KR20230131227A - 저면역원성 생물치료제 - Google Patents

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KR20230131227A
KR20230131227A KR1020237026313A KR20237026313A KR20230131227A KR 20230131227 A KR20230131227 A KR 20230131227A KR 1020237026313 A KR1020237026313 A KR 1020237026313A KR 20237026313 A KR20237026313 A KR 20237026313A KR 20230131227 A KR20230131227 A KR 20230131227A
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siglec
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리차드 제임스 글린
티그랑 아이바지안
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Abstract

본 개시내용은 개체에서 그 자신에 대한 면역 반응의 전개를 억제하는 저면역원성 생물치료 조성물을 제공한다. 본 개시내용은 또한 이러한 저면역원성 생물치료제를 포함하는 약학적 조성물, 이러한 저면역원성 생물치료제를 제조하는 방법, 및 이러한 저면역원성 생물치료제를 치료제로서 연구에 사용하는 방법을 제공한다.

Description

저면역원성 생물치료제
관련된 출원에 대한 교차-참조
본 출원은 2021년 1월 11일에 출원된 미국 가출원 번호 63/136,128의 이익을 주장하며, 그 개시내용은 그 전체적으로 참조로 본 명세서에 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 환자에서 그 자신에 대한 면역 반응을 억제하는 생물치료제에 관한 것이다.
치료제 단백질 및 유전자 요법은 질환의 치료를 위한 신규하고 성공적인 약물 양식이다. 그러나, 이러한 치료제에 대한 환자 면역 반응은 종종 약물 활성의 억제, 가속화된 약물 제거, 손상된 약물 안전성 및 약물 효능의 손실을 초래한다. 중화 및 비-중화 약물-특이적 항체("항-약물 항체" 또는 "ADA")의 형성의 방지는 생물치료제의 분야에서 해결되지 않은 주요 문제이다. 생물치료제에 대한 ADA 반응을 차단하면 약물 노출이 개선되고, 효능의 지속성이 개선되고, ADA-관련된 독성이 감소되고, 달리 약물투여할 수 없는 양식(예를 들어, 새로이 디자인된 약물, 내인성 단백질에 기반된 약물)에 대해 유리한 약리학이 가능해진다. 본 발명은 이들 문제를 다룬다.
본 개시내용은 개체에서 그 자신에 대한 면역 반응의 전개를 억제하는 저면역원성 생물치료제 조성물을 제공한다. 본 개시내용은 또한 이러한 저면역원성 생물치료제를 포함하는 약학적 조성물, 이러한 저면역원성 생물치료제를 제조하는 방법, 및 이러한 저면역원성 생물치료제를 치료제로서 및 연구에 사용하는 방법을 제공한다.
도 1은 억제된 항-약물 항체 반응을 갖는 CD22-계합 생물치료제에 대한 모델의 양태를 도시한다: B 세포 수용체 - Siglec 리간드 공동-인게이저(약물-Siglec 리간드 접합체 포함)는 B 세포 수용체 복합체에 대한 억제성 CD22 수용체의 물리적 동원의 장점에 의해 약물-특이적 B 세포 활성화를 억제 또는 침묵시킨다.
도 2는 억제된 항-약물 항체 반응을 갖는 CD22-계합 생물치료제에 대한 모델의 또 다른 양태를 묘사한다: B 세포 수용체 - Siglec 리간드 공동-인게이저(약물-Siglec 리간드 접합체 포함)는 약물-특이적 B 세포만을 억제, 침묵 또는 제거하는 반면 약물에 특이적이지 않은 이들 B 세포 클론을 그대로 남겨둔다.
도 3은 감소된 면역원성을 갖는 Siglec-B 세포 수용체-공동-계합 생물제제에 대한 다수의 형식을 묘사한다: 형식 1. Siglec 리간드-변형된 단백질: 비-효소적 또는 효소적 접합. 부위-특이적 또는 비-부위 특이적. 형식 2. Siglec 리간드-변형된 글리칸(세포-내 또는 시험관내): 생합성, 효소 글리칸 변형(예를 들어, 단백질 발현 중). 형식 3. Siglec 리간드-변형된 글리칸(시험관내): 발현 후, 시험관내 효소적 글리칸 변형. 형식 4. 단백질/펩티드 융합: CD22-결합 결합 도메인 또는 펩티드는 인-프레임 융합 또는 접합을 통해 생물제제에 통합된다.
도 4는 예시적인 접합가능한, CD22-결합, Siglec 리간드-링커 구조를 묘사하고, 구조의 구성요소: Siglec 리간드 결합 모이어티, Siglec 리간드-근위 링커 구조, 링커 및 반응성/접합가능한 기를 강조한다.
도 5는 Siglec-2 결합 친화성 및 종 특이성을 결정하는 요소에 초점을 맞춘 예시적인 Siglec 리간드 구조를 묘사한다.
도 6은 Siglec 리간드 원자가에서 다양한 구조를 보여주는 예시적인 Siglec 리간드 구조를 묘사한다.
도 7은 링커 구조에서 다양한 구조를 나타내는 예시적인 Siglec 리간드 구조를 묘사하며, 여기서 시알산-기반 모이어티에 근접한 영역은 PEG-기반 구조 또는 갈락토스-기반 구조로 구성된다.
도 8은 Siglec-2 결합에 대해 강화된(상단) 또는 강화되지 않은(중간) 예시적인 접합가능한 링커 구조, 및 Siglec-2에 결합하지 않는 음성 대조군 링커 구조(하단)를 묘사한다. 강화된 Siglec-리간드 링커 구조(Cpd. No. 26288, Siglec 리간드: 메틸-α-9-N-(비페닐-4-카르보닐)-아미노-9-데옥시-N-글리콜릴뉴라민산)(상단), 비-강화된 Siglec-2 결합 모이어티를 함유하는 Siglec-리간드 링커 구조(Cpd. No. 26614 , Siglec 리간드: N-글리콜릴 뉴라민산/Neu5Gc)(중간), 및 PEG-기반 비-Siglec 결합 접합가능한 링커 구조(Cpd. No. 26530 )(하단)가 도시되어 있다.
도 9a 및 9b는 아달리무맙 hIgG1-Siglec 리간드 접합체에 대한 예시적인 순도 및 물리화학적 특성화 데이터를 묘사한다. 아달리무맙 접합체는 접합 후 사용되는 Siglec-링커의 구조와 리간드/링커-대-약물 비율("LDR")에서 다양하다. 도 9a - 아달리무맙 접합체에 대한 모세관 겔 전기영동 데이터. 도 9b - 아달리무맙 IgG 및 아달리무맙 접합체에 대한 분석적 크기 배제 크로마토그래피 프로필.
도 10a 및 10b는 마우스 일차 B 세포가 B 세포 수용체 작용 항-IgD 항체 또는 항-IgD-Siglec 리간드 접합체로 처리되는 시험관내 B 세포 활성화 검정을 묘사한다. 항-IgD 및 항-IgD-Siglec 리간드 접합체의 B 세포 자극 활성을 용량 적정 실험에서 CD69 상향조절의 활성화 판독값과 비교한다. 상이한 처리 그룹에서의 CD69 수준은 CD69-양성인 세포의 백분율(도 10a) 또는 CD69 평균 형광 강도(MFI)(도 10b)를 통해 평가된다. 테스트된 접합체에서 Siglec 리간드는 링커 구조("PEG" 또는 "Gal") 및 원자가("1가" 또는 "2가")에서 다양하고 접합체는 또한 리간드/링커-대-약물 비율("LDR"), 또는 약물 분자당 Siglec 리간드 구조의 평균 수에서 다양하다.
도 11a 및 11b는 마우스 일차 B 세포가 B 세포 수용체 작용 항-IgD 항체 또는 항-IgD-Siglec 리간드 접합체로 처리되는 시험관내 B 세포 활성화 검정을 묘사한다. 항-IgD 항체 - Siglec 리간드 접합체는 3가 Siglec 리간드 구조를 담지한다. B 세포 활성화는 세포측정법에 의해 측정된 바와 같이 CD69 발현의 상향조절을 통해 측정된다. 상이한 처리 그룹에서의 CD69 수준은 CD69-양성인 세포의 백분율(도 11a) 또는 CD69 평균 형광 강도(MFI)(도 11b)를 통해 평가된다. 테스트된 접합체에서 Siglec 리간드는 링커 구조("PEG" 또는 "Gal")에서 다양하고 접합체는 또한 리간드/링커-대-약물 비율("LDR") 또는 약물 분자당 Siglec 리간드 구조의 평균 수에서 다양하다.
도 12a 및 12b는 마우스 일차 B 세포가 B 세포 수용체 작용 항-IgD 항체 또는 항-IgD-Siglec 리간드 접합체로 처리되는 시험관내 B 세포 활성화 검정을 묘사한다. 항-IgD 및 항-IgD-Siglec 리간드 접합체의 B 세포 자극 활성을 용량 적정 실험에서 CD69 상향조절의 활성화 판독값과 비교한다. 상이한 처리 그룹에서의 CD69 수준은 CD69-양성인 세포의 백분율(도 12a) 또는 CD69 평균 형광 강도(MFI)(도 12b)를 통해 평가된다. 테스트된 접합체에서 Siglec 리간드는 PEG-기반 링커 구조("PEG")를 함유하고 원자가에서 다양하다("1가", "2가" 및 "3가"). 접합체는 또한 리간드/링커-대-약물 비율("LDR") 또는 약물 분자당 Siglec 리간드 구조의 평균 수에서 다양하다.
도 13a 및 13b는 모체의, 비접합된 항-IgD 항체와 비교하여 마우스 일차 B 세포에 결합하는 Siglec 리간드-항-IgD 항체 접합체의 평가를 묘사한다. 결합은 Alexa-647-표지된 항-IgD 항체와의 경쟁 검정 형식에서 형광 세포계수법에 의해 평가된다. 도 13a는 비표지된 항-IgD-Siglec 리간드 접합체 및 비접합된, 비표지된 항-IgD 항체에 의한 IgD+ B 세포에 대한 형광-표지된 항-IgD 결합의 농도-의존적 억제에 대한 용량-반응 결과를 묘사한다. 각각의 비표지된 테스트 항목에 대한, 나노몰로의 결합 IC50이 표시된다. 도 13b는 결합 검정 시스템에 대한 개략도이다.
도 14는 마우스 일차 B 세포가 B 세포 수용체 작용 항-IgD 항체 또는 항-IgD-Siglec 리간드 접합체로 처리되는 시험관내 B 세포 활성화 검정을 묘사하고, 여기서 동일한 테스트 항목이 야생형 마우스로부터의 B 세포를 처리하는데 사용된다. 접합체 Siglec 리간드("1가 PEG - LDR 9", "2가 PEG - LDR 6", "3가 PEG - LDR 6" 및 "3가 PEG - LDR 8")는 Siglec-2 결합에 대해 강화된다. 항-IgD 및 항-IgD-Siglec 리간드 접합체의 B 세포 자극 활성을 용량 적정 실험에서 CD69 상향조절의 활성화 판독값과 비교한다. 상이한 처리 그룹에서의 CD69 수준은 CD69-양성인 세포의 백분율을 통해 평가된다. 테스트된 접합체에서의 Siglec 리간드는 PEG-기반 링커 구조("PEG")를 함유하고 원자가에서 다양하다("1가", "2가" 및 "3가"). 접합체는 또한 리간드/링커-대-약물 비율("LDR") 또는 약물 분자당 Siglec 리간드 구조의 평균 수에서 다양하다.
도 15는 모체의, 비접합된 항-IgD 항체와 비교하여 마우스 일차 B 세포에 대한 Siglec 리간드-항-IgD 항체 접합체 결합의 평가를 묘사한다. 결합은 Alexa-647-표지된 항-IgD 항체와의 경쟁 검정 형식으로 형광 세포계수법에 의해 평가된다. 비표지된 항-IgD-Siglec 리간드 접합체 및 비접합된, 비표지된 항-IgD 항체에 의한 IgD+ B 세포에 대한 형광-표지된 항-IgD 결합의 농도-의존적 억제에 대한 용량-반응 결과가 도시되어 있다. 각각의 비표지된 테스트 항목에 대해, 나노몰에서의 결합 IC50이 표시된다. 테스트 항목은 도 15에서의 것과 동일하다.
도 16a 및 16b는 마우스 일차 B 세포가 B 세포 수용체 작용 항-IgD 항체 또는 항-IgD-Siglec 리간드 접합체로 처리되는 시험관내 B 세포 활성화 검정을 묘사하고, 여기서 Siglec 리간드는 Siglec-2 결합에 대해 강화되거나("BPC-Neu5Gc 1가 PEG - LDR 9" 및 "BPC-Neu5Gc 2가 PEG - LDR 6") 또는 강화되지 않는다("Neu5Gc 1가 PEG - LDR 10" 및 "Neu5Gc 2가 PEG - LDR 7"). 항-IgD 및 항-IgD-Siglec 리간드 접합체의 B 세포 자극 활성을 용량 적정 실험에서 CD69 상향조절의 활성화 판독값과 비교한다. 상이한 처리 그룹에서의 CD69 수준은 CD69-양성인 세포의 백분율을 통해 평가된다. 1가(도 16a) 및 2가(도 16b) Siglec 리간드 접합체에 대한 용량 반응 곡선이 도시되어 있다. 접합체는 또한 리간드/링커-대-약물 비율("LDR") 또는 약물 분자당 Siglec 리간드 구조의 평균 수에서 다양하다.
도 17a 내지 17c는 B 세포 수용체 활성화의 Siglec 리간드-접합체-매개된 억제를 위한 CD22 계합의 중요성에 대해 시험하는 시험관내 일차 마우스 B 세포 활성화 검정을 묘사한다. 마우스 일차 B 세포가 B 세포 수용체 작용 항-IgD 항체 또는 강화된 Siglec 링커("BPC-Neu5Gc 1가 PEG - LDR 9", "BPC-Neu5Gc 2가 PEG - LDR 6", "BPC-Neu5Gc 3가 PEG - LDR 6" 및 "BPC-Neu5Gc 3가 PEG - LDR 8") 또는 Siglec 결합 결정자를 결하는 아시알로 링커("Asialo 1가 PEG - LDR 7", "Asialo 2가 PEG - LDR 8" 및 "Asialo 3가 PEG - LDR 7")를 담지하는 다양한 항-IgD-Siglec 리간드 접합체로 처리되었다. 항-IgD 및 항-IgD-Siglec 리간드 접합체의 B 세포 자극 활성을 용량 적정 실험에서 CD69 상향조절의 활성화 판독값과 비교한다. 상이한 처리 그룹에서의 CD69 수준은 CD69-양성인 세포의 백분율을 통해 평가된다. 테스트된 접합체에서의 Siglec 리간드는 PEG-기반 링커 구조("PEG")를 함유하고 원자가에서 다양하다("1가"(도 17a), "2가"(도 17b) 및 "3가"(도 17c)). 접합체는 또한 리간드/링커-대-약물 비율("LDR") 또는 약물 분자당 Siglec 리간드 구조의 평균 수에서 다양하다.
도 18a 내지 18c는 모체의 항-IgD 항체에 비해 B 세포에 대한 Siglec 리간드-항-IgD 항체 접합체 결합의 평가를 묘사한다. 항-IgD-Siglec 리간드 접합체는 강화된 Siglec 링커("BPC-Neu5Gc 1가 PEG - LDR 9", "BPC-Neu5Gc 2가 PEG - LDR 6", "BPC-Neu5Gc 3가 PEG - LDR 6" 및 "BPC- Neu5Gc 3가 PEG - LDR 8") 또는 Siglec 결합 결정자를 결하는 아시알로 링커("Asialo 1가 PEG - LDR 7", "Asialo 2가 PEG - LDR 8" 및 "Asialo 3가 PEG - LDR 7")를 담지한다. 결합은 Alexa-647-표지된 항-IgD 항체와의 경쟁 검정 형식에서 형광 세포계수법에 의해 평가된다. 비표지된 항-IgD-Siglec 리간드 접합체 및 비접합된 비표지된 항-IgD 항체에 의한 IgD+ B 세포에 대한 형광-표지된 항-IgD 결합의 농도-의존적 억제에 대한 용량-반응 결과가 도시되어 있다. 테스트 항목은 도 17에 사용된 것과 동일하다. 테스트된 접합체에서의 Siglec 리간드는 PEG-기반 링커 구조("PEG")를 함유하고 원자가에서 다양하다("1가"(도 18a), "2가"(도 18b) 및 "3가"(도 18c)). 접합체는 또한 리간드/링커-대-약물 비율("LDR") 또는 약물 분자당 Siglec 리간드 구조의 평균 수에서 다양하다.
도 19a 및 19b는 B 세포 수용체 활성화의 억제를 위한 시스 B 세포 수용체 및 CD22 공동-계합의 중요성에 대한 시험관내 일차 마우스 B 세포 활성화 검정을 묘사한다. 도 19a는 항-IgD BCR 작용제 및 Siglec-2-계합 모이어티가 동일한 또는 별도의 분자 상에 제시된 B 세포 수용체 활성화에 대한 모델을 묘사한다. 항-IgD, 항-IgD-Siglec 리간드 접합체 또는 2nM 항-IgD와 다양한 농도의 대조군 항체-Siglec 리간드 접합체의 혼합물의 B 세포 자극 활성을 용량 적정 실험에서 CD69 상향조절의 활성화 판독값과 비교한다. 상이한 처리 그룹에서의 CD69 수준은 CD69 평균 형광 강도(MFI)를 통해 평가된다(도 19b). 테스트된 접합체에서의 Siglec 리간드는 PEG-기반 링커 구조("PEG")를 함유하고 2가 Siglec 리간드 구조를 담지한다.
도 20은 작용적 항-IgD 항체 및 비-작용적 Siglec 리간드-항-IgD 접합체의 혼합물에서 BCR 작용기전 억제에 대해 시험하는 시험관내 일차 마우스 B 세포 활성화 검정을 묘사한다. Siglec 리간드-항-IgD 접합체는 2nM 항-IgD BCR 작용제의 존재 또는 부재에서 적정된다. 항-IgD, 항-IgD-Siglec 리간드 접합체 또는 다양한 농도의 항-IgD-Siglec 리간드 접합체와 2nM 항-IgD의 혼합물의 B 세포 자극 활성을 용량 적정 실험에서 CD69 상향조절의 활성화 판독값과 비교한다. 상이한 처리 그룹에서의 CD69 수준은 CD69 평균 형광 강도(MFI)를 통해 평가된다. 테스트된 항-IgD 접합체는 6의 리간드/링커-대-약물 비율("LDR")로 2가, Siglec-2-강화된 리간드(MPB-Neu5Ac) 및 PEG-기반 링커를 담지한다.
도 21a 및 21b는 인간 일차 B 세포 및 B 세포 수용체 작용 항-IgM 항체 또는 동일한 항-IgM 항체와의 Siglec 리간드 접합체를 사용하는 시험관내 B 세포 활성화 검정을 묘사한다. 항-IgM 및 항-IgM-Siglec 리간드 접합체의 B 세포 자극 활성을 용량 적정 실험에서 CD69 상향조절의 활성화 판독값과 비교한다. 상이한 처리 그룹에서의 CD69 수준은 CD69-양성인 세포의 백분율을 통해 평가된다. 갈락토스-기반 링커(도 21a) 및 PEG-기반 링커(도 21b)를 사용하는 접합체로의 결과가 도시되어 있다. 모든 접합체는 다양한 원자가 및 리간드/링커-대-약물 비율("LDR") 또는 약물 분자당 평균 Siglec 리간드 구조 수를 갖는 Siglec-2-강화된 MPB-Neu5Ac 구조를 담지한다.
도 22a 및 22b는 인간 일차 B 세포 및 B 세포 수용체 작용 항-IgM 항체 또는 동일한 항-IgM 항체와의 Siglec 리간드 접합체를 사용하는 시험관내 B 세포 활성화 검정을 묘사한다. 접합체는 CD22 결합에 대해 강화된("BPC-Neu5Gc 1가 PEG - LDR5-αIgM" 및 "BPC-Neu5Gc 2가 PEG - LDR9-αIgM") 또는 비강화된("Neu5Gc 1가 PEG - LDR6-αIgM" 및 "Neu5Gc 2가 PEG - LDR6-αIgM") Siglec 리간드 구조를 담지한다. 항-IgM 및 항-IgM-Siglec 리간드 접합체의 B 세포 자극 활성을 용량 적정 실험에서 CD69 상향조절의 활성화 판독값과 비교한다. 상이한 처리 그룹에서의 CD69 수준은 CD69-양성인 세포의 백분율을 통해 평가된다. 테스트된 접합체의 Siglec 리간드는 PEG-기반 링커 구조("PEG")를 함유하고 원자가에서 다양하다("1가"(도 22a) 또는 "2가"(도 22b)).
도 23a 및 23b는 Siglec 리간드-항-IgM 항체 접합체 및 인간 B 세포에 대한 모체의 항-IgM 결합의 평가를 묘사한다. 항-IgM - Siglec 리간드는 CD22 결합에 대해 강화되거나("BPC-Neu5Gc 1가 PEG - LDR5-αIgM" 및 "BPC-Neu5Gc 2가 PEG - LDR9-αIgM") 또는 비강화된다("Neu5Gc 1가 PEG - LDR6-αIgM" 및 "Neu5Gc 2가 PEG - LDR6-αIgM"). 결합은 Alexa-647-표지된 항-IgM 항체와의 경쟁 검정 형식에서 형광 세포계수법에 의해 평가된다. 비표지된 항-IgM-Siglec 리간드 접합체 및 비접합된, 비표지된 항-IgM 항체에 의한 IgM+ B 세포에 대한 형광-표지된 항-IgM 결합의 농도-의존적 억제에 대한 용량-반응 결과가 도시되어 있다. 각각의 비표지된 테스트 항목에 대한, 나노몰에서의 결합 IC50이 표시된다. 테스트 항목은 도 22에 대한 실험에 사용된 것과 동일하다.
도 24a 내지 24c는 아달리무맙 및 Siglec 리간드-아달리무맙 접합체에 대한 마우스에서의 항-약물 항체 반응의 평가를 묘사한다. 접합체는 갈락토스-함유 링커 구조를 갖는 Siglec 리간드에 대해 1가, 2가 또는 3가인 BPC-Neu5Gc-기반 Siglec 리간드-링커 구조를 담지한다. 마우스는 단일 4mg/kg i.v. 용량의 아달리무맙 또는 아달리무맙-Siglec 리간드 접합체를 투여받았다. 아달리무맙/아달리무맙 접합체에 대한 혈청 IgG 수준을 14일차, 21일차 및 28일차에 측정하였다. 도 24a, 도 24b 및 도 241c는 각각 14일차, 21일차 및 28일차에 개별 동물 혈청 IgG 역가 값(n = 5 마우스)을 보여준다.
도 25a 내지 25c는 아달리무맙 및 Siglec 리간드-아달리무맙 접합체에 대한 마우스에서의 항-약물 항체 반응의 평가를 묘사한다. 접합체는 PEG-함유 링커 구조를 갖는 Siglec 리간드에 대해 1가, 2가 또는 3가인 BPC-Neu5Gc-기반 Siglec 리간드-링커 구조를 담지한다. 마우스는 단일 4mg/kg i.v. 용량의 아달리무맙 또는 아달리무맙-Siglec 리간드 접합체를 투여받았다. 아달리무맙/아달리무맙 접합체에 대한 혈청 IgG 수준을 14일차, 21일차 및 28일차에 측정하였다. 도 25a, 도 25b 및 도 25c는 각각 14일차, 21일차 및 28일차에 개별 동물 혈청 IgG 역가 값(n = 5 마우스)을 보여준다
도 26a 및 26b는 마우스에서 아달리무맙 hIgG 및 Siglec 리간드-아달리무맙 hIgG1 접합체에 대한 혈청 약동학의 분석을 묘사한다. 접합체는 PEG-함유 링커 구조를 갖는 Siglec 리간드에 대해 1가, 2가 또는 3가인 BPC-Neu5Gc-기반 Siglec 리간드-링커 구조를 담지한다. 테스트 항목은 도 25에 사용된 것과 동일하다. 정맥내 투약 후, 항-인간 IgG Fc ELISA(도 26a) 및 SPR(표면 플라스몬 공명, 도 26b)에 의해 테스트 항목 농도에 대해 혈청 샘플을 분석하였다.
도 27a 내지 27g는 아달리무맙 hIgG 및 Siglec 리간드-아달리무맙 hIgG1 접합체에 대한 TNFα 결합 활성의 시험관내 표면 플라즈몬 공명(SPR) 분석을 묘사한다. 도 27a는 TNFα 분석물이 단백질 A 칩-고정화된 아달리무맙 또는 아달리무맙-Siglec 리간드 접합체에 결합하는 SPR 검정 셋업에 대한 개략도이다. TNFα 농도는 농도 의존성, 결합 동역학 및 친화성을 평가하기 위해 다양하다. 도 27b는 센서그램 연합 단계(RUmax)의 말단에서 결합의 농도 의존성을 나타낸다. 도 27c-g는 아달리무맙(도 27c), 아달리무맙 BPC-Neu5Gc 1가 GAL LDR 4(도 27d), 아달리무맙 BPC-Neu5Gc 1가 GAL LDR 7(도 27e), 아달리무맙 BPC-Neu5Gc 2가 GAL LDR 8.5(도 27f), 및 아달리무맙 BPC-Neu5Gc 3가 GAL LDR 5(도 27g)에 대한 개별 센서그램이다.
도 28a 및 28b는 1) 아달리무맙, 2) Siglec 리간드-아달리무맙 접합체("BPC-Neu5Gc 1가 PEG LDR 10"), 및 3) 음성 대조군, 비-Siglec-2-결합 링커 접합체("Neg Ctrl 1가 PEG LDR 7", "Neg Ctrl 2가 PEG LDR 7" 및 "Neg Ctrl 3가 PEG LDR 6"에 대한 마우스에서의 항-약물 항체 반응의 평가를 묘사한다. 마우스에는 단일 4mg/kg i.v. 용량의 아달리무맙, 아달리무맙-Siglec 리간드 접합체 또는 아달리무맙-음성 대조군 링커 접합체를 투여하였다. 아달리무맙/아달리무맙 접합체에 대한 혈청 IgG 수준을 14일차 및 28일차에 측정하였다. 도 28a 및 도 28b는 각각 14일차 및 28일차에 개별 동물 혈청 IgG 역가 값(n = 5 마우스)을 나타낸다.
도 29는 1) 아달리무맙, 2) 강화된 Siglec 리간드-아달리무맙 접합체("BPC-Neu5Gc 1가 PEG LDR 7"), 및 3) 비-강화된 Siglec 리간드-아달리무맙 접합체("Neu5Gc 1가 PEG LDR 6", "Neu5Gc 2가 PEG LDR 5", 및 "Neu5Gc 3가 PEG LDR 5")에 대한 마우스에서의 항-약물 항체 반응의 평가를 묘사한다. 마우스에는 단일 4mg/kg i.v. 용량의 아달리무맙 IgG 또는 접합체를 투여하였다. 아달리무맙/아달리무맙 접합체에 대한 혈청 IgG 수준을 28일차에 측정했다. 28일차에 대한 개별 동물 혈청 IgG 역가 값(n = 5 마우스)이 도시되어 있다.
도 30a 내지 30e는 4mg/kg 아달리무맙, 아달리무맙-Siglec 리간드 접합체(아달리무맙-BPC-Neu5Gc 2가 PEG LDR 10), 또는 PBS 비히클(0일차) 및 이후 매주 200μg의 난백 리소자임(HEL)을 투여한(7, 14, 21 및 28일차) 것의 상이한 조합으로 투여된 마우스에서의 IgG 면역 반응의 평가를 묘사한다. 연구 계획은 도 30a에 도시되어 있다. 아달리무맙/아달리무맙-Siglec 리간드 접합체 및 HEL에 대해 마우스 혈청 IgG 역가를 개별적으로 측정하였다. 항-아달리무맙/아달리무맙 접합체(도 30b) 및 HEL(도 30d)에 대한 28일차 혈청 IgG 수준이 도시되어 있다. 항-아달리무맙/아달리무맙 접합체(도 30c) 및 HEL(도 30e)에 대한 역가가 도시되어 있다.
도 31a 내지 31c는 HEL 및 1가 Siglec 리간드-HEL 접합체("HEL-BPC-Neu5Gc 1가 PEG LDR 1.6)에 대한 마우스에서의 항-약물 항체 반응의 평가를 묘사한다. 연구 계획은 도 31a에 도시되어 있다. 마우스에는 4회 매주 200μg i.v. 용량의 HEL 또는 HEL 접합체(0, 7, 14 및 21일차)를 투여하였다. HEL/HEL 접합체에 대한 혈청 IgG 수준을 27일차에 측정하였다. 도 31b는 혈청 샘플로부터의 IgG 수준 희석 시리즈를 도시한다. 도 31c는 개별 동물 27일차 혈청 IgG 역가 값을 도시한다(n = 5 마우스).
도 32는 재조합 아스파라기나제 효소 및 아스파라기나제-Siglec 리간드 접합체("Asn'ase BPC-Neu5Gc 1가 PEG - LDR 10" 및 "Asn'ase BPC-Neu5Gc 3가 PEG - LDR 3.5")에 대한 마우스에서의 항-약물 항체 반응의 평가를 묘사한다. BALB/c(n = 그룹당 5)에는 15μg 아스파라기나제 또는 아스파라기나제 접합체를 매주(4회) 투여했다. 항-아스파라기나아제 IgG 역가는 ELISA 검정에 의해 28일차에 측정되었다. 역가는 각 테스트 항목에 대해 도시된다.
개체에서 그 자신에 대한 면역 반응의 전개를 억제하는 저면역원성 생물치료제 조성물이 제공된다. 또한 이러한 저면역원성 생물치료제를 포함하는 약학적 조성물, 이러한 저면역원성 생물치료제를 제조하는 방법, 및 이러한 저면역원성 생물치료제를 치료제로서 및 연구에 사용하는 방법이 제공된다. 이러한 저면역원성 생물치료제는 치료적으로 유효하게 되도록 생물치료제의 반복 또는 만성 투여를 필요로 하는 질환의 치료에서의 특별한 용도를 발견한다. 발명의 이들 및 다른 목적, 이점 및 특징은 하기에 보다 충분히 기재된 바와 같이 조성물 및 방법의 세부 사항을 읽을 때 당업자에게 명백해질 것이다.
본 방법 및 조성물을 기술하기 전에, 본 발명은 기술된 특정 방법 또는 조성물에 제한되지 않으며, 물론 다양할 수 있음을 이해해야 한다. 또한 본 발명의 범주는 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것이기 때문에 본 명세서에서 사용된 용어는 단지 특정 실시형태를 설명하기 위한 것이고 제한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다.
값의 범위가 제공되는 경우, 문맥에서 달리 명시하지 않는 한 하한 단위의 10분의 1에 해당하는 범위의 상한과 하한 사이에 개재하는 값도 구체적으로 개시되는 것으로 이해된다. 임의의 명시된 값 또는 명시된 범위 내의 개재하는 값과 그 명시된 범위 내의 임의의 다른 명시된 또는 개재하는 값 사이의 각각의 더 작은 범위는 발명 내에 포괄된다. 이들 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 범위에 포함되거나 배제될 수 있고, 더 작은 범위에 어느 하나, 어느 쪽도 아닌 또는 양쪽 한계가 포함되는 각각의 범위는 또한 발명 내에 포괄되며, 명시된 범위에서 임의의 특별히 배제된 한계에 따라야 한다. 명시된 범위가 한계 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 경우, 이들 포함된 한계 중 하나 또는 둘 모두를 제외한 범위도 발명에 포함된다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기술된 것과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실행 또는 시험에 사용될 수 있지만, 일부 잠재적이고 바람직한 방법 및 재료가 이제 기술된다. 본 명세서에 언급된 모든 공보는 공보가 인용된 것과 관련된 방법 및/또는 재료를 개시하고 기술하기 위해 참조로 본 명세서에 포함된다. 본 개시내용은 모순이 있는 범위까지 포함된 공보의 개시내용을 대체하는 것으로 이해된다.
본 개시내용을 읽을 때 당업자에게 명백할 바와 같이, 본 명세서에 기술되고 예시된 각각의 개별적인 실시형태는 본 발명의 범주 또는 정신으로부터 벗어나지 않고 임의의 다른 몇몇 실시형태의 특징과 쉽게 분리되거나 조합될 수 있는 별개의 구성요소 및 특징을 갖는다. 임의의 언급된 방법은 언급된 사건의 순서 또는 논리적으로 가능한 임의의 다른 순서로 수행될 수 있다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥상 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다는 점에 유의해야 한다. 따라서, 예를 들어 "세포"에 대한 언급은 다수의 그러한 세포를 포함하고 "펩티드"에 대한 언급은 하나 이상의 펩티드 및 그의 등가물, 예를 들어 당업자에게 공지된 폴리펩티드에 대한 언급 등을 포함한다.
전환 용어 "포함하는"은 포괄적이거나 개방적이고 추가의 언급되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 전환 문구 "구성되는"은 특정되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 배제한다. 전환 문구 "필수적으로 구성되는"은 특정된 요소, 재료 또는 단계 및 발명의 기본적이고 신규한 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것으로 범주를 한정한다.
본 명세서에서 논의된 공보는 본 출원의 출원일 이전의 그의 개시를 위해서만 제공된다. 본 명세서의 어떤 것도 본 발명이 선행 발명에 의해 그러한 공보보다 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 더욱이, 제공된 공보의 일자는 실제 공보 일자와 다를 수 있어 독립적으로 확인될 필요가 있을 수 있다.
조성물
저면역원성인 조작된 생물치료제, 이러한 생물치료제를 제조하는 방법 및 이의 사용에 대한 방법이 본 명세서에 개시된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "생물치료제"는 당, 아미노산, 단백질, 지질 또는 핵산 또는 이들 물질의 복합체 조합으로 구성되고 개체에서 치료적인 조성물을 지칭한다. 생물치료제의 비제한적 예는 단백질 치료제, 예를 들어 항체 치료제, 융합 단백질 치료제, 효소 치료제; 바이러스 치료제; 세포 치료제; 및 핵산 치료제를 포함한다. "조작된" 생물치료제는 그렇게 조작되지 않은 생물치료제, 즉 본 명세서에서 조작되지 않은 생물치료제로도 지칭되는 모체의 생물치료제에 비해 하나 이상의 변형을 포함하도록 설계 및 구축된 생물치료제를 의미한다. "저면역원성" 조성물은 참조 조성물, 예를 들어, 개체에게 투여될 때 상응하는 조작되지 않은 조성물에 비해 개체에서 원치 않는 약물-특이적 면역 반응을 억제하는; 예를 들어 참조, 예를 들어 조작되지 않은 생물치료제에 비해 면역 반응을 50% 이상, 일부 경우에는 60%, 70%, 80% 이상, 예를 들어 85%, 90%, 95% 이상, 특정 경우에는 98%, 99% 또는 100% 감소시키는 것, 즉 면역 반응이 검출가능하지 않은 조성물을 의미하며, 즉 생물치료제는 비면역원성이다. 따라서, 변형되지 않은 생물치료제와 비교하여 투여된 개체에서 약물-특이적 면역 반응을 억제할 수 있는 생물치료제를 제공하는 하나 이상의 변형을 포함하면서 약리학적 활성을 유지하는 조작된 생물치료제가 본 명세서에 개시된다. 일부 실시형태에서, 면역 반응은 체액성 면역 반응, 즉 B 세포-구동 반응, 예를 들어 IgG 반응이다.
