WO2018003983A1 - ｈＡＮＰ－Ｆｃ含有分子コンジュゲート - Google Patents

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peg
hanp
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sugar chain
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充広 岩本
昇平 大石
幸子 関口
洋行 茶谷
隆記 宮内
雄 本田
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第一三共株式会社
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    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
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    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/90—Fusion polypeptide containing a motif for post-translational modification
    • C07K2319/91—Fusion polypeptide containing a motif for post-translational modification containing a motif for glycosylation

Definitions

  • the present invention provides a conjugate that has a hANP peptide loaded on an Fc-containing molecule serving as a carrier, and then gradually enters the blood after subcutaneous administration and significantly extends the pharmacological duration of hANP.
  • the present invention relates to a pharmaceutical contained as a component, a method for producing the conjugate, and the like.
  • Human atrial natriuretic peptide is a physiologically active peptide having a vasodilatory action, a diuretic action, a cell growth inhibitory action, a venous perfusion flow reducing action, and a sympathetic nerve activity inhibitory action.
  • the natural hANP loses its activity rapidly in the blood, for example, by being cleaved by neutral endopeptidase (NEP) in the blood.
  • NEP neutral endopeptidase
  • hANP has been clinically applied as a therapeutic agent for acute heart failure.
  • continuous intravenous administration such as infusion while monitoring blood pressure is necessary.
  • Endogenous physiologically active peptides such as hANP can be expected to be highly effective and safe because of their very high selectivity for specific receptors.
  • hANP endogenous physiologically active peptides
  • the half-life in blood is extremely short because it is rapidly metabolized by various metabolic enzymes during the systemic circulation, or rapidly discharged by glomerular filtration in the kidney. For this reason, attempts have been made to extend the blood half-life of peptides by imparting metabolic enzyme resistance or avoiding renal excretion.
  • Patent Document 1 sugar chain-modified peptide
  • Patent Document 2 fusion polypeptide
  • Patent Document 3 Non-Patent Document 1
  • immunoglobulin Fc fusion peptide Patent Document 4
  • Non-Patent Document 2 Non-Patent Document 2
  • Antibody drugs have a much longer blood half-life than peptide drugs and protein drugs due to a recycling mechanism via neonatal Fc receptor (FcRn) (Non-patent Document 5).
  • Non-Patent Documents 3 and 4 Non-Patent Documents 1 and 2.
  • hANP that is rapidly metabolized in the blood
  • the carrier protein it has been suggested that the hANP part on the carrier undergoes metabolism during circulation, and the "hANP-protein fusion" It is difficult to retain in the blood at the same level as the retention in blood (Non-patent Document 2).
  • Non-patent Document 6 Non-patent Documents 7 and 8
  • biopharmaceuticals are known to slowly enter the blood in subcutaneous administration rather than intravenous administration (Non-patent Document 9), but predict the pharmacokinetics of chemically modified antibodies. Is difficult.
  • development of an hANP preparation that has all of the slow blood migration, sufficient blood residence time, and retention of activity necessary for pharmacological effects is desired.
  • An object of the present invention is to find an improved body of hANP that has both drug efficacy and safety in subcutaneous administration.
  • hANP peptide is bound via a sugar chain that binds to Asn corresponding to the 297th position of an IgG heavy chain and a specific PEG linker.
  • the conjugate thus conjugated increased the intracellular cGMP concentration relative to the GC-A receptor-expressing cells, and the blood duration when administered to rats was prolonged. It was found that the cGMP concentration in the blood was continuously increased even after 168 hours after administration of the body, and that the conjugate body using hANP modified with a sugar chain as the hANP peptide has particularly good physical properties.
  • the present invention was completed through further research.
  • the present invention provides the following.
  • L (PEG) is a linker structure containing 10 to 35 ethylene glycol structures, which may contain other binding structures and / or modified structures
  • the Fc-containing molecule is a molecule having an amino acid sequence corresponding to the Fc region of human IgG and having no specific binding ability to human biomolecules
  • the N297 sugar chain is a sugar chain N297- (Fuc) SG
  • [L (PEG)] is bound to the 2-position of sialic acid at the non-reducing end of both the 1-3 and 1-6 chains of the ⁇ -Man branched chain. (Represents binding to a carbonyl group.)
  • [L (PEG)] represents that L (PEG) binds to the carbonyl group bonded to the 2-position of the non-reducing end sialic acid on the 1-3 chain side of the branched chain of ⁇ -Man. .
  • L (PEG) means that L (PEG) binds to the carbonyl group bonded to the 2-position of the non-reducing end sialic acid on the 1-6 chain side of the branched chain of ⁇ -Man.
  • the hANP peptide is hANP (1-28), hANP (2-28), hANP (3-28), hANP (1-27), hANP (2-27) or hANP (3-27)
  • the hANP peptide is a sugar in which asparagine or glutamine in which any sugar chain of AG5, AG7, AG9 or SG represented by the following formula is N-glycoside-linked to the side chain is bonded to the N-terminal or C-terminal of the peptide.
  • Solid line ⁇ is compound 3-1
  • solid line ⁇ is compound 3-2
  • solid line ⁇ is compound 3-3
  • solid line ⁇ is compound 3-4
  • broken line ⁇ is compound 3-5
  • broken line ⁇ is compound 3-6 are shown respectively.
  • FIG. 7 is a graph showing changes over time in the detected amounts of all human Fc-containing molecules and conjugates in plasma of rats subcutaneously administered with the conjugates of the present invention.
  • FIG. 8 is a graph showing time-dependent changes in plasma cGMP concentration in rats administered subcutaneously with the conjugate of the present invention.
  • the partial structure when the side chain of an amino acid is linked to a sugar chain is indicated by parentheses in the side chain portion, for example, “(SG-) Asn”.
  • a monosaccharide that is a basic unit of a sugar chain means that, for convenience, the ring structure is bonded to an oxygen atom constituting the ring and is assigned to a hydroxyl group (or glycoside bond).
  • the carbon atom directly bonded to the oxygen atom) is expressed as the 1-position (the 2-position only in sialic acid).
  • the names of the example compounds are given as the entire chemical structure, and this rule is not necessarily applied.
  • the monosaccharide contained in the sugar chain is not particularly limited as long as it has a basic structure of sugar, and various substances such as 6-membered sugar and 5-membered sugar can be used.
  • ⁇ -hANP has been approved for manufacture and sale in Japan under the general name carperitide and sold (trade name: HAMP, HANP).
  • ⁇ -hANP is also commonly known as Human pro-ANP [99-126].
  • the Cys residues at positions 7 and 23 of SEQ ID NO: 1 are disulfide-bonded to form an intramolecular ring structure. It is known that this ring structure and amino acids up to the Arg residue on the C-terminal side 27 are important for activation of the GC-A receptor by hANP (Silver, MA, Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. (2006), 15, p14-21, A.
  • hANP (7-27) consisting of this ring structure is considered to be the smallest unit that activates GC-A.
  • the hANP peptide of the present invention is a peptide consisting of an amino acid sequence in which 1 to 6 amino acids continuous from the N-terminal side and / or the 28th amino acid may be deleted in SEQ ID NO: 1)
  • it is a peptide in which at least one amino acid at position 1, 1 and 2 and position 28 of SEQ ID NO: 1 may be deleted, more preferably position 1 of SEQ ID NO: 1, and
  • It is a peptide (hANP (2-28), hANP (3-28), etc.) consisting of an amino acid sequence that may delete the first and second amino acids, and most preferably consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • It is a peptide (hANP (1-28)).
  • the hANP peptide and the PEG linker can be bonded to the N-terminal ⁇ -amino group or the C-terminal ⁇ -carboxyl group by an amide bond, for example, to the N-terminal of the hANP peptide. It is preferred that a PEG linker is attached.
  • a reducing end of a sugar chain is azidated, and the compound having a desired structure in the sugar chain is bonded by N-glycoside bond by reacting the azido sugar chain and a compound having a carboxyl group in the presence of triphenylphosphine.
  • a compound having a hydroxyl group such as alcohol
  • the desired compound and the sugar chain can be bound by an O-glycoside bond.
  • AG5 the above-mentioned sugar chain consisting of an N-linked basic structure
  • etc. from which is deleted can be exemplified.
  • AG (9), AG (7) and AG (9), AG (7) AG (5) reducing end modified sugar chain eg AG (9-Glc) in which GlcNAc at the reducing end of AG (9) is replaced with Glc, AG in which GlcNAc at the reducing end of AG (9) is replaced with Man (9-Man) etc.
  • reducing end modified sugar chain eg AG (9-Glc) in which GlcNAc at the reducing end of AG (9) is replaced with Glc
  • any one or more amino acids at positions 1 to 5 and 28 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 are (GLY-) Asn.
  • the sugar chain when a sugar chain derived from a naturally-occurring glycoprotein or glycolipid is used as the sugar chain used for the modification of the hANP peptide, the sugar chain is prepared according to the method described in Patent Document 1, for example.
  • SG reacts with SGP by a known method with a hydrolase (such as Endo M) and cuts out by hydrolysis, or is transferred to a desired compound using a glycosyltransferase (such as an Endo-M N175Q mutant).
  • a hydrolase such as Endo M
  • a glycosyltransferase such as an Endo-M N175Q mutant
  • IgG has a domain structure, and a Fab domain that includes a variable region and has an antigen binding ability and an Fc domain that binds to an Fc receptor are linked via a hinge region.
  • the Fc-containing molecule of the present invention is not particularly limited as long as it contains an Fc region, and it is possible to use a full-length IgG heavy chain, an antibody fragment containing an Fc region, a variant obtained by partially modifying the amino acid sequence, or the like. it can.
  • the Fc-containing molecule of the present invention may be only a heavy chain or may have a light chain corresponding to the structure of the heavy chain.
  • IgG When full-length IgG is employed as the Fc-containing molecule, there is no particular limitation as long as it does not have specific binding ability to a substance that is usually present in the human body, but IgG using a non-human animal protein as an antigen is When there is a human corresponding molecule / related molecule, there is a possibility of cross-reactivity with the human molecule. Therefore, it is preferable to select a monoclonal antibody against an antigen that does not have a corresponding molecule / related molecule. Even if an antibody has the possibility of binding to a component in the human body, this molecule can be used as long as it has a mutation introduced into its variable region by genetic engineering techniques and has lost its binding activity to the human component.
  • Such monoclonal antibodies are described in, for example, WO2015 / 046505 and the like, specifically, a heavy chain consisting of amino acid sequences of amino acid numbers 20 to 474 of SEQ ID NO: 3 (amino acid numbers 1 to 19 are signal peptides, The nucleotide sequence encoding the heavy chain is SEQ ID NO: 2) and the light chain consisting of the amino acid sequences of amino acid numbers 21 to 234 of SEQ ID NO: 5 (amino acid numbers 1 to 20 are signal peptides, and the nucleotide sequence encoding the light chain is And mAb-A consisting of a combination of SEQ ID NO: 4).
  • an antibody fragment or a variant is employed as the Fc-containing molecule of the present invention, it is not particularly limited as long as it contains an Fc region in a form capable of forming a dimer, and various sequences can be employed. . If the antibody to be derived does not have a brain that specifically binds to a human component as described above, a variant that retains part or all of the variable region may be employed, or preferably the variable region. Is a fragment or variant in which is deleted.
  • CH consisting only of a constant region obtained by deleting a variable region from a human IgG heavy chain
  • the IgG subclass from which it is derived is not particularly limited.
  • the amino acid sequence of CH derived from human IgG1 (referred to as “CH-A”) is amino acid numbers 20 to 349 of SEQ ID NO: 7 (positions 1 to 19 on the N-terminal side are signal peptides, and the nucleotide sequence encoding CH-A is a sequence) No. 6).
  • CL-A The amino acid sequence of CL of IgG1 light chain (referred to as “CL-A”) is amino acid numbers 21 to 125 of SEQ ID NO: 9 (the amino acids at positions 1 to 20 on the N-terminal side are nucleotide sequences encoding a signal peptide, CL-A) Is shown in SEQ ID NO: 8).
  • a preferred embodiment of the Fc-containing molecule of the present invention is CLCH, and more preferred is CLCH-A in which CH-A and CL-A are combined.
  • the Fc-containing molecule of the present invention employs a fragment or variant mainly composed of the Fc region, for example, an amino acid sequence in which CPPC as a part of the hinge region is added to the N-terminus of the Fc region of IgG (the sequence of IgG1 As an example, an antibody fragment consisting of the sequence at positions 128 to 349 of SEQ ID NO: 7 can be employed.
  • the hinge region is a region that increases the structural flexibility of the Fc-containing molecule, and does not affect the function as a carrier protein that is the object of the present invention. Therefore, as long as CPPC is included, the hinge region is appropriately adjusted and employed. be able to.
  • Examples of such an antibody fragment mainly composed of Fc include those derived from IgG1 in the amino acid sequence from position Glu to position 349 Lys of SEQ ID NO: 7 or 11, and from 1 to An Fc-containing molecule consisting of an amino acid sequence that may have 10 amino acids deleted, or a modified version of the amino acid sequence, preferably 123 from Asp to 349, Lys, 127 from Thr of SEQ ID NO: 7. An Fc-containing molecule consisting of Lys at position 349 or Lys at position 126 to Lys at position 349.
  • the amino acid sequence of amino acid numbers 22 to 243 of SEQ ID NO: 15, the amino acid sequence of amino acid numbers 26 to 247 of SEQ ID NO: 17, or the N-terminal thereof examples thereof include Fc-containing molecules consisting of amino acid sequences to which T, HT, THT, KTHT, or DKTHT are added, or variants in which those amino acid sequences have been modified.
  • it contains Fc consisting of the amino acid sequence of amino acid numbers 21 to 243 of SEQ ID NO: 15, the amino acid sequence of amino acid numbers 25 to 247 of SEQ ID NO: 17, or the amino acid sequence of amino acid numbers 21 to 247 of SEQ ID NO: 17.
  • Asn297 in these Fc fragments is Asn at position 93 in SEQ ID NO: 15, and Asn at position 97 in SEQ ID NO: 17.
  • Cys for constituting a dimer in the hinge region, Cys contributing to intramolecular disulfide bond in the Fc region, and an N297 sugar chain are bound. 1 to several (preferably 5 or less, more preferably 3, 2 or 1) within a range that retains Asn297 and its surrounding amino acids and does not impair the function as a carrier protein ( Preferably, 20 or less, more preferably 15 or less, still more preferably 10 or less, and even more preferably 7, 6, 5, 4, 3, 2, or 1 amino acids per modification are substituted or missing. Loss, insertion and / or modification may be adopted.
  • N-terminal amino acid may affect the production of Fc-containing molecules by biotechnological techniques, and can be altered to an amino acid sequence suitable for a desired production system.
  • the amino acid of Leu234-Lue235 is a site that affects the expression of effector activity by T cell activation by binding of an antibody and an Fc receptor. Replacing Leu contained in this region with Ala (the obtained mutant is referred to as “LALA body”) may eliminate this effector activity and reduce the risk of side effects (US Pat. No. US5885573), Such modifications may be made as necessary.
  • CLCH-B is prepared as the LALA body of CLCH-A
  • Fc-A is prepared as the LALA body of Fc-B, and functions appropriately as a carrier molecule in the conjugate of the present invention. It has been confirmed.
  • a tag sequence such as a signal sequence, a peptide degrading enzyme recognition sequence, or GST may be added for the purpose of improving the expression and purification efficiency of the target molecule.
  • the Fc-containing molecule used in the present invention undergoes post-translational modification in the production process using animal cells, and a heterogeneous sugar chain is added to Asn297, and the N297 sugar chain is an SG type having any of the following structures: Remodeled to a sugar chain (SG type N297 sugar chain). Normally, during production from animal cells, a sugar chain is added to Asn297 of both monomers of the dimer, and it is produced as a normal form having two N297 sugar chains per dimeric Fc-containing molecule.
  • [L (PEG)] is bound to the 2-position of sialic acid at the non-reducing end on both the 1-3 and 1-6 side of the branched chain of ⁇ -Man. Represents bonding with a carbonyl group.
  • L (PEG)] represents that L (PEG) binds to the carbonyl group bonded to the 2-position of the sialic acid at the non-reducing end of the ⁇ -Man branched chain on the 1-3 chain side.
  • [L (PEG)] means that L (PEG) binds to the carbonyl group bonded to the 2-position of the non-reducing end sialic acid on the 1-6 chain side of the branched chain of ⁇ -Man. To express.).
  • the Fc-containing molecule is a dimer and usually has an N297 sugar chain in both monomers.
  • the conjugate becomes a molecule in which two PEG linkers and an hANP peptide are bound (divalent hANP peptide) (if the Fc-containing molecule is a sugar chain-deficient, only one monomer is N297- (Fuc) MSG1 Alternatively, N297- (Fuc) MSG2 is added to form a monovalent hANP peptide).
  • N297 sugar chain is N297- (Fuc) SG
  • the conjugate is a molecule in which four PEG linkers and an hANP peptide are bound (tetravalent hANP).
  • the conjugate of the present invention is a molecule having a plurality of types of N297 sugar chains, or a mixture of these normal and sugar chain deficient (in the present invention, such a mixture is referred to as a normal conjugate for convenience.
  • GlcNAc (Fuc ⁇ 1,6) GlcNAc) to which fucose is added at the reducing end is derived from an Fc-containing molecule produced in animal cells, and the sugar chain on the non-reducing end side is SG described above. Remodeled to the same sugar chain structure. In either case, the PEG linker is used for the carboxylic acid bonded to the 2-position of sialic acid at the non-reducing end.
  • Such an Fc-containing molecule having an SG type N297 sugar chain can be produced by a method as shown in FIG. 3, for example, according to the method described in WO2013 / 120066 or the like.
  • the N297 sugar chain has an N-linked sugar chain structure with fucose added as a basic structure. It is obtained as a mixture of an antibody or a fragment thereof having a sugar chain having various structures in which various modifications are made to the structure and the constituent sugar (FIG. 3A (IV)).
  • EndoS or a mutant enzyme retaining its hydrolysis activity can be used as an enzyme used for such a hydrolysis reaction of the N297 sugar chain.
  • EndoS or a mutant enzyme retaining its hydrolysis activity By reacting the (Fuc ⁇ 1,6) GlcNAc-Fc-containing molecule obtained by the above hydrolysis reaction with a SG-type sugar chain donor molecule using a glycosyltransferase such as EndoS D233Q mutant as a sugar chain acceptor molecule.
  • a glycosyltransferase such as EndoS D233Q mutant
  • a sugar chain donor molecule having SG (10) as a sugar chain is used for the sugar transfer reaction.
  • SG (10) sugar chain may be obtained, for example, by hydrolysis from SGP, and commercially available dicialooctasaccharide (SG (10) sugar chain such as Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.). You may use only.
  • SG (10) sugar chain may be obtained, for example, by hydrolysis from SGP, and commercially available dicialooctasaccharide (SG (10) sugar chain such as Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.). You may use only.
  • a sugar chain donor molecule having MSG1 (9) or MSG2 (9) as the sugar chain is employed.
  • Such sugar chains are separated and employed according to the method described in Example 1-11 using commercially available monosialo-Asn free (1S2G / 1G2S-10NC-Asn, Glycotechnology Laboratory). It can also be used as a mixture without separation.
  • GlcNAc at the reducing end of the SG-type sugar chain contained in the donor molecule was activated, for example, in the form of oxazolation by treatment with 2-chloro-1,3-dimethyl-1H-benzimidazol-3-ium-chloride. It is preferable to use one, but activation is not necessary when using two types of enzymes described later.
  • the SG-type sugar chain contained in the donor molecule has a sugar chain obtained by binding a PEG linker or a linker molecule having a partial structure to a carboxylic acid contained in the sialic acid at the non-reducing end.
  • EndoS 233rd Asp As Gln.
  • EndoS D233Q which is a modified product that suppresses the hydrolysis reaction by substitution.
  • the transglycosylation reaction using EndoS D233Q is described in WO2013 / 120066 and the like.
  • modified enzymes such as EndoS D233Q / Q303L, EndoS D233Q / E350A, EndoS D233Q / E350Q, EndoS D233Q / E350D, EndoS D233Q / E350N, EndoS D233Q / D405A, etc. with further mutations compared to EndoS D233Q May be used.
  • the transglycosylation reaction using such modified EndoS D233Q is described in WO2017 / 010559.
  • the purification operation of Fc-containing molecules after sugar chain remodeling (sugar hydrolysis and transglycosylation) of Fc-containing molecules is aimed at separation from low-molecular compounds and enzymes used in the reaction.
  • gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, and the like are used, and further improvement in transglycosylation reaction efficiency was confirmed by performing additional purification using a hydroxyapatite column. That is, the present invention provides a method for producing a conjugate, wherein the intermediate purification step from the reaction solution after sugar hydrolysis of the Fc-containing molecule further includes a purification step using a hydroxyapatite column.
  • the present invention uses two types of enzymes at the same time to transfer sugar to the N297 sugar chain of an Fc-containing molecule using, as a direct sugar chain donor, SGP or (SG-) Asn whose reducing end is not activated.
  • a direct sugar chain donor SGP or (SG-) Asn whose reducing end is not activated.
  • Endo enzymes to be used should be an appropriate combination of enzyme A (EndoM-like enzyme) that uses complex sugar chains widely as a substrate and enzyme B (EndoS-like enzyme) that uses N297 sugar chains of Fc-containing molecules as substrates. is important.
  • Examples of the enzyme A include EndoM, EndoOm, EndoCC, and EndoM mutants, EndoOm mutants, EndoCC mutants, and the like, whose hydrolysis activity has been reduced.
  • Preferred as enzyme A are EndoM N175Q, EndoCC N180H, EndoOm N194Q.
  • Examples of the enzyme B include EndoS, EndoS2 (EndoS49), EndoS mutants with reduced hydrolytic activity thereof, EndoS2 (EndoS49) mutants, and the like.
  • Preferred examples of the enzyme B include EndoS D233Q, EndoS D233Q / Q303L, EndoS D233Q / E350A, EndoS D233Q / E350Q, EndoS D233Q / E350D, EndoS D233Q / E350N, EndoS D233Q / D405A and the like.
  • the structure of the sugar chain donor is not particularly limited as long as it has a sugar chain structure recognized by the enzyme A employed, and can be synthesized by combining with a chemical reaction or an enzyme reaction obtained from nature.
  • examples include an amide structure and an azide.
  • O-linked sugar chain structure In the case of O-linked sugar chain structure (see the following formula. Anomer substituent R is R at the reducing end of the top structural formula), ethylene glycol structure, glycolic acid structure, or benzyl used as protecting group for anomeric hydroxyl group Examples thereof include a group, an allyl group, and a paranitrophenyl group.
  • the structure of the non-reducing terminal of the sugar chain donor is not particularly limited as long as it is recognized by enzyme A, and the natural sugar chain structure or the non-reducing terminal sugar chain is deleted from the natural sugar chain structure.
  • Preferred sugar chain donors include SGP, (SG-) Asn, ([N 3 -PEG (3)] 2 -SG) -Asn-PEG (3) -N 3 and the like.
  • the acceptor molecule used in this method is not particularly limited as long as it is an Fc-containing molecule having an N297 sugar chain, and various types such as mAb, CLCH, and Fc fragment can be appropriately selected and used.
  • the reaction temperature can be appropriately selected according to the optimum temperature of the enzyme to be used, but is usually 15 to 50 ° C., preferably 25 to 40 ° C. In this method, since two types of enzymes are used, if the other enzyme is deactivated at the optimum temperature of one enzyme, the transfer reaction may not proceed appropriately. Therefore, it is preferable to select a combination of enzymes having similar conditions such as optimum reaction temperature.
  • the PEG linker contained in the conjugate of the present invention contains about 10 or more ethylene glycol units in a linear form, and this length is important for the expression of hANP activity retained by the conjugate.
  • the upper limit of the number of ethylene glycol units (—CH 2 —CH 2 —O—) contained in the linker structure is about 50 or less, preferably about 40 or less, more preferably about 35 or less, and still more preferably Is about 30 or less.
  • the lower limit of the ethylene glycol unit contained in the linker structure is preferably about 15 or more, more preferably about 20 or more, and further preferably about 25 or more.
  • Such a PEG linker may be derived from a single molecule or may be composed of a plurality of partial structures obtained by binding a plurality of molecules. Such a molecule from which the linker structure is derived is referred to as a “linker molecule”.
  • linker molecule Such a molecule from which the linker structure is derived is referred to as a “linker molecule”.
  • the PEG linker of the present invention is derived from one linker molecule, it is linked to the carboxylic acid 2-position carboxylic acid of the SG type N297 sugar chain for binding to the Fc-containing molecule.
  • the linker molecule When the PEG linker of the present invention is derived from a plurality of linker molecules, the linker molecule includes at least a compound containing a functional group that binds to the carboxylic acid at position 2 of sialic acid of the N297 sugar chain, and N of the hANP peptide. A compound having a functional group capable of binding to the terminal or C-terminal is used. If these two types of linker molecules further have a functional group that can be directly bonded, they can be directly bonded or may be linked via another compound. As the linker molecule to be used, a compound having an appropriate functional group or structure is appropriately selected in consideration of the efficiency and convenience of the conjugate production. Therefore, the final PEG linker structure only needs to contain a predetermined number of ethylene glycol unit structures in total, and only one kind of linker molecule may contain PEG, and two or more The linker molecule may contain an ethylene glycol unit.
  • n represents the number of consecutive ethylene glycol units contained, and when another chemical structure is inserted, such as PEG (n) -PEG (m) To display.
  • a linker structure containing 24 units of polyethylene glycol is represented as PEG (24)
  • a linker structure formed by combining a linker molecule containing 12 units of polyethylene glycol and a linker molecule containing 6 units of polyethylene glycol is PEG Display as (12) -PEG (6).
  • the same PEG (12) the linker molecules are formed by combining-PEG (12) portions may also be displayed using the PEG (12) 2 and shorthand.
  • Such a desired length PEG linker is, for example, 3- [2- [2- [2- [2- [2- [2- [2- [2- [2- [2- [2- [2- [2- [2- [2- [2- [2- [2- [2- [2- [2- [2- [2- [2- [2- [2- [2- [2- [2- [2- [2- [2- [2- [2- [2- [2- [2- [2- [2- [2- [2- [2- [2- [2- [2- [2- [2- [ 2- (9H-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino) ethoxy] ethoxy] ethoxy] ethoxy] ethoxy] ethoxy] ethoxy] ethoxy] ethoxy] propanoic acid (Fmoc-PEG (12) -COOH)
  • Fmoc-PEG (12) -COOH To form a linker with the desired PEG length by repeatedly deprotecting and activating the carboxylic acid using an Fmoc-PEG reagent with an Fmoc-
  • Fmoc-PEG reagents are commercially available from Novabiochem such as Fmoc-PEG (3) -COOH, Fmoc-PEG (6) -COOH, Fmoc-PEG (12) -COOH, Fmoc-PEG (24) -COOH. Has been.
  • a cycloaddition reaction that forms a 1,2,3-triazole ring [Cu (I) -Catalyzed Azide-Alkyne 1498711133922_0 (CuAAC)]
  • a cycloaddition reaction [Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition (SPAAC)] that forms a 1,2,3-triazole ring by the reaction of an azide group and dibenzylcyclooctene (DBCO).
  • a compound having a distorted cyclooctyne structure bicyclo [6.1.0] non-4-ene (BCN) (Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49, 9422-9425), or a medium ring structure Cycloalkyne (Angew. Chem. Int. Ed. 2015, 54, 1190-1194) containing a hetero atom can also be used.
  • BCN bicyclo [6.1.0] non-4-ene
  • Cycloalkyne Angew. Chem. Int. Ed. 2015, 54, 1190-1194
  • Diels-Alder cycloaddition reaction of 1,2,4,5-tetrazine ring and distorted alkene (Curr.Opin.Chem.Biol., 2014,21,89-95) it can.
  • Pictet-Spengler reaction type cyclization condensation with aldehyde group includes Hydrozino-Pictet-Spengler ligation (Bioconjugate Chem. 24,846-851.) And Oxyamine-based Pictet-Spengler ligation (Proc. Natl. Acad. Sci. USA). 110, 46-51).
  • amide bond by amino group and carboxyl group maleimide condensation of SH group and maleimide group, condensation of SH group and methylsulfonylphenyloxadiazole group (Angew. Chem., Int. Ed.
  • Examples include a bond between an SH group and an iodoacetyl group, a disulfide bond by condensation between an SH group and a 2-pyridyldithio group, a hydrazone condensation between an aldehyde group and a hydrazide, and an oxime condensation between an aldehyde group and an aminooxy group.
  • the linker molecule employed in the present invention one having a functional group that matches these bonding modes can be appropriately selected and used for the formation of a linker structure.
  • a stereoisomer, an optical isomer, a geometric isomer, or the like may be formed depending on the coupling mode.
  • These isomers may be separated and used by a known method, or may be used as a mixture. Since the final conjugate is a macromolecule, structural differences between the isomers of these partial structures are considered to have little effect on the conjugate.
  • PEG linker examples include, for example, the following L (PEG) A1 Structures such as ⁇ L (PEG) H1 and L (PEG) A2 ⁇ L (PEG) H2 can be mentioned.
  • hANP represents binding to the N-terminus of the hANP peptide
  • N297 GLY represents binding to the carbonyl group at the 2-position of sialic acid at the non-reducing end of the N297 sugar chain.
  • linker structures have a 1,2,3-triazole ring formed by the Click reaction of the azide group introduced into the N297 sugar chain that binds to the Fc-containing molecule and the DBCO group bound to the linker molecule containing the hANP peptide.
  • the linker structure attached to the azide group forms a geometric isomer attached to the 1- or 3-position of the triazole ring, but reacts with 2 or 4 azide groups per molecule of the Fc-containing molecule, A geometric isomerism structure is mixed in one molecule of the conjugate.
  • the conjugate of the present invention can be produced by appropriately combining intermediates such as the above-described hANP peptide, Fc-containing molecule, linker molecule and the like using a reaction known in the field of organic synthetic chemistry.
  • the order of the production is not particularly limited, and various methods can be adopted according to conventional methods according to the structure of the intermediate or the target product.
  • the functional group possessed by each intermediate is appropriately activated, deactivated, added with a protecting group, deprotected, etc. according to a conventional method according to the production process.
  • the conjugate having the PEG linker exemplified above can be produced, for example, as follows.
  • the linker molecule that binds to the N297 sugar chain is a molecule having a functional group (for example, an azide group) at the non-reducing end of the N297 sugar chain, and is synthesized in the above-described sugar chain remodeling step of the Fc-containing molecule.
  • a linker molecule having an amino group on one side and another functional group (eg, an azide group) on the other side is reacted with SG (10), and the linker molecule is bound to the carboxylic acid at the 2-position of sialic acid at the non-reducing end of the sugar chain. .
  • the reducing terminal GlcNAc of this sugar chain molecule is activated to form a sugar chain donor molecule, which is reacted with a (Fuc ⁇ 1,6) GlcNAc-Fc-containing molecule in the presence of a glycosyltransferase to produce the N297 sugar of the Fc-containing molecule.
  • a functional group is introduced at the non-reducing end of the chain.
  • the linker molecule that binds to the N-terminal of the hANP peptide is a molecule having a carboxyl group on one side and another functional group (DBCO, amino group having a protective group introduced, etc.) on the other side.
  • DBCO DBCO, amino group having a protective group introduced, etc.
  • the hANP peptide is hANP (1-28) or (SG-) Asn-hANP (1-28).
  • An antibody wherein the Fc-containing molecule is a combination of a heavy chain consisting of the amino acid sequence of amino acid numbers 20 to 474 of SEQ ID NO: 3 and a light chain consisting of the amino acid sequence of amino acid numbers 21 to 234 of SEQ ID NO: 5 (mAb-A); Or A CLCH (CLCH-A) consisting of a combination of a heavy chain consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 and amino acid sequence of amino acid numbers 21 to 125 of SEQ ID NO: 9 and an SG type N297 sugar Although the chain is N297- (Fuc) SG or N297- (Fuc) MSG1, and more specifically, compounds 3-1 to 3-14 synthesized in Example 3 can be mentioned, preferably compounds 3-1 to compound
  • the conjugate of the present invention exhibits an extended blood duration and excellent physical properties as compared with unmodified hANP (1-28), and is a gentle agent that is preferable as an hANP preparation upon subcutaneous administration. It has blood transfer performance. Since natural hANP (1-28) disappears rapidly from the blood, it has been necessary to continuously administer intravenously by intravenous infusion, etc., but the conjugate of the present invention can be prolonged even by ordinary subcutaneous administration. Can exert a period pharmacological effect. In addition, the conjugate of the present invention has the property of low aggregation even at high concentrations.
  • the conjugate of the present invention Due to the properties of the conjugate of the present invention, it is possible to adopt administration methods, administration routes, and formulation techniques that could not be achieved with conventional natural hANP and existing hANP formulations, and acute circulatory system It can be used not only for treating diseases but also for treating chronic cardiovascular diseases (such as hypertension and chronic heart disease). Furthermore, the conjugates of the present invention are also useful as biological research tools. Although natural type hANP is not known for its ability to migrate to the tissue when it has been in the blood for a long time, such localization and hANP are present in the blood for a long time by administering the conjugate of the present invention It becomes possible to investigate the influence on the living body by doing.
  • the blood persistence of the conjugate of the present invention is the cGMP concentration in the peripheral blood after administration to the animal and / or the peripheral blood sample. It can be tested by detecting the conjugate.
  • the conjugate of the present invention maintains the effect of increasing the cGMP concentration in peripheral blood even after about 24 hours after administration into the body, and more preferably the effect is achieved even after about 48 hours after administration. More preferably, the effect is maintained even after about 72 hours after administration, and even more preferably, the effect is maintained even after about 96, 120, 144, or 168 hours after administration.
  • the conjugate of the present invention slowly exhibits an activity after subcutaneous administration, and its peak is often after 24 to 48 hours. Such blood dynamics reduce / avoid the risk of hypotension.
  • the detection of the conjugate from the peripheral blood after administration of the conjugate it is preferably detected even after about 24 hours, more preferably after about 48 hours. More preferably, it is detected even after about 72 hours, and even more preferably, it is detected even after about 96, 120, 144 or 168 hours.
  • the conjugate of the present invention exhibits excellent physical properties that it hardly aggregates even in a high concentration aqueous solution.
  • the hANP peptide has the property of easily gelling due to the influence of salt in the solution, etc., and care must be taken in handling the preparation.
  • the conjugate of the present invention can be applied to various forms of preparations such as agglomeration problems are reduced, the active ingredient can be concentrated at a high concentration, and various additives can be employed. In particular, it has been confirmed that a conjugate containing a sugar chain-modified hANP peptide exhibits very good non-aggregation.
  • the blood duration of the conjugate of the present invention can be measured by administering the conjugate to a living body, collecting blood at regular intervals, and detecting the conjugate contained in the blood sample. it can.
  • various methods such as detection by LC-MS and ELISA using an antibody that specifically recognizes the ring structure of hANP can be used.
  • the conjugate of the present invention is administered at a dose that expresses cGMP-elevating activity
  • the cGMP level of the blood sample is measured using a commercially available measurement kit and compared with the cGMP level in the blood before the start of administration.
  • the duration as the biological activity of the conjugate in blood can be measured. It can also be detected by labeling the conjugate with a radioactive isotope, separating the blood sample with SDS-PAGE or the like, and detecting the radioactive signal.
  • the blood duration is prolonged means that the time detectable from the blood is prolonged after the administration of the test substance compared to natural hANP.
  • the natural hANP concentration falls below the measurement limit at 30 minutes after administration of 200 nmol / kg (data not shown), but the conjugate is still 7 days after administration of 100 nmol / kg. Detected from blood.
  • the conjugate of the present invention is resistant to the degradation of the hANP peptide by NEP as one of the factors that extend the duration.
  • Such resistance to NEP degradation can be measured by a known method.
  • the cGMP increasing activity of the conjugate of the present invention is determined by stimulating cells expressing GC-A receptor with a test substance adjusted to a sufficient concentration gradient, lysing the cells, and cGMP in the cell lysate. Measure the concentration and identify the maximum cGMP concentration (Emax).
  • the phrase “contains cGMP increasing activity” of the conjugate of the present invention means that the maximum cGMP concentration exhibited by the conjugate is about 30% or more compared to the maximum cGMP concentration of natural hANP. , Preferably about 50% or more, more preferably about 70% or more.
  • the conjugate of the present invention can be formulated at a higher concentration than natural hANP and exhibits an extended blood duration, the activity is defined by an indicator such as a so-called EC50 value. It is not appropriate to do so, and if the maximum activity at increasing concentrations can show more than a certain level of natural activity, it will be sufficient in clinical settings when administered at sustained and high concentrations. Can be obtained.
  • the present invention provides a medicament containing the conjugate of the present invention as an active ingredient.
  • the substance that can be used as the active ingredient of the medicament according to the present invention may be a pharmaceutically acceptable salt of the conjugate described above. That is, in the present invention, an acid addition of the above-described substances such as inorganic acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, or organic acids such as formic acid, acetic acid, butyric acid, trifluoroacetic acid (TFA), succinic acid, and citric acid. Salts can also be used as active ingredients. Alternatively, in the present invention, metal salts such as sodium, potassium, lithium and calcium, and salts with organic bases of the above-mentioned substances can be used as active ingredients.
