WO2018124142A1 - 高レバウジオシドｃ含有ステビア植物 - Google Patents

高レバウジオシドｃ含有ステビア植物 Download PDF

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一考 岩城
栄一郎 小埜
正良 平井
宮川　克郎
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サントリーホールディングス株式会社
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    • C12N5/04—Plant cells or tissues

Definitions

  • the present invention relates to a stevia plant having a high rebaudioside C content.
  • Patent Document 1 discloses a functional sweetener composition containing a vitamin, a high-intensity sweetener, and a sweet taste improving composition.
  • Rebaudioside (Rebaudioside, hereinafter also referred to as “Reb”) is known as a sweet component contained in stevia extract.
  • Stevia extract is extracted and purified from dried Stevia leaves.
  • Stevia is a perennial plant of Chrysanthemum that originated in Paraguay, South America, and its scientific name is Stevia Rebaudiana Bertoni.
  • Stevia contains ingredients that are about 300 times more sweet than sugar and is cultivated to extract these sweet ingredients and use them as natural sweeteners.
  • As Reb the presence of various glycosides such as RebA, RebB, RebC, RebD, RebE, and RebM has been reported (Special Tables 2012-504552).
  • RebA has been evaluated as a sweetener having high sweetness and good quality sweetness, and is widely used.
  • Other Rebs are also becoming known to have their own sweetness and associated taste.
  • Patent Document 3 stevia plants containing 3 to 8% by weight of rebaudioside C per dry leaf are known.
  • rebaudioside C (hereinafter sometimes referred to as “RebC”) contained in stevia extract is sweet. Found to improve the pull-up. Therefore, acquisition of a stevia plant containing even more rebaudioside C, means for producing such a plant, dry leaves obtained from such plants, food containing rebaudioside C obtained from these dry leaves It is desirable to provide food and beverages.
  • the present application provides a high rebaudioside C-containing non-genetically modified stevia plant containing rebaudioside C at a higher content than wild type stevia species, and a method for producing and screening the plant.
  • acquisition of a stevia plant containing more rebaudioside C, means for producing such a plant, dried leaves obtained from such a plant, rebaudioside C obtained from the dried leaves are included Food and beverages can be provided.
  • High rebaudioside C-containing non-genetically modified stevia plant of the present invention is a high rebaudioside C-containing non-genetically modified stevia plant containing 20% or more of rebaudioside C compared to wild-type stevia species, and
  • the plant body (hereinafter referred to as “plant body of the present invention”) in which the ratio of rebaudioside C in the total steviol glycoside is 40% or more is provided.
  • the stevia plant of the present invention is a species derived from a wild-type stevia plant, but the gene is mutated so that rebaudioside C is high. And the variation
  • Contains 20% or more of rebaudioside C compared to wild-type stevia species means that it is contained per unit amount (for example, 10 ml) of the extract obtained from fresh leaves (non-dried leaves) of wild-type stevia plants.
  • the amount of rebaudioside C to be used is a standard (concentration)
  • the same unit amount of the extract obtained from the fresh leaves (non-dried leaves) of the stevia plant of the present invention obtained from the leaves of the wild-type stevia plant
  • the amount (concentration) of rebaudioside C contained in the same amount as the extracted liquid is higher by 20% or more.
  • the stevia plant of the present invention has rebaudioside C of 20% or more, 22% or more, 24% or more, 26% or more, 28% or more, 30% or more, 32% or more, 34% compared to wild type stevia species. 36% or more, 38% or more, 40% or more, 42% or more, 44% or more, 46% or more, 48% or more, 50% or more, 52% or more, 54% or more, 56% or more, 58% or more,
  • the content may be 60% or more, 62% or more, 64% or more, 66% or more, 68% or more, 70% or more.
  • the ratio of rebaudioside C in the total steviol glycoside is 40% or more
  • the total steviol glycoside present in the extract obtained from the fresh leaves (non-dried leaves) of the stevia plant of the present invention means that rebaudioside C is present at a ratio of 40% or more with respect to body weight.
  • the total steviol glycoside does not include unknown steviol glycosides, nor does it include steviol glycosides that are present below the detection limit.
  • the total steviol glycoside includes rebaudioside A, rebaudioside B, rebaudioside C, rebaudioside D, rebaudioside E, rebaudioside F, rebaudioside I, rebaudioside J, rebaudioside K, rebaudioside N, rebaudioside M, rebaudioside O, rebaudioside O, It is any combination of two or more selected from the group consisting of rebaudioside R, dulcoside A, rubusoside, steviol, steviolmonoside, steviolbioside and stevioside.
  • the total steviol glycoside consists of rebaudioside A, rebaudioside B, rebaudioside C, rebaudioside D, rebaudioside F, rebaudioside M and steviol
  • the total steviol glycoside is rebaudioside A.
  • Rebaudioside B, rebaudioside C, rebaudioside D, rebaudioside F, rebaudioside M, rebaudioside N, rebaudioside O and steviol is rebaudioside A.
  • rebaudioside C in the plant of the present invention is as described above.
  • rebaudioside C is 7% by weight or more and 8% by weight with respect to the weight of the dry leaves. %, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18% %, 19% by weight, or 20% by weight or more.
  • the dry leaves of the plant body of the present invention is a moisture content of 10% by weight or less, 7% by weight or less, 5% by weight or less, 4% by weight or less by drying the fresh leaves of the Stevia plant of the present invention, 3% by weight or less, 2% by weight or less, 1% by weight or less.
  • the moisture content of the dried leaves of the plant of the present invention is 3 to 4% by weight.
  • the plant body of the present invention may have at least one of the following characteristics in addition to the above characteristics related to rebaudioside C.
  • the content (production amount) of rebaudioside A is lower than that of wild-type stevia species. More specifically, the rebaudioside A content (for example, weight concentration in dry leaves) is about 40% or more, about 50% or more, about 60% or more, about 70% or more, or about More than 80% lower.
  • the content (production amount) of stevioside is lower than that of wild type stevia species. More specifically, the content of stevioside (for example, the weight concentration in dried leaves) is lower by about 50% or more, about 60% or more, about 70% or more, or about 80% or more compared to wild type stevia species.
  • the content (production amount) of rebaudioside F is higher than that of wild-type stevia species. More specifically, the rebaudioside F content (for example, the weight concentration in dry leaves) is about 2 times or more, about 3 times or more, about 4 times or more, about 5 times or more, or about More than 6 times higher.
  • the ratio of rebaudioside A in the total steviol glycoside is lower than that of wild type stevia species. More specifically, the proportion of rebaudioside A in the total steviol glycosides (for example, in dry leaves) is about 8% or more, about 20% or more, about 30% or more, about 40% or more compared to wild type stevia species. About 50% or more, about 60% or more, or about 70% or more. (5) The ratio of stevioside in the total steviol glycoside is lower than that of wild type stevia species.
  • the proportion of stevioside in the total steviol glycoside (for example, in dry leaves) compared to wild type stevia species is about 30% or more, about 40% or more, about 50% or more, about 60% or more, Or about 70% or more lower.
  • the ratio of rebaudioside F in the total steviol glycoside is higher than that of wild-type stevia. More specifically, the proportion of rebaudioside F in the total steviol glycoside (eg, in dry leaves, etc.) is about 3 times or more, about 4 times or more, about 5 times or more, or about 6 compared to wild type stevia species. More than twice as low.
  • the above characteristics (1) to (6) indicate that the plurality of individuals of the plant of the present invention can be obtained by comparing the specific plant of the present invention with a specific individual of the wild type Stevia species. It may be based on a comparison between an arithmetic average value in a group consisting of and an arithmetic average value in a group consisting of a plurality of individuals of the wild type Stevia species.
  • the plant of the present invention has a low rebaudioside A and stevioside content (production amount) and a rebaudioside F content (production amount) in addition to the above-described characteristics relating to rebaudioside C. ) And / or the ratio of rebaudioside A and stevioside in the total steviol glycosides is low and the ratio of rebaudioside F in the total steviol glycosides is high compared to wild type stevia species.
  • the stevia plant of the present invention is a species derived from a wild-type stevia plant, and a gene is mutated so that rebaudioside C is high.
  • the gene mutation occurs under natural conditions or by non-genetic recombination techniques.
  • the gene mutation is as shown in SEQ ID NO: 1 (hereinafter referred to as “gene polymorphism of the present invention”).
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is a single nucleotide polymorphism (SNP: hereinafter referred to as “the present invention”) in which the 60th nucleotide sequence of the corresponding nucleotide sequence of the wild type allele (SEQ ID NO: 2) is mutated from wild type A to T. SNP "). Therefore, the stevia plant of the present invention has the polymorphism shown in SEQ ID NO: 1 in the genome. These polymorphisms have been confirmed in the Examples to have a statistical correlation with the phenotype of high rebaudioside C content.
  • the stevia plant of the present invention may have the gene polymorphism in a heterozygous form or a homozygous form.
  • a plant having the gene polymorphism in a homozygous form tends to have a higher rebaudioside C content than a heterozygous form.
  • These gene polymorphisms can be detected by the PCR method, TaqMan PCR method, sequencing method, microarray method, invader method, TILLING method, etc., but the detection method is not limited thereto. Details of the gene polymorphism detection method will be described later.
