WO2022059236A1 - 細胞支持体およびその製造方法、細胞の培養方法ならびに細胞構造体 - Google Patents

細胞支持体およびその製造方法、細胞の培養方法ならびに細胞構造体 Download PDF

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WO2022059236A1
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gelatin
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泰彦 田畑
典明 伊藤
明弘 前澤
勇樹 村田
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コニカミノルタ株式会社
泰彦 田畑
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    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/54—Collagen; Gelatin

Definitions

  • the present invention relates to a cell support and a method for producing the same, a method for culturing cells, and a cell structure.
  • Patent Document 1 describes that a probe solution is added to a culture solution to introduce the probe into cells so that the state of the cells can be detected.
  • Patent Document 2 describes a biodegradable substrate having a biodegradable nonwoven fabric sewn with a biodegradable filament and a biodegradable film-like material superimposed on the biodegradable nonwoven fabric. ing. Patent Document 2 describes that this biodegradable substrate, when used as a cell support, allows cells to easily enter the inside, does not cause a foreign body reaction in the living body, and can be implanted for a long period of time. ing.
  • Patent Document 3 describes that cells are cultured by coating a culture dish made of poly N-isopropylacrylamide (PIPAAm) (UpCell manufactured by CellSeed) with gelatin or the like.
  • Patent Document 4 describes that adhesive cancer cells are cultured using a cell culture substrate provided with a biobound polymer layer on a substrate made of a material such as silicon, glass and plastic. Further, it is described in Patent Document 5 that cells are cultured in a non-woven fabric made of gelatin.
  • PIPAAm poly N-isopropylacrylamide
  • the present invention has been made based on the above findings, and is capable of more uniformly introducing reagents, drugs, etc. into cells, a cell support and a method for producing the same, and culturing cells using the cell support. It is an object of the method and to provide a cell structure produced using the cell support.
  • the subject comprises a substrate containing a biocompatible substance or a substrate to which a biocompatible substance is applied to the surface, and gelatin particles held on the surface of the substrate on the side of contact with the cells. It is solved by a cell support.
  • a method for culturing cells having a step of preparing the cell support and a step of seeding the cells in the cell support.
  • the cell structure is provided.
  • FIG. 1A and 1B are schematic views showing the configuration of a cell support according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a fluorescence image observed in Experiment 1.
  • FIG. 3 is a fluorescence image observed in Experiment 2.
  • FIG. 4A is a fluorescent image observed from the cell support using the gelatin non-woven fabric 1 in Experiment 3
  • FIG. 4B is a fluorescent image observed from the cell support using the gelatin non-woven fabric 2 in Experiment 3.
  • Yes
  • FIG. 4C is a fluorescent image observed from a cell support using a gelatin-coated polypropylene non-woven fabric in Experiment 3
  • FIG. 4D is a gelatin-made product that was not gelatin-coated in Experiment 3. It is a fluorescent image observed from a cell support using a non-woven fabric.
  • a cell support according to an embodiment of the present invention includes a substrate containing a biocompatible substance or a substrate having a biocompatible substance attached to the surface thereof, and gelatin particles held on the substrate.
  • FIG. 1A and 1B are schematic views showing the configuration of a cell support according to the present embodiment.
  • the cell support 100 has a substrate 112 containing a biocompatible substance and gelatin particles 120 held by the biocompatible substance of the substrate 112.
  • the cell support 100 is a base material 114 such as glass or plastic, a biocompatible substance 116 attached to the surface of the base material, and gelatin particles 120 held by the biocompatible substance 116. And have.
  • These cell supports 100 can be used as a support for culturing, holding, and storing the seeded cells 130.
  • the base material may be a base material capable of culturing and retaining cells, may be a two-dimensional base material for growing cells into planar colonies, or may be a three-dimensional colony of cells. It may be a base material having a three-dimensional shape to be grown.
  • the above-mentioned two-dimensionally shaped substrate examples include a cell culture plate, a culture dish, a Petri dish, and the like.
  • the two-dimensional base material may have a shape such as a bottle shape, a tube shape, a bag shape, a microchannel shape, and a multi-well plate shape.
  • the three-dimensionally shaped substrate examples include aggregates of fibers such as non-woven fabrics, woven fabrics and meshes, and porous substrates such as membrane filters and mesh sheets.
  • the material of these base materials is not particularly limited, and may be any material such as metal, resin, glass and ceramic.
  • Examples of the above metals include titanium, nickel, platinum, gold, tungsten, iron and alloys thereof.
  • Examples of the above resins include polyurethanes, polyolefins including polyethylene and polypropylene, polycarbonates, polylactic acid, polyglycolic acids, poly- ⁇ -caprolactones, and polyvinyl alcohols and their copolymers, polyethylene glycols, polyimides, acrylic resins, etc.
  • Polyester polyvinylidene fluoride, polyvinyl alcohol, polyvinyl chloride, polyvinyl acetate, polyvinylpyrrolidone, synthetic resin including polystyrene and copolymers thereof, natural resin such as cellulose, styrene-butadiene copolymer, polyisoprene, isobutylene-isoprene Elastomers including copolymers (butyl rubber), halogenated butyl rubber, butadiene-styrene-acrylonitrile copolymers, silicon polymers, fluorosilicon polymers, etc., as well as polyhydroxybutyric acid, polyhydroxyvaleric acid, proteins, sugars and sugar proteins ( Bio-derived materials such as fibronectin) are included.
  • synthetic resin including polystyrene and copolymers thereof, natural resin such as cellulose, styrene-butadiene copolymer, polyisoprene, isobutylene-isopre
  • the base material may be a scaffold material imitating an extracellular matrix for growing cells into three-dimensional colonies to form spheroids.
  • the scaffolding material include gels of biocompatible substances described below, including gelatin, collagen, hyaluronic acid and the like.
  • the substrate contains a biocompatible substance on its surface.
  • the form of the base material is not particularly limited as long as the surface contains the biocompatible substance, and the base material having the above shape may be molded by the biocompatible substance, or the base material may be molded into a predetermined shape.
  • a biocompatible substance may be imparted to the surface of the substrate.
  • the efficiency of taking up gelatin particles into cells is not so high in the configuration in which gelatin particles are simply added to a substrate such as silicon, glass, or plastic.
  • the base material contains a biocompatible substance and the biocompatible substance holds the gelatin particles, the efficiency of taking up the gelatin particles into the cells is remarkably increased (FIGS. 4A to 4C).
  • FIG. 4D Comparison with FIG. 4D, comparison between cell supports 3-5 and cell supports 1-2 in Table 3).
  • the base material is a porous base material having a three-dimensional shape
  • the biocompatible substance may be a bioderived polymer or a biodegradable synthetic polymer.
  • bio-derived polymers examples include biodegradable polyesters such as polyhydroxybutyrate and polyhydroxyvaleric acid, glycosaminoglycans (such as hyaluronic acid), starch, cellulose or derivatives thereof (such as carboxymethyl cellulose), alginic acid, and the like.
  • biodegradable polyesters such as polyhydroxybutyrate and polyhydroxyvaleric acid, glycosaminoglycans (such as hyaluronic acid), starch, cellulose or derivatives thereof (such as carboxymethyl cellulose), alginic acid, and the like.
  • polysaccharides such as chitin and chitosan, as well as polys (amino acids) such as collagen, elastin, gelatin, and laminin, glycoproteins such as fibronectin, and complexes thereof.
  • collagen, gelatin, fibronectin, laminin, and polysaccharides are preferable.
  • biodegradable synthetic polymers examples include polylactic acid, polyglycolic acid, poly- ⁇ -caprolactone, and polyvinyl alcohol and their copolymers, polyethylene glycol, polyhydroxybutyrate, polyhydroxyvaleric acid, and raw. Degradable polyester and the like are included. Of these, polylactic acid, polyglycolic acid, poly- ⁇ -caprolactone, polyvinyl alcohol, and copolymers thereof are preferable.
  • the polymer material having a higher water content is easy to increase the introduction rate of gelatin particles into cells and is easy to control.
  • the biocompatible substance is preferably collagen, gelatin, fibronectin, polyvinyl alcohol and its copolymer, chitosan, and chitosan, and more preferably collagen, gelatin, fibronectin, and polyvinyl alcohol.
  • poly (amino acid) is preferable, and gelatin is more preferable because it has a high affinity with gelatin particles and it is easy to control the introduction rate of gelatin particles into cells.
  • the gelatin may be any known gelatin obtained by denaturing collagen derived from beef bone, cow skin, pig skin, pig tendon, fish scale, fish meat and the like.
  • the above gelatin may be crosslinked.
  • the cross-linking may be cross-linking with a cross-linking agent or self-cross-linking performed without using a cross-linking agent.
  • the cross-linking agent may be, for example, a compound having a plurality of functional groups that form a chemical bond with a hydroxyl group, a carboxyl group, an amino group, a thiol group, an imidazole group, or the like.
  • Examples of such cross-linking agents are glutaaldehyde, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) and 1-cyclohexyl-3- (2-morpholinoethyl) carbodiimide-meth-p.
  • -A compound having two or more epoxy groups including a water-soluble carbodiimide containing toluene sulfonate (CMC), an ethylene glycol diglycidyl ether, a polyethylene glycol diglycidyl ether, a polyglycerol polyglycidyl ether and a glycerol polyglycidyl ether, and a propylene oxide. included.
  • CMC water-soluble carbodiimide containing toluene sulfonate
  • an ethylene glycol diglycidyl ether a polyethylene glycol diglycidyl ether, a polyglycerol polyglycidyl ether and a glycerol polyglycidyl ether
  • a propylene oxide included.
  • glutaraldehyde and EDC are preferable, and glutaraldehyde is more preferable, from the viewpoint of further enhancing the reactivity.
  • Examples of the above self-crosslinking include cross-linking by applying heat or irradiating with an electron beam or ultraviolet rays.
  • the introduction rate of gelatin particles into the seeded and grown cells can be controlled by the type of biocompatible substance.
  • the biocompatible substance may be a substance farther from gelatin, or the degree of cross-linking of gelatin as a biocompatible substance may be the degree of cross-linking of gelatin in gelatin particles. It is preferable to move it further away from.
  • the difference in the degree of cross-linking of gelatin is the difference in the signal intensity of any energy band in the loss spectrum detected by transmission electron microscopy (TEM-EELS measurement) combined with electron energy loss spectroscopy, and Fourier.
  • TEM-EELS measurement transmission electron microscopy
  • CONH peak intensity ratio of COOH to CONH
  • FT-IR conversion type infrared spectrophotometer
  • the introduction rate of gelatin particles it is also possible to control the introduction rate of the reagent or drug carried by the gelatin particles into cells. Depending on the type of these reagents or agents, how much should be introduced into the cells also depends. Therefore, the introduction rate of gelatin particles into cells is controlled by the biocompatible substance, and the introduction rate of reagents or drugs into cells is also controlled, whereby the amount of reagents or drugs to be introduced into cells can be easily controlled. be able to.
  • the substrate holds gelatin particles.
  • the gelatin particles are in contact with the biocompatible substance of the base material and are immobilized on the base material.
  • the gelatin particles are immobilized and held at a position in contact with the biocompatible substance contained in the substrate.
  • the gelatin particles are applied and immobilized in the region of the substrate to which the biocompatible substance is applied.
  • the gelatin particles do not need to be applied to the inner surface of the base material, and at least the cells of the base material are seeded outside. It may be applied only to the outer surface on which the cells of the base material are seeded, as long as it is applied to the surface.
  • the gelatin particles may be nanoparticles made of any known gelatin similar to those described for biocompatible substances.
  • Gelatin has been used for food and medical purposes for a long time, and even if it is taken into the body, it does not cause any harm to the human body. Further, since gelatin is dispersed and disappears in the living body, it has an advantage that it does not need to be removed from the living body.
  • the weight average molecular weight of gelatin constituting the gelatin particles is preferably 1000 or more and 100,000 or less.
  • the weight average molecular weight can be, for example, a value measured according to the 10th edition of the Paggy method (2006).
  • the gelatin constituting the gelatin particles may be crosslinked.
  • the cross-linking may be cross-linking with the above-mentioned cross-linking agent or self-cross-linking performed without using a cross-linking agent.
  • the gelatin particles are cationized by introducing a primary amino group, a secondary amino group, a tertiary amino group or a quaternary ammonium group. It is preferable to have.
  • the cationization of gelatin particles can be carried out by a known method of introducing a functional group to be cationized under physiological conditions at the time of production.