  • Such a salt of the conjugate of the present invention may be a salt of the hANP peptide part, or may form a salt in the structure of the sugar chain.
  • the salt of the conjugate of the present invention is preferably one in which a pharmaceutically acceptable salt is formed with the hANP peptide moiety, and the pharmaceutical composition according to the present invention is a free form of the substance relating to the active ingredient. Or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • a substance that can be used as an active ingredient of a medicament according to the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof is generally used in medicine by mixing with a known pharmaceutically acceptable carrier, excipient, diluent or the like. It is preferable to administer to an individual by an administration method, that is, an oral administration method, or a parenteral administration method such as transmucosal administration, intravenous administration, intramuscular administration, or subcutaneous administration.
  • the dose of the substance that can be used as the active ingredient of the medicament according to the present invention varies depending on the type of disease, the age of the individual (patient), the body weight, the degree of symptoms, and the route of administration, but generally the dose per day.
  • the upper limit is about 100 mg / kg or less, preferably about 50 mg / kg or less, and more preferably 1 mg / kg or less.
  • the lower limit of the daily dose is, for example, about 0.1 ⁇ g / kg or more, preferably 0.5 ⁇ g / kg or more, more preferably 1 ⁇ g / kg or more.
  • the frequency of administration of the medicament according to the present invention varies depending on the active ingredient used, the administration route, and the specific disease to be treated.
  • peptidic substances when administered orally, it is preferable to formulate at a frequency of not more than 4 times per day, and when administered parenterally, for example intravenously, they can be injected using a normal syringe. It can also be administered continuously using an infusion pump, a catheter or the like.
  • administration by routes such as subcutaneous injection and intramuscular injection is also preferable, and in this case, various commonly used administration devices can be used.
  • the conjugate of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof is dissolved in an aqueous solvent, and if necessary, a stabilizer, a pH adjusting agent, It can be adjusted by adding a surfactant or the like.
  • a stabilizer e.g., sodium bicarbonate
  • a pH adjusting agent e.g., sodium bicarbonate
  • the solution prepared as described above can be lyophilized and dissolved in physiological saline, water for injection, glucose solution or the like when used.
  • the medicament of the present invention has an effect of treating a disease by being administered to a patient having a disease that can be treated by acting on GC-A and increasing cGMP level.
  • treatment of a disease or symptom means that the symptom is brought close to normalization by delaying, reducing, alleviating and / or suppressing the progression of a morbid symptom that is expected to be normalized by activation of GC-A. Means that.
  • an effect of suppressing the severity or onset of the disease is expected.
  • those who have suffered from the disease in the past have a risk of recurrence or chronicity.
  • recurrence or chronicity may occur. It can be expected to reduce the risk of conversion.
  • Such effects are also included in the treatment.
  • diseases include hypertension, acute heart failure (including condition management after the onset of acute heart failure), chronic heart failure, ischemic heart disease, acute nephritis (including condition management after the onset of acute nephritis), chronic nephritis, Acute renal failure (including pathological management after the onset of acute renal failure), chronic renal failure, ischemic heart disease (myocardial infarction, etc.), malignant tumor metastasis, liver fibrosis, cirrhosis, tissue adhesion in dialysis, fibrosis, Etc.
  • Example 1 is a production example of hANP peptide, linker molecule or derivative thereof, which is a production intermediate of the conjugate of the present invention
  • Example 2 is a production example of an antibody molecule
  • Example 3 is a conjugate.
  • Example 4 is a test example in which the characteristics and effects of the conjugate of the present invention were confirmed.
  • Example 1 Synthesis of various intermediates
  • the structural formula is simply expressed as "hANP”
  • the hANP peptide in the modified peptide is hANP (1-28) (SEQ ID NO: 1).
  • the peptide is linked to a linker molecule or sugar chain modified at the N-terminal Ser.
  • hANP (1-28) acetate (1000 mg) was dissolved in N, N-dimethylformamide (11 ml) and distilled water (3 ml), and diisopropylethylamine (315 ⁇ l, 1.81 mmol) was added.
  • N, N-dimethylformamide solution (5.6 m) containing an active ester prepared in advance was added and stirred at room temperature for 1 hour.
  • trifluoroacetic acid (186 ⁇ l, 2.41 mmol) was added to the reaction solution, transferred to a 20 mL-scintillation vial (manufactured by Biotage), and the solvent was removed using a high-speed concentrator V-10 (Biotage).
  • the compound (826 mg) synthesized in the step (1-1B) was dissolved by adding N, N-dimethylformamide (10 ml) and distilled water (3.5 ml), and diisopropylethylamine (160 ⁇ l, 0.92 mmol) was added.
  • N, N-dimethylformamide solution 4 m
  • an active ester prepared in advance was added and stirred at room temperature for 1 hour.
  • trifluoroacetic acid (77 ⁇ l, 1.00 mmol) was added to the reaction solution, transferred to a 20 mL-scintillation vial (Biotage), and the solvent was removed using a high-speed concentrator V-10 (Biotage).
  • acetic acid (343 ⁇ l, 5.99 mmol) was added to the reaction solution, transferred to a 20 mL-scintillation vial (Biotage), and the solvent was removed using a high-speed concentrator V-10 (Biotage).
  • Acetonitrile was added to the vial, and the solvent was removed using a high-speed concentrator V-10 (Biotage) to obtain a solid.
  • the solid was decanted with an appropriate amount of diethyl ether, and then an appropriate amount of acetonitrile / diethyl ether (1/2) was added and decanted again.
  • the obtained solid was dissolved by adding an appropriate amount of 0.2% aqueous trifluoroacetic acid solution and acetic acid, and was separated and purified in several steps. Using 0.1% trifluoroacetic acid aqueous solution and 0.1% trifluoroacetic acid acetonitrile solution as eluents, Purif-Rp2 (manufactured by Shoko Scientific) is used as the device, and Inertsil ODS-3 (manufactured by GL Sciences) is used as the column. did. Fractions containing the target compound that was UV detected (220 nm) during elution were combined and lyophilized. The title object compound (694 mg) was obtained as a colorless solid.
  • reaction mixture was transferred to a 20 mL-scintillation vial (manufactured by Biotage), and the solvent was removed using a high-speed concentrator V-10 (Biotage).
  • the solid was decanted by adding diethyl ether, and then decanted again by adding acetonitrile / diethyl ether (1/2).
  • the obtained solid was dissolved by adding an appropriate amount of an aqueous 0.1% trifluoroacetic acid solution and acetic acid, and was separated and purified in several steps.
  • the hANP (1-28) TFA salt (400 mg) prepared in step (1-2B) was dissolved by adding N, N-dimethylformamide solution (4.8 ml) and distilled water (1.2 ml), and diisopropylethylamine (118 ⁇ l, 0.68 mmol) was added. To this solution was added N, N-dimethylformamide solution 1-2C (8.0 m) containing an active ester prepared in advance, and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes. After completion of the reaction, acetic acid (82 ⁇ l, 1.36 mmol) was added.
  • Solids separated into two centrifuge tubes were combined into one centrifuge tube, washed with acetonitrile (30 mL), washed with diethyl ether (30 mL) ⁇ 2, and then dried under reduced pressure to obtain a crude product.
  • the above operation was performed for 3 lots, and each crude product (3 lots) was combined into one.
  • the obtained solid was dissolved by adding an appropriate amount of an aqueous 0.1% trifluoroacetic acid solution and acetic acid, and was separated and purified in several steps.
  • the compound (300 mg) synthesized in the step (1-2C) was dissolved in N, N-dimethylformamide (3 ml) and distilled water (1.4 ml), and diisopropylethylamine (54 ⁇ l, 0.31 mmol) was added.
  • N, N-dimethylformamide solution 1-2D 2.0 m containing an active ester prepared in advance was added and stirred at room temperature for 22 hours.
  • acetic acid (176 ⁇ l, 3.07 mmol) was added to the reaction solution, and about 2.1 ml each of the reaction solution was transferred to four centrifuge tubes (50 ml) to which diethyl ether / acetonitrile (30 ml / 10 ml) had been added in advance.
  • diethyl ether / acetonitrile (30 ml / 10 ml) had been added in advance.
  • a small centrifuge Hitachi Koki, CF16RX
  • solids were precipitated and the supernatant was removed.
  • the solids separated into four centrifuge tubes were combined into one centrifuge tube, washed with an appropriate amount of diethyl ether / acetonitrile (1/1) and an appropriate amount of diethyl ether, and then dried under reduced pressure to obtain a crude product.
  • the obtained solid was dissolved by adding an appropriate amount of 0.2% aqueous trifluoroacetic acid solution and acetic acid, and was separated and purified in several steps. Using 0.1% trifluoroacetic acid aqueous solution and 0.1% trifluoroacetic acid acetonitrile solution as eluents, Purif-Rp2 (manufactured by Shoko Scientific) is used as the device, and Inertsil ODS-3 (manufactured by GL Sciences) is used as the column. did. Fractions containing the target compound that was UV detected (220 nm) during elution were combined and lyophilized. The title object compound (416 mg) was obtained as a colorless solid.
  • the obtained solid was dissolved by adding an appropriate amount of 0.2% aqueous trifluoroacetic acid and acetic acid, and purified by reverse phase HPLC separation. Using 0.1% trifluoroacetic acid aqueous solution and 0.1% trifluoroacetic acid acetonitrile solution as eluents, Purif-Rp2 (manufactured by Shoko Scientific) is used as the device, and Inertsil ODS-3 (manufactured by GL Sciences) is used as the column. did. Fractions containing the target compound that was UV detected (220 nm) during elution were combined and lyophilized. The title object compound (620 mg) was obtained as a colorless solid.
  • DBCO-L (PEG) -hANP can be freely synthesized by incorporating the selection of these elements into the method of Example 1-1 or Example 1-2.
  • the following are compounds synthesized according to the same method as described in Example 1-1, changing the Fmoc-PEG reagent, the order of condensation / Fmoc deprotection, and the number of repetitions.
  • step (1-1A) of Example 1-1 the starting material of step (1-1E) is obtained in step (1-1B) in the method.
  • the title compound 1-4 was obtained by synthesis by substituting the obtained H2N-PEG (24) -hANP (1-28).
  • Step 1-1-1 and Example 1-1-1 of Example 1-1 Fmoc-PEG (6) -COOH was substituted as the Fmoc-PEG reagent, and between Steps 1-1-1 and 1-1E.
  • the title compound 1-8 was obtained by further synthesizing by repeating steps (1-1C) to (1-1D).
  • Step 1-1-1 and Example 1-1-1 of Example 1-1 Fmoc-PEG (6) -COOH was substituted as the Fmoc-PEG reagent, and between Steps 1-1-1 and 1-1E. And the steps (1-1C) to (1-1D) were further repeated twice to give the title compound 1-9.
  • HATU 92 mg, 0.24 mmol
  • N, N-dimethylformamide 0.6 ml
  • diisopropylethylamine 42 ⁇ l, 0.24 mmol
  • reaction solution was transferred to a centrifuge tube (50 ml) to which diethyl ether (20 ml) was added in advance.
  • diethyl ether (20 ml) was added in advance.
  • Diethyl ether (20 ml) was added and decanted.
  • acetonitrile (20 ml) was added and decanted, and then dried under reduced pressure to obtain a crude product.
  • the obtained solid was dissolved in an appropriate amount of 0.2% aqueous trifluoroacetic acid solution, and purified by reverse phase HPLC separation.
  • the obtained reaction solution was ultrafiltered using Amicon Ultra (Ultracel 30K, manufactured by Merck Millipore) to remove solids.
  • the passing liquid was purified by gel filtration chromatography.
  • Purif-Rp2 (manufactured by Shoko Scientific) is used for the instrument, HiPrep 26/10 Desalting (manufactured by GE Healthcare) is used for the column, 0.03% -NH 3 aqueous solution is used for the mobile phase, and the flow rate is adjusted.
  • the fraction volume was 10 ml at 10 ml / min.
  • (MSG-) Asn Asn monosialo-Asn free (1S2G / 1G2S-10NC-Asn, manufactured by Glycotechnology Institute) (referred to as “(MSG-) Asn”) (500mg) was purified by reverse-phase HPLC under the following conditions and eluted as 1st main peak (MSG1-) Asn (retention time around 15-19 min) and 2nd main peak (MSG2-) Asn ( The retention time was around 21-26 min.
  • Compound 1-10 can be synthesized by performing step (1-10B) using the compound obtained by this method.
  • HATU 148 mg, 0.39 mmol
  • N, N-dimethylformamide 500 ⁇ l
  • piperidine 386 ⁇ l, 3.91 mmol
  • acetic acid 469 ⁇ l
  • the reaction solution was transferred in half to two jumbo conical tubes (175 ml) to which diethyl ether (100 ml) had been added in advance. Using a small centrifuge (Hitachi Koki, CF16RX), solids were precipitated and the supernatant was removed. The gummy solid was transferred to a centrifuge tube (50 ml), diethyl ether (30 ml) and acetonitrile (10 ml) were added and decanted. This operation was repeated twice. Similarly, an appropriate amount of acetonitrile or an appropriate amount of diethyl ether was added and decanted, and then dried under reduced pressure to obtain a crude product.
  • mAb-A Anti-LPS antibody A that recognizes an antigen that does not exist in the human body (hereinafter referred to as "mAb-A") as a carrier full-length antibody (WO2015) H # 1G5-H1 / L1) in / 046505 was selected, and the antibody was prepared in the same manner as described in Examples 2, 5 and 7 of WO2015 / 046505.
  • the final storage sample was a 19.4 mg / ml mAb-A solution (HBSor (25 mM histidine / 5% sorbitol, pH 6.0)).
  • Example 2-2 Preparation of CLCH-A As a carrier molecule, CLCH-A, a partial antibody molecule lacking the variable region of IgG1, was prepared as follows.
  • CH-A expression vector DNA fragment (SEQ ID NO: 6) containing a DNA sequence encoding the amino acid of CH type heavy chain (CH-A) that binds human heavy chain secretion signal and human IgG1 constant region was synthesized.
  • the synthesized DNA fragment was amplified by PCR, and pCMA-LK described in WO2015 / 046505 was digested with XbaI and PmeI to remove the ⁇ chain secretion signal and the human ⁇ chain constant region, and In-Fusion HD PCR cloning
  • a CH-A expression vector was constructed by ligation using a kit (Clontech). The resulting expression vector was named “pCMA / CH”.
  • the amino acid sequence of CH-A is shown in amino acid numbers 20 to 349 of SEQ ID NO: 7 (amino acid numbers 1 to 19 are signal sequences).
  • CLCH-B which is a partial antibody molecule in which a LALA mutation was introduced into the heavy chain of CLCH-A, was prepared as a carrier molecule as follows.
  • CH-B expression vector Using pCMA / CH as a template, the following primer set (CHLALA-F and CHLALA-R) and KOD-Plus- Mutagenesis Kit (TOYOBO) A CH-B expression vector was constructed by introducing a mutation that replaces Leu-Leu (Eu number corresponding to Leu234-Lue235) at amino acid numbers 136-137 with Ala-Ala. The constructed expression vector was named “pCMA / CH-B”.
  • nucleotide sequence of DNA encoding CH-B is shown in nucleotide numbers 58 to 1047 of SEQ ID NO: 10 (nucleotide numbers 1 to 57 are signal sequences), and the amino acid sequence is amino acid numbers 20 to 349 of SEQ ID NO: 11 (amino acid numbers 1 to 19 is a signal sequence).
  • Primer set CHLALA-F; 5′-GCGGGAGGCCCTTCCGGTTCTCGTTCCCCC-3 ′ (SEQ ID NO: 12) CHLALA-R; 5′-GGCTTCGGGGGCAGGACAAGGGGGACAGTGTG-3 ′ (SEQ ID NO: 13).
  • Fc-B wild type Fc
  • Fc-B As a carrier molecule, Fc-B, which is a partial antibody molecule comprising an Fc fragment of IgG1, was prepared as follows.
  • Fc fragment was purified from the culture supernatant obtained in the Fc-B purification step (2-4B) by using recombinant Protein A affinity chromatography (at 4-6 ° C.) and ceramic hydroxyapatite (at room temperature). Purified in a stepwise process. The buffer replacement step after purification of recombinant Protein A affinity chromatography and after purification of ceramic hydroxyapatite was carried out at 4-6 ° C. First, the culture supernatant was applied to MabSelectSuRe (manufactured by GE Healthcare Bioscience, HiTrap column) equilibrated with PBS.
  • MabSelectSuRe manufactured by GE Healthcare Bioscience, HiTrap column
  • the column was washed with PBS having a column volume of 2 times or more.
  • elution was performed with 2M arginine hydrochloride solution (pH 4.0), and fractions containing Fc fragments were collected.
  • the fraction was replaced with PBS by dialysis (Thermo Scientific, Slide-A-Lyzer Dialysis cassette), and then the FC fragment solution diluted 5-fold with 5 mM sodium phosphate / 50 mM MES / pH 7.0 buffer was added to 5 mM NaPi.
  • Fc-A (LALA body) Fc-A, which is an LALA body of Fc-B and whose N-terminal was extended, was prepared as a carrier molecule.
  • nucleotide sequence of DNA encoding Fc-A is shown in nucleotide numbers 61 to 741 of SEQ ID NO: 16 (nucleotide numbers 1 to 60 are signal sequences), and the amino acid sequence is amino acid numbers 21 to 247 of SEQ ID NO: 17 (amino acid numbers 1 to 20 is a signal sequence).
  • elution buffer ImmunoPure IgG Eution buffer, manufactured by PIERCE
  • the eluate was immediately neutralized with 1M Tris buffer (pH 9.0).
  • the fraction detected by UV detection (280 nm) during elution was confirmed using a microspectrometer Xpose (manufactured by Trinean) and an Experion electrophoresis station (manufactured by BIO-RAD).
  • Solution A and Solution B 5 mM phosphate buffer, 50 mM 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES) solution (pH 6.8), 2 M sodium chloride solution).
  • a washing solution 500 mM phosphate buffer (pH 6.5) was flowed at 5 CV.
  • the fraction detected by UV detection (280 nm) during elution was confirmed using a microspectrometer Xpose (manufactured by Trinean) and an Experion electrophoresis station (manufactured by BIO-RAD).
  • the above formula shows a linker structure in which an azide group is introduced into the non-reducing terminal sialic acid of the SG type N297 sugar chain.
  • the intermediate linker structure in which the azide group is introduced into the N297 sugar chain is (It has the same structure as the formula.)
  • the 23.7 mg / ml (Fuc ⁇ 1,6) GlcNAc-mAb-A solution (50 mM phosphate buffer (pH 6.0)) (8.90 ml) obtained in step (3-1A) was added to 50 mM phosphate buffer (pH 6.
  • the binding buffer for purification by affinity chromatography was changed from 20 mM phosphate buffer (pH 7.0) to 20 mM phosphate buffer (pH 6.0), and the same method as in step (3-1A) was followed.
  • the fraction containing the target product was concentrated using Amicon Ultra (Ultracel 30K, manufactured by Merck Millipore), followed by 20 mM phosphate buffer (pH 6.
  • the buffer solution was exchanged into 0), and 20.5 mg / ml mAb-A- [PEG (3) -N 3 ] 4 solution (20 mM phosphate buffer (pH 6.0)) (19.0 ml) was obtained.
  • reaction solution was roughly purified with NAP25 (manufactured by GE Healthcare) and 20 mM phosphate buffer (pH 6.0). The progress of the reaction was confirmed by hydrophobic interaction chromatography under the following conditions, and then purified by the following affinity chromatography.
  • elution buffer ImmunoPure IgG Elution buffer, manufactured by PIERCE
  • the eluate was immediately neutralized with 1M Tris buffer (pH 9.0).
  • the fraction detected by UV detection (280 nm) during elution was confirmed using a microspectrophotometer Xpose (manufactured by Trinean) and hydrophobic interaction chromatography.
  • the fraction containing the target product was concentrated using Amicon Ultra (Ultracell 10K, manufactured by Merck Millipore), followed by 5% sorbitol / 10 mM acetate buffer ( The buffer solution was changed to pH 5.5), and 19.3 mg / ml CLCH-A- [PEG (3) -N 3 ] 4 solution (5% sorbitol / 10 mM acetate buffer (pH 5.5)) (13.8 ml) Obtained.
  • reaction solution was roughly purified with NAP25 (manufactured by GE Healthcare) and 20 mM phosphate buffer (pH 6.0). The progress of the reaction was confirmed by hydrophobic interaction chromatography under the following conditions, and then purified by the following affinity chromatography.
  • a washing solution (20 mM phosphate buffer (pH 7.0), 0.5 M sodium chloride solution) was allowed to flow at 10 CV.
  • 6 CV of elution buffer (ImmunoPure IgG Eution buffer, manufactured by PIERCE) was allowed to flow.
  • the eluate was immediately neutralized with 1M Tris buffer (pH 9.0).
  • the fraction detected by UV detection (280 nm) during elution was confirmed using a microspectrophotometer Xpose (manufactured by Trinean) and hydrophobic interaction chromatography.
  • the above structural formula shows the structure of sialic acid of N297 sugar chain, PEG linker and hANP peptide in compound 3-5, wherein the triazole ring formed by Click reaction has geometric isomerism, and compound 3-
  • the compound 3-5 has a mixture of linkers consisting of left and right structures of the above formula, and the non-reducing terminal sialic acid of all N297 sugar chains is modified with the linker of the above formula. 2 hANP (1-28) are linked per molecule) .
  • Example 4 Using DBCO-PEG (12) 2- (SG-) Asn-hANP (1-28) 4 equivalents synthesized in Example 1-2 with respect to the compound synthesized in Step (3-5A), By performing the same operation as 3-2, 17.9 mg / ml mAb-A- [PEG (3) // PEG (12) 2 -hANP (1-28)] 2 solution (5% sorbitol / 10 mM acetic acid Buffer (pH 5.5)) (2.55 ml) was obtained.
  • mAb-B For a monoclonal antibody (mAb-B), mAb-B- [PEG (3) -N 3 ] 4 was synthesized by using the method described in Example 3-1. Subsequently, as the DBCO compounds used in the Ckick reaction, Compound 1-1, Compound 1-3, Compound 1-4, Compound 1-5, Compound 1-6, Compound 1-7, Compound 1-7 synthesized in Example 1 were used. By separately using 8 and compound 1-9), mAb-B- [L (PEG) -hANP (1-28)] 4 having a different PEG linker structure was synthesized.
  • Table 1 shows the correspondence between the DBCO compound used and the structure of the target conjugate (L (PEG) corresponding to each compound is compound 3-7: L (PEG) B, compound 3-8: L (PEG ) E, compound 3-9: L (PEG) A, compound 3-10: L (PEG) D, compound 3-11: L (PEG) C, compound 3-12: L (PEG) F, compound 3- 13: L (PEG) G, Compound 3-14: L (PEG) H). Similar to compounds 3-1 to 3-6, in any compound, the triazole ring formed by the Click reaction has geometric isomerism, and a linker having a geometric isomer structure is mixed and held. In addition, four hANPs (1-28) are linked per molecule of the conjugate.
  • Example 3-8 CLCH-B- [PEG (3) // PEG (12) 2- (SG-) Asn-hANP (1-28)] 4 (in the structure of Compound 3-2 above, Synthesis of target compound in which A is replaced by CLCH-B, compound 3-15)
  • the reaction scheme and substance structure of each step in this example are the same as those in Example 3-2.
  • Replaced with B. (3-8A) Preparation of (Fuc ⁇ 1,6) GlcNAc-CLCH-B
  • the portion of the CLCH-A solution described in the preparation step (3-3A) was replaced with 20.6 mg / mL CLCH-B prepared in Example 2-3.
  • step (3-8B) The portion of the (Fuc ⁇ 1,6) GlcNAc-CLCH-A solution described in the preparation step (3-3B) of CLCH-B- [PEG (3) -N 3 ] 4 was added to the step (3-8A 19.8 mg / ml (Fuc ⁇ 1,6) GlcNAc-CLCH-B solution (50 mM phosphate buffer (pH 6.0)) obtained in step 3-3), and according to the method described in step (3-3B) 19.3 mg / ml CLCH-B- [PEG (3) -N 3 ] 4 solution (5% sorbitol / 10 mM acetate buffer (pH 5.5)) (15.7 ml) was obtained.
  • Fc-A solution 10.4 mg / ml (5% sorbitol / 25 mM histidine solution (pH 6.0)) (80.0 ml) prepared in Example 2-5 was added to 50 mM phosphoric acid using VIVASPIN 20 (10,000 MWCO, manufactured by Sartorius). The buffer solution was changed to a buffer solution (pH 6.0) to make about 50 mL.
  • a washing solution (20 mM phosphate buffer (pH 7.0), 0.5 M sodium chloride solution) was allowed to flow at 10 CV.
  • 6 CV of elution buffer (ImmunoPure IgG Elution buffer, manufactured by PIERCE) was allowed to flow.
  • the eluate was immediately neutralized with 1M Tris buffer (pH 9.0).
  • the fraction detected by UV detection (280 nm) during elution was confirmed using a microspectrophotometer Xpose (manufactured by Trinean) and an Experion electrophoresis station (manufactured by BIO-RAD) as necessary.
  • solution A 5 mM phosphate buffer, 50 mM 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES) solution (pH 7.0)
  • solution B 5 mM phosphate buffer, 50 mM 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES) solution (pH 7.0), 2 M sodium chloride solution.
  • a washing solution 500 mM phosphate buffer (pH 6.5) was flowed at 5 CV.
  • the fraction detected by UV detection (280 nm) during elution was confirmed using a microspectrophotometer Xpose (manufactured by Trinean) and an Experion electrophoresis station (manufactured by BIO-RAD) as necessary.
  • the following solutions a to d were used.
  • Solution a 7.24 mg / mL (Fuc ⁇ 1,6) GlcNAc-Fc-A solution (50 mM phosphate buffer (pH 6.0)) (24 ml) (173.8 mg)
  • Solution b 7.42 mg / mL (Fuc ⁇ 1,6) GlcNAc-Fc-A solution (50 mM phosphate buffer (pH 6.0)) (24 ml) (178.1 mg)
  • Solution c 7.18 mg / mL (Fuc ⁇ 1,6) GlcNAc-Fc-A solution (50 mM phosphate buffer (pH 6.0)) (24 ml) (172.3 mg)
  • Solution d 7.19 mg / mL (Fuc ⁇ 1,6) GlcNAc-Fc-A solution (50 mM phosphate buffer (pH 6.0)) (24 ml) (172.6 mg)
  • ESI-MS calculated for the chain of (Fuc ⁇ 1,6) GlcNAc-Fc-
  • GlcNAc-Fc-A solution 50 mM phosphate buffer (pH 6.0)) (12 ml), 50 mM phosphate buffer (pH 6.0) (1.65 ml), Example 1 [N3-PEG (3)] 2 -SG (10) -Ox (56.0 mg) 50 mM phosphate buffer (pH 6.0) solution (1.0 ml) and 4.3 mg / ml EndoS D233Q / Q303L solution ( PBS) (1.16 ml) was added and incubated at 30 ° C. for 4 hours. The above operation was performed for 8 lots.
  • a washing solution (20 mM phosphate buffer (pH 7.0), 0.5 M sodium chloride solution) was allowed to flow at 10 CV.
  • 6 CV of elution buffer (ImmunoPure IgG Elution buffer, manufactured by PIERCE) was allowed to flow.
  • the eluate was immediately neutralized with 1M Tris buffer (pH 9.0).
  • the fraction detected by UV detection (280 nm) during elution was confirmed using a microspectrophotometer Xpose (manufactured by Trinean) and hydrophobic interaction chromatography as necessary.
  • Example 3-10 Fc-B- [PEG (3) // PEG (12) 2- (SG-) Asn-hANP (1-28)] 4 (in the structure of compound 3-16, Fc-A Synthesis of compound 3-17) having a structure in which is replaced with Fc-B
  • the reaction scheme and substance structure of each step in this example are the same as those in Example 3-9 in the corresponding scheme. Replaced with B.
  • a washing solution (20 mM phosphate buffer (pH 7.0), 0.5 M sodium chloride solution) was allowed to flow at 10 CV.
  • 6 CV of elution buffer (ImmunoPure IgG Elution buffer, manufactured by PIERCE) was allowed to flow.
  • the eluate was immediately neutralized with 1M Tris buffer (pH 9.0).
  • the fraction detected by UV detection (280 nm) during elution was confirmed using a microspectrophotometer Xpose (manufactured by Trinean) and an Experion electrophoresis station (manufactured by BIO-RAD) as necessary.
  • the reaction solution was further mixed with a [N3-PEG (3)] 2-SG (10) -Ox (6.1 mg) solution (50 mM phosphate buffer (pH 6.0)) (0.10 ml) synthesized in Example 1-10. ) And incubated at 30 ° C. for 0.5 hour. The above operation was performed for 5 lots. The progress of the reaction was confirmed using an Experion electrophoresis station (manufactured by BIO-RAD). After completion of the reaction, change the binding buffer for purification by affinity chromatography from 20 mM phosphate buffer (pH 7.0) to 20 mM phosphate buffer (pH 6.0), and follow the same procedure as in step (3-110A).
  • reaction solution was roughly purified with NAP25 (manufactured by GE Healthcare) and 20 mM phosphate buffer (pH 6.0). The progress of the reaction was confirmed by hydrophobic interaction chromatography under the following conditions, and then purified by the following affinity chromatography.
  • a washing solution (20 mM phosphate buffer (pH 7.0), 0.5 M sodium chloride solution) was allowed to flow at 10 CV.
  • 6 CV of elution buffer (ImmunoPure IgG Elution buffer, manufactured by PIERCE) was allowed to flow.
  • the eluate was immediately neutralized with 1M Tris buffer (pH 9.0).
  • the fraction detected by UV detection (280 nm) during elution was confirmed using a microspectrophotometer Xpose (manufactured by Trinean) and hydrophobic interaction chromatography as necessary.
  • Example 4-1 cGMP raising activity test of conjugate
  • the cGMP raising activity of compound 3-1 to compound 3-6 prepared in Example 3 was measured by the following method.
  • CHO / human GC-A cells in which human GC-A is constitutively expressed in CHO cells are suspended in ⁇ -MEM, 10% FBS, 1% Penicillin-streptomycin at 2 ⁇ 10 5 cells / ml, 384 well plate (Corning, 3826) was seeded at 20 ⁇ l / well (4 ⁇ 10 3 cells / well) and cultured overnight in a CO 2 incubator.
  • the amount of cGMP in each well was measured using a cGMP kit (manufactured by CISBIO) according to the attached protocol.
  • the activity value (T / C) of the test substance at each concentration was corrected by setting the measured value of the well to which only the solvent was added to 0 and the measured value of the well to which 1 nM natural hANP was added as 1, and based on this, and calculate the specific activity of the test substance (the EC 50 values of the EC 50 values / natural hANP the test substance) and E max (maximum activity value of the test substance in the concentration range) (Table 2).
  • sugar chain modified hANP-mAb-A conjugate (compound 3-5) with 2 hANP peptides is more than the sugar chain modified hANP-mAb-A conjugate (compound 3-2) with 4 hANP peptides.
  • Specific activity decreased 4.5 times.
  • the sugar chain modified hANP-CLCH-A conjugate (compound 3-6) with 2 hANP peptides is more than the sugar chain modified hANP-CLCH-A conjugate (compound 3-4) with 4 hANP peptides.
  • Specific activity decreased 3.2 times. This suggests that the higher the number of hANP peptides, the better the tendency to show activity.
  • compound 3-15 employing CLCH-B which is the LALA form of CLCH compound 3-16 employing Fc-A which is the LALA form of Fc fragment, and Fc which is a wild-type Fc fragment All compounds 3-17 employing -B showed the same level of in vitro activity as natural hANP.
  • Isoflurane Japanese Pharmacopoeia
  • Isoflurane blood collection needle and syringe Terumo syringe 25G x 1
  • Tuberculin blood collection tube Capitol micro blood collection tube
  • EDTA-2Na 500 ⁇ L
  • Sample storage tube MTARIX4170
  • Sample track tube 0.75 mL 8-9 week-old male
  • Slc SD rats were subjected to isoflurane inhalation anesthesia ((inhalation with escaine inhalation anesthesia solution maintained at a concentration of 1-2%).
  • Test substance diluted with PBS as needed Solutions of each conjugate and compounds 3-1 to 3-6 were rapidly administered subcutaneously at a dose of 100 nmol / kg (1 mL / kg) 0.25, 0.5, 1, 2, and after administration.
  • blood was collected over time from the jugular vein (200 ⁇ L / time), and the blood sample was immediately placed on ice.
  • the collected blood sample is centrifuged at 5000 rpm, 5 min, 4 ° C using a centrifuge (Sigma 4K15, rotor: Nr12130-H), and the separated plasma sample is divided into two samples for PK measurement and cGMP measurement. Stored at -80 ° C until measurement.
  • Mouse Anti-ANP IgG (GeneTex) was used for measurement. Primary antibodies were prepared with 0.1% PBS-T to 700 nM each. As both secondary antibodies for detection, DyLight-labeled Goat Anti-Human IgG (SouthernBiotec) was prepared in Rexxip F Buffer (Gyros AB.) To 10 nM. Each solution was set in an automatic ELISA device Gyrolab xP workstation, injected into Bioaffy 200 CD (Gyros AB.), And the content of the test substance (Fc / Fc, ANP / Fc) was measured by the sandwich ELISA method. Concentration was calculated. The resulting plasma concentration transition is shown in FIG.
  • Compound 3-5 which is a conjugate with two hANP peptides, and compound 3-6 are Emax compared to compound 3-2 and compound 3-4, which are conjugates with four hANP peptides. Decreased. That is, it is considered that the sugar chain-modified hANP-mAb-A conjugate having a larger number of hANP peptides exhibits stronger pharmacological activity.
  • the blood concentration of hANP conjugate was confirmed even 168 hours after administration.
  • compound 3-1 which is an hANP-mAb-A conjugate has a smaller gap between Fc / Fc and ANP / Fc, and 168 hours after administration. Plasma concentration is high and decay rate is slow. This indicates that Compound 3-1 has a longer blood retention than Compound 3-3.
  • Compound 3-2 which is a sugar chain-modified hANP-mAb-A conjugate, has a smaller discrepancy between Fc / Fc and ANP / Fc than compound 3-1 that is a hANP-mAb-A conjugate. Plasma concentration at 168 hours is high and decay rate is slow. This indicates that Compound 3-2 has a longer blood retention than Compound 3-1.
  • compound 3-4 which is a sugar chain-modified hANP-CLCH-A conjugate, has a smaller divergence width between Fc / Fc and ANP / Fc than compound 3-3, which is an hANP-CLCH-A conjugate, Plasma concentration at 168 hours after administration is high and decay rate is slow. This indicates that Compound 3-4 has a longer blood retention than Compound 3-3.
  • Example 4-3 Effect of PEG linker on cGMP-elevating activity of conjugate This experiment is to examine the effect of PEG linker moiety on cGMP-elevating activity using the conjugate synthesized in Example 3-7. Implemented for the purpose. The specific activity and Emax of natural hANP and test substance were calculated in the same manner as described in Example 4-1. The results are shown in Table 3.
  • Example 4-4 Effect of PEG linker on the blood persistence of the conjugate in rat This experiment was conducted using the conjugate synthesized in Example 3-7, and the PEG linker moiety on the persistence in animal blood. The purpose of this study was to examine the effects of Similar to the method described in Example 4-2, the change in plasma cGMP concentration after the test substance was subcutaneously administered to rats was examined. The results are shown in FIG.
  • the solution was filtered through a Spin-X 0.22 ⁇ m centrifugal filter (manufactured by Costar), dispensed into a 0.5 mL sterilized slim tube (manufactured by Sumitomo Bakelite), 80 ⁇ L each, sealed, and allowed to stand at 40 ° C. for 2 weeks.
  • Samples before and after degradation were measured with a SEC-MALS system (Wyatt Technology) consisting of Agilent 1260 LC, DAWN HELEOS 8, and Eclipse3 + and analyzed with ASTRA software (Wyatt Technology).
  • the solution of natural hANP in PBS was gelled within 48 hours, whereas the conjugate showed fluidity of the solution even after 2 weeks and improved solution stability.
  • the accelerated aging treatment increased the high molecular weight compound 3-3 from 8.2% to 14.2% in the case of ABSor solution and from 9.2% to 45.7% in the case of PBS solution.
  • the high molecular weight material is increased from 1.8% to 4.5% in the case of ABSor liquid by accelerated deterioration treatment, and from 2.8% to 12.8 in the case of PBS liquid Increased to%. Therefore, it was shown that the aggregation property is remarkably reduced by introducing a sugar chain near the hANP part.
  • Plasma sample Blood collection needle and syringe Terumo syringe 25G x 1 SR Tuberculin blood collection tube: Capitect micro blood collection tube EDTA-2Na or Venojek and vacuum blood collection tube EDTA-2Na Sample storage tube: MTARIX4170 Sample track tube 0.75 mL
  • the test substance was administered and blood samples were collected from male cynomolgus monkeys aged 3-7 under anesthesia. A 10 nmol / kg dose of test substance (each conjugate, compounds 3-2, 3-4, 3-15, 3-16, and 3-17) diluted with PBS as needed. Rapid administration at 1 mL / kg.