  • examples of the “non-genetic recombination technique” include a method of inducing a mutation in a gene of a host cell (or host plant) without introducing a foreign gene.
  • examples of such a method include a method of causing a plant cell mutagen to act.
  • mutagens include ethylene methanesulfonic acid (EMS) and sodium azide.
  • EMS ethylene methane sulfonate
  • the treatment time is 1 to 48 hours, 2 to 36 hours, 3 to 30 hours, 4 to 28 hours, 5 to 26 hours, and 6 to 24 hours.
  • the treatment procedure itself is known, but can be carried out by immersing the water-seeded seed that has undergone the water absorption process in a treatment solution containing a mutagen at the above concentration for the treatment time.
  • a non-genetic recombination technique a method of irradiating a plant cell with radiation or light such as X-rays, ⁇ -rays, and ultraviolet rays can be used.
  • the irradiation intensity is 0.01 ⁇ 100Gr, 0.03 ⁇ 75Gr, 0.05 ⁇ 50Gr, 0.07 ⁇ 25Gr, 0.09 ⁇ 20Gr, 0.1 ⁇ 15Gr, 0.1 ⁇ 10Gr, 0.5 ⁇ 10Gr, 1 ⁇ 10Gr, and the irradiation distance is 1cm ⁇ 200m , 5cm ⁇ 100m ⁇ 7cm ⁇ 75m ⁇ 9cm ⁇ 50m ⁇ 10cm ⁇ 30m ⁇ 10cm ⁇ 20m ⁇ 10cm ⁇ 10m ⁇ Irradiation time is 1 minute ⁇ 2 years ⁇ 2 minutes ⁇ 1 year ⁇ 3 minutes ⁇ 0.5 years ⁇ 4 minutes ⁇ 1 month, 5 minutes to 2 weeks, 10 minutes to 1 week.
  • the intensity, distance, and time of irradiation vary depending on the radiation line type and the state to be irradiated (cells, callus, plant body), but can be appropriately adjusted by those skilled in the art.
  • techniques such as cell fusion, sputum culture (haploid growth), and far-cross hybridization (haploid growth) are also known.
  • plant cells may be mutated during culture, it is preferable to return the plant cells to plant individuals for more stable trait maintenance.
  • the plant body of the present invention is a non-genetically modified Stevia plant body.
  • a plant body obtained by performing genetic recombination afterwards using the plant body of the present invention as a host for example, the plant body of the present invention as a host). Plants that have been genetically modified and further added with other traits) are not excluded from the scope of the present invention.
  • Rebaudioside C can be extracted in the form of an extract by reacting the fresh or dried leaves of the plant of the present invention with an appropriate solvent (an aqueous solvent such as water or an organic solvent such as alcohol, ether and acetone). It can.
  • an aqueous solvent such as water or an organic solvent such as alcohol, ether and acetone
  • ethyl acetate and other organic solvents water gradient, high performance liquid chromatography (HPLC), gas chromatography, time-of-flight mass spectrometry (Time- Rebaudioside C can be purified by using a known method such as of-flight mass spectrometry (TOF-MS) or ultra (high) performance liquid chromatography (UPLC).
  • the rebaudioside C content according to the present invention can be measured by the method described in WO2016 / 090460 or the method described in Examples described later. Specifically, it can be measured by sampling fresh leaves from the stevia plant of the present invention and performing LC / MS-MS.
  • the plant body of the present invention includes not only the whole plant body but also a plant organ (eg, leaf, petal, stem, root, seed, etc.), plant tissue (eg, epidermis, phloem, soft tissue, xylem, vascular bundle, fence-like shape) Tissue, spongy tissue, etc.) or various forms of plant cells (eg, suspension culture cells), protoplasts, leaf sections, callus, and the like.
  • a plant organ eg, leaf, petal, stem, root, seed, etc.
  • plant tissue eg, epidermis, phloem, soft tissue, xylem, vascular bundle, fence-like shape
  • Tissue eg, spongy tissue, etc.
  • various forms of plant cells eg, suspension culture cells
  • protoplasts eg, leaf sections, callus, and the like.
  • the plant body of the present invention may include a tissue culture or a plant culture cell. It is because a plant body can be regenerated by culturing such tissue culture or plant culture cells.
  • tissue culture or plant culture cells of the plant of the present invention include embryos, meristem cells, pollen, leaves, roots, root tips, petals, protoplasts, leaf sections, and callus. It is not limited.
  • the present invention includes a step of crossing a stevia plant body of the present invention with a second stevia plant body, wherein 20% of rebaudioside C is compared with a wild type stevia species.
  • a method for producing a high rebaudioside C-containing stevia plant containing a high content as described above (hereinafter referred to as “production method of the present invention”) is provided.
  • production method of the present invention A “high rebaudioside C-containing stevia plant containing 20% or more of rebaudioside C compared to the wild-type stevia species” produced by this method has the same phenotype and genetic properties as the plant of the present invention.
  • the phenotype of the plant produced by the production method of the present invention contains rebaudioside C at a content 20% or more higher than that of wild-type stevia species, and the ratio of rebaudioside C in the total steviol glycosides. Is 40% or more.
  • containing rebaudioside C at a content 20% or more higher than that of wild-type stevia is as described above.
  • the ratio of rebaudioside C in the total steviol glycoside is 40% or more” is as described above.
  • the rebaudioside C is 7% by weight or more, 8% by weight or more, 9% by weight or more, 10% by weight or more, based on the weight of the dried leaves. 11% or more, 12% or more, 13% or more, 14% or more, 15% or more, 16% or more, 17% or more, 18% or more, 19% or more, 20% or more May be present in an amount.
  • the definition of dry leaves is as described above.
  • the genetic property of the plant produced by the production method of the present invention is that it has the gene polymorphism shown in SEQ ID NO: 1.
  • the plant produced by the production method of the present invention may have the gene polymorphism in a heterozygous form or a homozygous form.
  • crossing means that a plant body of the present invention and a second plant body are crossed to produce a child plant body (plant body produced by the production method of the present invention). It means getting.
  • backcrossing is preferable.
  • Backcross means that a child plant born between the plant of the present invention and the second plant is further converted into a plant of the present invention (that is, a plant having the gene polymorphism of the present invention). This is a technique for producing a homozygous plant of the gene polymorphism of the present invention by crossing.
  • the second plant used in the production method of the present invention has the same phenotype and genetic properties as the plant of the present invention, it is substantially backcrossed.
  • the gene polymorphism of the present invention is inherited according to Mendel's law, and a phenotype correlated with the gene polymorphism, that is, a phenotype containing high rebaudioside C is also inherited according to Mendel's law.
  • the plant of the present invention can be produced by self-propagation.
  • Self-propagation can be performed by causing the stamen pollen of the plant of the present invention to self-pollinate the pistil of the plant of the present invention.
  • the plant produced by the production method of the present invention has the same phenotype and genetic properties as the plant of the present invention, the plant produced by the production method of the present invention is further replaced with a third stevia plant. It is also possible to produce a high rebaudioside C-containing stevia plant containing 20% or more of rebaudioside C in comparison with the wild-type stevia species.
  • the plant body of the present invention can also be produced by regenerating the plant body by culturing the tissue culture or plant culture cell described above.
  • the culture conditions are the same as the conditions for culturing wild-type stevia plant tissue culture or plant culture cells (Protocols for In Vitro cultures and secondary metabolite analysis of aromatic and medicinal plants, Method in molecular biology, vo. 1391, pp113-123.).
  • Screening method of plant of the present invention The plant of the present invention and the plant having the same phenotype and genetic properties as the plant of the present invention are detected by detecting the gene polymorphism of the present invention from the tissue of the plant. Can be screened.
  • “screening” means identifying the plant body of the present invention from other plant bodies and selecting the plant body of the present invention. Therefore, as another embodiment, the present invention provides a method for screening a high rebaudioside C-containing stevia plant comprising the step of identifying the polymorphism shown in SEQ ID NO: 1 in the genome of a test plant (hereinafter referred to as “the present invention”). Screening method) ”.
  • the mutation site is included in an amplified probe obtained by amplifying at least one of the base sequence of the gene polymorphism of the present invention and / or the base sequence of the gene and its complementary sequence; A step of performing an amplification treatment and / or a hybridization treatment on the genome or cDNA library of the test Stevia plant using the prepared oligonucleotide primer; and (b) A method including a step of detecting a mutation site by analyzing the treated product.
  • telomere extension reaction does not occur because the nucleotide at the 3 'end of the primer mismatches with the template.
  • the sample template has a mutation. If no amplification product is present, it can be determined that the template has no mutation.
  • the primer sequence is designed so that the SNP of the present invention does not overlap with the primer sequence and the gene polymorphism of the present invention can be PCR amplified, and the nucleotide sequence of the amplified nucleotide fragment is sequenced. Thus, the gene polymorphism of the present invention can be detected.
  • PCR and agarose gel electrophoresis see: Sambrook, Fritsch and Maniatis, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” 2nd Edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press.
  • TaqMan PCR is a method using a PCR reaction with fluorescently labeled allele-specific oligos and Taq DNA polymerase (Livak, KJ Genet. Anal. 14, 143 (1999); Morris T. et al., J Clin. Microbiol. 34, 2933 (1996)).
