WO2018235745A1 - 生体適合長繊維不織布、その製造方法、細胞培養用立体足場及びこれを用いた細胞培養方法 - Google Patents

生体適合長繊維不織布、その製造方法、細胞培養用立体足場及びこれを用いた細胞培養方法 Download PDF

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WO2018235745A1
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biocompatible
woven fabric
scaffold
long
fiber non
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田畑泰彦
上杉昭二
尾井政夫
早乙女俊樹
中村耕一郎
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日本毛織株式会社
田畑泰彦
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    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • D04H3/08—Non-woven fabrics formed wholly or mainly of yarns or like filamentary material of substantial length characterised by the method of strengthening or consolidating
    • D04H3/16—Non-woven fabrics formed wholly or mainly of yarns or like filamentary material of substantial length characterised by the method of strengthening or consolidating with bonds between thermoplastic filaments produced in association with filament formation, e.g. immediately following extrusion

Definitions

  • the present invention relates to a biocompatible long-fiber non-woven fabric suitable for medical use and scaffolding for cell culture, a method for producing the same, a three-dimensional scaffold for cell culture, and a cell culture method using the same.
  • Fiber sheets are useful for medical applications, cell culture scaffolds, and the like because of their high porosity and specific surface area.
  • gelatin is a material which has been widely used in medicine until now, and there is a precedent as a medical device and a pharmaceutical additive, and biocompatibility, cell affinity and bioresorbability have been demonstrated.
  • Fibers made of gelatin are highly safe, and depending on the degree of chemical crosslinking of gelatin, it is possible to control the period of bioabsorption for several days to several months, and to control the hardness.
  • cotton floss moldings of gelatin have been practically used as topical hemostats in medical applications. Many three-dimensional moldings made of gelatin fiber have been reported.
  • Patent Document 1 proposes that gelatin is fiberized by an electrospinning method to form a non-woven fabric.
  • Patent Document 2 proposes that an aqueous solution containing a water-soluble linear polymer such as gelatin and polyethylene glycol is extruded into air and spun.
  • Patent Document 3 proposes that a gelatin solution is discharged into a coagulation bath to form a gel-like fiber, which is taken out and stretched to remove the remaining solution.
  • the three-dimensional structure (represented by cotton or non-woven fabric) consisting of gelatin fibers obtained by the prior art as described above is inferior in mechanical properties and has a low strength at the time of water swelling, and when used in cell culture.
  • the problem is that the shaped body is deformed as the cells proliferate, and the pore structure necessary for cell growth inside the shaped body disappears.
  • a non-woven fabric having high formability and high formability that is useful for medical applications and scaffolds for cell culture, etc. it is an essential material property that the internal structure can be maintained at the time of cell culture, and mechanical properties therefor It is essential to have
  • the present invention is a biocompatible long-fiber non-woven fabric having high moldability and molding stability useful for medical and cell culture scaffolds, a method for producing the same, a three-dimensional scaffold for cell culture, The cell culture method used is provided.
  • the biocompatible long-fiber non-woven fabric of the present invention is a biocompatible long-fiber non-woven fabric containing a biocompatible polymer as a main component, wherein the biocompatible long-fiber non-woven fabric varies in fiber diameter in the length direction
  • the biocompatible long fibers constituting the biocompatible long fiber non-woven fabric are characterized in that the fiber intersections are at least partially welded, do not get wet when wet, and become transparent when wet. I assume.
  • the method for producing a biocompatible long-fiber non-woven fabric according to the present invention is the method for producing a biocompatible long-fiber non-woven fabric according to the present invention, comprising: extruding a spinning solution containing a biocompatible polymer from the nozzle outlet into air; The pressure fluid is injected forward from the fluid jet outlet in a non-contact state with the nozzle discharge port, and the extruded spinning solution is caused to associate with the pressure fluid to form fibers. It is characterized in that the conforming long fibers are accumulated to form a non-woven fabric.
  • the three-dimensional scaffold for cell culture of the present invention is characterized in that the above-mentioned biocompatible long-fiber non-woven fabric is used as a three-dimensional scaffold for cell culture.
  • the cell culture method of the present invention is a cell culture method using the above-mentioned solid scaffold for cell culture, wherein after the cells are seeded on the scaffold, the cell seeded scaffold is put in a liquid medium and the cells are cultured. It is characterized by
  • the three-dimensional scaffold for cell culture of the present invention is composed of a biocompatible long-fiber non-woven fabric mainly composed of a biocompatible polymer, and the biocompatible long-fiber constituting the non-woven fabric is composed of one continuous fiber, as an example
  • the length is from several tens of meters to several hundreds of meters, the fiber diameter changes in the length direction, and the biocompatible long fibers constituting the non-woven fabric are medically treated by partially welding the fiber intersections. It is possible to provide formability and stability which are useful for three-dimensional scaffolds and the like for use and cell culture.
  • the biocompatible long fiber constituting the biocompatible long fiber non-woven fabric has unevenness of thickness, and by being partially welded, the biocompatible long fiber non-woven fabric has a bridge structure and is bulky and low in density, which is desirable. It is easy to be formed into a shape and high in molding stability, and does not get wet even when it gets wet with water. This suppresses changes in the three-dimensional structure of the non-woven fabric and changes in the internal structure (voids) during cell culture. For this reason, cells are uniformly distributed and proliferated throughout the biocompatible long-fiber non-woven fabric, and three-dimensional organization of cells is achieved. Usually, there is a problem that the cells present inside due to the three-dimensionalization of the cells are killed due to lack of nutrient oxygen.
  • the cells inside the three-dimensional tissue body cultured with the non-woven fabric composed of the biocompatible long fibers such as gelatin long fibers of the present invention do not die, but the cells by normal physiological production of proteins from the cells Outer matrix formation was observed.
  • the non-woven material is a biocompatible hydrogel such as gelatin hydrogel as this reason, it is considered that the supply of nutrient oxygen from the outside through the hydrogel layer was obtained.
  • Non-woven fabrics made of fibers other than hydrogel which have been reported before have not been recognized as such effects.
  • the biocompatible long-fiber non-woven fabric of the present invention is a non-woven fabric made of hydrogel fibers, and the improvement of the non-woven fabric production method enhances mechanical strength even when water is contained, suppresses deformation of the non-woven fabric during cell culture, internal structure (Void) maintenance, and features such as using biocompatible long fibers with high cell affinity are combined, and by adjusting the physiological environment of cells, cells can grow inside and outside of the non-woven fabric during cell culture. It seems that three-dimensional organization of cells is possible. Three-dimensional organization of cells is a necessary technique for cell research and drug discovery research. This is because it is known that the three-dimensional interaction between cells enhances the function of the cell and approaches the cell function in the body, as compared with each cell one by one.
  • the biocompatible long-fiber non-woven fabric of the present invention is a bulky three-dimensional material made of a hydrogel, and when it is swollen by containing water or a liquid medium and used as a scaffold, culture fluid and oxygen are hydrolysed in the non-woven fabric. It is easy to move around the entire scaffold through the gel fiber material, and nutrients and oxygen are efficiently supplied to the cells throughout the scaffold, enabling three-dimensional cell culture. Since the biocompatible long-fiber non-woven fabric of the present invention is firm and firm even when wet, it is possible to culture the liquid medium while flowing it by at least one means selected from stirring, circulating and shaking. it can. Moreover, when it gets wet with water, it is transparent and easy to observe with a microscope.
  • the non-woven fabric is made of long fibers, there is a low risk of foreign matters such as falling of fibers and the generation of dust.
  • it is also biocompatible.
  • the hydrogel such as bFGF is added when swelling the hydrogel with a phosphate buffer or the like. It can be used as a carrier for incorporating a drug inside and releasing the drug slowly.
  • the biocompatible long-fiber non-woven fabric of the present invention is suitable as a medical or cell culture scaffold. According to the production method of the present invention, the biocompatible long-fiber non-woven fabric can be produced hygienically and efficiently rationally without contamination or the like.
  • FIG. 1 is a photograph of a scanning electron microscope (SEM, Hitachi scanning microscope S-2600N, 100 ⁇ ) of the gelatin long-fiber non-woven fabric obtained in one example of the present invention.
  • FIG. 2 is a photograph of the scanning electron microscope (SEM, Hitachi scanning microscope S-2600N, 500 ⁇ ) of the gelatin long fiber non-woven fabric.
  • FIG. 3 is a photograph of a gelatin long fiber non-woven fabric (35 mm long, 25 mm wide, 0.95 mm thick) obtained in one example of the present invention.
  • FIG. 4 is a schematic explanatory view of a nonwoven fabric manufacturing apparatus used in one embodiment of the present invention.
  • FIG. 1 is a photograph of a scanning electron microscope (SEM, Hitachi scanning microscope S-2600N, 100 ⁇ ) of the gelatin long-fiber non-woven fabric obtained in one example of the present invention.
  • FIG. 2 is a photograph of the scanning electron microscope (SEM, Hitachi scanning microscope S-2600N, 500 ⁇ ) of the ge
  • FIG. 5 is a photograph showing the shape-retaining property when the gelatin long-fiber non-woven fabric of Example 1 of the present invention is swollen in purified water and held with tweezers.
  • FIG. 6 is a photograph showing the shape retention of the gelatin long-fiber non-woven fabric of Example 2.
  • FIG. 7 is a photograph showing the shape retention of the gelatin long-fiber non-woven fabric of Example 3.
  • FIG. 8 is a photograph showing the shape retention of the gelatin long-fiber non-woven fabric of Example 4.
  • FIG. 9 is a photograph showing the shape retention of the gelatin sponge swollen in the purified water of Comparative Example 1.
  • FIG. 10 is an inverted microscope observation photograph (20 ⁇ ) immediately after cell seeding when cells were cultured using the scaffold made of the gelatin long fiber nonwoven fabric of Example 4.
  • FIG. 11 is a photograph (20 ⁇ ) of the inverted microscope observation on the seventh day of the culture.
  • FIG. 12 is an inverted microscope observation photograph (10 ⁇ ) immediately after cell seeding when cells were cultured using the gelatin sponge of Comparative Example 1 as a scaffold.
  • FIG. 13 is an inverted microscope observation photograph (10 times) immediately after cell seeding when cells were cultured using the polypropylene nonwoven fabric of Comparative Example 2 as a scaffold.
  • FIG. 14 is an inverted microscope observation photograph (10 ⁇ ) immediately after cell seeding when cells were cultured using the polylactic acid non-woven fabric of Comparative Example 3 as a scaffold.
  • FIG. 12 is an inverted microscope observation photograph (10 ⁇ ) immediately after cell seeding when cells were cultured using the gelatin sponge of Comparative Example 1 as a scaffold.
  • FIG. 13 is an inverted microscope observation photograph (10 times) immediately after cell seeding when cells were cultured using the polypropylene nonwoven fabric of Comparative Example 2 as a scaffold.
  • FIG. 14 is an inverted microscope observation photograph (10
  • FIG. 15 is a light micrograph of a hematoxylin-eosin-stained scaffold section showing that cells have invaded to the inside of the scaffold when cultured for 8 days using the scaffold made of the gelatin long fiber nonwoven fabric of Example 4 It is.
  • the photos (10x) observed by light microscopy were connected on the software of the fluorescence microscope to give a full picture.
  • FIG. 16 is also a partial photograph (10 ⁇ ) observed with an optical microscope.
  • FIG. 17 is a light micrograph (4 ⁇ ) of a hematoxylin-eosin-stained scaffold section showing that the cells infiltrate only to the outside of the scaffold when cell culture was performed for 4 days using the polypropylene non-woven fabric of Comparative Example 2 as a scaffold. ).
  • FIG. 18 is an optical microscope observation photograph (20 ⁇ ) of the scaffold when cell culture was performed for 12 days using the gelatin long fiber non-woven fabric of Example 4 as a scaffold.
  • FIG. 19 is a fluorescence observation photomicrograph in which oxygen status in the scaffold was observed by a hypoxic marker when cell culture was performed for 12 days using the gelatin long fiber non-woven fabric of Example 4 as a scaffold Part close to): hypoxic site) (20 times).
  • FIG. 20 is a graph showing cell proliferation.
  • FIG. 21 is a schematic explanatory view of a cell culture device at the time of performing a stirring culture using the scaffold made of the biocompatible long fiber non-woven fabric of one example.
  • FIG. 22 is a photograph showing the morphological change (observed from the lateral direction) of the scaffold during agitation culture.
  • FIG. 23 is a photograph showing the appearance (observed from above) showing that the shape of the scaffold has changed after stirring culture.
  • FIG. 24 is a photograph showing the appearance (observed from above) of the decellularized scaffold after spinach culture.
  • FIG. 25 is a photograph showing the hematoxylin and eosin staining results (overall image) of the cross section of the scaffold 14 days after stirring and culturing.
  • FIG. 26 is a photograph showing the hematoxylin-eosin staining result (20 ⁇ ) of the cross section of the scaffold 14 days after agitation culture.
  • FIG. 27 is a photograph showing the hematoxylin and eosin staining results (20 ⁇ ) of the decapsulated scaffold cross section after 14 days of agitation culture.
  • FIG. 28 is a photograph showing the hematoxylin-eosin staining result (overall view) of the cross section of the scaffold after 25 days of agitation culture.
  • FIG. 29 is a photograph showing the hematoxylin-eosin staining result (20 ⁇ ) of the cross section of the scaffold after 25 days of agitation culture.
  • FIG. 30 is a photograph showing the hematoxylin-eosin staining result (overall image) of the decapsulated scaffold cross section after 25 days of the agitation culture.
  • FIG. 28 is a photograph showing the hematoxylin-eosin staining result (overall view) of the cross section of the scaffold after 25 days of the agitation culture.
  • FIG. 31 is a photograph showing the hematoxylin-eosin staining result (20 ⁇ ) of the decapsulated scaffold cross section after 25 days of the agitation culture.
  • FIG. 32 is a photograph showing a fluorescence microscope observation image (overall image) of live cells of the cross section of the scaffold 14 days after agitation culture.
  • FIG. 33 is a photograph showing a fluorescence microscope observation image (overall view) of dead cells in the cross section of the scaffold after 25 days of agitation culture.
  • FIG. 34 is a photograph showing a fluorescence microscope observation image (overall image) of live cells of the cross section of the scaffold after 25 days of agitation culture.
  • FIG. 32 is a photograph showing a fluorescence microscope observation image (overall image) of live cells of the cross section of the scaffold 14 days after agitation culture.
  • FIG. 33 is a photograph showing a fluorescence microscope observation image (overall view) of dead cells in the cross section of the scaffold after 25 days of agitation culture.
  • FIG. 35 is a photograph showing a fluorescence microscopic image (overall view) of dead cells in the cross section of the scaffold after 25 days of agitation culture.
  • FIG. 36 is an explanatory view of a process of stacking a plurality of the scaffolds made of the gelatin long fiber non-woven fabric according to the embodiment of the present invention and performing cell culture.
  • FIG. 37 is a photograph showing the shape-retaining property when the gelatin long-fiber non-woven fabric of Example 6 is swollen in purified water and held with tweezers.
  • FIG. 38 is a photograph showing an example in which shape retention is good when the scaffold is gripped with tweezers, but is bent.
  • FIG. 39 is an optical microscope (4 ⁇ ) showing the appearance (observed from above) of the appearance of the laminate of the scaffold and cell sheet in the laminate culture using the scaffold made of the gelatin long fiber nonwoven fabric of Example 6. It is connected on software and is a whole picture.
  • FIG. 40 is a photograph (4 times) showing the cross section of the result of hematoxylin and eosin staining of the cross section of the laminate.
  • FIG. 41 is a photograph showing an example of good handling in the evaluation of handling by a cantilever.
  • FIG. 42 is a photograph showing an example of poor handling.
  • FIG. 43 is a graph showing the relationship between the handling property and thickness and density when holding a scaffold made of gelatin long fiber non-woven fabric with tweezers.
  • the biocompatible long-fiber non-woven fabric of the present invention is a non-woven fabric composed of long-fibers.
  • the length of the fiber is preferably several meters to several thousand meters.
  • Long fibers can be produced by the meltblowing method.