  • Blood sampling over time from the vein before administration and at 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 24, 48, 96, 168, 336, 528 (or 504), and 696 (or 672) hours after administration The blood sample was immediately placed on ice. A plasma sample obtained by centrifuging the collected blood sample was stored at ⁇ 80 ° C. until measurement.
  • enzyme A EndoM-like enzyme
  • enzyme B EndoS-like enzyme
  • the enzyme A include EndoM, EndoOm, EndoCC, and EndoM mutants, EndoOm mutants, EndoCC mutants, and the like that have reduced hydrolysis activity.
  • the enzyme B include EndoS, EndoS2 (EndoS49), an EndoS mutant with reduced hydrolysis activity, EndoS2 (EndoS49) mutant, and the like.
  • Example 5-1 Measurement of sugar chain transfer rate using SGP as a sugar chain donor
  • Commercially available Trastuzumab was used as mAb-C.
  • Trastuzumab (440 mg / vial, manufactured by Genentech), using the method described in Example 3-1, 51.3 mg / ml (Fuc ⁇ 1,6) GlcNAc-Trastuzumab solution (50 mM Tris buffer (pH 7.4)) ) (1.65 ml).
  • this reaction solution was sampled at each time point of 2, 4, 8, 24, and 48 hours after the start of the reaction, and the progress of the reaction was measured using the Experion electrophoresis station (BIO- RAD).
  • a measurement sample was prepared according to a procedure manual attached to the instrument. In this process, since the collected reaction solution is exposed to a solution containing dithiothreitol and heated at 95 ° C. for 5 minutes, the transglycosylation reaction is immediately stopped.
  • the obtained measurement sample was transferred to Experion Pro260 Chips and measured according to the procedure manual attached to the Experion electrophoresis station. From the obtained chromatogram, it is confirmed as a peak in which the unreacted product and the sugar chain transfer product are separated.
  • the sugar chain transfer rate was calculated from the peak area ratio of the unreacted product and the sugar chain transfer product by the following formula.
  • Glycan transfer rate (%) [peak area of H chain derived from SG-Trastuzumab] / ⁇ [peak area of H chain derived from (Fuc ⁇ 1,6) GlcNAc-Trastuzumab + [peak area of H chain derived from SG-Trastuzumab] ⁇ ⁇ 100 Similarly, the reaction was carried out by changing the combination of various Endo enzymes, and the sugar chain transfer rate at each reaction time was calculated (Table 5).
  • the rate of sugar chain transfer at each reaction time was calculated in the same manner as in Example 5-1 (Table 5).
  • Example 5-3 Measurement of glycosylation rate using EndoCC as enzyme A 51.3 mg / ml (Fuc ⁇ 1,6) GlcNAc-Trastuzumab solution (50 mM Tris buffer (pH 7.4)) (19.5 ⁇ l) In contrast, 50 mM Tris buffer (pH 7.4) (0.5 ⁇ l), SGP (manufactured by Tokyo Chemical Industry) (5.82 mg) solution (50 mM Tris buffer (pH 7.4)) (29.1 ⁇ l), 1.16 U / ml EndoCC Alternatively, 2.21 U / ml EndoCC N180H solution (Fushimi Pharmaceutical) (15.0 ⁇ l) and 2.00 mg / ml EndoS D233Q solution (PBS) (10.0 ⁇ l) were added and incubated at 28 ° C. or 37 ° C. for 48 hours. Hereinafter, the rate of sugar chain transfer at each reaction time was calculated in the same manner as in Example 5-1 (Table 5).
  • a chemically modified sugar chain structure can be introduced into the Fc-containing molecule.
  • a chemically modified sugar chain structure can be introduced into the Fc-containing molecule.
  • mAb, CLCH, and Fc can be used as appropriate.
  • Example 5-4 Preparation of mAb-A- [PEG (3) -N 3 ] 4 using ([N 3 -PEG (3)] 2 -SG-) Asn-PEG (3) -N 3 Using ([N 3 -PEG (3)] 2 -SG-) Asn-PEG (3) -N 3 as a sugar donor, mAb-A- [PEG (3) -N 3 ] 4 was Produced.
  • Example 5-5 Preparation of CLCH-B- [PEG (3) -N 3 ] 4 Using ([N 3 -PEG (3)] 2 -SG-) Asn-PEG (3) -N 3 Using ([N 3 -PEG (3)] 2 -SG-) Asn-PEG (3) -N 3 as a sugar chain donor, CLCH-B- [PEG (3) -N 3 ] 4 was Produced.

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Abstract

本発明は、hANPペプチドがポリエチレングリコールリンカーを介して、Ｆｃ含有分子のAsn297に結合する糖鎖（Ｎ２９７糖鎖）に結合したコンジュゲート体またはその薬学上許容される塩、それを有効成分とする医薬、その製造方法などを提供する。

Description

ｈＡＮＰ－Ｆｃ含有分子コンジュゲート
　本発明は、hANPペプチドをキャリアとなるＦｃ含有分子に搭載することで、皮下投与後に緩やかに血中に移行し、かつhANPの薬理作用持続時間を大幅に延長させたコンジュゲート体、それを有効成分として含有する医薬、当該コンジュゲートの製造方法等に関する。
　ヒト心房性ナトリウム利尿ペプチド（hANP）は、血管拡張作用、利尿作用、細胞増殖抑制作用、静脈灌流量の低下作用、交感神経活性抑制作用を有する生理活性ペプチドである。天然型のhANPは、血中の中性エンドペプチダーゼ（NEP）により切断されるなどにより、血中では速やかに活性が消失する。日本において、hANPは急性心不全治療薬として臨床応用されているが、投与後の急激な血圧低下を避ける目的で、血圧モニタリングしながらの点滴などによる静脈内持続投与が必要である。
hANPのような内因性の生理活性ペプチドは、特異的な受容体に対する選択性が非常に高い為、高い有効性と安全性が期待できる。その反面、体循環中に、様々な代謝酵素により速やかに代謝されるか、腎において糸球体濾過により速やかに排出される為、血中半減期が極めて短いことが知られている。このことから、代謝酵素耐性を付与する、あるいは腎排泄を回避することで、ペプチドの血中半減期を延長する試みがなされている。例えば、糖鎖修飾ペプチド（特許文献１）、融合ポリペプチド（特許文献２）、アルブミン融合ペプチド（特許文献３、非特許文献１）、免疫グロブリンＦｃ融合ペプチド（特許文献４、非特許文献２）、ポリエチレングリコール（PEG）修飾ペプチド（非特許文献３、４）など様々な方法が挙げられる。
抗体医薬品は、neonatal Fc receptor(FcRn)を介したリサイクリング機構によって、ペプチド医薬品やタンパク医薬品と比べて非常に長い血中半減期を有している（非特許文献５）。このことから、同様のリサイクリング効果が期待される融合ペプチドもhANPの半減期延長の手段として考えられてきた（特許文献３及び４、非特許文献１及び２）。しかしながら、血中で速やかに代謝されるhANPをそのままキャリアタンパクに搭載した場合、キャリア上のhANP部分が循環中に代謝を受けると示唆されており、「hANP-タンパク融合体」をキャリアタンパク部分の血中滞留性と同等レベルで血中に滞留させることが難しい（非特許文献２）。
　近年、抗体－薬物結合体の技術開発が盛んに行われており、様々な合成法が報告されている（非特許文献６、非特許文献７、８）。しかしながら、キャリアタンパクと搭載する薬物部分の相性が悪くなるような結合法を採用すると、キャリア部分あるいは薬物部分が不安定化して、血中半減期が延長されなかったり、凝集性が増したりする恐れがある。その為、最適な結合方法やリンカーを選択することは非常に重要となる。また、一般にバイオ医薬品においては、静脈内投与よりも皮下投与において、緩やかに血中へ移行することが知られている（非特許文献９）が、化学修飾を受けた抗体の体内動態を予測することが困難である。
このように、緩やかな血中移行性、十分な血中滞留時間及び薬理効果に必要な活性の保持を全て併せ持つhANP製剤の開発が望まれている。
ＰＣＴ国際特許出願公開　WO2014/115797 A1 米国特許出願公開　US2006-036227 米国特許出願公開　US2007-0162986 A1 ＰＣＴ国際特許出願公開　WO2008/154226 A1
Regulatory Peptides,2012, 175,7-10 Bioconjugate Chem., 2012, 23, 518-526 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994, 91, 12544-12548 Bioconjugate Chem., 2008, 19, 342-348 Chem. Soc. Rev., 2012, 41, 2686-2695 Bioconjugate Chem., 2015, 26, 176-192 J. Am. Chem. Soc., 2012, 134, 12308-12318 Angew. Chem. Int. Ed., 2016, 55, 2361-2367 Drug Metab. Dispos., 2014, 42,1881-1889
　本発明は、皮下投与において薬効と安全性を併せ持つhANPの改良体を見出すことを課題とする。
　本発明者等は、皮下投与において薬効と安全性を併せ持つhANPの改良体について鋭意検討した結果、hANPペプチドをＩｇＧ重鎖の２９７番目に相当するＡｓｎに結合する糖鎖と特定のＰＥＧリンカーを介して連結させたコンジュゲート体が、ＧＣ－Ａ受容体発現細胞に対して細胞内ｃＧＭＰ濃度を上昇させたこと、ラットに投与した際の血中持続時間が延長されたこと、このとき、コンジュゲート体の投与後168時間以降においても持続的に血中のcGMP濃度が上昇していたこと、hANPペプチドとして糖鎖修飾されたhANPを採用したコンジュゲート体が特に良好な物性を有すること等を見出し、更に研究を重ねて本発明を完成するに至った。
　本発明は、以下を提供するものである。
（１）　hANPペプチドがポリエチレングリコールリンカー（L(PEG)）を介して、Ｆｃ含有分子のAsn297に結合する糖鎖（Ｎ２９７糖鎖）に結合したコンジュゲート体またはその薬学上許容される塩、ここで、
　hANPペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、Ｎ末端から連続する１～５個のアミノ酸および／またはＣ末端の１アミノ酸が欠失していても良く、且つ、当該ペプチドのＮ末端およびＣ末端のいずれか、または、両方が糖鎖修飾されていても良く、
　L(PEG)は、１０～３５個のエチレングリコール構造を含み、他の結合構造および／または修飾構造を含んでいても良いリンカー構造であり、
　Ｆｃ含有分子は、ヒトＩｇＧのＦｃ領域に相当するアミノ酸配列を有し、ヒトの生体分子に対する特異的な結合能を持たない分子であり、並びに、
　Ｎ２９７糖鎖は、以下の式で表される構造を有する糖鎖N297-(Fuc)SG、N297-(Fuc)MSG1又はN297-(Fuc)MSG2である、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
 （式中、［L(PEG)］は、L（PEG）がβ-Manの分岐鎖の1-3鎖側及び1-6鎖側の両方の非還元末端のシアル酸の２位に結合したカルボニル基と結合することを表す。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
 （式中、［L(PEG)］は、L(PEG)がβ-Manの分岐鎖の1-3鎖側の非還元末端のシアル酸の２位に結合したカルボニル基と結合することを表す。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
 （式中、［L(PEG)］は、L(PEG)がβ-Manの分岐鎖のうち1-6鎖側の非還元末端のシアル酸の２位に結合したカルボニル基と結合することを表す。）
（２）　hANPペプチドが、hANP(1-28)、hANP(2-28)、hANP(3-28)、hANP(1-27)、hANP(2-27)又はhANP(3-27)である（１）のコンジュゲート体、または、その薬学上許容される塩。
（３）　hANPペプチドが、以下式で表されるＡＧ５、ＡＧ７、ＡＧ９またはＳＧのいずれかの糖鎖が側鎖にＮグリコシド結合したアスパラギンまたはグルタミンが当該ペプチドのＮ末端またはＣ末端に結合した糖鎖修飾ペプチドである、（１）又は（２）のコンジュゲート体、または、その薬学上許容される塩、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
 （上記式中、” －（Ｎ／Ｑ）”は、Ｎグリコシド結合によりアスパラギンまたはグルタミンの側鎖に結合することを示す。）。
（４）　hANPペプチドが、ＳＧ糖鎖が側鎖にＮグリコシド結合したアスパラギンがそのＮ末端に結合したhANP(1-28)であることを特徴とする、（３）のコンジュゲート体、または、その薬学上許容される塩。
（５）　Ｌ（ＰＥＧ）が、２５～３０個のエチレングリコール構造を含み、結合構造として、アミド結合、及び、1,2,3-トリアゾール環を含んでいるリンカー構造である（１）のコンジュゲート体またはその薬学上許容される塩。
（６）　Ｌ（ＰＥＧ）が、以下のいずれかの式で表されるリンカー構造である（１）のコンジュゲート体またはその薬理学上許容される塩、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
 （上記式において、「hANP」はhANPペプチドのＮ末端と結合することを表し、「N297 GLY」はＮ２９７結合糖鎖の非還元末端と結合していることを表す。また、各リンカー構造は式中L(PEG)-X1及びL(PEG)-X2（これらを合わせて、L(PEG)-X（XはA,B,C,D,E,F、G又はHである）と表記する。）の構造で示されるように、1,2,3-トリアゾール環部位に、結合形成時に生成される幾何異性構造を有し、コンジュゲート体1分子中に、これらの構造からなるリンカーのいずれか一方のみが存在し、又は、その両方が混在している。）。
（７）　Ｆｃ含有分子が、ヒトの生体成分以外の物質を抗原とするヒトＩｇＧモノクローナル抗体、または、ヒトＩｇＧのＦｃ領域を有し可変領域部を欠損させた断片又は改変体である（１）のコンジュゲート体またはその薬学上許容される塩。
（８）　Ｆｃ含有分子が、ヒトＩｇＧに由来するＦｃまたはヒトＩｇＧの定常領域からなるＣＬＣＨである（７）のコンジュゲート体またはその薬学上許容される塩。
（９）　Ｆｃ含有分子が、配列番号３のアミノ酸番号２０～４７４のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号５のアミノ酸番号２１～２３４のアミノ酸配列からなる軽鎖の組み合わせからなる抗体（mAb-A）、配列番号７のアミノ酸番号２０～３４９のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号９のアミノ酸番号２１～１２５のアミノ酸配列からなる軽鎖の組み合わせからなるＣＬＣＨ（CLCH-A）、配列番号１１のアミノ酸番号２０～３４９のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号９のアミノ酸番号２１～１２５のアミノ酸配列からなる軽鎖の組み合わせからなるＣＬＣＨ（CLCH-B）、配列番号１５のアミノ酸番号２１～２４３のアミノ酸配列からなるＦｃ断片（Fc-B）、又は、配列番号１７のアミノ酸番号２１～２４７のアミノ酸配列からなるＦｃ断片（Fc-A）或いはそれらの改変体である（７）のコンジュゲート体またはその薬学上許容される塩。
（１０）　hANPペプチドが、hANP(1-28)又は(SG-)Asn-hANP(1-28)、
ＰＥＧリンカーが、L(PEG)-A、L(PEG)-B、L(PEG)-C、L(PEG)-D、L(PEG)-E、L(PEG)-F、L(PEG)-G又はL(PEG)-H、
Ｆｃ含有分子が、mAb-A、CLCH-A、CLCH-B、Fc-A又はFc-B、
Ｎ２９７糖鎖が、N297-(Fuc)SG、
である、（１）のコンジュゲート体又はその薬学上許容される塩。
（１１）　hANPペプチドが(SG-)Asn-hANP(1-28)、ＰＥＧリンカーがL(PEG)-B、Ｆｃ含有分子がFc-A又はFc-B、及び、Ｎ２９７糖鎖がN297-(Fuc)SG、である、（１）のコンジュゲート体又はその薬学上許容される塩。
（１２）　（１）～（１１）のいずれかのコンジュゲート体又はその薬学上許容される塩を有効成分として含有する医薬。
（１３）　ＧＣ－Ａの活性化により治療可能な疾患の治療剤、又は、予防剤である（１２）の医薬。
（１４）　高血圧症、急性心不全、慢性心不全、急性腎不全、慢性腎不全の治療剤、又は、予防剤である（１２）の医薬。
（１５）　以下の工程を含む、（１）～（１１）のいずれかのコンジュゲート体の製造方法：
工程Ａ：動物細胞で産生したＦｃ含有分子を加水分解酵素で処理し、(Fucα1,6)GlcNAc-Ｆｃ含有分子を製造する工程；
工程Ｂ１：SG(10)又はMSG(9)のシアル酸にアジド基を導入し、還元末端をオキサゾリン化した糖鎖ドナー分子と、糖転移酵素存在下で(Fucα1,6)GlcNAc-Ｆｃ含有分子と反応させ、シアル酸にアジド基が導入されたＳＧ型糖鎖リモデリングＦｃ含有分子を合成する工程、あるいは、工程Ｂ２：(SG-)Asn、(MSG-)Asnのシアル酸にアジド基を導入した糖鎖ドナー分子と、２種の糖転移酵素存在下で(Fucα1,6)GlcNAc-Ｆｃ含有分子と反応させ、シアル酸にアジド基が導入されたＳＧ型糖鎖リモデリングＦｃ含有分子を合成する工程；
及び、
工程Ｃ：一方にhANPペプチド、他方にＤＢＣＯを有するリンカー分子を、工程Ｂで作製されたシアル酸にアジド基が導入されたＳＧ型糖鎖リモデリングＦｃ含有分子と反応させ、（１）のコンジュゲート体を合成する工程。
（１６）　工程Ａの反応液を、ハイドロキシアパタイトカラムによる精製を含む工程により(Fucα1,6)GlcNAc-Ｆｃ含有分子を精製する工程を更に含む、（１５）の製造方法。
（１７）　投与が必要な対象に対して、（１）～（１１）のいずれかのコンジュゲート体又はその薬学上許容される塩を有効成分として投与することを含む、ＧＣ－Ａの活性化により治療可能な疾患を治療、又は、予防する方法。
（１８）　ＧＣ－Ａの活性化により治療可能な疾患の治療、又は、予防のために使用される、（１）～（１１）のいずれかのコンジュゲート体又はその薬学上許容される塩。
（１９）　ＧＣ－Ａの活性化により治療可能な疾患の治療剤、又は、予防剤の製造のための（１）～（１１）のいずれかのコンジュゲート体又はその薬学上許容される塩の使用。
上記の（１７）～（１９）において、ＧＣ－Ａの活性化により治療可能な疾患は、好ましくは、高血圧症、急性心不全、慢性心不全、急性腎不全、慢性腎不全である。
　本発明のコンジュゲート体は、皮下投与時の緩やかな血中移行性、長期間の血中半減期及び長期間の薬理効果発現を併せ持つため、臨床において、従来知られているhANP製剤では治療効果が得られなかった疾患への適用や患者の利便性が向上した薬剤の開発が可能となる。また、本コンジュゲート体において、hANPペプチドとして糖鎖修飾されたhANPペプチドを採用することによって、コンジュゲート体の凝集性が大幅に抑制され、良好な物性を示したため、多様な製剤形態への適用が期待される。
図１は、本発明のコンジュゲート体（（I）の分子）を模式的に表したものである。(a)は、hANPペプチド、（ｂ）はＰＥＧリンカー、（ｃ）はＮ２９７糖鎖（ここで、白の楕円はNeuAc(Sia)、白の六角形はMan、塗りつぶした六角形はGlcNAc、白のひし形はGal、及び、白の逆三角形はFuc）、をそれぞれ表す。Ｙ字型は、Ｆｃ含有分子を表し、便宜上Ｆａｂを含む全長ＩｇＧとして図示したが、本発明のコンジュゲート体のＦｃ含有分子は、Ｎ２９７糖鎖が結合するＦｃ領域を有するものであれば良い。また、本模式図では、Ｎ２９７糖鎖を便宜上N297-(Fuc)SGとして表示し、全ての分岐鎖の非還元末端のシアル酸にＰＥＧリンカーが結合した態様が示されているが、N297-(Fuc)MSGを採用することで、いずれか一方のみの分岐鎖においてのみＰＥＧリンカーが結合したシアル酸を有し、他方の分岐鎖の非還元末端にはシアル酸を持たなくても良い。このような表示方法は、特に言及がない限り、本明細書の全体を通じて適用される。 図２は、本発明のコンジュゲート体の製造中間体である、(Fucα1,6)GlcNAc-Ｆｃ含有分子（図２のＡの（ＩＩ）の分子）、及び、SG型糖鎖リモデリングＦｃ含有分子（図２のＢの（ＩＩＩ）の分子）、の構造を示す模式図である。両方の図において、Ｙ字型は図１と同様のＦｃ含有分子を表す。図２のＡにおいて、（ｄ）はFucの１位と、６位においてαグリコシド結合したGlcNAcのみからなるＮ２９７糖鎖を示す。図２のＢにおいて、（ｃ）は図１と同様のＮ２９７糖鎖を表し、（e）は、ＰＥＧリンカーの部分構造であり、末端に別のリンカー分子との結合に供される官能基（ここではアジド基が例示されるが、これに限定されない）を表す。ＰＥＧリンカーの結合様式は、図１の説明と同様である。 図３Ａ及び図３Ｂは、動物細胞で産生されたＦｃ含有分子からSG型糖鎖リモデリングＦｃ含有分子を製造する工程の模式図である。図中の分子（ＩＩ）、（ＩＩＩ）は、図２と同様に、 (Fucα1,6)GlcNAc-Ｆｃ含有分子及びＳＧ型糖鎖リモデリングＦｃ含有分子をそれぞれ表す。（ＩＶ）の分子は動物細胞で産生されたＦｃ含有分子であり、Ｎ２９７糖鎖が不均一な分子の混合物である。図３Ａは、（ＩＶ）の不均一なＮ２９７糖鎖を、EndoSのような加水分解酵素で処理することで、均一な(Fucα1,6)GlcNAc-Ｆｃ含有分子（ＩＩ）が作製される工程を示す。ここで用いられるＳＧ型糖鎖ドナー分子は、SG(10)、MSG1(9)又はMSG2(9)の非還元末端のシアル酸がＰＥＧリンカーで修飾されたものであり、作製されるＳＧ型Ｎ２９７糖鎖リモデリングＦｃ含有分子においても、図２のＢで説明したとおり、非還元末端のシアル酸が同様の修飾を受けたものとなる。図においては、便宜上ドナー分子としてSG(10)を用いた形で示されるが、MSG1(9)又はMSG2(9)を糖鎖ドナーとすることで、(III)のリモデリング抗体はＮ２９７糖鎖のいずれか一方のみの非還元末端に官能基を有するリンカー分子が結合したリモデリングＦｃ含有分子が合成される。 図３Ａ及び図３Ｂは、動物細胞で産生されたＦｃ含有分子からSG型糖鎖リモデリングＦｃ含有分子を製造する工程の模式図である。図中の分子（ＩＩ）、（ＩＩＩ）は、図２と同様に、 (Fucα1,6)GlcNAc-Ｆｃ含有分子及びＳＧ型糖鎖リモデリングＦｃ含有分子をそれぞれ表す。（ＩＶ）の分子は動物細胞で産生されたＦｃ含有分子であり、Ｎ２９７糖鎖が不均一な分子の混合物である。図３Ｂは、Ｆｃ含有分子（ＩＩ）のＮ２９７糖鎖のGlcNAcに対して、EndoS D233Q変異体のような糖転移酵素を用いて、ＳＧ型糖鎖ドナー分子の糖鎖を糖鎖転移させることで、（ＩＩＩ）のＳＧ型糖鎖リモデリングＦｃ含有分子が作製される工程を示す。ここで用いられるＳＧ型糖鎖ドナー分子は、SG(10)、MSG1(9)又はMSG2(9)の非還元末端のシアル酸がＰＥＧリンカーで修飾されたものであり、作製されるＳＧ型Ｎ２９７糖鎖リモデリングＦｃ含有分子においても、図２のＢで説明したとおり、非還元末端のシアル酸が同様の修飾を受けたものとなる。図においては、便宜上ドナー分子としてSG(10)を用いた形で示されるが、MSG1(9)又はMSG2(9)を糖鎖ドナーとすることで、(III)のリモデリング抗体はＮ２９７糖鎖のいずれか一方のみの非還元末端に官能基を有するリンカー分子が結合したリモデリングＦｃ含有分子が合成される。 図４は、化合物1-10（[N3-PEG(3)]2-SG(10)-Ox）のNMRチャートである。 図５は、化合物1-11（[N3-PEG(3)]-MSG1(9)-Ox）のNMRチャートである。 図６は、本発明のコンジュゲート体を皮下投与したラットの血漿中cGMP濃度の経時変化 を示すグラフである。横軸が投与後の経過時間(h)、縦軸はcGMP濃度（pmol/mL）を示し、各データは平均値±標準誤差で示した（n=2-4）。実線の●が化合物3-1、実線の〇が化合物3-2、実線の■が化合物3-3、実線の□が化合物3-4、破線の〇が化合物3-5、破線の□が化合物3-6、をそれぞれ示す。 図７は、本発明のコンジュゲート体を皮下投与したラットの血漿中の全ヒトＦｃ含有分子及びコンジュゲート体の検出量の経時変化を示すグラフである。横軸が投与後の経過時間(h)、縦軸は検出物濃度（μg/mL）を示し、各データは平均値±標準偏差で示した（n=3-4）。●は化合物3-1、〇は化合物3-2、■は化合物3-3で、□は化合物3-4である。それぞれの化合物において、実線はコンジュゲートとしての検出量、破線はヒトＦｃ含有分子の検出量を示す。それぞれの化合物で、実線と破線が重なっていることは、hANP(1-28)部分のみがＦｃ含有分子より速やかに分解されず、あるいはhANP(1-28)がＦｃ含有分子から乖離せず、コンジュゲートとして血中に持続していることを示す。 図８は、本発明のコンジュゲート体を皮下投与したラットの血漿中cGMP濃度の経時変化 を示すグラフである。横軸が投与後の経過時間(h)、縦軸はcGMP濃度（pmol/mL）を示し、各データは平均値±標準誤差で示した（n=2-4）。実線の◆が化合物3-7、実線の◇が化合物3-8、実線の×が化合物3-9、実線の△が化合物3-10、実線の▲が化合物3-11、破線の◆が化合物3-12、破線の×が化合物3-13、破線の▲が化合物3-14、をそれぞれ示す。 図９は、本発明のコンジュゲート体を皮下投与したサルの血漿中の全ヒトＦｃ含有分子及びコンジュゲート体の検出量の経時変化を示すグラフである。横軸が投与後の経過時間(h)、縦軸は検出物濃度（μg/mL）を示し、各データは平均値±標準偏差で示した（n=3-4）。●は化合物3-2、〇は化合物3-4、■は化合物3-15で、□は化合物3-16、◆は化合物3-17である。それぞれの化合物において、図７と同様に、実線はコンジュゲートとしての検出量、破線はヒトＦｃ含有分子の検出量を示す。
　本発明について、以下に詳細に説明する。
　本発明は、hANPペプチドがＰＥＧリンカーを介して、Ｆｃ含有分子の保存されたアスパラギン（Asn297）に結合するＮ結合型糖鎖（Ｎ２９７糖鎖）に連結したコンジュゲート体またはその薬学上許容される塩、を提供する。本発明のコンジュゲート体はhANPペプチド、ＰＥＧリンカー、Ｆｃ含有分子、それらを構成する部分構造など、複数の構造単位が連結した大型の分子であり、この構造の模式図を図１に示す。
本発明において、複数の構造単位が「連結された」とは、それぞれの構造単位が直接共有結合により結合しているか、又は、リンカーを介して間接的に結合されることで、同一分子中に存在していることを意味する。構造単位間を連結する化学構造は特に限定されない。
本発明のコンジュゲート体を構成する構造単位は非常に分子量が大きく、複雑な構造を有するため、便宜上記号を利用して簡略的に記載する場合がある。このような記号表記において、hANPペプチドは「hANP」、ＰＥＧリンカーは「L(PEG)」又は「PEG(n)」(ｎは含まれる連続したエチレングリコール単位（(-CH２-CH２-O-）の構造単位）の個数)、Ｆｃ含有分子に含まれるＮ２９７糖鎖は「N297 GLY」、Ｆｃ含有分子は「mAb」、「CLCH」、「Fc」のようにそれぞれ記載する。また、糖鎖には、後述の通り、ＳＧ等の表記を用いる。それぞれの構造単位同士の結合は、一般的な結合様式は省略される場合もあるが、特徴的な構造や官能基については有機合成化学分野で通常用いられる表現により表示することがある。
　本発明のコンジュゲート体又はその部分構造の表記において、アミノ酸又はペプチドは、特別な記載がない限り、左側にＮ末端（アミノ基）、右側にＣ末端（カルボキシル基）となるように表記する。アミノ酸又はペプチドの右に“*”を付けて記載する場合（例えば、Gln*）、前記のルールを逆転させ、左側にＣ末端、右側にＮ末端となることを示すものとする。
　また、アミノ酸について表記する場合、中心となる炭素原子（α炭素）に直接結合した、アミノ酸として必須の構造である、アミノ基及びカルボキシル基を、それぞれ「αアミノ基」及び「αカルボキシル基」と表記するものとする。
　本明細書において、コンジュゲート体又はその部分構造の表記において、アミノ酸又はペプチドがそのＮ末端のアミノ基において他のリンカーと連結する場合、連結される構造単位を表す記号は当該ペプチド又はアミノ酸を表す記号の左側に、ハイフンを付けて、括弧を付けずに記載され、この場合のハイフンはペプチド又はアミノ酸のアミノ基とリンカー構造の有するカルボキシル基の間で形成されるアミド結合を表すものとする。例えば、Asnのアミノ基にＳＧが連結した構造は、”SG-Asn”として表記される。
これに対して、本明細書におけて、アミノ酸又はペプチドがそのＣ末端のカルボキシル基において別の構造単位と連結する場合、連結される構造単位を表す記号は、当該アミノ酸又はペプチドを表す記号の右側にハイフンを付けて、括弧を付けずに記載され、この場合のハイフンはペプチド又はアミノ酸のＣ末端カルボキシル基とリンカー構造の有するアミノ基（又はアジド基）の間で形成されるアミド結合を表すものとする。例えば、Tyrのカルボキシル基にＳＧが連結した構造は、”Tyr-SG”として表記される。
　さらに、本明細書において、アミノ酸の側鎖において糖鎖と連結した場合の部分構造は、側鎖部分を括弧で表示し、例えば、「(SG-)Asn」のように表記するものとする。
　本発明において、「糖鎖」とは、２つ以上の単糖がグリコシド結合により結合された構造単位を意味する。具体的な単糖や糖鎖を、例えば”GlcNAc-”、”SG-”のように、略号として標記することがある。構造式中でこれらの略号で記載した場合、還元末端で別の構造単位とのグリコシド結合に帰属する酸素原子又は窒素原子は、特別な定義がある場合を除き、当該糖鎖を表す略号には含まれないものとして表示される。
　本明細書において、糖鎖の基本単位となる単糖の記載は、別に定める場合を除き、便宜上、その環構造において、環を構成する酸素原子に結合し、且つ、水酸基（又はグリコシド結合に帰属する酸素原子）と直接結合した炭素原子を１位（シアル酸においてのみ２位）として表記する。実施例化合物の名称は、化学構造全体として付されたものであり、このルールは必ずしも適用されない。
糖鎖に含まれる単糖としては、糖の基本構造を有するものであれば特に限定されず、６員糖、５員糖、など様々なものを用いることができる。また、天然に存在する糖であっても、人工的に合成された糖であっても良いが、天然に存在する糖が好ましい。単糖としては、例えば、グルコース（Glu）、フルクトース(Flu)、マンノース(Man)、ガラクトース(Gal)、グルコサミン（Glc）、Ｎアセチルグルコサミン（GlcNAc）、グルクロン酸（GlucA）、ノイラミニン酸（Neu）、シアル酸/N-アセチルノイラミニン酸（Sia/NeuNAc/Neu5Ac）、ガラクトサミン、Ｎアセチルガラクトサミン（GalNAc）、キシロース（Xyl）、イズロン酸（IdoA）、フコース（Fuc）、アルドトリオース、グリセルアルデヒド、アルドテトロース、エリトロース、トレオース、アルドペントース、リボース、リキソース、アラビノース、アルドヘキソース、アロース、タロース、グロース、アルドロース、イドース、ケトトリオース、ジヒドロキシアセトン、ケトテトロース、エリトルロース、ケトペントース、キシルロース、リブロース、ケトヘキソース、プシコース、ソルボース、タガトース、等を挙げることができる。
　本明細書において、糖鎖を記号（例えば、GLY、SG、GlcNAc等）として記載する場合、別に定義される場合を除き、還元末端の炭素までを、当該記号に含めるものとし、Ｎ-又はＯ-グリコシド結合に帰属するＮ又はＯは、当該記号には含まれないものとする。また、同様に、hANPペプチドを記号（例えば、hANP、hANP(1-28)など）として表記する場合は、原則としてＮ末端の―ＮＨ、及び、Ｃ末端のＣ＝Ｏは、当該記号に含まれるものとして表記される。また、特に断りが無い限り左側がＮ末端、右側がＣ末端として表記される。すなわち、修飾を受けないhANPペプチドは、Ｈ-hANP-ＯＨ として表記される。
＜hANPペプチド＞
　本発明において、「hANPペプチド」とは、２８個のアミノ酸からなる生理活性ペプチドであるヒト型心房性ナトリウム利尿ペプチド（human Atrial Natriuretic Peptide：配列番号１、以下天然型hANP、又は、hANP(1-28)）のアミノ酸配列において、少なくとも７位から２７位のアミノ酸を含むアミノ酸配列からなるペプチドを意味する。天然型hANPは、細胞表面に発現するGC-A受容体（Chinkers M,et al．，Nature 338;78-83,1989））に結合し、その受容体の細胞内ドメインに存在するグアニレートサイクレースを活性化させ、細胞内のcGMP濃度を上昇させることにより、その生理活性を発揮する。天然型hANPは、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１１８巻，１３１頁，１９８４年に記載のα－ｈＡＮＰが、一般名カルペリチド（ｃａｒｐｅｒｉｔｉｄｅ）として、日本において製造販売承認を取得し、販売（商品名：ハンプ、ＨＡＮＰ）されている。α－hANPは、一般的にはＨｕｍａｎ ｐｒｏ－ＡＮＰ［９９－１２６］としても知られている。
天然型hANPは、配列番号１の７位と２３位のCys残基同士がジスルフィド結合し、分子内リング構造を形成する。hANPによるGC-A受容体の活性化には、このリング構造と、そのＣ末端側２７位Arg残基までのアミノ酸が重要であることが知られている（Silver, MA,, Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. (2006), 15, p14-21、A. Calderone, Minerva Endocrinol.(2004), 29, p.113-127）。そのため、このリング構造からなるhANP(7-27)は、GC-Aを活性化させる最小単位であると考えられる。本発明のhANPペプチドとしては、配列番号１)において、Ｎ末端側から連続する１乃至６個のアミノ酸、及び／又は２８位のアミノ酸が欠失していても良いアミノ酸配列からなるペプチドであり、好ましくは、配列番号１の１位、１位及び２位、並びに、２８位のアミノ酸の少なくとも一箇所が欠失していても良いペプチドであり、より好ましくは配列番号１の１位、並びに、１位及び２位のアミノ酸が欠失しても良いアミノ酸配列からなるペプチド（hANP(2-28)、hANP(3-28)等）であり、最も好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド（hANP(1-28)）である。
 本発明において、配列番号１のペプチドは「hANP(1-28)」、配列番号１の１位のアミノ酸が欠失したペプチドは「hANP(2-28)」、配列番号１の１位及び２位のアミノ酸が欠失したペプチドは「hANP(3-28)」などとそれぞれ表記され、他の一部のアミノ酸が欠失したペプチドも同様に表記される。
　本発明のコンジュゲート体一分子中のhANP分子の個数は、Ｆｃ含有分子に結合されるＮ２９７糖鎖やPEGリンカーの構造に依存して変動するが、通常は、２又は４個である。