  • a functional group to be cationized under physiological conditions for example, alkyldiamine containing ethylenediamine and N, N-dimethyl-1,3-diaminopropane, etc., trimethylammonium acetohydrazide, spermin, spermidin, sewage diethylamide chloride, etc. can be added to 1-ethyl-3- (3-dimethylamino).
  • the amino group can be introduced into a hydroxyl group or a carboxyl group of gelatin by reacting with a dianhydride compound such as a substance and a condensing agent containing trisilkloride or the like.
  • the average particle size of the gelatin particles is preferably 100 nm or more and 1000 nm or less.
  • the gelatin particles carry a probe, they do not substantially have a probe on the surface layer thereof, so that even if the average particle size is 1000 nm or less, the activity of the cells themselves causes the cells to enter the cell. Easy to capture.
  • the average particle size of the gelatin particles is more preferably 800 nm or less.
  • the gelatin particles having an average particle diameter of 100 nm or more can easily support the probe in the particles and can increase the capacity of the probe.
  • the average particle size of the gelatin particles is in the range of 1000 nm or less, the easier it is to be taken up into the cells by the activity of the cells themselves. From the above viewpoint, the average particle size of the gelatin particles is preferably 200 nm or more, more preferably 300 nm or more.
  • the average particle size of the gelatin particles can be the apparent particle size of the gelatin particles measured by a dynamic light scattering method.
  • the average particle size of the gelatin particles can be a value obtained by adding and averaging the major axis and the minor axis.
  • the minor axis and the major axis of the gelatin particles are values obtained by analyzing an image of the gelatin particles at the time of drying after being allowed to stand in the air at 80 ° C. for 24 hours with a scanning electron microscope (SEM). be able to. Since the gelatin particles are usually an aggregate composed of a plurality of gelatin particles, the major axis, the minor axis, and the particle diameter of the gelatin particles are each optionally selected from the above aggregates (for example, 20 gelatins). The major axis, minor axis, and particle diameter of the particles) can be added and averaged. When there is a difference between the average particle diameters measured by these methods, the average particle diameters measured by the dynamic light scattering method may be adopted.
  • the gelatin particles carry a reagent or a drug.
  • the probe When the gelatin particles carry the probe, it means that the probe is immobilized on the surface of the gelatin particles or is incorporated inside the gelatin particles.
  • the amount of the probe inside the gelatin particle is larger than the amount of the probe in the surface layer portion.
  • the amount of the probe exposed on the surface of the gelatin particle can be reduced. This makes it difficult for the gelatin particles to be recognized as foreign substances by the cells, and can be easily taken up into the cells by activities such as endocytosis.
  • the surface layer portion means a region up to a depth of 1% with respect to the average particle size of the gelatin particles.
  • the reagent may be a probe used for testing the activity of a living body, measuring a substance in the living body, quantifying a substance in the living body, or a contrast agent for detecting the presence of cells.
  • the detection target of the probe is not particularly limited, and may be a protein, a sugar, a nucleic acid such as DNA and mRNA, or a physiological state such as a temperature or pH in a cell.
  • the probe may be, for example, a compound having a site that directly or indirectly binds to the substance to be detected and a site that emits a detectable signal.
  • the probe may be a probe capable of specifically binding to the mRNA by a nucleic acid having a sequence complementary to at least a part of the nucleic acid sequence of the mRNA to be detected, or may be a detection target by an antibody. It may be a probe that can specifically bind to a protein. Further, the probe may be a probe that contains a phosphor and emits fluorescence as a signal, or may be a probe that emits another signal by chemiluminescence or the like.
  • the type of the above-mentioned fluorescent substance is not particularly limited, and may be a fluorescent dye or semiconductor nanoparticles.
  • fluorescent dyes examples include rhodamine-based dye molecules, squarylium-based dye molecules, fluorescein-based dye molecules, coumarin-based dye molecules, aclysine-based dye molecules, pyrene-based dye molecules, erythrosin-based dye molecules, eosin-based dye molecules, and cyanine-based dyes. Includes dye molecules, aromatic ring-based dye molecules, oxazine-based dye molecules, carbopyronine-based dye molecules, and pyrromecein-based dye molecules.
  • Examples of semiconductors constituting the semiconductor nanoparticles include group II-VI compound semiconductors, group III-V compound semiconductors, and group IV semiconductors. Specific examples of the semiconductor constituting the semiconductor nanoparticles include CdSe, CdS, CdTe, ZnSe, ZnS, ZnTe, InP, InN, InAs, InGaP, GaP, GaAs, Si and Ge.
  • the probe capable of specifically binding to the mRNA may be a known probe such as a molecular beacon, Taqman probe, cycling probe and INAF probe, but a general-purpose fluorescent dye can be used, and various cells can be used.
  • Molecular beacons are preferred because they are easy to detect for species.
  • the molecular beacon is a nucleic acid derivative having a stem-loop structure, in which a fluorescent dye is bound to one end of the 5'end and the 3'end, and a quenching dye is bound to the other end.
  • a fluorescent dye is bound to one end of the 5'end and the 3'end
  • a quenching dye is bound to the other end.
  • the fluorescent dye and the quenching dye are in close proximity to each other, so that the fluorescence emitted from the fluorescent dye is extinguished, but when the molecular beacon is close to the target sequence, the loop structure is formed. Is opened and binds to the mRNA to be detected. As a result, the fluorescent dye and the quenching dye are separated from each other, and fluorescent light emission is detected.
  • the combination of the fluorescent dye and the quenching dye is not particularly limited, and may be appropriately selected from the fluorescent dyes described above.
  • the quenching dye may be a molecule that quenches by any of fluorescence resonance energy transfer (FRET), contact quenching, and collision quenching (collisional quenching).
  • the probe that can specifically bind to the protein to be detected by the above antibody is preferably phosphor integrated particles (PID).
  • PID is a nano-sized particle containing particles made of an organic substance or an inorganic substance as a base and containing a plurality of phosphors.
  • the PID specifically binds directly or indirectly to the protein to be detected by the above antibody to label the protein to be detected.
  • the plurality of phosphors may be present in the particles or may be present on the surface of the particles.
  • the fluorescent substance-accumulated particles can emit fluorescence of sufficient intensity to indicate the target substance as a bright spot one molecule at a time.
  • organic substances used as parent materials include thermosetting resins such as melamine resin, urea resin, aniline resin, guanamine resin, phenol resin, xylene resin, and furan resin, styrene resin, acrylic resin, acrylonitrile resin, and AS resin. (Acrylonitrile-styrene copolymer) and thermoplastic resins including ASA resin (acrylonitrile-styrene-methyl acrylate copolymer), other resins such as polylactic acid, and polysaccharides are included.
  • inorganic materials used as parent materials include silica and glass. It is preferable that the matrix and the fluorescent substance have substituents or sites having opposite charges and have electrostatic interactions.
  • the average particle size of the phosphor-accumulated particles is not particularly limited, but is preferably 10 nm or more and 500 nm or less, and more preferably 50 nm or more and 200 nm or less in consideration of ease of detection as a bright spot.
  • the particle size of the phosphor-accumulated particles can be measured by measuring the projected area of the phosphor-accumulated particles using a scanning electron microscope (SEM) and converting it into a circle-equivalent diameter.
  • SEM scanning electron microscope
  • the average particle size and coefficient of variation of a group of a plurality of phosphor-accumulated particles are calculated using the particle size (circle-equivalent diameter) calculated for a sufficient number (for example, 1000) of the phosphor-accumulated particles.
  • the above agent may be any as long as it can support gelatin particles.
  • examples of such agents include nucleic acids used in pharmaceutical applications, including proteins with medicinal activity, plasmids, aptamers, antisense nucleic acids, ribozymes, tRNAs, snRNAs, siRNAs, shRNAs, ncRNAs and condensed DNAs, as well as pharmaceutical uses. Contains the antigens used in.
  • Examples of the above pharmaceutical active proteins include steroids, non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs), vitamin A (retinoids), vitamin D3 and vitamin D3 analogs, antibiotics, antiviral agents, and antibacterial agents. Is included.
  • NSAIDs non-steroidal anti-inflammatory drugs
  • vitamin A retinoids
  • vitamin D3 and vitamin D3 analogs antibiotics, antiviral agents, and antibacterial agents. Is included.
  • the above-mentioned drug may be a water-soluble drug or a water-insoluble drug.
  • water-insoluble drugs include immunosuppressive agents such as cyclosporines including cyclosporine, immunoactive agents such as rapamycin, anticancer agents such as paclitaxel, antiviral or antibacterial agents, antineoplastic agents, analgesics and antispasmodic agents.
  • immunosuppressive agents such as cyclosporines including cyclosporine
  • immunoactive agents such as rapamycin
  • anticancer agents such as paclitaxel
  • antiviral or antibacterial agents such as paclitaxel
  • antineoplastic agents analgesics and antispasmodic agents.
  • rapamycin, paclitaxel, docetaxel and everolimus are preferable.
  • rapamycin, paclitaxel, docetaxel, and everolimus each contain analogs and derivatives thereof as long as they have similar efficacy.
  • paclitaxel and docetaxel have an analog relationship
  • rapamycin and everolimus have a derivative relationship.
  • paclitaxel is more preferred.
  • the reagent or drug may be pre-coated on the substrate in addition to being supported on gelatin particles.
  • the substrate is coated and incorporated into cells, the ease of incorporation into cells tends to vary, so the amount supported by gelatin particles (based on mass) should be larger than the amount coated on the substrate. Is preferable, and it is more preferable that the substrate is not coated.
  • the total charge on the surface of the cell support having the biocompatible substance and the gelatin particles supported on the biocompatible substance is positively charged. If so, the uptake of gelatin particles is promoted. This is because the surface of cells is negatively charged, so if the total charge on the surface to which the cells come into contact is positive, the cells can easily approach the substrate or gelatin particles, and the cells take up the gelatin particles. It is thought that this is because it is easy.
  • the culture efficiency and the observation efficiency are enhanced. It is considered that when the sum of the charges attached to the surface on which the cells come into contact is a positive charge, the adhesive force of the cells to the substrate is enhanced.
  • a Coulomb interaction occurs between the biocompatible substance and the gelatin particles in a culture environment (wet environment).
  • a culture environment wet environment
  • the zeta potential of the surface to which the cells come into contact and adhere to in a solution having a pH of 7.4 is preferably larger than 0 mV and 30 mV or less.
  • the zeta potential is larger than 0 mV, gelatin particles are easily taken up, and the culture efficiency and observation efficiency are enhanced.
  • the zeta potential is 30 mV or less, negative effects such as a decrease in flexibility of the substrate and gelatin particles can be suppressed.
  • the zeta potential is more preferably 2 mV or more and 30 mV or less, and further preferably 4 mV or more and 15 mV or less.
  • the above zeta potential may be a value measured using a known zeta potential measuring instrument (for example, a measuring instrument using the formula described in Hiroyuki Mori, Yoshio Okamoto: Froth flotation, 27,117 1-124 (1980)). can.
  • a known zeta potential measuring instrument for example, a measuring instrument using the formula described in Hiroyuki Mori, Yoshio Okamoto: Froth flotation, 27,117 1-124 (1980).
  • the gelatin particles are cationized in this embodiment.
  • Cationation of gelatin particles can be carried out by a method of reducing the amount of carboxyl groups in the molecule by crosslinking, surface modification with PEG-NH 2 , or the like.
  • the biocompatible substance is cationized.
  • the cationization of the biocompatible substance can also be carried out by a method of reducing the amount of acidic functional groups such as a carboxyl group, similar to the cationization of gelatin particles.
  • the cationization of the gelatin particles and the cationization of the biocompatible substance may be carried out by either one or both.
  • the cationization is performed so that the zeta potential on the surface to which the cells come into contact is 30 mV or less. Is preferable.
  • the method for culturing cells according to another embodiment of the present invention is a method for culturing cells using the above-mentioned cell support.
  • the cell culture according to the present embodiment can be carried out in the same manner as a known cell culture method except that the cell support described above is used as the cell support.
  • the method for culturing cells according to the present embodiment may include a step of preparing the above-mentioned cell support and a step of seeding cells in the above-mentioned cell support.
  • the already prepared cell support may be prepared, or the cell support may be prepared.
  • the production of the cell support can be performed by including a step of preparing a base material containing a biocompatible substance and a step of holding gelatin particles on the base material.
  • the step of preparing a base material containing a biocompatible substance is a step of preparing a base material having the above-mentioned shape and material.
  • the base material is a molded product molded from a biocompatible substance
  • the molded product may be prepared.
