WO2019044736A1 - コリバクチンおよびコリバクチン産生菌の検出方法および検出プローブ - Google Patents

コリバクチンおよびコリバクチン産生菌の検出方法および検出プローブ Download PDF

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colibactin
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渡辺　賢二
雄太 恒松
道大 佐藤
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静岡県公立大学法人
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    • G01N2333/245—Escherichia (G)

Definitions

  • the present invention relates to a method and a detection probe for detecting colibactin and colibactin producing bacteria.
  • Kolibactin is known as a causative agent of colon cancer and is produced in the intestine by a specific group of E. coli. Kolibactin is thought to be active in cleaving DNA in animal cells, and it has also been reported that Kolibactin-producing bacteria have been detected in 67% of colon patients and 40% of inflammatory bowel disease patients.
  • Non-patent Document 1 the structure of myristoyl asparagine as a prodrug motif for colibactin and detection by LC-MS have been reported (Non-patent Document 1). To date, the chemical structure of Koribactin has not been determined.
  • the present invention provides methods and probes for detecting Koribactin and Koribactin-producing bacteria.
  • the present inventors have found that, using myristoyl asparagine, which is a prodrug motif of colibactin, colibactin and colibactin-producing bacteria can be detected from fecal samples (particularly dry fecal samples) and colorectal cancer tissue samples.
  • the present inventors have also succeeded in synthesizing a fluorescent probe that detects Kolibactin producing bacteria.
  • the present inventors have further found that the colibactin producing enzyme ClbP can be detected from a stool sample (in particular, a dried stool sample) or a colon cancer tissue sample by these fluorescent probes.
  • various fluorescent probes for detecting ClbP can be designed. The present invention is based on such findings.
  • composition according to [7] which is intended for a tissue sample or a stool sample.
  • tissue sample or stool sample is a human tissue sample or stool sample.
  • a method for detecting the presence of colibactin or colibactin producing E. coli in a biological sample comprising: Detecting the presence or absence of myristoyl asparagine in a biological sample.
  • the biological sample is a tissue sample or a stool sample.
  • the biological sample is human.
  • FIG. 1 is a chromatogram by liquid chromatography in which myristoyl asparagine, which is cleaved from Koribactin when Kolibactin is produced from a prodrug of Kolibactin, is detected in a dried fecal sample.
  • FIG. 2 shows that the fluorescent probe of the present invention exhibited fluorescence in a ClbP-dependent manner in a dried stool sample.
  • FIG. 3 shows that the fluorescent probe of the present invention exhibited fluorescence in a probe dependent on the colibactin-producing bacteria in a dried stool sample.
  • FIG. 4 shows the results of detection of E. coli isolated from human colon tissue samples by the probe of the present invention.
  • the vertical axis shows the fluorescence intensity by the probe I
  • the horizontal axis shows each sample.
  • the upper part of FIG. 4 shows the fluorescence intensity of the probe I with respect to the sample confirmed by the PCR method to contain the colibactin positive bacteria
  • the lower part of FIG. 4 shows the probe for the sample confirmed by the PCR method not containing the colibactin positive bacteria
  • the fluorescence intensity of I is shown.
  • the leftmost bars at the top and bottom of FIG. 4 are positive controls, and next to them are negative controls.
  • FIG. 5 shows the fluorescence intensity of probe I on a culture obtained by culturing E. coli isolated from a human stool sample.
  • the vertical axis shows the fluorescence intensity by the probe I
  • the horizontal axis shows each sample.
  • FIG. 6 shows the detection of a colibactin biosynthesis gene using a frozen human colon cancer tissue sample and a colon normal tissue sample of the same patient, and the colibactin biosynthesis gene in a bacterium obtained by culturing the homogenate of the tissue sample. The percentage of positive bacteria is shown.
  • FIG. 7 shows the results of detection of myristoyl-D-asparagine in bacterial cultures obtained by culturing.
  • colibactin is known as a molecule involved in the development of colon cancer, and it has been known from biochemical analysis that it is a low molecular weight compound produced by a specific E. coli in enteric E. coli. However, its detailed chemical structure has not been clarified yet. On the other hand, colibactin is synthesized as an inactive prodrug in E. coli, and in the periplasm of E. coli, the prodrug motif is removed by intramolecular cleavage, thereby producing colibactin extracellularly in E. coli.
  • colibactin producer is meant a bacterium that produces koribactin. In the gut, a specific group of Escherichia coli is known to produce colibactin, but not all mammals (especially humans) carry colibactin-producing bacteria. It is known that Kolibactin producing bacteria have Kolibactin polyketide synthesis gene cluster on the genome. The Kolibactin polyketide synthesis gene cluster encodes a protein involved in the biosynthesis pathway of Kolibactin.
  • ClbP is one of the genes present in the colibactin polyketide synthesis gene cluster (eg, GenBank accession No .: AM229678.1).
  • the ClbP gene encodes, for example, a protein registered in GenBank: CAJ76284.1.
  • the protein encoded by ClbP has a property as a peptidase, and cleaves a peptide bond (amide bond) that links the target molecule Koribactin prodrug Koribactin and myristoyl asparagine.
  • ClbP is expressed in the periplasm of E. coli, and is considered to convert the colibactin prodrug into colibactin in the periplasm.
  • fluorescing in a ClbP-dependent manner means that, when hydrolysis is caused intramolecularly by a protein encoded by the ClbP gene, thereby acquiring fluorescence.
  • to obtain fluorescence means that excitation light of a specific wavelength comes to emit fluorescence of a specific wavelength.
  • obtaining fluorescence depending on the excitation light of a specific wavelength, those which do not emit fluorescence of a specific wavelength or are below the detection threshold will have fluorescence above the detection threshold Used in a sense that
  • a "subject” is a warm-blooded animal and may be a bird or a mammal.
  • mammals for example, primates such as monkeys, chimpanzees, gorillas, orangutans, bonobos and humans, or for example, domestic animals such as pigs, cows, horses, goats and sheep, or pets such as dogs and There is a cat.
  • the birds include, for example, chickens.
  • "patient” or "person” when referring to a subject as “patient” or “person” is a term directed to human and non-human warm-blooded animals.
  • the subject may preferably be a healthy individual, a patient with inflammatory bowel disease, a patient suspected of having inflammatory bowel disease, a colon cancer patient, or a patient suspected of having colon cancer.
  • fecal sample means a sample comprising feces excreted from a subject.
  • a stool sample is a sample that is usually excreted via the anus.
  • the fecal sample may be a dried or lyophilised sample.
  • the stool sample may be in a ground form (eg, in powder form).
  • fluorescent dye refers to a chemical that can be excited by excitation light of a specific wavelength and emit light (fluorescent light) of another specific wavelength.
  • fluorescent probe refers to a compound that emits fluorescence at a specific wavelength under certain conditions or a compound that increases its fluorescence intensity. Therefore, in the present specification, a compound that cleaves and fluoresces in a ClbP-dependent manner is called a fluorescent probe.
  • Myristoyl asparagine has the following structure:
  • myristoyl asparagine has a structure in which the carboxyl group of myristic acid and the amino group of asparagine are linked by an amide bond.
  • Koribactin prodrugs have a structure in which Koribactin and myristoyl asparagine (prodrug motif) are linked via an amide bond.
  • the coumarin-based fluorescent dye has the following basic skeleton (hereinafter, also referred to as "coumarin skeleton").
  • the above compound hardly emits fluorescence as it is, but when an electron donating group is introduced at the 7-position of the coumarin skeleton, it exhibits strong absorbance and emits fluorescence.
  • a strong fluorescent dye can be obtained by introducing an electron donating group having a high electron donating property at the 7-position.
  • myristoyl asparagine can be linked to the amino group such that the electron donating property of the electron donating group at the 7-position (amino group) is lowered.
  • the electron donating property of the electron donating group at position 7 of the coumarin based fluorescent dye can be reduced.
  • a compound in which the carboxyl group of myristoyl asparagine is linked to another compound via an amide bond is recognized by the enzyme encoded by ClbP, and cleaved to myristoyl asparagine and the other compound at the amide bond.
  • a compound in which the carboxyl group of myristoyl aspartic acid and the amino group at position 7 of the coumarin skeleton of the coumarin-based fluorescent dye are linked by an amide bond can be recognized by the enzyme encoded by ClbP. It exhibits fluorescence in a ClbP-dependent manner. Therefore, such compounds can be used for detection of the enzyme encoded by ClbP, detection of the colibactin biosynthesis gene cluster, detection of colibactin producing E. coli, and / or detection of colibactin.
  • the present invention provides a compound in which the amino group of a compound having an amino group at the 7 position of the coumarin skeleton of a coumarin-based fluorescent dye and the carboxyl group of myristoyl asparagine are linked by an amide bond, and a fluorescent probe containing the compound.
  • the coumarin skeleton is methyl optionally substituted at the 4-position (eg, -CH 3 , -CN, -CH 2 OH, methyl substituted by 1 to 3 halogens, such as -CF 3 and -CH 2 Br Etc.). Examples of such a compound include the following compounds.
  • naphthalimide fluorescent dyes can be similarly used to design compounds or probes that emit fluorescence in a ClbP-dependent manner.
  • R is naphthalimide skeleton, in particular such as but not limited, substituted optionally alkyl also a C 1-6, optionally substituted in a C 1-6 alkenyl, optionally substituted C 1-6 May be alkynyl.
  • naphthalimide fluorescent dye a compound having an amino group at the 4-position of the naphthalene ring and having the amino group and the carboxyl group of myristoyl asparagine linked by an amide bond is cleaved at the amide bond moiety depending on ClbP.
  • Naphthalimide fluorescent dyes that are fluorescent include the following compounds.
  • naphthalene substituted with an amino group, pyrene substituted with an amino group, and anthracene substituted with an amino group also depend on ClbP by connecting the carboxyl group of myristoyl asparagine with the amino group via an amide bond. It is possible to cleave at an amide bond and to generate a fluorescent probe.
  • Naphthalene, pyrene and anthracene may have an amino group which preferably forms an amide bond at its 2-position.
  • such compounds include the following compounds.
  • rhodamine fluorescent dyes when an electron donating group (for example, an amino group) is present at position 3 and 9 of the xanthene skeleton of the rhodamine fluorescent dye, the compound emits strong fluorescence and reduces the electron donating properties of these electron donating groups Thus, the fluorescence can be reduced. Therefore, any one or all of the amino groups of the rhodamine-based fluorescent dye having an amino group at position 3 and / or 9 of the xanthene skeleton, the carboxyl group of myristoyl asparagine and the amino group are linked by an amide bond In this case, it is possible to cleave at an amide bond in a ClbP-dependent manner and to generate a fluorescent probe.
  • an electron donating group for example, an amino group
  • a compound can be provided in which each of the amino groups of a rhodamine-based fluorescent dye having an amino group at the 3rd and 9th positions of the xanthene skeleton and the carboxyl group of myristoyl asparagine are linked by an amide bond.
  • examples of such a compound include the following compounds.
  • Bodipy has a Bodipy mother core structure (4,4-difluoro-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene) shown below.
  • the compound in which the amino group of the Bodipy fluorescent dye having an amino group at position 1 and / or 7 of the mother nucleus and the carboxyl group of myristoyl asparagine are linked by an amide bond is cleaved at the amide bond moiety depending on ClbP.
  • a probe that emits fluorescence As such a compound, for example, a compound having the following structure is mentioned.
  • a compound having the following structure may be cleaved at the amide bond in a ClbP-dependent manner, and may be a probe that emits fluorescence.
  • a compound having the following structure is mentioned.
  • the fluorescence due to the coumarin skeleton is quenched with PET at the pyridine ring in the molecule, but by cleaving with ClbP, the coumarin-based fluorescent dye is designed to be released to emit fluorescence.
  • a dye having a phenolic fluorescent group (oFlu) that emits fluorescence due to the free hydroxyl group such as TokyoGreen may also be cleaved at the amide bond moiety in a ClbP-dependent manner, resulting in a probe that emits fluorescence.
  • the following compounds are such compounds.
  • the self-cleavable linker which is a linker that links the fluorochrome moiety and the myristoyl asparagine moiety
  • the following linkers can be used.
  • the structure shown on the left is the structure of the linker and the corresponding structure shown on the right shows the mechanism of cleavage.
  • myristoyl asparagine By linking myristoyl asparagine to oFlu via such a linker, it can be cleaved at the amide bond moiety in a ClbP-dependent manner and a probe that emits fluorescence can be obtained.
  • a probe that emits fluorescence In the same way, TokyoGreen, TokyoMagenta, Oregon Green, SNAFL, carboxyfluorescein, carboxyfluorescein, carboxyfluorescein diacetate, fluorescein, and fluorescein isocyanate (FITC), and the amino group to be linked to the carboxyl group of myristoyl asparagine was replaced with a hydroxyl group
  • a compound in which the hydroxyl group of a compound selected from oFlu, such as a compound, is amide-bonded to the carboxyl group of myristoyl asparagine via a self-cleavable linker may be cleaved at the amide bond moiety in a ClbP-
  • the fluorescent compound or the fluorescent probe may be in the form of a salt and / or a solvate, and in addition to the free form, the form of the salt and / or a solvate is also specified by the chemical formula etc. Compounds or probes shall be included.
  • the solvent includes water, ethanol and other solvents, and when the solvent is water, it is called hydrate.
  • alanine when myristoyl asparagine is linked to a fluorescent dye via alanine (—NH—CH (CH 3 ) —CO—), alanine may be deleted.
  • myristoyl asparagine in the case where myristoyl asparagine is directly linked to the fluorescent dye without alanine, myristoyl asparagine may be linked to the fluorescent dye via alanine. This is because the cleavage activity by the enzyme encoded by the ClbP gene allows the alanine to be mediated.
  • Alanine forms an amide bond with the carboxyl group of myristoyl asparagine, and forms an amide bond with the amino group of the fluorescent dye, whereby myristoyl asparagine can be linked to the fluorescent dye.
  • a fluorescent probe comprising the above-mentioned compound.
  • a colivactin producing microorganism comprising the above-mentioned compound or a fluorescent probe, for detecting a microorganism having a colibactin biosynthesis gene cluster, and / or detecting a colibactin
  • a composition for use in the present invention is provided. These compositions are for use in detecting Kolibactin producing microorganisms in fecal samples, for use in detecting microorganisms having the Koribactin biosynthesis gene cluster, and / or for detecting Kolibactin (or Koribactin's It can be a composition for use in estimating the presence.
  • the probe of the present invention is cleaved in the presence of the enzyme encoded by the ClbP gene to fluoresce. Therefore, the probe of the present invention can be used to evaluate the presence or absence of the enzyme encoded by the ClbP gene in the contacted sample, using the intensity of its fluorescence as an indicator, or to evaluate the presence or absence of colibactin positive bacteria.
  • the fluorescence intensity for the sample to be evaluated may be evaluated in comparison to the fluorescence intensity of the inventive probe.
  • the fluorescence intensity when the fluorescence intensity is higher than the average value, the third quartile value, or the first quartile value of the fluorescence intensity of the probe of the present invention for samples obtained respectively from a group of patients in which Koribactin-positive bacteria are detected
  • the sample to be evaluated may be evaluated as containing Kolibactin positive bacteria.