  • the sequencing method is a method of analyzing the presence or absence of mutation by amplifying a region containing mutation by PCR and sequencing the DNA sequence using a dye terminator or the like (Sambrook, Fritsch and Maniatis, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual ”2nd Edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press).
  • a DNA microarray is one in which one end of a nucleotide probe is fixed in an array on a support, and includes a DNA chip, a Gene chip, a microchip, a bead array, and the like. By using a probe containing a sequence complementary to the gene polymorphism of the present invention, the presence or absence of the gene polymorphism of the present invention can be comprehensively detected.
  • DNA microarray assays such as DNA chips include GeneChip assay (see Affymetrix; US Pat. Nos. 6,045,996, 5,925,525, and 5,858,659). GeneChip technology uses a miniaturized high-density microarray of oligonucleotide probes attached to a chip.
  • the invader method is a special case in which two reporter probes specific to each allele of a gene polymorphism such as SNP and one invader probe are hybridized to the template DNA, and the DNA structure is recognized and cleaved.
  • This method combines DNA cleavage with a Cleavase enzyme having a unique endonuclease activity (Livak, KJ Biomol. Eng. 14, 143-149 (1999); Morris T. et al., J. Clin. Microbiol. 34, 2933 (1996); Lyamichev, V. et al., Science, 260, 778-783 (1993), etc.).
  • the TILLING (Targeting Induced Local Lesions IN Genomes) method is a method of screening mutation mismatches in the genome of a mutant group into which mutations have been introduced by PCR amplification and CEL I nuclease treatment.
  • the extract containing rebaudioside C comprising the step of obtaining an extract from the plant of the present invention, or the seed or dried leaf of the plant.
  • the method for producing the extract of the present invention comprising the step of purifying rebaudioside C from the extract obtained by the method of producing an extract of the present invention.
  • the rebaudioside C-containing extract can be obtained by reacting an appropriate solvent (an aqueous solvent such as water or an organic solvent such as alcohol, ether and acetone) with the fresh or dried leaves of the plant body of the present invention.
  • an appropriate solvent an aqueous solvent such as water or an organic solvent such as alcohol, ether and acetone
  • the method described in WO2016 / 090460 or the method described in the examples described later can be referred to.
  • rebaudioside C-containing extracts are extracted from ethyl acetate and other organic solvents: water gradient, high performance liquid chromatography (HPLC), gas chromatography, time-of-flight mass spectrometry (Time-of-Flight mass spectrometry)
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • gas chromatography time-of-flight mass spectrometry
  • time-of-Flight mass spectrometry time-of-Flight mass spectrometry
  • the rebaudioside C can be purified by using a known method such as TOF-MS) or ultra high performance liquid chromatography (UPLC).
  • the extract obtained by the method for producing an extract of the present invention contains rebaudioside C at a content 20% or more higher than that of the wild-type stevia species, and total steviol glycoside
  • the ratio of rebaudioside C in the body is 40% or more.
  • “containing rebaudioside C at a content 20% or more higher than that of wild-type stevia” is as described above.
  • “the ratio of rebaudioside C in the total steviol glycoside is 40% or more” is as described above.
  • the extract of the present invention is different in at least the ratio of rebaudioside C in the total steviol glycoside compared to the extract similarly extracted from the wild type stevia species, the extract similarly extracted from the wild type stevia species It is thought that characteristics such as taste characteristics are different.
  • the present invention includes a step of mixing the extract of the present invention and / or rebaudioside C obtained by the method for producing rebaudioside C of the present invention and other components, a pharmaceutical, a fragrance, or a food or drink A method for manufacturing a product is provided. Furthermore, this invention provides the novel pharmaceutical, the fragrance
  • the food and drink means beverages and foods. Therefore, in one embodiment, the present invention provides a novel pharmaceutical product, fragrance, beverage or food, and provides a method for producing the pharmaceutical product, fragrance, beverage or food.
  • Non-natural ingredients include non-naturally occurring compounds such as synthetic additives such as synthetic flavors and synthetic preservatives, fermentation products and the like.
  • the dosage form of a pharmaceutical product is not particularly limited, and can be any dosage form such as a solution, paste, gel, solid, and powder.
  • the pharmaceutical product (pharmaceutical composition) of the present invention includes oil, lotion, cream, emulsion, gel, shampoo, hair rinse, hair conditioner, enamel, foundation, lipstick, funny, pack, ointment, powder, toothpaste, aerosol, cleansing In addition to skin external preparations such as foam, it can be used for bath preparations, hair nourishing agents, skin cosmetics, sunscreen agents, and the like.
  • the pharmaceutical product (pharmaceutical composition) of the present invention may further contain other pharmaceutically active components (for example, anti-inflammatory components) or auxiliary components (for example, lubricating components and carrier components) as necessary.
  • the pharmaceutically active ingredient or auxiliary ingredient may be a natural ingredient or a non-natural ingredient.
  • beverages include, but are not limited to, fruit juice beverages, soft drinks, sports beverages, tea beverages (for example, non-fermented teas such as green tea, semi-fermented teas such as oolong tea, whole fermented teas such as black tea, pu-erh teas etc. Post-fermented tea), fermented beverages (for example, alcoholic beverages such as lactic acid beverages, sake, wine, beer, medicinal liquor), smoothies, milk shakes and the like.
  • tea beverages for example, non-fermented teas such as green tea, semi-fermented teas such as oolong tea, whole fermented teas such as black tea, pu-erh teas etc.
  • Post-fermented tea fermented beverages
  • fermented beverages for example, alcoholic beverages such as lactic acid beverages, sake, wine, beer, medicinal liquor
  • smoothies milk shakes and the like.
  • Food includes any processed food.
  • processed food examples include, but are not limited to, bread, noodles, pasta, rice, confectionery (cake, ice cream, popsicle, donut, baked confectionery, candy, rice cake, ice confectionery, chewing gum, gummi, tablet confectionery, snack , Rice cakes, corn cups, and Japanese sweets such as dumplings and manju), tofu and processed products thereof, agricultural foods such as canned fruits, cooking liquor, medicinal liquor, mirin, vinegar, soy sauce, miso, salted, Vermont vinegar, sweet vinegar Fermented foods such as pickles, sweet vinegar ginger, vinegared lotus root, pickles, etc., livestock foods such as yogurt, ham, bacon, sausage, fishery products such as kamaboko, fried tempura, hampen, shimeji mushroom, soup, potage, jelly, boiled, dressing, Noodle soup, tempura sauce, hippo sauce, chilled Chinese sauce, grilled meat sauce, sauce, toothpaste, sweet potato , However winding, yakisoba source, paste products, seasoned seaweed, tenka
  • processed foods are made from natural products, but the properties (eg, physical properties such as elasticity, viscosity, hardness, and sensory properties such as taste, smell, texture, etc.) are different from natural products. .
  • the processed food contains non-natural ingredients.
  • RebC-containing line (high RebC type line) in which the concentration of rebaudioside C (RebC) in the dried leaf is 5.68 to 9.96% by weight and the proportion of total steviol glycosides is 40% or more ) was obtained.
  • these high RebC type lines had a common decrease in RebA production. (“STV” in the table represents stevioside). [Weight concentration in dry leaves] [Percentage of total steviol glycosides]
  • the first generation (M1 generation) seeds were collected by self-breeding of all the M0 generation individuals. A total of 115 populations were prepared with a total of three EMS treatments. The M1 generation seeds were sown in a greenhouse in the Suntory Research Center to obtain M1 generation seedlings. An appropriate amount of fresh leaves was sampled from the M1 generation individuals, and steviol glycosides were quantified by LC / MS-MS (Shimadzu LCMS8050). Specifically, 0.25 g of fresh leaves were dried by freeze drying, and 0.05 g of dried crushed material was put into pure water.
  • Genomic DNA was extracted from the Stevia leaf which wants to investigate the presence or absence of the gene polymorphism of this invention, and PCR was performed using the extracted genomic DNA as a template.
  • Blend Taq Toyobo
  • a reaction solution was prepared according to the instructions of Blend Taq.
  • Amplification of the DNA fragment by PCR was performed using 5′-TGGTCACCCTCTAATCATGCTACCG-3 ′ (SEQ ID NO: 3) as an Fw primer and 5′-TTAACTCTCATGATCGATGGCAACCGCACGCGCATTCTTTTCCAAC-3 ′ (SEQ ID NO: 4) as Rv.
  • PCR conditions were 95 ° C.
  • the DNA fragment amplified by PCR was cleaved with a restriction enzyme (SpeI: Toyobo).
  • SpeI Toyobo
  • An enzyme reaction solution of 2 ⁇ L of H buffer, 1 ⁇ L of SpeI, and 5 ⁇ L of pure water was prepared in 12 ⁇ L of the reaction solution after PCR.
  • the enzyme reaction solution was allowed to stand at 37 ° C. for 16 hours for enzyme reaction.
  • the enzyme reaction solution after the restriction enzyme reaction was performed using LabChip GX Touch HT (Perkin elmer). A small amount of the enzyme reaction solution was electrophoresed on a DNA 5k / RNA CZE LabChip, the content of DNA in the mobile phase was detected by UV, a pseudo-electrophoresis image was prepared, and the marker was detected.
  • the nucleotide sequence of each band of polynucleotide was analyzed.
  • the base sequence (heterojunction) of the bands EM3-16-24, EM2-14-11, EM2-14-18, and EM2-14-30 is shown in SEQ ID NO: 5, and the base of the band EM-3-45-1
  • the sequence (homozygous) is shown in SEQ ID NO: 6, and the base sequences of the bands of EM2-14-38, EM1-11, and EM2-2-4 are shown in SEQ ID NO: 7 (homozygous).
  • the present invention makes it possible to provide rebaudioside C more efficiently, it is possible to provide a pharmaceutical, a fragrance, a food or drink, etc., in which the aftertreatment of sweetness by stevia is improved by containing a sufficient amount of rebaudioside C.

