WO2019208120A1 - 凍結保存液及び凍結保存方法 - Google Patents

凍結保存液及び凍結保存方法 Download PDF

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WO2019208120A1
WO2019208120A1 PCT/JP2019/014589 JP2019014589W WO2019208120A1 WO 2019208120 A1 WO2019208120 A1 WO 2019208120A1 JP 2019014589 W JP2019014589 W JP 2019014589W WO 2019208120 A1 WO2019208120 A1 WO 2019208120A1
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cells
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tissues
cryopreservation solution
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篤史 松澤
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三菱製紙株式会社
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    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents
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    • A01N1/0278—Physical preservation processes
    • A01N1/0284—Temperature processes, i.e. using a designated change in temperature over time
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/04—Preserving or maintaining viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/50—Soluble polymers, e.g. polyethyleneglycol [PEG]

Definitions

  • the present invention relates to a cryopreservation solution used for cryopreservation of cells or tissues, and a cryopreservation method using the cryopreservation solution.
  • Excellent preservation technology for biological cells or tissues is required in various industrial fields. In general, since cells or tissues collected from within a living body gradually lose their activity even in a culture solution, long-term culture of cells or tissues outside a living body is not preferable. Therefore, a technique for storing for a long time without losing biological activity is important. Excellent preservation technology makes it possible to analyze the collected cells or tissues more accurately, and use the cells or tissues for transplantation while maintaining higher biological activity, so that the survival rate after transplantation can be improved. I can hope. In addition, excellent preservation technology is used to produce and store artificial tissues for transplantation, such as cultured skin cultured in vitro and so-called cell sheets constructed in vitro, and use them when necessary. It is possible to do this, and not only research and medical aspects but also industrial benefits can be expected.
  • a slow freezing method As a method for preserving cells or tissues, for example, a slow freezing method is known.
  • cells or tissues are first immersed in a cryopreservation solution obtained by adding a cryoprotectant to a physiological solution such as phosphate buffered saline.
  • a cryopreservation solution obtained by adding a cryoprotectant to a physiological solution such as phosphate buffered saline.
  • compounds such as glycerol and ethylene glycol are used.
  • the cells or tissues After immersing the cells or tissues in the preservation solution, the cells or tissues are cooled or cooled to ⁇ 30 to ⁇ 35 ° C. at a relatively slow cooling rate (for example, a rate of 0.3 to 0.5 ° C./min).
  • the solution inside and outside is sufficiently cooled, and the viscosity of the storage solution is increased.
  • the vitrified cell or tissue can be stored semipermanently by storing it in liquid nitrogen.
  • a vitrification cryopreservation method has been proposed as a method for solving the problems of the slow freezing method described above.
  • the vitrification cryopreservation method is based on the principle that it becomes difficult to form ice crystals even below freezing point by lowering the freezing point of a cryopreservation solution containing a large amount of antifreezing agents such as glycerol, ethylene glycol, DMSO (dimethyl sulfoxide).
  • antifreezing agents such as glycerol, ethylene glycol, DMSO (dimethyl sulfoxide).
  • vitrification cryopreservation method As a specific operation of the vitrification cryopreservation method, cells are immersed in a cryopreservation solution, and then cooled at a liquid nitrogen temperature ( ⁇ 196 ° C.). Since the vitrification cryopreservation method is such a simple and rapid process, it does not require a long time for the operation for cryopreservation and does not require an apparatus or jig for temperature control. There are advantages.
  • vitrification freezing in principle, ice crystals do not form inside or outside the cell, so physical damage (freezing damage) to cells during freezing and thawing can be avoided.
  • concentration of the antifreeze contained in the preservation solution used for vitrification must be high.
  • the high-concentration antifreeze contained in the cryopreservation solution has high chemical toxicity to cells, it is preferable to reduce the concentration as much as possible from the viewpoint of reducing cytotoxicity. It is known that in order to perform vitrification freezing with a cryopreservation solution containing a low concentration of antifreeze, it is necessary to increase the freezing rate.
  • the amount of the cryopreservation solution present around the cells or tissues during cryopreservation is small.
  • the smaller the cryopreservation solution present around the cells or tissues the smaller the heat capacity of the object to be frozen, and the faster the freezing rate of the cells or tissues, which is preferable for vitrification freezing.
  • the fact that the cryopreservation solution present around the cells or tissues is small means that even when thawing after freezing, the cryopreservation solution is quickly diluted into the thawing solution, and re-ice crystals are formed in the cells or tissues. It is preferable from the viewpoint of suppression.
  • the concentration of the freezing agent mixed in the melt at the time of melting can be lowered, which is preferable from the viewpoint of reducing the chemical toxicity derived from the freezing agent.
  • Patent Document 1 shows that application of vitrification cryopreservation to animal or human germ cells or somatic cells is extremely useful in terms of cryopreservation and survival after thawing, A cryopreservation solution containing 5.5M ethylene glycol and 1M sucrose, a cryopreservation solution containing 40% by mass ethylene glycol, and 0.3M trehalose are described.
  • the vitrification cryopreservation method is a technique that has been developed mainly using human germ cells, but recently, its application to iPS cells and ES cells has been widely studied.
  • Non-Patent Document 1 shows that the vitrification cryopreservation method was effective for preserving Drosophila embryos.
  • Patent Document 2 shows that the vitrification cryopreservation method is effective in preserving plant cultured cells and tissues.
  • a cryopreservation solution containing ethylene glycol, glycol, propylene glycol, glycerol, DMSO as a freezing agent is described.
  • DMSO, propylene is used as a freezing agent (cryoprotectant) contained in the cryopreservation solution.
  • vitrification cryopreservation method is known to be useful for preserving various types of cells and tissues.
  • Patent Document 3 an ovum or embryo is placed on a preservation solution removing material together with a cryopreservation solution, and an extra cryopreservation solution adhering to the periphery of the ovum or embryo is removed by aspiration from the lower part.
  • a method of cryopreserving at a rate is proposed, and the cryopreservation solution contains ethylene glycol, glycerol and sucrose.
  • Patent Document 4 discloses a cryopreservation solution for cells or tissues in a slow freezing method, mainly for the purpose of protecting cells, that is, achieving an excellent survival rate.
  • a preservation solution is proposed, and Patent Literature 5 and Patent Literature 6 each describe polyvinyl alcohol as a cytoprotective substance or a cryoprotectant contained in the cryopreservation solution in the vitrification cryopreservation method.
  • Patent Document 7 describes that the problem that cells could not be efficiently cultured on the surface of a hydrophobic culture substrate can be improved by a cell culture solution to which a water-soluble synthetic polymer is added, Polyvinyl alcohol is described as an example of a synthetic polymer.
  • Patent Document 8 describes that a cell or tissue can be easily detached and recovered at the time of thawing by a cryopreservation jig having a layer containing a water-soluble polymer compound on the outermost surface on which the cell or tissue is placed. Has been.