  • Koribactin when the fluorescence intensity is lower than the first quartile value of the fluorescence intensity of the probe of the present invention for each of the samples obtained from the patient group in which Koribactin-positive bacteria are detected, Koribactin It may be evaluated that no positive bacteria are contained.
  • the fluorescence intensity is higher than the average, the third quartile, or the first quartile of the fluorescence intensity of the probe of the present invention for each of the samples obtained from the patient group in which Koribactin-positive bacteria were not detected. If it is low, the sample to be evaluated may be evaluated as containing no colibactin positive bacteria. Also, for example, when the fluorescence intensity of the probe of the present invention for each of the samples obtained from a group of patients in which Koribactin-positive bacteria are not detected is higher in fluorescence intensity, the sample to be evaluated is It may be evaluated that it contains Kolibactin positive bacteria.
  • the threshold is, for example, a numerical value between the maximum value and the third quartile value of the fluorescence intensity of the probe of the present invention for each of the samples obtained from the patient group in which Koribactin-positive bacteria are detected.
  • which may be any value between the maximum value and the mean value, and may be any value between the maximum value and the first quartile value, the mean value and the third quartile It can be any number between the values, it can be any number between the mean value and the first quartile value, or the third quartile value and the first quartile value It may be any numerical value in between.
  • the threshold may be, for example, the maximum, the first quartile, the mean, and the third quartile of the fluorescence intensity of the probe of the present invention for each of the samples obtained from the patient group in which Koribactin-positive bacteria were detected. Any one between the maximum value or the third quartile of the fluorescence intensity of the probe of the present invention for one sample selected from the group consisting of It may be a numeric value. And, when the fluorescence intensity of the probe relative to the measured sample is higher than the threshold value, it can be evaluated that the sample contains or is likely to contain Kolibactin-positive bacteria, and / or If it is lower than the threshold value, it can be evaluated that the sample does not contain or is likely to contain the colibactin positive bacteria.
  • the threshold value is, for example, any value between the maximum value and the third quartile value of the fluorescence intensity of the probe of the present invention for each of the samples obtained from the patient group in which Koribactin-positive bacteria were not detected. May be any value between the maximum and the mean value, any value between the maximum and the first quartile value, the mean value and the third quartile value And any numerical value between the mean and the first quartile value, or between the third quartile value and the first quartile value It may be any numerical value of Alternatively, the threshold value may be, for example, the maximum value, the first quartile, the average value, and the third quartile of the fluorescence intensity of the probe of the present invention for each sample obtained from a group of patients in whom Koribactin positive bacteria were not detected Any one of the lowest value or the first quartile value of the fluorescence intensity of the probe of the present invention to one sample selected from the group consisting of the samples and the samples respectively obtained from the patient groups in which Koribactin-positive bacteria were detected
  • the fluorescence intensity of the probe relative to the measured sample is higher than the threshold value, it can be evaluated that the sample contains or is likely to contain Kolibactin-positive bacteria, and / or If it is lower than the threshold value, it can be evaluated that the sample does not contain or is likely to contain the colibactin positive bacteria.
  • the threshold value can be, for example, the maximum value of the fluorescence intensity of the probe of the present invention with respect to the samples obtained respectively from the patient group in which no colibactin positive bacteria were detected. And, when the fluorescence intensity of the probe relative to the measured sample is higher than the threshold value, it can be evaluated that the sample contains or is likely to contain Kolibactin-positive bacteria, and / or If it is lower than the threshold value, it can be evaluated that the sample does not contain or is likely to contain the colibactin positive bacteria.
  • the threshold value can be, for example, the lowest value of the fluorescence intensity of the probe of the present invention with respect to the samples obtained respectively from the patient group in which the colibactin positive bacteria are detected. And, when the fluorescence intensity of the probe relative to the measured sample is higher than the threshold value, it can be evaluated that the sample contains or is likely to contain Kolibactin-positive bacteria, and / or If it is lower than the threshold value, it can be evaluated that the sample does not contain or is likely to contain the colibactin positive bacteria.
  • the threshold value may be, for example, the lowest value of the fluorescence intensity of the probe of the present invention for each of the samples obtained from the group of patients in which Koribactin-positive bacteria were detected and the sample obtained from each group of patients in which It can be any value between the maximum value of the fluorescence intensity of the probe of the present invention for.
  • the fluorescence intensity of the probe relative to the measured sample is higher than the threshold value, it can be evaluated that the sample contains or is likely to contain Kolibactin-positive bacteria, and / or If it is lower than the threshold value, it can be evaluated that the sample does not contain or is likely to contain the colibactin positive bacteria.
  • the false positive rate decreases while the false negative rate increases, and if the threshold decreases, the false positive rate increases while the false negative rate increases. It can be understood that it decreases, which will allow to set the threshold according to the purpose at that time.
  • a method of predicting the presence of colibactin or colibactin producing E. coli in a biological sample comprising: A method is provided, comprising detecting the presence or absence of myristoyl asparagine in a biological sample.
  • the biological sample is a fecal sample, for example a human fecal sample.
  • the biological sample is a tissue sample comprising cancer tissue or tissue suspected of being a cancer, eg, a human tissue sample ⁇ wherein the tissue sample is a frozen sample May be ⁇ .
  • myristoyl asparagine was detected means that the active form of colibactin was produced from the inactive form of the prodrug. Accordingly, detection of myristoyl asparagine in a biological sample means that the biological sample contains colibactin.
  • the fact that Koribactin is contained in the biological sample indicates that the Kolibactin-producing bacteria (for example, E.
  • the fact that myristoyl asparagine was detected in a stool sample by the method of the present invention means that colibactin and / or colibactin-producing bacteria (for example, E. coli) are present in the large intestine of a subject (for example, human) from which the biological sample is derived. Indicates to do. Koribactin is known as a cause of colorectal cancer.
  • the methods of the present invention can be used to determine whether a subject (eg, a human) has a predisposition for suffering from colorectal cancer.
  • the method of the present invention may be a method that does not include medical practice for a human by a doctor (ie, an industrially available method).
  • fecal samples may be cultured under conditions suitable for growth of E. coli and subsequently analyzed.
  • the detection sensitivity of colibactin and colibactin-producing bacteria is improved.
  • the isolation of Koribactin positive bacteria is not essential.
  • a method of predicting the presence of colibactin or colibactin producing E. coli in a biological sample comprising: A method is provided, comprising detecting the presence or absence of the enzyme activity of an enzyme encoded by ClbP in a biological sample.
  • the presence or absence of the enzyme activity of the enzyme encoded by ClbP can be determined using a fluorescent compound or a fluorescent probe that cleaves in a ClbP-dependent manner to acquire fluorescence.
  • the activity of the enzyme encoded by ClbP could also be detected using a fecal sample, in particular a dried fecal sample.
  • the biological sample can be a stool sample or a dried stool sample.
  • Example 1 Detection of Kolibactin This example attempted to detect Koribactin from a biological sample.
  • Koribactin is a chemical substance of unknown structure. It is known that colibactin is produced as a prodrug in the cells of E. coli having a colibactin production system. This colibactin prodrug is cleaved into myristoyl asparagine (prodrug motif) and colibactin by an enzyme on the inner membrane in the periplasm of E. coli to produce active colibactin. In this example, it was attempted to detect a prodrug motif in a biological sample.
  • human feces (23 cases) collected from a volunteer with no lesion in the large intestine was used as a biological sample.
  • E. coli genomic DNA was extracted from a stool sample and purified. Thereafter, in order to confirm whether or not E. coli having a colibactin production system is present in the sample, the clbA gene, the clbJ gene and the clbQ gene among the genes of the colibactin biosynthesis gene cluster are amplified by PCR, and the presence or absence is confirmed did.
  • the primers used for amplification of each gene were as follows: clbA forward primer GTTCAATATCGACACCAAGCTCGCAGT clbA reverse primer ACCCGTTATCTCTGCGTGAAGACAAGTATTG clbJ forward primer TGGCCTGTATTGAAAGAGCACCGTT clbJ reverse primer AATGGGAACGGTTGATGACGATGCT clbQ forward primer CTGTGTCTTACGATGGTGGATGCCG clbQ reverse primer GCATTACCAGATTGTCAGCATCGCC Among the 23 cases, amplification of the clbA gene, the clbJ gene and the clbQ gene was confirmed in 2 cases, and it was shown that E. coli having the colibactin biosynthesis gene cluster was present in feces.
  • prodrug motifs were extracted and purified from feces according to the following procedure, and subjected to LC-MS. Specifically, about 40 mg of stool after drying was suspended in milliQ water. Then, 800 ⁇ L of ethyl acetate was added and stirred. After centrifuging at 4 ° C. for 10 minutes, the ethyl acetate layer was collected and further centrifuged. The precipitate was dissolved in 50 ⁇ L of DMF, further centrifuged, and the supernatant was subjected to LC-MS analysis (Q Exactive). When a cell sample is used, 10 mL of ethyl acetate was added to E.
  • E. coli DH5 ⁇ was used as a negative control
  • Nissle 1917 was used as a positive control
  • E. coli isolated as confirmed to encode the colibactin biosynthesis gene was used as a cell culture sample. The results were as shown in FIG.
  • Example 2 Design of a Probe for Detecting Escherichia coli Having a Colibactin Production System
  • a probe capable of detecting E. coli having a colibactin production system was designed.
  • a compound (probe 1) having a structure in which a carboxyl group of myristoyl asparagine was linked to an amino group of a fluorescent dye aminomethyl coumarin (AMC) by an amide bond was designed and synthesized.
  • the electron donating property of the amino group at position 7 of AMC is lowered by the linkage of myristoyl asparagine, and does not emit fluorescence.
  • the peptide binding portion is cleaved by the enzyme encoded by the ClbP gene of the colibactin biosynthesis gene cluster to generate AMC which is a fluorescent dye, the presence or absence of the enzyme encoded by ClbP can be determined by fluorescence. This can be a probe for detecting the colibactin biosynthesis gene cluster.
  • Example 3 Detection of Escherichia coli having a colibactin production system in a biological sample
  • Example 1 As a biological sample, feces of a patient who was found to have the colibactin biosynthesis gene cluster in Example 1 was used.
  • Lyophilized feces (4 samples obtained from different human subjects) are suspended in 200 ⁇ l of 10 cups of Saji (estimated 40 mg), in milliQ water, and probe 20 in 20 mM DMSO at a final concentration of 20 ⁇ M. The solution was added to give (final concentration of DMSO 0.1%). Thereafter, it was shaken at 37 ° C. and 100 rpm for 24 hours or more. After the reaction, 200 ⁇ L of the reaction solution was taken, and 200 ⁇ L of the centrifuged supernatant was directly detected at ⁇ ex 380 mm / ⁇ em 460 mm (not extracted).
  • Fecal samples may be cultured under conditions suitable for growth of E. coli and then analyzed. According to this example, since the amount of colibactin-producing Escherichia coli is increased by the culture, the detection sensitivity of colibactin and colibactin-producing bacteria is improved.
  • Example 4 Assay Using Cultured E. coli
  • E. coli producing the colibactin could be determined from E. coli producing the colibactin and E. coli not producing the same.
  • strains 1246 and 1649T were used, and as E. coli producing colibactin, strains 5263, 5491 and Nissle were used.
  • Example 5 Detection of colibactin-positive bacteria from E. coli isolated from colon tissue samples
  • E. coli was isolated by homogenizing human colon tissue samples in physiological saline, applying it on MacConkey plate medium, and culturing. In order to confirm whether E. coli having the colibactin production system is present in the sample, clbB is amplified using the following primers among the genes of the colibactin biosynthesis gene cluster by PCR, and colibactin is indicated using the presence or absence of the amplified fragment as an indicator It was evaluated whether it was a positive bacteria. clbB forward primer tgttccgttttgtgtgtgtgtctcagcg clbB reverse primer gtgcgctgaccattgaagatttccg
  • E. coli isolated as described above from the colon tissue samples in which Koribactin-positive bacteria were detected by the above PCR method and the colon tissue specimens in which Koribactin-positive bacteria were not detected. 100 samples of each were prepared. In each well of the 96-well plate, 100 ⁇ L of LB liquid medium containing 100 ⁇ M probe (assay A) and 100 ⁇ L of LB liquid medium without probe (assay B) were dispensed. A very small amount of one E. coli strain colony on the plating medium (the extent to which it adheres to the tip of the toothpick) was added to each well of assay A and assay B.
  • the fluorescence was measured after standing culture of the plate at 37 ° C. for 24 hours.
  • ⁇ ex 380 mm / ⁇ em 460 mm is measured using a plate reader to determine the difference between the fluorescence intensities of assay A and assay B (background), and the threshold is 100, the ratio is 100 or more. It was judged as positive and evaluated as negative when it was less than 100.
  • the vertical axis represents fluorescence intensity ( ⁇ ex 380 mm / ⁇ em 460 mm), and the horizontal axis represents each sample.
  • the probe I detected Koribactin positive bacteria with 100% accuracy, and the ratio (false positive rate) judged negative bacteria as positive was less than 1%.
  • the leftmost bars in the upper and lower portions of FIG. 4 are positive controls, and the bars next to them are negative controls. From this result, it was confirmed that the probe of the present invention is useful in the detection of Koribactin positive bacteria.
  • Probe I can be applied to a culture obtained by dissolving a fecal sample in water and then culturing it to detect Koribactin-positive bacteria. It was confirmed.
  • Fecal samples obtained from humans were dissolved in water, applied to a plate containing MacConkey medium, and cultured at 37 ° C. for 12 hours.
  • the obtained reddish purple colonies were inoculated in LB liquid medium containing 100 ⁇ M of probe I, cultured for 24 hours, and fluorescence ( ⁇ ex 380 mm / ⁇ em 460 mm) was measured with a plate reader.
  • fluorescence ⁇ ex 380 mm / ⁇ em 460 mm
  • Probe I was able to detect Koribactin-positive bacteria present in stool samples with high sensitivity and high accuracy.
  • Example 7 Detection of Koribactin-positive bacteria in cancer patient tissues stored in a frozen state
  • Koribactin is produced by PCR for tissues including colon cancer tissues stored in a frozen state and their surrounding tissues. Synthetic genes were examined. Thereafter, the tissue homogenizing solution was cultured, and myristoyl-D-asparagine contained in the obtained culture was quantified.
  • the colibactin biosynthesis gene was detected in 8 samples (57.1%) in cancer tissues and in 1 sample (7.1%) in normal tissues among all 14 subjects-derived samples (see FIG. 6).
  • the homogenized solution derived from the above-mentioned tissue was applied to MacConkey agar medium to obtain a culturable bacteria obtained therefrom.
  • the presence or absence of the colibactin biosynthesis gene in the obtained colonies was confirmed by the colony PCR method, and it was found that 36 out of 220 colonies derived from cancer tissues were positive for the colibactin biosynthesis gene (16.4) %) (See FIG. 6).
  • 103 colonies derived from normal tissue only one colony was positive for colibactin biosynthesis gene (0.9%).