치료적 활성을 유지하면서 상응하는 조작되지 않은 생물치료제에 비해 변형된 시알산-결합 면역글로불린-유형 렉틴(Siglec) 리간드 프로필을 포함하도록 조작된 생물치료제를 포함하는 조작된 저면역원성 생물치료제가 본 명세서에 개시된다.
"Siglec"은 주로 백혈구의 표면에서 발견되고 표적 생물제제의 시알산에 결합하는 단백질 계열의 구성원을 의미한다. "Siglec 리간드 프로필"은 생물치료제에 공유적으로 결합된 Siglec 리간드의 양 및/또는 위치를 의미한다. 많은 경우에, 변형은 생물치료제에 공유적으로 결합된 Siglec 리간드의 양 및/또는 위치에서의 증가이며, 여기서 증가는 생물치료제가 상응하는 변형되지 않은 생물치료제에 비해 개체에서 덜 면역원성이 되게 한다.
다양한 유형의 백혈구 상에서 발현되고 억제성 모티프 또는 활성화 모티프를 포함하는지 여부에 의존하여 발현되는 세포에 억제성 또는 활성화 효과를 발휘할 수 있는 14가지 상이한 포유류 Siglec이 있다. Siglec은 서로 다른 시알산에 대해 뚜렷한 결합 선호도를 나타내고 연결의 유형과 기저 당의 유형도 시알산의 인식에 영향을 미친다. (Varki, A. and Crocker, P.R. (2009) I-type lectins. In Essentials of Glycobiology (2nd edn) (Varki, A. et al., eds), pp. 459-474, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Crocker, P.R. et al. (2007) Nat. Rev. Immunol. 7, 255-266). 이와 함께, 이것은 생물치료제에 대한 면역 반응을 조절하기 위해 배치될 수 있는 일련의 대체 Siglec 리간드를 제공한다. 특히 흥미로운 것은 생물치료제에 대한 면역 반응, 및 특히 생물치료제에 대한 B 세포 반응의 억제이다. 따라서, 일부 실시형태에서, Siglec 리간드는 B 림프구 상에 발현되는 Siglec, 예를 들어 Siglec-2(CD22라고도 함), Siglec-5(CD170), Siglec-6, Siglec-9(CD329), 또는 Siglec-10(Siglec-G)에 대한 리간드이다. 일부 실시형태에서, Siglec은 Siglec-2이다. 일부 실시형태에서, Siglec은 Siglec-5이다. 일부 실시형태에서, Siglec은 Siglec-6이다. 일부 실시형태에서, Siglec은 Siglec-9이다. 일부 실시형태에서, Siglec은 Siglec-10이다. 일부 실시형태에서, 저면역원성 생물치료제는 하나의 Siglec에 대한 시알산 리간드를 포함하도록 조작되었다. 다른 실시형태에서, 저면역원성 생물치료제는 2개 이상의 Siglec, 예를 들어 3개 Siglec 또는 4개 Siglec, 경우에 따라 5개 Siglec에 대한 Siglec 리간드를 포함하도록 조작되었다. 어떤 경우에는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 15개 Siglec이 있다.
일부 경우에, 조작된 저면역원성 생물치료제는 식 (I)의 것이다:
[Xn-L]m -Y
(I)
여기서 X는 시알산기이고, L은 선택적 링커이고, Y는 생물치료제이고, n은 1 이상의 정수이고, m은 1 이상의 정수이다. X와 L 기의 조합, 즉 [Xn-L]은 본 명세서에서 집합적으로 Siglec 리간드로 지칭된다.
시알산기 X
X는 시알산기이며, 여기서 "시알산"이라는 용어는 9-탄소 백본을 갖는 알파-케토산 당을 지칭한다. 따라서, X는 시알산기이므로, X는 시알산 또는 이의 유도체를 포함한다. 시알산 또는 이의 유도체는 천연 발생 또는 비-천연 발생일 수 있다. 일부 경우에, X는 시알산 또는 이의 유도체의 일 예인 뉴라민산을 포함한다.
일부 실시형태에서, 시알산은 천연 발생 시알산이다. 시알산 계열은 대략적으로 50개 천연 발생 구성원을 포함한다. 이들 중 가장 흔한 것은 N-아세틸뉴라민산(Neu5Ac), N-글리콜릴뉴라민산(Neu5Gc, 단일 산소 원자를 추가함에 의해(즉, 하이드록실화) Neu5Ac에서 효소적으로 생산됨), 2-케토-3 데옥시노눌로손산(Kdn) 및 뉴라민산(Neu)이고; 다른 것들은, 예를 들어, Schauer (2000) Glycoconjugate J 17:485-499에서 검토된 바와 같이 당업계에 잘 알려져 있다. 따라서, 예를 들어, 표적화되는 Siglec이 CD22인 경우, Siglec 리간드는 천연 발생 CD22 리간드, 즉 Neu5Acα2-6Galβ-4GlcNAc-6S와 같은 α2,6-연결된 시알산이고; Siglec이 Siglec-5인 경우, Siglec 리간드는 천연 발생 Siglec-5 리간드, 즉 Neu5Acα8-8Neu5Ac 및 Neu5Acα2-6GalNAc일 수 있으며; Siglec이 Siglec-6인 경우, Siglec 리간드는 천연 발생 Siglec-6 리간드, 즉 Neu5Acα2-6GalNAc일 수 있으며; Siglec이 Siglec-9인 경우, Siglec 리간드는 천연 발생 Siglec-9 리간드, 즉 Neu5Acα2-3Galβ-4GlcNAc-6Sα-3푸코스일 수 있고; 또는 Siglec이 Siglec-10/G인 경우, Siglec 리간드는 천연 발생 Siglec-10 리간드, 즉 α2,6-연결된 시알산 또는 α2,3-연결된 시알산, 예컨대 Neu5Acα2-6Galβ-4GlcNAc일 수 있다(O'Reilly, M.K. and Paulson, J.C. (2009) Trends Pharmacol. Sci. 30, 240-248). 일부 실시형태에서, 저면역원성 생물치료제는 2개 이상의 Siglec, 예를 들어 3개 Siglec 또는 4개 Siglec, 어떤 경우에는 5개 Siglec에 대한 시알산 리간드를 포함하도록 조작되었다. 일부 경우에는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 15개 Siglec이 있다.
일부 실시형태에서, 시알산은 비-천연 발생, 즉 합성 시알산이다. 또한 당업계에 공지되어 있고 "시알산 모방체" 또는 "SAM"으로 본 명세서에서 지칭되는 "합성 시알산"은 자연에서 발생하지 않는 시알산, 즉 비-천연 발생인 9-탄소 백본을 포함하는 알파-케토산 당 유도체를 지칭한다. Siglec에 대한 약한 1가 결합 친화성(0.1-3mM)를 갖는 천연 시알산을 포함하는 Siglec 리간드와 비교할 때, SAM을 포함하는 Siglec 리간드는 나노몰 범위에서의 결합 친화성을 특징으로 할 수 있다(Crocker, P.R. et al. (2007) Nat. Rev. Immunol.7, 255-266; Prescher, H. et al.(2014) ACS Chem. Biol. 9, 1444-1450). 대상 조성물에서 사용되는 SAM은 아글리콘(C-2)에서 백본의 나머지 부분(C-3 내지 C-9)에 이르는 천연 시알산의 하나 이상의 위치가 Siglec 결합을 개선하도록 변형된 것을 포함한다. 예를 들어, 변형 C-9-NH2(9-NH2-Neu5Ac/Me) 및 C-5-FAc(Neu5FAc/Me)는 SAM과 Siglec-2 사이의 수소 결합 및 친유성 상호작용에서 증가로 인해 Siglec-2 결합을 개선하고, 친유성 기를 통합하는 것은 이후 Siglec-2에 대해 증가된 결합 친화성을 갖는 추가 SAM을 합리적으로 설계하는데 사용되었다(van Rossenberg, S.M.W. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276, 12967-12973; Kelm, S. et al. (2002) J. Exp. Med. 195, 1207-1213; Zaccai, N.R. et al. (2003) Structure 11, 557-567). 본 출원에서 사용되는 SAM의 다른 비제한적인 예는 9-N-비페닐카르복실-NeuAcα2-Galβ1-4GlcNAc(6'-BPCNeuAc), NeuAcα2-6Galβ1-4GlcNAc, NeuAcα2-6Galβ1-4(6-술포)GlcNAc; Bull et al. (2016) Sialic Acid Mimetics to Target the Sialic Acid-Siglec Axis. Trends Biochem Sci. 41(6):519-531 및 Prescher, H. et al. (2014) Discovery of multifold modified sialosides as human CD22/Siglec-2 ligands with nanomolar activity on B-cells. ACS Chem. Biol. 9, 1444-1450에 개시된 이들 SAM; 및 미국 특허 번호 8,357,671, 미국 특허 번호 9,522,183, 미국 특허 번호 9,981,023에 개시된 이들 SAM을 포함하며, 이의 전체 개시내용은 본 명세서에 참조로 포함된다. 특정 실시형태에서, SAM은 아래 표 1에 제공된 SAM이다.
표 1
상기 식 (I)에 기재된 바와 같이, n은 1 내지 20, 또는 1 내지 15, 또는 1 내지 10, 또는 1 내지 5의 정수와 같이 1 이상의 정수이다. 일부 경우에, n은 1, 2, 3, 4, 5이다. 일부 경우에, n은 1이다. 일부 경우에, n은 2이다. 일부 경우에, n은 3이다. 일부 경우에, n은 4이다. 일부 경우에, n은 5이다.
하나 초과의 X가 존재하는 경우, 즉 n이 1보다 큰 경우 X 기는 서로 같거나 다를 수 있다. L이 존재하면 각 X는 L에 직접적으로 공유적으로 결합되고 L은 Y에 직접적으로 공유적으로 결합된다. L이 없으면 각 X는 Y에 직접적으로 공유적으로 결합된다. 일부 경우에 n은 1이다. 일부 경우에, n은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10과 같이 2 이상의 정수이다.
전술한 바와 같이, m은 1 이상의 정수이다. 일부 경우에, m은 2 이상, 3 이상, 5 이상 또는 10 이상이다. 일부 경우에, m의 범위는 1에서 20, 예컨대 2에서 10이다.
링커 L
L은 선택적 링커이다. 이와 같이, 일부 경우에 조작된 저면역원성 생물치료제는 링커를 갖고, 조작된 저면역원성 생물치료제는 식 [Xn-L]m-Y로 기술될 수 있다. 다른 경우에, 조작된 저면역원성 생물치료제는 링커를 갖지 않고, 조작된 생물치료제는 식 [Xn]m-Y로 기술될 수 있다.
조작된 저면역원성 생물치료제의 실시형태는 [Xn-L]m-Y의 가능한 구성을 입증하기 위해 사용될 수 있다. 상술한 바와 같이, X는 시알산 또는 그 유도체를 포함하는 시알산기이다. 아래 도시된 화합물에서, 단일 X 기에 해당하는 단일 뉴라민산기가 존재한다. 따라서, 아래 실시형태에서 n은 1이다. 식 (페닐)-C(O)-페닐렌-을 갖는 뉴라민산의 왼쪽에 도시된 기는 X 기의 일부로 간주될 수 있다. 생물치료제 Y가 화합물에 도시되지는 않지만, -C(O)-O-C6F5 기는 생물치료제 Y와 공유 결합을 형성하는 화학 반응을 겪을 수 있다.
하기 실시형태에서는 3개의 뉴라민산기를 나타내어 X기가 3개이므로 n이 3임을 나타낸다. 부가하여, 3개의 X기는 라이신 잔기의 유도체를 포함하는 분지 기를 통해 서로 공유적으로 결합된다. 이 분지 기는 링커 L의 일부이다. 다른 방식으로 말하면, 이 실시형태는 선택적인 링커 L을 포함하며, 여기서 L은 3개 X 기를 서로 공유적으로 연결하는 분지 기이다. 링커 L은 또한 생물치료제 Y와 공유 결합을 형성하는 화학 반응을 겪을 수 있는 -C(O)-O-C6F5 기에 X 기를 공유적으로 연결한다. 따라서, 링커 L은 또한 X 기를 생물치료제 Y에 공유적으로 연결한다.
상술한 바와 같이 X기와 L기의 조합은 총칭하여 Siglec 리간드로 지칭된다. 즉, [Xn-L]은 Siglec 리간드이다.
일부 실시형태에서, 각각의 X의 각각의 시알산기는 당 기를 포함하지 않는 원자의 사슬을 통해 생물치료제 Y에 공유적으로 연결된다. 예를 들어, 각각의 X 기는 단일 시알산기를 포함하지만 다른 당 기는 포함하지 않는다. 더욱이, 일부 실시형태에서, L이 존재하는 경우, L은 각각의 X를 Y에 직접적으로 공유적으로 연결하고 L은 당 기를 포함하지 않는다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "당"은 단당류 및 이당류를 지칭한다. 이와 같이, L이 삼당류를 포함하더라도, 삼당류는 이당류 단위 및 단당류 단위를 포함하기 때문에 그러한 L은 이러한 실시형태의 범주 내에 있지 않을 것이다. 다른 방식으로 말하면, [Xn-L]에 존재하는 유일한 당 기는 각 X에 대한 단일 시알산기이다. 시알산기는 서로 직접적으로 공유적으로 결합되지 않는다.
일부 실시형태에서, 각각의 X의 각각의 시알산기는 산소-함유 복소환기를 포함하지 않는 원자의 사슬을 통해 생물치료제 Y에 공유적으로 연결된다. 특히, 글루코스 및 갈락토스와 같은 단당류 당은 고리에 산소 원자를 함유하는 복소환기이다. 일부 실시형태에서, 각각의 X의 각각의 시알산기는 알킬, 알케닐, 알키닐, 폴리에틸렌 글리콜, 아릴, 헤테로아릴, 황 원자-함유 헤테로사이클, 질소 원자-함유 헤테로사이클, 아미노산 잔기, 아미노, 아실, 할로, 하이드록시, 카르복시, 술폭시 및 이들의 치환된 유사체로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 화학적 모이어티로 구성된 원자의 사슬을 통해 생물치료제 Y에 공유적으로 연결된다.
일부 실시형태에서, 존재하는 경우, 링커 L은 알킬, 알케닐, 알키닐, 폴리에틸렌 글리콜, 아릴, 헤테로아릴, 황 원자-함유 헤테로사이클, 질소 원자-함유 헤테로사이클, 아미노산 잔기, 아미노, 아실, 할로, 하이드록시, 카르복시, 술폭시 및 이들의 치환된 유사체로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 화학적 모이어티로 구성된다. 부가하여, 시알산과 L 또는 Y 사이의 X의 부분은 알킬, 알케닐, 알키닐, 폴리에틸렌 글리콜, 아릴, 헤테로아릴, 황 원자-함유 헤테로사이클, 질소 원자-함유 헤테로사이클, 아미노산 잔기, 아미노, 아실, 할로, 하이드록시, 카르복시, 술폭시 및 이들의 치환된 유사체로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 화학적 모이어티로 구성된다.
L이 존재하는 일부 경우에, L은 분지된 링커이다. 즉, L은 생물치료제 Y를 2개 이상의 X 기에 공유적으로 직접적으로 연결한다. 일부 경우에, L의 분지화 위치는 아미노산 잔기 또는 이의 유도체, 예를 들어 라이신 또는 그 유도체를 포함한다. 예를 들어, L의 분지화 위치는 아래 도시된 식을 가질 수 있으며, 여기서 별표(*)로 표시된 각 위치는 X 기 또는 Y 기로 향하는 사이트이다.
일부 경우에, L의 분지화 위치는 아릴기 또는 헤테로아릴기를 포함하지 않는다. 일부 경우에, L의 분지화 위치는 알킬기, 아미드기, 아미노산 잔기기 또는 이의 조합을 포함한다.
일부 실시형태에서, 링커 L은 폴리에틸렌 글리콜기, 트리아졸기 또는 이의 조합을 포함한다. 일부 경우에, 시알산기와 L 또는 Y 사이의 X의 부분은 폴리에틸렌 글리콜기, 트리아졸기 또는 이의 조합을 포함한다. 일부 경우에, 트리아졸기는 X 기와 L 기 사이의 공유 연결의 일부이다.
일부 실시형태에서, 링커 L은 하나 이상의 링커 서브유닛(LS), 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10, 또는 더욱이 그 초과의 링커 서브유닛(LS)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 링커의 일부 실시형태는 식 (II)로 기술된 1 내지 10개 링커 서브유닛(LS)을 포함할 수 있다:
-(LS1)a-(LS2)b-(LS3)c-(LS4)d-(LS5)e-(LS6)f-(LS7)g-(LS8)h-(LS9)i-(LS10)j- (II)
여기서 LS1, LS2, LS3, LS4, LS5, LS6, LS7, LS8, LS9 및 LS10은 각각 독립적으로 링커 서브유닛이고, a, b, c, d, e, f,g, h, i 및 j는 각각 독립적으로 0 또는 1이다. 일부 실시형태에서, a 내지 j의 합은 1이다(예를 들어, a는 1이고 b 내지 j는 각각 0이다). 이들 실시형태에서, 링커 서브유닛 LS1은 일 말단에서 Y에 부착되고 다른 말단에서 X에 부착된다. 일부 실시형태에서, a 내지 j의 합은 2이다(예를 들어, a 및 b는 각각 1이고, c 내지 j는 각 0이다). 이들 실시형태에서, 링커 서브유닛 LS1은 Y에 부착되고 링커 서브유닛 LS2는 X에 부착된다. 일부 실시형태에서, a 내지 j의 합은 3이다(예를 들어, a 내지 c는 각각 1이고, d 내지 j는 각각 0이다). 이들 실시형태에서, 링커 서브유닛 LS1은 Y에 부착되고 링커 서브유닛 LS3은 X에 부착된다. 일부 실시형태에서, a 내지 j의 합은 4이다(예를 들어, a 내지 d는 각각 1이고, e 내지 j는 각각 0이다). 이들 실시형태에서, 링커 서브유닛 LS1은 Y에 부착되고 링커 서브유닛 LS4는 X에 부착된다. 일부 실시형태에서, a 내지 j의 합은 5이다(예를 들어, a 내지 e는 각각 1이고, f 내지 j는 각각 0이다). 이들 실시형태에서, 링커 서브유닛 LS1은 Y에 부착되고 링커 서브유닛 LS5는 X에 부착된다. 일부 실시형태에서, a 내지 j의 합은 6이다(예를 들어, a 내지 f는 각각 1이고, g 내지 j는 각각 0이다). 이들 실시형태에서, 링커 서브유닛 LS1은 Y에 부착되고 링커 서브유닛 LS6은 X에 부착된다. 일부 실시형태에서, a 내지 j의 합은 7이다(예를 들어, a 내지 g는 각각 1이고, h 내지 j는 각각 0이다). 이들 실시형태에서, 링커 서브유닛 LS1은 Y에 부착되고 링커 서브유닛 LS7은 X에 부착된다. 일부 실시형태에서, a 내지 j의 합은 8이다(예를 들어, a 내지 h는 각각 1이고, i 및 j는 각각 0이다). 이들 실시형태에서, 링커 서브유닛 LS1은 Y에 부착되고 링커 서브유닛 LS9는 X에 부착된다. 일부 실시형태에서, a 내지 j의 합은 9이다(예를 들어, a 내지 i는 각각 1이고, j는 0이다). 이들 실시형태에서, 링커 서브유닛 LS1은 Y에 부착되고 링커 서브유닛 LS9는 X에 부착된다. 일부 실시형태에서, a 내지 j의 합은 10이다(예를 들어, a 내지 j는 각각 1이다). 이들 실시형태에서, 링커 서브유닛 LS1은 Y에 부착되고 링커 서브유닛 LS10은 X에 부착된다.
링커에서 각 링커 서브유닛(LS)에서 임의의 편리한 관능기가 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 링커 서브유닛(LS)은 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카르복실, 카르복실 에스테르, 아실 아미노, 알킬아미드, 치환된 알킬아미드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴 및 치환된 헤테로사이클릴부터 선택된 기를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 링커 서브유닛은 공유 결합, (C1-C12)알킬, 치환된 (C1-C12)알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 치환된 헤테로사이클릴, (PEG)n 및 (AA)p로부터 독립적으로 선택된 관능기를 포함하며, 여기서 각 n은 독립적으로 1 내지 50의 정수이고 각 p는 독립적으로 1 내지 20의 정수이다. 본 명세서에서 사용된 "PEG"는 폴리에틸렌 글리콜을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 "AA"는 아미노산 잔기를 지칭한다. 아미노산 잔기는 천연 발생 단백질에서 일반적으로 발견되는 아미노산(예를 들어, Ala 또는 A, Cys 또는 C, Asp 또는 D, Glu 또는 E, Phe 또는 F, Gly 또는g, His 또는 H, Ile 또는 I, Lys 또는 K, Leu 또는 L, Met 또는 M, Asn 또는 N, Pro 또는 P, Gln 또는 Q, Arg 또는 R, Ser 또는 S, Thr 또는 T, Val 또는 V, Trp 또는 W, Tyr 또는 Y)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 링커 및 링커 서브유닛에 사용되는 아미노산 잔기는 또한 변형된 측쇄 또는 백본을 갖는 천연 아미노산인 아미노산 유사체 및 아미노산 유도체를 포함한다. 아미노산 유사체는 또한 아미노산 유사체의 L-형 뿐만 아니라 천연 발생 D-형에서와 동일한 입체화학을 갖는 아미노산 유사체를 포함한다. 일부 예에서, 아미노산 유사체는 백본 구조 및/또는 하나 이상의 천연 아미노산의 측쇄 구조를 공유하며, 차이점(들)은 분자 내 하나 이상의 변형된 기이다. 이러한 변형은 관련된 원자(예를 들어, S)에 대한 원자(예를 들어, N)의 치환, 기(예컨대 메틸 또는 하이드록실 등) 또는 원자(예컨대 Cl 또는 Br 등)의 부가, 기의 결실, 공유 결합의 치환(이중 결합에 대한 단일 결합 등), 또는 측쇄 또는 백본에 다른 기의 부착, 또는 이의 조합을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 아미노산 유사체는 α-하이드록시산 및 α-아미노산 등을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 아미노산 유사체 또는 아미노산 유도체는 선택적 링커를 통해 아미노산 유사체 또는 아미노산 유도체의 측쇄 또는 백본에 부착된 또 다른 시알산 모이어티(X)와 같은 또 다른 기를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 링커 서브유닛은 (C1-C12)알킬 또는 치환된 (C1-C12)알킬로부터 독립적으로 선택된 관능기를 포함한다. 일부 실시형태에서, (C1-C12)알킬은 1 내지 12개의 탄소 원자, 예를 들어 1 내지 10개의 탄소 원자, 또는 1 내지 8개의 탄소 원자, 또는 1 내지 6개의 탄소 원자, 또는 1 내지 5개의 탄소 원자, 또는 1 내지 4개의 탄소 원자, 또는 1 내지 3개의 탄소 원자를 포함하는 직쇄 또는 분지된 알킬기이다. 일부 경우에, (C1-C12)알킬은 C1-C12 알킬, 또는 C1-C10 알킬, 또는 C1-C6 알킬, 또는 C1-C3 알킬과 같은 알킬일 수 있다. 일부 경우에, (C1-C12)알킬은 C2-알킬이다. 예를 들어, (C1-C12)알킬은 C1-C12 알킬렌, 또는 C1-C10 알킬렌, 또는 C1-C6 알킬렌, 또는 C1-C3 알킬렌과 같은 알킬렌 또는 치환된 알킬렌일 수 있다. 일부 경우에, (C1-C12)알킬은 C1-알킬렌(예를 들어, CH2)이다. 일부 경우에, (C1-C12)알킬은 C2-알킬렌(예를 들어, CH2CH2)이다.
일부 실시형태에서, 치환된 (C1-C12)알킬은 1 내지 12 탄소 원자, 예컨대 1 내지 10 탄소 원자, 또는 1 내지 8 탄소 원자, 또는 1 내지 6 탄소 원자, 또는 1 내지 5 탄소 원자, 또는 1 내지 4 탄소 원자, 또는 1 내지 3 탄소 원자를 포함하는 직쇄 또는 분지된 치환된 알킬기이다. 일부 경우에, 치환된 (C1-C12)알킬은 치환된 알킬, 예컨대 치환된 C1-C12 알킬, 또는 치환된 C1-C10 알킬, 또는 치환된 C1-C6 알킬, 또는 치환된 C1-C3 알킬일 수 있다. 일부 경우에, 치환된 (C1-C12)알킬은 치환된 C2-알킬이다. 예를 들어, 치환된 (C1-C12)알킬은 치환된 알킬렌, 예컨대 치환된 C1-C12 알킬렌, 또는 치환된 C1-C10 알킬렌, 또는 치환된 C1-C6 알킬렌, 또는 치환된 C1-C3 알킬렌일 수 있다. 일부 경우에, 치환된 (C1-C12)알킬은 치환된 C1-알킬렌이다. 일부 경우에, 치환된 (C1-C12)알킬은 치환된 C2-알킬렌이다.
일부 실시형태에서, 링커 서브유닛은 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 독립적으로 선택된 관능기를 포함한다.
일부 경우에, 링커 서브유닛은 아릴 또는 치환된 아릴로부터 독립적으로 선택된 관능기를 포함한다. 일부 경우에, 링커 서브유닛은 아릴을 포함한다. 예를 들어, 아릴은 페닐일 수 있다. 일부 경우에, 링커 서브유닛은 치환된 아릴을 포함한다. 일부 경우에, 치환된 아릴은 치환된 페닐이다. 치환된 아릴은 (C1-C12)알킬, 치환된 (C1-C12)알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택된 하나 이상의 치환체로 치환될 수 있다.
일부 경우에, 링커 서브유닛은 헤테로아릴 또는 치환된 헤테로아릴로부터 독립적으로 선택된 관능기를 포함한다. 일부 경우에, 링커 서브유닛은 헤테로아릴을 포함한다. 일부 경우에, 링커 서브유닛은 치환된 헤테로아릴을 포함한다. 치환된 헤테로아릴은 (C1-C12)알킬, 치환된 (C1-C12)알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택된 하나 이상의 치환체로 치환될 수 있다.
일부 경우에, 링커 서브유닛은 사이클로알킬 또는 치환된 사이클로알킬로부터 독립적으로 선택된 관능기를 포함한다. 일부 경우에, 링커 서브유닛은 사이클로알킬을 포함한다. 일부 경우에, 링커 서브유닛은 치환된 사이클로알킬을 포함한다. 치환된 사이클로알킬은 (C1-C12)알킬, 치환된 (C1-C12)알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택된 하나 이상의 치환체로 치환될 수 있다.
일부 경우에, 링커 서브유닛은 헤테로사이클릴 또는 치환된 헤테로사이클릴로부터 독립적으로 선택된 관능기를 포함한다. 일부 경우에, 링커 서브유닛은 헤테로사이클로알킬을 포함한다. 예를 들어, 링커 서브유닛은 트리아졸 (예를 들어, 1,2,3-트리아졸)을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 링커 서브유닛은 치환된 헤테로사이클로알킬을 포함한다. 치환된 헤테로사이클릴은 (C1-C12)알킬, 치환된 (C1-C12)알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 선택된 하나 이상의 치환체로 치환될 수 있다.
일부 실시형태에서, 링커는 천연 당류를 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, 링커(L)는 링커 내의 하나 이상의 링커 서브유닛(LS)에 인접하거나 그 사이에 하나 이상의 연결기를 포함한다. 연결기는 2개의 링커 서브유닛 사이, 링커 서브유닛과 관심있는 모이어티(Y)에 대한 접합을 위한 반응성 말단 사이, 또는 링커 서브유닛과 시알산 모이어티(X) 사이의 부착을 용이하게 할 수 있다. 연결기는 이들 부착을 용이하게 하는 편리한 관능기, 예컨대 비제한적으로, 아미노, 카르보닐, 아미도, 옥시카르보닐, 카르복시, 티오에테르, 술포닐, 술폭사이드, 술포닐아미노, 아미노술포닐, 티오, 옥시, 포스포, 포스포르아미데이트, 티오포스포라이데이트, 등을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 연결기는 공유 결합 -CO-, -NR15-, -NR15(CH2)q-, -CONR15-, -NR15CO-, -C(O)O-, -OC(O)-, -O-, -S-, -S(O)-, -SO2-, -SO2NR15-, -NR15SO2- 및 -P(O)OH-로부터 각각 독립적으로 선택되며, 여기서 q는 1 내지 6의 정수이다. 일부 실시형태에서, q는 1 내지 6의 정수(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6)이다. 일부 실시형태에서 q는 1이다. 일부 실시형태에서 q는 2이다. 일부 실시형태에서 q는 3이다. 일부 실시형태에서 q는 4이다. 일부 실시형태에서 q는 5이다. 일부 실시형태에서 q는 6이다.
일부 실시형태에서, 각각의 R15는 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아미노, 치환된 아미노, 카르복실, 카르복실 에스테르, 아실, 아실옥시, 아실 아미노, 아미노 아실, 알킬아미드, 치환된 알킬아미드, 술포닐, 티오알콕시, 치환된 티오알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 헤테로사이클릴, 및 치환된 헤테로사이클릴로부터 독립적으로 선택된다.
일부 실시형태에서, R15는 수소이다. 일부 실시형태에서, 각각의 R15는 수소이다. 일부 실시형태에서, R15는 알킬 또는 치환된 알킬, 예컨대 C1-6 알킬 또는 C1-6 치환된 알킬, 또는 C1-4 알킬 또는 C1-4 치환된 알킬, 또는 C1-3 알킬 또는 C1-3 치환된 알킬이다. 일부 실시형태에서, R15는 알케닐 또는 치환된 알케닐, 예컨대 C2-6 알케닐 또는 C2-6 치환된 알케닐, 또는 C2-4 알케닐 또는 C2-4 치환된 알케닐, 또는 C2-3 알케닐 또는 C2-3 치환된 알케닐이다. 일부 실시형태에서, R15는 알키닐 또는 치환된 알키닐이다. 일부 실시형태에서, R15는 알콕시 또는 치환된 알콕시이다. 일부 실시형태에서, R15는 아미노 또는 치환된 아미노이다. 일부 실시형태에서, R15는 카르복실 또는 카르복실 에스테르이다. 일부 실시형태에서, R15는 아실 또는 아실옥시이다. 일부 실시형태에서, R15는 아실 아미노 또는 아미노 아실이다. 일부 실시형태에서, R15는 알킬아미드 또는 치환된 알킬아미드이다. 일부 실시형태에서, R15는 술포닐이다. 일부 실시형태에서, R15는 티오알콕시 또는 치환된 티오알콕시이다. 일부 실시형태에서, R15는 아릴 또는 치환된 아릴, 예컨대 C5-8 아릴 또는 C5-8 치환된 아릴, 예컨대 C5 아릴 또는 C5 치환된 아릴, 또는 C6 아릴 또는 C6 치환된 아릴이다. 일부 실시형태에서, R15는 헤테로아릴 또는 치환된 헤테로아릴, 예컨대 C5-8 헤테로아릴 또는 C5-8 치환된 헤테로아릴, 예컨대 C5 헤테로아릴 또는 C5 치환된 헤테로아릴, 또는 C6 헤테로아릴 또는 C6 치환된 헤테로아릴이다. 일부 실시형태에서, R15는 사이클로알킬 또는 치환된 사이클로알킬, 예컨대 C3-8 사이클로알킬 또는 C3-8 치환된 사이클로알킬, 예컨대 C3-6 사이클로알킬 또는 C3-6 치환된 사이클로알킬, 또는 C3-5 사이클로알킬 또는 C3-5 치환된 사이클로알킬이다. 일부 실시형태에서, R15는 헤테로사이클릴 또는 치환된 헤테로사이클릴, 예컨대 C3-8 헤테로사이클릴 또는 C3-8 치환된 헤테로사이클릴, 예컨대 C3-6 헤테로사이클릴 또는 C3-6 치환된 헤테로사이클릴, 또는 C3-5 헤테로사이클릴 또는 C3-5 치환된 헤테로사이클릴이다.
일부 실시형태에서, 링커 서브유닛(LS)은 중합체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 메톡시폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 단일중합체, 폴리프로필렌 글리콜 단일중합체, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체(예를 들어, 단일중합체 및 공중합체가 비치환되거나 알킬기를 갖는 일 말단에서 치환되는 경우), 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 에틸 에테르, 폴리비닐피롤리돈, 이의 조합 등을 포함하는 폴리알킬렌 글리콜 및 이의 유도체를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 중합체는 폴리알킬렌 글리콜이다. 일부 실시형태에서, 중합체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이다.
일부 경우에, 링커는 분지되지 않고 하나의 X 기를 Y 기에 연결하므로 1가로 지칭될 수 있다. 일부 경우에, 링커는 2가이고 2개의 X 기를 Y 기에 연결하는 분지된 링커이다. 일부 경우에, 링커는 3가이고 3개의 X 기를 Y 기에 연결하는 분지된 링커이다. 일부 경우에, 링커는 더 높은 다중 원자가의 분지된 링커이고 다중의 X 기를 Y 기에 연결한다. 일부 경우에, 링커는 예를 들어 2개 이상의 모이어티 사이에서 측정된 바와 같이 길이에서 500 원자 이하(예컨대, 400 원자 이하, 300 원자 이하, 200 원자 이하, 100 원자 이하, 80 원자 이하, 60 원자 이하, 50 원자 이하, 40 원자 이하, 30 원자 이하, 또는 심지어 20 원자 이하)의 선형 또는 분지된 백본을 갖는다. 연결 모이어티는 2개의 기 또는 길이에서 1 내지 500 원자, 예를 들어 약 길이에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 300, 400 또는 500 탄소 원자의 선형 또는 분지된 사슬을 연결하는 공유 결합일 수 있으며, 여기서 링커는 선형, 분지형, 고리형 또는 단일 원자일 수 있다. 특정 경우에, 링커 백본의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 이상, 10개 이상 또는 심지어 그 초과의 탄소 원자는 헤테로원자, 예를 들어 황, 질소 또는 산소 헤테로원자로 선택적으로 치환될 수 있다. 특정 경우에, 링커가 PEG 기를 포함하는 경우, 링커 백본의 그 분절의 세 번째 원자마다 산소로 치환된다. 백본 원자 사이의 결합은 포화되거나 불포화될 수 있으며, 일반적으로 하나, 둘 또는 세 개 이하의 불포화된 결합이 링커 백본에 존재할 것이다. 링커는 하나 이상의 치환체기, 예를 들어 알킬, 아릴 또는 알케닐기를 포함할 수 있다. 링커는 제한 없이 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 올리고(에틸렌 글리콜), 에테르, 티오에테르, 디설파이드, 아미드, 카보네이트, 카바메이트, 3급 아민, 직쇄 또는 분지될 수 있는 알킬, 예를 들어 메틸, 에틸, n-프로필, 1-메틸에틸(이소-프로필), n-부틸, n-펜틸, 1,1-디메틸에틸(t-부틸) 등. 링커 백본은 고리형 기, 예를 들어 아릴, 헤테로사이클, 사이클로알킬기 또는 헤테로사이클기를 포함할 수 있으며, 여기서 고리형 기의 2개 이상의 원자, 예를 들어 2, 3 또는 4개의 원자가 백본에 포함된다.
