WO2018016701A1 - 세포 배양용 폴리비닐 알코올 나노섬유 구조체의 제조 방법 - Google Patents

세포 배양용 폴리비닐 알코올 나노섬유 구조체의 제조 방법 Download PDF

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곽종영
김정민
박여진
박단비
무하마드카심
정영훈
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아주대학교산학협력단
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    • D10B—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBLASSES OF SECTION D, RELATING TO TEXTILES
    • D10B2509/00—Medical; Hygiene

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a polyvinyl alcohol nanofiber structure for cell culture, and more particularly, to a method for producing a polyvinyl alcohol nanofiber structure for cell culture that can improve water resistance while securing predetermined transparency. .
  • Polyvinyl alcohol has the advantages of having high hydrophilicity, permeability, biocompatibility, and biodegradability, but has a high solubility in water, and thus is limited to being used as a cell culture material.
  • DS degree of saponification
  • the degree of saponification of commercially available PVA is less than 99.8%, so that nanofibers are easily dissolved in water when nanofibers are manufactured using commercially available PVA.
  • PVA is cross-linked to increase the water resistance of nanofibers made of PVA.
  • Representative methods of crosslinking include physical crosslinking using heat treatment or crystallization and chemical crosslinking using a crosslinking agent. 10-0703607, 10-0841463, 10-0835082).
  • the transmittance is decreased optically while the crystallinity is different from that of uncrosslinked PVA.
  • Korean Patent No. 10-1413095 discloses a method of adding an aqueous PVA solution and glyoxal to an aqueous solution.
  • the water-soluble solution is disclosed that a water-insoluble and transparent nanofiber membrane can be prepared by using a natural protein water-soluble solution and / or a low molecular weight chitosan water-soluble solution and electrospinning it.
  • polyacrylic acid contains a carboxyl group in its structure, and thus, by binding to hydroxyl groups of PVA using PAA, the resulting PVA has a crosslinked structure, thereby reducing the solubility in aqueous solution.
  • PAA polyacrylic acid
  • Destaye et al. ACS Appl Mater Interfaces, Vol. 5, 4745-4752, 2013
  • crosslinking occurs by intermolecular acetal linkage between aldehydes of glutaraldehyde (GA) and hydroxyl groups of PVA. I've done it. Due to the number of hydroxyl groups reduced by crosslinking, the PVA can be less soluble in aqueous solution.
  • One object of the present invention is to provide a method for producing a polyvinyl alcohol nanofiber structure for cell culture, while ensuring predetermined transparency.
  • Method for producing a polyvinyl alcohol nanofiber structure for cell culture for one purpose of the present invention is electrospinning an electrospinning solution containing polyvinyl alcohol, polyacrylic acid and glutaraldehyde (glutaraldehyde) Forming a nanofiber mat, crosslinking by hydrochloric acid vapor treatment with respect to the nanofiber mat, and crystallizing by treating with hydrochloric acid vapor treated nanofiber mat by dimethylformaldehyde solvent treatment.
  • the forming of the nanofiber mat may include forming the nanofibers by electrospinning the electrospinning solution at a 10 to 15 kV state using a metal syringe at a spinning speed of 5 to 10 ⁇ l / min, and It may include the step of performing a heat treatment for the nanofiber mat.
  • the step of crosslinking may be added to the nanofiber mat and hydrochloric acid (HCl) in a vacuum desiccator to treat the nanofiber mat with hydrochloric acid vapor in a vacuum for 60 seconds to 120 seconds.
  • HCl hydrochloric acid
  • the step of crystallization may include a step of 20 seconds to 1 minute treatment with dimethylformaldehyde solvent and drying.
  • the crystallized nanofiber mat is characterized in that the gel does not gel even when treated with distilled water.
  • the manufacturing method may further include the step of culturing by attaching two or more different cells to each of both sides of the crystallized nanofiber mat after the crystallization step.
  • the method for producing a polyvinyl alcohol nanofiber structure for cell culture of the present invention described above it is possible to manufacture a nanofiber structure with improved water resistance while ensuring transparency to the extent that the cell culture state can be observed.
  • the nanofiber structure produced by this method has the advantage that the state of the cells in real time through a microscope while culturing by attaching different types of cells on each side.
  • 1 is a view showing scanning electron microscope images for explaining the water resistance of the nanofiber mat immediately after the electrospinning process for each electrospinning solution.
  • FIG. 2 is a view showing a scanning electron microscope image showing the nanofiber structure of the nanofiber mat after the solvent treatment process for each solvent type.
  • Example 3 is a scanning electron microscope image showing a nanofiber structure after treatment of distilled water for the nanofiber mat prepared according to Example 1, Comparative Examples 1-a, 1-b and 2.
  • FIG. 4 is a view showing experimental results for explaining the effects of the hydrochloric acid vapor treatment process and DMF treatment process.
  • 5 is a view showing pictures for explaining the results of the transparency evaluation for each nanofiber mat.
  • FIG. 6 is a diagram showing an infrared spectroscopy spectrum before the DMF solvent treatment process of nanofiber mats.
  • FIG. 7 is a diagram showing an infrared spectroscopy spectrum before and after the DMF solvent treatment process of PVA / PAA / GA nanofiber mat.
  • FIG. 8 is a view showing photographs for explaining the results of cell adhesion evaluation for the nanofiber mat prepared according to Comparative Example 2.
  • FIG. 9 is a view for explaining a process for producing a nanofiber mat for cell culture using the nanofiber mat prepared according to Example 1 of the present invention.
  • 10 to 13 are photographs for explaining the results of the cell adhesion evaluation in the nanofiber mat prepared according to the process of FIG.
  • an electrospinning solution containing polyvinyl alcohol, polyacrylic acid and glutaraldehyde is electrospun to form a nanofiber mat.
  • the electrospinning solution contains polyvinyl alcohol and glutaraldehyde using a solvent as distilled water.
  • the electrospinning solution may be electrospun using a metal syringe at a spinning speed of 5 to 10 ⁇ l / min to form nanofibers.
  • the voltage condition of the electrospinning process may be 10 to 15 kV.
  • the electrospinning solution is carried out under the conditions of the spinning speed and the voltage, it is possible to form a nanofiber having a stable structure with a constant diameter and no formation of beads.
  • the nanofiber mat may be formed by accumulating the nanofibers formed through the electrospinning process.
  • the integration of the nanofibers may be performed simultaneously by using a drum integrated plate in the electrospinning process.
  • the electrospinning process includes performing a heat treatment on the nanofibers.
  • the nanofiber mat is crosslinked by treating with hydrochloric acid vapor, and the nanofiber mat treated with hydrochloric acid vapor is crystallized by treating with dimethylformaldehyde to prepare a polyvinyl alcohol nanofiber structure for cell culture.
  • the hydrochloric acid vapor treatment may be performed by adding nanofiber mat and hydrochloric acid (HCl) to a vacuum desiccator and treating the nanofiber mat with hydrochloric acid vapor in a vacuum state for 60 seconds to 120 seconds.
  • PVA and PAA of the nanofiber mat may be crosslinked by the hydrochloric acid vapor treatment.
  • the process to crystallize can be carried out by treating with DMF solvent and then drying it.