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Abstract

本発明は、コリバクチンおよびコリバクチン産生菌の検出方法および検出プローブを提供する。本発明によれば、例えば、組織検体および糞便試料を用いたミリストイルアスパラギンの検出、およびＣｌｂＰの酵素活性を検出する蛍光プローブが提供される。

Description

コリバクチンおよびコリバクチン産生菌の検出方法および検出プローブ
　本発明は、コリバクチンおよびコリバクチン産生菌の検出方法および検出プローブに関する。
　コリバクチンは、大腸がんの原因因子として知られ、大腸菌の特定の一群により腸内で産生される。コリバクチンは、動物細胞中のＤＮＡを切断する活性があると考えられ、大腸患者の６７％、炎症性腸疾患患者の４０％からコリバクチン産生菌が検出されたとの報告もなされている。
　コリバクチンに関しては、コリバクチンのプロドラッグモチーフとしてのミリストイルアスパラギンの構造およびＬＣ－ＭＳによる検出が報告されている（非特許文献１）。現在までのところ、コリバクチンの化学構造は決定されていない。
Ｂｒｏｔｈｅｒｔｏｎ　ＣＡ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｏｒｇ．　Ｌｅｔｔ．，　Ｖｏｌ．１７，　Ｐａｇｅ．１５４５－１５４８　（２０１５）
　本発明は、コリバクチンおよびコリバクチン産生菌の検出方法および検出プローブを提供する。
　本発明者らは、コリバクチンのプロドラッグモチーフであるミリストイルアスパラギンを利用するとコリバクチンおよびコリバクチン産生菌を糞便試料（特に乾燥糞便試料）や大腸がん組織検体から検出することができることを見出した。本発明者らはまた、コリバクチン産生菌を検出する蛍光プローブを合成することに成功した。本発明者らはさらに、これらの蛍光プローブによりコリバクチン産生酵素ＣｌｂＰを糞便試料（特に乾燥糞便試料）や大腸がん組織検体から検出することができることを見出した。本発明者らはさらにまた、同様の原理に基づいて、ＣｌｂＰを検出する蛍光プローブを各種設計できることを見出した。本発明はこのような知見に基づくものである。
　本発明によれば、例えば以下の発明が提供される。
［１］以下に示される、化合物または蛍光プローブ：
（Ａ）クマリン骨格の７位にアミノ基を有するクマリン系蛍光色素の当該アミノ基とミリストイルアスパラギンのカルボキシル基とがアミド結合で連結した化合物または蛍光プローブ；
（Ｂ）ナフタルイミド骨格の４位にアミノ基を有するナフタルイミド系蛍光色素の当該アミノ基とミリストイルアスパラギンのカルボキシル基とがアミド結合で連結した化合物または蛍光プローブ；
（Ｃ）２位にアミノ基を有するナフタレン、ピレンまたはアントラセンの当該アミノ基とミリストイルアスパラギンのカルボキシル基とがアミド結合で連結した化合物または蛍光プローブ；
（Ｄ）キサンテン骨格の３位および／または９位にアミノ基を有するローダミン系蛍光色素の当該アミノ基の一部または全部のそれぞれとミリストイルアスパラギンのカルボキシル基とがアミド結合で連結した化合物または蛍光プローブ；
（Ｅ）Ｂｏｄｉｐｙ母核の１位および／または７位にアミノ基を有するＢｏｄｉｐｙ系蛍光色素の当該アミノ基の一部または全部のそれぞれとミリストイルアスパラギンのカルボキシル基とがアミド結合で連結した化合物または蛍光プローブ；
（Ｆ）上記（Ａ）～（Ｅ）において、前記カルボキシル基と前記アミノ基とがアラニン（－ＮＨ－ＣＨ（ＣＨ３）－ＣＯ－）で連結された化合物（それぞれアラニンとアミド結合を形成する）または蛍光プローブ；
（Ｇ）ミリストイルアスパラギンのカルボキシル基と水酸基がフリーになることで蛍光性となる蛍光基であるｏＦｌｕの水酸基とが、自己開裂性リンカーを介して連結した化合物であって、自己開裂性リンカーは、ミリストイルアスパラギンのカルボキシル基とアミド結合で連結しており、当該アミド結合が加水分解されると、分解してｏＦｌｕの水酸基をフリーにする、化合物または蛍光プローブ；および
（Ｈ）ミリストイルアスパラギンのカルボキシル基とアミド結合により連結した蛍光色素を有する化合物であって、アミド結合がＣｌｂＰ依存的に開裂すると、その後、蛍光を発する、化合物または蛍光プローブ
からなる群から選択される、化合物または蛍光プローブ。
［２］上記［１］に記載の化合物または蛍光プローブであって、
（Ａ）クマリン骨格の７位にアミノ基を有するクマリン系蛍光色素の当該アミノ基とミリストイルアスパラギンのカルボキシル基とがアミド結合で連結した化合物または蛍光プローブである、化合物または蛍光プローブ。
［３］上記［１］に記載の化合物または蛍光プローブであって、
（Ｂ）ナフタルイミド骨格の４位にアミノ基を有するナフタルイミド系蛍光色素の当該アミノ基とミリストイルアスパラギンのカルボキシル基とがアミド結合で連結した化合物または蛍光プローブである、化合物または蛍光プローブ。
［４］上記［１］に記載の化合物または蛍光プローブであって、
（Ｃ）２位にアミノ基を有するナフタレン、ピレンまたはアントラセンの当該アミノ基とミリストイルアスパラギンのカルボキシル基とがアミド結合で連結した化合物または蛍光プローブである、化合物または蛍光プローブ。
［５］上記［１］に記載の化合物または蛍光プローブであって、
（Ｄ）キサンテン骨格の３位および／または９位にアミノ基を有するローダミン系蛍光色素の当該アミノ基の一部または全部のそれぞれとミリストイルアスパラギンのカルボキシル基とがアミド結合で連結した化合物または蛍光プローブである、化合物または蛍光プローブ。
［６］上記［１］に記載の化合物または蛍光プローブであって、
（Ｅ）Ｂｏｄｉｐｙ母核の１位および／または７位にアミノ基を有するＢｏｄｉｐｙ系蛍光色素の当該アミノ基の一部または全部のそれぞれとミリストイルアスパラギンのカルボキシル基とがアミド結合で連結した化合物または蛍光プローブである、化合物または蛍光プローブ。
［７］上記［１］～［６］のいずれかに記載の化合物または蛍光プローブを含む、コリバクチン産生微生物を検出することに用いるための、コリバクチン生合成遺伝子クラスターを有する微生物を検出することに用いるための、および／またはコリバクチンを検出することに用いるための組成物。
［８］組織検体または糞便試料を対象とする、上記［７］に記載の組成物。
［９］組織検体または糞便試料が、ヒトの組織検体または糞便試料である、上記［８］に記載の組成物。
［１０］生体試料においてコリバクチンまたはコリバクチン産生大腸菌の存在を検出する方法であって、
　生体試料中でミリストイルアスパラギンの有無を検出することを含む、方法。
［１１］生体試料が、組織検体または糞便試料である、上記［１０］に記載の方法。
［１２］生体試料が、ヒト由来である、上記［１０］または［１１］に記載の方法。
図１は、コリバクチンのプロドラッグからコリバクチンが生成される際にコリバクチンから切り離されるミリストイルアスパラギンを乾燥糞便試料中で検出した液体クロマトグラフィーによるクロマトグラムである。 図２は、本発明の蛍光プローブにより乾燥糞便試料中のＣｌｂＰ依存的にプローブが蛍光を示したことを示す図である。 図３は、本発明の蛍光プローブにより乾燥糞便試料中のコリバクチン産生菌依存的にプローブが蛍光を示したことを示す図である。 図４は、ヒト大腸組織検体から単離された大腸菌を本発明のプローブにより検出した結果を示す。縦軸はプローブＩによる蛍光強度を示し、横軸は各サンプルを示す。図４上段は、コリバクチン陽性菌を含むことがＰＣＲ法により確認された試料に対するプローブＩの蛍光強度を示し、図４下段は、コリバクチン陽性菌を含まないことがＰＣＲ法により確認された試料に対するプローブＩの蛍光強度を示す。図４の上段および下段の最左のバーはポジティブコントロールであり、その隣はネガティブコントロールである。 図５は、ヒト糞便試料より分離した大腸菌を培養して得られた培養物に対するプローブＩの蛍光強度を示す。縦軸はプローブＩによる蛍光強度を示し、横軸は各サンプルを示す。最左のバーはポジティブコントロールであり、最右のバーはネガティブコントロールである。 図６は、凍結されたヒト大腸がん組織検体および同一患者の大腸正常組織検体を用いたコリバクチン生合成遺伝子の検出と、当該組織検体のホモジェネートを培養して得られたバクテリアにおけるコリバクチン生合成遺伝子陽性バクテリアの割合を示す。 図７は、培養して得られたバクテリアの培養物中のミリストイル－Ｄ－アスパラギンの検出結果を示す。
発明の詳細な説明
　「コリバクチン」とは、大腸がんの発生に関わる分子として知られ、腸内の大腸菌のうち特定の大腸菌により産生される低分子化合物であることが生化学的分析から分かっている。しかし、その詳細な化学構造は未だ明らかにされていない。一方で、コリバクチンは、大腸菌体内では不活性なプロドラッグとして合成され、大腸菌のペリプラズムにおいて、プロドラッグモチーフが分子内開裂により除去され、これにより大腸菌の細胞外においてコリバクチンが産生される。
　「コリバクチン産生菌」とは、コリバクチンを産生する細菌を意味する。腸内では、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）の特定の一群がコリバクチンを産生することが知られているが、全ての哺乳動物（特にヒト）がコリバクチン産生菌を保有するわけではない。コリバクチン産生菌は、コリバクチンポリケチド合成遺伝子クラスターをゲノム上に有していることが知られている。コリバクチンポリケチド合成遺伝子クラスターには、コリバクチンの生合成経路に関わるタンパク質がコードされている。
　本明細書では、「ＣｌｂＰ」とは、コリバクチンポリケチド合成遺伝子クラスター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．：　ＡＭ２２９６７８．１）内に存在する遺伝子の１つである。ＣｌｂＰ遺伝子は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ：　ＣＡＪ７６２８４．１に登録されているタンパク質をコードする。ＣｌｂＰによりコードされるタンパク質はペプチダーゼとしての性質を有しており、標的分子であるコリバクチンプロドラッグのコリバクチンとミリストイルアスパラギンを連結するペプチド結合（アミド結合）を切断する。ＣｌｂＰは、大腸菌のペリプラズムに発現し、コリバクチンプロドラッグをペリプラズムでコリバクチンに変換していると考えられる。
　本明細書では、「ＣｌｂＰ依存的に蛍光を発する」とは、ＣｌｂＰ遺伝子によりコードされるタンパク質によって分子内で加水分解が生じると、これにより蛍光性を獲得することを意味する。本明細書では、「蛍光性を獲得する」とは、特定波長の励起光によって特定波長の蛍光を発するようになることを意味する。例えば、「蛍光性を獲得する」という用語には、特定波長の励起光によっては特定波長の蛍光性を発しないかまたは検出閾値以下であるものが、検出閾値以上の蛍光性を有するようになることを含む意味で用いられる。
　本明細書では、「対象」とは、温血動物であり、鳥類または哺乳動物であり得る。哺乳動物としては、例えば、霊長類、例えば、サル、チンパンジ、ゴリラ、オランウータン、ボノボおよびヒト、あるいは例えば、家畜、例えば、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、およびヒツジ、あるいは、ペット、例えば、イヌおよびネコが挙げられる。鳥類としては、例えば、ニワトリが挙げられる。本明細書では、対象に対して「患者」または「者」と表現した場合、「患者」または「者」は、ヒトおよび非ヒト温血動物に向けられた用語である。本明細書では、対象は、好ましくは健常者、炎症性腸疾患患者、炎症性腸疾患が疑われる患者、大腸がん患者、または大腸がんが疑われる患者であり得る。
　本明細書では、「糞便試料」とは、対象から排出された糞便を含む試料を意味する。糞便試料は、通常は肛門を介して排出された試料である。糞便試料は、乾燥または凍結乾燥された試料であってもよい。糞便試料は、粉砕された形態（例えば、粉末状）であってもよい。
　本明細書では、「蛍光色素」とは、特定波長の励起光により励起され、別の特定波長の光（蛍光）を発することができる化学物質をいう。本明細書では、「蛍光プローブ」とは、ある特定の条件下で特定波長の蛍光を発する化合物またはその蛍光強度が高まる化合物をいう。従って、本明細書では、ＣｌｂＰ依存的に開裂して蛍光を発する化合物は蛍光プローブと呼ばれる。
　ミリストイルアスパラギンは、以下の構造を有する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　すなわち、ミリストイルアスパラギンは、ミリスチン酸のカルボキシル基とアスパラギンのアミノ基がアミド結合で連結した構造を有する。
　コリバクチンプロドラッグは、コリバクチンとミリストイルアスパラギン（プロドラッグモチーフ）がアミド結合で連結した構造を有する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　クマリン系蛍光色素は、以下の基本骨格（以下、「クマリン骨格」ともいう）を有する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　上記化合物はそのままではほとんど蛍光を発しないが、上記クマリン骨格の７位に電子供与基を導入すると強い吸光性を示し、蛍光を発するようになる。この原理を利用して、７位に電子供与性の高い電子供与基を導入することで強い蛍光色素を得ることができる。
