JPH03272698A - 遊離ヘモグロビンの測定法及びそれに用いる遊離ヘモグロビン測定用試薬キット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は遊離ヘモグロビンの測定法及びそれに用いる遊
離ヘモグロビン測定用試薬キットに関する。更に詳細に
は、臨床検査領域等で用いられ、遊離ヘモグロビンを、
簡便且つ迅速に測定することができる遊離ヘモグロビン
の測定法及びそれに用いる遊離ヘモグロビン測定用試薬
キットに関する。

［従来の技術］ 大量輸血、体外循環、血液透析、臓器潅流などでは、し
ばしば高度溶血を起こすために溶血性腎障害をはじめ種
々の合併症が懸念される。その病因となるヘモグロビン
はハプトグロビンと結合していない遊離ヘモグロビンと
いわれており、臨床的には血漿及び血清中のヘモグロビ
ンはハプトグロビン結合型ヘモグロビンと遊離ヘモグロ
ビンに分けて測定することが必要となっている。

このように、血漿、血清等に含まれる遊離ヘモグロビン
の測定は臨床上重要な意義を有し、その測定方法として
は、セルロースアセテート膜電気泳動法による方法や、
簡易分別定量法による方法、遊離ヘモグロビン吸着定量
法（カラム法）が従来から知られている。

上記のセルロースアセテート膜電気泳動法による遊離ヘ
モグロビンの測定は、まずシアンメトヘモグロビン法で
検体（血漿及び血清）中の総ヘモグロビン量を定量する
。次に同一検体につき、セルロースアセテート膜電気泳
動法で遊離ヘモグロビン、ハプトグロビン−ヘモグロビ
ン複合体、メトヘモアルブミン（アルブミン結合型ヘモ
グロビン）画分に９雌し、ペルオキシダーゼ反応により
ヘモグロビンを染色した後、各画分における染色度をデ
ンシトメーターでスキャンニングし、総ヘモグロビン（
遊離ヘモグロビン＋ハプトグロビン−ヘモグロビン複合
体子メトヘモアルブミン）量に対する遊離ヘモグロビン
量の比率を求める。求めた比率を予めシアンメトヘモグ
ロビン法で定量した総ヘモグロビン量に乗じて検体中の
遊離ヘモグロビン量が算出される。

聞易分別定量法による遊離ヘモグロビンの測定は、シア
ンメトヘモグロビン法による総ヘモグロビンの定量と一
元免疫拡散法（Ｍａｎｃｉｎｉ法）による総ハプトグロ
ビンの定量を行ない、ｌ＼ブトグロビン−ヘモグロビン
との結合比を用いて、遊離ヘモグロビン量を算出するも
のである。なお、−元免疫拡散法で総ハプトグロビンを
定量するに当たっては、予め、澱粉ゲル電気泳動法又は
免疫電気泳動法もしくはアクリルアミドゲル電気泳動法
でハプトグロビンの血清型を識別しておき、血清型別に
作成した標準曲線を用いるか、又はプール血清を用いて
作成した標準曲線を用いる場合は標準曲線から求めた測
定値にハプトグロビンの血清型別の係数を乗じて定量値
としなければならない。

また、遊離ヘモグロビン吸着定量法による遊離ヘモグロ
ビンの測定は、ハプトグロビン固定化セファロースを均
一に充填した円筒状カラムに一定量の検体（血漿又は血
清）を注入し、約３倍〜１０倍量の生理食塩水で洗浄し
た後、ｌ＼ブトグロビン固定化セファロースに吸着した
遊離ヘモグロビンによる着色部分の長さを計測すること
により遊離ヘモグロビン量を求めるものである。

［発明が解決しようとする課題］ 上記の従来技術において、セルロースアセテート膜電気
泳動法による方法は、総ヘモグロビン量に分画比を乗じ
て、間接的に遊離ヘモグロビン量を求める方法であるた
め、測定操作が煩雑で長時間を要すると共に総ヘモグロ
ビンの定量限界及びセルロースアセテート膜電気泳動法
の検出限界以下の遊離ヘモグロビンについては測定でき
ないという問題がある。

簡易分別定量法による測定方法では、総ヘモグロビン量
と総ハプトグロビン量から間接的に遊離ヘモグロビン量
を求める方法であるため、総ヘモグロビンの定量限界以
下の遊離ヘモグロビンについては測定できない。更に総
ハプトグロビンの定量限界以下のハプトグロビン量と結
合したヘモグロビンは結果的に遊離ヘモグロビンとして
算出されるという問題がある。