  • DMF solvent treatment can be carried out by treatment for 20 seconds to 1 minute.
  • PVA is crystallized by DMF solvent treatment, thereby improving water resistance. Therefore, after the crystallization step, the crystallized nanofiber mat exhibits a property that does not gel even after distilled water treatment, and at the same time maintains the transparency of PVA and PAA itself.
  • the cells may be cultured by attaching two or more different cells to each of both sides of the crystallized nanofiber mat.
  • the PVA / PAA / GA nanofiber mat according to the present invention can be easily attached to cells even when performing DMF solvent treatment, and thus can be suitably used for cell culture. In the case of PVA / GA nanofiber mat, the cell adhesion is very low and it is very difficult to use for cell culture.
  • Nanofiber mat was prepared by electrospinning using the electrospinning solution (PVA / PAA / GA solution) prepared above. 2 mL of electrospinning solution (PVA / PAA / GA solution) was electrospun at 10 kV using a 27G metal syringe with a spinning distance of 10 cm at a spin rate of 8 ⁇ l / min. The nanofibers prepared by electrospinning were heat-treated at 60 ° C. for 40 seconds.
  • nanofibers and hydrochloric acid (HCl) were added to a vacuum desiccator for the catalytic reaction of crosslinking, and treated with hydrochloric acid vapor under vacuum for 60 to 120 seconds. Subsequently, the nanofibers treated with hydrochloric acid vapor were treated with dimethylformaldehyde (DMF) solution for 30 seconds and then dried.
  • DMF dimethylformaldehyde
  • the electrospinning process was a solution in which PVA and GA were dissolved in distilled water at room temperature, and GA used 2% (V / V).
  • a PVA solution and a PVA / PAA solution were prepared.
  • the PVA solution is a solution obtained by mixing PVA in distilled water at 10% (w / v) for 2 to 3 hours at 80 °C
  • PVA / PAA solution is 10% (w / v) PVA in distilled water
  • PAA was 0.2% (w / v)
  • a solution obtained by dissolving at 80 ° C. for 2 to 3 hours was used.
  • Each of the PVA solution and the PVA / PAA solution was subjected to an electrospinning process and a DMF solvent treatment process in the method of manufacturing the nanofiber mat according to Example 1, thereby preparing nanofiber mat according to Comparative Examples 1-b and Comparative Example 2. .
  • Nanofiber mat immediately after the electrospinning step without the hydrochloric acid vapor treatment step and the solvent treatment step in the step of manufacturing the nanofiber mat according to Example 1, Comparative Examples 1-a, 1-b and 2 described above Were prepared, and each was photographed with a nanofiber mat using a scanning electron microscopy (SEM). Subsequently, each of the nanofiber mats was treated with distilled water and then nanofiber mat images were taken using an electron microscope. The result is shown in FIG.
  • JSM-6700F (trade name, JEOL, Japan) was used as a scanning electron microscope after the nanofibers were coated with platinum.
  • 1 is a view showing scanning electron microscope images for explaining the water resistance of the nanofiber mat immediately after the electrospinning process for each electrospinning solution.
  • the PVA solution, the PVA / PAA solution, the PVA / GA solution, and the PVA / PAA / GA solution are used as the electrospinning solution from the top to the bottom, and "before” is an electron microscope image after the preparation of the nanofiber mat. "After” are electron microscope images after treatment of distilled water.
  • nanofibers are formed by forming nanofibers having a constant diameter without forming beads through an electrospinning process, as can be seen through "before" images.
  • the nanofibers of the nanofiber mat prepared using the PVA solution or the PVA / PAA solution without GA were dissolved in distilled water, It can be seen that it disappears and changes to a gel state.
  • the nanofiber structure is maintained to some extent to electrospin the PVA solution or PVA / PAA solution. It can be confirmed that the water resistance is higher than the prepared nanofibers.
  • the nanofiber mat immediately after the electrospinning process was treated with ethanol, chloroform, dichloromethane and dimethylformaldehyde solution for 30 seconds and then dried. After drying, the image was observed with a scanning electron microscope, and the result is shown in FIG. 2.
  • FIG. 2 is a view showing scanning electron microscope images showing the nanofiber structure of the nanofiber mat after the solvent type treatment process.
  • the nanofiber structure has a constant diameter and no beads are formed as shown in the image corresponding to “None”.
  • the nanofibers dissolve rather than during the solvent treatment process, indicating that the diameter of the nanofibers increased and changed irregularly.
  • the diameter of the nanofibers is maintained relatively intact, and the size of the pores formed by the nanofibers can be seen to be constant. That is, it can be seen that dimethylformaldehyde can be suitably used as a solvent for increasing the crosslinking of PVA / PAA nanofibers formed using the PVA / PAA solution.
  • Example 3 is a scanning electron microscope image showing a nanofiber structure after treatment of distilled water for the nanofiber mat prepared according to Example 1, Comparative Examples 1-a, 1-b and 2.
  • None is a nanofiber structure immediately after performing the electrospinning process
  • DMF treatment is a nanofiber structure of the nanofiber mat finally prepared according to the embodiments and comparative examples of the present invention
  • DMF & water treatment are images showing the nanofiber structure of the resulting distilled water treatment.
  • 3 shows a nanofiber mat prepared according to Comparative Example 1-b, Comparative Example 2, Comparative Example 1-a, and Example 1 from above.
  • the nanofiber structure made of the electrospinning solution containing PVA as shown in “None” is stably manufactured without a bead having a constant diameter.
  • DMF treatment all of the nanofiber mats prepared according to Example 1, Comparative Examples 1-a, 1-b and 2 are not dissolved by the DMF treatment and the diameter of the nanofibers is kept relatively intact. It can be seen that the size of the pores formed by the nanofibers also appears to be constant.
  • Comparative Example 1-a can be confirmed that the water resistance is higher than Comparative Examples 1-b or 2
  • the nanofiber mat prepared according to Example 1 of the present invention further comprises PAA and GA
  • the hydrochloric acid vapor treatment process it can be directly confirmed that the water resistance is remarkably good as compared with the nanofiber mat prepared according to Comparative Examples 1-a, 1-b and 2.
  • FIG. 4 is a view showing experimental results for explaining the effects of the hydrochloric acid vapor treatment process and DMF treatment process.
  • the nanofiber mat formed by electrospinning the PVA solution, the PVA / PAA solution, the PVA / GA solution, and the PVA / PAA / GA solution respectively, when the nanofiber mat was used as is (None) and hydrochloric acid vapor treatment was performed (HCl vapor), the DMF solvent treatment process (DMF) and the hydrochloric acid vapor treatment process and the DMF solvent treatment process (HCl vapor, DMF) after the samples are prepared, they are attached to an 8-well culture plate Distilled water was added and left for 4 hours. Then, transparency was evaluated through the degree to which the character described on the lower surface was seen. The result is shown in FIG.
  • 5 is a view showing pictures for explaining the results of the transparency evaluation for each nanofiber mat.
  • PAA and GA in the lower end of Figure 5 in PVA, PAA and GA "+” means that the corresponding component is included, “-" means that the corresponding component is not included, PVA is "+” and PAA and GA are respectively " -"Indicates nanofiber mat made of PVA solution, and PVA and PAA are both” + “and GA”-”indicates nanofiber mat made of PVA / PAA solution.