　本発明では、７位の電子供与基（アミノ基）の電子供与性が低下するようにミリストイルアスパラギンを当該アミノ基に連結させることができる。例えば、７位の電子供与基（アミノ基）とミリストイルアスパラギンのカルボキシル基とをアミド結合で連結させることにより、クマリン系蛍光色素の７位の電子供与基の電子供与性を低下させることができる。一方で、本発明では、ミリストイルアスパラギンのカルボキシル基がアミド結合で他の化合物と連結した化合物は、ＣｌｂＰによりコードされる酵素により認識され、アミド結合の箇所でミリストイルアスパラギンと当該他の化合物とに開裂させることができる。
　従って、本発明によれば、ミリストイルアスパラギン酸のカルボキシル基とクマリン系蛍光色素のクマリン骨格の７位のアミノ基とをアミド結合で連結させた化合物は、ＣｌｂＰによりコードされる酵素により認識され得、ＣｌｂＰ依存的に蛍光を発揮する。従って、このような化合物は、ＣｌｂＰによりコードされる酵素の検出、コリバクチン生合成遺伝子クラスターの検出、コリバクチン産生大腸菌の検出、および／または、コリバクチンの検出に用いることができる。
　本発明では、クマリン系蛍光色素のクマリン骨格の７位にアミノ基を有する化合物の当該アミノ基とミリストイルアスパラギンのカルボキシル基とがアミド結合で連結した化合物、および当該化合物を含む蛍光プローブが提供される。クマリン骨格は、４位に置換されていてもよいメチル（例えば、－ＣＨ３、－ＣＮ、－ＣＨ２ＯＨ、１～３個のハロゲンにより置換されたメチル、例えば－ＣＦ３および－ＣＨ２Ｂｒなど）を有していてもよい。このような化合物としては、例えば、以下の化合物が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　また、ナフタルイミド系蛍光色素も同様にしてＣｌｂＰ依存的に蛍光を発する化合物またはプローブの設計に利用できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 　上記ナフタルイミド骨格においてＲは、特に限定されないが例えば、置換されていてもよいＣ１－６のアルキル、置換されていてもよいＣ１－６のアルケニル、置換されていてもよいＣ１－６のアルキニルであり得る。
　ナフタルイミド系蛍光色素に関しては、そのナフタレン環の４位にアミノ基を有し、当該アミノ基とミリストイルアスパラギンのカルボキシル基とをアミド結合で連結した化合物は、ＣｌｂＰ依存的にアミド結合部分で開裂し、蛍光性であるナフタルイミド系蛍光色素を生じ得る。このようなフタルイミド系のプローブとしては、例えば、以下の化合物が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　同様に、アミノ基で置換されたナフタレン、アミノ基で置換されたピレン、およびアミノ基で置換されたアントラセンも、ミリストイルアスパラギンのカルボキシル基と当該アミノ基とをアミド結合で連結させることにより、ＣｌｂＰ依存的にアミド結合部分で開裂し、蛍光を発するプローブたり得る。ナフタレン、ピレンおよびアントラセンは、好ましくはその２位においてアミド結合を形成するアミノ基を有し得る。例えば、このような化合物としては、以下の化合物が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　ローダミン系蛍光色素に関しては、ローダミン系蛍光色素のキサンテン骨格の３位と９位に電子供与基（例えば、アミノ基）が存在すると強い蛍光を発し、これらの電子供与基の電子供与性を低下させることで蛍光性を低下させることができる。従って、キサンテン骨格の３位および／または９位にアミノ基を有するローダミン系蛍光色素の当該アミノ基のいずれか１つまたは全部と、ミリストイルアスパラギンのカルボキシル基と当該アミノ基とをアミド結合で連結させることにより、ＣｌｂＰ依存的にアミド結合部分で開裂し、蛍光を発するプローブたり得る。例えば、キサンテン骨格の３位および９位にアミノ基を有するローダミン系蛍光色素の当該アミノ基のそれぞれとミリストイルアスパラギンのカルボキシル基とがアミド結合で連結した化合物が提供され得る。このような化合物としては、例えば、以下の化合物が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　Ｂｏｄｉｐｙ系蛍光色素でも同様である。Ｂｏｄｉｐｙは、以下に示すＢｏｄｉｐｙ母核構造（４，４－ジフルオロ－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン）を有する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　上記母核の１位および／または７位にアミノ基を有するＢｏｄｉｐｙ系蛍光色素の前記アミノ基とミリストイルアスパラギンのカルボキシル基とがアミド結合で連結した化合物は、ＣｌｂＰ依存的にアミド結合部分で開裂し、蛍光を発するプローブたり得る。そのような化合物としては、例えば、以下の構造を有する化合物が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　その他、例えば、以下の構造を有する化合物は、ＣｌｂＰ依存的にアミド結合部分で開裂し、蛍光を発するプローブたり得る。そのような化合物としては、例えば、以下の構造を有する化合物が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　なお、プローブ８では、クマリン骨格による蛍光が、分子内のピリジン環でＰＥＴにより消光しているが、ＣｌｂＰにより開裂させることで、クマリン系蛍光色素が遊離し蛍光を発するように設計されている。
　また、ＴｏｋｙｏＧｒｅｅｎなどの水酸基がフリーになることで蛍光を発するフェノール性の蛍光基（ｏＦｌｕ）を有する色素も、ＣｌｂＰ依存的にアミド結合部分で開裂し、蛍光を発するプローブたり得る。例えば、以下の化合物はそのような化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
　自己開裂性リンカー（蛍光色素部分とミリストイルアスパラギン部分とを連結するリンカーである）としては、例えば、以下のリンカーを用いることができる。以下では、左に示される構造がリンカーの構造であり、右に示される対応する構造が開裂の機構を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
　このようなリンカーを介して、ミリストイルアスパラギンとｏＦｌｕとを連結させることでＣｌｂＰ依存的にアミド結合部分で開裂し、蛍光を発するプローブたり得る。同様の仕組みで、ＴｏｋｙｏＧｒｅｅｎ、ＴｏｋｙｏＭａｇｅｎｔａ、オレゴングリーン、ＳＮＡＦＬ、カルボキシフルオレセイン、カルボキシフルオレセインジアセテート、フルオレセイン、およびフルオレセインイソシアネート（ＦＩＴＣ）、並びに上記ミリストイルアスパラギンのカルボキシル基と連結させるべきアミノ基がヒドロキシル基に置き換わった化合物などのｏＦｌｕから選択される化合物の水酸基を自己開裂性リンカーを介してミリストイルアスパラギンのカルボキシル基とアミド結合させた化合物が、ＣｌｂＰ依存的にアミド結合部分で開裂し、蛍光を発するプローブたり得る。
　本発明では、蛍光化合物または蛍光プローブは、塩および／または溶媒和物の形態であってもよく、遊離形態に加えて塩および／または溶媒和物の形態も上記で示される化学式等で特定される化合物またはプローブには含まれるものとする。溶媒和物では、溶媒としては水、エタノールその他の溶媒が挙げられ、溶媒が水である場合には水和物と呼ばれる。
　上記において、ミリストイルアスパラギンがアラニン（－ＮＨ－ＣＨ（ＣＨ３）－ＣＯ－）を介して蛍光色素と連結している場合、アラニンは欠失していてもよい。上記において、ミリストイルアスパラギンがアラニンを介さずに直接蛍光色素と連結している場合は、ミリストイルアスパラギンをアラニンを介して蛍光色素と連結させてもよい。これは、ＣｌｂＰ遺伝子によりコードされる酵素による切断活性がアラニンの介在を許容することによる。なお、アラニンは、ミリストイルアスパラギンのカルボキシル基との間でアミド結合を形成し、蛍光色素のアミノ基との間でアミド結合を形成し、これによりミリストイルアスパラギンと蛍光色素とを連結することができる。
　本発明によれば、上記化合物を含む蛍光プローブが提供される。本発明によればまた、上記化合物または蛍光プローブを含む、コリバクチン産生微生物を検出することに用いるための、コリバクチン生合成遺伝子クラスターを有する微生物を検出することに用いるための、および／またはコリバクチンを検出することに用いるための組成物が提供される。これらの組成物は、糞便試料において、コリバクチン産生微生物を検出することに用いるための、コリバクチン生合成遺伝子クラスターを有する微生物を検出することに用いるための、および／またはコリバクチンを検出する（またはコリバクチンの存在を推定する）ことに用いるための組成物であり得る。
　本発明のプローブは、ＣｌｂＰ遺伝子によりコードされる酵素の存在下で切断され、蛍光を発する。従って、本発明のプローブは、その蛍光の強度を指標として、接触させた試料中にＣｌｂＰ遺伝子によりコードされる酵素の有無を評価することに用いることができ、または、コリバクチン陽性菌の有無を評価することに用いることができる。ある態様では、コリバクチン陽性菌が検出された患者群からそれぞれ得られた試料に対する本発明のプローブの蛍光強度、および／または、コリバクチン陽性菌が検出されなかった患者群からそれぞれ得られた試料に対する本発明のプローブの蛍光強度と比較して、評価する試料に対する蛍光強度を評価してもよい。例えば、コリバクチン陽性菌が検出された患者群からそれぞれ得られた試料に対する本発明のプローブの蛍光強度の平均値、第３四分位値、または第１四分位値よりも蛍光強度が高い場合には、評価する試料には、コリバクチン陽性菌が含まれていると評価してもよい。また例えば、コリバクチン陽性菌が検出された患者群からそれぞれ得られた試料に対する本発明のプローブの蛍光強度の第１四分位値よりも蛍光強度が低い場合には、評価する試料には、コリバクチン陽性菌が含まれていないと評価してもよい。また例えば、コリバクチン陽性菌が検出されなかった患者群からそれぞれ得られた試料に対する本発明のプローブの蛍光強度の平均値、第３四分位値、または第１四分位値よりも蛍光強度が低い場合には、評価する試料には、コリバクチン陽性菌が含まれていないと評価してもよい。また例えば、コリバクチン陽性菌が検出されなかった患者群からそれぞれ得られた試料に対する本発明のプローブの蛍光強度の第三子分位値よりも蛍光強度が高い場合には、評価する試料には、コリバクチン陽性菌が含まれていると評価してもよい。
　この意味では、閾値は、例えば、コリバクチン陽性菌が検出された患者群からそれぞれ得られた試料に対する本発明のプローブの蛍光強度の最大値と第３四分位値との間のいずれかの数値であり得、最大値と平均値との間のいずれかの数値であり得、最大値と第１四分位値との間のいずれかの数値であり得、平均値と第３四分位値との間のいずれかの数値であり得、平均値と第１四分位値との間のいずれかの数値であり得、または第３四分位値と第１四分位値との間のいずれかの数値であり得る。あるいは、閾値は、例えば、コリバクチン陽性菌が検出された患者群からそれぞれ得られた試料に対する本発明のプローブの蛍光強度の最大値、第１四分位値、平均値および第３四分位値からなる群から選択される１つの値とコリバクチン陽性菌が検出されなかった患者群からそれぞれ得られた試料に対する本発明のプローブの蛍光強度の最大値または第３四分位値との間のいずれかの数値であり得る。そして、測定した試料に対するプローブの蛍光強度が閾値よりも高い場合には、試料にはコリバクチン陽性菌が含まれている、または含まれている可能性が高いと評価することができ、および／または、閾値よりも低い場合には、試料には、コリバクチン陽性菌が含まれていない、または含まれていない可能性が高いと評価することができる。
　また、閾値は、例えば、コリバクチン陽性菌が検出されなかった患者群からそれぞれ得られた試料に対する本発明のプローブの蛍光強度の最大値と第３四分位値との間のいずれかの数値であり得、最大値と平均値との間のいずれかの数値であり得、最大値と第１四分位値との間のいずれかの数値であり得、平均値と第３四分位値との間のいずれかの数値であり得、平均値と第１四分位値との間のいずれかの数値であり得、または第３四分位値と第１四分位値との間のいずれかの数値であり得る。あるいは、閾値は、例えば、コリバクチン陽性菌が検出されなかった患者群からそれぞれ得られた試料に対する本発明のプローブの蛍光強度の最大値、第１四分位値、平均値および第３四分位値からなる群から選択される１つの値とコリバクチン陽性菌が検出された患者群からそれぞれ得られた試料に対する本発明のプローブの蛍光強度の最低値または第１四分位値との間のいずれかの数値であり得る。そして、測定した試料に対するプローブの蛍光強度が閾値よりも高い場合には、試料にはコリバクチン陽性菌が含まれている、または含まれている可能性が高いと評価することができ、および／または、閾値よりも低い場合には、試料には、コリバクチン陽性菌が含まれていない、または含まれていない可能性が高いと評価することができる。
