WO2020066722A1 - ヘモグロビンの測定試薬、測定キット及び測定方法 - Google Patents

ヘモグロビンの測定試薬、測定キット及び測定方法 Download PDF

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Definitions

  • Detection of blood contained in specimens such as feces, urine, and saliva is useful for diagnosis of many diseases.
  • a fecal occult blood test for detecting blood in feces is used for screening for colorectal cancer.
  • an immunological technique for detecting hemoglobin contained in occult blood in a specimen such as feces using an anti-hemoglobin antibody is known.
  • a specimen to be subjected to an occult blood test is usually collected by a subject in a container containing a preservation solution, and sent to a laboratory such as a hospital.
  • the preservation solution containing the specimen is stored for several days before it is actually tested, during which time it is often subjected to high temperatures.
  • Hemoglobin is unstable in solution and is particularly prone to denaturation or decomposition under high temperature conditions. If the structure of the epitope or its peripheral site changes due to denaturation or degradation of hemoglobin, the antibody cannot recognize hemoglobin, and therefore, the accuracy of hemoglobin detection by immunological techniques decreases.
  • Haptoglobin is a protein that exists in the blood of a wide range of animals and plays a role in recovering hemoglobin released into the blood by hemolysis of red blood cells. It is known that haptoglobin rapidly and irreversibly binds to hemoglobin to form a stable hemoglobin-haptoglobin complex.
  • haptoglobin By adding haptoglobin to the storage solution or the like in advance, when the sample is added to the storage solution or the like, hemoglobin contained in the sample is stabilized by forming a hemoglobin-haptoglobin complex.
  • the object of the present invention is to provide a reagent for measuring hemoglobin and a method for measuring hemoglobin that can more accurately measure the amount of hemoglobin while suppressing a decrease in the measured value of hemoglobin caused by the addition of haptoglobin.
  • the present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above-mentioned problems of the prior art, and as a result, by coexisting an insoluble carrier to which an anti-hemoglobin antibody is bound and an insoluble carrier to which an anti-haptoglobin antibody is bound.
  • the present inventors have found that a decrease in the measured value of hemoglobin caused by the addition of haptoglobin can be suppressed, and the amount of hemoglobin can be measured more accurately, and the present invention has been completed.
  • a reagent for measuring hemoglobin comprising: an insoluble carrier carrying an anti-hemoglobin antibody; and an insoluble carrier carrying an anti-haptoglobin antibody.
  • the reagent of [1], wherein the anti-hemoglobin antibody is at least two kinds.
  • the reagent of any one of [1] to [3], wherein the anti-hemoglobin antibody and the anti-haptoglobin antibody are monoclonal antibodies.
  • a method for measuring hemoglobin in a sample (1) mixing a sample and haptoglobin to form a hemoglobin-haptoglobin complex, and obtaining a sample containing the hemoglobin-haptoglobin complex; (2) a step of bringing the sample obtained in step (1) into contact with an insoluble carrier carrying an anti-hemoglobin antibody and an insoluble carrier carrying an anti-haptoglobin antibody to cause immunoaggregation; And a method for measuring hemoglobin.
  • the hemoglobin in the sample includes at least one selected from the group consisting of free hemoglobin, a hemoglobin-haptoglobin complex intermediate, and a complete hemoglobin-haptoglobin complex, and at least a part of the free hemoglobin is obtained by the step ( The method according to any one of [6] to [12], wherein after the step 1), the above-mentioned haptoglobin and a hemoglobin-haptoglobin complex intermediate and / or a complete hemoglobin-haptoglobin complex are formed.
  • a method for measuring hemoglobin in a sample comprising a step of bringing a sample into contact with an insoluble carrier carrying an anti-hemoglobin antibody and an insoluble carrier carrying an anti-haptoglobin antibody to immunoaggregate.
  • a method for suppressing a decrease in the measured value of hemoglobin in a sample comprising a step of bringing a sample into contact with an insoluble carrier carrying an anti-hemoglobin antibody and an insoluble carrier carrying an anti-haptoglobin antibody to immunoaggregate.
  • a kit for measuring hemoglobin in a sample comprising: an insoluble carrier carrying an anti-hemoglobin antibody; an insoluble carrier carrying an anti-haptoglobin antibody; and haptoglobin.
  • a kit for measuring hemoglobin in a sample comprising a reagent according to any one of [1] to [5] and haptoglobin.
  • a measurement reagent and a measurement method capable of measuring the amount of hemoglobin more accurately are provided.
  • Hemoglobin-haptoglobin complex Hemoglobin is a protein present in erythrocytes and has a tetrameric structure [ ⁇ ] composed of two types of subunits called ⁇ subunit (or ⁇ chain) and ⁇ subunit (or ⁇ chain). 2 ⁇ 2 ].
  • Haptoglobin is a protein that exists in plasma and binds to hemoglobin released in blood, and has three types of structures. For example, type 1-1 haptoglobin has a tetrameric structure [ ⁇ 2 ⁇ 2 ] composed of two types of subunits called ⁇ subunit (or ⁇ chain) and ⁇ subunit (or ⁇ chain) Having.
  • Hemoglobin and haptoglobin form a stable complex. Usually, one molecule of hemoglobin is bound to one molecule of haptoglobin. Such a complex is called a hemoglobin-haptoglobin complex, and is also referred to herein as a complete hemoglobin-haptoglobin complex.
  • hemoglobin haptoglobin
  • a complex called a hemoglobin-haptoglobin complex intermediate
  • the body tends to form (JV PASTEWKA et al., Biochimica et Biophysica Acta, 386 (1975) 530-537).
  • hemoglobin-haptoglobin complex intermediate one molecule of tetrameric hemoglobin [ ⁇ 2 ⁇ 2 ] dissociates into two molecules of dimer ( ⁇ ), and each ⁇ dimer becomes haptoglobin.
  • hemoglobin-haptoglobin complex intermediate is considered to be a complex in which one molecule of haptoglobin [ ⁇ 2 ⁇ 2 ] is bound to 1 / molecule of hemoglobin ( ⁇ ).
  • the hemoglobin-haptoglobin complex includes both a complete hemoglobin-haptoglobin complex and a hemoglobin-haptoglobin complex intermediate, unless otherwise specified.
  • the specimen in the present specification is a biological sample containing or possibly containing hemoglobin collected from a subject.
  • the specimen may be faeces, saliva, or urine, particularly preferably faeces.
  • whole blood, serum, plasma, and the like can be used as samples, and measuring the amount of these hemoglobins can be useful, for example, as an index for treatment using hemolysis or a haptoglobin preparation.
  • the sample in the present specification contains a sample, and particularly is obtained by mixing the sample with haptoglobin.
  • Free hemoglobin in the sample forms a stable hemoglobin-haptoglobin complex when mixed with haptoglobin. That is, in the sample, free hemoglobin not forming a complex with haptoglobin, a hemoglobin-haptoglobin complex originally present in the sample (a hemoglobin-haptoglobin complex derived from the sample), and / or a haptoglobin formed by addition of haptoglobin
  • the prepared hemoglobin-haptoglobin complex (prepared hemoglobin-haptoglobin complex) may be included.
  • a prepared hemoglobin-haptoglobin complex in a sample in which a specimen and haptoglobin are mixed, it is preferable that all free hemoglobin forms a complex with haptoglobin to form a prepared hemoglobin-haptoglobin complex. It preferably comprises a hemoglobin-haptoglobin complex of origin and a prepared hemoglobin-haptoglobin complex.
  • the sample is obtained, for example, by immediately adding a sample to a sample storage solution containing haptoglobin (hereinafter, sometimes referred to as “storage solution”) after the subject collects the sample.
  • the sample may be stored at room temperature for several days until the measurement of hemoglobin, and is preferably stored refrigerated at 2 to 10 ° C.
  • the preservation solution may be filtered to remove the solid and used as a sample.
  • the storage solution refers to a sample storage solution for storing a sample, and preferably contains haptoglobin.
  • the storage solution preferably further contains a buffer and the like.
  • buffers include 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES), 2- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl] -ethanesulfonic acid (HEPES), piperazine-1,4-bis (2- It may be a buffer containing a good buffer such as ethanesulfonic acid) (PIPES), and may be a phosphate buffer, a Tris buffer or a glycine buffer.
  • the pH of the stock solution may be between 5 and 10, and between 6 and 8.