  • in vitrification cryopreservation cells or tissues are placed together with a small amount of a cryopreservation solution to achieve excellent viability of the cells or tissues.
  • a cryopreservation solution When the tissue is placed and frozen, when thawing after freezing, the ovum or embryo on the sheet often sticks to the surface of the placement part due to the type or state of the cell or tissue, and it is high when these are collected There was a problem that skill was required.
  • the more the cell or tissue is cryopreserved with a smaller amount of cryopreservation solution which is the preferred state for freezing by the operator, the more prominent the problem that the cell or tissue adheres to the surface of the mounting part when thawing after freezing. Met.
  • Patent Document 3 it is not necessary for the operator to remove an extra cryopreservation solution adhering to the periphery of a cell or tissue by using a vitrification preservation solution removing material on the part where an embryo or egg is placed. Although a good workability is obtained in that it is frozen with a small amount of the cryopreservation solution except for the cryopreservation solution, when the preservation solution absorber absorbs the preservation solution, the cell or tissue is especially in the preservation solution absorber. In some rare cases, it is firmly fixed, and there is a case where a particularly high skill is required when cells or tissues are collected.
  • the main object of the present invention is to provide a cell or tissue cryopreservation solution and a cryopreservation method capable of easily and reliably performing a cell or tissue cryopreservation operation. More specifically, it shows good workability in pipetting operation during freezing work, and can easily collect cells or tissues without being stuck to the surface of the placement part during melting work. It is an object to provide a cryopreservation solution and a cryopreservation method that can be used.
  • a cryopreservation solution containing polyvinyl alcohol having a saponification degree of 84 mol% or less containing polyvinyl alcohol having a saponification degree of 84 mol% or less.
  • the cryopreservation solution of the present invention is used when cryopreserving cells or tissues.
  • the cell includes a cell population of an organism composed of one cell or a plurality of cells.
  • the cell population composed of a plurality of cells may be a colony or cluster cell population composed of a single type of cell, or may be a colony or cluster cell population composed of a plurality of types of cells.
  • the tissue may be a tissue composed of a single type of cell or a tissue composed of a plurality of types of cells, and includes non-cellular substances such as an extracellular matrix in addition to cells. Things can be used.
  • the cryopreservation solution of the present invention is used for cryopreservation work, and is preferably used for vitrification cryopreservation work. More specifically, the cryopreservation solution of the present invention can be preferably used for cryopreservation of embryos or eggs including the cryotop method.
  • the freezing operation in the cryotop method is generally performed according to the following procedure. After immersing cells or tissues such as embryos and eggs in an equilibration solution, the cells or tissues are taken out together with a small amount of equilibration solution using a thin tubular jig such as a pipette and moved into a cryopreservation solution. After immersing the cells or tissues in the cryopreservation solution for a predetermined time, the cells or tissues are taken out together with a small amount of the cryopreservation solution, and the cells or tissues are dropped and attached together with a small amount of the cryopreservation solution on the sheet of the cryopreservation jig.
  • a thin tubular jig such as a pipette
  • an operation for removing the excess cryopreservation solution is performed using a thin tubular jig such as a pipette. Thereafter, the sheet on which the cells or tissues are placed is immersed in a cooling medium such as liquid nitrogen and frozen.
  • a cooling medium such as liquid nitrogen and frozen.
  • the purpose of dehydrating the water in the cells or tissues and replacing them with a solution containing a cryoprotectant is to make the cells or tissues in a tube-shaped jig in the equilibration solution or the cryopreservation solution. Pipetting may be performed using the. Next, the melting operation will be described.
  • the cells or tissues When the cells or tissues are thawed, the cells or tissues placed on the sheet are taken out from the cooling medium, and immersed in a melt to melt.
  • the cryopreservation solution of the present invention When the cryopreservation solution of the present invention is used, the cells or tissues can be easily recovered from the placement part at the time of thawing, so that the work for cryopreserving the cells or tissues can be easily and reliably performed.
  • Vitrification freezing in this specification is different from a so-called slow freezing method in which freezing is performed at a relatively slow cooling rate (for example, a rate of 0.3 to 0.5 ° C./min). ) Is a method of freezing cells or tissues while suppressing ice crystal formation at a high cooling rate.
  • the cooling rate in vitrification freezing is, for example, a cooling rate from 0 ° C. to ⁇ 150 ° C. measured using a Chino sheath type thermocouple (tip outer diameter 0.3 mm) is 200 ° C./min or more.
  • the cryopreservation solution of the present invention contains polyvinyl alcohol having a saponification degree of 84 mol% or less.
  • Polyvinyl alcohol is known to have a role as a cytoprotective substance or a cryoprotective substance in a cryopreservation solution, and is mainly contained for the purpose of improving the viability after freeze-thawing. According to Patent Document 4 described above, it is described that there is an action of maintaining the skeleton of an embryo cell as a substitute for a protein added as a cryoprotectant.
  • the polyvinyl alcohol contained in the cryopreservation solution of the present invention has a saponification degree of 84 mol% or less. More preferably, it is 76 mol% or less.
  • the lower limit of the saponification degree is preferably 65 mol% or more.
  • the saponification degree in this invention is an average saponification degree in a single polyvinyl alcohol composition.
  • the content of polyvinyl alcohol contained in the cryopreservation solution of the present invention is preferably 0.1 to 3% by mass. If the content is less than 0.1% by mass, good peelability during melting may not be obtained. On the other hand, if the content exceeds 3% by mass, the viscosity of the cryopreservation solution is too high, which may hinder the handling of pipettes and other thin tubular jigs. In some cases, the workability when removing the cells or tissues from the pipetting work or the cryopreservation solution may be reduced.
  • a more preferable content of polyvinyl alcohol is 0.7 to 2.2% by mass.
  • the cryopreservation solution of the present invention preferably contains an organic solvent type antifreeze.
  • organic solvent freezing agents such as ethylene glycol, DMSO, glycerol, propylene glycol, and propanediol can be suitably used.
  • the organic solvent-based antifreeze agent may be used alone or in combination of two or more.
  • concentration of the organic solvent antifreeze in the cryopreservation solution of the present invention is preferably 20 to 50% by volume. More preferably, it is 25 to 45% by volume.
  • the cryopreservation solution of the present invention can contain saccharides from the viewpoint of adjusting osmotic pressure and imparting vitrification performance (freezing resistance).
  • saccharide sucrose, trehalose, glucose, raffinose, lactose, maltose, mannose, galactose, and fructose can be preferably used. Saccharides may be used alone or in combination of two or more.
  • concentration of the saccharide in the vitrified cryopreservation solution of the present invention is preferably 0.2 to 1M, and more preferably 0.3 to 0.7M.
  • the cryopreservation solution of the present invention can contain a polymer compound from the viewpoint of viscosity adjustment and cell protection effect.
  • the polymer compound include polyethylene glycol, ficoll (a copolymer of sucrose and epichlorohydrin), dextran, polyvinylpyrrolidone, albumin and the like, or hyaluronic acid, gellan gum, xanthan gum, carrageenan, sodium alginate.