　あるいは、閾値は、例えば、コリバクチン陽性菌が検出されなかった患者群からそれぞれ得られた試料に対する本発明のプローブの蛍光強度の最大値とすることができる。そして、測定した試料に対するプローブの蛍光強度が閾値よりも高い場合には、試料にはコリバクチン陽性菌が含まれている、または含まれている可能性が高いと評価することができ、および／または、閾値よりも低い場合には、試料には、コリバクチン陽性菌が含まれていない、または含まれていない可能性が高いと評価することができる。
　あるいは、閾値は、例えば、コリバクチン陽性菌が検出された患者群からそれぞれ得られた試料に対する本発明のプローブの蛍光強度の最低値とすることができる。そして、測定した試料に対するプローブの蛍光強度が閾値よりも高い場合には、試料にはコリバクチン陽性菌が含まれている、または含まれている可能性が高いと評価することができ、および／または、閾値よりも低い場合には、試料には、コリバクチン陽性菌が含まれていない、または含まれていない可能性が高いと評価することができる。
　あるいは、閾値は、例えば、コリバクチン陽性菌が検出された患者群からそれぞれ得られた試料に対する本発明のプローブの蛍光強度の最低値とコリバクチン陽性菌が検出されなかった患者群からそれぞれ得られた試料に対する本発明のプローブの蛍光強度の最大値との間のいずれかの値とすることができる。そして、測定した試料に対するプローブの蛍光強度が閾値よりも高い場合には、試料にはコリバクチン陽性菌が含まれている、または含まれている可能性が高いと評価することができ、および／または、閾値よりも低い場合には、試料には、コリバクチン陽性菌が含まれていない、または含まれていない可能性が高いと評価することができる。
　また、コリバクチン陽性菌が検出された患者群および、コリバクチン陽性菌が検出されなかった患者群は、ＰＣＲ法によりコリバクチン生合成遺伝子が試料から検出されるか否かや、ミリストイル－Ｄ－アスパラギンが試料から検出されるか否かにより予め決定しておくことができる。
　当業者であれば、上記の判定のための閾値を高めれば、偽陽性率が低下する一方で、偽陰性率が高まり、閾値を低くすれば、偽陽性率が高まる一方で、偽陰性率が低下することを理解し得、これにより、そのときの目的に応じて閾値を設定することができるであろう。
　本発明によれば、
　生体試料においてコリバクチンまたはコリバクチン産生大腸菌の存在を予測する方法であって、
　生体試料中でミリストイルアスパラギンの有無を検出することを含む、方法
が提供される。
　本発明の方法のある態様では、生体試料は糞便試料であり、例えば、ヒトの糞便試料である。本発明の方法のある態様では、生体試料はがん組織またはがんであると疑われる組織を含む組織検体であり、例えば、ヒトの組織検体である｛ここで、組織検体は凍結された検体であってもよい｝。ミリストイルアスパラギンが検出されたということは、不活性型であるプロドラッグ形態から活性化型であるコリバクチンが産生されたことを意味する。従って、生体試料にミリストイルアスパラギンが検出されたことは、当該生体試料にコリバクチンが含まれることを意味する。生体試料にコリバクチンが含まれているということからは、糞便試料にコリバクチン産生菌（例えば、大腸菌）が存在していることが分かる。すなわち、本発明の方法で糞便試料中にミリストイルアスパラギンが検出されたということは、生体試料が由来する対象（例えば、ヒト）の大腸に、コリバクチンおよび／またはコリバクチン産生菌（例えば、大腸菌）が存在することを示す。コリバクチンは、大腸がんの原因として知られている。従って、本発明の方法は、対象（例えば、ヒト）が大腸がんに罹患する素因を有しているかを判定することに用いることができる。本発明の方法は、医師によるヒトに対する医療行為を含まない方法（すなわち、産業上利用可能な方法）であり得る。
　本発明のある態様では、糞便試料は、大腸菌の増殖に適した条件下で培養し、その後分析してもよい。本発明者らによれば、培養によりコリバクチン産生大腸菌の量が増えるため、コリバクチンやコリバクチン産生菌の検出感度が向上した。本発明では、コリバクチン陽性菌の単離は必須ではない。
　本発明によれば、
　生体試料においてコリバクチンまたはコリバクチン産生大腸菌の存在を予測する方法であって、
　生体試料中でＣｌｂＰによりコードされる酵素の酵素活性の有無を検出することを含む、方法
が提供される。
　ＣｌｂＰによりコードされる酵素の酵素活性の有無は、ＣｌｂＰ依存的に開裂して蛍光性を獲得する蛍光化合物または蛍光プローブを用いて決定することができる。
　本発明によれば、ＣｌｂＰによりコードされる酵素の活性は、糞便試料（特に乾燥された糞便試料）を用いても検出することができた。従って、本発明によれば、生体試料は、糞便試料または乾燥された糞便試料とすることができる。
実施例１：コリバクチンの検出
　本実施例は、生体試料からのコリバクチンの検出を試みた。
　具体的には、コリバクチンは、構造未知の化学物質である。コリバクチンは、コリバクチン産生系を有する大腸菌の菌体内でプロドラッグとして産生されることが知られている。このコリバクチンのプロドラッグは、大腸菌のペリプラズムにおいて内膜上の酵素により、ミリストイルアスパラギン（プロドラッグモチーフ）とコリバクチンとに開裂し、活性型コリバクチンを産生する。本実施例では、プロドラッグモチーフを生体試料中で検出することを試みた。
　本実施例では、生体試料として、大腸に病変を認めないボランティアから採取されたヒトの糞便（２３例）を用いた。まず、糞便試料から大腸菌ゲノムＤＮＡを抽出し、精製した。その後、コリバクチン産生系を有する大腸菌が試料中に存在するか否かを確認するため、ＰＣＲによりコリバクチン生合成遺伝子クラスターの遺伝子のうち、ｃｌｂＡ遺伝子、ｃｌｂＪ遺伝子およびｃｌｂＱ遺伝子を増幅し、その有無を確認した。
　各遺伝子の増幅に用いたプライマーは以下の通りであった：
clbAフォワードプライマー　GTTCAATATCGACACCAAGCTCGCAGT
clbAリバースプライマー　　ACCCGTTATCTCTGCGTGAAAGACAAGTATTG
clbJフォワードプライマー　TGGCCTGTATTGAAAGAGCACCGTT
clbJリバースプライマー　　AATGGGAACGGTTGATGACGATGCT
clbQフォワードプライマー　CTGTGTCTTACGATGGTGGATGCCG
clbQリバースプライマー　　GCATTACCAGATTGTCAGCATCGCC
　２３例中、２例において、ｃｌｂＡ遺伝子、ｃｌｂＪ遺伝子およびｃｌｂＱ遺伝子の増幅が確認され、コリバクチン生合成遺伝子クラスターを有する大腸菌が糞便中に存在することが示された。
　そのうち、一例について、糞便から以下の手順によりプロドラッグモチーフを抽出、精製し、ＬＣ－ＭＳに供した。具体的には、乾燥後の約４０ｍｇの糞便をｍｉｌｌｉＱ水に懸濁した。次いで、８００μＬの酢酸エチルを加えて攪拌した。４℃で１０分間遠心し、酢酸エチル層を採取し、さらに遠心濃縮した。沈殿を５０μＬのＤＭＦに溶かし、さらに遠心して上清をＬＣ－ＭＳ解析（Ｑ　Ｅｘａｃｔｉｖｅ）に供した。菌体試料を用いる場合には、１０ｍＬのＬＢ培地で３７℃で２４時間振とう培養した大腸菌に対して１０ｍＬの酢酸エチルを加え、攪拌した後に遠心分離し、酢酸エチル層を採取した。遠心濃縮して沈殿を５０μＬのＤＭＦに溶かし、さらに遠心して上清をＬＣ－ＭＳ解析（Ｑ　Ｅｘａｃｔｉｖｅ）に供した。
　ＬＣ－ＭＳ条件は以下の通りであった。
カラム条件：
ＡＣＱＵＩＴＹ　ＵＰＬＣ　ＨＳＳ　Ｃ１８　Ｃｏｌｕｍｎ
２．１×５０ｍｍ　Ｃｏｌｕｍｎ
溶媒条件：
Ａ：　Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ＝９５／５　（０．０５％　ＦＡ）
Ｂ：　ＭｅＣＮ　（０．０５％　ＦＡ）
ＨＰＬＣ条件：
（１）　Ｂ　１０％→５０　％　グラジエント（０　～　５　ｍｉｎ）
（２）　Ｂ　５０％　イソクラティック　（５　～　７．５　ｍｉｎ）
（３）　Ａ　１００　％　（７．５　～　１１　ｍｉｎ　）
　ネガティブコントロールとして大腸菌ＤＨ５αを用い、ポジティブコントロールとしてＮｉｓｓｌｅ　１９１７を用い、菌体培養試料としてコリバクチン生合成遺伝子をコードしていることが確かめられた我々が分離した大腸菌を用いた。結果は、図１に示される通りであった。
　図１に示されるように、上記患者の糞便から、ポジティブコントロールや菌体培養試料と同じ保持時間を有し、プロドラッグモチーフに固有の質量電荷比（ｍ／ｚ＋　３４３．２５９１）を示すピークが検出された。このことから、コリバクチンのプロドラッグモチーフは糞便試料から直接的に検出し得ることが明らかとなった。このプロドラッグモチーフはコリバクチンに固有であることから、糞便試料においてプロドラッグモチーフが検出されたということは、糞便試料に構造未知のコリバクチン（活性型）が存在することを示す。このようにして、本実施例では、糞便試料においてプロドラッグモチーフを検出することにより、コリバクチンの存在を検出することができることが明らかとなった。
実施例２：コリバクチン産生系を有する大腸菌を検出するプローブの設計
　本実施例では、コリバクチン産生系を有する大腸菌を検出することができるプローブを設計した。
　蛍光色素であるアミノメチルクマリン（ＡＭＣ）のアミノ基にミリストイルアスパラギンのカルボキシル基とがアミド結合により連結した構造を有する化合物（プローブ１）を設計し、合成した。この化合物は、ＡＭＣの７位のアミノ基の電子供与性がミリストイルアスパラギンの連結により低下しており、蛍光を発しない。しかし、コリバクチン生合成遺伝子クラスターのＣｌｂＰ遺伝子によりコードされる酵素によりペプチド結合部分が開裂し、蛍光色素であるＡＭＣを生成すれば、蛍光によりＣｌｂＰによりコードされる酵素の有無を判定することができ、これによりコリバクチン生合成遺伝子クラスターを検出するプローブとなり得る。
プローブ１の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
　５０　ｍＬナスフラスコにＢｏｃ－Ｄ－Ａｓｎ－ＯＨ　３００　ｍｇ（１．３　ｍｍｏｌ）、７－Ａｍｉｎｏ－４－ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎ　（ＡＭＣ）１７６　ｍｇ（１．０　ｍｍｏｌ）、Ｏ－（７－Ａｚａ－１Ｈ－ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌ－１－ｙｌ）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｕｒｏｎｉｕｍ　ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ　（ＨＡＴＵ）　４００　ｍｇ（１．１　ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－４－ａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ　（ＤＭＡＰ）一欠片（触媒量）を量り取り、窒素置換後にＤｒｙ　Ｎ，Ｎ－ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ　（ＤＭＦ）　５　ｍＬに溶かした。Ｎ，Ｎ－ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ　（ＤＩＥＡ）　１５０　μＬ（０．９　ｍｍｏｌ）を加え、室温で４日間撹拌した。飽和重曹水　３５　ｍＬを加え、よく撹拌後、不溶物をろ別して回収し、真空ラインで減圧濃縮し、アミド１を２６　ｍｇ（０．０６７　ｍｍｏｌ，　収率６．７％）得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
　２６　ｍｇ（０．０６７　ｍｍｏｌ）のアミド１を５０　ｍＬナスフラスコに取り、ジクロロメタン　１　ｍＬ及びｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ　（ＴＦＡ）　１　ｍＬを加えて室温で１時間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、トルエンで２回共沸した。得られた粗脱Ｂｏｃ体２はそのまま次の反応に用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
　５０　ｍＬナスフラスコに粗脱Ｂｏｃ体２、ミリスチン酸　２０　ｍｇ（０．０８８　ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ　３０　ｍｇ（０．０７８　ｍｍｏｌ）を量り取り、窒素雰囲気下にした後、Ｄｒｙ　ＤＭＦ　１　ｍＬ、ＤＩＥＡ　１００　μＬ（０．５７　ｍｍｏｌ）を加え、室温で４時間撹拌した。反応液に飽和重曹水　１０　ｍＬを加え、酢酸エチル５０　ｍＬで３回抽出した。得られた有機層をまとめて濃縮し、得られた生成物をＨＰＬＣ［５Ｃ１８－ＭＳ－ＩＩ（φ２０　ｘ　２５０　ｍｍ），アセトニトリル－Ｈ２Ｏ　グラジエント７０－１００％　１　ｈ］で精製し、６　ｍｇ（０．０１２　ｍｍｏｌ，　二段回収率１８％）のプローブ１を得た。