  • a spinning solution containing a biocompatible polymer is extruded from a nozzle discharge port, and pressure is applied forward from a fluid injection port located in the rear of the nozzle discharge port and not in contact with the nozzle discharge port.
  • the fluid is jetted, the extruded spinning solution is caused to accompany the pressure fluid, and the fibers are dried directly to form fibers, and the resultant biocompatible long fibers are accumulated to form a non-woven fabric, thereby generating contamination (contamination).
  • This long fiber is an undivided fiber, which has not been subjected to processing such as splitting after spinning.
  • this non-woven fabric when fibers are accumulated (deposited) after spinning, the fibers are laminated in a moisture-containing state, so they are fused or integrated by being entangled with each other.
  • the nonwoven fabric density can be easily changed by changing the collection distance at the time of depositing the fibers.
  • the biocompatible long-fiber non-woven fabric is based on a biocompatible polymer.
  • the term "main component" refers to containing 90% by mass or more of a biocompatible polymer.
  • the component of 10% by mass or less may be a crosslinking agent, a drug, another additive, and the like. It may be substantially 100% by weight of a biocompatible polymer.
  • Biocompatible polymers may be commercially available products.
  • the biocompatible long fiber constituting the biocompatible long fiber non-woven fabric has a change in fiber diameter in the length direction.
  • the change of the fiber diameter in the longitudinal direction is caused by the turbulence (turbulence) of the pressure fluid because the spinning solution discharged from the nozzle is made to accompaniment with the pressure fluid (for example, compressed air) and spun.
  • the change in fiber diameter in the longitudinal direction also occurs when the discharge speed of each nozzle and / or the flow rate of pressure fluid are different when using a plurality of nozzles.
  • the fiber intersections are partially welded. This partial welding occurs when the biocompatible long fibers such as gelatin long fibers blown away by the pressure fluid are deposited but not completely solidified.
  • the biocompatible long-fiber non-woven fabric has a bridge structure, is bulky, low in density, easily formed into a desired shape, and has high forming stability.
  • the biocompatible long fibers preferably have an average fiber diameter (D) in the range of 1 to 70 ⁇ m, and the fiber diameter changes in the range of D ⁇ 0.5 D.
  • a further preferable range of the average fiber diameter (D) is 5 to 60 ⁇ m.
  • the "average fiber diameter" and the "degree of change thereof” are respectively an average value of diameters of 50 fibers arbitrarily selected from a scanning electron micrograph (500 times) of a biocompatible long-fiber non-woven fabric and It means the degree of the change.
  • the biocompatible continuous fiber is preferably in a substantially undrawn state.
  • the substantially unstretched state means a state in which mechanical stretching has not been performed.
  • the biocompatible long-fiber non-woven fabric does not get wet when it gets wet with water.
  • “does not distort when wet” means the rate of compressive deformation at a compressive stress of 1.0 kPa (hereinafter simply referred to as “compression,” after swelling to saturation with water of a biocompatible long-fiber non-woven fabric. It also means that “the deformation rate” is 40% or less.
  • the saturated state means that the water is contained to the maximum, and the water content remains at a certain limit and does not increase further.
  • the compression deformation rate of the biocompatible long-fiber non-woven fabric is preferably 40% or less, more preferably 35% or less, and still more preferably 30% or less.
  • the lower limit of the compression deformation rate of the biocompatible long-fiber non-woven fabric is not particularly limited, it is preferably, for example, 1% or more, and more preferably 5% or more.
  • the biocompatible continuous fiber non-woven fabric has an initial elastic modulus (hereinafter also referred to simply as an “initial elastic modulus”) of 0.
  • the pressure is preferably 30 kPa or more, more preferably 0.35 kPa or more.
  • the upper limit of the initial elastic modulus of the biocompatible continuous fiber non-woven fabric is not particularly limited, but is preferably 20 kPa or less, and more preferably 10 kPa or less.
  • the compressive deformation rate is, in a biocompatible long-fiber non-woven fabric after swelling to a saturated state with water, the thickness at no load is defined as (H1), and the thickness at a compressive stress of 1.0 kPa ( In the case of H2), it is calculated by the following equation. If the compression deformation rate after swelling with water is in the above-mentioned range, it does not get wet even if it gets wet with water.
  • the biocompatible long-fiber non-woven fabric becomes transparent when it gets wet with water. This transparency is such that the inside of the scaffold can be observed by the inverted microscope in the culture solution. If the transparency is such that it can be observed with an inverted microscope, it is convenient to be able to confirm the culture state.
  • “being transparent when wetted” means in the wavelength range of 400 to 800 nm of the biocompatible long-fiber non-woven fabric (thickness 1.5 mm) after swelling to a saturated state with water. It means that the average transmittance is 10% or more.
  • the average transmittance in the wavelength range of 400 to 800 nm of the biocompatible long-fiber non-woven fabric (thickness 1.5 mm) after swelling to a saturated state with water is preferably 15% or more, more preferably 20% or more .
  • the biocompatible long-fiber non-woven fabric is preferably formed in a sheet shape. If it is a sheet, it can be formed into various shapes.
  • the biocompatible long-fiber non-woven fabric is preferably crosslinked. This can maintain form stability and heat resistance. Crosslinking is preferably thermal dehydration crosslinking for biological safety. Also, it is preferable that the biocompatible long fiber or biocompatible polymer before crosslinking is water soluble. When the biocompatible polymer is water-soluble, it can be spun in the form of an aqueous solution as a spinning solution, and the safety to the living body can be enhanced.
  • the biocompatible polymer is at least one selected from the group consisting of gelatin, collagen, chitosan, alginic acid, hyaluronic acid, mucopolysaccharide, dextran, carboxymethylcellulose, polyvinyl alcohol, water-soluble polymers such as polyvinyl alcohol, polyethylene glycol and the like, and modified products thereof It is preferably a polymer.
  • modified form means that the molecular terminal, side chain, etc. are denatured to such an extent that the water solubility is not impaired. These are preferable because they are easily dissolved in water (including heated water), solution spinning is possible, gelation can be performed after fiber formation, crosslinking can be performed, and a nonwoven fabric with high shape stability can be formed. Among these, gelatin is more preferable.
  • a spinning solution containing a biocompatible polymer is extruded into air from a nozzle outlet, and is positioned behind the nozzle outlet and is not in contact with the nozzle outlet.
  • a pressure fluid is injected forward from the fluid injection port, the extruded spinning solution is caused to accompany the pressure fluid to form fibers, and the obtained biocompatible long fibers are accumulated to form a non-woven fabric.
  • a manufacturing apparatus used for manufacturing a biocompatible long-fiber non-woven fabric is provided with means for pushing a spinning solution containing a biocompatible polymer from the nozzle outlet into air, and behind the nozzle outlet, the nozzle outlet Includes means for injecting pressure fluid forward from the non-contact fluid injection port, and means for collecting the biocompatible long fibers formed by entraining the extruded spinning solution with the pressure fluid. Since the pressure fluid jet outlet is disposed rearward and independently of and not in contact with the nozzle outlet, the spinning solution is not mixed. Therefore, contamination of the product can be prevented.
  • the temperature of the spinning solution is preferably equal to or higher than the temperature at which the spinning solution flows and lower than the decomposition temperature of the biocompatible polymer. If the temperature is higher than the temperature at which the spinning solution flows, it can not be spun, and if it is higher than the decomposition temperature of the biocompatible polymer, there is a risk that the decomposition product may be mixed into the product.
  • the injection pressure of the pressure fluid is preferably 0.05 to 0.5 MPa. If it is the said range, the spinning solution extruded in air from a nozzle discharge port can be blown off and it can be fiberized.
  • the temperature of the pressure fluid is preferably around the temperature of the spinning solution, more preferably, the temperature of the pressure fluid is ⁇ 50 ° C. of the spinning solution, and more preferably ⁇ 30 ° C. of the spinning solution. In this state, the spinning solution extruded into the air from the nozzle discharge port is not quenched but is fiberized in a fluid state and then cooled in air to form solid fibers.
  • the viscosity of the spinning solution is preferably 500 to 3000 mPa ⁇ s at a temperature of 60 ° C. If the viscosity is in the above range, it is convenient for fiberization.
  • the biocompatible long-fiber non-woven fabric is preferably vacuum-lyophilized and then crosslinked.
  • the vacuum lyophilization is to prevent the deterioration of the biocompatible long fiber (biocompatible polymer) and rapidly dry it.
  • Subsequent crosslinking is preferred for morphological stability.
  • Crosslinking may be crosslinking using a chemical reagent, thermal dehydration crosslinking, photocrosslinking, energy beam crosslinking such as ultraviolet light, electron beam, radiation or the like.
  • the temperature of heat dehydration crosslinking varies depending on the type of biopolymer, but for example, it is preferably not less than the glass transition point and not more than the softening point.
  • the thermal dehydration crosslinking temperature of the gelatin long fiber is preferably 100 to 160.degree.
  • Gelatin long fiber non-woven fabrics are suitable for medical non-woven fabrics or scaffolds for cell culture.
  • Gelatin itself is biocompatible and biodegradable, and it is convenient if it is a long fiber non-woven fabric.
  • the method for producing a gelatin long fiber non-woven fabric includes the following steps. 1. Preparation step (1) Dissolve gelatin in heated water. The dissolution temperature (the temperature of the heating water) is preferably 20 to 90 ° C. After dissolution, filtration may be performed to remove foreign matter and dust. (2) Thereafter, reduced pressure or vacuum degassing may be performed to remove the dissolved air. 2. This step (1) The heated aqueous gelatin solution (spinning solution) is discharged from the nozzle of the spinning machine. (2) A pressure fluid is supplied from the periphery of the nozzle, and the discharged aqueous gelatin solution is caused to accompany the pressure fluid to form fibers. (3) The obtained gelatin long fibers are accumulated to form a gelatin long fiber non-woven fabric. 3.
  • the gelatin long-fiber non-woven fabric is vacuum freeze-dried.
  • the dried gelatin long fiber non-woven fabric may be cut into a predetermined size and formed into a predetermined shape.
  • press molding can be used.
  • Crosslinking the gelatin long fiber non-woven fabric may be heat dehydration crosslinking, thermal crosslinking, electron beam crosslinking, radiation crosslinking such as ⁇ -ray, ultraviolet crosslinking, or the like.
  • the gelatin long-fiber non-woven fabric or sheet having a predetermined shape is sterilized. For sterilization, ethylene oxide gas sterilization, water vapor, electron beam irradiation, radiation irradiation such as ⁇ ray, etc. can be used.
  • crosslinking can be performed simultaneously with sterilization. 4. Sterilization at the time of use It may be ethylene oxide sterilization or steam sterilization as a preparatory process at the time of using for scaffolds etc. for medical use and cell culture.
  • the cross-linked gelatin long fiber non-woven fabric can be steam sterilized.
  • the temperature of the heated aqueous gelatin solution (spinning solution) is preferably 20 to 90.degree. Within the above range, gelatin can maintain a stable sol state.
  • the gelatin concentration of the heated aqueous gelatin solution is preferably 30 to 55% by mass, based on 100% by mass of the aqueous gelatin solution. A further preferred concentration is 35 to 50% by mass. A stable sol state can be maintained with the above concentration.
  • the viscosity of the heated aqueous gelatin solution (spinning solution) is preferably 500 to 3000 mPa ⁇ s. If it is the said viscosity, stable spinning can be performed.
  • the temperature of the pressure fluid is preferably 80 to 120 ° C. in the case of an aqueous gelatin solution (spinning solution). Depending on the flow rate of the pressure fluid and the temperature of the surrounding atmosphere, stable spinning can be achieved within the above temperature range.
  • the pressure fluid is preferably air, and the pressure is preferably 0.1 to 1 MPa.
  • the three-dimensional scaffold for cell culture of the present invention is produced using the biocompatible long-fiber non-woven fabric.
  • the crosslinked non-woven fabric (sheet) is punched into a predetermined shape or the like to form a scaffold for cell culture.
  • a predetermined liquid medium it is used as a target cell culture scaffold.
  • the thickness of the scaffold before swelling with the liquid culture medium (in the dry state) is preferably 0.2 mm or more, and more preferably 0.3 mm or more and 10 mm or less. When the thickness is in the above-mentioned range, when it is swollen with water or a liquid medium and gripped with tweezers, the shape-retaining property is high, and it is difficult to bend and the handling property becomes good.
  • the density of the scaffold before swelling with liquid medium is preferably 0.8 g / cm 3 or more, more preferably 1.0 g / cm 3 or more and 1.3 g / cm 3 It is below.
  • the density is within the above range, when used for layered culture, when it is swollen with water or a liquid medium and then gripped with tweezers, its shape maintainability is high, and it is difficult to bend and handling becomes good.
  • the cell culture using the said scaffold is not specifically limited, For example, it can carry out as follows. First, a target cell is suspended in a liquid medium at a predetermined concentration to prepare a cell suspension, and a similar long-fiber non-woven fabric scaffold such as a gelatin long-fiber non-woven fabric scaffold is used. And let stand for a predetermined time (for example, 30 minutes) to fully swell. Next, a scaffold made of swollen biocompatible long fiber non-woven fabric is placed in a tube or culture dish, to which a cell suspension is added, shaken on a shaker in an incubator, and seeded with cells.
  • the cell suspension may be a suspension of one cell or a suspension of two or more different cells.
  • cell seeding may be performed by seeding a single cell or by simultaneously seeding different cell types.
  • the scaffold made of the biocompatible long-fiber non-woven fabric is washed with a phosphate buffer to remove unadhered cells, to obtain a cell-seeded biocompatible long-fiber non-woven scaffold.
  • the cell-seeded biocompatible long fiber non-woven scaffold may be transferred to a plate or culture dish, a liquid medium may be added, and stationary culture may be performed in an incubator under predetermined conditions (eg, 37 ° C., 5% CO 2 ). The liquid medium may be changed every two to three days.
  • a cell-seeded biocompatible long-fiber non-woven fabric scaffold is placed in a culture vessel, and liquid medium is added until the cell-seeded biocompatible long-fiber non-woven fabric scaffold is immersed, in an incubator at 37 ° C., 5% CO 2 While stirring and circulating the liquid medium on a magnetic stirrer placed in the above, it is possible to carry out spin culture.
  • Medium change may be performed every 3 to 4 days by removing half the liquid medium and adding an equal volume of fresh liquid medium.
  • a cell-seeded biocompatible long-fiber non-woven fabric scaffold is placed in a culture vessel, and liquid medium is added until the cell-seeded biocompatible long-fiber non-woven fabric scaffold is immersed, in an incubator at 37 ° C., 5% CO 2 Culture while shaking. Medium change may be performed every 3 to 4 days by removing half the liquid medium and adding an equal volume of fresh liquid medium.
  • the three-dimensional scaffold for cell culture using the biocompatible long-fiber non-woven fabric and the biocompatible long-fiber non-woven fabric of the present invention becomes transparent when wetted with water. This transparency is such that the inside of the scaffold can be observed by the inverted microscope in the culture solution.
  • the transparency is such that it can be observed with an inverted microscope, it is convenient to be able to confirm the culture state.
  • three-dimensional cell aggregates are obtained as described later.
  • the resulting three-dimensional cell aggregate can be used in combination with a cell sheet of a single cell or a cell sheet of multiple cell types.
  • cell culture may be performed by stacking a plurality of scaffolds made of a biocompatible long fiber non-woven fabric.
  • cell culture can be performed by alternately stacking a plurality of cell sheets obtained by cell culture and a scaffold made of biocompatible long-fiber non-woven fabric swollen in a liquid medium.
  • the thickness of the scaffold before swelling with liquid medium (dry state) is 0.2 mm or more, and the density is 0 It is preferable that it is .8 g / cm ⁇ 3 > or more.
  • the cell sheet is not limited to the same cell type, and a cell sheet composed of plural kinds of cells and a cell sheet of plural kinds of different cells may be stacked and cocultured.
  • FIG. 1 is a photograph of a scanning electron microscope (SEM, Hitachi scanning microscope S-2600N, 100 ⁇ ) of the gelatin long-fiber non-woven fabric obtained in one example of the present invention.