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Abstract

本発明は、レバウジオシドＣの含有量が高いステビア植物を提供することを目的とする。　本発明は、野生型ステビア種と比べレバウジオシドＣをより高い含量、より詳細には２０％以上高い含量で含む高レバウジオシドＣ含有型非遺伝子組み換えステビア植物体を提供する。本発明はまた、そのような高レバウジオシドＣ含有型非遺伝子組み換えステビア植物体を作出する方法、そのような植物体から得られる乾燥葉も提供する。

Description

高レバウジオシドＣ含有ステビア植物
　本発明は、レバウジオシドＣの含有量が高いステビア植物に関する。
　多様化する消費者ニーズに対応すべく、様々な飲料が開発され、市販されている。ショ糖等の糖類は、甘味を与える等の目的で飲料にごく普通に配合される成分であるが、過剰摂取による健康への影響が指摘されてきており、より低カロリーであり、かつ天然由来の甘味料に対するニーズが高まりつつある。例えば特許文献１は、ビタミン、高甘味度甘味料、及び甘味改善組成物を含有する機能性甘味料組成物を開示している。
　レバウジオシド（Ｒｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅ、以下「Ｒｅｂ」ともいう）は、ステビア抽出物に含まれる甘味成分として知られている。ステビア抽出物は、ステビア乾燥葉から抽出、精製されたものである。ステビアは南米パラグアイを原産地とする菊科多年生植物で、学名をステビア・レバウディアナ・ベルトニー（Ｓｔｅｖｉａ Ｒｅｂａｕｄｉａｎａ Ｂｅｒｔｏｎｉ）という。ステビアは砂糖の約３００倍以上の甘味を持つ成分を含むので、この甘味成分を抽出して天然甘味料として用いる為に栽培されている。Ｒｅｂとしては、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＣ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＥ、ＲｅｂＭ等、様々な配糖体の存在が報告されている（特表２０１２－５０４５５２）。様々なＲｅｂの中で、例えばＲｅｂＡは、高甘味度と良質甘味を有する甘味料として評価されており、広く用いられている。その他のＲｅｂについても、その独自の甘さおよび付随する味を有することが判明しつつある。
　そのような状況において、レバウジオシドＣを乾燥葉あたり３～８重量％含むステビア植物体が知られている（特許文献３）。
特表２００９－５１７０４３号明細書 特表２０１６－５１５８１４号明細書 国際出願公開パンフレットＷＯ２０１６／０９０４６０
　これらステビア植物の甘味成分は、程よい甘味を呈するものの、ショ糖に比べて甘味の後引きが見られることが問題となっている。この問題に対し、本発明者らは、その後引きの程度はステビア抽出物の組成により異なることを見出し、特にステビア抽出物の中に含まれるレバウジオシドＣ（以下「ＲｅｂＣ」ということもある）が甘味の後引きを改善することを見出した。
　そこで、レバウジオシドＣをさらにより多く含むステビア植物体の取得、そのような植物体を作出するための手段、そのような植物体より得られる乾燥葉、この乾燥葉より得られたレバウジオシドＣを含む食物や飲料などの提供が望まれている。
　本出願は、野生型ステビア種と比べて高含有量でレバウジオシドＣを含む高レバウジオシドＣ含有型非遺伝子組み換えステビア植物体並びに当該植物体の作出方法及びスクリーニング方法を提供する。
　本発明によって、レバウジオシドＣをより多く含むステビア植物体の取得、そのような植物体を作出するための手段、そのような植物体より得られる乾燥葉、この乾燥葉より得られたレバウジオシドＣを含む食物や飲料などの提供が可能になる。
　以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をそのような実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
１．本発明の高レバウジオシドＣ含有型非遺伝子組み換えステビア植物体
　本発明は、野生型ステビア種と比べレバウジオシドＣを２０％以上高い含量で含む高レバウジオシドＣ含有型非遺伝子組み換えステビア植物体であって、かつ総ステビオール配糖体に占めるレバウジオシドＣの割合が４０％以上である、前記植物体（以下、「本発明の植物体」）を提供する。
　本発明のステビア植物体は、野生種のステビア植物体から派生した種であるが、レバウジオシドＣが高くなるように遺伝子に変異が生じたものである。かつ当該遺伝子の変異は非遺伝子組換え的に生じるものである（後述）。
　「野生型ステビア種と比べレバウジオシドＣを２０％以上高い含量で含む」とは、野生型ステビア植物体の新鮮葉（非乾燥葉）から得られた抽出液の単位量（例えば10ml）あたりに含まれるレバウジオシドＣの量を基準（濃度）とした場合、本発明のステビア植物体の新鮮葉（非乾燥葉）から得られた抽出液の同一単位量（前記野生型ステビア植物体の葉から得られた抽出液と同一量）あたりに含まれるレバウジオシドＣの量（濃度）が２０％以上高いことを意味する。ここで、本発明のステビア植物体は、野生型ステビア種と比べレバウジオシドＣを２０％以上、２２％以上、２４％以上、２６％以上、２８％以上、３０％以上、３２％以上、３４％以上、３６％以上、３８％以上、４０％以上、４２％以上、４４％以上、４６％以上、４８％以上、５０％以上、５２％以上、５４％以上、５６％以上、５８％以上、６０％以上、６２％以上、６４％以上、６６％以上、６８％以上、７０％以上高い含量で含んでいてもよい。
　また、「総ステビオール配糖体に占めるレバウジオシドＣの割合が４０％以上である」とは本発明のステビア植物体の新鮮葉（非乾燥葉）から得られた抽出液に存在する総ステビオール配糖体量に対してレバウジオシドＣが４０％以上の比率で存在することを意味する。ここで、総ステビオール配糖体とは、未知のステビオール配糖体を含むものではなく、また検出限界未満で存在するステビオール配糖体も含まない。好ましくは、総ステビオール配糖体とは、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＦ、レバウジオシドＩ、レバウジオシドＪ、レバウジオシドＫ、レバウジオシドＮ、レバウジオシドＭ、レバウジオシドＯ、レバウジオシドＱ、レバウジオシドＲ、ズルコシドＡ、ルブソシド、ステビオール、ステビオールモノシド、ステビオールビオシド及びステビオシドからなる群より選択される２つ以上の任意の組み合わせである。例えば、ある実施形態では、総ステビオール配糖体は、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＦ、レバウジオシドＭ及びステビオールからなり、別の実施形態では総ステビオール配糖体は、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＦ、レバウジオシドＭ、レバウジオシドＮ、レバウジオシドＯ及びステビオールからなるものであってもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
  
