KR101104335B1 - 알카노일화된 히알루론산으로 형성된 나노입자 및 그 제조방법 - Google Patents

알카노일화된 히알루론산으로 형성된 나노입자 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 히알루론산 아세테이트가 C2-C4 알카노일화되어 양친매성화된 히알루론산 아세테이트가 약물을 봉입하면서 자가응집되어 형성된 나노입자, 그 제조방법, 및 그 나노입자를 포함하는 주사제를 제공한다.
본 발명에 따른 나노입자는 소수성 약물을 비롯한 각종 약물의 전달체로서 사용될 수 있으며, 나노입자를 구성하는 히알루론산이 독성이 없고, 생체내 분해성이 있어 생체 적합성을 가진다. 또한, 나노입자가 가지고 있는 본연의 특성인 약물의 서방성을 기대할 수 있다. 더욱이, 상기 본 발명에 따른 나노입자는 항암제의 약물 전달체로서 사용하여 수동적 암표적화에 의해 항암제의 여러 가지 부작용을 줄일 수 있을 뿐만 아니라, 히알루론산의 암세포에 대한 선택성으로 인해 암세포로의 타겟팅이 우수한 약물 전달체로서 이용될 수 있다. 또한, 나노입자를 구성하는 히알루론산은 다양한 관능기를 가지며, 이러한 관능기를 이용하여 기능성 고분자 물질을 도입하기 용이하므로 더욱 진보적인 다기능성 약물전달체를 개발하기 용이하다.

Description

알카노일화된 히알루론산으로 형성된 나노입자 및 그 제조방법{Nanoparticles formed from alkanoylated hyaluronic acid and a process for the preparation thereof}
본 발명은 새로운 나노입자 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 소수성기의 도입으로 양친매성화된 히알루론산이 자가응집되어 형성된 나노입자 및 그 제조방법에 관한 것이다.
암의 발병율은 계속해서 증가하고 있으며, 이에 따른 암 치료방법 및 약물의 개발이 끊임없이 이루어지고 있다. 현재 사용되고 있는 암 치료법은 암세포만을 외과수술로 제거하는 수술요법, 방사선 요법, 세포독성을 보이는 항암제를 이용한 화학요법 등이다. 항암제를 이용한 화학요법은 암 치료에 널리 사용되는 방법이지만, 암세포 뿐만 아니라 정상세포에까지 세포 독성을 나타내므로 부작용의 위험성이 따른다. 따라서, 항암제를 이용한 화학요법 분야에서는 항암제의 부작용은 줄이면서 암 치료 효과는 극대화시키기 위한 연구가 지속적으로 이루어지고 있다.
나노입자는 항암제를 비롯한 약물의 선택적 표적부위 전달을 위한 약물 전달체중 하나로서, 직경이 수 nm 내지 수백 nm인 입자 크기를 갖는 넓은 표면적을 가 진 콜로이드 상의 불균일 분산입자를 의미한다. 항암제가 봉입된 나노입자는 어떤 암세포 표적 잔기가 없어도 정상조직에 부작용을 미치지 않으면서 암치료를 하기 위한 암조직으로의 타겟팅이 그 자체로서 가능하다. 나노입자의 이러한 타겟팅 효과는 향상된 투과성 및 유지(Enhanced permeability and retention; EPR) 효과라 불리는 암 세포의 특이적인병리 생리학적 특징에 의해 얻어진다. 체내에서의 악성 이상형상물(neoplasm)은 정상 조직보다 빠르게 자라고, 필수적으로 많은 영양분 및 산소의 공급을 요구하게 되며, 이로 인해 암세포 주변에 새로운 혈관의 급격한 생성을 유발하게 된다. 즉, 암세포 주변이 혈관은 빨리 생성되기 때문에, 이들 신생성 혈관은 혈관으로부터 나노 입자가 빠져 나가기 충분하게 큰 유출성의 구멍을 가지게 되며, 따라서 나노입자가 암 조직에 축적되게 되는 것이다.
생체 적합성의 다당류 물질에 소수성을 부여하여 양친매성화한 다당류를 미셀화에 의해 나노입자를 형성하고, 그러한 나노입자를 약물전달체로서 사용하는 방법이 알려져 있다(C.T. Lee et al. 2007, Biomolecular Engineering. 24, 131-139). 생체 적합성 다당류는 많은 하이드록실 그룹을 갖는 다당류 물질의 경우 친수성이 있고 생체활성 잔기를 포함하기 때문에, 친수성과 세포와의 친화성을 갖는다고 보고된 바 있다(Rodrigues N.S., Santos-Magalhaes N.S., Coelho. L.C.B.B, Couvreur. P., Ponchel. G., Gref. R. 2003. J. Contr. Rel. 92, 103-112). 생체 적합성 다당류의 이러한 관능기는 특정 점막유착 및 수용체를 인식할 수 있다는 특징을 지니고 있다고 알려져 있다(Torchilin. V.P., 2000, Eur. J. Pharm. Sci. 2, s81-s91). 따라서, 생체적 적합성 다당류를 양친매성화하여 형성되는 나노입자는 나노입자 자체로서의 제제학적 특성 이외에도 생체 적합성 다당류의 생체 친화성으로 인해 우수한 약물전달체로서 이용될 수 있다.