  • FIG. 2 is a photograph of the scanning electron microscope (SEM, Hitachi scanning microscope S-2600N, 500 ⁇ ) of the gelatin long fiber non-woven fabric. It can be seen that the gelatin long fibers constituting the non-woven fabric change in fiber diameter in the length direction. In addition, it can also be confirmed that the gelatin filaments constituting the non-woven fabric are partially welded at the fiber intersections.
  • FIG. 3 is a photograph of the long-fiber non-woven fabric (35 mm long, 25 mm wide, 0.95 mm thick) obtained in one example of the present invention. According to the method for producing a biocompatible long-fiber non-woven fabric of the present invention, a long sheet-like non-woven fabric is obtained, but the size is taken as an example in consideration of handleability in forming a three-dimensional scaffold for cell culture. be able to.
  • FIG. 4 is a schematic explanatory view of a nonwoven fabric manufacturing apparatus used in one embodiment of the present invention.
  • the spinning solution 2 containing the biocompatible polymer placed in the heating tank 1 is pushed out from the nozzle discharge port 3 into the air.
  • a predetermined pressure is applied to the heating tank 1 by the compressor 4.
  • 12 is a heat retention container.
  • the pressure fluid 7 is ejected forward from the fluid ejection port 5 located in the rear of the nozzle ejection port 3 and not in contact with the nozzle ejection port 3.
  • the fluid injection port 5 is supplied with pressure fluid (e.g., compressed air) from the compressor 6.
  • the distance between the fluid injection port 5 and the nozzle discharge port 3 is preferably 5 to 30 mm.
  • the extruded spinning solution is entrained by the pressure fluid 7 to form long fibers 8 and deposited on the take-up roll 11 as long fiber non-woven fabric 9.
  • the fibers since the deposited long fibers contain moisture or are not completely solidified, the fibers in contact at at least a part of the fiber intersections weld together.
  • long fibers may be collected and deposited by a net or the like to form a non-woven fabric.
  • FIG. 21 is a schematic explanatory view of a cell culture apparatus at the time of performing a stirring culture using the scaffold made of the biocompatible long fiber non-woven fabric of one embodiment.
  • the stirred culture test apparatus 20 includes a stirring rod 22 and a stirring rod 23 in a spinner flask 21.
  • the liquid culture medium 24 is stirred by rotating the stirring rod 22.
  • a scaffold 26 made of a biocompatible long-fiber non-woven fabric passed through a 22 gauge needle 25 is placed in the liquid culture medium 24, and the cells are cultured.
  • a predetermined atmosphere gas may be fed into the flask.
  • the culture solution may be shaken or circulated in addition to agitation.
  • the obtained three-dimensional cell aggregate may be replaced by a cell made of a biocompatible long fiber non-woven fabric scaffold such as a gelatin long fiber non-woven fabric, and an extracellular matrix produced by cells. Furthermore, the obtained three-dimensional cell aggregates show high strength.
  • the three-dimensional cell aggregate thus obtained can be used in appropriate combination with the cell sheet of another single cell or the cell sheet of plural types of cells.
  • FIG. 36 is process explanatory drawing which laminates
  • a cell suspension 32 of a predetermined concentration is seeded on a culture dish 31 containing a predetermined liquid medium 30, and stationary culture is performed for a predetermined time (for example, 10 days),
  • a cell sheet 33 is prepared.
  • the cell sheet 33 is detached from the culture dish as shown in (c) by the flow of the pipette.
  • the scaffold 34 made of a biocompatible long-fiber non-woven fabric which has been swollen in a predetermined liquid medium for a predetermined time (for example, 30 minutes) is held by tweezers and inserted (d)
  • the cell sheet 33 is placed on the exfoliated cell sheet 33 as shown in FIG.
  • the cell sheet 33 and the scaffold 34 can be integrated by pressing them from above at a predetermined pressure 35 (for example, 1 kPa) for several seconds.
  • the integrated unit of the cell sheet 33 and the scaffold 34 is gripped by tweezers, and a plurality of sheets are stacked as shown in (f). A large three-dimensional cell mass is thus produced.
  • FIG. 36 illustrates a method of stacking a cell sheet and a scaffold and culturing a plurality of cells, the cell suspension is seeded on a scaffold made of a gelatin long fiber non-woven fabric swollen with a predetermined liquid medium for a predetermined time.
  • a plurality of scaffolds obtained after cell culture obtained by performing cell culture for a time may be stacked to produce a three-dimensionalized large cell mass.
  • cells may infiltrate the inside of the scaffold.
  • the cells may be cultured so as to stay on the surface of the scaffold, resulting in a cell sheet-like structure.
  • the cell sheet is not limited to the same cell type, and a cell sheet composed of plural kinds of cells and a cell sheet of plural kinds of different cells may be stacked and cocultured.
  • the measuring method is as follows. ⁇ Fiber diameter> The average fiber diameter and the degree of change were measured using 50 fibers arbitrarily selected from photographs of a scanning electron microscope (SEM, Hitachi scanning microscope S-2600N, 500 ⁇ ) of a biocompatible long-fiber non-woven fabric . ⁇ Others> As described later, it was measured in accordance with the JIS or industry defined measurement method.
  • the temperature of the spinning solution is 60 ° C., nozzle diameter (inner diameter) 250 ⁇ m, discharge pressure 0.3 MPa, nozzle height 5 mm, air pressure 0.3 MPa, air temperature 100 ° C., distance between fluid jet 5 and nozzle jet 3
  • the long fiber non-woven fabric 9 was wound up by the winding roller 11 with a collection distance of 100 cm and 20 mm. Then, the long-fiber non-woven fabric was vacuum freeze-dried (-80 ° C, 13 Pa, 72 hours), and then heat dewatered and crosslinked. The crosslinking conditions were a temperature of 140 ° C. and 48 hours.
  • the obtained nonwoven fabric of Example 1 was observed with a scanning electron microscope (SEM, Hitachi scanning microscope S-2600N), and the results are shown in FIG. 1 (100 ⁇ ) and FIG. 2 (500 ⁇ ).
  • the diameter of 50 fibers arbitrarily selected from the scanning electron micrograph (500 times) of the biocompatible long-fiber non-woven fabric of FIG. 2 was measured, and the average fiber diameter of the long fibers constituting the non-woven fabric was 51 ⁇ m.
  • the fiber diameter was changed in the range of ⁇ 20 ⁇ m. Further, as shown in FIGS. 1 and 2, the constituent fibers were partially welded at the fiber intersections.
  • the obtained nonwoven fabric of Example 1 was punched into a cylindrical shape having a diameter of 4 mm.
  • the punched-out non-woven fabric sample was allowed to stand overnight in purified water at 37 ° C. to swell sufficiently until it became saturated, and the shape retention when held with tweezers was confirmed.
  • the results are shown in FIG. As shown in FIG. 5, the non-woven fabric of Example 1 had good shape maintenance after swelling, and even after holding it with a tweezer, it maintained its shape and had excellent handleability.
  • thickness (H1) is measured by using a creep meter physical property test system RE 2-33005C manufactured by Sanden Co., Ltd., and using a plunger with a diameter of 40 mm, 0.05 mm Compressed at / sec.
  • the compressive elastic modulus (kPa) of 1 to 5% strain and the intermediate compressive stress (kPa) of 10%, 20% and 30% strain were measured.
  • the rate of change in thickness (strain rate) at a compressive stress of 1 kPa was calculated based on the thickness (strain 0%) at no load, and was used as the rate of compressive deformation.
  • the compressive elastic modulus (kPa) of 1 to 5% strain corresponds to the initial elastic modulus.
  • the transmittance of the swollen non-woven fabric sample (thickness 1.5 mm) in the wavelength range of 400 to 800 nm is measured at intervals of 10 nm using a plate reader company, model number “Spectra Maxi 3”), and the range of 400 to 800 nm The average transmittance at was calculated.
  • Example 2 A nonwoven fabric was produced in the same manner as in Example 1 except that the discharge pressure was changed to 0.15 MPa, and the physical properties were measured in the same manner as in Example 1.
  • Example 3 A nonwoven fabric was produced in the same manner as in Example 1 except that the discharge pressure was changed to 0.2 MPa, and the physical properties were measured in the same manner as in Example 1.
  • Example 4 A nonwoven fabric was produced in the same manner as in Example 1 except that the discharge pressure was 0.1 MPa, the air pressure was 0.2 MPa, and the collection distance was 50 cm, and the physical properties were measured in the same manner as in Example 1.
  • Example 5 A nonwoven fabric was prepared in the same manner as in Example 4 except that the preparation time of the non-woven fabric was increased and the thickness at no load was 3.03 mm after swelling, and the physical properties were measured in the same manner as in Example 1. did.
  • Example 6 The nonwoven fabric was prepared in the same manner as in Example 4 except that the preparation time of the nonwoven fabric was reduced and the thickness after no swelling was 0.69 mm after swelling, and the diameter ⁇ 6 mm of the nonwoven fabric sample used for physical property measurement. Physical properties were measured in the same manner as in Example 1 except that the above were used.
  • Comparative example 1 As Comparative Example 1, a gelatin sponge after thermal crosslinking (Pfizer Inc., trade name "Zelfoam”) was sliced to an arbitrary thickness, then punched to a diameter of 4 mm, and allowed to stand overnight in purified water at 37 ° C. The sample was sufficiently swollen until it became saturated, and the physical properties were measured in the same manner as in Example 1.
  • Pfizer Inc. trade name "Zelfoam”
  • the gelatin sponge of Comparative Example 1 was thinner after swelling when the thickness before and after swelling was compared.
  • the gelatin sponge of Comparative Example 1 was very easy to deform and did not have a waist, because the compressive elasticity was low in compression characteristics and the change in compressive stress was small with strain.
  • the gelatin long-fiber non-woven fabric of each example of the present invention was thicker after swelling when the thickness before and after swelling was compared.
  • the compressive modulus was about 1.2 to 3.0 times higher than that of gelatin sponge. Furthermore, the larger the fiber diameter, the higher the compressive stress with strain, and the stronger the deformation.
  • the compressive deformation rate (strain rate) at a compressive stress of 1.0 kPa is largely deformed to 56.8% in the gelatin sponge
  • the gelatin long fiber non-woven fabric of the example is 35% or less, and the stiffness is strong.
  • Example A1 The present example is an example of a cell culture test by static culture. Static culture of cells was performed using the scaffold (the thickness 1.2 mm when dried, the density 0.44 g / cm 3 , the diameter 4 mm) made of the gelatin long-fiber non-woven fabric obtained in Example 4. 1. Description of the test (1) Cell culture (a) Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSC) were added to a liquid medium ( ⁇ MEM medium containing 10% by mass of fetal bovine serum and 1% by mass of penicillin streptomycin) in 2.0 ⁇ The cell suspension was prepared by suspending to 10 6 cells / mL.
  • hMSC Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells
  • (B) The scaffold made of a gelatin long fiber non-woven fabric after ethylene oxide gas sterilization was allowed to stand in liquid medium for 30 minutes to be sufficiently swollen.
  • (C) Place the swollen gelatin long fiber non-woven scaffold in a 15 mL PP tube, add 200 ⁇ L of cell suspension to it, and shake it at 300 rpm for 6 hours on an orbital shaker in a 37 ° C incubator. , Cells were seeded.
  • the cultured scaffold was washed with phosphate buffer (pH 7.4), and 37 ° C, 30 mM sodium chloride-citric acid solution (SSC solution) containing 0.2 mg / mL sodium dodecyl sulfate.
  • SSC solution sodium chloride-citric acid solution
  • the cells were collected by stirring at 300 rpm for 24 hours in 300 ⁇ L.
  • 400 ⁇ L of 30 mM sodium chloride-citric acid solution (SSC solution) was added, and to the resulting solution, 1 ⁇ L / mL of the nuclear stain Hoechest 33258 (Nacalai Tesque) was added. .
  • the resulting solution was measured for fluorescence intensity at Ex 355 nm and Em 460 nm, and the cell number was determined from a standard line obtained from a solution with a known cell number.
  • (4) Cell Distribution in Scaffold The cultured scaffold was washed with phosphate buffer, fixed with 4% paraformaldehyde, and further washed three times with phosphate buffer (pH 7.4). After washing, after embedding in OCT compound (Sakura Finetech Japan Co., Ltd.), in the frozen state, a section was prepared in the direction perpendicular to the diameter of the cylindrical scaffold.
  • the frozen section was stained with hematoxylin and eosin, and the method of cell distribution in the scaffold was observed with a light microscope (manufactured by Keyence Corporation, model number "BZ-X710").
  • a light microscope manufactured by Keyence Corporation, model number "BZ-X710”
  • LOX-1 Hypoxia Probe LOX-1 (ORGANOGENIX) was added to the newly added ⁇ MEM medium, and the mixture was incubated overnight. Scaffolds in culture were observed for fluorescence at Ex 510-560 nm and Em 580 nm with a fluorescence microscope (“BZ-X710” manufactured by Keyence Corporation). The contrast was adjusted with Image J.
  • Example A2 The cell culture was carried out as described in Example A1, except that the gelatin long fiber non-woven fabric scaffold obtained in Example 2 was used instead of the gelatin long fiber non-woven fabric scaffold obtained in Example 4. The
  • FIG. 10 shows a photograph (20 ⁇ ) of an inverted microscope observation immediately after cell seeding when cells were cultured using the scaffold made of the gelatin long-fiber non-woven fabric of Example 4.
  • cultivation 7th day of 11 is shown.
  • the scaffold made of the gelatin long-fiber non-woven fabric of Example 4 was transparent in the culture solution, and the cell culture could be observed.
  • cell adhesion was observed at the intersection of the gelatin long fibers, and on the 7th day of culture, the cells covered the fiber gap.
  • Comparative Example A1 FIG. 10 shows a photograph (20 ⁇ ) of an inverted microscope observation immediately after cell seeding when cells were cultured using the scaffold made of the gelatin long-fiber non-woven fabric of Example 4.
  • cultivation 7th day of 11 is shown.
  • the scaffold made of the gelatin long-fiber non-woven fabric of Example 4 was transparent in the culture solution, and the cell culture could be observed.
  • cell adhesion
  • Example 20 show data of cell proliferation data when using the scaffold made of the gelatin long fiber non-woven fabric obtained in Example 2 and the scaffold made of the gelatin long fiber non-woven fabric obtained in Example 4 Indicates When the scaffold made of the gelatin long fiber non-woven fabric of Example 4 is used, on the 7th day of the culture, about 3.5 times after the cell seeding, on the 14th day of the culture, about 8.2 times after the cell seeding, 21 The cells proliferated approximately 19.5 times after cell seeding on the day.
  • FIG. 17 shows a photomicrograph (20 ⁇ ) of the scaffold obtained when cell culture was performed for 12 days using the scaffold made of the gelatin long-fiber non-woven fabric obtained in Example 4. Indicated.
  • FIG. 18 shows a photomicrograph (20 ⁇ ) of the scaffold obtained when cell culture was performed for 12 days using the scaffold made of the gelatin long-fiber non-woven fabric obtained in Example 4. Indicated.
  • FIG. 19 is a fluorescence observation photomicrograph in which oxygen status in the scaffold was observed by a hypoxic marker after cell culture was performed for 12 days using the scaffold made of the gelatin long fiber non-woven fabric obtained in Example 4 (high brightness) Part (near white part): hypoxic site) (20 times) was shown. Since the scaffold made of the gelatin long-fiber non-woven fabric obtained in Example 4 has a weak fluorescence intensity due to the low oxygen marker at a site which can be identified as a fiber by the optical microscope observation photograph of FIG. 18 (FIG. 19) It was confirmed that oxygen was diffused.
  • Example A3 This example is an example of a cell culture test by spinner culture. 1. Description of test (1) Preparation of gelatin long fiber non-woven fabric Using the gelatin long fiber non-woven fabric scaffold obtained in Example 5 (thickness: 1.6 mm, density: 0.44 g / cm 3 , diameter: 4 mm when dry) Cell culture was performed by spinner culture. (2) Cell culture Using the scaffold made of the gelatin long fiber non-woven fabric obtained above, cells were seeded by the same cell seeding method as the above-mentioned stationary culture. Using the apparatus shown in FIG.