遊離ヘモグロビン吸着定量法による測定方法では、ハプ
トグロビン固定化セファロースを充填したカラムに一定
量の検体（血清又は血漿）を注入し、ハプトグロビン固
定化セファロースに吸着した遊離ヘモグロビンによって
着色したカラムの着色層の長さを計測することによって
検体中の遊離ヘモグロビン量を求める方法であるため、
カラム内のハプトグロビン固定化セファロースの均一性
、検体の注入方法、洗浄方法等によって着色層の長さが
異なる上に、着色層の終末点が不明確であり、定量性、
再現性に欠けるという問題がある。

また、上記の従来技術の測定法は何れも使用される試薬
類の調製及び測定操作が煩雑であると共に測定結果が得
られるまでに長時間を要する欠点があり、検体中の遊離
ヘモグロビンの有無を迅速に測定したいような定性的測
定には適用し難いという問題がある。

本発明は、上記の従来技術の欠点を解消すべくなされた
もので、検体（例えば、血清、血漿、尿、糞便等）中の
遊離ヘモグロビンを、總便な操作で迅速且つ特異的に測
定（定量及び定性）できる遊離ヘモグロビンの測定法及
びそれに用いる遊離ヘモグロビン測定用試薬キットを提
供することを目的とする。

［課題を解決するための手段及び作用］本発明の遊離ヘ
モグロビンの測定法は、ヒトハプトグロビンを固相に結
合させたハプトグロビン固定化固相に、遊離ヘモグロビ
ン含有検体を接触させて検体中の遊離ヘモグロビンを固
相上のヒトハプトグロビンと結合させ、次いで過酸化物
試薬溶液及び発色試薬溶液を作用させ、当該溶液の光学
的変化を測定することを特徴とするものである。

トは、上記測定法に使用する測定用キットで、ヒトハプ
トグロビンを固相に結合させたハプトグロビン固定化固
相、過酸化物試薬及び発色試薬とからなることを特徴と
するものである。

本発明は上記の構成よりなり、ヒトハプトグロビンを固
相に結合させたハプトグロビン固定化固相は遊離ヘモグ
ロビン含有検体中の遊離ヘモグロビンと特異的に結合す
るので、当該固相上には遊離ヘモグロビンのみを選択的
に固定化することができる。そしてヘモグロビンはペル
オキシダーゼ様活性を有するので、遊離ヘモグロビンが
固定化された固相に過酸化物試薬及び発色試薬を作用さ
せると呈色色素等が生じ、その光学的変化を測定するこ
とにより、遊離ヘモグロビンの有無を判別することがで
きる。また、当該光学的変化量は、ハプトグロビン固定
化固相に結合した遊離ヘモグロビン量によって定まり、
また、ハプトグロビン固定化固相に結合する遊離ヘモグ
ロビン量は検体中の遊離ヘモグロビン量によって定まる
。従って、光学的変化量は検体中の遊離ヘモグロビン量
に相関するので、光学的変化量を測定することにより検
体中の遊離ヘモグロビン量を定量することができる。

本発明で使用されるハプトグロビン固定化固相の調製に
用いられるヒトハプトグロビンは、例えば、ヒト血漿か
ら既知の手段（臨床ハプトグロビン、大城孟著：永井書
店発行、第２２３頁参照）で調製したヒトハプトグロビ
ン、さらに必要に応じてそれを抗ヒトヘモグロビン抗体
を結合させたアフィニティクロマトグラフィーに付して
ヘモグロビン−ハプトグロビン複合体（吸着画分）を除
いて精製したヒトハプトグロビン（未吸着画分）が用い
られる。ハプトグロビン固定化固相の調製は、上記で得
られたヒトハプトグロビンを、例えば、吸着法、ブロム
シアン法などの既知の手段（酵素免疫測定法、第３版：
医学書院発行、第３９５頁参照）で固相上に固定化する
ことにより調製できる。