　本発明の植物体に占めるレバウジオシドＣの含有量は以上のとおりであるが、本発明の植物体から乾燥葉を得た場合、当該乾燥葉の重量に対しレバウジオシドＣは７重量％以上、８重量％以上、９重量％以上、１０重量％以上、１１重量％以上、１２重量％以上、１３重量％以上、１４重量％以上、１５重量％以上、１６重量％以上、１７重量％以上、１８重量％以上、１９重量％以上、２０重量％以上の量で存在していてもよい。
　ここで本発明の植物体の乾燥葉とは、本発明のステビア植物体の新鮮葉を乾燥させることにより含水量を１０重量％以下、７重量％以下、５重量％以下、４重量％以下、３重量％以下、２重量％以下、１重量％以下にまで減らしたものをいう。好ましくは、本発明の植物体の乾燥葉の含水量は３～４重量％である。
　本発明の植物体は、レバウジオシドＣに係る上記特性に加え、以下の特性の少なくとも１つを有していてもよい。
（１）野生型ステビア種と比べレバウジオシドＡの含量（産生量）が低い。より具体的には、野生型ステビア種と比べレバウジオシドＡの含量（例えば乾燥葉などにおける重量濃度）が、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、または、約８０％以上低い。
（２）野生型ステビア種と比べステビオシドの含量（産生量）が低い。より具体的には、野生型ステビア種と比べステビオシドの含量（例えば乾燥葉などにおける重量濃度）が、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、または、約８０％以上低い。
（３）野生型ステビア種と比べレバウジオシドＦの含量（産生量）が高い。より具体的には、野生型ステビア種と比べレバウジオシドＦの含量（例えば乾燥葉などにおける重量濃度）が、約２倍以上、約３倍以上、約４倍以上、約５倍以上、または、約６倍以上高い。
（４）野生型ステビア種と比べ、総ステビオール配糖体に占めるレバウジオシドＡの割合が低い。より具体的には、野生型ステビア種と比べ（例えば乾燥葉などにおける）総ステビオール配糖体に占めるレバウジオシドＡの割合が約８％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、または、約７０％以上低い。
（５）野生型ステビア種と比べ、総ステビオール配糖体に占めるステビオシドの割合が低い。より具体的には、野生型ステビア種と比べ（例えば乾燥葉などにおける）総ステビオール配糖体に占めるステビオシドの割合が約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、または、約７０％以上低い。
（６）野生型ステビア種と比べ、総ステビオール配糖体に占めるレバウジオシドＦの割合が高い。より具体的には、野生型ステビア種と比べ（例えば乾燥葉などにおける）総ステビオール配糖体に占めるレバウジオシドＦの割合が約３倍以上、約４倍以上、約５倍以上、または、約６倍以上低い。
　上記（１）～（６）の特性は、本発明の植物体の特定の１個体と野生型ステビア種の特定の１個体との比較を基準にしても、本発明の植物体の複数の個体からなる集団における算術平均値と、野生型ステビア種の複数の個体からなる集団における算術平均値との比較を基準にしてもよい。
　一部の態様において、本発明の植物体は、レバウジオシドＣに係る上記特性に加え、野生型ステビア種と比べレバウジオシドＡおよびステビオシドの含量（産生量）が低く、かつ、レバウジオシドＦの含量（産生量）が高く、および／または、野生型ステビア種と比べ、総ステビオール配糖体に占めるレバウジオシドＡおよびステビオシドの割合が低く、かつ、総ステビオール配糖体に占めるレバウジオシドＦの割合が高い。
　前述のとおり、本発明のステビア植物体は、野生種のステビア植物体から派生した種であり、レバウジオシドＣが高くなるように遺伝子に変異が生じたものである。また、当該遺伝子の変異は天然条件下で生じるか、あるいは非遺伝子組換え的手法により生じるものである。その遺伝子変異は、配列番号１に示すとおりである（以下、「本発明の遺伝子多型」という）。配列番号１の塩基配列は、対応する野生型アレルの塩基配列（配列番号２）の第６０番目の塩基配列が野生型のＡからＴに変異した一塩基多型（ＳＮＰ：以下、「本発明のＳＮＰ」という）を有する。
　したがって、本発明のステビア植物体は、配列番号１に示す多型をゲノム中に有することを特徴とする。これらの多型は、高レバウジオシドＣ含有という表現型と統計学上の相関関係を有することが実施例において確認されている。
　本発明のステビア植物体は前記遺伝子多型をヘテロ接合型で有していてもよく、あるいはホモ接合型で有していてもよい。一般に前記遺伝子多型をホモ接合型で有する植物体はヘテロ接合型と比べてレバウジオシドＣ含有量が高くなる傾向がある。
　これらの遺伝子多型は、PCR法、TaqMan PCR法、シーケンス法、マイクロアレイ法、インベーダー法、TILLING法等により検出することが可能であるが、検出方法はこれらに限定されるものではない。遺伝子多型の検出方法の詳細については後述する。
　本明細書中、「非遺伝子組換え的手法」の例としては、外来遺伝子の導入を行わずに宿主細胞（または宿主植物体）の遺伝子に変異を誘発する方法が挙げられる。そのような方法としては植物細胞の変異誘発剤を作用させる方法が挙げられる。そのような変異誘発剤としては、エチレンメタンスルホン酸（EMS）及びアジ化ナトリウム等が挙げられる。例えば、エチレンメタンスルホン酸（EMS）は、0.1%、0.2%、0.3%、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％などの濃度で植物細胞を処理することができる。処理時間は１～４８時間、２～３６時間、３～３０時間、４～２８時間、５～２６時間、６～２４時間である。処理の手順自体は公知であるが、吸水過程を経た給水種子を上記濃度で変異誘発剤を含む処理液に、上記処理時間浸漬することで行うことができる。
　あるいは、非遺伝子組換え的手法の例としてＸ線、γ線、紫外線などの放射線や光線を植物細胞に照射する方法もできる。この場合、適当な紫外線の照射量（紫外線ランプ強さ、距離、時間）を用いて照射した細胞を、選択培地などで培養させた後、目的の形質を有する細胞、カルス、植物体を選択できる。その際の照射強度は0.01～100Gr、0.03～75Gr、0.05～50Gr、0.07～25Gr、0.09～20Gr、0.1～15Gr、0.1～10Gr、0.5～10Gr、1～10Grであり、照射距離は1cm～200m、5cm～100m、7cm～75m、9cm～50m、10cm～30m、10cm～20m、10cm～10mであり、照射時間は1分～2年、2分～1年、3分～0.5年、4分～1か月、５分～2週間、１０分～1週間である。照射の強度、距離及び時間は、放射線の線種や照射対象となる状態（細胞、カルス、植物体）により異なるが、当業者であれば適宜調整することができる。
　また、細胞融合、葯培養（半数体育成）、遠縁交雑（半数体育成）などの手法も公知である。
　一般に、植物細胞は、培養の間に変異を伴うことがあるため、より安定した形質維持のために植物個体に戻すことが好ましい。
　なお、本発明の植物体は非遺伝子組み換えステビア植物体であるが、本発明の植物体を宿主として事後的に遺伝子組み換えを行って得られた植物体（例えば、本発明の植物体を宿主として遺伝子組み換えを行って、さらに別の形質を付加した植物体）も、本発明の範囲から除外されるものではない。
　レバウジオシドＣは、本発明の植物体の新鮮葉または乾燥葉に適切な溶媒（水等の水性溶媒又はアルコール、エーテル及びアセトン等の有機溶媒）を反応させることにより抽出液の状態で抽出することができる。抽出条件等はＷＯ２０１６／０９０４６０に記載の方法や、後述の実施例に記載の方法を参照することができる。
　さらに、このようにして得られた抽出液に対し、酢酸エチルその他の有機溶媒：水の勾配、高速液体クロマトグラフィー（High Performance Liquid Chromatography：HPLC）、ガスクロマトグラフィー、飛行時間型質量分析（Time-of-Flight mass spectrometry：TOF-MS）、超高性能液体クロマトグラフィー (Ultra （High）Performance Liquid chromatography：UPLC) 等の公知の方法を用いることによりレバウジオシドＣを精製することができる。
　本発明に係るレバウジオシドＣ含量は、ＷＯ２０１６／０９０４６０に記載の方法や、後述の実施例に記載の方法で測定することができる。具体的には本発明のステビア植物体から新鮮葉をサンプリングし、LC/MS-MSを行うことにより測定することができる。
