的HAMA。在25℃下将200mg HAMA溶于160mL DI水和70mL二甲基亚砜(DMSO)中。向混合物中添加100μL荧光素-胺、乙醛和环己基异腈，并进行酰胺化反应24小时。
图8示出了与根据本发明实验实施例制备的荧光物质结合的HAMA。
参考图8，通过与荧光素-胺的酰胺化反应使HAMA的羧基缀合。最终混合物在100mMNaCl溶液中透析48小时，冷冻干燥，然后通过微流体系统制备异硫氰酸荧光素(以下，FITC)-缀合的HAMA微凝胶。
图9示出了根据本发明实验实施例制备的微凝胶的形状。
参考图9，通过荧光显微镜可以确认稳定缀合的FITC-HAMA微凝胶的形状。
图10示出了将根据本发明实验实施例的FITC-HAMA微凝胶注射到大鼠中的部位。参考图10，将0.2mL分散在PBS(pH7.4)中的溶液注射到具有活跃运动的大鼠的股间肌中以评估FITC-HAMA的生物分布。
图11示出了图10所述的实验的结果。
参考图11，注射FITC-HAMA微凝胶1小时、168小时后，切除大鼠的股间肌，并通过荧光显微镜(Eclipse TS100，Nikon，日本)分析切割至0.1cm厚度的组织。将FITC-HAMA微凝胶稳定地注射到大鼠股间肌中，并观察到其在注射部位以包埋在肌肉组织中的形式存在，未观察到由于聚合物降解或停留导致的组织炎症。
<实验实施例3>131I-HAMA微凝胶的体内局部停留实验
进行实验以确认131I的分布以及131I-HAMA微凝胶在注射到体内的部位保留多久。在将分散在PBS中的0.2mL Na131I和131I-HAMA微凝胶(1mCi/mL)的溶液注射到大鼠的股间肌中后，采用SPECT成像系统(Infinia Hawkeye 4，GE Healthcare，USA)随时间获得γ图像。在注射后即刻30分钟内，以动态模式用计数器测量每秒注射部位的放射能力。30分钟后，以静态模式获得注射有131I的整个大鼠随时间的图像，并测量主要组织(如注射部位、甲状腺和胃)的γ射线计数(gamma counter)。
图12示出了根据本发明实验实施例的大鼠的SPECT图像。
参照图12，a为注射Na131I溶液，b为注射131I-HAMA微凝胶溶液；将放射能力为200μCi的131I溶液注射至大鼠肌肉内，其在30分钟内流入全身，注射有131I-HAMA微凝胶溶液的大鼠即使在168h后仍可确认在注射部位有局部停留(T：甲状腺，S：胃，B：膀胱)。
图13示出了根据本发明实验实施例的131I的流动。
参考图13，通过动态成像分析131I在注射部位的流动，发现131I溶液在体内的扩散速度比131I-HAMA微凝胶更快。
图14示出了根据本发明实验实施例的测量131I溶液转移到其它组织的结果，图15示出了根据本发明实验实施例的测量131I-HAMA微凝胶溶液转移到其它组织的结果。参考图14和图15，除注射部位外，还在甲状腺、胃和膀胱中测出了131I溶液，但在其它部位几乎没有发现131I-HAMA微凝胶溶液。此外，131I溶液中放射强度迅速降低，但在131I-HAMA微凝胶溶液中，放射强度随着水凝胶的分解逐渐地降低。
图16示出了显示根据本发明实施例的微凝胶的应用实例的示意图。参考图16，用131I-标记的可光交联的透明质酸(HA)制备的放射性微凝胶可限制在注射部位，并且注射后放射性核素到目标部位的停留时间由于附着到肌肉组织而增加，但是可使体液的快速吸收最小化。这些技术的应用可以改善定期向患者注射的现有放射性核素的放疗，同时也保留了作为低毒性新型可注射放射性核素制剂递送剂的潜力。
<实施例4>具有改进的甲基丙烯酸酯取代的透明质酸的制备
将约1.0g透明质酸(HA，Mw：90kDa；SNvia，韩国)溶解在12mL蒸馏水中，并使用1N氢氧化钠将pH调节至8。在将透明质酸溶液冷却到5℃后，在1小时内将1倍或4倍当量的甲基丙烯酸酐(MA)滴加到二糖单元的透明质酸中。同时，加入1N氢氧化钠，以使pH保持在8.0至10.0之间。将温度和pH再维持23小时后，将大分子单体溶液用蒸馏水透析3天(Cellu Sep，标称分子量截止值3500Da)，在-55℃下冷冻，冷冻干燥，并在20℃下储存，然后使用。使用Bruker 600-NMR光谱仪获得1H NMR光谱。证实了甲基丙烯酸酯基团与透明质酸的结合，其用于计算甲基丙烯酸化程度(以下，DM)(n＝3)。
