WO2020088494A1 - 一种等电点可控的磷酸铝纳米佐剂及其制备方法 - Google Patents

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Definitions

  • the invention relates to the improvement of the production process of aluminum phosphate colloid, and mainly relates to an aluminum phosphate nano adjuvant with controllable isoelectric point and a preparation method thereof.
  • the purpose of the present invention is to provide a simple and efficient method for preparing aluminum phosphate nanoadjuvants.
  • a series of aluminum phosphate colloids with controllable isoelectric point can be obtained.
  • the present invention precisely adjusts the isoelectric point of the resulting aluminum phosphate adjuvant product by changing the pH during the reaction.
  • the principle is that as the reaction pH rises, the final product Al (OH) x (PO 4 ) y PO 4 / OH As the ratio increases, the content of phosphate-substituted hydroxyl groups increases, and the zero charge point of the product decreases, that is, the isoelectric point of the product decreases. Therefore, the higher the pH during the reaction, the smaller the isoelectric point of the resulting aluminum phosphate adjuvant product, thereby achieving precise control of the isoelectric point of the aluminum phosphate adjuvant.
  • the inorganic aluminum salt is completely dissolved in deionized water to form a transparent and clear aluminum salt solution (ie, precursor solution); the process of taking the inorganic aluminum salt completely dissolved in deionized water is stirred and dissolved at a certain temperature.
  • a transparent and clear aluminum salt solution ie, precursor solution
  • the aluminum salt is mainly but not limited to aluminum chloride hexahydrate, such as aluminum chloride AlCl 3 , aluminum hydroxide Al (OH) 3 , Aluminum sulfate Al 2 (SO4) 3 and other common inorganic aluminum salts or mixtures thereof.
  • the concentration of the precursor solution in step 2) is 0.01-0.5M.
  • the sterilization treatment temperature in step 3 is 121 ° C.
  • the treatment time is preferably 20-30 min; preferably 30 min.
  • Another aspect of the invention is to protect the aluminum phosphate nanoadjuvant prepared by the method described above.
  • an aluminum salt solution with a certain concentration is used as a precursor, and an aluminum phosphate nano-adjuvant whose isoelectric point varies with reaction pH is obtained at room temperature under the action of an Al ion precipitant.
  • the final product particle size is 10- Between 40nm, the PDI dispersion index is between 0.2-0.4, and the isoelectric point is between 3-6.
  • the method of the present invention is simple in process, easy to operate, good in repeatability, and has a wide range of application. The product impurities are easily removed by means of water washing and centrifugation. Based on the chemical precipitation method, this method can obtain A series of aluminum phosphate colloids with different isoelectric points.
  • FIG. 1 is a transmission electron micrograph of aluminum phosphate colloid obtained by reacting at different pH for 30 minutes in Example 1.
  • FIG. 2 is an X-ray diffraction characterization result of aluminum phosphate colloid obtained by reacting at different pH for 30 minutes in Example 1.
  • FIG. 2 is an X-ray diffraction characterization result of aluminum phosphate colloid obtained by reacting at different pH for 30 minutes in Example 1.
  • Figure 5 is the transmission electron microscopy characterization results of aluminum phosphate colloids obtained by reacting at different pH for 30min in a 450mL system.
  • the scale in the figure is 100nm.

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Abstract

一种基于化学沉淀原理的疫苗用纳米磷酸铝佐剂、其制备方法及其等电点调控的方法。上述佐剂的粒径在10-40nm之间，PDI分散性指数0.2-0.4之间，等电点3-6之间。所述的磷酸铝佐剂均一性好、性质稳定、分散性良好，并通过调控反应沉淀过程中的pH值，可以精确调控最终产物的等电点。本方法操作工艺简单，易于控制，为疫苗用佐剂等生物医学领域具有潜在的应用前景。