  • a biocompatible substance may be applied to a known substrate for coating or the like.
  • the biocompatible substance can be added, for example, by applying a solution containing the biocompatible substance to the surface of the substrate and then drying the solution.
  • the base material is a porous base material having a three-dimensional shape, it is not necessary to apply the biocompatible substance to the inner surface of the base material, and at least the outer surface on which the cells of the base material are seeded. It may be performed only on the outer surface on which the cells of the substrate are seeded.
  • a solution containing the gelatin particles may be applied to the substrate containing the biocompatible substance.
  • the adhesiveness of the solized gelatin particles causes the gelatin particles to be used as a base material. It can be immobilized and the gelatin particles can be retained on the substrate. After that, the above solution may be dried.
  • the gelatin particles are immobilized and held at a position in contact with the biocompatible substance contained in the substrate.
  • the gelatin particles are applied to and immobilized in the region of the substrate to which the biocompatible substance is applied.
  • the base material is a porous base material having a three-dimensional shape or the like
  • the gelatin particles do not need to be applied to the inner surface of the base material to be immobilized, and at least the cells of the base material are seeded outside. It may be applied and immobilized on the surface, or may be applied and immobilized only on the outer surface on which the cells of the substrate are seeded.
  • gelatin particles carry reagents or drugs.
  • the support of the reagent or drug by the gelatin particles may be carried out by a known method such as mixing the gelatin particles with these reagents or drugs, or adding these reagents or drugs to the solution for preparing the gelatin particles. ..
  • the base material is a porous base material having a three-dimensional shape
  • the total charge on the surface to which the cells of the cell support come into contact and adhere to becomes a positive charge, or the Coulomb mutual between the biocompatible substance and the gelatin particles in a culture environment (wet environment).
  • Types of biocompatible substances or types of gelatin particles so that the zeta potential in a solution in which the pH of the surface to which cells come into contact and adhere is 7.4 is greater than 0 mV and less than 30 mV. May be selected.
  • cationized biocompatible substances or cationized gelatin particles may be used to make cell supports.
  • the above cells may be seeded by a usual method.
  • the seeded cells may be any cells that are desired to be cultured and stored as needed. Examples of the above cells include bone marrow, heart, lung, liver, kidney, pancreas, spleen, intestinal tract, small intestine, heart valve, skin, blood vessels, corneal, eyeball, hard membrane, bone, trachea and ear follicles. Cells derived from excised biological samples or specimens, commercially available strained cells, as well as skin stem cells, epidermal keratinized stem cells, retinal stem cells, retinal epithelial stem cells, cartilage stem cells, hair follicle stem cells, muscle stem cells, bone precursor cells, adipose precursors.
  • Cells hematopoietic stem cells, neural stem cells, hepatic stem cells, pancreatic stem cells, ectodermal stem cells, mesenchymal stem cells, endometrial stem cells, mesenchymal stem cells, stem cells including ES cells and iPS cells, and cells differentiated from these stem cells.
  • the seeded cells may be cells of organisms other than animals, such as plants, fungi, protists, and bacteria.
  • a known medium may be applied to the cell retainer to promote cell growth.
  • the seeded cells proliferate using the cell retainer as a scaffold while taking in the gelatin particles held by the cell retainer by endocytosis, and form colonies. Then, the reagent or drug carried by the gelatin particles is gradually released from the gelatin particles taken up in the cells. In this way, colonies are formed by cells containing reagents or drugs.
  • the cells When the substrate is a porous substrate having a three-dimensional shape or the like, the cells may be seeded in the region of the surface of the cell retainer that retains the gelatin particles.
  • the seeded cells take up gelatin particles held by the cell retainer by endocytosis. After that, when the cells that have taken up the gelatin particles proliferate while dividing and enter the inside of the substrate, the reagents or drugs carried by the gelatin particles are also taken over by each of the divided cells. As a result, it is considered that colonies are formed by cells containing reagents or drugs.
  • the cell structure according to another embodiment of the present invention is a cell structure including the cell support described above.
  • the cell structure has a substrate containing the biocompatible substance described above and a plurality of cells designated by the cell support. Then, the gelatin particles held by the substrate and the reagents or agents carried by the gelatin particles are taken up inside the cells.
  • the gelatin particles or the reagents or drugs are uniformly incorporated into more cells. for example,
  • the above cell culture can be used for transplantation into a living body, storage of cells, and the like. At this time, since the reagent or drug carried by the gelatin particles is uniformly taken up by more cells, the state such as cell differentiation and the life or death of cells can be detected with higher sensitivity. be able to.
  • GAPDH-MB A probe in which the 5'end of a base sequence containing a sequence complementary to the mRNA of glutaraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) is modified with AlexaFlour488 and the 3'end is modified with IBRQ (lowa black RQ).
  • GAPDH-MB is a molecular beacon in which the 5'end site and the 3'end site are complementary sequences constituting the stem region, and the site between them constitutes a loop structure.
  • the fluorescence intensity from the above molecular beacon emits fluorescence only when it reacts with the mRNA of glutaraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), which is an mRNA constantly expressed in cells, and the fluorescence intensity is high. It was confirmed in advance that the strength was increased according to the amount of each mRNA.
  • GPDH glutaraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
  • This solution was stirred at 37 ° C. for 4 hours to introduce ethylenediamine into the carboxyl group of gelatin. Then, the reaction product was dialyzed against reddistilled water for 3 days to obtain slurry-like cationized gelatin. Then, acetone as a phase separation inducer was added and mixed at 50 ° C. to recover the particles precipitated in the slurry and washed with pure water to obtain cationized gelatin particles. These cationized gelatin particles are referred to as cGNS.
  • the apparent average particle size of cGNS was determined by a dynamic light scattering method at 37 ° C. using DLS-7000 manufactured by Otsuka Electronics Co., Ltd. and found to be 168.0 nm. Moreover, when the zeta potential of cGNS was determined by the electrophoretic light scattering method using DLS-8000 manufactured by Otsuka Electronics Co., Ltd., it was 8.41 mV.
  • cGNS and GAPDH-MB Supporting Molecular Beacon by Gelatin Particles cGNS and GAPDH-MB were mixed at room temperature for 15 minutes, then centrifuged and washed with water to obtain gelatin particles carrying the above probe. These gelatin particles are referred to as cGNS (GAPDH-MB).
  • CGNS (GAPDH-MB) was added to this substrate, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour to immobilize cGNS (GAPDH-MB) to prepare a cell support.
  • MC3T3-E1 cells which are mouse mesenchymal stem cell lines, were seeded in the cell support and the cells were cultured for 1 day.
  • FIG. 2 is a fluorescence image observed one day after sowing. As is clear from FIG. 2, red fluorescence was uniformly observed from the entire plate. It is considered that this is because GAPDH-MB was uniformly taken up by the whole cells grown on the cell support and reacted with GAPDH mRNA in the cells to emit red fluorescence.
  • DAPI 6-diamidino-2-phenylindole
  • FIG. 3 is a fluorescence image observed at this time. As is clear from FIG. 3, red fluorescence was uniformly observed from the entire plate. It is considered that this is because GAPDH-MB was uniformly taken up by the whole cells grown into cell aggregates and reacted with GAPDH mRNA in the cells to emit red fluorescence.
  • MC3T3-E1 cells which are mouse mesenchymal stem cell lines, were seeded on the cell support and the cells were cultured for 1 day.
  • MC3T3-E1 cells were seeded on a 6-well plate, and the cells were cultured for 1 day in the presence of OptiMEM culture medium supplemented with cGNS (GAPDH-MB).
  • Table 1 shows the average fluorescence intensity and standard deviation per cell number.
  • Cell culture MC3T3-E1 cells which are mouse mesenchymal stem cell lines, were seeded in each of the cell supports 1 to 3 and the cells were cultured for 1 day.
  • Table 2 shows the average fluorescence intensity per number of cells.
  • CGNS (GAPDH-MB) was added to these substrates, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour to immobilize cGNS (GAPDH-MB) to prepare a cell support.
  • MC3T3-E1 cells which are mouse mesenchymal stem cell lines, were seeded into the above cell supports, and the cells were cultured for 1 day.
  • FIG. 4A is a fluorescence image observed from a cell support using gelatin non-woven fabric 1.
  • FIG. 4B is a fluorescence image observed from a cell support using the gelatin non-woven fabric 2.
  • FIG. 4C is a fluorescence image observed from a cell support using a polypropylene coated non-woven fabric coated with gelatin.
  • FIG. 4D is a fluorescence image observed from a cell support using a polypropylene non-woven fabric uncoated with gelatin.
  • red fluorescence was uniformly observed from the entire plate. It is considered that this is because GAPDH-MB was uniformly taken up by the whole cells grown into cell aggregates and reacted with GAPDH mRNA in the cells to emit red fluorescence. In addition, the fluorescence intensity differed depending on the type of substrate. From this result, it was found that the introduction rate of GAPDH-MB differs depending on the state of the base material, and it was found that the introduction rate of GAPDH-MB can be changed by changing the state of the base material.
  • a well plate made of polypropylene (PP), a non-woven fabric made of polypropylene (PP) (polypropylene long fiber non-woven fabric manufactured by Toray Industries, Inc.), a well plate coated with polyvinyl alcohol (PVA), A well plate coated with polypropylene and a polypropylene non-woven fabric (Genocel manufactured by Nippon Kaori Co., Ltd.) were prepared.
  • cGNS GPDH-MB
  • Cell culture MC3T3-E1 cells which are mouse mesenchymal stem cell lines, were seeded in each of the cell supports 1 to 5, and the cells were cultured for 1 day.
  • Table 3 shows the average fluorescence intensity per number of cells.
  • non-heat-crosslinked gelatin non-woven fabric (Genocel manufactured by Nippon Kaori Co., Ltd.), heat-crosslinked gelatin non-woven fabric 2 (Genocel manufactured by Nippon Kaori Co., Ltd., heat treatment time 4 hours), A heat-crosslinked gelatin nonwoven fabric 3 (manufactured by Nippon Kaori Co., Ltd., Genocel, heat treatment time 24 hours) was prepared.
  • gelatin nonwoven fabric 4 obtained by cationizing non-thermally crosslinked gelatin nonwoven fabric (Genocel, manufactured by Nippon Maori Co., Ltd.) by introducing an amino group, and gelatin amino of non-thermally crosslinked gelatin nonwoven fabric (Genocel, manufactured by Nippon Maori Co., Ltd.).
  • a gelatin nonwoven fabric 5 anionized by introducing anhydrous succinic acid was prepared.
  • Each of cGNS (GAPDH-MB) was added to these substrates, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour to immobilize cGNS1 (GAPDH-MB). And said.
  • the cell support 5 is the same as the cell support 5 in Experiment 6.
  • the zeta potential in the solution in which the pH of the cell support 5 to the cell support 7 was 7.4 was measured by a nanoparticle analyzer nanoPartica SZ-100V2 (product name) manufactured by HORIBA, Ltd.
  • Cell culture MC3T3-E1 cells which are mouse mesenchymal stem cell lines, were seeded in each of the cell supports 1 to 5, and the cells were cultured for 1 day.
  • Table 4 shows the zeta potential of each cell support and the average fluorescence intensity per cell number.
  • a drug paclitaxel
  • a solvent absolute ethanol
  • a base material gelatin non-woven fabric (Genocel, manufactured by Japan Wool Textile Co., Ltd.)
  • Cell culture SK-BR-3 cells which are human breast cancer cell lines, were seeded on each of the prepared cell support and the base material coated with the drug, and the cells were cultured for 24 to 48 hours.
  • Table 5 shows the average fluorescence intensity and standard deviation per number of cells.
  • the standard deviation was smaller when the cell support was used.
  • the drug is only coated on the substrate, it can be seen from the average fluorescence intensity per cell that the drug is sufficiently taken up by the cells, but on the other hand, the standard deviation is large and the uptake of the drug into the cells varies. Was found to have occurred. From this result, it was found that when a cell support containing a substrate containing a biocompatible substance and gelatin particles held on the substrate was used, the drug or reagent was more uniformly taken up by the cells. rice field.
  • the present invention it is possible to obtain a cell structure in which reagents and drugs are uniformly incorporated into more cells.
  • This cell structure can be suitably used for transplantation and storage of cells.