  • alginic acid derivatives and salts thereof such as cellulose derivatives such as methyl cellulose, ethyl cellulose, hydroxyethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, carboxymethyl cellulose, and thickening polysaccharides such as salts thereof.
  • the cryopreservation solution of the present invention can contain other biological materials such as serum. Serum has been widely used for the purpose of cytoprotective effects when frozen, although its constituents have not yet been fully elucidated.
  • the time for immersing the cells or tissues in the cryopreservation solution (the time from when the cells are brought into contact with the cryopreservation solution until the cooling with the cooling solvent is started) is used.
  • the composition of the cryopreservation solution in most cases, 3 minutes or less is preferable from the viewpoint of avoiding chemical toxicity of the cryopreservation solution. More preferably, it is within 1 minute 30 seconds.
  • the cells or tissues are immersed in the cryopreservation solution, and then the cells are frozen by vitrification using a cryogenic cooling medium. It is preferable to make it. By freezing at a rapid cooling rate, the cells are expected to be cryopreserved with little ice crystal formation. It is preferable to use liquid nitrogen as the cooling medium.
  • the cryopreserved cells can be stored semipermanently by storing them in a cryogenic environment where the vitrification state of the cells is maintained.
  • the temperature at which the vitrification state is maintained varies depending on the composition of the cryopreservation solution, but in many cases is preferably ⁇ 150 ° C. or less.
  • the environment in which such a temperature is maintained is preferably in a liquid nitrogen storage container or a gas phase nitrogen storage container.
  • the cell or tissue thawing operation using the cryopreservation solution of the present invention can be performed by a generally known method such as the cryotop method.
  • the cells or tissues placed on the cryopreserved sheet are taken out and brought into direct contact with a thawed solution adjusted to 37 ° C., so that the cryopreserved solution and the cells or tissues are thawed and the cryopreserved solution is diluted. To do. At this time, the cells or tissues are peeled from the sheet in the melt. It is preferable from the viewpoint of viability after freezing / thawing that cells or tissues are gently detached from the sheet.
  • the peeled cells or tissues are transferred from the melted solution to the diluted solution after a predetermined time, soaked for a predetermined time, and further transferred to a washing solution.
  • the osmotic pressure is gradually changed, the antifreezing agent in the cells or tissues is diluted and removed, and an operation for returning to a gentle culture condition is performed.
  • Examples of cells that can be cryopreserved using the cryopreservation solution of the present invention include, for example, mammals (eg, humans, cows, pigs, horses, rabbits, rats, mice, etc.) eggs, embryos, sperm, etc. Germ cells; pluripotent stem cells such as induced pluripotent stem cells (iPS cells) and embryonic stem cells (ES cells). Moreover, cultured cells, such as a primary cultured cell, a subcultured cell, and a cell line cell, are mentioned.
  • the cell is a fibroblast, a cancer-derived cell such as pancreatic cancer / hepatoma, epithelial cell, vascular endothelial cell, lymphatic endothelial cell, nerve cell, chondrocyte, tissue stem cell, And adherent cells such as immune cells.
  • tissues that can be cryopreserved include tissues composed of the same or different types of cells, such as tissues such as ovary, skin, corneal epithelium, periodontal ligament, and myocardium.
  • the present invention is particularly suitable for cryopreservation of tissues having a sheet-like structure (for example, cell sheets, skin tissues, etc.).
  • the cryopreservation jig of the present invention is not limited to a tissue directly collected from a living body, for example, cultured skin grown and grown in vitro, a so-called cell sheet constructed in vitro, JP 2012-205516 A It can also be suitably used for cryopreservation of an artificial tissue such as a proposed tissue model having a three-dimensional structure.
  • the cryopreservation solution of the present invention can be suitably used as a cell or tissue cryopreservation solution as described above.
  • Example 1 A commercially available Medium 199 medium (manufactured by Life Technologies) containing L-glutamine, phenol red, 25 mM HEPES (4- (2-hydroxyethylethyl) -1-piperazine etheric acid), and 15 ethylene glycol as an organic solvent antifreeze. Volume% and DMSO 15 volume%, sucrose 0.5 M as a saccharide, gentamicin 50 mg / L as an antibiotic, and Kuraray Poval PVA505 (saponification degree 73.5 mol%) manufactured by Kuraray Co., Ltd., which is polyvinyl alcohol. A cryopreservation solution of Example 1 containing 5% by mass was prepared.
  • Example 2 A cryopreservation solution of Example 2 was prepared in the same manner as in Example 1 except that the content of Kuraray Poval PVA505 was changed to 0.5% by mass and 0.9% by mass.
  • Example 3 A cryopreservation solution of Example 3 was prepared in the same manner as in Example 1 except that the content of Kuraray Poval PVA505 was changed to 0.5% by mass and 1.8% by mass.
  • Example 4 A cryopreservation solution of Example 4 was produced in the same manner as in Example 1 except that the content of Kuraray Poval PVA505 was changed to 0.5% by mass and changed to 2.5% by mass.
  • Example 5 In the same manner as in Example 1 except that 0.9% by mass of Kuraray Poval PVA403 (saponification degree: 80 mol%) manufactured by Kuraray Co., Ltd., which is polyvinyl alcohol, was added without adding Kuraray Poval PVA505. A cryopreservation solution was prepared.
  • Comparative Example 1 A cryopreservation solution of Comparative Example 1 was prepared in the same manner as in Example 1 except that Kuraray Poval PVA505, which is polyvinyl alcohol, was not added.
  • Comparative Example 2 The same as Example 1 except that Kuraraypoval PVA505 was not added and 0.9% by mass of GOHSENOL (registered trademark) EG05P (saponification degree: 88 mol%) manufactured by Nippon Synthetic Chemical Industry Co., Ltd., which is polyvinyl alcohol, was contained. Thus, a cryopreservation solution of Comparative Example 2 was prepared.
  • Comparative Example 3 was the same as Example 1 except that Kuraray Poval PVA505 was not added and 0.9% by mass of Kuraray Kuraray PVA617 (saponification degree 95 mol%), which is polyvinyl alcohol, was contained. A cryopreservation solution was prepared.
  • Spheres used for evaluation of cell or tissue detachability were adjusted as follows. MEF cells, which are mouse embryonic fibroblasts, were cultured on a culture dish and then detached and collected by trypsin treatment. Subsequently, sphere formation was induced by seeding on a PrimeSurface 96U plate manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd. at a cell number of 50 cells / well, followed by suspension culture. After 3 days of culture, spheres having a diameter of about 100 ⁇ m were obtained.
  • a cryopreservation jig used for cryopreservation of cells or tissues was prepared as follows.
  • a hot melt urethane resin Purmelt (registered trademark) QR 170-7141P manufactured by Henkel Japan Co., Ltd. was applied as an adhesive layer on the transparent PET film so as to have a solid content of 30 g / m 2 when dried. Note that the adhesive layer was not applied to the placement portion region, but only the periphery.