일부 실시형태에서, 링커 서브유닛(LS)은 분지된 서브유닛일 수 있다. 분지된 서브유닛은 각 시알산 모이어티에 대한 각각의 링커를 통해 또는 직접적으로 2개 이상의 시알산 모이어티에 부착된 링커 서브유닛일 수 있다. 예를 들어, 분지된 서브유닛은 2개의 시알산 모이어티에 부착될 수 있다. 일부 실시형태에서, 분지된 서브유닛은 아미노산(AA)을 포함한다. 예를 들어, 분지된 서브유닛은 아미노산의 백본이 제1 시알산 모이어티에 부착된 링커의 일부를 형성하고 아미노산의 측쇄가 제2 시알산 모이어티에 직접적으로 또는 분지의 링커(즉, "분지 링커")를 통해 접합되는 아미노산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 분지된 서브유닛은 라이신을 포함하며 여기서 라이신의 백본은 제1 시알산 모이어티에 부착된 링커의 일부를 형성하고 여기서 라이신의 측쇄는 제2 시알산 모이어티에 직접적으로 또는 분지 링커를 통해 접합된다. 일부 실시형태에서, 제2 시알산 모이어티는 라이신 측쇄의 말단 아민에서의 부착에 의해 라이신에 접합된다. 일부 실시형태에서, 분지 링커는 상기 식 (II)에 의해 기재된 바와 같은 링커이다.
본 개시내용에 따른 링커의 예는 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다:
LS1은 PEG(예를 들어, PEG4)이고; LS2는 헤테로사이클릴(예를 들어, 1,2,3-트리아졸)이고; LS3은 PEG(예를 들어, PEG2)이고; d 내지 j는 각각 0이고;
LS1은 PEG(예를 들어, PEG4)이고; LS2는 분지된 서브유닛(예를 들어, 라이신)이고; LS3은 알킬(예를 들어, C3-알킬)이고; LS4는 PEG(예를 들어, PEG2)이고; LS5는 헤테로사이클릴(예를 들어, 1,2,3-트리아졸)이고; LS6은 PEG(예를 들어, PEG2)이고; g 내지 j는 각각 0이고; 그리고 여기서 LS2 분지된 서브유닛은 다음에 의해 기술된 분지 링커에 부착되고: LS1은 PEG(예를 들어, PEG2)이고; LS2는 헤테로사이클릴(예를 들어, 1,2,3-트리아졸)이고; LS3은 PEG(예를 들어, PEG2)이고; d 내지 j는 각각 0이고;
LS1은 PEG(예를 들어, PEG4)이고; LS2는 헤테로사이클릴(예를 들어, 1,2,3-트리아졸)이고; LS3은 알킬(예를 들어, C2-알킬)이고; d 내지 j는 각각 0이고;
LS1은 PEG(예를 들어, PEG4)이고; LS2는 분지된 서브유닛(예를 들어, 라이신)이고; LS3은 알킬(예를 들어, C3-알킬)이고; LS4는 PEG(예를 들어, PEG2)이고; LS5는 헤테로사이클릴(예를 들어, 1,2,3-트리아졸)이고; LS6은 알킬(예를 들어, C2-알킬)이고; g 내지 j는 각각 0이고; 그리고 여기서 LS2 분지된 서브유닛은 다음에 의해 기술된 분지 링커에 부착되고: LS1은 PEG(예를 들어, PEG2)이고; LS2는 헤테로사이클릴(예를 들어, 1,2,3-트리아졸)이고; LS3은 알킬(예를 들어, C2-알킬)이고; d 내지 j는 각각 0이고;
LS1은 PEG(예를 들어, PEG4)이고; LS2는 분지된 서브유닛(예를 들어, 라이신)이고; LS3은 분지된 서브유닛(예를 들어, 라이신)이고; LS4는 알킬(예를 들어, C3-알킬)이고; LS5는 PEG(예를 들어, PEG2)이고; LS6은 헤테로사이클릴(예를 들어, 1,2,3-트리아졸)이고; LS7은 알킬(예를 들어, C2-알킬)이고; h 내지 j는 각각 0이고; 여기서 LS2 분지된 서브유닛은 다음에 의해 기술된 분지 링커에 부착되고: LS1은 PEG(예를 들어, PEG2)이고; LS2는 헤테로사이클릴(예를 들어, 1,2,3-트리아졸)이고; LS3은 알킬(예를 들어, C2-알킬)이고; d 내지 j는 각각 0이고; 그리고 여기서 LS3 분지된 서브유닛은 다음에 의해 기술된 분지 링커에 부착되고: LS1은 PEG(예를 들어, PEG2)이고; LS2는 헤테로사이클릴 (예를 들어, 1,2,3-트리아졸)이고; LS3은 알킬(예를 들어, C2-알킬)이고; d 내지 j는 각각 0이고;
LS1은 PEG(예를 들어, PEG4)이고; LS2는 분지된 서브유닛(예를 들어, 라이신)이고; LS3은 분지된 서브유닛(예를 들어, 라이신)이고; LS4는 알킬(예를 들어, C3-알킬)이고; LS5는 PEG(예를 들어, PEG2)이고; LS6은 헤테로사이클릴(예를 들어, 1,2,3-트리아졸)이고; LS7은 PEG(예를 들어, PEG2)이고; h 내지 j는 각각 0이고; 여기서 LS2 분지된 서브유닛은 다음에 의해 기술된 분지 링커에 부착되고: LS1은 PEG(예를 들어, PEG2)이고; LS2는 헤테로사이클릴(예를 들어, 1,2,3-트리아졸)이고; LS3은 PEG(예를 들어, PEG2)이고; d 내지 j는 각각 0이고; 그리고 여기서 LS3 분지된 서브유닛은 다음에 의해 기술된 분지 링커에 부착되고: LS1은 PEG(예를 들어, PEG2)이고; LS2는 헤테로사이클릴(예를 들어, 1,2,3-트리아졸)이고; LS3은 PEG(예를 들어, PEG2)이고; d 내지 j는 각각 0이고;
LS1은 분지된 서브유닛(예를 들어, 라이신)이고; LS2는 분지된 서브유닛(예를 들어, 라이신)이고; LS3은 알킬(예를 들어, C3-알킬)이고; LS4는 헤테로사이클릴(예를 들어, 1,2,3-트리아졸)이고; LS5는 PEG(예를 들어, PEG2)이고; f 내지 j는 각각 0이고; 여기서 LS1 분지된 서브유닛은 다음에 의해 기술된 분지 링커에 부착되고: LS1은 헤테로사이클릴(예를 들어, 1,2,3-트리아졸)이고; LS2는 PEG(예를 들어, PEG2)이고; c 내지 j는 각각 0이고; 그리고 여기서 LS2 분지된 서브유닛은 다음에 의해 기술된 분지 링커에 부착되고: LS1은 헤테로사이클릴(예를 들어, 1,2,3-트리아졸)이고; LS2는 PEG(예를 들어, PEG2)이고; c 내지 j는 각각 0이고;
LS1은 PEG(예를 들어, PEG4)이고; LS2는 분지된 서브유닛(예를 들어, 라이신)이고; LS3은 분지된 서브유닛(예를 들어, 라이신)이고; LS4는 알킬(예를 들어, C3-알킬)이고; LS5는 헤테로사이클릴(예를 들어, 1,2,3-트리아졸)이고; LS6은 PEG(예를 들어, PEG2)이고; g 내지 j는 각각 0이고; 여기서 LS2 분지된 서브유닛은 다음에 의해 기술된 분지 링커에 부착되고: LS1은 헤테로사이클릴(예를 들어, 1,2,3-트리아졸)이고; LS2는 PEG(예를 들어, PEG2)이고; c 내지 j는 각각 0이고; 그리고 여기서 LS3 분지된 서브유닛은 다음에 의해 기술된 분지 링커에 부착되고: LS1은 헤테로사이클릴(예를 들어, 1,2,3-트리아졸)이고; LS2는 PEG(예를 들어, PEG2)이고; c 내지 j는 각각 0이고; 그리고
LS1은 PEG(예를 들어, PEG4)이고; LS2는 분지된 서브유닛(예를 들어, 라이신)이고; LS3은 알킬(예를 들어, C3-알킬)이고; LS4는 헤테로사이클릴(예를 들어, 1,2,3-트리아졸)이고; LS5는 PEG(예를 들어, PEG2)이고; f 내지 j는 각각 0이고; 그리고 여기서 LS2 분지된 서브유닛은 다음에 의해 기술된 분지 링커에 부착되고: LS1은 헤테로사이클릴(예를 들어, 1,2,3-트리아졸)이고; LS3은 PEG(예를 들어, PEG2)이고; c 내지 j는 각각 0이다.
상기 기재된 링커는 2개의 링커 서브유닛 사이, 링커 서브유닛과 관심있는 모이어티(Y)에 대한 접합을 위한 반응성 말단 사이, 또는 링커 서브유닛과 시알산 모이어티(X) 사이의 부착을 용이하게 하기 위해 하나 이상의 연결기를 포함할 수 있다.
Siglec 리간드 [X n -L] m
식 [Xn-L]m-Y에서, [Xn-L]은 Siglec 리간드를 나타내고, m은 1-25의 정수를 나타낸다. 하나 이상의 Siglec 리간드, 예를 들어. 2, 3, 4, 또는 5개 이상의 Siglec 리간드, 일부 경우에는 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 Siglec 리간드, 일부 이러한 경우에는 11, 12, 13, 14, 15개 이상의 Siglec 리간드, 일부 경우에는 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 Siglec 리간드, 때로는 21, 22, 23, 24 또는 25개의 Siglec 리간드가 생물치료제의 동일하거나 다른 아미노산에 부착된 생물치료제에 접합될 수 있다는 것이 구상된다. Siglec 리간드는 천연 발생, 즉 천연 발생 시알산 및 천연 발생 글리칸을 포함하는 모이어티일 수 있으며, 여기서 시알산 및 글리칸은 전형적으로 자연에서 서로 결합하여 Siglec 리간드를 형성하는 것으로 발견된다. Siglec 리간드는 비-천연 발생, 즉 천연 발생 시알산 및 링커를 포함하는 모이어티, 비-천연 시알산 및 Siglec 리간드의 일부로서 자연에서 발견되는 글리칸을 포함하는 모이어티, 비-천연 발생 시알산 및 링커를 포함하는 모이어티, Siglec에 대해 친화성을 갖는 펩티드를 포함하는 모이어티, 등일 수 있다.
생물치료제 Y
식 [Xn-L]m-Y에서 Y는 생물치료제이다. Y 자체는 조작되지 않은 생물치료제로 지칭되며, 이 용어는 모체의 생물치료제라는 용어와 상호교환적으로 사용된다. 그러나, [Xn-L]m-Y인 요소들의 조합은 조작된 저면역원성 생물치료제로도 지칭된다. Y는 그 자체로 치료적 활성을 갖는다. [Xn-L]은 Y의 치료적 활성을 매개하지 않는다. 다른 방식으로 말하면, Y의 치료적 활성은 [Xn-L]의 존재 또는 부재와 무관하다.
예시적인 생물치료제 Y 기는 항체, 효소, 바이러스 입자, 나노입자, 폴리펩티드 및 핵산을 포함한다.
예를 들어, 단백질, 예를 들어 항체, 융합 단백질, 효소, 바이러스 입자, DNA 분자 또는 RNA 분자를 포함하는, 임의의 단백질 또는 핵산 생물치료제는 본 개시내용에 따라 저면역원성 생물치료제가 되도록 조작된 생물치료제로서 작용할 수 있다. 생물치료제는 천연 발생, 예를 들어 치료제로서 환자에게 전달되는 천연 발생 단백질, 천연 발생 캡시드 등일 수 있다. 생물치료제는 조작된 단백질, 예를 들어 항체 치료제, 융합 또는 "키메라" 단백질, 즉 2개 이상의 다른 단백질의 단백질 도메인을 포함하는 단백질 또는 완전히 비-천연 단백질, 즉 그 기능적 도메인에 걸쳐 임의의 천연 발생 단백질과 30% 이하의 동일성을 갖는 단백질일 수 있다(예를 들어, Chen et al. (2020) De novo design of protein logic gates. Science 368 (6486): 78-84; 및 Polizzi et al. (2020) A defined structural unit enables de novo design of small-molecule-binding proteins Science 369 (6508): 1227-1233 참조). 일부 실시형태에서, 생물치료제는 천연 발생 단백질 또는 공지된 조작된 단백질의 변이체이다. "변이체"는 이것이 유래된 단백질과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 단백질의 돌연변이체를 의미한다. 예를 들어, 변이체 단백질은 전장 네이티브 단백질과 60% 이상의 서열 동일성, 예를 들어 전장 네이티브 단백질과 65%, 70%, 75% 또는 80% 이상의 동일성, 예컨대 85%, 90% 또는 95% 이상의 동일성, 예를 들어 98% 또는 99% 동일성을 갖는 단백질일 수 있다. 변이체는 또한 천연 발생 단백질의 단편, 특히 천연 발생 단백질에 필적하거나 개선된 활성을 갖는 것을 포함한다. 생물치료제는 임의의 출처, 예를 들어 인간, 비-인간으로부터 유래될 수 있거나 또는 조작될 수 있다.
일부 실시형태에서, 단백질은 항체 또는 그의 단편, 예를 들어 모노클로날 항체, 이중특이적 항체, 삼중특이적 항체, scFv, Fab, 카멜리드 나노바디 등이다. 본 명세서에서 고려된 조작이 특정 용도를 발견한 항체의 비제한적 예는 아달리무맙 및 인플릭시맙(류마티스성 관절염, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 크론병, 궤양성 대장염, 건선, 화농한선염, 포도막염 또는 소아 특발성 관절염과 같은 자가면역 또는 염증성 질환의 치료용), 세툭시맙(예를 들어 전이성 결장직장암, 전이성 비소세포 폐암 및 두경부암을 포함하는 암의 치료용), 나탈리주맙(다발성 경화증의 치료용), 루목시티/목세투모맙 파수도톡스(모상 세포 백혈병의 치료용), 티센트릭/아테졸리주맙(다양한 암의 치료용), 옵디보/니볼루맙(다양한 암의 치료용), 레오프로/아브식시맙(항-GPIIb/IIIa, 혈관성형술과 같은 관상동맥 시술 중 및 이후 혈전증의 예방용), 브렌툭시맙(재발성 또는 불응성 호지킨 림프종(HL) 및 전신 역형성 대세포 림프종(ALCL)의 치료용), 세르톨리주맙 페골(크론병, 류마티스 관절염, 건선성 관절염 및 강직성 척추염의 치료용), 엘로투주맙(재발성 다발성 골수종의 치료용), 벤랄리주맙(천식의 치료용), 베돌리주맙(궤양성 대장염 및 크론병의 치료용), 갈칸네주맙(편두통 및 군집성 두통의 치료용), 리툭시맙(자가면역 질환 및 다양한 암의 치료용), 알렘투주맙(만성 림프구성 백혈병(CLL) 및 다발성 경화증의 치료용), 두필루맙(습진(아토피성 피부염), 천식 및 비용종과 같은 알레르기 질환의 치료용), 골리무맙(염증의 치료용), 오비누투주맙(림프종, 예를 들어 만성 림프구성 백혈병, 여포성 림프종의 치료용), 틸드라키주맙(면역학적으로 매개된 염증 질환의 치료), 알렌누맙(편두통의 예방용), 메폴리주맙(중증 호산구성 천식, 호산구성 육아종증 및 과호산구성 증후군(HES)의 치료용), 라무시루맙(고형 종양의 치료용), 라니비주맙("습성" 연령-관련된 황반 변성(AMD, 또한 ARMD), 당뇨병성 망막병증 및 황반 부종의 치료용), 우스테키누맙(건선, 크론병, 및 궤양성 대장염의 치료용), 레슬리주맙(천식의 치료용), 이필리무맙(다양한 암의 치료용), 알리로쿠맙(고콜레스테롤의 치료용), 벨리무맙(전신성 홍반성 루푸스(SLE)의 치료용), 파니투무맙(다양한 암의 치료용), 아벨루맙(메르켈 세포 암종, 요로상피암 및 신장 세포 암종의 치료용), 네시투무맙(전이성 편평 비소세포 폐암종(NSCLC)의 치료용), 모가물리주맙(재발성 또는 불응성 균상 식육종 및 세자리병, 재발성 또는 불응성 CCR4+ 성인 T-세포 백혈병/림프종(ATCLL) 및 재발성 또는 불응성 CCR4+ 피부 T 세포 림프종(CTCL)의 치료용), 올라라투맙(고형 종양의 치료용), 브로달루맙(염증성 질환의 치료용), 에쿨리주맙(발작성 야간 혈색소뇨증(PNH), 비정형 용혈성 요독 증후군(aHUS) 및 시신경 척수염의 치료용), 페르투주맙(전이성 HER2-양성 유방암의 치료용), 펨브롤리주맙(다양한 암의 치료용) 및 토실리주맙(류마티스 관절염(RA) 및 전신성 소아 특발성 관절염의 치료용)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 생물치료제 Y는 B 세포 수용체(BCR), 면역글로불린 E의 Fc 영역에 대한 수용체(FcRI), 톨 유사 수용체(TLR), T-세포 수용체(TCR), 또는 이의 복합체로부터 선택된 수용체에 특이적인 항체가 아닌 항체이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 표적 항원을 특이적으로 인식하여 결합하는 상보성 결정 영역(CDR) 도메인을 포함하는 항체를 지칭한다. 따라서, B 세포 수용체 또는 이의 복합체에 특이적으로 결합하는 항체는 B 세포 수용체 또는 B 세포 수용체를 포함하는 복합체를 특이적으로 인식하고 결합하는 CDR을 포함하는 항체를 지칭하고, IgE의 Fc 영역에 대한 수용체에 특이적으로 결합하는 항체는 IgE의 Fc 영역에 대한 수용체 또는 IgE의 Fc 영역에 대한 수용체를 포함하는 복합체를 특이적으로 인식하고 결합하는 CDR을 포함하는 항체를 지칭하고, 톨 유사 수용체에 특이적으로 결합하는 항체는 톨-유사 수용체 또는 톨-유사 수용체를 포함하는 복합체를 특이적으로 인식하고 결합하는 CDR을 포함하는 항체를 지칭하고, 그리고 T-세포 수용체에 특이적으로 결합하는 항체는 T-세포 수용체 또는 T-세포 수용체를 포함하는 복합체를 특이적으로 인식하여 결합하는 CDR을 포함하는 항체를 지칭한다.
일부 실시형태에서, 단백질은 네이티브 또는 천연 발생 단백질이다. 다른 실시형태에서, 단백질은 조작된 단백질이다. 본 명세서에서 고려된 조작이 특정 용도를 발견한 단백질의 예는 에리스로포이에틴(EPO, 적혈구의 생성을 자극하기 위함), 트롬보포이에틴(TPO, 혈소판의 생성을 자극하기 위함), 인간 성장 호르몬, 조직 인자, IFNβ-1b(다발성 경화증의 치료용), IFNβ-1a(다발성 경화증의 치료용), IL-2 또는 IL-2 모방 알데스류킨(흑색종 및 신장 세포 암종의 치료용), 엑세나타이드(제2형 당뇨병의 치료용), 알비글루타이드(제2형 당뇨병의 치료용), 알레파셉트(플라크 형성이 있는 중등도에서 중증 건선의 염증 조절, 피부 T-세포 림프종 및 T-세포 비호지킨 림프종의 치료용), 팔리페르민(화학요법 후 입과 장의 표면을 감싸는 세포의 성장을 자극하기 위함), 벨라타셉트(접목/이식 생존을 촉진하기 위한), 및 중성 및 염기성 아미노산 수송 단백질 rBAT 또는 b(0,+)-유형 아미노산 수송체 1(시스틴뇨증의 치료용)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 생물치료제 Y는 오브알부민 또는 면역글로불린 E(IgE)가 아닌 단백질이다.
일부 실시형태에서, 단백질은 효소, 예를 들어 대사 효소, 리소좀 효소, 프로테아제, 펩티다아제 등이다. 본 명세서에서 고려된 조작이 특정 용도를 발견한 효소의 비제한적 예는 에르위니아 크리산테미로부터의 아스파라기나제(백혈병의 치료용), 박테리아 IdeS(조직 이식 후 또는 환자가 기존 면역을 가지고 있는 유전자 요법 같은 요법의 투여에서 면역억제용; IgG 항체-구동 질환, 예컨대 전신성 홍반성 루푸스, 심상성 천포창 또는 IgA 신병증의 치료용), 박테리아 뮤시나아제(MUC+ 암, 예를 들어, MUC1+ 암의 치료용), 인자 VIII(혈우병 A의 치료용), 인자 IX(혈우병 B의 치료용), 인자 Xa(응고를 촉진하기 위함), 예를 들어 박테리아 병원체 또는 진균 병원체와 같은 병원체로부터 보체 분해 프로테아제(예를 들어, IgA 신병증과 같은 보체-매개된 질환의 치료를 위한 슈도모나스 엘라스타제(PaE), 슈도모나스 알칼린 프로테아제(PaAP), 연쇄상구균 발열성 외독소 B(SpeB), 포르피로모나스 진지발리스로부터 진지폐인, 아스퍼길루스 알칼린 프로테아제 1(Alp1), C. 알비칸스 분비된 아스파르틸 프로테이나제 1(Sap1), 2(Sap2) 및 3(Sap3)), 페닐알라닌 암모니아-분해효소 또는 모방 페그발리아제(PKU의 치료용), 알파-갈락토시다아제 A(파브리병의 치료용), 산 α-글루코시다아제 또는 모방 알글루코시다아제 알파(GAA, 폼페병의 치료용), 글루코세레브로시다아제(GCase, 고셔의 치료용), 아스파르틸글리코사미니다제(AGA, 아스파르틸글리코사민뇨증의 치료용), 아스포타제(저인산혈증(HPP)의 치료용), 알파-L-이두로니다제(MPS I의 치료용), 이두로네이트 설파타제 또는 이두로네이트 설파타제 모방 이두르설파제(MPS II의 치료용), 설파미나제(MPS IIIa의 치료용), α-N-아세틸글루코사미니다아제(NAGLU, MPS IIIB의 치료용), 헤파린 아세틸 CoA: α-글루코사미나이드 N-아세틸트랜스퍼라제(HGSNAT, MPS IIIC의 치료용), N-아세틸글루코사민 6-설파타아제(GNS, MPS IIID의 치료용), N-글루코사민 3-O-설파타제(아릴설파타제 G 또는 ARSG, MPS IIIE의 치료용), N-아세틸갈락토사민 6-설파타제(MPS IVA의 치료용), 베타-갈락토시다아제(MPS IVB의 치료용), N-아세틸갈락토사민 4-설파타아제(MPS VI의 치료용), 베타-글루쿠로니다아제(MPS VI의 치료용), 팔미토일 단백질 티오에스테라아제(PPT1, 바텐병의 치료용/CLN1), 트리펩티딜 펩티다제(TPP1, 바텐병의 치료용/CLN2), 아르기나제-1 또는 페그질라기나제(아르기나제-1 결핍증의 치료용) 또는 시스타티오닌 베타 합성효소 또는 에글리아 생성물 AGLE-177(고전적 호모시스틴뇨증으로도 알려져 있는 시스타티오닌 베타 합성효소(CBS) 결핍증의 치료용)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 생물치료제 Y는 인자 VIII이 아닌 효소이다.
일부 실시형태에서, 단백질은 바이러스 단백질 또는 바이러스 입자, 예를 들어 재조합 바이러스 입자이다. "재조합" 바이러스 또는 바이러스 입자는 바이러스에 대해 이종성인, 즉 자연에서 바이러스의 캡시드/엔벨로프와 연관되는 것으로 발견되지 않는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 게놈을 포함하는 바이러스/바이러스의 입자를 의미하며, 여기서 폴리뉴클레오티드는 유전자 생성물(RNA 또는 단백질)을 인코딩한다. 재조합 바이러스 입자는 유전자 요법 또는 종양용해성 바이러스 요법을 목적으로 치료적 유전자 생성물을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전달에서 용도를 발견한다. 유전자 요법은 잘-확립된 기술이다. 또한 바이러스 입자가 개체에서 면역 반응을 유도한다는 사실 때문에 동일한 바이러스 치료제를 한 번 또는 몇 번 이상 재투여할 수 없기 때문에 유전자 요법이 심각하게 방해를 받는다는 사실도 잘-확립되어 있다. 이와 같이, 통상의 기술자는 유전자 요법에 사용되는 임의의 바이러스 입자가 본 명세서에서 고려되는 바와 같은 조작으로부터 이익을 얻을 것임을 인식할 것이다. 본 개시내용에 따라 저면역원성 생물치료제가 되도록 조작된 생물치료제로서 작용할 수 있는 바이러스 입자의 비제한적 예는 재조합 아데노-연관된 바이러스(rAAV) 입자, 예를 들어 AAV1, AAV2, AAV3b, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAV11, AAV12 또는 AAV13 VP1 단백질로 구성된 군으로부터의 캡시드 VP1 단백질 또는 이의 변이체 또는 유사형 바이러스를 포함하는 rAAV 입자; 재조합 인간 아데노바이러스 입자, 예를 들어 rHAdV-A, rHAdV-B, rHAdV-C, rHAdV-D, rHAdV-E, rHAdV-F 또는 rHAdV-G로부터의 캡시드 단백질 또는 이의 변이체를 포함하는 rHAdV 입자; 재조합 단순 헤르페스 바이러스(rHSV) 입자, 예를 들어 rHSV1 또는 rHSV2 또는 이의 변이체 또는 유사형 바이러스; 재조합 유두종바이러스(PV) 입자; 재조합 폴리오마바이러스 입자; 재조합 백시니아 바이러스 입자; 재조합 사이토메갈로바이러스(CMV) 입자; 재조합 배큘로바이러스 입자; 재조합 인간 유두종바이러스(HPV) 입자; 또는 재조합 레트로바이러스 입자, 예를 들어 재조합 렌티바이러스, 재조합 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 입자, 유인원 면역결핍 바이러스(SIV) 입자, 고양이 면역결핍 바이러스(FIV) 입자, 퓨마 렌티바이러스(PLV) 입자, 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV) 입자, 소 면역결핍 바이러스(BIV) 입자, 염소 관절염 뇌염 바이러스 입자, 감마레트로바이러스 입자, 및 뮤어라인 백혈병 바이러스(MLV) 입자, 또는 이의 변이체 또는 유사형 바이러스를 포함한다.
일부 실시형태에서, 생물치료제 Y는 독소가 아니다. 일반적으로, 독소는 일반적으로 비-특이적 방식으로 세포에 해로운 화합물이며, 즉 독소는 이러한 세포가 상당히 다른 범주로부터의 것이라도 다른 세포에 비슷한 양의 피해를 야기할 것이다. 대조적으로, 선택적으로 손상시키는 화합물은 다른 유형의 세포에 가해지는 피해보다 상당히 더 큰 정도로 특정 세포에 피해를 줄 것이다. 예를 들어, 선택적으로 손상하는 화합물은 폐 세포에서는 일반적이지만 신장 세포에서는 드문 생화학적 과정을 기반으로 피해를 야기할 수 있는 반면, 독소는 폐와 신장 세포 둘 모두에 공통적인 생화학적 과정을 기반으로 피해를 야기할 수 있다. 일부 경우에, 피해는 세포 사멸이다. 일부 경우에, 독소는 슈도모나스 외독소 A이다. 일부 실시형태에서, 생물치료제 Y는 B 세포 조절제가 아니다. Y는 B 세포의 면역 작용을 증가시키거나 감소시키지 않는다. B 세포의 조절의 예는 B 세포의 생물치료제-특이적 성숙한 B 세포, 예를 들어, 형질 세포 또는 기억 세포로의 분화, B 세포가 항원-특이적 항체를 생성하는 것을 방지, CD69와 같은 활성화 마커의 상향조절을 방지, 생물치료제-특이적 B 세포 모집단의 생존력에서 감소를 촉진하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, B 세포 활성화는 (X를 인식하는 전체 B 세포 모집단과 대조적으로) Y를 인식하는 B 세포 수용체를 갖는 이들 B 세포에 대해서만 억제된다.
상기 논의된 바와 같이, 변경된 Siglec 리간드 프로필을 포함하도록 조작되지 않은 모체의 생물치료제와 달리, 본 개시내용의 저면역원성 생물치료제 조성물은 그 자신에 대한 면역 반응의 전개를 억제할 것이다. 이와 같이, 본 개시내용의 조작된 저면역원성 생물치료제는 조작된 저면역원성 생물치료제가 면역 세포의 활성을 약화시키는 정도를 평가함에 의해 그것이 유도되는 조작되지 않은, 즉 모체의 생물치료제로부터 기능적으로 구별될 수 있다. 활성을 약화시킨다는 것은, 예를 들어, 세포 또는 세포의 모집단을 침묵, 억제, 결실시키는 것 등에 의해, 활성에서 증가를 늦추거나, 활성을 감소시키거나, 활성을 방지하는 것을 의미한다. 따라서, 예를 들어, B 세포 또는 B 세포의 모집단의 활성을 약화시키는 것은 B 세포가 생물치료제-특이적 성숙 B 세포, 예를 들어, 형질 세포 또는 기억 세포로의 분화하는 것을 방지, B 세포가 항원-특이적 항체를 생성하는 것을 방지, CD69와 같은 활성화 마커의 상향조절을 방지, 생물치료제-특이적 B 세포 모집단의 생존력에서 감소를 촉진하는 것을 포함할 수 있다. 전형적으로, 조작되지 않은, 즉 모체의 생물치료제의 치료적 활성은 면역 세포의 활성을 약화시키는 것을 포함하지 않는다. 보다 전형적으로, 조작되지 않은, 즉 모체의 생물치료제의 치료적 활성은 B 세포 또는 B 세포의 모집단의 활성을 약화시키는 것을 포함하지 않는다.
면역 반응을 억제하는 본 개시내용에 따라 조작된 생물치료제의 능력은 시험관내 또는 생체내에서 임의의 수의 방식으로 쉽게 측정될 수 있다. 시험관내에서, 면역억제는, 예를 들어, B 세포의 모집단이 생물치료제에 의해 활성화되는 정도로서 측정될 수 있으며, 여기서 더 적은 활성화는 더 큰 면역억제를 나타낸다. B 세포 활성화를 측정하기 위해 당업계에 공지된 임의의 접근법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 모집단의 세포가 조작된 생물치료제와 접촉할 때 CD69 발현을 상향조절하는 정도는, 예를 들어 FACS에 의한 CD69+ 세포의 백분율 측정, B 세포의 평균 형광 강도(MFI) 평가, B 세포의 활성 평가 등에 의해 평가될 수 있다. 이러한 분석에서 조작된 생물치료제는 조작되지 않은 생물치료제보다 적어도 약 2.5-배 덜 강력하게, 일부 경우에는 적어도 약 5-배 덜 강력하게, 적어도 약 7.5-배 덜 강력하게, 또는 적어도 약 10-배 덜 강력하게, 일부 경우에는 약 20-배 덜 강력하게 B 세포를 활성화할 것으로 예상된다. 생체내에서, 면역억제는 예를 들어 조작된 생물치료제가 개체, 예를 들어 명반과 같은 면역 보조제의 존재 또는 부재에서, 예를 들어 근육내로 또는 정맥내로 주사된 마우스, 또는 예를 들어 상응하는 변형되지 않은 생물치료제의 투여 시 인간에서 도출된 ADA에 비해 "항-약물 항체" 또는 ADA를 도출하는 정도로서 측정될 수 있으며, 여기서 더 적은 ADA는 더 큰 면역억제를 나타낸다. 일부 경우에서, 저면역원성 생물치료제에 대한 ADA 역가는 상응하는 변형되지 않은 생물치료제에 비해 50% 이상, 예를 들어 60%, 70%, 80% 이상, 특정 경우에는 85%, 90%, 95% 이상, 더 바람직하게는 98%, 99% 또는 100%, 즉 감지할 수 없게 되도록 감소된다. 달리 말하면, 저면역원성 생물치료제에 의해 도출되는 ADA 역가는 상응하는 조작되지 않은 생물치료제에 의해 도출되는 것의 50% 이하, 예를 들어, 40%, 30% 또는 20% 이하, 특정 경우에는, 상응하는 조작되지 않은 생물치료제에 의해 도출되는 것의 15%, 10%, 5% 이하, 바람직하게는 단지 2%, 1% 이하이다.
효소면역측정법(ELISA), 미립자 ELISA, ELISPOT, 방사성-면역침전법, 전기화학발광 면역법(ECLIA), DELFIA(해리-강화 란타나이드 형광 면역법) 시간 분해 형광법(TRF) 검정, 표면 플라즈몬 공명 면역분석법(SPRIA), 웨스턴 블롯팅(면역블롯팅) 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 항체를 검출하기 위한 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 이들 중 임의의 것은 ADA가 생성되었는지 여부를 결정하기 위해 개체의 혈청에서 항체를 검출하는데 사용될 수 있다. ADA 역가는 저면역원성 생물치료제의 투여 후 개체의 혈청에서 평가될 수 있으며, 여기서 저면역원성 치료제의 투여 24시간 이상, 예를 들어 48시간 또는 78시간 이상, 일부 경우에 1, 2, 3 또는 4주 이상, 예를 들어 6주 또는 8주 후 수집된 혈청에서 검출된 ADA의 수준은 상응하는 조작되지 않은 생물치료제로 동일한 기간 동안 동일한 복용량 요법으로 치료된 대조군 개체로부터 혈청에서 검출된 ADA의 수준보다 낮을 것이다.