プローブ２の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
　３０　ｍＬナスフラスコにＢｏｃ－Ｌ－Ａｌａ－ＯＨ　９８　ｍｇ（０．５２　ｍｍｏｌ）、ＡＭＣ　６０　ｍｇ　（０．３４　ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ　３８０　ｍｍｏｌ（１．０　ｍｍｏｌ）を量り取り、窒素置換後にＤｒｙ　ＤＭＦ　２　ｍＬ、ＤＩＥＡ　２００　μＬ（１．１５　ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ　一欠片（触媒量）を加え、室温で１日撹拌した。反応液に飽和重曹水　８　ｍＬを加え、酢酸エチル／ヘキサン（４／１）　５　ｍＬで３回抽出した。有機層をあわせて、飽和食塩水５　ｍＬで一度洗浄した後、減圧濃縮して粗生成物を２４０　ｍｇ得た。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［関東化学株式会社シリカゲル６０Ｎ　１００－２１０　μｍ　５　ｇ，　（クロロホルム／メタノール＝１／０→３０／１→１５／１）］、及びＨＰＬＣ［５Ｃ１８－ＭＳ－ＩＩ（φ２０　ｘ　２５０　ｍｍ），　４５％アセトニトリル－Ｈ２Ｏ］で精製し、９１　ｍｇ　（０．２６　ｍｍｏｌ，　収率７６％）のアミド３を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
　３０　ｍＬナスフラスコにアミド２　２１　ｍｇ　（０．０６２　ｍｍｏｌ）を量り取り、ジクロロメタン　０．５　ｍＬとＴＦＡ　０．５　ｍＬを加えて室温で一時間撹拌した。得られた反応液を減圧濃縮し、トルエン共沸を５回行い、粗脱Ｂｏｃ体４を得た。得られた粗脱Ｂｏｃ体４はそのまま次の反応に用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
　３０　ｍＬナスフラスコに粗脱Ｂｏｃ体４、Ｂｏｃ－Ｄ－Ａｓｎ－ＯＨ　２０　ｍｇ（０．０８８　ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ　２５　ｍｇ（０．０６７　ｍｍｏｌ）を加え、窒素置換後にＤｒｙ　ＤＭＦ　１　ｍＬに溶かした。ＤＩＥＡ　１００　μＬ（０．５８　ｍｍｏｌ）を加えて、室温で１１時間撹拌した。得られた反応液に飽和重曹水　５　ｍＬを加え、酢酸エチル　５　ｍＬで４回抽出した。得られた有機層をまとめて硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮した。さらにＨ２Ｏ　５　ｍＬを加えて凍結乾燥し、粗アミド５を３９　ｍｇ得た。得られたアミド５はそのまま次
の反応に用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
　３０　ｍＬナスフラスコに粗アミド５　３９　ｍｇ、ジクロロメタン０．５　ｍＬ、ＴＦＡ　０．５　ｍＬを量り取り、室温で一時間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、トルエン共沸を２回行った。得られた粗脱Ｂｏｃ体６はそのまま次の反応に用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
　３０　ｍＬナスフラスコに粗脱Ｂｏｃ体６、ミリスチン酸　２０　ｍｇ（０．０８７　ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ　２５．１　ｍｇ（０．０６６　ｍｍｏｌ）を量り取り、窒素置換後、Ｄｒｙ　ＤＭＦ　１　ｍＬを加えた。ＤＩＥＡ　１００　μＬ（０．５８　ｍｍｏｌ）を加えて室温で３時間撹拌した。反応液に飽和重曹水１０　ｍＬを加え、不溶物をろ別し、飽和重曹水と水で洗浄した。残った不溶物を集め、ＤＭＦ可溶部をＨＰＬＣ［５Ｃ１８－ＭＳ－ＩＩ（φ２０　ｘ　２５０　ｍｍ），　アセトニトリル－Ｈ２Ｏ　グラジエント５０－１００％　１　ｈ］で精製し、ＣｌｂＰ　ｐｒｏｂｅ　ＩＩ　３．８　ｍｇ　（６．７　μｍｏｌ，　４段階収率１１％）を得た。
実施例３：生体試料におけるコリバクチン産生系を有する大腸菌の検出
　生体試料としては、実施例１でコリバクチン生合成遺伝子クラスターを有することが分かった患者の糞便を用いた。
　凍結乾燥後の糞便（異なるヒト対象から得られた４サンプル）を、サジ１０杯分（推定４０ｍｇ）すくい、ｍｉｌｌｉＱ水　２００　μｌに懸濁し、さらにプローブ１の２０　ｍＭ　ＤＭＳＯ溶液を終濃度が２０　μＭになるように加えた（ＤＭＳＯ終濃度０．１％）。その後、３７　℃，　１００　ｒｐｍで２４時間以上振盪した。反応後、反応液２００　μＬを取り、遠心した上清２００　μＬをそのままλｅｘ３８０　ｍｍ／λｅｍ４６０　ｍｍで検出した（未抽出）。またさらに反応液２００　μＬを取り、酢酸エチル５００　μＬを加えてよく懸濁後、遠心して上清の酢酸エチル層を４５０　μＬ回収し、濃縮した。濃縮物にｍｉｌｌｉＱ水２００　μＬを加え、よく懸濁後に遠心し、上清２００　μＬをλｅｘ３８０　ｍｍ／λｅｍ４６０　ｍｍで検出した（抽出後）。結果は、図２に示される通りであった。図２においては、４つの糞便試料の検出結果は、それぞれ「糞便あり＿１」～「糞便あり＿４」に分けて図示された。
　図２に示されるように、糞便と接触させることによりプローブの蛍光が回復することが示された。これは、糞便中にＣｌｂＰ遺伝子によりコードされる酵素が存在し、この酵素によりプローブが切断され、蛍光性のＡＭＣが生成したことを意味するものである。このことから、上記のように設計したプローブの蛍光強度を指標として、糞便試料中にコリバクチン生合成遺伝子クラスターを有する大腸菌の存在を検出することができることが明らかとなった。図２の結果は、未抽出の糞便試料においても同様であった。このことから、糞便試料の分析においては、ＣｌｂＰ遺伝子によりコードされる酵素の抽出は、してもしなくてもよいことが分かった。実施例１で作製したプローブ２でも同様の結果であった。
　糞便試料は、大腸菌の増殖に適した条件下で培養し、その後分析してもよい。本実施例によれば、培養によりコリバクチン産生大腸菌の量が増えるため、コリバクチンやコリバクチン産生菌の検出感度が向上した。
実施例４：培養した大腸菌を用いたアッセイ
　本実施例では、コリバクチンを産生する大腸菌と産生しない大腸菌から、上記プローブがコリバクチンを産生する大腸菌のみを判定することができるかを検討した。
　コリバクチンを産生しない大腸菌としては、１２４６株および１６４９Ｔ株を用い、コリバクチンを産生する大腸菌としては、５２６３株、５４９１株およびＮｉｓｓｌｅ株を用いた。
　一晩培養した大腸菌をＬＢ培地（２～４　ｍＬ）に２０　μＬ播種し、さらにプローブ１の２０　ｍＭ　ＤＭＳＯ溶液を終濃度が２０　μＭになるように加えた（ＤＭＳＯ終濃度０．１％）。３７　℃，　１００　ｒｐｍで２４時間以上振盪した。反応後、反応液２００　μＬを取り、遠心した上清２００　μＬをそのままλｅｘ　３８０　ｍｍ／λｅｍ　４６０　ｍｍで検出した（未抽出）。またさらに反応液２００　μＬを取り、酢酸エチル５００　μＬを加えてよく懸濁後、遠心して上清の酢酸エチル層を４５０　μＬ回収し、濃縮した。濃縮物にｍｉｌｌｉＱ水２００　μＬを加え、よく懸濁後に遠心し、上清２００　μＬをλｅｘ　３８０　ｍｍ／λｅｍ　４６０　ｍｍで検出した（抽出後）。結果は図３に示される通りであった。
　図３に示されるように、上記検出系を用いることにより、特に抽出後の試料において、プローブの蛍光強度を指標として、コリバクチンを産生する大腸菌を検出することができることが明らかとなった。実施例１で作製したプローブ２でも同様の結果であった。
実施例５：大腸組織検体から分離された大腸菌からのコリバクチン陽性菌の検出
　本実施例では、ＰＣＲ法によりコリバクチン生合成遺伝子が検出された大腸組織検体（ｎ＝１００）およびコリバクチン生合成遺伝子が検出されなかった大腸組織検体（ｎ＝１００）から分離した大腸菌に対してプローブＩを適用することでコリバクチン陽性菌の検出を試みた。
大腸菌は、ヒト大腸組織検体を生理食塩水中でホモジナイズし、これをマッコンキー平板培地上に塗布し、培養することにより分離した。コリバクチン産生系を有する大腸菌が試料中に存在するか否かを確認するため、ＰＣＲによりコリバクチン生合成遺伝子クラスターの遺伝子のうち、clbBを下記プライマーを用いて増幅し、増幅断片の有無を指標としてコリバクチン陽性菌か否かを評価した。
clbBフォワードプライマー　tgttccgttttgtgtggtttcagcg
clbBリバースプライマー　　gtgcgctgaccattgaagatttccg
　プローブＩによるコリバクチン陽性菌の検出感度および精度を評価するため、上記ＰＣＲ法によってコリバクチン陽性菌が検出された大腸組織検体とコリバクチン陽性菌が検出されなかった大腸組織検体から上記の通り分離された大腸菌をそれぞれ１００検体ずつ用意した。９６ウェルプレートの各ウェルに１００μＭプローブを含むＬＢ液体培地１００μＬ（アッセイＡ）、ならびにプローブを含まないＬＢ液体培地１００μＬ（アッセイＢ）を分注した。平板培地上の一つの大腸菌株コロニーのごく微小量（爪楊枝の先に付着する程度）を、アッセイＡとアッセイＢのそれぞれのウェルに加えた。プレートを３７℃にて２４時間静置培養した後に、蛍光を測定した。λｅｘ　３８０　ｍｍ／λｅｍ　４６０　ｍｍをプレートリーダーを用いて測定し、アッセイＡとアッセイＢ（バックグラウンド）との蛍光強度の差を求め、閾値を１００として、当該比が１００以上である場合に陽性とし、１００未満である場合に陰性と評価した。
　結果は、図４に示される通りであった。図４では、上段にＰＣＲでコリバクチン陽性菌が検出された１００検体が表示され、下段にＰＣＲでコリバクチン陽性菌が検出されなかった１００検体が表示されている。また、縦軸は、蛍光強度（λｅｘ　３８０　ｍｍ／λｅｍ　４６０　ｍｍ）を表し、横軸は各検体を表す。図４に示されるように、プローブＩは、コリバクチン陽性菌を精度１００％で検出し、陰性菌を陽性と判定した比率（偽陽性率）は１％未満であった。なお、図４の上段および下段の最も左のバーは、ポジティブコントロールであり、その隣のバーは、ネガティブコントロールである。
　この結果から、本発明のプローブは、コリバクチン陽性菌の検出において有用であることが確認された。
実施例６：糞便試料を用いたコリバクチン陽性菌の検出
　本実施例では、糞便試料を水に溶解後、培養して得られた培養物に対してプローブＩを適用し、コリバクチン陽性菌を検出できることを確認した。
　ヒトから得られた糞便試料を水に溶解し、マッコンキー培地を含むプレートへと塗布して３７℃で１２時間培養した。得られた赤紫色のコロニーについて、100μＭのプローブＩを含むＬＢ液体培地に植菌し、２４時間培養して、プレートリーダーで蛍光（λｅｘ　３８０　ｍｍ／λｅｍ　４６０　ｍｍ）を測定した。これらの試料それぞれについて、実施例５と同様にコリバクチン陽性菌の有無をＰＣＲ法で検出し、プローブＩによる蛍光強度との相関を調べた。結果は、図５に示される通りであった。
　図５に示されるように、プローブＩは、糞便試料中に存在するコリバクチン陽性菌を高感度および高精度に検出することができた。
実施例７：凍結状態で保存されたがん患者組織におけるコリバクチン陽性菌の検出
　本実施例では、凍結状態で保存されていた大腸がん組織およびその周辺組織を含む組織について、ＰＣＲ法によってコリバクチン生合成遺伝子を調べた。その後、組織のホモジェナイズ液を培養し、得られた培養物に含まれるミリストイル－Ｄ－アスパラギンを定量した。
　その結果、全１４名の被験者由来サンプル中、がん組織において８検体（５７．１％）、正常組織において１検体（７．１％）でコリバクチン生合成遺伝子が検出された（図６参照）。また、上記の組織由来のホモジナイズ液をマッコンキー寒天培地へと塗布し、そこから得られる可培養性バクテリアを獲得した。コロニーＰＣＲ法にて、得られたコロニー中のコリバクチン生合成遺伝子の有無を確認したところ、がん組織由来の全コロニー２２０個のうちの３６個がコリバクチン生合成遺伝子陽性であった（１６．４％）（図６参照）。一方で、正常組織由来１０３個のコロニーのうち、１つのコロニーのみがコリバクチン生合成遺伝子陽性であった（０．９％）。
　以上のことから、大腸がん組織には、多くのコリバクチン生産菌が集積していることが示唆された。獲得されたコリバクチン生合成遺伝子陽性株計３７株については、試験管内での培養を行い、ミリストイル－Ｄ－アスパラギンの定量を通じて、コリバクチン生産能を評価した。結果は図７に示される通りであった。図７に示されるように、全３７株の菌株のうち、検出限界以下であったH13-3310T-16以外の３６株においてミリストイル－Ｄ－アスパラギンの生産が確認された。その生産量には菌株間で明確な差があり、生産量が多い株は少ない株に比べて１０，０００倍程度高い生産性を示した。