ヒトハプトグロビンを固定化する固相材料としては、酵
素免疫測定法等で従来から使用されている固相材料のい
ずれも用いることができ、例えば、アガロース、セファ
ロース等の多糖類、ガラス、セラミックス、プラスチッ
ク等が例示される。これらの材料の形状は特に限定され
ないが、測定操作の便宜性等から、例えば、ニトロセル
ロース膜、ナイロン膜、セルロース膜等のプラスチック
膜（シート及びフィルム）、プラスチックチューブ又は
プラスチックボールがより好ましい。特に、取扱の容品
な点から、プラスチック等の支持体の一鴫に、ハプトグ
ロビンを上記のプラスチック膜に結合させたハプトグロ
ビン固定化膜を固着したスティック状とするのが好まし
い。固相上に固定化されるヒトハプトグロビン量は特に
限定されず、所望する感度等により適宜調整され、この
調整は固相に導入するブロムシアン基、ヒトハプトグロ
ビン濃度等を調整することにより行うことができ、固定
化に使用されるヒトハプトグロビン溶液のヒトハプトグ
ロビン濃度は５μｇ：／ｗｌ〜５■／Ｖ程度が好ましい
。

ハプトグロビン固定化固相に結合した遊離ヘモグロビン
のペルオキシダーゼ様活性の測定は、ペルオキシダーゼ
を標識酵素として用いた酵素免疫測定法と実質的に同様
に行うことができるので、遊離ヘモグロビンのペルオキ
シダーゼ様活性の測定に用いられる過酸化物試薬及び発
色試薬も、上記酵素免疫測定法で用いられているものと
同様なものを用いる二°とができる。より具体的には、
過酸化物試薬としては、例えば、過酸化水素、過酸化ス
トロンチュウム、過酸化バリウム、過酸化水素クメン、
ジメチルヘキサン過酸化物等が挙げられ、特に過酸化水
素が好ましい。また、発色試薬としては、例えば、３．
３−．５．５−−テトラメチルベンジジン、３，３″、
５．５”−テトラメチルベンジジン・ジハイドロクロラ
イド、オルトフェニレンジアミン、ベンジジン、オルト
トリジン、オルトジアニシジン、ジフェニルアミン、グ
アヤツクチンキ、アミドピリン、ヘモグリーン、フェノ
ルフタリン等が挙げられ、特に、３．３−５．５″−テ
トラメチルベンジジン及びオルトフェニレンジアミンが
好ましい。

次に、本発明の測定法の一例をより具体的に説明する。

まず、適当な固相材料上に前述の方法にて精製ヒトハプ
トグロビンを固定化し、ハプトグロビン固定化同相を調
製する。次いで、ハプトグロビン固定化固相を、必要に
応じて精製水等で適当な濃度に希釈した遊離ヘモグロビ
ン含有検体（例えば、血漿、血清、尿等）に浸漬し、検
体中の遊離ヘモグロビンのみをハプトグロビン固定化固
相上のハプトグロビンに特異的に結合させる。

その後、必要に応じて、ハプトグロビン固定化固相を精
製水等で洗浄する。洗浄操作は、ハプトグロビン固定化
固相の形状により適宜な方法にて行うことができ、例え
ば、ハプトグロビン固定化固相が膜状の場合には、精製
水中に浸漬又は精製水中で振盪することにより、またハ
プトグロビン固定化固相が粒状の場合には、洗浄上清を
吸引除去することにより行われる。かかる洗浄操作によ
り、ハプトグロビン固定化同相に非特異的に結合（吸着
）しているおそれのあるハプトグロビン−ヘモグロビン
複合体を除去し、ハプトグロビン固定化固相上にはハプ
トグロビンと特異的に結合したヘモグロビンのみを残す
ことができる。かくして固定化された遊離ヘモグロビン
に、前述の過酸化物試薬溶液及び発色試薬溶液を作用さ
せて光学的変化を測定することにより、遊離ヘモグロビ
ンのペルオキシダーゼ様活性を測定し、検体中の遊離ヘ
モグロビンを測定する。光学的変化の測定方法としては
、例えば、比色法、螢光法、化学発光法等が挙げられ、
特に吸光度測定法で行うのが間便であり、また操作性に
優れるので好ましい。なお、検体中の遊離ヘモグロビン
量を定量するには、上記の測定法において、遊離ヘモグ
ロビン含有検体の代りに、濃度既知の遊離ヘモグロビン
標準液を適宜希釈した試料液を用い、上記と同様な操作
を行うことによって、遊離ヘモグロビン濃度と光学的変
化量との関係式（検量線）を作威し、遊離ヘモグロビン
検体で測定された光学的変化量と検量線とを対比するこ
とにより、検体中の遊離ヘモグロビン量を求めることが
できる。また、遊離ヘモグロビンを定性的に判別する際
には、反応液の発色又は消色を目視等により観察するこ
とにより行うこともできる。

