WO2018012607A1 - 反応促進剤 - Google Patents

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reaction accelerator
oxidase
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敦 一柳
一彦 下地
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    • C07D231/14—Heterocyclic compounds containing 1,2-diazole or hydrogenated 1,2-diazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology

Definitions

  • the present invention relates to an oxidase reaction accelerator (for example, but not limited to, an amadoriase reaction accelerator, a sarcosine oxidase reaction accelerator, and a cholesterol oxidase reaction accelerator).
  • an oxidase reaction accelerator for example, but not limited to, an amadoriase reaction accelerator, a sarcosine oxidase reaction accelerator, and a cholesterol oxidase reaction accelerator.
  • Oxidase is an enzyme that catalyzes an oxidation reaction and is applied in various fields.
  • hemoglobin A1c HbA1c
  • GA glycated albumin
  • amadoriase amadoriase
  • Amadoriase catalyzes a reaction that oxidizes iminodiacetic acid or a derivative thereof (also referred to as “Amadori compound”) in the presence of oxygen to produce glyoxylic acid or ⁇ -ketoaldehyde, an amino acid or peptide, and hydrogen peroxide.
  • amadoriase include fructosyl amino acid oxidase, fructosyl peptide oxidase, A1c oxidase (A1cOX) and the like.
  • HbA1c As a method for measuring HbA1c using amadoriase, for example, a method is known in which HbA1c is decomposed with a protease and the glycated substrate released from its ⁇ -chain amino terminus is quantified (for example, Patent Documents 1 to 11). Furthermore, some amadoriases (A1cOX) that directly act on HbA1c without requiring protease are also known (Patent Documents 12 and 13).
  • Patent Document 14 describes a compound that shifts the detection wavelength of a phenothiazine derivative in a method of detecting a phenothiazine derivative dye in a reaction system by absorbance measurement.
  • Sarcosine oxidase (also referred to as sarcosine oxidase) (EC 1.5.3.1) is a catalytic enzyme that hydrolyzes sarcosine to produce glycine and formaldehyde, and is used to measure the amount of creatinine in human serum or urine. It can be used as a diagnostic agent for various diseases including kidney disease.
  • Sarcosine oxidase is known to be derived from the genus Corynebacterium, Bacillus, Cylindrocarbon, Pseudomonas, Arthrobacter and the like. See, for example, Patent Documents 15 to 17 for various sources of modified sarcosine oxidase and sarcosine oxidase.
  • Cholesterol oxidase (EC 1.1.3.6) is an oxidase that catalyzes the reaction between 3 ⁇ -hydroxysteroid and oxygen to produce the corresponding 3-oxosteroid and hydrogen peroxide. Cholesterol oxidase has been researched and developed for the purpose of measuring cholesterol concentration in body fluids (Patent Document 18). Cholesterol oxidase is known to be produced by Streptomyces, Brevibacterium, Rhodococcus, Pseudomonas, Burkholderia cepacia and the like. See, for example, Patent Document 19 for cholesterol oxidase and its various origins.
  • glycated albumin (GA) measurement method using amadoriase for example, a method is known in which GA is decomposed with a protease or the like and the glycated substrate ⁇ -fructosyl lysine ( ⁇ -FK) released is quantified. See, for example, US Pat.
  • the present invention includes compounds that promote enzyme reactions catalyzed by oxidases (for example, but not limited to amadoriase), that is, oxidase reaction accelerators (for example, amadoriase reaction accelerators). (Not limited). Furthermore, the present invention provides a composition comprising an oxidase reaction accelerator (for example, but not limited to, an amadoriase reaction accelerator). Furthermore, the present invention provides a method using oxidase and an oxidase reaction accelerator (for example, but not limited to, amadoriase and a method for measuring HbA1c using an amadoriase reaction accelerator).
  • the present inventors have surprisingly found a compound that can promote the oxidase reaction, while lacking information on compounds that promote the oxidase reaction such as amadoriase.
  • the present invention has been completed. That is, the present invention includes the following embodiments.
  • a method using an oxidase reaction comprising a step of using an oxidase and an oxidase reaction accelerator represented by the following formula (I):
  • R 1 and R 2 are each independently an aromatic 5- to 6-membered monocyclic carbon ring or at least one nitrogen atom, sulfur atom, or optionally substituted with one or more substituents
  • —C 1-6 alkyl —CONH 2 , —NO 2 , —NH 2 , —CO—NH 2 , —R 3 , —NH—R 4 , —NHCO—NH—R 5 —N ⁇ N—R 6 , Selected from the group consisting of —SO 3 X, —COOX, Y, Z;
  • X is selected from the group consisting of —H, —Na, —K, —Li;
  • Y is selected from the group consisting of —H, —SO 3 X, —COOX;
  • Z is selected from the group consisting of —H, —C 1-6 alkyl, —O—C 1-6 alkyl, —SO 3 X;
  • Each X, Y, Z may be the same or different, —R 3 is —H or optionally —F, —Cl, —Br, —I, —At, —C 1-6 alkyl
  • a 9 to 10 membered fused ring containing —R 5 and —R 6 are each independently, optionally, —F, —Cl, —Br, —I, —At, —C 1-6 alkyl, —C 2-6 alkenyl, —C 2-6 alkynyl.
  • R 1 and R 2 are each independently, optionally substituted by one or more substituents, an aromatic 6-membered monocyclic ring Or a 10-membered condensed ring containing the aromatic 6-membered monocyclic carbocycle.
  • R 1 and R 2 are each independently The method according to 1 or 2, wherein the compound is selected from the group consisting of: wherein X, Y, and Z are as defined in 1.
  • R 1 is R 2 is selected from the group consisting of 4.
  • reaction accelerator represented by the formula (I) is a reaction accelerator represented by the following formula: [Where: X is selected from the group consisting of —H, —Na, —K, —Li; Y is selected from the group consisting of —H, —SO 3 X, —COOX; Each X and Y may be the same or different, —R 3 is —H or —NHCO—NH—R 5 —N ⁇ N—R 6 or, optionally, —F, —Cl, —Br, —I, —At, —C 1-6 Alkyl, —C 2-6 alkenyl, —C 2-6 alkynyl, ⁇ O, —OH, —O—C 1-6 alkyl, —CONH 2 , —NO 2 , —NH 2 , —SO 3 X
  • An aromatic 6-membered monocyclic carbocycle optionally substituted by one or more substituents selected from
  • reaction accelerator represented by the formula (I) is a reaction accelerator represented by any of the following formulas: [Where: X is selected from the group consisting of —H, —Na, —K, —Li; Y is selected from the group consisting of —H, —SO 3 X, —COOX; Each X and Y may be the same or different.
  • reaction accelerator represented by the formula (I) is a reaction accelerator represented by the following formula: [Where: R 1 is a benzene ring or naphthalene ring optionally substituted by one or more substituents, The substituents include —NO 2 , —SO 3 X, and Selected from the group consisting of X is selected from the group consisting of —H, —Na, —K, —Li].
  • R 1 is an aromatic 6-membered monocyclic carbocycle optionally substituted with one or more substituents
  • 2 is an aromatic 5-membered monocyclic heterocycle containing at least one nitrogen, sulfur or oxygen atom, optionally substituted by one or more substituents Method.
  • R 2 is an aromatic 5-membered monocyclic heterocycle containing two nitrogen atoms, optionally substituted by one or more substituents, wherein the heterocycle is 9.
  • R 2 is Wherein X is as defined in 1, and each X may be the same or different, the method according to 1, 8, or 9.
  • the compound represented by the formula (I) is: A compound represented by the following formula: [Wherein X is selected from the group consisting of —H, —Na, —K, —Li], A compound represented by the following formula: [Wherein X is selected from the group consisting of —H, —Na, —K, —Li], A compound represented by the following formula: Wherein X is selected from the group consisting of —H, —Na, —K, —Li, and each X may be the same or different. A compound represented by the following formula: Wherein X is selected from the group consisting of —H, —Na, —K, —Li, and each X may be the same or different.
  • oxidase is an oxidase selected from the group consisting of amadoriase, sarcosine oxidase, and cholesterol oxidase.
  • —C 1-6 alkyl —CONH 2 , —NO 2 , —NH 2 , —CO—NH 2 , —R 3 , —NH—R 4 , —NHCO—NH—R 5 —N ⁇ N—R 6 , Selected from the group consisting of —SO 3 X, —COOX, Y, Z;
  • X is selected from the group consisting of —H, —Na, —K, —Li;
  • Y is selected from the group consisting of —H, —SO 3 X, —COOX;
  • Z is selected from the group consisting of —H, —C 1-6 alkyl, —O—C 1-6 alkyl, —SO 3 X;
  • Each X, Y, Z may be the same or different, —R 3 is —H or optionally —F, —Cl, —Br, —I, —At, —C 1-6 alkyl
  • a 9 to 10 membered fused ring containing —R 5 and —R 6 are each independently, optionally, —F, —Cl, —Br, —I, —At, —C 1-6 alkyl, —C 2-6 alkenyl, —C 2-6 alkynyl.
  • R 1 and R 2 are each independently an optionally substituted aromatic 6-membered monocyclic carbocycle, Alternatively, the reaction accelerator according to 13, which is a 10-membered condensed ring including the aromatic 6-membered monocyclic carbocycle.
  • R 1 and R 2 are each independently The reaction accelerator according to 13 or 14, wherein X, Y and Z are selected from the group consisting of:
  • R 1 is:
  • R 2 is selected from the group consisting of The reaction accelerator according to any one of 13 to 15, wherein the reaction accelerator is selected from the group consisting of: wherein X is as defined in 12.
  • reaction accelerator is a reaction accelerator represented by the following formula: [Where: X is selected from the group consisting of —H, —Na, —K, —Li; Y is selected from the group consisting of —H, —SO 3 X, —COOX; Each X and Y may be the same or different, —R 3 is —H or —NHCO—NH—R 5 —N ⁇ N—R 6 or, optionally, —F, —Cl, —Br, —I, —At, —C 1-6 Alkyl, —C 2-6 alkenyl, —C 2-6 alkynyl, ⁇ O, —OH, —O—C 1-6 alkyl, —CONH 2 , —NO 2 , —NH 2 , —SO 3 X
  • An aromatic 6-membered monocyclic carbocycle optionally substituted by one or
  • reaction accelerator according to any one of 13 to 17, wherein the reaction accelerator represented by the formula (I) is a reaction accelerator represented by any of the following formulas: [Where: X is selected from the group consisting of —H, —Na, —K, —Li; Y is selected from the group consisting of —H, —SO 3 X, —COOX; Each X, Y, Z may be the same or different.
  • reaction accelerator according to any one of 13 to 17, wherein the reaction accelerator represented by the formula (I) is a reaction accelerator represented by the following formula: [Where: R 1 is a benzene ring or naphthalene ring optionally substituted by one or more substituents, The substituents include —NO 2 , —SO 3 X, and Selected from the group consisting of X is selected from the group consisting of —H, —Na, —K, —Li].
  • R 1 is an aromatic 6-membered monocyclic carbocycle optionally substituted by one or more substituents, and R 2, it may optionally be substituted by one or more substituents, a 5-membered monocyclic aromatic, at least one nitrogen atom, a heterocyclic ring containing a sulfur atom or an oxygen atom, according to 13 Reaction accelerator.
  • R 2 is an aromatic 5-membered monocyclic heterocycle containing two nitrogen atoms, optionally substituted by one or more substituents, wherein the heterocycle is The reaction accelerator according to 13 or 20, wherein X is as defined in 12, and each X may be the same or different.
  • R 2 is In the formula, X is as defined in 12, and each X may be the same or different, The reaction accelerator according to 13, 20, or 21.
  • the compound represented by the formula (I) is: A compound represented by the following formula: A compound represented by the following formula: [Wherein X is selected from the group consisting of —H, —Na, —K, —Li], A compound represented by the following formula: Wherein X is selected from the group consisting of —H, —Na, —K, —Li, and each X may be the same or different. A compound represented by the following formula: Wherein X is selected from the group consisting of —H, —Na, —K, —Li, and each X may be the same or different.
  • a composition comprising the reaction accelerator according to any one of 13 to 23 and an oxidase.
  • composition according to 24, wherein the oxidase is an oxidase selected from the group consisting of amadoriase, sarcosine oxidase, and cholesterol oxidase.
  • an enzyme reaction catalyzed by oxidase can be promoted.
  • the amount of enzyme required for measurement can be reduced, the reaction time can be shortened even with the same amount of enzyme, and the measurement sensitivity can be increased.
  • an amadoriase-catalyzed enzymatic reaction can be facilitated.
  • the prescription amount of amadoriase to the HbA1c measurement reagent for example, the prescription amount of A1cOX and the prescription amount of amadoriase to the GA measurement reagent can be reduced as compared with the case where the amadoriase reaction accelerator of the present invention is not added. it can.
  • the present invention provides an oxidase reaction promoter.
  • the oxidase reaction accelerator refers to a compound that promotes an enzyme reaction catalyzed by the oxidase. Promoting an enzyme reaction catalyzed by oxidase means that more product (in the same reaction time) is present when the oxidase reaction accelerator of the present invention is present in the system as compared to when the oxidase reaction accelerator is not present in the system. Hydrogen peroxide or the like) or the reaction is completed or almost completed in a shorter time.
  • the oxidase reaction promoter of the present invention can promote various oxidase reactions.
  • the oxidase reaction promoter of the present invention may promote amadoriase reaction.
  • the oxidase reaction accelerator of the present invention is also referred to as an amadoriase reaction accelerator.
  • the oxidase reaction promoter of the present invention can promote the reaction of sarcosine oxidase.
  • the oxidase reaction accelerator of the present invention is also referred to as a sarcosine oxidase reaction accelerator.
  • the oxidase reaction promoter of the present invention can promote the reaction of cholesterol oxidase.
  • the oxidase reaction accelerator of the present invention is also referred to as a cholesterol oxidase reaction accelerator.
  • these names are for convenience only.
  • the same reaction accelerator compound may promote the reaction of amadoriase and the reaction of sarcosine oxidase.
  • Such a reaction accelerator corresponds to an amadoriase reaction accelerator and a sarcosine oxidase reaction accelerator. This also applies. Therefore, names such as amadoriase reaction accelerators should not be construed as limiting the reaction accelerators of the present invention.
  • the reaction accelerator of the present invention means an oxidase reaction accelerator unless otherwise specified.
  • the oxidase reaction promoter of the present invention can promote amadoriase reaction.
  • the amadoriase whose reaction is promoted uses ⁇ -fructosyl valine ( ⁇ FV), ⁇ -fructosyl valylhistidine ( ⁇ FVH), and / or ⁇ -fructosyl hexapeptide ( ⁇ F6P) as a substrate.
  • ⁇ FV ⁇ -fructosyl valine
  • ⁇ FVH ⁇ -fructosyl valylhistidine
  • ⁇ F6P ⁇ -fructosyl hexapeptide
  • examples include, but are not limited to, amadoriase.
  • the amadoriase whose reaction is promoted includes amadoriase using ⁇ -fructosyl lysine ( ⁇ -FK) as a substrate.
  • the amadoriase whose reaction is promoted includes amadoriase that acts directly on hemoglobin A1c, ie, hemoglobin A1c oxidase (A1cOX).
  • the amadoriase reaction accelerator of the present invention is also referred to as a hemoglobin A1c oxidase reaction accelerator.
  • the present invention provides a method comprising a step of using an oxidase and an oxidase reaction accelerator.
  • the present invention provides a method for measuring an oxidase reaction product comprising using an oxidase and an oxidase reaction accelerator.
  • the present invention provides a method for synthesizing a product comprising using an oxidase and an oxidase reaction promoter.
  • the present invention provides a method for producing hydrogen peroxide comprising using an oxidase and an oxidase reaction promoter. This method can be applied to sterilization, cleaning, oxidation reaction, etc., using, for example, generated hydrogen peroxide.
  • the present invention provides a method for measuring a substance to be measured, including a step of using an oxidase and an oxidase reaction accelerator.
  • the method of the present invention includes a step of adding and heating a first reagent containing a peroxidase and an oxidase reaction promoter to a sample that may contain a measurement target substance, and an oxidase that promotes the reaction with a color former.
  • the first reagent containing the peroxidase and the oxidase reaction accelerator may be a single reagent or a combination of a plurality of reagents each containing individual components.
  • the second reagent containing the oxidase that promotes the reaction with the color former may be a single reagent or a combination of a plurality of reagents each containing individual components.
  • the measurement method of the present invention includes a step of adding a first reagent containing a peroxidase, a color former, and an oxidase reaction accelerator to a sample that may contain a measurement target substance, and heating, and a reaction-promoted oxidase.
  • each component in the reagent may be a single reagent or a combination of multiple reagents each containing an individual component. The measurement may be qualitative or quantitative.
  • the measurement method of the present invention includes a step of adding and warming a measurement reagent containing a peroxidase, an oxidase reaction accelerator, a color former, and a reaction-promoted oxidase to a sample that may contain a measurement target substance, and Measuring the absorbance of the reagent.
  • the measurement reagent containing peroxidase, oxidase reaction accelerator, color former and oxidase to be promoted may be a single reagent or a combination of a plurality of reagents each containing individual components.
  • the present invention provides a method for measuring HbA1c, comprising a step of using amadoriase and an amadoriase reaction accelerator.
  • the method for measuring HbA1c of the present invention comprises a step of adding a first reagent containing a peroxidase and an amadoriase reaction accelerator to a sample that may contain HbA1c and heating, a second reagent containing a color former and an amadoriase. Adding and heating, and measuring the absorbance of the sample.
  • the first reagent containing the peroxidase and the amadoriase reaction accelerator may be a single reagent or a combination of a plurality of reagents each containing individual components.
  • the second reagent containing the color former and amadoriase may be a single reagent or a combination of a plurality of reagents each containing individual components.
  • the method for measuring HbA1c of the present invention comprises adding a first reagent containing a peroxidase, a color former and an amadoriase reaction accelerator to a sample that may contain HbA1c, and heating the second reagent containing amadoriase. Adding and heating, and measuring the absorbance of the sample.
  • each component in the reagent may be a single reagent or a combination of multiple reagents each containing an individual component. The measurement may be qualitative or quantitative.
  • total hemoglobin in the sample in the step of adding and warming a first reagent containing a peroxidase and an amadoriase reaction accelerator, total hemoglobin in the sample can be further quantified.
  • the ratio of glycated hemoglobin to total hemoglobin in the sample, HbA1c% may be calculated from the quantified total hemoglobin and glycated hemoglobin.
  • the method for measuring HbA1c comprises adding a measurement reagent containing peroxidase, an amadoriase reaction accelerator, a color former and an amadoriase to a sample that can contain HbA1c, and heating the reagent. Including the step of measuring.
  • the measurement reagent containing peroxidase, amadoriase reaction accelerator, color former and amadoriase may be a single reagent or a combination of a plurality of reagents each containing individual components.
  • an amadoriase that acts on a saccharification substrate such as ⁇ FV, ⁇ FVH, and / or ⁇ F6P can be used as the amadoriase.
  • the HbA1c measurement method of the present invention may further include a step of pretreating HbA1c with a protease. Any known protease can be used.
  • an amadoriase that acts on ⁇ -FK can be used as an amadoriase. This can be used in a method for measuring glycated albumin (GA).
  • the GA measurement method may further include a step of pretreating GA with a protease.
  • hemoglobin A1c oxidase (A1cOX) that acts directly on HbA1c can be used as an amadoriase. In this case, pretreatment with protease is not necessary.
  • the present invention provides a method for measuring sarcosine, comprising a step of using sarcosine oxidase and the reaction accelerator of the present invention.
  • a step of converting creatinine into creatine with creatinine amide hydrolase (also referred to as creatininase) and converting creatine into sarcosine with creatine amidinohydrolase (also referred to as creatinase) may be added. .
  • This provides a method for measuring creatinine or creatine.
  • the measurement method of the present invention includes a step of adding a first reagent containing peroxidase and a reaction accelerator of the present invention to a sample that may contain a measurement target substance (sarcosine), heating, a color former and sarcosine oxidase A step of adding and heating a second reagent containing, and a step of measuring the absorbance of the sample.
  • the first reagent containing peroxidase and the reaction accelerator of the present invention may be a single reagent or a combination of a plurality of reagents each containing individual components.
  • the second reagent containing the color former and sarcosine oxidase may be a single reagent or a combination of a plurality of reagents each containing individual components.
  • the measurement method of the present invention comprises adding a first reagent containing a peroxidase, a color former and the reaction accelerator of the present invention to a sample that may contain a substance to be measured, and heating the sample, which comprises sarcosine oxidase.
  • each component in the reagent may be a single reagent or a combination of multiple reagents each containing an individual component.
  • the measurement may be qualitative or quantitative.
  • the measurement method of the present invention comprises a step of adding a measurement reagent containing peroxidase, the reaction accelerator of the present invention, a color former and sarcosine oxidase to a sample that may contain a substance to be measured, and heating the reagent.
  • the measurement reagent containing the peroxidase, the reaction accelerator of the present invention, the color former and the oxidase to be accelerated may be a single reagent or a combination of a plurality of reagents each containing individual components.
  • the present invention provides a method for measuring cholesterol, comprising a step of using cholesterol oxidase and the reaction accelerator of the present invention.
  • a step of converting cholesterol ester into cholesterol by cholesterol esterase may be added as an upstream step.
  • the measurement method of the present invention comprises adding a first reagent containing peroxidase and a reaction accelerator of the present invention to a sample that may contain cholesterol, and heating the second reagent containing a color former and cholesterol oxidase. It includes a step of adding a reagent and heating, and a step of measuring the absorbance of the sample.
  • the first reagent containing peroxidase and the reaction accelerator of the present invention may be a single reagent or a combination of a plurality of reagents each containing individual components.
  • the second reagent containing the color former and cholesterol oxidase may be a single reagent or a combination of a plurality of reagents each containing individual components.
  • the measurement method of the present invention comprises adding a first reagent containing a peroxidase, a color former and the reaction accelerator of the present invention to a sample that may contain cholesterol, and heating the second reagent containing cholesterol oxidase. And a step of measuring the absorbance of the sample.
  • each component in the reagent may be a single reagent or a combination of multiple reagents each containing an individual component. The measurement may be qualitative or quantitative.
  • the measurement method of the present invention includes a step of adding and heating a measurement reagent containing peroxidase, the reaction accelerator of the present invention, a color former and cholesterol oxidase to a sample that may contain cholesterol, and the absorbance of the reagent.
  • the measurement reagent containing peroxidase, the reaction accelerator of the present invention, the color former and cholesterol oxidase may be a single reagent or a combination of a plurality of reagents each containing individual components.
  • the final concentration of the reaction accelerator of the present invention to be added to the sample solution is not particularly limited. For example, 0.01 to 200 mM, 0.02 to 150 mM, 0.03 to 100 mM, 0.04 to 80 mM, 0.05 to 60 mM, 0.06-50 mM, 0.08-40 mM, 0.1 mM-30 mM, 0.15-20 mM, 0.2-10 mM, 0.3-5 mM, 0.4-3 mM, eg 0.05-10 mM Range.
  • the final concentration of the reaction accelerator of the present invention added to the sample solution is not particularly limited.
  • reaction accelerator and other enzymes and reagents For example, 0.001 to 5% (w / v), 0.003 to 3% (w / v), 0.005 to 1 % (W / v), 0.01 to 0.5% (w / v), 0.02 to 0.3% (w / v), 0.03 to 0.1% (w / v) obtain.
  • the order of addition of the reaction accelerator and other enzymes and reagents is not limited, and may be added simultaneously or sequentially.
  • the substance to be measured is a saccharification substrate and the saccharification substrate concentration in the sample solution is 0 to 0.5 mM
  • the final concentration of the amadoriase reaction promoter to be added is, for example, 0.01 to 20 mM, for example 0.02 to It can be 10 mM.
  • the final concentration of the amadoriase reaction accelerator to be added is, for example, 0.01 to 20 mM, for example, 0.02 to 10 mM. can do.
  • the final concentration of the sarcosine oxidase reaction promoter to be added is, for example, 0.01 to 20 mM, for example, 0.02 to 10 mM. It can be.
  • the method of using sarcosine as the substance to be measured as referred to herein is an upstream process in which creatinine is converted into creatine by creatinine amide hydrolase (also referred to as creatininase), and creatine is converted by creatine amidinohydrolase (also referred to as creatinase). It is intended to include a method comprising the step of converting to sarcosine.
  • the final concentration of the cholesterol oxidase reaction promoter to be added is, for example, 0.01-20 mM, for example, 0.02-10 mM. It can be.
  • the total reaction time can be 60 minutes or less, 30 minutes or less, 20 minutes or less, preferably 15 minutes or less, and preferably about 10 minutes.
  • the heating after the addition of the first reagent can be 30 minutes or less, 20 minutes or less, 15 minutes or less, 10 minutes, for example, about 5 minutes, and the heating after the addition of the second reagent is 30 minutes.
  • it may be about 20 minutes or less, 15 minutes or less, 10 minutes or less, for example, about 5 minutes.
  • the concentration of each component of the measurement reagent is adjusted so that the reaction with the oxidase (eg, amadoriase) is completed or almost complete with respect to the concentration range of the measurement target substance (eg, glycated hemoglobin) estimated to be contained in the sample. Can be adjusted. Completion of reaction means that 100% of the measurement target substance (for example, glycated hemoglobin or glycated substrate) contained in the sample has reacted.