  • Cell support 112 Base material containing biocompatible substance 114 Base material such as glass or plastic 116 Biocompatible substance 120 Gelatin particle 130 Cell

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Abstract

本発明は、生体適合性物質を含む基材、または生体適合性物質が表面に付与された基材と、前記基材の前記生体適合性物質に保持されたゼラチン粒子を、を含む、細胞支持体に関する。前記細胞支持体は、生体適合性物質を含む基材にゼラチン粒子を保持させる方法で製造することができる。前記細胞支持体に細胞を播種して、前記細胞を培養することにより、試薬や薬剤がより多くの細胞に均一に取り込まれた細胞構造体を得ることができる。

Description

細胞支持体およびその製造方法、細胞の培養方法ならびに細胞構造体
　本発明は、細胞支持体およびその製造方法、細胞の培養方法ならびに細胞構造体に関する。
　培養している細胞に試薬や薬剤などを導入する技術が公知である。たとえば、特許文献１には、培養液にプローブ溶液を添加して、当該プローブを細胞に導入し、当該細胞の状態を検知できるようにしたことが記載されている。
　また、移植用の細胞を培養したり、あるいは細胞を保持させて保管したりするための支持体（以下、単に「細胞支持体」ともいう。）が知られている。たとえば、特許文献２には、生分解性糸状物によって縫製された生分解性不織布と、この生分解性不織布と重ね合わされた生分解性膜状物と、を有する生分解性基材が記載されている。特許文献２には、この生分解性基材は、細胞支持体として使用したときに、細胞が内部に入りやすく、かつ生体内で異物反応を起こさず、長期間埋入しておけると記載されている。
　また、ポリＮ－イソプロピルアクリルアミド（ＰＩＰＡＡｍ）製の培養皿（セルシード社製ＵｐＣｅｌｌ）をゼラチンなどでコーティングして細胞を培養することが特許文献３に記載されている。また、シリコン、ガラスおよびプラスチックなどの素材からなる基板上に生体結合性ポリマー層を設けた細胞培養基材を用いて接着性がん細胞を培養することが特許文献４に記載されている。また、ゼラチン製の不織布で細胞を培養したことが特許文献５に記載されている。
特開２０１６－０７７１５９号公報 特開２００４－１４８０１４号公報 国際公開第２０１４／１９２９０９号 国際公開第２０１８／１８２０４４号 国際公開第２０１８／２３５７４５号
　特許文献１にも記載のように、細胞中に試薬や薬剤などを導入しようとする際には、細胞への試薬や薬剤などの取り込みに偏りが生じるという問題があった。特に、三次元方向に細胞のコロニーを成長させようとすると、試薬や薬剤などの取り込みに偏りが生じやすく、これらを取り込んだ細胞と取り込まない細胞とが生じたり、これらを多く取り込んだ細胞と少ししか取り込まない細胞とが生じたりしていた。この細胞の取り込みへの偏りは、特許文献２～特許文献５に記載のような、単に生体適合性物質を細胞と接触する表面に用いた基材を用いて細胞を培養したときにも生じていた。
　本発明は、上記知見に基づいてなされたものであり、細胞に、より均一に試薬や薬剤などを導入することができる、細胞支持体およびその製造方法、当該細胞支持体を用いた細胞の培養方法、ならびに当該細胞支持体を用いて製造された細胞構造体を提供することを、その目的とする。
　上記課題は、生体適合性物質を含む基材または生体適合性物質が表面に付与された基材と、前記基材の前記細胞が接触する側の表面に保持されたゼラチン粒子を、を含む、細胞支持体によって解決される。
　また、上記課題は、前記細胞支持体を用意する工程と、前記細胞支持体に細胞を播種する工程と、を有する細胞の培養方法により解決される。
　また、上記課題は、前記細胞支持体と、前記細胞支持体に保持された細胞と、を有する、細胞構造体により解決される。
　本発明により、細胞に、より均一に試薬や薬剤などを導入することができる、細胞支持体およびその製造方法、当該細胞支持体を用いた細胞の培養方法、ならびに当該細胞支持体を用いて製造された細胞構造体が提供される。
図１Ａおよび図１Ｂは、本発明の一実施形態に関する細胞支持体の構成を示す模式図である。 図２は、実験１において観察された蛍光画像である。 図３は、実験２において観察された蛍光画像である。 図４Ａは、実験３において、ゼラチン不織布１を用いた細胞支持体から観察された蛍光画像であり、図４Ｂは、実験３において、ゼラチン不織布２を用いた細胞支持体から観察された蛍光画像であり、図４Ｃは、実験３において、ゼラチンをコーティングしたポリプロピレン製の不織布を用いた細胞支持体から観察された蛍光画像であり、図４Ｄは、実験３において、ゼラチンをコーティングしなかったポリプロピレン製の不織布を用いた細胞支持体から観察された蛍光画像である。
　以下、本発明の実施形態について図面を参照して詳細に説明する。なお、本発明は、以下の形態に限定されるものではない。
　［細胞支持体］
　本発明の一実施形態に関する細胞支持体は、生体適合性物質を含む基材または生体適合性物質が表面に付与された基材と、上記基材に保持されたゼラチン粒子を、を含む。
　図１Ａおよび図１Ｂは、本実施形態に関する細胞支持体の構成を示す模式図である。図１Ａに示す例では、細胞支持体１００は、生体適合性物質を含む基材１１２と、基材１１２の生体適合性物質に保持されたゼラチン粒子１２０と、を有する。図１Ｂに示す例では、細胞支持体１００は、ガラスやプラスチックなどの基材１１４と、基材の表面に付与された生体適合性物質１１６と、生体適合性物質１１６に保持されたゼラチン粒子１２０と、を有する。これらの細胞支持体１００は、播種された細胞１３０を培養したり、あるいは保持して保管したりなどするための支持体として使用することができる。
　（基材）
　上記基材は、細胞を培養および保持することができる基材であればよく、細胞を平面状のコロニーに成長させる二次元形状の基材であってもよいし、細胞を三次元状のコロニーに成長させる三次元形状の基材であってもよい。
　上記二次元形状の基材の例には、細胞培養プレート、培養皿、およびペトリ皿などが含まれる。また、上記二次元形状の基材は、ボトル状、チューブ状、袋状、マイクロ流路状、およびマルチウェルプレート状などの形状であってもよい。
　上記三次元形状の基材の例には、不織布、織物および網物などの繊維の集合体、ならびにメンブレンフィルターおよびメッシュシートなどの多孔質基材などが含まれる。
　これらの基材の材料は特に限定されず、金属、樹脂、ガラスおよびセラミックなどのいずれの材料であってもよい。
　上記金属の例には、チタン、ニッケル、白金、金、タングステン、鉄およびこれらの合金などが含まれる。
　上記樹脂の例には、ポリウレタン、ポリエチレンおよびポリプロピレンなどを含むポリオレフィン、ポリカーボネート、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ－ε－カプロラクトン、およびポリビニルアルコールならびにこれらの共重合体、ポリエチレングリコール、ポリイミド、アクリル樹脂、ポリエステル、ポリフッ化ビニリデン、ポリビニルアルコール、ポリビニルクロライド、ポリビニルアセテート、ポリビニルピロリドン、ポリスチレンおよびこれらの共重合体などを含む合成樹脂、セルロースなどの天然樹脂、スチレン－ブタジエン共重合体、ポリイソプレン、イソブチレン－イソプレン共重合体（ブチルゴム）、ハロゲン化ブチルゴム、ブタジエン－スチレン－アクリロニトリル共重合体、シリコンポリマー、およびフルオロシリコンポリマーなどを含むエラストマー、ならびに、ポリヒドロキシ酪酸、ポリヒドロキシ吉草酸、タンパク質、糖および糖タンパク質（フィブロネクチンなど）などの生体由来材料などが含まれる。
　また、上記基材は、細胞を三次元状のコロニーに成長させてスフェロイドを形成させるための、細胞外マトリックスを模倣した足場材料であってもよい。上記足場材料の例には、ゼラチン、コラーゲンおよびヒアルロン酸などを含む、後述する生体適合性物質のゲル状体などが含まれる
　（生体適合性物質）
　上記基材は、その表面に生体適合性物質を含む。
　上記基材は、表面に生体適合性物質を含む限りにおいてその形態は特に限定されず、生体適合性物質により上記形状を有する基材が成形されていてもよいし、所定の形状に成形された基材の表面に生体適合性物質が付与されていてもよい。
　本発明者らの知見によると、シリコン、ガラスおよびプラスチックなどの基材に単にゼラチン粒子を付与したのみの構成では、細胞へのゼラチン粒子の取り込み効率はさほど高くはない。これに対し、基材が生体適合性物質を含み、生体適合性物質がゼラチン粒子を保持する構成とすることで、細胞へのゼラチン粒子の取り込み効率が顕著に高くなる（図４Ａ～図４Ｃと図４Ｄとの比較、表３の細胞支持体３～５と細胞支持体１～２との比較を参照）。
　なお、上記基材が三次元形状を有する多孔質基材などであるとき、生体適合性物質の付与は、基材の内部の表面までなされている必要はなく、少なくとも、基材の細胞が播種される外表面に対してなされていればよく、基材の細胞が播種される外表面のみに対してなされていてもよい。
　上記生体適合性物質は、生体由来の高分子であってもよいし、生分解性の合成高分子であってもよい。
　上記生体由来の高分子の例には、ポリヒドロキシ酪酸、ポリヒドロキシ吉草酸などの生分解性ポリエステル、グリコサミノグリカン（ヒアルロン酸など）、デンプン、セルロースまたはその誘導体（カルボキシメチルセルロースなど）、アルギン酸、キチン、およびキトサンなどの多糖類、ならびにコラーゲン、エラスチン、ゼラチン、およびラミニンなどのポリ（アミノ酸）、フィブロネクチンなどの糖タンパク質、ならびにこれらの複合体などが含まれる。これらのうち、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ラミニン、多糖類が好ましい。
　上記生分解性の合成高分子の例には、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ－ε－カプロラクトン、およびポリビニルアルコールならびにこれらの共重合体、ポリエチレングリコール、ポリヒドロキシ酪酸、ポリヒドロキシ吉草酸、ならびに生分解性ポリエステルなどが含まれる。これらのうち、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ－ε－カプロラクトン、およびポリビニルアルコールならびにこれらの共重合体が好ましい。
　本発明者らの知見によれば、これらの生体適合性物質のうち、含水率がより高い高分子材料は、ゼラチン粒子の細胞への導入率を高めやすく、かつ制御しやすい。上記観点から、上記生体適合性物質は、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ポリビニルアルコールおよびその共重合体、キチン、ならびにキトサンが好ましく、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ポリビニルアルコールがより好ましい。
　また、これらの生体適合性物質のうち、ゼラチン粒子との親和性が高く、ゼラチン粒子の細胞への導入率を制御しやすいことから、ポリ（アミノ酸）が好ましく、ゼラチンがより好ましい。
　上記ゼラチンは、牛骨、牛皮、豚皮、豚腱、魚鱗および魚肉などに由来するコラーゲンを変性して得られる、公知のいかなるゼラチンであってもよい。
　また、上記ゼラチンは、架橋していてもよい。架橋は、架橋剤による架橋でもよいし、架橋剤を用いずになされる自己架橋でもよい。