  • the PVA / PAA nanofiber mat prepared using the PVA / PAA solution may be regarded as having increased water resistance compared to the case where no treatment is performed through maintaining the translucent state in the case of hydrochloric acid vapor treatment.
  • the PVA / GA nanofiber mat formed from the PVA / GA solution or the PVA / PAA / GA nanofiber mat formed from the PVA / PAA / GA solution is relatively transparent compared to the case of hydrochloric acid vapor treatment and / or DMF solvent treatment. Since it indicates that the increase in water resistance is low compared to these.
  • PVA nanofiber mat, PVA / PAA nanofiber mat, PVA / GA nanofiber mat and PVA which are nanofiber mats formed by electrospinning PVA solution, PVA / PAA solution, PVA / GA solution and PVA / PAA / GA solution, respectively
  • FT-IR Fourier-transform infrared
  • FIG. 6 is a diagram showing an infrared spectroscopy spectrum before the DMF solvent treatment process of the nanofiber mat
  • Figure 7 is a diagram showing the infrared spectroscopy spectrum before / after the DMF solvent treatment of the PVA / PAA / GA nanofiber mat.
  • the PVA characteristic absorption peak appears in the wavelength range 3100 ⁇ 3650 cm -1 , 2800 ⁇ 2900 cm -1 , 1600 ⁇ 1750 cm -1 and 1000 ⁇ 1100 cm -1 .
  • Peak I region 3100-3650 cm -1 peaks (parts marked as Peak I region) are PVA / GA nanofiber mats treated with GA and hydrochloric acid vapor or PVA nanofibers without PGA / PAA / GA nanofiber mats. It can be seen that the height of the peak is lower than that of the mat or the PVA / PAA nanofiber mat.
  • the peak I region is associated with the stretching vibration of the hydroxyl group showing hydrogen bonds, and the peak intensity decreases as the crosslinking of the hydroxyl group of PVA and CHO group of GA proceeds. Is the result.
  • the peak appearing at 1000-1100 cm -1 which is a portion indicated by the Peak II region in FIG. 6, is PVA / GA nanofiber mat or PVA / PAA / GA nanofiber mat with GA added and hydrochloric acid vapor treatment. It can be seen that the PVA nanofiber mat or PVA / PAA nanofiber mat without added GA appears wider. This can be seen that the increase in the area indicated by the Peak II region appears as the addition of GA and the increase in OCO crosslinking by hydrochloric acid vapor treatment.
  • Fibroblasts and colorectal cancer cells were cultured in a cell culture maintained at 5% CO 2 in a culture medium containing 10% FBS 100 IU / mL penicillin and 100 ⁇ g / mL streptomycin in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) medium, respectively.
  • the culture was also used for cell culture on the nanofiber mat. The result is shown in FIG.
  • FIG. 8 is a view showing pictures for explaining the results of the cell adhesion evaluation for the nanofiber mat prepared according to Comparative Example 2, referring to Figure 8 cells do not adhere to the surface of the nanofibers are attached to the cells Cell aggregation appeared until culture for 3 days. That is, in the nanofiber mat prepared according to Comparative Example 2, even if the water resistance can be improved to some extent by treatment with the DMF solvent, it can be confirmed that the cell adhesion ability is very bad and cannot be used as the nanofiber mat for cell culture.
  • the nanofiber mat was removed from the coring costa transwell assay chamber in order to attach two different cells to each side of the nanofiber mat. And attached.
  • FIG. 9 is a view for explaining a process for manufacturing a cell culture nanofiber mat using a nanofiber mat prepared according to Example 1 of the present invention, a nanofiber mat attached to the chamber as shown in FIG.
  • 5 ⁇ 10 4 cells stained with red fluorescence of PKH26 were placed on the bottom layer of the nanofibers and incubated for 4 hours.
  • the upper layer of the nanofibers was attached with 5 ⁇ 10 4 NIH3T3 fibroblasts stained with green fluorescence of PKH67.
  • 10 to 13 are photographs for explaining the results of the cell adhesion evaluation in the nanofiber mat prepared according to the process of FIG.
  • FIG. 10 is a result of measuring the upper surface with an optical microscope.
  • cancer cells and fibroblasts are attached to both surfaces of the nanofiber mat, so that two kinds of cells can be observed simultaneously on an optical microscope.
  • Fibroblasts showed some cell aggregation, but cancer cells were shown to adhere well as indicated by the arrow of FIG. 10.
  • FIG. 11 is a result of measuring the bottom surface with a fluorescence microscope. Referring to FIG. 11, two types of cells were stained with different fluorescence by confocal microscopy and simultaneously observed on the bottom surface of the nanofibers.
  • FIG. 12 is a result of culturing for 24 hours with different kinds of cells attached to the lower layer / upper layer of nanofibers and observing with a confocal microscope and analyzing with Z-stack. Referring to FIG. 12, two kinds of cells are simultaneously observed. The positions of these cells appeared to overlap.
  • FIG. 13 is a result of observing whether or not cells are attached to nanofibers.
  • the cells and nanofiber samples attached to each surface are fixed for electron microscopy and divided into two surfaces. When observed under an electron microscope, cancer cells and fibroblasts were attached.

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Abstract

본 발명에 따른 세포 배양용 폴리비닐 알코올 나노섬유 구조체의 제조 방법은 폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohol), 폴리아크릴산(polyacrylic acid) 및 글루타르알데히드(glutaraldehyde)를 포함하는 전기방사 용액을 전기방사 하여 나노섬유매트를 형성하는 단계, 나노섬유매트에 대해서 염산 증기 처리하여 가교시키는 단계 및 염산 증기 처리된 나노섬유매트에 대해서 디메틸포름알데히드 용매 처리하여 결정화시키는 단계를 포함한다.

Description

세포 배양용 폴리비닐 알코올 나노섬유 구조체의 제조 방법
본 발명은 세포 배양용 폴리비닐 알코올 나노섬유 구조체의 제조 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 소정의 투명성은 확보하면서도 내수성을 향상시킬 수 있는 세포 배양용 폴리비닐알콜 나노섬유 구조체의 제조 방법에 관한 것이다.
폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohol, PVA)은 높은 친수성, 투과성, 생체적합성, 생분해성을 가지는 장점이 있지만, 물에 대한 용해도가 높아서 세포배양용 소재로 이용되는데 한계가 있다. PVA를 이용하여 나노섬유를 만드는 경우, PVA의 가수분해 정도를 나타내는 검화도(degree of saponification, DS)가 99.8% 이하이면 PVA에 존재하는 아세테이트 그룹에 의해 고분자 사슬 간의 수소 결합이 방해되어 그 부분에 물이 쉽게 침투하게 됨으로써 PVA 섬유의 내수성이 저하되는 문제가 있다.