  • the reaction is almost complete, for example, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, for example 99% or more of the measurement target substance (eg, glycated hemoglobin or glycated substrate) contained in the sample Say what you did.
  • the measurement target substance eg, glycated hemoglobin or glycated substrate
  • the measurement wavelength in the absorbance measurement can be selected according to the color former.
  • the measurement wavelength of absorbance can be, for example, 340 to 900 nm, 590 to 900 nm, 600 to 751 nm, and 610 to 730 nm.
  • the measurement can be performed at two measurement wavelengths A 1 and A 2 to obtain a difference (may be expressed as A 1 -A 2 or A 1 / A 2 ).
  • the two measurement wavelengths A 1 and A 2 can be any two wavelengths in the range of 590 to 900 nm.
  • the difference (A 1 -A 2 ) can be calculated with A 1 as the absorption wavelength of the dye and A 2 as the background wavelength.
  • the absorbance measurement wavelength may be 590 to 730 nm, for example 610 to 710 nm, when a phenothiazine derivative dye is used.
  • the background wavelength can be selected from a region in which the phenothiazine derivative dye hardly absorbs, for example, a range higher than 710 nm and not more than 900 nm.
  • a 1 A 694
  • a 2 A 751
  • a 694 -A 751 may be calculated from these.
  • Absorbance measurement may be performed using an automatic analyzer.
  • the color former is not particularly limited, but is preferably a compound whose absorbance is changed by the catalytic reaction of peroxidase in the presence of hydrogen peroxide.
  • the color former include 4-aminoantipyrine, for example, ADOS (N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -m-anisidine), ALOS (N-ethyl-N- (2-hydroxy-) 3-sulfopropyl) aniline), TOOS (sodium N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -m-toluidine), DA-67 (10- (carboxymethylaminocarbonyl) -3, 7- Bis (dimethylamino) -phenocyanazine), DA-64 (N- (carboxymethylaminocarbonyl) -4,4′-bis (dimethylamino) -diphenylamine) and the like.
  • ADOS N-ethy
  • ADOS, ALOS, and TOOS develop color when condensed with 4-aminoantipyrine.
  • DA-64 and DA-67 do not require 4-aminoantipyrine and develop color only by prescribing alone. In either case, the color reaction is catalyzed by peroxidase.
  • a color former methylene blue, 10- (acetylaminocarbonyl) -3,7-bis (dimethylamino) phenothiazine, 10- (carboxymethylaminocarbonyl) -3,7-bis (dimethylamino) phenothiazine, 10- (phenyl) Carbonyl) -3,7-bis (dimethylamino) phenothiazine, 10- (3- (methylcarboxyamino) -hexamethyl-amino) -phenothiazine, 10-((3- (methylcarboxyamino) -4-methyl-phenyl) -Amino) -phenothiazine, 10-((3- (methylcarboxyaminomethyl) -phenyl) -methylamino) -phenothiazine, 10- (1-naphthaleneamino) -phenothiazine, 10- (methyl) -phenothiazine,
  • any known amadoriase, sarcosine oxidase, and cholesterol oxidase can be used, but not limited thereto. See, for example, Patent Documents 15 to 17 for known sarcosine oxidase. For known cholesterol oxidase, see, for example, Patent Document 19. The entire contents of which are incorporated herein by reference. These modifications and equivalents can also be used.
  • amadoriase examples include those that act on saccharification substrates such as ⁇ FV, ⁇ FVH and / or ⁇ F6P.
  • examples of amadoriase include those that act on saccharification substrates such as ⁇ FV, ⁇ FVH and / or ⁇ F6P.
  • Other known amadoriases can also be used.
  • Examples of amadoriase include A1cOX that directly acts on HbA1c, and examples thereof include those described in Patent Documents 12 and 13.
  • Other A1cOX having an equivalent function can also be used.
  • amadoriase examples include amadoriase that acts on ⁇ -FK, and examples include those described in Patent Document 20. The entire contents of which are incorporated herein by reference.
  • amadoriase reaction amadoriase is added to a sample solution that can contain a saccharification substrate or HbA1c, and amadoriase is allowed to act on the substrate to generate hydrogen peroxide.
  • the amadoriase reaction accelerator of the present invention is allowed to coexist in the system.
  • Amadoriase acts on a glycated amino acid, glycated peptide or glycated protein in which ⁇ and / or ⁇ -amino groups are glycated to catalyze a reaction that generates hydrogen peroxide and ⁇ -ketoaldehyde.
  • the present amadoriase reaction accelerator is present in the system, this reaction is considered to be promoted.
  • the present invention is not limited to a specific mechanism of action.
  • the amadoriase reaction can be performed in a buffer solution.
  • the same or different buffer solution as the pretreatment reaction can be used for the amadoriase reaction.
  • the pH of the reaction solution is not particularly limited, but can be, for example, 3 to 11, 4 to 10, 5 to 9, such as 6 to 8.
  • the reaction temperature can be, for example, 10 to 45 ° C., 10 to 38 ° C., 20 to 37 ° C., for example 25 to 37 ° C.
  • the reaction time is 0.1 to 60 minutes, 0.1 to 30 minutes, 0.1 to 20 minutes, 0. It can be -15 minutes, 0.1-10 minutes, for example 0.1-5 minutes.
  • the reaction using sarcosine oxidase can be performed in a buffer solution.
  • the same or different buffer solution as that used in the upstream process may be used for the reaction using sarcosine oxidase.
  • the pH of the reaction solution is not particularly limited, but can be, for example, 3 to 11, 4 to 10, 5 to 9, such as 6 to 8.
  • the reaction temperature can be, for example, 10 to 45 ° C., 10 to 38 ° C., 20 to 37 ° C., for example 25 to 37 ° C.
  • the reaction time is 0.1 to 60 minutes, 0.1 to 30 minutes, 0.1 to 20 minutes, 0. It can be -15 minutes, 0.1-10 minutes, for example 0.1-5 minutes.
  • the reaction using cholesterol oxidase can be performed in a buffer solution.
  • the same or different buffer solution as the pretreatment reaction may be used for the cholesterol oxidase reaction.
  • the pH of the reaction solution is not particularly limited, but can be, for example, 3 to 11, 4 to 10, 5 to 9, such as 6 to 8.
  • the reaction temperature can be, for example, 10 to 45 ° C., 10 to 38 ° C., 20 to 37 ° C., for example 25 to 37 ° C.
  • the reaction time is 0.1 to 60 minutes, 0.1 to 30 minutes, 0.1 to 20 minutes, 0. It can be -15 minutes, 0.1-10 minutes, for example 0.1-5 minutes.
  • the oxidase depends on the amount of the substrate (for example, saccharification substrate) contained in the sample solution.
  • the final concentration is 0.01 to 50 U / mL, 0.1 to 20 U / mL, 0.2 to It can be added to the sample to be 10 U / mL, for example 0.5-10 U / mL.
  • the enzyme activity “U” for amadoriase using ⁇ FV as a substrate, the amount of 1 ⁇ mol hydrogen peroxide generated per minute using ⁇ FV as a substrate can be set to 1U.
  • the amount of 1 ⁇ mol hydrogen peroxide generated per minute using ⁇ FVH as a substrate can be set to 1U.
  • the enzyme activity “U” for amadoriase using ⁇ -FK as a substrate the amount of 1 ⁇ mol hydrogen peroxide generated per minute using ⁇ -FK as a substrate can be 1 U.
  • the enzyme activity “U” for amadoriase using ⁇ F6P as a substrate the amount of 1 ⁇ mol hydrogen peroxide generated per minute using ⁇ F6P as a substrate can be set to 1U.
  • the amount that generates 1 micromole of hydrogen peroxide per minute using HbA1c as a substrate can be 1 U.
  • the enzyme activity “U” for sarcosine oxidase using sarcosine as a substrate, the amount of 1 micromole of urea produced per minute using sarcosine as a substrate can be set to 1U.
  • the enzyme activity “U” for cholesterol oxidase using cholesterol as a substrate, the amount of 1 ⁇ mol hydrogen peroxide generated per minute using cholesterol as a substrate can be 1 U.
  • the enzyme activity “U” is defined as 1 U that produces 1 micromole of hydrogen peroxide per minute using HbA1c as a substrate.
  • Peroxidase catalyzes a redox reaction between hydrogen peroxide and a color former. By this reaction, the color former develops color.
  • the conditions for using peroxidase are not particularly limited, and the pH of the reaction solution is, for example, 5 to 9, and the treatment temperature is, for example, in the range of 10 to 40 ° C., preferably 25 to 37 ° C.
  • the processing time is not particularly limited, and may be 0.1 to 60 minutes, 0.1 to 10 minutes, for example, 0.1 to 5 minutes.
  • Peroxidase can be added to the reaction solution so that the final concentration is 0.01 to 300 KU / L, for example 0.5 to 50 KU / L.
  • Peroxidase activity “U” is defined as the amount of enzyme (POD) that produces 1 mg purpurogallin in 20 seconds under the following reaction conditions: 1 kg purpurogallin unit:
  • reagent A. 5% (W / V) pyrogallol aqueous solution B. 0.147M H 2 O 2 aqueous solution (Diluting 1.67 ml of 30% (W / V) H 2 O 2 solution with distilled water to 100 ml) C. 0.1M phosphate buffer, pH 6.0 (for reaction mixture and enzyme dilution) D. Enzyme solution of 2.0N H 2 SO 4 solution: Dissolve the enzyme preparation in 0.1M phosphate buffer, pH 6.0, previously ice-cooled, and dilute to 3.0-6.0 purpurogallin U / P with the same buffer. save
  • the absorbance of this solution is measured at 420 nm (OD test). 4.
  • the blind test is prepared by allowing the reaction mixture 1 to stand at 20 ° C. for 20 seconds, adding 1.0 ml of H 2 SO 4 solution (D), mixing, and then adding 1.0 ml of the enzyme solution.
  • the liquid is subjected to ether extraction in the same manner as described above, and the absorbance is measured (ODblank).
  • the absorbance of the reaction solution indicates the amount of the color former that has developed color, from which the concentration of the substance to be measured (eg, HbA1c) in the sample can be determined.
  • concentration of the substance to be measured eg, HbA1c
  • the absorbance for a standard substance containing a substrate having a known concentration can be measured, and a calibration curve can be created by plotting the relationship between the concentration and the absorbance.
  • absorbance is measured for a sample containing a substrate of unknown concentration (for example, glycated hemoglobin or glycated substrate), and the concentration of the substrate (for example, glycated hemoglobin or glycated substrate) can be determined from the calibration curve.
  • a substrate of unknown concentration for example, glycated hemoglobin or glycated substrate
  • concentration of the substrate for example, glycated hemoglobin or glycated substrate
  • the present invention provides a composition comprising an oxidase reaction promoter.
  • the composition can optionally include oxidases, peroxidases, buffers, stabilizers, color formers, surfactants, and the like.
  • the present invention provides a composition for measuring HbA1c, comprising an amadoriase reaction accelerator.
  • the composition can optionally include amadoriase, peroxidase, buffer, stabilizer, color former, surfactant, and the like. Further, additional enzymes and reagents for measuring markers and compounds other than HbA1c may be added to the composition of the present invention.
  • the present invention provides a composition for measuring sarcosine, comprising a sarcosine oxidase reaction accelerator.
  • the composition can optionally include creatinine amide hydrolase, creatine amidinohydrolase, sarcosine oxidase, peroxidase, buffer, stabilizer, color former, surfactant, and the like. Creatine or creatinine can be measured by using creatinine amide hydrolase, creatine amidinohydrolase, and peroxidase.
  • the present invention further provides a composition for measuring creatine or creatinine, comprising a sarcosine oxidase reaction accelerator, creatinine amide hydrolase, creatine amidinohydrolase, sarcosine oxidase, and peroxidase.
  • the present invention provides a composition for measuring cholesterol comprising a cholesterol oxidase reaction accelerator.
  • the composition can optionally include cholesterol oxidase, cholesterol esterase, peroxidase, buffer, stabilizer, color former, surfactant, and the like.
  • buffer examples include N- [tris (hydroxymethyl) methyl] glycine, phosphate, acetate, carbonate, tris (hydroxymethyl) -aminomethane, borate, citrate, dimethylglutamate, and tricine. , HEPES, MES, Bis-Tris, ADA, PIPES, ACES, MOPSO, BES, MOPS, TES, DIPSO, TAPSO, POPSO, HEPPSO, EPPS, Tricine, Bicine, TAPS, phthalic acid, tartaric acid and the like.
  • a surfactant (n-octyl- ⁇ -D-glucoside, n-octyl- ⁇ -D-thioglucoside, n-type) may be used as a solubilizer, stabilizer, reactivity improver, HbA1c modifier, etc.
  • HbA1c may be denatured in advance in order to increase the reaction efficiency between A1cOX and HbA1c.
  • the modification can be carried out by surfactant treatment, heat treatment, or treatment with acid or alkali.
  • the heat treatment can be performed at a temperature and time sufficient to modify all or part of HbA1c.
  • the treatment temperature can be, for example, 60 ° C. or higher, 70 ° C. or higher, 80 ° C. or higher, 90 ° C. or higher, eg 98 ° C.
  • the treatment time can be, for example, 10 seconds or more, 20 seconds, 30 seconds or more, 1 minute or more, or 2 minutes or more. Examples of the surfactant are as described above, and these can be added at an appropriate concentration.
  • the oxidase reaction accelerator of the present invention is a compound represented by the following formula (I).
  • R 1 and R 2 are each independently an aromatic 5- to 6-membered monocyclic carbon ring or at least one nitrogen atom, sulfur atom, or optionally substituted with one or more substituents A heterocyclic ring containing an oxygen atom, or a 9-10 membered condensed ring containing the aromatic 5- to 6-membered monocyclic carbocyclic or heterocyclic ring,
  • —C 1-6 alkyl —CONH 2 , —NO 2 , —NH 2 , —CO—NH 2 , —R 3 , —NH—R 4 , —NHCO—NH—R 5 —N ⁇ N—R 6 , Selected from the group consisting of —SO 3 X, —COOX, Y, Z;
  • X is selected from the group consisting of —H, —Na, —K, —Li;
  • Y is selected from the group consisting of —H, —SO 3 X, —COOX;
  • Z is selected from the group consisting of —H, —C 1-6 alkyl, —O—C 1-6 alkyl, —SO 3 X;
  • Each X, Y, Z may be the same or different, —R 3 is —H or optionally —F, —Cl, —Br, —I, —At, —C 1-6 alkyl
  • Examples of the 5- to 6-membered monocycle include 5- to 6-membered carbocycles and 5- to 6-membered heterocycles.
  • the 9- to 10-membered condensed ring may be a condensed ring of a heterocyclic ring and a heterocyclic ring, a condensed ring of a carbocyclic ring and a heterocyclic ring, or a condensed ring of a carbocyclic ring and a carbocyclic ring.
  • the monocycle may optionally be substituted by 1, 2, 3, or 4 substituents; in the case of a 6-membered monocycle, the monocycle may optionally be 1, 2 May be substituted by 3, 4 or 5 substituents, and in the case of a 9-membered fused ring, the fused ring is optionally substituted by 1, 2, 3, 4, 5 or 6 substituents.
  • the condensed ring In the case of a 10-membered condensed ring, the condensed ring may optionally be substituted with 1, 2, 3, 4, 5, 6 or 7 substituents.
  • aromatic monocyclic carbocycle examples include a benzene ring.
  • a condensed ring of an aromatic carbocycle and a carbocycle a naphthalene ring can be mentioned.
  • Examples of the 5-membered heterocyclic ring include, but are not limited to, pyrroline, imidazoline, pyrazoline, pyrrolidine, imidazolidine, pyrazolidine, tetrahydrothiophene, tetrahydrofuran, and tetrahydropyrrole.
  • Examples of the six-membered heterocyclic ring include, but are not limited to, piperidine, piperazine, morpholine, tetrazine, and oxazine.
  • Aromatic five-membered heterocycles include imidazole, pyrazole, oxazole, isoxazole, thiazole, isothiazole, thiophene, oxadiazole (eg 1,2,3-oxadiazole, 1,2,4-oxadiazole 1,2,5-oxadiazole (also called furazane), 1,3,4-oxadiazole, furan, pyrrole (1H-pyrrole, 2H-pyrrole), triazole (1,2,3-triazole, 1 , 2,4-triazole), tetrazole, pentazole, and thiadiazole, but are not limited thereto.
  • oxadiazole eg 1,2,3-oxadiazole, 1,2,4-oxadiazole 1,2,5-oxadiazole (also called furazane)
  • 1,3,4-oxadiazole furan
  • pyrrole (1H-pyrrole, 2H-pyrrole
  • Aromatic six-membered heterocyclic compounds include pyridine, pyrazine, pyrimidine, pyridazine, and triazine (1,2,3-triazine, 1,2,4-triazine, 1,3,5-triazine). Not limited to this.
  • Condensed rings include 9-membered benzimidazole, benzoxazole, benzisoxazole, 1,3-benzodioxole, benzothiophene, benzo [c] thiophene, benzothiazole, indole (2,3-benzopyrrole) ), Indazole, isoindole, purine, quinoline, isoquinoline, phthalazine, and isobenzofuran, but are not limited thereto.
  • condensed ring examples include, but are not limited to, 10-membered benzodioxane, 1,4-benzodioxin, naphthyridine, quinoxaline, quinazoline, cinnoline, and pteridine.
  • —C 1-6 alkyl includes methyl, ethyl, propyl (n-propyl, isopropyl), butyl (n-butyl, sec-butyl, isobutyl, tert-butyl), pentyl (n-pentyl, tert-pentyl, neopentyl) , Isopentyl, sec-pentyl, 3-pentyl), hexyl (n-hexyl, isohexyl, neohexyl) groups.
  • -C 2-6 alkenyl includes ethenyl group (vinyl group), 1-propenyl group, 2-propenyl group (allyl group), 1-butenyl group, 2-butenyl group, 3-butenyl group, pentenyl group, hexenyl group Etc.
  • Examples of —C 2-6 alkynyl include ethynyl group, 1-propynyl group, 2-propynyl group, 1-butynyl group, 2-butynyl group, 3-butynyl group, pentynyl group, hexynyl group and the like.
  • —O—C 1-6 alkyl is also referred to as C 1-6 alkoxy group, and examples thereof include linear or branched alkoxy groups such as methoxy, ethoxy, propoxy, butoxy, pentyloxy, hexyloxy groups.
  • R 1 and R 2 are each independently an aromatic 6-membered monocyclic carbocycle optionally substituted with one or more substituents, or the aromatic 6-membered It is a 10-membered condensed ring containing a monocyclic carbocycle.
  • R 1 and R 2 are each independently, A group selected from the group consisting of In the formula, X, Y and Z are as defined above.
  • R 1 is R 2 is selected from the group consisting of Wherein X is as defined above.
  • the oxidase reaction accelerator of the present invention includes a compound represented by the following formula: [Where: X is selected from the group consisting of —H, —Na, —K, —Li; Y is selected from the group consisting of —H, —SO 3 X, —COOX; Each X and Y may be the same or different, —R 3 is —H or —NHCO—NH—R 5 —N ⁇ N—R 6 or, optionally, —F, —Cl, —Br, —I, —At, —C 1-6 Alkyl, —C 2-6 alkenyl, —C 2-6 alkynyl, ⁇ O, —OH, —O—C 1-6 alkyl, —CONH 2 , —NO 2 , —NH 2 , —SO 3 X An aromatic 6-membered monocyclic carbocycle optionally substituted by one or more substituents selected from the group, or
  • the oxidase reaction promoter of the present invention includes a compound represented by any of the following formulae: [Where: X is selected from the group consisting of —H, —Na, —K, —Li; Y is selected from the group consisting of —H, —SO 3 X, —COOX; Each X and Y may be the same or different.
  • the oxidase reaction accelerator of the present invention includes a compound represented by the following formula: [Where: R 1 is a benzene ring or naphthalene ring optionally substituted by one or more substituents, The substituents include —NO 2 , —SO 3 X, and Selected from the group consisting of X is selected from the group consisting of —H, —Na, —K, —Li].
  • R 1 is an aromatic 6-membered monocyclic carbocycle that is optionally substituted with one or more substituents
  • R 2 is optionally one or more substituents.
  • An aromatic 5-membered monocyclic heterocyclic ring which may be substituted by at least one nitrogen atom, sulfur atom or oxygen atom.
  • R 2 is an aromatic 5-membered monocyclic heterocycle containing two nitrogen atoms, optionally substituted with one or more substituents, wherein the heterocycle is Wherein X is as defined above, and each X may be the same or different.
  • R 2 is Wherein X is as defined above, and each X may be the same or different.
  • the oxidase reaction accelerator of the present invention is an azobenzene derivative, such as an azobenzene derivative exhibiting water solubility, such as a compound having an azobenzene-4-sulfonic acid skeleton.
  • the oxidase reaction promoter of the present invention comprises A compound represented by the following formula: [Wherein X is selected from the group consisting of —H, —Na, —K, —Li], For example, Mordant Orange 1 (CAS 2243-76-7) represented by the following formula A compound represented by the following formula: [Wherein X is selected from the group consisting of —H, —Na, —K, —Li], For example, Alizarin Yellow GG (CAS 584-42-9) represented by the following formula, A compound represented by the following formula: Wherein X is selected from the group consisting of —H, —Na, —K, —Li, and each X may be the same or different.
  • Chrome Yellow represented by the following formula
  • Direct Yellow 44 (CAS8005-52-5) represented by the following formula, A compound represented by the following formula: [Wherein X is selected from the group consisting of —H, —Na, —K, —Li], For example, Acid Red 151 (CAS6406-56-0) represented by the following formula A compound represented by the following formula: [Wherein X is selected from the group consisting of —H, —Na, —K, —Li], For example, Acid Yellow 36 (CAS587-98-4) represented by the following formula A compound represented by the following formula: Wherein X is selected from the group consisting of —H, —Na, —K, —Li, and each X may be the same or different.
  • Xylene Fast Yellow 2G (CAS 6359-98-4) represented by the following formula
  • Acid Yellow 34 (CAS 6359-90-6) represented by the following formula
  • And Disperse Diazo Black 3BF (CAS 6232-57-1) represented by the following formula:
  • reaction accelerators of the present invention exclude compounds represented by the following formula (Tartrazine, CAS 1934-21-0):
  • the above compounds may be commercially available or salts thereof.
  • Other compounds of formula I may be synthesized using conventional techniques, or those commercially available or salts thereof may be used.
  • the oxidase reaction promoter of the present invention can promote amadoriase reaction.
  • reaction accelerators include the compounds described above, such as compounds of formula I, formula II, and formula III, compounds of formula IV, such as Mordant Orange 1, compounds of formula V, such as Alizarin Yellow GG, compound of formula VI, e.g. Chrome Yellow, compound of formula VII, e.g. Direct Yellow 44, compound of formula VIII, e.g. Acid Red 151, compound of formula IX, e.g. Acid Yellow 36, compound of formula X, e.g. Xylene Fast Yellow 2G, compounds of formula XI, such as Acid Yellow 34 and compounds of formula XII, such as Disperse Diazo Black 3BF, but are not limited thereto.
  • the oxidase reaction promoter of the present invention can promote the reaction of sarcosine oxidase.
  • reaction accelerators also referred to as sarcosine oxidase reaction accelerators
  • Such reaction accelerators include the above-mentioned compounds, for example, compounds of formula I, formula II, and formula III, compounds of formula IV, such as MordantordOrange 1, compounds of formula V, For example, Alizarin Yellow GG, compounds of formula VI such as ChromeCYellow, compounds of formula VII such as Direct Yellow 44, compounds of formula VIII such as Acid Red 151, compounds of formula X such as Xylene Fast Yellow 2G, and compounds of formula XII Examples include, but are not limited to DispersepersDiazo ⁇ ⁇ Black ⁇ ⁇ 3BF.
  • the oxidase reaction promoter of the present invention can promote the reaction of cholesterol oxidase.
  • reaction accelerators also referred to as cholesterol oxidase reaction accelerators
  • HbA1c measurement method The HbA1c measuring reagent and measuring method of the present invention will be exemplified. However, the present invention is not limited to this.
  • HbA1c reference material HbA1c certified practical reference material JCCRM 423-9b manufactured by National Institute for Laboratory Medicine
  • First reagent (solution containing peroxidase and leuco dye) 30 mM MOPS-NaOH buffer, pH 6.5 15 mM Tris 0.2% (w / v) n-dodecyl- ⁇ -D-maltoside (manufactured by Dojindo Laboratories) 4 mM NaNO 2 10 U / ml peroxidase PEO-301 (Toyobo) 0.023 mM 10- (carboxymethylaminocarbonyl) -3,7-bis (dimethylamino) phenothiazine sodium (DA-67, manufactured by Wako Pure Chemical Industries
  • HbA1c is measured according to the following procedure using Bio Majesty JCA-BM1650 (manufactured by JEOL). 8 ⁇ l of HbA1c standard diluted 12.5 times with ion-exchanged water is added to 96 ⁇ l of the first reagent and incubated at 37 ° C. for 5 minutes, and then 24 ⁇ l of the second reagent is added to the ⁇ -chain amino terminal of HbA1c. The quantitative reaction of hydrogen peroxide generated by oxidation is allowed to proceed at 37 ° C. for 5 minutes.