따라서, 다양한 생체 적합성 다당류를 양친매성화 하여 제조하는 나노입자를 개발하기 위한 노력이 이루어지고 있으나, 실질적으로 임의의 생체 적합성 다당류를 단순히 소수성화 함으로써 나노입자가 용이하게 생성될 수는 없다. 그러므로, 원하는 생체 적합성 고분자를 양친매성화하여 원하는 나노입자를 제조하기 위해서는 적합한 생체 적합성 고분자의 선택 및 소수성화 잔기의 선택을 위한 부단한 연구가 필요하다.
이에 본 발명자들은 약물 전달체로서 우수한 성질을 갖는, 생체 적합성 다당류를 이용한 나노입자의 개발을 위해 예의 연구한 결과, 히알루론산을 소수성 잔기의 도입에 의해 양친매성화한 다음, 자가응집시켜 형성된 나노입자를 개발하여 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 양친매성화된 히알루론산으로 형성된 나노입자를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 양친매성화된 히알루론산으로 형성된 나노입자를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 양친매성화된 히알루론산으로 형성된 나노입자를 포함하는 주사제를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 히알루론산이 C2-C4알카노일화되어 양친매성화된 히알루론산이 약물을 봉입하면서 자가응집되어 형성된 나노입자를 제공한다.
상기 나노입자는
히알루론산 및 C2-C4알칸산 무수물을 용매 중에 용해하고 반응시켜, C2-C4알카노일화된 히알루론산 생성물을 얻는 단계;
상기 생성물과 물을 혼합하여 C2-C4알카노일화된 히알루론산을 침전시켜 수득하는 단계;
상기 수득된 C2-C4알카노일화된 히알루론산 및 약물을 용매 중에 용해한 후 투석막에 넣고 수중에서 투석함으로써 물이 투석막 내부로 유입되면서 상기 C2-C4알카노일화된 히알루론산이 약물을 봉입하면서 자가응집되어 나노입자를 형성하는 단계; 및
상기 형성된 나노입자를 동결건조하여 나노입자를 회수하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 히알루론산이 C2-C4 알카노일화되어 양친매성화된 히알루론산이 약물을 봉입하면서 자가응집되어 형성된 나노입자를 포함하는 주사제를 제공한다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명에서는 히알루론산의 하이드록실기에 C2-C4알카노일기를 친핵성 치환반응에 의해 에스테르 결합시 상기 히알루론산이 양친매성화 되어, 자가응집에 의해 약물 전달체로서 적합한 나노입자를 형성할 수 있다는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 일 측면에 있어서, 히알루론산이 C2-C4 알카노일화되어 양친매성화된 히알루론산이 약물을 봉입하면서 자가응집되어 형성된 나노입자를 제공한다.
상기 나노입자를 구성하는 히알루론산은 글리코사아미노글리칸으로 1 x 5~6 kDa 정도의 분자량을 가지며, 대부분의 인체 조직의 세포외 바탕질(extracellular matrix)과 세포 표면에서 발견된다. 히알루론산은 (β,1-4)-D-글루크론산(GlcUA)과 (β,1-3)-N-acetyl-D-글루코사민(GlcNAc)의 반복서열로 구성되어져 있으며, 하기 화학식 1의 구조를 갖는다.
Figure 112009013943968-pat00001
인체에서 히알루론산의 농도는 정상세포에 비해 암세포에서 더 높게 나타나며, 히알루론산의 수용체인 CD44는 다양한 암세포의 표면에서 다량으로 생산된다고 알려져 있다. 또한, 몇몇의 암에서 분리된 세포주(전립선 암과 폐, 자궁경부암으로부터 분리된 암 세포주 등)는 히알루론산을 분해할 수 있는 히알루로니다아제(hyaluronidase)를 생산해낸다고 한다. 이 효소는 히알루론산의 글루코사이드 결합을 가수분해하여 결국엔 이당류를 만들어내는 역할을 한다. 이와 같이, 히알루론산이 정상세포에 비해 암세포에서 분해가 용이하고 암세포 표면에 다량 존재하는 CD44로 인해 암세포에 의한 선택적 포획이 가능하게 되므로, 상기 알카노일화된 히알루론산으로 형성된 나노입자는 암세포로의 타겟팅이 우수한 약물 전달체로서 이용될 수 있다.