Claims (12)

  1. 　以下に示される、化合物または蛍光プローブ：
    （Ａ）クマリン骨格の７位にアミノ基を有するクマリン系蛍光色素の当該アミノ基とミリストイルアスパラギンのカルボキシル基とがアミド結合で連結した化合物または蛍光プローブ；
    （Ｂ）ナフタルイミド骨格の４位にアミノ基を有するナフタルイミド系蛍光色素の当該アミノ基とミリストイルアスパラギンのカルボキシル基とがアミド結合で連結した化合物または蛍光プローブ；
    （Ｃ）２位にアミノ基を有するナフタレン、ピレンまたはアントラセンの当該アミノ基とミリストイルアスパラギンのカルボキシル基とがアミド結合で連結した化合物または蛍光プローブ；
    （Ｄ）キサンテン骨格の３位および／または９位にアミノ基を有するローダミン系蛍光色素の当該アミノ基の一部または全部のそれぞれとミリストイルアスパラギンのカルボキシル基とがアミド結合で連結した化合物または蛍光プローブ；
    （Ｅ）Ｂｏｄｉｐｙ母核の１位および／または７位にアミノ基を有するＢｏｄｉｐｙ系蛍光色素の当該アミノ基の一部または全部のそれぞれとミリストイルアスパラギンのカルボキシル基とがアミド結合で連結した化合物または蛍光プローブ；
    （Ｆ）上記（Ａ）～（Ｅ）において、前記カルボキシル基と前記アミノ基とがアラニン（－ＮＨ－ＣＨ（ＣＨ３）－ＣＯ－）で連結された化合物（それぞれアラニンとアミド結合を形成する）または蛍光プローブ；
    （Ｇ）ミリストイルアスパラギンのカルボキシル基と水酸基がフリーになることで蛍光性となる蛍光基であるｏＦｌｕの水酸基とが、自己開裂性リンカーを介して連結した化合物であって、自己開裂性リンカーは、ミリストイルアスパラギンのカルボキシル基とアミド結合で連結しており、当該アミド結合が加水分解されると、分解してｏＦｌｕの水酸基をフリーにする、化合物または蛍光プローブ；および
    （Ｈ）ミリストイルアスパラギンのカルボキシル基とアミド結合により連結した蛍光色素を有する化合物であって、アミド結合がＣｌｂＰ依存的に開裂すると、その後、蛍光を発する、化合物または蛍光プローブ
    からなる群から選択される、化合物または蛍光プローブ。
  2. 　請求項１に記載の化合物または蛍光プローブであって、
    （Ａ）クマリン骨格の７位にアミノ基を有するクマリン系蛍光色素の当該アミノ基とミリストイルアスパラギンのカルボキシル基とがアミド結合で連結した化合物または蛍光プローブ
    である、化合物または蛍光プローブ。
  3. 　請求項１に記載の化合物または蛍光プローブであって、
    （Ｂ）ナフタルイミド骨格の４位にアミノ基を有するナフタルイミド系蛍光色素の当該アミノ基とミリストイルアスパラギンのカルボキシル基とがアミド結合で連結した化合物または蛍光プローブ
    である、化合物または蛍光プローブ。
  4. 　請求項１に記載の化合物または蛍光プローブであって、
    （Ｃ）２位にアミノ基を有するナフタレン、ピレンまたはアントラセンの当該アミノ基とミリストイルアスパラギンのカルボキシル基とがアミド結合で連結した化合物または蛍光プローブ
    である、化合物または蛍光プローブ。
  5. 　請求項１に記載の化合物または蛍光プローブであって、
    （Ｄ）キサンテン骨格の３位および／または９位にアミノ基を有するローダミン系蛍光色素の当該アミノ基の一部または全部のそれぞれとミリストイルアスパラギンのカルボキシル基とがアミド結合で連結した化合物または蛍光プローブ
    である、化合物または蛍光プローブ。
  6. 　請求項１に記載の化合物または蛍光プローブであって、
    （Ｅ）Ｂｏｄｉｐｙ母核の１位および／または７位にアミノ基を有するＢｏｄｉｐｙ系蛍光色素の当該アミノ基の一部または全部のそれぞれとミリストイルアスパラギンのカルボキシル基とがアミド結合で連結した化合物または蛍光プローブ
    である、化合物または蛍光プローブ。
  7. 　請求項１～６のいずれか一項に記載の化合物または蛍光プローブを含む、コリバクチン産生微生物を検出することに用いるための、コリバクチン生合成遺伝子クラスターを有する微生物を検出することに用いるための、および／またはコリバクチンを検出することに用いるための組成物。
  8. 　組織検体または糞便試料を対象とする、請求項７に記載の組成物。
  9. 　組織検体または糞便試料が、ヒトの組織検体または糞便試料である、請求項８に記載の組成物。
  10. 　生体試料においてコリバクチンまたはコリバクチン産生大腸菌の存在を検出する方法であって、
    　生体試料中でミリストイルアスパラギンの有無を検出することを含む、方法。
  11. 　生体試料が、組織検体または糞便試料である、請求項１０に記載の方法。
  12. 　生体試料が、ヒト由来である、請求項１０または１１に記載の方法。