  • a plurality of scaffolds 26 made of cell-seeded gelatin long-fiber non-woven fabric were pierced with a 22-gauge sterile needle 25 so that the distance between the scaffolds 26 was 2 mm.
  • a 22 G needle 25 pierced with a scaffold 26 made of a gelatin long fiber non-woven fabric was pierced by a rubber stopper at the top of the spinner flask 21 and fixed.
  • the liquid medium was added until the gelatin long fiber non-woven scaffold was immersed, and the medium was stirred at 100 rpm on a magnetic stirrer placed in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator. Every three to four days, medium replacement was performed by removing half of the liquid medium and adding an equal volume of fresh liquid medium.
  • the cultured scaffold was washed with phosphate buffer, and then in 300 ⁇ L of 30 mM sodium chloride-citric acid (SSC) solution containing 0.2 mg / mL sodium dodecyl sulfate at 37 ° C., 24 Stirring at 300 rpm for time, cells were extracted and decellularized.
  • SSC sodium chloride-citric acid
  • Cell distribution The scaffold after agitation culture and the scaffold subjected to decellularization treatment were washed with phosphate buffer, fixed with 4% paraformaldehyde, and further washed three times with phosphate buffer.
  • the compressive elastic modulus (kPa) of 1 to 5% strain and the intermediate compressive stress (kPa) of 10%, 20% and 30% strain were measured.
  • the strain at 1 kPa compressive stress was taken as the dimensional change rate based on no load (strain 0%).
  • FIG. 22 shows a photograph of the scaffold in culture taken with a digital camera from the lateral direction.
  • FIG. 23 shows an appearance photograph of a cell scaffold in which one scaffold was cut out after culture.
  • FIG. 24 shows a photograph of the decellularized cell scaffold.
  • the scaffold made of the gelatin long fiber non-woven fabric had a corner of the gelatin long fiber non-woven fabric taken off on the 7th day of culture, and the diameter became small on the 14th day and after and became cloudy.
  • the scaffolds placed on the needle at 2 mm intervals were connected to one another.
  • FIG. 25 shows a section (scaffold cross section) of the scaffold after stirring culture for 14 days in Example A3 was stained with hematoxylin and eosin, and a photograph of the entire image observed with a light microscope (observed at 10 ⁇ ) , Linked on the software).
  • FIG. 26 shows a partially enlarged photograph (20 ⁇ ) at the end.
  • cells invaded into the inside of the scaffold, and in particular, at the end of the scaffold, cells proliferated at higher density.
  • the part appearing dark is the cell nucleus.
  • FIG. 25 and 26 shows a partially enlarged photograph (20 ⁇ ) at the end.
  • FIG. 28 shows a section of the scaffold after stirring culture for 25 days in Example A3, stained with hematoxylin and eosin, and a photograph of the entire image observed with a light microscope (observed at 10 ⁇ , linked on software).
  • FIG. 29 shows a partially enlarged photograph (20 ⁇ ) at the end.
  • FIGS. 28 and 29 cells grew to a high density to the center of the tissue.
  • the part that appears dark is the cell nucleus.
  • FIG. 30 after stirring culture for 25 days in Example A3 in Example A3, a section of the scaffold after decellularization treatment was stained with hematoxylin and eosin, and a photograph of the entire image observed with a light microscope (observed at 10 ⁇ , connected on software )showed that.
  • FIG. 31 shows a partially enlarged photograph ( ⁇ 20) at the end and center thereof.
  • FIG. 32 a photograph of the whole image of viable cells of a section of the scaffold after stirring culture for 14 days in Example A3 was observed with a fluorescence microscope (observed at 10 ⁇ , linked on software) Indicated. Because the fluorescence intensity is strong at the living cell site, the site with high brightness (the site close to white) is a living cell.
  • FIG. 32 a photograph of the whole image of viable cells of a section of the scaffold after stirring culture for 14 days in Example A3 was observed with a fluorescence microscope (observed at 10 ⁇ , linked on software) Indicated. Because the fluorescence intensity is strong at the living cell site, the site with high brightness (the site close to white) is a living cell.
  • FIG. 33 shows photographs of dead images of sections of the scaffold after agitation culture for 14 days in Example A3 (a photograph observed at 10 ⁇ , linked on software) observed with a fluorescence microscope. Since the fluorescence intensity is high at the dead cell site, the site with high brightness (close to white) is the dead cell site. As is clear from FIGS. 32 to 33, in the gelatin long fiber non-woven fabric, many living cells are seen and almost no dead cells are seen. By making the gelatin long-fiber non-woven fabric into a cell culture scaffold, it was found that the cells in the central part of the tissue show high viability even in three-dimensional cell aggregates. FIG.
  • FIG. 34 shows a photograph (10 ⁇ ) of viable cells of a section of the scaffold after stirring culture for 25 days in Example A3, observed with a photograph (10 ⁇ ) of the entire image, and shown on the software). Because the fluorescence intensity is strong at the living cell site, the site with high brightness (the site close to white) is a living cell.
  • FIG. 35 shows photographs of dead images of sections of the scaffold after stirring culture for 25 days in Example A3 (a photograph observed at 10 ⁇ , linked on software) observed with a fluorescence microscope. Since the fluorescence intensity is high at the dead cell site, the site with high brightness (close to white) is the dead cell site. As apparent from FIGS.
  • the strength was improved by dense growth of cells in the void of the gelatin long fiber non-woven fabric. Furthermore, these mechanical behaviors are the same tendency even in the decellularized scaffold, and the strength was improved by the extracellular matrix produced by the cells filling the voids of the gelatin long fiber non-woven fabric.
  • the gelatin long-fiber non-woven fabric disappears, and although it is a cell aggregate consisting only of cells and extracellular matrix, it has high strength, and the extracellular cells produced by cells
  • the matrix contains elastic fibers such as elastin, and it can be expected that the matrix is a cell aggregate closer to human's ecological environment.
  • Example A4 This example is an example of a cell culture test by layered culture. Static culture of cells was carried out using the scaffold made of the gelatin long fiber non-woven fabric obtained in Example 6 (thickness 0.2 mm when dried, density 0.8 g / cm 3 , diameter 6 mm).
  • Cell culture Alternate stacking of scaffolds made of gelatin long fiber non-woven fabric and cell sheets
  • hMSC Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells
  • liquid medium 10% by mass of fetal bovine serum, 1% by mass of penicillin streptomycin
  • the cell suspension was prepared by suspending the cells in an ⁇ MEM medium containing the cells to 2.0 ⁇ 10 6 cells / mL.
  • B 1 mL of a liquid medium was added to a 12-well plate, 50 ⁇ L of the cell suspension was seeded therein, and static culture was carried out for 10 days to prepare a cell sheet.
  • C The cell sheet was detached from the 12-well plate by liquid flow using a 1000 mL micropipette.
  • FIG. 39 a micrograph (4 ⁇ ) of the laminate observed from the top was connected on software of a fluorescence microscope (manufactured by Keyence Corporation, model number “BZ-X710”), and an entire image It showed what it was. It was confirmed that the cell sheet was overlapped on the upper surface of the gelatin nonwoven fabric without wrinkles.