  • a hydrophilized polytetrafluoroethylene porous material (pore size 0.2 ⁇ m, porosity 71%, thickness 35 ⁇ m) manufactured by Advantech Toyo Co., Ltd.
  • a preservation solution absorber is applied as a preservation solution absorber.
  • this was used as a placement portion for placing cells or tissues.
  • the placement portion was cut into a size of 1.5 mm ⁇ 20 mm, and the short side of the placement portion was joined to a stick-shaped ABS resin gripping portion to prepare a cryopreservation jig 1.
  • the spheres obtained as described above were collected from the culture solution and moved into the equilibration solution together with a small amount of the culture solution using a stripper pipetter (hereinafter referred to as pipette) which is a thin tubular jig.
  • the composition of the equilibration liquid is 7.5% by volume ethylene glycol, 7.5% by volume DMSO, and 50 mg / L gentamicin based on the Medium 199 medium.
  • the spheres were immersed in the equilibration solution for 3 minutes, and then transferred to the cryopreservation solution of Examples 1 to 5 or Comparative Examples 1 to 3 together with a small amount of the equilibration solution using a pipette.
  • the spheres that had been frozen with the cryopreservation solutions of Examples 1 to 5 or Comparative Examples 1 to 3 were each thawed by the following operations.
  • the cryopreservation jig containing the frozen spheres was taken out of the liquid nitrogen, and the placement part of the cryopreservation jig on which the spheres were placed was immersed in a melt adjusted to 37 ° C.
  • the composition of the thawing solution contains 1M sucrose and 50 mg / L gentamicin based on the Medium 199 medium. While observing the mounting part immersed in the melt under a microscope, an attempt was made to peel off the sphere from the mounting part.
  • the sphere peeling operation was performed as follows. After immersing the mounting part in the melt, the spheres were observed to peel from the mounting part while standing for 60 seconds. When the sphere did not peel after 60 seconds from the immersion in the melt, the sphere was peeled by shaking the mounting portion.
  • the peelability in the melting operation was evaluated according to the following criteria.
  • Double-circle The sphere peeled from the mounting part within 60 seconds after melt
  • ⁇ After 60 seconds from the immersion of the melt, the mounting part was shaken to peel off the sphere from the mounting part.
  • X The sphere was fixed so that it could not be easily recovered, and could not be peeled off, or the cells constituting the sphere were separated at the time of recovery.
  • cryopreservation solution of the present invention is excellent in workability during freezing work and peelability during melting work.
  • cryopreservation solution After confirming that the cryopreservation solution is automatically absorbed by the preservation solution absorber after the spheres are dropped, confirm that the excess cryopreservation solution has been absorbed almost completely, and then perform cryopreservation treatment.
  • the sphere on the mounting part of the tool 2 was immersed in liquid nitrogen and frozen.
  • the frozen cryopreservation jig 2 was stored in liquid nitrogen until the melting operation was performed.