　本発明のコンジュゲート体において、hANPペプチドとＰＥＧリンカーの結合は、例えば、Ｎ末端のαアミノ基、又は、Ｃ末端のαカルボキシル基とアミド結合により結合することができ、hANPペプチドのＮ末端にPEGリンカーが結合することが好ましい。
　本発明のコンジュゲート体において、hANPペプチドは糖鎖修飾されていても良い。hANPペプチドの糖鎖修飾については、特許文献１に様々な態様が記載されており、これらを利用して多様な糖鎖修飾ペプチドを適用することができる。hANPペプチドの修飾に用いる糖鎖としては、ヒトの体内に存在する糖鎖と類似した構造を有する糖鎖を採用することが適切である。
　天然の糖タンパク質に含まれる糖鎖には、糖タンパク質のアスパラギンに結合しているＮ結合型糖鎖と、セリン又はトレオニンに結合しているＯ結合型糖鎖に大別され、それぞれに特徴的な基本構造を有する。天然においては、Ｎ結合型糖鎖はＮグリコシド結合、Ｏ結合型糖鎖はＯグリコシド結合により、タンパク質のアミノ酸側鎖と結合しているが、人工的には、いずれのグリコシド結合によっても他の化合物と結合させることができる。そのため、グリコシド結合の様式を限定するものではない。例えば、糖鎖の還元末端をアジド化し、当該アジド化された糖鎖とカルボキシル基を有する化合物をトリフェニルホスフィン存在下反応させることにより、糖鎖に所望の構造を有する化合物をＮ-グリコシド結合により結合させることができる。また、糖鎖をアルコールのような水酸基を有する化合物と反応させることで、所望の化合物と糖鎖をＯ－グリコシド結合で結合させることができる。
　Ｎ結合型糖鎖の基本構造は、以下の構造式及び配列式で表され、この糖鎖構造からなる糖鎖をＡＧ５と呼ぶものとする。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
   （式中、「－（N/Q）」は、Ａｓｎ又はＧｌｎの側鎖とNグリコシド結合することを示す。）
　Ｎ結合型糖鎖の多くは、この基本構造を有しており、その非還元末端や分岐糖においてさらに別の糖が結合していても良い。
　ヒト型糖鎖、又は、ヒト適合型糖鎖とは、ヒトの体内で抗原性を示さないことが知られている糖鎖であり、Ｎ結合型糖鎖では，高マンノース型、複合（コンプレックス）型、混成型などが知られている。高マンノース型は、Ｎ型基本構造の非還元末端に、複数のマンノースが連続したマンノースリッチ構造を有する糖鎖である。複合型とは、Ｎ結合型基本構造の非還元末端に、Galβ1-4GlcNAcのモチーフ構造を有する糖鎖である。混成型糖鎖とは、Ｎ結合型基本構造の非還元末端に、Galβ1-4GlcNAcモチーフ構造を有し、且つ、複数のマンノースからなるマンノースリッチな構造を有する糖鎖である。
Ｎ結合型複合型糖鎖の代表的なものとしては、鶏卵の卵黄に含まれるシアリルグリコペプチド（Sialyl GlycoPeptide：以下、「SGP」という）に含まれる糖鎖であり、以下の構造式及び配列式で示される構造からなるシアリルグリカン（Sialyl Glycan、以下、「SG」という）を例示することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
 （式中、「－（N/Q）」は、Ａｓｎ又はＧｌｎの側鎖とNグリコシド結合することを示す。）
ＳＧＰは、鶏卵の卵黄から、常法例えば、WO2011/0278681に記載の方法に従って単離、精製することができる。また、ＳＧＰの精製品が市販（東京化成（株）、（株）伏見製薬所）されており、購入することができる。また、ＳＧの糖鎖部分において還元末端のGlcNAcが一つ欠損した糖鎖（以下、「SG（10）」）のみからなるジシアロオクタサッカリド（東京化成（株）製）などが市販されている。また本明細書において、SG(10)のβ-Manの分岐鎖のいずれか一方のみで非還元末端のシアル酸が欠失した糖鎖構造をMSG(9)といい、分岐鎖の1-3糖鎖のみにシアル酸を有するものをMSG1(9)、分岐鎖の1-6糖鎖のみにシアル酸を有するものをMSG2(9)、とそれぞれ表記するものとする。
また、SGの還元末端のGlcNAcを別の糖に置き換えた還元末端改変糖鎖を、公知の糖転移反応を利用して、上記のジシアロサッカリドを用いて作製することができる。SGの還元末端のGlcNAcを、Glcに置き換えた還元末端改変糖鎖をSG(Glc)、Manに置き換えた還元末端改変糖鎖をSG(Man)、とそれぞれ表記するものとする。
　本発明の糖鎖として用いることができる改変糖鎖の具体例として、ＳＧをノイラミニダーゼ処理し、２つの非還元末端のNeuAcを欠失させたAG9（以下の構造式及び配列式のAG9）、AG9をガラクトシダーゼ処理し、２つの非還元末端のGalを欠失させたAG(7)（以下構造式及び配列式のAG7）、AG7をさらにN－アセチルグルコサミニダーゼで処理し、２つの非還元末端のGlcNAcを欠失させたAG5（上記、Ｎ結合型基本構造からなる糖鎖），などを例示することができる。また、上記において、SGに代えてSGの還元末端改変糖鎖（例えばSG(Glc)、SG(Man)など）を採用して同様に処理することで、AG(9)、AG(7)及びAG(5)の還元末端改変糖鎖（例えばAG(9)の還元末端のGlcNAcがGlcに置き換えられたAG(9-Glc)、AG(9)の還元末端のGlcNAcがManに置き換えられたAG(9-Man)など）も、本発明の糖鎖修飾に採用することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
 （式中、「－（N/Q）」は、Ａｓｎ又はＧｌｎの側鎖とNグリコシド結合することを示す。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
   （式中、「－（N/Q）」は、Asn又はGlnの側鎖とNグリコシド結合することを示す。）
　本発明のコンジュゲート体において、hANPペプチドに結合する糖鎖の個数の上限はないが、例えば３個以下であり、好ましくは２個又は１個である。hANPペプチドに付加する糖鎖は、同一の構造のものであっても異なる構造の糖鎖が混在していても良いが、全て同一の糖鎖構造であることが好ましい。
　本発明の糖鎖修飾されたhANPペプチドの一つの態様として、上述のようなＮ結合型糖鎖が側鎖にＮグリコシド結合したAsn又はGln（「(GLY-)Asn」又は「(GLY-)Gln」を含むhANPペプチドを挙げることができる。このようなペプチドにおいて、配列番号１のアミノ酸配列の１位～５位、及び、２８位のいずれか一つ又は複数のアミノ酸が(GLY-)Asn又は(GLY-)Glnに置換されていても良い。また、配列番号１の６位～２７位を含む連続したアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端及びＣ末端のいずれか一方または両方に(GLY-)Asn又は (GLY-)Glnがペプチド結合したものでも良い。このようなペプチドとして、好ましいものは、hANP(1-28)、hANP(2-28)、hANP(3-28)、hANP(4-28)、hANP(5-28)、又は、hANP(6-28)のＮ末端及び／又はＣ末端に(GLY-)Asn若しくは(GLY-)Glnがペプチド結合したペプチドであり、より好ましくは、hANP(1-28)、 hANP(2-28)又は hANP(3-28)のＮ末端に(SG-)Asn若しくは(SG-)Glnがペプチド結合したペプチドであり、さらに好ましくは、(SG-)Asn-hANP(1-28)である。
　本発明において、hANPペプチドの修飾に用いられる糖鎖として、天然に存在する糖タンパク質又は糖脂質に由来する糖鎖を用いる場合、例えば特許文献１等に記載された方法に準じて、当該糖鎖は、加水分解酵素を用いて、切断・単離され、又は、糖転移酵素を用いた転移反応により所望の化合物（被転移化合物）へ転移させて、用いることができる。例えばＳＧは、ＳＧＰを公知の方法で加水分解酵素（Endo M等）と反応させて加水分解により切り出す、又は、糖転移酵素（Endo-M N175Q変異体など）を用いて所望の化合物に転移させて取り出すことができる。また、ＳＧＰをアクチナーゼ等のペプチド分解酵素で処理することによって、（SG-）Asn、又は、(SG-)Asnを含むペプチド断片に分解され、糖鎖結合画分を公知の分離方法によって精製することで、糖鎖結合アミノ酸として取得することができる。このようにして得られた、(SG-)Asn、(SG-)Gln又はそれらを含むペプチド断片を、通常の保護基を用いた反応によってhANPペプチドのN末端及び／又はC末端にペプチド結合させることによって、糖鎖修飾を含むhANPペプチドを製造することができる。
＜Ｆｃ含有分子＞
本発明のコンジュゲート体において、「Ｆｃ含有分子」は、ＩｇＧ重鎖のＦｃ領域においてよく保存されたN結合型糖鎖による修飾を受けるアスパラギン（「Asn297」という。）の側鎖に結合する糖鎖（「Ｎ２９７糖鎖」という）を介してhANPペプチドと連結し、血中でhANPペプチドを長期間持続させるためのキャリアタンパク質として機能するため、ヒトＩｇＧのＦｃ領域に相当するアミノ酸配列を有し、ヒトの生体分子に対する特異的な結合能を持たないことが必要である。ＩｇＧのＦｃ領域に相当するアミノ酸配列としては、例えば、配列番号７のアミノ酸番号１２８～３４９のアミノ酸配列、配列番号１１のアミノ酸番号１２８～３４９のアミノ酸配列、配列番号１５のアミノ酸番号２２～２４３のアミノ酸配列、配列番号１７のアミノ酸番号２６～２４７のアミノ酸配列、及び、それらの配列を改変したアミノ酸配列を挙げることができる。
IgGは重鎖と軽鎖からなる。両鎖はジスルフィド結合で連結されており、さらに、重鎖同士がヒンジ領域でジスルフィド結合してホモ２量体を形成している。また、IgGはドメイン構造を有しており、可変領域を含み抗原結合能を有するFabドメインと、Fc受容体と結合するFcドメインがヒンジ領域を介して連結されている。本発明のＦｃ含有分子は、Ｆｃ領域を含むものであれば特に限定されず、全長ＩｇＧ重鎖、Ｆｃ領域を含む抗体断片、それらのアミノ酸配列を部分的に改変した改変体などを用いることができる。また、本発明のＦｃ含有分子は、重鎖のみでも良く、重鎖の構造に対応した軽鎖を有していても良い。Ｆｃ含有分子の元となるＩｇＧのサブクラスは特に限定されず、いずれのサブクラスを選択しても良いが、好ましくはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４であり、より好ましくはＩｇＧ１である。ＩｇＧの定常領域におけるアミノ酸配列はよく保存されており、Edelman et al.,(Biochemistry、(1969) Vol. 63, pp. 98-85)においてそれぞれのアミノ酸がEu番号（Eu INDEX）で特定されている。例えば、Ｆｃ領域においてＮ結合型糖鎖が付加するAsn297は、Eu番号において２９７位に相当するものであり、分子の断片化や領域欠損によって実際のアミノ酸位置が変動した場合であってもEu番号で表示することによってアミノ酸が一義的に特定される。
　Ｆｃ含有分子として、完全長ＩｇＧを採用する場合、ヒト体内に通常存在する物質に特異的な結合能を有しないＩｇＧであれば特に限定は無いが、非ヒト動物のタンパク質を抗原としたＩｇＧはヒトの対応分子・関連分子が存在する場合はヒトの分子に交差反応性を示す可能性があるため、ヒトが対応分子・関連分子を持たない抗原に対するモノクローナル抗体を選択するのが好ましい。また、ヒト体内の成分に結合する恐れがある抗体であっても、遺伝子工学的手法によって、その可変領域に変異を導入し、ヒト成分との結合活性を欠失させた分子であれば、本発明のＦｃ含有分子として採用することができる。本発明のＦｃ含有分子に用いられる完全長ＩｇＧとして、より好ましくは、哺乳動物以外の生物に由来する分子を抗原とするＩｇＧであり、より好ましくは、微生物由来の分子を抗原としたＩｇＧであり、さらに好ましくはリポポリサッカライド（ＬＰＳ）を抗原としたＩｇＧである。このようなモノクローナル抗体は、例えば、WO2015/046505等に記載されており、具体的には配列番号３のアミノ酸番号２０～４７４のアミノ酸配列からなる重鎖（アミノ酸番号１～１９はシグナルペプチド、当該重鎖をコードするヌクレオチド配列は配列番号２）、及び、配列番号５のアミノ酸番号２１～２３４のアミノ酸配列からなる軽鎖（アミノ酸番号１～２０はシグナルペプチド、該軽鎖をコードするヌクレオチド配列は配列番号４）の組み合わせからなるmAb-A などが挙げられる。
　本発明のＦｃ含有分子として、抗体断片又は改変体を採用する場合、二量体を形成できる形でＦｃ領域を含むものであれば特に限定されず、さまざまな配列のものを採用することができる。由来となる抗体が、上述のようなヒト成分と特異的な結合脳を有しないものであれば、可変領域の一部又は全部を保持した改変体を採用しても良いか、好ましくは可変領域を欠損させた断片又は改変体である。
　このような改変体の例としては、例えば、ヒトＩｇＧ重鎖から可変領域を欠失させた定常領域のみからなるＣＨを挙げることができる。本発明のＦｃ含有分子としてＣＨを採用する場合、その由来となるＩｇＧサブクラスは特に限定されない。ヒトＩｇＧ１に由来するＣＨ（「CH-A」という）のアミノ酸配列を配列番号７のアミノ酸番号２０～３４９（N末端側１位～１９位はシグナルペプチド、CH-Aをコードするヌクレオチド配列は配列番号６）に示す。この配列において、ヒンジ領域は１１８位Ｇｌｕ～１３２位ＰｒｏのEPKSCDKTHTCPPCPであり、Ｆｃ領域は１３３位Ａｌａ～３４９位Ｌｙｓであり、１９９位ＡｓｎがAsn297に相当する（配列番号１１でも同様）。Ｆｃ含有分子としてＣＨを選択する場合、ＣＨのみを採用してもよく、軽鎖の定常領域のみからなるＣＬと組み合わせたＣＬＣＨとして採用することもできる。ＩｇＧ１軽鎖のＣＬ（「CL-A」という）のアミノ酸配列を配列番号９のアミノ酸番号２１～１２５（Ｎ末端側の1位～２０位のアミノ酸はシグナルペプチド、CL-Aをコードするヌクレオチド配列は配列番号８）に示す。本発明のＦｃ含有分子の好ましい態様としてＣＬＣＨを挙げることができ、より好ましくは、CH-AとCL-Aを組み合わせたＣＬCH-Aである。
　本発明のＦｃ含有分子として、Ｆｃ領域を主体とする断片又は改変体を採用する場合、例えば、ＩｇＧのＦｃ領域のＮ末端にヒンジ領域の一部であるＣＰＰＣが付加したアミノ酸配列（IgG1の配列の例としては、配列番号７の１２８位～３４９位の配列）からなる抗体断片を採用することができる。ヒンジ領域はＦｃ含有分子の構造的自由度を高める領域であり、本発明の目的であるキャリアタンパク質としての機能に影響するものではないため、ＣＰＰＣを含む限り、適宜長さを調整して採用することができる。このようなＦｃを主体とする抗体断片の例としては、IgG1に由来するものとしては、配列番号７又は配列番号１１の１１８位Ｇｌｕ～３４９位Ｌｙｓのアミノ酸配列において、Ｎ末端から連続する１～１０個のアミノ酸が欠失しても良いアミノ酸配列からなるＦｃ含有分子又はそのアミノ酸配列が改変された改変体であり、好ましくは、配列番号７の１２３位Ａｓｐ～３４９位Ｌｙｓ、１２７位Ｔｈｒ～３４９位Ｌｙｓ、又は、１２６位Ｈｉｓ～３４９位ＬｙｓからなるＦｃ含有分子である。また、Fc-A及びFc-Bに関連する分子としては、配列番号１５のアミノ酸番号２２～２４３のアミノ酸配列、若しくは、配列番号１７のアミノ酸番号２６～２４７のアミノ酸配列、又は、それらのＮ末端に、T、HT、THT、KTHT若しくはDKTHTが付加したアミノ酸配列からなるＦｃ含有分子或いはそれらのアミノ酸配列が改変された改変体を例示することができる。好ましくは、配列番号１５のアミノ酸番号２１～２４３のアミノ酸配列、又は、配列番号１７のアミノ酸番号２５～２４７のアミノ酸配列、又は、配列番号１７のアミノ酸番号２１～２４７のアミノ酸配列、からなるＦｃ含有分子である。これらのFc断片におけるAsn297は、配列番号１５では９３位のＡｓｎであり、配列番号１７では９７位Ａｓｎである。
また、本発明のＦｃ含有分子として抗体断片又は改変体を設計する場合、ヒンジ領域において二量体を構成するためのCys、Ｆｃ領域において分子内ジスルフィド結合に寄与するCys、Ｎ２９７糖鎖が結合するAsn297及びその周辺のアミノ酸を保持しつつ、キャリアタンパクとしての機能を損なわない範囲で、１～数箇所（好ましくは５箇所以下、より好ましくは３、２又は１箇所）において、１～数個（改変箇所当たり、好ましくは２０個以下、より好ましくは１５個以下、さらに好ましくは１０個以下、さらにより好ましくは７、６、５、４、３、２又は１個）のアミノ酸を、置換、欠失、挿入及び／又は付加させた改変体を採用しても良い。アミノ酸配列の改変の箇所としては、N末端、及び、Ｃ末端におけるアミノ酸の置換、欠失及び／又は付加等が行われる。特にN末端のアミノ酸は生物工学的手法でＦｃ含有分子を産生させる際に影響する場合があり、所望の生産系に適したアミノ酸配列へと改変させることができる。また、Ｅｕ番号で、Leu234 - Lue235のアミノ酸は、抗体とＦｃ受容体との結合によるＴ細胞活性化によるエフェクター活性発現に影響を与える部位であることが知られている。この領域に含まれるLeuをAlaに置換する（得られる変異体を「ＬＡＬＡ体」という）ことでこのエフェクター活性を消失させ、副作用リスクを低減させることができる場合があり（米国特許公報US5885573）、必要に応じてこのような改変を施しても良い。本発明の実施例において、CLCH-AのＬＡＬＡ体としてCLCH-Bが、Fc-BのＬＡＬＡ体としてFc-Aが、それぞれ作製され、本発明のコンジュゲートにおけるキャリア分子として適切に機能することが確認されている。
また、目的分子の発現、精製効率の向上を目的として、シグナル配列、ペプチド分解酵素認識配列、ＧＳＴのようなTag配列を付加させても良い。
　本発明に用いられるＦｃ含有分子は、動物細胞を用いた産生過程で翻訳後修飾を受けAsn297に不均一な糖鎖が付加するが、そのＮ２９７糖鎖が以下のいずれかの構造からなるＳＧ型糖鎖にリモデリングされたもの（ＳＧ型Ｎ２９７糖鎖）である。通常は動物細胞からの産生時に、２量体の両方のモノマーのAsn297に糖鎖が付加し、二量体のＦｃ含有分子当たり２つのN297糖鎖を有する通常体として産生される。しかし、産生条件やＦｃ含有分子の構造によっては、一方のモノマーのみにN297糖鎖が付加した糖鎖欠損体（二量体のＦｃ含有分子当たり１つのＮ２９７糖鎖を有する分子）が、一定の割合で産生される場合がある。このような、糖鎖欠損体を含むＦｃ含有分子であっても、本発明に用いることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
 （式中、[L(PEG)]は、L(PEG)がβ-Manの分岐鎖の1-3鎖側及び1-6鎖側の両方の非還元末端のシアル酸の２位に結合したカルボニル基と結合することを表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
 （式中、[L(PEG)]は、L(PEG)がβ-Manの分岐鎖の1-3鎖側の非還元末端のシアル酸の２位に結合したカルボニル基と結合することを表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
 （式中、[L(PEG)]は、L(PEG)がβ-Manの分岐鎖のうち1-6鎖側の非還元末端のシアル酸の２位に結合したカルボニル基と結合することを表す。）。
本発明のコンジュゲート体において、Ｎ２９７糖鎖が、N297-(Fuc)MSG1又はN297-(Fuc)MSG2である場合、Ｆｃ含有分子が二量体であり、通常両方のモノマーにＮ２９７糖鎖を有するため、コンジュゲート体は２つのＰＥＧリンカー及びhANPペプチドが結合された分子（２価のhANPペプチド）となる（Ｆｃ含有分子が糖鎖欠損体の場合、一方のモノマーのみにN297-(Fuc)MSG1又はN297-(Fuc)MSG2が付加し、１価のhANPペプチドとなる）。一方で、Ｎ２９７糖鎖が、N297-(Fuc)SGである場合、Ｆｃ含有分子が二量体であるため、コンジュゲート体は４つのＰＥＧリンカー及びhANPペプチドが結合された分子（４価のhANPペプチド）となる（Ｆｃ含有分子が糖鎖欠損体の場合、一方のモノマーのみにN297-(Fuc) SGが付加し、２価のhANPペプチドのコンジュゲートとなる）。本発明のコンジュゲート体は、これら複数種類のＮ２９７糖鎖を有する分子、又はそれらの通常体と糖鎖欠損体の混合物（本発明において、このような混合物は、便宜上、通常体のコンジュゲートとして表記される。）であっても良く、いずれか一つの構造からなるＮ２９７糖鎖を有する分子であっても良く、好ましくはいずれか一つの構造からなるＳＧ型Ｎ２９７糖鎖を有する分子であり、より好ましくはＮ２９７糖鎖としてN297-(Fuc)SGを有し、コンジュゲート体が４価のhANPペプチド（糖鎖欠損体では２価）を有するものである。
　これらの糖鎖構造中、還元末端のフコース付加したGlcNAc(Fucα1,6)GlcNAc）は、動物細胞で産生されたＦｃ含有分子に由来し、それより非還元末端側の糖鎖は、上述したＳＧと同様の糖鎖構造にリモデリングされたものである。いずれもその非還元末端のシアル酸２位に結合したカルボン酸を利用して、ＰＥＧリンカーと結合している。
　このようなＳＧ型Ｎ２９７糖鎖を有するＦｃ含有分子は、例えばWO2013/120066などに記載の方法に準じて、図３に示すような方法で製造することができる。公知の方法に準じて、動物細胞を用いて、遺伝子組み換えタンパク質としてＦｃ含有分子を産生させた場合、Ｎ２９７糖鎖は、基本構造としてフコース付加したＮ結合型糖鎖構造を有するが、非還元末端の構造や構成糖に多様な修飾がされた様々な構造からなる糖鎖を有する抗体またはそ断片の混合物として得られる（図３Ａの（ＩＶ））。このように動物細胞で産生されたＦｃ含有分子は、EndoSなどの加水分解酵素で処理することによって、還元末端のキトビオース構造のGlcNAｃβ1- 4GlcNAcの間のグリコシド結合が加水分解され、Ｎ２９７糖鎖として(Fucα1,6)GlcNAcのみを有する単一の糖鎖構造を有するＦｃ含有分子（「(Fucα1,6)GlcNAc－Ｆｃ含有分子」という、図２のＡ参照）が得られる（図３Ａ）。
　このようなＮ２９７糖鎖の加水分解反応に用いる酵素としては、EndoS又はその加水分解活性を保持した変異酵素などを用いることができる。
上記の加水分解反応により得られた(Fucα1,6)GlcNAc－Ｆｃ含有分子を糖鎖アクセプター分子として、EndoS D233Q変異体のような糖転移酵素を用いてＳＧ型糖鎖ドナー分子と反応させることによって、上述の構造からなるＳＧ型Ｎ２９７糖鎖を有するＦｃ含有分子（図２のＢ参照）を得ることができる（図３Ｂ）。
　目的物が４価のhANPペプチドを有するコンジュゲート体である場合、この糖転移反応にには糖鎖としてSG(10)を有する糖鎖ドナー分子を用いる。このようなSG(10)糖鎖は、例えばＳＧＰから加水分解等によって取得されたものを用いても良く、市販のジシアロオクタサッカリド（東京化成工業（株）のようなSG(10)糖鎖のみを用いても良い。
目的物が２価のhANPペプチドを有するコンジュゲート体である場合、糖鎖としてMSG1(9)又はMSG2(9)を有する糖鎖ドナー分子を採用する。このような糖鎖は、市販のmonosialo-Asn free (1S2G/1G2S-10NC-Asn、(株)糖鎖工学研究所)を原料に実施例１－１１に記載の方法に準じて分離して採用することもできるし、分離せずに混合物として採用することもできる。
　ドナー分子に含まれるＳＧ型糖鎖の還元末端のGlcNAcは、例えば2-クロロ-1,3-ジメチル-1H-ベンズイミダゾール-3-イウム-クロライド処理によるオキサゾリン化のような形で活性化されたものを用いることが好ましいが、後述する２種類の酵素を同時に用いる場合は活性化の必要はない。
　ドナー分子に含まれるＳＧ型糖鎖は、その非還元末端のシアル酸に含まれるカルボン酸に、ＰＥＧリンカー、又は、その部分構造を有するリンカー分子を結合させた糖鎖を有する。
　このような糖転移反応に用いる酵素としては、Ｎ２９７糖鎖に複合型糖鎖を転移させる活性を有するものであれば様々なものが採用できるが、好ましいものはEndoSの２３３番目のAspをGlnに置換することで加水分解反応を抑制した改変体であるEndoS D233Qである。EndoS D233Qを用いた糖転移反応については、WO2013/120066などに記載されている。また、EndoS D233Qに対して、さらに変異を加えたEndoS D233Q/Q303L、EndoS D233Q/E350A、EndoS D233Q/E350Q、EndoS D233Q/E350D、EndoS D233Q/E350N、EndoS D233Q/D405Aなどのような改変体酵素を利用してもよい。このようなEndoS　D233Qの改変体を用いた糖転移反応は、WO2017/010559に記載されている。
　Ｆｃ含有分子の糖鎖リモデリング（糖加水分解、及び糖鎖転移反応）後のＦｃ含有分子の精製操作は、反応に使用した低分子化合物及び酵素との分離を目的とし、このような精製には、通常、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどが使用されるが、更にハイドロキシアパタイトカラムによる追加精製を施すことによって、糖鎖転移反応効率の向上が確認された。すなわち、本発明は、Ｆｃ含有分子の糖加水分解後の反応液からの中間体の精製工程において、更にハイドロキシアパタイトカラムによる精製工程を含む、コンジュゲート体の製造方法を提供する。
　糖鎖リモデリング報告例（J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 12308-12318.、Angew. Chem. Int. Ed. 2016, 55, 2361-2367）に従うと、Ｆｃ含有分子を加水分解酵素で処理した反応液をプロテインAカラム（アフィニティクロマトグラフィーカラム）で精製するのみであるが、この精製方法では、加水分解酵素（EndoS）が完全には除去できず、残留酵素が影響して、次の糖転移反応に影響を与えることが判明した。ここで、精製法を検討した結果、Ｆｃ含有分子を加水分解酵素で処理した反応液をプロテインＡカラム、ハイドロキシアパタイトカラム(CHTカラム、Bio-Rad Laboratories, Inc.)の順に精製することによって、残留酵素の影響なく、次の糖鎖転移反応の反応効率が向上した。
　また、本発明は、２種類の酵素を同時に用いることで、還元末端が活性化されていないＳＧＰや(SG-)Asnなどを直接糖鎖ドナーとして、Ｆｃ含有分子のＮ２９７糖鎖へ糖転移させる方法を提供する。通常の糖転移反応は、糖鎖ドナーの還元末端が活性化されている必要があり、このような活性型ドナーの調製に時間とコストを要していた。本方法は、天然から取得され、又は、市販されている糖ペプチドなどを直接糖転移反応に使用できるため、効率的な糖鎖リモデリングが可能となる。
使用する2種類のEndo酵素は、複合型糖鎖を広く基質とする酵素Ａ（EndoM様酵素）とＦｃ含有分子のＮ２９７糖鎖を基質とする酵素Ｂ（EndoS様酵素）を適切に組合せることが重要である。
酵素Ａとしては、EndoM、EndoOm、EndoCCとその加水分解活性を低下させたEndoM変異体、EndoOm変異体、EndoCC変異体などを例示できる。酵素Ａとして好ましいものは、EndoM N175Q、EndoCC N180H、EndoOm N194Qである。
酵素Ｂとしては、EndoS、EndoS2(EndoS49)及びそれらの加水分解活性を低下させたEndoS変異体、 EndoS2(EndoS49)変異体などを例示できる。酵素Ｂとして好ましいものは、EndoS D233Q 、EndoS D233Q/Q303L、EndoS D233Q/E350A、EndoS D233Q/E350Q、EndoS D233Q/E350D、EndoS D233Q/E350N、EndoS D233Q/D405Aなどである。
糖鎖ドナーの構造は、採用される酵素Ａに認識される糖鎖構造を有するものであれば、特に限定されず、天然から取得されたもの、化学反応あるいは酵素反応との組み合わせで合成可能な分子など、様々なものを用いることができる。アノマー部位の置換基Ｒは、Ｒ＝Ｈ以外、何を使用してもよい。Ｎ結合型糖鎖構造の場合（下記式参照。アノマーの置換基Rは一番上の構造式の還元末端のR）、アミド構造やアジドを例示できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
 Ｏ結合型糖鎖構造の場合（下記式参照。アノマーの置換基Rは一番上の構造式の還元末端のR）、エチレングリコール構造やグリコール酸構造、あるいはアノマー水酸基の保護基として用いられるベンジル基、アリル基、パラニトロフェニル基がなどが例示できる。また、糖鎖ドナーの非還元末端の構造についても、酵素Ａに認識されるものであれば特に限定されず、天然の糖鎖構造、天然の糖鎖構造から非還元末端糖鎖を欠失させたもの、任意の水酸基をりん酸修飾したもの、化学的にリンカー構造が結合したものなど、様々なものを使用することができる。好ましい糖鎖ドナーとしては、ＳＧＰ、（SG-）Aｓｎ、([N3-PEG(3)]2-SG)-Asn-PEG(3)-N3などである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000043
 本方法に用いるアクセプター分子としては、Ｎ２９７糖鎖を有するＦｃ含有分子であれば特に制限なく、mAb、CLCH、Fc断片など様々なタイプのものを適宜選択して使用できる。
反応温度は、用いる酵素の至適温度に応じて適宜選択することができるが、通常１５～５０℃であり、好ましくは、２５～４０℃である。本方法では、２種類の酵素を用いるため、一方の酵素の至適温度で他方の酵素が失活してしまうと、適切に転移反応が進まない場合がある。そのため、至適反応温度等の条件が近い酵素の組み合わせを選択するのが好ましい。
＜ＰＥＧリンカー＞
　本発明においてＰＥＧリンカーとは、本発明のコンジュゲート体においてhANPペプチドとＦｃ含有分子の連結を仲介する、ポリエチレングリコール構造を含む化学構造を意味する。ＰＥＧリンカー構造は、通常は分岐構造を含まない直鎖構造からなり、一方の末端でhANPペプチドのＮ末端のアミノ基又はＣ末端のカルボキシル基と結合し、他方の末端でＦｃ含有分子のＮ２９７糖鎖のシアル酸２位のカルボン酸と結合している。
　本発明のコンジュゲート体に含まれるＰＥＧリンカーは、約１０個以上のエチレングリコール単位を直鎖状に含んでおり、この長さは、コンジュゲート体が保持するhANPの活性発現に重要である。リンカー構造に含まれるエチレングリコール単位（-CH2-CH2-O-）の個数の上限は約５０個以下であり、好ましくは約４０個以下であり、より好ましくは約３５個以下であり、さらに好ましくは約３０個以下である。リンカー構造に含まれるエチレングリコール単位の下限としては、好ましくは約１５個以上であり、より好ましくは約２０個以上であり、さらに好ましくは約２５個以上である。
　このようなＰＥＧリンカーは、単一の分子に由来するものであっても良く、複数の分子を結合させた、複数の部分構造からなるものであっても良い。このような、リンカー構造の由来となる分子を「リンカー分子」という。
本発明のＰＥＧリンカーが、一つのリンカー分子に由来する場合、Ｆｃ含有分子との結合にはＳＧ型Ｎ２９７糖鎖のシアル酸の２位カルボン酸と結合させるため、コンジュゲート体の構造の均一性を確保するため、hANPペプチドとはＮ末端と結合するように、リンカー分子に含まれる官能基を選択することが好ましい。
　本発明のＰＥＧリンカーが、複数のリンカー分子に由来する場合、当該リンカー分子としては、少なくとも、Ｎ２９７糖鎖のシアル酸２位のカルボン酸に結合する官能基を含む化合物、及び、hANPペプチドのＮ末端又はC末端と結合できる官能基を有する化合物が用いられる。この２種類のリンカー分子が直接結合できる官能基をさらに有していれば、直接結合することもできるし、さらに別の化合物を仲介して連結されていてもよい。
用いられるリンカー分子は、コンジュゲート体製造の効率や利便性を考慮して適宜、適切な官能基や構造を有する化合物が選択される。そのため、最終的に構成されるPEGリンカー構造において、合計として所定の個数のエチレングリコール単位構造を含んでいれば良く、一種類のリンカー分子のみがＰＥＧを含んでいても良く、２つ又はそれ以上のリンカー分子がエチレングリコール単位を含んでいても良い。
　リンカー構造において、「PEG(ｎ)」と表示する場合、ｎは含まれる連続したエチレングリコール単位の個数を表し、別の化学構造が挿入された場合、PEG(n)-PEG(m)のように表示する。例えば、24単位のポリエチレングリコールを含むリンカー構造はPEG(24)と表し、12単位のポリエチレングリコールを含むリンカー分子と６単位のポリエチレングリコールを含むリンカー分子が結合して形成されたリンカー構造は、PEG(12)-PEG(6)のように表示する。例えば、同一のリンカー分子が結合して形成されるPEG(12)-PEG(12)部分は、PEG(12)2と簡易表記を用いて表示する場合もある。このような所望の長さのＰＥＧリンカーは、例えば、3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ) エトキシ] エトキシ] エトキシ] エトキシ] エトキシ] エトキシ] エトキシ] エトキシ] エトキシ] エトキシ] エトキシ] エトキシ]プロパン酸（Fmoc-PEG(12)-COOH）のように、一方にFmoc保護されたアミノ基、他方にカルボン酸を有するFmoc-PEG試薬を用いて、脱保護及びカルボン酸の活性化を繰り返すことによって、所望のPEG長を有するリンカーを形成することができる。このようなFmoc-PEG試薬は、Novabiochemより、Fmoc-PEG(3)-COOH、Fmoc-PEG(6)-COOH、Fmoc-PEG(12)-COOH、Fmoc-PEG(24)-COOH等が市販されている。
　このようなリンカー分子同士の結合には、有機合成化学の分野で公知の様々な方法を適用することができ、特に限定されるものではない。一般に、抗体-薬物コンジュゲート合成に応用されている結合法を参考にできる（Bioconjugate Chem. 2015, 26, 2198-2215）。例えば、アジド基とアセチレン基のHusgen反応による環形成法として、1,2,3-トリアゾール環を形成させる付加環化反応[Cu(I)-Catalyzed Azide-Alkyne 
1498711133922_0
 (CuAAC)]、アジド基とジベンジルシクロオクテン（DBCO）の反応により1,2,3-トリアゾール環を形成させる付加環化反応［Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition(SPAAC)］を例示でき、ここでは、その他同様に歪んだシクロオクチン構造を有する化合物、ビシクロ［6.1.0］ノン-4-エン(BCN)（Angew.Chem.Int.Ed.2010,49,9422-9425）や中員環構造上にヘテロ原子を含むシクロアルキン（Angew.Chem.Int.Ed.2015,54,1190-1194）なども利用できる。別の環形成反応として、1,2,4,5-テトラジン環と歪んだアルケンとのDiels-Alder付加環化反応(Curr.Opin.Chem.Biol.,2014,21,89-95)を例示できる。また、アルデヒド基とのPictet-Spengler反応型の環化縮合として、Hydrazino-Pictet-Spengler ligation（Bioconjugate Chem. 24,846-851.）やOxyamine-based Pictet-Spengler ligation（Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 46-51）が例示できる。その他、アミノ基とカルボキシル基によるアミド結合、ＳＨ基とマレイミド基のマレイミド縮合、SH基とメチルスルフォニルフェニルオキサジアゾール基との縮合（Angew. Chem., Int. Ed. 52, 12592-6.）、ＳＨ基とヨードアセチル基との結合、SH基と2-ピリジルジチオ基との縮合によるジスルフィド結合、アルデヒド基とヒドラジドのヒドラゾン縮合、アルデヒド基とアミノオキシ基のオキシム縮合等を例示することができる。本発明で採用されるリンカー分子としてはこれらの結合様式に合致した官能基を有するものを適宜選択して、リンカー構造の形成に用いることができる。
　このような結合反応において、結合様式によっては立体異性体、光学異性体、幾何異性体などが形成される場合がある。これらの異性体は公知の方法で分離して用いても良く、混合物として用いても良い。最終的なコンジュゲートが巨大分子であるためこれら部分構造の異性体の構造的相違はほぼ、コンジュゲート体には影響しないものと考えられる。
　このようなＰＥＧリンカーの具体例としては、例えば、以下のL(PEG) A1
～L(PEG) H1、及びL(PEG) A2～L(PEG) H2、のような構造を挙げることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000044
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000045
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 （上記式において、「hANP」はhANPペプチドのＮ末端と結合することを表し、「N297 GLY」はＮ２９７糖鎖の非還元末端のシアル酸２位のカルボニル基と結合していることを表す。）。
　これらのリンカー構造は、Ｆｃ含有分子に結合するN297糖鎖に導入されたアジド基とhANPペプチドを含むリンカー分子に結合したDBCO基のClick反応で形成される1,2,3-トリアゾール環を有する。この構造では、アジド基に結合するリンカー構造が、トリアゾール環の１位又は３位に結合した幾何異性体が形成されるが、Ｆｃ含有分子１分子当たり２又は４つのアジド基で反応するため、コンジュゲート１分子中に幾何異性構造が混在している。
＜コンジュゲート体及びその製造方法＞
　本発明のコンジュゲート体は、上述したhANPペプチド、Ｆｃ含有分子、リンカー分子等の中間体を適宜、有機合成化学分野で公知の反応を利用して結合させることで製造することができる。その製造の順序は特に限定されず、中間体や目的物の構造に合わせて、常法に従って、様々な方法を採用することができる。
それぞれの中間体の有する官能基は、当該製造工程に応じて、常法に従って、適宜、活性化、不活性化、保護基の付加、脱保護等を行う。
　各反応工程において、中間体及び最終物は、適宜分離・精製され次の反応へ供され、又は医薬品原体若しくは試薬として利用される。
上記に例示したＰＥＧリンカーを有するコンジュゲート体は、例えば以下のように製造することができる。
Ｎ２９７糖鎖に結合するリンカー分子は、Ｎ２９７糖鎖の非還元末端に官能基（例えばアジド基）を有する分子であり、上述のＦｃ含有分子の糖鎖リモデリング工程で合成する。一方にアミノ基、他方に別の官能基（例えばアジド基）を有するリンカー分子をSG(10)と反応させ、糖鎖の非還元末端のシアル酸２位のカルボン酸に当該リンカー分子を結合させる。続いて、この糖鎖分子の還元末端GlcNAcを活性化させて、糖鎖ドナー分子とし、糖転移酵素存在下で(Fucα1,6)GlcNAc-Ｆｃ含有分子と反応させて、Ｆｃ含有分子のＮ２９７糖鎖の非還元末端に官能基を導入する。
hANPペプチドのＮ末端に結合するリンカー分子は、一方にカルボキシル基、他方に別の官能基（ＤＢＣＯ、保護基が導入されたアミノ基など）を有する分子である。hANPペプチドを当該リンカー分子と反応させることで、hANPペプチドのＮ末端側に所望の官能基を導入することができる。