상기 히알루론산은 다수의 하이드록실기(-OH)를 포함하고 있으므로 이 부분의 알카노일화를 통해서 히알루론산에 양친매성을 부여할 수 있다. 양친매성을 띠는 히알루론산은 유기용매 중에 잘 용해되며 수중에서의 투석과정을 통해 나노입자가 형성할 수 있게 되는 것이다. 상기 히알루론산이 알카노일화되는 정도는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 히알루론산 1 몰당 200-600 몰의 C2-C4알칸산과 반응시킬 수 있으며, 바람직하게는 250-500 몰의 C2-C4알칸산과 반응시켜 알카노일화시킬 수 있다.
상기 히알루론산의 C2-C4 알카노일화는 당업자에게 공지되어 있는 임의의 방법에 의해 이루어질 수 있으며, 예를 들어 히알루론산과 C2-C4 알칸산 무수물과의 반응에 의해 이루어질 수 있다. 상기 C2-C4알카노일화 중에서도 아세틸화가 바람직하다.
상기 본 발명에 따른 나노입자에 봉입된 약물은 그 나노입자에 봉입될 수 있는 임의의 약물일 수 있으며, 예를 들어 소수성 약물일 수 있다. 이러한 소수성 약물은 독소루비신, 탁솔, 캄토테신, 아드리아마이신, 파클리탁셀, 시스플라틴, 미토마이신-C, 도노마이신(daunomycin) 및 5-플루오로우라실로 구성된 그룹에서 선택될 수 있다.
본 발명은 다른 측면에 있어서,
히알루론산 및 C2-C4알칸산 무수물을 용매 중에 용해하고 반응시켜, C2-C4알카노일화된 히알루론산 생성물을 얻는 단계;
상기 생성물과 물을 혼합하여 C2-C4알카노일화된 히알루론산을 침전시켜 수득하는 단계;
상기 수득된 C2-C4알카노일화된 히알루론산 및 약물을 용매 중에 용해한 후 투석막에 넣고 수중에서 투석함으로써 물이 투석막 내부로 유입되면서 상기 C2-C4알카노일화된 히알루론산이 약물을 봉입하면서 자가응집되어 나노입자를 형성하는 단계; 및
상기 형성된 나노입자를 동결건조하여 나노입자를 회수하는 단계를 포함하는, 히알루론산이 C2-C4 알카노일화되어 양친매성화된 히알루론산이 약물을 봉입하면서 자가응집되어 형성된 나노입자를 제조하는 방법을 제공한다.
이하에서는, 상기 제조방법을 단계별로 보다 상세하게 설명한다.
1) 히알루론산 및 C 2 -C 4 알칸산 무수물을 용매 중에 용해하고 반응시켜, C 2 -C 4 알카노일화된 히알루론산 생성물을 얻는 단계.
상기 C2-C4 알칸산 무수물은 바람직하게는 아세트산 무수물이며, 하기 화학식 2와 같은 구조식을 갖는다.
Figure 112009013943968-pat00002
상기 C2-C4 알칸산 무수물은 히알루론산의 -CH2OH 모이어티와의 친핵성 치환반응을 통해 히알루론산의 -CH2OH 모이어티를 -CH2OCOC1-3알킬로 변화시킴으로써 히알루론산에 소수성을 부여할 수 있다. 히알루론산과 알칸산 무수물의 반응이 종결된 후 남은 알칸산 무수물의 잔기들은 산성을 부여하게 되는데, 이러한 산성을 중화시켜 주기 위해 반응 용매 중에 피리딘 등을 부가할 수 있다.
상기 반응에서 사용되는 용매는 상기 히알루론산 및 C2-C4 알칸산 무수물이 모두 녹으면서, 히알루론산의 알카노일화를 저해하지 않는 임의의 용매가 이용될 수 있으며, 예를 들어 포름아미드, 등이 이용될 수 있다.
상기 히알루론산을 C2-C4알칸산과 반응시키는 비율은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 히알루론산 1 몰당 200-600 몰의 C2-C4알칸산과 반응시킬 수 있으며, 바람직하게는 250-500 몰의 C2-C4알칸산과 반응시킬 수 있다.
상기 반응은 실온에서 이루어질 수 있으며, 반응시간은 약 8-16 시간 동안 수행할 수 있다.
2) 상기 생성물과 물을 혼합하여 C 2 -C 4 알카노일화된 히알루론산을 침전시켜 수득하는 단계.
상기 단계 1)의 과정에서 생성된 알카노일화된 히알루론산을 분리하기 위해, 상기 알카노일화된 히알루론산 생성물을 물과 혼합함으로써 소수성이 부여된 알카노일화된 히알루론산만을 침전시킬 수 있다. 알카노일화된 히알루론산은 소수성이 부여되었기 때문에 상기 생성물을 친수성의 물에 부가하면, 알카노일화된 히알루론산만이 용해되지 않아 침전될 수 있는 것이다. 그리하여 침전된 생성물을 다른 용매, 미반응물 등으로부터 용이하게 분리해 낼 수 있으며, 바람직하게는 원심분리에 의해 상기 침전된 생성물을 용이하게 분리해 낼 수 있다.