  • the absorbance (A 694 and A 751 ) of the reaction solution with respect to light having a wavelength of 694 nm and 751 nm for 10 minutes after mixing the diluted standard substance and the first reagent was measured over time, and A 694/751 (A 694 ⁇ A 751 ) is obtained.
  • the horizontal axis plots the concentration of HbA1c standard substance, and the vertical axis plots A 694/751 10 minutes after mixing the diluted standard substance and the first reagent, indicating the correlation between HbA1c concentration and A 694/751. Create a calibration curve.
  • HbA1c concentration of the sample is determined using A 694/751 10 minutes after mixing the diluted sample and the first reagent and the calibration curve prepared above.
  • Whether the compound promotes the oxidase reaction can be evaluated by comparing the progress of the reaction when the candidate compound is added to the system with the progress of the reaction when the compound is not added.
  • reaction reagents The following solutions are prepared as reaction reagents. 1) 0.2M sarcosine, 100 mM Tris-HCl, 2 mM KCl, 0.05% Triton-X100 pH 7.7 2) 80U / ml POD solution 3) 0.2% phenol solution 4) 0.2% 4-aminoantipyrine solution 5) 0.3% SDS solution 6) 20mM Tris-HCl, 1mM KCl, 0.2% BSA pH7.7 (enzyme dilution) Next, the following quantities of the above solutions are mixed to prepare an activity measurement solution. 1) 5ml 2) 1ml 3) 2ml 4) 1ml
  • Measurement method is performed as follows. 1) Preincubate 0.95 ml of activity measurement solution at 37 ° C for 5 minutes. 2) Add and mix 0.05 ml of enzyme solution (adjusted with 0.04 U / ml to 0.16 U / ml with enzyme diluent). 3) Incubate at 37 ° C for 10 minutes. 4) After the reaction for 10 minutes, mix the above 0.3% SDS solution. 5) After standing at 25 ° C for 10 minutes, measure the absorbance at 495 nm. (ODsample)
  • the blank value is measured by mixing a 0.3% SDS solution before mixing the enzyme solution.
  • ODblank Activity conversion formula
  • U / ml (ODsample ⁇ ODblank) ⁇ 0.95
  • Example of measurement method using cholesterol oxidase The measurement reagent and measurement method using cholesterol oxidase are illustrated. However, the present invention is not limited to this.
  • a method for measuring the enzyme activity of cholesterol oxidase a method for measuring the amount of hydrogen peroxide will be described.
  • cholesterol oxidase activity measurement cholesterol is used as a substrate unless otherwise specified.
  • the enzyme titer of cholesterol oxidase is defined as 1 U for the amount of enzyme that produces 1 ⁇ mol of hydrogen peroxide per minute when measured using cholesterol as a substrate.
  • Reagent 1 Cholesterol Solution Add 500 mg of cholesterol (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) to 5.0 ml of Triton X-100, and stir and dissolve on a heater. 90 ml of ion-exchanged water is added thereto, boiled, cooled on ice, 4.0 g of sodium cholate (manufactured by Nacalai Tesque) is added and dissolved, and the volume is made up to 100 ml.
  • Reagent 2 6.0% phenol solution Dissolve 6.0 g of phenol in ion exchange water to make 100 ml.
  • Reagent 3 0.15% peroxidase solution 150 mg is dissolved in 100 ml of 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 7.0).
  • Reagent 4 4-aminoantipyrine solution 1.76 g of 4-aminoantipyrine (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) is dissolved in ion-exchanged water and made up to a volume of 100 ml.
  • the control solution ( ⁇ ODblank) was the same as described above except that 50 ⁇ l of 20 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.2% bovine serum albumin was added instead of the enzyme solution.
  • the calculated value was defined as the enzyme activity value (U / ml) according to the following formula. 13.78: millimolar extinction coefficient (cm 2 / micromole) under the above measurement conditions 1/2: Coefficient due to the fact that the quinoneimine dye formed from two molecules of H 2 O 2 produced by an enzyme reaction is one molecule.
  • 1.0 Optical path length (cm).
  • Example 1 Preparation of plasmid pKK223-3-CFP-DH2 carrying the amadoriase gene
  • the amino acid sequence of amadoriase (CFP-DH2, see International Publication No. 2015/060429) acting on HbA1c is shown in SEQ ID NO: 1.
  • pKK223-3-CFP-DH2 which is a pKK223-3 vector incorporating the CFP-DH2 gene (SEQ ID NO: 2), E.
  • coli strain JM109 having pKK223-3-CFP-DH2 was prepared with 3 ml of LB- Amp medium [1% (w / v) bactotryptone, 0.5% (w / v) peptone, 0.5% (w / v) NaCl, 50 ⁇ g / ml ampicillin] and inoculated at 37 ° C. for 16 The culture was obtained by shaking with time.
  • the culture was collected by centrifugation at 10,000 ⁇ g for 1 minute to obtain bacterial cells. From this cell, pKK223-3-CFP-DH2 was extracted and purified using GenElute Plasmid MiniprepKit (Sigma-Aldrich) to obtain 2.5 ⁇ g of recombinant plasmid pKK223-3-CFP-DH2. .
  • Plasmid DNA was isolated in the same manner as in Example 1.
  • the base sequence of DNA encoding amadoriase in the plasmid was determined using a multicapillary DNA analysis system Applied Biosystems 3130xl Genetic Analyzer (manufactured by LifeTechnologies), and the arginine at position 64 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 was replaced by glycine.
  • a plasmid (pKK223-3-CFP-DH3) carrying the gene for the substituted modified amadoriase (CFP-DH3, SEQ ID NO: 5) was obtained.
  • Example 3 Production and purification of pKK223-3-CFP-DH4 Escherichia coli JM109 strain into which a plasmid carrying the CFP-DH4 gene (pKK223-3-CFP-DH4) was introduced was adjusted to a final concentration of 0.1 mM. Inoculated into 200 ml of LB-amp medium supplemented with IPTG and cultured at 25 ° C. for 16 hours. Each of the obtained cultured cells was washed with 2 mM potassium phosphate buffer (pH 8.0), suspended in the same buffer, subjected to ultrasonic disruption, and centrifuged at 20,000 ⁇ g for 10 minutes. Separated, 40 ml of crude enzyme solution was prepared.
  • 2 mM potassium phosphate buffer pH 8.0
  • a column packed with Q-sepharose FF (manufactured by GE Healthcare) was equilibrated with 2 mM potassium phosphate buffer (pH 8.0), and then the prepared crude enzyme solution containing CFP-DH4 was applied to remove the amadoriase. Binding to ion exchange resin. Thereafter, 20 column volume integration of 4 mM potassium phosphate buffer (pH 8.0) was carried out to elute contaminating proteins, and then bound to the resin with 4 mM potassium phosphate buffer (pH 8.0) containing 30 mM NaCl. The eluted protein was eluted, and the fraction showing amadoriase activity was collected.
  • the obtained fractions showing amadoriase activity were concentrated with Amicon Ultra Ultra-30K (Millipore) and purified with HiLoad 26/60 Superdex200.
  • a 10 mM potassium phosphate buffer (pH 6.5) containing 150 mM NaCl was used for equilibration and elution of the resin.
  • the purity of each eluted fraction was evaluated by SDS-PAGE, and the fraction containing no contaminating protein was collected and used as a purified sample of CFP-DH4.
  • Example 4 Measurement of Absorbance when HbA1c Detection Reaction is Completed
  • the amount of change in absorbance when the HbA1c detection reaction is completed is determined using an excessive amount of A1cOX.
  • HbA1c A reagent for measuring HbA1c having the following composition was prepared, and HbA1c was measured by using Bio Majesty JCA-BM1650 (manufactured by JEOL Ltd.).
  • Blood cells HbA1c 10.4% (NGSP value)
  • First Reagent-A 30 mM MOPS-NaOH buffer, pH 6.5 15 mM Tris 0.2% (w / v) n-dodecyl- ⁇ -D-maltoside (manufactured by Dojindo Laboratories) 4 mM NaNO 2 10 U / ml peroxidase PEO-301 (Toyobo) 0.023 mM 10- (carboxymethylaminocarbonyl) -3,7-bis (dimethylamino) phenothiazine sodium (DA-67, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 0.04% (w / v)
  • Table 1 The compound of Comparative Example 2 in Table
  • Example 5 Calculation of the HbA1c detection reaction promoting effect by the compound of the present invention
  • the degree of acceleration of the HbA1c detection reaction by the compound of the present invention was determined using a small amount of A1cOX.
  • HbA1c A reagent for measuring HbA1c having the following composition was prepared, and HbA1c was measured by using Bio Majesty JCA-BM1650 (manufactured by JEOL Ltd.).
  • Blood cells HbA1c 10.4% (NGSP value)
  • First reagent 30 mM MOPS-NaOH buffer, pH 6.5 15 mM Tris 0.2% (w / v) n-dodecyl- ⁇ -D-maltoside (manufactured by Dojindo Laboratories) 4 mM NaNO 2 10 U / ml peroxidase PEO-301 (Toyobo) 0.023 mM 10- (carboxymethylaminocarbonyl) -3,7-bis (dimethylamino) phenothiazine sodium (DA-67, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 0.04% (w / v) Any one of the compounds of Comparative Example 2 in Table 2, the compounds
  • ⁇ A was calculated by subtracting (104/128) times A 694/751 4.8 minutes after mixing the diluted sample and the first reagent from A 694/751 . Note that 5 minutes after mixing the diluted sample and the first reagent represents the time immediately before the addition of the second reagent-B.
  • ⁇ A calculated in this example was divided by 100% ⁇ A defined in Example 4 to calculate the progress of the HbA1c detection reaction.
  • Table 2 shows the degree of progress of the HbA1c detection reaction 7.5 and 10 minutes after mixing the diluted sample and the first reagent (in other words, 2.5 and 5 minutes after the addition of the second reagent-B). Shown in
  • Mordant Orange 1 AlizarinYellow GG, Chrome Yellow, DirectYellow 44, Acid Red 151, AcidYellow 36, Xylene Fast Yellow 2G, and Acid Yellow 34 have been found to have the effect of promoting the HbA1c detection reaction. It was issued.
  • Example 6 Measurement of absorbance when fructosyl valylhistidine detection reaction is completed by fructosyl peptide oxidase
  • an excess amount of fructosyl peptide oxidase FPOX-CET
  • FPOX-CET fructosyl peptide oxidase
  • a reagent for measuring fructosyl valyl histidine having the following composition was prepared, and fructosyl valyl histidine was measured with fructosyl peptide oxidase using Bio Majesty JCA-BM1650 (manufactured by JEOL Ltd.).
  • ⁇ A was calculated by subtracting (104/128) times A 694/751 4.8 minutes after mixing the sample and the first reagent-B from A 694/751 .
  • 4.8 minutes after mixing the sample and the first reagent-B represents immediately before the addition of the second reagent-C.
  • Table 3 shows ⁇ A ( ⁇ A 9 min and ⁇ A 10 min ) 9 minutes and 10 minutes after mixing the diluted sample and the first reagent-B.
  • Example 7 Calculation of fructosyl valyl histidine detection reaction promoting effect by fructosyl peptide oxidase by compound of the present invention
  • a small amount of fructosyl peptide oxidase was used, and the compound of the present invention was used.
  • the degree of acceleration of the fructosyl valyl histidine detection reaction was determined.
  • fructosyl valyl histidine having the following composition was prepared, and fructosyl valyl histidine was measured using Bio Majesty JCA-BM 1650 (manufactured by JEOL Ltd.).
  • sample 32 ⁇ M fructosyl valyl histidine (Kikkoman Biochemifa) (First Reagent-B) 30 mM MOPS-NaOH buffer, pH 7.0 0.2% (v / v) Triton X-100 (Wako Pure Chemical Industries) 10 U / ml peroxidase PEO-301 (Toyobo) 0.023 mM 10- (carboxymethylaminocarbonyl) -3,7-bis (dimethylamino) phenothiazine sodium (DA-67, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 0.04% (w / v) Any one of the compounds of Comparative Example 2, the compounds of the present invention in Table 1, or ion-
  • ⁇ A was calculated by subtracting (104/128) times A 694/751 4.8 minutes after mixing the sample and the first reagent-B from A 694/751 .
  • 5 minutes after mixing the sample and the first reagent-B represents immediately before the addition of the second reagent-D.
  • ⁇ A calculated in this example was divided by ⁇ A 100% defined in Example 6 to calculate the degree of progress of the fructosyl valyl histidine detection reaction. 7.5% and 10 minutes after mixing the sample and the first reagent-B (in other words, 2.5 and 5 minutes after the addition of the second reagent-D), the fructosyl valyl histidine detection reaction Table 4 shows the degree of progress.
  • Example 8 Measurement of absorbance when fructosyl valine detection reaction with fructosyl amino acid oxidase is completed
  • FOD-E fructosyl amino acid oxidase
  • a reagent for measuring fructosyl valine having the following composition was prepared, and fructosyl valine was measured with fructosyl amino acid oxidase using Bio Majesty JCA-BM1650 (manufactured by JEOL).
  • ⁇ A was calculated by subtracting (104/128) times A 694/751 4.8 minutes after mixing the sample and the first reagent-C from A 694/751 .
  • 4.8 minutes after mixing the sample and the first reagent-C represents immediately before the addition of the second reagent-E.
  • Table 5 shows ⁇ A ( ⁇ A 9 min and ⁇ A 10 min ) 9 minutes and 10 minutes after mixing the diluted sample and the first reagent-C.
  • Example 9 Calculation of fructosyl valine detection reaction accelerating effect by fructosyl amino acid oxidase using compound of the present invention
  • a small amount of fructosyl amino acid oxidase was used to obtain the fructosyl amino acid oxidase.
  • the degree of acceleration of the kutosylvaline detection reaction was determined.
  • fructosyl valine having the following composition was prepared, and fructosyl valine was measured using Bio Majesty JCA-BM1650 (manufactured by JEOL Ltd.).
  • ⁇ A was calculated by subtracting (104/128) times A 694/751 4.8 minutes after mixing the sample and the first reagent-C from A 694/751 .
  • 5 minutes after mixing the sample and the first reagent-C represents immediately before the addition of the second reagent-F.
  • ⁇ A calculated in this example was divided by 100% ⁇ A defined in Example 8 to calculate the degree of progress of the fructosyl valine detection reaction.
  • Progress of fructosyl valine detection reaction 7.5 and 10 minutes after mixing sample and first reagent-C (in other words, 2.5 and 5 minutes after adding second reagent-F) The degrees are shown in Table 6.
  • Example 10 Measurement of absorbance when sarcosine detection reaction with sarcosine oxidase is completed
  • SOD-TE sarcosine oxidase
  • sarcosine N-methylglycine as a substrate
  • a reagent for measuring sarcosine having the following composition was prepared, and sarcosine was measured with sarcosine oxidase using Bio Majesty JCA-BM1650 (manufactured by JEOL).
  • sample 32 ⁇ M sarcosine (manufactured by Wako Pure Chemical Industries)
  • First Reagent-D 30 mM MOPS-NaOH buffer, pH 8.0 0.2% (v / v) NP-10 (made by HELM) 10 U / ml peroxidase PEO-301 (Toyobo) 0.023 mM 10- (carboxymethylaminocarbonyl) -3,7-bis (dimethylamino) phenothiazine sodium (DA-67, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 0.04% (w / v) Any one of the compounds of Comparative Example 2, the compounds of the present invention in Table 1, or ion-exchanged water containing no compound
  • ⁇ A was calculated by subtracting (104/128) times A 694/751 4.8 minutes after mixing the sample and the first reagent-D, from A 694/751 .
  • 4.8 minutes after mixing the sample and the first reagent-D represents immediately before the addition of the second reagent-G.
  • Table 7 shows ⁇ A ( ⁇ A 9 min and ⁇ A 10 min ) 9 minutes and 10 minutes after mixing the diluted sample and the first reagent-D.
  • Example 11 Calculation of the sarcosine detection reaction-accelerating effect of sarcosine oxidase by the compound of the present invention
  • the degree of acceleration of the sarcosine detection reaction by the compound of the present invention using a small amount of sarcosine oxidase was determined.
  • ⁇ A was calculated by subtracting (104/128) times A 694/751 4.8 minutes after mixing the sample and the first reagent-D, from A 694/751 .
  • 5 minutes after mixing the sample and the first reagent-D represents immediately before the addition of the second reagent-H.
  • ⁇ A calculated in this example was divided by 100% ⁇ A defined in Example 10 to calculate the progress of the sarcosine detection reaction. Shows the degree of progress of the sarcosine detection reaction 7.5 and 10 minutes after mixing the sample and the first reagent-D (in other words, 2.5 and 5 minutes after adding the second reagent-H). It is shown in FIG.
  • Mordant Orange 1 Alizarin Yellow GG, Chrome Yellow, Direct Yellow 44, Acid Red 151, Xylene Fast Yellow 2G, Disperse Diazo Black 3BF have been found to have the effect of promoting the sarcosine detection reaction. It was issued.
  • Example 12 Measurement of absorbance when cholesterol detection reaction with cholesterol oxidase is completed
  • the detection of cholesterol as a substrate was completed using an excessive amount of cholesterol oxidase (CHO-CE), which is a kind of oxidase. Determine the amount of change in absorbance.
  • CHO-CE cholesterol oxidase
  • a cholesterol measuring reagent having the following composition was prepared, and cholesterol was measured with cholesterol oxidase using Bio Majesty JCA-BM1650 (manufactured by JEOL Ltd.).
  • sample 32 ⁇ M Cholesterol (Wako Pure Chemical Industries) 5.0% (v / v) Triton X-100 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) 4.0% (w / v) sodium cholate (Wako Pure Chemical Industries)
  • First Reagent-E 30 mM MOPS-NaOH buffer, pH 7.0 10 U / ml peroxidase PEO-301 (Toyobo) 0.023 mM 10- (carboxymethylaminocarbonyl) -3,7-bis (dimethylamino) phenothiazine sodium (DA-67, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 0.04% (w / v) Any one of the compounds of Comparative Example 2, the compounds of the present invention in Table 1, or i
  • ⁇ A was calculated by subtracting (104/128) times A 694/751 4.8 minutes after mixing the sample and the first reagent-E from A 694/751 .
  • 4.8 minutes after mixing the sample and the first reagent-E represents immediately before the addition of the second reagent-I.
  • Table 9 shows ⁇ A ( ⁇ A 9 min and ⁇ A 10 min ) 9 minutes and 10 minutes after mixing the diluted sample and the first reagent-E.
  • ⁇ A 9 min and ⁇ A 10 min for the compound of the present invention there is no difference between ⁇ A 9 min and ⁇ A 10 min for the compound of the present invention and the comparative example.
  • the cholesterol quantitative reaction that is, the quantitative reaction of hydrogen peroxide generated by the oxidation of cholesterol is completed. Therefore, in Examples 12 and 13, ⁇ A 10 min in each comparative example and the present invention was defined as ⁇ A ( ⁇ A 100% ) when cholesterol quantitative reaction progressed 100% under each condition.
  • Example 13 Calculation of the cholesterol detection reaction promoting effect by cholesterol oxidase by the compound of the present invention
  • the degree of promotion of the cholesterol detection reaction by the compound of the present invention was measured using a small amount of cholesterol oxidase. Were determined.
  • a cholesterol measurement reagent having the following composition was prepared, and cholesterol was measured using Bio Majesty JCA-BM1650 (manufactured by JEOL Ltd.).
  • sample 32 ⁇ M Cholesterol (Wako Pure Chemical Industries) 5.0% (v / v) Triton X-100 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) 4.0% (w / v) sodium cholate (Wako Pure Chemical Industries)
  • First Reagent-E 30 mM MOPS-NaOH buffer, pH 7.0 10 U / ml peroxidase PEO-301 (Toyobo) 0.023 mM 10- (carboxymethylaminocarbonyl) -3,7-bis (dimethylamino) phenothiazine sodium (DA-67, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 0.04% (w / v) Any one of the compounds of Comparative Example 2, the compounds of the present invention in Table 1, or ion-exchanged water
  • ⁇ A was calculated by subtracting (104/128) times A 694/751 4.8 minutes after mixing the sample and the first reagent-E from A 694/751 .
  • 5 minutes after mixing the sample and the first reagent-E represents immediately before adding the second reagent-J.
  • ⁇ A calculated in this example was divided by 100% ⁇ A defined in Example 12 to calculate the progress of cholesterol detection reaction. Shows the progress of cholesterol detection reaction 7.5 and 10 minutes after mixing sample and first reagent-E (in other words, 2.5 and 5 minutes after adding second reagent-J) 10 shows.
  • MordantMOrange 1 Alizarin Yellow GG, Chrome Yellow, Acid Red 151, Acid Yellow 36, Acid Yellow 34, Disperse Diazo Black 3BF was found to have an effect of promoting cholesterol detection reaction. It was done.
  • the reaction accelerator of the present invention may also promote an enzyme reaction catalyzed by peroxidase.
  • an excessive amount of peroxidase is added to the system, and the enzyme reaction of various oxidases. It is thought that the hydrogen peroxide generated by is immediately decomposed by peroxidase. Therefore, it is considered that the results of the above reaction promotion are mainly caused by the fact that the reaction accelerator of the present invention promotes enzyme reactions of various oxidases.
  • oxidase reaction accelerator of the present invention it is possible to reduce the amount of oxidase prescribed in clinical diagnostic reagents such as HbA1c measurement reagent, GA measurement reagent, sarcosine measurement reagent, cholesterol measurement reagent and the like. Moreover, reaction time can be shortened and detection sensitivity can be increased.