Description

一种等电点可控的磷酸铝纳米佐剂及其制备方法 技术领域
本发明是关于磷酸铝胶体生产过程的改进，主要涉及一种等电点可控的磷酸铝纳米佐剂及其制备方法。
背景技术
近年来，随着对微生物致病机理的不断了解和免疫学研究的不断深入，活载体疫苗和蛋白质疫苗等新型疫苗的研究取得了很大的进步。然而，由于新型疫苗的免疫原性的限制，诱导机体产生的免疫应答不够，因此，应用佐剂来引导和增强其抗原的免疫应答效应，给予人体更加长久有效的预防性保护。
尽管新型佐剂飞速发展，但是大部分均处于实验研究阶段，铝盐佐剂在疫苗佐剂中仍然占有很大一部分比例。在FDA已批准的80种疫苗中，36％的疫苗使用了不同种类的佐剂，其中包含铝盐佐剂的疫苗占含佐剂疫苗总数的86％，可见对其进行深入的研究兼具重要性与必要性。作为铝盐佐剂中重要的一种阳离子抗原吸附剂，磷酸铝一直以来都是研究的热点，其免疫效应与佐剂的特性息息相关。目前，商业化磷酸铝佐剂的等电点为5.0，在pH＝7.4的溶液中呈阴离子形式存在，是阳离子抗原的良好吸附剂。研究表明，磷酸铝佐剂的免疫效应在很大程度上取决于佐剂本身对抗原的吸附能力，因此通过调控材料的等电点进而改变材料对抗原的吸附能力是磷酸铝佐剂研究的重点。先前的工艺研究表明，磷酸铝佐剂的特性取决于制备的条件，包括试剂的浓度，添加试剂的顺序，添加和混合试剂的速率，搅拌速率，沉淀过程的pH等，因此难以在生产中维持稳定的物理化学特性，无法保证批次间的重复性。因此，本领域仍然需要在工业规模上的更有效的方法，来实现磷酸铝佐剂的高效制备及其等电点的精确调控。
本发明通过使用磷酸根离子沉淀剂对Al离子在不同pH条件下进行均匀沉淀，可以得到不同等电点的磷酸铝佐剂材料，符合疫苗在制剂中的应用需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简单、高效的制备磷酸铝纳米佐剂的改进方法，通过调控其反应过程中的pH，得到等电点可控的一系列磷酸铝胶体。本发明通过改变反应过程中的pH来精确调控所得磷酸铝佐剂产物的等电点，其原理在于随着反应pH的上升，最终产物Al(OH)x(PO 4)y的PO 4/OH比值增大，磷酸根取代羟基的含量增大，产物的零电荷点下降，即产物的等电点下降。因此，反应过程中pH越高，所得磷酸铝佐剂产物的等电点越小，从而实现了对磷酸铝佐剂等电点的精确调控。
本发明制备疫苗用磷酸铝纳米佐剂的方法，具体步骤为：
1)取无机铝盐完全溶解于去离子水形成透明澄清的铝盐溶液(即：前驱物溶液)；取无机铝盐完全溶解于去离子水的过程是在一定温度下进行搅拌、溶解的。
2)在上述铝盐溶液中滴加可溶性碱性磷酸盐溶液作为沉淀剂，搅拌使其发生均匀沉淀；控制磷酸盐加入的量，控制反应终点pH，得到pH从3.0到6.0的一系列产物。
3)灭菌、冷却、离心、洗涤、干燥得到磷酸铝粉末固体。
对于上文所述制备方法的技术方案中，优选的情况下，所述的铝盐主要是但不限于六水合氯化铝，可以采用如氯化铝AlCl 3、氢氧化铝Al(OH) 3、硫酸铝Al 2(SO4) 3等常用无机铝盐的一种或其混合物。
对于上文所述制备方法的技术方案中，优选的情况下，所述的磷酸盐沉淀剂可以采用如磷酸钠、磷酸氢二钠等磷酸根离子沉淀剂中的一种或其混合物。
对于上文所述制备方法的技术方案中，优选的情况下，步骤2)所述的前驱物溶液浓度为0.01-0.5M。
对于上文所述制备方法的技术方案中，优选的情况下，步骤2)所述的沉淀剂与前驱物的摩尔比为(1-3)：1，优先选择摩尔比比值≤2。
对于上文所述制备方法的技术方案中，优选的情况下，步骤2)所述的搅拌转速为200-1000rpm，优选500-600rpm；搅拌时间为10-60min，优选35-55min。
对于上文所述制备方法的技术方案中，优选的情况下，步骤2)所述的滴加，是在前驱物溶液中有Al离子的存在条件下，控制磷酸盐沉淀剂的滴加速率，采用逐滴滴加或以一定的速率滴加的方式，均可使沉淀剂与Al离子发生均匀沉淀。
对于上文所述制备方法的技术方案中，优选的情况下，步骤3)中灭菌处理温度为121℃，优选处理时间为20-30min；优选30min。反应结束后将灭菌瓶置于空气中或者冰水浴中进行冷却，待反应物冷却至室温。