또 다른 예로서, 면역억제는 상응하는 조작되지 않은 생물치료제에 비해 조작된 생물치료제에 노출시 백혈구 반응에서의 감소로서 시험관내에서 관찰될 수 있다. 예를 들어, 다운스트림 시그널링 경로(예를 들어, Erk 인산화, NFAT 핵 전좌)의 더 큰 활성화는 더 많은 CD22 리간드를 포함하도록 변형된 생물치료제에 노출된 CD22 Siglec을 포함하는 B 세포와 비교하여 조작되지 않은 생물치료제에 노출된 CD22 Siglec을 포함하는 B 세포에서 관찰될 것이다. 또 다른 예로서, CD22 Siglec -- 및 마찬가지로, CD22 Siglec을 발현하는 세포 --은 조작되지 않은 생물치료제보다 더 많은 CD22 리간드를 포함하도록 조작된 생물치료제에 대해 더 높은 결합 친화성을 가질 것이다.
일부 실시형태에서, 저면역원성 생물치료제에 대한 ADA는 동일한 복용량 요법으로 동일한 기간 동안 상응하는 조작되지 않은 생물치료제로 치료된 대조군 개체로부터의 혈청에서 검출된 ADA의 수준에 비해, 1일 이상, 예를 들어 1개월 이상, 6개월 이상, 9개월 이상 또는 1년 이상 동안 대상체에 생물치료제를 투여한 후 치료된 개체의 혈청에서 더 낮다. 특정 실시형태에서, 저면역원성 생물치료제에 대한 ADA는 1개월 이상, 예를 들어 6개월 이상, 9개월 이상 또는 1년 이상 동안 대상체에 생물치료제를 투여한 후 개체의 혈청에서 검출할 수 없는 반면, ADA는 동일한 복용량 요법으로 동일한 기간 동안 상응하는 조작되지 않은 생물치료제로 치료받은 대조군 개체로부터의 혈청에서 검출될 수 있다. 이러한 투여는 매일, 매주, 격주, 매월, 분기별, 반년마다, 매년, 격년, 3년에 한 번, 4년에 한 번, 5년에 한 번 또는 10년에 한 번일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 조작된 저면역원성 생물치료제는 아시알로당단백질 수용체(ASGPR)에 대한 리간드의 상승된 양을 포함하도록 추가로 조작될 수 있다. 아시알로당단백질 수용체는 갈락토스 잔기를 노출시키기 위해 시알산이 제거된 당단백질 및 아시알로당단백질에 결합하는 렉틴이다. ASGPR에 대한 리간드, 예컨대 갈락토실화 모이어티(갈락토오스, 갈락토사민, N-아세틸갈락토사민(GalNAc)), 글루코실화 모이어티(글루코스, 글루코사민, N-아세틸글루코사민(GlcNAc)) 및 이의 글리코미메틱은 일반적으로 T 세포 반응을 도출하는 항원과 공유적으로 결합될 때 대신 항원에 대한 면역 관용을 유도하는 것으로 나타났다; 예를 들어 US20170007708A1를 참조하며, 그의 전체 개시내용은 본 명세서에 전체적으로 포함된다. 특정 실시형태에서, ASGPR 리간드는 갈락토즈, 갈락토사민 또는 GalNAc와 같은 천연 발생 갈락토실화 모이어티이다. 다른 실시형태에서, ASGPR 리간드는 글루코스, 글루코사민 또는 GlcNAc와 같은 글루코실화 모이어티이다. 다른 실시형태에서, ASGPR 리간드는 합성 리간드, 예를 들어, 예를 들어 Mamidyala, SK et al. (2012) J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 4, 1978-1981에 개시된 바와 같은 글리코미메틱이다.
ASGPR 리간드를 생물치료제에 공유적으로 연합시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며(예를 들어 US20170007708A1 참조, 그 전체 개시내용은 본 명세서에 참조로 포함됨), 이들 중 임의의 것은 본 개시내용의 생물치료제를 조작하는데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 저면역원성 생물치료제는 개체에서 T 세포 반응을 유도할 상응하는 조작되지 않은 생물치료제보다 적어도 2-배 더 많은 ASGPR 리간드, 예를 들어 조작되지 않은 생물치료제보다 3-배 더, 4-배 더, 5-배 더, 6-배 더, 7-배 더, 8-배 더, 9-배 더, 10-배 더, 11-배 더, 12-배 더, 13-배 더, 14-배 더, 15-배 더, 16-배 더, 17-배 더, 18-배 더, 19-배 더, 또는 심지어 20-배 더 많은 ASGPR 리간드를 포함한다. 예를 들어, 당단백질 LC/MS, 글리칸 LC/MS, 모세관 겔 전기영동 글리칸 분석, 분석적 이온 교환 HPLC 등을 포함하는 생물치료제 조성물 상의 글리칸 함량을 측정하기 위한 임의의 접근법을 사용하여 생물치료제에 첨부된 ASGPR 리간드의 양을 결정할 수 있다.
대상 저면역원성 생물치료제에 대한 ASGPR 리간드의 공유 회합은 대상 저면역원성 생물치료제가 간의 항원 제시 세포(특히 간세포 및 특히 ASGPR에 대한 결합)로 향하게 할 것으로 예상된다. 간에서 항원-제시 세포에 결합하는 특이성은 예를 들어 ASGPR 리간드를 포함하는 대상 저면역원성 생물치료제를 마커(예컨대 형광 마커 피코에리트린("PE"))로 표지함에 의해 확인될 수 있다. 대상 생물치료제는 적합한 실험 대상체에게 투여된다. 대조군, 예를 들어, 비접합된 PE 또는 비히클(식염수)은 대상체의 다른 그룹(들)에 투여된다. 대상 생물치료제 및 대조군을 1 내지 5시간의 기간 동안 순환시킨 후, 대상체의 비장 및 간을 수확하여 형광을 측정하였다. 형광이 발견되는 특정 세포는 이후에 식별될 수 있다. 대상 ASGPR 리간드-연관된 생물치료제는 이러한 방식으로 시험될 때 비접합된 PE 또는 비히클과 비교하여 간의 항원-제시 세포에서 더 높은 수준의 농도를 나타낸다.
면역 조절에서의 유효성은 저면역원성 생물치료제 단독 또는 단지 비히클의 투여와 비교하여 ASGPR 리간드를 포함하는 대상 저면역원성 생물치료제의 투여에 반응하는 OT-1 CD8+ 세포(숙주 마우스 안으로 이식됨)의 증식을 측정함에 의해 테스트될 수 있다. ASGPR 리간드-연관된 생물치료제는 이 방식으로 테스트될 때 생물치료제 단독 또는 비히클과 비교하여 OT-1 세포의 증식을 나타내어 CD8+ T-세포 교차-프라이밍이 증가됨을 입증한다. 기능적 이펙터 표현형으로 확장되는 T 세포를 확장 및 결실되는 T 세포와 구별하기 위해, 증식하는 OT-1 CD8+ T 세포가 고갈의 분자적 특징[예컨대 프로그램된 사멸-1(PD-1), FasL, 및 기타], 뿐만 아니라 아폽토시스 및 따라서 결실의 특질로서 아넥신-V 결합에 대해 표현형으로 분석될 수 있다. OT-1 CD8+ T 세포는 또한 생물치료제에 대한 기능적 비-반응성과, 따라서 면역 내성을 입증하기 위해 조작되지 않은 생물치료제 플러스 어쥬번트를 사용한 도전에 대한 그 반응성에 대해 평가될 수 있다. 그렇게 하기 위해, 세포는 개시내용의 조성물의 숙주 마우스 안으로의 투여 후 단백질 도전 후 염증 특징에 대해 분석된다. 개시내용의 조성물은 이 방식으로 시험될 때 대조군과 비교하여 생물치료제에 대한 염증성 OT-1 CD8+ T 세포 반응의 매우 낮은(예를 들어, 배경) 수준을 나타내어 면역 관용을 입증한다.
인간에서 관용을 유도하는 대상 ASGPR 리간드-연관된 생물치료제의 유효성은 T 세포 반응과 연관된 염증 특징을 평가함에 의해 평가될 수 있다. 전형적으로, ASGPR 리간드가 공유 회합된 생물치료제는 생물치료제를 투여받은 개체에서 상응하는 생물치료제에 의해 도출된 T 세포 반응의 50% 이하, 예를 들어, 40%, 30% 또는 20% 이하, 특정 경우에, 상응하는 조작되지 않은 생물치료제에 의해 도출되는 것의 15%, 10%, 5% 이하, 바람직하게는 단지 2%, 1% 이하인 T 세포 반응을 도출할 것이다. ASGPR-연관된 저면역원성 생물치료제에 의한 내성의 유도는 ASGPR 리간드-연관된 생물치료제로 치료(들) 몇 주 후 투여된 조작되지 않은 생물치료제에 특이적인 항-생물치료제 항체 역가를 정량화함에 의하여 쉽게 평가될 수 있다. 개시내용의 조성물은 이 방식으로 시험될 때 전처리되지 않은 그룹과 비교하여 ASGPR 리간드-연관된 생물치료제로 전처리된 그룹에서 생물치료제로의 도전에 반응하는 낮은 수준의 항체 형성을 나타낸다.
상기 논의된 바와 같이, 본 개시내용의 조작된 저면역원성 생물치료제는 면역 반응을 억제할 수 있는 생물치료제가 되도록 하는 본 명세서에 개시된 하나 이상의 변형을 포함하면서 약리학적 활성을 유지한다. "약리학적 활성을 유지[하는]"은 생물치료제가 나이브 개체(즉, 처음으로 요법을 투여받는 개체)에게 투여될 때 상응하는 조작되지 않은 생물치료제가 되는 것보다 5-배 이하 치료적으로 활성, 일부 경우에 3-배 이하의 활성, 바람직하게는 2-배 이하의 활성, 보다 바람직하게는 적어도 나이브 개체에게 투여될 때 상응하는 조작되지 않은 생물치료제만큼 치료적으로 활성이 있을 것이다는 것을 의미한다.
일부 경우에, Y가 폴리펩티드인 경우, 링커의 폴리펩티드 접합 반응성 말단은 일부 경우에 폴리펩티드 상의 시스테인 티올 또는 라이신 아민기를 통해 폴리펩티드에 접합할 수 있는 부위이고, 따라서 티올-반응성기 예컨대 말레이미드 또는 디브로모말레이미드 또는 본 명세서에서 정의된 바와 같거나, 또는 아민-반응성기 예컨대 활성 에스테르(예를 들어, 퍼플루오로페닐 에스테르 또는 테트라플루오로페닐 에스테르)일 수 있거나, 또는 본 명세서에서 정의된 바와 같다. 다른 방식으로 말하면, Y와 L 또는 X 사이의 접합은 폴리펩티드 상의 시스테인, 티올 또는 라이신 아민기와 L 또는 X 기 상의 말레이미드 또는 디브로모말레이미드와 같은 티올-반응성기, 또는 L 또는 X 기 상의 아민-반응성기 사이의 반응의 생성일 수 있다.
일부 실시형태에서, X 또는 L 기는 전형적으로 시알릴화되지 않은, 즉, 시알산 잔기가 아미노산 잔기 또는 글리칸 모이어티에 대해 이종성인 생물치료제 Y 상의 아미노산 잔기 또는 글리칸의 말단 단부에 공유적으로 결합된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "이종성"은 조성물에 대해 비-자연인, 즉 그것이 비교되는 실체의 나머지와 연관하여 자연에서 전형적으로 발견되지 않는 조성물의 성분을 지칭한다. 예를 들어, 시알산은 G0, G1, G2, G0F, G1F 또는 G2F와 같은 글리칸 구조에 공유적으로 결합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 시알산은 G1S, G2S, G2S2, G1FS, G2FS 및 G2FS2와 같은 글리칸에서 전형적으로 시알릴화된 구조에 공유적으로 결합된다. 일부 실시형태에서, 시알산은 시알산 변형을 결하는 상응하는 조작되지 않은 생물치료제에 존재하는 N- 또는 O-연결된 네이티브 글리칸에 공유 결합된다. 다른 이러한 실시형태에서, 시알산은 신규한 N-연결된 글리칸 부위에 공유적으로 결합된다. 다른 실시형태에서, 시알산은 생물치료제의 아미노산, 예를 들어 무작위 라이신 또는 시스테인, 조작된 트랜스글루타미나제 부위, 포르밀글리신-생성 효소(FGE)를 사용하는 조작된 캐털란트 포르밀글리신 알데하이드 부위, N-말단 2-하이드록시에틸아민(세린) 모이어티를 함유하는 생물치료제에 대한 N-말단-선택적 접합(SeriMab 기술), 또는 신규한 O-연결된 글리칸 부위에 직접적으로 공유적으로 결합된다. 예를 들어 단백질분해 생성물 LC/MS(펩티드 매핑 LC/MS) 및 더 큰 생성물 단편의 LC/MS(예를 들어, 항체 Fc 대 경쇄, Fd')을 포함하는, 생물치료제에서 시알릴화 또는 Siglec 리간드 접합의 부위를 결정하기 위한 임의의 접근법이 생물치료제 내에서 Siglec 리간드의 배치를 결정하는데 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, X 또는 L은 생물치료제 Y의 네이티브 요소, 즉 글리칸에 공유적으로 결합된다.
추가 양태
상기 논의된 바와 같이, 개시내용의 일부 양태에서, 조작된 저면역원성 생물치료제가 제공되며, 여기서 조작된 저면역원성 생물치료제(이하 "저면역원성 생물치료제", "변형된 생물치료제" 또는 간단히 "대상 생물치료제"로 지칭됨)는 변경된 Siglec 리간드 프로필을 포함하도록 조작되어진 생물치료제이다.
일부 실시형태에서, 변경된 Siglec 리간드 프로필은 모체의 생물치료제에 비해 시알산에 대한 강화를 포함할 것이다. 다른 말로 하면, 조작된 저면역원성 생물치료제는 시알산이 풍부하며, 즉, 그것은 "과시알릴화"된다. 예를 들어, 조작된 저면역원성 생물치료제는 하나 이상의 시알산 모이어티, 예를 들어 1, 2, 3, 4개 이상의 시알산 모이어티, 일부 경우에는 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 시알산 모이어티, 일부 이러한 경우에는 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 이상의 모이어티를 포함할 수 있는 반면, 모체의 생물치료제는 시알산 모이어티를 포함하지 않는다 또 다른 예로서, 대상 생물치료제는 2개 이상의 시알산 모이어티, 예를 들어 2, 3, 4개 이상의 시알산 모이어티, 일부 경우에는 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 시알산 모이어티, 일부 이러한 경우에는 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 이상의 시알산 모이어티를 포함하는 반면, 모체의 생물치료제는 단지 하나의 시알산 모이어티를 포함한다. 일부 실시형태에서, 저면역원성 생물치료제는 개체에서 면역 반응을 유도할 상응하는 조작되지 않은 생물치료제보다 2-배 이상의 시알산, 예를 들어 조작되지 않은 생물치료제보다 3-배 더, 4-배 더, 5-배 더, 6-배 더, 7-배 더, 8-배 더, 9-배 더, 10-배 더, 11-배 더, 12-배 더, 13-배 더, 14-배 더, 15-배 더, 16-배 더, 17-배 더, 18-배 더, 19-배 더, 또는 심지어 20-배 더 많은 시알산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조작된 저면역원성 생물치료제의 글리칸 모이어티의 50% 이상, 예를 들어 글리칸 모이어티의 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 100%는 시알산을 포함한다.
일부 실시형태에서, 샘플 중 저면역원성 생물치료제의 50% 이상이 과시알릴화되며, 예를 들어 샘플 중 저면역원성 생물치료제의 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 100%가 과시알릴화된다. 예를 들어, 샘플 중 저면역원성 생물치료제의 50% 이상이 동일한 정도로 또는 그 초과로 과시알릴화될 수 있으며, 이는 상기 기재된 바와 같이 저면역원성 생물치료제가 개체에서 면역 반응을 유도할 상응하는 조작되지 않은 생물치료제보다 더 많은 시알산을 포함하는 실시형태를 포함한다. 일부 실시형태에서, 샘플 중 저면역원성 생물치료제의 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 100%는 동일하거나 그 초과로 과시알릴화된다.
예를 들어, 당단백질 LC/MS, 글리칸 LC/MS, 단백질 LC/MS, 온전한 약물 LC/MS, 모세관 겔 전기영동 글리칸 분석, 이온 교환 HPLC, 분석 역상 HPLC, 분석 소수성 상호작용 크로마토그래피 HPLC, 분석 혼합 모드 크로마토그래피 HPLC, 플레이트-기반 검정에 의한 총 시알산 또는 Siglec 리간드 분석, UV/Vis 흡광도 분광법, 표면 플라즈몬 공명-기반 Siglec 리간드 정량 검정, 바이오레이어 간섭계-기반 Siglec 리간드 정량 검정 등을 포함하는, 생물치료제 조성물의 시알릴화, 즉 시알산 함량을 측정하기 위한 임의의 접근법을 사용하여 생물치료제에 첨부된 Siglec 리간드의 양을 결정할 수 있다.
일부 실시형태에서, Siglec 리간드는 Siglec-특이적 항체로부터 Siglec 결합 단편, 예를 들어 모노클로날 항체로부터, 예를 들어, CDR, Fab, Fab', Fv, 나노바디 등, scFv, 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 다르핀, 카멜리드 나노바디, 어피머, 피노머, 이중특이적 항체, 삼중특이적 항체, 또는 Siglec에 특이적인 기타를 포함한다. 일부 실시형태에서, Siglec 리간드는 Siglec 특이적 키메라 항원 수용체("CAR")로부터의 Siglec 결합 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, Siglec-특이적 항체 또는 Siglec-특이적 CAR은 Siglec-2에 대해 특이적이다. 일부 이러한 실시형태에서, Siglec-2 특이적 항체는 에프라투주맙, 이노투주맙, 수시라슬리맙, 벡투모맙, 피나투주맙, GTB-1550, hLL2, RFB4, JNJ-75348780, HB-22.7, m971, H10-2-4, 및 목세투모맙으로 구성된 군으로부터 선택된다 일부 이러한 실시형태에서 Siglec 리간드는 에프라투주맙으로부터 설계된 scFv 폴리펩티드 서열로부터 유래된 Siglec 결합 단편, 또는 PV1(GYINPRNDYTEYNQ), PV2(CGYRNPRNDYREYCNQ) 및 PV3(RNDYTE)으로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드, 표 2에서 찾을 수 있는 화학 구조를 포함한다(Kim, B. et al. Nanoscale 2020, 12, 11672-11683). 이러한 특정 실시형태에서, Siglec 결합 단편은 본질적으로 에프라투주맙으로부터 설계된 scFv 폴리펩티드 서열 또는 PV1(GYINPRNDYTEYNQ), PV2(CGYRNPRNDYREYCNQ) 및 PV3(RNDYTE)로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드로 구성된다.
표 2. PV1, PV2 및 PV3의 화학 구조.
이러한 일부 실시형태에서, Siglec 리간드는 Pearson, et al. (International Journal of Peptide Research and Therapeutics, 14, 3, 237-246 (2008))에 기술된 바와 같이 HB-22.5, 22.7, 22.23, 22.33, 22.13 및 HB22.196을 포함하는 모노클로날 항체 폴리펩티드로부터 유래된 합성물이다. 하나의 그러한 펩티드는 아미노산 서열 CLGIIWGDGRTDYNSALKSRC 및 N-과 C-말단 시스테인 사이의 이황화 결합을 갖는 모노클로날 항체 HB22-7의 CDR2 영역으로부터 유래된 "펩티드 5"이다.
일부 실시형태에서, Siglec 리간드는 Siglec-특이적 압타머로부터의 Siglec 결합 단편을 포함한다. 대상 생물치료제에서 사용되는 Siglec 결합 단편을 포함하는 Siglec-특이적 앱타머의 비제한적인 예는 TD-05, TD-05.1 및 TD-05.17을 포함한다.
이러한 일부 실시형태에서, Siglec 리간드는 합성의 비-항체-유래된 Siglec 결합 펩티드를 포함하며, 여기서 펩티드는 CD22에 대해 측정가능한 친화성 및 높은 특이성으로 결합한다. 예를 들어, 펩티드는 WO2014044793에 기술된 것, 예를 들어 아미노산 서열 RALLSIFGSLDHRHHHRTCNTTHYRVTTMSHPQFEKKKKLRMKMSHPQLINTTHYRGGPTMGGSPSRQV"를 갖는 "G635BVI07IM1TK"로도 공지된, "펩티드 26"일 수 있다.
따라서, 일부 실시형태에서, 대상 조작된 저면역원성 생물치료제는 하나 이상의 천연 발생 Siglec 리간드, 즉 천연 발생 시알산 및 천연 발생 글리칸을 포함하는 모이어티에 접합된 생물치료제를 포함하며, 여기서 시알산 및 글리칸은 전형적으로 Siglec 리간드를 형성하기 위해 서로 회합하여 자연에서 발견된다. 다른 실시형태에서, 대상 조작된 저면역원성 생물치료제는 하나 이상의 비-천연 발생 Siglec 리간드, 예를 들어, 천연 발생 시알산 및 링커를 포함하는 모이어티, Siglec 리간드의 일부로서 자연에서 발견되는 비-천연 시알산 및 글리칸을 포함하는 모이어티, 비-천연 시알산 및 링커를 포함하는 모이어티, Siglec에 대해 친화성을 갖는 펩티드를 포함하는 모이어티 등에 접합된 생물치료제를 포함한다. 예를 들어, 조작된 저면역원성 생물치료제의 일부 실시형태에서, Siglec 리간드는 비-천연 발생 Siglec 리간드이다. 일부 실시형태에서, 비-천연 발생 Siglec 리간드는 천연 발생 시알산 및 비-천연 발생 링커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 비-천연 발생 Siglec 리간드는 본질적으로 천연 발생 시알산 및 비-천연 발생 링커로 구성된다. 일부 실시형태에서, 비-천연 발생 Siglec 리간드는 비-천연 발생 시알산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 비-천연 발생 Siglec 리간드는 비-천연 발생 링커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 비-천연 발생 Siglec 리간드는 본질적으로 비-천연 발생 시알산 및 비-천연 발생 링커로 구성된다.
제조 방법
상기에 논의한 바와 같이, 저면역원성 생물치료제는 이종성 Siglec 리간드(생물치료제에 이종성이거나 이들이 첨부된 아미노산에 이종성일 수 있음) 및/또는 상기 생물치료제에 천연 발생하는 상승된 양의 Siglec 리간드(들)를 포함하도록 변형된 생물치료제이다. 전형적으로 변형은 단순히 Siglec 리간드를 제형, 예를 들어 리포솜 제형을 통해 생물치료제와 회합함에 의한 것이 아니다. 오히려, 변형은 생물치료제에 대한 Siglec 리간드의 공유 결합이다.
시알산을 생물치료제에 공유적으로 결합시키는 방법은 당업계에 잘 인지되어 있으며, 이들 중 임의의 것이 본 개시내용의 조작된 저면역원성 생물치료제가 되도록 선택된 생물치료제를 변형시키기 위해 전개될 수 있다. 예를 들어, 변형은 조작된 생합성에 의해 수행될 수 있다. "생합성"은 세포에 의해 매개되는 합성 과정을 의미한다. 예를 들어, 골지체에서 20개의 알려진 시알릴트랜스퍼라아제의 하위집합은 3가지 다른 유형의 연결(α2,3, α2,6 및 α2,8)을 통해 갈락토스와 같은 기본 단당류에 시알산을 부착한다. 조작된 생합성은 일부 경우에는 새로운 방식으로, 다른 경우에는 변형된 방식으로 과정을 수행하도록 조작된 세포에 의해 매개되는 합성 과정을 의미한다. 따라서, 예를 들어, 생산자 세포주는 하나 이상의 시알릴 트랜스퍼라제, 예를 들어 시알릴트랜스퍼라제(EC 2.4.99), 베타-갈락토사미드 알파-2,6-시알릴트랜스퍼라제(EC 2.4.99.1), 알파-N-아세틸갈락토사미나이드 알파-2,6-시알릴트랜스퍼라제(EC 2.4.99.3), 베타-갈락토시드 알파-2,3-시알릴트랜스퍼라제(EC 2.4.99.4), N-아세틸락토사미나이드 알파-2,3-시알릴트랜스퍼라제(EC 2.4.99.6), 알파-N-아세틸-뉴라미나이드 알파-2,8-시알릴트랜스퍼라제(EC 2.4.99.8); 락토실세라마이드 알파-2,3-시알릴트랜스퍼라제(EC 2.4.99.9) 또는 효소 경로에서 기타 효소, 예를 들어, 특정 시알산의 생물치료제에 대한 공유 결합을 유도하거나 시알산으로 공유 변형을 위해 특정 신규한 아미노산 잔기를 표적화하는, CMP-Neu5Ac 하이드록실라제, 시알레이트-4-O-아세틸 트랜스퍼라제, 시알레이트-4-O-아세틸에스테라제, 시알레이트-7(9)-O-아세틸트랜스퍼라제, 시알레이트-8-O-메틸 전이효소, 시알레이트-9-)-아세틸트랜스퍼라제 등을 발현하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 또 다른 예로서, 생산자 세포주는 특정 Siglec 리간드로서 제조된 생물치료제 안으로 생산자 라인에 의해 합체될 전구체 기질을 공급받을 수 있다. 치료적 생물치료제로 사용하기 위한 단백질의 발현에 사용되는 임의의 생산자 세포, 예를 들어 그 전체 개시내용은 그 전체가 본 명세서에 참조로 포함되는, 예를 들어 WO2017093291, WO2019002512, WO2019234021에 개시된 바와 같은 포유동물 세포(CHO, HEK 등), 곤충 세포(SF9 등), 박테리아, 원생동물 (리슈마니아 등)이 이 과정에 사용될 수 있다.
다른 예로서, 변형은 화학적 접합에 의해 수행될 수 있다. "화학적 접합"은 세포에 대해 외인성으로 발생하는 과정을 의미한다. 따라서, 예를 들어, Siglec 리간드는 생산자 세포주로부터 생합성 후 생물치료제에 효소적으로 또는 화학적으로 연결될 수 있다. 이러한 시험관내 공정의 비제한적인 예는 미국 특허 번호 7,220,555, 미국 특허 번호 6,376,475B 및 미국 특허 번호 5,409,817에 개시되어 있으며, 그의 전체 개시내용은 본 명세서에 참고로 포함된다. 이러한 일부 실시형태에서, 시알산을 생물치료제에 공유적으로 연결하기 위해 링커가 배치될 수 있다. 링커의 많은 예가 당업계에 존재하며, 이들 중 임의의 것은 시알산(들)을 생물치료제에 화학적으로 접합시켜 본 개시내용의 저면역원성 생물치료제에 도달하는데 사용될 수 있다.
세 번째 예로서, 특히 Siglec 리간드가 펩티드 또는 폴리펩티드 서열, 예를 들어 scFv 또는 에프라투주맙 유래 펩티드, 예를 들어 PV1, PV2 또는 PV3인 실시형태에 대한 것이며, 변형은 생물치료제 내에 펩티드/폴리펩티드 서열을 포함하도록 생물치료제의 유전적 조작에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 생물치료제를 생산하는데 사용되는 폴리뉴클레오티드는 동일한 번역 판독 프레임("인 프레임")에 펩티드/폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하도록 표준 분자 생물학 클로닝 기술에 의해 변형될 수 있어, 생산 세포에서 생물치료제의 전사 및 번역 시 생물치료제는 생물치료제를 구성하는 아미노산과 공유적으로 회합된 펩티드/폴리펩티드 서열을 포함하여 저면역원성인 생물치료제를 생성할 것이다. 바람직하게는, 펩티드/폴리펩티드 서열은 생물치료제의 치료 효과를 담당하지 않는 생물치료제의 도메인, 예를 들어, 효소의 효소적 도메인, Fab 또는 보다 구체적으로 항체의 CDR 도메인 등 안으로 유전적으로 조작될 것이다. 바이러스 입자를 변형시키는 경우, 펩티드/폴리펩티드 서열은 바람직하게는 바이러스 입자의 외부로 노출되도록 캡시드 또는 외피 단백질 안으로, 예를 들어 바이러스 캡시드 단백질의 노출된 루프, 표면-노출된 피막 단백질 등 안으로 유전적으로 조작될 것이다. 그러한 구조적 특징은 바이러스 치료의 분야에서 당업자에 의해 잘 이해된다.
사용 방법
발명의 일부 양태에서, 의료적 개입이 필요한 개체의 치료를 위한 방법이 제공된다. 용어 "치료", "치료하는" 등은 본 명세서에서 일반적으로 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것을 의미하기 위해 사용된다. 효과는 질환 또는 이의 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방한다는 관점에서 예방적일 수 있고/있거나 질환 및/또는 질환에 기인한 부작용에 대한 부분적 또는 완전한 치유의 관점에서 치료적일 수 있다. 본 명세서에 사용된 "치료"는 포유동물에서 질환의 임의의 치료를 포함하고: (a) 질환에 걸리기 쉬울 수 있지만 아직 질환이 있는 것으로 진단되지 않은 대상체에서 질환이 발생하는 것을 예방하는 것; (b) 질환을 억제하는 것, 즉 질환의 전개를 저지하는 것; 또는 (c) 질환을 완화하는 것, 즉 질환의 퇴행을 야기하는 것을 포함한다. 치료제는 질환 또는 상해의 개시 전, 개시 동안 또는 개시 후에 투여될 수 있다. 치료가 환자의 바람직하지 않은 임상 증상을 안정화시키거나 감소시키는 진행중인 질환의 치료가 특히 관심있는 것이다. 이러한 치료는 바람직하게는 영향을 받은 조직에서 기능의 완전히 상실 이전에 수행된다. 대상 요법은 바람직하게는 질환의 증상 단계 동안, 일부 경우에는 질환의 증상 단계 후에 투여될 것이다.
용어 "개체", "대상체", "숙주" 및 "환자"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되고 진단, 치료 또는 요법이 요구되는 임의의 포유동물 대상체, 특히 인간을 지칭한다.
본 개시내용의 저면역원성 조성물은 효과적인 치료제의 반복적 또는 만성적 투여를 필요로 하는 질환의 치료에서 특별한 용도를 발견한다. 그러한 조건의 많은 예가 있으며, 그 중 몇 가지 비제한적인 예가 아래 및 다른 곳에서 제공된다. 통상의 기술자는 이들 실시예로부터 당업계에 공지된 바와 같은 다른 적응증 및 생물치료제에 외삽할 수 있을 것이다는 것이 예상된다.
예를 들어, 개체는 만성적 자가면역 또는 염증성 질환, 예를 들어 류마티스 관절염, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 크론병, 궤양성 대장염, 건선, 화농한선염, 포도막염, 및 소아 특발성 관절염을 앓고 있을 수 있다. 그러한 경우에, 방법은 개체에게 저면역원성 TNFα-특이적 항체, 예를 들어 아달리무맙으로부터 조작된 저면역원성 아달리무맙, 또는 인플릭시맙으로부터 조작된 저면역원성 인플릭시맙을 만성 면역 질환을 치료하기에 유효한 양으로 투여하는 것을 포함할 수 있다.
또 다른 예로서, 개체는 백혈병, 예를 들어 ALL을 앓고 있을 수 있다. 그러한 경우에, 방법은 백혈병을 치료하기에 유효한 양으로 에르위니아 크리산테미로부터 조작된 저면역원성 아스파라기나제를 개체에게 투여하는 것을 포함할 수 있다.
또 다른 예로서, 개체는 결장직장암, 비소세포 폐암 또는 두경부암을 앓고 있을 수 있다. 그러한 경우에, 방법은 대장암, 비소세포 폐암 또는 두경부암을 치료하기에 유효한 양으로 조작된 저면역원성 세툭시맙을 개체에게 투여하는 것을 포함할 수 있다.
또 다른 예로서, 개체는 다발성 경화증을 앓고 있을 수 있다. 그러한 경우에, 방법은 조작된 저면역원성 나탈리주맙, 조작된 저면역원성 IFNβ-1b, 또는 조작된 저면역원성 IFNβ-1a를 다발성 경화증을 치료하기에 유효한 양으로 개체에게 투여하는 것을 포함할 수 있다.
또 다른 예로서, 개체는 장기 이식의 수용자일 수 있고 이식된 조직을 개체의 면역계에 의한 거부로부터 보호하는 면역억제제가 필요할 수 있다. 그러한 경우에, 방법은 이식된 조직에 대한 항체 반응을 방지하기에 유효한 양으로 조작된 저면역원성 IdeS를 개체에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이식된 기관은 동종이계 이식편이다. 일부 실시형태에서, 이식된 기관은 이종의 이식편이다. 일부 실시형태에서, 기관은 신장, 심장, 폐, 간, 췌장, 기관, 혈관 조직, 피부, 뼈, 연골, 부신 조직, 태아 흉선 및 각막으로부터 선택된다.
또 다른 예로서, 개체는 제2형 당뇨병을 앓고 있을 수 있다. 그러한 경우에, 방법은 당뇨병을 치료하기에 유효한 양으로 조작된 저면역원성 엑세나타이드 또는 조작된 저면역원성 알비글루타이드를 개체에게 투여하는 것을 포함할 것이다.
또 다른 예로서, 개체는 보체-매개된 질환을 앓고 있을 수 있다. 그러한 경우에, 방법은 예를 들어 박테리아 병원체 또는 진균 병원체(예를 들어, 슈도모나스 엘라스타제(PaE), 슈도모나스 알칼리성 프로테아제(PaAP), 연쇄상구균 발열성 외독소 B(SpeB)로부터 조작된 저면역원성 보체 분해 프로테아제, 포르피로모나스 진지발리스로부터 진지페인, 아스페르길루스 알칼리성 프로테아제 1(Alp1), C. 알비칸스 분비 아스파르틸 프로테이나제 1(Sap1), 2(Sap2) 및 3(Sap3)을 보체를 분해하고 질환을 치료하는 데 유효한 양으로 개체에게 투여하는 것을 포함할 것이다.