  • the concentration of haptoglobin in the storage solution depends on the type and amount of the sample, but is, for example, 0.05 unit / L to 50 units / L, 0.1 unit / L to 10 units / L, or 0.2 unit / L to 10 units / L. Unit / L to 2 units / L.
  • one unit means the amount of haptoglobin that binds to 1 mg of hemoglobin.
  • the haptoglobin concentration in the above range is a concentration that is sufficient to cause all hemoglobin in the sample to form a complex with haptoglobin.
  • the amount ratio of the sample to the haptoglobin is 0.075 g / unit. It may be up to 5000 g / unit.
  • the haptoglobin in the present invention is not particularly limited as long as it forms a hemoglobin-haptoglobin complex by complexing with the hemoglobin to be measured.
  • the binding between hemoglobin and haptoglobin has a low species specificity, so that a wide range of haptoglobin can be used.
  • haptoglobin derived from humans, horses, pigs, monkeys, dogs, rabbits, rats, and the like can be used. Haptoglobin does not necessarily need to be used in a highly purified state.
  • additives that can be used during storage of hemoglobin such as an antibacterial agent such as sodium azide (NaN 3 ), a pH adjuster, and a salt for adjusting ionic strength may be further added to the storage solution.
  • Antimicrobial agents include antibiotics and lytic enzymes.
  • additives are known to have an effect of stabilizing hemoglobin, such as amino acids such as lysine and histidine, albumin, protease inhibitors, water-soluble complexes of transition metal ions, and ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA).
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • albumin include serum albumin such as bovine serum albumin (BSA), and albumin derived from egg white (ovalbumin).
  • the hemoglobin measurement reagent includes an insoluble carrier carrying an anti-hemoglobin antibody and an insoluble carrier carrying an anti-haptoglobin antibody.
  • an immunological technique is used, and the immunological technique may be a known immunological technique using an anti-hemoglobin antibody. , Latex agglutination method, or colloidal gold agglutination method), immunochromatography, and ELISA.
  • the reagent of the present invention is suitably used particularly for an immunoagglutination method, more preferably a latex agglutination method.
  • the hemoglobin measuring reagent measures the total amount of hemoglobin by measuring both free hemoglobin and hemoglobin-haptoglobin complex at the time of measurement.
  • the reagent of the present invention has almost the same reactivity as a hemoglobin in the immunoassay (particularly in the immunoagglutination method) for each antigen of free hemoglobin, complete hemoglobin-haptoglobin complex, and hemoglobin-haptoglobin complex intermediate. Is shown.
  • hemoglobin by coexisting an anti-haptoglobin antibody bound to an insoluble carrier, the same reactivity as hemoglobin ("equivalent reactivity to hemoglobin") with respect to both antigens of the complete hemoglobin-haptoglobin complex and the hemoglobin-haptoglobin complex intermediate ).
  • hemoglobin refers to the case where free hemoglobin, complete hemoglobin-haptoglobin complex, hemoglobin-haptoglobin complex intermediate, or each antigen of a mixture thereof is present in the sample at the same concentration as hemoglobin.
  • the hemoglobin concentration measured by the immunoagglutination reaction of the insoluble carrier is substantially equal for each antigen.
  • substantially equal hemoglobin concentration measured by the immunoagglutination reaction of the insoluble carrier means that when the measured value of free hemoglobin is 100%, other various antigens having the same concentration as hemoglobin were measured.
  • the lower limit of the measured value of the hemoglobin concentration at that time is 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and the upper limit of the measured value is 120% or less, preferably 110% or less. And more preferably means 105% or less.
  • the reagent of the present invention in addition to the conventional insoluble carrier carrying an anti-hemoglobin antibody, also includes an insoluble carrier carrying an anti-haptoglobin antibody, thereby suppressing a decrease in the measured value of hemoglobin due to the addition of the conventional haptoglobin. .
  • the molar ratio (hemoglobin / haptoglobin) of haptoglobin to be added and free hemoglobin in the sample is less than 1, that is, even when a hemoglobin-haptoglobin complex intermediate is present, the measured value of hemoglobin is reduced. And the hemoglobin in the sample can be accurately detected and measured.
  • haptoglobin is not added to the specimen, even if haptoglobin (regardless of free haptoglobin, hemoglobin-haptoglobin complex intermediate or hemoglobin-haptoglobin complex) is originally present in the specimen, the measured value of hemoglobin decreases. And the hemoglobin in the sample can be accurately detected and measured.
  • the present inventors believe that the decrease in the measured value of hemoglobin due to the conventional addition of haptoglobin is attributable to the presence of the hemoglobin-haptoglobin complex intermediate, and the addition of an insoluble carrier carrying an anti-haptoglobin antibody was considered. Solved this problem.
  • the insoluble carrier may be any one that can carry an anti-hemoglobin antibody or an anti-haptoglobin antibody, and is preferably an insoluble particle that can be used for an immunological technique, and generally used metal colloid particles such as gold colloid particles, latex particles , Silica particles, magnetic particles, fluorescent particles, red blood cells, and the like, but are not limited thereto.
  • metal colloid particles such as gold colloid particles, latex particles , Silica particles, magnetic particles, fluorescent particles, red blood cells, and the like, but are not limited thereto.
  • latex particles are preferred, and polystyrene-based latex particles are more preferred.
  • the insoluble carrier is preferably in the form of particles, and the average particle size is preferably from 5 to 1,000 nm, more preferably from 30 to 500 nm, and still more preferably from 75 to 350 nm. Is possible.
  • Carrying an antibody means that the antibody is immobilized by physical adsorption or chemical bonding on the surface of the insoluble carrier.
  • a supporting method an immobilizing method
  • an immobilizing method for example, a known technique is used in which an antibody and an insoluble carrier particle are mixed, and the antibody is physically adsorbed on the surface of the insoluble carrier particle to thereby react the antibody with the insoluble carrier particle. Can be fixed.
  • insoluble carrier particles having amino groups or carboxyl groups introduced on the surface are used, the antibody can be immobilized on the surfaces of the insoluble carrier particles by chemical bonding using glutaraldehyde or a carboximide reagent.
  • the amount of the antibody carried is not particularly limited, but may be 0.5 to 2000 ⁇ g / mg latex, and may be 1 to 1000 ⁇ g / mg latex or 2 to 500 ⁇ g / mg latex.
  • the amount of antibody carried can be calculated by subtracting the amount of antibody after immobilization from the amount of antibody before immobilization on the insoluble carrier.
  • the anti-hemoglobin antibody is not particularly limited, but is preferably capable of recognizing an epitope of hemoglobin in a hemoglobin-haptoglobin complex and not causing cross-reaction with haptoglobin.
  • the antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, but is preferably a monoclonal antibody from the viewpoint of specificity, and more preferably an anti-human hemoglobin monoclonal antibody.
  • the measurement reagent contains at least one, and preferably at least two, anti-hemoglobin antibodies.
  • the anti-haptoglobin antibody is not particularly limited, but is preferably capable of recognizing an epitope of haptoglobin in a hemoglobin-haptoglobin complex and not causing cross-reaction with hemoglobin.
  • the anti-haptoglobin antibody does not aggregate at least in the insoluble carrier carrying the free haptoglobin and the anti-haptoglobin antibody within the range of the amount of free haptoglobin in which at least free hemoglobin is used to form the hemoglobin-haptoglobin complex. Is preferred.
  • the anti-haptoglobin antibody does not aggregate in an insoluble carrier carrying free haptoglobin and anti-haptoglobin antibody.
  • the anti-haptoglobin antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, but is preferably a monoclonal antibody, and more preferably an anti-haptoglobin monoclonal antibody.
  • the anti-haptoglobin antibody is a monoclonal antibody, its recognition site may be the ⁇ -chain ( ⁇ -chain-recognizing antibody) or ⁇ -chain ( ⁇ -chain-recognizing antibody) of haptoglobin.
  • the measurement reagent contains at least one anti-haptoglobin antibody.
  • the above-mentioned antibodies that can be used in the present invention include, but are not limited to, animal species derived therefrom, and include, for example, antibodies derived from animals such as rabbits, goats, mice, rats, horses, sheep, and the like. Either a polyclonal obtained from the serum of an animal immunized with the subject or a monoclonal antibody obtained by fusing the spleen of the animal immunized with the subject with myeloma cells may be used. In addition, fragments thereof (for example, F (ab ') 2, Fab, Fab', or Fv) can be used.