对于上文所述制备方法的技术方案中，优选的情况下，步骤3)所述的灭菌条件为121℃，20-30min；实施例中，所述混合液反应总体积为70mL-100L。
对于上文所述制备方法的技术方案中，优选的情况下，步骤3)所述的离心转速为4000-9000rpm，离心时间为5-20min，洗涤次数为3-5次；最终烘干温度为50-100℃，进一步优选是在40-60℃下恒温干燥得到白色固体粉末，最优选60℃。
本发明的另一方面在于保护上文所述方法制备的磷酸铝纳米佐剂。
本发明中，采用一定浓度的铝盐溶液作为前驱体，在Al离子沉淀剂的作用下在室温下获得等电点随反应pH不同而变化的磷酸铝纳米佐剂，最终产物粒径在10-40nm之间，PDI分 散性指数0.2-0.4之间，等电点3-6之间。本发明的方法工艺简单，易于操作，重复性好，适用范围广，产物杂质容易通过水洗离心的方式除去，该方法在化学沉淀法的基础上，通过控制前驱体与沉淀剂的投料比例，得到等电点不同的一系列磷酸铝胶体。
附图说明
图1是实施例1中不同pH下反应30min所得磷酸铝胶体的透射电镜图。图1a-f分别为pH＝3.38、4.0、4.5、5.0、5.5和6.0下反应所得的磷酸铝胶体材料。其中，标尺为100nm。
图2是实施例1中不同pH下反应30min所得磷酸铝胶体的X射线衍射表征结果。
图3是实施例1中不同pH下反应30min所得磷酸铝胶体的水合粒径分布及Zeta电势表征结果。
图4是实施例1中不同pH下反应30min所得磷酸铝胶体的等电点随体系pH递减的线性曲线。
图5是450mL的体系中不同pH下反应30min所得磷酸铝胶体的透射电镜表征结果。图中标尺为100nm。
具体实施方式
下述非限定性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1
准确称取4.237g六水合氯化铝和6.947g磷酸钠并分别将其在室温下溶解到50mL去离子水溶液中，在溶解的过程中进行不断搅拌，搅拌速率控制在500-600rpm，待两试剂完全溶解于去离子水形成透明澄清溶液后，取磷酸钠溶液逐滴滴加入六水合氯化铝溶液中，控制反应终点pH，滴加时间控制在10min以内。溶液随着磷酸钠的不断加入变得浑浊，可以观察到有白色沉淀生成，反应时间控制在30min到35min，将所得的混合液转移至灭菌瓶中，置于高压灭菌箱中进行热处理30min后处理温度为121℃。最后将灭菌瓶取出，待自然冷却至室温，将反应产物取出，使用去离子水离心洗涤两到三次，60℃下恒温干燥，得到白色粉末状固体，即为所得产物磷酸铝纳米佐剂。
上述材料经过表征显示，pH＝3.38和pH＝6.0下合成的磷酸铝佐剂分散性较好，产物均为无定型结构，二级粒径均约为300nm，各pH下合成材料的粒径与Zeta电势的分布均满足反比关系，随着反应终点pH的增加，等电点从5.5线性递减至4.5，结果见图1,2，3，4。
实施例2
准确称取30g的六水合氯化铝，在搅拌的状态下溶解于450mL的去离子水，准确称取46g的六水合氯化铝，在搅拌的状态下溶解于450mL的去离子水，不断进行搅拌至完全溶解，溶 液呈澄清透明状态。取磷酸钠作为沉淀剂，采用注射泵逐滴将磷酸钠水溶液滴加至六水合氯化铝溶液中，控制磷酸钠水溶液滴加速率为30mL/min，滴加过程中进行搅拌，控制搅拌速率为500-600rpm，控制反应终点pH为5.26。滴加结束后，将上述溶液转移至灭菌瓶当中，置于121℃下灭菌30min，待灭菌结束后，将产物转移取出置于50mL离心管中，进行洗涤离心，使用去离子水洗涤3-5次，最终产物置于表面皿中烘干，烘干温度60℃。最终所得产物即为白色的磷酸铝纳米材料。具体结果见图5。
对于任何熟悉本领域的技术人员而言，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的技术内容对本发明技术方案作出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均应仍属于本发明技术方案保护的范围内。