　本発明の植物体には植物体全体のみならず、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子など）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織など）あるいは種々の形態の植物細胞（例えば、懸濁培養細胞）、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどが含まれ得る。
　また、本発明の植物体には、組織培養物又は植物培養細胞も含まれ得る。このような組織培養物又は植物培養細胞を培養することにより、植物体を再生することができるからである。本発明の植物体の組織培養物又は植物培養細胞の例としては、胚、分裂組織細胞、花粉、葉、根、根端、花弁、プロトプラスト、葉の切片およびカルス等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
２．本発明の植物体の作出方法
　本発明は、別の実施態様において、本発明のステビア植物体と第２のステビア植物体とを交雑させる工程を含む、野生型ステビア種と比べレバウジオシドＣを２０％以上高い含量で含む高レバウジオシドＣ含有型ステビア植物体を作出する方法（以下、「本発明の作出方法」という）を提供する。
　当該方法により作出される「野生型ステビア種と比べレバウジオシドＣを２０％以上高い含量で含む高レバウジオシドＣ含有型ステビア植物体」は、本発明の植物体と同じ表現型と遺伝的性質を有する。
　具体的には、本発明の作出方法により作出される植物体の表現型は、野生型ステビア種と比べレバウジオシドＣを２０％以上高い含量で含み、かつ総ステビオール配糖体に占めるレバウジオシドＣの割合が４０％以上である。ここで、「野生型ステビア種と比べレバウジオシドＣを２０％以上高い含量で含む」とは前述のとおりである。また、「総ステビオール配糖体に占めるレバウジオシドＣの割合が４０％以上である」とは前述のとおりである。
　さらに本発明の作出方法により作出された植物体から乾燥葉を得た場合、当該乾燥葉の重量に対しレバウジオシドＣは７重量％以上、８重量％以上、９重量％以上、１０重量％以上、１１重量％以上、１２重量％以上、１３重量％以上、１４重量％以上、１５重量％以上、１６重量％以上、１７重量％以上、１８重量％以上、１９重量％以上、２０重量％以上の量で存在していてもよい。乾燥葉の定義については前述のとおりである。
　本発明の作出方法により作出される植物体の遺伝的性質は、配列番号１に示す遺伝子多型を有することである。本発明の作出方法により作出される植物体は前記遺伝子多型をヘテロ接合型で有していてもよく、あるいはホモ接合型で有していてもよい。これらの多型の検出方法については、前述及び後述のとおりである。
　本発明の作出方法において、「交雑させる」とは、本発明の植物体と、第２の植物体とを交配させることにより、その子植物体（本発明の作出方法により作出される植物体）を得ることを意味する。交雑方法としては、戻し交雑が好ましい。「戻し交雑」とは、本発明の植物体と第２の植物体との間に生まれた子植物体を、さらに本発明の植物体（つまり、本発明の遺伝子多型を有する植物体）と交雑させて、本発明の遺伝子多型のホモ接合型植物体を作出する手法である。本発明の作出方法に用いられる第２の植物体が、本発明の植物体と同じ表現型と遺伝的性質を有する場合には、実質的に戻し交雑となる。本発明の遺伝子多型はメンデルの法則に従って遺伝し、これに伴って当該遺伝子多型と相関する表現型、つまり高レバウジオシドＣ含有という表現型も、メンデルの法則に従って遺伝する。
　あるいは、本発明の植物体は自殖により作出することもできる。自殖は、本発明の植物体のおしべの花粉を本発明の植物体のめしべに自家受粉させることにより行うことができる。
　本発明の作出方法により作出される植物体は、表現型及び遺伝的性質が本発明の植物体と同じであるため、本発明の作出方法により作出される植物体をさらに第３のステビア植物体とを交雑させることにより、野生型ステビア種と比べレバウジオシドＣを２０％以上高い含量で含む高レバウジオシドＣ含有型ステビア植物体を作出することも可能である。
　別の態様として、本発明の植物体は、先に述べた組織培養物又は植物培養細胞を培養することにより植物体を再生することで作出することも可能である。培養条件については、野生型ステビア植物の組織培養物又は植物培養細胞を培養する条件と同じであり、公知である（Protocols for In Vitro cultures and secondary metabolite analysis of aromatic and medicinal plants, Method in molecular biology, vo. 1391, pp113-123.）。
３．本発明の植物体のスクリーニング方法
　本発明の植物体および本発明の植物体と同じ表現型と遺伝的性質を有する植物体は、当該植物体の組織から本発明の遺伝子多型を検出することによりスクリーニングすることができる。ここで、「スクリーニング」とは、本発明の植物体とそれ以外の植物体とを識別し、本発明の植物体を選択することを意味する。
　したがって、本発明は、別の実施形態として、被験植物のゲノムに配列番号１に示す多型を同定する工程を含む、高レバウジオシドＣ含有型ステビア植物体をスクリーニングする方法（以下、「本発明のスクリーニング方法」という）を提供する。
　本発明のスクリーニング方法としては、
　(a)  本発明の遺伝子多型の塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプローブ、及び/又は前記遺伝子の塩基配列及びその相補配列の少なくとも一方を増幅したときの増幅断片中に前記変異部位が含まれるように作製されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いて被検ステビア植物体のゲノム又はcDNAライブラリーについて増幅処理及び/又はハイブリダイゼーション処理を行う工程、及び、
　(b)  前記処理物を分析することにより変異部位を検出する工程
を含む、方法が挙げられる。
　このような検出方法の具体例としては、PCR法、TaqMan PCR法、シーケンス法、マイクロアレイ法、インベーダー法やTILLING法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　PCR法の場合、3’末端部分が本発明のＳＮＰに相補的な配列を有するようなプライマーを作製することが好ましい。このように設計されたプライマーを用いると、鋳型となるサンプルが変異を有する場合には、プライマーが完全に鋳型にハイブリダイズするため、ポリメラーゼ伸長反応が進むが、鋳型が本発明のＳＮＰを有しない場合には、プライマーの3’末端のヌクレオチドが鋳型とミスマッチを生じるので、伸長反応は起こらない。したがって、このようなプライマーを用いてPCR増幅を行い、増幅産物をアガロースゲル電気泳動などによって分析し、所定のサイズの増幅産物が確認できれば、サンプルである鋳型が変異を有していることになり、増幅産物が存在しない場合には、鋳型が変異を有していないものと判断できる。
　あるいは、本発明のＳＮＰとプライマー配列とは重複させず、かつ本発明の遺伝子多型をPCR増幅させることが可能なようにプライマー配列を設計し、増幅されたヌクレオチド断片の塩基配列をシーケンスすることにより、本発明の遺伝子多型を検出することができる。
　PCR及びアガロースゲル電気泳動については、以下を参照：Sambrook, Fritsch and Maniatis, ”Molecular Cloning: A Laboratory Manual” 2nd Edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press。
　TaqMan PCR法とは、蛍光標識したアレル特異的オリゴとTaq DNAポリメラーゼによるPCR反応とを利用した方法である（Livak, K.J. Genet. Anal. 14, 143 (1999); Morris T. et al., J. Clin.Microbiol. 34, 2933 (1996)）。
　シークエンス法とは、変異を含む領域をPCRにて増幅させ、Dye Terminatorなどを用いてDNA配列をシークエンスすることで、変異の有無を解析する方法である（Sambrook, Fritsch and Maniatis, ”Molecular Cloning: A Laboratory Manual” 2nd Edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press）。