  • the insoluble carrier used to carry the anti-hemoglobin antibody is at least one, but may be at least two.
  • One or more insoluble carriers may carry one or more anti-hemoglobin antibodies.
  • one kind of anti-hemoglobin antibody may be carried on one kind or two or more kinds of insoluble carriers.
  • two or more anti-hemoglobin antibodies may be supported on the same insoluble carrier.
  • a plurality of insoluble carriers in which one anti-hemoglobin antibody is carried by one insoluble carrier may be used in combination.
  • the insoluble carriers used to carry different types of anti-hemoglobin antibodies may be the same type of insoluble carriers, or may be different types of insoluble carriers having different materials or particle sizes.
  • the insoluble carrier used to carry the anti-haptoglobin antibody is at least one, but may be at least two.
  • One or more insoluble carriers may carry one or more anti-haptoglobin antibodies.
  • one kind of anti-haptoglobin antibody may be carried on one kind or two or more kinds of insoluble carriers.
  • the form of the measurement reagent is not particularly limited.
  • a two-reagent system of a reagent containing no insoluble carrier (first reagent) and a reagent containing an insoluble carrier carrying an antibody (antibody carrying insoluble carrier) (second reagent) is used. It may be constituted by a single reagent system containing only the reagent containing the insoluble carrier carrying the antibody.
  • the first reagent can be used to adjust the measurement environment, for example, by using it as a diluent in terms of adjusting the concentration of an object to be measured or contaminants in the reaction system, adjusting the reaction rate, and the like.
  • the second reagent contains an insoluble carrier carrying an antibody, and is mixed with the first reagent and the sample to generate an immunoagglutination reaction.
  • the first reagent and the second reagent can appropriately contain a pH buffer, a salt, a surfactant, an aggregation promoter, a preservative, and the like.
  • the pH during the agglutination reaction is preferably from 5 to 9.
  • the measurement reagent is mixed with the storage solution to obtain a reaction solution.
  • the concentration of the insoluble carrier in the reaction solution is, for example, 0.0001 mg / mL to 0.0001 mg / mL in accordance with the particle size of the insoluble carrier used and the design of the entire measurement system. It can be appropriately selected from the range of 10 mg / mL.
  • the concentration of the insoluble carrier carrying the anti-hemoglobin antibody in the measurement reagent may be 0.01 to 20 mg / mL, or 0.05 to 1 mg / mL, and the concentration of the insoluble carrier carrying the anti-haptoglobin antibody is 0. It may be from 01 to 20 mg / mL, or from 0.05 to 1 mg / mL.
  • the concentration of the insoluble carrier in the second reagent is diluted by mixing with the storage solution at the time of use or by mixing with the first reagent and the storage solution.
  • the concentration can be appropriately selected according to the dilution factor. For example, when using two-fold dilution, 0.004 mg / mL to 80 mg / mL, when using three-fold dilution, 0.06 mg / mL. It can be adjusted appropriately so as to be up to 120 mg / mL.
  • step (1) the specimen and haptoglobin are mixed to form a hemoglobin-haptoglobin complex, and a sample containing the hemoglobin-haptoglobin complex is obtained.
  • the hemoglobin-haptoglobin complex contained in the sample may include both the complete hemoglobin-haptoglobin complex and the hemoglobin-haptoglobin complex intermediate.
  • the sample may also include free hemoglobin from the sample, hemoglobin-haptoglobin complex from the sample, and other components from the sample, and may further include free haptoglobin that does not form a complex with hemoglobin.
  • Haptoglobin for mixing with the sample may be included in the sample storage solution, and when haptoglobin is added in a form included in the sample storage solution, the sample is stored in addition to free haptoglobin that does not form a complex with hemoglobin.
  • the amount of haptoglobin mixed with the specimen may be an excess amount relative to the free hemoglobin in the specimen.
  • Step (2) In the step (2), the sample obtained in the step (1) is brought into contact with an insoluble carrier carrying an anti-hemoglobin antibody and an insoluble carrier carrying an anti-haptoglobin antibody to cause an immunoagglutination reaction.
  • the anti-hemoglobin antibody recognizes hemoglobin in the sample, whereby the insoluble carrier carrying the anti-hemoglobin antibody binds to hemoglobin or the hemoglobin-haptoglobin complex, and the insoluble carriers aggregate. Since the turbidity of the solution changes due to the aggregation of the insoluble carrier, the change in the turbidity of the solution is measured, and the hemoglobin concentration in the sample is determined by a calibration curve prepared using hemoglobin having a known hemoglobin concentration or a hemoglobin-haptoglobin complex. You can ask.
  • a method of measuring the change in turbidity includes a method of measuring the absorbance, scattered light, and the like of the immunoreaction solution by an optical method.
  • the optical method for example, a general-purpose optical measuring device may be used.
  • a biochemical automatic analyzer “JCA-BM2250” manufactured by JEOL Ltd.
  • JCA-BM6070 JEOL Ltd.
  • the measurement method of the present invention in addition to the insoluble carrier carrying the conventional anti-hemoglobin antibody, by contacting the sample also the insoluble carrier carrying the anti-haptoglobin antibody, the measurement value of the hemoglobin due to the addition of the conventional haptoglobin The decrease can be suppressed, and hemoglobin in the sample can be detected and measured more accurately.
  • haptoglobin is not added when measuring hemoglobin in a sample (that is, when step (1) is not performed)
  • haptoglobin free haptoglobin, hemoglobin-haptoglobin complex intermediate, complete hemoglobin
  • the specimen is brought into contact with an insoluble carrier carrying an anti-hemoglobin antibody and an insoluble carrier carrying an anti-haptoglobin antibody to allow immunoaggregation (ie, step (2) ) Only), it is possible to accurately detect and measure hemoglobin in the sample while suppressing a decrease in the measured value of hemoglobin.
  • the present invention further provides a kit that can be used when detecting hemoglobin in a sample by the above method.
  • the kit may include components such as a measurement reagent containing an insoluble carrier carrying an anti-hemoglobin antibody and an insoluble carrier carrying an anti-haptoglobin antibody, haptoglobin (preferably, a storage solution containing haptoglobin), a calibrator, and a control. And a storage solution for storing a sample.
  • Example 1 By mixing at the concentrations shown in Table 1, the reagents for measuring the immunoagglutination reaction of Examples 1-1 to 1-4 and Comparative Example 1 having the final latex concentrations shown in Table 1 were prepared. Similarly, as the second reagent, Examples 2-1 to 2-3, Examples 3-1 to 3-3, and Example 4 having the final latex concentration shown in Table 2 mixed at a predetermined concentration Reagents for measuring the immunoagglutination reaction of -1 to 4-2 were prepared.
  • a AO-53 ( ⁇ chain recognition), AO-27 ( ⁇ chain recognition), AO-35 ( ⁇ chain recognition), or AN12-8 ( ⁇ chain recognition) were used as anti-haptoglobin monoclonal antibodies.
  • the anti-haptoglobin antibody used was confirmed to be free from aggregation with the insoluble carrier carrying the anti-haptoglobin antibody in the amount of free haptoglobin added in the item [Preparation of sample] below.
  • the antibody-loaded polystyrene latex was prepared by a known method. That is, each anti-hemoglobin monoclonal antibody or anti-haptoglobin monoclonal antibody was mixed with polystyrene latex particles (average particle size: 200 nm) to prepare an anti-hemoglobin monoclonal antibody or anti-haptoglobin monoclonal antibody on the polystyrene latex particle surface.
  • JCA-BM2250 The measurement conditions in JCA-BM2250 are as follows. Sample volume: 2.0 ⁇ L First reagent: 60 ⁇ L Second reagent: 30 ⁇ L Measurement wavelength: 658 nm
  • Example 1-1 a reagent was prepared by mixing a free anti-haptoglobin antibody not supported on the latex with an anti-hemoglobin antibody-carrying latex. Agglomeration reaction was similarly caused by adding to samples 0 to 6, and the converted value of hemoglobin concentration and the relative value (%) of hemoglobin were calculated.
  • Table 4 shows the composition of the reagent of each comparative example, and Table 5 shows the results.