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Abstract

オキシダーゼが触媒する酵素反応を促進する化合物を提供する。　式(I)により表される化合物を含むオキシダーゼ反応促進剤及びこれを用いた方法。

Description

反応促進剤
　本発明は、オキシダーゼの反応促進剤（例えばアマドリアーゼの反応促進剤、サルコシンオキシダーゼの反応促進剤、及び、コレステロールオキシダーゼの反応促進剤などが挙げられるがこれに限らない）に関する。
　オキシダーゼは、酸化反応を触媒する酵素であり、様々な分野に応用されている。例えば糖尿病の臨床診断分野において、糖尿病患者の診断や症状管理のための重要な血糖コントロールマーカーとして、ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）および糖化アルブミン（ＧＡ）が注目されている。このＨｂＡ１ｃおよびＧＡを迅速かつ簡便に測定する方法として、オキシダーゼの一種であるアマドリアーゼを用いる酵素的方法がある。
　アマドリアーゼは、酸素の存在下で、イミノ２酢酸もしくはその誘導体（「アマドリ化合物」ともいう）を酸化して、グリオキシル酸又はα－ケトアルデヒド、アミノ酸又はペプチド及び過酸化水素を生成する反応を触媒する。アマドリアーゼとしては、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、フルクトシルペプチドオキシダーゼ、A1cオキシダーゼ（A1cOX）などが挙げられる。
　アマドリアーゼを用いたＨｂＡ１ｃ測定法としては、例えばＨｂＡ１ｃをプロテアーゼ等で分解し、そのβ鎖アミノ末端より遊離させた糖化基質を定量する方法が知られている（例えば、特許文献１～１１）。さらに、プロテアーゼを必要とせずＨｂＡ1ｃに直接作用するアマドリアーゼ（A1cOX）もいくつか知られている（特許文献１２、１３）。
　HbA1cの測定では、反応を10分程度の短時間で完了させることが望ましい。一方で、これまでに知られているA1cOXの種類は限られており、10分程度の短時間で反応を完了させるには、場合により測定試薬にA1cOXを多量に処方する必要があった。ところが酵素は一般に高価であり、HbA1c測定試薬へのA1cOXの処方量の低減が望まれていた。
　特許文献１４は、反応系におけるフェノチアジン誘導体色素を吸光度測定により検出する方法において、フェノチアジン誘導体の検出波長をシフトさせる化合物を記載している。
　サルコシンオキシダーゼ(ザルコシンオキシダーゼともいう)(EC 1.5.3.1)は、ザルコシンを加水分解してグリシン及びホルムアルデヒドを生成する触媒作用を有する酵素であり、ヒトの血清中又は尿中のクレアチニン量の測定に用いることができ、腎臓病をはじめとする各種の疾患の診断薬として利用することができる。サルコシンオキシダーゼは、コリネバクテリウム属、バチルス属、シリンドロカーボン属、シュードモナス属、アースロバクター属等の由来が知られている。改変型サルコシンオキシダーゼやサルコシンオキシダーゼの種々の由来については、例えば特許文献１５～１７を参照のこと。
　コレステロールオキシダーゼ(EC 1.1.3.6)は、３β－ヒドロキシステロイドと酸素の間の反応を触媒し、相当する３－オキソステロイドと過酸化水素を生成する酸化酵素である。コレステロールオキシダーゼは、体液中のコレステロール濃度の測定（特許文献１８）等に利用することを目的として研究開発されている。コレステロールオキシダーゼはストレプトマイセス、ブレビバクテリウム、ロドコッカス、シュードモナス、バークホルデリア・セパシア等により生産されることが知られている。コレステロールオキシダーゼやその種々の由来については例えば特許文献１９を参照のこと。
　アマドリアーゼを用いた糖化アルブミン（ＧＡ）測定法としては、例えばＧＡをプロテアーゼ等で分解し、遊離させた糖化基質ε－フルクトシルリジン（ε－ＦＫ）を定量する方法が知られている。例えば特許文献２０を参照のこと。
国際公開第２００４／１０４２０３号パンフレット 国際公開第２００５／４９８５７号パンフレット 特開２００１－９５５９８号公報 特公平０５－３３９９７号公報 特開平１１－１２７８９５号公報 国際公開第９７／１３８７２号パンフレット 特開２０１１－２２９５２６号公報 国際公開第２０１１／０１５３２５号パンフレット 国際公開第２００８／１０８３８５号パンフレット 国際公開第２０１５／００５２５８号パンフレット 国際公開第２０１３／１６２０３５号パンフレット 国際公開第２０１５／０６０４２９号パンフレット 国際公開第２０１５／００５２５７号パンフレット 国際公開第２００８／０９３７２２号パンフレット 特開2005-176828 特開2005-168487 特開2000-175685 特開平６－１６９７６５号公報 特開2007-014329 特開２００１－２０４４９５号公報
　こうした問題に鑑み、本発明は、オキシダーゼ（例えばアマドリアーゼが挙げられるがこれに限らない)が触媒する酵素反応を促進する化合物、すなわちオキシダーゼ反応促進剤（例えばアマドリアーゼ反応促進剤等が挙げられるがこれに限らない）を提供する。さらに本発明はオキシダーゼ反応促進剤（例えばアマドリアーゼ反応促進剤が挙げられるがこれに限らない）を含む組成物を提供する。さらに本発明はオキシダーゼ及びオキシダーゼ反応促進剤を用いる方法（例えばアマドリアーゼ及びアマドリアーゼ反応促進剤を用いるHbA1cの測定方法が挙げられるがこれに限らない）を提供する。
　アマドリアーゼをはじめとするオキシダーゼの反応を促進させる化合物についての情報が乏しい中で、本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、驚くべきことにオキシダーゼの反応を促進させることのできる化合物を見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、以下の実施形態を包含する。
[１]　オキシダーゼ、及び、下記の式（I)で表されるオキシダーゼ反応促進剤を用いる工程を含む、オキシダーゼ反応を用いる方法、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
 ［式中、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、場合により１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の５～６員単環の、炭素環又は少なくとも１つの窒素原子、硫黄原子若しくは酸素原子を含む複素環、或いは前記芳香族の５～６員単環の炭素環若しくは複素環を含む９～１０員の縮合環であり、
前記の置換基は、－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－Ａｔ、－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ２－６アルケニル、－Ｃ２－６アルキニル、＝Ｏ、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－６アルキル、－ＣＯＮＨ２、－ＮＯ２、－ＮＨ２、－ＣＯ－ＮＨ２、－Ｒ３、－ＮＨ－Ｒ４、－ＮＨＣＯ－ＮＨ－Ｒ５－Ｎ＝Ｎ－Ｒ６、－ＳＯ３Ｘ、－ＣＯＯＸ、Ｙ、Ｚからなる群より選択され、
Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択され、
Ｙは、－Ｈ、－ＳＯ３Ｘ、－ＣＯＯＸからなる群より選択され、
Ｚは、－Ｈ、－Ｃ１－６アルキル、－Ｏ－Ｃ１－６アルキル、－ＳＯ３Ｘからなる群より選択され、
各Ｘ、Ｙ、Ｚは、同一でも異なっていてもよく、
－Ｒ３は、－Ｈであるか、或いは、場合により－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－Ａｔ、－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ２－６アルケニル、－Ｃ２－６アルキニル、＝Ｏ、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－６アルキル、－ＣＯＮＨ２、－ＮＯ２、－ＮＨ２、－ＳＯ３Ｘ、からなる群より選択される１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の５～６員単環の、炭素環又は少なくとも１つの窒素原子、硫黄原子若しくは酸素原子を含む複素環、或いは前記芳香族の５～６員単環の炭素環若しくは複素環を含む９～１０員の縮合環であり、
－Ｒ４は、場合により－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－Ａｔ、－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ２－６アルケニル、－Ｃ２－６アルキニル、＝Ｏ、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－６アルキル、－ＣＯＮＨ２、－ＮＯ２、－ＮＨ２、－ＳＯ３Ｘ、－ＣＯＯＸ、Ｙ、Ｚからなる群より選択される１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の５～６員単環の、炭素環又は少なくとも１つの窒素原子、硫黄原子若しくは酸素原子を含む複素環、或いは前記芳香族の５～６員単環の炭素環若しくは複素環を含む９～１０員の縮合環であり、
－Ｒ５及び－Ｒ６は、それぞれ独立に、場合により－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－Ａｔ、－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ２－６アルケニル、－Ｃ２－６アルキニル、＝Ｏ、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－６アルキル、－Ｏ－ＣＨ３、－ＣＯＮＨ２、－ＮＯ２、－ＮＨ２、－ＳＯ３Ｘ、－ＣＯＯＸ、Ｙ、Ｚからなる群より選択される１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の５～６員単環の、炭素環又は少なくとも１つの窒素原子、硫黄原子若しくは酸素原子を含む複素環、或いは前記芳香族の５～８員単環の炭素環若しくは複素環を含む９～１０員の縮合環であり、
　ただし、Ｒ１又はＲ２が、芳香族の５員単環の、炭素環又は少なくとも１つの窒素原子、硫黄原子若しくは酸素原子を含む複素環である場合には、該複素環は－ＣＯＯＸにより置換されたものではない]。 　
[２]　式（I)により表される反応促進剤において、Ｒ１及びＲ２が、それぞれ独立に、場合により１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環、或いは前記芳香族の６員単環の炭素環を含む１０員の縮合環である、１に記載の方法。　
[３]　式（I)により表される反応促進剤において、Ｒ１及びＲ２が、それぞれ独立に、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000043
からなる群より選択され、式中、Ｘ、Ｙ、Ｚは１に定義したとおりである、１又は２に記載の方法。
[４]　式（I)により表される反応促進剤において、Ｒ１が、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000044
 からなる群より選択され、Ｒ２が、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000045
 からなる群より選択され、式中、Ｘは１に定義したとおりである、１、２又は３に記載の方法。
[５]　式（I)により表される反応促進剤が、下記の式で表される反応促進剤である、１に記載の方法、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000046
 ［式中、
Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択され、
Ｙは、－Ｈ、－ＳＯ３Ｘ、－ＣＯＯＸからなる群より選択され、
各Ｘ、Ｙは、同一でも異なっていてもよく、
－Ｒ３は、－Ｈ又は－ＮＨＣＯ－ＮＨ－Ｒ５－Ｎ＝Ｎ－Ｒ６であるか、或いは、場合により－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－Ａｔ、－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ２－６アルケニル、－Ｃ２－６アルキニル、＝Ｏ、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－６アルキル、－ＣＯＮＨ２、－ＮＯ２、－ＮＨ２、－ＳＯ３Ｘ、からなる群より選択される１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環、或いは前記炭素環を含む１０員の縮合環であり、
－Ｒ５及び－Ｒ６は、それぞれ独立に、場合により－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－Ａｔ、－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ２－６アルケニル、－Ｃ２－６アルキニル、＝Ｏ、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－６アルキル、－Ｏ－ＣＨ３、－ＣＯＮＨ２、－ＮＯ２、－ＮＨ２、－ＳＯ３Ｘ、からなる群より選択される１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環、或いは前記炭素環を含む１０員の縮合環である]。
[６]　式（I)により表される反応促進剤が、下記のいずれかの式で表される反応促進剤である、１に記載の方法、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000047
 ［式中、
Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択され、
Ｙは、－Ｈ、－ＳＯ３Ｘ、－ＣＯＯＸからなる群より選択され、
各Ｘ、Ｙは、同一でも異なっていてもよい]。
[７]　式（I)により表される反応促進剤が、下記の式で表される反応促進剤である、１に記載の方法、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000048
 ［式中、
Ｒ１は、場合により１又は複数の置換基により置換されていてもよい、ベンゼン環又はナフタレン環であり、
前記の置換基は、－ＮＯ２、－ＳＯ３Ｘ、及び
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000049
 からなる群より選択され、
Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択される]。
[８]　式（I)により表される反応促進剤において、Ｒ１が、場合により１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環であり、Ｒ２が、場合により１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の５員単環の、少なくとも１つの窒素原子、硫黄原子若しくは酸素原子を含む複素環である、１に記載の方法。　
[９]　Ｒ２が、場合により１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の５員単環の、２つの窒素原子を含む複素環であり、該複素環が
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000050
 により置換されており、式中、Ｘは１に定義したとおりであり、各Ｘは同一でも異なっていてもよい、１又は８に記載の方法。
[１０]　Ｒ２が、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000051
 であり、式中、Ｘは１に定義したとおりであり、各Ｘは同一でも異なっていてもよい、１、８又は９に記載の方法。　
[１１]　式（I)により表される化合物が、
以下の式により表される化合物、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000052
 ［式中、Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択される]、
以下の式により表される化合物、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000053
 ［式中、Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択される]、
以下の式により表される化合物、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000054
 ［式中、Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択され、各Ｘは、同一でも異なっていてもよい]、
以下の式により表される化合物、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000055
 ［式中、Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択され、各Ｘは、同一でも異なっていてもよい]、
以下の式により表される化合物、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000056
 ［式中、Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択される]、
以下の式により表される化合物、 
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000057
 ［式中、Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択される]、
以下の式により表される化合物、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000058
 ［式中、Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択され、各Ｘは、同一でも異なっていてもよい]、
以下の式により表される化合物、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000059
 ［式中、Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択される]、
及び、以下の式により表される化合物、
からなる群より選択される、１～１０のいずれかに記載の方法。 　
[１２]　オキシダーゼが、アマドリアーゼ、サルコシンオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼからなる群より選択されるオキシダーゼである、１～１１のいずれかに記載の方法。 　
[１３]　式（I)により表される化合物を含む、オキシダーゼ反応促進剤、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000061
 ［式中、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、場合により１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の５～６員単環の、炭素環又は少なくとも１つの窒素原子、硫黄原子若しくは酸素原子を含む複素環、或いは前記芳香族の５～６員単環の炭素環若しくは複素環を含む９～１０員の縮合環であり、
前記の置換基は、－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－Ａｔ、－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ２－６アルケニル、－Ｃ２－６アルキニル、＝Ｏ、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－６アルキル、－ＣＯＮＨ２、－ＮＯ２、－ＮＨ２、－ＣＯ－ＮＨ２、－Ｒ３、－ＮＨ－Ｒ４、－ＮＨＣＯ－ＮＨ－Ｒ５－Ｎ＝Ｎ－Ｒ６、－ＳＯ３Ｘ、－ＣＯＯＸ、Ｙ、Ｚからなる群より選択され、
Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択され、
Ｙは、－Ｈ、－ＳＯ３Ｘ、－ＣＯＯＸからなる群より選択され、
Ｚは、－Ｈ、－Ｃ１－６アルキル、－Ｏ－Ｃ１－６アルキル、－ＳＯ３Ｘからなる群より選択され、
各Ｘ、Ｙ、Ｚは、同一でも異なっていてもよく、
－Ｒ３は、－Ｈであるか、或いは、場合により－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－Ａｔ、－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ２－６アルケニル、－Ｃ２－６アルキニル、＝Ｏ、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－６アルキル、－ＣＯＮＨ２、－ＮＯ２、－ＮＨ２、－ＳＯ３Ｘ、からなる群より選択される１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の５～６員単環の、炭素環又は少なくとも１つの窒素原子、硫黄原子若しくは酸素原子を含む複素環、或いは前記芳香族の５～６員単環の炭素環若しくは複素環を含む９～１０員の縮合環であり、
－Ｒ４は、場合により－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－Ａｔ、－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ２－６アルケニル、－Ｃ２－６アルキニル、＝Ｏ、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－６アルキル、－ＣＯＮＨ２、－ＮＯ２、－ＮＨ２、－ＳＯ３Ｘ、－ＣＯＯＸ、Ｙ、Ｚからなる群より選択される１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の５～６員単環の、炭素環又は少なくとも１つの窒素原子、硫黄原子若しくは酸素原子を含む複素環、或いは前記芳香族の５～６員単環の炭素環若しくは複素環を含む９～１０員の縮合環であり、
－Ｒ５及び－Ｒ６は、それぞれ独立に、場合により－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－Ａｔ、－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ２－６アルケニル、－Ｃ２－６アルキニル、＝Ｏ、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－６アルキル、－Ｏ－ＣＨ３、－ＣＯＮＨ２、－ＮＯ２、－ＮＨ２、－ＳＯ３Ｘ、－ＣＯＯＸ、Ｙ、Ｚからなる群より選択される１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の５～６員単環の、炭素環又は少なくとも１つの窒素原子、硫黄原子若しくは酸素原子を含む複素環、或いは前記芳香族の５～８員単環の炭素環若しくは複素環を含む９～１０員の縮合環であり、
　ただし、Ｒ１又はＲ２が、芳香族の５員単環の、炭素環又は少なくとも１つの窒素原子、硫黄原子若しくは酸素原子を含む複素環である場合には、該複素環は－ＣＯＯＸにより置換されたものではない]。
[１４]　式（I)により表される反応促進剤において、Ｒ１及びＲ２が、それぞれ独立に、場合により置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環、或いは前記芳香族の６員単環の炭素環を含む１０員の縮合環である、１３に記載の反応促進剤。
[１５]　式（I)により表される化合物において、Ｒ１及びＲ２が、それぞれ独立に、　　
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000062
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000063
からなる群より選択され、式中、Ｘ、Ｙ、Ｚは１２に定義したとおりである、１３又は１４に記載の反応促進剤。
[１６]　式（I)により表される反応促進剤において、Ｒ１が、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000064
 からなる群より選択され、Ｒ２が、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000065
 からなる群より選択され、式中、Ｘは１２に定義したとおりである、１３～１５のいずれかに記載の反応促進剤。
[１７]　式（I)により表される反応促進剤が、下記の式で表される反応促進剤である、１３～１６のいずれかに記載の反応促進剤、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000066
 ［式中、
Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択され、
Ｙは、－Ｈ、－ＳＯ３Ｘ、－ＣＯＯＸからなる群より選択され、
各Ｘ、Ｙは、同一でも異なっていてもよく、
－Ｒ３は、－Ｈ又は－ＮＨＣＯ－ＮＨ－Ｒ５－Ｎ＝Ｎ－Ｒ６であるか、或いは、場合により－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－Ａｔ、－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ２－６アルケニル、－Ｃ２－６アルキニル、＝Ｏ、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－６アルキル、－ＣＯＮＨ２、－ＮＯ２、－ＮＨ２、－ＳＯ３Ｘ、からなる群より選択される１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環、或いは前記炭素環を含む１０員の縮合環であり、
－Ｒ５及び－Ｒ６は、それぞれ独立に、場合により－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－Ａｔ、－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ２－６アルケニル、－Ｃ２－６アルキニル、＝Ｏ、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－６アルキル、－Ｏ－ＣＨ３、－ＣＯＮＨ２、－ＮＯ２、－ＮＨ２、－ＳＯ３Ｘ、からなる群より選択される１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環、或いは前記炭素環を含む１０員の縮合環である]。
[１８]　式（I)により表される反応促進剤が、下記のいずれかの式で表される反応促進剤である、１３～１７のいずれかに記載の反応促進剤、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000067
 ［式中、
Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択され、
Ｙは、－Ｈ、－ＳＯ３Ｘ、－ＣＯＯＸからなる群より選択され、
各Ｘ、Ｙ、Ｚは、同一でも異なっていてもよい]。
[１９]　式（I)により表される反応促進剤が、下記の式で表される反応促進剤である、１３～１７のいずれかに記載の反応促進剤、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000068
 ［式中、
Ｒ１は、場合により１又は複数の置換基により置換されていてもよい、ベンゼン環又はナフタレン環であり、
前記の置換基は、－ＮＯ２、－ＳＯ３Ｘ、及び
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000069
 からなる群より選択され、
Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択される]。
[２０]　式（I)により表される反応促進剤において、Ｒ１が、場合により１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環であり、Ｒ２が、場合により１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の５員単環の、少なくとも１つの窒素原子、硫黄原子若しくは酸素原子を含む複素環である、１３に記載の反応促進剤。
[２１]　Ｒ２が、場合により１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の５員単環の、２つの窒素原子を含む複素環であり、該複素環が
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000070
 により置換されており、式中、Ｘは１２に定義したとおりであり、各Ｘは同一でも異なっていてもよい、１３又は２０に記載の反応促進剤。
[２２]　Ｒ２が、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000071
 であり、式中、Ｘは１２に定義したとおりであり、各Ｘは同一でも異なっていてもよい、１３、２０又は２１に記載の反応促進剤。
[２３]　式（I)により表される化合物が、
以下の式により表される化合物、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000072
 以下の式により表される化合物、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000073
 ［式中、Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択される]、
以下の式により表される化合物、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000074
 ［式中、Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択され、各Ｘは、同一でも異なっていてもよい]、
以下の式により表される化合物、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000075
 ［式中、Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択され、各Ｘは、同一でも異なっていてもよい]、
以下の式により表される化合物、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000076
 ［式中、Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択される]、
以下の式により表される化合物、 
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000077
 以下の式により表される化合物、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000078
 ［式中、Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択され、各Ｘは、同一でも異なっていてもよい]、
以下の式により表される化合物、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000079
 ［式中、Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択される]
及び、以下の式により表される化合物、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000080