  • the present invention is not limited to livestock such as cattle and animal embryo transfer, artificial insemination, artificial insemination to humans, iPS cells, ES cells, commonly used cultured cells, for inspection or transplantation collected from living organisms. It can be used for cryopreservation of cells or tissues, cells or tissues cultured in vitro, and the like.

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Abstract

本発明は、ケン化度が８４ｍｏｌ％以下のポリビニルアルコールを含有することを特徴とする凍結保存液に関する。

Description

凍結保存液及び凍結保存方法
　本発明は、細胞又は組織の凍結保存に用いられる凍結保存液、及び、該凍結保存液を用いた凍結保存方法に関する。
　生物の細胞又は組織の優れた保存技術は、様々な産業分野で求められている。一般に、生体内から採取された細胞又は組織は、たとえ培養液の中であっても、次第に活性が失われていくことから、生体外での細胞又は組織の長期間の培養は好ましくない。そのため、生体活性を失わせずに長期間保存するための技術が重要である。優れた保存技術によって、採取された細胞又は組織をより正確に分析することが可能となり、より高い生体活性を保ったまま細胞又は組織を移植に用いることで、移植後の生着率の向上が望める。さらに、優れた保存技術は、生体外で培養した培養皮膚、生体外で構築したいわゆる細胞シートのような移植のための人工の組織を、順次生産して保存しておき、必要なときに使用することも可能となり、研究・医療の面だけではなく、産業面においても大きなメリットが期待できる。
　細胞又は組織の保存方法として、例えば緩慢凍結法が知られている。この方法では、まず、例えばリン酸緩衝生理食塩水等の生理的溶液に耐凍剤を含有させることで得られた凍結保存液に、細胞又は組織を浸漬する。該耐凍剤としては、グリセロール、エチレングリコール等の化合物が用いられる。該保存液に、細胞又は組織を浸漬後、比較的遅い冷却速度（例えば０．３～０．５℃／ｍｉｎの速度）で、－３０～－３５℃まで冷却することにより、細胞内外又は組織内外の溶液が十分に冷却され、該保存液の粘性が高くなる。このような状態で、該保存液中の細胞又は組織をさらに液体窒素の温度（－１９６℃）まで冷却すると、細胞内又は組織内とその周囲の微少溶液がいずれも非結晶のまま固化するガラス化が起こる。ガラス化により、細胞内外又は組織内外が固化すると、実質的に分子の動きがなくなるので、ガラス化された細胞又は組織を液体窒素中に保存することで、半永久的に保存できると考えられる。
　しかしながら、緩慢凍結法では、比較的遅い冷却速度で冷却する必要があるために、凍結保存のための操作に時間を要するという問題がある。また、冷却速度を制御するための装置又は治具を必要とする問題がある。加えて、緩慢凍結法では、細胞外又は組織外の保存液中に氷晶が形成されるので、細胞又は組織が該氷晶により物理的に損害を受けるおそれがある。
　上記した緩慢凍結法での問題点を解決するための方法として、ガラス化凍結保存法が提案されている。ガラス化凍結保存法とは、グリセロール、エチレングリコール、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）などの耐凍剤を多量に含む凍結保存液の凝固点降下により、氷点下でも氷晶ができにくくなる原理を用いたものである。この凍結保存液を急速に液体窒素中で冷却させると氷晶を生じさせないまま固化させることができる。このように固化させることをガラス化凍結という。
　前記ガラス化凍結保存法の具体的な操作としては、凍結保存液に細胞を浸漬させ、その後、液体窒素の温度（－１９６℃）で冷却する。ガラス化凍結保存法は、このような簡便かつ迅速な工程であるために、凍結保存のための操作に長い時間を必要としない他、温度制御をするための装置又は治具を必要としないという利点がある。
　ガラス化凍結法を用いると、原理的には、細胞内外のいずれにも氷晶が生じないために凍結時及び融解時の細胞への物理的障害（凍害）を回避することができるが、適切なガラス化凍結を成し得るためには、ガラス化に用いる保存液に含有される耐凍剤の濃度を高いものとしなければならない。一方で、凍結保存液に含まれる高濃度の耐凍剤は細胞にとっての化学的毒性が高いため、細胞毒性を低減する観点では、可能な限り濃度を低くすることが好ましい。低濃度の耐凍剤を含有する凍結保存液でガラス化凍結を行うためには、凍結速度を速める必要があることが知られている。
　細胞又は組織の凍結速度を速める観点から、凍結保存時には細胞又は組織の周囲に存在する凍結保存液量は少ない方が好ましい。細胞又は組織の周囲に存在する凍結保存液が少ないほど凍結対象の熱容量が少なくなり、細胞又は組織の凍結速度が速くなり、ガラス化凍結にとっては好ましいといえる。さらに、細胞又は組織の周囲に存在する凍結保存液が少ないことは、凍結後の融解時においても、凍結保存液が速やかに融解液中に希釈され、細胞又は組織中への再氷晶形成を抑制する観点で好ましい。さらには、融解時に融解液中に混入する耐凍剤の濃度を低くすることができ、耐凍剤に由来する化学的毒性を低減する観点からも好ましい。
　ガラス化凍結保存法を用いた細胞又は組織の凍結保存については、様々な方法で、様々な種類の細胞又は組織を用いた例が示されている。例えば、特許文献１では、動物又はヒトの生殖細胞又は体細胞へのガラス化凍結保存法の適用が、凍結保存及び融解後の生存率の点で、極めて有用であることが示されており、５．５Ｍエチレングリコール及び１Ｍスクロースを含有する凍結保存液、４０質量％エチレングリコール及び０．３Ｍトレハロースを含有する凍結保存液等が記載されている。
　ガラス化凍結保存法は、主にヒトの生殖細胞を用いて発展してきた技術であるが、最近では、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞への応用も広く検討されている。また、非特許文献１では、ショウジョウバエの胚の保存にガラス化凍結保存法が有効であったことが示されている。さらに、特許文献２では、植物培養細胞や組織の保存において、ガラス化凍結保存法が有効であることが示されている。前者においては、エチレングリコール、グリコール、プロピレングリコール、グリセロール、ＤＭＳＯを耐凍剤として含有する凍結保存液が記載され、後者においては、凍結保存液が含有する耐凍剤（凍結保護剤）として、ＤＭＳＯ、プロピレングリコール、グリセロール、ポリエチレングリコール、ブタンジオール、ホルムアミド、プロパンジオール、ソルビトール、マンニトール等が例示されている。このように、ガラス化凍結保存法は広く様々な種の細胞及び組織の保存に有用であることが知られている。
　特許文献３では、卵子又は胚を、凍結保存液と共に保存液除去材の上に載置し、下部から吸引することで卵子又は胚の周囲に付着した余分な凍結保存液を除き、優れた生存率で凍結保存させる方法が提案され、該凍結保存液はエチレングリコール、グリセロール及びスクロースを含有する。
　また、特許文献４には、緩慢凍結法における細胞又は組織の凍結保存液として、主に細胞の保護、つまりは優れた生存率の達成を目的として、１．５％のポリビニルアルコールを含有する凍結保存液が提案され、特許文献５及び特許文献６には、ガラス化凍結保存法における凍結保存液が含有する細胞保護物質又は凍結保護物質として、ポリビニルアルコールがそれぞれ記載されている。