  • the anti-haptoglobin antibodies AN11-2 and AN12-3 are ⁇ -chain-recognizing anti-haptoglobin monoclonal antibodies, and were prepared by a known method.
  • the reagents for measuring the immunoagglutination reaction of Examples 5-1 to 5-5 and Comparative Example 8 having the final latex concentrations shown in Table 6 were prepared.
  • AO-53 (recognition of ⁇ chain) or AN12-8 (recognition of ⁇ chain) was used as an anti-haptoglobin monoclonal antibody.
  • the anti-haptoglobin antibody used was confirmed to be free from aggregation with the insoluble carrier carrying the anti-haptoglobin antibody in the amount of free haptoglobin added in the item of [Sample preparation] below.
  • the confirmation method was that a polystyrene latex 1.0 mg / mL carrying AO-53 ( ⁇ chain recognition) or AN12-8 ( ⁇ chain recognition) was used as the second reagent, and 0 ng of free haptoglobin was used as a sample.
  • / ML or 24.5 pmol / mL except that a solution (without hemoglobin) added to a stock solution (Hb calibrator diluent 'Eiken' (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.)) was used. It carried out similarly to the sample preparation and the immunoaggregation method described later.
  • the haptoglobin concentration of 24.5 pmol / mL corresponds to a free haptoglobin concentration of 1.2 units / L.
  • the antibody-loaded polystyrene latex was prepared by a known method. That is, each anti-hemoglobin monoclonal antibody or anti-haptoglobin monoclonal antibody was mixed with polystyrene latex particles (average particle size: 200 nm) to prepare an anti-hemoglobin monoclonal antibody or anti-haptoglobin monoclonal antibody on the polystyrene latex particle surface.
  • sample preparation Two stool samples (stool samples 1 and 2) were collected from healthy subjects. Each stool specimen was prepared so that the stool concentration was 0.5% (W / V%), and human hemoglobin (hHb) and human haptoglobin (hHp) (Haptoglobin Human, Phenotype) purified from human blood. 1-1 (manufactured by SIGMA)) was mixed in a storage solution (Hb calibrator diluent 'Eiken' (manufactured by Eiken Chemical Co., Ltd.)) so as to have the concentrations shown in Tables 7 and 8. 0-5 samples were prepared. No. No. 3 is a mixture of human hemoglobin (600 ⁇ g / L) and human haptoglobin (0.6 unit / L), and hemoglobin and haptoglobin all form a complete hemoglobin-haptoglobin complex.
  • JCA-BM6070 The measurement conditions in JCA-BM6070 are as follows. Sample volume: 2.0 ⁇ L First reagent: 60 ⁇ L Second reagent: 30 ⁇ L Measurement wavelength: 658 nm

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Abstract

本発明の課題はハプトグロビンの添加に起因するヘモグロビンの測定値の低下を抑制して、ヘモグロビンの量をより正確に測定できるヘモグロビンの測定試薬及び測定方法を提供することである。本発明のヘモグロビンを測定するための試薬は、抗ヘモグロビン抗体を担持する不溶性担体と、抗ハプトグロビン抗体を担持する不溶性担体とを含む。本発明の検体中のヘモグロビンを測定するための方法は、（１）検体とハプトグロビンとを混合し、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を形成させ、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を含む試料を得る工程と、（２）工程（１）で得られた試料と、抗ヘモグロビン抗体を担持する不溶性担体、及び抗ハプトグロビン抗体を担持する不溶性担体とを接触させ、免疫凝集させる工程と、を含む。

Description

ヘモグロビンの測定試薬、測定キット及び測定方法
　本発明は、ヘモグロビンの測定試薬及び測定方法に関する。
　糞便、尿、唾液等の検体に含まれる血液の検出は、多くの疾患の診断に有用である。例えば、糞便中の血液を検出する便潜血検査は、大腸癌の検診に利用されている。潜血を検出する方法として、糞便等の検体中の潜血に含まれるヘモグロビンを、抗ヘモグロビン抗体を用いて検出する免疫学的手法が知られている。
　潜血検査に供される検体は、通常、被験者によって保存溶液の入った容器に採取され、病院等の検査機関に送られる。多くの場合、検体を含有する保存溶液は、実際に検査に供されるまで数日間保管され、その間、高温下に置かれることも度々ある。ヘモグロビンは溶液中で不安定であり、高温条件下では特に変性又は分解しやすい。ヘモグロビンが変性又は分解することによりエピトープ又はその周辺部位の構造が変化すると、抗体がヘモグロビンを認識できなくなり、よって、免疫学的手法によるヘモグロビンの検出の正確性が低下する。
　それゆえ、ヘモグロビンを安定化するために、検体の保存溶液にハプトグロビンを添加する方法が用いられている（例えば、特許文献１）。ハプトグロビンは、幅広い動物の血液中に存在し、赤血球の溶血によって血液中に放出されたヘモグロビンを回収する役割を担うタンパク質である。ハプトグロビンはヘモグロビンと速やかに不可逆的に結合し、安定なヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を形成することが知られている。保存溶液等にあらかじめハプトグロビンを添加しておくことで、検体を保存溶液等に加えた際に、検体に含まれるヘモグロビンは、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を形成することで安定化される。
　しかしながら、ハプトグロビンを添加する場合、特に検体中の遊離ヘモグロビンに対してハプトグロビンを過剰量で添加すると、ヘモグロビンの測定値の低下が認められることがある（特許文献１）。
特開平１０－１３２８２４公報
　本発明は、ハプトグロビンの添加に起因するヘモグロビンの測定値の低下を抑制して、ヘモグロビンの量をより正確に測定できるヘモグロビンの測定試薬及び測定方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記従来技術の課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、抗ヘモグロビン抗体が結合している不溶性担体と、抗ハプトグロビン抗体が結合している不溶性担体とを共存させることで、ハプトグロビンの添加に起因するヘモグロビンの測定値の低下を抑制でき、ヘモグロビンの量をより正確に測定できることを見出し、本発明の完成に至った。