  • FIG. 40 shows a photomicrograph of a cross-sectional view of a laminate in which three layers of gelatin long fiber non-woven fabric and cell sheet are alternately stacked. The presence of a cell sheet was confirmed by the linear appearance of the cell nucleus and cytoplasm stained by hematoxylin and eosin.
  • the cell sheet was observed in three layers at regular intervals.
  • the interval was equivalent to the thickness (about 0.7 mm) of the swollen gelatin long fiber non-woven fabric, and it was confirmed that the gelatin long fiber non-woven fabric and the cell sheet were alternately laminated.
  • Example B1 Using a gelatin long fiber non-woven fabric of different thickness (dry state) and density (dry state), a gelatin long fiber non-woven fabric preferable for the lamination scaffold was examined.
  • Good handgability means that when the scaffold after swelling with liquid medium is gripped with tweezers, its shape-retaining property is good and it is difficult to bend.
  • FIGS. 5 to 8 and FIG. 37 are examples in which the shape maintenance property is good when the scaffold after swelling with water or liquid medium is gripped with tweezers and is not bent.
  • FIG. 38 shows an example in which the shape maintainability is good when grasped by tweezers, but it is bent.
  • the handling property of the gelatin long fiber non-woven fabric scaffold was evaluated by a cantilever.
  • a rectangular solid stand was used as a test stand.
  • the specimen was placed at the end of the pedestal so that half of the area of the specimen exits the pedestal so as to be cantilevered. It was judged that the handling property was good (A) if the included angle of the test piece was measured and within 45 degrees, and the handling property was bad (B) if it was more than 45 degrees.
  • An example of good handling is shown in FIG. 41 and an example of poor handling is shown in FIG. 42 in the cantilever test. The result of handling is shown in FIG. From FIG.
  • the thickness in the dry state before swelling is 0.2 mm or more and the density is 0.8 g / cm 3 or more. It turned out to be preferable.
  • the biocompatible long-fiber non-woven fabric of the present invention is suitable for a three-dimensional scaffold for cell culture and can be applied to various medical applications.

Abstract

本発明は、生体適合ポリマーを主成分とする生体適合長繊維不織布であって、生体適合長繊維不織布を構成する生体適合長繊維は、長さ方向で繊維直径が変化しており、かつ繊維交点が少なくとも部分的に溶着しており、水に濡れてもへたらず、水に濡れると透明になる生体適合長繊維不織布に関する。前記生体適合長繊維不織布は、生体適合ポリマーを含む紡糸液をノズル吐出口３から空気中に押し出し、ノズル吐出口３の後方に位置し、ノズル吐出口３とは非接触状態の流体噴射口５から前方に向けて圧力流体７を噴射し、押し出された紡糸液を圧力流体７に随伴させて繊維形成させ、前記繊維形成した長繊維８を集積させて長繊維不織布９とすることで作製することができる。これにより、医療用及び細胞培養の足場等に有用な成形性と成形安定性の高い生体適合長繊維不織布、その製造方法、細胞培養用立体足場及びこれを用いた細胞培養方法を提供する。

Description

生体適合長繊維不織布、その製造方法、細胞培養用立体足場及びこれを用いた細胞培養方法
　本発明は医療用及び細胞培養の足場用として好適な生体適合長繊維不織布、その製造方法、細胞培養用立体足場及びこれを用いた細胞培養方法に関する。
　繊維シートは、有孔度や比表面積の高さから、医療用及び細胞培養の足場等に有用である。特にゼラチンはこれまでにも医療に広く用いられてきた材料であり、医療機器、医薬品添加剤としての前例があり、生体適合性、細胞親和性、生体吸収性は実証済みである。ゼラチンからなる繊維は、安全性が高く、ゼラチンの化学架橋の程度によって、数日から数か月にわたる生体吸収期間のコントロールや、硬さのコントロールが可能である。例えばゼラチンの綿状成形物は、実際に医療用途において局所止血材として実用化されている。ゼラチン繊維からなる３次元成形体が多く報告されている。例えば、ゼラチンをエレクトロスピニング法で繊維化し、不織布とすることが特許文献１に提案されている。特許文献２には、ゼラチンとポリエチレングリコール等の水溶性直鎖状高分子を含む水溶液を、空気中に押し出して紡糸することが提案されている。特許文献３には、ゼラチン溶液を凝固浴に吐出させてゲル状繊維とし、取り出して延伸し、残存する溶液を除去することが提案されている。
特開２０１４－０５５１９号公報 特開２０１２－１６７３９７号公報 特開２００５－１２０５２７号公報
　しかし、前記のような従来技術で得られたゼラチン繊維からなる３次元構造体（綿あるいは不織布に代表される）は、力学特性が劣り、水膨潤時の強度が小さく、細胞培養に用いた時に細胞の増殖とともに成形体が変形し、成形体内部の細胞増殖に必要な孔構造がなくなることが問題となっている。このように、医療用及び細胞培養の足場等に有用な成形性と成形安定性の高い不織布としては、細胞培養時に、その内部構造を維持できることが必要不可欠な材料特性であり、そのための力学特性を持つことが必須となっている。
　本発明は、前記従来の問題を解決するため、医療用及び細胞培養の足場等に有用な成形性と成形安定性の高い生体適合長繊維不織布、その製造方法、細胞培養用立体足場及びこれを用いた細胞培養方法を提供する。
　本発明の生体適合長繊維不織布は、生体適合ポリマーを主成分とする生体適合長繊維不織布であって、前記生体適合長繊維不織布を構成する生体適合長繊維は、長さ方向で繊維直径が変化しており、前記生体適合長繊維不織布を構成する生体適合長繊維は、繊維交点が少なくとも部分的に溶着しており、水に濡れてもへたらず、水に濡れると透明になることを特徴とする。
　本発明の生体適合長繊維不織布の製造方法は、前記の生体適合長繊維不織布の製造方法であって、生体適合ポリマーを含む紡糸液をノズル吐出口から空気中に押し出し、前記ノズル吐出口の後方に位置し、前記ノズル吐出口とは非接触状態の流体噴射口から前方に向けて圧力流体を噴射し、前記押し出された紡糸液を前記圧力流体に随伴させて繊維形成させ、得られた生体適合長繊維を集積させて不織布とすることを特徴とする。
　本発明の細胞培養用立体足場は、前記の生体適合長繊維不織布を細胞培養用立体足場とすることを特徴とする。
　本発明の細胞培養方法は、前記の細胞培養用立体足場を使用した細胞培養方法であって、前記足場に細胞を播種した後、細胞播種した足場を液体培地中に入れて、細胞培養することを特徴とする。
　本発明の細胞培養用立体足場は、生体適合ポリマーを主成分とする生体適合長繊維不織布で構成され、前記不織布を構成する生体適合長繊維は、連続する１本の繊維から構成され、一例として長さが数十メートルから数百メートルであり、長さ方向で繊維直径が変化しており、前記不織布を構成する生体適合長繊維は、繊維交点が部分的に溶着していることにより、医療用及び細胞培養の立体足場等に有用な成形性と成形安定性を提供できる。すなわち、生体適合長繊維不織布を構成する生体適合長繊維は太さ斑があり、部分的に溶着していることにより、生体適合長繊維不織布はブリッジ構造となり、嵩高く低密度であり、所望の形状に成形しやすく、かつ成形安定性も高いものとなり、水に濡れてもへたらない。このことが、細胞培養時の不織布の３次元構造の変化や内部構造（空隙）の変化を抑制する。このため、細胞が生体適合長繊維不織布全体に均一に分布して増殖し、細胞の３次元組織化が達成される。通常、細胞が三次元化することにより内部に存在する細胞は、栄養酸素不足で死滅することが問題となっている。しかしながら、本発明のゼラチン長繊維等の生体適合長繊維で構成された不織布で培養された細胞３次元組織体内部の細胞は、死滅せず、細胞からのタンパク質などの正常な生理学的産生による細胞外マトリクス形成が認められた。この理由として、不織布材料がゼラチンハイドロゲル等の生体適合ハイドロゲルであることから、ハイドロゲル層を通しての外部からの栄養酸素の供給が得られたことが考えられる。以前から報告されているハイドロゲル以外の繊維からなる不織布は、このような効果は認められていない。本発明の生体適合長繊維不織布が、ハイドロゲル繊維による不織布であること、不織布作製方法の改良により、水を含んだ場合でもその力学強度が高まり、細胞培養時における不織布の変形の抑制、内部構造（空隙）の維持、細胞親和性の高い生体適合長繊維を用いていることなどの特徴が重なり、細胞の生理学的環境が整えられたことで、細胞培養時に不織布内側及び外側で細胞が増殖でき、細胞の３次元組織化が可能となったと考えられる。細胞の３次元組織化は、細胞研究及び創薬研究に必要な技術である。細胞一つ一つに比べて、細胞が３次元的に相互作用することによって、細胞の機能が増強され、体内での細胞機能に近づくことが分かっているからである。また、本発明の生体適合長繊維不織布は、ハイドロゲルからなる嵩高な三次元材料であり、水や液体培地を含ませて膨潤して足場として使用すると、培養液と酸素が、不織布内のハイドロゲル繊維材料を通して足場全体に回りやすく、栄養と酸素が足場全体に細胞へ効率よく供給され、立体的な細胞培養が可能となる。本発明の生体適合長繊維不織布は、水に濡れても腰が強くしっかりしているため、前記液体培地を攪拌、循環及び振とうから選ばれる少なくとも一つの手段で流動させながら細胞培養することもできる。また、水に濡れると透明であり、顕微鏡観察しやすい。この透明性は、培養液中で倒立顕微鏡により足場の内部まで観察できる程度の透明性である。倒立顕微鏡で観察できる程度の透明性があれば、培養状態を確認でき、好都合である。さらに、不織布は長繊維で構成されているため、繊維が脱落する等の異物混入やごみの発生リスクも低い。加えて、生体適合性もある。また、本発明の生体適合性長繊維不織布の一例では、架橋したハイドロゲルから構成されるため、ハイドロゲルをリン酸緩衝液などで膨潤させる際に、ｂＦＧＦ等の薬剤を加えることで、ハイドロゲル内部に薬剤を取り込ませ、薬剤を徐放する担体としても使用することが可能である。従って本発明の生体適合長繊維不織布は、医療用や細胞培養の足場として好適である。本発明の製造方法は、前記生体適合長繊維不織布をコンタミ等がなく、衛生的にかつ効率よく合理的に製造できる。
図１は本発明の一実施例で得られたゼラチン長繊維不織布の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ、日立走査型顕微鏡Ｓ－２６００Ｎ、１００倍）の写真である。 図２は同、ゼラチン長繊維不織布の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ、日立走査型顕微鏡Ｓ－２６００Ｎ、５００倍）の写真である。 図３は本発明の一実施例で得られたゼラチン長繊維不織布（縦３５ｍｍ、横２５ｍｍ、厚さ０．９５ｍｍ）の写真である。 図４は本発明の一実施例で使用する不織布製造装置の模式的説明図である。 図５は本発明の実施例１のゼラチン長繊維不織布を精製水中で膨潤させ、ピンセットで持った際の形状維持性を示す写真である。 図６は同、実施例２のゼラチン長繊維不織布の形状維持性を示す写真である。 図７は同、実施例３のゼラチン長繊維不織布の形状維持性を示す写真である。 図８は同、実施例４のゼラチン長繊維不織布の形状維持性を示す写真である。 図９は比較例１の精製水中で膨潤させたゼラチンスポンジの形状維持性を示す写真である。 図１０は実施例４のゼラチン長繊維不織布製の足場を用いて細胞培養した時の細胞播種直後の倒立顕微鏡観察写真（２０倍）である。 図１１は同、培養７日目の倒立顕微鏡観察写真（２０倍）である。 図１２は比較例１のゼラチンスポンジを足場として用いて細胞培養した時の細胞播種直後の倒立顕微鏡観察写真（１０倍）である。 図１３は比較例２のポリプロピレン不織布を足場として用いて細胞培養した時の細胞播種直後の倒立顕微鏡観察写真（１０倍）である。 図１４は比較例３のポリ乳酸不織布を足場として用いて細胞培養した時の細胞播種直後の倒立顕微鏡観察写真（１０倍）である。 図１５は実施例４のゼラチン長繊維不織布製の足場を用いて細胞培養を８日間行った時、足場の内部まで、細胞が侵入していることを示すヘマトキシリンエオジン染色した足場切片の光学顕微鏡写真である。光学顕微鏡観察した写真（１０倍）を蛍光顕微鏡のソフトウェア上で連結し、全体像とした。 図１６は同、光学顕微鏡で観察した部分写真（１０倍）である。 図１７は比較例２のポリプロピレン不織布を足場として用いて細胞培養を４日間行った時、細胞が足場の外側までしか侵入していないことを示すヘマトキシリンエオジン染色した足場切片の光学顕微鏡写真（４倍）である。 図１８は実施例４のゼラチン長繊維不織布を足場として用いて細胞培養を１２日間行った時の足場の光学顕微鏡観察写真（２０倍）である。 図１９は同、実施例４のゼラチン長繊維不織布を足場として用いて細胞培養を１２日間行った時の足場内の酸素状態を低酸素マーカーによって観察した蛍光観察顕微鏡写真（明度の高い部分（白色に近い部分）：低酸素部位）（２０倍）である。 図２０は同、細胞増殖を示すグラフである。 図２１は、一実施例の生体適合長繊維不織布製の足場を用いて撹拌培養を行う際の細胞培養装置の模式的説明図である。 図２２は同、撹拌培養中の足場の形態変化（横方向から観察）を示す写真である。 図２３は同、撹拌培養後、足場の形状が変化していることを示す外観（上方向から観察）を示す写真である。 図２４は同、撹拌培養後、脱細胞処理した足場の外観（上方向から観察）を示す写真である。 図２５は同、撹拌培養１４日後における足場断面のヘマトキシリンエオジン染色結果（全体像）を示す写真である。 図２６は同、撹拌培養１４日後における足場断面のヘマトキシリンエオジン染色結果（２０倍）を示す写真である。 図２７は同、撹拌培養１４日後、脱細胞処理した足場断面のヘマトキシリンエオジン染色結果（２０倍）を示す写真である。 図２８は同、撹拌培養２５日後における、足場断面のヘマトキシリンエオジン染色結果（全体像）を示す写真である。 図２９は同、撹拌培養２５日後における、足場断面のヘマトキシリンエオジン染色結果（２０倍）を示す写真である。 図３０は同、撹拌培養２５日後における、脱細胞処理した足場断面のヘマトキシリンエオジン染色結果（全体像）を示す写真である。 図３１は同、撹拌培養２５日後における、脱細胞処理した足場断面のヘマトキシリンエオジン染色結果（２０倍）を示す写真である。 図３２は同、撹拌培養１４日後における、足場断面の生細胞の蛍光顕微鏡観察像（全体像）を示す写真である。 図３３は同、撹拌培養２５日後における、足場断面の死細胞の蛍光顕微鏡観察像（全体像）を示す写真である。 図３４は同、撹拌培養２５日後における、足場断面の生細胞の蛍光顕微鏡観察像（全体像）を示す写真である。 図３５は同、撹拌培養２５日後における、足場断面の死細胞の蛍光顕微鏡観察像（全体像）を示す写真である。 図３６は、本発明の一実施例のゼラチン長繊維不織布製の足場を複数枚積層して細胞培養する工程説明図である。 図３７は、実施例６のゼラチン長繊維不織布を精製水中で膨潤させ、ピンセットで持った際の形状維持性を示す写真である。 図３８は、足場をピンセットで把持した際に形状維持性が良好であるが、屈曲している例を示す写真である。 図３９は、実施例６のゼラチン長繊維不織布製の足場を用いた積層培養時の足場と細胞シートの積層体の外観（上方向から観察）を示す光学顕微鏡（４倍）写真を蛍光顕微鏡のソフトウェア上で連結し、全体像としたものである。 図４０は同、積層体断面のヘマトキシリンエオジン染色結果断面を示す写真（４倍）である。 図４１は、片持ち梁によるハンドリング性の評価におけるハンドリング性良好の例を示す写真である。 図４２は同、ハンドリング性不良の例を示す写真である。 図４３は、ゼラチン長繊維不織布製の足場をピンセットで把持する際のハンドリング性と厚さ及び密度との関係を示すグラフである。