또 다른 예로서, 개체은 효소 결핍증을 앓고 있을 수 있다. 그러한 경우에, 방법은 결핍을 치료하기에 유효한 양으로 조작된 저면역원성 효소를 개체에게 투여하는 것을 포함할 것이다. 이러한 효소 결핍의 비제한적 예는 저면역원성 페닐알라닌 암모니아-분해효소가 투여되는 PKU; 저면역원성 알파-갈락토시다아제 A가 투여되는 파브리병; 저면역원성 산 α-글루코시다제(GAA)가 투여되는 폼페병; 저면역원성 글루코세레브로시다제(GCase)가 투여되는 고셔병; 저면역원성 아스파르틸글리코사미니다제(AGA)가 투여되는 아스파르틸글리코사미뇨증; 저면역원성 아스포타제가 투여되는 저인산증(HPP); 저면역원성 알파-L-이두로니다제가 투여되는 MPS I; 저면역원성 이두로네이트 설파타제가 투여되는 MPS II; 저면역원성 술파미나제가 투여되는 MPS IIIa; 저면역원성 α-N-아세틸글루코사미니다제(NAGLU)가 투여되는 MPS IIIB; 저면역원성 헤파린 아세틸 CoA: α-글루코사미나이드 N-아세틸트랜스퍼라제(HGSNAT)가 투여되는 MPS IIIC; 저면역원성 N-아세틸글루코사민 6-설파타제(GNS)가 투여되는 MPS IIID; 저면역원성 N-글루코사민 3-O-설파타제(아릴설파타제 G 또는 ARSG)가 투여되는 MPS IIIE; 저면역원성 N-아세틸갈락토사민 6-설파타제가 투여되는 MPS IVA; 저면역원성 베타-갈락토시다제가 투여되는 MPS IVB; 저면역원성 N-아세틸갈락토사민 4-설파타제가 투여되는 MPS VI; 저면역원성 베타-글루쿠로니다제가 투여되는 MPS VI; 저면역원성 인자 VIII가 투여될 혈우병 A; 저면역원성 인자 IX가 투여될 혈우병 B; 저면역원성 팔미토일 단백질 티오에스테라제(PPT1)가 투여되는 바텐병의 CLN1 형태; 저면역원성 트리펩티딜 펩티다제(TPP1)가 투여되는 바텐병의 CLN2 형태; 저면역성 아르기나제-1 또는 페그질라기나제가 투여될 아르기나제-1 결핍; 및 저면역원성 시스타티오닌 베타 합성효소 또는 에글리아 생성물 AGLE-177이 투여되는 고전적 호모시스틴뇨증으로도 공지된 시스타티오닌 베타 합성효소(CBS) 결핍을 포함할 것이다.
또 다른 예로서, 개체은 유전자 요법으로부터 이익을 얻을 수 있는 질환, 예를 들어 치료적 RNA 또는 단백질의 만성적 발현이 병태를 치료할 유전 질환 또는 복합 질환(즉, 특정 유전 병인과 연관되는 것으로 제한되지 않음)을 앓고 있을 수 있다. 그러한 경우에, 방법은 관심있는 치료적 유전자 생성물을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열("이식유전자")을 포함하는 조작된 저면역원성 바이러스 입자를 질환을 치료하기에 유효한 양으로 개체에게 투여하는 것을 포함할 것이다. 대상 저면역원성 바이러스 입자를 통해 전달될 수 있는 적합한 이식유전자/유전자 생성물의 비제한적인 예는 근이영양증, 낭포성 섬유증, 가족성 고콜레스테롤혈증 및 희귀 또는 드문 질환과 연관된 것을 포함한다. 그러한 희귀 질환의 예는 척수성 근위축증(SMA), 헌팅던병, 레트 증후군(예를 들어, 메틸-CpG-결합 단백질 2(MeCP2); UniProtKB - P51608), 근위축성 측삭 경화증(ALS), 뒤센형 근이영양증, 척수소뇌성 운동실조 2형(SCA2)/ALS와 연관된 프리드리히 운동실조(예를 들어, 프라탁신), ATXN2; ALS와 연관된 TDP-43, 프로그래눌린(PRGN)(전측두엽 치매(FTD), 진행성 비-유창성 실어증(PNFA) 및 의미 치매를 포함하는 비-알츠하이머 뇌 변성과 연관됨) 등을 포함할 수 있다. 예를 들어, www.orpha.net/consor/cgi-bin/Disease_Search_List.php; rarediseases.info.nih.gov/diseases 참조.
이식유전자에 의해 인코딩될 수 있는 다른 유용한 치료적 유전자 생성물은 또한 인슐린, 글루카곤, 글루카곤-유사 펩티드 1(GLP-1), 성장 호르몬(GH), 부갑상선 호르몬(PTH), 성장 호르몬 방출 인자(GRF), 난포 자극 호르몬(FSH), 황체형성 호르몬(LH), 인간 융모막 성선자극호르몬(hCG), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 안지오포이에틴, 안지오스타틴, 과립구 콜로니 자극 인자(GCSF), 에리스로포이에틴(EPO), 결합 조직 성장 인자(CTGF), 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 산성 섬유아세포 성장 인자(aFGF), 표피 성장 인자(EGF), 형질전환 성장 인자 a(TGFa), 혈소판-유래된 성장 인자(PDGF), 인슐린 성장 인자 I 및 II(IGF-I 및 IGF-II), TGF b, 액티빈, 인히빈을 포함하는 형질전환 성장 인자 b 슈퍼패밀리 중 임의의 하나, 또는 임의의 골형성 단백질(BMP) BMP 1-15, 성장 인자, 신경 성장 인자(NGF), 뇌-유래된 신경영양 인자(BDNF), 뉴로트로핀 NT-3 및 NT-4/5, 섬모 신경영양 인자(CNTF), 신경교 세포주 유래된 신경영양 인자(GDNF), 뉴투린, 아그린의 헤레글루인/뉴레귤린/ARIA/neu 분화 인자(NDF) 패밀리 중 임의의 하나, 세마포린/콜랩신 패밀리 중 임의의 하나, 네트린-1 및 네트린-2, 간세포 성장 인자(HGF), 에프린, 노긴, 소닉 헤지호그 및 티로신 수산화효소를 포함하나 이에 제한되지 않는 호르몬 및 성장과 분화 인자를 포함한다.
다른 유용한 이식유전자는 사이토카인 및 림포카인 예컨대 트롬보포이에틴(TPO), 인터류킨(IL) IL-1 내지 IL-25(IL-2, IL-4, IL-12, 및 IL-18 포함), 단핵구 화학유인 단백질, 백혈병 억제 인자, 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자, Fas 리간드, 종양 괴사 인자 a 및 b, 인터페론 a, b, 및g, 줄기 세포 인자, Hk-2/flt3 리간드를 포함하지만 이에 제한되지 않는 면역계를 조절하는 단백질을 인코딩하는 것을 포함한다. 면역계에 의해 생성된 유전자 생성물도 발명에 유용하다. 이들은 면역글로불린 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE, 키메라 면역글로불린, 인간화된 항체, 단일 사슬 항체, T 세포 수용체, 키메라 T 세포 수용체, 단일 사슬 T 세포 수용체, 클래스 I 및 클래스 II MHC 분자, 뿐만 아니라 조작된 면역글로불린 및 MHC 분자를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 유용한 유전자 생성물은 또한 보체 조절 단백질, 막 보조인자 단백질(MCP), 분해 가속 인자(DAF), CR1, CF2 및 CD59와 같은 보체 조절 단백질을 포함한다.
또 다른 유용한 이식유전자는 호르몬, 성장 인자, 사이토카인, 림포카인, 조절 단백질 및 면역계 단백질에 대한 수용체 중 임의의 하나에 대한 유전자 생성물을 인코딩하는 것들을 포함한다.
또 다른 유용한 이식유전자는 저밀도 지단백질(LDL) 수용체, 고밀도 지단백질(HDL) 수용체, 초저밀도 지단백질(VLDL) 수용체 및 스캐빈저 수용체를 포함하는 콜레스테롤 조절용 수용체를 인코딩하는 것들을 포함한다. 발명은 또한 글루코코르티코이드 수용체 및 에스트로겐 수용체, 비타민 D 수용체 및 기타 핵 수용체를 포함하는 스테로이드 호르몬 수용체 슈퍼패밀리의 구성원과 같은 유전자 생성물을 포함한다. 부가하여, 유용한 유전자 생성물은 전사 인자 예컨대 jun,fos, max, mad, 혈청 반응 인자(SRF), AP-1, AP2, myb, MyoD 및 myogenin, ETS-box 함유 단백질, TFE3, E2F, ATF1, ATF2, ATF3, ATF4, ZF5, NFAT, CREB, HNF-4, C/EBP, SP1, CCAAT-박스 결합 단백질, 인터페론 조절 인자(IRF-1), Wilms 종양 단백질, ETS-결합 단백질, STAT, GATA-박스 결합 단백질, 예를 들어 GATA-3 및 날개달린 나선 단백질의 포크헤드 패밀리를 포함한다.
다른 유용한 유전자 생성물은 카바모일 합성효소 I, 오르니틴 트랜스카바밀라아제, 아르기노숙시네이트 합성효소, 아르기노숙시네이트 분해효소, 아르기나아제, 푸마릴아세트아세트산 가수분해효소, 페닐알라닌 하이드록실라아제, 알파-1 항트립신, 글루코스-e-포스파타아제, 포르포빌리노겐 데아미나아제, 인자 VIII, 인자 IX, 시스타티온 베타-합성효소, 분지쇄 케톤산 데카르복실라제, 알부민, 이소발레릴-coA 데하이드로게나제, 프로피오닐 CoA 카르복실라제, 메틸 말로닐 CoA 뮤타제, 글루타릴 CoA 데하이드로게나제, 인슐린, 베타-글루코시다제, 피루베이트 카르복실레이트, 간 포스포릴라제, 포스포릴라제 키나제, 글리신 데카르복실라제, H-단백질, T-단백질, 낭포성 섬유증 막횡단 조절인자(CFTR) 서열, 및 디스트로핀 서열 또는 이의 기능적 단편을 포함한다. 또 다른 유용한 유전자 생성물은 효소 대체 요법에 유용할 수 있는 것과 같은 효소를 포함하며, 이는 효소의 결핍 활성으로 인한 다양한 병태에서 유용하다. 예를 들어, 만노스-6-포스페이트를 함유하는 효소는 리소좀 저장 질환에 대한 요법에서 이용될 수 있다(예를 들어, b-글루쿠로니다제(GUSB)를 인코딩하는 적합한 유전자를 포함). 다른 예에서, 유전자 생성물은 유비퀴틴 단백질 리가제 E3A(UBE3A)이다. 여전히 유용한 유전자 생성물은 UDP 글루쿠로노실트랜스퍼라제 패밀리 1 구성원 A1(UGT1A1)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 유전자 생성물은 인자 VIII이 아니다.
다른 유용한 유전자 생성물은 삽입, 결실 또는 아미노산 치환을 함유하는 비-천연 발생 아미노산 서열을 갖는 키메라 또는 하이브리드 폴리펩티드와 같은 비-천연 발생 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들어, 단일-사슬 조작된 면역글로불린은 특정 면역손상된 환자에게 유용할 수 있다. 다른 유형의 비-천연 발생 유전자 서열에는 표적의 과발현을 감소시키는데 사용될 수 있는 리보자임과 같은 촉매적 핵산 및 안티센스 분자가 포함된다.
유전자의 발현의 감소 및/또는 조절은 암 및 건선인 것과 같이 과증식하는 세포를 특징으로 하는 과증식성 상태의 치료에 특히 바람직하다. 표적 폴리펩티드는 정상 세포와 비교하여 과증식성 세포에서 배타적으로 또는 더 높은 수준으로 생산되는 이들 폴리펩티드를 포함한다. 표적 항원은 myb, myc, fyn과 같은 발암유전자 및 전좌 유전자 bcr/abl, ras, src, P53, neu, trk 및 EGRF에 의해 인코딩되는 폴리펩티드를 포함한다. 표적 항원으로서 발암유전자 생성물에 부가하여, 항암 치료 및 보호 요법을 위한 표적 폴리펩티드는 B 세포 림프종에 의해 제작된 항체의 가변 영역 및 T 세포 림프종의 T 세포 수용체의 가변 영역을 포함하며 이는 일부 실시형태에서 또한 자가면역 질환에 대한 표적항원으로 사용된다. 다른 종양-연관된 폴리펩티드가 모노클로날 항체 17-1A에 의해 인식되는 폴리펩티드 및 엽산 결합 폴리펩티드를 포함하는 종양 세포에서 더 높은 수준으로 발견되는 폴리펩티드와 같은 표적 폴리펩티드로 사용될 수 있다.
다른 적합한 이식유전자는 세포 수용체 및 자가-지향된 항체를 생성하는 세포를 포함하는 자가면역과 연관된 표적에 대해 광범위한 보호 면역 반응을 부여함에 의해 자가면역 질환 및 장애를 앓고 있는 개체을 치료하는데 유용할 수 있는 치료제를 인코딩하는 것들을 포함한다. T 세포 매개된 자가면역 질환은 류마티스성 관절염(RA), 다발성 경화증(MS), 쇼그렌 증후군, 유육종증, 인슐린 의존성 진성 당뇨병(IDDM), 자가면역 갑상선염, 반응성 관절염, 강직성 척추염, 경피증, 다발성근염, 피부근염, 건선, 혈관염, 베게너 육아종증, 크론병 및 궤양성 대장염을 포함한다. 각각의 이들 질환은 내인성 항원에 결합하고 자가면역 질환과 연관된 염증 캐스케이드를 개시하는 T 세포 수용체(TCR)를 특징으로 한다.
또 다른 유용한 유전자 생성물은 혈우병 B(인자 IX 포함) 및 혈우병 A(인자 VIII 및 이의 변이체, 예컨대 이종이량체의 경쇄 및 중쇄 및 B-결실된 도메인 포함; 미국 특허 번호 6,200,560 및 미국 특허 번호 6,221,349)를 포함하는 혈우병의 치료에 사용되는 것들을 포함한다. 일부 실시형태에서, 미니유전자는 인간 성장 호르몬(hGH) 폴리아데닐화 서열뿐만 아니라 10개 아미노산 신호 서열을 인코딩하는 인자 VIII 중쇄의 처음 57개 염기쌍을 포함한다. 대체 실시형태에서, 미니유전자는 B 도메인의 N-말단으로부터의 5개 아미노산뿐만 아니라, A1 및 A2 도메인, 및/또는 B 도메인의 C-말단의 85개 아미노산, 뿐만 아니라 A3, C1 및 C2 도메인을 더 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 인자 VIII 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 핵산은 B 도메인의 14개 아미노산을 코딩하는 42개 핵산에 의해 분리된 단일 미니 유전자에 제공된다[미국 특허 번호 6,200,560].
저면역원성 바이러스 입자를 통해 전달될 수 있는 추가의 예시적인 유전자는
글리코겐 축적 질환 또는 결핍 유형 1A(GSD1)와 연관된 글루코스-6-포스파타제, PEPCK 결핍과 연관된 포스포에놀피루베이트-카르복시 키나제(PEPCK); 발작 및 심각한 신경발달 손상과 연관된 세린/트레오닌 키나아제 9(STK9)로도 알려진 사이클린 의존 키나아제-유사 5(CDKL5); 갈락토오스혈증과 연관된 갈락토오스-1 인산염 유리딜 전이효소; 페닐케톤뇨증(PKU)과 연관된 페닐알라닌 수산화효소(PAH); 메이플시럽뇨병과 연관된 BCKDH, BCKDH-E2, BAKDH-Ela 및 BAKDH-Elb를 포함하는, 하이드록시산 산화효소 1(GO/HAO1) 및 AGXT, 분지쇄 알파-케토산 탈수소효소를 포함한 원발성 고산소뇨증 유형 1과 연관된 유전자 생성물; 티로신혈증 유형 1과 연관된 푸마릴아세토아세테이트 가수분해효소; 메틸말론산혈증과 연관된 메틸말로닐-CoA 뮤타제; 중간 사슬 아세틸 CoA 결핍과 연관된 중간 사슬 아실 CoA 탈수소효소; 오르니틴 트랜스카바밀라제 결핍과 연관된 오르니틴 트랜스카바밀라제(OTC); 시트룰린혈증과 연관된 아르기니노숙신산 합성효소(ASS1); 레시틴-콜레스테롤 아실트랜스퍼라제(LCAT) 결핍; 아메틸말론산혈증(MMA); 니만-픽 질환과 연관된 NPC1, 유형 C1); 프로피온 아카데미아(PA); 트랜스티레틴(TTR)-관련된 유전성 아밀로이드증과 연관된 TTR; 가족성 고콜레스테롤혈증(FH)과 연관된 저밀도 지단백질 수용체(LDLR) 단백질, LDLR 변이체, 예컨대 WO 2015/164778에 기술된 것들; PCSK9; 치매와 연관된 ApoE 및 ApoC 단백질; Crigler-Najjar 질환과 연관된 UDP-글루코로노실트랜스퍼라아제; 중증 복합 면역결핍 질환과 연관된 아데노신 데아미나제; 통풍 및 Lesch-Nyan 증후군과 연관된 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 전이효소; 바이오티미다제 결핍과 연관된 바이오티미다제; 파브리병과 연관된 알파-갈락토시다제 A(a-Gal A)); GM1 강글리오시다제와 연관된 베타-갈락토시다제(GLB1); 윌슨병과 연관된 ATP7B; 고셔병 유형 2 및 3과 연관된 베타-글루코세레브로시다제; 젤웨거 증후군과 연관된 퍼옥시좀 막 단백질 70kDa; 이색성 백질이영양증과 연관된 아릴설파타제 A(ARSA), 크라베병과 연관된 갈락토세레브로시다제(GALC) 효소, 폼페병과 연관된 알파-글루코시다제(GAA); 니만픽병 유형 A와 연관된 스핑고미엘리나제(SMPD1) 유전자; 성인 발병 유형 II 시트룰린혈증(CTLN2)과 연관된 아르기니노석시네이트 합성효소; 우레아 순환 장애와 연관된 카르바모일-포스페이트 합성효소 1(CPS1); 척수성 근위축증과 연관된 생존 운동 뉴런(SMN) 단백질; 파버 지방육아종증과 연관된 세라미다제; GM2 강글리오시드증 및 테이-삭스 및 샌드호프병과 연관된 b-헥소사미니다제; 아스파르틸-글루코사미뇨증과 연관된 아스파르틸글루코사미니다제; 푸코시다증과 연관된 α-푸코시다아제; 알파-만노시드증과 연관된 α-만노시다아제; 급성 간헐적 포르피린증(AIP)과 연관된 포르포빌리노겐 데아미나제; 알파-1 항트립신 결핍(폐기종)의 치료를 위한 알파-1 항트립신; 지중해 빈혈 또는 신부전으로 인한 빈혈의 치료를 위한 에리스로포이에틴; 허혈성 질환의 치료를 위한 혈관 내피 성장 인자, 안지오포이에틴-1 및 섬유아세포 성장 인자; 예를 들어 죽상경화증, 혈전증 또는 색전증에서 볼 수 있는 폐색된 혈관의 치료를 위한 트롬보모듈린 및 조직 인자 경로 억제제; 파킨슨병의 치료를 위한 방향족 아미노산 탈탄산효소(AADC) 및 티로신 수산화효소(TH); 울혈성 심부전의 치료를 위한 포스포람반, 사르코(엔도)플라즈믹 세망 아데노신 트리포스파타제-2(SERCA2) 및 심장 아데닐릴 사이클라제에 대한 안티-센스 또는 돌연변이 형태인, 베타 아드레날린성 수용체; 다양한 암의 치료를 위한 p53과 같은 종양 억제 유전자; 염증 및 면역 장애 및 암의 치료를 위한 다양한 인터루킨 중 하나와 같은 사이토카인; 근이영양증의 치료를 위한 디스트로핀 또는 미니디스트로핀 및 유트로핀 또는 미니유트로핀; 및 당뇨병의 치료를 위한 인슐린 또는 GLP-1을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
약학적 조성물
대상 저면역원성 생물치료제로 개체를 치료하는 방법에서, 환자는 전형적으로 대상 저면역원성 생물치료제를 포함하는 약학적 조성물을 투여받을 것이다. 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체에 제형화된 본 개시내용의 조작된 저면역원성 생물치료제를 의미한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제"는 임의의 보조제, 담체, 부형제, 활주제, 감미제, 희석제, 방부제, 염료/착색제, 풍미 증강제, 계면활성제, 습윤제, 분산제, 현탁제, 안정화제, 등장화제, 용제 또는 유화제로서 미국 식품의약국에서 사람이나 가축에 사용할 수 있는 것으로 승인된 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
개시내용의 약학적 조성물은 치료학적으로 유효한 복용량, 예를 들어, 전술한 질환 상태에 대한 치료를 제공하기에 충분한 복용량으로 투여된다. 개시내용의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 투여는 유사한 효용을 제공하는 작용제에 대해 임의의 허용된 투여 방식을 통해 이루어질 수 있다. 인간 복용량 수준은 개시내용의 화합물에 대해 아직 최적화되지 않았지만, 이들은 그 동물 모델에서 질환 또는 장애의 치료를 초래하는 연관된 동물 모델, 예를 들어, 마우스에 투여된 용량으로부터 쉽게 외삽될 수 있다. 일반적으로, 개별 인간 용량은 약 0.01 내지 2.0mg/kg 체중, 바람직하게는 약 0.1 내지 1.5mg/kg 체중, 가장 바람직하게는 약 0.3 내지 1.0mg/kg 체중이다. 치료는 하루 또는 수일의 기간 동안 투여될 수 있고, 수일, 1주 또는 수주 또는 1개월 또는 수개월의 간격으로 반복될 수 있다. 투여는 단일 용량(예를 들어, 볼루스) 또는 초기 볼루스로서 될 수 있고 이어서 시간, 예를 들어 1일 내지 7일에 걸쳐 완전한 용량의 나머지 부분의 연속적인 주입을 할 수 있다. 물론 투여되는 활성 화합물의 양은 다음 중 일부 또는 전부에 따라 달라질 것이다: 치료되는 대상체 및 질환 상태, 고통의 중증도, 투여의 방식 및 일정 및 처방 의사의 판단. 또한 투여되는 양은 생물치료제의 분자량, 공유적으로 결합된 Siglec 리간드의 양 및 링커의 크기에 따라 달라질 것임을 이해할 것이다.
모든 전형적인 투여 경로가 고려되지만(예를 들어, 경구, 국소, 경피, 주사(근육내, 정맥내 또는 동맥-내)), 현재 주사에 적합한 액체 복용 형태를 제공하는 것이 바람직하다. 일반적으로, 의도된 투여의 방식에 따라, 약학적으로 허용가능한 조성물은 개시내용의 대상 저면역원성 생물치료제의 중량으로 약 0.1% 내지 95%, 바람직하게는 약 0.5% 내지 50%를 함유할 것이며, 나머지는 적합한 약학적 부형제, 담체 등이다. 0.005% 내지 95% 범위의 활성 성분을 함유하고 나머지는 비-독성 담체로 이루어진 복용 형태 또는 조성물을 제조할 수 있다.
대상 약학적 조성물은 단독으로 또는 다른 약학적 작용제와 조합하여 투여될 수 있다. 이들 조성물은 항-엽산제, 면역 억제제, 세포분열억제제, 유사분열 억제제 및 항-대사물질, 또는 이의 조합을 포함하여 면역-조절 작용제로서 작용할 수 있고 보다 구체적으로 B-세포에 대한 억제 효과를 가질 수 있는 다른 활성 작용제를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다른 의약 작용제, 약학적 작용제, 담체 등을 포함할 수 있다.
약학적으로 투여가능한 액상 조성물은, 예를 들어 물(주사용수), 식염수, 수성 덱스트로스, 글리세롤, 글리콜, 에탄올 등(갈락토스 제외)과 같은 담체에 개시내용의 활성 조성물(예를 들어, 동결건조된 분말) 및 선택적 약학적 보조제를 예를 들어 용해, 분산 등을 하고 이에 의해 용액 또는 현탁액을 형성함에 의해 제조될 수 있다. 원하는 경우, 투여되어 지는 약학적 조성물은 또한 습윤제, 유화제, 안정화제, 가용화제, pH 완충액 등과 같은 소량의 비독성 보조 물질, 예를 들어 아세트산나트륨, 시트르산나트륨, 사이클로덱스트린 유도체, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 아세테이트 및 트리에탄올아민 올레이트 등, 삼투질, 아미노산, 당 및 탄수화물, 단백질 및 중합체, 염, 계면활성제, 킬레이터 및 항산화제, 방부제 및 특정 리간드를 함유할 수 있다. 그러한 복용 형태를 제조하는 실제 방법은 당업자에게 공지되어 있거나 자명할 것이다; 예를 들어, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Pharmaceutical Press, 22nd Edition, 2012 참조. 투여되어 지는 조성물 또는 제형은 어떠한 경우에도 치료되어 지는 대상체의 증상을 치료하기에 유효한 양으로 활성 화합물의 양을 함유할 것이다.
실시예
다음의 실시예는 본 발명을 만들고 사용하는 방법에 대한 완전한 개시 및 설명을 당업자에게 제공하기 위해 제시된 것이고, 발명자가 그들의 발명으로 간주하는 범주를 제한하려는 의도가 아니고 아래 실험이 수행된 모든 실험이거나 유일한 실험임을 나타내기 위해 의도되지도 않는다. 사용된 숫자(예를 들어, 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위해 노력했지만 일부 실험 오류 및 편차를 고려해야 한다. 달리 표시되지 않는 한, 부는 중량부이고, 분자량은 중량 평균 분자량이고, 온도는 섭씨 온도이고, 압력은 대기압 또는 대기압에 가깝다. "평균"은 산술 평균을 의미한다. 예를 들어 bp, 염기쌍(들); kb, 킬로베이스(들); pl, 피코리터(들); s 또는 sec, 초(들); min, 분; h 또는 hr, 시간(들); aa, 아미노산(들); kb, 킬로베이스(들); bp, 염기쌍(들); nt, 뉴클레오티드(들); i.m., 근육내(로); i.p., 복강내(로); s.c., 피하(로); 등과 같은 표준 약어가 사용될 수 있다.
일반 합성 절차
모든 합성 화학은 실시예에서 달리 나타내지 않는 한 표준 실험실 유리제품에서 수행되었다. 상업적 시약은 받은 그대로 사용했다. 가열 시간과 압력을 제어하기 위해 기기 소프트웨어를 사용하여 Anton Paar Monowave 400에서 마이크로파 반응을 수행했다. 분석 LC/MS는 Masslynx 소프트웨어를 사용한 PDA 및 단일 사중극자 검출기(교대로 양이온 및 음이온 스캔을 가짐)를 갖는 Waters Acquity UPLC 장비 또는 LabSolutions 소프트웨어를 사용한 Shimadzu LCMS-2020에서 수행되었다. 잔류 시간은 추출된 214 및/또는 254nm UV 크로마토그램에서 결정되었다. Prep HPLC는 Masslynx 소프트웨어/DAD 검출기가 있는 Agilent 1260 Infinity Autopurification 시스템을 사용한 분획 모듈 2767, 펌프 2545 및 2998 PDA 검출기로 구성된 Waters 자동정제 시스템 또는 215 액체 처리기, 333 및 334 펌프, UV/VIS-155 검출기 및 Trilution lc 소프트웨어를 사용한 Gilson 시스템에서 수행되었다. 1H NMR은 Bruker Avance 400 MHz 또는 Bruker Fourier 300 MHz에서 Topspin 소프트웨어를 사용하여 수행되었다. 분석 박층 크로마토그래피는 실리카(Sigma Aldrich TLC Silica gel 60 F254 알루미늄 또는 유리 TLC 플레이트, 형광 지시약 F254로 코팅된 실리카겔)에서 수행되었고 UV 광 하에서 시각화된다. 실리카겔 크로마토그래피는 구배 용리를 위해 수동으로 수행되거나 Teledyne ISCO CombiFlash NextGen 300+ 자동화된 크로마토그래피로 수행되었다.
개시된 화합물을 합성하는데 유용한 일반적으로 공지된 화학 합성 도식 및 조건을 제공하는 많은 일반 참조가 이용가능한다(예를 들어, Smith and March, March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, Fifth Edition, Wiley-Interscience, 2001; 또는 Vogel, A Textbook of Practical Organic Chemistry, Including Qualitative Organic Analysis, Fourth Edition, New York: Longman, 1978 참조).
대상 화합물의 제조 공정 동안, 임의의 관련 분자 상에서 민감성 또는 반응성 기를 보호하는 것이 필요하고/하거나 바람직할 수 있다. 이는 표준 작업, 예컨대 J. F. W. McOmie, "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, London and New York 1973, T. W. Greene and P. G. M. Wuts , "Protective Groups in Organic Synthesis", Third edition, Wiley, New York 1999, "The Peptides"; Volume 3 (editors: E. Gross and J. Meienhofer), Academic Press, London and New York 1981, "Methoden der organischen Chemie", Houben-Weyl, 4th edition, Vol. 15/l, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974, H.-D. Jakubke and H. Jescheit, "Aminosauren, Peptide, Proteine", Verlag Chemie, Weinheim, Deerfield Beach, and Basel 1982, 및/또는 Jochen Lehmann, "Chemie der Kohlenhydrate: Monosaccharide and Derivate", Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974에 기술된 바와 같은 통상적인 보호기의 수단에 의해 달성될 수 있다. 보호기는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 편리한 후속 단계에서 제거될 수 있다.
대상 화합물은 상업적으로 이용가능한 출발 재료 및/또는 통상적인 합성 방법에 의해 제조된 출발 재료를 사용하여 다양한 상이한 합성 경로를 통해 합성될 수 있다. 본 명세서에 개시된 화합물을 합성하는데 사용될 수 있는 합성 경로의 다양한 실시예가 하기 도식에 기재되어 있다.
실시예 1 : 항-약물 항체 반응에 대해 억제되는 CD22-계합 생물치료제의 클래스에 대한 개념
B 세포와 그 클론유형 B 세포 수용체는 외래 작용제에 대한 항체-기반 면역 반응의 중심에 있다. 항-약물 항체는 모노클로날 항체, 이중특이성 및 다중특이성 항체, 효소 대체 요법 약물, 재조합 미생물 효소, 단백질-Fc 융합 단백질, 세포내 전달 작제물 및 유전자 요법 벡터를 포함한 많은 생물치료제 약물 클래스에 대한 약물 노출에 대해 도처에 있는 문제이다.
체액성 면역원성을 억제하거나 삭제한 신규한 클래스의 생체분자 및 생물치료제가, 항-약물 항체-분비 형질 세포로 분화할 가능성이 있는 B 세포 클론이 클로노타입의 항-약물 B 세포 수용체에 대한 Siglec 억제 수용체 동원을 통해 억제될 수 있다는 원리에 기반하여 설계되었다. Siglec은 대부분 또는 모든 유형의 조혈 세포에서 발현되는 시알산-결합 렉틴 단백질의 클래스이다.
도 1은 억제된 항-약물 항체 반응을 갖는 CD22-계합 생물치료제에 대한 모델의 일 양태를 묘사한다. B 세포 수용체 - Siglec 리간드 공동-인게이저(약물-Siglec 리간드 접합체 포함)는 B 세포 수용체 복합체에 대한 억제성 CD22 수용체의 물리적 동원의 장점에 의해 약물-특이적 B 세포 활성화를 억제 또는 침묵시킨다.
도 2는 억제된 항-약물 항체 반응을 갖는 CD22-계합 생물치료제에 대한 모델의 또 다른 양태를 묘사한다: B 세포 수용체 - Siglec 리간드 공동-인게이저(약물-Siglec 리간드 접합체 포함)는 약물-특이적 B 세포만을 억제, 침묵 또는 제거하는 반면 약물에 특이적이지 않은 이들 B 세포 클론을 그대로 남겨둔다.
실시예 2 : Siglec-2/CD22-계합, 저- 또는 비-면역원성 생물치료제의 다양한 형식
4가지 형식의 Siglec-2/CD22-계합, 저- 또는 비-면역원성 생물치료제가 조작될 수 있다. 도 3은 각 형식의 대표적인 구조를 예시한다. 항체는 이러한 생물치료제를 예시하기 위해 예시되지만, 다른 생물학적 양상(예를 들어, 이중특이성 및 다중특이성 항체, 효소 대체 요법 약물, 재조합 미생물 효소, 단백질-Fc 융합 단백질, 세포내 전달 작제물, 유전자 요법 벡터)은 4가지 제시된 형식을 사용하여 유사하게 조작될 수 있다. 형식 1, 2 및 3은 화학적으로 통합된 합성 소-분자 Siglec 리간드를 사용하여 주어진 약물에 Siglec-2 결합 활성을 부여한다. 이러한 합성 Siglec-2 리간드 구조는 실시예 3에 기술되어 있다.
"형식 1"은 하나 이상의 접합가능한 Siglec 리간드-링커 구조로 그 폴리펩티드 사슬 상에 공유적으로 변형된 생물치료제이다. Siglec-2 리간드-링커 구조의 접합은 부위-특이적 또는 비-부위-특이적 방법론을 통해 달성될 수 있다.
"형식 2"는 Siglec 리간드 구조를 갖는 천연 또는 조작된 글리칸 상에 변형된 생물치료제이며, 여기서 Siglec-2 리간드 합체는 세포에서 약물 발현 동안 생합성적으로 발생한다. 이러한 접근법은 약물 글리칸에 생합성 합체를 가능하게 하기 위해 약물 발현 동안 Siglec-2 리간드-기반 기질이 세포에 공급되는 접근법을 포함할 것이다. 글리칸 안으로 Siglec 리간드의 합체는 또한 시험관내 단백질 번역 시스템에서 Siglec-2 리간드-기반 효소 기질로의 처리를 통하여 달성될 수 있다.
"형식 3"은 Siglec 리간드 구조로 천연 또는 조작된 글리칸 상에 공유적으로 변형된 생물치료제이다. 말단 Siglec-2 리간드 구조를 갖는 글리칸 변형은 생물제제의 정제 후 화학적 및/또는 화학효소적 접합을 통해 달성된다.
저- 또는 비-면역원성 생물제제의 조작을 위한 "형식 4"는 생물치료제의 폴리펩티드 사슬 안으로 단백질- 또는 펩티드-기반 CD22 결합제 i의 합체에 의존한다. 이러한 CD22 결합제의 예는: 1) 면역글로불린-기반 결합제, 예컨대 Fab 도메인, 단일-사슬 Fv(scFv) 단편, 디아바디 및 단일-도메인 항체 단편(카멜리드 VHH 또는 상어 VNAR); 2) 비-면역글로불린-기반 결합 도메인, 예컨대 어피바디, 파이노머, 모노바디, DARPin, Knottin, 가변 림프구 수용체(VLR) 및 어피머; 3) CD22-결합 펩티드, 예컨대 펩티드 앱타머; 및 4) 올리고뉴클레오티드-기반 Siglec 결합제, 예컨대 올리고뉴클레오티드 압타머를 포함할 것이다.
4가지 모두의 예시된 형식은 약물-특이적 B 세포에 대한 항-약물 클론유형 B 세포 수용체에 대해 CD22 동원을 가능하게 하여 결과적으로 B 세포 활성화, 증식 및 분화를 억제하여 궁극적으로 항-약물 항체 생성을 차단할 것이다.