　上記架橋剤は、たとえば、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、チオール基およびイミダゾール基などと化学結合を作る官能基を複数有する化合物であればよい。このような架橋剤の例には、グルタルアルデヒド、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）および１－シクロヘキシル－３－（２－モルホリノエチル）カルボジイミド－メト－ｐ－トルエンスルホナート（ＣＭＣ）を含む水溶性カルボジイミド、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリグリセロールポリグリシジルエーテルおよびグリセロールポリグリシジルエーテルを含む２以上のエポキシ基を有する化合物、ならびにプロピレンオキサイドが含まれる。これらのうち、反応性をより高める観点からは、グルタルアルデヒドおよびＥＤＣが好ましく、グルタルアルデヒドがより好ましい。
　上記自己架橋の例には、熱の付与または電子線もしくは紫外線の照射による架橋が含まれる。
　本実施形態では、生体適合性物質の種類によって、播種され生育される細胞へのゼラチン粒子の導入率を制御することができる。たとえば、細胞へのゼラチン粒子の導入率を高めたいときは、生体適合性物質をゼラチンにより近い物質にしたり、あるいは生体適合性物質としてのゼラチンの架橋度をゼラチン粒子におけるゼラチンの架橋度により近づけたりすることが好ましい。あるいは、細胞へのゼラチン粒子の導入率をある程度に抑えたいときは、生体適合性物質をゼラチンからより遠い物質にしたり、あるいは生体適合性物質としてのゼラチンの架橋度をゼラチン粒子におけるゼラチンの架橋度からより遠ざけたりすることが好ましい。このように、達成すべき前記ゼラチン粒子の導入率に応じて、生体適合性物質の種類を選択することが望ましい。
　なお、上記ゼラチンの架橋度の差は、電子エネルギー損失分光法を組み合わせた透過型電子顕微鏡観察（ＴＥＭ－ＥＥＬＳ測定）により検出される損失スペクトルにおけるいずれかのエネルギーバンドのシグナル強度の差や、フーリエ変換型の赤外分光光度計（ＦＴ－ＩＲ）で測定して得られる、横軸に波数、縦軸に吸光度をプロットしたスペクトルにおける、ＣＯＯＨとＣＯＮＨとのピーク強度比（ＣＯＯＨのピーク強度／ＣＯＮＨのピーク強度）などから推測することができる。
　ゼラチン粒子の導入率を制御することにより、ゼラチン粒子が担持する試薬または薬剤の細胞への導入率を制御することもできる。これらの試薬または薬剤の種類によって、細胞にどの程度の量を導入すべきかも異なる。そのため上記生体適合性物質によってゼラチン粒子の細胞への導入率を制御し、これにより試薬または薬剤の細胞への導入率も制御することで、細胞に導入する試薬または薬剤の量を容易に制御することができる。
　（ゼラチン粒子）
　上記基材は、ゼラチン粒子を保持する。
　上記ゼラチン粒子は、上記基材の生体適合性物質と接触し、かつ上記基材に固定化されている。
　このとき、ゼラチン粒子は、基材が含む生体適合性物質に接する位置に、固定化させて保持されている。たとえば、基材の表面に生体適合性物質が付与されているとき、ゼラチン粒子は、基材の上記生体適合性物質が付与された領域に付与されて固定化されている。
　また、上記基材が三次元形状を有する多孔質基材などであるとき、ゼラチン粒子は、基材の内部の表面まで付与されている必要はなく、少なくとも、基材の細胞が播種される外表面に対して付与されていればよく、基材の細胞が播種される外表面のみに対して付与されていてもよい。
　上記ゼラチン粒子は、生体適合性物質について説明したものと同様の、公知のいかなるゼラチンからなるナノ粒子であってもよい。ゼラチンは、以前から食用や医療用に使用されており、体内に摂取しても人体に害を与えることが少ない。また、ゼラチンは生体内で分散消失するため、生体内から除去する必要がないという利点を有する。
　上記ゼラチン粒子を構成するゼラチンの重量平均分子量は、１０００以上１０００００以下であることが好ましい。上記重量平均分子量は、たとえばパギイ法第１０版（２００６年）に準じて測定された値とすることができる。
　上記ゼラチン粒子を構成するゼラチンは、架橋していてもよい。架橋は、上述した架橋剤による架橋でもよいし、架橋剤を用いずになされる自己架橋でもよい。
　細胞への取り込まれやすさを制御しやすくする観点からは、上記ゼラチン粒子は、１級アミノ基、２級アミノ基、３級アミノ基または４級アンモニウム基を導入するなどしてカチオン化されていることが好ましい。
　ゼラチン粒子のカチオン化は、製造時に生理条件下でカチオン化する官能基を導入する公知の方法により行うことができる。たとえば、エチレンジアミンおよびＮ，Ｎ－ジメチル－１，３－ジアミノプロパンなどを含むアルキルジアミン、トリメチルアンモニウムアセトヒドラジド、スペルミン、スペルミジン、ならびみジエチルアミド塩化物などを、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、塩化シアヌル、Ｎ，Ｎ’－カルボジイミダゾール、臭化シアン、ジエポキシ化合物、トシルクロライド、ジエチルトリアミン－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’－ペンタン酸ジ無水物等のジ無水物化合物、およびトリシルクロリドなどを含む縮合剤を用いて反応させて、ゼラチンの水酸基またはカルボキシル基に上記アミノ基を導入することができる。
　上記ゼラチン粒子の平均粒子径は、１００ｎｍ以上１０００ｎｍ以下であることが好ましい。上記ゼラチン粒子はプローブを担持しているにもかかわらず、その表層部に実質的にプローブを有していないため、平均粒子径が１０００ｎｍ以下であっても、細胞自らの活動による細胞内への取り込みがなされやすい。多くのゼラチン粒子をより短時間で細胞内に取り込ませるためには、上記ゼラチン粒子の平均粒子径は、８００ｎｍ以下であることがより好ましい。一方で、上記平均粒子径が１００ｎｍ以上であるゼラチン粒子は、粒子内にプローブを担持させやすく、プローブの収容量を大きくすることができる。また、ゼラチン粒子の平均粒子径は、１０００ｎｍ以下の範囲内においてより大きいほうが細胞自らの活動により細胞内に取り込まれやすい。上記観点からは、ゼラチン粒子の平均粒子径は、２００ｎｍ以上であることが好ましく、３００ｎｍ以上であることがより好ましい。
　なお、上記ゼラチン粒子の平均粒子径は、動的光散乱法により測定した、ゼラチン粒子のみかけの粒子径とすることができる。あるいは、上記ゼラチン粒子の平均粒子径は、長径と短径とを加算平均した値とすることができる。上記ゼラチン粒子の短径および長径は、８０℃の大気中に２４時間静置した後の、乾燥時のゼラチン粒子を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で撮像した画像を解析して得られる値とすることができる。ゼラチン粒子は通常、複数のゼラチン粒子からなる集合体であるため、ゼラチン粒子の長径、短径、および粒子径はそれぞれ、上記集合体から任意に選択した複数のゼラチン粒子（たとえば、２０個のゼラチン粒子）の長径、短径、および粒子径を加算平均した値とすることができる。これらの方法により測定された平均粒子径の間に相違があるときは、動的光散乱法により測定して得られた平均粒子径を採用すればよい。
　上記ゼラチン粒子は、試薬または薬剤を担持する。
　ゼラチン粒子がプローブを担持するとは、プローブがゼラチン粒子の表面に固定化されているかまたはゼラチン粒子の内部に取り込まれていることを意味する。
　なお、ゼラチン粒子は、表層部におけるプローブの量よりも内部におけるプローブの量が多いことが好ましい。ゼラチン粒子の表層部における、プローブの量を少なくすることで、ゼラチン粒子の表面に露出するプローブの量を減らすことができる。これにより、ゼラチン粒子を細胞によって異物と認識されにくくして、エンドサイトーシス等の活動により細胞内に取り込まれやすくすることができる。上記表層部とは、ゼラチン粒子の平均粒子径に対して１％の深さまでの領域を意味する。
　上記試薬は、生体の活性などの検査、生体内の物質の測定および生体内の物質の定量などの用途に用いられるプローブや、細胞の存在を検知するための造影剤などであればよい。上記プローブの検出対象は特に限定されず、タンパク質、糖、ならびにＤＮＡおよびｍＲＮＡなどの核酸などであってもよいし、細胞中の温度やｐＨなどの生理的状態であってもよい。
　上記プローブは、たとえば、検出対象の物質に直接または間接的に結合する部位と、検出可能なシグナルを発する部位と、を有する化合物であればよい。たとえば、上記プローブは、検出対象であるｍＲＮＡの核酸配列の少なくとも一部に相補的な配列を有する核酸によって当該ｍＲＮＡに特異的に結合し得るプローブであってもよいし、抗体によって検出対象であるタンパク質に特異的に結合し得るプローブであってもよい。また、上記プローブは、蛍光体を含んでいてシグナルとして蛍光を発光するプローブであってもよいし、化学発光などにより他のシグナルを発するプローブであってもよい。
　上記蛍光体の種類は、特に限定されず、蛍光色素であってもよいし半導体ナノ粒子であってもよい。
　上記蛍光色素の例には、ローダミン系色素分子、スクアリリウム系色素分子、フルオレセイン系色素分子、クマリン系色素分子、アクリジン系色素分子、ピレン系色素分子、エリスロシン系色素分子、エオシン系色素分子、シアニン系色素分子、芳香環系色素分子、オキサジン系色素分子、カルボピロニン系色素分子、およびピロメセン系色素分子などが含まれる。
　上記半導体ナノ粒子を構成する半導体の例には、II－VI族化合物半導体、III－V族化合物半導体、およびIV族半導体が含まれる。上記半導体ナノ粒子を構成する半導体の具体例には、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、ＣｄＴｅ、ＺｎＳｅ、ＺｎＳ、ＺｎＴｅ、ＩｎＰ、ＩｎＮ、ＩｎＡｓ、ＩｎＧａＰ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、ＳｉおよびＧｅなどが含まれる。
　上記ｍＲＮＡに特異的に結合し得るプローブは、モレキュラービーコン、Ｔａｑｍａｎプローブ、サイクリングプローブおよびＩＮＡＦプローブなどの公知のプローブであってもよいが、汎用的な蛍光色素を使用することができ、様々な細胞種に対する検出が容易であることから、モレキュラービーコンが好ましい。
　モレキュラービーコンは、ステム－ループ構造を有する核酸誘導体であって、５’末端および３’末端の一方の末端に蛍光色素が結合し、他方の末端に消光色素が結合している。モレキュラービーコンは、上記ステム－ループ構造を形成している状態では、蛍光色素と消光色素とが近接しているため、蛍光色素から発光した蛍光が消光されているが、標的配列に近接するとループ構造が開かれて検出対象であるｍＲＮＡに結合する。これにより、蛍光色素と消光色素とが離間して、蛍光発光が検出される。
　上記蛍光色素と消光色素との組み合わせは特に限定されず、上述した蛍光色素から適宜選択すればよい。上記消光色素は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、接触クエンチング（contact quenching）、および衝突クエンチング（collisional quenching）のいずれによる消光を行う分子でもよい。
　上記抗体によって検出対象であるタンパク質に特異的に結合し得るプローブは、蛍光体集積粒子（Phosphor Integrated Dot：ＰＩＤ）であることが好ましい。ＰＩＤは、有機物または無機物でできた粒子を母体とし、複数の蛍光体を含む、ナノサイズの粒子である。ＰＩＤは、上記抗体によって検出対象であるタンパク質に特異的に直接または間接的に結合して、検出対象であるタンパク質を標識する。複数の蛍光体は、粒子内に存在していてもよいし、粒子の表面に存在していてもよい。蛍光体集積粒子は、標的物質を１分子ずつ輝点として示すのに十分な強度の蛍光を発することができる。
　母体の材料となる有機物の例には、メラミン樹脂、尿素樹脂、アニリン樹脂、グアナミン樹脂、フェノール樹脂、キシレン樹脂、およびフラン樹脂などの熱硬化性樹脂、スチレン樹脂、アクリル樹脂、アクリロニトリル樹脂、ＡＳ樹脂（アクリロニトリル－スチレン共重合体）、およびＡＳＡ樹脂（アクリロニトリル－スチレン－アクリル酸メチル共重合体）などを含む熱可塑性樹脂、ポリ乳酸などのその他の樹脂、ならびに多糖などが含まれる。母体の材料となる無機物の例には、シリカおよびガラスが含まれる。母体および蛍光物質は、互いに反対の電荷を有する置換基または部位を有しており、静電的相互作用が働くものであることが好ましい。