일반적으로 시판되는 PVA의 검화도는 대부분 99.8% 미만의 것이어서, 시판되는 PVA를 이용하여 나노섬유를 제조한 경우 나노섬유가 쉽게 물에 녹는다. PVA로 만들어진 나노섬유의 내수성을 증가시키기 위해서 PVA를 가교(cross-linkage)를 시키기도 하는데, 가교의 대표적인 방법으로는 열처리나 결정화를 이용한 물리적 가교법과 가교제를 이용하는 화학적 가교법이 있다(한국등록특허 제10-0703607호, 제10-0841463호, 제10-0835082호 참조). 다만, 가교된 PVA의 경우, 가교되지 않은 PVA와 다르게 결정화도가 변화하면서 광학적으로 투과도가 감소하게 된다.
가교법 이외에 PVA 나노섬유의 내수성 향상을 위한 다른 방법으로서, 한국등록특허 제10-1413095호에서는, 수용성 용액에 PVA 수용액과 글리옥살을 첨가하는 방법이 개시되어 있다. 이때 상기 수용성 용액은 천연 단백질 수용성 용액 및/또는 저분자화된 키토산 수용성 용액을 이용하고, 이를 전기 방사함으로써 수불용성이면서도 투명한 나노섬유 멤브레인을 제조할 수 있다고 개시하고 있다.
또한, 폴리아크릴산(polyacrylic acid, 이하 PAA)은 구조상 카르복시기를 포함하고 있어, PAA를 이용하여 PVA의 하이드록실기와 결합함으로써 결과적으로 PVA가 가교 구조를 가지게 되고 이에 따라 수용액에서의 용해도를 낮출 수 있다. Destaye et al.(ACS Appl Mater Interfaces, Vol. 5, 4745-4752, 2013)은 글루타르알데히드(glutaraldehyde, 이하 GA)의 알데히드기와 PVA의 하이드록실기 사이의 분자간 아세탈 연결에 의하여 가교화가 이루어진다고 보고한 바 있다. 가교화에 의해서 감소된 하이드록실기의 수에 의해서 PVA는 수용액에서 용해도가 낮아질 수 있다.
한편, PVA의 결정화도가 0이나 1인 경우에는 PVA는 투명성을 가지지만, PVA의 가교에 의해서 0 내지 1의 사이 값을 가지게 되면 광산란에 의해 투명도가 낮아지게 된다. 즉, PVA의 가교를 통해서 내수성을 향상시킬 수 있는 반대 효과로 인해서 투명도가 낮아지게 되고, 이러한 PVA 나노섬유를 세포배양용 매트에 이용하는 경우에, 세포배양을 용이하게 관찰할 수 없는 단점이 있다.
이러한 이유로, 바이오 분야에서는 재료 자체의 투명성은 그대로 유지하면서 내수성을 향상시킬 수 있는 PVA 나노섬유매트를 제조하는 기술이 필요하다.
본 발명의 일 목적은 소정의 투명성은 확보하면서도 내수성이 향상된 세포 배양용 폴리비닐 알코올 나노섬유 구조체의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 목적을 위한 세포 배양용 폴리비닐 알코올 나노섬유 구조체의 제조 방법은 폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohol), 폴리아크릴산(polyacrylic acid) 및 글루타르알데히드(glutaraldehyde)를 포함하는 전기방사 용액을 전기방사하여 나노섬유매트를 형성하는 단계, 상기 나노섬유매트에 대해서 염산 증기 처리하여 가교시키는 단계 및 염산 증기 처리된 나노섬유매트에 대해서 디메틸포름알데히드 용매 처리하여 결정화시키는 단계를 포함한다.
일 실시예에서, 상기 나노섬유매트를 형성하는 단계는 상기 전기방사 용액을 5 내지 10 ㎕/분의 방사속도로 금속 주사기를 사용하여 10 내지 15 kV 상태에서 전기방사 하여 나노섬유를 형성하는 단계 및 상기 나노섬유매트에 대해서 열처리를 수행하는 단계를 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 가교시키는 단계는 진공데시케이터에 나노섬유매트와 염산(HCl)을 넣고 60초 내지 120초 동안 진공 상태에서 염산 증기로 나노섬유매트를 처리할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 결정화시키는 단계는 디메틸포름알데히드 용매로 20초 내지 1분간 처리하는 단계 및 건조시키는 단계를 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 결정화시키는 단계 이후에, 결정화된 나노섬유매트를 증류수 처리하여도 겔화되지 않는 것을 특징으로 한다.
일 실시예에서, 상기 제조 방법은 상기 결정화시키는 단계 이후에, 결정화된 나노섬유매트 양면 각각에 서로 다른 2종 이상의 세포들을 부착시켜 배양시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기에서 설명한 본 발명의 세포 배양용 폴리비닐 알코올 나노섬유 구조체의 제조 방법에 따르면, 세포배양 상태를 관찰할 수 있는 정도의 투명성은 확보하면서도 내수성이 향상된 나노섬유 구조체를 제조할 수 있다. 특히, 이러한 방법을 통해서 제조된 나노섬유 구조체는 양면에 각각 서로 다른 종류의 세포를 부착시켜 배양하면서 현미경을 통해서 실시간으로 세포의 상태를 확인할 수 있는 장점이 있다.
도 1은 전기방사 용액별 전기방사 공정 직후의 나노섬유매트의 내수성을 설명하기 위한 주사전자현미경 이미지들을 나타낸 도면이다.
도 2는 용매 종류별 용매 처리 공정 후의 나노섬유매트의 나노섬유 구조를 나타낸 주사전자현미경 이미지들을 나타낸 도면이다.
도 3은 실시예 1, 비교예 1-a, 1-b 및 2에 따라 제조된 나노섬유매트에 대해서 증류수를 처리한 후의 나노섬유 구조를 나타낸 주사전자현미경 이미지들을 나타낸 도면이다.
도 4는 염산 증기처리 공정과 DMF 처리 공정에 의한 영향을 설명하기 위한 실험 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 나노섬유매트 별 투명성 평가 결과를 설명하기 위한 사진들을 도시한 도면이다.
도 6은 나노섬유매트들의 DMF 용매 처리 공정 전의 적외선 분광스펙트럼을 나타낸 도면이다.
도 7은 PVA/PAA/GA 나노섬유매트의 DMF 용매 처리 공정 전/후의 적외선 분광스펙트럼을 나타낸 도면이다.
도 8은 비교예 2에 따라 제조된 나노섬유매트에 대한 세포 부착성 평가 결과를 설명하기 위한 사진들을 도시한 도면이다.
도 9는 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 나노섬유매트를 이용하여 세포배양용 나노섬유매트를 제작하는 공정을 설명하기 위한 도면이다.
도 10 내지 도 13은 도 9의 공정에 따라 제조된 나노섬유매트에서의 세포 부착성 평가 결과를 설명하기 위한 사진들을 도시한 도면들이다.
이하, 본 발명의 실시예에 대해 상세히 설명한다. 본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 본문에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시 예를 설명하기 위해 사용된 것으로서 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
나노섬유매트의 제조방법
본 발명에 따른 나노섬유매트의 제조방법에서, 먼저 폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohol), 폴리아크릴산(polyacrylic acid) 및 글루타르알데히드(glutaraldehyde)를 포함하는 전기방사 용액을 전기방사 하여 나노섬유매트를 형성한다.
상기 전기방사 용액은 용매를 증류수로 하여 폴리비닐 알코올과 글루타르알데히드를 포함한다.