3) 상기 수득된 C 2 -C 4 알카노일화된 히알루론산 및 약물을 용매 중에 용해한 후 투석막에 넣고 수중에서 투석함으로써 물이 투석막 내부로 유입되면서 상기 C 2 -C 4 알카노일화된 히알루론산이 약물을 봉입하면서 자가응집되어 나노입자를 형성하는 단계.
상기 단계 2)를 통해 얻어진 침전물(C2-C4알카노일화된 히알루론산) 및 약물을 용매에 녹인 후, 투석막에 넣고 수중에서 투석과정을 통해 나노입자를 제조할 수 있다. 이러한 투석과정을 통하면 투석막 안의 유기용매와 막 밖의 증류수간의 삼투압에 의하여 유기용매는 투석 막 밖으로 이동하고 증류수는 막 안으로 이동하게 된다. 이러한 과정 중 소수성이 부여된 양친매성 히알루론산이 자가응집되어 나노입자를 형성하게 되며, 이러한 나노입자 형성과정에서 나노입자의 소수성 부위 와 약물의 소수성 부위가 상호작용을 통해 결합하게 되어 약물이 나노입자의 내부에 봉입될 수 있다. 이러한 C2-C4알카노일화된 히알루론산의 나노입자 형성의 모식도를 도 1에 나타내었다.
상기 약물로서 독소루비신을 사용할 경우에는, 시중에 시판되는 독소루비신 염산염을 친수성을 제거하기 위해, 상기 나노입자 형성과정을 수행하기 전에 트리에틸아민을 가하여 염산을 제거하는 것이 바람직하다.
상기 침전물 및 약물을 용해하기 위한 용매는 약물을 봉입한 나노입자의 형성을 저해하지 않는 임의의 용매가 이용될 수 있으며, 예를 들어 디메틸술폭시드, 1,4-다이옥세인 등이 이용될 수 있다.
상기 C2-C4알카노일화된 히알루론산 및 약물을 용매 중에 용해한 혼합액을 투석막에 넣고 투석하기 위해 사용되는 외부의 물은, 상기 사용되는 약물의 특성에 따라 당업자가 적절히 선택한 완충제를 함유한 수용액으로서 이용될 수 있다. 예를 들어 독소루비신을 사용할 경우 독소루비신의 아민기의 안정성을 유지하기 위하여 pH 9 이상의 완충용액을 사용하는 것이 바람직하며, 예를 들어 붕산염 완충염 완충용액을 사용할 수 있다.
상기 투석에 사용되는 투석막은 봉입되지 않는 약물, 및 상기 침전물과 약물을 용해하기 위해 사용된 용매가 투과될 수 있는 투석막을 사용할 수 있으며, MWCO 500-1000 범위의 투석막을 사용할 수 있다. 독소루비신과 같이 소수성 항암제를 봉입한 나노입자를 제조할 경우에는 소수성 항암제의 종류에 따라 달라질 수도 있 으나, 통상적으로는 분자량 1,000 이하의 물질만 제거할 수 있는 범위의 투석막을 이용할 수 있다. 상기 투석과정에 의해, 투석막을 통해 유입된 물에 의해서 양친매성 알카노일화 히알루론산이 약물을 봉입하면서 자가응집에 의해 나노입자를 형성할 수 있다. 이러한 나노입자의 형성과 함께, 부산물로서 형성될 수 있는 불순물 및 용매가 제거될 수 있고, 봉입되지 않은 약물 및 중합되지 않은 알칸산 무수물이 제거될 수 있다.
4) 상기 형성된 나노입자를 동결건조하여 나노입자를 회수하는 단계.
상기 투석과정에 의해 생성 및 정제된 나노 입자를 동결건조시킴으로써 약물이 봉입된 순수한 나노입자만을 회수할 수 있다.
상기 본 발명에 따른 나노입자는 소수성 약물을 비롯한 각종 약물의 전달체로서 사용될 수 있으며, 나노입자를 구성하는 히알루론산이 독성이 없고, 생체내 분해성이 있어 생체 적합성을 가진다. 또한, 나노입자가 가지고 있는 본연의 특성인 약물의 서방성을 기대할 수 있다. 더욱이, 상기 본 발명에 따른 나노입자는 항암제의 약물 전달체로서 사용하여 수동적 암표적화에 의해 항암제의 여러 가지 부작용을 줄일 수 있을 뿐만 아니라, 히알루론산을 분해할 수 있는 히알루로니다아제가 정상세포에 비해 암세포에서 더 높게 나타나며, 히알루론산의 수용체인 CD44가 다양한 암세포의 표면에서 다량으로 존재하므로 암세포로의 타겟팅이 우수한 약물 전달체로서 이용될 수 있다. 이는 암세포에서 많이 분비되는 히알루로니다아제에 의해 암세포 주변에서만 히알루론산 나노입자가 분해되어 나노입자에 봉입되어 있 던 항암제가 방출되어지면서 암세포만을 선택적으로 작용하게 되거나, 히알루론산 나노입자가 암세포의 표면에서 다량으로 존재하는 CD44에 의해 선택적으로 포획되어 암세포에만 선택적으로 작용할 수 있게 되기 때문에 가능한 것이다. 이러한 본 발명에 따른 알카노일화된 히알루론산 나노입자의 암세포에 대한 타겟팅에 의해 기존의 암 세포 이외의 정상세포까지 독성을 보이던 항암제의 단점을 보완 할 수 있게 된다. 이외에도, 종래 주사제로 사용하기 위해 화학적 변형을 통한 친수성기를 부여해야 했던 독소루비신과 같은 소수성 약물을 본 발명에 따를 나노입자에 봉입함으로써 간편하게 주사제로 제제화할 수 있다. 또한, 나노입자를 구성하는 히알루론산은 다양한 관능기를 가지며, 이러한 관능기를 이용하여 기능성 고분자 물질을 도입하기 용이하므로 더욱 진보적인 다기능성 약물전달체를 개발하기 용이하다.