　このようにして得られた、官能基が導入されたＦｃ含有分子とhANPペプチドを直接、又は別のリンカー分子を介して連結させることによって、本発明のコンジュゲート体を得ることができる。
　本発明のコンジュゲート体の具体例としては、上記のL（PEG）A～L(PEG)Hにおいて、hANPペプチドがhANP(1-28)又は(SG-)Asn-hANP(1-28)であり、Ｆｃ含有分子が配列番号３のアミノ酸番号２０～４７４のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号５のアミノ酸番号２１～２３４のアミノ酸配列からなる軽鎖の組み合わせ（mAb-A）からなる抗体、または、
配列番号７のアミノ酸番号２０～３４９のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号９のアミノ酸番号２１～１２５のアミノ酸配列からなる軽鎖の組み合わせからなるＣＬＣＨ（CLCH-A）であり、ＳＧ型Ｎ２９７糖鎖がN297-(Fuc)SG又はN297-(Fuc)MSG1であり、より具体的には実施例３で合成された、化合物３－１～化合物３－１４を挙げることができるが、好ましくは化合物３－１～化合物３－６である。
＜機能、活性＞
　本発明のコンジュゲート体は、修飾されていないhANP(1-28)と比較して、延長された血中持続時間、及び、優れた物性を示し、且つ、皮下投与時にhANP製剤として好ましい緩やかな血中移行性能を有している。天然型hANP(1-28)は、血中から速やかに消失するため、臨床では点滴等により静脈内へ持続投与する必要があったが、本発明のコンジュゲート体は通常の皮下投与によっても長期間薬理効果を発揮できる。また、本発明のコンジュゲート体は、高濃度においても凝集性が低いという特性を有する。このような、本発明のコンジュゲート体の特性によって、従来の天然型hANPや既存のhANP製剤では達成できなかった投与方法、投与経路、製剤技術を採用することが可能となり、急性の循環器系疾患のみならず、慢性の循環器系疾患（高血圧症や慢性心疾患など）の治療に用いることも可能となる。さらに、本発明のコンジュゲート体は生物学的研究ツールとしても有用である。天然型hANPは、長期間血中に存在した場合の組織移行性などは不明であるが、本発明のコンジュゲート体を投与することで、このような局在やhANPが長期間血中に存在することによる生体への影響を調べることが可能となる。
本発明のコンジュゲート体の血中持続性は、実施例４－２の方法に準じて、動物への投与後の末梢血中のcGMP濃度、及び／又は、末梢血サンプル中に含有される当該コンジュゲート体を検出することによって試験することが出来る。本発明のコンジュゲート体は、体内に投与された後、約２４時間後においても末梢血中のcGMP濃度を上昇させる効果を維持しており、より好ましくは投与約４８時間後においても当該効果を維持しており、より好ましくは投与約７２時間後においても当該効果を維持しており、さらにより好ましくは投与約９６、１２０、１４４又は１６８時間後においても当該効果を維持している。更に、本発明のコンジュゲート体は、皮下投与後緩やかに活性を発現し、そのピークは２４～４８時間後である場合が多く、このような血中動態は低血圧発現のリスクを低減・回避できると期待される。また、コンジュゲート体の投与後の末梢血からの、当該コンジュゲート体の検出に関して、約２４時間後においても検出されることが好ましく、より好ましくは約４８時間後においても検出されることであり、さらに好ましくは約７２時間後においても検出されることであり、さらにより好ましくは約９６、１２０、１４４又は１６８時間後においても検出されることである。
　本発明のコンジュゲート体は、高い濃度の水溶液においても凝集しにくいという優れた物性を示す。hANPペプチドは溶液中の塩の影響などによりゲル化し易い性質を有しており、製剤の取扱いに注意が必要であった。本発明のコンジュゲート体は凝集性の問題が低減され、有効成分を高濃度にしたり、様々な添加物を採用できるなど、多様な形態の製剤に適用することができる。特に、糖鎖修飾されたhANPペプチドを含むコンジュゲート体は、非常に良好な非凝集性を示すことが確認されている。
　本発明のコンジュゲート体の血中持続時間は、コンジュゲート体を生体に投与し、一定時間おきに血液を採取し、当該血液サンプル中に含まれるコンジュゲート体を検出することにより測定することができる。コンジュゲート体の検出方法としては、例えば、LC-MSによる検出、hANPのリング構造を特異的に認識する抗体を用いたELISA法、など、様々な方法を用いることができる。また、本発明のコンジュゲート体をcGMP上昇活性を発現する用量で投与した場合、当該血液サンプルのcGMPレベルを市販の測定キットを用いて測定し、投与開始前の血中のcGMPレベルと比較することで、血中のコンジュゲート体の生物活性としての持続時間を測定することができる。また、コンジュゲート体を放射性同位体で標識し、血液サンプルをＳＤＳ－ＰＡＧＥ等で分離し、放射性シグナルを検出することによって、検出することもできる。
　本発明において、「血中持続時間が延長された」とは、天然型hANPと比較して被験物質の投与後に血中から検出可能な時間が延長されることを意味する。サルへの皮下投与において、天然型hANPは200nmol/kgの投与後30分の時点で血中濃度が測定限界以下となる(data not shown)が、コンジュゲート体は100nmol/kgの投与7日後でも血中から検出された。
　また、本発明のコンジュゲート体は、ＮＥＰによるhANPペプチドの分解に対して耐性を有することが、持続時間が延長される要因の一つと考えられる。このような、ＮＥＰ分解耐性は、公知の方法で測定することができる。
　本発明のコンジュゲート体のcGMP上昇活性は、GC-A受容体を発現する細胞を十分量までの濃度勾配に調整した被験物質で刺激した後、細胞を溶解してその細胞溶解液中のcGMP濃度を測定し、最大のcGMP濃度（Emax）を同定することで測定する。本発明のコンジュゲート体が「cGMP上昇活性を保持する」とは、コンジュゲート体が示す最大cGMP濃度が、天然型hANPの最大cGMP濃度と比較して、約３０％以上であることを意味し、好ましくは、約５０％以上であり、より好ましくは、約７０％以上である。本発明のコンジュゲート体は、天然型hANPと比較して、高濃度に製剤化することができ、且つ、延長された血中持続時間を示すため、いわゆるＥＣ５０値のような指標で活性を定義することは適切ではなく、濃度を上昇させた場合の最大の活性が、天然型の一定以上の活性を示すことができれば、臨床において、持続的、及び又は、高濃度で投与された場合に十分な薬効を得ることができる。
　本発明は、本発明のコンジュゲート体を有効成分として含有する医薬を提供する。
＜医薬＞
　本発明に係る医薬の有効成分として用い得る物質は、上述したコンジュゲート体の薬学的に許容される塩であってもよい。すなわち、本発明においては、上述した物質の、無機酸、例えば塩酸、硫酸、リン酸、又は有機酸、例えばギ酸、酢酸、酪酸、トリフルオロ酢酸（TFA）、コハク酸、クエン酸等の酸付加塩を、有効成分として使用することもできる。あるいは、本発明においては、上述した物質の、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム等の金属塩、有機塩基による塩の形態を有効成分として使用することもできる。このような、本発明のコンジュゲート体の塩は、hANPペプチド部分の塩であっても良く、糖鎖の構造において塩を形成していても良い。本発明のコンジュゲート体の塩として好ましくは、hANPペプチド部分で薬学上許容される塩を形成したものであり、また、本発明に係る医薬組成物は、その有効成分に係る物質の遊離形としても、又はその薬学上許容し得る塩であってもよい。
　本発明に係る医薬の有効成分として用い得る物質又はその薬学的に許容し得る塩は、公知の薬学的に許容し得る担体、賦形剤、希釈剤などと混合して医薬に一般に使用されている投与方法、即ち経口投与方法、又は、経粘膜投与、静脈内投与、筋肉内投与もしくは皮下投与等の非経口投与方法によって個体に投与するのが好ましい。
　本発明に係る医薬の有効成分として用い得る物質の投与量は、疾患の種類、個体（患者）の年齢、体重、症状の程度及び投与経路などによっても異なるが、一般的に１日当りの投与量の上限としては、例えば約１００ｍｇ／ｋｇ以下であり、好ましくは約５０ｍｇ／ｋｇ以下であり、さらに好ましくは１ｍｇ／ｋｇ以下である。また、一日あたりの投与量の下限としては、例えば約０．１μｇ／ｋｇ以上であり、好ましくは０．５μｇ／ｋｇ以上であり、より好ましくは、１μｇ／ｋｇ以上である。
　本発明に係る医薬の投与頻度は、使用する有効成分、投与経路、および処置する特定の疾患に依存しても変動する。例えばペプチド性の物質を経口投与する場合、一日当たり４回以下の投与回数で処方することが好ましく、また非経口投与、例えば静脈内投与する場合には、通常のシリンジを用いて注射することもできるし、インフュージョンポンプ、カテーテル等を利用して持続的に投与することもできる。また、皮下注射、筋肉内注射等の経路で投与することも好ましく、その場合、通常用いられる様々な投与デバイスを利用することができる。
　本発明の医薬の有効成分を液剤として調整する場合、本発明のコンジュゲート体又はその薬学的に許容しうる塩を、水性溶媒に溶解し、必要に応じて、安定化剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤等を添加して調整することができる。また、凍結乾燥製剤とする場合、上記のように調製した液剤を凍結乾燥し、使用時に生理食塩水、注射用水、ブドウ糖液などで溶解して用いることができる。
　本発明の医薬は、GC-Aへ作用してcGMPレベルを上昇させることにより、治療することができる疾患の患者に投与することで、当該疾患を治療する効果を有する。ここで、疾患又は症状の「治療」とはGC-Aの活性化により正常化が期待される病的症状の進行を遅延、軽減、緩和及び／又は抑制することで、症状を正常化に近づけることを意味する。疾患の早期又は疾患リスクが高い状態で投与を開始することで、疾患の重症化または発症を抑制する効果が期待される。また、過去に当該疾患を罹患したものは、再発、又は、慢性化に陥る危険性があるが、このような患者に対して、本発明の医薬を継続的に投与することによって、再発や慢性化のリスクを低減させることが期待できる。このような効果も、治療に含まれるものとする。
　このような疾患としては、例えば、高血圧、急性心不全（急性心不全発症後における病状管理を含む）、慢性心不全、虚血性心疾患、急性腎炎（急性腎炎発症後における病状管理を含む）、慢性腎炎、急性腎不全（急性腎不全発症後における病状管理を含む）、慢性腎不全、虚血性心疾患（心筋梗塞など）、悪性腫瘍の転移、肝繊維化、肝硬変、透析における組織の癒着、繊維化、などである。
　以下、実施例を用いて、本発明を具体的に説明する。実施例に示されたものは、本発明の実施形態の一例であり、本発明はこれに限定されるものではない。
　実施例１は、本発明のコンジュゲートの製造中間体である、hANPペプチド、リンカー分子又はその誘導体の製造例であり、実施例２は抗体分子の作製例であり、実施例３は、コンジュゲート体の合成例であり、実施例４は、本発明のコンジュゲート体の特性や効果を確認した試験例である。
　本明細書に記載されている各中間体の質量は、次の方法で確認した。装置には、Q Exactive( Thermo Fisher Scientific Inc製)、Ultimate 3000(Thermo Fisher Scientific Inc製)およびCORETECS UPLC C18 (WatersInc製) (1.6 μm、2.1x50 mm)を使用し、移動相Aにはアセトニトリル、移動相Bには0.1%ギ酸添加水溶液を利用し、移動相Aが4分間で2%から95%に変化するグラジェントにて使用し、流速0.4 mL/min、40℃にて分析した。
　本特許に記載されているタンパク濃度は、微量分光光度計Xpose(Trinean製)を用いて定量した。糖鎖リモデリング抗体分子、コンジュゲート体の質量は、次の方法で確認した。糖鎖リモデリング抗体分子、コンジュゲート体を重鎖と軽鎖にフラグメント化した後に、それぞれのピークを分析カラムで分離し、質量分析した。装置には、Q Exactive( Thermo Fisher Scientific Inc製)、Ultimate 3000(Thermo Fisher Scientific Inc製)およびMAbPac RP (Thermo Fisher Scientific Inc製) (4.0 μm、2.1x50 mm)を使用し、移動相Aにはアセトニトリル、移動相Bには0.1%ギ酸/0.02%トリフルオロ酢酸添加水溶液を利用し、移動相Aが4分間で20%から50%に変化するグラジェントにて使用し、流速0.6 mL/min、80℃にて分析した。
［実施例１］各種中間体の合成
以下において、構造式中で、単に「hANP」と表記される場合、修飾ペプチド中のhANPペプチドがhANP(1-28)(配列番号１)であることを示し、当該ペプチドはＮ末端のＳｅｒにおいて、リンカー分子と結合、又は、糖鎖修飾されている。
＜実施例１－１＞DBCO-PEG(12)2-hANP(1-28) (下記式の化合物1-1) の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000052
 （上記の図において、構造式の右の模式図は、図１～３及び実施例３の反応式に表示されるコンジュゲート体又は中間体の模式図中の対応構造を示す。）
（１－１Ａ）Fmoc-PEG(12)-hANP(1-28)の合成
Fmoc-PEG試薬であるFmoc-PEG(12)-COOH；3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ) エトキシ] エトキシ] エトキシ] エトキシ] エトキシ] エトキシ] エトキシ] エトキシ] エトキシ] エトキシ] エトキシ] エトキシ]プロパン酸(Novabiochem製、304mg,0.36mmol)のN,N-ジメチルホルムアミド溶液(4.6ml)に、N,N,N',N'-テトラメチル-O-(N-スクシンイミジル)ウロニウムテトラフルオロボラート(東京化成工業（株）製,109mg,0.36mmol)のN,N-ジメチルホルムアミド溶液(1.0ml)とジイソプロピルエチルアミン(131μl,0.75mmol)を加え、室温で1時間攪拌した。
hANP(1-28)酢酸塩(1000mg)をN,N-ジメチルホルムアミド(11ml)、蒸留水(3ml)に溶解させ、ジイソプロピルエチルアミン(315μl,1.81mmol)を加えた。この溶液に対して、事前に調製した活性エステルを含むN,N-ジメチルホルムアミド溶液(5.6m)を加え、室温で1時間攪拌した。
反応終了後、反応液にトリフルオロ酢酸(186μl,2.41mmol)を加え、20mL-scintillation vial(Biotage製)に移し、高速濃縮装置V-10(Biotage)を用いて溶媒を除去した。適量のアセトニトリルを前記バイアルに加え、高速濃縮装置V-10(Biotage)を用いて溶媒を除去し、固形物を得た。この固形物に適量のジエチルエーテルを加えてデカンテーションした後に、適量のアセトニトリル/ジエチルエーテル(1/2)を加え再びデカンテーションした。得られた固形物を減圧下乾燥し、表記目的化合物を含む粗生成物を得た。これ以上精製せず、そのまま次の反応に用いた。
（１－１Ｂ）H2N-PEG(12)-hANP(1-28)の合成
工程（１－１Ａ）で合成した粗生成物（全量)をN,N-ジメチルホルムアミド(16ml)と蒸留水(3.2ml)の混合溶液に溶解させ、ピペリジン(518μl,5.23mmol)を加え、室温で1時間攪拌した。反応終了後、反応液に酢酸(451μl,7.88mmol)加え、20mL-scintillation vial(Biotage)に移し、高速濃縮装置V-10(Biotage)を用いて溶媒を除去した。適量のアセトニトリルを前記バイアルに加え、高速濃縮装置V-10(Biotage)を用いて溶媒を除去し、固形物を得た。この固形物に適量のジエチルエーテルを加えてデカンテーションした後に、適量のアセトニトリル/ジエチルエーテル(1/2)を加え、再びデカンテーションした。得られた固形物を適量の0.1%トリフルオロ酢酸水溶液と酢酸を加えて溶解させ、数回に分けて、逆相HPLC分離精製した。0.1%トリフルオロ酢酸水溶液と0.1%トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液を溶離液とし、装置にはPurif-Rp2（昭光サイエンティフィック製）を使用し、カラムにはInertsil ODS-3（GLサイエンス製）を使用した。溶出中にUV検出（220nm）された目的物を含むフラクションを一つにまとめ、凍結乾燥した。表記目的化合物(826mg)を無色固体として得た。
（１－１Ｃ）Fmoc-PEG(12)2-hANPの合成
Fmoc-PEG試薬であるFmoc-PEG(12)-COOH；3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ) エトキシ] エトキシ] エトキシ] エトキシ] エトキシ] エトキシ] エトキシ] エトキシ] エトキシ] エトキシ] エトキシ] エトキシ]プロパン酸(Novabiochem製,251mg,0.30mmol)のN,N-ジメチルホルムアミド溶液(3.8ml)に、N,N,N',N'-テトラメチル-O-(N-スクシンイミジル)ウロニウムテトラフルオロボラート(東京化成工業（株）製、90mg,0.30mmol)のN,N-ジメチルホルムアミド溶液(0.8ml)とジイソプロピルエチルアミン(87μl,0.50mmol)を加え、室温で1時間攪拌した。
工程（１－１Ｂ）で合成した化合物(826mg)をN,N-ジメチルホルムアミド(10ml)と蒸留水(3.5ml)を加えて溶解させ、ジイソプロピルエチルアミン(160μl,0.92mmol)を加えた。この溶液に対して、事前に調製した活性エステルを含むN,N-ジメチルホルムアミド溶液(4.6m)を加え、室温で1時間攪拌した。反応終了後、反応液にトリフルオロ酢酸(77μl,1.00mmol)を加え、20mL-scintillation vial(Biotage製)に移し、高速濃縮装置V-10(Biotage)を用いて溶媒を除去した。適量のアセトニトリルを前記バイアルに加え、高速濃縮装置V-10(Biotage)を用いて溶媒を除去し、固形物を得た。この固形物にジエチルエーテルを加えてデカンテーションした後に、適量のアセトニトリル/ジエチルエーテル(1/2)を加え、再びデカンテーションした。得られた固形物を減圧下乾燥し、表記目的化合物を含む粗生成物を得た。これ以上精製せず、そのまま次の反応に用いた。
（１－１Ｄ）H2N-PEG(12)2-hANP(1-28)の合成
工程(１－１Ｃ）で合成した粗生成物（全量）をN,N-ジメチルホルムアミド(14ml)と蒸留水(1.4ml)を加えて溶解させ、ピペリジン(395μl,3.99mmol)を加え、室温で30分攪拌した。反応液に蒸留水(1.0ml)を加え、更に30分攪拌した。反応終了後、反応液に酢酸(343μl,5.99mmol)を加え、20mL-scintillation vial(Biotage製)に移し、高速濃縮装置V-10(Biotage)を用いて溶媒を除去した。アセトニトリルを前記バイアルに加え、高速濃縮装置V-10(Biotage)を用いて溶媒を除去し、固形物を得た。この固形物に適量のジエチルエーテルを加えてデカンテーションした後に、適量のアセトニトリル/ジエチルエーテル(1/2)を加え再びデカンテーションした。得られた固形物を適量の0.2%トリフルオロ酢酸水溶液と酢酸を加えて溶解させ、数回に分けて、逆相HPLC分離精製した。0.1%トリフルオロ酢酸水溶液と0.1%トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液を溶離液とし、装置にはPurif-Rp2（昭光サイエンティフィック製）を使用し、カラムにはInertsil ODS-3（GLサイエンス製）を使用した。溶出中にUV検出（220nm）された目的物を含むフラクションを一つにまとめ、凍結乾燥した。表記目的化合物(694mg)を無色固体として得た。
（１－１Ｅ）DBCO-PEG(12)2-hANP(1-28)の合成
工程（１－１Ｄ）で合成した化合物(520mg)をN,N-ジメチルホルムアミド(5.5ml)と蒸留水(1.5ml)を加えて溶解させ、ジイソプロピルエチルアミン(77μl,0.44mmol)を加えた。この溶液に対して、DBCO-NHS ester(Click Chemistry Tools製, 53mg, 132mmol)のN,N-ジメチルホルムアミド溶液(0.2m)を加え、室温で1時間攪拌した。反応終了後、20mL-scintillation vial(Biotage製)に移し、高速濃縮装置V-10(Biotage)を用いて溶媒を除去した。この固形物にジエチルエーテルを加えてデカンテーションした後に、アセトニトリル/ジエチルエーテル(1/2)を加え再びデカンテーションした。得られた固形物を適量の0.1%トリフルオロ酢酸水溶液と酢酸を加えて溶解させ、数回に分けて、逆相HPLC分離精製した。0.1%トリフルオロ酢酸水溶液と0.1%トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液を溶離液とし、装置にはPurif-Rp2（昭光サイエンティフィック製）を使用し、カラムにはInertsil ODS-3（GLサイエンス製）を使用した。溶出中にUV検出（220nm）された目的物を含むフラクションを一つにまとめ、凍結乾燥し、表記目的化合物（化合物１－１）(283mg)を無色固体として得た。
ESI-MS: Calcd for C200H322N48O67S3: [M+4H]4+ 1142.8(ave.), Found 1142.6 ; [M+5H]5+914.4(ave.), Found 914.3; [M+6H]6+ 762.2(ave.), Found 762.0
＜実施例１－２＞DBCO-PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP(1-28)(下記式の化合物1-2)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000053
 （上記の図において、構造式の右の模式図は、図１～３及び実施例３の反応式に表示されるコンジュゲート体又は中間体の模式図中の対応構造を示す。）
（１－２Ａ）Fmoc-(SG-)Asnフリー体の調製
Fmoc-(SG-)Asn (1S2S-11NC-Asn-Fmoc、糖鎖工学研究所製,2g)を適量の0.1%トリフルオロ酢酸水溶液に溶解させ、複数回に分けて逆相HPLC分離精製した。0.1%トリフルオロ酢酸水溶液と0.1%トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液を溶離液とし、装置にはPurif-Rp2（昭光サイエンティフィック製）を使用し、カラムにはInertsil ODS-3（GLサイエンス製）を使用した。溶出中にUV検出（220nm）された目的物を含むフラクションを一つにまとめ、凍結乾燥した。無色固体(1.8g)を得た。
（１－２Ｂ）hANP(1-28)TFA塩（トリフルオロ酢酸塩）の調製
カルペリチド酢酸塩（hANP(1-28)酢酸塩)（2.7g）を蒸留水(200 ml)に溶解させ、トリフルオロ酢酸(4ml,52.3mmol)加え、10分間放置した後に、凍結乾燥した。凍結乾燥終了後、蒸留水(200 ml)に溶解させ、再び凍結乾燥した。無色固体(2.7g)を得た。
（１－２Ｃ）(SG-)Asn-hANP(1-28)の合成
工程（１－２Ａ）で調製したFmoc-(SG-)Asnフリー体(436mg)のN,N-ジメチルホルムアミド溶液(7.2ml)に対して、氷冷下HATU(65mg,0.17mmol)のN,N-ジメチルホルムアミド溶液(0.8ml)とジイソプロピルエチルアミン(118μl,0.68mmol)を加え、2.5分攪拌し、速やかに次の反応に用いた（溶液１－２Ｃ）。
工程（１－２Ｂ）で調製したhANP(1-28)TFA塩(400mg)をN,N-ジメチルホルムアミド溶液(4.8ml)と蒸留水(1.2ml)を加えて溶解させ、ジイソプロピルエチルアミン(118μl,0.68mmol)を加えた。この溶液に対して、事前に調製した活性エステルを含むN,N-ジメチルホルムアミド溶液１－２Ｃ(8.0m)を加え、室温で30分攪拌した。反応終了後、酢酸(82μl,1.36mmol)を加えた。約5mlずつの反応液をあらかじめアセトニトリル(35ml)を加えた遠沈管(50ml)3本に移した。小型遠心機(日立工機、CF16RX)を利用して、固形物を沈殿させ、上澄みを取り除いた。3本の遠沈管に分かれた固形物を1つの遠沈管にまとめ、アセトニトリル(30mL)で洗浄した後、ジエチルエーテル(30mL)で２回洗浄した後に、減圧下乾燥し、粗生成物を得た。
得られた粗生成物（全量）をN,N-ジメチルホルムアミド溶液(8.4ml)、蒸留水(1.4ml)に溶解させ、ピペリジン(224μl,2.26mmol)を加え、室温で30分攪拌した。反応終了後、酢酸(194μl,3.39mmol)を加えた。約5mlずつの反応液をあらかじめアセトニトリル(35ml)を加えた遠沈管(50ml)2本に移した。小型遠心機(日立工機、CF16RX)を利用して、固形物を沈殿させ、上澄みを取り除いた。2本の遠沈管に分かれた固形物を1つの遠沈管にまとめ、アセトニトリル(30mL)で洗浄、ジエチルエーテル(30mL)x2で洗浄した後に、減圧下乾燥し、粗生成物を得た。
以上の操作を3ロット分行い、各粗生成物(3ロット分)を1つにまとめた。得られた固形物を適量の0.1%トリフルオロ酢酸水溶液と酢酸を加えて溶解させ、数回に分けて、逆相HPLC分離精製した。0.1%トリフルオロ酢酸水溶液と0.1%トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液を溶離液とし、装置にはPurif-Rp2（昭光サイエンティフィック製）を使用し、カラムにはInertsil ODS-3（GLサイエンス製）を使用した。溶出中にUV検出（220nm）された目的物を含むフラクションを一つにまとめ、凍結乾燥した。表記目的化合物(SG-)Asn-hANP(1-28) (1.49g)を無色固体として得た。
ESI-MS: Calcd for C215H345N53O102S3: [M+4H]4+ 1351.1(ave.), Found 1351.1; [M+5H]5+1081.1(ave.), Found 1080.9
（１－２Ｄ）Fmoc-PEG(12)2-(SG-)Asn-hANPの合成
WO2014115797A1 (実施例2-28A)に記載された方法に従って合成したFmoc-NH-PEG(12)2-COOH(122mg,0.085mmol)のN,N-ジメチルホルムアミド溶液(1.0ml)に、N,N,N',N'-テトラメチル-O-(N-スクシンイミジル)ウロニウムテトラフルオロボラート(東京化成工業（株）,23mg,0.077mmol)のN,N-ジメチルホルムアミド溶液(1.0ml)とジイソプロピルエチルアミン(54μl,0.31mmol)を加え、室温で1時間攪拌した（溶液１－２Ｄ）。
工程（１－２Ｃ）で合成した化合物(300mg)をN,N-ジメチルホルムアミド(3ml)、蒸留水(1.4ml)に溶解させ、ジイソプロピルエチルアミン(54μl,0.31mmol)を加えた。この溶液に対して、事前に調製した活性エステルを含むN,N-ジメチルホルムアミド溶液１－２Ｄ(2.0m)を加え、室温で22時間攪拌した。
反応終了後、反応液にトリフルオロ酢酸(47μl,0.61mmol)を加え、約3.2mlずつの反応液をあらかじめジエチルエーテル/アセトニトリル(30ml/10ml)を加えた遠沈管(50ml)2本に移した。小型遠心機(日立工機、CF16RX)を利用して、固形物を沈殿させ、上澄みを取り除いた。2本の遠沈管に分かれた固形物を1つの遠沈管にまとめ、適量のジエチルエーテル/アセトニトリル(1/1)で洗浄した後に、減圧下乾燥し、粗生成物を得た。これ以上精製せずにそのまま用いた。上記操作を4ロット分行い、表記目的化合物を含む粗生成物を計1.47g得た。
（１－２Ｅ）H2N-PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP(1-28)の合成
工程(１－２Ｄ）で合成した粗生成物(0.734g)をN,N-ジメチルホルムアミド(7.2ml)、蒸留水(1.2ml)に溶解させ、ピペリジン(200μl,2.05mmol)を加え、室温で45分攪拌した。反応終了後、反応液に酢酸(176μl,3.07mmol)加え、約2.1mlずつの反応液をあらかじめジエチルエーテル/アセトニトリル(30ml/10ml)を加えた遠沈管(50ml)4本に移した。小型遠心機(日立工機、CF16RX)を利用して、固形物を沈殿させ、上澄みを取り除いた。4本の遠沈管に分かれた固形物を1つの遠沈管にまとめ、適量のジエチルエーテル/アセトニトリル(1/1)及び適量のジエチルエーテルで洗浄した後に、減圧下乾燥し、粗生成物を得た。得られた固形物を適量の0.2%トリフルオロ酢酸水溶液と酢酸を加えて溶解させ、数回に分けて、逆相HPLC分離精製した。0.1%トリフルオロ酢酸水溶液と0.1%トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液を溶離液とし、装置にはPurif-Rp2（昭光サイエンティフィック製）を使用し、カラムにはInertsil ODS-3（GLサイエンス製）を使用した。溶出中にUV検出（220nm）された目的物を含むフラクションを一つにまとめ、凍結乾燥した。表記目的化合物(416mg)を無色固体として得た。
（１－２Ｆ）DBCO-PEG(12)2-(SG-)Asn-hANPの合成
工程（１－２Ｅ）で合成した化合物(832mg)をN,N-ジメチルホルムアミド(12ml)、蒸留水(2.4ml)に溶解させ、ジイソプロピルエチルアミン(123μl,0.71mmol)を加えた。この溶液に対して、DBCO-NHS ester(Click Chemistry Tools製, 57mg, 142mmol)のN,N-ジメチルホルムアミド溶液(0.4m)を加え、室温で1時間攪拌した。反応終了後、反応液にトリフルオロ酢酸(109μl,1.42mmol)を加え、約2.5mlずつの反応液をあらかじめジエチルエーテル/アセトニトリル(30ml/5ml)を加えた遠沈管(50ml)6本に移した。小型遠心機(日立工機、CF16RX)を利用して、固形物を沈殿させ、上澄みを取り除いた。6本の遠沈管に分かれた固形物を1つの遠沈管にまとめ、適量のジエチルエーテル/アセトニトリル(1/1)で洗浄した後に、減圧下乾燥し、粗生成物を得た。得られた固形物を適量の0.2%トリフルオロ酢酸水溶液と酢酸を加えて溶解させ、逆相HPLC分離精製した。0.1%トリフルオロ酢酸水溶液と0.1%トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液を溶離液とし、装置にはPurif-Rp2（昭光サイエンティフィック製）を使用し、カラムにはInertsil ODS-3（GLサイエンス製）を使用した。溶出中にUV検出（220nm）された目的物を含むフラクションを一つにまとめ、凍結乾燥した。表記目的化合物(620mg)を無色固体として得た。
ESI-MS: Calcd for C288H464N56O130S3: [M+5H]5+ 1378.4(ave.), Found 1378.2; [M+6H]6+1148.9(ave.), Found 1148.7; [M+7H]7+ 984.9(ave.), Found 984.9
ＰＥＧリンカーが有するPEG長やPEG縮合数は、使用するFmoc-PEG試薬、縮合・Fmoc脱保護の順番、及び繰り返し回数の選択により制御可能である。従って、実施例１－１あるいは実施例１－２の方法にこれらの要素の選択を組み入れることで、DBCO-L(PEG) -hANPを自在に合成することが可能である。以下に、実施例１－１に記載した方法と同様の方法に従って、Fmoc-PEG試薬、縮合・Fmoc脱保護の順番、及び繰り返し回数を変えて合成した化合物を示す。
＜実施例１－３＞DBCO-PEG(12)-hANP(1-28) (下記式の化合物1-3)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000054
 （上記の図において、構造式の右の模式図は、図１～３及び実施例３の反応式に表示されるコンジュゲート体又は中間体の模式図中の対応構造を示す。）
　実施例１－１の工程（１－１Ｅ）において、出発物質を工程（１－１Ｂ）で合成したH2N-PEG(12)-hANP(1-28)に置き換えて合成することで、標題の目的化合物１－３を得た。
ESI-MS: Calcd for C173H269N47O54S3: [M+3H]3+ 1323.5(ave.), Found 1323.2; [M+5H]5+794.5(ave.), Found 794.4
＜実施例１－４＞DBCO-PEG(24)-hANP(1-28) (下記式の化合物1-4)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000055
 （上記の図において、構造式の右の模式図は、図１～３及び実施例３の反応式に表示されるコンジュゲート体又は中間体の模式図中の対応構造を示す。）
　実施例１－１の工程（１－１Ａ）においてFmoc-PEG試薬としてFmoc-PEG(24)-COOHを用い、工程（１－１Ｅ）の出発物を当該方法において工程（１－１Ｂ）で得られたH2N-PEG(24)-hANP(1-28)に置き換えて合成することで、標題の目的化合物１－４を得た。
ESI-MS: Calcd for C197H317N47O66S3: [M+4H]4+ 1125.0(ave.), Found 1124.8,[M+5H]5+ 900.2(ave.), Found 900.0; [M+6H]6+ 750.4(ave.), Found 750.2
＜実施例１－５＞DBCO-PEG(12)-PEG(6)-hANP(1-28) (下記式の化合物1-5)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000056
 （上記の図において、構造式の右の模式図は、図１～３及び実施例３の反応式に表示されるコンジュゲート体又は中間体の模式図中の対応構造を示す。）
　実施例１－１の工程（１－１Ａ）においてFmoc-PEG試薬としてFmoc-PEG(6)-COOHに置き換えて合成することで、標題の目的化合物１－５を得た。
ESI-MS: Calcd for C288H464N56O130S3: [M+5H]5+ 1378.4(ave.), Found 1378.2; [M+6H]6+1148.9(ave.), Found 1148.7; [M+7H]7+ 984.9(ave.), Found 984.9
＜実施例１－６＞DBCO-PEG(6)-PEG(12)-hANP(1-28) (下記式の化合物1-6)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000057
 （上記の図において、構造式の右の模式図は、図１～３及び実施例３の反応式に表示されるコンジュゲート体又は中間体の模式図中の対応構造を示す。）
　実施例１－１の工程（１－１Ｃ）においてFmoc-PEG試薬としてFmoc-PEG(6)-COOHに置き換えて合成することで、標題の目的化合物１－６を得た。
ESI-MS: Calcd for C188H298N48O61S3: [M+3H]3+ 1435.3(ave.), Found 1435.0; [M+4H]4+1076.7(ave.), Found 1076.5; [M+5H]5+ 861.6(ave.), Found 861.4
＜実施例１－７＞DBCO-PEG(6)2-hANP(1-28) (下記式の化合物1-7)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000058
 （上記の図において、構造式の右の模式図は、図１～３及び実施例３の反応式に表示されるコンジュゲート体又は中間体の模式図中の対応構造を示す。）
　実施例１－１の工程（１－１Ａ）及び工程（１－１Ｃ）においてFmoc-PEG試薬としてFmoc-PEG(6)-COOHに置き換えて合成することで、標題の目的化合物１－７を得た。
ESI-MS: Calcd for C176H274N48O55S3: [M+3H]3+ 1347.2(ave.), Found 1347.0; [M+4H]4+1010.6(ave.), Found 1010.5; [M+5H]5+ 808.7(ave.), Found 808.6
＜実施例１－８＞DBCO-PEG(6)3-hANP(1-28) (下記式の化合物1-8)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000059
 （上記の図において、構造式の右の模式図は、図１～３及び実施例３の反応式に表示されるコンジュゲート体又は中間体の模式図中の対応構造を示す。）
　実施例１－１の工程（１－１Ａ）及び工程（１－１Ｃ）においてFmoc-PEG試薬としてFmoc-PEG(6)-COOHに置き換え、工程（１－１Ｄ）と（１－１Ｅ）の間で更に工程（１－１Ｃ）～（１－１Ｄ）を繰り返すことによって合成することで、標題の目的化合物１－８を得た。
ESI-MS: Calcd for C191H303N49O62S3: [M+3H]3+ 1459.0(ave.), Found 1458.7; [M+4H]4+1094.5(ave.), Found 1094.3; [M+5H]5+ 875.8(ave.), Found 875.6
＜実施例１－９＞DBCO-PEG(6)4-hANP(1-28) (下記式の化合物1-9)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000060
 （上記の図において、構造式の右の模式図は、図１～３及び実施例３の反応式に表示されるコンジュゲート体又は中間体の模式図中の対応構造を示す。）
　実施例１－１の工程（１－１Ａ）及び工程（１－１Ｃ）においてFmoc-PEG試薬としてFmoc-PEG(6)-COOHに置き換え、工程（１－１Ｄ）と（１－１Ｅ）の間で更に工程（１－１Ｃ）～（１－１Ｄ）を２回繰り返すことによって合成することで、標題の目的化合物１－９を得た。
ESI-MS: Calcd for C206H332N50O69S3: [M+4H]4+ 1178.3(ave.), Found 1178.3; [M+5H]5+942.9(ave.), Found 942.7; [M+6H]6+ 785.9(ave.), Found 785.7
＜実施例１－１０＞[N3-PEG(3)]2-SG(10)-Ox（下記式からなる化合物）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000061
 （上記の図において、構造式の右の模式図は、図１～３及び実施例３の反応式に表示されるコンジュゲート体又は中間体の模式図中の対応構造を示す。）
（１－１０Ａ）[N3-PEG(3)]2-SG(10)の合成