上記の測定方法において、検体中の遊離ヘモグロビン濃
度は１■／ｄ１以上であればよく、遊離ヘモグロビンの
定量を行う場合には、１〜１００■／ｄｌ程度、好まし
くは５〜５０■／ｄｌ程度に調整する。また、使用され
る過酸化物試薬溶液におけろ過酸化物試薬濃度は、例え
ば過酸化水素水の場合、通常、０．０１〜１．ＯＷ／Ｖ
％程度、好ましくは０．０５〜ｏ、ｔＵｖ％程度に調整
され、発色試薬溶液における発色試薬濃度は、例えば３
，１．５．５＝−テトラメチルベンジジンの場合、通常
、０．１〜４ｓＭ程度、好ましくは１．０〜８．０　ｓ
Ｍ程度に調整される。過酸化物試薬溶液と発色試薬溶液
は、通常、等量に混合して用いられる。なお、上記の測
定は、通常、室温で行われ、１０〜１５分間程度で終了
する。

本発明の遊離ヘモグロビン測定用試薬キットは、ヒトハ
プトグロビンを固相に結合させたハプトグロビン固定化
面相、過酸化物試薬及び発色試薬とで少なくとも構成さ
れる。該ハプトグロビン固定化固相は保存性及び安定性
を向上させるため、通常、凍結乾燥手段等を用いて乾燥
状態とされる。

また、過酸化物試薬及び発色試薬は、通常、水溶液とさ
れ、必要に応じて、安定化剤（例えば、過酸化水素の場
合にはリン酸、尿酸等、オルトフェニレンジアミンの場
合には金属マスキング剤等）を添加してもよい。本発明
の試薬キットには、追加的に、ヒトハプトグロビンが固
定化されていない固相を比較対照用として含んでいても
よく、さらに検量線作成に使用する遊離ヘモグロビン標
準液を含んでいてもよい。

［発明の効果コ 本発明の遊離ヘモグロビンの測定法及び遊離ヘモグロビ
ン測定用試薬キットによれば、遊離ヘモグロビンと特異
的に結合し得るハプトグロビン固定化固相が用いられて
いるので、検体（例えば、血清、血漿、尿、糞便等）に
含まれる遊離ヘモグロビンを高感度且つ直接的に測定す
ることができ、また遊離ヘモグロビンのペルオキシダー
ゼ様活性を利用しているので、使用される試薬類の調製
が容易であり、さらに測定操作も筒便であると共に短時
間で測定が終了するという利点を有し、遊離ヘモグロビ
ンの定量的及び定性的測定に広く用いることができると
いう効果を奏する。

［実施例］ 以下、本発明を製造例及び実施例に基づいてより詳細に
説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものでは
ない。

製造例１ ハプトグロビン固定化膜の調製 ヘモグロビンを含まない正常人プール血漿より調製した
精製ヒトハプトグロビン（−ミドリ十字製）を、ＰＢＳ
　（リン酸塩緩衝化生理食塩水）でヒトハプトグロビン
濃度が１■／　ｗｌになるように溶解してヒトハプトグ
ロビン溶液を調製した。

次いで、ニトロセルロース膜（４５Ｘ　５０Ｘ　Ｏ，０
５紬）を、上記ヒトハプトグロビン溶液に室温で約１８
時間浸漬した後、濾紙上で軽く水分を除去し、次いで０
．２５％ウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳに室温で
約１６時間浸漬した。その後、ニトロセルロース膜を減
圧乾燥し、１５Ｘ５ｍｍに切断してハプトグロビン固定
化膜を調製した。

製造例２ 遊離ヘモグロビン標準液の調製 ウィリアムズ（Ｖｉｌｌｌａｍｓ、　Ａｎａｌ、　Ｂｌ
ｏｃｈｅｍ、　Ｖｏｌ。

５４、１８７〜１４５．１９７８）の方法によって調製
したヒトヘモグロビンから、抗ヒトハプトグロビン抗体
を結合させたアフィニティクロマトグラフィーにより未
吸着画分を分取し、吸着画分（ヘモグロビン−ハプトグ
ロビン複合体）を除去した。分取した未吸着画分につき
、シアンメトヘモグロビン法でヘモグロビン量を測定し
、遊離ヘモグロビン標準液とした。