　すなわち、本発明は、例えば、以下の各発明に関する。
［１］　抗ヘモグロビン抗体を担持する不溶性担体と、抗ハプトグロビン抗体を担持する不溶性担体とを含む、ヘモグロビンを測定するための試薬。
［２］　抗ヘモグロビン抗体が少なくとも２種である、［１］の試薬。
［３］　不溶性担体がラテックス粒子及び／又は金コロイド粒子である、［１］又は［２］のいずれかの試薬。
［４］　抗ヘモグロビン抗体及び抗ハプトグロビン抗体がモノクローナル抗体である、［１］～［３］のいずれかの試薬。
［５］　抗ハプトグロビン抗体が１種である、［１］～［４］のいずれかの試薬。
［６］　検体中のヘモグロビンを測定するための方法であって、
　（１）検体とハプトグロビンとを混合し、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を形成させ、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を含む試料を得る工程と、
　（２）工程（１）で得られた試料と、抗ヘモグロビン抗体を担持する不溶性担体、及び抗ハプトグロビン抗体を担持する不溶性担体とを接触させ、免疫凝集させる工程と、
を含むヘモグロビンの測定方法。
［７］　抗ヘモグロビン抗体が少なくとも２種である、［６］の測定方法。
［８］　不溶性担体がラテックス粒子及び／又は金コロイド粒子である、［６］又は［７］の測定方法。
［９］　抗ヘモグロビン抗体及び抗ハプトグロビン抗体がモノクローナル抗体である、［６］～［８］のいずれかの測定方法。
［１０］　検体が糞便、唾液、又は尿である、［６］～［９］のいずれかの測定方法。
［１１］　ハプトグロビンが検体保存用溶液に含まれる、［６］～［１０］のいずれかの測定方法。
［１２］　検体保存用溶液におけるハプトグロビン濃度が０．０５単位／Ｌ～５０単位／Ｌである、［１１］の測定方法。
［１３］　検体中のヘモグロビンが、遊離ヘモグロビン、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体中間体、及び完全ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体からなる群から選ばれる少なくとも一つを含み、上記遊離ヘモグロビンの少なくとも一部は、工程（１）の後に、上記ハプトグロビンと、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体中間体及び／又は完全ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を形成する、［６］～［１２］のいずれかの測定方法。
［１４］　検体と、抗ヘモグロビン抗体を担持する不溶性担体、及び抗ハプトグロビン抗体を担持する不溶性担体とを接触させ、免疫凝集させる工程を含む、検体中のヘモグロビンを測定するための方法。
［１５］　検体と、抗ヘモグロビン抗体を担持する不溶性担体、及び抗ハプトグロビン抗体を担持する不溶性担体とを接触させ、免疫凝集させる工程を含む、検体中のヘモグロビンの測定値の低下を抑制する方法。
［１６］　検体中のヘモグロビンを測定するためのキットであって、抗ヘモグロビン抗体を担持する不溶性担体と、抗ハプトグロビン抗体を担持する不溶性担体と、ハプトグロビンとを含む、キット。
［１７］　［１］～［５］のいずれかの試薬と、ハプトグロビンとを含む、検体中のヘモグロビンを測定するためのキット。
　本発明によれば、ヘモグロビンの量をより正確に測定できる測定試薬及び測定方法が提供される。
＜定義＞
［ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体］
　ヘモグロビンは、赤血球の中に存在するタンパク質であり、αサブユニット（又はα鎖）とβサブユニット（又はβ鎖）と呼ばれる２種類のサブユニットそれぞれ２つから構成される四量体構造［α２β２］を有している。ハプトグロビンは、血漿中に存在し、血中に遊離したヘモグロビンと結合するタンパク質であり、３つの型の構造を有する。例えば、１－１型ハプトグロビンは、αサブユニット（又はα鎖）とβサブユニット（又はβ鎖）と呼ばれる２種類のサブユニットそれぞれ２つから構成される四量体構造［α２β２］を有する。
　ヘモグロビンとハプトグロビンとは安定な複合体を形成する。通常ハプトグロビン１分子に対して、ヘモグロビン１分子が結合している。このような複合体は、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体と呼ばれており、本明細書では完全ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体ともいう。
　一方、ハプトグロビンに対してヘモグロビンのモル比（ヘモグロビン：ハプトグロビン）が１未満となる場合、すなわち、ヘモグロビンに対してハプトグロビンが過剰量に存在する場合、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体中間体（intermediate）と呼ばれる複合体が形成される傾向にある（J. V. PASTEWKA et al.,Biochimica et Biophysica Acta, 386 (1975) 530-537）。ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体中間体を形成する際、１分子の四量体ヘモグロビン［α２β２］は、２分子の二量体（αβ）へと解離して、それぞれのαβ二量体がハプトグロビン１分子と結合すると考えられている。すなわち、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体中間体は、１分子のハプトグロビン［α２β２］に１／２分子のヘモグロビン（αβ）が結合している複合体であると考えられている。
　本明細書において、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体は、特に明記しない限り、完全ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体とヘモグロビン－ハプトグロビン複合体中間体との両方を含む。
［検体］
　本明細書における検体は、ヘモグロビンを含む又は含む可能性のある、被検対象から採取した生体サンプルである。検体は、糞便、唾液、又は尿であってよく、特に糞便であることが好ましい。また、全血、血清、血漿等を検体とすることもでき、これらのヘモグロビン量を測定することは、例えば、溶血やハプトグロビン製剤を用いた治療の指標として有用となりうる。
［試料］
　本明細書における試料は、検体を含むものであり、特に検体とハプトグロビンとを混合して得られたものである。検体中の遊離ヘモグロビンは、ハプトグロビンと混合することで、安定なヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を形成する。
　すなわち、試料中において、ハプトグロビンと複合体を形成していない遊離ヘモグロビン、検体中に元々存在していたヘモグロビン－ハプトグロビン複合体（検体由来のヘモグロビン－ハプトグロビン複合体）、及び／又はハプトグロビンの添加によって形成されたヘモグロビン－ハプトグロビン複合体（調製ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体）が含まれ得る。
　特に、安定性の点から、検体とハプトグロビンを混合した試料中において、全ての遊離ヘモグロビンがハプトグロビンと複合体を形成して調製ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を形成していることが好ましく、試料は、検体由来のヘモグロビン－ハプトグロビン複合体及び調製ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体からなることが好ましい。
　試料は、例えば、被検者等が検体を採取してから、速やかにハプトグロビンを含有する検体保存用溶液（以下、場合によって「保存溶液」という）中に検体を添加することによって得られる。試料は、ヘモグロビンの測定までは常温で数日間保存してもよく、２～１０℃で冷蔵保存されることが好ましい。検体が固形物を含む糞便等である場合、保存溶液をろ過して固形物を除去したものを試料とするようにしてもよい。
［保存溶液］
　保存溶液は、検体を保存するための検体保存用溶液を意味し、ハプトグロビンを含むものであることが好ましい。
　保存溶液は、さらに緩衝液等を含むことが好ましい。緩衝液等としては、２－モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］－エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、ピペラジン－１，４－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）等のグッド緩衝剤を含む緩衝液であってよく、リン酸緩衝液、トリス緩衝液又はグリシン緩衝液であってもよい。保存溶液のｐＨは、５～１０であってよく、６～８であってよい。
　保存溶液中のハプトグロビンの濃度は、検体の種類及び量にもよるが、例えば、０．０５単位／Ｌ～５０単位／Ｌ、０．１単位／Ｌ～１０単位／Ｌ、又は、０．２単位／Ｌ～２単位／Ｌである。ここで、１単位は、１ｍｇのヘモグロビンに結合するハプトグロビン量を意味する。上記範囲のハプトグロビン濃度は、検体中の全てのヘモグロビンを、ハプトグロビンと複合体を形成させるのに十分な濃度である。