　5mlサンプリングチューブ(（株）イナ・オプティカ)に、11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミン(Aldrich,96μl,0.485mmol)、ジシアロオクタサッカリド（東京化成工業（株）, 50 mg, 0.24mmol）の水溶液(0.5ml)を加え、1時間攪拌した後に、凍結乾燥した。凍結乾燥後の5mlサンプリングチューブに、HATU(92mg,0.24mmol)のN,N-ジメチルホルムアミド溶液(0.6ml)とジイソプロピルエチルアミン(42μl,0.24mmol)を加え、37℃で4時間攪拌した。
　反応終了後、あらかじめジエチルエーテル(20ml)を加えた遠沈管(50ml)に反応液を移した。小型遠心機(日立工機、CF16RX)を利用して、固形物を沈殿させ、上澄みを取り除いた。ジエチルエーテル(20ml)を加えて、デカンテーションした。続いて、アセトニトリル(20ml)を加えて、デカンテーションした後に、減圧下乾燥し、粗生成物を得た。得られた固形物を適量の0.2%トリフルオロ酢酸水溶液に溶解させ、逆相HPLC分離精製した。0.1%トリフルオロ酢酸水溶液と0.1%トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液を溶離液とし、装置にはPurif-Rp2（昭光サイエンティフィック製）を使用し、カラムにはInertsil ODS-3（GLサイエンス製）を使用した。溶出中にUV検出（220nm）された目的物を含むフラクションを一つにまとめ、凍結乾燥して、表記目的化合物(42mg)を無色固体として得た。
ESI-MS: Calcd for C92H157N13O61 : [M+2H]2+1211.7(ave.), Found 1211.5; [M-2H]2- 1209.6(ave.), Found 1209.5
（１－１０Ｂ）[N3-PEG(3)]2-SG(10)-Oxの合成
5mlサンプリングチューブ(（株）イナ・オプティカ製)に、工程（１－１０Ａ）で合成した化合物(40mg)、2-クロロ-1,3-ジメチル-1H-ベンズイミダゾール-3-イウム-クロライド(CDMBI)(伏見製薬所製、17.9mg,0.083mmol)の水溶液(200μl)を加えた。氷冷後の反応液にりん酸三カリウム（52.6 mg, 0.25mmol）の水溶液(200μl)を加え、氷冷下で２時間攪拌した。得られた反応液を、アミコンウルトラ(ウルトラセル30K、 Merck Millipore製)を用いて限外ろ過し、固形物を除去した。その通過液を、ゲルろ過クロマトグラフィーにて精製した。装置にはPurif-Rp2（昭光サイエンティフィック製）を使用し、カラムにはHiPrep 26/10 Desalting（GEヘルスケア製）を使用し、移動相に0.03%- NH3水溶液を使用し、流速を10ml/min、分画容量を10mlとした。溶出中にUV検出（220nm）された目的物を含むフラクションを一つにまとめ、1Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（33μl,0.033mmol）を加えて凍結乾燥した。表記目的化合物（34 mg）を無色固体として得た。
NMR(in D2O)（図４のチャート）。
＜実施例１－１１＞[N3-PEG(3)]-MSG1(9)-Ox（下記式からなる化合物）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000062
 （上記の図において、構造式の右の模式図は、図１～３及び実施例３の反応式に表示されるコンジュゲート体、中間体又は反応式の模式図中の対応構造を示す。）
（１－１１Ａ）(MSG1-)Asnの調製
市販品であるmonosialo-Asn free (1S2G/1G2S-10NC-Asn 、(株)糖鎖工学研究所製)(「(MSG-)Asn」と呼ぶ)(500mg)を以下の条件で逆相HPLC分離精製し、1st main peakとして溶出される(MSG1-)Asn(保持時間 15～19 min 付近)と2nd main peakとして溶出される(MSG2-)Asn(保持時間 21～26 min 付近)に分離した。0.1%ぎ酸水溶液を溶離液として使用し、装置にはELS-PDAトリガー分取システム（日本分光株式会社製）を使用し、カラムにはInertsil ODS-3（10um、30Φx250mm、GLサイエンス社製）を使用し、流速を30ml/minとした。溶出中にUV検出（210nm）された最初のピークに帰属するフラクションを一つにまとめ、凍結乾燥して、表記目的化合物(238mg)を無色固体として得た。上記の溶出操作でUV検出される２つ目のピークに帰属するフラクションを集めることで、(MSG2-)Asnを取得することができる。
（１－１１Ｂ）MSG1(9)の合成
工程（１－１１Ａ）で得られた化合物(229mg)を200mMりん酸緩衝溶液(pH6.25)(1145μL)に溶解させ、EndoM(東京化成工業（株）製、1U/mL))水溶液(100μL)を加え、35℃で6日間インキュベートした。反応終了後、反応液をVIVASPIN 15R （Hydrosart膜、30K,6,000 g）を用いて限外ろ過し、得られた通過液を逆相HPLC分離精製した。0.1%トリフルオロ酢酸水溶液を溶離液として使用し、装置にはELS-PDA トリガー分取システム（日本分光株式会社製）、カラムにはInertsil ODS-3（GLサイエンス社製）を使用した。溶出中にUV検出（210nm）された目的物を含むフラクションを一つにまとめ、凍結乾燥して、表記目的化合物(117mg)を無色固体として得た。
（１－１１Ｃ）[N3-PEG(3)]-MSG1(9)の合成
工程（１－１１Ｂ）で合成した化合物(169mg)を使い、工程（１－１０Ａ）と同様の手法に従って、表記目的物 (94.2mg)を得た。
ESI-MS: Calcd for C73H124N8O51: [M+H]+ 1929.9(ave.), Found 1929.7
（１－１１Ｄ）[N3-PEG(3)]-MSG1(9)-Oxの合成
工程（１－１１Ｃ）で合成した化合物(100mg)を使い、工程（１－１０Ｂ）と同様の手法に従って、表記目的物(89mg)を得た。NMR(in D2O)（図５のチャート）。
また、工程（１－１１Ｂ）の出発物質として、工程（１－１１Ａ）の２つ目のピークとして得られる(MSG2-)Asnを用いて、以降同様の操作を行うことによって、[N3-PEG(3)]-MSG2(9)-Ox（化合物1-11において、β-Manの分岐鎖のうち1-6鎖側のシアル酸にリンカーが結合した化合物1-12）を合成することができる。実施例３－５、３－６において化合物1-11を化合物1-12に置換することで、２つのhANPペプチドが異なる分岐鎖に連結したコンジュゲートを合成することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000063
＜実施例１－１２＞[N3-PEG(3)]2-SG(10)の合成－２
　上記（１－１０Ａ）で合成した[N3-PEG(3)]2-SG(10)は、以下の方法によっても合成された。この方法で得られた化合物を用いて、工程（１－１０Ｂ）を行うことで、化合物１－１０を合成することができる。
（１－１２Ａ）([N3-PEG(3)]2-SG)-Asn-PEG(3)-N3（下記式の化合物）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000064
 工程（１－２Ａ）で調製したFmoc-(SG-)Asnフリー体(1000mg)のN,N-ジメチルホルムアミド溶液(10ml)に対して、HATU(891mg,2.34mmol)のN,N-ジメチルホルムアミド溶液(3ml)、11-アジド-3,6,9-トリオキサウンデカン-1-アミン(東京化成工業（株）,511mg,2.34mmol)とジイソプロピルエチルアミン(816μl,4.69mmol)のN,N-ジメチルホルムアミド溶液(3ml)を加え、37℃で3時間攪拌した。更に、HATU(148mg,0.39mmol)のN,N-ジメチルホルムアミド溶液(500μl)を加え、37℃で1時間攪拌した。その後に、ピペリジン(386μl,3.91mmol)を加え、37℃で1時間攪拌した。反応終了後、酢酸(469μl)を加えた。
　あらかじめジエチルエーテル(100ml)を加えたジャンボコニカルチューブ(175ml)2本に反応液を半分ずつ移した。小型遠心機(日立工機、CF16RX)を利用して、固形物を沈殿させ、上澄みを取り除いた。ガム状の固形物を遠沈管(50ml)に移し、ジエチルエーテル(30ml)、アセトニトリル(10ml)を加え、デカンテーションした。この操作を2回繰り返した。同様にして、適量のアセトニトリル、あるいは適量のジエチルエーテルを加えて、デカンテーションした後に、減圧下乾燥し、粗生成物を得た。得られた固形物を適量の0.2%トリフルオロ酢酸水溶液に溶解させ、逆相HPLC分離精製した。0.1%トリフルオロ酢酸水溶液と0.1%トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液を溶離液とし、装置にはPurif-Rp2（昭光サイエンティフィック製）を使用し、カラムにはInertsil ODS-3（GLサイエンス製）を使用した。溶出中にUV検出（220nm）された目的物を含むフラクションを一つにまとめ、凍結乾燥して、表記目的化合物(637mg)を無色固体として得た。
ESI-MS: Calcd for C112H192N20O70: [M+3H]3+ 980.6(ave.), Found 980.4。
（１－１２Ｂ）[N3-PEG(3)]2-SG(10)（工程（１－１０Ａ）の化合物）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000065
 2mlのチューブに、工程(1-1２Ａ)で合成した([N3-PEG(3)]2-SG)-Asn-PEG(3)-N3(78.6mg)を100mMリン酸バッファー,pH6.0(ナカライテスク(株),465μl)に溶解させた。この溶液に1U/mL EndoM(東京化成工業（株）,70μl)を加え、28℃で5時間振とうした後に、室温で4日間静置した。反応終了後、適量の0.2%トリフルオロ酢酸水溶液を加え、逆相HPLCにより分離精製した。0.1%トリフルオロ酢酸水溶液と0.1%トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液を溶離液とし、装置にはPurif-Rp2（昭光サイエンティフィック製）を使用し、カラムにはInertsil ODS-3（GLサイエンス製）を使用した。溶出中にUV検出（220nm）された目的物を含むフラクションを一つにまとめ、凍結乾燥して、表記目的化合物(40mg)を無色固体として得た。
ESI-MS: Calcd for C92H157N13O61: [M+2H]2+ 1211.7(ave.), Found 1211.5
［実施例２］キャリアタンパクの調製
＜実施例２－１＞　キャリア用全長抗体（ｍＡｂ－Ａ）の調製
キャリア用全長抗体として、ヒト体内に存在しない抗原を認識する抗ＬＰＳ抗体Ａ（以降、「ｍＡｂ－Ａ」と呼ぶ）（WO2015/046505におけるｈ＃１Ｇ５－Ｈ１／Ｌ１）を選択し、当該抗体をWO2015/046505の実施例２、５及び７等に記載された方法と同様の方法で調製した。最終保存サンプルは、19.4mg/mlのｍＡｂ－Ａ溶液 (ＨＢＳｏｒ（２５ｍＭ ヒスチジン／５％ ソルビトール、ｐＨ６．０）)とした。
＜実施例２－２＞ＣＬＣＨ－Ａの調製
キャリア用分子として、ＩｇＧ１の可変領域を欠損させた部分抗体分子であるＣＬＣＨ－Ａを以下のように作製した。
（２－２Ａ）ＣＨ―Ａ発現ベクターの構築
ヒト重鎖分泌シグナルとヒトＩｇＧ１定常領域を結合したＣＨタイプ重鎖（ＣＨ―Ａ）のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片（配列番号６）を合成した。合成したＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅し、ＷＯ２０１５／０４６５０５に記載されたｐＣＭＡ－ＬＫをＸｂａＩ及びＰｍｅＩで消化してκ鎖分泌シグナル及びヒトκ鎖定常領域を取り除いたＤＮＡ断片とＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて結合して、ＣＨ―Ａ発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ／ＣＨ」と命名した。ＣＨ―Ａのアミノ酸配列を配列番号７のアミノ酸番号２０～３４９（アミノ酸番号１～１９はシグナル配列）に示した。
（２－２Ｂ）ＣＬ―Ａ発現ベクターの構築
ヒト軽鎖分泌シグナルとヒトκ鎖定常領域を結合したＣＬタイプ軽鎖（ＣＬ―Ａ）のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片（配列番号８）を合成した。工程（２－２Ａ）と同様の方法で、ＣＬ発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ／ＣＬ」と命名した。ＣＬ―Ａのアミノ酸配列を配列番号９のアミノ酸番号２１～１２５（アミノ酸番号１～２０はシグナル配列）に示した。
（２－２Ｃ）ＣＬＣＨ－Ａの生産
WO2015/046505の実施例２に記載された方法と同様の方法で、上記で構築したｐＣＭＡ／ＣＨとｐＣＭＡ／ＣＬの組み合わせてＦｒｅｅＳｔｙｌｅ　２９３Ｆ細胞（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社製）を用いて、ＣＨ―ＡとＣＬ―Ａを組み合わせた部分抗体分子を含む培養上清を得た。得られた部分抗体分子を「ＣＬＣＨ－Ａ」と命名した。
（２－２Ｄ）ＣＬＣＨ－Ａの精製
　工程（２－２Ｃ）で得られた培養上清からＣＬＣＨ－Ａを、組み換えＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィーの２段階工程で精製した。精製工程と精製後のバッファー置換、濃縮工程は４－６℃下で実施した。最初に、培養上清を、ＰＢＳで平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）が充填されたカラムにアプライした。培養液がカラムに全て入ったのち、カラム容量２倍以上のＰＢＳでカラムを洗浄した。次に２Ｍアルギニン塩酸塩溶液（ｐＨ４．０）で溶出し、溶出液を分画し、吸光度に基づきＣＬＣＨ－Ａの含まれる画分を集めた。回収液を透析（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ　Ｄｉａｌｙｓｉｓ　Ｃａｓｓｅｔｔｅ）により５０ｍＭ ＭＥＳ／２０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ６．０への液置換を行った。回収した溶液を５０ｍＭ ＭＥＳ／２０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ６．０で平衡化したＨｉＴｒａｐ　ＳＰ　ＨＰ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）にアプライした。５０ｍＭ ＭＥＳ／２０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ６．０でカラムを洗浄したのち、0から200 mM塩化ナトリウムによる直線的濃度勾配溶出（10カラム容量）を実施し、上記と同様の方法で溶出液からＣＬＣＨ－Ａの含まれる画分を集めた。回収液を透析（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ　Ｄｉａｌｙｓｉｓ　Ｃａｓｓｅｔｔｅ）によりＨＢＳｏｒ（２５ｍＭ ヒスチジン／５％ ソルビトール、ｐＨ６．０）への液置換を行った。最後にＣｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ　ＵＦ　Ｆｉｌｔｅｒ　Ｄｅｖｉｃｅ　ＶＩＶＡＳＰＩＮ２０（分画分子量ＵＦ１０Ｋ，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社，４℃下）にて濃縮し、濃度を２０ｍｇ／ｍｌ以上に調製し、ＣＬＣＨ－Ａ精製サンプルとした。
＜実施例２－３＞ＣＬＣＨ－Ｂの調製
　キャリア用分子として、ＣＬＣＨ－Ａの重鎖にＬＡＬＡ変異を導入させた部分抗体分子であるＣＬＣＨ－Ｂを以下のように作製した。
（２－３Ａ）ＣＨ－Ｂ発現ベクターの構築
ｐＣＭＡ／ＣＨをテンプレートとし、下記プライマーセット（ＣＨＬＡＬＡ－Ｆ及びＣＨＬＡＬＡ－Ｒ）とＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて、配列番号９のアミノ酸番号１３６－１３７のＬｅｕ－Ｌｅｕ（Ｅｕ番号でLeu234 - Lue235に相当）をＡｌａ－Ａｌａに置換する変異を導入することによりＣＨ－Ｂ発現ベクターを構築した。構築した発現ベクターを「ｐＣＭＡ／ＣＨ－Ｂ」と命名した。ＣＨ―ＢをコードするＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号１０のヌクレオチド番号５８～１０４７（ヌクレオチド番号１～５７はシグナル配列）に示し、アミノ酸配列を配列番号１１のアミノ酸番号２０～３４９（アミノ酸番号１～１９はシグナル配列）に示した。
プライマーセット
ＣＨＬＡＬＡ－Ｆ；５’－ＧＣＧＧＧＡＧＧＣＣＣＴＴＣＣＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣ－３’（配列番号１２）
ＣＨＬＡＬＡ－Ｒ；５’－ＧＧＣＴＴＣＧＧＧＧＧＣＡＧＧＡＣＡＡＧＧＧＧＧＡＣＡＧＧＴＧ－３’（配列番号１３）。
（２－３Ｂ）ＣＬＣＨ－Ｂの生産及び精製
ｐＣＭＡ／ＣＨ―Ｂと工程（２－２Ｂ）で作製したｐＣＭＡ／ＣＬを組み合わせて工程（２－２Ｃ）と同様の方法で、ＣＨ－ＢとＣＬ－Ａを組み合わせた部分抗体分子（得られる部分抗体分子を「ＣＬＣＨ－Ｂ」と命名した。）を含む培養上清を得た。得られた培養上清から工程２－２Ｄと同様の方法で部分抗体分子を精製し、ＣＬＣＨ－Ｂ精製サンプルとした。
＜実施例２－４＞Ｆｃ－Ｂ（野生型Ｆｃ）の調製
　キャリア用分子として、ＩｇＧ１のＦｃ断片からなる部分抗体分子であるＦｃ－Ｂを以下のように作製した。
（２－４Ａ）Ｆｃ－Ｂ発現ベクターの構築
ヒト軽鎖分泌シグナルとヒトＦｃ領域を結合したＦｃ－Ｂのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片（配列番号１４）を合成した。工程（２－２Ａ）と同様の方法で、Ｆｃ－Ｂ発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＣＭＡ／Ｆｃ－Ｂ」と命名した。Ｆｃ－Ｂのアミノ酸配列を配列番号１５のアミノ酸番号２１～２４３（アミノ酸番号１～２０はシグナル配列）に示した。
（２－４Ｂ）Ｆｃ－Ｂの生産
ｐＣＭＡ／Ｆｃ－Ｂを用いて、実施例（２－２Ｃ）と同様の方法でＦｃ－Ｂを部分抗体分子として含む培養上清を得た。
（２－４Ｃ）Ｆｃ－Ｂの精製
工程（２－４Ｂ）で得られた培養上清からＦｃ断片を、組み換えＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィー（４－６℃下）とセラミックハイドロキシアパタイト（室温下）の２段階工程で精製した。組み換えＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィー精製後とセラミックハイドロキシアパタイト精製後のバッファー置換工程は４－６℃下で実施した。最初に、培養上清を、ＰＢＳで平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、ＨｉＴｒａｐカラム）にアプライした。培養上清がカラムに全て入ったのち、カラム容量２倍以上のＰＢＳでカラムを洗浄した。次に２Ｍアルギニン塩酸塩溶液（ｐＨ４．０）で溶出し、Ｆｃ断片の含まれる画分を集めた。その画分を透析（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ　Ｄｉａｌｙｓｉｓ　Ｃａｓｓｅｔｔｅ）によりＰＢＳに置換した後、５ｍＭ　りん酸ナトリウム／５０ｍＭ　ＭＥＳ／ｐＨ７．０のバッファーで５倍希釈したＦＣ断片溶液を、５ｍＭ　ＮａＰｉ／５０ｍＭ　ＭＥＳ／３０ｍＭ　ＮａＣｌ／ｐＨ７．０のバッファーで平衡化されたセラミックハイドロキシアパタイトカラム（日本バイオラッド、Ｂｉｏ－Ｓｃａｌｅ　ＣＨＴ Ｔｙｐｅ－ｌ　Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ　Ｃｏｌｕｍｎ）にアプライした。０から２Ｍ塩化ナトリウムによる直線的濃度勾配溶出を実施し、Ｆｃ－Ｂの含まれる画分を集めた。その画分を透析（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ　Ｄｉａｌｙｓｉｓ　Ｃａｓｓｅｔｔｅ）によりＨＢＳｏｒ（２５ｍＭ ヒスチジン／５％ ソルビトール、ｐＨ６．０）への液置換を行った。最後にＣｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ　ＵＦ　Ｆｉｌｔｅｒ　Ｄｅｖｉｃｅ　ＶＩＶＡＳＰＩＮ２０（分画分子量ＵＦ１０Ｋ，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社，４℃下）にて濃縮し、濃度を１０ｍｇ／ｍｌに調製し、精製Ｆｃ－Ｂサンプルとした。
＜実施例２－５＞Ｆｃ－Ａ（ＬＡＬＡ体）の調製
　キャリア用分子として、Ｆｃ－ＢのＬＡＬＡ体であり、Ｎ末端が延長された、Ｆｃ－Ａを以下のように作製した。
　（２－５Ａ）Ｆｃ－Ａ発現ベクターの構築
ｐＣＭＡ／Ｆｃ－Ｂをテンプレートとし、下記プライマーセット（ＦｃＬＡＬＡ－Ｆ及びＦｃ０５－Ｒ）とＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて、配列番号１５のアミノ酸番号３０－３１のＬｅｕ－Ｌｅｕ（Ｅｕ番号でLeu234 - Lue235に相当）をＡｌａ－Ａｌａに置換させ、且つ、Ｎ末端に４アミノ酸（ＤＫＴＨ）を付加する変異を導入することによりＦｃ－Ａ発現ベクターを構築した。構築した発現ベクターを「ｐＣＭＡ／Ｆｃ－Ａ」と命名した。Ｆｃ－ＡをコードするＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号１６のヌクレオチド番号６１～７４１（ヌクレオチド番号１～６０はシグナル配列）に示し、アミノ酸配列を配列番号１７のアミノ酸番号２１～２４７（アミノ酸番号１～２０はシグナル配列）に示した。
プライマーセット
ＦｃＬＡＬＡ－Ｆ；５’－ＴＧＴＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＡＧＧＣＣＧＣＧＧＧＣＧＧＡＣＣＴＡＧＣＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＣ－３’（配列番号１８）
Ｆｃ０５－Ｒ；５’－ＴＧＧＡＧＧＡＣＡＧＧＴＧＴＧＡＧＴＴＴＴＧＴＣＧＣＣＧＴＡＧＧＣＧＣＣＧＣＴＧＡＴＣＣＡＣＡＧＣＡＧ－３’（配列番号１９）
（２－５Ｂ）Ｆｃ－Ａの生産及び精製
ｐＣＭＡ／Ｆｃ－Ａを用いて、工程（２－２Ｃ）と同様の方法でＦｃ－Ａを部分抗体分子として含む培養上清を得た。得られた培養上清から実施例２－４Ｃと同様の方法で精製し、Ｆｃ－Ａ精製サンプルとした。
［実施例３］コンジュゲートの作製
　本実施例で製造された各コンジュゲート体には、その構造的特徴を表示する名称を付した。当該名称は、原則として上記の明細書に定義した命名法を採用するが、完全な構造は図や構造式を参照して特定される。PEGリンカーにおいて、「//」はアジド基とDBCOの反応により形成される1,2,3-トリアゾール環を表し、「－」はアミド結合を表す。
＜実施例３－１＞mAb-A-[PEG(3)//PEG(12)2-hANP(1-28)]4(化合物3-1)の合成
（３－１Ａ）(Fucα1,6)GlcNAc-mAb-Aの調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000066
 実施例２－１で調整したｍＡｂ－Ａ溶液19.4mg/ml (5%ソルビトール／25mMヒスチジン溶液(pH6.0))(26.0ml)をアミコンウルトラ(ウルトラセル30K、 Merck Millipore製)を用いて50mM りん酸緩衝液(pH6.0)へ緩衝液交換を行った。得られた24.5mg/ml mAb1溶液 (50mMりん酸緩衝液(pH6.0))(20.0ml)に2.00mg/ml 野生型EndoS溶液(PBS)(1.26ml)を加えて、37℃で3時間インキュベートした。反応の進行具合をExperion電気泳動ステーション(BIO-RAD製)を用いて確認した。反応終了後、以下の方法に従い、アフィニティークロマトグラフィーによる精製とハイドロキシアパタイトカラムによる精製を行った。
（１）アフィニティークロマトグラフィーによる精製
精製装置：AKTA pure150(GE ヘルスケア製)
カラム：HiTrap rProtein A FF (5ml)(GE ヘルスケア製)
流速：5ml/min(チャージ時は1.25ml/min)
上記で得た反応液を5回に分けて精製した。カラムへの結合時は、反応液をカラム上部へ添加し、結合バッファー(20mMりん酸緩衝液(pH7.0))を1.25ml/minで2CV流し、更に5ml/minで5CV流した。中間洗浄時は、洗浄溶液(20mM りん酸緩衝液(pH7.0)、0.5M 塩化ナトリウム溶液)を15CV流した。溶出時は、溶出バッファー(ImmunoPure IgG Eution buffer、PIERCE製)を6CV流した。溶出液を1M トリス緩衝液(pH9.0)で直ちに中和した。溶出中にＵＶ検出(280nm)されたフラクションについて、微量分光光度計Xpose(Trinean製)、及びExperion電気泳動ステーション(BIO-RAD製)を用いて確認した。
目的物を含むフラクションをアミコンウルトラ(ウルトラセル30K、 Merck Millipore製)を用いて濃縮し、緩衝液(5mM りん酸緩衝液、50mM 2-モルホリノエタンスルホン酸(MES)溶液(pH6.8))交換を行った。
　（２）ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーによる精製
精製装置：AKTA pure150(GE ヘルスケア製)
カラム：Bio-Scale Mini CHT Type Iカートリッジ(5ml)(BIO-RAD製)
流速：5ml/min(チャージ時は1.25ml/min)
カラムを2連結し、上記（１）で得られた溶液を2回に分けて精製した。溶液をカラムの上部へ添加し、Ａ液(5mM りん酸緩衝液、50mM 2-モルホリノエタンスルホン酸(MES)溶液(pH6.8))を1.25ml/minで2CV流し、更に5ml/minで3CV流した。その後、Ａ液とＢ液(5mM りん酸緩衝液、50mM 2-モルホリノエタンスルホン酸(MES)溶液(pH6.8)、2M塩化ナトリウム溶液)を用いて、溶出した。溶出条件は、Ａ液：Ｂ液 = 100:0 ～ 0:100 (15CV)である。さらに、洗浄溶液(500mMりん酸緩衝液(pH6.5))を5CV流した。
溶出中にＵＶ検出(280nm)されたフラクションについて、微量分光光度計Xpose(Trinean製)、及びExperion電気泳動ステーション(BIO-RAD製)を用いて確認した。
目的物を含むフラクションをアミコンウルトラ(ウルトラセル30K、 Merck Millipore製)を用いて濃縮し、50mM りん酸緩衝液(pH6.0)へ緩衝液交換を行い、23.7mg/ml (Fucα1,6)GlcNAc-mAb-A溶液(50 mMりん酸緩衝液(pH6.0))(19.9ml)が得られた。
ESI-MS:
calculated for the heavy chain of (Fucα1, 6)GlcNAc-mAb-A (-Lys, pyrGlu), M = 50166.6 found(m/z), 50165.3 (deconvolution data). 
calculated for the light chain of (Fucα1, 6)GlcNAc-mAb-A, M = 23292.9 found(m/z), 23292.0 (deconvolution data).
（３－１Ｂ）mAb-A-[PEG(3)-N3]4の調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000067
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000068
 （上記式は、ＳＧ型Ｎ２９７糖鎖の非還元末端シアル酸にアジド基が導入されたリンカー構造を示す。実施例３において、Ｎ２９７糖鎖にアジド基を導入した中間体のリンカー構造は全て上記式と同一の構造である。）
工程（３－１Ａ）で得られた23.7mg/ml (Fucα1,6)GlcNAc-mAb-A溶液 (50mMりん酸緩衝液(pH6.0))(8.90ml)に50mMりん酸緩衝液(pH6.0)(1.65ml)、実施例１－１０で合成した[N3-PEG(3)]2-SG(10)-Ox (33.8mg) 50mMりん酸緩衝液(pH6.0)溶液(0.676ml)、2.10mg/ml EndoS D233Q/Q303L溶液(PBS)(1.98ml)を加えて、30℃で3.5時間インキュベートした。以上の操作を2ロット分行った。反応の進行具合をExperion電気泳動ステーション(BIO-RAD製)を用いて確認した。反応終了後、アフィニティークロマトグラフィーによる精製時の結合バッファーを20mMりん酸緩衝液(pH7.0)から20mMりん酸緩衝液(pH6.0)に変えて、工程（３－１Ａ）と同様の方法に従い、アフィニティークロマトグラフィーによる精製とハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーによる精製を行った後、目的物を含むフラクションをアミコンウルトラ(ウルトラセル30K、 Merck Millipore製)を用いて濃縮、続いて20mM りん酸緩衝液(pH6.0)へ緩衝液交換を行い、20.5mg/ml mAb-A-[PEG(3)-N3]4溶液(20mMりん酸緩衝液(pH6.0))(19.0ml)が得られた。
ESI-MS:
calculated for the heavy chain of mAb-A-[PEG(3)-N3]4(-Lys, pyrGlu), M = 52569.9 found(m/z), 52569.4 (deconvolution data). 
calculated for the light chain of mAb-A-[PEG(3)-N3]4, M = 23292.9 found(m/z), 23292.1 (deconvolution data).
（３－１Ｃ）mAb-A-[PEG(3)//PEG(12) 2-hANP(1-28)]4（下記式の目的化合物、化合物3-1）の調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000069
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000070
 （上記式は、化合物3-1における、Ｎ２９７糖鎖のシアル酸、ＰＥＧリンカー及びhANPペプチドの構造を示す。式中、Click反応で形成されるトリアゾール環は幾何異性を有し、化合物3-1は上記式の左右の構造からなるリンカーを混合して保持する。化合物3-1には、全てのＮ２９７糖鎖の非還元末端シアル酸が上記式のリンカーにより修飾されているため、コンジュゲート１分子当たり４つのhANP(1-28)が連結されている。）
工程（３－１Ｂ）で得られた20.5mg/ml mAb-A-[PEG(3)-N3]4溶液 (20mMりん酸緩衝液(pH6.0))(2.44ml)に20mMりん酸緩衝液(pH6.0)(1.56ml)、ジメチルスルホキシド(0.736ml)、実施例１－１で合成したDBCO-PEG(12)2-hANP(1-28) (12.9mg)ジメチルスルホキシド溶液 (0.264ml)をDBCO化合物として加えて、30℃で16時間インキュベートした（Click反応）。反応液をNAP25(GE ヘルスケア製)、20mMりん酸緩衝液(pH6.0)で粗精製した。反応の進行具合を、下記の条件による疎水性相互作用クロマトグラフィーで確認後、下記のアフィニティークロマトグラフィーによる精製を行った。
　（１）疎水性相互作用クロマトグラフィーによる分析条件
分析装置：日立D-7000 (日立製)
カラム：TSKgel Butyl-NPR (4.6x100mm)(東ソー製)
移動層：A液 20mM りん酸緩衝液(pH7.0)、2M 硫酸アンモニウム溶液
B液 20mM りん酸緩衝液(pH7.0)
グラジェント：A:B=75:25～0:100(0～25分)-0:100(25～30分)
温度：25℃
波長：214nm
流速：1ml/min
（２）アフィニティークロマトグラフィーによる精製
精製装置：AKTA pure150(GE ヘルスケア製)
カラム：HiTrap rProtein A FF (5ml)(GE ヘルスケア製)
流速：5ml/min(チャージ時は1.25ml/min)
カラムへの結合時は、上記で得た反応液をカラム上部へ添加し、結合バッファー(20mMりん酸緩衝液(pH6.0))を1.25ml/minで2CV流し、更に5ml/minで5CV流した。中間洗浄時は、洗浄溶液(20mM りん酸緩衝液(pH7.0)、0.5M 塩化ナトリウム溶液)を10CV流した。溶出時は、溶出バッファー(ImmunoPure IgG Elution buffer、PIERCE製)を6CV流した。溶出液を1M トリス緩衝液(pH9.0)で直ちに中和した。溶出中にＵＶ検出(280nm)されたフラクションについて、微量分光光度計Xpose(Trinean製)、及び疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いて確認した。
目的物を含むフラクションをアミコンウルトラ(ウルトラセル30K、 Merck Millipore製)を用いて濃縮し、5%ソルビトール／10mM 酢酸緩衝液(pH5.5)へ緩衝液交換を行い、フィルター(Millex-GV、0.22μm、PVDF、滅菌済、Merck Millipore製)でろ過し、19.4mg/ml mAb-A-[PEG(3)//PEG(12)2-hANP]4溶液(5%ソルビトール／10mM 酢酸緩衝液(pH5.5))(2.14ml)が得られた。
ESI-MS:
calculated for the heavy chain of mAb-A-[PEG(3)//PEG(12)2-hANP]4 (-Lys, pyr-Glu), M = 61708.2 found(m/z), 61706.4 (deconvolution data). 
calculated for the light chain of mAb-A-[PEG(3)//PEG(12)2-hANP]4, M = 23292.9 found(m/z), 23291.7 (deconvolution data).
＜実施例３－２＞mAb-A-[PEG(3)//PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP(1-28)]4(下記式の目的化合物、化合物3-2)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000071
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000072
 （上記式は、化合物3-2における、Ｎ２９７糖鎖のシアル酸、ＰＥＧリンカー及びhANPペプチドの構造を示す。式中、Click反応で形成されるトリアゾール環は幾何異性を有し、化合物3-２は上記式の左右の構造からなるリンカーを混合して保持する。化合物3-2には、全てのＮ２９７糖鎖の非還元末端シアル酸が上記式のリンカーにより修飾されているため、コンジュゲート１分子当たり４つのhANP(1-28)が連結されている。）
工程（３－１Ｂ）で得られた20.5mg/ml mAb-A-[PEG(3)-N3]4溶液 (20mMりん酸緩衝液(pH6.0))(5.51ml)、20mMりん酸緩衝液(pH6.0)(2.49ml)、ジメチルスルホキシド(1.40ml)、工程（１－２Ｆ）で合成したDBCO-PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP(1-28) (43.1mg)ジメチルスルホキシド溶液 (0.596ml)を用いて、30℃で16時間インキュベートした。以上の操作を2ロット分行った。以下工程（３－１Ｃ）と同様の方法で21.6mg/ml mAb-A-[PEG(3)//PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP(1-28)]4溶液(5%ソルビトール／10 mM 酢酸緩衝液(pH5.5))(10.2ml)が得られた。
ESI-MS:
calculated for the heavy chain of mAb-A-[PEG(3)//PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP]4(-Lys, pyrGlu), M = 66348.4 found(m/z), 66347.5 (deconvolution data). 
calculated for the light chain of mAb-A-[PEG(3)//PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP]4, M =23292.9  found(m/z), 23291.9 (deconvolution data).
＜実施例３－３＞CLCH-A-[PEG(3)//PEG(12)2-hANP(1-28)]4(化合物3-3)の合成
（3-3A）(Fucα1,6)GlcNAc-CLCH-Aの調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000073
 実施例２－２で調整した21.6mg/ml ＣＬＣＨ-Ａ溶液（5%ソルビトール／25 mMヒスチジン溶液(pH6.0) )(21.0ml)をアミコンウルトラ(ウルトラセル10K、 Merck Millipore製)を用いて50mM りん酸緩衝液(pH6.0)へ緩衝液交換を行った。得られた22.0mg/ml ＣＬＣＨ-Ａ溶液 (50mMりん酸緩衝液(pH6.0))(20.0ml)に2.00mg/ml 野生型EndoS溶液(PBS)(2.27ml)を加えて、37℃で6時間インキュベートした。反応の進行具合をExperion電気泳動ステーション(BIO-RAD製)を用いて確認した。反応終了後、工程（３－１Ａ）と同様の方法に従い、アフィニティークロマトグラフィーによる精製とハイドロキシアパタイトカラムによる精製を行った後、目的物を含むフラクションをアミコンウルトラ(ウルトラセル10K、 Merck Millipore製)を用いて濃縮、続いて、50mM りん酸緩衝液(pH6.0)へ緩衝液交換を行い、21.1mg/ml (Fucα1,6)GlcNAc-CLCH-A溶液(50mMりん酸緩衝液(pH6.0))(20.4ml)が得られた。
ESI-MS:
calculated for the heavy chain of (Fucα1,6)GlcNAc-CLCH-A (-Lys), M = 36386.4 found(m/z), 36386.1 (deconvolution data). 
calculated for the light chain of (Fucα1,6)GlcNAc-CLCH-A, M =11507.6 found(m/z), 11506.8 (deconvolution data).