상기 본 발명에 따른 나노입자는 주사에 의해 생체에 투여할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또 다른 측면에 있어서, 상기 본 발명에 따른 나노입자를 포함하는 주사제를 제공한다.
이러한 주사제는 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상의 주사제 제조방법에 따라 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 주사제는 환자에게 투여 시 그대로 이용될 수 있도록 멸균 매질에 분산된 형태일 수도 있으며, 투여 시 주사용 증류수를 가해 적절한 농도로 분산시킨 다음 투여하는 형태일 수도 있다.
상기한 바와 같이, 상기 본 발명에 따른 나노입자는 소수성 약물을 비롯한 각종 약물의 전달체로서 사용될 수 있으며, 나노입자를 구성하는 히알루론산이 독 성이 없고, 생체내 분해성이 있어 생체 적합성을 가진다. 또한, 나노입자가 가지고 있는 본연의 특성인 약물의 서방성을 기대할 수 있다. 더욱이, 상기 본 발명에 따른 나노입자는 항암제의 약물 전달체로서 사용하여 수동적 암표적화에 의해 항암제의 여러 가지 부작용을 줄일 수 있을 뿐만 아니라, 히알루론산의 암세포에 대한 선택성으로 인해 암세포로의 타겟팅이 우수한 약물 전달체로서 이용될 수 있다. 또한, 나노입자를 구성하는 히알루론산은 다양한 관능기를 가지며, 이러한 관능기를 이용하여 기능성 고분자 물질을 도입하기 용이하므로 더욱 진보적인 다기능성 약물전달체를 개발하기 용이하다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 히알루론산 아세테이트의 제조
40℃의 온도를 제공해준 상태에서 분자량 5.8 kDa의 분지형 히알루론산(Bioland 사) 500 mg을 포름아미드(Kanto Chemical사) 5 ml에 녹인 후, 아세트산 무수물(Junsei사)을 첨가하기에 앞서 아세트화로 인한 산성 환경으로 변화하는 것을 막기 위해 피리딘(Junsei사)을 아세트산 무수물을 사용할 양에 비례하여 아세트산 무수물 : 피리딘 = 1 : 1.3 몰비로 넣어주었다. 피리딘을 넣어주고 30분 후, 히알루론산의 아세트화의 정도가 어떠한 경향성을 띠는지 알아보기 위하여, 아세트산 무수물을 히알루론산의 몰비에 비례하여 1:250, 1:400, 및 1:500의 비로 넣어주고 각각에 대해 AC-HA 250, AC-HA 400, AC-HA 500으로 명명하였다. 아세트산 무수물을 몰비에 따라 넣어준 후 12시간 동안 반응을 수행하였다.
실시예 2: 히알루론산 아세테이트 수득
상기 실시예 1에서 제조한 히알루론산 아세테이트만을 수득하기 위하여 반응이 끝난 용액을 증류수 300 ml에 넣어 침전시켰다. 증류수에서 침전된 물질은 성공적으로 아세트화된 히알루론산인데, 이것만을 분리시키기 위하여 원심분리(3000 rpm, 15분)를 통하여 침전물만을 분리시켰다.
실시예 3: 히알루론산 아세테이트 나노입자의 제조
상기 실시예 2에서 분리한 히알루론산 아세테이트를 DMSO 3 ml에 녹이고 DMSO를 투석막(Spectra사, MWCO 2,000)을 사용하여 증류수에서 2일간 투석하였다. 본 과정에서 실행한 투석은 불순물들을 제거해 줌과 동시에, 물이 투석 막 안으로 유입됨으로써 나노 입자가 형성된다. 원료로서 사용한 히알루론산 아세테이트에 따라 각각 AC-HA NP 250, AC-HA NP 400, AC-HA NP 500으로 명명하였다.
투석과정이 끝난 용액을 동결건조 방법을 이용하여 증류수만을 증발시키는 방식으로 분지형으로 보관가능하다.