전기방사 공정은, 상기 전기방사 용액을 5 내지 10 ㎕/분의 방사속도로 금속 주사기를 사용하여 전기방사 하여 나노섬유를 형성할 수 있다. 이때, 전기방사 공정의 전압 조건은 10 내지 15 kV일 수 있다. 상기 전기방사 용액을 상기 방사속도 및 전압 조건에서 수행하는 경우, 직경이 일정하고 비드의 형성이 없는 안정적인 구조의 나노섬유를 형성할 수 있다. 이때, 전기방사 공정을 통해서 형성된 나노섬유를 집적함으로써 나노섬유매트를 형성할 수 있다. 상기 나노섬유의 집적은 전기방사 공정에서 드럼 집적판을 이용함으로써 동시에 수행할 수 있다. 전기방사 공정은 나노섬유에 대해서 열처리를 수행하는 단계를 포함한다.
상기와 같은 전기방사 공정을 통해서, PVA/PAA/GA 나노섬유매트를 제조할 수 있다.
이어서, 상기 나노섬유매트에 대해서 염산 증기로 처리하여 가교시키고, 염산 증기로 처리된 나노섬유매트에 대해서 디메틸포름알데히드 용매 처리하여 결정화시킴으로써 세포 배양용 폴리비닐 알코올 나노섬유 구조체를 제조한다.
상기 염산 증기 처리는 진공데시케이터에 나노섬유매트와 염산(HCl)을 넣고 60초 내지 120초 동안 진공 상태에서 염산 증기로 나노섬유매트를 처리함으로써 수행할 수 있다. 상기 염산 증기 처리에 의해서 나노섬유매트의 PVA 및 PAA가 가교될 수 있다.
결정화되는 공정은 DMF 용매 처리를 한 후에 이를 건조시킴으로써 수행할 수 있다. DMF 용매 처리는 20초 내지 1분간 처리하여 수행할 수 있다. DMF 용매 처리에 의해서 PVA가 결정화됨으로써 내수성이 향상될 수 있다. 이에 따라, 상기 결정화시키는 단계 이후에, 결정화된 나노섬유매트를 증류수 처리하여도 겔화되지 않는 특성을 나타내고, 동시에 PVA 및 PAA 자체의 투명성도 그대로 유지하게 된다.
상기 결정화시키는 단계 이후에, 결정화된 나노섬유매트 양면 각각에 서로 다른 2종 이상의 세포들을 부착시켜 세포를 배양시킬 수 있다. 본 발명에 따른 PVA/PAA/GA 나노섬유매트는 DMF 용매 처리를 수행하더라도 세포가 용이하게 부착될 수 있어, 세포 배양용으로 적합하게 이용될 수 있다. PVA/GA 나노섬유매트의 경우에는 세포 부착성이 매우 낮아 세포 배양용으로 이용하기 매우 어렵다.
이하에는, 구체적인 실시예 및 실험들을 통해서 본 발명에 대해서 보다 구체적으로 설명하기로 한다.
실시예 1
폴리비닐알코올(PVA, Mw=89,000~98,000 99+% hydrolyzed, Sigma), 폴리아크릴산(PAA, Mw=2000, Sigma) 및 용매로서 증류수를 이용하여 전기방사 용액을 제조하였다. 이때, PVA는 증류수에 10%(w/v)로, PAA는 0.2%(w/v)로 하여 이들을 혼합하였고, 80℃에서 2 내지 3시간 동안 용해하였다. 완전히 용해된 PVA 용액을 실온에서 식힌 후 글루타르알데히드(glutaraldehyde)를 2%(V/V) 첨가하여 24 시간동안 방치한 후 전기방사 용액(PVA/PAA/GA 용액)을 얻었다.
상기에서 준비된 전기방사 용액(PVA/PAA/GA 용액)을 이용하여 전기방사하여 나노섬유매트를 제조하였다. 전기방사 용액(PVA/PAA/GA 용액) 2 mL를 8 ㎕/분의 방사속도로 10 cm의 방사거리를 두고 27G 금속 주사기를 사용하여 10 kV 상태에서 전기방사하였다. 전기방사로 제조된 나노섬유에 대해서 60℃에서 40초간 열처리하였다.
열처리된 나노섬유에 대해서, 가교화의 촉매 반응을 위하여 진공데시케이터에 나노섬유와 염산(HCl)을 넣고 60초 내지 120초 동안 진공 상태에서 염산 증기로 처리하였다. 이어서, 염산 증기 처리된 나노섬유에 대해서 디메틸포름알데히드 (dimethylformaldehyde, DMF) 용액으로 30초간 처리한 후, 건조시켰다.
비교예 1-α
전기방사 용액으로 PVA/GA 용액을 이용한 것을 제외하고는 실시예 1에 따라 나노섬유매트를 제조하는 방법과 실질적으로 동일하게 전기방사 공정, 염산 증기 처리 공정 및 용매 처리 공정을 수행하여 비교예 1-a에 따라 나노섬유매트를 제조하였다. 이때, PVA/GA 용액은 PVA와 GA를 실온에서 증류수에 용해시킨 용액으로서, GA는 2%(V/V)를 이용하였다.
비교예 1-β 및 2
비교예 1-b 및 2에 따라 나노섬유매트를 제조하기 위한 전기방사 용액으로서, PVA 용액 및 PVA/PAA 용액을 준비하였다. 이때, PVA 용액은 PVA를 증류수에 10%(w/v)로 혼합한 후 80℃에서 2 내지 3시간 동안 용해시킴으로써 얻은 용액이고, PVA/PAA 용액은 PVA를 증류수에 10%(w/v)로, PAA는 0.2%(w/v)로 하여 이들을 혼합한 후 80℃에서 2 내지 3시간 동안 용해시킴으로써 얻은 용액을 이용하였다.
PVA 용액 및 PVA/PAA 용액 각각을 실시예 1에 따라 나노섬유매트를 제조하는 방법 중의 전기방사 공정 및 DMF 용매 처리 공정을 수행하여 비교예 1-b 및 비교예 2에 따른 나노섬유매트를 제조하였다.
실험 1: 전기방사 공정 직후의 나노섬유매트의 내수성 평가
상기에서 설명한 실시예 1, 비교예 1-a, 1-b 및 2에 따라 나노섬유매트를 제조하는 공정 중에서 염산 증기 처리 공정 및 용매 처리 공정을 생략하고 전기방사 공정을 수행한 직후의 나노섬유매트를 준비하였고, 각각에 대해 주사전자현미경(scanning electron microscopy, SEM)을 이용하여 나노섬유매트 이미지를 촬영하였다. 이어서, 나노섬유매트 각각에 대해 증류수를 이용하여 처리한 후 전자현미경을 이용하여 나노섬유매트 이미지를 촬영하였다. 그 결과를 도 1에 나타낸다.
전자현미경을 이용한 관찰을 위해서, 나노섬유를 백금코팅한 후 주사전자현미경으로 JSM-6700F(상품명, JEOL사, 일본)를 사용하였다.
도 1은 전기방사 용액별 전기방사 공정 직후의 나노섬유매트의 내수성을 설명하기 위한 주사전자현미경 이미지들을 나타낸 도면이다.