実施例１ 血清中の遊離ヘモグロビンの測定（定性）製造例１で調
製したハプトグロビン固定化膜（膜ａという）を用いて
、ヒト血清（３７検体）中の遊離ヘモグロビンの定性的
測定を下記の方法で行った。

膜ａ及び対照としてのハプトグロビン非固定化膜（膜す
という）を、検体（ヒト血清）の収容されているチュー
ブに同時に浸漬し、室温、１分間インキュベートした。

検体より膜ａ及びｂを取出し、注射用水（約３０−）の
入った容器に入れ、蓋をした後、容器を上下に激しく振
ＩＩ（２０回程度）して洗浄した。この洗浄操作を、水
を代えて繰り返した（計３回）。容器より膜ａ及びｂを
取出し、濾紙上で軽く水分を除去した。

一方、濃度０．１Ｗ／Ｖ％の過酸化水素水と濃度２ｍＭ
の３．３”、５．５″−テトラメチルベンジジン溶液を
１：１で混合した溶液を調製し、この溶液を１ｖずつチ
ューブ２本に採取し、各チューブに上記膜ａ及びｂをそ
れぞれ浸漬した。室温で５分間インキュベートした後、
膜すを対照として膜ａの発色を観察し、発色が認められ
た検体を遊離ヘモグロビン陽性（＋）と、発色が認めら
れない検体を遊離ヘモグロビン陰性（−）と判別した。

比較試験として、遊離ヘモグロビン分別定量法（臨床ハ
プトグロビン、大城孟著：永井書店発行、第２８頁参照
）に基づき、同一の血清検体について遊離ヘモグロビン
の定量を行い、上記本発明の測定法との相関を調べた。

その結果を第１表に示す。

なお、第１表中、分別定量法の欄において、＋は遊離ヘ
モグロビンが認められた検体、−は遊離ヘモグロビンが
認められなかった検体を意味する。

第１表に示されるように、本発明の測定法の結果は、分
別定量法の結果とよく相関していた。

第１表 実施例２ 遊離ヘモグロビン標準品による検量線の作成製造例２で
得た遊離ヘモグロビン標準液を、１１１中の遊離ヘモグ
ロビン量が０．５〜１００■／ｄｉ程度となるように精
製水で希釈し、種々の濃度の遊離ヘモグロビン標準試料
液を調製した。

次いで、得られた遊離ヘモグロビン標準試料液を検体と
して、実施例１と同様な方法で測定を行って発色させた
後、２Ｎ硫酸（０，１，ｆｆ）を添加して反応を停止さ
せ、試料液の４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。吸
光度測定は、各標準試料液について３回行い、その平均
値を求め、遊離ヘモグロビン濃度に対して吸光度をプロ
ットし、検量線を作成した。得られた検量線を第１図に
示す。

実施例３ 前記の分別定量法により予め遊離ヘモグロビン量を測定
したヒト血清（２４検体）につき、実施例１と同様な方
法で測定を行い、発色した試料液に２Ｎ硫酸（０１１ｆ
）を添加して反応を停止させ、試料液の４５０ｎｍにお
ける吸光度を測定した。

次に、測定された吸光度と実施例２で得られた検量線と
を対比して、各ヒト血清中の遊離ヘモグロビン量を求め
た。その結果を第２表に示す。

第２表 第２表（続き） 第２表に示されるように、分別定量法の測定値と本発明
測定法の測定値とはよく相関していることが明らかとな
った。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ハプトグロビン固定化膜を用いて本発明の方
法により遊離ヘモグロビンを測定した場合の遊離ヘモグ
ロビン濃度と吸光度との関係を示す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒトハプトグロビンを固相に結合させたハプトグロ
   ビン固定化固相に、遊離ヘモグロビン含有検体を接触さ
   せて検体中の遊離ヘモグロビンを固相上のヒトハプトグ
   ロビンと結合させ、次いで過酸化物試薬溶液及び発色試
   薬溶液を作用させ、当該溶液の光学的変化を測定するこ
   とを特徴とする遊離ヘモグロビンの測定法。 ２、ヒトハプトグロビンを固相に結合させたハプトグロ
   ビン固定化固相、過酸化物試薬及び発色試薬とからなる
   遊離ヘモグロビン測定用試薬キット。 ３、ハプトグロビン固定化固相の固相が、プラスチック
   膜、プラスチックボール又はプラスチックチューブであ
   る請求項２記載の遊離ヘモグロビン測定用試薬キット。