실시예 4: 독소루비신이 봉입된 나노입자의 제조
독소루비신(Sigma-aldrich, USA) 0.5mg을 DMSO 1ml에 녹인 후 트리에틸아민(Sigma-aldrich, USA) 2μl를 첨가하고 12시간 정도 반응시켰다. 별도로, 상기 실시예 2에서 수득한 히알루론산 아세테이트 10mg을 DMSO 2ml에 녹인 다음, 상기 독소루비신 용액과 혼합하였다. 그 혼합 용액을 pH 9.5 붕산염 완충제(borate buffer) 수용액 중에서 MWCO 1,000 투석막을 사용하여 투석하였다. pH 9.5, 붕산염 완충액제 수용액을 사용하여 투석을 실행한 이유는 독소루비신의 pKa 값이 8.4이므로 8.4이하의 pH에서는 독소루비신의 아민기(-NH2)가 친수성을 가져 물에 녹는 성질이 있기 때문에, 나노입자에 독소루비신을 봉입하는 과정에서 독소루비신의 나노입자의 소수성 부분과 소수성-소수성 상호작용을 극대화 시켜주기 위한 과정이다.
상기 투석과정에 의해 약물이 봉입된 나노입자를 형성시킴과 동시에, 유기용매인 디메틸설폭시드, 독소루비신 염산의 염산을 제거하기 위한 촉매로 사용된 트리에틸아민, 및 봉입되지 않은 독소루비신을 제거하였다.
그리하여 제조된 나노 입자 수용액을 동결 건조기를 사용하여 건조시켜 순수한 나노 입자만을 회수하였다. 원료로서 사용한 히알루론산 아세테이트에 따라 각각 AC-HA NP-DOX 250, AC-HA NP-DOX 400, AC-HA NP-DOX 500으로 명명하였다.
실험예 1: 히알루론산 아세테이트의 합성 검증
히알루론산 아세테이트가 잘 합성 되었는지를 확인하기 위하여 FT-IR(Nicolet, Magna IR 550)을 이용하여 확인하였다. 상기 실시예 1에서 제조된 히알루론산 아세테이트를 KBr과 함께 나노입자 : KBr = 1 : 5의 비율로 막자사발에 섞은 후 막자를 사용하여 갈아, 고체형태의 펠렛으로 만들고, 고체형태의 펠렛을 기기에 넣고 측정 하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 3400cm-1 파수의 하이드록실기(-OH)가 줄어들고 1800cm-1 부근의 카보닐기(C=O)가 생성되고, 1300cm-1 부근의 메틸기(-CH3)가 생성된 것을 확인하였다. 이러한 하이드록실기의 감소와 카보닐기와 메틸기의 생성을 확인함으로써 히알루론산이 아세틸화 되었다는 것이 확인되었다.
실험예 2: 나노입자의 특성분석
상기 실시예 3 및 4에서 제조한 히알루론산 아세테이트 나노입자의 크기를 히알루론산 아세테이트 나노입자를 탈이온수에 1mg/ml의 농도로 분산시킨 다음 제타전위 zetasizerSZ (Malvern, UK)를 이용하여 측정하였다. 나노입자의 약물 봉입율과 봉입량을 확인하기 위해 UV-VIS 분광광도계(UV-2450, Shimadzu)를 이용하여 490 nm 파장에서 독소루비신의 흡광도를 측정하였다. 봉입율은 투입한 약물의 중량 대비 나노입자에 봉입된 약물의 중량을 퍼센트화한 지표이고, 봉입량은 수득한 나노입자 중량대비 약물의 중량을 퍼센트화한 지표이다.
나노입자에 봉입시킨 약물인 독소루비신을 g/L의 농도 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625, 0.03125, 0.015625, 0.007813, 0.003906, 0.001953, 0.000977의 농도로 희 석하여 흡광도를 측정하여 표준검량선을 얻었고, 실시예 4에서 얻어진 독소루비신 봉입 나노입자의 흡광도 값을 표준검량선에 도입하여 약물의 농도를 구한 다음 그에 기초하여 봉입된 약물양을 계산하여 약물의 봉입율 및 봉입량을 계산하였다. 그 결과를 하기의 표 1에 나타내었다.
Figure 112009013943968-pat00003
PDI=Polydispersion index(다분산계수)
실험예 3: 나노입자 형성의 최소 농도 측정
나노입자가 형성될 수 있는 히알루론산 아세테이트의 최소 농도 값을 측정하기 위하여 형광물질인 파이렌 98%(Simga Aldrich사)을 사용하였고, 형광분광광도계(spectrofluorophotometer, Shimadzu사, RF-5301PC)를 이용하여 파이렌의 형광을 측정하였다.