　本発明の生体適合長繊維不織布は、長繊維で構成される不織布である。繊維の長さは数メートル～数千メートルが好ましい。長繊維はメルトブロー法で製造できる。本発明で用いるメルトブロー法は、生体適合ポリマーを含む紡糸液をノズル吐出口から押し出し、ノズル吐出口の後方に位置し、前記ノズル吐出口とは非接触状態の流体噴射口から前方に向けて圧力流体を噴射し、前記押し出された紡糸液を前記圧力流体に随伴させて乾式でダイレクトに繊維化し、得られた生体適合長繊維を集積させて不織布にすることから、コンタミ（夾雑物）の発生は防止され、衛生的に製造できる。この長繊維は非分割繊維であり、紡糸後に分割などの処理はされていない。この不織布は紡糸後に繊維を集積（堆積）させる時に繊維同士が、水分を含んだ状態で積層されるため、溶着したり互いに絡んで一体化されている。繊維を堆積させる際の捕集距離を変えることで、容易に不織布密度を変えることができる。
　これに対して従来のメルトブロー法は、紡糸液のノズル吐出口の周囲から圧力空気を噴射するため、紡糸液が圧力空気噴射口に漏れ出すことがあり、長期間溜まった紡糸液が製品中にコンタミ（夾雑物）となって入り込み、製品汚染になってしまう現象がみられた。
　本発明において、生体適合長繊維不織布は生体適合ポリマーを主成分とする。ここで主成分とは、生体適合ポリマーを９０質量％以上含むことを言う。１０質量％以下の成分は、架橋剤、薬剤、他の添加剤等であってもよい。実質的に１００質量％の生体適合ポリマーであってもよい。生体適合ポリマーは市販品を使用できる。
　前記生体適合長繊維不織布を構成する生体適合長繊維は、長さ方向で繊維直径が変化している。長さ方向で繊維直径が変化することは、ノズルから吐出した紡糸液を圧力流体（例えば、圧空）に随伴させて紡糸するため、圧力流体の乱れ（乱流）により生ずる。また、長さ方向で繊維直径が変化することは、複数のノズルを使用した時に各ノズルの吐出速度及び／又は圧力流体の流速が異なる際にも生ずる。
　前記生体適合長繊維不織布を構成する生体適合長繊維は、繊維交点が部分的に溶着している。この部分的溶着は、圧力流体によって吹き飛ばされたゼラチン長繊維等の生体適合長繊維が堆積する際に、完全に固化していない状態の時に発現する。この部分的溶着により、生体適合長繊維不織布はブリッジ構造となり、嵩高く低密度であり、所望の形に成形しやすく、かつ成形安定性も高いものとなる。本発明において、「繊維交点が少なくとも部分的に溶着している」とは、生体適合長繊維不織布が水に濡れてもへたらない程度に溶着していることを意味し、生体適合長繊維不織布が水に濡れてもへたらない程度に繊維交点の一部が溶着してもよく、繊維交点の全部が溶着してもよい。
　前記生体適合長繊維は、平均繊維直径（Ｄ）が１～７０μｍの範囲にあり、Ｄ±０．５Ｄの範囲で繊維直径が変化していることが好ましい。平均繊維直径（Ｄ）のさらに好ましい範囲は５～６０μｍである。前記生体適合長繊維の直径とその変化の度合いが前記のとおりであると、医療用及び細胞培養の足場等にさらに有用である。本発明において、「平均繊維直径」及び「その変化の度合い」は、それぞれ、生体適合長繊維不織布の走査型電子顕微鏡写真（500倍）から任意に選択した５０本の繊維の直径の平均値及びその変化の度合いを意味する。
　前記生体適合長繊維は、実質的に未延伸状態であることが好ましい。前記において、実質的に未延伸状態とは、機械的延伸を受けていない状態をいう。ノズルから吐出した紡糸液を圧空に随伴させて吹き飛ばすと繊維は細くなるが、実質的に未延伸状態である。
　前記生体適合長繊維不織布は、水に濡れてもへたらない。本発明において、「水に濡れてもへたらない」とは、生体適合長繊維不織布の水で飽和状態まで膨潤した後における１．０ｋＰａの圧縮応力時の圧縮変形率（以下において、単に「圧縮変形率」とも記す。）が４０％以下であることを意味する。前記飽和状態とは、水が最大限に含まれた状態であり、水の含有量が一定限度にとどまりそれ以上増えない状態を意味する。前記生体適合長繊維不織布の圧縮変形率は、４０％以下であることが好ましく、３５％以下であることがより好ましく、３０％以下がさらに好ましい。なお、前記生体適合長繊維不織布の圧縮変形率の下限は特に限定されないが、例えば、１％以上であることが好ましく、５％以上であることがより好ましい。また、前記生体適合長繊維不織布は、水に濡れてもへたらない観点から、水で飽和状態まで膨潤した後における初期弾性率（以下において、単に「初期弾性率」とも記す））が０．３０ｋＰａ以上であることが好ましく、より好ましくは０．３５ｋＰａ以上であることが好ましい。なお、前記生体適合長繊維不織布の初期弾性率の上限は特に限定されないが、例えば、２０ｋＰａ以下であることが好ましく、１０ｋＰａ以下であることがより好ましい。本発明において、圧縮変形率は、水で飽和状態まで膨潤した後の生体適合長繊維不織布において、無荷重の時の厚さを（Ｈ１）とし、１．０ｋＰａの圧縮応力時の厚さを（Ｈ２）とした場合、下記式で算出したものである。水で膨潤した後の圧縮変形率が上述した範囲であると、水に濡れてもへたらない。本発明において、初期弾性率は、ひずみ１～５％の圧縮弾性率を意味する。圧縮試験は、後述のとおりに行う。
　圧縮変形率（％）＝１００－｛（Ｈ２／Ｈ１）×１００｝
　前記生体適合長繊維不織布は、水に濡れると透明になる。この透明性は、培養液中で倒立顕微鏡により足場の内部まで観察できる程度の透明性である。倒立顕微鏡で観察できる程度の透明性があれば、培養状態を確認でき、好都合である。具体的には、本発明において、「水に濡れると透明になる」とは、水で飽和状態まで膨潤した後の生体適合長繊維不織布（厚さ１．５ｍｍ）の波長４００～８００ｎｍの範囲における平均透過率が１０％以上であることを意味する。水で飽和状態まで膨潤した後の生体適合長繊維不織布（厚さ１．５ｍｍ）の波長４００～８００ｎｍの範囲における平均透過率は、好ましくは１５％以上であり、より好ましくは２０％以上である。
　前記生体適合長繊維不織布は、シート状に形成されているのが好ましい。シート状であれば様々な形状に成形できる。
　前記生体適合長繊維不織布は、架橋しているのが好ましい。これにより形態安定性及び耐熱性を保てる。架橋は加熱脱水架橋が生体安全性のために好ましい。また、架橋前の生体適合長繊維又は生体適合ポリマーは水溶性であるのが好ましい。生体適合ポリマーが水溶性であると、紡糸液として水溶液の状態で紡糸でき、生体に対する安全性を高くすることができる。
　前記生体適合ポリマーは、ゼラチン、コラーゲン、キトサン、アルギン酸、ヒアルロン酸、ムコ多糖、デキストラン、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコールなどの水溶性高分子およびこれらの修飾体からなる群から選ばれる少なくとも一つのポリマーであるのが好ましい。ここで、「修飾体」とは、水溶性を損なわない程度に分子末端や側鎖等を変性することを意味する。これらは水（加熱水を含む）に溶解しやすく、溶液紡糸が可能で、繊維形成後にゲル化し、架橋させることができ、形態安定性の高い不織布に形成できることから好ましい。この中でもゼラチンがより好ましい。
　本発明の生体適合長繊維不織布の製造方法は、生体適合ポリマーを含む紡糸液をノズル吐出口から空気中に押し出し、前記ノズル吐出口の後方に位置し、前記ノズル吐出口とは非接触状態の流体噴射口から前方に向けて圧力流体を噴射し、前記押し出された紡糸液を前記圧力流体に随伴させて繊維形成させ、得られた生体適合長繊維を集積させて不織布とする。本発明において、生体適合長繊維不織布の製造に用いる製造装置は、生体適合ポリマーを含む紡糸液をノズル吐出口から空気中に押し出す手段と、前記ノズル吐出口の後方に位置し、前記ノズル吐出口とは非接触状態の流体噴射口から前方に向けて圧力流体を噴射する手段と、前記押し出された紡糸液が前記圧力流体に随伴されて形成される生体適合長繊維を集積させる手段を含む。圧力流体噴射口は、ノズル吐出口とは独立にかつ非接触状態で後方に配置されているため、紡糸液が混入することはない。このため、製品にコンタミが混入することを防止できる。
　前記紡糸液の温度は、紡糸液が流動する温度以上、かつ生体適合ポリマーの分解温度未満であることが好ましい。紡糸液が流動する温度以上でないと紡糸することはできず、生体適合ポリマーの分解温度以上であると分解物が製品に混入する恐れがある。
　前記圧力流体の噴射圧力は０．０５～０．５ＭＰａであるのが好ましい。前記の範囲であれば、ノズル吐出口から空気中に押し出された紡糸液を吹き飛ばして繊維化できる。また、前記圧力流体の温度は前記紡糸液の温度近辺が好ましく、より好ましくは、圧力流体の温度は紡糸液の温度±５０℃であり、さらに好ましくは紡糸液の温度±３０℃とする。この状態であればノズル吐出口から空気中に押し出された紡糸液は急冷されず、流動状態で繊維化され、その後空気中で冷却されて固体の繊維が形成される。
　前記紡糸液の粘度は、温度６０℃において５００～３０００ｍＰａ・ｓであるのが好ましい。粘度が前記範囲であれば、繊維化するのに都合がよい。
　前記生体適合長繊維不織布は、真空凍結乾燥し、その後、架橋させることが好ましい。真空凍結乾燥するのは、生体適合長繊維（生体適合ポリマー）の変質を防いで急速に乾燥させるためである。その後、架橋させるのは、形態安定性のために好ましい。架橋は、化学試薬を用いた架橋、加熱脱水架橋、光架橋、紫外線、電子線、放射線等のエネルギー線架橋等でもよい。加熱脱水架橋の温度は生体ポリマーの種類によって異なるが、例えば、ガラス転移点以上軟化点以下が好ましい。ゼラチン長繊維の加熱脱水架橋温度は１００～１６０℃が好ましい。
　以下、ゼラチン長繊維不織布を例に挙げて説明する。ゼラチン長繊維不織布は、医療用不織布又は細胞培養の足場用に好適である。ゼラチン自体は生体適合性、生分解性があり、長繊維不織布であると使い勝手が良い。
　ゼラチン長繊維不織布の製造方法は、下記の工程を含む。
１．準備工程
（１）ゼラチンを加熱水に溶解する。溶解温度（加熱水の温度）は２０～９０℃が好ましい。溶解した後、フィルトレーションして異物やごみなどを除去してもよい。
（２）その後、減圧又は真空脱泡して溶解空気を除去してもよい。
２．本工程
（１）加熱したゼラチン水溶液（紡糸液）を紡糸機のノズルから吐出する。
（２）前記ノズル周囲から圧力流体を供給し、前記吐出したゼラチン水溶液を前記圧力流体に随伴させて繊維形成させる。
（３）得られたゼラチン長繊維を集積させてゼラチン長繊維不織布とする。
３．後工程
（１）ゼラチン長繊維不織布を真空凍結乾燥する。
（２）乾燥したゼラチン長繊維不織布は所定の大きさにカットし、所定の形状に成形してもよい。成形はプレス成形等を使用できる。
（３）ゼラチン長繊維不織布を架橋させる。架橋は、加熱脱水架橋、熱架橋、電子線架橋、γ線等の放射線架橋、紫外線架橋等を採用できる。
（４）所定形状のゼラチン長繊維不織布、又はシートは滅菌する。滅菌はエチレンオキサイドガス滅菌、水蒸気、電子線照射、γ線等の放射線照射等を使用できる。電子線照射、γ線等の放射線照射の場合は、滅菌とともに架橋を同時にすることもできる。
４．使用時の滅菌
　医療用及び細胞培養の足場等に使用する際の準備工程として、エチレンオキサイド滅菌、または蒸気滅菌してもよい。架橋後のゼラチン長繊維不織布は蒸気滅菌できる。
　前記加熱したゼラチン水溶液（紡糸液）の温度は２０～９０℃であることが好ましい。前記の範囲であればゼラチンは安定したゾル状態を維持できる。また、前記加熱したゼラチン水溶液のゼラチン濃度は、ゼラチン水溶液を１００質量％とした時、３０～５５質量％であることが好ましい。さらに好ましい濃度は３５～５０質量％である。前記の濃度であれば安定したゾル状態を維持できる。前記加熱したゼラチン水溶液（紡糸液）の粘度は５００～３０００ｍＰａ・ｓが好ましい。前記の粘度であれば安定した紡糸ができる。
　前記圧力流体の温度は、ゼラチン水溶液（紡糸液）の場合は８０～１２０℃が好ましい。圧力流体の流速及び周囲雰囲気の温度にもよるが、前記の温度範囲であれば安定した紡糸ができる。圧力流体は空気を使用することが好ましく、圧力は０.１～１ＭＰａが好ましい。
　本発明の細胞培養用立体足場は、前記生体適合長繊維不織布を使用して作製する。一例として、架橋させた後の不織布（シート）を所定の形に打ち抜くなどして成形し、細胞培養用足場とする。或いは、所定の液体培地で膨潤した後に、目的の細胞培養用足場とする。前記液体培地で膨潤する前（乾燥状態）の足場の厚さは０．２ｍｍ以上であることが好ましく、より好ましくは０．３ｍｍ以上１０ｍｍ以下である。厚さが前記の範囲であれば、水又は液体培地で膨潤した後にピンセットで把持する際に、形状維持性が高いとともに、屈曲しにくくハンドリング性が良好になる。また、積層培養に用いる場合、液体培地で膨潤する前（乾燥状態）の足場の密度は、０．８ｇ／ｃｍ3以上が好ましく、より好ましくは１．０ｇ／ｃｍ3以上１．３ｇ／ｃｍ3以下である。密度が前記の範囲であれば、積層培養に用いる場合、水又は液体培地で膨潤した後にピンセットで把持する際に、形状維持性が高いとともに、屈曲しにくくハンドリング性が良好になる。
　前記足場を用いた細胞培養は、特に限定されないが、例えば、下記のように行うことができる。まず、目的とする細胞を液体培地中に、所定の濃度で懸濁し、細胞懸濁液を準備するとともに、同様の液体培地にゼラチン長繊維不織布製の足場等の生体適合長繊維不織布製の足場を入れ、所定時間（例えば３０分間）静置して、十分に膨潤させる。次に、膨潤させた生体適合長繊維不織布製の足場を、チューブや培養皿中に入れ、ここに細胞懸濁液を加え、インキュベーター中のシェイカー上で振盪し、細胞播種する。細胞懸濁液は、１種の細胞の懸濁液であってもよく、２種以上の複数種の異なる細胞の懸濁液であってもよい。すなわち、細胞播種は、単一細胞を播種してもよく、異なる細胞種を同時に播種することで行っても良い。細胞播種後、リン酸緩衝液で生体適合長繊維不織布製の足場を洗浄し、未接着の細胞を除去し、細胞播種した生体適合長繊維不織布製の足場を得る。細胞播種した生体適合長繊維不織布製の足場をプレートや培養皿に移し、液体培地を加え、所定条件（例えば温度３７℃、５％ＣＯ2）のインキュベーター中で静置培養してもよい。液体培地は、２～３日毎に交換してもよい。或いは、細胞播種した生体適合長繊維不織布製の足場を培養容器に配置し、細胞播種した生体適合長繊維不織布製の足場が浸るまで、液体培地を加え、３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーター中に置いたマグネティックスターラー上で液体培地を撹拌して循環させながら、撹拌培養してもよい。３～４日毎に、液体培地を半分量除き、等量の新たな液体培地を加えることで、培地交換を行ってもよい。或いは、細胞播種した生体適合長繊維不織布製の足場を培養容器に配置し、細胞播種した生体適合長繊維不織布製の足場が浸るまで、液体培地を加え、３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーター中で振とうさせながら培養してもよい。３～４日毎に、液体培地を半分量除き、等量の新たな液体培地を加えることで、培地交換を行ってもよい。本発明の生体適合長繊維不織布及び生体適合長繊維不織布を用いた細胞培養用立体足場は、水に濡れると透明になる。この透明性は、培養液中で倒立顕微鏡により足場の内部まで観察できる程度の透明性である。倒立顕微鏡で観察できる程度の透明性があれば、培養状態を確認でき、好都合である。上記のように生体適合長繊維不織布製足場に細胞を播種し、細胞培養を行うと、後述するように３次元細胞凝集体が得られる。得られた３次元細胞凝集体は、単一の細胞の細胞シート又は複数種の細胞の細胞シートと組み合わせて用いることができる。
　また、生体適合長繊維不織布製の足場を複数枚積層させて、細胞培養を行ってもよい。例えば、細胞培養して得られた細胞シートと、液体培地で膨潤させた生体適合長繊維不織布製の足場を交互に複数枚積層させて細胞培養を行うことができる。積層培養を行う際、ハンドリング性を高める観点から、上述したとおり、積層培養に用いる場合、液体培地で膨潤する前（乾燥状態）の足場の厚さは０．２ｍｍ以上であり、密度は、０．８ｇ／ｃｍ3以上であることが好ましい。複数枚細胞培養する方法では細胞シートが同一の細胞種に限られることはなく、複数種の細胞からなる細胞シート及び複数種の異なる細胞の細胞シートを積層して共培養してもよい。
　次に図面を用いて説明する。図１は本発明の一実施例で得られたゼラチン長繊維不織布の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ，日立走査型顕微鏡Ｓ－２６００Ｎ、１００倍）の写真である。図２は同、ゼラチン長繊維不織布の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ，日立走査型顕微鏡Ｓ－２６００Ｎ、５００倍）の写真である。不織布を構成するゼラチン長繊維は長さ方向で繊維直径が変化していることが分かる。また、不織布を構成するゼラチン長繊維は、繊維交点が部分的に溶着していることも確認できる。
　図３は本発明の一実施例で得られた長繊維不織布（縦３５ｍｍ、横２５ｍｍ、厚さ０．９５ｍｍ）の写真である。本発明の生体適合長繊維不織布の製造方法によれば、長尺シート状の不織布が得られるが、細胞培養用立体足場にする場合の取り扱い性を考慮して、一例として前記の大きさにすることができる。