 からなる群より選択される、１３～２２のいずれかに記載の反応促進剤。
[２４]　１３～２３のいずれかに記載の反応促進剤及びオキシダーゼを含む、組成物。
[２５]　オキシダーゼが、アマドリアーゼ、サルコシンオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼからなる群より選択されるオキシダーゼである、２４に記載の組成物。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2016-138547号の開示内容を包含する。
　本発明の効果として、オキシダーゼが触媒する酵素反応を促進しうる。これにより測定に必要な酵素量を軽減したり、同じ酵素量でも反応時間を短縮したり、測定感度を高めたりすることができる。例えばある実施形態において、アマドリアーゼが触媒する酵素反応を促進することができる。これによりHbA1c測定試薬へのアマドリアーゼの処方量、例えばA1cOXの処方量や、GA測定試薬へのアマドリアーゼの処方量を、本発明のアマドリアーゼ反応促進剤を添加しない場合と比較して、低減することができる。また同一のアマドリアーゼの処方量であれば、酵素反応が促進されるため、測定の高感度化及び／又は反応時間短縮が可能となる。他のオキシダーゼ（例えばサルコシンオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ等）についても、同様である。
希釈試料と第１試薬を混合してから１０分間の、波長６９４ｎｍ及び７５１ｎｍの光に対する反応液の吸光度（Ａ６９４及びＡ７５１）を経時的に測定した結果を示す。横軸は時間（分）であり、縦軸はＡ６９４／７５１（Ａ６９４－Ａ７５１）である。また、Ａ６９４／７５１と、ΔＡ９ｍｉｎ及びΔＡ１０ｍｉｎとの関係を示す。
　ある実施形態において、本発明は、オキシダーゼ反応促進剤を提供する。ここでオキシダーゼ反応促進剤とは、オキシダーゼが触媒する酵素反応を促進する化合物をいう。オキシダーゼが触媒する酵素反応を促進するとは、オキシダーゼ反応促進剤が系に存在しない場合と比較して、本発明のオキシダーゼ反応促進剤が系に存在する場合、同一反応時間中により多くの生成物（過酸化水素等）が生成する、又は、より短時間で反応が完了する若しくはほぼ完了することをいう。
　本発明のオキシダーゼ反応促進剤は、種々のオキシダーゼの反応を促進しうる。ある実施形態において、本発明のオキシダーゼ反応促進剤は、アマドリアーゼの反応を促進しうる。この場合、本発明のオキシダーゼ反応促進剤のことをアマドリアーゼ反応促進剤ともいう。ある実施形態において、本発明のオキシダーゼ反応促進剤は、サルコシンオキシダーゼの反応を促進しうる。この場合、本発明のオキシダーゼ反応促進剤のことをサルコシンオキシダーゼ反応促進剤ともいう。ある実施形態において、本発明のオキシダーゼ反応促進剤は、コレステロールオキシダーゼの反応を促進しうる。この場合、本発明のオキシダーゼ反応促進剤のことをコレステロールオキシダーゼ反応促進剤ともいう。なお、これらの名称はあくまで便宜上のものである。例えば同一の反応促進剤化合物が、アマドリアーゼの反応を促進し、かつ、サルコシンオキシダーゼの反応を促進することがあり、このような反応促進剤は、アマドリアーゼ反応促進剤に該当するとともにサルコシンオキシダーゼ反応促進剤にも該当する。したがってアマドリアーゼ反応促進剤などの名称は、何ら本発明の反応促進剤を限定する意味に解されてはならない。本明細書において本発明の反応促進剤という場合、特に断らない限りこれはオキシダーゼ反応促進剤を意味する。
　ある実施形態において、本発明のオキシダーゼ反応促進剤は、アマドリアーゼの反応を促進しうる。ある実施形態において反応が促進されるアマドリアーゼとしては、α-フルクトシルバリン（αFV）、α-フルクトシルバリルヒスチジン（αFVH）、及び／又はα-フルクトシルヘキサペプチド（αF6P）を基質とするアマドリアーゼが挙げられるがこれに限らない。ある実施形態において、反応が促進されるアマドリアーゼとしては、ε－フルクトシルリジン（ε－ＦＫ）を基質とするアマドリアーゼが挙げられる。ある実施形態において、反応が促進されるアマドリアーゼとしては、ヘモグロビンA1ｃに直接作用するアマドリアーゼ、すなわちヘモグロビンA1ｃオキシダーゼ（A1cOX）が挙げられる。この場合、本発明のアマドリアーゼ反応促進剤のことをヘモグロビンA1ｃオキシダーゼ反応促進剤ともいう。
　ある実施形態において、本発明は、オキシダーゼ及びオキシダーゼ反応促進剤を用いる工程を含む方法を提供する。例えばある実施形態において、本発明は、オキシダーゼ及びオキシダーゼ反応促進剤を用いることを含む、オキシダーゼ反応生成物の測定方法を提供する。別の実施形態では、本発明はオキシダーゼ及びオキシダーゼ反応促進剤を用いることを含む、生成物の合成方法を提供する。別の実施形態では、本発明はオキシダーゼ及びオキシダーゼ反応促進剤を用いることを含む、過酸化水素の生成方法を提供する。この方法は例えば、生成する過酸化水素を利用し、殺菌、洗浄、酸化反応などに適用しうる。
　ある実施形態において、本発明は、オキシダーゼ及びオキシダーゼ反応促進剤を用いる工程を含む、測定対象物質の測定方法を提供する。ある実施形態において、本発明の方法は、測定対象物質を含み得る試料にペルオキシダーゼ、及びオキシダーゼ反応促進剤を含む第１試薬を添加し加温する工程、発色剤と反応促進されるオキシダーゼとを含む第２試薬を添加し加温する工程、並びに試料の吸光度を測定する工程を含む。ペルオキシダーゼ、及びオキシダーゼ反応促進剤を含む第１試薬は、単一の試薬でもよく、個別の成分をそれぞれ含有する複数の試薬の組み合わせでもよい。発色剤と反応促進されるオキシダーゼを含む第２試薬は、単一の試薬でもよく、個別の成分をそれぞれ含有する複数の試薬の組み合わせでもよい。別の実施形態では、本発明の測定方法は、測定対象物質を含み得る試料にペルオキシダーゼ、発色剤及びオキシダーゼ反応促進剤を含む第1試薬を添加し加温する工程、反応促進されるオキシダーゼを含む第２試薬を添加し加温する工程、並びに試料の吸光度を測定する工程を含む。やはり試薬中の各成分は、単一の試薬でもよく、個別の成分をそれぞれ含有する複数試薬の組み合わせでもよい。測定は定性的でも定量的でもよい。
　別の実施形態において、本発明の測定方法は、測定対象物質を含み得る試料に、ペルオキシダーゼ、オキシダーゼ反応促進剤、発色剤及び反応促進されるオキシダーゼを含む測定試薬を添加し加温する工程、並びに試薬の吸光度を測定する工程を含む。ペルオキシダーゼ、オキシダーゼ反応促進剤、発色剤及び反応促進されるオキシダーゼを含む測定試薬は単一の試薬でもよく、個別の成分をそれぞれ含有する複数の試薬の組み合わせでもよい。
　ある実施形態において、本発明は、アマドリアーゼ及びアマドリアーゼ反応促進剤を用いる工程を含む、HbA1cの測定方法を提供する。ある実施形態において、本発明のHbA1cの測定方法は、HbA1cを含み得る試料にペルオキシダーゼ、及びアマドリアーゼ反応促進剤を含む第１試薬を添加し加温する工程、発色剤とアマドリアーゼを含む第２試薬を添加し加温する工程、並びに試料の吸光度を測定する工程を含む。ペルオキシダーゼ、及びアマドリアーゼ反応促進剤を含む第１試薬は、単一の試薬でもよく、個別の成分をそれぞれ含有する複数の試薬の組み合わせでもよい。発色剤とアマドリアーゼを含む第２試薬は、単一の試薬でもよく、個別の成分をそれぞれ含有する複数の試薬の組み合わせでもよい。別の実施形態では、本発明のHbA1cの測定方法は、HbA1cを含み得る試料にペルオキシダーゼ、発色剤及びアマドリアーゼ反応促進剤を含む第1試薬を添加し加温する工程、アマドリアーゼを含む第２試薬を添加し加温する工程、並びに試料の吸光度を測定する工程を含む。やはり試薬中の各成分は、単一の試薬でもよく、個別の成分をそれぞれ含有する複数試薬の組み合わせでもよい。測定は定性的でも定量的でもよい。ある実施形態では、ペルオキシダーゼ及びアマドリアーゼ反応促進剤を含む第１試薬を添加し加温する工程において、さらに試料中の全ヘモグロビンを定量することができる。ある実施形態ではさらに、定量した全ヘモグロビン及び糖化ヘモグロビンから、試料中の全ヘモグロビンに対する糖化ヘモグロビンの割合、HbA1c％を算出しうる。
　別の実施形態において、本発明のHbA1cの測定方法は、HbA1cを含み得る試料に、ペルオキシダーゼ、アマドリアーゼ反応促進剤、発色剤及びアマドリアーゼを含む測定試薬を添加し加温する工程、並びに試薬の吸光度を測定する工程を含む。ペルオキシダーゼ、アマドリアーゼ反応促進剤、発色剤及びアマドリアーゼを含む測定試薬は単一の試薬でもよく、個別の成分をそれぞれ含有する複数の試薬の組み合わせでもよい。
　ある実施形態において、アマドリアーゼとしてはαFV、αFVH及び／又はαF6P等の糖化基質に作用するアマドリアーゼを用いることができる。この場合、本発明のHbA1c測定方法は、HbA1cをプロテアーゼで前処理する工程をさらに有しうる。プロテアーゼとしては任意の公知のものを使用しうる。別の実施形態において、アマドリアーゼとして、ε－ＦＫに作用するアマドリアーゼを用いることができる。これは糖化アルブミン（ＧＡ）の測定方法に利用することができる。この場合、GA測定方法は、ＧＡをプロテアーゼで前処理する工程をさらに有しうる。別の実施形態において、アマドリアーゼとして、HbA1cに直接作用するヘモグロビンA1ｃオキシダーゼ（A1cOX）を用いることができる。この場合、プロテアーゼでの前処理は行わなくともよい。
　ある実施形態において、本発明は、サルコシンオキシダーゼ及び本発明の反応促進剤を用いる工程を含む、サルコシンの測定方法を提供する。この測定方法には、上流工程として、クレアチニンをクレアチニンアミドヒドロラーゼ（クレアチニナーゼともいう）によりクレアチンに変換し、クレアチンをクレアチンアミジノヒドロラーゼ（クレアチナーゼともいう）によりサルコシンに変換する工程を追加してもよい。これによりクレアチニン又はクレアチンの測定方法が提供される。ある実施形態において、本発明の測定方法は、測定対象物質（サルコシン）を含み得る試料にペルオキシダーゼ、及び本発明の反応促進剤を含む第１試薬を添加し加温する工程、発色剤とサルコシンオキシダーゼとを含む第２試薬を添加し加温する工程、並びに試料の吸光度を測定する工程を含む。ペルオキシダーゼ、及び本発明の反応促進剤を含む第１試薬は、単一の試薬でもよく、個別の成分をそれぞれ含有する複数の試薬の組み合わせでもよい。発色剤とサルコシンオキシダーゼとを含む第２試薬は、単一の試薬でもよく、個別の成分をそれぞれ含有する複数の試薬の組み合わせでもよい。別の実施形態では、本発明の測定方法は、測定対象物質を含み得る試料にペルオキシダーゼ、発色剤及び本発明の反応促進剤を含む第1試薬を添加し加温する工程、サルコシンオキシダーゼを含む第２試薬を添加し加温する工程、並びに試料の吸光度を測定する工程を含む。やはり試薬中の各成分は、単一の試薬でもよく、個別の成分をそれぞれ含有する複数試薬の組み合わせでもよい。測定は定性的でも定量的でもよい。
　別の実施形態において、本発明の測定方法は、測定対象物質を含み得る試料に、ペルオキシダーゼ、本発明の反応促進剤、発色剤及びサルコシンオキシダーゼを含む測定試薬を添加し加温する工程、並びに試薬の吸光度を測定する工程を含む。ペルオキシダーゼ、本発明の反応促進剤、発色剤及び反応促進されるオキシダーゼを含む測定試薬は単一の試薬でもよく、個別の成分をそれぞれ含有する複数の試薬の組み合わせでもよい。
　ある実施形態において、本発明は、コレステロールオキシダーゼ及び本発明の反応促進剤を用いる工程を含む、コレステロールの測定方法を提供する。この測定方法には、上流工程として、コレステロールエステルをコレステロールエステラーゼによりコレステロールに変換する工程を追加してもよい。ある実施形態において、本発明の測定方法は、コレステロールを含み得る試料にペルオキシダーゼ、及び本発明の反応促進剤を含む第１試薬を添加し加温する工程、発色剤とコレステロールオキシダーゼとを含む第２試薬を添加し加温する工程、並びに試料の吸光度を測定する工程を含む。ペルオキシダーゼ、及び本発明の反応促進剤を含む第１試薬は、単一の試薬でもよく、個別の成分をそれぞれ含有する複数の試薬の組み合わせでもよい。発色剤とコレステロールオキシダーゼとを含む第２試薬は、単一の試薬でもよく、個別の成分をそれぞれ含有する複数の試薬の組み合わせでもよい。別の実施形態では、本発明の測定方法は、コレステロールを含み得る試料にペルオキシダーゼ、発色剤及び本発明の反応促進剤を含む第1試薬を添加し加温する工程、コレステロールオキシダーゼを含む第２試薬を添加し加温する工程、並びに試料の吸光度を測定する工程を含む。やはり試薬中の各成分は、単一の試薬でもよく、個別の成分をそれぞれ含有する複数試薬の組み合わせでもよい。測定は定性的でも定量的でもよい。
　別の実施形態において、本発明の測定方法は、コレステロールを含み得る試料に、ペルオキシダーゼ、本発明の反応促進剤、発色剤及びコレステロールオキシダーゼを含む測定試薬を添加し加温する工程、並びに試薬の吸光度を測定する工程を含む。ペルオキシダーゼ、本発明の反応促進剤、発色剤及びコレステロールオキシダーゼを含む測定試薬は単一の試薬でもよく、個別の成分をそれぞれ含有する複数の試薬の組み合わせでもよい。
　試料溶液に添加する本発明の反応促進剤の終濃度は特に限定されず、例えば、０．０１～２００ｍＭ、０．０２～１５０ｍＭ、０．０３～１００ｍＭ、０．０４～８０ｍＭ、０．０５～６０ｍＭ、０．０６～５０ｍＭ、０．０８～４０ｍＭ、０．１ｍＭ～３０ｍＭ、０．１５～２０ｍＭ、０．２～１０ｍＭ、０．３～５ｍＭ、０．４～３ｍＭ、例えば０．０５～１０ｍＭの範囲であり得る。試料溶液に添加する本発明の反応促進剤の終濃度は特に限定されず、例えば０．００１～５％（ｗ／ｖ）、０．００３～３％（ｗ／ｖ）、０．００５～１％（ｗ／ｖ）、０．０１～０．５％（ｗ／ｖ）、０．０２～０．３％（ｗ／ｖ）、０．０３～０．１％（ｗ／ｖ）であり得る。なお、反応促進剤と他の酵素や試薬との添加順序は制限されず、同時でも逐次添加でもよい。
　例えば測定対象物質が糖化基質であり、試料溶液中の糖化基質濃度が０～０．５ｍＭの場合、添加するアマドリアーゼ反応促進剤の終濃度は、例えば、０．０１～２０ｍＭ、例えば０．０２～１０ｍＭとすることができる。
　例えば測定対象物質がHbA1cであり、試料溶液中のHbA1c濃度が０～０．５ｍＭの場合、添加するアマドリアーゼ反応促進剤の終濃度は、例えば、０．０１～２０ｍＭ、例えば０．０２～１０ｍＭとすることができる。
　例えば測定対象物質がサルコシンであり、試料溶液中のサルコシン濃度が0.1～2mg/dLの場合、添加するサルコシンオキシダーゼ反応促進剤の終濃度は、例えば、０．０１～２０ｍＭ、例えば０．０２～１０ｍＭとすることができる。なお本明細書にいう、測定対象物質をサルコシンとする方法は、上流工程として、クレアチニンをクレアチニンアミドヒドロラーゼ（クレアチニナーゼともいう）によりクレアチンに変換し、クレアチンをクレアチンアミジノヒドロラーゼ（クレアチナーゼともいう）によりサルコシンに変換する工程を含む方法を包含するものとする。
　例えば測定対象物質がコレステロールであり、試料溶液中のコレステロール濃度が1～1000mg/dLの場合、添加するコレステロールオキシダーゼ反応促進剤の終濃度は、例えば、０．０１～２０ｍＭ、例えば０．０２～１０ｍＭとすることができる。
　ある実施形態において合計反応時間は、６０分以下、３０分以下、２０分以下、好ましくは１５分以下、好ましくは１０分程度とすることができる。例えば、上記の第1試薬添加後の加温を３０分以下、２０分以下、１５分以下、１０分、例えば５分程度とすることができ、上記の第2試薬添加後の加温を３０分以下、２０分以下、１５分以下、１０分、例えば５分程度とすることができる。また、試料に含まれると推定される測定対象物質（例えば糖化ヘモグロビン）の濃度範囲に対して、オキシダーゼ（例えばアマドリアーゼ）による反応が完了するか又はほぼ完了するよう、測定試薬の各成分の濃度を調節することができる。反応が完了するとは、試料に含まれる測定対象物質（例えば糖化ヘモグロビン又は糖化基質）の１００％が反応したことをいう。反応がほぼ完了するとは、試料に含まれる測定対象物質（例えば糖化ヘモグロビン又は糖化基質）の例えば９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上が反応したことをいう。
　吸光度測定における測定波長は、発色剤に応じて選択することができる。吸光度の測定波長は、例えば340～900nm、590～900nm、600～751nm、610～730nmでありうる。ある実施形態において、２つの測定波長A1及びA2で測定を行い、その差（A1-A2又はA1/A2と表記することがある）を取得することもできる。２つの測定波長A1及びA2は、590～900nmの範囲の任意の２つの波長とすることができる。例えばA1を色素の吸光波長とし、A2をバックグラウンド波長とし、その差（A1-A2）を算出し得る。吸光度の測定波長は、フェノチアジン誘導体色素を用いる場合、590～730nm、例えば610～710nmでありうる。バックグラウンド波長は、フェノチアジン誘導体色素を用いる場合、当該フェノチアジン誘導体色素の吸収がほとんどない領域、例えば710nmより高く900nm以下である範囲から選択することができる。例えばA1＝A694とし、A2＝A751とし、これらからA694-A751を算出してもよい。吸収波長をA1＝A654としてもよい。吸光度測定は自動分析装置を用いて行ってもよい。
　発色剤は、特に限定されないが、過酸化水素存在下でのペルオキシダーゼの触媒反応により吸光度が変化する化合物が好ましい。発色剤としては、４－アミノアンチピリンや、例えば、ＡＤＯＳ（Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－ｍ－アニシジン）、ＡＬＯＳ（Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）アニリン）、ＴＯＯＳ（Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－ｍ－トルイジンナトリウム）、ＤＡ－６７（１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３、７－ビス（ジメチルアミノ）－フェノシアジン）、ＤＡ－６４（Ｎ－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－４、４’－ビス（ジメチルアミノ）－ジフェニルアミン）等が挙げられる。ＡＤＯＳ、ＡＬＯＳ、ＴＯＯＳは４－アミノアンチピリンと縮合した際に発色する。ＤＡ－６４、ＤＡ－６７は４－アミノアンチピリンを必要とせず、単独で処方するだけで発色する。いずれの場合も、発色反応はパーオキシダーゼにより触媒される。さらに発色剤として、メチレンブルー、１０－（アセチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン、１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン、１０－（フェニルカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン、１０－（３－（メチルカルボキシアミノ）－ヘキサメチル－アミノ）－フェノチアジン、１０－（（３－（メチルカルボキシアミノ）－４－メチル－フェニル）－アミノ）－フェノチアジン、１０－（（３－（メチルカルボキシアミノメチル）－フェニル）－メチルアミノ）－フェノチアジン、１０－（１－ナフタレンアミノ）－フェノチアジン、１０－（メチル）－フェノチアジン、１０－（フェニルアミノ）－フェノチアジン、１０－（メチルアミノ）－フェノチアジン、アズールＡ、アズールＢ、アズールＣ、トルイジンブルーＯ、１，９－ジメチル－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン塩、メチレングリーン若しくはその塩、又はそのロイコ体等が挙げられるがこれに限らない。発色剤は、反応溶液における終濃度が、０.００１～１０ｍＭ、例えば０.００５～２ｍＭとなるよう添加しうる。
　オキシダーゼとしては、任意の公知のアマドリアーゼ、サルコシンオキシダーゼ、及びコレステロールオキシダーゼを使用しうるがこれに限らない。公知のサルコシンオキシダーゼについては例えば特許文献１５～１７を参照のこと。公知のコレステロールオキシダーゼについては、例えば特許文献１９を参照のこと。参照によりそれらの全内容を本明細書に組み入れる。これらの改変体や均等物も使用しうる。
　アマドリアーゼとしては任意の公知のものを使用しうる。例えばアマドリアーゼとしては、αFV、αFVH及び／又はαF6P等の糖化基質に作用するものが挙げられる。例えば特許文献１～７、８～１１を参照されたい。他の公知のアマドリアーゼも使用しうる。またアマドリアーゼとしては、HbA1cに直接作用するA1cOXが挙げられ、特許文献１２、１３に記載のもの等が例示される。同等の機能を有する他のA1cOXも使用しうる。またアマドリアーゼとしては、ε－ＦＫに作用するアマドリアーゼが挙げられ、特許文献２０に記載のもの等が例示される。参照によりこれらの全内容を本明細書に組み入れる。
　アマドリアーゼ反応では、糖化基質又はHbA1cを含み得る試料溶液にアマドリアーゼを添加し、基質にアマドリアーゼを作用させて過酸化水素を生成させる。このとき、系に本発明アマドリアーゼ反応促進剤を共存させる。
　アマドリアーゼは、α及び／又はε-アミノ基が糖化された、糖化アミノ酸、糖化ペプチド又は糖化タンパク質に作用して、過酸化水素及びα－ケトアルデヒドを発生する反応を触媒する。このとき、系に本発明アマドリアーゼ反応促進剤が存在すると、この反応が促進されると考えられる。ただし本発明は特定の作用機序に拘束されるものではない。
　アマドリアーゼ反応は緩衝溶液中で行うことができる。プロテアーゼを用いた前処理を行う場合は、当該前処理反応と同じまたは異なる緩衝溶液をアマドリアーゼ反応に使用しうる。反応溶液のｐＨは特に限定されないが、例えば３～１１、４～１０、５～９、例えば６～８でありうる。反応温度は、例えば、１０～４５℃、１０～３８℃、２０～３７℃、例えば２５～３７℃でありうる。反応時間は、０．１～６０分、０．１～３０分、０．１～２０分、０．～１５分、０．１～１０分、例えば０．１～５分であり得る。
　サルコシンオキシダーゼを用いた反応は緩衝溶液中で行うことができる。上流工程として、クレアチニナーゼ及びクレアチナーゼを用いて、クレアチニンをクレアチンに、次いでサルコシンに変換する場合は、当該上流工程での反応と同じまたは異なる緩衝溶液をサルコシンオキシダーゼを用いた反応に使用しうる。反応溶液のｐＨは特に限定されないが、例えば３～１１、４～１０、５～９、例えば６～８でありうる。反応温度は、例えば、１０～４５℃、１０～３８℃、２０～３７℃、例えば２５～３７℃でありうる。反応時間は、０．１～６０分、０．１～３０分、０．１～２０分、０．～１５分、０．１～１０分、例えば０．１～５分であり得る。
　コレステロールオキシダーゼを用いた反応は緩衝溶液中で行うことができる。コレステロールエステラーゼを用いた前処理を行う場合は、当該前処理反応と同じまたは異なる緩衝溶液をコレステロールオキシダーゼ反応に使用しうる。反応溶液のｐＨは特に限定されないが、例えば３～１１、４～１０、５～９、例えば６～８でありうる。反応温度は、例えば、１０～４５℃、１０～３８℃、２０～３７℃、例えば２５～３７℃でありうる。反応時間は、０．１～６０分、０．１～３０分、０．１～２０分、０．～１５分、０．１～１０分、例えば０．１～５分であり得る。
　オキシダーゼ（例えばアマドリアーゼ）は、試料溶液中に含まれる基質（例えば糖化基質）の量にもよるが、例えば終濃度が０.０１～５０Ｕ/ｍＬ、０.１～２０Ｕ/ｍＬ、０．２～１０Ｕ／ｍＬ、例えば０.５～１０Ｕ／ｍＬとなるよう試料に添加することができる。酵素活性「Ｕ」は、αFVを基質とするアマドリアーゼについては、αFVを基質として１分間に１マイクロモルの過酸化水素を生成する量を１Ｕとすることができる。酵素活性「Ｕ」は、αFVHを基質とするアマドリアーゼについては、αFVHを基質として１分間に１マイクロモルの過酸化水素を生成する量を１Ｕとすることができる。酵素活性「Ｕ」は、ε-FKを基質とするアマドリアーゼについては、ε-FKを基質として１分間に１マイクロモルの過酸化水素を生成する量を１Ｕとすることができる。酵素活性「Ｕ」は、αF6Pを基質とするアマドリアーゼについては、αF6Pを基質として１分間に１マイクロモルの過酸化水素を生成する量を１Ｕとすることができる。酵素活性「Ｕ」は、HbA1cを基質とするアマドリアーゼについては、HbA1cを基質として１分間に１マイクロモルの過酸化水素を生成する量を１Ｕとすることができる。酵素活性「Ｕ」は、サルコシンを基質とするサルコシンオキシダーゼについては、サルコシンを基質として１分間に１マイクロモルの尿素を生成する量を１Ｕとすることができる。酵素活性「Ｕ」は、コレステロールを基質とするコレステロールオキシダーゼについては、コレステロールを基質として１分間に１マイクロモルの過酸化水素を生成する量を１Ｕとすることができる。本明細書では、アマドリアーゼについて、特に断らない限り、酵素活性「Ｕ」は、HbA1cを基質として１分間に１マイクロモルの過酸化水素を生成する量を１Ｕとして定義する。
　ペルオキシダーゼとしては任意の公知のものを使用しうる。ペルオキシダーゼは、過酸化水素と発色剤との酸化還元反応を触媒する。この反応により発色剤が発色する。ペルオキシダーゼを用いる条件は特に制限されず、反応液のｐＨは、例えば、５～９であり、処理温度は、例えば、１０～４０℃の範囲であり、好ましくは２５～３７℃である。処理時間も特に制限されず、０.１～６０分、０.１～１０分、例えば０.１～５分でありうる。ペルオキシダーゼは、終濃度が０.０１～３００ＫＵ/Ｌ、例えば０.５～５０ＫＵ／Ｌとなるよう反応溶液に添加しうる。ペルオキシダーゼの活性「Ｕ」は、次の反応条件下で、20秒間に1mgのプルプロガリン(purpurogallin)を生成する酵素(POD)量を1 プルプロガリン単位と定義する：
試薬：
A. 5%(W/V)ピロガロール水溶液
B. 0.147M H2O2水溶液(30%(W/V)H2O2溶液1.67mlを蒸留水で希釈して100mlとする)
C. 0.1Mリン酸緩衝液、pH6.0 (反応混液及び酵素希釈用)
D. 2.0N H2SO4溶液
酵素溶液：酵素標品を予め氷冷した0.1Mリン酸緩衝液、pH6.0で溶解し、同緩衝液で3.0～6.0 プルプロガリン U/Pに希釈して氷冷保存する
手順：
１　試験管(32φ×200mm)に下記反応混液を調製し、20℃で約５分間予備加温する
14.0ml 蒸留水
2.0ml ピロガロール水溶液(A)
1.0ml H2O2水溶液(B)
2.0ml リン酸緩衝液(C)
２　酵素溶液1.0mlを加え、反応を開始する。 
３　20℃で正確に20秒間反応させた後、H2SO4溶液(D)1.0mlを加えて反応を停止させる。反応停止後の混液から生成したプルプロガリンをエーテル15mlで抽出する。この操作を5回繰り返し、抽出液を合わせ、更にエーテルを加えて全量を100 mlにする。この液について420nmにおける吸光度を測定する(OD test)。 
４　盲検は反応混液１を20℃で20秒間放置後、H2SO4溶液(D)1.0mlを加えて混和し、次いで酵素溶液1.0mlを加えて調製する。この液につき上記同様にエーテル抽出を行って吸光度を測定する(ODblank)。 
計算式は次のとおりである：
U/ml＝ΔOD(OD test-OD blank)×希釈倍率／（0.117×1ml）
　　＝ΔOD×8.547×希釈倍率
U/mg ＝ U/ml×1/C
0.117 : 1mg% プルプロガリンエーテル溶液の420nmにおける吸光度
C : 溶解時の酵素濃度(c mg/ml)
1プルプロガリン単位は13.5国際単位(o-ジアニシジンを基質とし、25℃の反応条件下)に相当する。
　吸光度測定には、任意の公知の分光光度計や検出機器を使用しうる。反応溶液の吸光度は発色した発色剤の量を示し、ここから試料中の測定対象物質（例えばHbA1c）濃度を決定しうる。例えば濃度が既知の基質（例えば濃度が既知の糖化ヘモグロビン又は糖化基質）を含む標準物質についての吸光度を測定し、濃度と吸光度の関係をプロットして検量線を作成しうる。次いで、濃度未知の基質（例えば糖化ヘモグロビン又は糖化基質）を含む試料について吸光度を測定し、前記検量線から基質（例えば糖化ヘモグロビン又は糖化基質）の濃度を決定しうる。
　ある実施形態において、本発明は、オキシダーゼ反応促進剤を含む組成物を提供する。この組成物は場合により、オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、緩衝剤、安定化剤、発色剤、界面活性剤等を含み得る。また本発明の組成物に、マーカーや化合物を測定するためのさらなる酵素や試薬を追加してもよい。
　ある実施形態において、本発明は、アマドリアーゼ反応促進剤を含む、HbA1c測定用の組成物を提供する。この組成物は場合により、アマドリアーゼ、ペルオキシダーゼ、緩衝剤、安定化剤、発色剤、界面活性剤等を含み得る。また本発明の組成物に、HbA1c以外のマーカーや化合物を測定するためのさらなる酵素や試薬を追加してもよい。
　ある実施形態において、本発明は、サルコシンオキシダーゼ反応促進剤を含む、サルコシン測定用の組成物を提供する。この組成物は場合により、クレアチニンアミドヒドロラーゼ、クレアチンアミジノヒドロラーゼ、サルコシンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、緩衝剤、安定化剤、発色剤、界面活性剤等を含み得る。クレアチニンアミドヒドロラーゼやクレアチンアミジノヒドロラーゼ、及びペルオキシダーゼを用いることによりクレアチン又はクレアチニンを測定することができる。したがってある実施形態において、本発明はさらに、サルコシンオキシダーゼ反応促進剤、クレアチニンアミドヒドロラーゼ、クレアチンアミジノヒドロラーゼ、サルコシンオキシダーゼ、及びペルオキシダーゼを含む、クレアチン又はクレアチニン測定用の組成物を提供する。
　ある実施形態において、本発明は、コレステロールオキシダーゼ反応促進剤を含む、コレステロール測定用の組成物を提供する。この組成物は場合により、コレステロールオキシダーゼ、コレステロールエステラーゼ、ペルオキシダーゼ、緩衝剤、安定化剤、発色剤、界面活性剤等を含み得る。
　緩衝剤としては、例えば、Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）－アミノメタン、硼酸塩、クエン酸塩、ジメチルグルタミン酸塩、トリシン、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ、フタル酸、酒石酸等が挙げられる。さらに必要により、溶解補助剤、安定化剤、反応性向上剤、ＨｂＡ１ｃ変性剤等として、界面活性剤（ｎ－オクチル－β－Ｄ－グルコシド、ｎ－オクチル－β－Ｄ－チオグルコシド、ｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシド、ｎ－テトラデシル－β－Ｄ－マルトシド、ｎ－オクチル－β－Ｄ－マルトシド、１－ドデシルピリジニウム塩、ヘキサデシルトリメチルアンモニウム塩、テトラデシルトリメチルアンモニウム塩、ドデシルトリメチルアンモニウム塩、トリトンＸ－１００、ブリッジ３５、ブリッジ５８、ツイーン８０、コール酸塩、ｎ－ヘプチル－β－Ｄ－チオグルコシド、３－オキサトリデシル－α－Ｄ－マンノシド、ｎ－ノニル－β－Ｄ－チオマルトシド、ｎ－デシル－β－Ｄ－マルトシド、ｎ－ウンデシル－β－Ｄ－マルトシド、トレハロースＣ８、トレハロースＣ１０、トレハロースＣ１２、トレハロースＣ１４、トレハロースＣ１６、ＢＩＧＣＨＡＰ、ｄｅｏｘｙ－ＢＩＧＣＨＡＰ、ＭＥＧＡ－８、ＭＥＧＡ－９、ＭＥＧＡ－１０、ヘキサデシルピリジニウム塩、オクタデシルトリメチルアンモニウム塩、デシルトリメチルアンモニウム塩、ノニルトリメチルアンモニウム塩、オクチルトリメチルアンモニウム塩、へキシルトリメチルアンモニウム塩、ドデシル硫酸ナトリウム等）、還元剤（ジチオスレイトール、メルカプトエタノール、Ｌ－システイン等）、亜硝酸塩、牛血清アルブミン、糖類（グリセリン、乳糖、シュークロース等）等を適宜添加してもよい。