실시예 3 :
접합가능한 링커 화합물의 세트를 설계 및 합성하여 약물 Siglec-2 결합의 중요성과 시험관내 B 세포 활성화 및 생체내 항-약물 항체 반응의 억제를 위한 강화된 Siglec-2 결합 대 비-강화된 Siglec-2 결합의 중요성을 확립했다. 도 4는 예시적인 접합가능한, CD22-결합, Siglec 리간드-링커 구조를 묘사하고, 구조의 구성요소: Siglec 리간드 결합 모이어티, Siglec 리간드-근위 링커 구조, 링커 및 반응성/접합가능한 기를 강조한다. 도 5는 Siglec-2 결합 친화성 및 종 특이성을 결정하는 요소에 초점을 맞춘 예시적인 Siglec 리간드 구조를 묘사한다. 도 6은 Siglec 리간드 원자가에서 다양한 구조를 보여주는 예시적인 Siglec 리간드 구조를 묘사한다. 도 7은 링커 구조에서 다양한 구조를 나타내는 예시적인 Siglec 리간드 구조를 묘사하며, 여기서 시알산-기반 모이어티에 근접한 영역은 PEG-기반 구조 또는 갈락토스-기반 구조로 구성된다. 도 8은 Siglec-2 결합에 대해 강화된(상단) 또는 강화되지 않은(중간) 예시적인 접합가능한 링커 구조, 및 Siglec-2에 결합하지 않는 음성 대조군 링커 구조(하단)를 묘사한다. 강화된 Siglec-리간드 링커 구조(Cpd. No. 26288, Siglec 리간드: 메틸-α-9-N-(비페닐-4-카르보닐)-아미노-9-데옥시-N-글리콜릴뉴라민산)(상단), 비-강화된 Siglec-2 결합 모이어티를 함유하는 Siglec 리간드-링커 구조(Cpd. No. 26614 , Siglec 리간드: N-글리콜릴 뉴라민산/Neu5Gc)(중간), 및 PEG-기반 비-Siglec 결합 접합가능한 링커 구조(Cpd. No. 26530 )(하단)가 도시되어 있다. 실시예 5에 나타낸 바와 같이, 이들 화합물을 고순도로 합성되고 상이한 생물치료제 및 단백질에 접합되었다.
모든 합성 화학은 실시예에서 달리 나타내지 않는 한 표준 실험실 유리제품에서 수행되었다. 상업적 시약은 받은 그대로 사용했다. 가열 시간과 압력을 제어하기 위해 기기 소프트웨어를 사용하여 Anton Paar Monowave 400에서 마이크로파 반응을 수행했다. 분석 LC/MS는 Masslynx 소프트웨어를 사용한 PDA 및 단일 사중극자 검출기(교대로 양이온 및 음이온 스캔을 가짐)를 갖는 Waters Acquity UPLC 장비 또는 LabSolutions 소프트웨어를 사용한 Shimadzu LCMS-2020에서 수행되었다. 잔류 시간은 추출된 214 및/또는 254nm UV 크로마토그램에서 결정되었다. Prep HPLC는 Masslynx 소프트웨어/DAD 검출기가 있는 Agilent 1260 Infinity Autopurification 시스템을 사용한 분획 모듈 2767, 펌프 2545 및 2998 PDA 검출기로 구성된 Waters 자동정제 시스템 또는 215 액체 처리기, 333 및 334 펌프, UV/VIS-155 검출기 및 Trilution lc 소프트웨어를 사용한 Gilson 시스템에서 수행되었다. 1H NMR은 Bruker Avance 400 MHz 또는 Bruker Fourier 300 MHz에서 Topspin 소프트웨어를 사용하여 수행되었다. 분석 박층 크로마토그래피는 실리카(Sigma Aldrich TLC Silica gel 60 F254 알루미늄 또는 유리 TLC 플레이트, 형광 지시약 F254로 코팅된 실리카겔)에서 수행되었고 UV 광 하에서 시각화된다. 실리카겔 크로마토그래피는 구배 용리를 위해 수동으로 수행되거나 Teledyne ISCO CombiFlash NextGen 300+ 자동화된 크로마토그래피로 수행되었다.
실시예 4: 접합가능한 Siglec 리간드의 합성
(2R,3S,4S,5R,6R)-2-(아세톡시메틸)-6-(부트-3-인-1-일옥시)테트라하이드로-2H-피란-3,4,5-트리일 트리아세테이트 (Cpd. No. 26499) 및 (2R,3R,4S,5S,6R)-2-(부트-3-인-1-일옥시)-6-(하이드록시메틸)테트라하이드로-2H-피란-3,4,5-트리일 트리벤조에이트 (실시예 1)
(2R,3S,4S,5R,6R)-2-(아세톡시메틸)-6-(부트-3-인-1-일옥시)테트라하이드로-2H-피란-3,4,5-트리일 트리아세테이트 ( 3 )의 합성
아르곤 분위기에서, (2S,3R,4S,5S,6R)-6-(아세톡시메틸)테트라하이드로-2H-피란-2,3,4,5-테트라일 테트라아세테이트(1, 10.0g, 25.62mmol) 및 부트-3-인-1-올(2, 2.69g, 38.43mmol)을 무수 디클로로메탄(100.0mL)에 교반하면서 용해시켰다. 이 용액에 활성화된 분말형 4Å 분자체(10.0g, 100% w/w)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 다음, 0℃로 냉각시킨 후 삼불화붕소 디에틸 에테레이트(22.32mL, 76.86mmol)를 30분에 걸쳐 점적 부가하였다. 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물을 중성 pH까지 트리에틸아민으로 켄칭하고, 셀라이트 상에서 여과하고, 디클로로메탄(50mL)으로 세정하였다. 여액에 수성 중탄산나트륨(100mL)을 교반하면서 첨가하였다. 10분 후, 유기층을 분리하고 물(2 X 50mL)로 세정하고 무수 황산나트륨으로 건조하고 회전 증발기에서 농축하여 조 잔사를 얻었다. 조 잔사를 컬럼 크로마토그래피(헥산 중 60-90% 에틸 아세테이트)로 정제하여 (2R,3S,4S,5R,6R)-2-(아세톡시메틸)-6-(부트-3-인-1-일옥시)테트라하이드로-2H-피란-3,4,5-트리일 트리아세테이트(3)를 백색 고체로 얻었다. 수율: 8.50g, 82.87%; ELSD-MS (ESI) m/z 401.38 [M+1]+.
(2R,3S,4S,5R,6R)-2-(아세톡시메틸)-6-(부트-3-인-1-일옥시)테트라하이드로-2H-피란-3,4,5-트리일 트리아세테이트 (Cpd. No. 26499 )의 합성
메탄올(80mL) 중 (2R,3R,4S,5R,6R)-2-(부트-3-인-1-일옥시)-6-(하이드록시메틸)테트라하이드로-2H-피란-3,4,5-트리올(3, 8.5.0g, 21.23mmol)의 교반된 용액에 0℃에서 나트륨 메톡사이드(메탄올 중 25%) 용액(0.44mL, 2.12mmol)에 점적 부가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물을 0℃로 냉각하고 DOWEX 수소 형태로 켄칭하여 pH 6을 유지하였다. 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고 감압 하에 농축하여 고체를 얻은 다음 디에틸 에테르로 분쇄하고 여과하여 (2R,3R,4S,5R,6R)-2-(부트-3-인-1-일옥시)-6-(하이드록시메틸)테트라하이드로-2H-피란-3,4,5-트리올(Cpd. No. 26499)을 회백색 고체로 얻었다. 수율: 4.0g, 81.13%; ELSD-MS (ESI) m/z 250.0 [M+18]+.
(2R,3R,4S,5R,6R)-2-(부트-3-인-1-일옥시)-6-(((tert-부틸디메틸실릴)옥시)메틸)테트라하이드로-2H-피란-3,4,5-트리올( 4 )의 합성
건조 피리딘(10.0ml) 중 (2R,3R,4S,5R,6R)-2-(부트-3-인-1-일옥시)-6-(하이드록시메틸)테트라하이드로-2H-피란-3,4,5-트리올(26499, 1.0gm, 4.31mmol)의 교반된 용액에 tert-부틸(클로로)디메틸실란(0.779gm, 5.17mmol)을 0℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물을 감압 하에서 직접적으로 농축하여 조 잔사를 얻은 다음 컬럼 크로마토그래피(헥산 중 70-95% 에틸 아세테이트)를 통해 정제하여 (2R,3R,4S,5R,6R)-2-(부트-3-인-1-일옥시)-6-(((tert-부틸디메틸실릴)옥시)메틸)테트라하이드로-2H-피란-3,4,5-트리올(4)을 무색 점착성 액체로 얻었다. 수율; 0.80g, 53.62%. LCMS m/z 347.0 [M+1]+.
(2R,3R,4S,5S,6R)-2-(부트-3-인-1-일옥시)-6-(((tert-부틸디메틸실릴)옥시)메틸)테트라하이드로-2H-피란-3,4,5-트리일 트리벤조에이트 ( 5 )의 합성
피리딘(7.5mL) 중 (2R,3R,4S,5R,6R)-2-(부트-3-인-1-일옥시)-6-(((tert-부틸디메틸실릴)옥시)메틸)테트라하이드로-2H-피란-3,4,5-트리올(4, 0.75g, 2.16mmol)의 교반된 용액에 0℃에서 벤조일 클로라이드(2.01mL, 17.3mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물을 회전식 증발기에서 직접적으로 농축하여 조 잔사를 얻은 다음 컬럼 크로마토그래피(헥산 중 10-30% 에틸 아세테이트)를 통해 정제하여 (2R,3R,4S,5S,6R)-2-(부트-3-인-1-일옥시)-6-(((tert-부틸디메틸실릴)옥시)메틸)테트라하이드로-2H-피란-3,4,5-트리일 트리벤조에이트 (5)를 무색 고체로 얻었다. 수율: 1.25g, 87.66%; LCMS m/z 659.44 [M+1]+.
(2R,3R,4S,5S,6R)-2-(부트-3-인-1-일옥시)-6-(하이드록시메틸)테트라하이드로-2H-피란-3,4,5-트리일 트리벤조에이트 ( 실시예 1 )의 합성
옥솔란(30.0ml) 중 (2R,3R,4S,5S,6R)-2-(부트-3-인-1-일옥시)-6-(((tert-부틸디메틸실릴)옥시)메틸)테트라하이드로-2H-피란-3,4,5-트리일 트리벤조에이트(5, 3.0g, 4.55mmol)의 교반된 용액에 테트라부틸아자늄 플루오라이드(6.83mL, 6.83mmol)를 0℃에서 점적 부가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 2.5시간 동안 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물을 물로 켄칭하고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조하고 감압 하에서 증발시켜 조 잔사를 얻은 다음 컬럼 크로마토그래피(헥산 중 30-40% 에틸 아세테이트)를 통해 정제하여 (2R,3S,4S,5R,6R)-4,5-비스(아세틸옥시)-6-(부트-3-인-1-일옥시)-2-(하이드록시메틸)옥산-3-일 아세테이트(실시예 1)를 백색 고체로 얻었다. 수율; 1.2g, 48.39%; ELSD-MS (ESI) m/z 250.0 [M+18]+. 1H NMR (400 MHz, 메탄올-d 4) δ 4.25 (d,　J　= 7.2 Hz, 1H), 3.98 - 3.92 (m, 3H), 3.81 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 3.78 - 3.66 (m, 3H), 3.53 - 3.43 (m, 3H), 2.50 (dt, J = 7.2 & 2.8 Hz, 2H), 2.25 (t, J = 2.4 Hz, 1H).
(1R,2R)-1-((2R,3R,4S,6R)-3-아세트아미도-4-아세톡시-6-(메톡시카르보닐)-6-(p-톨릴티오)테트라하이드로-2H-피란-2-일)-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로판-1,2-디일 디아세테이트 (실시예 3)
메틸 (2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-2,4-디하이드록시-6-((1R,2R)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실레이트 ( 2 )의 합성
무수 메탄올(2500mL) 중 (2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-2,4-디하이드록시-6-((1R,2R)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(1, 100.0g, 323.3mmol)의 교반된 현탁액에 Amberlite IR-120(H+) 수지(80.0g)를 실온에서 아르곤 분위기 하에 첨가하였다. 현탁액이 투명한 용액이 될 때까지 반응 혼합물을 불활성 분위기 하에서 교반하였다. 수지를 여과에 의해 제거하고 여액을 감압 하에 농축하여 잔사를 얻었다. 잔사를 디에틸 에테르로 분쇄하고 여과하여 메틸 (2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-2,4-디하이드록시-6-((1R,2R)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실레이트(2)를 연분홍색 고체로 얻었다. 수율: 104.0g, 99.49%; LCMS (ESI) m/z 324.2 [M+1]+.
(1S,2R)-1-((2R,3R,4S,6S)-3-아세트아미도-4,6-디아세톡시-6-(메톡시카르보닐)테트라하이드로-2H-피란-2-일)프로판-1,2,3-트리일 트리아세테이트 ( 3 )의 합성
2000mL 둥근 바닥 플라스크에서 메틸 (2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-2,4-디하이드록시-6-((1R,2R)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실레이트(2, 102.0g, 315mmol)를 아르곤 분위기 하에 피리딘(600mL)에 교반하면서 용해시켰다. 이 용액에 아세트산 무수물(298mL, 3.15mmol)을 교반하면서 0℃에서 30분에 걸쳐 점적 부가하였다. 혼합물을 0℃에서 실온까지 밤새 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물을 회전식 증발기에서 감압 하에 직접적으로 농축하였다. 얻어진 걸쭉한 시럽을 에틸 아세테이트(500mL)와 함께 분별 깔때기에 붓고 수성 1N HCl 용액(200mL)에 이어서 포화 중탄산나트륨(200mL) 용액 및 DM 수(2 X 200mL)로 세정하였다. 유기층을 분리하여 무수 황산나트륨으로 건조하고 감압 하에 농축하여 걸쭉한 시럽을 얻었다. 시럽을 디에틸 에테르로 분쇄하고 여과하여 (1S,2R)-1-((2R,3R,4S,6S)-3-아세트아미도-4,6-디아세톡시-6-(메톡시카르보닐)테트라하이드로-2H-피란-2-일)프로판-1,2,3-트리일 트리아세테이트(3)를 백색 고체로 얻었다. 수율: 130.0g, 71.83%; LCMS (ESI) m/z 534.2 [M+1]+.
(1S,2R)-1-((2R,3R,4S,6R)-3-아세트아미도-4-아세톡시-6-(메톡시카르보닐)-6-(p-톨릴티오)테트라하이드로-2H-피란-2-일)프로판-1,2,3-트리일 트리아세테이트 ( 4 )의 합성
아르곤 분위기 하에서, (1S,2R)-1-((2R,3R,4S,6S)-3-아세트아미도-4,6-디아세톡시-6-(메톡시카르보닐)테트라하이드로-2H-피란-2-일)프로판-1,2,3-트리일 트리아세테이트(3, 130.0g, 243.68mmol)를 무수 디클로로메탄(1300.0mL)에 교반하면서 용해시켰다. 이 용액에 활성화된 분말형 4Å 분자체(40.0g)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하고 0℃로 냉각시킨 후 삼불화붕소 디에틸 에테레이트(111.0mL, 365.5mmol)를 30분에 걸쳐 점적 부가하였다. 혼합물을 실온에서 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물을 중성 pH까지 트리에틸아민으로 켄칭하고, 셀라이트 상에서 여과하고, 디클로로메탄(100mL)으로 세정하였다. 여액에 수성 중탄산나트륨(300mL)을 교반하면서 첨가하였다. 10분 후, 유기층을 분리하고 물(2 X 300mL)로 세정하고 무수 황산나트륨으로 건조하고 회전식 증발기에서 농축하여 조 잔사를 얻었다. 얻어진 조 잔사를 컬럼 크로마토그래피(헥산 중 60-90% 에틸 아세테이트)를 통해 정제하여 (1S,2R)-1-((2R,3R,4S,6R)-3-아세트아미도-4-아세톡시-6-(메톡시카르보닐)-6-(p-톨릴티오)테트라하이드로-2H-피란-2-일)프로판-1,2,3-트리일 트리아세테이트(4)를 백색 고체로 얻었다. 수율: 125.0g, 85.83%; LCMS (ESI) m/z 598.32 [M+1]+.
메틸 (2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-4-하이드록시-2-(p-톨릴티오)-6-((1R,2R)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실레이트 ( 5 )의 합성
메탄올(800mL) 중 (1S,2R)-1-((2R,3R,4S,6R)-3-아세트아미도-4-아세톡시-6-(메톡시카르보닐)-6-(p-톨릴티오)테트라하이드로-2H-피란-2-일)프로판-1,2,3-트리일 트리아세테이트(4, 100.0g, 167mmol)의 교반된 용액에 나트륨 메톡사이드(MeOH 중 25%) 용액(3.58mL, 16.7mmol)을 0℃에서 천천히 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물을 0℃로 냉각하고 DOWEX 수소 형태로 켄칭하여 pH 6을 유지하였다. 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고 감압 하에 농축하여 고체를 얻은 다음 디에틸 에테르로 분쇄하고 여과하여 메틸(2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-4-하이드록시-2-(p-톨릴티오)-6-((1R,2R)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실레이트(5)를 회백색 고체로 얻었다. 수율: 71.0g, 98.80%; LCMS (ESI) m/z 430.10 [M+1]+.
메틸 (2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(토실옥시)프로필)-4-하이드록시-2-(p-톨릴티오)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실레이트 ( 6 )의 합성
피리딘(300mL) 중 메틸 (2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-4-하이드록시-2-(p-톨릴티오)-6-((1R,2R)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실레이트(5, 40.0g, 93.1mmol)의 교반된 용액에 피리딘(100mL) 중 4-메틸벤젠-1-설포닐 클로라이드(30.2g, 158mmol)의 용액에 0℃에서 점적 부가하였다. 생성된 반응 용액을 밤새 교반하였다. 완료 후 반응 혼합물을 직접적으로 감압 하에 농축하여 걸쭉한 시럽을 얻었다. 걸쭉한 시럽을 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(헥산 중 80-95% 에틸 아세테이트)를 통해 정제하여 메틸(2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(토실옥시)프로필)-4-하이드록시-2-(p-톨릴티오)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실레이트(6)를 백색 고체로 얻었다. 수율: 21.2g, 39.0%. LC-MS (ESI) m/z 584.05 [M+1]+.
메틸 (2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-6-((1R,2R)-3-아지도-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-2-(p-톨릴티오)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실레이트 ( 7 )의 합성
불활성 분위기에서, 메틸 (2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(토실옥시)프로필)-4-하이드록시-2-(p-톨릴티오)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실레이트(6, 21.0g, 35.98mmol)를 교반하면서 무수 N,N-디메틸포름아미드(210.0mL)에 용해시켰다. 이 용액에 아지드화나트륨(7.80g, 120mmol)을 실온에서 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 60℃에서 16시간 동안 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물을 회전식 증발기에서 직접적으로 농축하여 조 고체를 얻었다. 조 고체를 컬럼 크로마토그래피(헥산 중 80-95% 에틸 아세테이트)를 통해 정제하여 메틸(2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-6-((1R,2R)-3-아지도-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-2-(p-톨릴티오)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실레이트(7)를 회백색 고체로 얻었다. 수율: 11.7g, 71.55%; LCMS [ESI) m/z 453.19 [M-1]-.
메틸 (2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-6-((1R,2R)-3-아미노-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-2-(p-톨릴티오)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실레이트 ( 8 )의 합성
테트라하이드로푸란(100mL) 중 메틸 (2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-6-((1R,2R)-3-아지도-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-2-(p-톨릴티오)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실레이트(7, 10.0g, 22.0mmol)의 교반된 용액에 실온에서 10% Pd/C(10.0g, 100% w/w)를 첨가하였다. 이어서 반응물을 12시간 동안 H2 기체의 풍선 압력을 사용하여 수소화시켰다. 완료 후, 반응물을 셀라이트를 통해 여과하고 여액을 농축하였다. 잔사를 진공 하에서 건조시켜 조 메틸 (2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-6-((1R,2R)-3-아미노-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-2-(p-톨릴티오)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실레이트(8)를 걸쭉한 시럽으로 얻었다. 수율 9.9g, 105.3%; LCMS, m/z 428.16 [M+1]+.
메틸 (2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시-2-(p-톨릴티오)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실레이트 ( 10 )의 합성
메틸 (2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-6-((1R,2R)-3-아미노-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-2-(p-톨릴티오)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실레이트(8, 9.90g, 21.78mmol) 및 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 3-페녹시벤조에이트(9, 7.91g, 25.41mmol)를 아르곤 분위기 하에서 교반하면서 테트라하이드로푸란(90.0mL)에 용해시켰다. 이 용액에 에틸비스(프로판-2-일)아민(12.07mL, 69.31mmol)을 0℃에서 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물을 감압 하에서 농축하여 조 잔사를 얻은 다음 컬럼 크로마토그래피(헥산 중 80-90% 에틸 아세테이트)를 통해 정제하여 메틸 (2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-페녹시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시-2-(p-톨릴티오)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실레이트(10)를 백색 고체로 얻었다. 수율: 8.10g, 58.93% (over two steps); LCMS (ESI) m/z 625.23 [M+1]+.
(1R,2R)-1-((2R,3R,4S,6R)-3-아세트아미도-4-아세톡시-6-(메톡시카르보닐)-6-(p-톨릴티오)테트라하이드로-2H-피란-2-일)-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로판-1,2-디일 디아세테이트 ( 실시예 3 )의 합성
피리딘(80.0mL) 중 메틸 (2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-페녹시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시-2-(p-톨릴티오)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실레이트(10, 8.0g, 12.81mmol)의 교반된 용액에 아세트산 무수물(5.45mL, 57.63mmol)을 0℃에서 30분에 걸쳐 점적 부가하였다. 혼합물을 0℃에서 실온까지 밤새 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물을 진공 하에서 직접적으로 농축하였다. 얻어진 걸쭉한 시럽을 에틸 아세테이트(80.0mL)와 함께 분별 깔대기에 붓고 1N HCl 용액(50mL)에 이어서 포화 황산나트륨 용액(50mL) 및 DM 수(2 X 100mL)로 세정하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조하고 감압 하에 농축하여 조 잔사를 얻었다. 잔사를 컬럼 크로마토그래피(헥산 중 55-70% 에틸 아세테이트)를 통해 정제하여 (1R,2R)-1-((2R,3R,4S,6R)-3-아세트아미도-4-아세톡시-6-(메톡시카르보닐)-6-(p-톨릴티오)테트라하이드로-2H-피란-2-일)-3-(3-페녹시벤즈아미도)프로판-1,2-디일 디아세테이트(실시예 3)를 백색 고체로 얻었다. 수율: 4.80g, 49.92%; LCMS (ESI) m/z 751.25 [M+1]+. 1H NMR (400 MHz, 메탄올-d 4) δ 8.20 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 7.82 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 7.57 - 7.35 (m, 7H), 7.17 - 7.01 (m, 6H), 5.44 - 5.42 (m, 1H), 5.35 (dt, J = 10.4 & 4.8 Hz, 1H), 4.75 (dd, J = 10.4 & 1.8 Hz, 1H), 4.03 (d, J = 10.4 Hz, 2H), 3.85 - 3.74 (m, 1H), 3.28 - 4.26 (m, 1H), 2.61 (dd, J = 14.0 & 4.8 Hz, 1H), 2.19 (s, 3H), 2.08 - 1.96 (m, 7H), 1.85 (s, 3H).
(1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1-((2R,3R,4S,6R)-4-아세톡시-3-(2-아세톡시아세트아미도)-6-(메톡시카르보닐)-6-(p-톨릴티오)테트라하이드로-2H-피란-2-일)프로판-1,2-디일 디아세테이트 (실시예 4)
메틸 (2R,4S,5R,6R)-5-아미노-6-((1R,2R)-3-아지도-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-2-(p-톨릴티오)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실레이트 ( 2 )의 합성
메탄올(210.0mL) 중 메틸 (2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-6-((1R,2R)-3-아지도-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-2-(p-톨릴티오)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실레이트(1, 21.0g, 46.20mmol)의 교반된 용액에 메탄 설폰산(18.0mL, 277.2mmol)을 0℃에서 점적 부가하였다. 생성된 반응 혼합물을 63℃에서 30시간 동안 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물을 0℃로 냉각시키고 트리에틸아민(~15.0mL, pH 7)으로 켄칭하였다. 혼합물을 감압 하에서 농축하여 조 메틸 (2R,4S,5R,6R)-5-아미노-6-((1R,2R)-3-아지도-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-2-(p-톨릴티오)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실레이트(2)를 밝은 갈색 겔로 얻었다. 수율: 19.0g, 99.68%; LC-MS (ESI) m/z 413.57 [M+1]+.
메틸 (2R,4S,5R,6R)-5-(2-아세톡시아세트아미도)-6-((1R,2R)-3-아지도-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-2-(p-톨릴티오)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실레이트 ( 3 )의 합성
불활성 분위기에서, 조 메틸 (2R,4S,5R,6R)-5-아미노-6-((1R,2R)-3-아지도-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-2-(p-톨릴티오)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실레이트(2, 19.0g, 46.06mmol)를 교반하면서 건조 테트라하이드로푸란(200.0mL)에 용해시키고 0℃로 냉각시켰다. 이 용액에 트리에틸아민(17.70mL, 138.2mmol)에 이어 2-클로로-2-옥소에틸 아세테이트(4.95mL, 46.06mmol)를 0℃에서 천천히 첨가하였다. 반응이 완료될 때까지 0℃에서 교반하였다. 혼합물을 감압 하에서 농축하여 조 잔사를 얻은 다음 컬럼 크로마토그래피(헥산 중 60-75% 에틸 아세테이트)를 통해 정제하여 메틸 (2R,4S,5R,6R)-5-(2-아세톡시아세트아미도)-6-((1R,2R)-3-아지도-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-2-(p-톨릴티오)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실레이트(3)를 백색 고체로 얻었다. 수율: 15.2g, 64.38%; LCMS (ESI) m/z 513.42 [M+1]+.
메틸 (2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-아지도-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-(p-톨릴티오)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실레이트 ( 4 )의 합성
메탄올(150.0mL) 중 메틸 (2R,4S,5R,6R)-5-(2-아세톡시아세트아미도)-6-((1R,2R)-3-아지도-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-2-(p-톨릴티오)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실레이트(3, 15.0g, 29.27mmol)의 교반된 용액에 0℃에서 나트륨 메톡시드 용액(메탄올 중 25%, 0.061ml, 2.93mmol)을 천천히 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 0℃로 냉각하고 DOWEX 수소 형태로 켄칭하여 pH 6을 유지하였다. 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고 감압 하에 농축하여 고체를 얻었고 이를 디에틸 에테르로 분쇄하고 중심 깔때기로 여과하여 메틸 (2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-아지도-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-(p-톨릴티오)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실레이트(4)를 회백색 고체로 얻었다. 수율: 13.0g, 94.41%; LCMS (ESI) m/z, 471.15 [M+1]+.
메틸 (2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-아미노-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-(p-톨릴티오)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실레이트 ( 5 )의 합성
메탄올(130mL) 중 메틸 (2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-아지도-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-(p-톨릴티오)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실레이트(4, 13.0g, 27.63mmol)의 교반된 용액에 실온에서 10% Pd/C(13.0g, 100% w/w)를 첨가하였다. 이어서 반응물을 H2 가스의 풍선 압력을 사용하여 12시간 동안 수소화하였다. 완료 후, 반응물을 셀라이트를 통해 여과하고 여액을 농축하였다. 이어서 수득된 잔사를 고진공 하에 건조시켜 조 메틸 (2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-아미노-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-(p-톨릴티오)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실레이트(5)를 걸쭉한 시럽으로 얻었다. 수율: 12.2g, 99.41%; LCMS (ESI) m/z 445.16 [M+1]+.
메틸 (2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-(p-톨릴티오)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실레이트 ( 7 )의 합성
테트라하이드로푸란(40.0mL) 중 메틸 (2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-아미노-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-(p-톨릴티오)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실레이트(5, 12.2g, 27.45mmol) 및 2,5-디옥소사이클로펜틸 2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세테이트(6, 10.19g, 32.94mmol)의 교반된 용액에 에틸비스(프로판-2-일)아민(22.4mL, 137.23mmol)을 0℃에서 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 완료 후, 혼합물을 감압 하에서 농축하여 조 잔사를 얻었다. 조 잔사를 컬럼 크로마토그래피(헥산 중 80-90% 에틸 아세테이트)를 통해 정제하여 메틸 (2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-(p-톨릴티오)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실레이트(7)를 백색 고체로 얻었다. 수율: 8.0g, 45.63%; LCMS (ESI) m/z 639.23 [M+1]+.
(1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1-((2R,3R,4S,6R)-4-아세톡시-3-(2-아세톡시아세트아미도)-6-(메톡시카르보닐)-6-(p-톨릴티오)테트라하이드로-2H-피란-2-일)프로판-1,2-디일 디아세테이트 ( 실시예 4 )의 합성
피리딘(80.0mL) 중 메틸 (2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-(p-톨릴티오)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실레이트(7, 8.0g, 12.52mmol)의 교반된 용액에 아세트산 무수물(11.61mL, 125.2mmol)을 0℃에서 30분 동안 점적 부가했다. 반응 혼합물을 0℃에서 실온까지 밤새 교반하였다. 완료 후, 휘발성재료를 진공 하에서 제거하여 조 걸쭉한 시럽을 얻었다. 이어서 조 걸쭉한 시럽을 에틸 아세테이트(240.0mL)와 함께 분별 깔대기에 붓고 1N HCl 용액에 이어서 포화 황산나트륨 용액으로 세정하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조하고 감압 하에 농축하여 조 걸쭉한 시럽을 얻었다. 조 걸쭉한 시럽을 컬럼 크로마토그래피(헥산 중 60-70% 에틸 아세테이트)를 통해 정제하여 (1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1-((2R,3R,4S,6R)-4-아세톡시-3-(2-아세톡시아세트아미도)-6-(메톡시카르보닐)-6-(p-톨릴티오)테트라하이드로-2H-피란-2-일)프로판-1,2-디일 디아세테이트(실시예 4)를 백색 고체로 얻었다. 수율: 5.40g, 53.43%; LCMS (ESI) m/z 807.2 [M+1]+. 1H NMR (400 MHz, 메탄올-d 4) δ 7.27 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.14 (d, J = 8.4 Hz, 2H),4.03 (t, J = 8.4 Hz,1H), 3.77 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 3.51 - 3.47 (m, 2H), 3.20 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.91 (dd, J = 9.6, 14.4 Hz, 1H), 2.82 (dd, J = 6, 14 Hz, 1H), 2.24 - 2.20 (m, 3H), 2.07 (d, J = 9.6 Hz, 1H),1.75 (d, J = 12.8 Hz, 2H), 1.68 - 1.62 (m, 2H), 1.60 - 1.57 (m, 2H), 1.56 - 1.47 (m, 1H).
(2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시-2-(2-(2-((1-(15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메톡시)에톡시)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (Cpd. No. 24836)
(2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시-2-(2-(2-((1-(15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메톡시)에톡시)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (Cpd. No. 24836 )의 합성
디메틸 설폭사이드(2.0mL) 중 (2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-페녹시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시-2-(2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(26334, 0.025g, 0.039mmol) 및 퍼플루오로페닐 1-아지도-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-오에이트(1, 0.020g, 0.043mmol)의 교반된 용액에 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(0.041g, 0.111mmol)를 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 그 후, 아세트산(0.5mL)을 첨가하고 반응 혼합물을 아세토니트릴로 희석하고 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 20-42% 아세토니트릴)를 통해 정제하였다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 (2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-페녹시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시-2-(2-(2-((1-(15-옥소-15-(퍼플루오로페녹시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메톡시)에톡시)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(Cpd. No. 24836)을 무정형 고체로 얻었다. 수율: 0.018g, 41.73%, LCMS, m/z 1088.53 [M+1]+; 1H NMR (400 MHz, D2O 교환을 갖는 DMSO-d 6) δ 8.00 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 7.59 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.46 - 7.36 (m, 4H), 7.16 - 7.12 (m, 2H), 6.99 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 4.48 - 4.45 (m, 4H), 3.76 - 3.72 (m, 6H), 3.62 - 3.57 (m, 2H), 3.56 - 3.43 (m, 23H), 3.24 - 3.20 (m, 2H), 2.95 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.42 - 2.39 (m, 1H), 1.84 (s, 3H), 1.53 - 1.47 (m, 1H).
(2S,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시-2-(2-(2-((1-(15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메톡시)에톡시)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (Cpd. No. 24838)
(2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시-2-(2-(2-((1-(15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메톡시)에톡시)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 ( Cpd. No. 24838 )의 합성
디메틸 설폭사이드(2.0mL) 중 (2S,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-페녹시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시-2-(2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(26335, 0.035g, 0.055mmol) 및 퍼플루오로페닐 1-아지도-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-오에이트(1, 0.028g, 0.061mmol)의 교반된 용액에 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(0.057g, 0.155mmol)를 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 아세트산(0.5mL)을 첨가하고 반응 혼합물을 아세토니트릴로 희석하고 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 18-40% 아세토니트릴)를 통해 정제하였다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 (2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-페녹시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시-2-(2-(2-((1-(15-옥소-15-(퍼플루오로페녹시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메톡시)에톡시)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(Cpd. No. 24838)을 무정형 고체로 얻었다. 수율: 0.017g, 28.15%, LCMS, m/z 1088.56 [M+1]+; 1H NMR (400 MHz, D2O 교환을 갖는 DMSO-d 6) δ 7.98 (s, 1H), 7.57 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.47 - 7.36 (m, 4H), 7.16 - 7.12 (m, 2H), 6.98 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 4.74 - 4.44 (m, 4H), 3.76-3.55 (m, 9H), 3.50 - 3.42 (m, 17H), 3.30 -3.17 (m, 3H), 3.04 (dd, J = 14.8 & 7.6 Hz, 2H), 2.93 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.16 - 2.11 (m, 1H), 1.84 (s, 3H), 1.53 - 1.47 (m, 1H) 1.19 - 1.13 (m, 3H).
(2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시-2-(2-(2-((1-(15-옥소-3,6,9,12-테트라옥사-16-아자옥타데실)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메톡시)에톡시)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (Cpd. No. 24839)
(2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시-2-(2-(2-((1-(15-옥소-3,6,9,12-테트라옥사-16-아자옥타데실)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메톡시)에톡시)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (Cpd. No. 24839 )의 합성
디메틸 설폭사이드(2.0mL) 중 (2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-페녹시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시-2-(2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(26334, 0.025g, 0.039mmol) 및 1-아지도-N-에틸-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-아미드(1, 0.014g, 0.043mmol)의 교반된 용액에 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(0.041g, 0.111mmol)를 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 그 후, 아세트산(0.5mL)을 첨가하고 반응 혼합물을 아세토니트릴로 희석하고 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 20-42% 아세토니트릴)를 통해 정제하였다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 (2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-페녹시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시-2-(2-(2-((1-(15-옥소-3,6,9,12-테트라옥사-16-아자옥타데실)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메톡시)에톡시)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(Cpd. No. 24839)을 회백색 고체로 얻었다. 수율: 0.026g, 60.28%, LCMS, m/z 475.62 [M/2+1]+; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 13.84 (bs, 1H), 8.31 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 8.04 (s, 1H), 7.97 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 7.80-7.77 (m, 1H), 7.64 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.48 - 7.38 (m, 4H), 7.18 - 7.14 (m, 2H), 7.02 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 4.51 - 4.48 (m, 4H), 3.81 - 3.72 (m, 4H), 3.64 - 3.46 (m, 27H), 3.26 - 3.16 (m, 1H), 3.07 - 3.02 (m, 2H), 2.65 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 1.86 (s, 3H), 1.55 - 1.49 (m, 1H) 0.98 (t, J = 7.2 Hz, 3H).