（３－３Ｂ）CLCH-A-[PEG(3)-N3]4の調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000074
 工程（３－３Ａ）で得られた21.1mg/ml (Fucα1,6)GlcNAc-CLCH-A溶液(50mMりん酸緩衝液(pH6.0))(4.65ml)に50mMりん酸緩衝液(pH6.0)(2.66ml)、実施例１－１０で合成した[N3-PEG(3)]2-SG(10)-Ox (23.5mg) 50mMりん酸緩衝液(pH6.0) 溶液(0.470ml)、2.10mg/ml EndoS D233Q/Q303L溶液(PBS)(1.40ml)を加えて、30℃で3時間インキュベートした。さらに、（1-10B）で合成した[N3-PEG(3)]2-SG(10)-Ox (11.8mg) 50mMりん酸緩衝液(pH6.0) 溶液(0.236ml) を加えて、30℃で1時間インキュベートした。以上の操作を3ロット分行った。反応の進行具合をExperion電気泳動ステーション(BIO-RAD製)を用いて確認した。反応終了後、アフィニティーカラムによる精製時の結合バッファーを20mMりん酸緩衝液(pH7.0)から20mMりん酸緩衝液(pH6.0)に変えて、工程（３－１Ａ）と同様の方法に従い、アフィニティークロマトグラフィーによる精製とハイドロキシアパタイトカラムによる精製を行った後、目的物を含むフラクションをアミコンウルトラ(ウルトラセル10K、 Merck Millipore製)を用いて濃縮、続いて、5%ソルビトール／10mM 酢酸緩衝液(pH5.5)へ緩衝液交換を行い、19.3mg/ml CLCH-A-[PEG(3)-N3]4溶液(5%ソルビトール／10mM 酢酸緩衝液(pH5.5))(13.8ml)が得られた。
ESI-MS:
calculated for the heavy chain of CLCH-A-[PEG(3)-N3]4 (-Lys), M = 38789.6 found(m/z), 38789.4(deconvolution data). 
calculated for the light chain of CLCH-A-[PEG(3)-N3]4, M = 11507.6 found(m/z), 11506.7 (deconvolution data).
（３－３Ｃ）CLCH-A-[PEG(3)//PEG(12)2-hANP(1-28)]4 （化合物3-3）の調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000075
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000076
 （上記式は、化合物3-3における、Ｎ２９７糖鎖のシアル酸、ＰＥＧリンカー及びhANPペプチドの構造を示す。式中、Click反応で形成されるトリアゾール環は幾何異性を有し、化合物3-3は上記式の左右の構造からなるリンカーを混合して保持する。化合物3-3には、全てのＮ２９７糖鎖の非還元末端シアル酸が上記式のリンカーにより修飾されているため、コンジュゲート１分子当たり４つのhANP(1-28)が連結されている。）
工程（３－３Ｂ）で得られた19.3mg/ml CLCH-A-[PEG(3)-N3]4溶液（5%ソルビトール／10mM 酢酸緩衝液(pH5.5))(5.18ml)に5%ソルビトール／10mM 酢酸緩衝液(pH5.5) (2.82ml)、ジメチルスルホキシド(1.18ml)、実施例１－１で合成したDBCO-PEG(12)2-hANP(1-28)(40.1mg)ジメチルスルホキシド溶液 (0.816ml)を加えて、30℃で16時間インキュベートした。以上の操作を2ロット分行った。反応液をNAP25(GE ヘルスケア製)、20mMりん酸緩衝液(pH6.0)で粗精製した。反応の進行具合を下記の条件の疎水性相互作用クロマトグラフィーで確認後、下記のアフィニティークロマトグラフィーによる精製を行った。
（１）疎水性相互作用クロマトグラフィーによる分析条件
分析装置：日立D-7000 (日立製)
カラム：TSKgel Butyl-NPR (4.6x100mm)(東ソー製)
移動層：A液 20mM りん酸緩衝液(pH7.0)、2M 硫酸アンモニウム溶液
B液 20mM りん酸緩衝液(pH7.0)
グラジェント：A:B=75:25～0:100(0～25分)-0:100(25～30分)
温度：25℃
波長：214nm
流速：1ml/min
（２）アフィニティークロマトグラフィーによる精製
精製装置：AKTA pure150(GE ヘルスケア製)
カラム：HiTrap rProtein A FF (5ml)(GE ヘルスケア製)
流速：5ml/min(チャージ時は1.25ml/min)
上記で得た2ロット分の反応液を3回に分けて精製した。カラムへの結合時は、反応液をカラム上部へ添加し、結合バッファー(20mMりん酸緩衝液(pH6.0))を1.25ml/minで4CV流し、更に5ml/minで5CV流した。中間洗浄時は、洗浄溶液(20mM りん酸緩衝液(pH7.0)、0.5M 塩化ナトリウム溶液)を10CV流した。溶出時は、溶出バッファー(ImmunoPure IgG Eution buffer、PIERCE製)を6CV流した。溶出液を1M トリス緩衝液(pH9.0)で直ちに中和した。溶出中にＵＶ検出(280nm)されたフラクションについて、微量分光光度計Xpose(Trinean製)、及び疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いて確認した。
目的物を含むフラクションをアミコンウルトラ(ウルトラセル10K、 Merck Millipore製)を用いて濃縮し、5%ソルビトール／10mM 酢酸緩衝液(pH5.5)へ緩衝液交換を行い、フィルター(Millex-GV、0.22μm、PVDF、滅菌済、Merck Millipore製)でろ過し、21.3mg/ml CLCH-A-[PEG(3)//PEG(12)2-hANP(1-28)]4溶液(5%ソルビトール／10mM 酢酸緩衝液(pH5.5))(9.60ml)が得られた。
ESI-MS:
calculated for the heavy chain of CLCH-A-[PEG(3)//PEG(12)2-hANP]4 (-Lys), M = 47928.0 found(m/z), 47928.4 (deconvolution data). 
calculated for the light chain of CLCH-A-[PEG(3)//PEG(12)2-hANP]4, M = 11507.6 found(m/z), 11506.7 (deconvolution data).
＜実施例３－４＞CLCH-A-[PEG(3)//PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP(1-28)]4(下記式の目的化合物、化合物3-4)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000077
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000078
 （上記式は、化合物3-4における、Ｎ２９７糖鎖のシアル酸、ＰＥＧリンカー及びhANPペプチドの構造を示す。式中、Click反応で形成されるトリアゾール環は幾何異性を有し、化合物3-4は上記式の左右の構造からなるリンカーを混合して保持する。化合物3-4には、全てのＮ２９７糖鎖の非還元末端シアル酸が上記式のリンカーにより修飾されているため、コンジュゲート１分子当たり４つのhANP(1-28)が連結されている。）
工程（３－３Ｂ）で得られた19.3mg/ml CLCH-A-[PEG(3)-N3]4溶液（5%ソルビトール／10mM 酢酸緩衝液(pH5.5)) (2.59ml)、5%ソルビトール／10mM 酢酸緩衝液(pH5.5) (1.41ml)、ジメチルスルホキシド(0.602ml)、実施例１－２で合成したDBCO-PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP(1-28)(28.7mg)ジメチルスルホキシド溶液 (0.398ml)を用いて、30℃で16時間インキュベートした。以下工程（３－３Ｃ）と同様の方法で、20.0mg/ml CLCH-A-[PEG(3)//PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP(1-28)]4溶液（5%ソルビトール／10mM 酢酸緩衝液(pH5.5))(2.46ml)が得られた。
ESI-MS:
calculated for the heavy chain of CLCH-A-[PEG(3)//PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP]4 (-Lys), M = 52568.2 found(m/z), 52568.4(deconvolution data). 
calculated for the light chain of CLCH-A-[PEG(3)//PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP]4, M = 11507.6 found(m/z), 11506.7(deconvolution data).
＜実施例３－５＞mAb-A-[PEG(3)//PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP]2の合成(化合物3-5)
（３－５Ａ）mAb-A-[PEG(3)-N3]2の調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000079
 工程(３－１Ａ)で合成した化合物に対して、実施例１－１１で合成した[N3-PEG(3)]-MSG1(9)-Oxを糖鎖供与体として使い、30℃で3時間インキュベートし、工程（３－１Ｂ）と同様の操作を行うことで、14.1mg/ml mAb-A-[PEG(3)-N3]2溶液(20mMりん酸緩衝液(pH6.0))(5.90ml)を得た。
ESI-MS:
calculated for the heavy chain of mAb-A-[PEG(3)-N3]2 (-Lys, pyrGlu), M = 52078.4 found(m/z), 52077.0(deconvolution data). 
calculated for the light chain of mAb-A-[PEG(3)-N3]2, M = 23292.9 found(m/z), 23291.7 (deconvolution data).
（３－５Ｂ）mAb-A-[PEG(3)//PEG(12) 2-(SG-)Asn-hANP(1-28)]2（下記式の目的化合物、化合物3-5）の調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000080
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000081
 （上記の構造式は、化合物3-5における、Ｎ２９７糖鎖のシアル酸、ＰＥＧリンカー及びhANPペプチドの構造を示す式中、Click反応で形成されるトリアゾール環は幾何異性を有し、化合物3-５は上記式の左右の構造からなるリンカーを混合して保持する。化合物3-５には、全てのＮ２９７糖鎖の非還元末端シアル酸が上記式のリンカーにより修飾されているため、コンジュゲート１分子当たり２つのhANP(1-28)が連結されている。）
。）
工程(３－５Ａ)で合成した化合物に対して、実施例１－２で合成したDBCO-PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP(1-28) 4当量を用いて、実施例３－２と同様の操作を行うことで、17.9mg/ml mAb-A-[PEG(3)//PEG(12) 2-hANP(1-28)]2溶液（5%ソルビトール／10 mM 酢酸緩衝液(pH5.5)) (2.55ml)を得た。
ESI-MS:
calculated for the heavy chain of mAb-A-[PEG(3)//PEG(12) 2-hANP]2(-Lys, pyrGlu), M = 58967.7 found(m/z), 58968.1 (deconvolution data). 
calculated for the light chain of mAb-A-[PEG(3)//PEG(12) 2-hANP]2, M = 23292.9 found(m/z), 23291.8 (deconvolution data).
＜実施例３－６＞CLCH-A-[PEG(3)//PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP(1-28)]2(化合物3-6)の合成
（３－６Ａ）CLCH-A-[PEG(3)-N3]2の調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000082
 工程（３－３Ａ）で合成した化合物に対して、実施例１－１１で合成した[N3-PEG(3)]-MSG1(9)-Oxを糖鎖供与体として使い、30℃で3時間インキュベートし、（3-3B）と同様の操作を行うことで、14.6mg/ml CLCH-A-[PEG(3)-N3]2溶液（5%ソルビトール／10 mM 酢酸緩衝液(pH5.5)) (3.98ml)を得た。
ESI-MS:
calculated for the heavy chain of N3-MSG-CLCH-A(-Lys), M = 38298.1 found(m/z), 38297.7 (deconvolution data). 
calculated for the light chain of N3-MSG-CLCH-A, M =11507.6 found(m/z), 11506.8 (deconvolution data).
（３－６Ｂ）CLCH-A- [PEG(3)//PEG(12) 2-(SG-)Asn-ANP(1-28)]2の調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000083
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000084
 （上記式は、化合物3-6における、Ｎ２９７糖鎖のシアル酸、ＰＥＧリンカー及びhANPペプチドの構造を示す。式中、Click反応で形成されるトリアゾール環は幾何異性を有し、化合物3-6は上記式の左右の構造からなるリンカーを混合して保持する。化合物3-6には、全てのＮ２９７糖鎖の非還元末端シアル酸が上記式のリンカーにより修飾されているため、コンジュゲート１分子当たり２つのhANP(1-28)が連結されている。）
　工程（３－６Ａ）で合成した化合物に対して、実施例１－２で合成したDBCO-PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP(1-28) 4当量を用いて、実施例３－４と同様の操作を行うことで、19.2mg/ml CLCH-A-[PEG(3)//PEG(12) 2-(SG-)Asn-ANP(1-28)]2溶液（5%ソルビトール／10 mM 酢酸緩衝液(pH5.5)) (2.62ml)を得た。
ESI-MS:
calculated for the heavy chain of CLCH-A- [PEG(3)//PEG(12) 2-(SG-)Asn-ANP]2 (-Lys), M = 45187.4 found(m/z), 45188.0 (deconvolution data). 
calculated for the light chain of CLCH-A- [PEG(3)//PEG(12) 2-(SG-)Asn-ANP]2, M =11507.6 found(m/z), 11506.8 (deconvolution data).
＜実施例３－７＞多様なリンカー構造を有するコンジュゲート(化合物3-7～化合物3-14)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000085
 あるモノクローナル抗体(mAb-B)に対して、実施例３－１に記載された方法を用いることで、 mAb-B-[PEG(3)-N3]4を合成した。続いて、Ckick反応に用いるDBCO化合物として、実施例１で合成した化合物1-1、化合物1-3、化合物1-4、化合物1-5、化合物1-6、化合物1-7、化合物1-8及び化合物1-9）を使い分けることで、PEGリンカー部分の構造が異なるmAb-B-[L(PEG)-hANP(1-28)]4を合成した。用いたDBCO化合物と目的とするコンジュゲートの構造の対応を表１に示す（各化合物に対応するL(PEG)は、化合物３－７：L(PEG) B、化合物３－８：L(PEG)E、化合物３－９：L(PEG)A 、化合物３－１０：L(PEG)D、化合物３－１１：L(PEG)C、化合物３－１２：L(PEG)F、化合物３－１３：L(PEG)G、化合物３－１４：L(PEG)H）。化合物3-1～3-6と同様に、いずれの化合物においても、Click反応で形成されるトリアゾール環は幾何異性を有し、幾何異性構造を有するリンカーを混合して保持する。また、コンジュゲート１分子当たり４つのhANP(1-28)が連結されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000086
＜実施例３－８＞CLCH-B-[PEG(3)//PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP(1-28)]4(上記化合物３－２の構造において、CLCH-AがCLCH-Bに置き換えられた目的化合物、化合物3-15)の合成
　本実施例の各工程の反応スキーム及び物質の構造は、実施例３－２の対応するスキームにおいてCLCH-AをCLCH-Bに置き換えたものである。
（３－８Ａ）(Fucα1,6)GlcNAc-CLCH-Bの調製
工程（３－３Ａ）に記載したＣＬＣＨ-Ａ溶液の部分を、実施例２－３で調整した20.6mg/mLのＣＬＣＨ-Ｂ溶液（5%ソルビトール／25 mMヒスチジン溶液(pH6.0))に置き換え、工程（３－３Ａ）に記載された方法に準じて、19.8mg/ml(Fucα1,6)GlcNAc-CLCH-B溶液(50mMりん酸緩衝液(pH6.0))(16ml)が得られた。
ESI-MS:
calculated for the heavy chain of (Fucα1,6)GlcNAc-CLCH-B(-Lys), M = 36303.1; found 36302.6(deconvolution data).
calculated for the light chain of (Fucα1,6)GlcNAc-CLCH-B, M = 11507.8; found 11506.7(deconvolution data).
（３－８Ｂ）CLCH-B-[PEG(3)-N3]4の調製
工程（３－３Ｂ）に記載した(Fucα1,6)GlcNAc-CLCH-A溶液の部分を、工程（３－８Ａ）で得られた19.8mg/ml (Fucα1,6)GlcNAc-CLCH-B溶液(50mMりん酸緩衝液(pH6.0)) に置き換え、工程（３－３Ｂ）に記載された方法に準じて、19.3mg/ml CLCH-B-[PEG(3)-N3]4溶液（5%ソルビトール／10mM 酢酸緩衝液(pH5.5))(15.7ml)が得られた。
ESI-MS:
calculated for the heavy chain of CLCH-B-[PEG(3)-N3]4 (-Lys), M = 38706.3; found 38704.7(deconvolution data).
calculated for the light chain of CLCH-B-[PEG(3)-N3]4, M = 11507.8; found 11506.8(deconvolution data).
（３－８Ｃ）CLCH-B-[PEG(3)//PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP(1-28)]4 （化合物3-15）の調製
工程（３－８Ｂ）で得られた19.3mg/ml CLCH-B-[PEG(3)-N3]4溶液（5%ソルビトール／10mM 酢酸緩衝液(pH5.5) ) (3.90ml)、5%ソルビトール／10mM 酢酸緩衝液(pH5.5) (4.1ml)、ジメチルスルホキシド(1.4ml)及び実施例１－２で合成したDBCO-PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP(1-28)(43.4mg)ジメチルスルホキシド溶液 (0.6ml)を混合して、30℃で16時間インキュベートした。上記操作を4ロット実施した。以下工程（３－３Ｃ）と同様の方法で、27.1mg/ml CLCH-B-[PEG(3)//PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP(1-28)]4溶液(5%ソルビトール／10mM 酢酸緩衝液(pH5.5))(11.5ml)が得られた。
ESI-MS:
calculated for the heavy chain of CLCH-B-[PEG(3)//PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP]4(-Lys), M = 52484.9; found 52484.4(deconvolution data).
calculated for the light chain of CLCH-B-[PEG(3)//PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP]4, M = 11507.8; found 11506.7(deconvolution data).
＜実施例３－９＞Fc-A-[PEG(3)//PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP(1-28)]4(下記式の目的化合物、化合物3-16)の合成
（３－９Ａ）(Fucα1,6)GlcNAc-Fc-Aの調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000087
 （上記式は、調製されたキャリアタンパクに糖鎖構造欠損体が含まれることに由来する混合物を表している。n=1の他に、n=0が含まれていてもよい。）
実施例２－５で調製したFc-A溶液10.4mg/ml (5%ソルビトール／25mMヒスチジン溶液(pH6.0) )(80.0ml)をVIVASPIN 20 (10,000MWCO、Sartorius製)を用いて50mM りん酸緩衝液(pH6.0)へ緩衝液交換を行い、約50mLとした。得られたFc-A溶液(50mMりん酸緩衝液(pH6.0))を２本のビオラモ遠沈管(VIO-50B)にわけ、7.70mg/ml 野生型EndoS溶液(PBS)(0.8ml)を加えて、37℃で2時間インキュベートした。反応の進行具合をExperion電気泳動ステーション(BIO-RAD製)を用いて確認した。反応終了後、以下の方法に従い、アフィニティークロマトグラフィーによる精製とハイドロキシアパタイトカラムによる精製を行った。
（１）アフィニティークロマトグラフィーによる精製
精製装置：AKTA pure150(GE ヘルスケア製)
カラム：MediaScout ValiChrom 25mm ID x 100mm H; V=50.0mL
担体：KANEKA KanCapA
流速：40mL/min （サンプル添加時は10mL/min）
上記で得た反応液(x2本)を0.45um PVDFフィルターでろ過し、約40mL(x2)とし、2回に分けて精製した。カラムへの結合時は、反応液をカラム上部へ添加し、結合バッファー(20mMりん酸緩衝液(pH7.0))を10ml/minで4.4CV流し、更に40ml/minで5CV流した。中間洗浄時は、洗浄溶液(20mM りん酸緩衝液(pH7.0)、0.5M 塩化ナトリウム溶液)を10CV流した。溶出時は、溶出バッファー(ImmunoPure IgG Elution buffer、PIERCE製)を6CV流した。溶出液を1M トリス緩衝液(pH9.0)で直ちに中和した。溶出中にＵＶ検出(280nm)されたフラクションについて、必要に応じて、微量分光光度計Xpose(Trinean製)、及びExperion電気泳動ステーション(BIO-RAD製)を用いて確認した。目的物を含むフラクションをVIVASPIN 20 (10,000MWCO、Sartorius製)を用いて濃縮し、緩衝液(5mM りん酸緩衝液、50mM 2-モルホリノエタンスルホン酸(MES)溶液(pH7.0))交換した。
　（２）ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーによる精製
精製装置：AKTA pure150(GE ヘルスケア製)
カラム：MediaScout ValiChrom 25mm ID x 100mm H; V=50.0mL
担体：BIO-RAD CHT Type I 40um
流速：20mL/min （サンプル添加時は10mL/min）
　上記(1)で得られた溶液を0.45um PVDFフィルターでろ過し、約40mLずつ２つに分けた。これらを以下の工程により、2回に分けて精製した。溶液をカラムの上部へ添加し、Ａ液(5mM りん酸緩衝液、50mM 2-モルホリノエタンスルホン酸(MES)溶液(pH7.0))を10ml/minで4.2CV流し、更に20ml/minで2CV流した。その後、Ａ液とＢ液(5mM りん酸緩衝液、50mM 2-モルホリノエタンスルホン酸(MES)溶液(pH7.0)、2M塩化ナトリウム溶液)を用いて、溶出した。溶出条件は、Ａ液：Ｂ液 = 100:0 ～ 0:100 (15CV)である。さらに、洗浄溶液(500mMりん酸緩衝液(pH6.5))を5CV流した。
溶出中にＵＶ検出(280nm)されたフラクションについて、必要に応じて微量分光光度計Xpose(Trinean製)、及びExperion電気泳動ステーション(BIO-RAD製)を用いて確認した。
目的物を含むフラクションをVIVASPIN 20 (10,000MWCO、Sartorius製)を用いて濃縮し、50mM りん酸緩衝液(pH6.0)へ緩衝液交換を行い、得られた溶液を24mL ずつ4つの容器に分け、、以下の溶液a～ｄとした。
溶液a：7.24mg/mL(Fucα1,6)GlcNAc-Fc-A溶液(50 mMりん酸緩衝液(pH6.0))(24ml)（173.8mg)
溶液ｂ：7.42mg/mL(Fucα1,6)GlcNAc-Fc-A溶液(50 mMりん酸緩衝液(pH6.0))(24ml) (178.1mg)
溶液ｃ：7.18mg/mL(Fucα1,6)GlcNAc-Fc-A溶液(50 mMりん酸緩衝液(pH6.0))(24ml) (172.3mg)
溶液ｄ：7.19mg/mL(Fucα1,6)GlcNAc-Fc-A溶液(50 mMりん酸緩衝液(pH6.0))(24ml) (172.6mg)
ESI-MS:
calculated for the chain of (Fucα1,6)GlcNAc-Fc-A(-Lys), M = 25685.0, found 25681.9 (deconvolution data).
（３－９Ｂ）Fc-A-[PEG(3)-N3]4の調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000088
 （上記式は、調製されたキャリアタンパクに糖鎖構造欠損体が含まれることに由来する混合物を表している。n=1の他に、n=0が含まれていてもよい。）
工程（３－８Ａ）で得られた４つの(Fucα1,6)GlcNAc-Fc-A溶液 (50mMりん酸緩衝液(pH6.0))(24ml)をそれぞれ２つにわけ、計8本の50mL 遠沈管に分けた。
1本の(Fucα1,6)GlcNAc-Fc-A溶液(50mMりん酸緩衝液(pH6.0))(12ml)に、50mMりん酸緩衝液(pH6.0)(1.65ml)、実施例１－１０で合成した[N3-PEG(3)]2-SG(10)-Ox (56.0mg) 50mMりん酸緩衝液(pH6.0)溶液(1.0ml)及び4.3mg/ml EndoS D233Q/Q303L溶液(PBS)(1.16ml)を加えて、30℃で4時間インキュベートした。以上の操作を8ロット分行った。反応の進行具合をExperion電気泳動ステーション(BIO-RAD製)を用いて確認した。反応終了後、アフィニティークロマトグラフィーによる精製時の結合バッファーを20mMりん酸緩衝液(pH7.0)から20mMりん酸緩衝液(pH6.0)に変えて、工程（３－９Ａ）と同様の方法に従い、アフィニティークロマトグラフィーによる精製とハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーによる精製を行った。目的物を含むフラクションを全てまとめた後、限外ろ過膜（Pellicon XL50 Cassette Ultracel 10kDa (2個使用）)を装着した限外ろ過装置(CogentμScale TFF System)を使用して、約100mLに濃縮した。VIVASPIN 20 (10,000MWCO、Sartorius製)を用いて5%ソルビトール／10mM 酢酸緩衝液(pH5.5)へ緩衝液交換を行い、得られた溶液を２つの容器に分け、以下の溶液ａ及び溶液ｂを得た。
溶液ａ：12.45mg/mL Fc-A-[PEG(3)-N3]4溶液（5%ソルビトール／10mM 酢酸緩衝液(pH5.5))(19.7ml)（245.3mg)
溶液ｂ：14.95mg/mL Fc-A-[PEG(3)-N3]4溶液(5%ソルビトール／10mM 酢酸緩衝液(pH5.5)) (19.5ml) (291.5mg)
ESI-MS:
calculated for the chain of Fc-A-[PEG(3)-N3]4 (-Lys), M = 28088.3; found 28086.4(deconvolution data).
（３－９Ｃ）Fc-A-[PEG(3)//PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP(1-28)]4 （化合物3-16）の調製
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000089
 （上記式は、調製されたキャリアタンパクに糖鎖構造欠損体が含まれることに由来する混合物を表している。n=1の他に、n=0が含まれていてもよい。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000090
 （上記式は、化合物3-16における、Ｎ２９７糖鎖のシアル酸、ＰＥＧリンカー及びhANPペプチドの構造を示す。式中、Click反応で形成されるトリアゾール環は幾何異性を有し、化合物3-16は上記式の左右の構造からなるリンカーを混合して保持する。化合物3-16には、全てのＮ２９７糖鎖の非還元末端シアル酸が上記式のリンカーにより修飾されているため、コンジュゲート１分子当たり、通常体Fc-Aでは４つのhANP(1-28)、糖鎖欠損体Fc-Aでは2つのhANP(1-28)が連結されている。）
工程（３－９Ｂ）で調製した溶液aである12.45mg/mL Fc-A-[PEG(3)-N3]4溶液(5%ソルビトール／10mM 酢酸緩衝液(pH5.5))(4.0ml)、5%ソルビトール／10mM 酢酸緩衝液(pH5.5) (6.0ml)、ジメチルスルホキシド(1.9ml)、及び、実施例１－２で合成したDBCO-PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP(1-28)(45.1mg)ジメチルスルホキシド溶液 (0.62ml)を混合して、30℃で16時間インキュベートした。上記操作を溶液aについて4ロット実施した。また、工程（３－９Ｂ）で調製した溶液ｂである14.95mg/mL Fc-A-[PEG(3)-N3]4溶液(5%ソルビトール／10mM 酢酸緩衝液(pH5.5))(3.3ml)、5%ソルビトール／10mM 酢酸緩衝液(pH5.5) (6.7ml)、ジメチルスルホキシド(1.9ml)、及び、実施例１－２で合成したDBCO-PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP(1-28)(45.1mg)ジメチルスルホキシド溶液 (0.62ml)を混合して、30℃で16時間インキュベートした。上記操作を溶液ｂについて4ロット実施した。このようにして得られた計８ロット分の反応液をNAP25(GE ヘルスケア製)、20mMりん酸緩衝液(pH6.0)で粗精製した。反応の進行具合を下記の条件の疎水性相互作用クロマトグラフィーで確認後、下記のアフィニティークロマトグラフィーによる精製を行った。
（１）疎水性相互作用クロマトグラフィーによる分析条件
分析装置：日立D-7000 (日立製)
カラム：TSKgel Butyl-NPR (4.6x100mm)(東ソー製)
移動層：A液 20mM りん酸緩衝液(pH7.0)、2M 硫酸アンモニウム溶液
B液 20mM りん酸緩衝液(pH7.0)
グラジェント：A:B=75:25～0:100(0～25分)-0:100(25～30分)
温度：25℃
波長：214nm
流速：1ml/min
（２）アフィニティークロマトグラフィーによる精製
精製装置：AKTA pure150(GE ヘルスケア製)
カラム：MediaScout ValiChrom 25mm ID x 100mm H; V=50.0mL
担体：KANEKA KanCapA
流速：40mL/min （サンプル添加時は10mL/min）
上記で得られた溶液を0.45um PVDFフィルターでろ過し、約80mLずつ２つに分け、以下の操作により、2回に分けて精製した。カラムへの結合時は、反応液をカラム上部へ添加し、結合バッファー(20mMりん酸緩衝液(pH6.0))を10ml/minで5CV流し、更に40ml/minで5CV流した。中間洗浄時は、洗浄溶液(20mM りん酸緩衝液(pH7.0)、0.5M 塩化ナトリウム溶液)を10CV流した。溶出時は、溶出バッファー(ImmunoPure IgG Elution buffer、PIERCE製)を6CV流した。溶出液を1M トリス緩衝液(pH9.0)で直ちに中和した。溶出中にＵＶ検出(280nm)されたフラクションについて、必要に応じて微量分光光度計Xpose(Trinean製)、及び疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いて確認した。
目的物を含むフラクションを2回分全てまとめた後、限外ろ過膜（Pellicon XL50 Cassette Ultracel 10kDa (2個使用）)を装着した限外ろ過装置(CogentμScale TFF System)を使用して、約40mLに濃縮した後に、5%ソルビトール／10mM 酢酸緩衝液(pH5.5)へ緩衝液交換した。最後に、フィルター(Millex-GV、0.22μm、PVDF、滅菌済、Merck Millipore製)でろ過し、7.81mg/ml Fc-A-[PEG(3)//PEG(12)2-hANP(1-28)]4溶液(5%ソルビトール／10mM 酢酸緩衝液(pH5.5))(56ml)が得られた。
calculated for the chain of Fc-A-[PEG(3)//PEG(12)2-hANP(1-28)]4 (-Lys), M = 41866.8; found 41863.8 (deconvolution data).
以下に、コンジュゲート体をフラグメント化せずに質量分析した結果を示す。
calculated for Fc-A-[PEG(3)//PEG(12)2-hANP(1-28)]4 (-Lys), M = 83713.5; found 83712.6 (deconvolution data).
calculated for Fc-A-[PEG(3)//PEG(12)2-hANP(1-28)]2 (-Lys), M = 67186.4; found 67184.8(deconvolution data).
＜実施例３－１０＞Fc-B-[PEG(3)//PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP(1-28)]4(化合物3-16の構造において、Fc-AをFc-Bに置き換えた構造を有する化合物、化合物3-17)の合成
　本実施例の各工程の反応スキーム及び物質の構造は、実施例３－９の対応するスキームにおいてFc-AをFc-Bに置き換えたものである。
（３－１０Ａ）(Fucα1,6)GlcNAc-Fc-Bの調製
実施例２－４で調整したFc-B溶液13.0mg/ml (5%ソルビトール／25mMヒスチジン溶液(pH6.0))(20.0ml)をVIVASPIN 20 (10,000MWCO、Sartorius製)を用いて50mM りん酸緩衝液(pH6.0)へ緩衝液交換した。得られた20.0mg/ml Fc-B溶液 (50mMりん酸緩衝液(pH6.0))(13.0ml)に、50mM りん酸緩衝液(pH6.0)(7.0ml)加え、2.00mg/ml 野生型EndoS溶液(PBS)(1.92ml)を加えて、37℃で2時間インキュベートした。反応の進行具合をExperion電気泳動ステーション(BIO-RAD製)を用いて確認した。反応終了後、以下の方法に従い、アフィニティークロマトグラフィーによる精製とハイドロキシアパタイトカラムによる精製を行った。
（１）アフィニティークロマトグラフィーによる精製
精製装置：AKTA pure150(GE ヘルスケア製)
カラム：HiTrap rProtein A FF (5ml)(GE ヘルスケア製)
流速：5ml/min(チャージ時は1.25ml/min)
上記で得た反応液を５つにわけ、以下の方法により5回に分けて精製した。カラムへの結合時は、反応液をカラム上部へ添加し、結合バッファー(20mMりん酸緩衝液(pH7.0))を1.25ml/minで2CV流し、更に5ml/minで5CV流した。中間洗浄時は、洗浄溶液(20mM りん酸緩衝液(pH7.0)、0.5M 塩化ナトリウム溶液)を10CV流した。溶出時は、溶出バッファー(ImmunoPure IgG Elution buffer、PIERCE製)を6CV流した。溶出液を1M トリス緩衝液(pH9.0)で直ちに中和した。溶出中にＵＶ検出(280nm)されたフラクションについて、必要に応じて、微量分光光度計Xpose(Trinean製)、及びExperion電気泳動ステーション(BIO-RAD製)を用いて確認した。
目的物を含むフラクションを5回分全てまとめた後、VIVASPIN 20 (10,000MWCO、Sartorius製)を用いて濃縮し、緩衝液(5mM りん酸緩衝液、50mM 2-モルホリノエタンスルホン酸(MES)溶液(pH6.5))交換を行い、12mLとした。
　（２）ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーによる精製
精製装置：AKTA pure150(GE ヘルスケア製)
カラム：Bio-Scale Mini CHT Type Iカートリッジ(5ml)(BIO-RAD製)
流速：5ml/min(チャージ時は1.25ml/min)
カラムを2連結し、上記（１）で得られた溶液を３つに分け、以下の方法により3回に分けて精製した。溶液をカラムの上部へ添加し、Ａ液(5mM りん酸緩衝液、50mM 2-モルホリノエタンスルホン酸(MES)溶液(pH6.5))を1.25ml/minで2CV流し、更に5ml/minで3CV流した。その後、Ａ液とＢ液(5mM りん酸緩衝液、50mM 2-モルホリノエタンスルホン酸(MES)溶液(pH6.5)、2M塩化ナトリウム溶液)を用いて、溶出した。溶出条件は、Ａ液：Ｂ液 = 100:0 ～ 0:100 (15CV)である。さらに、洗浄溶液(500mMりん酸緩衝液(pH6.5))を5CV流した。
溶出中にＵＶ検出(280nm)されたフラクションについて、必要に応じて微量分光光度計Xpose(Trinean製)、及びExperion電気泳動ステーション(BIO-RAD製)を用いて確認した。
目的物を含むフラクションを3回分全てまとめた後、VIVASPIN 20 (10,000MWCO、Sartorius製)を用いて濃縮し、50mM りん酸緩衝液(pH6.0)へ緩衝液交換を行い、7.17mg/ml (Fucα1,6)GlcNAc-Fc-B溶液(50 mMりん酸緩衝液(pH6.0))(35.4ml)が得られた。
ESI-MS:
calculated for the chain of (Fucα1, 6)GlcNAc-Fc-B(-Lys), M = 25287.7; found 25286.8 (deconvolution data).
（３－１０Ｂ）Fc-B-[PEG(3)-N3]4の調製
工程（３－１0Ａ）で得られた7.17mg/ml (Fucα1,6)GlcNAc-Fc-B溶液 (50mMりん酸緩衝液(pH6.0))(6.0ml)に実施例１－１０で合成した[N3-PEG(3)]2-SG(10)-Ox (28.6mg)溶液（50mMりん酸緩衝液(pH6.0)）(0.50ml)及び2.10mg/ml EndoS D233Q/Q303L溶液(PBS)(1.2ml)を加えて、30℃で3.5時間インキュベートした。この反応液に更に、実施例１－１０で合成した[N3-PEG(3)]2-SG(10)-Ox (6.1mg)溶液（50mMりん酸緩衝液(pH6.0)）(0.10ml)を加え、30℃で0.5時間インキュベートした。以上の操作を5ロット分行った。反応の進行具合をExperion電気泳動ステーション(BIO-RAD製)を用いて確認した。反応終了後、アフィニティークロマトグラフィーによる精製時の結合バッファーを20mMりん酸緩衝液(pH7.0)から20mMりん酸緩衝液(pH6.0)に変えて、工程（３－１0Ａ）と同様の方法に従い、アフィニティークロマトグラフィーによる精製とハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーによる精製を行った。分割操作で得られた分を併せて、目的物を含むフラクションの全てをVIVASPIN 20 (10,000MWCO、Sartorius製)を用いて濃縮後、NAP25(GE ヘルスケア製)を用いて、5%ソルビトール／10mM 酢酸緩衝液(pH5.5)へ緩衝液交換し、13.06mg/mL Fc-B-[PEG(3)-N3]4溶液(5%ソルビトール／10mM 酢酸緩衝液(pH5.5))(13.7ml)を得た。
ESI-MS:
calculated for the chain of Fc-B-[PEG(3)-N3]4 (-Lys), M = 27691.0; found 27690.4(deconvolution data).