　アマドリアーゼがA1cOXであり、糖化基質がHbA1cである場合において、A1cOXとHbA1cとの反応効率を高めるために、HbA1cを予め変性させてもよい。変性は、界面活性剤処理や熱処理、又は酸若しくはアルカリでの処理により行うことができる。変性処理として界面活性剤添加と熱処理の両方を行う場合、その順序は任意である。熱処理はHbA1cの全部又は一部を変性させるのに十分な温度及び時間で行われうる。処理温度は例えば６０℃以上、７０℃以上、８０℃以上、９０℃以上、例えば９８℃とすることができる。処理時間は温度にもよるが例えば１０秒以上、２０秒、３０秒以上、１分以上、又は２分以上であり得る。界面活性剤の例は上述したとおりであり、これらを適当な濃度で添加しうる。
　ある実施形態において、本発明のオキシダーゼ反応促進剤は以下の式（I)により表される化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000081
 ［式中、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、場合により１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の５～６員単環の、炭素環又は少なくとも１つの窒素原子、硫黄原子若しくは酸素原子を含む複素環、或いは前記芳香族の５～６員単環の炭素環若しくは複素環を含む９～１０員の縮合環であり、
前記の置換基は、－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－Ａｔ、－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ２－６アルケニル、－Ｃ２－６アルキニル、＝Ｏ、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－６アルキル、－ＣＯＮＨ２、－ＮＯ２、－ＮＨ２、－ＣＯ－ＮＨ２、－Ｒ３、－ＮＨ－Ｒ４、－ＮＨＣＯ－ＮＨ－Ｒ５－Ｎ＝Ｎ－Ｒ６、－ＳＯ３Ｘ、－ＣＯＯＸ、Ｙ、Ｚからなる群より選択され、
Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択され、
Ｙは、－Ｈ、－ＳＯ３Ｘ、－ＣＯＯＸからなる群より選択され、
Ｚは、－Ｈ、－Ｃ１－６アルキル、－Ｏ－Ｃ１－６アルキル、－ＳＯ３Ｘからなる群より選択され、
各Ｘ、Ｙ、Ｚは、同一でも異なっていてもよく、
－Ｒ３は、－Ｈであるか、或いは、場合により－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－Ａｔ、－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ２－６アルケニル、－Ｃ２－６アルキニル、＝Ｏ、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－６アルキル、－ＣＯＮＨ２、－ＮＯ２、－ＮＨ２、－ＳＯ３Ｘ、からなる群より選択される１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の５～６員単環の、炭素環又は少なくとも１つの窒素原子、硫黄原子若しくは酸素原子を含む複素環、或いは前記芳香族の５～６員単環の炭素環若しくは複素環を含む９～１０員の縮合環であり、
－Ｒ４は、場合により－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－Ａｔ、－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ２－６アルケニル、－Ｃ２－６アルキニル、＝Ｏ、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－６アルキル、－ＣＯＮＨ２、－ＮＯ２、－ＮＨ２、－ＳＯ３Ｘ、－ＣＯＯＸ、Ｙ、Ｚからなる群より選択される１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の５～６員単環の、炭素環又は少なくとも１つの窒素原子、硫黄原子若しくは酸素原子を含む複素環、或いは前記芳香族の５～６員単環の炭素環若しくは複素環を含む９～１０員の縮合環であり、
Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、場合により－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－Ａｔ、－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ２－６アルケニル、－Ｃ２－６アルキニル、＝Ｏ、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－６アルキル、－Ｏ－ＣＨ３、－ＣＯＮＨ２、－ＮＯ２、－ＮＨ２、－ＳＯ３Ｘ、－ＣＯＯＸ、Ｙ、Ｚからなる群より選択される１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の５～６員単環の、炭素環又は少なくとも１つの窒素原子、硫黄原子若しくは酸素原子を含む複素環、或いは前記芳香族の５～８員単環の炭素環若しくは複素環を含む９～１０員の縮合環であり、
　ただし、Ｒ１又はＲ２が、芳香族の５員単環の、炭素環又は少なくとも１つの窒素原子、硫黄原子若しくは酸素原子を含む複素環である場合には、該複素環は－ＣＯＯＸにより置換されたものではない]。
　５～６員単環としては５～６員炭素環や５～６員複素環が挙げられる。
　９～１０員の縮合環は、複素環と複素環との縮合環、炭素環と複素環との縮合環、炭素環と炭素環との縮合環であってもよい。
　５員単環の場合には該単環は場合により１、２、３、若しくは４つの置換基により置換されていてもよく、６員単環の場合には該単環は場合により１、２、３、４若しくは５つの置換基により置換されていてもよく、９員縮合環の場合には該縮合環は場合により１、２、３、４、５、若しくは６つの置換基により置換されていてもよく、１０員縮合環の場合には該縮合環は場合により１、２、３、４、５、６若しくは７つの置換基により置換されていてもよい。
　芳香族の単環の炭素環としてはベンゼン環が挙げられる。芳香族の炭素環と炭素環との縮合環としてはナフタレン環が挙げられる。
　五員複素環としては、ピロリン、イミダゾリン、ピラゾリン、ピロリジン、イミダゾリジン、ピラゾリジン、テトラヒドロチオフェン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピロールが挙げられるがこれに限らない。
　六員複素環としては、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、テトラジン、オキサジンが挙げられるがこれに限らない。
　芳香族の五員複素環としては、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、チオフェン、オキサジアゾール（例えば1,2,3-オキサジアゾール、1,2,4-オキサジアゾール、1,2,5-オキサジアゾール（フラザンともいう）、1,3,4-オキサジアゾール、フラン、ピロール(1H-ピロール、2H-ピロール）、トリアゾール（1,2,3-トリアゾール、1,2,4-トリアゾール）、テトラゾール、ペンタゾール、チアジアゾールが挙げられるがこれに限らない。
　芳香族の六員複素環式化合物としては、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、トリアジン（1,2,3-トリアジン、1,2,4-トリアジン、1,3,5-トリアジン）が挙げられるがこれに限らない。
　縮合環としては９員環のベンズイミダゾール、ベンゾオキサゾール、ベンズイソオキサゾール(Benzisoxazole)、1,3-ベンゾジオキソール、ベンゾチオフェン、ベンゾ[c]チオフェン、ベンゾチアゾール、インドール（2,3-ベンゾピロール）、インダゾール、イソインドール、プリン、キノリン、イソキノリン、フタラジン、イソベンゾフランが挙げられるがこれに限らない。
　縮合環としては１０員環のベンゾジオキサン、1,4-ベンゾジオキシン、ナフチリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、プテリジンが挙げられるがこれに限らない。
　－Ｃ１－６アルキルとしては、メチル、エチル、プロピル（n-プロピル、イソプロピル）、ブチル（n-ブチル、sec-ブチル、イソブチル、tert-ブチル）、ペンチル（n-ペンチル、tert-ペンチル、ネオペンチル、イソペンチル、sec-ペンチル、3-ペンチル）、ヘキシル（n-ヘキシル、イソヘキシル、ネオヘキシル）基が挙げられる。
　－Ｃ2－６アルケニルとしては、エテニル基（ビニル基）、１-プロペニル基、２-プロペニル基（アリル基）、１-ブテニル基、２-ブテニル基、３-ブテニル基、ペンテニル基、ヘキセニル基などが挙げられる。
　－Ｃ2－６アルキニルとしては、エチニル基、１-プロピニル基、２-プロピニル基、１-ブチニル基、２-ブチニル基、３-ブチニル基、ペンチニル基、ヘキシニル基などが挙げられる。
　－Ｏ－Ｃ１－６アルキルは、Ｃ１－６アルコキシ基ともいい、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ基などの直鎖状又は分岐鎖状アルコキシ基が挙げられる。
　ある実施形態において、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、場合により１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環、或いは前記芳香族の６員単環の炭素環を含む１０員の縮合環である。
　ある実施形態において、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、　　
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000082
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000083
からなる群より選択される基である。式中、Ｘ、Ｙ、Ｚは上記に定義したとおりである。
　ある実施形態において、Ｒ１は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000084
 からなる群より選択され、Ｒ２は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000085
 からなる群より選択され、式中、Ｘは上記に定義したとおりである。
　ある実施形態において、本発明のオキシダーゼ反応促進剤は、下記の式で表される化合物を含む、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000086
 ［式中、
Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択され、
Ｙは、－Ｈ、－ＳＯ３Ｘ、－ＣＯＯＸからなる群より選択され、
各Ｘ、Ｙは、同一でも異なっていてもよく、
－Ｒ３は、－Ｈ又は－ＮＨＣＯ－ＮＨ－Ｒ５－Ｎ＝Ｎ－Ｒ６であるか、或いは、場合により－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－Ａｔ、－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ２－６アルケニル、－Ｃ２－６アルキニル、＝Ｏ、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－６アルキル、－ＣＯＮＨ２、－ＮＯ２、－ＮＨ２、－ＳＯ３Ｘ、からなる群より選択される１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環、或いは前記炭素環を含む１０員の縮合環であり、
Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に、場合により－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－Ａｔ、－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ２－６アルケニル、－Ｃ２－６アルキニル、＝Ｏ、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－６アルキル、－Ｏ－ＣＨ３、－ＣＯＮＨ２、－ＮＯ２、－ＮＨ２、－ＳＯ３Ｘ、からなる群より選択される１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環、或いは前記炭素環を含む１０員の縮合環である]。
　ある実施形態において、本発明のオキシダーゼ反応促進剤は、下記のいずれかの式で表される化合物を含む、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000087
 ［式中、
Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択され、
Ｙは、－Ｈ、－ＳＯ３Ｘ、－ＣＯＯＸからなる群より選択され、
各Ｘ、Ｙは、同一でも異なっていてもよい]。
　ある実施形態において、本発明のオキシダーゼ反応促進剤は、下記の式で表される化合物を含む、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000088
 ［式中、
Ｒ１は、場合により１又は複数の置換基により置換されていてもよい、ベンゼン環又はナフタレン環であり、
前記の置換基は、－ＮＯ２、－ＳＯ３Ｘ、及び
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000089
 からなる群より選択され、
Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択される]。
　ある実施形態において、Ｒ１は、場合により１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環であり、Ｒ２は、場合により１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の５員単環の、少なくとも１つの窒素原子、硫黄原子若しくは酸素原子を含む複素環である。
　ある実施形態において、Ｒ２は、場合により１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の５員単環の、２つの窒素原子を含む複素環であり、該複素環は
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000090
 により置換されており、式中、Ｘは上記に定義したとおりであり、各Ｘは同一でも異なっていてもよい。
　ある実施形態において、Ｒ２は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000091
 であり、式中、Ｘは上記に定義したとおりであり、各Ｘは同一でも異なっていてもよい。
　ある実施形態において、本発明のオキシダーゼ反応促進剤はアゾベンゼン誘導体、例えば水溶性を示すアゾベンゼン誘導体、例えばアゾベンゼン-4-スルホン酸骨格を有する化合物である。
　ある実施形態において、本発明のオキシダーゼ反応促進剤は、
以下の式により表される化合物、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000092
 ［式中、Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択される]、
例えば、以下の式により表されるMordant Orange 1（CAS 2243-76-7)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000093
 以下の式により表される化合物、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000094
 ［式中、Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択される]、
例えば以下の式により表されるAlizarin Yellow GG（CAS 584-42-9)、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000095
 以下の式により表される化合物、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000096
 ［式中、Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択され、各Ｘは、同一でも異なっていてもよい]、
例えば以下の式により表されるChrome Yellow（CAS6054-97-3）、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000097
 以下の式により表される化合物、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000098
 ［式中、Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択され、各Ｘは、同一でも異なっていてもよい]、
例えば以下の式により表されるDirect Yellow 44（CAS8005-52-5)、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000099
 以下の式により表される化合物、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000100
 ［式中、Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択される]、
例えば以下の式により表されるAcid Red 151（CAS6406-56-0) 
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000101
 以下の式により表される化合物、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000102
 ［式中、Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択される]、
例えば以下の式により表されるAcid Yellow 36（CAS587-98-4) 
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000103
 以下の式により表される化合物、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000104
 ［式中、Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択され、各Ｘは、同一でも異なっていてもよい]、
例えば以下の式により表されるXylene Fast Yellow 2G(CAS 6359-98-4)、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000105
 及び、以下の式により表される化合物、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000106
 [式中、Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択される]、
例えば以下の式により表されるAcid Yellow 34（CAS 6359-90-6)、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000107
 及び、以下の式により表されるDisperse Diazo Black 3BF（CAS 6232-57-1）、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000108
 からなる群より選択される化合物である。
　本発明の反応促進剤からは、以下の式により表される化合物(Tartrazine、CAS 1934-21-0)は除かれる：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000109
　上記の化合物は市販されているもの又はその塩を使用しうる。他の式Iの化合物は慣用の手法を用いて合成するか、又は市販されているもの又はその塩を使用しうる。
　ある実施形態において本発明のオキシダーゼ反応促進剤は、アマドリアーゼの反応を促進しうる。このような反応促進剤（アマドリアーゼ反応促進剤ともいう）としては、上記の化合物、例えば式I、式II、及び式IIIの化合物、式IVの化合物、例えばMordant Orange 1、式Vの化合物、例えばAlizarin Yellow GG、式VIの化合物、例えばChrome Yellow、式VIIの化合物、例えばDirect Yellow 44、式VIIIの化合物、例えばAcid Red 151、式IXの化合物、例えばAcid Yellow 36、式Xの化合物、例えばXylene Fast Yellow 2G、式XIの化合物、例えばAcid Yellow 34及び式XIIの化合物、例えばDisperse Diazo Black 3BFが挙げられるがこれに限らない。
　ある実施形態において本発明のオキシダーゼ反応促進剤は、サルコシンオキシダーゼの反応を促進しうる。このような反応促進剤（サルコシンオキシダーゼ反応促進剤ともいう）としては、上記の化合物、例えば式I、式II、及び式IIIの化合物、式IVの化合物、例えばMordant Orange 1、式Vの化合物、例えばAlizarin Yellow GG、式VIの化合物、例えばChrome Yellow、式VIIの化合物、例えばDirect Yellow 44、式VIIIの化合物、例えばAcid Red 151、式Xの化合物、例えばXylene Fast Yellow 2G、及び式XIIの化合物、例えばDisperse Diazo Black 3BFが挙げられるがこれに限らない。
　ある実施形態において本発明のオキシダーゼ反応促進剤は、コレステロールオキシダーゼの反応を促進しうる。このような反応促進剤（コレステロールオキシダーゼ反応促進剤ともいう）としては、上記の化合物、例えば式I、式II、及び式IIIの化合物、式IVの化合物、例えばMordant Orange 1、式Vの化合物、例えばAlizarin Yellow GG、式VIの化合物、例えばChrome Yellow、式VIIの化合物、例えばDirect Yellow 44、式VIIIの化合物、例えばAcid Red 151、式IXの化合物、例えばAcid Yellow 36、式XIの化合物、例えばAcid Yellow 34及び式XIIの化合物、例えばDisperse Diazo Black 3BFが挙げられるがこれに限らない。
（HbA1c測定方法の例）
　本発明のHbA1c測定試薬及び測定方法について例示する。ただし本発明はこれ限定されない。
　以下のHbA1c測定用試薬を調製する。
ＨｂＡ１ｃ標準物質
ＨｂＡ１ｃ認証実用標準物質ＪＣＣＲＭ４２３－９ｂ（検査医学標準物質機構製）
総ヘモグロビン濃度１３３ｇ／ｌ、
ＨｂＡ１ｃ濃度３レベル（ＮＧＳＰ値　５．６１％、７．７１％、１０．５５％）
第１試薬（ペルオキシダーゼ、ロイコ色素を含む溶液）
３０ｍＭ　ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ緩衝液　ｐＨ６．５
１５ｍＭ　Ｔｒｉｓ
０．２％（ｗ／ｖ）　ｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシド（同仁化学研究所製）
４ｍＭ　ＮａＮＯ２
１０Ｕ／ｍｌ　ペルオキシダーゼ ＰＥＯ－３０１（東洋紡）
０．０２３ｍＭ　１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンナトリウム（ＤＡ－６７、和光純薬工業製）
第２試薬（A1cOXを含む溶液）
１０ｍＭ　ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ緩衝液　ｐＨ６．５
５．３ｍｇ／ｍｌ　ＣＦＰ－ＤＨ４（A1cOX）
　Ｂｉｏ　Ｍａｊｅｓｔｙ　ＪＣＡ－ＢＭ１６５０（日本電子製）を利用して、次に示す手順に沿ってＨｂＡ１ｃを測定する。イオン交換水で１２．５倍希釈したＨｂＡ１ｃ標準物質８μｌを、９６μｌの第１試薬に添加して３７℃で５分間インキュベートした後、２４μｌの第２試薬を添加してＨｂＡ１ｃのβ鎖アミノ末端の酸化により生じる過酸化水素の定量反応を３７℃で５分間進行させる。希釈した標準物質と第１試薬を混合してから１０分間の、波長６９４ｎｍ及び７５１ｎｍの光に対する反応液の吸光度（Ａ６９４及びＡ７５１）を経時的に測定し、Ａ６９４／７５１（Ａ６９４－Ａ７５１）を求める。横軸にＨｂＡ１ｃ標準物質の濃度を、縦軸に希釈した標準物質と第１試薬を混合してから１０分後のＡ６９４／７５１をプロットし、ＨｂＡ１ｃ濃度とＡ６９４／７５１の相関性を表す検量線を作成する。
　次に、ＨｂＡ１ｃ標準物質の代わりに、ＨｂＡ1ｃ濃度が未知の試料を用いて、上記と同様の測定を行う。希釈試料と第１試薬を混合してから１０分後のＡ６９４／７５１と、上記で作成した検量線を用いて、試料のＨｂＡ1ｃ濃度を決定する。
　化合物がオキシダーゼ反応を促進するか否かは、系に候補化合物を添加した場合の反応の進行と、添加しなかった場合の反応の進行とを比較することにより評価することができる。
（サルコシンオキシダーゼを用いた測定方法の例）
　サルコシンオキシダーゼを用いた測定試薬及び測定方法について例示する。ただし本発明はこれ限定されない。尚、サルコシンオキシダーゼの酵素活性に関し、サルコシンを基質として、1分間に1マイクロモルの尿素を生成するサルコシンオキシダーゼ酵素活性を1単位（Ｕ）とする。
Ａ．試薬の調製
　反応用試薬として、以下の溶液を調製する。 　
1) 0.2M  ザルコシン, 100mM Tris-HCl, 2 mM KCl, 0.05% Triton-X100  pH7.7
2) 80U/ml POD溶液
3) 0.2% phenol 溶液
4) 0.2% 4-アミノアンチピリン溶液
5) 0.3% SDS 溶液
6) 20mM Tris-HCl, 1mM KCl, 0.2% BSA pH7.7 （酵素希釈液）
  次いで、上記各溶液を以下の数量混合し、活性測定液を調製する。 　
1) 5ml 
2) 1ml
3) 2ml
4) 1ml
Ｂ．測定法
　測定は、以下のようにして行う。 　
1)活性測定液　0.95 mlを37℃、５分間プレインキュベーションする。 　
2)酵素液（0.04U/ml～0.16U/mlに酵素希釈液で調整）0.05mlを添加混合する。 　
3) 37℃において10分間反応させる。 　
4) 10分間の反応後、上記0.3% SDS 溶液を混合する。 　
5) 25℃にて10分間放置後、495 nmの吸光度を測定する。（ＯＤsample）
　ブランク値は、酵素液の混合前に 0.3% SDS 溶液を混合することによって測定する。ＯＤblank）
　（活性換算式）
Ｕ／ｍｌ＝(ＯＤsample－ＯＤblank) ×0.95
（コレステロールオキシダーゼを用いた測定方法の例）
　コレステロールオキシダーゼを用いた測定試薬及び測定方法について例示する。ただし本発明はこれ限定されない。コレステロールオキシダーゼの酵素活性の測定方法の例として、過酸化水素量を測定する方法について示す。以下のコレステロールオキシダーゼの活性測定には、特に断らない限り、コレステロールを基質として用いる。なお、コレステロールオキシダーゼの酵素力価は、コレステロールを基質として測定したとき、１分間に１μｍｏｌの過酸化水素を生成する酵素量を１Ｕと定義する。 　
Ａ．試薬の調製
（１）試薬１：コレステロール溶液
５．０ｍｌのＴｒｉｔｏｎＸ－１００に５００ｍｇのコレステロール（和光純薬製）を添加し、ヒーター上で攪拌溶解する。これに９０ｍｌのイオン交換水を添加後、煮沸後、氷上で冷却し、４．０ｇのコール酸ナトリウム（ナカライテスク製）を添加し、溶解した後、１００ｍｌに定容する。 　
（２）試薬２：６．０％フェノール溶液
　フェノール６．０ｇをイオン交換水に溶解して１００ｍｌにする。 　
（３）試薬３：０．１５％ペルオキシダーゼ溶液
　１５０ｍｇを１００ｍｌの０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に溶解する。 　
（４）試薬４：４－アミノアンチピリン溶液
　１．７６ｇの４－アミノアンチピリン（和光純薬製）をイオン交換水に溶解し、１００ｍｌに定容する。 　
Ｂ．測定法
　４．０ｍｌの試薬１と５１ｍｌの０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）とを混合した後、２．０ｍｌの試薬２、２．０ｍｌの試薬３、１．０ｍｌの試薬４を順に加え、混合する。これを３．０ｍｌずつ試験管に分注し、氷冷保存する。測定時は、３．０ｍｌを３７℃で５分加温し、５０μｌの酵素液を加え混和し、分光光度計（Ｕ－３０１０、日立社製）により、５００ｎｍにおける吸光度を測定する。測定値（ΔODtest）は、５００ｎｍにおける２分後から４分後の１分間あたりの吸光度変化とする。なお対照液（ΔODblank）は、酵素液の代わりに５０μｌの０．２％牛血清アルブミンを含む２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を加える以外は前記と同様にしたものである。下記の計算式に従い、算出した値を酵素活性値（Ｕ／ｍｌ）とした。 　
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000110
 １３．７８：上記の測定条件下でのミリモル分子吸光係数（cm2/micromole）
１／２：酵素反応で生成したＨ２Ｏ２の２分子から形成するQuinoneimine色素は１分子であることによる係数。 　
１．０：光路長(cm)。
　以下の実施例において本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。特に断らない場合、試薬は市販品を用いた。
[実施例１]アマドリアーゼ遺伝子を保持するプラスミドｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－ＤＨ２の調製
　ＨｂＡ１ｃに作用するアマドリアーゼ（ＣＦＰ－ＤＨ２、国際公開第２０１５／０６０４２９号参照）のアミノ酸配列を配列番号１に示す。ＣＦＰ－ＤＨ２遺伝子（配列番号２）を組込んだｐＫＫ２２３－３ベクターであるｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－ＤＨ２を調製するために、ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－ＤＨ２を有する大腸菌ＪＭ１０９株を、３ｍｌのＬＢ－ａｍｐ培地［１％（ｗ／ｖ）バクトトリプトン、０．５％（ｗ／ｖ）ペプトン、０．５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、５０μｇ／ｍｌ　アンピシリン］に接種して、３７℃で１６時間振とう培養し、培養物を得た。
　この培養物を１０，０００×ｇで、１分間遠心分離することにより集菌して菌体を得た。この菌体より、GenElute Plasmid MiniprepKit（Sigma-Aldrich社製）を用いてｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－ＤＨ２を抽出して精製し、２．５μｇの組換え体プラスミドｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－ＤＨ２を得た。
[実施例２]ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－ＤＨ２の部位特異的改変操作
　得られたｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－ＤＨ２を鋳型として、配列番号３、４の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（東洋紡績社製）を用い、以下の条件でＰＣＲ反応を行った。