　他方、特許文献７には、疎水性の培養基材表面において細胞が効率よく培養できなかったとの課題を、水溶性の合成ポリマーを添加してなる細胞培養液によって改善できる事が記載され、該合成ポリマーの一例としてポリビニルアルコールが記載されている。また特許文献８には、細胞又は組織を載置する最表面に水溶性高分子化合物を含有する層を有する凍結保存用治具によって、融解時において細胞又は組織を容易に剥離、回収できることが記載されている。
特許第３０４４３２３号公報 特開２００８－５８４６号公報 国際公開第２０１１／０７０９７３号 特開２００５－２６１４１３号公報 特開２０１０－２１３６９２号公報 特開２０１３－１１１０１７号公報 特開２００７－１２４９８２号公報 特開２０１７－６０４５７号公報
Ｓｔｅｐｏｎｋｕｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　３４５：１７０－１７２（１９９０）
　上述の通り、ガラス化凍結保存においては、細胞又は組織を、少量の凍結保存液とともに載置することにより、細胞又は組織の優れた生存性が達成されるが、少量の凍結保存液とともに細胞又は組織を載置し凍結した場合、凍結後に融解する際、細胞又は組織の種類や状態等によって、しばしばシート上の卵子又は胚が載置部表面に固着してしまい、これらを回収する際に高い技量が要求されるという問題があった。さらには、作業者が凍結に好ましい状態である、より少量の凍結保存液で細胞又は組織を凍結保存するほど、凍結後に融解する際に、細胞又は組織が載置部表面に固着する問題が顕著であった。
　特に、特許文献３では、胚又は卵子を載置する部分にガラス化保存液除去材を用いることにより、細胞又は組織の周囲に付着した余分な凍結保存液を作業者が除く必要はなく、余分な凍結保存液を除き、少量の凍結保存液とともに凍結するという点では良好な作業性が得られるものの、保存液吸収体が保存液を吸収する際に、細胞又は組織が保存液吸収体にとりわけ強固に固着することが稀にあり、細胞又は組織を回収する際に特に高い技量が要求される場合があった。
　本発明は、細胞又は組織の凍結保存作業を容易かつ確実に行うことが可能な、細胞又は組織の凍結保存液及び凍結保存方法を提供することを主な課題とする。より具体的には、凍結作業時のピペット操作において良好な作業性を示し、かつ、融解作業時に、細胞又は組織が載置部表面に固着することなく、細胞又は組織を容易に回収することができる凍結保存液及び凍結保存方法を提供することを課題とする。
　本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、以下の手段によって、上記課題を解決できることを見出した。
　（１）ケン化度が８４ｍｏｌ％以下のポリビニルアルコールを含有することを特徴とする凍結保存液。
　（２）前記ポリビニルアルコールのケン化度が７６ｍｏｌ％以下であることを特徴とする凍結保存液。
　（３）平衡化処理した細胞又は組織を、前記（１）又は（２）に記載の凍結保存液に浸漬した後、極低温の冷却媒体を用いてガラス化凍結することを特徴とする凍結保存方法。
　上記（１）の発明によれば、細胞又は組織をガラス化凍結保存する際に、凍結作業時のピペット操作において良好な作業性を示し、かつ、融解作業時に、細胞又は組織が載置部表面に固着することなく、細胞又は組織を容易に回収することができる凍結保存液を提供することができる。
　上記（２）の発明によれば、融解作業時に、細胞又は組織が載置部表面に固着することなく、細胞又は組織の回収性にとりわけ優れた凍結保存液を提供することができる。
　上記（３）の発明によれば、細胞又は組織をガラス化凍結保存する際に、凍結作業時のピペット操作において良好な作業性を示し、かつ、融解作業時に、細胞又は組織が載置部表面に固着することなく、細胞又は組織を容易に回収することができる凍結保存方法を提供することができる。
　本発明の凍結保存液は、細胞又は組織を凍結保存する際に用いられるものである。本発明において細胞とは、１個の細胞又は複数の細胞からなる生物の細胞集団を含むものである。複数の細胞からなる細胞集団とは単一の種類の細胞から構成されるコロニー状あるいはクラスター状の細胞集団でも良いし、複数の種類の細胞から構成されるコロニー状あるいはクラスター状の細胞集団でも良い。また、組織とは、単一の種類の細胞から構成される組織でも良いし、複数の種類の細胞から構成される組織でも良く、細胞以外に細胞外マトリックスのような非細胞性の物質を含むものでも良い。
　本発明の凍結保存液は、凍結保存作業に用いるものであり、好ましくはガラス化凍結保存作業に用いるものである。より詳細には、本発明の凍結保存液は、クライオトップ法をはじめとする胚又は卵子の凍結保存に好ましく用いることができる。
　クライオトップ法における凍結作業は、一般に以下のような手順で行われる。胚や卵子等の細胞又は組織を平衡化液に浸漬した後に、ピペット等の細管状の治具を用いて、細胞又は組織を少量の平衡化液と共に取り出し、凍結保存液中に移動させる。細胞又は組織を所定時間、凍結保存液中に浸漬させた後に、少量の凍結保存液と共に取り出し、細胞又は組織を凍結保存用治具が有するシート上に少量の凍結保存液と共に滴下付着させる。この際に、滴下した凍結保存液が多い場合はピペット等の細管状の治具を用いて余分な凍結保存液を除く操作を行う。その後、細胞又は組織を載置したシートを液体窒素等の冷却媒体に浸漬させて凍結する。なお、凍結作業においては、細胞又は組織中の水分を脱水させ、耐凍剤を含む溶液に置換させることを目的とし、平衡化液中又は凍結保存液中において、細胞又は組織を細管状の治具を用いてピペッティングする作業がなされることがある。次に融解作業について説明する。細胞又は組織を融解する際には、シート上に載置された細胞又は組織を冷却媒体から取り出し、融解液中に浸漬させて融解する。本発明の凍結保存液を用いると、融解時には容易に細胞又は組織を載置部上から回収できることから、細胞又は組織の凍結保存にかかる作業を容易にかつ確実に行うことができる。
　本明細書におけるガラス化凍結とは、比較的遅い冷却速度（例えば０．３～０．５℃／ｍｉｎの速度）で凍結する所謂緩慢凍結法とは異なり、極低温の冷却媒体（例えば液体窒素）を用いて速い冷却速度で、氷晶形成を抑制しながら細胞又は組織を凍結させる方法をさす。ガラス化凍結における冷却速度は、例えば、チノー社製シース型熱電対（先端外径０．３ｍｍ）を用いて測定される０℃から－１５０℃までの冷却速度が２００℃／ｍｉｎ以上である。
　本発明の凍結保存液は、ケン化度が８４ｍｏｌ％以下のポリビニルアルコールを含有する。
　ポリビニルアルコールは、凍結保存液においては、細胞保護物質又は凍結保護物質としての役割が知られ、主に凍結融解後の生存性を向上させる目的で含有させることが知られている。前述した特許文献４によれば、同様に凍結保護物質として添加するタンパク質の代替物質として胚細胞の骨格を維持する作用があることが記載されている。
　本発明の凍結保存液が含有するポリビニルアルコールは、ケン化度が８４ｍｏｌ％以下である。より好ましくは、７６ｍｏｌ％以下である。ケン化度の下限は６５ｍｏｌ％以上であることが好ましい。上記範囲のケン化度のポリビニルアルコールを用いると、凍結保存作業の融解作業時に、細胞又は組織を載置部上から容易に回収することができる。なお、本発明におけるケン化度は、単一のポリビニルアルコール組成物における平均ケン化度のことである。
　本発明の凍結保存液が含有するポリビニルアルコールの含有量は、０．１～３質量％であることが好ましい。含有量が０．１質量％を下回る場合には、融解作業時の良好な剥離性が得られない場合がある。一方、含有量が３質量％を上回る場合には、凍結保存液の粘性が高すぎるために、ピペット等の細管状の治具操作などのハンドリングに支障が生じる場合があり、凍結保存液中でのピペッティング作業や凍結保存液から細胞又は組織を取り出す際の作業性が低下する場合がある。ポリビニルアルコールのより好ましい含有量は０．７～２．２質量％である。