     
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110981841A (zh) * 2019-11-15 2020-04-10 郑州大学 一种基于香豆素的检测革兰氏阳性菌的免洗荧光探针及应用
CN111440753A (zh) * 2020-03-16 2020-07-24 扬州大学 禽致病性大肠杆菌clbH基因缺失株及其构建方法和应用
CN111675632A (zh) * 2020-06-22 2020-09-18 湖南师范大学 一种可视化成像检测基因毒素Colibactin荧光分子探针及其制备方法和应用
EP3831449A1 (en) 2019-12-04 2021-06-09 Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) Tools and methods to detect and isolate colibactin producing bacteria
WO2022186119A1 (ja) * 2021-03-04 2022-09-09 株式会社アデノプリベント コリバクチン代謝物及びコリバクチン誘導体の検出方法
CN115181098A (zh) * 2022-04-27 2022-10-14 武汉工程大学 一种靶向线粒体的aie型次氯酸荧光探针及其制备方法、应用
WO2023223796A1 (ja) * 2022-05-16 2023-11-23 株式会社アデノプリベント コリバクチン産生大腸菌結合性抗体

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11040951B2 (en) 2018-08-17 2021-06-22 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions relating to genotoxin colibactin
WO2022150681A1 (en) 2021-01-11 2022-07-14 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions relating to clbp inhibition
WO2023049828A1 (en) * 2021-09-27 2023-03-30 Nitto Denko Corporation Boron-containing cyclic emissive compounds and color conversion film containing the same

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009165475A (ja) * 2001-07-16 2009-07-30 Cepheid プローブの完全性を検証するための方法、装置、およびコンピュータプログラム
JP2009192548A (ja) * 2001-07-16 2009-08-27 Caprotec Bioanalytics Gmbh 捕獲化合物、その収集物、ならびにプロテオームおよび複合組成物の分析方法
JP2010523157A (ja) * 2007-04-09 2010-07-15 ボード オブ リージェンツ， ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム 核酸を内部移行している細胞の選択方法
JP2014218494A (ja) * 2013-04-10 2014-11-20 株式会社ペプチド研究所 γ−グルタミルシクロトランスフェラーゼ（ＧＧＣＴ）の新規基質およびそれを用いたＧＧＣＴ活性測定法
WO2016128476A1 (en) * 2015-02-10 2016-08-18 Chr. Hansen A/S Blends of chymosins with improved milk-clotting properties
WO2017033966A1 (ja) * 2015-08-26 2017-03-02 塩野義製薬株式会社 オートタキシン阻害活性を有する５位カルボニルアミノアルキル置換縮合ピラゾール誘導体
JP2017052753A (ja) * 2006-04-05 2017-03-16 アッヴィ バイオテクノロジー リミテッド 抗体精製

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0670765A (ja) 1992-07-10 1994-03-15 Showa Denko Kk プロテアーゼ、それをコードする遺伝子、そのプロテアーゼの製造方法および用途
US6075150A (en) 1998-01-26 2000-06-13 Cv Therapeutics, Inc. α-ketoamide inhibitors of 20S proteasome
CA2913835C (en) * 2013-05-30 2021-04-20 Bracco Imaging S.P.A. Fluorescent solid lipid nanoparticles composition and preparation thereof
JP6707065B2 (ja) 2017-09-29 2020-06-10 日立建機株式会社 建設機械

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009165475A (ja) * 2001-07-16 2009-07-30 Cepheid プローブの完全性を検証するための方法、装置、およびコンピュータプログラム
JP2009192548A (ja) * 2001-07-16 2009-08-27 Caprotec Bioanalytics Gmbh 捕獲化合物、その収集物、ならびにプロテオームおよび複合組成物の分析方法
JP2017052753A (ja) * 2006-04-05 2017-03-16 アッヴィ バイオテクノロジー リミテッド 抗体精製
JP2010523157A (ja) * 2007-04-09 2010-07-15 ボード オブ リージェンツ， ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム 核酸を内部移行している細胞の選択方法
JP2014218494A (ja) * 2013-04-10 2014-11-20 株式会社ペプチド研究所 γ−グルタミルシクロトランスフェラーゼ（ＧＧＣＴ）の新規基質およびそれを用いたＧＧＣＴ活性測定法
WO2016128476A1 (en) * 2015-02-10 2016-08-18 Chr. Hansen A/S Blends of chymosins with improved milk-clotting properties
WO2017033966A1 (ja) * 2015-08-26 2017-03-02 塩野義製薬株式会社 オートタキシン阻害活性を有する５位カルボニルアミノアルキル置換縮合ピラゾール誘導体

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIAN X. ET AL.: "In Vivo Evidence for a Prodrug Activation Mechanism during Colibactin Maturation", CHEMBIOCHEM, vol. 14, 2013, pages 1194 - 1197, XP055581484 *
HIRAMAYA YUICHIRO ET AL: "development of molecular probes screening producers of colibactin that is risk factor of colorectal cancer", ANNUAL CONFERENCE OF THE JAPANESE SOCIETY OF PHARMACOGNOSY, pages 79 *
TERENTYEVA T.G. ET AL.: "Morpholinecarbonyl-Rhodamine 110 Based Substrates for the Determination of Protease Activity with Accurate Kinetic Parameters", BIOCONJUGATE CHEM., vol. 22, 2011, pages 1932 - 1938, XP055284374, DOI: doi:10.1021/bc2001038 *

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110981841A (zh) * 2019-11-15 2020-04-10 郑州大学 一种基于香豆素的检测革兰氏阳性菌的免洗荧光探针及应用
EP3831449A1 (en) 2019-12-04 2021-06-09 Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) Tools and methods to detect and isolate colibactin producing bacteria
WO2021110833A1 (en) 2019-12-04 2021-06-10 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas Tools and methods to detect and isolate colibactin producing bacteria
CN111440753A (zh) * 2020-03-16 2020-07-24 扬州大学 禽致病性大肠杆菌clbH基因缺失株及其构建方法和应用
CN111675632A (zh) * 2020-06-22 2020-09-18 湖南师范大学 一种可视化成像检测基因毒素Colibactin荧光分子探针及其制备方法和应用
CN111675632B (zh) * 2020-06-22 2021-06-22 湖南师范大学 一种可视化成像检测基因毒素Colibactin荧光分子探针及其制备方法和应用
WO2022186119A1 (ja) * 2021-03-04 2022-09-09 株式会社アデノプリベント コリバクチン代謝物及びコリバクチン誘導体の検出方法
CN115181098A (zh) * 2022-04-27 2022-10-14 武汉工程大学 一种靶向线粒体的aie型次氯酸荧光探针及其制备方法、应用
CN115181098B (zh) * 2022-04-27 2023-04-07 武汉工程大学 一种靶向线粒体的aie型次氯酸荧光探针及其制备方法、应用
WO2023223796A1 (ja) * 2022-05-16 2023-11-23 株式会社アデノプリベント コリバクチン産生大腸菌結合性抗体

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