　すなわち、１０×ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－緩衝液を５μｌ、ｄＮＴＰが各２ｍＭになるよう調製されたｄＮＴＰｓ混合溶液を５μｌ、２５ｍＭのＭｇＳＯ４溶液を２μｌ、鋳型となるｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－ＤＨ２を５０ｎｇ、上記合成オリゴヌクレオチドをそれぞれ１５ｐｍｏｌ、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－を１Ｕｎｉｔ加えて、滅菌水により全量を５０μｌとした。調製した反応液をサーマルサイクラー（エッペンドルフ社製）を用いて、９４℃で２分間インキュベートし、続いて、「９４℃、１５秒」－「５０℃、３０秒」－「６８℃、６分」のサイクルを３０回繰り返した。
　得られた反応液に、制限酵素ＤｐｎＩ（NEW ENGLAND BioLabs社製）を添加して３７℃で反応させ、残存している鋳型ＤＮＡを切断した後、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、ＬＢ－ａｍｐ寒天培地に展開した。生育したコロニーをＬＢ－ａｍｐ培地に接種して振とう培養し、実施例１と同様の方法でプラスミドＤＮＡを単離した。該プラスミド中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムApplied Biosystems 3130xlジェネティックアナライザ（LifeTechnologies社製）を用いて決定し、配列番号１記載のアミノ酸配列の６４位のアルギニンがグリシンに置換された改変型アマドリアーゼ（ＣＦＰ－ＤＨ３、配列番号５）の遺伝子を保持するプラスミド（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－ＤＨ３）を得た。
　続いて、ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－ＤＨ３を鋳型として、配列番号６、配列番号７のオリゴヌクレオチド、及びＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　を用い、先述の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換及び生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の６４位のアルギニンがグリシンに置換され、かつ、１１０位のロイシンがチロシンに置換された改変型アマドリアーゼ（ＣＦＰ－ＤＨ４、配列番号８）の遺伝子を保持するプラスミド（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－ＤＨ４）を得た。
［実施例３］ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－ＤＨ４の製造及び精製
　ＣＦＰ－ＤＨ４遺伝子を保持するプラスミド（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－ＤＨ４）を導入した大腸菌ＪＭ１０９株を、終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加したＬＢ－ａｍｐ培地２００ｍｌに植菌し、２５℃で１６時間培養した。得られた各培養菌体を２ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した後、同緩衝液に菌体を懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、粗酵素液４０ｍｌを調製した。
　Ｑ－ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ（ＧＥヘルスケア社製）を充てんしたカラムを２ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化した後、調製したＣＦＰ－ＤＨ４を含む粗酵素液をアプライしてアマドリアーゼを陰イオン交換樹脂に結合させた。その後、４ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）を２０カラム体積分送液し、夾雑タンパク質を溶出させた後、３０ｍＭのＮａＣｌを含む４ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で樹脂に結合したタンパク質を溶出させ、アマドリアーゼ活性を示す画分を回収した。
　得られたそれぞれのアマドリアーゼ活性を示す画分を、Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　Ｕｌｔｒａｃｅｌ－３０Ｋ（ミリポア社製）により濃縮し、ＨｉＬｏａｄ　２６／６０　Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００により精製した。樹脂の平衡化、溶出には１５０ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を用いた。溶出した各フラクションの純度をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより評価し、夾雑タンパク質を含んでいないフラクションを回収し、ＣＦＰ－ＤＨ４の精製標品とした。
［実施例４］ＨｂＡ１ｃ検出反応が完遂した場合における吸光度の測定
　本実施例では過剰量のA1cOXを用いて、HbA1c検出反応が完遂した場合の吸光度変化量を決定する。
　以下の組成を有するＨｂＡ１ｃ測定用試薬を調製し、Ｂｉｏ　Ｍａｊｅｓｔｙ　ＪＣＡ－ＢＭ１６５０（日本電子製）を利用してＨｂＡ１ｃの測定を実施した。
（試料）
血球（ＨｂＡ１ｃ　１０．４％（ＮＧＳＰ値））
（第１試薬－Ａ）
３０ｍＭ　ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ緩衝液　ｐＨ６．５
１５ｍＭ　Ｔｒｉｓ
０．２％（ｗ／ｖ）　ｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシド（同仁化学研究所製）
４ｍＭ　ＮａＮＯ２
１０Ｕ／ｍｌ　ペルオキシダーゼ ＰＥＯ－３０１（東洋紡）
０．０２３ｍＭ　１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンナトリウム（ＤＡ－６７、和光純薬工業製）
０．０４％（ｗ／ｖ）　表１における比較例２の化合物（和光純薬工業）、本発明の化合物のいずれか一つ（いずれも東京化成工業、ただしAcid Yellow 34のみMP Biomedicals）、もしくは化合物を含有しない（比較例１とする）イオン交換水 
（第２試薬－Ａ）
１０ｍＭ　ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ緩衝液　ｐＨ６．５
５．３ｍｇ／ｍｌ　ＣＦＰ－ＤＨ４（A1cOX）
　イオン交換水で５１倍希釈した試料８μｌを、９６μｌの第１試薬－Ａに添加して３７℃で５分間インキュベートした後、２４μｌの第２試薬－Ａを添加してＨｂＡ１ｃのβ鎖アミノ末端の酸化により生じる過酸化水素の定量反応を３７℃で５分間進行させた。希釈試料と第１試薬－Ａを混合してから１０分間の、波長６９４ｎｍ及び７５１ｎｍの光に対する反応液の吸光度（Ａ６９４及びＡ７５１）を経時的に測定し、Ａ６９４からＡ７５１を引いた値、すなわちＡ６９４／７５１を求めた。続いて、希釈試料と第１試薬－Ａを混合してから４．８分後のＡ６９４／７５１を（１０４／１２８）倍した値を、Ａ６９４／７５１から引いてΔＡを算出した。なお、希釈試料と第１試薬－Ａを混合してから４．８分後は、第２試薬－Ａを添加する直前を表す。希釈試料と第１試薬を混合してから９分後、１０分後のΔＡ（ΔＡ９ｍｉｎ及びΔＡ１０ｍｉｎ）を表１に示す。また、一例として、比較例２における、Ａ６９４／７５１、ΔＡ９ｍｉｎ及びΔＡ１０ｍｉｎの関係性を図１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000111
　表１に示した通り、本発明の化合物及び比較例について、ΔＡ９ｍｉｎ及びΔＡ１０ｍｉｎに差は見られない。つまり、希釈試料と第１試薬－Ａを混合してから１０分後には、ＨｂＡ１ｃ定量反応、すなわちＨｂＡ１ｃの酸化により生じた過酸化水素の定量反応は完遂していることが分かる。そこで、実施例４および５において、各比較例、及び本発明におけるΔＡ１０ｍｉｎを、それぞれの条件においてＨｂＡ１ｃ定量反応が１００％進行した時のΔＡ（ΔＡ１００％）と定義した。
［実施例５］本発明の化合物による、ＨｂＡ１ｃ検出反応促進効果の算出
　次に本実施例では、少量のA1cOXを用いて、本発明の化合物による、ＨｂＡ１ｃ検出反応の促進の度合いを決定した。
　以下の組成を有するＨｂＡ１ｃ測定用試薬を調製し、Ｂｉｏ　Ｍａｊｅｓｔｙ　ＪＣＡ－ＢＭ１６５０（日本電子製）を利用してＨｂＡ１ｃの測定を実施した。
（試料）
血球（ＨｂＡ１ｃ　１０．４％（ＮＧＳＰ値））
（第１試薬）
３０ｍＭ　ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ緩衝液　ｐＨ６．５
１５ｍＭ　Ｔｒｉｓ
０．２％（ｗ／ｖ）　ｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシド（同仁化学研究所製）
４ｍＭ　ＮａＮＯ２
１０Ｕ／ｍｌ　ペルオキシダーゼ ＰＥＯ－３０１（東洋紡）
０．０２３ｍＭ　１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンナトリウム（ＤＡ－６７、和光純薬工業製）
０．０４％（ｗ／ｖ）　表２における比較例２の化合物、本発明の化合物のいずれか一つ、もしくは化合物を含有しない（比較例１とする）イオン交換水 
（第２試薬－Ｂ）
１０ｍＭ　ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ緩衝液　ｐＨ６．５
１．１ｍｇ／ｍｌ　ＣＦＰ－ＤＨ４（A1cOX）
　イオン交換水で５１倍希釈した試料８μｌを、９６μｌの第１試薬に添加して３７℃で５分間インキュベートした後、２４μｌの第２試薬－Ｂを添加してＨｂＡ１ｃのβ鎖アミノ末端の酸化により生じる過酸化水素の定量反応を３７℃で５分間進行させた。希釈試料と第１試薬を混合してから１０分間の、波長６９４ｎｍ及び７５１ｎｍの光に対する反応液の吸光度（Ａ６９４及びＡ７５１）を経時的に測定し、Ａ６９４からＡ７５１を引いた値、すなわちＡ６９４／７５１を求めた。続いて、希釈試料と第１試薬を混合してから４．８分後のＡ６９４／７５１を（１０４／１２８）倍した値を、Ａ６９４／７５１から引いてΔＡを算出した。なお、希釈試料と第１試薬を混合してから５分後は、第２試薬－Ｂを添加する直前を表す。
　次に、本実施例で算出されたΔＡを実施例４で定義したΔＡ１００％で割り、ＨｂＡ１ｃ検出反応の進行度を算出した。希釈試料と第１試薬を混合してから７．５、１０分後（換言すると、第２試薬－Ｂを添加してから２．５、５分後）のＨｂＡ１ｃ検出反応の進行度を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000112
　表２に示した通り、Mordant Orange 1、AlizarinYellow GG、Chrome Yellow、DirectYellow 44、Acid Red 151、AcidYellow 36、Xylene Fast Yellow 2G、Acid Yellow 34には、ＨｂＡ１ｃ検出反応を促進する効果があることが見出された。
［実施例６］フルクトシルペプチドオキシダーゼによるフルクトシルバリルヒスチジン検出反応が完遂した場合における吸光度の測定
　本実施例ではオキシダーゼの一種であるフルクトシルペプチドオキシダーゼ（ＦＰＯＸ－ＣＥＴ）を過剰量用いて、基質であるフルクトシルバリルヒスチジン検出反応が完遂した場合の吸光度変化量を決定する。
　以下の組成を有するフルクトシルバリルヒスチジン測定用試薬を調製し、Ｂｉｏ　Ｍａｊｅｓｔｙ　ＪＣＡ－ＢＭ１６５０（日本電子製）を利用してフルクトシルペプチドオキシダーゼによるフルクトシルバリルヒスチジンの測定を実施した。
（試料）
３２μＭ　フルクトシルバリルヒスチジン（キッコーマンバイオケミファ製）
（第１試薬－Ｂ）
３０ｍＭ　ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ緩衝液　ｐＨ７．０
０．２％（ｖ／ｖ）　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００（和光純薬工業製）
１０Ｕ／ｍｌ　ペルオキシダーゼ ＰＥＯ－３０１（東洋紡）
０．０２３ｍＭ　１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンナトリウム（ＤＡ－６７、和光純薬工業製）
０．０４％（ｗ／ｖ）　表１における比較例２の化合物、本発明の化合物のいずれか一つ、もしくは化合物を含有しない（比較例１とする）イオン交換水 
（第２試薬－Ｃ）
１０ｍＭ　ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ緩衝液　ｐＨ７．０
４．８Ｕ／ｍｌ　ＦＰＯＸ－ＣＥＴ（キッコーマンバイオケミファ製）
　試料８μｌを、９６μｌの第１試薬－Ｂに添加して３７℃で５分間インキュベートした後、２４μｌの第２試薬－Ｃを添加してフルクトシルバリルヒスチジンの酸化により生じる過酸化水素の定量反応を３７℃で５分間進行させた。試料と第１試薬－Ｂを混合してから１０分間の、波長６９４ｎｍ及び７５１ｎｍの光に対する反応液の吸光度（Ａ６９４及びＡ７５１）を経時的に測定し、Ａ６９４からＡ７５１を引いた値、すなわちＡ６９４／７５１を求めた。続いて、試料と第１試薬－Ｂを混合してから４．８分後のＡ６９４／７５１を（１０４／１２８）倍した値を、Ａ６９４／７５１から引いてΔＡを算出した。なお、試料と第１試薬－Ｂを混合してから４．８分後は、第２試薬－Ｃを添加する直前を表す。希釈試料と第１試薬－Ｂを混合してから９分後、１０分後のΔＡ（ΔＡ９ｍｉｎ及びΔＡ１０ｍｉｎ）を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000113
　表３に示した通り、本発明の化合物及び比較例について、ΔＡ９ｍｉｎ及びΔＡ１０ｍｉｎに差は見られない。つまり、希釈試料と第１試薬－Ｂを混合してから１０分後には、フルクトシルバリルヒスチジン定量反応、すなわちフルクトシルバリルヒスチジンの酸化により生じた過酸化水素の定量反応は完遂していることが分かる。そこで、実施例６および７において、各比較例、及び本発明におけるΔＡ１０ｍｉｎを、それぞれの条件においてＨｂＡ１ｃ定量反応が１００％進行した時のΔＡ（ΔＡ１００％）と定義した。
［実施例７］本発明の化合物による、フルクトシルペプチドオキシダーゼによるフルクトシルバリルヒスチジン検出反応促進効果の算出
　次に本実施例では、少量のフルクトシルペプチドオキシダーゼを用いて、本発明の化合物による、フルクトシルバリルヒスチジン検出反応の促進の度合いを決定した。
　以下の組成を有するフルクトシルバリルヒスチジン測定用試薬を調製し、Ｂｉｏ　Ｍａｊｅｓｔｙ　ＪＣＡ－ＢＭ１６５０（日本電子製）を利用してフルクトシルバリルヒスチジンの測定を実施した。
（試料）
３２μＭ　フルクトシルバリルヒスチジン（キッコーマンバイオケミファ製）
（第１試薬－Ｂ）
３０ｍＭ　ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ緩衝液　ｐＨ７．０
０．２％（ｖ／ｖ）　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００（和光純薬工業製）
１０Ｕ／ｍｌ　ペルオキシダーゼ ＰＥＯ－３０１（東洋紡）
０．０２３ｍＭ　１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンナトリウム（ＤＡ－６７、和光純薬工業製）
０．０４％（ｗ／ｖ）　表１における比較例２の化合物、本発明の化合物のいずれか一つ、もしくは化合物を含有しない（比較例１とする）イオン交換水 
（第２試薬－Ｄ）
１０ｍＭ　ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ緩衝液　ｐＨ７．０
０．４８Ｕ／ｍｌ　ＦＰＯＸ－ＣＥＴ（キッコーマンバイオケミファ製）
　試料８μｌを、９６μｌの第１試薬－Ｂに添加して３７℃で５分間インキュベートした後、２４μｌの第２試薬－Ｄを添加してフルクトシルバリルヒスチジンの酸化により生じる過酸化水素の定量反応を３７℃で５分間進行させた試料と第１試薬－Ｂを混合してから１０分間の、波長６９４ｎｍ及び７５１ｎｍの光に対する反応液の吸光度（Ａ６９４及びＡ７５１）を経時的に測定し、Ａ６９４からＡ７５１を引いた値、すなわちＡ６９４／７５１を求めた。続いて、試料と第１試薬－Ｂを混合してから４．８分後のＡ６９４／７５１を（１０４／１２８）倍した値を、Ａ６９４／７５１から引いてΔＡを算出した。なお、試料と第１試薬－Ｂを混合してから５分後は、第２試薬－Ｄを添加する直前を表す。
　次に、本実施例で算出されたΔＡを実施例６で定義したΔＡ１００％で割り、フルクトシルバリルヒスチジン検出反応の進行度を算出した。試料と第１試薬－Ｂを混合してから７．５、１０分後（換言すると、第２試薬－Ｄを添加してから２．５、５分後）のフルクトシルバリルヒスチジン検出反応の進行度を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000114
　表４に示した通り、Chrome Yellow、Direct Yellow 44、Xylene Fast Yellow 2G、Acid Yellow 34には、フルクトシルバリルヒスチジン検出反応を促進する効果があることが見出された。
［実施例８］フルクトシルアミノ酸オキシダーゼによるフルクトシルバリン検出反応が完遂した場合における吸光度の測定
　本実施例ではオキシダーゼの一種であるフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＤ－Ｅ）を過剰量用いて、基質であるフルクトシルバリン検出反応が完遂した場合の吸光度変化量を決定する。
　以下の組成を有するフルクトシルバリン測定用試薬を調製し、Ｂｉｏ　Ｍａｊｅｓｔｙ　ＪＣＡ－ＢＭ１６５０（日本電子製）を利用してフルクトシルアミノ酸オキシダーゼによるフルクトシルバリンの測定を実施した。
（試料）
３２μＭ　フルクトシルバリン（キッコーマンバイオケミファ製）
（第１試薬－Ｃ）
３０ｍＭ　ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ緩衝液　ｐＨ８．０
０．２％（ｖ／ｖ）　ナイミーンＦ－２１５（日油製）
１０Ｕ／ｍｌ　ペルオキシダーゼ ＰＥＯ－３０１（東洋紡）
０．０２３ｍＭ　１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンナトリウム（ＤＡ－６７、和光純薬工業製）
０．０４％（ｗ／ｖ）　表１における比較例２の化合物、本発明の化合物のいずれか一つ、もしくは化合物を含有しない（比較例１とする）イオン交換水 
（第２試薬－Ｅ）
１０ｍＭ　ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ緩衝液　ｐＨ８．０
２１．４Ｕ／ｍｌ　ＦＡＯＤ－Ｅ（キッコーマンバイオケミファ製）
　試料８μｌを、９６μｌの第１試薬－Ｃに添加して３７℃で５分間インキュベートした後、２４μｌの第２試薬－Ｅを添加してフルクトシルバリンの酸化により生じる過酸化水素の定量反応を３７℃で５分間進行させた。試料と第１試薬－Ｃを混合してから１０分間の、波長６９４ｎｍ及び７５１ｎｍの光に対する反応液の吸光度（Ａ６９４及びＡ７５１）を経時的に測定し、Ａ６９４からＡ７５１を引いた値、すなわちＡ６９４／７５１を求めた。続いて、試料と第１試薬－Ｃを混合してから４．８分後のＡ６９４／７５１を（１０４／１２８）倍した値を、Ａ６９４／７５１から引いてΔＡを算出した。なお、試料と第１試薬－Ｃを混合してから４．８分後は、第２試薬－Ｅを添加する直前を表す。希釈試料と第１試薬－Ｃを混合してから９分後、１０分後のΔＡ（ΔＡ９ｍｉｎ及びΔＡ１０ｍｉｎ）を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000115
　表５に示した通り、本発明の化合物及び比較例について、ΔＡ９ｍｉｎ及びΔＡ１０ｍｉｎに差は見られない。つまり、希釈試料と第１試薬－Ｃを混合してから１０分後には、フルクトシルバリン定量反応、すなわちフルクトシルバリンの酸化により生じた過酸化水素の定量反応は完遂していることが分かる。そこで、実施例８および９において、各比較例、及び本発明におけるΔＡ１０ｍｉｎを、それぞれの条件においてＨｂＡ１ｃ定量反応が１００％進行した時のΔＡ（ΔＡ１００％）と定義した。
［実施例９］本発明の化合物による、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼによるフルクトシルバリン検出反応促進効果の算出
　次に本実施例では、少量のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを用いて、本発明の化合物による、フルクトシルバリン検出反応の促進の度合いを決定した。
　以下の組成を有するフルクトシルバリン測定用試薬を調製し、Ｂｉｏ　Ｍａｊｅｓｔｙ　ＪＣＡ－ＢＭ１６５０（日本電子製）を利用してフルクトシルバリンの測定を実施した。
（試料）
３２μＭ　フルクトシルバリン（キッコーマンバイオケミファ製）
（第１試薬－Ｃ）
３０ｍＭ　ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ緩衝液　ｐＨ８．０
０．２％（ｖ／ｖ）　ナイミーンＦ－２１５（日油製）
１０Ｕ／ｍｌ　ペルオキシダーゼ ＰＥＯ－３０１（東洋紡）
０．０２３ｍＭ　１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンナトリウム（ＤＡ－６７、和光純薬工業製）
０．０４％（ｗ／ｖ）　表１における比較例２の化合物、本発明の化合物のいずれか一つ、もしくは化合物を含有しない（比較例１とする）イオン交換水 
（第２試薬－Ｆ）
１０ｍＭ　ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ緩衝液　ｐＨ８．０
２．１４Ｕ／ｍｌ　ＦＡＯＤ－Ｅ（キッコーマンバイオケミファ製）
　試料８μｌを、９６μｌの第１試薬－Ｃに添加して３７℃で５分間インキュベートした後、２４μｌの第２試薬－Ｆを添加してフルクトシルバリンの酸化により生じる過酸化水素の定量反応を３７℃で５分間進行させた試料と第１試薬－Ｃを混合してから１０分間の、波長６９４ｎｍ及び７５１ｎｍの光に対する反応液の吸光度（Ａ６９４及びＡ７５１）を経時的に測定し、Ａ６９４からＡ７５１を引いた値、すなわちＡ６９４／７５１を求めた。続いて、試料と第１試薬－Ｃを混合してから４．８分後のＡ６９４／７５１を（１０４／１２８）倍した値を、Ａ６９４／７５１から引いてΔＡを算出した。なお、試料と第１試薬－Ｃを混合してから５分後は、第２試薬－Ｆを添加する直前を表す。
　次に、本実施例で算出されたΔＡを実施例８で定義したΔＡ１００％で割り、フルクトシルバリン検出反応の進行度を算出した。試料と第１試薬－Ｃを混合してから７．５、１０分後（換言すると、第２試薬－Ｆを添加してから２．５、５分後）のフルクトシルバリン検出反応の進行度を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000116
　表６に示した通り、Mordant Orange 1、Alizarin Yellow GG、Chrome Yellow、Disperse Diazo Black 3BFには、フルクトシルバリン検出反応を促進する効果があることが見出された。
［実施例１０］サルコシンオキシダーゼによるサルコシン検出反応が完遂した場合における吸光度の測定
　本実施例ではオキシダーゼの一種であるサルコシンオキシダーゼ（ＳＯＤ－ＴＥ）を過剰量用いて、基質であるサルコシン（Ｎ－メチルグリシン）検出反応が完遂した場合の吸光度変化量を決定する。
　以下の組成を有するサルコシン測定用試薬を調製し、Ｂｉｏ　Ｍａｊｅｓｔｙ　ＪＣＡ－ＢＭ１６５０（日本電子製）を利用してサルコシンオキシダーゼによるサルコシンの測定を実施した。
（試料）
３２μＭ　サルコシン（和光純薬工業製）
（第１試薬－Ｄ）
３０ｍＭ　ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ緩衝液　ｐＨ８．０
０．２％（ｖ／ｖ）　ＮＰ－１０（ＨＥＬＭ製）
１０Ｕ／ｍｌ　ペルオキシダーゼ ＰＥＯ－３０１（東洋紡）
０．０２３ｍＭ　１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンナトリウム（ＤＡ－６７、和光純薬工業製）
０．０４％（ｗ／ｖ）　表１における比較例２の化合物、本発明の化合物のいずれか一つ、もしくは化合物を含有しない（比較例１とする）イオン交換水 
（第２試薬－Ｇ）
１０ｍＭ　ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ緩衝液　ｐＨ８．０
１２３Ｕ／ｍｌ　ＳＯＤ－ＴＥ（キッコーマンバイオケミファ製）
　試料８μｌを、９６μｌの第１試薬－Ｄに添加して３７℃で５分間インキュベートした後、２４μｌの第２試薬－Ｇを添加してサルコシンの酸化により生じる過酸化水素の定量反応を３７℃で５分間進行させた。試料と第１試薬－Ｄを混合してから１０分間の、波長６９４ｎｍ及び７５１ｎｍの光に対する反応液の吸光度（Ａ６９４及びＡ７５１）を経時的に測定し、Ａ６９４からＡ７５１を引いた値、すなわちＡ６９４／７５１を求めた。続いて、試料と第１試薬－Ｄを混合してから４．８分後のＡ６９４／７５１を（１０４／１２８）倍した値を、Ａ６９４／７５１から引いてΔＡを算出した。なお、試料と第１試薬－Ｄを混合してから４．８分後は、第２試薬－Ｇを添加する直前を表す。希釈試料と第１試薬－Ｄを混合してから９分後、１０分後のΔＡ（ΔＡ９ｍｉｎ及びΔＡ１０ｍｉｎ）を表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000117
　表７に示した通り、本発明の化合物及び比較例について、ΔＡ９ｍｉｎ及びΔＡ１０ｍｉｎに差は見られない。つまり、希釈試料と第１試薬－Ｄを混合してから１０分後には、サルコシン定量反応、すなわちサルコシンの酸化により生じた過酸化水素の定量反応は完遂していることが分かる。そこで、実施例１０および１１において、各比較例、及び本発明におけるΔＡ１０ｍｉｎを、それぞれの条件においてＨｂＡ１ｃ定量反応が１００％進行した時のΔＡ（ΔＡ１００％）と定義した。
［実施例１１］本発明の化合物による、サルコシンオキシダーゼによるサルコシン検出反応促進効果の算出
　次に本実施例では、少量のサルコシンオキシダーゼを用いて、本発明の化合物による、サルコシン検出反応の促進の度合いを決定した。
　以下の組成を有するサルコシン測定用試薬を調製し、Ｂｉｏ　Ｍａｊｅｓｔｙ　ＪＣＡ－ＢＭ１６５０（日本電子製）を利用してサルコシンの測定を実施した。
（試料）
３２μＭ　サルコシン（和光純薬工業製）
（第１試薬－Ｄ）
３０ｍＭ　ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ緩衝液　ｐＨ８．０
０．２％（ｖ／ｖ）　ＮＰ－１０（ＨＥＬＭ製）
１０Ｕ／ｍｌ　ペルオキシダーゼ ＰＥＯ－３０１（東洋紡）
０．０２３ｍＭ　１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンナトリウム（ＤＡ－６７、和光純薬工業製）
０．０４％（ｗ／ｖ）　表１における比較例２の化合物、本発明の化合物のいずれか一つ、もしくは化合物を含有しない（比較例１とする）イオン交換水 
（第２試薬－Ｈ）
１０ｍＭ　ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ緩衝液　ｐＨ８．０
１２．３Ｕ／ｍｌ　ＳＯＤ－ＴＥ（キッコーマンバイオケミファ製）
　試料８μｌを、９６μｌの第１試薬－Ｄに添加して３７℃で５分間インキュベートした後、２４μｌの第２試薬－Ｈを添加してサルコシンの酸化により生じる過酸化水素の定量反応を３７℃で５分間進行させた試料と第１試薬－Ｄを混合してから１０分間の、波長６９４ｎｍ及び７５１ｎｍの光に対する反応液の吸光度（Ａ６９４及びＡ７５１）を経時的に測定し、Ａ６９４からＡ７５１を引いた値、すなわちＡ６９４／７５１を求めた。続いて、試料と第１試薬－Ｄを混合してから４．８分後のＡ６９４／７５１を（１０４／１２８）倍した値を、Ａ６９４／７５１から引いてΔＡを算出した。なお、試料と第１試薬－Ｄを混合してから５分後は、第２試薬－Ｈを添加する直前を表す。
　次に、本実施例で算出されたΔＡを実施例１０で定義したΔＡ１００％で割り、サルコシン検出反応の進行度を算出した。試料と第１試薬－Ｄを混合してから７．５、１０分後（換言すると、第２試薬－Ｈを添加してから２．５、５分後）のサルコシン検出反応の進行度を表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000118
　表８に示した通り、Mordant Orange 1、Alizarin Yellow GG、Chrome Yellow、Direct Yellow 44、Acid Red 151、Xylene Fast Yellow 2G、Disperse Diazo Black 3BFには、サルコシン検出反応を促進する効果があることが見出された。
［実施例１２］コレステロールオキシダーゼによるコレステロール検出反応が完遂した場合における吸光度の測定
　本実施例ではオキシダーゼの一種であるコレステロールオキシダーゼ（ＣＨＯ－ＣＥ）を過剰量用いて、基質であるコレステロール検出反応が完遂した場合の吸光度変化量を決定する。
　以下の組成を有するコレステロール測定用試薬を調製し、Ｂｉｏ　Ｍａｊｅｓｔｙ　ＪＣＡ－ＢＭ１６５０（日本電子製）を利用してコレステロールオキシダーゼによるコレステロールの測定を実施した。
（試料）
３２μＭ　コレステロール（和光純薬工業製）
５．０％（ｖ／ｖ）　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００（和光純薬工業製）
４．０％（ｗ／ｖ）　コール酸ナトリウム（和光純薬工業製）
（第１試薬－Ｅ）
３０ｍＭ　ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ緩衝液　ｐＨ７．０
１０Ｕ／ｍｌ　ペルオキシダーゼ ＰＥＯ－３０１（東洋紡）
０．０２３ｍＭ　１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンナトリウム（ＤＡ－６７、和光純薬工業製）
０．０４％（ｗ／ｖ）　表１における比較例２の化合物、本発明の化合物のいずれか一つ、もしくは化合物を含有しない（比較例１とする）イオン交換水 
（第２試薬－Ｉ）
１０ｍＭ　ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ緩衝液　ｐＨ７．０
１１．６Ｕ／ｍｌ　ＣＨＯ－ＣＥ（キッコーマンバイオケミファ製）
　試料８μｌを、９６μｌの第１試薬－Ｅに添加して３７℃で５分間インキュベートした後、２４μｌの第２試薬－Ｉを添加してコレステロールの酸化により生じる過酸化水素の定量反応を３７℃で５分間進行させた。試料と第１試薬－Ｅを混合してから１０分間の、波長６９４ｎｍ及び７５１ｎｍの光に対する反応液の吸光度（Ａ６９４及びＡ７５１）を経時的に測定し、Ａ６９４からＡ７５１を引いた値、すなわちＡ６９４／７５１を求めた。続いて、試料と第１試薬－Ｅを混合してから４．８分後のＡ６９４／７５１を（１０４／１２８）倍した値を、Ａ６９４／７５１から引いてΔＡを算出した。なお、試料と第１試薬－Ｅを混合してから４．８分後は、第２試薬－Ｉを添加する直前を表す。希釈試料と第１試薬－Ｅを混合してから９分後、１０分後のΔＡ（ΔＡ９ｍｉｎ及びΔＡ１０ｍｉｎ）を表９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000119