　図４は本発明の一実施例で使用する不織布製造装置の模式的説明図である。不織布製造装置１０において、加温槽１に入れた生体適合ポリマーを含む紡糸液２をノズル吐出口３から空気中に押し出す。加温槽１にはコンプレッサー４により、所定の圧力をかけておく。１２は保温容器である。
　また、ノズル吐出口３の後方に位置し、ノズル吐出口３とは非接触状態の流体噴射口５から前方に向けて圧力流体７を噴射させる。流体噴射口５にはコンプレッサー６から圧力流体（例えば圧空）が供給される。流体噴射口５とノズル吐出口３との距離は５～３０ｍｍが好ましい。
　押し出された紡糸液は圧力流体７に随伴されて長繊維８となり、巻き取りロール１１上で長繊維不織布９となって堆積される。この時、堆積された長繊維は水分を含んでいたり、完全には固化していないので、繊維交点の少なくとも一部において接している繊維が互いに溶着する。なお、巻き取りロール以外でもネット等で長繊維を捕集し堆積して不織布にしてもよい。
　図２１は一実施例の生体適合長繊維不織布製の足場を用いて撹拌培養を行う際の細胞培養装置の模式的説明図である。この撹拌培養試験装置２０は、スピナーフラスコ２１内に攪拌棒２２と攪拌子２３を備えており、攪拌棒２２を回転させることにより、液体培地２４が攪拌される。液体培地２４内には例えば２２ゲージ針２５に通した生体適合長繊維不織布製の足場２６を入れ、細胞培養する。フラスコ内には所定の雰囲気ガスを送り込んでもよい。培養液は攪拌以外に、振とうさせてもよく、循環させてもよい。このように細胞培養すると、短期で、大きな３次元細胞凝集体が得られ、その凝集体内部で、細胞は高生存率となる。また、得られた３次元細胞凝集体は、ゼラチン長繊維不織布等の生体適合長繊維不織布製の足場が消失し、細胞及び細胞が産生する細胞外マトリクスと置き換わることもある。さらに、得られた３次元細胞凝集体は、高強度を示す。このようにして得られた３次元細胞凝集体は、その他の単一の細胞の細胞シート又は複数種の細胞の細胞シートと適宜に組み合わせて用いることができる。
　図３６は本発明の一実施例の生体適合長繊維不織布製の足場を複数枚積層して細胞培養する工程説明図である。（ａ）に示されているように、所定の液体培地３０を入れた培養皿３１に所定の濃度の細胞懸濁液３２を播種し、所定の時間（例えば１０日間）静置培養して、（ｂ）に示されているように、細胞シート３３を作製する。次に、ピペットの液流によって、細胞シート３３を、（ｃ）に示されているように、培養皿から剥離する。培養皿３１から液体培地３０を除去した後、所定の液体培地中で所定時間（例えば３０分）膨潤させておいた生体適合長繊維不織布製の足場３４をピンセットで把持して入れ、（ｄ）に示されているように、剥離された細胞シート３３の上に載せる。次に、（ｅ）に示されているように、それらを上から所定の圧力３５（例えば１ｋＰａ）で数秒押すことで、細胞シート３３と足場３４を一体化できる。細胞シート３３と足場３４が一体化したものをピンセットで把持して、（ｆ）に示されているように、複数枚積層する。このようにして３次元化した大きな細胞の塊を作製する。従来は、足場をピペットで吸い上げて積層しており、手間暇がかかるうえ、成功率も低く、熟練を要するという問題があった。これに比較して、本発明のゼラチン長繊維不織布製の足場等の生体適合長繊維不織布製の足場はピンセットで把持できるので、取扱性は飛躍的に向上できる。ピンセットで把持する操作は、例えば、図６－９に示すとおりに行う。図３６では細胞シートと足場を積層して複数枚細胞培養する方法を説明しているが、細胞懸濁液を所定の液体培地で所定時間膨潤したゼラチン長繊維不織布製の足場に播種し、所定時間細胞培養して得られた細胞培養後の足場を複数枚積層して、３次元化した大きな細胞の塊を作製してもよい。この所定時間細胞培養して得られた細胞培養後の足場は、足場内部に細胞が浸潤してもよい。また細胞が足場表面に留まるように培養し細胞シート様の構造となってもよい。複数枚細胞培養する方法では細胞シートが同一の細胞種に限られることはなく、複数種の細胞からなる細胞シート及び複数種の異なる細胞の細胞シートを積層して共培養してもよい。
　以下、実施例を用いてさらに具体的に説明する。なお、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
　測定方法は下記のとおりである。
　＜繊維直径＞
　生体適合長繊維不織布の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ、日立走査型顕微鏡Ｓ－２６００Ｎ、５００倍)の写真から任意に選択した５０本の繊維を用いて、平均繊維直径及びその変化の度合いを測定した。
＜その他＞
　後述のとおり、ＪＩＳ又は業界の規定する測定方法に従って測定した。
　（実施例１）
　ゼラチンとして新田ゼラチン社製（ゼリー強度２６２ｇ　原料：アルカリ処理牛骨）を使用し、ゼラチン：水＝３：５の質量比（ゼラチン濃度３７．５質量％）とし、温度６０℃で溶解した。６０℃における粘度は９６０～９７０ｍＰａ・ｓであった。このゼラチン水溶液を紡糸液とし、図４に示す不織布製造装置を使用して長繊維不織布を製造した。紡糸液の温度は６０℃、ノズル直径（内径）２５０μｍ、吐出圧０．３ＭＰａ、ノズル高さ５ｍｍ、エアー圧力０．３ＭＰａ、エアー温度１００℃、流体噴射口５とノズル吐出口３との距離は２０ｍｍ、捕集距離１００ｃｍとし、巻き取りローラ１１で長繊維不織布９を巻き取った。
　次いで、長繊維不織布は真空凍結乾燥し（－８０℃、１３Ｐａ、７２時間）、その後、加熱脱水架橋させた。架橋条件は温度１４０℃、４８時間とした。
　得られた実施例１の不織布を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ、日立走査型顕微鏡Ｓ－２６００Ｎ）で観察し、その結果を図１（１００倍）及び図２（５００倍）に示した。図２の生体適合長繊維不織布の走査型電子顕微鏡写真（５００倍）から任意に選択した５０本の繊維直径を測定したところ、前記不織布を構成する長繊維の平均繊維直径は５１μｍであり、５１±２０μｍの範囲で繊維直径が変化していた。また、図１～２に示すように構成繊維は、繊維交点において部分的に溶着していた。
　得られた実施例１の不織布を、直径φ４ｍｍの円柱状に打ち抜いた。打ち抜いた不織布サンプルを、３７℃の精製水中で、１晩静置し、飽和状態になるまで十分に膨潤させ、ピンセットで持った際の形状維持性を確認した。その結果を図５に示した。図５に示されているように、実施例１の不織布は膨潤後の形態維持性が良好であり、膨潤後にピンセットで持っても、形状を維持しておりハンドリング性に優れていた。また、膨潤させた不織布サンプルの直径を計測後、（株）山電製クリープメータ物性試験システムＲＥ２－３３００５Ｃにて、厚さ（Ｈ１）を測定し、直径φ４０ｍｍのプランジャーを用い、０．０５ｍｍ／ｓｅｃで圧縮した。ひずみ１～５％の圧縮弾性率（kＰａ）及び、ひずみ１０％、２０％、３０％の中間圧縮応力（kＰａ）を測定した。また、無荷重時の厚さ（ひずみ０％）を基準とし、圧縮応力１ｋＰａ時の厚さの変化率（ひずみ率）を算出し、圧縮変形率とした。ひずみ１～５％の圧縮弾性率（kＰａ）は初期弾性率に該当する。また、プレートリーダー社製、型番「Ｓｐｅｃｔｒａ　Ｍａｘ　ｉ３」）を用いて、膨潤させた不織布サンプル（厚み１．５ｍｍ）の波長範囲４００～８００ｎｍにおける透過率を１０ｎｍ間隔で測定し、４００～８００ｎｍの範囲における平均透過率を算出した。
　（実施例２）
　吐出圧０．１５ＭＰａとした以外は実施例１と同様にして不織布を作製し、実施例１と同様にして物性を測定した。
　（実施例３）
　吐出圧０．２ＭＰａとした以外は実施例１と同様にして不織布を作製し、実施例１と同様にして物性を測定した。
　（実施例４）
　吐出圧０．１ＭＰａとし、エアー圧力０．２ＭＰａ、捕集距離５０ｃｍとした以外は実施例１と同様にして不織布を作製し、実施例１と同様にして物性を測定した。
　（実施例５）
　不織布の作製時間を増やし、膨潤後、無荷重時での厚さが３．０３ｍｍになるようにした以外は、実施例４と同様に不織布を作製し、実施例１と同様にして物性測定をした。
　（実施例６）
　不織布の作製時間を減らし、膨潤後、無荷重時での厚さが０．６９ｍｍになるようにした以外は、実施例４と同様に不織布を作製し、物性測定に用いた不織布サンプルの直径φ６ｍｍにした以外は、実施例１と同様にして物性測定をした。
　（比較例１）
　比較例１として、熱架橋後のゼラチンスポンジ（ファイザー株式会社、商品名「ゼルフォーム」）を任意の厚さにスライスした後、直径φ４ｍｍに打ち抜き、３７℃の精製水中で、１晩静置し、飽和状態になるまでに十分に膨潤させ、実施例１と同様に物性測定した。
　以上の条件及び結果は表１にまとめて示す。また、実施例２～４のゼラチン長繊維不織布、比較例１のゼラチンスポンジ、及び実施例６のゼラチン長繊維不織布を精製水中で膨潤させ、ピンセットで持った際の形状維持性を確認した結果を図６～９、３７にそれぞれ示した。図６～９、３７から分かるように、実施例２～４のゼラチン長繊維不織布も、実施例１のゼラチン長繊維不織布と同様、膨潤後の形態維持性が良好であり、膨潤後にピンセットで持っても、形状を維持しておりハンドリング性に優れていた。一方、比較例１のゼラチンスポンジは、膨潤後の形態維持性が悪く、膨潤後にピンセットで持った場合、形状が崩れていた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１から明らかなとおり、比較例１のゼラチンスポンジは、膨潤前後での厚さを対比すると、膨潤後の方が薄くなった。また、比較例１のゼラチンスポンジは、圧縮特性において、圧縮弾性率が低く、またひずみに伴い、圧縮応力変化が小さいことから、非常に変形しやすく、腰がなかった。一方で、本発明の各実施例のゼラチン長繊維不織布は、膨潤前後の厚さを対比すると、膨潤後の方が、厚くなった。ゼラチンスポンジと比較して、圧縮弾性率が約１．２～３．０倍高かった。さらに繊維直径が太いほど、ひずみに伴い、圧縮応力が増大しており、変形に強かった。また、１．０ｋＰａの圧縮応力時の圧縮変形率（ひずみ率）は、ゼラチンスポンジは５６．８％と大きく変形するが、実施例のゼラチン長繊維不織布は、３５％以下であり、腰が強かった。
　（実施例Ａ１）
　本実施例は、静置培養による細胞培養試験の例である。実施例４で得られたゼラチン長繊維不織布製の足場（乾燥時の厚さ１．２ｍｍ、密度 ０．４４ｇ／ｃｍ3、直径４ｍｍ）を用いて細胞の静置培養を行った。
　１．試験の内容
　（１）細胞培養
　（a）ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を、液体培地中（ウシ胎児血清１０質量％、ペニシリンストレプトマイシン１質量％を含むαＭＥＭ培地）に、２．０×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるよう懸濁し、細胞懸濁液を準備した。
　（ｂ）エチレンオキサイドガス滅菌後のゼラチン長繊維不織布製の足場を、液体培地に３０分間静置して、十分に膨潤させた。
　（ｃ）膨潤させたゼラチン長繊維不織布製の足場を、１５ｍＬのＰＰチューブ中に入れ、ここに細胞懸濁液２００μＬを加え、３７℃インキュベーター中で、オービタルシェイカー上で、３００ｒｐｍ、６時間振盪し、細胞播種した。
　（ｄ）細胞播種後、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）でゼラチン長繊維不織布製の足場を洗浄し、未接着の細胞を除去し、１２ウェルプレートにピンセットで移し、液体培地３ｍＬを加え、温度３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーター中で静置培養した。液体培地は、２～３日毎に交換した。
（２）培養時の観察
　細胞培養中の足場を、ルーチン倒立顕微鏡（カールツァイスマイクロスコピー社製の「Ｐｒｉｍｏ　Ｖｅｒｔ」）で観察、撮影した。
（３）細胞数
　培養した足場をリン酸緩衝液（ｐＨ7.4）で洗浄し、３７℃の、０．２ｍｇ／ｍＬのドデシル硫酸ナトリウムを含んだ３０ｍＭの塩化ナトリウム－クエン酸溶液（ＳＳＣ溶液）３００μＬ中で、２４時間、３００ｒｐｍで撹拌し、細胞を回収した。回収した細胞の分散液１００μＬに、３０ｍＭの塩化ナトリウム－クエン酸溶液（ＳＳＣ溶液）４００μＬを加え、得られた溶液に核染色剤であるＨｏｅｃｈｅｓｔ３３２５８（ナカライテスク社）を１μＬ／ｍＬとなるよう加えた。得られた溶液をＥｘ３５５ｎｍ、Ｅｍ４６０ｎｍで蛍光強度測定し、細胞数既知の溶液から得られた標準線から、細胞数を求めた。
（４）足場内の細胞分布
　培養した足場をリン酸緩衝液で洗浄後、４％パラホルムアルデヒドで固定し、さらにリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で３回洗浄した。洗浄後、ＯＣＴコンパウンド（サクラファインテックジャパン社）で包埋後、凍結状態で、円柱状の足場の直径と垂直方向に、切片を作製した。凍結切片をヘマトキシリンエオジン染色し、足場内の細胞分布の仕方を光学顕微鏡（株式会社キーエンス社製、型番「ＢＺ－Ｘ７１０」）観察した。
（５）足場内の低酸素状態の評価
　細胞培養中の液体培地を取り除き、新たに加えたαＭＥＭ培地に、Ｈｙｐｏｘｉａ　Ｐｒｏｂｅ　ＬＯＸ－１（ＯＲＧＡＮＯＧＥＮＩＸ社）を所定量加え、一晩インキュベートした。培養中の足場を、蛍光顕微鏡（株式会社キーエンス製の「ＢＺ－Ｘ７１０」）で、Ｅｘ５１０－５６０ｎｍ、Ｅｍ５８０ｎｍで蛍光観察した。Ｉｍａｇｅ　Ｊでコントラストを調整した。
　（実施例Ａ２）
　実施例４で得られたゼラチン長繊維不織布製の足場に代わりに、実施例２で得られたゼラチン長繊維不織布製の足場を用いた以外は、実施例Ａ１に記載のとおりに細胞培養を行った。
　（比較例Ａ１～Ａ３）
　実施例４で得られたゼラチン長繊維不織布製の足場に代わりに、比較例１のゼラチンスポンジ製の足場（比較例Ａ１）、比較例２として繊維径４０μｍのポリプロピレン長繊維不織布製の足場（比較例Ａ２）、比較例３として繊維径２μｍのポリ乳酸長繊維不織布製の足場（比較例Ａ３）を用いた以外は、実施例Ａ１に記載のとおりに細胞培養を行った。
２．結果
（１）細胞培養及び培養時の観察性
　図１０に実施例４のゼラチン長繊維不織布製の足場を用いて細胞培養した時の細胞播種直後の倒立顕微鏡観察写真（２０倍）を示し、図１１に同培養７日目の倒立顕微鏡観察写真（２０倍）を示した。図１０及び図１１から分かるように、実施例４のゼラチン長繊維不織布製の足場は、培養液中で透明で、細胞培養の様子が観察できた。また、細胞播種後は、ゼラチン長繊維の交点に細胞接着が見られ、培養７日目には繊維間隙を細胞が覆い尽くした。一方、比較例１のゼラチンスポンジの足場を用いた比較例Ａ１（図１２）、比較例２のポリプロピレン不織布製の足場を用いた比較例Ａ２（図１３）、比較例３のポリ乳酸不織布製の足場を用いた比較例Ａ３で（図１４）は、細胞培養時に光が足場を透過せず、細胞の状態を観察できなかった。実施例で得られたゼラチン長繊維不織布を用いた足場は、細胞培養しながら細胞形態の観察が可能であるため、研究用途に使いやすいことが確認できた。
（２）細胞数
　表２及び図２０に実施例２で得られたゼラチン長繊維不織布製の足場及び実施例４で得られたゼラチン長繊維不織布製の足場を用いた場合の細胞増殖データのデータを示す。実施例４のゼラチン長繊維不織布製の足場を用いた場合は、培養７日目で、細胞播種後の約３．５倍、培養１４日目で細胞播種後の約８．２倍、培養２１日目で細胞播種後の約１９．５倍に細胞増殖した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（３）足場内の細胞分布
　図１５に、実施例４で得られたゼラチン長繊維不織布製の足場を用いて８日間細胞培養した後の足場切片のヘマトキシリンエオジン染色し、光学顕微鏡で観察した全体像の写真（１０倍で観察した写真をソフトウェア上で連結）を示し、図１６にその部分拡大写真（１０倍）を示した。図１５及び図１６から明らかなように、本発明の実施例４で得られたゼラチン長繊維不織布製の足場不織布製の足場を用いて細胞培養した時、足場の内部まで、細胞が侵入していた。一方、比較例２のポリプロピレン不織布製の足場を用いた比較例Ａ２では、細胞侵入は足場の外側までであった（図１７：倍率４の写真）。図１５～１７において、濃色に見える部分は細胞核である。
（４）足場内の酸素分圧
　図１８に、実施例４で得られたゼラチン長繊維不織布製の足場を用いて１２日間細胞培養を行った時の足場の光学顕微鏡観察写真（２０倍）を示した。図１９に、実施例４で得られたゼラチン長繊維不織布製の足場を用いて細胞培養を１２日間行った後の足場内の酸素状態を低酸素マーカーによって観察した蛍光観察顕微鏡写真（明度の高い部分（白色に近い部分）：低酸素部位）（２０倍）を示した。実施例４で得られたゼラチン長繊維不織布製の足場は、図１８の光学顕微鏡観察写真で繊維と同定できる部位にて、低酸素マーカーによる蛍光強度が弱いことから（図１９）、繊維内を酸素が拡散していることが確認できた。本発明の実施例で得られたゼラチン長繊維不織布製の足場は、構成繊維が部分的に溶着し、水に濡れてもへたらないことから、酸素がゼラチン長繊維不織布製の足場全体に行きわたり、立体足場として有用であった。
　（実施例Ａ３）
　本実施例は、撹拌培養による細胞培養試験の例である。
１．試験の内容
（１）ゼラチン長繊維不織布の作製
　実施例５で得られたゼラチン長繊維不織布製の足場（乾燥時の厚さ１．６ｍｍ、密度０．４４ｇ／ｃｍ3、直径４ｍｍ）を用いて撹拌培養による細胞培養を行った。
（２）細胞培養