　例えば、保存溶液０．２～２０ｍＬに対して、糞便の濃度が０．０５％～２５％（Ｗ／Ｖ％）となるよう懸濁する場合、検体対ハプトグロビンの量比は０．０７５ｇ／単位～５０００ｇ／単位としてもよい。
　本発明におけるハプトグロビンは、測定対象であるヘモグロビンと複合化してヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を生成するものであれば特に限定されない。ヘモグロビンとハプトグロビンの結合は、種特異性が小さいので幅広いハプトグロビンを利用することができる。ヒト・ヘモグロビンを測定対象としているときには、ヒトをはじめとして、ウマ、ブタ、サル、イヌ、ウサギ、ラット等に由来するハプトグロビンを利用できる。ハプトグロビンは必ずしも高度に精製された状態のものを用いる必要はない。
　保存溶液には、アジ化ナトリウム（ＮａＮ３）等の抗菌剤、ｐＨ調整剤、イオン強度を調節するための塩等、ヘモグロビンの保存時に使用され得る公知の添加剤をさらに添加してもよい。抗菌剤は、抗生物質及び溶菌酵素を含む。添加剤の例には、リジン、ヒスチジン等のアミノ酸、アルブミン、タンパク質分解酵素阻害剤、遷移金属イオンの水溶性錯体、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等、ヘモグロビンを安定化する作用があることが知られる公知の成分も含まれる。アルブミンの例には、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等の血清アルブミン、及び卵白に由来するアルブミン（オボアルブミン）が含まれる。
＜ヘモグロビンの測定試薬＞
　本発明の一実施形態のヘモグロビンの測定試薬は、抗ヘモグロビン抗体を担持する不溶性担体と、抗ハプトグロビン抗体を担持する不溶性担体とを含む。本発明の試薬が用いられる測定法としては免疫学的手法が用いられ、免疫学的手法としては、抗ヘモグロビン抗体を利用する公知の免疫学的手法であってよく、例えば、免疫凝集法（例えば、ラテックス凝集法、又は金コロイド凝集法）、イムノクロマトグラフ法、ＥＬＩＳＡ法が挙げられる。本発明の試薬は特に免疫凝集法、より好ましくはラテックス凝集法に好適に用いられる。
　本発明の一実施形態のヘモグロビンの測定試薬は、測定時に遊離ヘモグロビン及びヘモグロビン－ハプトグロビン複合体の両方を測定対象として、ヘモグロビンの総量を測定する。本発明の試薬は、免疫学的測定法（特に免疫凝集法）において、遊離ヘモグロビン、完全ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体、及びヘモグロビン－ハプトグロビン複合体中間体の各抗原に対し、ヘモグロビンとしてほぼ同等の反応性を示す。特に、不溶性担体に結合した抗ハプトグロビン抗体を共存させることで、完全ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体とヘモグロビン－ハプトグロビン複合体中間体の両抗原に対し、ヘモグロビンとして同等の反応性（「ヘモグロビンに対する同値反応性」）を示すという優れた効果を奏する。
　なお、「ヘモグロビンとして同等の反応性」とは、試料中にヘモグロビンとして同濃度の、遊離ヘモグロビン、完全ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体中間体又はこれらの混合物の各抗原が存在する場合、不溶性担体の免疫凝集反応により測定されるヘモグロビン濃度が、各抗原において実質的に等しくなることをいう。ここで、不溶性担体の免疫凝集反応により測定されるヘモグロビン濃度が「実質的に等しい」とは、遊離ヘモグロビンの測定値を１００％とした場合、ヘモグロビンとして同濃度であるその他の各種抗原を測定した際のヘモグロビン濃度の測定値の下限が８０％以上であり、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上であり、また、測定値の上限値は１２０％以下であり、好ましくは１１０％以下であり、より好ましくは１０５％以下であることを意味する。
　本発明の試薬は、従来の抗ヘモグロビン抗体を担持する不溶性担体に加えて、抗ハプトグロビン抗体を担持する不溶性担体も含むことにより、従来のハプトグロビンの添加に起因するヘモグロビンの測定値の低下を抑制できる。特に、添加するハプトグロビンと検体中の遊離ヘモグロビンのモル比（ヘモグロビン／ハプトグロビン）が１未満となる場合、すなわち、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体中間体が存在する場合であっても、ヘモグロビンの測定値の低下を抑制して、検体中のヘモグロビンを正確に検出、測定できる。さらに、検体にハプトグロビンを添加しない場合において、検体中に元々ハプトグロビン（遊離ハプトグロビン、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体中間体、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を問わず）が存在していても、ヘモグロビンの測定値の低下を抑制して、検体中のヘモグロビンを正確に検出、測定できる。
　本発明者らは、従来のハプトグロビンの添加に起因するヘモグロビンの測定値の低下は、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体中間体の存在が一因であると考え、抗ハプトグロビン抗体を担持する不溶性担体の添加でこの問題を解決した。
　不溶性担体としては、抗ヘモグロビン抗体又は抗ハプトグロビン抗体を担持できるものであればよく、免疫学的手法に使用できる不溶性粒子が好ましく、一般的に使用される金コロイド粒子等の金属コロイド粒子、ラテックス粒子、シリカ粒子、磁性粒子、蛍光粒子、赤血球等が挙げられるが、これらに限定されることはない。不溶性粒子としては、ラテックス粒子が好ましく、ポリスチレン系ラテックス粒子がさらに好ましい。不溶性担体は、好ましくは粒子状であり、その平均粒子径としては５～１０００ｎｍが好ましく、３０～５００ｎｍがより好ましく、７５～３５０ｎｍがさらに好ましいが、特にこの範囲に捉われることなく、使用することが可能である。
　抗体を担持しているとは、抗体が不溶性担体の表面に物理吸着又は化学結合していることによって固定化されることをいう。担持方法（固定化方法）としては、例えば、公知の技術である、抗体と不溶性担体粒子とを混合して、不溶性担体粒子の表面に抗体を物理的に吸着させることにより不溶性担体粒子への抗体の固定化が可能である。また、表面にアミノ基やカルボキシル基を導入した不溶性担体粒子を用いる場合には、グルタルアルデヒドやカルボキシイミド試薬を用いた化学結合によって不溶性担体粒子の表面への抗体の固定化が可能である。
　抗体の担持量は、特に限定されないが、０．５～２０００μｇ／ｍｇラテックスであればよく、１～１０００μｇ／ｍｇラテックス、又は２～５００μｇ／ｍｇラテックスであってもよい。抗体の担持量は、不溶性担体に固定化する前の抗体量から固定化した後の抗体量を引いた量で算出することができる。
　抗ヘモグロビン抗体は、特に限定されないが、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体におけるヘモグロビンのエピトープを認識することができ、かつ、ハプトグロビンと交差反応を起こさないことが好ましい。ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であってもよいが、特異性の点からモノクローナル抗体であることが好ましく、抗ヒト・ヘモグロビンモノクローナル抗体であることが好ましい。測定試薬に含まれる抗ヘモグロビン抗体は少なくとも１種、好ましくは少なくとも２種である。
　一方、抗ハプトグロビン抗体は、特に限定されないが、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体におけるハプトグロビンのエピトープを認識することができ、かつ、ヘモグロビンと交差反応を起こさないことが好ましい。特に、抗ハプトグロビン抗体は、少なくとも遊離のヘモグロビンがヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を形成するために用いられる遊離のハプトグロビンの添加量の範囲で、遊離のハプトグロビンと抗ハプトグロビン抗体を担持した不溶性担体において凝集しないものが好ましい。さらに、抗ハプトグロビン抗体は、遊離のハプトグロビンと抗ハプトグロビン抗体を担持した不溶性担体において凝集しないものがより好ましい。抗ハプトグロビン抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体であることが好ましく、抗ハプトグロビンモノクローナル抗体であることが好ましい。抗ハプトグロビン抗体がモノクローナル抗体である場合、その認識部位はハプトグロビンのα鎖（α鎖認識抗体）又はβ鎖（β鎖認識抗体）であってよい。測定試薬に含まれる抗ハプトグロビン抗体は、少なくとも１種である。
　本発明で使用できる上記抗体としては、由来する動物種は特に限定されず、例えば、ウサギ、ヤギ、マウス、ラット、ウマ、ヒツジ等の動物に由来する抗体が挙げられ、公知の方法により、測定対象物を免疫した動物の血清から得られるポリクローナル、測定対象物を免疫した動物の脾臓をミエローマ細胞と細胞融合して得られるモノクローナル抗体のいずれを用いてもよい。また、それらの断片［例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖ］を用いることができる。