图17示出了根据本发明实施例的HAMA的制备过程。
通常通过在水性碱性条件下使可光交联的甲基丙烯酸酯基团与甲基丙烯酸酐反应，将可光交联的甲基丙烯酸酯基团并入透明质酸聚合物骨架中。认为透明质酸的伯羟基是酯交换反应最活跃的部位。透明质酸每个二糖单元具有4个羟基，且所有的4个羟基都可以与甲基丙烯酸酯基团结合。
通过改变透明质酸的分子量、甲基丙烯酸酐与透明质酸的摩尔比和反应时间，可以合成具有不同DM的HAMA。还有其它一些参数决定DM，如反应混合物的pH和温度。甲基丙烯酸酐在水性介质中水解，特别是在高于pH10.0时，在氢氧根离子的催化下生成甲基丙烯酸，其与透明质酸不发生反应。认为甲基丙烯酸酐在低温下水解为甲基丙烯酸是较慢的。然而，在这个温度下，甲基丙烯酸酐存在于一个单独的相中。
参考17，考虑到生物活性和较好的溶液加工性，选择了90kDa的透明质酸。为了合成具有不同DM的HAMA，使相对于二糖单元的1倍和4倍当量的甲基丙烯酸酐与透明质酸反应。此外，为了使甲基丙烯酸酐的过量水解最小化并减少反应期间的相分离，将其在剧烈搅拌下在1小时内进行滴加。同时，在5℃下将pH保持在8.0至10.0之间24小时。
图18示出了根据图17制备的HAMA的1H NMR光谱。1H NMR实验用于确定甲基丙烯酸酯基团并入透明质酸和DM。
参考图18，1H-NMR光谱显示出对应于丙烯酸酯质子的δ5.6ppm和6.0ppm附近的新峰，表明甲基丙烯酸酯基团并入了透明质酸中。DM是根据甲基丙烯酸酯质子(5.6ppm和6.0ppm)与透明质酸中的甲基质子(1.9ppm)的相对积分计算得出的，对于每二糖单元1当量和4当量的甲基丙烯酸酐，分别为46±4％和181±36％的值。
用凝胶渗透色谱系统测定了透明质酸及其衍生物的分子量。它们显示出相似的聚合物分子量分布，表明在反应过程中没有过早交联或明显的链断裂。高于100％的甲基丙烯酸化表明，当使用4当量的甲基丙烯酸酐时，至少有一个羟基被取代。
即，根据实施例4，通过在剧烈搅拌下在1小时内缓慢加入甲基丙烯酸酐并在5℃下将pH保持在pH8.0和10.0之间24小时，使甲基丙烯酸酐的过度水解最小化，从而使用4倍过量的甲基丙烯酸酐可以获得高的DM(>100％)。
<实验实施例4>具有改进的甲基丙烯酸酯取代的HAMA水凝胶的机械性能
简明而言，将5％(w/v)、10％(w/v)和20％(w/v)不同浓度的聚合物前体溶液进行光交联，以制备宽度为5mm、长度为20mm、厚度为1.5mm的拉伸试验结构。
水凝胶在机械测试仪(AND 210，韩国)上直接分析。对于拉伸试验，将应变速率设定为1mm min-1。在水凝胶的破坏点(拉伸下断裂)测定样品的极限拉伸强度。在应力-应变曲线的最大应力点测定拉伸强度。
通过获得应变-应力曲线中斜率的初始5％来计算杨氏模量(拉伸模量)。在应力-应变曲线中应变的最大点处确定弹性。
图19示出了显示根据本发明实验实施例的水凝胶的机械性能的图。参考图19，(A)是在低DM和高DM中由不同浓度(5％、10％、20％[w/v])的HAMA溶液(n＝5)生成的HAMA水凝胶的应力-应变曲线；(B)是水凝胶的拉伸强度图；(C)是水凝胶的杨氏模量图；以及(D)是水凝胶的延伸率图(星号表示p<0.05(*)、p<0.01(**)和p<0.001(***)的统计显著性水平)。
(A)的应力-应变曲线表明，具有高DM的HAMA溶的浓度越高，曲线斜率越大。
随着HAMA溶液浓度从5％增加到20％，(B)的抗拉强度在低DM时从3.31±0.61kPa不断增加到21.22±6.48kPa，在高DM时从8.83±2.99不断增加到44.24±7.09kPa。
(C)的杨氏模量也随着更高的DM和浓度而增加。
取决于DM和浓度，(D)的延伸率在6％～17％范围内变化。
<制备实施例1>HAMA-DOPA-I
[反应流程1]
Figure BDA0003186363980000191