　上記で得られたゼラチン長繊維不織布製の足場を用い、上述の静置培養と同様の細胞播種方法にて、細胞播種した。図２１に示す装置を用いて、細胞播種したゼラチン長繊維不織布製の足場２６を、２２ゲージの滅菌針２５に複数個刺し、足場２６間の距離が２ｍｍとなるよう調整した。ゼラチン長繊維不織布製の足場２６を刺した２２Ｇ針２５をスピナーフラスコ２１の上部のゴム栓に刺し、固定した。ゼラチン長繊維不織布製の足場が浸るまで、液体培地を加え、３７℃、５％ＣＯ2のインキュベーター中に置いたマグネティックスターラー上で、１００ｒｐｍで撹拌し、培養液を撹拌させた。３～４日毎に、液体培地を半分量除き、等量の新たな液体培地を加えることで、培地交換を行った。
（３）細胞生死の確認
　培養中の足場を、リン酸緩衝液で洗浄した。リン酸緩衝液に、Ｃａｌｃｅｉｎ　ＡＭ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）０．７５μＬ／ｍＬ、Ｅｔｈｉｄｉｕｍ　ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ－１（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）２μＬ／ｍＬとなるよう、溶液を調整した。２４ウェルプレート中に置いた足場に、上記溶液を１ｍＬ加え、３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後、溶液を除去し、リン酸緩衝液を１ｍＬ加え、３７℃で５分間インキュベートすることで、洗浄した。洗浄後の足場を、ＯＣＴコンパウンド（サクラファインテックジャパン社）で包埋後、凍結状態で、円柱状の足場の直径と垂直方向に、切片を作製した。蛍光顕微鏡（株式会社キーエンス製、型番「ＢＺ－Ｘ７１０」）を用い、生細胞をＥｘ：４７０ｎｍ、Ｅｍ：５２５ｎｍ、死細胞をＥｘ：５４５ｎｍ、Ｅｍ：６０５ｎｍで蛍光観察した。
（４）脱細胞処理
　培養した足場をリン酸緩衝液で洗浄し、３７℃の、０．２ｍｇ／ｍＬのドデシル硫酸ナトリウムを含んだ３０ｍＭの塩化ナトリウム―クエン酸（ＳＳＣ）溶液３００μＬ中で、２４時間、３００ｒｐｍで撹拌し、細胞を抽出し、脱細胞処理を行った。
（５）細胞分布
　撹拌培養後の足場及び脱細胞処理を行った足場を、リン酸緩衝液で洗浄後、４％パラホルムアルデヒドで固定し、さらにリン酸緩衝液で３回洗浄した。洗浄後、ＯＣＴコンパウンド（サクラファインテックジャパン社）で包埋後、凍結状態で、円柱状の足場の直径と垂直方向になるように、切片を作製した。凍結切片をヘマトキシリンエオジン染色し、足場内の細胞分布の仕方を光学顕微鏡（株式会社キーエンス製、型番「ＢＺ－Ｘ７１０」）で観察した。
（６）足場の強度測定
　細胞培養後の足場及び脱細胞処理後の足場の直径を計測し、（株）山電製のクリープメータ物性試験システムＲＥ２－３３００５Ｃにて、厚さを測定し、φ４０ｍｍのプランジャーを用い、０．０５ｍｍ／ｓｅｃの速度で圧縮した。ひずみ１～５％の圧縮弾性率（ｋＰａ）及び、ひずみ１０％、２０％、３０％の中間圧縮応力（ｋＰａ）を測定した。また無荷重時（ひずみ０％）を基準とし、圧縮応力１ｋＰａ時のひずみを寸法変化率とした。
２．結果
（１）撹拌培養による足場形状の変化
　培養日時の経過により、ゼラチン長繊維不織布製の足場の形状が変化した。図２２に、培養中の足場を、横方向からデジタルカメラで撮影した写真を示した。図２３に、培養後、足場一つ分を切り出した、細胞足場の外観写真を示した。図２４に、脱細胞処理した細胞足場の写真を示した。撹拌培養により、ゼラチン長繊維不織布製の足場は、培養７日目で、ゼラチン長繊維不織布製の足場の角が取れ、１４日目以降で直径が小さくなり、白く濁った。培養２５日目には、２ｍｍ間隔で針に配置した足場同士が繋がり、一体となった。細胞培養後の足場は、脱細胞処理を行っても形状を維持していた。
（２）細胞の分布
　図２５に、実施例Ａ３において、１４日間撹拌培養した後の足場の切片（足場断面）をヘマトキシリンエオジン染色し、光学顕微鏡で観察した全体像の写真（１０倍で観察し、ソフトウェア上で連結）を示した。図２６に、その端部における部分拡大写真（２０倍）を示した。図２５及び２６から明らかなように、細胞が足場内部まで侵入しており、特に足場の端部では、細胞がより高密度に増殖していた。図２５、２６において、濃色に見える部分は細胞核である。
　図２７に、実施例Ａ３において、１４日間撹拌培養後、脱細胞処理した後の足場の切片をヘマトキシリンエオジン染色し、端部を光学顕微鏡で観察した（２０倍）を示した。細胞が高密度で増殖した足場端部では、足場を取り除いた後も、ゼラチン繊維間に組織が残存しており、細胞が細胞外マトリクスを産生していることが分かった。
　図２８に、実施例Ａ３において、２５日間撹拌培養した後の足場の切片をヘマトキシリンエオジン染色し、光学顕微鏡で観察した全体像の写真（１０倍で観察し、ソフトウェア上で連結）を示した。図２９に、その端部における部分拡大写真（２０倍）を示した。図２８及び２９から明らかなように、細胞が組織中心部まで高密度に増殖した。図２８、２９において、濃色に見える部分は細胞核である。
　図３０に、実施例Ａ３において、２５日間撹拌培養後、脱細胞処理した後の足場の切片をヘマトキシリンエオジン染色し、光学顕微鏡で観察した全体像の写真（１０倍で観察し、ソフトウェア上で連結）を示した。図３１に、その端部及び中心部における部分拡大写真（２０倍）を示した。図３０及び３１より明らかなように、培養２５日目には、ゼラチン繊維が見られず、細胞外マトリクスのみが見られるため、細胞が高密度に凝集する中で、ゼラチン長繊維不織布が分解し、細胞が産生した細胞外マトリクスとすべて置き換わったことが分かった。
（３）細胞生死
　図３２に、実施例Ａ３において、１４日間撹拌培養した後の足場の切片の生細胞を蛍光顕微鏡で観察した全体像の写真（１０倍で観察し、ソフトウェア上で連結）を示した。生細胞部位にて、蛍光強度が強いため、明度の高い部位（白色に近い部位）が、生細胞である。
　図３３に、実施例Ａ３において、１４日間撹拌培養した後の足場の切片の死細胞を蛍光顕微鏡で観察した全体像の写真（１０倍で観察し、ソフトウェア上で連結）を示した。死細胞部位にて、蛍光強度が強いため、明度の高い部位（白色に近い部位）が、死細胞部位である。
　図３２～３３より明らかなように、ゼラチン長繊維不織布内部では、生細胞が多くみられ、死細胞がほぼ見られない。ゼラチン長繊維不織布を細胞培養足場とすることで、３次元の細胞凝集体においても、組織中心部で細胞が、高い生存率を示すことが分かった。
　図３４に、実施例Ａ３において、２５日間撹拌培養した後の足場の切片の生細胞を蛍光顕微鏡で観察した全体像の写真（１０倍）で観察し、ソフトウェア上で連結）を示した。生細胞部位にて、蛍光強度が強いため、明度の高い部位（白色に近い部位）が、生細胞である。
　図３５に、実施例Ａ３において、２５日間撹拌培養した後の足場の切片の死細胞を蛍光顕微鏡で観察した全体像の写真（１０倍で観察し、ソフトウェア上で連結）を示した。死細胞部位にて、蛍光強度が強いため、明度の高い部位（白色に近い部位）が、死細胞部位である。
　図３４及び３５より明らかなように、ゼラチン長繊維不織布が消失し、細胞と細胞外マトリクスで構成される組織と置き換わった後においても、細胞組織内部では、生細胞が多くみられ、死細胞がほぼ見られなかった。ゼラチン長繊維不織布を足場として細胞培養した時、ゼラチン長繊維不織布が、直径２ｍｍ以上と大きく、かつ高密度の３次元細胞凝集体と置き換わったあとも、高い生存率を示すことが分かった。
（４）足場の強度測定
　実施例Ａ３において、撹拌培養した後の足場及び、脱細胞処理した足場の力学特性を表３に示した。ゼラチン長繊維不織布を用い、撹拌培養することで、１-５％弾性率及び中間応力は、いずれも上昇した。ゼラチン長繊維不織布の空隙内、細胞が密に増殖していくことで、強度が向上した。さらにこれらの力学挙動は、脱細胞処理した足場においても、同傾向であり、細胞が産生した細胞外マトリクスが、ゼラチン長繊維不織布の空隙内を満たすことによって、強度が向上した。特に、培養２５日目においては、ゼラチン長繊維不織布が消失し、細胞及び細胞外マトリクスのみからなる細胞凝集体となっているにも関わらず、高強度となっており、細胞が産生した細胞外マトリクスには、エラスチンなどの弾性線維が含まれており、よりヒトの生態環境に近い細胞凝集体となっていると期待できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　本実施例のゼラチン長繊維不織布製の足場を用いて撹拌下で細胞培養した結果から、次のことが分かる。
（１）培養２５日の短期で、大きさ２ｍｍ以上の３次元細胞凝集体が得られ、その凝集体内部で、細胞は高生存率であった。
（２）得られた３次元細胞凝集体では、ゼラチン長繊維不織布が消失し、細胞及び細胞が産生する細胞外マトリクスと置き換わっていた。
（３）得られた３次元細胞凝集体は、高強度を示した。
　（実施例Ａ４）
　本実施例は、積層培養による細胞培養試験の例である。実施例６で得られたゼラチン長繊維不織布製の足場（乾燥時の厚さ０．２ｍｍ、密度０．８ｇ／ｃｍ3、直径６ｍｍ）を用いて細胞の静置培養を行った。
１．細胞培養
（１）ゼラチン長繊維不織布製の足場と細胞シートの交互積層
（ａ）ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を、液体培地中（ウシ胎児血清１０質量％、ペニシリンストレプトマイシン１質量％を含むαＭＥＭ培地）に、２．０×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるよう懸濁し、細胞懸濁液を準備した。
（ｂ）１２穴のウェルプレートに液体培地を１ｍＬ加え、そこに細胞懸濁液を５０μＬ播種し、１０日間静置培養して細胞シートを作製した。
（ｃ）１０００ｍＬのマイクロピペットを用い、液流によって細胞シートを１２穴のウェルプレートから剥離した。
（ｄ）エチレンオキサイドガス滅菌後のゼラチン長繊維不織布製の足場を、液体培地に３０分間静置して、十分に膨潤させた。
（ｄ）ウェルプレートの培地を抜き、細胞シートの上に膨潤させたゼラチン長繊維不織布製の足場を置いた。ゼラチン長繊維不織布製の足場の上から圧力１．３ｋＰａの圧力をかけて、細胞シートとゼラチン不織布を接着させた。
（ｅ）ピンセットを用いて、同様にして作製した細胞シート・ゼラチン長繊維不織布製の足場の一体物を３層積層させて（図３６－ｆ）、温度３７℃、５％ＣＯ2の条件で６０分間インキュベートして、層同士を接着し一体化した。
（２）積層体の上面の観察
　積層後の足場と細胞シートの積層体を、光学顕微鏡（株式会社キーエンス製、型番「ＢＺ－Ｘ７１０」）で観察し、撮影した。
（３）積層体の断面の観察
　積層体をリン酸緩衝液で洗浄後、４％パラホルムアルデヒドで固定し、さらにリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で３回洗浄した。洗浄後、ＯＣＴコンパウンド（サクラファインテックジャパン社）で包埋後、凍結状態で、円柱状の足場の直径と垂直方向に、切片を作製した。凍結切片をヘマトキシリン・エオジン染色し、足場内の細胞分布の仕方を光学顕微鏡（株式会社キーエンス製、型番「ＢＺ－Ｘ７１０」）で観察した。
２．結果
（１）積層体の観察
　図３９に、積層体を上面から観察した顕微鏡写真（４倍）を蛍光顕微鏡（株式会社キーエンス製、型番「ＢＺ－Ｘ７１０」）のソフトウェア上で連結し、全体像としたものを示した。細胞シートがゼラチン不織布の上面にシワなく重なっていることが確認できた。
　図４０にゼラチン長繊維不織布と細胞シートを３層交互に積層した積層体の断面図の顕微鏡写真を示した。ヘマトキシリン・エオジンによって染色された細胞核と細胞質が線状にみられることから、細胞シートの存在が確認できた。また、その細胞シートが一定の間隔を置いて３層みられた。その間隔は膨潤したゼラチン長繊維不織布の厚さ（約０．７ｍｍ）と同等であり、ゼラチン長繊維不織布と細胞シートが交互積層していることが確認できた。
　（実施例Ｂ１）
　異なる厚さ（乾燥状態）及び密度（乾燥状態）のゼラチン長繊維不織布を用いて、積層用足場に好ましいゼラチン長繊維不織布を検討した。ハンドリグ性が良好というのは、液体培地で膨潤した後の足場をピンセットで把持した際に形状維持性は良好であるとともに、屈曲しにくいことを意味する。例えば、図５～８及び図３７は、水又は液体培地で膨潤した後の足場をピンセットで把持した際に形状維持性が良好であとともに、屈曲していない例である。一方、図３８には、ピンセットで把持した際に形状維持性が良好であるが、屈曲している例を示した。ゼラチン長繊維不織布製の足場のハンドリング性を片持ち梁で評価した。直方体の台を試験台とした。片持ち梁となるように、試験片の面積の半分が台座から出るように、台座の端に試験片を置いた。試験片の俯角を測定して４５度以内であればハンドリング性良好（Ａ）、４５度より大きければハンドリング性不良（Ｂ）と判断した。片持ち梁試験において、ハンドリング性良好の例を図４１に示し、ハンドリング性不良の例を図４２に示した。ハンドリング性の結果を図４３に示した。図４３から、ゼラチン長繊維不織布製の足場を液体培地で膨潤させてピンセットで把持する際に、膨潤する前の乾燥状態の厚さが０．２ｍｍ以上、密度は０．８ｇ／ｃｍ3以上が好ましいことが分かった。
　本発明の生体適合長繊維不織布は、細胞培養用立体足場に好適であるほか、様々な医療用途にも適用できる。
１　加温槽
２　紡糸液
３　ノズル吐出口
４，６　コンプレッサー
５　流体噴射口
７　圧力流体
８　長繊維
９　長繊維不織布
１０　不織布製造装置
１１　巻き取りロール
１２　保温容器
２０　撹拌培養試験装置
２１　スピナーフラスコ
２２　攪拌棒
２３　攪拌子
２４、３０　液体培地
２５　２２ゲージ針
２６、３４　足場
３１　培養皿
３２　細胞懸濁液
３３　細胞シート
３５　圧力

Claims (20)

  1. 　生体適合ポリマーを主成分とする生体適合長繊維不織布であって、
    　前記生体適合長繊維不織布を構成する生体適合長繊維は、長さ方向で繊維直径が変化しており、
    　前記生体適合長繊維不織布を構成する生体適合長繊維は、繊維交点が少なくとも部分的に溶着しており、
    　水に濡れてもへたらず、水に濡れると透明になることを特徴とする生体適合長繊維不織布。
  2. 　前記生体適合長繊維は、平均繊維直径（Ｄ）が１～７０μｍの範囲にあり、Ｄ±０．５Ｄの範囲で繊維直径が変化している請求項１に記載の生体適合長繊維不織布。
  3. 　前記生体適合長繊維は、実質的に未延伸状態である請求項１又は２に記載の生体適合長繊維不織布。
  4. 　前記生体適合長繊維不織布は、１．０ｋＰａの圧縮応力時の圧縮変形率が４０％以下である請求項１～３のいずれか１項に記載の生体適合長繊維不織布。
  5. 　前記生体適合長繊維不織布を構成する生体適合長繊維は、架橋している請求項１～４のいずれか１項に記載の生体適合長繊維不織布。
  6. 　前記生体適合長繊維不織布を構成する生体適合長繊維は、架橋前は水溶性である請求項１～５のいずれか１項に記載の生体適合長繊維不織布。
  7. 　前記生体適合ポリマーは、ゼラチン、コラーゲン、キトサン、アルギン酸、ヒアルロン酸、ムコ多糖、デキストラン、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコールおよびこれらの修飾体からなる群から選ばれる少なくとも一つの水溶性高分子である請求項１～６のいずれかに記載の生体適合長繊維不織布。
  8. 　請求項１～７のいずれか１項に記載の生体適合長繊維不織布の製造方法であって、
    　生体適合ポリマーを含む紡糸液をノズル吐出口から空気中に押し出し、
    　前記ノズル吐出口の後方に位置し、前記ノズル吐出口とは非接触状態の流体噴射口から前方に向けて圧力流体を噴射し、
    　前記押し出された紡糸液を前記圧力流体に随伴させて繊維形成させ、前記繊維形成した繊維を集積させて不織布とすることを特徴とする生体適合長繊維不織布の製造方法。
  9. 　前記紡糸液の温度は、紡糸液が流動する温度以上、かつ生体適合ポリマーの分解温度以下である請求項８に記載の生体適合長繊維不織布の製造方法。
  10. 　前記圧力流体の噴射圧力は０．０５～０．５ＭＰａであり、前記圧力流体の温度は前記紡糸液の温度±３０℃である請求項８又は９に記載の生体適合長繊維不織布の製造方法。
  11. 　前記紡糸液の粘度は、温度６０℃において５００～３０００ｍＰａ・ｓである請求項８～１０のいずれか１項に記載の生体適合長繊維不織布の製造方法。
  12. 　前記生体適合長繊維不織布は、真空凍結乾燥し、その後加熱脱水架橋する請求項８～１１のいずれか１項に記載の生体適合長繊維不織布の製造方法。
  13. 　請求項１～７のいずれか１項に記載の生体適合長繊維不織布を細胞培養用立体足場とすることを特徴とする細胞培養用立体足場。
  14. 　前記足場の厚みが０．２ｍｍ以上であり、足場内部でも細胞が生存する請求項１３に記載の細胞培養用立体足場。
  15. 　請求項１３又は１４に記載の細胞培養用立体足場を使用した細胞培養方法であって、
    　前記足場に細胞を播種した後、細胞播種した足場を液体培地中に入れて、細胞培養することを特徴とする細胞培養方法。
  16. 　前記足場の厚みが０．２ｍｍ以上であり、足場内部でも細胞が生存する請求項１５に記載の細胞培養方法。
  17. 　前記液体培地を攪拌、循環及び振とうから選ばれる少なくとも一つの手段で流動させながら細胞培養する請求項１５又は１６に記載の細胞培養方法。
  18. 　前記細胞培養中に、前記足場は消失し、培養した細胞及び前記細胞が産生する細胞外マトリクスと置き換わる請求項１５～１７のいずれか１項に記載の細胞培養方法。
  19. 　前記足場をピンセットで把持して細胞シートと積層する工程を含む請求項１５～１８のいずれか１項に記載の細胞培養方法。
  20. 　前記足場の厚さは０．２ｍｍ以上であり、密度が０．８ｇ／ｃｍ3以上である請求項１９に記載の細胞培養方法。
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