　蛍光体集積粒子の平均粒子径は、特に限定されないが、輝点としての検出のしやすさなどを考慮すると、１０ｎｍ以上５００ｎｍ以下であることが好ましく、５０ｎｍ以上２００ｎｍ以下であることがより好ましい。
　なお、蛍光体集積粒子の粒径は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて蛍光体集積粒子の投影面積を計測し、円相当径に換算することで測定できる。複数の蛍光体集積粒子からなる集団の平均粒子径および変動係数は、十分な数（例えば１０００個）の蛍光体集積粒子について算出された粒径（円相当径）を用いて算出される。
　上記薬剤は、ゼラチン粒子が担持できるものであればよい。このような薬剤の例には、医薬活性を有するタンパク質、プラスミド、アプタマー、アンチセンス核酸、リボザイム、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｎｃＲＮＡおよび凝縮型ＤＮＡを含む医薬用途に用いられる核酸、ならびに医薬用途に用いられる抗原が含まれる。
　上記医薬活性を有するタンパク質の例には、ステロイド、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、ビタミンＡ（レチノイド）、ビタミンＤ３およびビタミンＤ３類似体、抗生物質、抗ウィルス性薬剤、ならびに抗細菌性薬剤が含まれる。
　上記薬剤は、水溶性薬剤であってもよいし、水不溶性薬剤であってもよい。水不溶性薬剤の例には、シクロスポリンを含むシクロスポリン類などの免疫抑制剤、ラパマイシンなどの免疫活性剤、パクリタキセルなどの抗がん剤、抗ウイルス剤または抗菌剤、抗新生組織剤、鎮痛剤および抗炎症剤、抗生物質、抗てんかん剤、不安緩解剤、抗麻酔剤、拮抗剤、ニューロンブロック剤、抗コリン作用剤、抗不整脈剤、抗高血圧剤、ホルモン剤ならびに栄養剤が含まれる。
　これらの水不溶性薬剤としては、ラパマイシン、パクリタキセル、ドセタキセルおよびエベロリムスが好ましい。なお、ラパマイシン、パクリタキセル、ドセタキセル、およびエベロリムスは、それぞれ、同様の薬効を有する限り、それらの類似体および誘導体を含む。たとえば、パクリタキセルとドセタキセルとは類似体の関係にあり、ラパマイシンとエベロリムスとは誘導体の関係にある。これらのうち、パクリタキセルがより好ましい。
　上記試薬または薬剤は、ゼラチン粒子への担持に加えて、基材にあらかじめコーティングされていてもよい。ただし、基材にコーティングして細胞に取り込ませると、細胞への取り込まれやすさにばらつきが生じやすいので、基材へのコーティング量よりも、ゼラチン粒子による担持量（質量基準）を多くすることが好ましく、基材へのコーティングは行わないことがより好ましい。
　（表面電荷）
　本発明者らの知見によると、上記生体適合性物質と、生体適合性物質に担持されたゼラチン粒子と、を有する細胞支持体の、細胞が接触して付着する表面の荷電の総和が正電荷であると、ゼラチン粒子の取り込みが促進される。これは、細胞の表面は負電荷であるため、上記細胞が接触して付着する表面の荷電の総和が正電荷であると、基材やゼラチン粒子に細胞が近づきやすく、細胞がゼラチン粒子を取り込みやすいためだと考えられる。
　また、本発明者らの知見によると、上記細胞が接触する表面の荷電の総和が正電荷であると、培養効率や観察の効率が高まる。上記細胞が接触する表面して付着の荷電の総和が正電荷であると、基材への細胞の接着力が高まるためだと考えられる。
　また、上記生体適合性物質とゼラチン粒子との間には、培養環境下（湿潤環境下）においてクーロン相互作用が生じることが好ましい。これにより、単に生体適合性物質にゼラチン粒子を付与するのみでも、培養環境下での基材からのゼラチン粒子の離脱を抑制できるほか、生体適合性物質が正電荷を有するときには生体適合性物質に細胞をより近づきやすくして、細胞によるゼラチン粒子の取り込みやすさや、基材への細胞の接着強度をより高めることができる。
　より具体的には、上記細胞が接触して付着する表面の、ｐＨが７．４である溶液中におけるゼータ電位は、０ｍＶより大きく３０ｍＶ以下であることが好ましい。上記ゼータ電位が０ｍＶより大きいと、ゼラチン粒子の取り込みがされやすく、かつ培養効率や観察の効率が高まる。上記ゼータ電位が３０ｍＶ以下であると、基材およびゼラチン粒子の柔軟性の低下などの負の影響を抑制することができる。上記観点から、ゼータ電位は２ｍＶ以上３０ｍＶ以下であることがより好ましく、４ｍＶ以上１５ｍＶ以下であることがさらに好ましい。
　上記ゼータ電位は、公知のゼータ電位測定器（たとえば、森裕行、岡本嘉夫：浮選、27,117 1-124 (1980)に記載された式を用いる測定器）を用いて測定した値とすることができる。
　上記状態を達成するため、本実施形態では、ゼラチン粒子がカチオン化されていることが好ましい。ゼラチン粒子のカチオン化は、架橋やＰＥＧ－ＮＨ２による表面修飾などにより、分子内のカルボキシル基の量を減らす方法により、行うことができる。また、本実施形態では、生体適合性物質がカチオン化されていることが好ましい。生体適合性物質のカチオン化も、ゼラチン粒子のカチオン化と同様に、カルボキシル基などの酸性官能基の量を減らす方法により、行うことができる。ゼラチン粒子のカチオン化および生体適合性物質のカチオン化は、いずれか一方のみを行ってもよいし、双方を行ってもよい。これらのカチオン化の程度が大きいほど、ゼラチン粒子の取り込みがよりされやすくなり、かつ培養効率や観察の効率がより高まる。一方で、これらのカチオン化の程度が過剰になることによる、柔軟性の低下などを抑制するため、カチオン化は、上記細胞が接触して付着する表面のゼータ電位が３０ｍＶ以下となる程度に行うことが好ましい。
　［細胞の培養方法］
　本発明の他の実施形態に関する細胞の培養方法は、上述した細胞支持体を用いる、細胞の培養方法である。
　本実施形態に関する細胞の培養は、細胞支持体として上述した細胞支持体を使用するほかは、公知の細胞の培養方法と同様に行い得る。
　具体的には、本実施形態に関する細胞の培養方法は、上述した細胞支持体を用意する工程と、上記細胞支持体に細胞を播種する工程と、を含めばよい。
　細胞支持体の用意は、すでに作製されてある細胞支持体を用意してもよいし、あるいは細胞支持体を作製してもよい。
　上記細胞支持体の作製は、生体適合性物質を含む基材を用意する工程と、上記基材にゼラチン粒子を保持させる工程と、を含んで行うことができる。
　生体適合性物質を含む基材を用意する工程は、上述した形状および材料からなる基材を用意する工程である。上記基材が生体適合性物質から成形された成形体であるときは、当該成形体を用意すればよい。あるいは、公知の基材に、生体適合性物質を付与してコーティング等してもよい。生体適合性物質の付与は、たとえば、当該生体適合性物質を含む溶液を基材の表面に付与し、その後、上記溶液を乾燥する方法などにより、行うことができる。上記基材が三次元形状を有する多孔質基材などであるとき、生体適合性物質の付与は、基材の内部の表面まで行う必要はなく、少なくとも、基材の細胞が播種される外表面に対して行えばよく、基材の細胞が播種される外表面のみに対して行ってもよい。
　ゼラチン粒子を保持させる工程は、生体適合性物質を含む基材に、ゼラチン粒子を含む溶液を付与すればよい。このとき、ゼラチン粒子がゾル化する温度（３５℃～４５℃程度）に加温して１時間程度静置することで、ゾル化したゼラチン粒子が発現する粘着性により、ゼラチン粒子を基材に固定化させ、基材にゼラチン粒子を保持させることができる。その後、上記溶液を乾燥させてもよい。
　このとき、ゼラチン粒子は、基材が含む生体適合性物質に接する位置に、固定化させて保持させる。たとえば、基材の表面に生体適合性物質が付与されているとき、ゼラチン粒子は、基材の上記生体適合性物質が付与された領域に付与されて固定化される。上記基材が三次元形状を有する多孔質基材などであるとき、ゼラチン粒子は、基材の内部の表面まで付与して固定化させる必要はなく、少なくとも、基材の細胞が播種される外表面に対して付与して固定化させればよく、基材の細胞が播種される外表面のみに対して付与して固定化してもよい。
　また、ゼラチン粒子は、試薬または薬剤を担持する。ゼラチン粒子による試薬または薬剤の担持は、ゼラチン粒子とこれらの試薬または薬剤とを混合したり、ゼラチン粒子を調製する際の溶液にこれらの試薬または薬剤を添加したりする公知の方法で行えばよい。
　なお、このときも、上記基材が三次元形状を有する多孔質基材などであるとき、ゼラチン粒子の付与および固定化は、基材の内部の表面まで行う必要はなく、少なくとも、基材の細胞が播種される外表面にゼラチン粒子が固定化されて保持されればよい。
　また、このとき、細胞支持体の細胞が接触して付着する表面の荷電の総和が正電荷になったり、培養環境下（湿潤環境下）において生体適合性物質とゼラチン粒子との間にクーロン相互作用が生じたり、細胞が接触して付着する表面のｐＨが７．４である溶液中におけるゼータ電位が０ｍＶより大きく３０ｍＶ以下になったりするように、生体適合性物質の種類またはゼラチン粒子の種類を選択してもよい。たとえば、カチオン化された生体適合性物質またはカチオン化されたゼラチン粒子を用いて、細胞支持体を作製してもよい。
　上記細胞の播種は、通常の方法で行えばよい。
　播種される細胞は、培養および必要に応じて保管したい細胞であればよい。上記細胞の例には、骨髄、心臓、肺、肝臓、腎臓、膵臓、脾臓、腸管、小腸、心臓弁、皮膚、血管、角膜、眼球、硬膜、骨、気管および耳小骨を含む各種臓器から摘出された生体試料または検体に由来する細胞、市販の株化細胞、ならびに皮膚幹細胞、表皮角化幹細胞、網膜幹細胞、網膜上皮幹細胞、軟骨幹細胞、毛包幹細胞、筋幹細胞、骨前駆細胞、脂肪前駆細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、外胚葉系幹細胞、中胚葉系幹細胞、内胚葉系幹細胞、間葉系幹細胞、ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞を含む幹細胞ならびにこれらの幹細胞から分化した細胞を含む公知の細胞などが含まれる。また、播種される細胞は、植物、菌、原生生物、および細菌などの、動物以外の生物の細胞であってもよい。
　このとき、細胞保持体に公知の培地を付与して、細胞の生育を促進してもよい。
　播種された細胞は、細胞保持体が保持するゼラチン粒子をエンドサイトーシスにより取り込みながら、細胞保持体を足場として増殖し、コロニーを形成していく。そして、ゼラチン粒子が担持する試薬または薬剤は、細胞中に取り込まれたゼラチン粒子から徐放されていく。このようにして、試薬または薬剤を含む細胞によるコロニーが形成されていく。
　従来は、試薬や薬剤を含む溶液から細胞に上記試薬または薬剤を取り込ませようとしたり、あるいは試薬や薬剤を担持するゼラチン粒子を含む分散液を培地に付与して当該ゼラチン粒子を取り込ませて、細胞中に上記試薬または薬剤を導入しようとしたりしていた。本発明者らの知見によれば、上記細胞保持体が保持するゼラチン粒子を細胞に取り込ませると、これらの方法と比べて、より多くの細胞に均一に試薬または薬剤を導入することができる。
　なお、上記基材が三次元形状を有する多孔質基材などであるとき、細胞は、細胞保持体の表面のうちゼラチン粒子を保持する領域に播種されればよい。当該播種された細胞は、細胞保持体が保持するゼラチン粒子をエンドサイトーシスにより取り込む。その後、ゼラチン粒子を取り込んだ細胞が分裂しながら増殖して基材の内部へと進入していく際に、ゼラチン粒子が担持していた試薬または薬剤も、分裂した細胞のそれぞれに引き継がれていくことにより、試薬または薬剤を含む細胞によるコロニーが形成されていくと考えられる。
　［細胞構造体］
　本発明の他の実施形態に関する細胞構造体は、上述した細胞支持体を含む、細胞構造体である。
　上記細胞構造体は、上述した生体適合性物質を含む基材と、上記細胞支持体に指示された複数の細胞と、を有する。そして、基材が保持していたゼラチン粒子およびゼラチン粒子が担持していた試薬または薬剤は、細胞の内部に取り込まれている。
　上記細胞培養体は、上記ゼラチン粒子、または上記試薬もしくは薬剤が、より多くの細胞に均一に取り込まれている。たとえば、