反应流程1示出HAMA-DOPA-I的制备过程。根据实施例4制备具有改进的甲基丙烯酸酯取代的HAMA后，将100mg HAMA溶于10mL PBS(pH7.4)溶液中。在使用1N HCl将pH调节至5.5后，以与实施例1制备HAMA-API的方法相同的方式向溶液中添加85.5mg EDC和102.7mgNHS，随后搅拌30分钟。此后，根据反应流程1添加126.9mg盐酸多巴胺以代替API，并且使用1N NaOH将反应混合物的pH调节至7，随后在25℃下搅拌24小时。反应混合物在pH5.0溶液中透析2天(Cellu Sep，标称分子量截止值3500Da)，然后用蒸馏水透析1天。将所得溶液冷冻干燥以获得产物，制备所得HAMA-DOPA溶液，随后进行131I标记。与实施例1的HAMA-API相比，由于能够进行更多的131I取代，因此预计放射治疗效果也更高。
<制备实施例2>HAMA-吡咯-I
[反应流程2]
Figure BDA0003186363980000201
反应流程2示出了HAMA-吡咯-I的制备过程。根据实施例4制备具有改进的甲基丙烯酸酯取代的HAMA后，将100mg HAMA溶于10mL PBS(pH7.4)溶液中。在使用1N HCl将pH调节至5.5后，以与实施例1制备HAMA-API的方法相同的方式向溶液中添加85.5mg EDC和102.7mg NHS，随后搅拌30分钟。此后，根据反应流程2添加110.7mg3-(1H-吡咯-1-基)-1-丙胺以代替API，并在25℃下搅拌24小时。反应混合物在pH5.0溶液中透析2天，然后用蒸馏水透析1天。将所得溶液冷冻干燥以获得产物，制备所得HAMA-吡咯溶液，随后进行131I标记。
<制备实施例3>HAMA-呋喃-I
[反应流程3]
Figure BDA0003186363980000202
反应流程3示出了HAMA-呋喃-I的制备过程。根据实施例4制备具有改进的甲基丙烯酸酯取代的HAMA后，将100mg HAMA溶于10mL PBS(pH7.4)溶液中。在使用1N HCl将pH调节至5.5后，以与实施例1制备HAMA-API的方法相同的方式向溶液中添加85.5mg EDC和102.7mg NHS，随后搅拌30分钟。此后，根据反应流程3添加119.2mg3-(氨基甲基)呋喃盐酸盐以代替API，随后在25℃下搅拌24小时。反应混合物在pH5.0溶液中透析2天，然后用蒸馏水透析1天。将所得溶液冷冻干燥以获得产物，制备所得HAMA-呋喃溶液，随后进行131I标记。
<制备实施例4>HAMA-噻吩-I
[反应流程4]
Figure BDA0003186363980000211
反应流程4示出了HAMA-噻吩-I的制备过程。根据实施例4制备具有改进的甲基丙烯酸酯取代的HAMA后，将100mg HAMA溶于10mL PBS(pH7.4)溶液中。在使用1N HCl将pH调节至5.5后，以与实施例1制备HAMA-API的方法相同的方式向溶液中添加85.5mg EDC和102.7mg NHS，随后搅拌30分钟。此后，根据反应流程4添加100.9mg 2-噻吩基甲胺以代替API，随后在25℃下搅拌24小时。反应混合物在pH5.0溶液中透析2天，然后用蒸馏水透析1天。将所得溶液冷冻干燥以获得产物，制备所得HAMA-噻吩溶液，随后进行131I标记。
<制备实施例5>HAMA-N-碘吲哚(衍生物1)
[反应流程5]
Figure BDA0003186363980000212
反应流程5示出了HAMA-N-碘吲哚的制备过程。根据实施例4制备具有改进的甲基丙烯酸酯取代的HAMA后，将100mg HAMA溶于20mL二甲基亚砜(DMSO)溶液中。然后，以与实施例1制备HAMA-API的方法相同的方式向溶液中添加115.1mg EDC和138.1mg NHS，随后搅拌2小时。此后，根据反应流程5向混合物中添加77.5mg N-乙基二异丙胺来代替API，然后添加96.1mg色胺。反应在氮气下搅拌36小时。反应混合物在DMSO溶液中透析12小时，然后用蒸馏水透析3天。将所得溶液冷冻干燥得到产物，制备所得HAMA-吲哚溶液，然后进行131I标记以制备HAMA-N-碘吲哚。
图20示出了根据本发明制备实施例生成的HAMA和HAMA-N-吲哚的UV/vis光谱，图21示出了根据本发明制备实施例生成的HAMA-N-吲哚和HAMA-N-碘吲哚的1H NMR光谱。
虽然已经参考本发明的具体实施例对本发明进行了具体描述，但是显而易见的是，该具体描述仅仅是优选实施例，并且本发明的范围并不由此对本领域技术人员构成限制。即，本发明的实际范围由所附权利要求书及其等同物来定义。

Claims (13)

1.一种用于放疗的可光交联的水凝胶，所述可光交联的水凝胶包含由化学式1表示的化合物或其药学上可接受的盐：