　DNAマイクロアレイは、ヌクレオチドプローブの一端が支持体上にアレイ状に固定されたものであり、DNAチップ、Geneチップ、マイクロチップ、ビーズアレイ等を含むものである。本発明の遺伝子多型と相補的な配列を含むプローブを用いることで、網羅的に本発明の遺伝子多型の有無を検出することができる。DNAチップなどのDNAマイクロアレイアッセイとしてはGeneChipアッセイが挙げられる（Affymetrix社；米国特許第6,045,996号、同第5,925,525号、及び同第5,858,659号参照）。GeneChip技術は、チップに貼り付けたオリゴヌクレオチドプローブの小型化高密度マイクロアレイを利用するものである。
　インベーダー法とは、SNP等の遺伝子多型のそれぞれのアレルに特異的な2種類のレポータープローブ及び1種類のインベーダープローブの鋳型DNAへのハイブリダイゼーションと、DNAの構造を認識して切断するという特殊なエンドヌクレアーゼ活性を有するCleavase酵素によるDNAの切断を組み合わせた方法である（Livak, K. J. Biomol. Eng. 14, 143-149 (1999); Morris T. et al., J. Clin.Microbiol. 34, 2933 (1996); Lyamichev, V. et al., Science, 260, 778-783 (1993)等）。
　TILLING（Targeting Induced Local Lesions IN Genomes）法とは、変異導入した突然変異体集団のゲノム中の変異ミスマッチをPCR増幅とCEL Iヌクレアーゼ処理によってスクリーニングする方法である。
４．本発明の植物体由来抽出物及びそれを用いた製品
　本発明のさらなる態様において、本発明の植物体、または当該植物体の種子若しくは乾燥葉から抽出物を得る工程を含む、レバウジオシドＣ含有抽出物の製造方法（以下、「本発明の抽出物の製造方法」という）が提供される。さらに、本発明の抽出物の製造方法により得られた抽出物からレバウジオシドＣを精製する工程を含む、レバウジオシドＣの製造方法（以下、「本発明のレバウジオシドＣの製造方法」という）が提供される。
　レバウジオシドＣ含有抽出物は、本発明の植物体の新鮮葉または乾燥葉に適切な溶媒（水等の水性溶媒又はアルコール、エーテル及びアセトン等の有機溶媒）を反応させることにより得ることができる。抽出条件等はＷＯ２０１６／０９０４６０に記載の方法や、後述の実施例に記載の方法を参照することができる。
　また、レバウジオシドＣ含有抽出物を酢酸エチルその他の有機溶媒：水の勾配、高速液体クロマトグラフィー（High Performance Liquid Chromatography：HPLC）、ガスクロマトグラフィー、飛行時間型質量分析（Time-of-Flight mass spectrometry：TOF-MS）、超高性能液体クロマトグラフィー (Ultra （High）Performance Liquid chromatography：UPLC) 等の公知の方法を用いることによりレバウジオシドＣを精製することができる。
　本発明の抽出物の製造方法により得られた抽出物（以下、「本発明の抽出物」という）は、野生型ステビア種と比べレバウジオシドＣを２０％以上高い含量で含み、かつ総ステビオール配糖体に占めるレバウジオシドＣの割合が４０％以上であることを特徴とする。ここで、「野生型ステビア種と比べレバウジオシドＣを２０％以上高い含量で含む」とは前述のとおりである。また、「総ステビオール配糖体に占めるレバウジオシドＣの割合が４０％以上である」とは前述のとおりである。本発明の抽出物は、野生型ステビア種から同様に抽出した抽出物と比べ、少なくとも総ステビオール配糖体に占めるレバウジオシドＣの割合が異なるため、野生型ステビア種から同様に抽出した抽出物とは味覚特性などの特性が異なっていると考えられる。
　このようにして得られた本発明の抽出物及び／又は本発明のレバウジオシドＣの製造方法により得られるレバウジオシドＣと他の成分とを混合することにより、レバウジオシドＣの含量を高めた新規な医薬品、香料又は飲食品を製造することができる。そこで、本発明は、別の実施態様として、本発明の抽出物及び／又は本発明のレバウジオシドＣの製造方法により得られるレバウジオシドＣと他の成分とを混合する工程を含む、医薬品、香料又は飲食品の製造方法を提供する。さらに、本発明は、前記製造方法により得られた、レバウジオシドＣの含量を高めた新規な医薬品、香料又は飲食品を提供する。ここで飲食品とは、飲料及び食品を意味する。したがって、ある実施態様では、本発明は新規な医薬品、香料、飲料又は食品を提供し、また、当該医薬品、香料、飲料又は食品の製造方法を提供する。
　他の成分としては、医薬品、香料又は飲食品に使用し得るものであれば特に限定されず、天然成分及び非天然成分を使用することができる。非天然成分としては、天然に存在しない化合物、例えば、合成風味料、合成保存料などの合成添加物、発酵産物などが挙げられる。
　医薬品（医薬組成物）の剤型は、特に限定されず、溶液状、ペースト状、ゲル状、固体状、粉末状等任意の剤型をとることができる。また、本発明の医薬品（医薬組成物）は、オイル、ローション、クリーム、乳液、ゲル、シャンプー、ヘアリンス、ヘアコンディショナー、エナメル、ファンデーション、リップスティック、おしろい、パック、軟膏、パウダー、歯磨、エアロゾル、クレンジングフォーム等の皮膚外用薬の他、浴用剤、養毛剤、皮膚美容液、日焼け防止剤等に用いることができる。本発明の医薬品（医薬組成物）は、必要に応じてさらに、その他の医薬活性成分（例えば、消炎成分）又は補助成分（例えば、潤滑成分、担体成分）を含んでいてもよい。医薬活性成分又は補助成分は、天然成分であっても非天然成分であってもよい。
　飲料の例としては、限定されずに、果汁飲料、清涼飲料、スポーツ飲料、茶飲料（例えば、緑茶などの不発酵茶、ウーロン茶などの半発酵茶、紅茶などの全発酵茶、プーアール茶などの後発酵茶）、発酵飲料（例えば、乳酸飲料、清酒、ワイン、ビール、薬用酒などのアルコール飲料）、スムージー、ミルクセーキなどが挙げられる。
　食品は任意の加工食品を包含する。加工食品の例としては、限定されずに、パン、麺類、パスタ、ごはん、菓子類（ケーキ、アイスクリーム、アイスキャンデー、ドーナツ、焼き菓子、キャンデー、飴、氷菓、チューインガム、グミ、錠菓、スナック、米菓、コーンカップ、並びに団子及びまんじゅう等の和菓子）、豆腐及びその加工品、フルーツ缶詰等の農産食品、料理酒、薬用酒、みりん、食酢、醤油、みそ、塩辛、バーモント酢、甘酢らっきょ漬け、甘酢生姜、酢レンコン、漬物等の発酵食品、ヨーグルト、ハム、ベーコン、ソーセージ等の畜産食品、かまぼこ、揚げ天、はんぺん、しめ鯖等の水産食品、スープ、ポタージュ、ゼリー、佃煮、ドレッシング、麺つゆ、天ぷらのタレ、カバ焼きのタレ、冷やし中華のタレ、焼肉のタレ、ソース、歯磨きペースト、さつま揚げ、だし巻き、焼きそばソース、練り製品、味付け海苔、天カス、ふりかけなどが挙げられる。一態様において、加工食品は天然物を原料とするが、天然物とはその特性（例えば、弾力性、粘性、硬度などの物理的特性、味、匂い、食感などの官能的特性）が異なる。別の態様において、加工食品は非天然成分を含む。
　以下に本発明に関する実験例、実施例等を記載するが、本発明はこれらの具体的な態様に限定されるものではない。
（１）高RebC型系統の個体の単離（M0世代）
　野生型ステビア種子（タイ国での市販品種、2014年8月に導入）約2000個（重量換算）を３つに分けて、各々に対して0.1%、0.2%又は0.3%のエチレンメタンスルホン酸（EMS）処理を行って遺伝子改変を行った。
　このEMS処理済み種子及び無処理の種子を、サントリー研究センター内温室にて播種し、EMS処理当代（M0世代）苗および無処理苗を得た。処理濃度間での発芽率差異は見られなかった。
　EMS処理当代（M0世代）および無処理個体より適量の新鮮葉をサンプリングし、LC/MS-MS（島津LCMS8050）にて各ステビオール配糖体の濃度を定量した。具体的には、0.25gの新鮮葉をフリーズドライにより乾燥し、破砕物乾物0.05gを純水中に投入した。超音波処理20分にて抽出し、遠心・濾過した後に0.33mlの抽出液を得た。この抽出液をLCMS8050イオンモード（島津LCMS8050）にてLC/MS-MS分析を行ったところ、以下の分析結果が得られた。分析結果を以下の表に示す（表１－１、表１－２）。表中、EMの後の数字が処理濃度を示す（すなわち、EM1＝0.1％処理）。
　各植物体のスクリーニングの結果、乾燥葉中のレバウジオシドＣ（RebC）の濃度が5.68～9.96重量％であり、かつ総ステビオール配糖体に占める割合が40%以上のRebC含有系統（高RebC型系統）を複数得た。なお、これら高RebC型系統は共通してRebA生産量が低下していた。（表中「STV」はステビオシドを表す）。
［乾燥葉中の重量濃度］
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
  