　上記細胞培養体は、生体への移植や、細胞の保管などに用いることができる。このとき、ゼラチン粒子が担持していた試薬または薬剤がより多くの細胞に均一に取り込まれているため、細胞の分化などの状態の検知や、細胞の生死の検知などを、より高い感度で行うことができる。
　以下、本発明の具体的な実施例を比較例とともに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
　１．プローブ
　以下のプローブを用いた。
　ＧＡＰＤＨ－ＭＢ：グルタルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のｍＲＮＡと相補的な配列を含む塩基配列の５’末端をＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ４８８で、３’末端をＩＢＲＱ（ｌｏｗａ　ｂｌａｃｋ　ＲＱ）でそれぞれ修飾したプローブ。ＧＡＰＤＨ－ＭＢは、５’末端部位と３’末端部位がステム領域を構成する相補的な配列であり、これらの間の部位がループ構造を構成する配列である、モレキュラービーコンである。
　上記モレキュラービーコンからの蛍光強度が、細胞内で常に発現しているｍＲＮＡである、グルタルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のｍＲＮＡと反応したときのみに蛍光を発光すること、および蛍光強度がそれぞれのｍＲＮＡの量に応じて強まることを、事前に確認した。
　２．実験１
　２－１．ゼラチン粒子の調製
　ゼラチン（新田ゼラチン株式会社製、Ｇ－２６１３Ｐ）を２４ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝水溶液（ｐＨ５．０）に３７℃で溶解させた。この溶液に対して、適量のエチレンジアミンを添加した。さらに、塩酸水溶液を添加して、溶液のｐＨを５．０に調整した。さらに、適量の１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩を添加し、０．１Ｍリン酸緩衝水溶液の添加によってゼラチンの濃度を２質量％に調整した。この溶液を３７℃で４時間撹拌して、ゼラチンが有するカルボキシル基へエチレンジアミンを導入した。その後、反応物を再蒸留水で３日間透析して、スラリー状のカチオン化されたゼラチンを得た。その後、相分離誘起剤としてのアセトンを添加し、５０℃で混合して、スラリー中に析出した粒子を回収し、純水で洗浄して、カチオン化されたゼラチン粒子を得た。このカチオン化されたゼラチン粒子を、ｃＧＮＳとする。
　ｃＧＮＳのみかけの平均粒子径を、大塚電子株式会社製、ＤＬＳ－７０００を用いて３７℃において動的光散乱法により求めたところ、１６８．０ｎｍであった。また、ｃＧＮＳのゼータ電位を大塚電子株式会社製、ＤＬＳ－８０００を用いて電気泳動光散乱法により求めたところ、８．４１ｍＶであった。
　２－２．ゼラチン粒子によるモレキュラービーコンの担持
　ｃＧＮＳと、ＧＡＰＤＨ－ＭＢとを室温で１５分間混合し、その後、遠心分離して水で洗浄して、上記プローブを担持するゼラチン粒子を得た。このゼラチン粒子を、ｃＧＮＳ（ＧＡＰＤＨ－ＭＢ）とする。
　２－３．基材によるゼラチン粒子の保持
　二次元形状の基材として、細胞培養プレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製、９６ｗｅｌｌ Ｅｄｇｅ Ｐｌａｔｅ）を用意した。この細胞培養プレートに、ゼラチン（新田ゼラチン社製、ＴｙｐｅＢ、等電点５）をコーティングした。
　この基材に、ｃＧＮＳ（ＧＡＰＤＨ－ＭＢ）を添加し、３７℃で１時間静置して、ｃＧＮＳ（ＧＡＰＤＨ－ＭＢ）を固定化して、細胞支持体とした。
　２－４．細胞支持体での細胞の培養
　上記細胞支持体に、マウス間葉系幹細胞株であるＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞を播種して、１日間細胞を培養した。
　２－５．観察
　図２は、播種後、１日後に観察された蛍光画像である。図２から明らかなように、プレートの全体から、均一に赤色蛍光が観察された。これは、細胞支持体上で成長した細胞の全体に、ＧＡＰＤＨ－ＭＢが均一に取り込まれ、細胞中のＧＡＰＤＨのｍＲＮＡと反応して赤色蛍光を発したためと考えられる。
　３．実験２
　３－１．ゼラチン粒子の調製、ゼラチン粒子によるモレキュラービーコンの担持
　実験１と同様に、カチオン化されたゼラチン粒子ｃＧＮＳを調製した。ｃＧＮＳと、ＧＡＰＤＨ－ＭＢとを室温で１５分間混合し、その後、遠心分離して水で洗浄して、上記プローブを担持するゼラチン粒子ｃＧＮＳ（ＧＡＰＤＨ－ＭＢ）を得た。
　３－２．基材によるゼラチン粒子の保持
　ゼラチンハイドロゲル粒子をＰＢＳで分散し、膨潤させた熱架橋ゼラチンハイドロゲル粒子（スフェロイド形成の足場材料）を用意した。この熱架橋ゼラチンハイドロゲル粒子の粒子径は、３２～５３ｍｍだった。この熱架橋ゼラチンハイドロゲル粒子と、ゼラチン粒子ｃＧＮＳ（ＧＡＰＤＨ－ＭＢ）とを混合して、３７℃で１時間静置して、ｃＧＮＳ（ＧＡＰＤＨ－ＭＢ）を熱架橋ゼラチンハイドロゲル粒子に固定化して、細胞支持体とした。
　３－３．細胞支持体への細胞の播種
　上記細胞支持体と、マウス間葉系幹細胞株であるＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞とを、ポリビニルアルコールでコーティングされたＵ字底の９６ ｗｅｌｌプレートに導入して、３日間細胞を培養して、細胞凝集体を形成させた。
　３－４．観察
　播種後、３日後に細胞凝集体を４％パラホルムアルデヒドで固定し、細胞凝集体の中心面の凍結切片を作成した。この凍結切片に、4’,6-diamidino-2-phenylindole（ＤＡＰＩ）を添加して核を染色し、その後、蛍光顕微鏡で観察した。
　図３は、このとき観察された蛍光画像である。図３から明らかなように、プレートの全体から、均一に赤色蛍光が観察された。これは、細胞凝集体に成長した細胞の全体に、ＧＡＰＤＨ－ＭＢが均一に取り込まれ、細胞中のＧＡＰＤＨのｍＲＮＡと反応して赤色蛍光を発したためと考えられる。
　４．実験３
　４－１．ゼラチン粒子の調製
　実験１と同様に、カチオン化されたゼラチン粒子ｃＧＮＳを調製した。ｃＧＮＳと、ＧＡＰＤＨ－ＭＢとを室温で１５分間混合し、その後、遠心分離して水で洗浄して、上記プローブを担持するゼラチン粒子ｃＧＮＳ（ＧＡＰＤＨ－ＭＢ）を得た。
　４－２．基材によるゼラチン粒子の保持
　熱架橋されていないゼラチン不織布１（日本毛織株式会社製、Ｇｅｎｏｃｅｌ（「Ｇｅｎｏｃｅｌ」は同社の登録商標））を用意した。この基材に、ｃＧＮＳ（ＧＡＰＤＨ－ＭＢ）を添加し、３７℃で１時間静置して、ｃＧＮＳ（ＧＡＰＤＨ－ＭＢ）を固定化して、細胞支持体とした。
　４－３．細胞の培養
　上記細胞支持体に、マウス間葉系幹細胞株であるＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞を播種して、１日間細胞を培養した。比較例として、６ｗｅｌｌプレートにＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞を播種して、ｃＧＮＳ（ＧＡＰＤＨ－ＭＢ）を添加したＯｐｔｉＭＥＭ培養液の存在下で１日間細胞を培養した。
　４－４．観察
　播種後、１日後に培養された細胞を蛍光顕微鏡で観察し、無作為に撮像した６視野のイメージング蛍光強度を測定した。視野中に確認された細胞数で上記イメージング蛍光強度を除算して、細胞数あたりの平均蛍光強度を算出し、視野ごとの標準偏差も算出した。
　表１に、上記細胞数あたりの平均蛍光強度および標準偏差を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に示すように、細胞支持体を用いると、細胞あたりの平均蛍光強度がより高くなり、標準偏差がより小さくなっていた。この結果から、生体適合性物質を含む基材と、上記基材に保持されたゼラチン粒子を、を含む、細胞支持体を用いると、細胞によるモレキュラービーコン（薬剤または試薬）の取り込みが促進され、かつより均一に取り込まれることがわかった。
　５．実験４
　５－１．ゼラチン粒子の調製
　実験１と同様に、カチオン化されたゼラチン粒子ｃＧＮＳを調製した。このとき、調製条件を変更して、平均粒子径が異なる３種類のｃＧＮＳ（ｃＧＮＳ１～ｃＧＮＳ３）を調整した。ｃＧＮＳ１～ｃＧＮＳ３のそれぞれと、ＧＡＰＤＨ－ＭＢとを室温で１５分間混合し、その後、遠心分離して水で洗浄して、上記プローブを担持するゼラチン粒子ｃＧＮＳ１（ＧＡＰＤＨ－ＭＢ）～ｃＧＮＳ３（ＧＡＰＤＨ－ＭＢ）を得た。
　５－２．基材によるゼラチン粒子の保持
　熱架橋されていないゼラチン不織布（日本毛織株式会社製、Ｇｅｎｏｃｅｌ）を用意した。この基材に、ｃＧＮＳ１（ＧＡＰＤＨ－ＭＢ）～ｃＧＮＳ３（ＧＡＰＤＨ－ＭＢ）のそれぞれを添加し、３７℃で１時間静置して、ｃＧＮＳ１（ＧＡＰＤＨ－ＭＢ）～ｃＧＮＳ３（ＧＡＰＤＨ－ＭＢ）を固定化して、細胞支持体１～細胞支持体３とした。
　５－３．細胞の培養
　細胞支持体１～細胞支持体３のそれぞれに、マウス間葉系幹細胞株であるＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞を播種して、１日間細胞を培養した。
　５－４．観察
　播種後、１日後に培養された細胞を蛍光顕微鏡で観察し、無作為に撮像した６視野のイメージング蛍光強度を測定した。視野中に確認された細胞数で上記イメージング蛍光強度を除算して、細胞数あたりの平均蛍光強度を算出した。
　表２に、上記細胞数あたりの平均蛍光強度を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２に示すように、ゼラチン粒子の平均粒子径がより大きいほど、ゼラチン粒子およびゼラチン粒子に担持されるモレキュラービーコン（薬剤または試薬）が細胞自らの活動により細胞中に取り込まれやすいことがわかった。
　６．実験５
　６－１．ゼラチン粒子の調製
　実験１と同様に、カチオン化されたゼラチン粒子ｃＧＮＳを調製した。ｃＧＮＳと、ＧＡＰＤＨ－ＭＢとを室温で１５分間混合し、その後、遠心分離して水で洗浄して、上記プローブを担持するゼラチン粒子ｃＧＮＳ（ＧＡＰＤＨ－ＭＢ）を得た。
　６－２．基材によるゼラチン粒子の保持
　三次元形状の基材として、熱架橋されていないゼラチン不織布１（日本毛織株式会社製、Ｇｅｎｏｃｅｌ）、熱架橋されたゼラチン不織布２（日本毛織株式会社製、Ｇｅｎｏｃｅｌ、熱処理時間４～２４時間）、ポリプロピレン製の不織布（東レ株式会社製、ポリプロピレン長繊維不織布）を用意した。なお、ポリプロピレン製の不織布については、ゼラチンをコーティングした基材と、ゼラチンをコーティングしなかった基材と、を用意した。
　これらの基材に、ｃＧＮＳ（ＧＡＰＤＨ－ＭＢ）を添加し、３７℃で１時間静置して、ｃＧＮＳ（ＧＡＰＤＨ－ＭＢ）を固定化して、細胞支持体とした。
　６－３．細胞支持体への細胞の播種
　上記細胞支持体に、マウス間葉系幹細胞株であるＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞を播種して、１日間細胞を培養した。
　６－４．観察
　播種後、１日後に細胞支持体にＣＹＴＯ１３を含むＰＢＳを添加して核を染色し、３７℃で１時間静置した。その後、それぞれの細胞支持体をガラスボトムディッシュに映し、共焦点レーザー顕微鏡で観察した。
　図４Ａは、ゼラチン不織布１を用いた細胞支持体から観察された蛍光画像である。図４Ｂは、ゼラチン不織布２を用いた細胞支持体から観察された蛍光画像である。図４Ｃは、ゼラチンをコーティングしたポリプロピレン製の不織布を用いた細胞支持体から観察された蛍光画像である。図４Ｄは、ゼラチンをコーティングしなかったポリプロピレン製の不織布を用いた細胞支持体から観察された蛍光画像である。
　図４Ａ～図４Ｃから明らかなように、プレートの全体から、均一に赤色蛍光が観察された。これは、細胞凝集体に成長した細胞の全体に、ＧＡＰＤＨ－ＭＢが均一に取り込まれ、細胞中のＧＡＰＤＨのｍＲＮＡと反応して赤色蛍光を発したためと考えられる。また、基材の種類によって蛍光強度が異なっていた。この結果から、基材の状態によって、ＧＡＰＤＨ－ＭＢの導入率が異なることがわかり、基材の状態を変化させることで、ＧＡＰＤＨ－ＭＢの導入率を変化させることができることがわかった。