(2S,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시-2-(2-(2-((1-(15-옥소-3,6,9,12-테트라옥사-16-아자옥타데실)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메톡시)에톡시)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (Cpd. No. 24840)
(2S,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시-2-(2-(2-((1-(15-옥소-3,6,9,12-테트라옥사-16-아자옥타데실)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메톡시)에톡시)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 ( Cpd. No. 24840 )의 합성
디메틸 설폭사이드(2.0mL) 중 (2S,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-페녹시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시-2-(2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(26335, 0.020g, 0.032mmol) 및 1-아지도-N-에틸-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-아미드(1, 0.011g, 0.034mmol)의 교반된 용액에 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(0.033g, 0.088mmol)를 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 이어서, 아세트산(0.5mL)을 첨가하고 반응 혼합물을 아세토니트릴로 희석하고 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 18-40% 아세토니트릴)를 통해 정제하였다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 (2S,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-페녹시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시-2-(2-(2-((1-(15-옥소-3,6,9,12-테트라옥사-16-아자옥타데실)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메톡시)에톡시)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(Cpd. No. 24840)를 회백색 고체로 얻었다. 수율: 0.005g, 14.49%, LCMS, m/z 949.62 [M/2+1]+; 1H NMR (400 MHz, D2O 교환을 갖는DMSO-d 6) δ 8.00 (s, 1H), 7.59 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.48 - 7.37 (m, 4H), 7.17 - 7.13 (m, 2H), 7.00 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 4.49 - 4.46 (m, 4H), 3.84 - 3.73 (m, 5H), 3.62 - 3.42 (m, 23H), 3.24 - 3.16 (m, 3H), 3.02 (dd, J = 14.4 & 7.2 Hz, 2H), 2.25 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.17 - 2.12 (m, 1H), 1.84 (s, 3H), 1.51 - 1.45 (m, 1H) 0.98 - 0.94 (m, 3H).
(2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-트리하이드록시-6-(2-(1-(15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-일)메톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (Cpd. No. 24906)
(2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-트리하이드록시-6-(2-(1-(15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-일)메톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (Cpd. No. 24906 )의 합성
디메틸 설폭사이드(3mL) 중 퍼플루오로페닐 1-아지도-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-오에이트(1, 0.156g, 0.342mmol) 및 (2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-6-(부트-3-인-1-일옥시)-3,4,5-트리하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-일)메톡시)-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-페녹시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(26409, 0.087g, 0.310mmol)의 교반된 용액에 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(0.324g, 0.869mmol)를 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 그 후, 아세트산(0.5mL)을 첨가하고 반응 혼합물을 아세토니트릴로 희석하고 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 23-41% 아세토니트릴)를 통해 정제하였다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 (2-((2R,3S,4R,5S,6R)-3,4,5-트리하이드록시-6-((1-(15-옥소-15-(퍼플루오로페녹시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메틸)테트라하이드로-2H-피란-2-일)에틸)포스폰산(Cpd. No. 24906) 회백색 고체로 얻었다. 수율: 0.101g, 44.11%, LCMS (ESI) m/z 738.20 [M+1]+; 1H NMR (400 MHz, D2O 교환을 갖는 DMSO-d 6) δ 4.44 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 3.89 - 3.86 (m, 1H), 3.77 - 3.73 (m, 4H), 3.60 - 3.56 (m, 2H), 3.53 - 3.46 (m, 13H), 3.29 - 3.28 (m, 2H), 2.97 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 2.86 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 1.82 (bs, 1H), 1.57 (bs, 1H), 1.46 - 1.31 (m, 2H).
(2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-트리하이드록시-6-(2-(1-(15-옥소-3,6,9,12-테트라옥사-16-아자옥타데실)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-일)메톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (Cpd. No. 24924)
(2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-트리하이드록시-6-(2-(1-(15-옥소-3,6,9,12-테트라옥사-16-아자옥타데실)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-일)메톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (Cpd. No. 24924 )의 합성
디메틸 설폭사이드(2.0mL) 중 (2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-6-(부트-3-인-1-일옥시)-3,4,5-트리하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-일)메톡시)-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-페녹시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(26409, 0.023g, 0.032mmol) 및 1-아지도-N-에틸-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-아미드(1, 0.011g, 0.032mmol)의 교반된 용액에 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(0.029g, 0.080mmol)를 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 완료 후, 아세트산(0.3mL)을 첨가하고 반응 혼합물을 아세토니트릴로 희석한 다음 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 15-35% 아세토니트릴)를 통해 정제하였다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 (2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-페녹시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-트리하이드록시-6-(2-(1-(15-옥소-3,6,9,12 -테트라옥사-16-아자옥타데실)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-일)메톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(Cpd. No. 24924)을 백색 고체로 TFA 염으로 얻었다. 수율: 0.006g, 18.08%; LCMS (ESI) m/z 1037.75 [M+1]+; 1H NMR (400 MHz, D2O 교환을 갖는 DMSO-d 6) δ 7.86 (s, 1H), 7.59 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.46 - 7.37 (m, 4H), 7.16 - 7.11 (m, 2H), 6.99 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.42 (t, J = 5.0 Hz, 2H), 4.13 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 3.91 - 3.85 (m, 1H), 3.79 - 3.73 (m, 6H), 3.63 - 3.60 (m, 2H), 3.56 - 3.52 (m, 5H), 3.49 - 3.43 (m, 15H), 3.27 - 3.21 (m, 4H), 3.02 (ABq, J = 7.6 Hz, 2H), 2.83 - 2.80 (m, 2H), 2.25 (t, J = 6.4 Hz, 1H), 1.83 (s, 3H), 1.57 - 1.51 (m, 1H), 0.96 (t, J = 7.2 Hz, 3H).
(2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-트리하이드록시-6-(2-(1-(15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-일)메톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (Cpd. No. 26288)
(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-(2-(2-((1-(15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메톡시)에톡시)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 ( Cpd. No. 26288 )의 합성
디메틸 설폭사이드(0.5mL) 중 (2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-(2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(26463, 0.035g, 0.054mmol) 및 퍼플루오로페닐 1-아지도-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-오에이트(1, 0.025g, 0.054mmol)의 교반된 용액에 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(0.050g, 0.135mmol)를 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 완료 후, 아세트산(0.3mL)을 첨가하였다. 생성된 용액을 아세토니트릴로 희석하고 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 19-35% 아세토니트릴)를 통해 정제하였다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 (2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-(2-(2-((1-(15-옥소-15-(퍼플루오로페녹시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메톡시)에톡시)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(Cpd. No. 26288)을 TFA 염으로서 백색 고체로 얻었다. 수율: 0.022g, 36.77%; LCMS (ESI) m/z 1102.72 [M+1]+; 1H NMR (400 MHz, D2O 교환을 갖는 DMSO-d 6) δ 7.98 (d, J = 3.6 Hz, 2H), 7.59 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.56 - 7.52 (m, 2H), 7.42 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 7.33 - 7.31 (m, 3H), 4.46 (s, 4H), 4.11 (m, 2H), 3.55 - 3.40 (m, 22H), 3.19 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 2.99 - 2.92 (m, 5H), 2.45 - 2.43 (m, 6H), 2.50 (m, 1H), 1.20 (s, 1H).
(2R,2'R,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-2,2'-(((((((S)-9,14,22-트리옥소-16-((15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)카르바모일)-3,6,25,28-테트라옥사-10,15,21-트리아자트리아콘탄-1,30-디일)비스(1H-1,2,3-트리아졸-1,4-디일))비스(메틸렌))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(5-아세트아미도-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산) (Cpd. No. 26289)
(2R,2'R,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-2,2'-(((((((S)-9,14,22-트리옥소-16-((15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)카르바모일)-3,6,25,28-테트라옥사-10,15,21-트리아자트리아콘탄-1,30-디일)비스(1H-1,2,3-트리아졸-1,4-디일))비스(메틸렌))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(5-아세트아미도-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산) (Cpd. No . 26289 )의 합성
디메틸 설폭사이드(0.5mL) 중 (2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-페녹시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시-2-(2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(26334, 0.025g, 0.039mmol) 및 퍼플루오로페닐(S)-1-아지도-16-(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-9,14,17-트리옥소-3,6,21,24,27,30-헥사옥사-10,15,18 -트리아자트리아콘탄-33-오에이트(26332, 0.020g, 0.019mmol)의 교반된 용액에 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(0.036g, 0.099mmol)를 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 반응의 진행을 LC-MS로 모니터링하고 완료 후 아세트산(0.3mL)을 첨가하였다. 생성된 용액을 아세토니트릴로 희석하고 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 25-44% 아세토니트릴)를 통해 정제하였다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 (2R,2'R,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-2,2'-(((((((S)-9,14,22-트리옥소-16-((15-옥소-15-(퍼플루오로페녹시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)카르바모일)-3,6,25,28-테트라옥사-10,15,21-트리아자트리아콘탄-1,30-디일)비스(1H-1,2,3-트리아졸-1,4-디일))비스(메틸렌))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(5-아세트아미도-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-페녹시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산)(Cpd. No. 26289)을 TFA 염으로 백색 고체로 얻었다. 수율: 0.012g, 27.67%; LCMS (ESI) m/z 738.20 [M+1]+; 1H NMR (400 MHz, D2O 교환을 갖는 DMSO-d 6) δ 7.98 (s, 2H), 7.58 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.46 - 7.36 (m, 9H), 7.16 - 7.12 (m, 4H), 6.98 (d, J = 7.6 Hz, 4H), 4.46 - 4.43 (m, 9H), 4.11 (m, 2H), 3.53 - 3.35 (m, 56H), 3.23 - 3.21 (m, 5H), 3.14 (bs, 2H), 2.97 - 2.93 (m, 9H), 2.25 - 2.22 (m, 6H), 2.08 (bs, 4H), 1.83 (s, 6H), 1.56 - 1.44 (m, 8H), 1.49 - 1.44 (m, 2H), 1.33 - 1.27 (m, 4H), 1.20 (bs, 5H), 0.98 (d, J = 6.8 Hz, 2H).
퍼플루오로페닐 (S)-1-아지도-16-(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-9,14,17-트리옥소-3,6,21,24,27,30-헥사옥사-10,15,18-트리아자트리트리아콘탄-33-오에이트 (Cpd. No. 26332)
퍼플루오로페닐 (S)-1-아지도-16-(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-9,14,17-트리옥소-3,6,21,24,27,30-헥사옥사-10,15,18-트리아자트리트리아콘탄-33-오에이트 (Cpd. No. 26332 )의 합성
0℃에서 테트라하이드로푸란(10.0mL) 중 (S)-1-아지도-16-(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-9,14,17-트리옥소-3,6,21,24,27,30-헥사옥사-10,15,18-트리아자트리아콘탄-33-오산(26337, 1.0g, 1.18mmol)의 교반된 용액에 2,3,4,5,6-펜타플루오로페놀(1, 0.434g, 2.36mmol) 및 N,N'-디이소프로필카르보디이미드(0.461mL, 2.94mmol)를 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 완료 후, 용매를 농축하고 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 30-75% 아세토니트릴)를 통해 정제하였다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 퍼플루오로페닐(S)-1-아지도-16-(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-9,14,17-트리옥소-3,6,21,24,27,30-헥사옥사-10,15,18-트리아자트리트리아콘탄-33-오에이트(Cpd. No. 26332)를 회백색 고체로 얻었다. 수율: 0.291g, 24%; ELSD (ESI) m/z 1015.6 [M+1]+; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 7.92 (t, J = 11.6 Hz, 1H), 7.85 - 7.80 (m, 2H), 7.78 (t, J = 11.2 Hz, 1H), 4.19 - 4.14 (m, 1H), 3.78 (t, J = 12.0 Hz, 2H), 3.61 - 3.49 (m, 29H), 3.38 - 3.35 (m, 5H), 3.25 - 3.13 (m, 3H), 3.07 - 2.99 (m, 6H), 2.32 - 2.26 (m, 4H), 1.62 - 1.20 (m, 9H).
퍼플루오로페닐 (16S,19S)-1-아지도-16,19-비스(4-(3-(2-(2- 아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-9,14,17,20-테트라옥소-3,6,24,27,30,33-헥사옥사-10,15,18,21-테트라아자헥사트리아콘탄-36-오에이트 (Cpd. No. 26333)
퍼플루오로페닐 (16S,19S)-1-아지도-16,19-비스(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-9,14,17,20-테트라옥소-3,6,24,27,30,33-헥사옥사-10,15,18,21-테트라아자헥사트리아콘탄-36-오에이트 (Cpd. No. 26333 )의 합성
0℃에서 테트라하이드로푸란(20.0mL) 중 (16S,19S)-1-아지도-16,19-비스(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-9,14,17,20-테트라옥소-3,6,24,27,30,33-헥사옥사-10,15,18,21-테트라아자헥사트리아콘탄-36-오산(26338, 1.5g, 1.29mmol)의 교반된 용액에 2,3,4,5,6-펜타플루오로페놀(1, 0.475g, 2.58mmol) 및 N,N'-디이소프로필카르보디이미드(0.472mL, 3.22mmol)를 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 완료 후, 용매를 농축하여 잔사를 얻은 다음 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 20-55% 아세토니트릴)를 통해 정제했다. 원하는 분획을 조합하고 동결건조하여 퍼플루오로페닐 (16S,19S)-1-아지도-16,19-비스(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-9,14,17,20-테트라옥소-3,6,24,27,30,33-헥사옥사-10,15,18,21-테트라아자헥사트리아콘탄-36-오에이트(Cpd. No. 26333)를 회백색 점착성 고체로 얻었다. 수율: 0.556g, 32.25%; LC-MS (ESI) m/z 1329.09 [M+1]+ 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 7.98 - 7.68 (m, 6H), 4.16 (bs, 2H), 3.78 (t, J = 11.6 Hz, 2H), 3.59 - 3.49(m, 35H), 3.38 - 3.33(m, 9H), 3.21 - 3.17(m, 4H), 3.03 - 2.99 (m, 9H), 2.30 - 2.27 (m, 6H), 2.14 (t, J = 14.4 Hz, 2H), 1.60 - 1.57(m, 4H), 1.48 - 1.23 (m, 10H).
(2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시-2-(2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (Cpd. No. 26334) 및 (2S,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시-2-(2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (Cpd. No. 26335)
(1R,2R)-1-((2R,3R,4S,6R)-3-아세트아미도-4-아세톡시-6-(메톡시카르보닐)-6-(2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-일)-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로판-1,2-디일 디아세테이트 ( 3 )의 합성
건조 디클로로메탄(20.0mL) 중 (1R,2R)-1-((2R,3R,4S,6S)-3-아세트아미도-4-아세톡시-6-(메톡시카르보닐)-6-(p-톨릴티오)테트라하이드로-2H-피란-2-일)-3-(3-페녹시벤즈아미도)프로판-1,2-디일 디아세테이트(1, 1.0g, 1.33mmol) 및 2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에탄 -1-올(2, 0.288g, 2.0mmol)의 교반된 용액에 4Å 분자체(1.0g, 100% w/w)를 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 질소 분위기 하에서 12시간 동안 교반하였다. 이어서, 1-요오도피롤리딘-2,5-디온(0.576g, 2.56mmol) 및 트리플루오로메탄술폰산(0.094mL, 1.066mmol)을 -45℃에서 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 -45℃에서 1시간 동안 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물을 중성 pH까지 트리메틸아민으로 켄칭하고, 셀라이트를 통해 여과하고, 디클로로메탄으로 희석하고, 수성 중탄산나트륨에 이어 DM 수로 세정하였다. 유기층을 농축하여 조 잔사를 얻은 다음 플래시 컬럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트 중 5-7.5% 메탄올)를 통해 정제했다. 원하는 분획을 농축하고 건조하여 (1R,2R)-1-((2R,3R,4S,6R)-3-아세트아미도-4-아세톡시-6-(메톡시카르보닐)-6-(2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-일)-3-(3-페녹시벤즈아미도)프로판-1,2-디일 디아세테이트(3)를 백색 고체로 아노머 혼합물로 얻었다. 수율: 1.0g, 97.41%; LCMS (ESI) m/z 771.79.
(2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시-2-(2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (Cpd. No. 26334 ) 및 (2S,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시-2-(2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (Cpd. No. 26335 )의 합성
에탄올(10.0mmol) 중 (1R,2R)-1-((2R,3R,4S,6R)-3-아세트아미도-4-아세톡시-6-(메톡시카르보닐)-6-(2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-일)-3-(3-페녹시벤즈아미도)프로판-1,2-디일 디아세테이트(3, 1.0g, 1.302mmol)의 교반된 용액에 수산화리튬(0.186g, 7.78mmol)을 0℃에서 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 완료 후, Dowex-Hydrgen 형태를 pH 6까지 첨가하고 반응물을 여과하였다. 여액을 농축하고 건조하여 조 잔사를 얻은 다음 아세토니트릴로 희석하고 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 22-38% 아세토니트릴)를 통해 정제했다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 별도로 조합하고 동결건조하여 (2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-페녹시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시-2-(2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(Cpd. No. 26334)을 TFA 염으로 걸쭉한 시럽으로 얻었다. 수율: 0.24g, 29.33%; LCMS (ESI) m/z 631.55 [M+1]+; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 8.36 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 8.06 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.65 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.50 - 7.39 (m, 4H), 7.17 - 7.15 (m, 2H), 7.02 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 4.83 (bs, 2H), 4.13 (d J = 2.0 Hz, 1H), 3.76 - 3.71 (m, 4H), 3.59 - 3.14 (m, 14H), 2.17 (dd, J = 12.8 & 4.8 Hz, 1H), 1.87 (s, 3H),1.49 (t, J = 12.0 Hz, 1H); (2S,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시-2-(2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(Cpd. No. 26335)을 TFA 염으로 백색 고체로 얻었다. 수율: 0.23g, 28.11%; LCMS (ESI) m/z 631.55 [M+1]+; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 8.32 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 7.99 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.64 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.48 - 7.39 (m, 4H), 7.18 - 7.14 (m, 2H), 7.30 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 4.33 (bs, 1H), 4.11 (d J = 2.0 Hz, 1H), 3.82 - 3.73 (m, 2H), 3.66 - 3.24 (m, 11H), 3.25 - 3.21 (m, 1H), 1.88 (s, 3H),1.52 (t, J = 12.0 Hz, 1H).
(S)-1-아지도-16-(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-9,14,17-트리옥소-3,6,21,24,27,30-헥사옥사-10,15,18-트리아자트리트리아콘탄-33-오산 (Cpd. No. 26337)
메틸 N6-((벤질옥시)카르보닐)-N2-(4-(((벤질옥시)카르보닐)아미노)부타노일)-L-리시네이트 ( 3 )의 합성
메틸 N6-((벤질옥시)카르보닐)-L-리시네이트 염산염(1, 5.00g, 19.5mmol)의 용액에 N,N-디메틸포름아미드(50.0mL) 중 4-(((벤질옥시)카르보닐)아미노)부탄산(2, 4.63g, 17.0mmol), [(디메틸아미노)({3H-[1,2,3]트리아졸로[4,5-b]피리딘-3-일옥시})메틸리덴]디메틸아자늄; 헥사플루오로-λ5-포스파누이드(8.07g, 21.2mmol) 및 디이소프로필에틸아민(11.0mL, 59.5mmol)을 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 8시간 동안 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물을 포화 중탄산나트륨 용액으로 희석하고 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 황산나트륨으로 건조하고, 여과하고, 고진공 하에서 농축하여 조 잔사를 얻었고 이를 플래시 컬럼 크로마토그래피(헥산 중 50-70% 에틸 아세테이트)로 정제했다. 원하는 분획을 감압 하에서 농축하여 메틸 N6-((벤질옥시)카르보닐)-N2-(4-(((벤질옥시)카르보닐)아미노)부타노일)-L-리시네이트(3)를 회백색 고체로 얻었다. 수율: 7.0g, 90.25%; LC-MS (ESI) m/z 514.2 [M+1]+.
N6-((벤질옥시)카르보닐)-N2-(4-(((벤질옥시)카르보닐)아미노)부타노일)-L-라이신 ( 4 )의 합성
메탄올(25.0mL) 중 메틸 N6-((벤질옥시)카르보닐)-N2-(4-(((벤질옥시)카르보닐)아미노)부타노일)-L-리시네이트(3, 7.0g, 13.6mmol), 테트라하이드로푸란(25.0mL) 및 물(5.0mL)의 용액에 실온에서 수산화리튬(0.979g, 40.9mmol)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 40℃에서 4시간 동안 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물을 1N HCl 용액(pH 4)으로 산성화하고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 고진공 하에 농축하여 조 N6-((벤질옥시)카르보닐)-N2-(4-(((벤질옥시)카르보닐)아미노)부타노일)-L-라이신(4)을 회백색 고체로 얻었다. 수율: 6.0g, 94.25%; LCMS (ESI) m/z 500.2 [M+1]+.
tert-부틸 (S)-10-(4-(((벤질옥시)카르보닐)아미노)부틸)-3,8,11-트리옥소-1-페닐-2,15,18,21,24-펜타옥사-4,9,12-트리아자헵타코산-27-오에이트 ( 6 )의 합성
0℃에서 테트라하이드로푸란(30.0mL) 중 N6-((벤질옥시)카르보닐)-N2-(4-(((벤질옥시)카르보닐)아미노)부타노일)-L-라이신(4, 3.0g, 6.01mmol)의 용액에 2,3,4,5,6-펜타플루오로페놀(2.21g, 12.0mmol) 및 N,N'-디이소프로필카르보디이미드(1.91mL, 15.0mmol)를 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. Tert-부틸 1-아미노-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-오에이트(5, 2.32g, 7.21mmol)를 실온에서 첨가하고 반응 혼합물을 12시간 동안 교반하였다. 완료 후, 용매를 고진공 하에서 농축하여 조 잔사를 얻은 다음 플래시 컬럼 크로마토그래피(헥산 중 70-100% 에틸 아세테이트)를 통해 정제했다. 원하는 분획을 감압 하에서 농축하여 tert-부틸 (S)-10-(4-(((벤질옥시)카르보닐)아미노)부틸)-3,8,11-트리옥소-1-페닐-2,15,18,21,24-펜타옥사-4,9,12-트리아자헵타코산-27-오에이트 (6)를 담황색 점착성으로 얻었다 수율: 4.0g, 84.25%; LC-MS (ESI) m/z 803.41 [M+1]+.
tert-부틸 (S)-23-아미노-18-(4-아미노부틸)-17,20-디옥소-4,7,10,13-테트라옥사-16,19-디아자트리코사노에이트 ( 7 )의 합성
메탄올(50mL) 중 tert-부틸 (S)-10-(4-(((벤질옥시)카르보닐)아미노)부틸)-3,8,11-트리옥소-1-페닐-2,15,18,21,24-펜타옥사-4,9,12-트리아자헵타코산-27-오에이트(6, 4.0g, 4.98mmol)의 교반된 용액에 탄소 상 10% 팔라듐(4.0g, 100% w/w)을 실온에서 질소 하에서 첨가하였다. 생성된 혼합물을 수소 기체 압력 하에 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고 메탄올로 세정하였다. 여액을 진공 하에서 농축하여 tert-부틸 (S)-23-아미노-18-(4-아미노부틸)-17,20-디옥소-4,7,10,13-테트라옥사-16,19-디아자트리코사노에이트(7)를 회백색 고체로 얻었다. 수율: 2.0g, 75%; ELSD (ESI) m/z 803.4 [M+1]+.
tert-부틸 (S)-1-아지도-16-(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-9,14,17-트리옥소-3,6,21,24,27,30-헥사옥사-10,15,18-트리아자트리트리아콘탄-33-오에이트 ( 9 )의 합성
0℃에서 테트라하이드로푸란(40.0mL) 중 tert-부틸 (S)-23-아미노-18-(4-아미노부틸)-17,20-디옥소-4,7,10,13-테트라옥사-16,19-디아자트리코사노에이트(7, 2.0g, 3.74mmol)의 용액에 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로파노에이트(2.25g, 7.48mmol)을 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 완료 후, 용매를 고진공 하에서 농축하여 조 잔사를 얻은 다음 플래시 컬럼 크로마토그래피(디클로로메탄 중 0-7.5% 메탄올)를 통해 정제했다. 원하는 분획을 감압 하에서 농축하여 tert-부틸 (S)-1-아지도-16-(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-9,14,17-트리옥소-3,6,21,24,27,30-헥사옥사-10,15,18-트리아자트리트리아콘탄-33-오에이트(9)를 옅은 황색 점성 액체로 얻었다 수율: 1.10g, 32.25%; ELSD (ESI) m/z 905.4 [M+1]+.
(S)-1-아지도-16-(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-9,14,17-트리옥소-3,6,21,24,27,30-헥사옥사-10,15,18-트리아자트리트리아콘탄-33-오산 (Cpd. No. 26337 )의 합성
디클로로메탄(10mL) 중 tert-부틸 (S)-1-아지도-16-(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-9,14,17-트리옥소-3,6,21,24,27,30-헥사옥사-10,15,18-트리아자트리트리아콘탄-33-오에이트(9, 1.1g, 1.21mmol)의 용액에 0℃에서 트리플루오로아세트산(5.0mL)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 질소 하에 4시간 동안 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물을 농축하고, 디에틸 에테르로 세정하고, 건조하여 (S)-1-아지도-16-(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-9,14,17-트리옥소-3,6,21,24,27,30-헥사옥사-10,15,18-트리아자트리트리아콘탄-33-오산(Cpd. No. 26337)을 담황색 점성 액체로 얻었다. 수율: 1.0g, 99.25%; ELSD (ESI) m/z 849.6 [M+1]+. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 12.0 (bs, 1H), 7.92 (t, J = 11.6 Hz, 1H), 7.85-7.80 (m, 2H), 7.78 (t, J = 11.2 Hz, 1H), 4.20 - 4.15 (m, 1H), 3.63 - 3.49 (m, 31H), 3.40 - 3.36 (m, 5H), 3.25 - 3.17 (m, 2H), 3.15 - 3.07 (m, 4H), 2.45 - 2.42 (m, 2H), 2.32 - 2.26 (m, 4H), 2.13 (t, J = 14.8 Hz, 2H),1.62 - 1.14 (m, 8H).
(16S,19S)-1-아지도-16,19-비스(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-9,14,17,20-테트라옥소-3,6,24,27,30,33-헥사옥사-10,15,18,21-테트라아자헥사트리아콘탄-36-오산 (Cpd. No. 26338)
메틸 N6-((벤질옥시)카르보닐)-N2-(N6-((벤질옥시)카르보닐)-N2-(4-(((벤질옥시)카르보닐)아미노)부타노일)-L-리실)-L-리시네이트 ( 3 )의 합성
0℃에서 N,N-디메틸포름아미드(50.0mL) 중 N6-((벤질옥시)카르보닐)-N2-(4-(((벤질옥시)카르보닐)아미노)부타노일)-L-라이신(1, 6.0g, 12.0mmol)의 교반된 용액에 메틸 N6-((벤질옥시)카르보닐)-L-리시네이트(2, 4.24g, 14.4mmol)에 이어서 [(디메틸아미노)({3H-[1,2,3]트리아졸로[4,5-b]피리딘-3-일옥시})메틸리덴]디메틸아자늄; 헥사플루오로-λ5-포스파누이드(9.59g, 25.2mmol) 및 에틸비스(프로판-2-일)아민(7.32mL, 42.0mmol)을 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물을 포화 중탄산나트륨 용액으로 희석하고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 황산나트륨으로 건조하고, 여과하고, 고진공 하에 농축하여 조 잔사를 얻었다. 조 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피(헥산 중 50-70% 에틸 아세테이트)를 통해 정제하여 메틸 N6-((벤질옥시)카르보닐)-N2-(N6-((벤질옥시)카르보닐)-N2-(4-(((벤질옥시)카르보닐)아미노)부타노일)-L-리실)-L-리시네이트(3)를 회백색 고체로 얻었다. 수율: 9.0g, 96.25%; LCMS (ESI) m/z 776.54 [M+1]+.
N6-((벤질옥시)카르보닐)-N2-(N6-((벤질옥시)카르보닐)-N2-(4-(((벤질옥시)카르보닐)아미노)부타노일)-L-리실)-L-라이신 ( 4 )의 합성
메탄올(30.0mL) 및 테트라하이드로푸란(15.0mL) 중 메틸 N6-((벤질옥시)카르보닐)-N2-(N6-((벤질옥시)카르보닐)-N2-(4-(((벤질옥시)카르보닐)아미노)부타노일)-L-리실)-L-리시네이트(3, 9.0g, 11.6mmol)의 교반된 용액에 물(1.0mL)에 용해시킨 리튬 하이드록사이드(0.833g, 34.8mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 40℃에서 16시간 동안 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물을 농축하고 조 잔사를 물에 용해시키고 1N 염산 용액으로 pH 4까지 산성화하고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 분리하여 무수 황산나트륨으로 건조하고 감압 하에 농축하여 N6-((벤질옥시)카르보닐)-N2-(N6-((벤질옥시)카르보닐)-N2-(4-(((벤질옥시)카보닐)아미노)부타노일)-L-리실)-L-라이신(4)을 회백색 고체로 얻었다. 수율: 8.0g, 90%; LCMS (ESI) m/z 762.43 [M+1]+.
tert-부틸 (10S,13S)-10,13-비스(4-(((벤질옥시)카르보닐)아미노)부틸)-3,8,11,14-테트라옥소-1-페닐-2,18,21,24,27-펜타옥사-4,9,12,15-테트라아자트리아콘탄-30-오에이트 (6)의 합성
0℃에서 테트라하이드로푸란(40.0mL) 중 N6-((벤질옥시)카르보닐)-N2-(N6-((벤질옥시)카르보닐)-N2-(4-(((벤질옥시)카르보닐)아미노)부타노일)-L-리실)-L-라이신(4, 4.0g, 5.25mmol)의 교반된 용액에 2,3,4,5,6-펜타플루오로페놀(1.93g, 12.0mmol) 및 N,N'-디이소프로필카르보디이미드(1.67mL, 13.1mmol)를 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물에 tert-부틸 1-아미노-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-오에이트(5, 2.03g, 6.30mmol)를 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 완료 후, 용매를 고진공 하에서 농축하여 조 잔사를 얻은 다음 플래시 컬럼 크로마토그래피(헥산 중 70-100% 에틸 아세테이트)를 통해 정제했다. 원하는 분획을 감압 하에서 농축하여 tert-부틸(10S,13S)-10,13-비스(4-(((벤질옥시)카르보닐)아미노)부틸)-3,8,11,14-테트라옥소-1-페닐-2,18,21,24,27-펜타옥사-4,9,12,15-테트라아자트리아콘탄-30-오에이트(6)를 옅은 황색 반-고체로 얻었다. 수율: 5.0g, 89.25%; LC-MS (ESI) m/z 1065.8 [M+1]+.
tert-부틸 (18S,21S)-26-아미노-18,21-비스(4-아미노부틸)-17,20,23-트리옥소-4,7,10,13-테트라옥사-16,19,22-트리아자헥사코사노에이트 ( 7 )의 합성
메탄올(40.0mL) 중 tert-부틸 (10S,13S)-10,13-비스(4-(((벤질옥시)카르보닐)아미노)부틸)-3,8,11,14-테트라옥소-1-페닐-2,18,21,24,27-펜타옥사-4,9,12,15-테트라아자트리아콘탄-30-오에이트(6, 5.0g, 4.69mmol)의 교반된 용액에 탄소상 10% 팔라듐(5.0g, 100% w/w)을 질소 하에 실온에서 첨가하였다. 생성된 혼합물을 수소 기체 압력 하에 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고 메탄올로 세정하였다. 여액을 진공 하에서 농축하여 tert-부틸 (18S,21S)-26-아미노-18,21-비스(4-아미노부틸)-17,20,23-트리옥소-4,7,10,13-테트라옥사-16,19,22-트리아자헥사코사노에이트(7)를 담황색 점성 액체로 얻었다. 수율: 3.0g, 96.23%; ELSD (ESI) m/z 663.5 [M+1]+.
tert-부틸 (16S,19S)-1-아지도-16,19-비스(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-9,14,17,20-테트라옥소-3,6,24,27,30,33-헥사옥사-10,15,18,21-테트라아자헥사트리아콘탄-36-오에이트 ( 9 )의 합성
0℃에서 테트라하이드로푸란(30.0mL) 중 tert-부틸 (18S,21S)-26-아미노-18,21-비스(4-아미노부틸)-17,20,23-트리옥소-4,7,10,13-테트라옥사-16,19,22-트리아자헥사코사노에이트(7, 3.0g, 4.53mmol)의 교반된 용액에 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로파노에이트(8, 4.08g, 13.6mmol)를 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 완료 후, 용매를 고진공 하에서 농축하여 조 잔사를 얻은 다음 플래시 컬럼 크로마토그래피(디클로로메탄 중 0-7.5% 메탄올)를 통해 정제했다. 원하는 분획을 감압 하에서 농축하여 tert-부틸 (16S,19S)-1-아지도-16,19-비스(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-9,14,17,20-테트라옥소-3,6,24,27,30,33-헥사옥사-10,15,18,21-테트라아자헥사트리아콘탄-36-오에이트(9)를 옅은 황색 점성 액체로 얻었다 수율: 2.2g, 39.30%; ELSD (ESI) m/z 1217.6 [M+1]+.