　本発明の凍結保存液は、有機溶媒系耐凍剤を含有することが好ましい。有機溶媒系耐凍剤としては、エチレングリコール、ＤＭＳＯ、グリセロール、プロピレングリコール、プロパンジオール等の有機溶媒系耐凍剤を好適に用いることができる。有機溶媒系耐凍剤は単独で用いても良いし、二種類以上を併用して用いても良い。本発明の凍結保存液中の該有機溶媒系耐凍剤の濃度は、２０～５０容量％であることが好ましい。より好ましくは２５～４５容量％である。
　本発明の凍結保存液は、浸透圧調整及びガラス化性能（耐凍性能）付与の観点から、糖類を含有することができる。糖類としては、スクロース、トレハロース、グルコース、ラフィノース、ラクトース、マルトース、マンノース、ガラクトース、フルクトースを好適に用いることができる。糖類は単独で用いても良いし、二種類以上を併用して用いても良い。本発明のガラス化凍結保存液中の該糖類の濃度は、０．２～１Ｍであることが好ましく、より好ましくは、０．３～０．７Ｍである。
　本発明の凍結保存液は、粘度調整や細胞保護効果の観点で、高分子化合物を含有することができる。高分子化合物としては、例えば、ポリエチレングリコール、フィコール（スクロースとエピクロロヒドリンの共重合体）、デキストラン、ポリビニルピロリドン、アルブミン等の高分子化合物、又は、ヒアルロン酸、ジェランガム、キサンタンガム、カラギーナン、アルギン酸ナトリウム等のアルギン酸誘導体及びその塩、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース等のセルロース誘導体及びその塩等の増粘性多糖類等が例示される。
　本発明の凍結保存液は、その他、血清のような生物由来材料を含有することができる。血清は、その構成成分が未だ完全に解明されていないものの、凍結時の細胞保護効果を目的として、広く用いられている。
　本発明の凍結保存液を用いた凍結作業において、細胞又は組織を凍結保存液に浸漬させる時間（細胞を凍結保存液と接触させてから、冷却溶媒で冷却を開始するまでの時間）は、用いる凍結保存液の組成によるものの、多くの場合、凍結保存液の化学的毒性を避けるという観点で、３分以内が好ましい。より好ましくは１分３０秒以内である。
　本発明の凍結保存液を用いた凍結保存作業は、細胞又は組織の平衡化処理の後に、凍結保存液に細胞又は組織を浸漬させた後、極低温の冷却媒体を用いて細胞をガラス化凍結させることが好ましい。速やかな冷却速度で凍結させることで、氷晶の形成が少ない状態で細胞が凍結保存されることが期待される。冷却媒体としては、液体窒素を用いることが好ましい。
　速やかな冷却速度で凍結させるために、細胞又は組織を、少量の凍結保存液とともに載置することが一般になされ、これにより、細胞又は組織の優れた生存性が達成される。一方で、少量の保存液とともに細胞又は組織を載置し凍結した場合、凍結後に融解する際、細胞又は組織の種類や状態等によって、しばしばシート上の細胞又は組織が載置部表面に固着してしまい、これらを回収する際に高い技量が要求されるという問題がある。特に、特許文献３に提案されているような濾紙等の吸収体を用いて余分なガラス化液を除く方法では、優れた冷却速度が達成される一方で、細胞又は組織の固着がより顕著になる問題があるが、本発明の凍結保存液を用いると、融解時に細胞又は組織が容易に剥離できることから、好適に使用できる。
　凍結保存された細胞は、細胞のガラス化状態が維持される極低温環境下で保存することで半永久的に保存することができる。ガラス化状態が維持される温度は、凍結保存液の組成によって異なるが、多くの場合－１５０℃以下が好ましい。このような温度が維持される環境としては、液体窒素保存容器中、気相窒素保存容器中が好ましい。
　以上、本発明の凍結保存方法における凍結作業について説明してきた。次に、融解作業について説明する。
　本発明の凍結保存液を用いた細胞又は組織の融解作業は、クライオトップ法のように一般に知られている方法によって行うことができる。凍結保存されたシート上に載置された細胞又は組織を取り出し、３７℃に温調された融解液中に直接接触させることで、凍結保存液と細胞又は組織を融解させるとともに凍結保存液を希釈する。この際、融解液中で、細胞又は組織をシート上から剥離する。シート上から細胞又は組織を穏やかに剥離することが、凍結・融解後の生存性の観点で好ましい。剥離した細胞又は組織は、所定時間後に、融解液中から、希釈液中に移し、所定時間浸漬させ、さらには洗浄液中に移す。このような作業により、徐々に浸透圧を変化させ、細胞内又は組織内の耐凍剤を希釈・除去し、穏やかな培養条件に戻していく作業がなされる。
　本発明の凍結保存液を用いて凍結保存することができる細胞として、例えば、哺乳類（例えば、人（ヒト）、牛、豚、馬、ウサギ、ラット、マウス等）の卵子、胚、精子等の生殖細胞；人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）等の多能性幹細胞が挙げられる。また、初代培養細胞、継代培養細胞、及び細胞株細胞等の培養細胞が挙げられる。また、細胞は、一又は複数の実施形態において、線維芽細胞、膵ガン・肝ガン細胞等のガン由来細胞、上皮細胞、血管内皮細胞、リンパ管内皮細胞、神経細胞、軟骨細胞、組織幹細胞、及び免疫細胞等の接着性細胞が挙げられる。さらに、凍結保存することができる組織として、同種又は異種の細胞からなる組織、例えば、卵巣、皮膚、角膜上皮、歯根膜、心筋等の組織が挙げられる。本発明は、特にシート状構造を有する組織（例えば、細胞シート、皮膚組織など）の凍結保存に好適である。本発明の凍結保存用治具は、直接生体から採取した組織だけでなく、例えば、生体外で培養し増殖させた培養皮膚、生体外で構築したいわゆる細胞シート、特開２０１２－２０５５１６号公報で提案されている三次元構造を有する組織モデルのような人工の組織の凍結保存についても、好適に用いることができる。本発明の凍結保存液は、上記のような細胞又は組織の凍結保存液として好適に用いることができる。
　以下に本発明を実施例によりさらに詳細に示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
　Ｌ－グルタミン、フェノールレッド、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（４－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）を含む市販のＭｅｄｉｕｍ１９９培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を基礎液として、有機溶媒系耐凍剤としてエチレングリコールを１５容量％とＤＭＳＯを１５容量％、糖類としてスクロースを０．５Ｍ、抗生物質としてゲンタマイシンを５０ｍｇ／Ｌ、ポリビニルアルコールである株式会社クラレ製のクラレポバールＰＶＡ５０５（ケン化度７３．５ｍｏｌ％）を０．５質量％含有する実施例１の凍結保存液を作製した。
（実施例２）
　クラレポバールＰＶＡ５０５の含有量を０．５質量％にかえて、０．９質量％とした以外は実施例１と同様にして、実施例２の凍結保存液を作製した。
（実施例３）
　クラレポバールＰＶＡ５０５の含有量を０．５質量％にかえて、１．８質量％とした以外は実施例１と同様にして、実施例３の凍結保存液を作製した。
（実施例４）
　クラレポバールＰＶＡ５０５の含有量を０．５質量％にかえて、２．５質量％とした以外は実施例１と同様にして、実施例４の凍結保存液を作製した。
（実施例５）
　クラレポバールＰＶＡ５０５を添加せず、ポリビニルアルコールである株式会社クラレ製のクラレポバールＰＶＡ４０３（ケン化度８０ｍｏｌ％）を０．９質量％含有させた以外は実施例１と同様にして、実施例５の凍結保存液を作製した。
（比較例１）
　ポリビニルアルコールであるクラレポバールＰＶＡ５０５を添加しなかった以外は、実施例１と同様にして、比較例１の凍結保存液を作製した。
（比較例２）