（３－１０Ｃ）Fc-B-[PEG(3)//PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP(1-28)]4 （化合物3-17）の調製
工程（３－１０Ｂ）で調製した13.06mg/mL Fc-B-[PEG(3)-N3]4溶液(5%ソルビトール／10mM 酢酸緩衝液(pH5.5))(3.1ml)、5%ソルビトール／10mM 酢酸緩衝液(pH5.5) (4.9ml)、ジメチルスルホキシド(1.5ml)、及び、実施例１－２で合成したDBCO-PEG(12)2-(SG-)Asn-hANP(1-28)(36.6mg)ジメチルスルホキシド溶液 (0.51ml)を混合して、30℃で16時間インキュベートした。上記操作を4ロット実施した。反応液をNAP25(GE ヘルスケア製)、20mMりん酸緩衝液(pH6.0)で粗精製した。反応の進行具合を下記の条件の疎水性相互作用クロマトグラフィーで確認後、下記のアフィニティークロマトグラフィーによる精製を行った。
（１）疎水性相互作用クロマトグラフィーによる分析条件
分析装置：日立D-7000 (日立製)
カラム：TSKgel Butyl-NPR (4.6x100mm)(東ソー製)
移動層：A液 20mM りん酸緩衝液(pH7.0)、2M 硫酸アンモニウム溶液
B液 20mM りん酸緩衝液(pH7.0)
グラジェント：A:B=75:25～0:100(0～25分)-0:100(25～30分)
温度：25℃
波長：214nm
流速：1ml/min
（２）アフィニティークロマトグラフィーによる精製
精製装置：AKTA pure150(GE ヘルスケア製)
カラム　HiTrap rProtein A FF, 5mL
流速：5mL/min （サンプル添加時は1.25mL/min）
上記で得られた溶液を６つにわけ、以下の方法により6回に分けて精製した。カラムへの結合時は、反応液をカラム上部へ添加し、結合バッファー(20mMりん酸緩衝液(pH6.0))を1.25ml/minで4CV流し、更に5ml/minで5CV流した。中間洗浄時は、洗浄溶液(20mM りん酸緩衝液(pH7.0)、0.5M 塩化ナトリウム溶液)を10CV流した。溶出時は、溶出バッファー(ImmunoPure IgG Elution buffer、PIERCE製)を6CV流した。溶出液を1M トリス緩衝液(pH9.0)で直ちに中和した。溶出中にＵＶ検出(280nm)されたフラクションについて、必要に応じて微量分光光度計Xpose(Trinean製)、及び疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いて確認した。
目的物を含むフラクションを6回分全てあわせたものをVIVASPIN 20 (10,000MWCO、Sartorius製)を用いて濃縮後、5%ソルビトール／10mM 酢酸緩衝液(pH5.5)へ緩衝液交換した。最後に、フィルター(Millex-GV、0.22μm、PVDF、滅菌済、Merck Millipore製)でろ過し、13.03mg/ml Fc-A-[PEG(3)//PEG(12)2-hANP(1-28)]4溶液(5%ソルビトール／10mM 酢酸緩衝液(pH5.5))(13.6ml)が得られた。
calculated for the chain of Fc-B-[PEG(3)//PEG(12)2-hANP(1-28)]4 (-Lys), M = 41469.4; found 41467.9 (deconvolution data).
以下に、コンジュゲート体をフラグメント化せずに質量分析した結果を示す。
calculated for Fc-B-[PEG(3)//PEG(12)2-hANP(1-28)]4(-Lys), M = 82918.8; found 82917.0 (deconvolution data).
calculated for Fc-B-[PEG(3)//PEG(12)2-hANP(1-28)]2 (-Lys), M = 66391.7; found 66390.8 (deconvolution data).
　［実施例４］各種コンジュゲートの評価
＜実施例４－１＞　コンジュゲートのcGMP上昇活性試験
以下の方法により、実施例３で作製した化合物3-1～化合物3-6のcGMP上昇活性を測定した。
CHO細胞にhuman GC-Aを恒常的に発現させたCHO/human GC-A細胞をα-MEM, 10%FBS, 1%Penicillin-streptomycinで2×105cells/mlに懸濁し、384 well plate (Corning製, 3826)に20 μl/wellで播種し(4×103 cells/well)、CO2インキュベーター内で一晩培養した。翌日、このプレートから培地を除去した後、1.6 mM IBMX/KRB bufferを10-15 μl/well添加し、プレートシェイカーで攪拌後、室温で10分間インキュベーションをした。次に、0.1%BSA/PBSに溶解した被験物質（各コンジュゲート及び天然型hANP(1-28)を最終濃度が0.0001, 0.001, 0.01, 0.1, 1, 10及び100 nMとなるように希釈系列を調製）を5 μl/wellずつ添加し、プレートシェイカーで攪拌後、CO2インキュベーター内で15分間インキュベーションをした。その後、各well中のcGMP量をcGMP kit（CISBIO製）を用いて添付のプロトコールに従って測定した。各濃度における被験物質の活性値（T/C）は溶媒のみを添加したウェルの測定値を０とし、1 nM天然型hANPを添加したウェルの測定値を１として補正し、これに基づき、各被験物質の比活性（被験物質のEC50値／天然型hANPのEC50値）及びEmax（濃度範囲における被験物質の最大活性値）を算出した（表２）。
　表２の結果から、全てのコンジュゲートがcGMP上昇活性を示した。また、コンジュゲートのEmaxは天然型hANPとほぼ等価であった。糖鎖修飾hANP-mAb-Aコンジュゲート(化合物3-2)は、hANP-mAb-Aコンジュゲート(化合物3-1)より比活性は弱いことが確認された。また、糖鎖修飾hANP-CLCH-Aコンジュゲート(化合物3-4)は、hANP- CLCH-Aコンジュゲート(化合物3-3)より比活性は弱いことが確認された。このことから、hANPペプチドに糖鎖を導入するとin vitro活性は低下する傾向があると示唆された。また、hANPペプチド数が2つの糖鎖修飾hANP-mAb-Aコンジュゲート(化合物3-5)は、hANPペプチドの数が4つの糖鎖修飾hANP-mAb-Aコンジュゲート(化合物3-2)より比活性が4.5倍減弱した。また、hANPペプチド数が2つの糖鎖修飾hANP-CLCH-Aコンジュゲート(化合物3-6)は、hANPペプチドの数が4つの糖鎖修飾hANP-CLCH-Aコンジュゲート(化合物3-4)より比活性が3.2倍減弱した。このことから、hANPペプチド数が多い方が、良好な活性を示す傾向が示唆された。
　また、キャリア分子として、ＣＬＣＨのＬＡＬＡ体であるCLCH-Bを採用した化合物３－１５、Ｆｃ断片のＬＡＬＡ体であるFc-Aを採用した化合物３－１６、及び、野生型Ｆｃ断片であるFc-Bを採用した化合物３－１７は、いずれも天然型hANPと同レベルのin vitro活性を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000091
＜試験例４－２＞　コンジュゲートのラットの血中持続性試験
以下の方法により、実施例3で作製した各コンジュゲートのラットの血中における持続性（血中cGMPの持続的上昇作用及び被験物質の血中からの検出時間）を調べた。
（１）血漿サンプルの調製
イソフルラン：日本薬局方イソフルラン
採血用針およびシリンジ：テルモシリンジ　25G x 1 SR ツベルクリン用
採血用チューブ：キャピジェクト微量採血管　EDTA-2Na  500 μL
サンプル保管用チューブ：MTARIX4170 サンプルトラックチューブ　0.75 mL
8-9週齢の雄性Slc:SDラットに対しイソフルラン吸入麻酔（（エスカイン吸入麻酔液を1-2%の濃度で維持して吸入）を行った。必要に応じてPBSで希釈した被験物質（各コンジュゲート、化合物3-1～3-6）の溶液を、皮下より、100 nmol/kgの用量(1 mL/kg)で急速投与した。投与前並びに投与後0.25、0.5、1、2、4、8、24、48、72、96、120及び168時間のうち化合物毎に選抜した時点で、頸静脈から経時的採血（200μL／回）を行い、血液サンプルは速やかに氷上に置いた。
採取した血液サンプルは遠心機（Sigma 4K15、ローター:Nr12130-H）を用いて5000 rpm,5 min,4℃で遠心分離し、分離した血漿サンプルをPK測定用とcGMP測定用の2本に分け測定まで-80℃に保存した。
（２）血漿中cGMP濃度の測定
血漿中のcGMP濃度は、100倍に希釈した血漿サンプルについて、Amersham cGMP Enzymeimmunoassay BiotrakTM (EIA) System (dual range)を用いて、キットに添付のプロトコールに従って測定した。得られた血漿中cGMP濃度推移を図６に示す。
（３）血漿サンプル中の被験物質の検出
　（１）で調整したラット血漿サンプル10 μLをRexxip HN Buffer (Gyros AB.製)で10倍希釈し、必要に応じて適宜、更に同バッファーで10倍希釈（最終：100倍希釈）し、あるいは、これを更に1％血漿/ Rexxip HN Bufferで10倍希釈（最終：1000倍希釈）し、測定用血漿サンプルとした。1次抗体としてはサンプル中の全てのヒトFc含有分子(Fc/Fc) 測定用にGoat Anti-Human IgG Biotin conjugate (SouthernBiotec) を、サンプル中のhANP(1-28)が結合したコンジュゲート（ANP/Fc）測定用にはMouse Anti-ANP IgG (GeneTex) を用いた。1次抗体をそれぞれ700 nMになるよう0.1％PBS-Tにて調製した。検出用の2次抗体として両者ともに、DyLight標識したGoat Anti-Human IgG (SouthernBiotec) を10 nMになるようRexxip F Buffer (Gyros AB.) にて調製した。各溶液を自動ELISA装置Gyrolab xP workstation にセットし、Bioaffy 200 CD (Gyros AB.) にインジェクションして被験物質（Fc/Fc、ANP/Fc）の含有量をサンドウィッチELISA法により測定し、血漿中の濃度を算出した。 
得られた血漿中濃度推移を図７に示す。 
図６、及び図７より、天然型hANPに比べて各種コンジュゲートは、緩やかな血中移行性、長い血中滞留性、及び薬理作用持続性を併せ持つGC-A活性化薬であることが確認された。
図６より、以下のことが確認された。
hANP-mAb-Aコンジュゲートである化合物3-1は、最も高いEmaxを示した。また、化合物3-1は、hANP-CLCH-Aコンジュゲートである化合物3-3と比べて、より長い薬理活性持続を示した。
糖鎖修飾hANP-mAb-Aコンジュゲートである化合物3-2、及び糖鎖修飾hANP-CLCH-Aコンジュゲートである化合物3-4は、化合物3-1と比べてEmaxに到達するまでの時間と減衰速度も遅延した。すなわち、糖鎖修飾hANP-mAb-Aコンジュゲートの方がより長い薬理活性持続を示すと考えられる。
　hANPペプチドの数が2つのコンジュゲート体である化合物3-5、及び化合物3-6は、hANPペプチドの数が４つのコンジュゲート体である化合物3-2及び化合物3-4と比較すると、Emaxが減弱した。すなわち、hANPペプチドの数が多い糖鎖修飾hANP-mAb-Aコンジュゲートの方がより強い薬理活性を示すと考えられる。
　図７より、以下のことが確認された。
　hANPコンジュゲートは、投与後168時間後においても、血中濃度が確認された。
　hANP-mAb-Aコンジュゲートである化合物3-1は、hANP-CLCH-Aコンジュゲートである化合物3-3と比べると、Fc/FcとANP/Fcの乖離幅が小さく、投与後168時間の血漿中濃度が高く、減衰速度が遅い。このことは、化合物3-1は、化合物3-3より長い血中滞留性を有していることを示している。
　糖鎖修飾hANP-mAb-Aコンジュゲートである化合物3-2は、hANP-mAb-Aコンジュゲートである化合物3-1と比べると、Fc/FcとANP/Fcの乖離幅が小さく、投与後168時間の血漿中濃度が高く、減衰速度が遅い。このことは、化合物3-2は、化合物3-1より長い血中滞留性を有していることを示している。また、糖鎖修飾hANP-CLCH-Aコンジュゲートである化合物3-4は、hANP-CLCH-Aコンジュゲートである化合物3-3と比べると、Fc/FcとANP/Fcの乖離幅が小さく、投与後168時間の血漿中濃度が高く、減衰速度が遅い。このことは、化合物3-4は、化合物3-3より長い血中滞留性を有していることを示している。
＜実施例４－３＞　コンジュゲートのcGMP上昇活性に対するＰＥＧリンカーの影響
　本実験は、実施例3-7で合成したコンジュゲートを用いて、cGMP上昇活性に対するPEGリンカー部分の影響を検討することを目的に実施した。実施例４－１に記載した方法と同様にして、天然型hANPと被験物質の比活性及びEmaxを算出した。結果を表３に示す。
　PEGリンカーの長さ・種類のin vitro活性に与える影響について、以下のことが確認された。Emaxについては全ての化合物でhANPと同程度まで保たれていた。また、hANPに対する比活性は0.41-2.84倍の幅にあり、いずれの化合物も一定以上のcGMP上昇活性を有していた。ＰＥＧリンカーに含まれるエチレングリコール単位が多い化合物ほど良好な活性を示す傾向が見られた。一方で、全体として同程度の長さのリンカー構造の場合、短いＰＥＧ（例えばPEG(6)）を含むリンカー分子を多数結合させたリンカー構造の化合物よりも、長いＰＥＧを少数結合させたリンカー構造の化合物のほうが良好な活性を示す傾向が示唆された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000092
＜試験例４－４＞　コンジュゲートのラットの血中持続性に対するＰＥＧリンカーの影響
　本実験は、実施例3-7で合成したコンジュゲートを用いて、動物血中での持続性に対するPEGリンカー部分の影響を検討することを目的に実施した。実施例4-2に記載した方法と同様に、被験物質をラットに皮下投与した後の血漿中cGMP濃度の経過時変化を調べた。結果を図８に示す。
　PEGリンカーの長さ・種類のin vitro活性に与える影響について、以下のことが確認された。PEG（12）-PEG（12）を有する化合物3-7のEmaxが最も高かったが、in vitroの結果と相反して、PEG（24）を有する化合物3-9は最も活性が弱く持続も短かった。
＜試験例４－５＞　コンジュゲートの物性評価
　天然型hANP(1-28)については、凝集性が高いことが分かっている。例えば、7mg/mL PBS溶液中、30℃でインキュベートした場合、24時間以内に、ゲル状析出物が確認され、48時間以内に溶液全体がゲル状となることが確認される。
　含有されるhANPのモル数換算でほぼ同量になる濃度で試験を実施すれば、hANPコンジュゲートの凝集性を間接的に比較することができる。本発明のコンジュゲート体の凝集性を確認する目的で、以下の試験を行った。
（１）加速劣化試験
　各サンプルをVivapore 5（Vivascience製）で濃縮し、25 mM AcONa 5% sorbitol pH5.5（ABSor液）またはPBSへ透析後、70 mg/mLに調製した。Spin-X 0.22 μm遠心式フィルター（Costar製）でろ過し、0.5 mL滅菌スリムチューブ（住友ベークライト製）に80 μLずつ分注して密封後 40℃で2週間静置した。劣化前後のサンプルをAgilent 1260 LC、DAWN HELEOS 8、Eclipse3+で構成されたSEC-MALSシステム（Wyatt Technology製）で測定し、ASTRAソフトウェア（Wyatt Technology製）で解析した。測定は、カラム: Nanofilm SEC-250 7.8´300 mm（Sepax製）、バッファー: 0.2 M KPi 0.2 M KCl pH 7.0、流速: 0.5 mL/min、カラム温度: 30°C、検出波長: 280 nmの条件で実施した。結果を表４に示す。
　天然型hANPのPBS溶液が48時間以内に溶液全体がゲル状となるのに対して、コンジュゲートでは２週間後でも溶液の流動性が確認され、溶液安定性が改善された。加速劣化処理により化合物3-3の高分子量体はABSor液の場合で8.2%から14.2%へ、PBS液の場合で9.2%から45.7%へ増加した。化合物3-3のhANP部近傍に糖鎖を導入した化合物3-4の場合、加速劣化処理により高分子量体はABSor液の場合で1.8%から4.5%へ、PBS液の場合で2.8%から12.8%へ増加した。よって、hANP部近傍への糖鎖導入により、凝集性が顕著に低減されることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000093
＜試験例４－６＞　コンジュゲートのサルの血中持続性試験
以下の方法により、実施例3で作製したキャリア分子が異なる各コンジュゲートのサルの血中における被験物質の血中からの検出時間を調べることで、コンジュゲートの血中持続性に対するキャリア分子の影響を検討した。
　（１）血漿サンプルの調製
採血用針およびシリンジ：テルモシリンジ　25G x 1 SR ツベルクリン用
採血用チューブ：キャピジェクト微量採血管　EDTA-2Na、 もしくはベノジェクと真空採血管EDTA-2Na
サンプル保管用チューブ：MTARIX4170 サンプルトラックチューブ　0.75 mL
3-7年齢の雄性カニクイザルに対し無麻酔下において披験物質の投与および採血を実施した。必要に応じてPBSで希釈した被験物質（各コンジュゲート、化合物3-2、3-4、3-15、3-16、及び3-17）の溶液を、皮下より、10 nmol/kgの用量(1 mL/kg)で急速投与した。投与前並びに投与後0.25、0.5、1、2、4、8、24、48、96、168、336、528(あるいは504)、及び696(あるいは672)時間の時点で、静脈から経時的採血（約500μL／回）を行い、血液サンプルは速やかに氷上に置いた。
採取した血液サンプルを遠心分離することで得られた血漿サンプルを測定まで-80℃に保存した。
（２）血漿サンプル中の被験物質の検出
　（１）で調整したサル血漿サンプル10 μLにRexxip HN Buffer (Gyros AB.) を90 μL添加後混合（10倍希釈サンプル、MRD 10）、もしくはさらにRexxip HN Bufferで10倍希釈（100倍希釈サンプル、MRD 100）、さらに1％血漿/ Rexxip HN Bufferで10倍希釈（1000倍希釈サンプル、MRD 100）して測定用血漿サンプルを調製した。1次抗体としてはサンプル中の全てのヒトFc含有分子(Fc/Fc) 測定用にGoat Anti-Human IgG Biotin conjugate (SouthernBiotec)を、サンプル中のhANP(1-28)が結合したコンジュゲート（ANP/Fc）測定用にはMouse Anti-ANP IgG (GeneTex) を用いた。1次抗体をそれぞれ700 nMになるよう0.1％PBS-Tにて調製した。検出用の2次抗体として両者ともに、DyLight標識したGoat Anti-Human IgG (SouthernBiotec)を10 nMになるようRexxip F Buffer (Gyros AB.) にて調製した。こ各溶液を自動ELISA装置Gyrolab xP workstation にセットし、Bioaffy 200 CD (Gyros AB.) にインジェクションして被験物質（Fc/Fc、ANP/Fc）の含有量をサンドウィッチELISA法により測定し、血漿中の濃度を算出した。 
得られた血漿中濃度推移を図９に示す。 
図９より、この試験で用いたhANPコンジュゲートは、投与後672時間(28日)後においても、分解されずにコンジュゲート体として血中濃度が確認された。キャリア分子がそれぞれCLCH-A、CLCH-Bである化合物3-4および化合物3-15は、キャリア分子がmAb-Aである化合物3-2と比べて速やかに血中から減衰した。一方、キャリア分子がそれぞれFc-A、Fc-Bである化合物3-16及び化合物3-17は、化合物３－２より緩やかに血中から減衰した。すなわち、サルにおいて糖鎖修飾hANP-Fcコンジュゲートの血中持続性が最も長いことが示された。
［実施例５］2種類のEndo酵素を使用した糖鎖転移反応
　使用する2種類のEndo酵素に関して、酵素Ａ（EndoM様酵素）及び酵素Ｂ（EndoS様酵素）は適切に組合せることができる。酵素Ａには、EndoM,EndoOm,EndoCCとその加水分解活性を低下させたEndoM変異体,EndoOm変異体,EndoCC変異体などを例示できる。また、酵素Ｂには、EndoS,EndoS2(EndoS49)とその加水分解活性を低下させたEndoS変異体, EndoS2(EndoS49)変異体などを例示できる。糖鎖供与体部分の構造は、化学反応あるいは酵素反応との組み合わせで合成可能な分子であれば、アノマー部位の置換基Ｒは、Ｒ＝Ｈ以外、何を使用してもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000094
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000095
＜実施例５－１＞　糖鎖供与体にSGPを用いた糖鎖転移率の測定
mAb-Cとして、市販のTrastuzumabを使用した。Trastuzumab(440mg/vial、Genentech製)に対して、実施例3-1に記載された方法を用い、51.3mg/ml (Fucα1,6)GlcNAc-Trastuzumab溶液(50 mMトリス緩衝液(pH7.4))(1.65ml)とした。51.3mg/ml (Fucα1,6)GlcNAc-Trastuzumab溶液 (50 mMトリス緩衝液(pH7.4))(19.5μl)に対して、50 mMトリス緩衝液(pH7.4)(0.5μl)、SGP(東京化成製)(5.82mg)溶液（50mMトリス緩衝液(pH7.4)）(29.1μl)、1U/ml EndoM N175Q溶液(東京化成製) (5.0μl)及び2.00mg/ml EndoS D233Q溶液(PBS)(10.0μl) を加えて、28℃で48時間インキュベーションした。
反応開始から、2時間後、4時間後、8時間後、24時間後及び48時間後の各時点で、この反応液の一部を採取し、反応の進行度をExperion電気泳動ステーション(BIO-RAD製)で測定した。測定に当っては、機器に付随している手順書に従って、測定サンプルを調製した。この過程で、採取した反応液をジチオトレイトールを含む溶液にさらして、95℃で5分間加熱する操作がある為、糖鎖転移反応は即座に停止される。
　得られた測定サンプルをExperion　Pro260 Chipsに移して、Experion電気泳動ステーションに付随している手順書に従って測定した。得られたクロマトグラムより、未反応物と糖鎖転移体が分離したピークとして確認される。未反応物と糖鎖転移体のピーク面積比から糖鎖転移率を下記算出式により算出した。
糖鎖転移率(%) = [SG-Trastuzumab由来のH鎖のピーク面積] /{[(Fucα1,6)GlcNAc-Trastuzumab由来のH鎖ピーク面積 + [SG-Trastuzumab由来のH鎖のピーク面積]｝×100
同様にして各種Endo酵素の組み合わせを変えて反応を行い、各反応時間における糖鎖転移率を算出した（表５）。
＜実施例５－２＞　糖鎖供与体にSG-Asnを用いた糖鎖転移率の測定
51.3mg/ml (Fucα1,6)GlcNAc-Trastuzumab溶液 (50 mMトリス緩衝液(pH7.4))(19.5μl)に対して、50 mMトリス緩衝液(pH7.4)(0.5μl)、SG-Asn アンモニウム塩 (4.74mg)溶液（50mMトリス緩衝液(pH7.4)）(23.7μl)、1U/ml EndoM N175Q溶液 (5.0μl)及び、2.00mg/ml EndoS D233Q溶液(PBS)(10.0μl) を加えて、28℃で48時間インキュベーションした。以下実施例5-1と同様の方法で、各反応時間における糖鎖転移率を算出した（表５）。
＜実施例５－３＞　酵素ＡにEndoCCを用いた糖鎖転移率の測定
　51.3mg/ml (Fucα1,6)GlcNAc-Trastuzumab溶液 (50 mMトリス緩衝液(pH7.4))(19.5μl)に対して、50 mMトリス緩衝液(pH7.4)(0.5μl)、SGP(東京化成製)(5.82mg)溶液（50mMトリス緩衝液(pH7.4)）(29.1μl)、1.16U/ml EndoCCあるいは2.21U/ml EndoCC N180H溶液(伏見製薬所) (15.0μl)及び2.00mg/ml EndoS D233Q溶液(PBS)(10.0μl) を加えて、28℃あるいは37℃で48時間インキュベーションした。以下実施例5-1と同様の方法で、各反応時間における糖鎖転移率を算出した（表５）。
表５．　反応条件と糖鎖転移率の経時変化
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000096
　糖鎖供与体にオキサゾリン体を使用しない場合、2種類のEndo酵素変異体を適度な割合で混合させることで糖鎖転移反応が効率的に進行することを確認した。酵素Ａの加水分解活性が高い場合、酵素Ｂに加水分解活性を抑えた変異体を使用しても、糖鎖転移率は低い。加水分解活性を抑えた酵素Ｂは、その程度により、糖鎖転移率90%を越えるまでの反応時間に違いがある。反応の至適温度が50℃とされるEndoCCは、反応温度が高い方が転移率が高くなる傾向がある。
　適切に化学修飾された糖鎖供与体を選ぶことにより、Fc含有分子に化学修飾された糖鎖構造を導入することができる。例えば、糖鎖供与体SGPや(SG-)Asnの代りに、(N3-PEG(3)-SG-)Asn-PEG(3)-N3を用いると対応する糖鎖をFc含有分子に転移させることができる。また、Fc含有分子はmAb,CLCH,Fcを適宜使用できる。
＜実施例５－４＞　([N3-PEG(3)]2-SG-)Asn-PEG(3)-N3を用いたmAb-A-[PEG(3)-N3]4の調製
糖鎖ドナーとして([N3-PEG(3)]2-SG-)Asn-PEG(3)-N3を用い、mAb-A-[PEG(3)-N3]4を以下の方法で作製した。 
　51.27mg/ml (Fucα1, 6)GlcNAc-mAb-A溶液 (50 mMトリス緩衝液(pH7.4))(200μl)に、工程（１－１２Ａ）で作成した([N3-PEG(3)]2-SG-)Asn-PEG(3)-N3(50.0mg)溶液（50mMトリス緩衝液(pH7.4)） (240μl)、1U/ml EndoM N175Q溶液 (東京化成製) (50μl)及び2.10mg/ml EndoS D233Q Q303L溶液(PBS)(100μl)を加えて、28℃で20時間インキュベートした後に、実施例3-1に記載された方法に準じ、反応スケールに適した精製方法（精製装置、カラム）や限外ろ過方法（限外ろ過膜）を選択し、14.78mg/mL mAb-A-[PEG(3)-N3]4溶液(5%ソルビトール／10mM 酢酸緩衝液(pH5.5))(500μl)を得た。
ESI-MS:
calculated for the heavy chain of mAb-A-[PEG(3)-N3]4(-Lys, pyrGlu), M = 52569.9; found 52570.0(deconvolution data).
calculated for the light chain of mAb-A-[PEG(3)-N3]4, M = 23292.9; found 23292.0 (deconvolution data).
＜実施例５－５＞　([N3-PEG(3)]2-SG-)Asn-PEG(3)-N3を用いたCLCH-B-[PEG(3)-N3]4の調製
糖鎖ドナーとして([N3-PEG(3)]2-SG-)Asn-PEG(3)-N3を用い、CLCH-B-[PEG(3)-N3]4を以下の方法で作製した。 
　39.2mg/ml (Fucα1, 6)GlcNAc-CLCH-B溶液 (50 mMトリス緩衝液(pH7.4))(150μl)に50mMトリス緩衝液(pH7.4) (50μl)、工程（１－１２Ａ）で作成した([N3-PEG(3)]2-SG-)Asn-PEG(3)-N3(53.0mg)溶液（50mMトリス緩衝液(pH7.4)）(240μl)、1U/ml EndoM N175Q溶液 (東京化成製) (50μl)及び2.10mg/ml EndoS D233Q Q303L溶液(PBS)(100μl)を加えて、28℃で20時間インキュベートした後に、実施例3-8に記載された方法に準じ、反応スケールに適した精製方法（精製装置、カラム）や限外ろ過方法（限外ろ過膜）を選択し、8.92mg/mL CLCH-B-[PEG(3)-N3]4溶液(5%ソルビトール／10mM 酢酸緩衝液(pH5.5))(500ul)を得た。
ESI-MS:
calculated for the heavy chain of CLCH-B-[PEG(3)-N3]4 (-Lys), M = 38706.3; found 38706.1(deconvolution data).
calculated for the light chain of CLCH-B-[PEG(3)-N3]4, M = 11507.8; found 11506.7(deconvolution data).
＜実施例５－６＞　([N3-PEG(3)]2-SG-)Asn-PEG(3)-N3を用いたFc-A-[PEG(3)-N3]4の調製
糖鎖ドナーとして([N3-PEG(3)]2-SG-)Asn-PEG(3)-N3を用い、Fc-A-[PEG(3)-N3]4を以下の方法で作製した。 
　24.8mg/ml (Fucα1, 6)GlcNAc-Fc-A溶液 (50 mMトリス緩衝液(pH7.4))(140μl)に50mMトリス緩衝液(pH7.4) (60μl)、工程（１－１２Ａ）で作成した([N3-PEG(3)]2-SG-)Asn-PEG(3)-N3(60.0mg) 50mMトリス緩衝液(pH7.4)溶液(240μl)、1U/ml EndoM N175Q溶液 (東京化成製) (50μl)及び2.10mg/ml EndoS D233Q Q303L溶液(PBS)(100μl)を加えて、28℃で20時間インキュベートし後に、実施例3-9に記載された方法に準じ、反応スケールに適した精製方法（精製装置、カラム）や限外ろ過方法（限外ろ過膜）を選択し、4.06mg/mL Fc-A-[PEG(3)-N3]4溶液(5%ソルビトール／10mM 酢酸緩衝液(pH5.5))(500ul)を得た。 
calculated for the chain of Fc-B-[PEG(3)-N3]4 (-Lys), M = 28088.3; found 28085.6(deconvolution data).

Claims (18)

  1. 　hANPペプチドがポリエチレングリコールリンカー（L(PEG)）を介して、Ｆｃ含有分子のAsn297に結合する糖鎖（Ｎ２９７糖鎖）に結合したコンジュゲート体またはその薬学上許容される塩、ここで、
    　hANPペプチドが、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、Ｎ末端から連続する１～５個のアミノ酸および／またはＣ末端の１アミノ酸が欠失していても良く、且つ、当該ペプチドのＮ末端およびＣ末端のいずれか、または、両方が糖鎖修飾されていても良く、
    　L(PEG)は、１０～３５個のエチレングリコール構造を含み、他の結合構造および／または修飾構造を含んでいても良いリンカー構造であり、
    　Ｆｃ含有分子は、ヒトＩｇＧのＦｃ領域に相当するアミノ酸配列を有し、ヒトの生体分子に対する特異的な結合能を持たない分子であり、並びに、
    　Ｎ２９７糖鎖は、以下の式で表される構造を有する糖鎖N297-(Fuc)SG、N297-(Fuc)MSG1又はN297-(Fuc)MSG2である、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式中、L(PEG)は、β-Manの分岐鎖の1-3鎖側及び1-6鎖側の両方の非還元末端のシアル酸の２位に結合したカルボニル基と結合することを表す。）
    （式中、L(PEG)は、β-Manの分岐鎖の1-3鎖側の非還元末端のシアル酸の２位に結合したカルボニル基と結合することを表す。）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     （式中、L(PEG)は、β-Manの分岐鎖のうち1-6鎖側の非還元末端のシアル酸の２位に結合したカルボニル基と結合することを表す。）。
  2. 　hANPペプチドが、hANP(1-28)、hANP(2-28)、hANP(3-28)、hANP(1-27)、hANP(2-27)又はhANP(3-27)である請求項１のコンジュゲート体、または、その薬学上許容される塩。
  3. 　hANPペプチドが、以下式で表されるＡＧ５、ＡＧ７、ＡＧ９またはＳＧのいずれかの糖鎖が側鎖にＮグリコシド結合したアスパラギンまたはグルタミンが当該ペプチドのＮ末端またはＣ末端に結合した糖鎖修飾ペプチドである、請求項１又は２のコンジュゲート体、または、その薬学上許容される塩、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
    （上記式中、” －（Ｎ／Ｑ）”は、Ｎグリコシド結合によりアスパラギンまたはグルタミンの側鎖に結合することを示す。）。
  4. 　hANPペプチドが、ＳＧ糖鎖が側鎖にＮグリコシド結合したアスパラギンがそのＮ末端に結合したhANP(1-28)であることを特徴とする、請求項３のコンジュゲート体、または、その薬学上許容される塩。
  5. 　Ｌ（ＰＥＧ）が、２５～３０個のエチレングリコール構造を含み、結合構造として、アミド結合、及び、1,2,3-トリアゾール環を含んでいるリンカー構造である請求項１のコンジュゲート体またはその薬学上許容される塩。
  6. 　Ｌ（ＰＥＧ）が、以下のいずれかの式で表されるリンカー構造である請求項１のコンジュゲート体またはその薬理学上許容される塩、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
     （上記式において、「hANP」はhANPペプチドを表し、「N297 GLY」はＮ２９７結合糖鎖の非還元末端と結合していることを表す。また、各リンカー構造は式中L(PEG)-X1及びL(PEG)-X2（これらを合わせて、L(PEG)-X（XはA,B,C,D,E,F、G又はHである）と表記する。）の構造で示されるように、1,2,3-トリアゾール環部位に、結合形成時に生成される幾何異性構造を有し、コンジュゲート体1分子中に、これらの構造からなるリンカーのいずれか一方のみが存在し、又は、その両方が混在している。）。
  7. 　Ｆｃ含有分子が、ヒトの生体成分以外の物質を抗原とするヒトＩｇＧモノクローナル抗体、または、ヒトＩｇＧのＦｃ領域を有し可変領域部を欠損させた断片又は改変体である請求項１のコンジュゲート体またはその薬学上許容される塩。
  8. 　Ｆｃ含有分子が、ヒトＩｇＧに由来するＦｃまたはヒトＩｇＧの定常領域からなるＣＬＣＨである請求項７のコンジュゲート体またはその薬学上許容される塩。
  9. 　Ｆｃ含有分子が、配列番号３のアミノ酸番号２０～４７４のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号５のアミノ酸番号２１～２３４のアミノ酸配列からなる軽鎖の組み合わせからなる抗体（mAb-A）、配列番号７のアミノ酸番号２０～３４９のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号９のアミノ酸番号２１～１２５のアミノ酸配列からなる軽鎖の組み合わせからなるＣＬＣＨ（CLCH-A）、配列番号１１のアミノ酸番号２０～３４９のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号９のアミノ酸番号２１～１２５のアミノ酸配列からなる軽鎖の組み合わせからなるＣＬＣＨ（CLCH-B）、配列番号１５のアミノ酸番号２１～２４３のアミノ酸配列からなるＦｃ断片（Fc-B）、又は、配列番号１７のアミノ酸番号２１～２４７のアミノ酸配列からなるＦｃ断片（Fc-A）、或いは、その改変体である請求項７のコンジュゲート体またはその薬学上許容される塩。
  10. 　hANPペプチドが、hANP(1-28)又は(SG-)Asn-hANP(1-28)、
    ＰＥＧリンカーが、L(PEG)-A、L(PEG)-B、L(PEG)-C、L(PEG)-D、L(PEG)-E、L(PEG)-F、L(PEG)-G又はL(PEG)-H、
    Ｆｃ含有分子が、mAb-A、CLCH-A、CLCH-B、Fc-A又はFc-B、
    Ｎ２９７糖鎖が、N297-(Fuc)SG、
    である、請求項１のコンジュゲート体又はその薬学上許容される塩。
  11. 　hANPペプチドが(SG-)Asn-hANP(1-28)、ＰＥＧリンカーがL(PEG)-B、Ｆｃ含有分子がFc-A又はFc-B、及び、Ｎ２９７糖鎖がN297-(Fuc)SG、である、請求項１のコンジュゲート体又はその薬学上許容される塩。
  12. 　請求項１～１０のいずれかのコンジュゲート体又はその薬学上許容される塩を有効成分として含有する医薬。
  13. 　ＧＣ－Ａの活性化により治療可能な疾患の治療剤、又は、予防剤である請求項１２の医薬。
  14. 　高血圧症、急性心不全、慢性心不全、急性腎不全、又は、慢性腎不全の治療剤、又は、予防剤である請求項１２の医薬。
  15. 　以下の工程を含む、請求項１～１０のいずれかのコンジュゲート体の製造方法、
    工程Ａ：動物細胞で産生したＦｃ含有分子を加水分解酵素で処理し、(Fucα1,6)GlcNAc-Ｆｃ含有分子を製造する工程。
    工程Ｂ１：SG(10)又はMSG(9)のシアル酸にアジド基を導入し、還元末端をオキサゾリン化した糖鎖ドナー分子と、糖転移酵素存在下で(Fucα1,6)GlcNAc-Ｆｃ含有分子と反応させ、シアル酸にアジド基が導入されたＳＧ型糖鎖リモデリングＦｃ含有分子を合成する工程。
    あるいは、工程Ｂ２：(SG-)Asn、(MSG-)Asnのシアル酸にアジド基を導入した糖鎖ドナー分子と、２種の糖転移酵素存在下で(Fucα1,6)GlcNAc-Ｆｃ含有分子と反応させ、シアル酸にアジド基が導入されたＳＧ型糖鎖リモデリングＦｃ含有分子を合成する工程。
    及び
    工程Ｃ：一方にhANPペプチド、他方にＤＢＣＯを有するリンカー分子を、工程Ｂで作製されたシアル酸にアジド基が導入されたＳＧ型糖鎖リモデリングＦｃ含有分子と反応させ、請求項１のコンジュゲート体を合成する工程。
  16. 　工程Ａの反応液を、ハイドロキシアパタイトカラムによる精製を含む工程により(Fucα1,6)GlcNAc-Ｆｃ含有分子を精製する工程を更に含む、請求項１４の製造方法。
  17. 投与が必要な対象に対して、請求項１～１１のいずれかのコンジュゲート体又はその薬学上許容される塩を有効成分として投与することを含む、ＧＣ－Ａの活性化により治療可能な疾患を治療、又は、予防する方法。
  18. 　ＧＣ－Ａの活性化により治療可能な疾患の治療、又は、予防のために使用される、請求項１～１１のいずれかのコンジュゲート体又はその薬学上許容される塩。
     
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