　抗ヘモグロビン抗体を担持するために用いられる不溶性担体は、少なくとも１種であるが、少なくとも２種であってもよい。１種の不溶性担体には１種又は２種以上の抗ヘモグロビン抗体が担持されていてもよい。また、１種の抗ヘモグロビン抗体が、１種又は２種以上の不溶性担体に担持されていてもよい。
　測定試薬に２種以上の抗ヘモグロビン抗体が含まれる場合、２種以上の抗ヘモグロビン抗体が共に同じ不溶性担体に担持されてもよい。あるいは、１種の不溶性担体に１種の抗ヘモグロビン抗体を担持させた不溶性担体を複数種混合して用いることもできる。このとき、異なる種の抗ヘモグロビン抗体を担持するために用いられる不溶性担体は、同種の不溶性担体であってもよく、材質又は粒径等が異なる異種の不溶性担体であってもよい。
　抗ハプトグロビン抗体を担持するために用いられる不溶性担体は、少なくとも１種であるが、少なくとも２種であってもよい。１種の不溶性担体には１種又は２種以上の抗ハプトグロビン抗体が担持されていてもよい。また、１種の抗ハプトグロビン抗体が、１種又は２種以上の不溶性担体に担持されていてもよい。測定試薬に２種以上の抗ハプトグロビン抗体が含まれる場合は、上述の測定試薬に２種以上の抗ヘモグロビン抗体が含まれる場合と同様である。
　測定試薬の形態は特に限定されず、例えば、不溶性担体を含有しない試薬（第１試薬）及び抗体を担持する不溶性担体（抗体担持不溶性担体）を含有する試薬（第２試薬）の二試薬系で構成されてもよく、抗体担持不溶性担体を含有する試薬のみの一試薬系で構成されるようにしてもよい。
　第１試薬は反応系における、測定対象物や夾雑物の濃度の調整や反応速度の調整等の点から希釈液として用いるなど、測定環境を調整するよう用いることができる。第２試薬は、抗体担持不溶性担体を含有しており、第１試薬及び試料と混合されて、免疫凝集反応を生じる。第１試薬及び第２試薬は、ｐＨ緩衝剤、塩、界面活性剤、凝集促進剤、防腐剤などを、適宜含むことができる。凝集反応時のｐＨとしては５～９が好ましい。
　また、測定試薬は保存溶液と混合して反応液を得るが、不溶性担体の反応液中の濃度は、使用する不溶性担体の粒径や測定系全体の設計にあわせ、例えば０．０００１ｍｇ／ｍＬ～１０ｍｇ／ｍＬの範囲から適宜選択をすることができる。測定試薬における抗ヘモグロビン抗体を担持する不溶性担体の濃度は、０．０１～２０ｍｇ／ｍＬ、又は０．０５～１ｍｇ／ｍＬであってよく、抗ハプトグロビン抗体を担持する不溶性担体の濃度は、０．０１～２０ｍｇ／ｍＬ、又は０．０５～１ｍｇ／ｍＬであってよい。
　なお、不溶性担体の第二試薬中の濃度は、使用時には保存溶液と混合することにより、又は、第一試薬と保存溶液と混合することにより希釈されるため、その第二試薬中の不溶性担体の濃度は、希釈倍率に応じて適宜選択することができ、例えば、２倍希釈して用いる場合は、０．００４ｍｇ／ｍＬ～８０ｍｇ／ｍＬ、３倍希釈して用いる場合は、０．０６ｍｇ／ｍＬ～１２０ｍｇ／ｍＬとなるように適宜調整することができる。
＜ヘモグロビンの測定方法＞
［工程（１）］
　工程（１）において、検体とハプトグロビンとを混合し、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を形成させ、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を含む試料を得る。
　検体とハプトグロビンとの混合は、上記［試料］の項目に記載のとおりである。ここで、試料中に含まれるヘモグロビン－ハプトグロビン複合体は、完全ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体及びヘモグロビン－ハプトグロビン複合体中間体の両方を含み得る。試料はまた、検体由来の遊離ヘモグロビン、検体由来のヘモグロビン－ハプトグロビン複合体、及び検体由来の他の成分を含み得、さらに、ヘモグロビンと複合体を形成しない遊離ハプトグロビンを含み得る。検体と混合するためのハプトグロビンは検体保存用溶液に含まれてもよく、ハプトグロビンが検体保存用溶液に含まれる形で添加される場合、試料はヘモグロビンと複合体を形成しない遊離ハプトグロビンのほか、保存溶液の他の成分も含み得る。検体由来の遊離ヘモグロビンが全てハプトグロビンと複合体を形成することが好ましいため、検体に混合するハプトグロビンの量が、検体中の遊離ヘモグロビンに対して過剰量であってよい。
［工程（２）］
　工程（２）において、工程（１）で得られた試料と、抗ヘモグロビン抗体を担持する不溶性担体、及び抗ハプトグロビン抗体を担持する不溶性担体とを接触させ、免疫凝集反応を生じさせる。
　上記接触によって、抗ヘモグロビン抗体が試料中のヘモグロビンを認識し、それによって抗ヘモグロビン抗体を担持する不溶性担体がヘモグロビン又はヘモグロビン－ハプトグロビン複合体に結合し、さらに不溶性担体同士が凝集する。不溶性担体の凝集により溶液の濁度が変化するため、溶液の濁度の変化を測定し、ヘモグロビン濃度既知のヘモグロビン又はヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を用いて作成した検量線により、試料中のヘモグロビン濃度を求めることができる。
　濁度の変化の測定は、免疫反応液の吸光度や散乱光等を光学的手法により測定する方法があげられる。光学的手法としては、例えば、汎用の光学的測定装置を用いてもよく、例えば、生化学自動分析装置「ＪＣＡ－ＢＭ２２５０」（日本電子株式会社製）又は「ＪＣＡ－ＢＭ６０７０」（日本電子株式会社製）を用いて測定することができる。
　本発明の測定方法は、従来の抗ヘモグロビン抗体を担持する不溶性担体に加えて、抗ハプトグロビン抗体を担持する不溶性担体も試料に接触させることにより、従来のハプトグロビンの添加に起因するヘモグロビンの測定値の低下を抑制でき、検体中のヘモグロビンをより正確に検出及び測定することができる。なお、検体中のヘモグロビンを測定する際にハプトグロビンを添加しない場合（すなわち、工程（１）が行われない場合）において、検体中に元々ハプトグロビン（遊離ハプトグロビン、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体中間体、完全ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を問わず）が存在していても、検体と、抗ヘモグロビン抗体を担持する不溶性担体、及び抗ハプトグロビン抗体を担持する不溶性担体とを接触させ、免疫凝集させる（すなわち、工程（２）のみ）ことで、ヘモグロビンの測定値の低下を抑制して、検体中のヘモグロビンを正確に検出、測定できる。
　本発明は、上記の方法により検体中のヘモグロビンを検出する際に、使用することのできるキットをさらに提供する。キットは、抗ヘモグロビン抗体担持不溶性担体及び抗ハプトグロビン抗体担持不溶性担体を含む測定試薬、ハプトグロビン（好ましくは、ハプトグロビンを含む保存溶液）、キャリブレータ、及びコントロールなどの構成を含んでもよく、また、検体を採取するための器具及び容器、検体を保存するための保存溶液などの構成を含んでいてもよい。
＜実施例１－１～４－２、比較例１＞
［測定試薬の調製］
　測定試薬として、第１試薬及び第２試薬を調製した。
　第１試薬として、５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を用いた。
　第２試薬として５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）と、複数種の抗ヘモグロビンモノクローナル抗体（抗Ｈｂ抗体）それぞれの抗体を担持する各ポリスチレンラテックス、及び抗ハプトグロビンモノクローナル抗体を担持するポリスチレンラテックスを、表１に示す濃度で混合して、表１に示す最終的なラテックス濃度を有する実施例１－１～１－４及び比較例１の免疫凝集反応測定用の試薬を調製した。同様に、第２試薬として、所定の濃度で混合し、表２に示す最終的なラテックス濃度を有する実施例２－１～２－３、実施例３－１～３－３、及び実施例４－１～４－２の免疫凝集反応測定用の試薬を調製した。
　抗ハプトグロビンモノクローナル抗体としてＡＯ－５３（α鎖認識）、ＡＯ－２７（α鎖認識）、ＡＯ－３５（α鎖認識）、若しくはＡＮ１２－８（β鎖認識）を使用した。抗ハプトグロビン抗体は、下記の［試料の調製］の項目において添加する量の遊離ハプトグロビンでは、抗ハプトグロビン抗体を担持した不溶性担体と凝集しないことを確認したものを用いた。
　抗体担持ポリスチレンラテックスは公知の方法により調製した。すなわち、各抗ヘモグロビンモノクローナル抗体又は抗ハプトグロビンモノクローナル抗体とポリスチレンラテックス粒子（平均粒径２００ｎｍ）を混合して、ポリスチレンラテックス粒子表面に抗ヘモグロビンモノクローナル抗体又は抗ハプトグロビンモノクローナル抗体を担持することにより調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
［試料の調製］
　ヒト血液から精製したヒト・ヘモグロビン（ｈＨｂ）、及びヒト・ハプトグロビン（ｈＨｐ）（Ｈａｐｔｏｇｌｏｂｉｎ　Ｈｕｍａｎ，　Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ　１－１（ＳＩＧＭＡ社製））をＨｂキャリブレータ希釈液‘栄研’（栄研化学株式会社製）中に、表３に示す濃度となるように混合し、Ｎｏ．０～６の試料を調製した。Ｎｏ．３は、ヒト・ヘモグロビン８００μｇ／Ｌに対してヒト・ハプトグロビン０．８単位／Ｌを混合しており、ヘモグロビンとハプトグロビンがすべて完全ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を形成している。
［免疫凝集］