Claims (10)

  1. 一种等电点可控的磷酸铝纳米佐剂的制备方法，包括以下步骤：
    1)取无机铝盐完全溶解于去离子水形成透明澄清的铝盐溶液；
    2)在上述铝盐溶液中滴加碱性磷酸盐溶液作为沉淀剂，搅拌使其发生均匀沉淀；控制磷酸钠加入的量，进而控制反应终点pH，得到pH从3.0到6.0的一系列产物；
    3)灭菌、冷却、离心、洗涤、干燥得到磷酸铝粉末固体。
  2. 根据权利要求1所述的一种等电点可控的磷酸铝纳米佐剂的制备方法，其特征在于：所述的铝盐为六水合氯化铝、氯化铝、硫酸铝或氢氧化铝中的一种或其混合物。
  3. 根据权利要求1所述的一种等电点可控的磷酸铝纳米佐剂的制备方法，其特征在于：所述的磷酸盐沉淀剂是磷酸根离子沉淀剂。
  4. 根据权利要求3所述的一种等电点可控的磷酸铝纳米佐剂的制备方法，其特征在于：所述的磷酸盐沉淀剂选自磷酸钠、磷酸氢二钠中的一种或其混合物。
  5. 根据权利要求1所述的一种等电点可控的磷酸铝纳米佐剂的制备方法，其特征在于：所述的铝盐溶液浓度为0.01-0.5M。
  6. 根据权利要求1所述的一种等电点可控的磷酸铝纳米佐剂的制备方法，其特征在于：所述的沉淀剂与铝盐的摩尔比为1-3:1。
  7. 根据权利要求1所述的一种等电点可控的磷酸铝纳米佐剂的制备方法，其特征在于：步骤2)所述的搅拌转速为200-1000rpm，搅拌时间为10-60min。
  8. 根据权利要求1所述的一种等电点可控的磷酸铝纳米佐剂的制备方法，其特征在于：所述的灭菌条件为121℃，20-30min。
  9. 根据权利要求1所述的一种等电点可控的磷酸铝纳米佐剂的制备方法，其特征在于：所述的离心转速为4000-9000rpm，离心时间为5-20min，洗涤次数为3-5次，烘干温度为50-100℃。
  10. 利用权利要求1所述方法制备的磷酸铝纳米佐剂。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109432418A (zh) * 2018-11-01 2019-03-08 大连理工大学 一种等电点可控的磷酸铝纳米佐剂及其制备方法
CN112138155B (zh) * 2019-06-28 2022-04-12 怡道生物科技(苏州)有限公司 一种复合佐剂系统及制备该佐剂的方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009136233A1 (en) * 2008-05-08 2009-11-12 Serum Institute Of India Ltd. Aluminium phosphate nanoparticles
CN101730660A (zh) * 2007-07-10 2010-06-09 惠氏有限责任公司 生产磷酸铝的方法
CN102188701A (zh) * 2010-03-12 2011-09-21 上海泽润生物科技有限公司 一种磷酸铝佐剂及其制备方法
CN104055736A (zh) * 2014-07-08 2014-09-24 安徽医科大学 包封纳米铝的载体及其应用
CN106729702A (zh) * 2016-12-28 2017-05-31 北京民海生物科技有限公司 一种磷酸铝佐剂及其制备方法与应用
CN107929729A (zh) * 2017-12-20 2018-04-20 北京民海生物科技有限公司 一种磷酸铝佐剂的制备方法
CN109432418A (zh) * 2018-11-01 2019-03-08 大连理工大学 一种等电点可控的磷酸铝纳米佐剂及其制备方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101730660A (zh) * 2007-07-10 2010-06-09 惠氏有限责任公司 生产磷酸铝的方法
WO2009136233A1 (en) * 2008-05-08 2009-11-12 Serum Institute Of India Ltd. Aluminium phosphate nanoparticles
CN102188701A (zh) * 2010-03-12 2011-09-21 上海泽润生物科技有限公司 一种磷酸铝佐剂及其制备方法
CN104055736A (zh) * 2014-07-08 2014-09-24 安徽医科大学 包封纳米铝的载体及其应用
CN106729702A (zh) * 2016-12-28 2017-05-31 北京民海生物科技有限公司 一种磷酸铝佐剂及其制备方法与应用
CN107929729A (zh) * 2017-12-20 2018-04-20 北京民海生物科技有限公司 一种磷酸铝佐剂的制备方法
CN109432418A (zh) * 2018-11-01 2019-03-08 大连理工大学 一种等电点可控的磷酸铝纳米佐剂及其制备方法

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