형광 분광의 측정을 위해 피렌 스톡 용액 (Pyrene stock solution, 6.0 x 10 M)을 아세톤에서 준비하였고, 사용할 때까지 5℃에서 저장하였다. 안정상태 형광분광의 측정을 위하여 피렌 농도 12.0 x 10-7M을 맞추려고, 아세톤하의 피렌 용액을 증류수에 첨가하여 100ml의 용액을 만들었다, 다음으로 용액으로부터 아세톤을 제거하기 위하여 60℃에서 1시간동안 용액을 증류하였다. 아세톤이 없는 피렌 용액은 0.00025mg/ml에서 1.0 mg/mL 범위 농도의 자가 응집 나노입자와 함께 혼합되었다. 피렌 용액 1ml과 시료 용액 1ml을 혼합하여 최종 2ml의 용액을 만들었다. 각 시료에서 피렌의 최종농도는 6.0 x 10-7M이었고 이는 25 ℃의 물에서 용해도와 거의 같은 것이다. 그에 따른 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3 은 형광 스펙트럼의 쉬프트(shift)현상을 수식(337nm의 형광강도/ 334nm의 형광강도)을 통해 시료의 농도에 따라 나타낸 그래프 이다.
실험예 4: 나노입자에서의 약물 방출시험
상기 실시예 4에서 제조된 독소루비신이 봉입된 나노입자 2 ml를 투석막(MWCO 1,000, Spectra사)에 넣고 투석막을 10 mM 생리식염수 10 ml와 37℃, 50rpm의 환경에서 약물의 방출 경향을 알아보았다. 특정 시간마다 생리식염수를 완전히 교체해 주는 식으로 실험을 수행하였으며, 교체한 생리식염수에 녹아있는 독소루비신 흡광도를 UV-VIS 분광광도계(UV-2450, Shimadzu)를 이용하여 490 nm 파장에서 측정함으로써 독소루비신의 양을 정량하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 약물방출이 140시간 동안 진행되었음을 알 수 있다.
실험예 5: 세포독성실험
본 발명에 따른 나노입자가 항암제를 봉입한 경우(실시예 4)와 약물을 전혀 봉입하지 않은 경우(실시예 3) 암 세포인 HeLa 세포와 정상 세포인 Vero 세포에서 어떠한 독성 차이를 보이는지 알아보기 위하여 96 플레이트에 플레이트당 3 X 10-5 세포 농도로 세포를 분주하고 24 시간 후 나노입자 20 μl를 처리하였다. 각 웰의 농도가 순서대로 1mg/ml, 0.5mg/ml, 0.25mg/ml, 0.125mg/ml, 0.0625mg/ml, 또는 0.03125mg/ml가 되도록 처리하였다. 나노입자 처리 48 시간 후 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(Sigma Aldrich사) 20 μl를 처리하고 4 시간 후, 흡입기로 세포를 제외한 모든 용액을 제거하였다. 용액 제거 후 DMSO(Junsei사) 150μl를 처리, 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 595nm 파장에서 흡광도를 측정하여 세포 생존률을 확인하였다.
그 결과를 도 5에서 나타내었다. 도 5에 따르면, 실시예 4에서 제조한 나노입자의 경우 암세포에 대해서는 세포 생존률이 농도의 증가에 따라 50% 내외로 감소하는데 반해 정상세포에 대해서는 전 농도 범위에서 세포 생존율이 약 90% 이상으로 독성이 거의 나타나지 않았다. 독소루비신을 봉입하지 않는 실시예 3의 경우 세포 생존율이 암세포 및 정상세포 모두에 대해 전 농도 범위에서 약 90% 이상으로 나타나, 세포독성이 거의 없는 것으로 확인되었다. 따라서, 본 발명에 따른 나노입자(약물성분 제외한 약물 전달체)는 생체적합성이 뛰어난 약물 전달체이며 암세포에 대해 선택적으로 작용할 수 있는 표적지향형 제제로서 이용될 수 있다는 것을 알 수 있다.
실험예 6: 항암제 봉입 히알루론산 아세테이트 나노입자의 세포내 유입 실험
독소루비신을 봉입한 히알루론산 아세테이트 나노입자가 암 세포 내로 유입될 수 있는지 알아보기 위하여 히알루론산 아세테이트 30 mg을 FITC(Fluorescein isothiocyanate isomer) 0.15mg을 이용하여 형광표지를 하는 것만을 제외하고 동일한 방식으로 실시예 4와 같이 나노입자를 제조하였다. 독소루비신은 자체 형광을 가지기 때문에 처리해주지 않았다.
HeLa 세포를 6 플레이트의 커버글라스 위에 1 X 10-5 세포 농도로 분주하고 24시간 후 나노입자 100 μl씩 처리하였다. 나노입자 처리 4시간 후 생리식염수로 3회에 걸쳐 세포 내로 유입되지 않은 모든 물질을 세척해주고, 4% 파라포름알데히드(Yakuri pure chemicals, Japan)를 이용하여 10분간 세포를 고정하고 다시 생리식염수로 3회에 걸쳐 세척을 시행하고 세포가 붙어 있는 커버글라스를 마운팅 용액(mounting solution)(Dako, Japan)을 사용하여 슬라이드 글라스에 고정시킨 다음 공촛점 현미경(Leica TCS NT, Leica, Germany)을 이용하여 관찰되는 세포의 사진을 촬영하였다.