　クラレポバールＰＶＡ５０５を添加せず、ポリビニルアルコールである日本合成化学工業株式会社製のゴーセノール（登録商標）ＥＧ０５Ｐ（ケン化度８８ｍｏｌ％）を０．９質量％含有させた以外は実施例１と同様にして、比較例２の凍結保存液を作製した。
（比較例３）
　クラレポバールＰＶＡ５０５を添加せず、ポリビニルアルコールである株式会社クラレ製のクラレポバールＰＶＡ６１７（ケン化度９５ｍｏｌ％）を０．９質量％含有させた以外は実施例１と同様にして、比較例３の凍結保存液を作製した。
＜スフェアの調整＞
　細胞又は組織の剥離性の評価に用いるスフェアは以下のように調整した。マウス胚性線維芽細胞であるＭＥＦ細胞を培養シャーレ上で培養後、トリプシン処理により剥離、回収した。その後、住友ベークライト（株）製ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ９６Ｕプレートに５０細胞／ウェルの細胞数で播種し、浮遊培養することでスフェア形成を誘導した。培養３日後に直径約１００μｍのスフェアを得た。
＜凍結保存用治具１の準備＞
　　細胞又は組織の凍結保存作業に用いる凍結保存用治具は以下のようにして準備した。透明ＰＥＴフィルム上に接着層として、ヘンケルジャパン（株）製のホットメルトウレタン樹脂Ｐｕｒｍｅｌｔ（登録商標）ＱＲ　１７０－７１４１Ｐを乾燥時の固形分量３０ｇ／ｍ２となるように塗布した。なお、接着層の塗布は載置部領域には行わず、周辺のみとした。接着層が完全硬化する前に、保存液吸収体として、アドバンテック東洋（株）製の親水化処理されたポリテトラフルオロエチレン多孔体（細孔径０．２μｍ、空隙率７１％、厚み３５μｍ）を貼り合わせ、これを細胞又は組織を載置する載置部とした。この載置部を１．５ｍｍ×２０ｍｍの大きさに裁断し、載置部の短辺側をスティック状のＡＢＳ樹脂製把持部と接合させ、凍結保存用治具１を作製した。
＜凍結作業＞
　上記のように得たスフェアを培養液中から回収し、細管状の治具であるストリッパーピペッター（以下、ピペット）を用いて、少量の培養液とともに平衡化液中に移動させた。なお、平衡化液の組成は、前記Ｍｅｄｉｕｍ１９９培地を基礎液として、７．５容量％エチレングリコール、７．５容量％ＤＭＳＯ、５０ｍｇ／Ｌゲンタマイシンを含有させたものである。スフェアを平衡化液中で３分間浸漬させた後に、ピペットを用いて、少量の平衡化液とともに、実施例１～５又は比較例１～３の凍結保存液中に移した。スフェアを凍結保存液中で数回ピペッティングした後に、凍結保存液に浸漬後１分経過後のタイミングで、前記凍結保存用治具１の載置部上にピペットを用いて、スフェアを極少量の凍結保存液とともに、滴下付着させた。スフェアを滴下付着後、凍結保存液が自動的に保存液吸収体に吸収される様子を顕微鏡下で確認しながら、余分な凍結保存液が概ね吸収されたことを確認した後に、凍結保存用治具１の載置部上のスフェアを液体窒素に浸漬させ、凍結させた。以上が凍結作業である。凍結された凍結保存用治具１は、融解作業を行うまでの間、液体窒素中で保存した。
＜凍結作業における作業性の評価＞
　凍結作業における凍結保存液中でのピペット操作の際の作業性を以下の基準で評価した。これらの結果を表１の「凍結作業における作業性の評価」の項目に示す。
　凍結作業における作業性は以下の基準で評価した。
○：ピペット操作が容易な液物性であり、凍結保存液中でのピペッティング等の作業性は良好であった。
△：ピペット操作にやや支障がある液物性であったが、凍結保存液中でのピペッティング等の一連の作業は可能であった。
×：ピペット操作に支障のある液物性であり、ピペット操作が困難であった。
＜融解作業＞
　実施例１～５又は比較例１～３の凍結保存液によって凍結作業を行ったスフェアを以下の操作によりそれぞれ融解操作を行った。液体窒素中から凍結したスフェアを含む凍結保存用治具を取り出し、３７℃に温調した融解液中に、スフェアが載置された凍結保存用治具の載置部を浸漬した。融解液の組成は、前記Ｍｅｄｉｕｍ１９９培地を基礎液として、１Ｍのスクロース、５０ｍｇ／Ｌゲンタマイシンを含有するものである。融解液中に浸漬した載置部を顕微鏡下で観察しながら、スフェアを載置部上から剥離することを試みた。なお、スフェアの剥離作業は以下のように行った。融解液に載置部を浸漬後、６０秒間は静置しながらスフェアが載置部上から剥離する様子を観察した。融解液浸漬から６０秒経過後にスフェアが剥離しなかった場合には、載置部をゆすってスフェアの剥離を試みた。
＜融解作業における剥離性の評価＞
　融解作業における載置部上からのスフェアの剥離性を以下の基準で評価した。これらの結果を表１の「融解作業における剥離性の評価」の項目に示す。
　融解作業における剥離性は以下の基準で評価した。
◎：融解液浸漬後６０秒以内にスフェアが載置部上から剥離した。
○：融解液浸漬後６０秒経過後、載置部をゆすってスフェアを載置部上から剥離できた。
×：スフェアを回収することが容易にできないほどに固着しており、剥離できなかったか、回収の際にスフェアを構成する細胞がバラバラになってしまった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１の結果から、本発明の凍結保存液は、凍結作業時の作業性と融解作業時の剥離性に優れていることが分かる。
（比較例４）
　先に作製した凍結保存用治具１が有する保存液吸収体（親水化処理されたポリテトラフルオロエチレン多孔体）上に、ポリビニルアルコールである株式会社クラレ製クラレポバールＰＶＡ５０５（ケン化度７３．５ｍｏｌ％）の５質量％水溶液を、乾燥時の固形分量が５ｇ／ｍ２になるように、スライドホッパー方式で塗布し、室温乾燥後、１２０℃で４０時間の加熱処理を行い、凍結保存用治具２を得た。
＜凍結作業＞
　前述した凍結作業において、スフェアを平衡化液中で３分間浸漬させた後に、ピペットを用いて、少量の平衡化液とともに比較例１の凍結保存液中に移した。スフェアを該凍結保存液中で数回ピペッティングした後に、凍結保存液に浸漬後１分経過後のタイミングで、前記凍結保存用治具２の載置部上にピペットを用いて、スフェアを極少量の凍結保存液とともに、滴下付着させた。スフェアを滴下付着後、凍結保存液が自動的に保存液吸収体に吸収される様子を顕微鏡下で確認しながら、余分な凍結保存液が概ね吸収されたことを確認した後に、凍結保存用治具２の載置部上のスフェアを液体窒素に浸漬させ、凍結させた。凍結された凍結保存用治具２は、融解作業を行うまでの間、液体窒素中で保存した。
＜凍結作業における作業性の評価＞
　前記した凍結作業における作業性の評価と同様の基準で評価した。この結果、比較例１の凍結保存液を用いた際の作業性と同等との結果を得た。
＜融解作業における剥離性の評価＞
　前記した融解作業における剥離性の評価と同様の基準で評価した。この結果、融解液浸漬後、６０秒経過後に載置部をゆすっても載置部からスフィアを剥離することはできなかったが、９０秒経過後に載置部をゆすったところ、スフェアを載置部上から剥離できた。
　本発明は、牛などの家畜や動物の胚移植や人工授精、人への人工授精などの他、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、一般に用いられている培養細胞、生体から採取した検査用又は移植用の細胞又は組織、生体外で培養した細胞又は組織などの凍結保存に用いることができる。

Claims (3)

  1. 　ケン化度が８４ｍｏｌ％以下のポリビニルアルコールを含有することを特徴とする凍結保存液。
  2. 　前記ポリビニルアルコールのケン化度が７６ｍｏｌ％以下であることを特徴とする凍結保存液。
  3. 　平衡化処理した細胞又は組織を、前記請求項１又は請求項２に記載の凍結保存液に浸漬した後、極低温の冷却媒体を用いてガラス化凍結することを特徴とする凍結保存方法。
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