［総ステビオール配糖体中の割合］
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
  
（２）高RebC型系統の個体の単離（M1世代）
　上記M0世代全個体の自殖により処理第一代（M1世代）種子を採種した。3種EMS処理合計で115集団を作製した。
　上記M1世代種子をサントリー研究センター内の温室内で播種し、M1世代苗を得た。上記M1世代個体より適量の新鮮葉をサンプリングし、LC/MS-MS（島津LCMS8050）にてステビオール配糖体を定量した。
　具体的には、0.25gの新鮮葉をフリーズドライにより乾燥し、破砕物乾物0.05gを純水中に投入した。超音波処理20分にて抽出し、遠心・濾過した後に0.33mlの抽出液を得た。この抽出液をLCMS8050イオンモード（島津LCMS8050）にてLC/MS-MS分析を行ったところ、以下の分析結果が得られた（表２－１、表２－２）。
　表中、EMの後の数字は処理濃度を表す（すなわち、EM1＝0.1％処理）。
　分析結果に基づき、高RebC個体を複数選抜した。
○高RebC型系統
［乾燥葉中の重量濃度］
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
  
［総ステビオール配糖体中の割合］
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
  
○低RebC型もしくは通常濃度の系統
［乾燥葉中の重量濃度］
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
  
［ステビオール配糖体中の割合］
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
  
（３）高RebC型系統の個体の単離（M2世代）
　高RebC型系統についてさらにRebOおよびRebN濃度を定量した。定量条件は上記と同じである。RebC、RebO、RebNは共通して、分子内にラムノース残基を有するため、糖の転移に関与する同一の酵素がこれらの含有比率に影響しているのではないかと仮定し、各成分の濃度が比例関係にある場合に本仮説を支持できると考え実施したものである。
［乾燥葉中の重量濃度］
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
  
［総ステビオール配糖体中の割合］
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
  
 
（４）高RebC含有植物体の遺伝子多型について
（５）高RebC含有植物体に特有の遺伝子多型の検出について
　本発明の遺伝子多型の有無を調査したいステビア葉からゲノムDNAを抽出し、抽出したゲノムDNAを鋳型にPCRを行った。PCRはBlend Taq(東洋紡)を使用しBlend Taqの説明書に従い反応液を作製した。PCRによるDNA断片の増幅にはFwプライマーとして 5’-TGGTCACCCTCTAATCATGCTACCG-3’ （配列番号３）とRvとして 5’-TTAACTCTCATGATCGATGGCAACCGCACGCGCATTCTTTTCCAAC-3’ （配列番号４）を用いてPCRを行った。PCRの条件は95℃ 2分、55℃ 30秒、72℃ 30秒の3段階の反応を35回繰り返した。PCRで増幅したDNA断片は制限酵素（SpeI：東洋紡）で切断した。PCR後の反応液12μLにH buffer 2μL、SpeI 1μL、純水5μLの酵素反応液を作製した。酵素反応液は37℃で16時間静置し酵素反応させた。制限酵素反応後の酵素反応液はLabChip GX Touch HT（Perkin elmer社）を使って行った。微量の酵素反応液をDNA 5k/RNA CZE LabChip上で電気泳動を行い、UVにより移動相内のDNAの含量を検出し疑似的な電気泳動像を作製しマーカーの検出を行った。
　上記の検出の結果、#8の断片（1412、A>T）を用いると、RebC濃度が非常に高い個体（EM3-45-1、EM3-16-24、EM2-14-11、EM2-14-18、EM2-14-30）において、野生型よりも上側にバンドが検出された。一方、RebC濃度が野生型と同レベルかいくらか高い個体（EM2-14、EM2-11、EM2-16、EM2-14-38、EM3-19-16、EM2-14-27、EM2-2-7、EM2-32-6、EM1-11、EM2-4-4、EM2-4-13）では、野生型と同サイズ又は同程度のサイズのバンドが、ホモ型又はヘテロ型で検出された。
　各バンドのポリヌクレオチドについて塩基配列を解析した。EM3-16-24、EM2-14-11、EM2-14-18、EM2-14-30のバンドの塩基配列（ヘテロ接合）を配列番号５に示し、EM-3-45-1のバンドの塩基配列（ホモ接合）を配列番号６に示し、及びEM2-14-38、EM1-11、EM2-2-4のバンドの塩基配列を配列番号７（ホモ接合）に示す。
　高RebC表現型の株は、全てが共通して配列番号１の塩基配列を有していた。これは対応する野生型の配列（配列番号２）の５’側から６０番目の塩基がＡからＴに変異した多型である。さらに高RebC濃度の表現型と配列番号１の多型との相関関係について統計解析を行ったところ、当該多型は高RebC濃度の表現型と統計学上の相関関係を有することが明らかになった。具体的には、高RebC型（ヘテロ型A/T）×低RebC型（野生ホモ型A/A）の後代における分離比は、帰無仮説に基づけば高RebC型：低RebC型＝１：１と推定できる。上記検定交雑より得られた後代22個体のRebC表現型における観測値は高：低＝７：１５となったため、期待値は高：低＝１１：１１となる。分離分析結果について適合度検定を行ったところ、χ2＝2.91となり、df=1、α=0.05における棄却域が3.84であるため、観測値（実際の分離比）と期待値との間には統計的に有意な違いはなく、両者は適合すると判断した。
　つまり、検定交雑の結果、高RebC型：低RebC型は１：１に分離したため、マーカー検定結果と表現型は一定の関係にあり、本SNPによってRebC遺伝子型を規定できることが判明した。
　以上の結果から、本発明の遺伝子多型の有無について本手順を用いると、RebC濃度が高い個体を遺伝子レベルで検出することが可能であることが判明した。
　本発明によってレバウジオシドＣがより効率的に提供可能になるので、レバウジオシドＣを十分な量含むことによってステビアによる甘味の後引きが改善された医薬品、香料又は飲食品などを提供できる。

Claims (16)

  1. 　野生型ステビア種と比べレバウジオシドＣを２０％以上高い含量で含む高レバウジオシドＣ含有型非遺伝子組み換えステビア植物体であって、かつ総ステビオール配糖体に占めるレバウジオシドＣの割合が４０％以上である、前記植物体。
  2. 　乾燥葉として７重量％以上のレバウジオシドＣ含量を有する、請求項１に記載の植物体。
  3. 　配列番号１に示す多型をゲノム中に有する、請求項１又は２に記載の植物体。
  4. 　請求項１～３のいずれか一項に記載の植物体の種子。
  5. 　請求項１～３のいずれか一項に記載の植物体の乾燥葉。
  6. 　請求項１～３のいずれか一項に記載の植物体の組織培養物又は植物培養細胞。
  7. 　胚、分裂組織細胞、花粉、葉、根、根端、花弁、プロトプラスト、葉の切片およびカルスである請求項６記載の組織培養物又は植物培養細胞。
  8. 　請求項１～３のいずれか一項に記載のステビア植物体と第２のステビア植物体とを交雑させる工程を含む、野生型ステビア種と比べレバウジオシドＣを２０％以上高い含量で含む高レバウジオシドＣ含有型ステビア植物体を作出する方法。
  9. 　第２の植物体が請求項１～３のいずれか一項に記載のステビア植物体である、請求項８に記載の方法。
  10. 　請求項１～３のいずれか一項に記載の植物体、請求項４に記載の種子又は請求項５に記載の乾燥葉の抽出物。
  11. 　請求項１０に記載の抽出物を含む医薬品、香料又は飲食品。
  12. 　請求項１～３のいずれか一項に記載の植物体、請求項４に記載の種子又は請求項５に記載の乾燥葉から抽出物を得る工程を含む、レバウジオシドＣ含有抽出物の製造方法。
  13. 　請求項１２に記載のレバウジオシドＣ含有抽出物からレバウジオシドＣを精製する工程を含む、レバウジオシドＣの製造方法。
  14. 　請求項１２に記載の方法により得られる抽出物及び／又は請求項１３に記載の方法により得られるレバウジオシドＣと他の成分とを混合する工程を含む、医薬品、香料又は飲食品の製造方法。
  15. 　被験植物のゲノムに配列番号１に示す多型を同定する工程を含む、高レバウジオシドＣ含有型ステビア植物体をスクリーニングする方法。
  16. 　さらに、葉組織のレバウジオシドＣの含有量を測定する工程を含む、請求項１５に記載の方法。
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