도 1에서, 위에서부터 아래로 전기방사 용액으로서 PVA 용액, PVA/PAA 용액, PVA/GA 용액 및 PVA/PAA/GA 용액을 이용한 경우이며, "before"는 나노섬유매트를 제조한 후의 전자현미경 이미지들이고, "after"는 증류수를 처리한 후의 전자현미경 이미지들이다.
도 1을 참조하면, "before" 이미지들을 통해서 확인할 수 있듯이 전기방사 공정을 통해서 비드가 생성되지 않고 직경이 일정한 나노섬유들이 형성되어 나노섬유매트를 구성하는 것을 확인할 수 있다.
여기에 증류수 처리를 한 경우에, "after"이미지에서 나타나는 바와 같이, GA를 이용하지 않은 PVA 용액이나 PVA/PAA 용액을 이용하여 제조된 나노섬유매트의 나노섬유들은 증류수에 용해되어 나노섬유 구조가 없어지고 겔 상태로 변화하는 것을 확인할 수 있다. 반면, GA를 포함하는 PVA/GA 용액이나 PVA/PAA/GA 용액을 이용한 경우에는 일부가 증류수에 용해되기는 하지만, 나노섬유 구조는 어느 정도 유지한 상태로 PVA 용액이나 PVA/PAA 용액을 전기방사하여 제조한 나노섬유에 비해서 내수성이 높은 것을 확인할 수 있다.
실험 2: 용매 처리 공정에서의 용매 선택
전기방사 용액으로 PVA/PAA 용액을 이용하여 전기방사 공정을 수행한 후, 전기방사 공정 직후의 나노섬유매트에 대해서 에탄올, 클로로포름, 디클로로메탄 및 디메틸포름알데히드 용액으로 30초간 처리한 후 건조시켰다. 건조시킨 후에 주사전자현미경으로 이미지를 관찰하였고, 그 결과를 도 2에 나타낸다.
도 2는 용매 종류별 처리 공정 후의 나노섬유매트의 나노섬유 구조를 나타낸 주사전자현미경 이미지들을 나타낸 도면이다.
도 2를 참조하면, PVA/PAA 용액을 이용하여 전기방사 공정을 수행한 직후에는 "None"에 해당하는 이미지와 같이 직경이 일정하고 비드도 형성되지 않은 나노섬유 구조를 가지는 것을 확인할 수 있다. 하지만, 이 나노섬유 구조에 클로로포름, 에탄올 및 디클로로메탄을 처리한 경우에는 용매 처리 공정 중에서 오히려 나노섬유가 녹는 효과가 나타나서 나노섬유의 직경이 증가하고 불규칙하게 변화한 것을 알 수 있다. 반면, 디메틸포름알데히드 용액을 이용한 경우에는 나노섬유의 직경이 비교적 그대로 유지되며 나노섬유에 의해 형성되는 공극의 크기도 일정하게 나타나는 것을 확인할 수 있다. 즉, PVA/PAA 용액을 이용하여 형성된 PVA/PAA 나노섬유의 가교화를 증가시키는 용매로서 디메틸포름알데히드를 적합하게 이용할 수 있음을 확인할 수 있다.
실험 3: DMF 처리에 의한 내수성 평가
상기 실시예 1, 비교예 1-a, 1-b 및 2에 따라 나노섬유매트를 각각 준비하는 과정에서, 전기방사 공정 직후의 나노섬유 구조를 각각 주사전자현미경을 이용하여 관찰하였다. 또한, 상기 실시예 1, 비교예 1-a, 1-b 및 2에 따라 제조된 나노섬유매트 각각에 대해서 주사전자현미경을 이용하여 관찰하였다. 그 결과를 도 3에 나타낸다.
나아가, 상기 실시예 1, 비교예 1-a, 1-b 및 2에 따라 제조된 나노섬유매트 각각에 대해서 증류수를 처리한 후의 나노섬유 구조를 주사전자현미경을 이용하여 관찰하였고, 그 결과를 도 3에 나타낸다.
도 3은 실시예 1, 비교예 1-a, 1-b 및 2에 따라 제조된 나노섬유매트에 대해서 증류수를 처리한 후의 나노섬유 구조를 나타낸 주사전자현미경 이미지들을 나타낸 도면이다.
도 3에서, "None"은 전기방사 공정을 수행한 직후의 나노섬유 구조이고, "DMF treatment"가 본 발명의 실시예들 및 비교예들에 따라 최종적으로 제조된 나노섬유매트의 나노섬유 구조이며, "DMF & water treatment"는 이에 대해서 증류수를 처리한 결과의 나노섬유 구조를 나타내는 이미지들이다. 도 3에서 위에서부터 비교예 1-b, 비교예 2, 비교예 1-a 및 실시예 1에 따라 제조된 나노섬유매트를 나타낸다.
도 3을 참조하면, "None"에서 보는 바와 같이 PVA를 포함하는 전기방사 용액으로 제조된 나노섬유 구조는 직경이 일정하고 비드가 없이 안정적으로 제조된 것을 확인할 수 있다. 또한, "DMF treatment"에서 보는 바와 같이, 실시예 1, 비교예 1-a, 1-b 및 2에 따라 제조된 나노섬유매트 모두 DMF 처리에 의해서 용해되지 않고 나노섬유의 직경이 비교적 그대로 유지되며 나노섬유에 의해 형성되는 공극의 크기도 일정하게 나타나는 것을 확인할 수 있다.
하지만, 비교예 1-b 및 2에 따라 제조된 나노섬유매트의 경우에는 증류수 처리 후에 증류수에 용해되어 겔화되어 나노섬유 구조가 없어진 것을 확인할 수 있다. 반면, 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 나노섬유매트의 경우에는 증류수 처리를 하더라도 증류수에 의해 용해되지 않고 나노섬유 구조를 그대로 유지하고 있는 것을 확인할 수 있다. 비교예 1-a의 경우에도 비교예 1-b나 2에 비해서는 내수성이 높은 것을 확인할 수 있으나, 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 나노섬유매트의 경우에는 PAA 및 GA를 더 포함하고, 염산 증기 처리 공정을 더 수행함으로써 비교예 1-a, 1-b 및 2에 따라 제조된 나노섬유매트에 비해서 내수성이 현저하게 좋은 것을 직접 확인할 수 있다.
실험 4: 염산 증기 처리 공정 및 ΔΝΖ 처리 공정에 의한 내수성 평가
전기방사 용액으로 PVA/PAA/GA 용액을 이용하여 전기방사 공정을 수행한 후, ① 염산 증기 처리 및 DMF 처리 공정이 모두 수행되지 않은 경우, ② 염산 증기 처리 공정을 수행되지 않고, DMF 처리 공정만을 수행한 경우, ③ 염산 증기 처리를 수행하되 DMF 처리 공정은 수행하지 않은 경우, 그리고 ④ 염산 증기 처리 및 DMF 처리 공정을 모두 수행한 경우 각각에 대해서, 증류수를 처리하고 건조시킨 결과를 주사전자현미경으로 관찰하였다. 그 결과를 도 4에 나타낸다.
도 4는 염산 증기처리 공정과 DMF 처리 공정에 의한 영향을 설명하기 위한 실험 결과를 나타낸 도면이다.