그 촬영한 사진을 도 6에 나타내었다. 1행의 사진의 경우 형광을 띠는 독소루비신(빨강)가 봉입된 FITC(초록) 표지를 한 나노입자를 세포에 처리하였을 때 세포내로 잘 유입되는 것을 보여주는 사진이다. 2행의 경우는 나노입자가 수용체 매개적 유입인지를 확인하기 위해 수용체에 경쟁적으로 작용할 수 있는 히알루론산 1mg/ml을 처리해 준 경우이다. 사진을 보면 1행에 비해 형광이 줄어드는 것을 확인 할 수 있다. 이를 통해 수용체 매개적 유입이 이루어짐을 확인 할 수 있다. 3행은 히알루론산 분해 효소를 1mg/ml로 나노입자와 같이 처리하였을 경우 나노입자가 분해되어 나노입자의 형광(녹색)은 줄어들고 항암제(빨강)만이 세포내로 유입됨을 확인 한 사진이다. 따라서, 본 나노입자의 경우 암세포의 특이적인 CD-44 수용체 뿐만 아니라 암세포의 특이적인 효소의 분해에 의해 능동적인 표적화가 되는 것을 특징으로 한다는 것을 확인 할 수 있다.
이러한 사진에 따르면, 히알루론산 아세테이트 나노 입자의 세포 내로의 유입을 확인할 수 있고, 항암제 또한 세포 내로 유입되었음을 확인 할 수 있었다.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 C2-C4알카노일화된 히알루론산의의 나노입자 형성의 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 히알루론산 아세테이트의 FT-IR 기기분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 발명의 일 실시예에 따른 히알루론산 아세테이트 나노입자의 임계 응집농도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 발명의 일 실시예에 따른 히알루론산 아세테이트 나노입자의 수중에서의 약물 방출율을 시간의 경과에 따라 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5a는 본 발명의 일 실시예에 따른 독소루비신이 봉입된 나노입자(실시예 4)의 암세포에 대한 세포 독성 시험을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5b는 본 발명의 일 실시예에 따른 독소루비신이 봉입된 나노입자(실시예 4)의 정상세포에 대한 세포 독성 시험을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5c는 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자에 약물이 봉입되지 않은 나노입자(실시예 3)의 암세포에 대한 세포 독성 시험을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5d는 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자에 약물이 봉입되지 않은 나노입자(실시예 3)의 정상세포에 대한 세포 독성 시험을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 나노입자가 암세포에 유입는지 여부를 확인하기 위해, FITC 형광표지된 히알루론산 아세테이트로 제조된 독소루비신이 봉입된 나노입자를 암세포에 처리한 다음, 공초점 현미경으로 관찰하여 촬영한 사진이다.

Claims (10)

  1. 히알루론산이 C2-C4 알카노일화되어 양친매성화된 히알루론산이 약물을 봉입하면서 자가응집되어 형성된 나노입자.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 히알루론산은 분자량이 5~6 kDa인 것을 특징으로 하는 나노입자.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 히알루론산은 아세틸화되는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 약물은 소수성 약물인 것을 특징으로 하는 나노입자.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 소수성 약물은 독소루비신, 탁솔, 캄토테신, 아드리아마이신, 파클리탁셀, 시스플라틴, 미토마이신-C, 도노마이신(daunomycin), 포피린(porphyrin), 클로린(chlorine), 및 5-플루오로우라실로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 나노입자.
  6. 히알루론산 및 C2-C4알칸산 무수물을 용매 중에 용해하고 반응시켜, C2-C4알 카노일화된 히알루론산 생성물을 얻는 단계;
    상기 생성물과 물을 혼합하여 C2-C4알카노일화된 히알루론산을 침전시켜 수득하는 단계;
    상기 수득된 C2-C4알카노일화된 히알루론산 및 약물을 용매 중에 용해한 후 투석막에 넣고 수중에서 투석함으로써 물이 투석막 내부로 유입되면서 상기 C2-C4알카노일화된 히알루론산이 약물을 봉입하면서 자가응집되어 나노입자를 형성하는 단계; 및
    상기 형성된 나노입자를 동결건조하여 나노입자를 회수하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 나노입자를 제조하는 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 C2-C4알칸산 무수물은 아세트산 무수물인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 6항에 있어서, 상기 C2-C4알카노일화된 히알루론산 생성물을 얻는 단계에서 사용된 용매는 포름아미드인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 6항에 있어서, 상기 C2-C4알카노일화된 히알루론산을 수득하는 단계는 침전된 C2-C4알카노일화된 히알루론산을 원심분리에 의해 분리하는 것을 특징으로 하 는 방법.
  10. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 나노입자를 포함하는 주사제.
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