　Ｎｏ．０～６の試料に、それぞれ実施例１－１～１－４、実施例２－１～２－３、実施例３－１～３－３、実施例４－１～４－２及び比較例１の測定試薬を添加し自動分析機ＢＭ２２５０を用いて濁度を測定し、あらかじめ作成した検量線に基づき、ヘモグロビンの濃度換算値を算出した。さらにＮｏ．０（ヒト・ハプトグロビンを含まない試料）に対するヘモグロビンの相対値（％）も算出した。結果を表３に示す。
　ＪＣＡ－ＢＭ２２５０における測定条件は次のとおりである。
　　検体量：２．０μＬ
　　第１試薬：６０μＬ
　　第２試薬：３０μＬ
　　測定波長：６５８ｎｍ
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３から、ヘモグロビンの測定に際してハプトグロビンを添加した場合において、抗ヘモグロビン抗体を担持するラテックスのみを添加し、抗ハプトグロビン抗体を担持するラテックスを添加しない比較例１と比べて、抗ヘモグロビン抗体を担持するラテックスとともに、抗ハプトグロビン抗体を担持するラテックスを添加する各実施例は、ハプトグロビン添加によるヘモグロビン測定値の低下を抑制できること、すなわち、実際の値により近い測定値が得られることを判明した。この結果は、使用したα鎖認識及びβ鎖認識のいずれの抗ハプトグロビン抗体においても得られたため、抗ハプトグロビン抗体が認識するサブユニットに依存しないことが証明された。
＜比較例２－１～２－３、３－１～３－３、４～７＞
　実施例１－１における抗ハプトグロビン抗体担持ラテックスの代わりに、ラテックスに担持されていない遊離の抗ハプトグロビン抗体を、抗ヘモグロビン抗体担持ラテックスと混合した試薬を調製し、Ｎｏ．０～６の試料に添加し、同様に凝集反応を生じさせ、ヘモグロビンの濃度換算値及びヘモグロビンの相対値（％）を算出した。各比較例の試薬の組成は表４に、結果は表５に示す。なお、抗ハプトグロビン抗体ＡＮ１１－２及びＡＮ１２－３はβ鎖認識抗ハプトグロビンモノクローナル抗体であり、公知の方法により作製した。
　表５から、ラテックスに結合されていない遊離の抗ハプトグロビン抗体を添加しても、ハプトグロビン添加によるヘモグロビン測定値の低下を抑制できなかった。むしろ、より低値となる傾向を示した。その原因は恐らく、過剰に存在する抗ハプトグロビン抗体によって、ラテックスに結合されている抗ヘモグロビン抗体とヘモグロビン－ハプトグロビン複合体との結合を阻害しているものと推測される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
＜実施例５－１～５－５、比較例８＞
　［測定試薬の調製］
　測定試薬として、第１試薬及び第２試薬を調製した。
　第１試薬として、５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を用いた。
　第２試薬として５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）と、複数種の抗ヘモグロビンモノクローナル抗体（抗Ｈｂ抗体）それぞれの抗体を担持する各ポリスチレンラテックス、及び抗ハプトグロビンモノクローナル抗体を担持するポリスチレンラテックスを、表６に示す濃度で混合して、表６に示す最終的なラテックス濃度を有する実施例５－１～５－５及び比較例８の免疫凝集反応測定用の試薬を調製した。
　抗ハプトグロビンモノクローナル抗体としてＡＯ－５３（α鎖認識）、若しくはＡＮ１２－８（β鎖認識）を使用した。抗ハプトグロビン抗体は、下記の[試料の調製]の項目において添加する量の遊離ハプトグロビンでは、抗ハプトグロビン抗体を担持した不溶性担体と凝集しないことを確認したものを用いた。
　確認の方法は、第２試薬として、ＡＯ－５３（α鎖認識）、若しくはＡＮ１２－８（β鎖認識）を担持したポリスチレンラテックス１．０ｍｇ／ｍＬを用いた点、試料として、遊離ハプトグロビンを０ｎｇ／ｍＬ若しくは２４．５ｐｍｏｌ／ｍＬとなるように保存溶液（Ｈｂキャリブレータ希釈液‘栄研’（栄研化学株式会社製））に添加したもの（ヘモグロビンを含まない）を用いた点を除いて、後述する試料の調製及び免疫凝集方法と同様に行った。なお、２４．５ｐｍｏｌ／ｍＬのハプトグロビン濃度は、１．２単位／Ｌの遊離ハプトグロビン添加濃度に相当する。
　抗体担持ポリスチレンラテックスは公知の方法により調製した。すなわち、各抗ヘモグロビンモノクローナル抗体又は抗ハプトグロビンモノクローナル抗体とポリスチレンラテックス粒子（平均粒径２００ｎｍ）を混合して、ポリスチレンラテックス粒子表面に抗ヘモグロビンモノクローナル抗体又は抗ハプトグロビンモノクローナル抗体を担持することにより調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
［試料の調製］
　健常者から糞便検体を２つ（糞便検体１及び２）採取した。それぞれの糞便検体を、糞便濃度が０．５％（Ｗ／Ｖ％）となるように、また、ヒト血液から精製したヒト・ヘモグロビン（ｈＨｂ）、及びヒト・ハプトグロビン（ｈＨｐ）（Ｈａｐｔｏｇｌｏｂｉｎ　Ｈｕｍａｎ，　Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ　１－１（ＳＩＧＭＡ社製））を、表７及び８に示す濃度となるように、保存溶液（Ｈｂキャリブレータ希釈液‘栄研’（栄研化学株式会社製））中に混合し、Ｎｏ．０～５の試料を調製した。Ｎｏ．３は、ヒト・ヘモグロビン６００μｇ／Ｌに対してヒト・ハプトグロビン０．６単位／Ｌを混合しており、ヘモグロビンとハプトグロビンがすべて完全ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を形成している。
［免疫凝集］
　糞便検体１及び２のそれぞれのＮｏ．０～５の試料に、それぞれ実施例５－１～５－５及び比較例８の測定試薬を添加し自動分析機ＪＣＡ－ＢＭ６０７０を用いて濁度を測定し、あらかじめ作成した検量線に基づき、ヘモグロビンの濃度換算値を算出した。さらにＮｏ．０（ヒト・ハプトグロビンを含まない試料）に対するヘモグロビンの相対値（％）も算出した。結果を表７及び８に示す。
　ＪＣＡ－ＢＭ６０７０における測定条件は次のとおりである。
　　検体量：２．０μＬ
　　第１試薬：６０μＬ
　　第２試薬：３０μＬ
　　測定波長：６５８ｎｍ
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008

Claims (15)

  1. 　抗ヘモグロビン抗体を担持する不溶性担体と、抗ハプトグロビン抗体を担持する不溶性担体とを含む、ヘモグロビンを測定するための試薬。
  2. 　抗ヘモグロビン抗体が少なくとも２種である、請求項１に記載の試薬。
  3. 　不溶性担体がラテックス粒子及び／又は金コロイド粒子である、請求項１又は２に記載の試薬。
  4. 　抗ヘモグロビン抗体及び抗ハプトグロビン抗体がモノクローナル抗体である、請求項１～３のいずれか一項に記載の試薬。
  5. 　抗ハプトグロビン抗体が１種である、請求項１～４のいずれか一項に記載の試薬。
  6. 　検体中のヘモグロビンを測定するための方法であって、
    　（１）検体とハプトグロビンとを混合し、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を形成させ、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を含む試料を得る工程と、
    　（２）工程（１）で得られた試料と、抗ヘモグロビン抗体を担持する不溶性担体、及び抗ハプトグロビン抗体を担持する不溶性担体とを接触させ、免疫凝集させる工程と
    を含むヘモグロビンの測定方法。
  7. 　抗ヘモグロビン抗体が少なくとも２種である、請求項６に記載の測定方法。
  8. 　不溶性担体がラテックス粒子及び／又は金コロイド粒子である、請求項６又は７に記載の測定方法。
  9. 　抗ヘモグロビン抗体及び抗ハプトグロビン抗体がモノクローナル抗体である、請求項６～８のいずれか一項に記載の測定方法。
  10. 　検体が糞便、唾液、又は尿である、請求項６～９のいずれか一項に記載の測定方法。
  11. 　ハプトグロビンが検体保存用溶液に含まれる、請求項６～１０のいずれか一項に記載の測定方法。
  12. 　検体保存用溶液におけるハプトグロビン濃度が０．０５単位／Ｌ～５０単位／Ｌである、請求項１１に記載の測定方法。
  13. 　検体中のヘモグロビンが、遊離ヘモグロビン、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体中間体、及び完全ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体からなる群から選ばれる少なくとも一つを含み、前記遊離ヘモグロビンの少なくとも一部は、工程（１）の後に、前記ハプトグロビンと、ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体中間体及び／又は完全ヘモグロビン－ハプトグロビン複合体を形成する、請求項６～１２のいずれか一項に記載の測定方法。
  14. 　検体と、抗ヘモグロビン抗体を担持する不溶性担体、及び抗ハプトグロビン抗体を担持する不溶性担体とを接触させ、免疫凝集させる工程を含む、検体中のヘモグロビンを測定するための方法。
  15. 　検体と、抗ヘモグロビン抗体を担持する不溶性担体、及び抗ハプトグロビン抗体を担持する不溶性担体とを接触させ、免疫凝集させる工程を含む、検体中のヘモグロビンの測定値の低下を抑制する方法。
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