도 4를 참조하면, 염산 증기 처리를 수행하지 않은 경우(①, ②)에는 모두 증류수에 녹아서 나노섬유 구조가 없어진 것을 확인할 수 있고, 염산 증기 처리를 수행한 경우(③, ④)에는 증류수 처리를 하더라도 나노섬유 구조가 유지되는 것을 확인할 수 있다. 특히, 염산 증기 처리를 동일하게 수행한 경우라 하더라도, DMF 처리를 수행한 경우(④)가 수행하지 않은 경우(③)에 비해서 현저하게 나노섬유 구조를 그대로 유지하고 있는 것을 확인할 수 있다. 즉, 본 발명에서와 같이 염산 증기 처리 및 DMF 용액 처리를 모두 수행함으로써 내수성이 현저하게 증가한 것을 확인할 수 있다.
실험 5: 투명성 평가
PVA 용액, PVA/PAA 용액, PVA/GA 용액 및 PVA/PAA/GA 용액 각각을 전기방사 하여 형성한 나노섬유매트에 있어서, 나노섬유매트 그대로(None), 염산 증기 처리 공정을 수행한 경우(HCl vapor), DMF 용매 처리 공정을 수행한 경우(DMF) 및 염산 증기 처리 공정과 DMF 용매 처리 공정을 모두 수행한 경우(HCl vapor, DMF)의 샘플들을 준비한 후, 이들을 8웰 배양 플레이트에 부착시킨 후 증류수를 넣고 4 시간 동안 방치하였다. 그 후에 아랫면에 기재된 문자가 보이는 정도를 통해서 투명성을 평가하였다. 그 결과를 도 5에 나타낸다.
도 5는 나노섬유매트 별 투명성 평가 결과를 설명하기 위한 사진들을 도시한 도면이다.
도 5의 하단부에 PVA, PAA 및 GA에서 "+"는 해당 성분이 포함된 것을 의미하며, "-"는 해당 성분이 포함되지 않은 것을 의미하며, PVA가 "+"이고 PAA 및 GA가 각각 "-"인 경우가 PVA 용액으로 만들어진 나노섬유매트를 나타내며, PVA와 PAA가 모두 "+"이고 GA가 "-"인 경우가 PVA/PAA 용액으로 만들어진 나노섬유매트를 나타낸다.
도 5를 참조하면, PVA 용액으로 제조된 PVA 나노섬유매트의 경우에는 염산 증기 처리 및/또는 DMF 용매 처리를 하더라도 증류수 처리한 후에 하부에 표시된 문자가 명확하게 보이도록 투명하게 변화한 것을 확인할 수 있고, 이를 통해서 내수성이 낮아 증류수에 녹아 겔 상태가 됨을 알 수 있다.
PVA/PAA 용액을 이용하여 제조한 PVA/PAA 나노섬유매트는, 염산 증기 처리한 경우 반투명 상태를 유지하고 있는 것을 통해서 아무런 처리를 하지 않은 경우에 비해서 내수성이 증가한 것으로 볼 수 있다. 다만, PVA/GA 용액으로 형성된 PVA/GA 나노섬유매트 또는 PVA/PAA/GA 용액으로 형성된 PVA/PAA/GA 나노섬유매트를 염산 증기 처리 및/또는 DMF 용매 처리한 경우에 비해서는 상대적으로 투명한 상태를 나타내므로 이들에 비해서는 내수성 증가 정도가 낮은 것으로 볼 수 있다.
PVA/GA 나노섬유매트나 PVA/PAA/GA 나노섬유매트를 염산 증기 처리 및/또는 DMF 용매 처리한 경우에는 반투명 상태를 그대로 유지하는 것을 통해서 나노섬유매트의 형태가 증류수에 의해서 변형되지 않은 것을 확인할 수 있고, 이를 통해서 내수성이 매우 높은 것을 확인할 수 있다. 이를 통해서, PVA/GA 나노섬유매트나 PVA/PAA/GA 나노섬유매트를 염산 증기 처리 및/또는 DMF 용매 처리한 경우에는 투명성을 가지면서도 내수성이 증가된 나노섬유매트를 제조할 수 있음을 확인할 수 있다.
특히, 염산 증기 처리나 DMF 용매 처리 중 어느 하나를 수행한 경우에 비해서, 이들을 처리 공정을 모두 수행한 경우, 내수성이 더 향상된 것으로 볼 수 있다.
나노섬유 구조 분석
PVA 용액, PVA/PAA 용액, PVA/GA 용액 및 PVA/PAA/GA 용액 각각을 전기방사 하여 형성한 나노섬유매트인 PVA 나노섬유매트, PVA/PAA 나노섬유매트, PVA/GA 나노섬유매트 및 PVA/PAA/GA 나노섬유매트에 대해서, 적외선 분광분석기 (Fourier-transform infrared (FT-IR, Jobin Yvon, LabRam HR Evolution-Nicolet iS50, HORIBA-Thermo Co.)를 이용하여 나노섬유매트들 각각의 적외선 분광스펙트럼을 얻었다. 그 결과를 도 6에 나타낸다.
또한, 이들 중에 PVA/PAA/GA 나노섬유매트에 DMF 용매 처리 공정을 수행한 후의 적외선 분광스펙트럼 결과를 얻었다. 그 결과를 도 7에 나타낸다.
도 6은 나노섬유매트들의 DMF 용매 처리 공정 전의 적외선 분광스펙트럼을 나타낸 도면이고, 도 7은 PVA/PAA/GA 나노섬유매트의 DMF 용매 처리 공전 전/후의 적외선 분광스펙트럼을 나타낸 도면이다.
도 6을 참조하면, 파장범위 3100~3650 cm-1, 2800~2900 cm-1, 1600~1750 cm-1 및 1000~1100 cm-1에서 PVA 특성 흡수 피크가 나타나는 것을 확인할 수 있다.
3100~3650 cm-1 피크(Peak I 지역으로 표시한 부분)는 GA를 첨가하고 염산 증기를 처리한 PVA/GA 나노섬유매트나 PVA/PAA/GA 나노섬유매트가 GA를 첨가하지 않은 PVA 나노섬유매트나 PVA/PAA 나노섬유매트에 비해서 피크의 높이가 낮은 것을 알 수 있다. Peak I 지역으로 표시한 부분은 수소결합을 나타내는 하이드록실기의 스트레칭 진동(stretching vibration)과 연관되어 나타나는 것으로서, PVA의 하이드록실기와 GA의 CHO기와의 가교가 진행됨에 따라 그 피크의 세기가 감소하는 결과로 나타나는 것이다.
또한, 도 6에서 Peak II 지역으로 표시한 부분인 1000~1100 cm-1에서 나타나는 피크는 피크의 넓이가 GA를 첨가하고 염산 증기 처리한 PVA/GA 나노섬유매트나 PVA/PAA/GA 나노섬유매트가 GA를 첨가하지 않은 PVA 나노섬유매트나 PVA/PAA 나노섬유매트보다 넓게 나타나는 것을 알 수 있다. 이는, Peak II 지역으로 표시한 부분의 넓이 증가는 GA를 첨가하고 염산 증기 처리에 의하여 O-C-O 가교가 증가함에 따라 나타나는 것으로 볼 수 있다.