[化学式1]
Figure FDA0003803855710000011
在化学式1中，
X选自于由可光交联的丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯和乙烯酯组成的组，
Y为OH或化学式2：
[化学式2]
Figure FDA0003803855710000012
在化学式1和化学式2中，
R1和R2可各自相同或不同，并且选自于由以下组成的组：氢；以及能够进行一种或多种放射性同位素标记的咪唑、吡咯、呋喃、噻吩、吲哚和3,4-二羟基苯基，
并且，当Y为OH时，R2不为氢；当Y为化学式2表示的基团时，R1和R2不同时为氢，
m1和m2是1至3的整数，以及
n是20至4,000；
其中，将所述水凝胶注射到体内并在注射部位停留1周至3周。
2.如权利要求1所述的用于放疗的可光交联的水凝胶，其中，所述放射性同位素为选自于由131I、125I、124I、123I、18F、19F、177Lu和211At组成的组的至少一种。
3.如权利要求1或2所述的用于放疗的可光交联的水凝胶，其中，所述水凝胶为平均粒径为10μm至200μm的微凝胶。
4.一种用于放疗的药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1-3中任一项所述的可光交联的水凝胶作为活性成分。
5.一种用于放射诊断成像的组合物，所述组合物包含如权利要求1-3中任一项所述的可光交联的水凝胶作为活性成分。
6.一种用于抗癌治疗的药物组合物，所述药物组合物包含抗癌剂和如权利要求1-3中任一项所述的可光交联的水凝胶。
7.一种制备用于放疗的可光交联的微水凝胶的方法，所述方法包括：
制备可光交联的化合物，其中，所述化合物为选自于由化学式1表示的化合物或其药学上可接受的盐组成的组的至少一种；
将所述可光交联的化合物溶解在光引发剂溶液中，然后将其注入微流体装置的入口；
将含有表面活性剂的油注入所述微流体装置的出口；
通过离心形成微滴；以及
对所述微滴进行提取、光交联和洗涤，以形成微水凝胶；
[化学式1]
Figure FDA0003803855710000031
在化学式1中，
X选自于由可光交联的丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯和乙烯酯组成的组，
Y为OH或化学式2：
[化学式2]
Figure FDA0003803855710000032
在化学式1和化学式2中，
R1和R2可各自相同或不同，并且选自于由以下组成的组：氢；以及能够进行一种或多种放射性同位素标记的咪唑、吡咯、呋喃、噻吩、吲哚和3,4-二羟基苯基，
并且，当Y为OH时，R2不为氢；当Y为化学式2表示的基团时，R1和R2不同时为氢，
m1和m2是1至3的整数，以及
n是20至4,000。
8.如权利要求7所述的制备用于放疗的可光交联的微水凝胶的方法，其中，制备可光交联的化合物的步骤包括：
使选自于由透明质酸、其盐及其组合组成的组的可生物降解的聚合物与甲基丙烯酸酯反应；
缀合选自于由咪唑、吡咯、呋喃、噻吩、吲哚和3,4-二羟基苯基组成的组的一种或多种化合物，所述化合物能够在反应的反应物中进行一种或多种放射性同位素标记；以及
在缀合的化合物上标记放射性同位素。
9.如权利要求8所述的制备用于放疗的可光交联的微水凝胶的方法，其中，所述反应步骤包括：
在30分钟至2小时内，将所述甲基丙烯酸酯逐滴添加至冷却到0℃至10℃的所述可生物降解的聚合物溶液中，并在pH 7至11内保持20小时至30小时。
10.如权利要求7-9中任一项所述的制备用于放疗的可光交联的微水凝胶的方法，其中，以所述光引发剂溶液的1wt％至20wt％包含所述可光交联的化合物。
11.如权利要求7-9中任一项所述的制备用于放疗的可光交联的微水凝胶的方法，其中，所述微水凝胶是即时制备的，并在10分钟至60分钟内立即使用。
12.如权利要求7-9中任一项所述制备的用于放疗的可光交联的微水凝胶的方法，其中，所述微水凝胶以凝胶型注射制剂进行制备。
13.如权利要求7-9中任一项所述制备的用于放疗的可光交联的微水凝胶的方法，其中，将所述微水凝胶注射到体内并在注射部位停留1周至3周。
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