　一方で、図４Ｄから明らかなように、生体適合性物質を付与しなかった基材にｃＧＮＳ（ＧＡＰＤＨ－ＭＢ）を固定化して細胞を培養したところ、赤色蛍光は観察されなかった。この結果から、基材が生体適合性物質を有することで、ｃＧＮＳ（ＧＡＰＤＨ－ＭＢ）の取り込みが促進されることがわかった。
　７．実験６
　７－１．ゼラチン粒子の調製
　実験１と同様に、カチオン化されたゼラチン粒子ｃＧＮＳを調製した。ｃＧＮＳと、ＧＡＰＤＨ－ＭＢとを室温で１５分間混合し、その後、遠心分離して水で洗浄して、上記プローブを担持するゼラチン粒子ｃＧＮＳ（ＧＡＰＤＨ－ＭＢ）を得た。
　７－２．基材によるゼラチン粒子の保持
　基材として、ポリプロピレン（ＰＰ）製のウェルプレート、ポリプロピレン（ＰＰ）製の不織布（東レ株式会社製、ポリプロピレン長繊維不織布）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）でコーティングしたウェルプレート、ゼラチンでコーティングしたウェルプレート、ゼラチン不織布（日本毛織株式会社製、Ｇｅｎｏｃｅｌ）を用意した。これらの基材に、ｃＧＮＳ（ＧＡＰＤＨ－ＭＢ）のそれぞれを添加し、３７℃で１時間静置して、ｃＧＮＳ１（ＧＡＰＤＨ－ＭＢ）を固定化して、それぞれ、細胞支持体１～細胞支持体５とした。
　７－３．細胞の培養
　細胞支持体１～細胞支持体５のそれぞれに、マウス間葉系幹細胞株であるＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞を播種して、１日間細胞を培養した。
　７－４．観察
　播種後、１日後に培養された細胞を蛍光顕微鏡で観察し、無作為に撮像した６視野のイメージング蛍光強度を測定した。視野中に確認された細胞数で上記イメージング蛍光強度を除算して、細胞数あたりの平均蛍光強度を算出した。
　表３に、上記細胞数あたりの平均蛍光強度を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３に示すように、基材が生体適合性物質を含むと、細胞あたりの平均蛍光強度が高くなっていた。この結果から、基材が生体適合性物質を有することで、ｃＧＮＳ（ＧＡＰＤＨ－ＭＢ）の取り込みが促進されることがわかった。
　８－１．実験７
　実験１と同様に、カチオン化されたゼラチン粒子ｃＧＮＳを調製した。ｃＧＮＳと、ＧＡＰＤＨ－ＭＢとを室温で１５分間混合し、その後、遠心分離して水で洗浄して、上記プローブを担持するゼラチン粒子ｃＧＮＳ（ＧＡＰＤＨ－ＭＢ）を得た。
　８－２．基材によるゼラチン粒子の保持
　基材として、熱架橋されていないゼラチン不織布（日本毛織株式会社製、Ｇｅｎｏｃｅｌ）、熱架橋されたゼラチン不織布２（日本毛織株式会社製、Ｇｅｎｏｃｅｌ、熱処理時間４時間）、熱架橋されたゼラチン不織布３（日本毛織株式会社製、Ｇｅｎｏｃｅｌ、熱処理時間２４時間）を用意した。また、熱架橋されていないゼラチン不織布（日本毛織株式会社製、Ｇｅｎｏｃｅｌ）をアミノ基導入によりカチオン化したゼラチン不織布４、熱架橋されていないゼラチン不織布（日本毛織株式会社製、Ｇｅｎｏｃｅｌ）のゼラチンのアミノ基に無水コハク酸導入によりアニオン化したゼラチン不織布５を用意した。これらの基材に、ｃＧＮＳ（ＧＡＰＤＨ－ＭＢ）のそれぞれを添加し、３７℃で１時間静置して、ｃＧＮＳ１（ＧＡＰＤＨ－ＭＢ）を固定化して、それぞれ、細胞支持体５～細胞支持体９とした。なお、細胞支持体５は、実験６における細胞支持体５と同一である。
　細胞支持体５～細胞支持体７のｐＨが７．４である溶液中におけるゼータ電位を、堀場製作所社製ナノ粒子解析装置　ｎａｎｏＰａｒｔｉｃａ　ＳＺ－１００Ｖ２（製品名）により測定した
　８－３．細胞の培養
　細胞支持体１～細胞支持体５のそれぞれに、マウス間葉系幹細胞株であるＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞を播種して、１日間細胞を培養した。
　８－４．観察
　播種後、１日後に培養された細胞を蛍光顕微鏡で観察し、無作為に撮像した６視野のイメージング蛍光強度を測定した。視野中に確認された細胞数で上記イメージング蛍光強度を除算して、細胞数あたりの平均蛍光強度を算出した。
　表４に、それぞれの細胞支持体のゼータ電位、および上記細胞数あたりの平均蛍光強度を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４に示すように、基材が含む生体適合性物質をアニオン化し、細胞支持体のゼータ電位を調整することで、ゼラチン粒子の取り込みが促進されることがわかった。
　９．実験８
　９－１．ゼラチン粒子の調製
　実験１と同様に、カチオン化されたゼラチン粒子ｃＧＮＳを調製した。ｃＧＮＳと、ＧＡＰＤＨ－ＭＢとを室温で１５分間混合し、その後、遠心分離して水で洗浄して、上記プローブを担持するゼラチン粒子ｃＧＮＳ（ＧＡＰＤＨ－ＭＢ）を得た。
　９－２．基材の用意
　熱架橋されていないゼラチン不織布（日本毛織株式会社製、Ｇｅｎｏｃｅｌ）を用意した。この基材に、ｃＧＮＳ（ＧＡＰＤＨ－ＭＢ）を添加し、３７℃で１時間静置して、ｃＧＮＳ（ＧＡＰＤＨ－ＭＢ）を固定化して、細胞支持体とした。
　比較例として、溶剤（無水エタノール）に溶解した薬剤（パクリタキセル）を基材（ゼラチン不織布（日本毛織株式会社製、Ｇｅｎｏｃｅｌ））に塗布し、乾燥させて、薬剤でコーティングした基材を用意した。
　９－３．細胞の培養
　上記用意した細胞支持体および薬剤でコーティングした基材のそれぞれに、ヒト乳がん細胞株であるＳＫ－ＢＲ－３細胞を播種して、２４～４８時間細胞を培養した。
　９－４．観察
　細胞凝集体を４％パラホルムアルデヒドで固定し、細胞凝集体の中心面の凍結切片を作成した。この凍結切片に、4’,6-diamidino-2-phenylindole（ＤＡＰＩ）を添加して核を染色し、その後、蛍光顕微鏡で観察し、無作為に撮像した６視野のイメージング蛍光強度を測定した。視野中に確認された細胞数で上記イメージング蛍光強度を除算して、細胞数あたりの平均蛍光強度を算出し、視野ごとの標準偏差も算出した。
　表５に、上記細胞数あたりの平均蛍光強度および標準偏差を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表５に示すように、細胞支持体を用いると、標準偏差がより小さくなっていた。これに対し、薬剤を基材にコーティングしたのみだと、細胞あたりの平均蛍光強度から薬剤が細胞に十分に取り込まれることはわかるが、一方で標準偏差が大きく、細胞への薬剤の取り込みにばらつきが生じていることがわかった。この結果から、生体適合性物質を含む基材と、上記基材に保持されたゼラチン粒子を、を含む、細胞支持体を用いると、細胞により、薬剤または試薬がより均一に取り込まれることがわかった。
　本出願は、２０２０年９月１７日出願の国際出願番号ＰＣＴ／ＪＰ２０２０／０３５１９７に基づく優先権を主張する出願であり、当該出願の特許請求の範囲、明細書および図面に記載された内容は本出願に援用される。
　本発明によれば、試薬や薬剤がより多くの細胞に均一に取り込まれた細胞構造体を得ることができる。この細胞構造体は、移植や細胞の保管に好適に使用することができる。
　１００　細胞支持体
　１１２　生体適合性物質を含む基材
　１１４　ガラスやプラスチックなどの基材
　１１６　生体適合性物質
　１２０　ゼラチン粒子
　１３０　細胞

Claims (26)

  1. 　生体適合性物質を含む基材、または生体適合性物質が表面に付与された基材と、
    　前記基材の前記生体適合性物質に保持されたゼラチン粒子を、を含む、
    　細胞支持体。
  2. 　前記基材は、生体適合性物質の成形体である、請求項１に記載の細胞支持体。
  3. 　前記基材は、成形体と、前記成形体の表面に付与された生体適合性物質と、を有する、請求項１または２に記載の細胞支持体。
  4. 　前記生体適合性物質は、生体由来の高分子、または生分解性の合成高分子である、請求項１～３のいずれか１項に記載の細胞支持体。
  5. 　前記生体適合性物質は、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、およびポリビニルアルコールならびにこれらの共重合体からなる群から選択される少なくとも１種の生体適合性物質である、請求項４に記載の細胞支持体。
  6. 　前記生体適合性物質および前記ゼラチン粒子には、培養環境下において前記生体適合性物質と前記ゼラチン粒子との間にクーロン相互作用が生じる、請求項１～５のいずれか１項に記載の細胞支持体。
  7. 　細胞が付着する表面の荷電の総和が正電荷である、請求項１～６のいずれか１項に記載の細胞支持体。
  8. 　細胞が付着する表面の、ｐＨが７．４である溶液中におけるゼータ電位が０ｍＶより大きく３０ｍＶ以下である、請求項１～７のいずれか１項に記載の細胞支持体。
  9. 　細胞が付着する表面の、ｐＨが７．４である溶液中におけるゼータ電位が４ｍＶ以上１５ｍＶ以下である、請求項１～８のいずれか１項に記載の細胞支持体。
  10. 　前記生体適合性物質は、カチオン化されている、請求項１～９のいずれか１項に記載の細胞支持体。
  11. 　前記ゼラチン粒子は、カチオン化されている、請求項１～１０のいずれか１項に記載の細胞支持体。
  12. 　前記生体適合性物質は、前記細胞支持体が支持する細胞に対して達成すべき前記ゼラチン粒子の導入率に応じて選択された材料である、請求項１～１１のいずれか１項に記載の細胞支持体。
  13. 　前記基材は、二次元形状を有する、請求項１～１２のいずれか１項に記載の細胞支持体。
  14. 　前記基材は、三次元形状を有する、請求項１～１２のいずれか１項に記載の細胞支持体。
  15. 　前記ゼラチン粒子は、試薬または薬剤を担持する、請求項１～１４のいずれか１項に記載の細胞支持体。
  16. 　前記試薬または薬剤は、モレキュラービーコンである、請求項１５に記載の細胞支持体。
  17. 　生体適合性物質を含む基材を用意する工程と、
    　前記基材にゼラチン粒子を付与して前記基材に前記ゼラチン粒子を保持させる工程と、
    　を有する、
    　細胞支持体の製造方法。
  18. 　前記基材の選択または前記ゼラチン粒子の選択により、培養環境下において前記生体適合性物質と前記ゼラチン粒子との間にクーロン相互作用を生じさせる、請求項１７に記載の細胞支持体の製造方法。
  19. 　前記基材の選択または前記ゼラチン粒子の選択により、細胞が付着する表面の荷電の総和を正電荷とする、請求項１７または１８に記載の細胞支持体の製造方法。
  20. 　前記基材の選択または前記ゼラチン粒子の選択により、細胞が付着する表面のゼータ電位を０ｍＶより大きく３０ｍＶ以下とする、請求項１７～１９のいずれか１項に記載の細胞支持体の製造方法。
  21. 　前記基材の選択または前記ゼラチン粒子の選択により、細胞が付着する表面のゼータ電位を４ｍＶ以上１５ｍＶ以下とする、請求項１７～２０のいずれか１項に記載の細胞支持体の製造方法。
  22. 　前記基材は、カチオン化された前記生体適合性物質を含む、請求項１７～２１のいずれか１項に記載の細胞支持体の製造方法。
  23. 　前記ゼラチン粒子は、カチオン化されたゼラチン粒子である、請求項１７～２２のいずれか１項に記載の細胞支持体の製造方法。
  24. 　前記生体適合性物質は、前記細胞支持体が支持する細胞に対して達成すべき前記ゼラチン粒子の導入率に応じて選択された材料である、請求項１７～２３のいずれか１項に記載の細胞支持体の製造方法。
  25. 　請求項１～１６のいずれか１項に記載の細胞支持体を用意する工程と、
    　前記細胞支持体に細胞を播種する工程と、
    　を有する細胞の培養方法。
  26. 　請求項１～１６のいずれか１項に記載の細胞支持体と、
    　前記細胞支持体に保持された細胞と、
    　を有する、細胞構造体。
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