도 7을 참조하면, PVA/PAA/GA 나노섬유매트에 대해서 DMF 용매 처리 공정을 수행한 경우에는 Peak III 지역에 1650 cm-1에서 나타나는 피크가 증가하는 동시에, Peak IV 지역에 1140 cm-1에서 새로운 피크가 나타나는 것을 확인할 수 있다. 이는, DMF 용매 처리에 의하여 PVA의 결정화가 증가하여 나타나는 피크에 해당하는 것으로 확인할 수 있다. 이러한 DMF 용매 처리에 의한 PVA의 결정화 증가로 인해서 나노섬유매트의 내수성이 증가함을 확인할 수 있다.
실험 6: 세포 부착성 평가-1
PVA/PAA 나노섬유매트에 대해서 DMF 용매 처리 공정을 수행한 후, 이를 세포배양용으로 NIH3T3 섬유아세포나 CT26 대장암세포의 부착성에 대해서 평가하였다.
섬유아세포 및 대장암세포는 각각 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 배지에 10% FBS 100 IU/mL penicillin 및 100 μg/mL streptomycin을 첨가한 배양액에서 5% CO2를 유지하는 세포배양기에서 배양하였다. 나노섬유매트에서의 세포배양도 상기 배양액을 사용하였다. 그 결과를 도 8에 나타낸다.
도 8은 비교예 2에 따라 제조된 나노섬유매트에 대한 세포 부착성 평가 결과를 설명하기 위한 사진들을 도시한 도면으로, 도 8을 참조하면 세포들이 나노섬유의 표면에 부착하지 못하고 세포들끼리 붙는 세포응집 현상이 3일간 배양할 때 까지 나타났다. 즉, 비교예 2에 따라 제조된 나노섬유매트에서는 DMF 용매 처리를 하여 내수성을 어느 정도 향상시킬 수 있다하더라도 세포 부착능이 매우 나빠 세포배양용 나노섬유매트로 이용할 수 없는 것을 확인할 수 있다.
실험 7: 세포 부착성 평가-2
본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 나노섬유매트에 대해서, 나노섬유매트에 서로 다른 2종의 세포들을 나노섬유매트의 양면에 각각 부착시키기 위해서 나노섬유매트를 coring costa transwell assay chamber의 filter를 제거하고 부착시켰다.
도 9는 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 나노섬유매트를 이용하여 세포배양용 나노섬유매트를 제작하는 공정을 설명하기 위한 도면으로서, 도 9에 도시된 바와 같이 챔버에 부착된 나노섬유매트의 아랫층면에 CT26 대장암 세포를 부착시키기 위하여 챔버를 뒤집어서 나노섬유의 아랫층면에 PKH26인 적색형광으로 염색된 5 ×104 개의 세포를 얹고 4시간 동안 배양하여 부착시켰다. 나노섬유의 윗층면에는 PKH67인 녹색형광으로 염색된 NIH3T3 섬유아세포를 5 ×104 개로 하여 부착시켰다. 윗층면과 아랫층면에 부착된 세포는 광학현미경(Nikon, Japan)인 up-light microscope을 사용하여 윗면으로부터 관찰하였으며 공촛점 형광현미경(K1 confocal microscope, Nanoscope system Co., 대전, 대한민국)인 inverted microscope을 사용하여 아랫면으로부터 관찰하였다. 그 결과를 도 10 내지 도 13에 나타낸다.
도 10 내지 도 13은 도 9의 공정에 따라 제조된 나노섬유매트에서의 세포 부착성 평가 결과를 설명하기 위한 사진들을 도시한 도면들이다.
도 10은 광학 현미경으로 윗면에 대해서 측정한 결과로서, 도 10을 참조하면 나노섬유매트의 양쪽 면에 암세포와 섬유아세포가 부착하여 광학현미경 상 2종류의 세포가 동시에 관찰되는 것을 확인할 수 있다. 섬유아세포는 다소의 세포응집현상을 보이나 암세포는 도 10의 화살표로 나타낸 바와 같이 세포들이 잘 부착하는 것으로 나타난 것을 알 수 있다.
도 11은 형광 현미경으로 아랫면에 대해서 측정한 결과로서, 도 11을 참조하면 공촛점 현미경으로 2종류의 세포가 각기 다른 형광으로 염색되어 동시에 나노섬유의 아랫면에서 관찰되는 것으로 나타났다.
도 12는 나노섬유의 아랫층/윗층면에 부착시킨 다른 종류의 세포를 24시간 동안 배양하여 공촛점 현미경으로 관찰하여 Z-stack으로 분석한 결과로서, 도 12를 참조하면 2 종류의 세포가 동시에 관찰되며 이들 세포의 위치는 겹치는 것으로 나타났다.
도 13은 나노섬유에 세포가 부착되어 있는가를 전자현미경으로 관찰한 결과로서, 도 13을 참조하면, 각각의 표면에 부착된 세포와 나노섬유 샘플을 전자현미경 관찰을 위하여 고정시키고 2개로 나누어서 각 면을 전자현미경으로 관찰하였을 때 암세포 및 섬유아세포가 부착된 것으로 나타났다.
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야의 숙련된 당업자는 하기의 특허 청구 범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

Claims (6)

  1. 폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohol), 폴리아크릴산(polyacrylic acid) 및 글루타르알데히드(glutaraldehyde)를 포함하는 전기방사 용액을 전기방사하여 나노섬유매트를 형성하는 단계;
    상기 나노섬유매트에 대해서 염산 증기 처리하여 가교시키는 단계; 및
    염산 증기 처리된 나노섬유매트에 대해서 디메틸포름알데히드 용매 처리하여 결정화시키는 단계를 포함하는,
    세포 배양용 폴리비닐 알코올 나노섬유 구조체의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 나노섬유매트를 형성하는 단계는
    상기 전기방사 용액을 5 내지 10 ㎕/분의 방사속도로 금속 주사기를 사용하여 10 내지 15 kV 상태에서 전기방사 하여 나노섬유를 형성하는 단계; 및
    상기 나노섬유에 대해서 열처리를 수행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는,
    세포 배양용 폴리비닐 알코올 나노섬유 구조체의 제조 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 가교시키는 단계는
    진공데시케이터에 나노섬유매트와 염산(HCl)을 넣고 60초 내지 120초 동안 진공 상태에서 염산 증기로 나노섬유매트를 처리하는 것을 특징으로 하는,
    세포 배양용 폴리비닐 알코올 나노섬유 구조체의 제조 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 결정화시키는 단계는
    디메틸포름알데히드 용매로 20초 내지 1분간 처리하는 단계; 및
    건조시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는,
    세포 배양용 폴리비닐 알코올 나노섬유 구조체의 제조 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 결정화시키는 단계 이후에, 결정화된 나노섬유매트를 증류수 처리하여도 겔화되지 않는 것을 특징으로 하는,
    세포 배양용 폴리비닐 알코올 나노섬유 구조체의 제조 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 결정화시키는 단계 이후에, 결정화된 나노섬유매트 양면 각각에 서로 다른 2종 이상의 세포들을 부착시켜 배양하면서 동시에 2층의 세포를 관찰하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는,
    세포 배양용 폴리비닐 알코올 나노섬유 구조체의 제조 방법.
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