　表９に示した通り、本発明の化合物及び比較例について、ΔＡ９ｍｉｎ及びΔＡ１０ｍｉｎに差は見られない。つまり、希釈試料と第１試薬－Ｅを混合してから１０分後には、コレステロール定量反応、すなわちコレステロールの酸化により生じた過酸化水素の定量反応は完遂していることが分かる。そこで、実施例１２および１３において、各比較例、及び本発明におけるΔＡ１０ｍｉｎを、それぞれの条件においてコレステロール定量反応が１００％進行した時のΔＡ（ΔＡ１００％）と定義した。
［実施例１３］本発明の化合物による、コレステロールオキシダーゼによるコレステロール検出反応促進効果の算出
　次に本実施例では、少量のコレステロールオキシダーゼを用いて、本発明の化合物による、コレステロール検出反応の促進の度合いを決定した。
　以下の組成を有するコレステロール測定用試薬を調製し、Ｂｉｏ　Ｍａｊｅｓｔｙ　ＪＣＡ－ＢＭ１６５０（日本電子製）を利用してコレステロールの測定を実施した。
（試料）
３２μＭ　コレステロール（和光純薬工業製）
５．０％（ｖ／ｖ）　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００（和光純薬工業製）
４．０％（ｗ／ｖ）　コール酸ナトリウム（和光純薬工業製）
（第１試薬－Ｅ）
３０ｍＭ　ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ緩衝液　ｐＨ７．０
１０Ｕ／ｍｌ　ペルオキシダーゼ ＰＥＯ－３０１（東洋紡）
０．０２３ｍＭ　１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンナトリウム（ＤＡ－６７、和光純薬工業製）
０．０４％（ｗ／ｖ）　表１における比較例２の化合物、本発明の化合物のいずれか一つ、もしくは化合物を含有しない（比較例１とする）イオン交換水 
（第２試薬－Ｊ）
１０ｍＭ　ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ緩衝液　ｐＨ７．０
２．３１Ｕ／ｍｌ　ＣＨＯ－ＣＥ（キッコーマンバイオケミファ製）
　試料８μｌを、９６μｌの第１試薬－Ｅに添加して３７℃で５分間インキュベートした後、２４μｌの第２試薬－Ｊを添加してコレステロールの酸化により生じる過酸化水素の定量反応を３７℃で５分間進行させた試料と第１試薬－Ｅを混合してから１０分間の、波長６９４ｎｍ及び７５１ｎｍの光に対する反応液の吸光度（Ａ６９４及びＡ７５１）を経時的に測定し、Ａ６９４からＡ７５１を引いた値、すなわちＡ６９４／７５１を求めた。続いて、試料と第１試薬－Ｅを混合してから４．８分後のＡ６９４／７５１を（１０４／１２８）倍した値を、Ａ６９４／７５１から引いてΔＡを算出した。なお、試料と第１試薬－Ｅを混合してから５分後は、第２試薬－Ｊを添加する直前を表す。
　次に、本実施例で算出されたΔＡを実施例１２で定義したΔＡ１００％で割り、コレステロール検出反応の進行度を算出した。試料と第１試薬－Ｅを混合してから７．５、１０分後（換言すると、第２試薬－Ｊを添加してから２．５、５分後）のコレステロール検出反応の進行度を表１０に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000120
　表１０に示した通り、Mordant Orange 1、Alizarin Yellow GG、Chrome Yellow、Acid Red 151、Acid Yellow 36、Acid Yellow 34、Disperse Diazo Black 3BFには、コレステロール検出反応を促進する効果があることが見出された。
　なお、本発明の反応促進剤は、ペルオキシダーゼが触媒する酵素反応も促進する可能性があるが、本実施例の条件下では、系に過剰量のペルオキシダーゼが添加されており、各種オキシダーゼの酵素反応により生じた過酸化水素は直ちにペルオキシダーゼによって分解されると考えられる。そのため、上記の反応促進の結果は、主として、本発明の反応促進剤が各種オキシダーゼの酵素反応を促進していることに起因するものと考察される。
　本発明のオキシダーゼ反応促進剤を用いることにより、臨床診断用試薬、例えばHbA1c測定試薬、GA測定試薬、サルコシン測定試薬、コレステロール測定試薬等に処方するオキシダーゼの量を低減することができる。また、反応時間を短縮したり、検出感度を高めることができる。
[配列表の簡単な説明]
配列番号1　CFP-DH2のアミノ酸配列
配列番号2　CFP-DH2遺伝子の塩基配列
配列番号3　R64G導入用プライマー
配列番号4　R64G導入用プライマー
配列番号5　CFP-DH3のアミノ酸配列
配列番号6　L110Y導入用プライマー
配列番号7　L110Y導入用プライマー
配列番号8　CFP-DH4のアミノ酸配列
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (25)

  1. 　オキシダーゼ、及び、下記の式（I)で表されるオキシダーゼ反応促進剤を用いる工程を含む、オキシダーゼ反応を用いる方法、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式中、
    Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、場合により１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の５～６員単環の、炭素環又は少なくとも１つの窒素原子、硫黄原子若しくは酸素原子を含む複素環、或いは前記芳香族の５～６員単環の炭素環若しくは複素環を含む９～１０員の縮合環であり、
    前記の置換基は、－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－Ａｔ、－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ２－６アルケニル、－Ｃ２－６アルキニル、＝Ｏ、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－６アルキル、－ＣＯＮＨ２、－ＮＯ２、－ＮＨ２、－ＣＯ－ＮＨ２、－Ｒ３、－ＮＨ－Ｒ４、－ＮＨＣＯ－ＮＨ－Ｒ５－Ｎ＝Ｎ－Ｒ６、－ＳＯ３Ｘ、－ＣＯＯＸ、Ｙ、Ｚからなる群より選択され、
    Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択され、
    Ｙは、－Ｈ、－ＳＯ３Ｘ、－ＣＯＯＸからなる群より選択され、
    Ｚは、－Ｈ、－Ｃ１－６アルキル、－Ｏ－Ｃ１－６アルキル、－ＳＯ３Ｘからなる群より選択され、
    各Ｘ、Ｙ、Ｚは、同一でも異なっていてもよく、
    －Ｒ３は、－Ｈであるか、或いは、場合により－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－Ａｔ、－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ２－６アルケニル、－Ｃ２－６アルキニル、＝Ｏ、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－６アルキル、－ＣＯＮＨ２、－ＮＯ２、－ＮＨ２、－ＳＯ３Ｘ、からなる群より選択される１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の５～６員単環の、炭素環又は少なくとも１つの窒素原子、硫黄原子若しくは酸素原子を含む複素環、或いは前記芳香族の５～６員単環の炭素環若しくは複素環を含む９～１０員の縮合環であり、
    －Ｒ４は、場合により－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－Ａｔ、－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ２－６アルケニル、－Ｃ２－６アルキニル、＝Ｏ、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－６アルキル、－ＣＯＮＨ２、－ＮＯ２、－ＮＨ２、－ＳＯ３Ｘ、－ＣＯＯＸ、Ｙ、Ｚからなる群より選択される１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の５～６員単環の、炭素環又は少なくとも１つの窒素原子、硫黄原子若しくは酸素原子を含む複素環、或いは前記芳香族の５～６員単環の炭素環若しくは複素環を含む９～１０員の縮合環であり、
    －Ｒ５及び－Ｒ６は、それぞれ独立に、場合により－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－Ａｔ、－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ２－６アルケニル、－Ｃ２－６アルキニル、＝Ｏ、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－６アルキル、－Ｏ－ＣＨ３、－ＣＯＮＨ２、－ＮＯ２、－ＮＨ２、－ＳＯ３Ｘ、－ＣＯＯＸ、Ｙ、Ｚからなる群より選択される１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の５～６員単環の、炭素環又は少なくとも１つの窒素原子、硫黄原子若しくは酸素原子を含む複素環、或いは前記芳香族の５～８員単環の炭素環若しくは複素環を含む９～１０員の縮合環であり、
    　ただし、Ｒ１又はＲ２が、芳香族の５員単環の、炭素環又は少なくとも１つの窒素原子、硫黄原子若しくは酸素原子を含む複素環である場合には、該複素環は－ＣＯＯＸにより置換されたものではない]。
  2. 　式（I)により表される反応促進剤において、Ｒ１及びＲ２が、それぞれ独立に、場合により１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環、或いは前記芳香族の６員単環の炭素環を含む１０員の縮合環である、請求項１に記載の方法。
  3. 　式（I)により表される反応促進剤において、Ｒ１及びＲ２が、それぞれ独立に、　　
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
    からなる群より選択され、式中、Ｘ、Ｙ、Ｚは請求項１に定義したとおりである、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　式（I)により表される反応促進剤において、Ｒ１が、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     からなる群より選択され、Ｒ２が、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     からなる群より選択され、式中、Ｘは請求項１に定義したとおりである、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　式（I)により表される反応促進剤が、下記の式で表される反応促進剤である、請求項１に記載の方法、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     ［式中、
    Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択され、
    Ｙは、－Ｈ、－ＳＯ３Ｘ、－ＣＯＯＸからなる群より選択され、
    各Ｘ、Ｙは、同一でも異なっていてもよく、
    －Ｒ３は、－Ｈ又は－ＮＨＣＯ－ＮＨ－Ｒ５－Ｎ＝Ｎ－Ｒ６であるか、或いは、場合により－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－Ａｔ、－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ２－６アルケニル、－Ｃ２－６アルキニル、＝Ｏ、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－６アルキル、－ＣＯＮＨ２、－ＮＯ２、－ＮＨ２、－ＳＯ３Ｘ、からなる群より選択される１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環、或いは前記炭素環を含む１０員の縮合環であり、
    －Ｒ５及び－Ｒ６は、それぞれ独立に、場合により－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－Ａｔ、－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ２－６アルケニル、－Ｃ２－６アルキニル、＝Ｏ、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－６アルキル、－Ｏ－ＣＨ３、－ＣＯＮＨ２、－ＮＯ２、－ＮＨ２、－ＳＯ３Ｘ、からなる群より選択される１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環、或いは前記炭素環を含む１０員の縮合環である]。
  6. 　式（I)により表される反応促進剤が、下記のいずれかの式で表される反応促進剤である、請求項１に記載の方法、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
     ［式中、
    Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択され、
    Ｙは、－Ｈ、－ＳＯ３Ｘ、－ＣＯＯＸからなる群より選択され、
    各Ｘ、Ｙは、同一でも異なっていてもよい]。
  7. 　式（I)により表される反応促進剤が、下記の式で表される反応促進剤である、請求項１に記載の方法、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
     ［式中、
    Ｒ１は、場合により１又は複数の置換基により置換されていてもよい、ベンゼン環又はナフタレン環であり、
    前記の置換基は、－ＮＯ２、－ＳＯ３Ｘ、及び
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
     からなる群より選択され、
    Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択される]。
  8. 　式（I)により表される反応促進剤において、Ｒ１が、場合により１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環であり、Ｒ２が、場合により１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の５員単環の、少なくとも１つの窒素原子、硫黄原子若しくは酸素原子を含む複素環である、請求項１に記載の方法。
  9. 　Ｒ２が、場合により１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の５員単環の、２つの窒素原子を含む複素環であり、該複素環が
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
     により置換されており、式中、Ｘは請求項１に定義したとおりであり、各Ｘは同一でも異なっていてもよい、請求項１又は８に記載の方法。
  10. 　Ｒ２が、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
     であり、式中、Ｘは請求項１に定義したとおりであり、各Ｘは同一でも異なっていてもよい、請求項１、８又は９に記載の方法。
  11. 　式（I)により表される化合物が、
    以下の式により表される化合物、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
     ［式中、Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択され、各Ｘは、同一でも異なっていてもよい]、
    以下の式により表される化合物、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
     ［式中、Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択される]、
    以下の式により表される化合物、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
     ［式中、Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択され、各Ｘは、同一でも異なっていてもよい]、
    以下の式により表される化合物、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
     ［式中、Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択され、各Ｘは、同一でも異なっていてもよい]、
    以下の式により表される化合物、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
     ［式中、Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択される]、
    以下の式により表される化合物、 
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
     ［式中、Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択される]、
    以下の式により表される化合物、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
     ［式中、Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択され、各Ｘは、同一でも異なっていてもよい]、
    以下の式により表される化合物、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
     ［式中、Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択される]、
    及び、以下の式により表される化合物、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
     からなる群より選択される、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 　オキシダーゼが、アマドリアーゼ、サルコシンオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼからなる群より選択されるオキシダーゼである、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 　式（I)により表される化合物を含む、オキシダーゼ反応促進剤、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
     ［式中、
    Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、場合により１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の５～６員単環の、炭素環又は少なくとも１つの窒素原子、硫黄原子若しくは酸素原子を含む複素環、或いは前記芳香族の５～６員単環の炭素環若しくは複素環を含む９～１０員の縮合環であり、
    前記の置換基は、－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－Ａｔ、－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ２－６アルケニル、－Ｃ２－６アルキニル、＝Ｏ、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－６アルキル、－ＣＯＮＨ２、－ＮＯ２、－ＮＨ２、－ＣＯ－ＮＨ２、－Ｒ３、－ＮＨ－Ｒ４、－ＮＨＣＯ－ＮＨ－Ｒ５－Ｎ＝Ｎ－Ｒ６、－ＳＯ３Ｘ、－ＣＯＯＸ、Ｙ、Ｚからなる群より選択され、
    Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択され、
    Ｙは、－Ｈ、－ＳＯ３Ｘ、－ＣＯＯＸからなる群より選択され、
    Ｚは、－Ｈ、－Ｃ１－６アルキル、－Ｏ－Ｃ１－６アルキル、－ＳＯ３Ｘからなる群より選択され、
    各Ｘ、Ｙ、Ｚは、同一でも異なっていてもよく、
    －Ｒ３は、－Ｈであるか、或いは、場合により－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－Ａｔ、－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ２－６アルケニル、－Ｃ２－６アルキニル、＝Ｏ、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－６アルキル、－ＣＯＮＨ２、－ＮＯ２、－ＮＨ２、－ＳＯ３Ｘ、からなる群より選択される１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の５～６員単環の、炭素環又は少なくとも１つの窒素原子、硫黄原子若しくは酸素原子を含む複素環、或いは前記芳香族の５～６員単環の炭素環若しくは複素環を含む９～１０員の縮合環であり、
    －Ｒ４は、場合により－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－Ａｔ、－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ２－６アルケニル、－Ｃ２－６アルキニル、＝Ｏ、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－６アルキル、－ＣＯＮＨ２、－ＮＯ２、－ＮＨ２、－ＳＯ３Ｘ、－ＣＯＯＸ、Ｙ、Ｚからなる群より選択される１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の５～６員単環の、炭素環又は少なくとも１つの窒素原子、硫黄原子若しくは酸素原子を含む複素環、或いは前記芳香族の５～６員単環の炭素環若しくは複素環を含む９～１０員の縮合環であり、
    －Ｒ５及び－Ｒ６は、それぞれ独立に、場合により－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－Ａｔ、－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ２－６アルケニル、－Ｃ２－６アルキニル、＝Ｏ、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－６アルキル、－Ｏ－ＣＨ３、－ＣＯＮＨ２、－ＮＯ２、－ＮＨ２、－ＳＯ３Ｘ、－ＣＯＯＸ、Ｙ、Ｚからなる群より選択される１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の５～６員単環の、炭素環又は少なくとも１つの窒素原子、硫黄原子若しくは酸素原子を含む複素環、或いは前記芳香族の５～８員単環の炭素環若しくは複素環を含む９～１０員の縮合環であり、
    　ただし、Ｒ１又はＲ２が、芳香族の５員単環の、炭素環又は少なくとも１つの窒素原子、硫黄原子若しくは酸素原子を含む複素環である場合には、該複素環は－ＣＯＯＸにより置換されたものではない]。
  14. 　式（I)により表される反応促進剤において、Ｒ１及びＲ２が、それぞれ独立に、場合により置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環、或いは前記芳香族の６員単環の炭素環を含む１０員の縮合環である、請求項１３に記載の反応促進剤。
  15. 　式（I)により表される化合物において、Ｒ１及びＲ２が、それぞれ独立に、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000023
    からなる群より選択され、式中、Ｘ、Ｙ、Ｚは請求項１２に定義したとおりである、請求項１３又は１４に記載の反応促進剤。
  16. 　式（I)により表される反応促進剤において、Ｒ１が、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
     からなる群より選択され、Ｒ２が、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
     からなる群より選択され、式中、Ｘは請求項１２に定義したとおりである、請求項１３～１５のいずれか１項に記載の反応促進剤。
  17. 　式（I)により表される反応促進剤が、下記の式で表される反応促進剤である、請求項１３～１６のいずれか１項に記載の反応促進剤、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
     ［式中、
    Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択され、
    Ｙは、－Ｈ、－ＳＯ３Ｘ、－ＣＯＯＸからなる群より選択され、
    各Ｘ、Ｙは、同一でも異なっていてもよく、
    －Ｒ３は、－Ｈ又は－ＮＨＣＯ－ＮＨ－Ｒ５－Ｎ＝Ｎ－Ｒ６であるか、或いは、場合により－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－Ａｔ、－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ２－６アルケニル、－Ｃ２－６アルキニル、＝Ｏ、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－６アルキル、－ＣＯＮＨ２、－ＮＯ２、－ＮＨ２、－ＳＯ３Ｘ、からなる群より選択される１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環、或いは前記炭素環を含む１０員の縮合環であり、
    －Ｒ５及び－Ｒ６は、それぞれ独立に、場合により－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、－Ｉ、－Ａｔ、－Ｃ１－６アルキル、－Ｃ２－６アルケニル、－Ｃ２－６アルキニル、＝Ｏ、－ＯＨ、－Ｏ－Ｃ１－６アルキル、－Ｏ－ＣＨ３、－ＣＯＮＨ２、－ＮＯ２、－ＮＨ２、－ＳＯ３Ｘ、からなる群より選択される１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環、或いは前記炭素環を含む１０員の縮合環である]。
  18. 　式（I)により表される反応促進剤が、下記のいずれかの式で表される反応促進剤である、請求項１３～１７のいずれか１項に記載の反応促進剤、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
     ［式中、
    Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択され、
    Ｙは、－Ｈ、－ＳＯ３Ｘ、－ＣＯＯＸからなる群より選択され、
    各Ｘ、Ｙ、Ｚは、同一でも異なっていてもよい]。
  19. 　式（I)により表される反応促進剤が、下記の式で表される反応促進剤である、請求項１３～１７のいずれか１項に記載の反応促進剤、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
     ［式中、
    Ｒ１は、場合により１又は複数の置換基により置換されていてもよい、ベンゼン環又はナフタレン環であり、
    前記の置換基は、－ＮＯ２、－ＳＯ３Ｘ、及び
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
     からなる群より選択され、
    Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択される]。
  20. 　式（I)により表される反応促進剤において、Ｒ１が、場合により１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の６員単環の炭素環であり、Ｒ２が、場合により１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の５員単環の、少なくとも１つの窒素原子、硫黄原子若しくは酸素原子を含む複素環である、請求項１３に記載の反応促進剤。
  21. 　Ｒ２が、場合により１又は複数の置換基により置換されていてもよい、芳香族の５員単環の、２つの窒素原子を含む複素環であり、該複素環が
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
     により置換されており、式中、Ｘは請求項１２に定義したとおりであり、各Ｘは同一でも異なっていてもよい、請求項１３又は２０に記載の反応促進剤。
  22. 　Ｒ２が、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
     であり、式中、Ｘは請求項１２に定義したとおりであり、各Ｘは同一でも異なっていてもよい、請求項１３、２０又は２１に記載の反応促進剤。
  23. 　式（I)により表される化合物が、
    以下の式により表される化合物、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
     以下の式により表される化合物、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
     ［式中、Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択される]、
    以下の式により表される化合物、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
     ［式中、Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択され、各Ｘは、同一でも異なっていてもよい]、
    以下の式により表される化合物、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
     ［式中、Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択され、各Ｘは、同一でも異なっていてもよい]、
    以下の式により表される化合物、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
     ［式中、Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択される]、
    以下の式により表される化合物、 
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
     以下の式により表される化合物、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
     ［式中、Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択され、各Ｘは、同一でも異なっていてもよい]、
    以下の式により表される化合物、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
     ［式中、Ｘは、－Ｈ、－Ｎａ、－Ｋ、－Ｌｉからなる群より選択される]
    及び、以下の式により表される化合物、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
     からなる群より選択される、請求項１３～２２のいずれか１項に記載の反応促進剤。
  24. 　請求項１３～２３のいずれか１項に記載の反応促進剤及びオキシダーゼを含む、組成物。
  25. 　オキシダーゼが、アマドリアーゼ、サルコシンオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼからなる群より選択されるオキシダーゼである、請求項２４に記載の組成物。
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