(16S,19S)-1-아지도-16,19-비스(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-9,14,17,20-테트라옥소-3,6,24,27,30,33-헥사옥사-10,15,18,21-테트라아자헥사트리아콘탄-36-오산 (Cpd. No. 26338 )의 합성
디클로로메탄(20mL) 중 tert-부틸 (16S,19S)-1-아지도-16,19-비스(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-9,14,17,20-테트라옥소-3,6,24,27,30,33-헥사옥사-10,15,18,21-테트라아자헥사트리아콘탄-36-오에이트(9, 2.2g, 1.80mmol)의 교반된 용액에 트리플루오로아세트산(5.0mL)을 0℃에서 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 질소 하에 4시간 동안 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물을 농축하고, 디에틸 에테르로 세정하고, 건조하여 (16S,19S)-1-아지도-16,19-비스(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-9,14,17,20-테트라옥소-3,6,24,27,30,33-헥사옥사-10,15,18,21-테트라아자헥사트리아콘탄-36-오산(Cpd. No. 26338)을 회백색 점성 액체로 얻었다. 수율: 1.4g, 70.35%; ELSD (ESI) m/z 1161.4 [M-1]-. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 12.0 (bs, 1H), 7.97 - 7.77 (m, 5H), 4.16 (bs, 2H), 3.60 - 3.57 (m,14H), 3.53 - 3.48 (m, 24H), 3.38-3.19 (m, 14H), 2.94 (bs, 9H), 2.43 - 2.42 (m, 8H), 2.30 - 2.27 (m, 5H), 2.14 (t, J = 15.2 Hz, 2H),1.62 - 1.59 (m, 4H), 1.49 - 1.48 (m, 2H),1.37 - 1.23 (m, 8H).
(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-아세톡시-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-6-(부트-3-인-1-일옥시)-3,4,5-트리하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-일)메톡시)-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (Cpd. No. 26339) 및 (2S,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-아세톡시-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-6-(부트-3-인-1-일옥시)-3,4,5-트리하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-일)메톡시)-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (Cpd. No. 26411)
(2R,3S,4S,5R,6R)-2-((((2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디아세톡시프로필)-4-아세톡시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-(메톡시카르보닐)테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)메틸)-6-(부트-3-인-1-일옥시)테트라하이드로-2H-피란-3,4,5-트리일 트리벤조에이트 ( 3 )의 합성
건조 디클로로메탄(30mL) 중 (1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1-((2R,3R,4S,6S)-4-아세톡시-3-(2-아세톡시아세트아미도)-6-(메톡시카르보닐)-6-(p-톨릴티오)테트라하이드로-2H-피란-2-일)프로판-1,2-디일 디아세테이트(1, 1.50g, 1.86mmol) 및 (2R,3R,4S,5S,6R)-2-(부트-3-인-1-일옥시)-6-(하이드록시메틸)테트라하이드로-2H-피란-3,4,5-트리일 트리벤조에이트(2, 2.53g, 4.65mmol)의 교반된 용액에 4Å 분자체(1.50g, 100% w/w)를 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 질소 분위기 하에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 -45℃로 냉각시킨 후, 1-요오도피롤리딘-2,5-디온(1.05g, 4.65mmol)을 첨가한 후 트리플루오로메탄술폰산(0.164mL, 1.86mmol)을 점적 부가하였다. 반응 혼합물을 -45℃에서 30분 동안 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물을 중성 pH까지 트리메틸아민으로 켄칭하고, 셀라이트를 통해 여과하고, 디클로로메탄으로 희석하고, 수성 중탄산나트륨에 이어 DM 수로 세정하였다. 유기층을 농축하여 조 잔사를 얻은 다음 플래시 컬럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트 중 5-7.5% 메탄올)를 통해 정제했다. 원하는 분획을 농축하고 건조하여 (2R,3S,4S,5R,6R)-2-((((2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디아세톡시프로필)-4-아세톡시-5-(2-아세톡시아세트아미도)-2-(메톡시카르보닐)테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)메틸)-6-(부트-3-인-1-일옥시)테트라하이드로-2H-피란-3,4,5-트리일 트리벤조에이트(3)를 분리할 수 없는 아노머 혼합물로서의 백색 고체로 얻었다. 수율: 1.40g, 63.54%; LCMS (ESI) m/z 1186.20 [M+1]+.
(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-아세톡시-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-6-(부트-3-인-1-일옥시)-3,4,5-트리하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-일)메톡시)-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (Cpd. No. 26339 ) 및 (2S,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-아세톡시-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-6-(부트-3-인-1-일옥시)-3,4,5-트리하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-일)메톡시)-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (Cpd. No. 26411 )의 합성
메탄올(5.0mL) 중 (2R,3S,4S,5R,6R)-2-((((2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디아세톡시프로필)-4-아세톡시-5-(2-아세톡시아세트아미도)-2-(메톡시카르보닐)테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)메틸)-6-(부트-3-인-1-일옥시)테트라하이드로-2H-피란-3,4,5-트리일 트리벤조에이트(3, 1.40g, 1.18mmol)의 교반된 용액에 0℃에서 물(1.0mL) 중 수산화리튬의 용액(0.071g, 2.95mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 완료 후, Dowex-Hydrogen 형태를 pH 6까지 첨가하고 반응물을 여과하였다. 여액을 농축하고 건조하여 조 잔사를 얻었고 이를 아세토니트릴로 희석하고 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 17-35% 아세토니트릴)를 통해 정제했다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 별도로 조합하고 동결건조하여 (2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-아세톡시-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-6-(부트-3-인-1-일옥시)-3,4,5-트리하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-일)메톡시)-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(Cpd. No. 26339)을 TFA 염으로 백색 고체로 얻었다. 수율: 0.12g; 13.11%; LCMS (ESI) m/z 733.18 [M+1]+; 1H NMR (400 MHz, 메탄올-d 4) δ 7.99 - 7.97 (m, 1H), 7.88 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.61 - 7.57 (m, 4H), 7.43 - 7.37(m, 4H), 7.31 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 4.25 (d, J = 7.2 Hz,1H), 4.01 (s, 2H), 3.94 - 3.88 (m, 3H), 3.86 - 3.82 (m, 3H), 3.79 - 3.63 (m, 5H), 3.60 (s, 2H), 3.52 - 3.44 (m, 2H), 3.38 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 2.70 (dd, J = 13.2 & 3.6 Hz, 1H), 2.49 (dt, J = 7.6 & 2.8 2H), 2.25 (t, J = 2.8 Hz, 1H), 1.75 (t, J = 13.2 Hz, 1H); (2S,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-아세톡시-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-6-(부트-3-인-1-일옥시)-3,4,5-트리하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-일)메톡시)-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(Cpd. No. 26411)을 TFA 염으로 백색 고체로 얻었다. 수율: 0.230g, 25.13%; LCMS (ESI) m/z 733.24 [M+1]+; 1H NMR (400 MHz, 메탄올-d 4) δ 8.06 - 8.04 (m, 1H), 7.89 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 7.61 - 7.57 (m, 4H), 7.43 - 7.36 (m, 4H), 7.31 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 4.26 (d, J = 7.2 Hz,1H), 4.16 - 4.13 (m, 1H), 4.04 - 4.02 (m, 3H), 3.94 - 3.83 (m, 5H), 3.71 - 3.64 (m, 3H), 3.60 (s, 2H), 3.53 - 3.44 (m, 3H), 3.39 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 2.50 (dt, J = 7.2 & 2.4 2H), 2.40 (dd, J = 12.8 & 4.4 Hz, 1H), 2.25 (t, J = 2.4 Hz, 1H), 1.66 (t, J = 12.8 Hz, 1H).
(2S,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-트리하이드록시-6-(2-(1-(15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-일)메톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (Cpd. No. 26373)
(2S,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-트리하이드록시-6-(2-(1-(15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-일)메톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (Cpd. No. 26373 )의 합성
교반 막대가 있는 1 드램 바이알에서 NMP(0.3mL) 중 (2S,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-6-(부트-3-인-1-일옥시)-3,4,5-트리하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-일)메톡시)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(26411, 1.00당량, 19.5mg, 0.0266mmol)의 용액에 NMP(0.3mL) 중 퍼플루오로페닐 1-아지도-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-오에이트(1, 1.10당량, 13.4mg, 0.0293mmol)의 용액 이어서 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(2.50당량, 24.8mg, 0.0665mmol)를 첨가하였다. 생성된 투명한 녹색 용액을 캡핑하고 실온에서 10분 동안 교반하였다. 반응물을 아세트산으로 희석하고, 여과하고, 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 20-100% 아세토니트릴)를 통해 정제하였다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 (2S,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-트리하이드록시-6-(2-(1-(15-옥소-15-(퍼플루오로페녹시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-일)메톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(Cpd. No. 26373)을 백색 고체로 얻었다. 수율: 19.4mg, 61%;　LCMS m/z 1190.8 [M+1]+;　1H NMR (300 MHz, D2O를 갖는 DMSO) δ 7.87 (s, 1H), 7.75 (d,　J　= 8.8 Hz, 1H), 7.64 - 7.52 (m, 4H), 7.47 - 7.39 (m, 2H), 7.36 - 7.28 (m, 3H), 4.42 (t,　J　= 5.0 Hz, 2H), 4.20 - 4.11 (m, 1H), 4.07 - 3.58 (m, 9H), 3.57 - 3.38 (m, 16H), 3.36 - 2.81 (m, 14H), 2.19 - 2.08 (m, 1H), 1.48 (t,　J　= 12.1 Hz, 1H).
(2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-6-(부트-3-인-1-일옥시)-3,4,5-트리하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-일)메톡시)-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (Cpd. No. 26409) 및 (2S,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-6-(부트-3-인-1-일옥시)-3,4,5-트리하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-일)메톡시)-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (Cpd. No. 26410)
(2R,3S,4S,5R,6R)-2-((((2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-4-아세톡시-6-((1R,2R)-1,2-디아세톡시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-2-(메톡시카르보닐)테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)메틸)-6-(부트-3-인-1-일옥시)테트라하이드로-2H-피란-3,4,5-트리일 트리벤조에이트 ( 3 )의 합성
건조 디클로로메탄(20mL) 중 (1R,2R)-1-((2R,3R,4S,6S)-3-아세트아미도-4-아세톡시-6-(메톡시카르보닐)-6-(p-톨릴티오)테트라하이드로-2H-피란-2-일)-3-(3-페녹시벤즈아미도)프로판-1,2-디일 디아세테이트(1, 0.50g, 0.665mmol) 및 (2R,3R,4S,5S,6R)-2-(부트-3-인-1-일옥시)-6-(하이드록시메틸)테트라하이드로-2H-피란-3,4,5-트리일 트리벤조에이트(2, 0.543g, 0.998mmol)의 교반된 용액에 4Å 분자체(0.50g, 100% w/w)를 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 질소 분위기 하에서 12시간 동안 교반하였다. 이어서, 1-요오도피롤리딘-2,5-디온(0.288g, 1.28mmol) 및 트리플루오로메탄술폰산(0.047mL, 0.533mmol)을 -45℃에서 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 -45℃에서 30분 동안 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물을 중성 pH까지 트리메틸아민으로 켄칭하고, 셀라이트를 통해 여과하고, 디클로로메탄으로 희석하고, 수성 중탄산나트륨에 이어 DM 수로 세정하였다. 유기층을 농축하여 조 잔사를 얻은 다음 플래시 컬럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트 중 5-7.5% 메탄올)를 통해 정제했다. 원하는 분획을 농축하고 건조하여 (2R,3S,4S,5R,6R)-2-((((2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-4-아세톡시-6-((1R,2R)-1,2-디아세톡시-3-(3-페녹시벤즈아미도)프로필)-2-(메톡시카르보닐)테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)메틸)-6-(부트-3-인-1-일옥시)테트라하이드로-2H-피란-3,4,5-트리일 트리벤조에이트(3)를 아노머 혼합물로서 황색 무정형 고체로 얻었다. 수율: 0.60g, 76.93%; LCMS (ESI) m/z 1172.17 [M+1]+.
(2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-6-(부트-3-인-1-일옥시)-3,4,5-트리하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-일)메톡시)-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (Cpd. No. 26409 ) 및 (2S,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-6-(부트-3-인-1-일옥시)-3,4,5-트리하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-일)메톡시)-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (Cpd. No. 26410 )의 합성
0℃에서 에탄올(5.0mL) 중 (2R,3S,4S,5R,6R)-2-((((2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-4-아세톡시-6-((1R,2R)-1,2-디아세톡시-3-(3-페녹시벤즈아미도)프로필)-2-(메톡시카르보닐)테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)메틸)-6-(부트-3-인-1-일옥시)테트라하이드로-2H-피란-3,4,5-트리일 트리벤조에이트(3, 0.60g, 0.512mmol)의 교반된 용액에 수산화리튬(0.129g, 3.07mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 완료 후, Dowex-Hydrogen 형태를 pH 6까지 첨가하고 반응물을 여과하였다. 여액을 농축하고 건조하여 조 잔사를 얻은 다음 아세토니트릴로 희석하고 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 15-35% 아세토니트릴)를 통해 정제했다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 별도로 조합하고 동결건조하여 (2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-6-(부트-3-인-1-일옥시)-3,4,5-트리하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-일)메톡시)-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-페녹시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(Cpd. No. 26409)을 TFA 염으로 백색 고체로 얻었다. 수율: 0.045g, 12%; LCMS (ESI) m/z 719.57 [M+1]+; 1H NMR (400 MHz, 메탄올-d 4) δ 8.28 - 8.26 (m, 1H), 8.15 - 8.12 (m, 1H), 7.58 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.48 - 7.35 (m, 4H), 7.15 - 7.11 (m, 2H), 7.01 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 4.21 (t, J = 3.6 Hz,1H), 4.04 - 4.00 (m, 2H), 3.91 - 3.77 (m, 2H), 3.72 - 3.57 (m, 6H), 3.49 - 3.45 (m, 3H), 3.39 (d, J = 8.8 Hz,1H), 2.83 - 2.80 (m, 1H), 2.45 - 2.41 (m, 2H), 2.21 (t, J = 2.8 Hz, 1H), 1.97 (s, 3H),1.61 (t, J =11.6 Hz, 1H); (2S,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-6-(부트-3-인-1-일옥시)-3,4,5-트리하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-일)메톡시)-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(Cpd. No. 26410)을 TFA 염으로 백색 고체로 얻었다. 수율: 0.045g, 12%; LCMS (ESI) m/z 719.57 [M+1]+; 1H NMR (400 MHz, 메탄올-d 4) δ 7.59 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.49 - 7.35 (m, 4H), 7.15 - 7.13 (m, 2H), 7.00 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 4.25 (t, J = 6.8 Hz,1H), 3.99 - 3.85 (m, 6H), 3.81 - 3.63 (m, 4H), 3.54 - 3.44 (m, 4H), 3.36 (d, J = 8.8 Hz,1H), 2.49 - 2.45 (m, 2H), 2.42 - 2.37 (m, 1H), 2.23 (t, J = 2.8 Hz, 1H), 1.95 (s, 3H), 1.60 (t, J = 12.4 Hz, 1H).
(2S,2'S,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-2,2'-((((2R,2'R,3R,3'R,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-(((((RS)-9,14,22-트리옥소-16-((15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)카르바모일)-3,6,25,28-테트라옥사-10,15,21-트리아자트리아콘탄-1,30-디일)비스(1H-1,2,3-트리아졸-1,4-디일))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(3,4,5-트리하이드록시테트라하이드로-2H-피란-6,2-디일))비스(메틸렌))비스(옥시))비스(6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산) (Cpd. No. 26412)
(2S,2'S,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-2,2'-((((2R,2'R,3R,3'R,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-(((((RS)-9,14,22-트리옥소-16-((15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)카르바모일)-3,6,25,28-테트라옥사-10,15,21-트리아자트리아콘탄-1,30-디일)비스(1H-1,2,3-트리아졸-1,4-디일))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(3,4,5-트리하이드록시테트라하이드로-2H-피란-6,2-디일))비스(메틸렌))비스(옥시))비스(6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산) (Cpd. No. 26412 )의 합성
교반 막대가 있는 1 드램 바이알에 NMP(0.6mL) 중 퍼플루오로페닐 (R)-1-아지도-16-(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-9,14,17-트리옥소-3,6,21,24,27,30-헥사옥사-10,15,18-트리아자트리트리아콘탄-33-오에이트(26332, 1.00당량, 14.3mg, 0.0141mmol) 및 (2S,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-6-(부트-3-인-1-일옥시)-3,4,5-트리하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-일)메톡시)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(26411, 2.10당량, 21.7mg, 0.0296mmol)의 용액에 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(5.00당량, 26.3mg, 0.0704mmol)를 첨가하였다. 생성된 투명한 녹색 용액을 캡핑하고 실온에서 10분 동안 교반하였다. 반응물을 아세트산으로 희석하고, 여과하고, 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 20-80% 아세토니트릴)를 통해 정제하였다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 (2S,2'S,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-2,2'-((((2R,2'R,3R,3'R,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-(((((RS)-9,14,22-트리옥소-16-((15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)카르바모일)-3,6,25,28-테트라옥사-10,15,21-트리아자트리아콘탄-1,30-디일)비스(1H-1,2,3-트리아졸-1,4-디일))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(3,4,5-트리하이드록시테트라하이드로-2H-피란-6,2-디일))비스(메틸렌))비스(옥시))비스(6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산)(Cpd. No. 26412)을 백색 고체로 얻었다. 수율: 22.8mg, 65%; LCMS m/z 1240.7 [M/2+1]+;　1H NMR (300 MHz, D2O를 갖는 DMSO) δ 7.86 (s, 2H), 7.75 (d,　J　= 8.8 Hz, 2H), 7.63 - 7.51 (m, 8H), 7.42 (t,　J　= 7.5 Hz, 4H), 7.35 - 7.27 (m, 6H), 4.46 - 4.34 (m, 4H), 4.19 - 3.58 (m, 19H), 3.57 - 2.79 (m, 66H), 2.30 - 2.19 (m, 4H), 2.18 - 2.03 (m, 4H), 1.64 - 1.39 (m, 6H), 1.37 - 1.07 (m, 4H).
(2S,2'S,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-2,2'-(((((((((RS)-9,14,22-트리옥소-16-((15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)카르바모일)-3,6,25,28-테트라옥사-10,15,21-트리아자트리아콘탄-1,30-디일)비스(1H-1,2,3-트리아졸-1,4-디일))비스(메틸렌))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(5-아세트아미도-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산) (Cpd. No. 26414)
(2S,2'S,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-2,2'-(((((((((RS)-9,14,22-트리옥소-16-((15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)카르바모일)-3,6,25,28-테트라옥사-10,15,21-트리아자트리아콘탄-1,30-디일)비스(1H-1,2,3-트리아졸-1,4-디일))비스(메틸렌))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(5-아세트아미도-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산) (Cpd. No. 26414 )의 합성
교반 막대가 있는 1 드램 바이알에 NMP(0.6mL) 중 퍼플루오로페닐 (R)-1-아지도-16-(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-9,14,17-트리옥소-3,6,21,24,27,30-헥사옥사-10,15,18-트리아자트리트리아콘탄-33-오에이트(26332, 1.00당량, 22.5mg, 0.0222mmol) 및 (2S,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-페녹시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시-2-(2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(26335, 2.10당량, 29.4mg, 0.0466mmol)의 용액에 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(5.00당량, 41.3mg, 0.111mmol)를 첨가하였다. 생성된 맑은 연황색 용액을 캡핑하고 실온에서 10분 동안 교반하였다(천천히 녹색으로 변함). 반응물을 아세트산으로 희석하고, 여과하고, 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 20-90% 아세토니트릴)를 통해 정제하였다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 (2S,2'S,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-2,2'-(((((((((RS)-9,14,22-트리옥소-16-((15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)카르바모일)-3,6,25,28-테트라옥사-10,15,21-트리아자트리아콘탄-1,30-디일)비스(1H-1,2,3-트리아졸-1,4-디일))비스(메틸렌))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(5-아세트아미도-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산)(Cpd. No. 26414)을 백색고체로 얻었다. 수율: 32.9mg, 65%; LCMS m/z 1138.8 [M/2+1]+;　1H NMR (300 MHz, D2O를 갖는 DMSO) δ 7.96 (s, 2H), 7.55 (d,　J　= 7.7 Hz, 2H), 7.48 - 7.32 (m, 8H), 7.13 (t,　J　= 7.4 Hz, 4H), 6.97 (d,　J　= 8.0 Hz, 4H), 4.51 - 4.38 (m, 8H), 3.89 - 2.87 (m, 71H), 2.29 - 2.19 (m, 4H), 2.18 - 2.03 (m, 4H), 1.82 (s, 6H), 1.62 - 1.39 (m, 6H), 1.36 - 1.06 (m, 4H).
(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-트리하이드록시-6-(2-(1-(15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-일)메톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (Cpd. No. 26415)
(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-트리하이드록시-6-(2-(1-(15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-일)메톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (Cpd. No. 26415 )의 합성
교반 막대가 있는 1 드램 바이알에 NMP(0.3mL) 중 (2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-6-(부트-3-인-1-일옥시)-3,4,5-트리하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-일)메톡시)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(26339, 1.00당량, 26.2mg, 0.0358mmol)의 용액에 NMP(0.3mL) 중 퍼플루오로페닐 1-아지도-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-오에이트(1, 1.10당량, 18.0mg, 0.0393mmol)의 용액 이어서 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(2.50당량, 33.3mg, 0.0894mmol)를 첨가하였다. 생성된 투명한 녹색 용액을 캡핑하고 실온에서 10분 동안 교반하였다. 반응물을 아세트산으로 희석하고, 여과하고, 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 20-70% 아세토니트릴)를 통해 정제하였다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 (2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-트리하이드록시-6-(2-(1-(15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-일)메톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(Cpd. No. 26415)을 백색고체로 얻었다. 수율: 26.5mg, 62%;　LCMS m/z 1190.7 [M+1]+;　1H NMR (300 MHz, D2O를 갖는 DMSO) δ 7.83 (s, 1H), 7.79 (d,　J　= 7.4 Hz, 1H), 7.62 - 7.50 (m, 4H), 7.42 (t,　J　= 7.6 Hz, 2H), 7.34 - 7.26 (m, 3H), 4.39 (t,　J　= 4.8 Hz, 2H), 4.15 (d,　J　= 6.6 Hz, 1H), 3.96 - 2.79 (m, 38H), 2.47 - 2.40 (m, 1H), 1.55 (t,　J　= 12.2 Hz, 1H).
(2R,2'R,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-2,2'-((((2R,2'R,3R,3'R,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-(((((RS)-9,14,22-트리옥소-16-((15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)카르바모일)-3,6,25,28-테트라옥사-10,15,21-트리아자트리아콘탄-1,30-디일)비스(1H-1,2,3-트리아졸-1,4-디일))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(3,4,5-트리하이드록시테트라하이드로-2H-피란-6,2-디일))비스(메틸렌))비스(옥시))비스(6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산) (Cpd. No. 26416)
(2R,2'R,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-2,2'-((((2R,2'R,3R,3'R,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-(((((RS)-9,14,22-트리옥소-16-((15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)카르바모일)-3,6,25,28-테트라옥사-10,15,21-트리아자트리아콘탄-1,30-디일)비스(1H-1,2,3-트리아졸-1,4-디일))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(3,4,5-트리하이드록시테트라하이드로-2H-피란-6,2-디일))비스(메틸렌))비스(옥시))비스(6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산) (Cpd. No. 26416 )의 합성
교반 막대가 있는 1 드램 바이알에 NMP(0.6mL) 중 퍼플루오로페닐 (R)-1-아지도-16-(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-9,14,17-트리옥소-3,6,21,24,27,30-헥사옥사-10,15,18-트리아자트리트리아콘탄-33-오에이트(26332, 1.00당량, 20.7mg, 0.0204mmol) 및 (2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-6-(부트-3-인-1-일옥시)-3,4,5-트리하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-일)메톡시)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(26339, 2.10당량, 31.4mg, 0.0428mmol)의 용액에 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(5.00당량, 38.0mg, 0.102mmol)를 첨가하였다. 생성된 투명한 녹색 용액을 캡핑하고 실온에서 10분 동안 교반하였다. 반응물을 아세트산으로 희석하고, 여과하고, 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 20-65% 아세토니트릴)를 통해 정제하였다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 (2R,2'R,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-2,2'-((((2R,2'R,3R,3'R,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-(((((RS)-9,14,22-트리옥소-16-((15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)카르바모일)-3,6,25,28-테트라옥사-10,15,21-트리아자트리아콘탄-1,30-디일)비스(1H-1,2,3-트리아졸-1,4-디일))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(3,4,5-트리하이드록시테트라하이드로-2H-피란-6,2-디일))비스(메틸렌))비스(옥시))비스(6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산)(Cpd. No. 26416)을 백색고체로 얻었다. 수율: 27.2mg, 54%; LCMS m/z 1240.8 [M/2+1]+;　1H NMR (300 MHz, D2O를 갖는 DMSO) δ 7.84 - 7.75 (m, 4H), 7.61 - 7.49 (m, 8H), 7.41 (t,　J　= 7.5 Hz, 4H), 7.34 - 7.25 (m, 6H), 4.42 - 4.32 (m, 4H), 3.94 - 2.76 (m, 85H), 2.47 - 2.39 (m, 2H), 2.30 - 2.17 (m, 4H), 2.08 (t,　J　= 7.5 Hz, 2H), 1.64 - 1.37 (m, 6H), 1.35 - 1.07 (m, 4H).
Cpd. No. 26417
Cpd. No. 26417 의 합성
교반 막대가 있는 1 드램 바이알에 NMP(0.6mL) 중 퍼플루오로페닐 (16R,19R)-1-아지도-16,19-비스(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-9,14,17,20-테트라옥소-3,6,24,27,30,33-헥사옥사-10,15,18,21-테트라아자헥사트리아콘탄-36-오에이트(26333, 1.00당량, 19.1mg, 0.0144mmol) 및 (2R,4S,5R,6R) -6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-6-(부트-3-인-1-일옥시)-3,4,5-트리하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-일)메톡시)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로 -2H-피란-2-카르복실산(26339, 3.10당량, 32.7mg, 0.0446mmol)의 용액에 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(7.50당량, 40.2mg, 0.108mmol)를 첨가하였다. 생성된 투명한 녹색 용액을 캡핑하고 실온에서 10분 동안 교반하였다. 반응물을 NMP 중 70% 아세트산의 혼합물로 희석하고, 여과하고, 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 15-65% 아세토니트릴)를 통해 정제하였다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 Cpd No. 26417을 백색 고체로 얻었다. 수율: 22.8mg, 45%;　LCMS m/z [M+1]+;　1H NMR (300 MHz, D2O를 갖는 DMSO) δ 7.83 - 7.73 (m, 6H), 7.60 - 7.48 (m, 12H), 7.40 (t,　J　= 7.5 Hz, 6H), 7.33 - 7.25 (m, 9H), 4.40 - 4.32 (m, 6H), 3.93 - 2.77 (m, 120H), 2.47 - 2.40 (m, 2H), 2.30 - 2.18 (m, 6H), 2.13 - 2.03 (m, 2H), 1.66 - 1.38 (m, 8H), 1.36 - 1.06 (m, 8H).
Cpd. No. 26418
Cpd. No. 26418 의 합성
교반 막대가 있는 1 드램 바이알에 NMP(0.6mL) 중 퍼플루오로페닐 (16R,19R)-1-아지도-16,19-비스(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-9,14,17,20-테트라옥소-3,6,24,27,30,33-헥사옥사-10,15,18,21-테트라아자헥사트리아콘탄-36-오에이트(26333, 1.00당량, 18.3mg, 0.0138mmol) 및 (2S,4S,5R,6R) -6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-6-(부트-3-인-1-일옥시)-3,4,5-트리하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-일)메톡시)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로 -2H-피란-2-카르복실산(26411, 3.10당량, 31.3mg, 0.0427mmol)의 용액에 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(7.50당량, 38.5mg, 0.103mmol)를 첨가하였다. 생성된 투명한 녹색 용액을 캡핑하고 실온에서 10분 동안 교반하였다. 반응물을 NMP 중 70% 아세트산의 혼합물로 희석하고, 여과하고, 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 15-65% 아세토니트릴)를 통해 정제하였다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 Cpd No. 26418을 백색 고체로 얻었다. 수율: 32.7mg, 67%; LCMS m/z 1763.7 [M/2+1]+; 1H NMR (300 MHz, D2O를 갖는 DMSO) δ 7.83 (s, 3H), 7.76 (d,　J　= 8.9 Hz, 3H), 7.61 - 7.49 (m, 12H), 7.40 (t,　J　= 7.5 Hz, 6H), 7.34 - 7.26 (m, 9H), 4.43 - 4.34 (m, 6H), 4.02 - 2.80 (m, 120H), 2.30 - 2.04 (m, 10H), 1.64 - 1.40 (m, 8H), 1.35 - 1.08 (m, 8H).
(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-(2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (Cpd. No. 26463) 및 (2S,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-(2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (Cpd. No. 26464)
(1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1-((2R,3R,4S)-4-아세톡시-3-(2-아세톡시아세트아미도)-6-(메톡시카르보닐)-6-(2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-일)프로판-1,2-디일 디아세테이트 ( 3 )의 합성
무수 디클로로메탄(20.0mL) 중 (1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1-((2R,3R,4S,6S)-4-아세톡시-3-(2-아세톡시아세트아미도)-6-(메톡시카보닐)-6-(p-톨릴티오)테트라하이드로-2H-피란-2-일)프로판-1,2-디일 디아세테이트(1, 1.0g, 1.240mmol)의 교반된 용액에 2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에탄-1-올(2, 0.893g, 6.20mmol) 및 활성화된 4Å 분말 분자체(1.0g, 100% W w)를 첨가하였다. 생성된 반응 용액을 질소 하에 실온에서 15시간 동안 교반하였다. 용액에 -40℃에서 1-요오도피롤리딘-2,5-디온(0.697g, 3.10mmol) 및 트리플루오로메탄술폰산(0.109mL, 1.240mmol)을 첨가하였다. 생성된 반응 용액을 -40℃에서 1시간 동안 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물을 트리에틸 아민(0.5mL)으로 켄칭하고 실온으로 가온하였다. 반응 혼합물을 소결 깔대기를 통해 여과하고 디클로로메탄으로 세정하였다. 여액을 포화 중탄산나트륨(aq)으로 세정하고, 황산나트륨으로 건조하고, 여과하고, 감압 하에서 농축하여 조 잔사를 얻었다. 잔사를 컬럼 크로마토그래피(헥산 중 60-80% 에틸 아세테이트)로 정제하여 (1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1-((2R,3R,4S)-4-아세톡시-3-(2-아세톡시아세트아미도)-6-(메톡시카르보닐)-6-(2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-일)프로판-1,2-디일 디아세테이트(3)를 아노머 혼합물로서 백색 고체로 얻었다. 수율: 0.80g, 78.07%; LCMS (ESI) m/z 827.30 [M+1]+.
(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-(2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (Cpd. No. 26463 ) 및 (2S,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-(2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (Cpd. No. 26464 )의 합성
메탄올(5.0mL) 중 (1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1-((2R,3R,4S,6R)-4-아세톡시-3-(2-아세톡시아세트아미도)-6-(메톡시카르보닐)-6-(2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-일)프로판-1,2-디일 디아세테이트(3, 0.450g, 0.544mmol)의 교반된 용액에 물(0.50mL) 중 수산화리튬 일수화물(0.137g, 3.27mmol)의 용액에 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 6시간 동안 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물을 pH ~6까지 Dowex 50, H+)로 처리하고 현탁액을 여과하고 메탄올로 세정하였다. 여액을 감압 하에서 농축하여 조 잔사를 얻었다. 잔사를 분취용 HPLC를 통해 정제하여 (2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-(2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(Cpd. No. 26463)을 백색 고체로 얻었다. 수율: 0.316g, 90%; LCMS (ESI) m/z 645.45 [M+1]+ . 1H NMR (400 MHz, 메탄올-d 4) δ 7.87 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.61 - 7.56 (m, 4H), 7.43 - 7.37 (m, 4H), 7.31 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 4.17 (d, J = 2.4 Hz, 2H), 3.90 (s, 2H), 3.89 - 3.81 (m, 4H), 3.74 - 3.59 (m, 11H), 3.39 - 3.25 (m, 2H), 2.82 (t, J = 0.8 Hz, 1H), 2.71 (dd, J = 8.8 & 4.0 Hz, 1H), 1.75 (t, J = 12.4 Hz, 1H); (2S,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-(2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(Cpd. No. 26464)을 백색고체로 얻었다. 수율: 0.192g, 80.25%; LCMS (ESI) m/z 645.42 [M+1]+. 1H NMR (400 MHz, 메탄올-d 4) δ 7.82 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.61 - 7.57 (m, 4H), 7.44 - 7.36 (m, 4H), 7.31 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 4.17 (d, J = 2.4 Hz, 2H), 4.15 - 4.119 (m, 1H), 4.03 - 3.96 (m, 3H), 3.94 - 3.86 (m, 1H), 3.86 - 3.78 (m, 2H), 3.36 - 3.62 (m, 2H) 3.59 (s, 2H), 3.51 - 3.46 (m, 1H), 3.42 - 3.35 (m, 2H), 2.84 (t, J = 2.4 Hz, 1H), 2.38 (dd, J = 12.8 & 3.8 Hz, 1H), 1.66 (t, J = 11.6 Hz, 1H).
(2S,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-트리하이드록시-6-(2-(1-(15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-일)메톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (Cpd. No. 26465)
(2S,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-트리하이드록시-6-(2-(1-(15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-일)메톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (Cpd. No. 26465 )의 합성
교반 막대가 있는 1 드램 바이알에 NMP(0.3mL) 중 (2S,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-6-(부트-3-인-1-일옥시)-3,4,5-트리하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-일)메톡시)-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-페녹시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(26410, 1.00당량, 25.8mg, 0.0359mmol)의 용액에 NMP(0.3mL) 중 퍼플루오로페닐 1-아지도-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-오에이트(1, (1.10당량, 18.1mg, 0.0395mmol)의 용액 이어서 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(2.50당량, 33.5mg, 0.0898mmol)를 첨가하였다. 생성된 투명한 녹색 용액을 캡핑하고 실온에서 10분 동안 교반하였다. 반응물을 아세트산으로 희석하고, 여과하고, 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 15-65% 아세토니트릴)를 통해 정제하였다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 (2S,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-트리하이드록시-6-(2-(1-(15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-일)메톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(Cpd. No. 26465)을 백색고체로 얻었다. 수율: 23.5mg, 56%;　LCMS m/z 1176.8 [M+1]+;　1H NMR (300 MHz,　D2O를 갖는 DMSO-d 6) δ 7.93 (d,　J　= 7.5 Hz, 1H), 7.84 (s, 1H), 7.55 (d,　J　= 7.7 Hz, 1H), 7.45 (t,　J　= 7.9 Hz, 1H), 7.41 - 7.32 (m, 3H), 7.14 (t,　J　= 7.1 Hz, 2H), 6.97 (d,　J　= 8.0 Hz, 2H), 4.44 - 4.34 (m, 2H), 3.95 - 3.78 (m, 2H), 3.78 - 2.95 (m, 30H), 2.95 - 2.81 (m, 4H), 2.18 - 2.06 (m, 1H), 1.83 (s, 3H), 1.54 - 1.40 (m, 1H).
Cpd. No. 26466
Cpd. No. 26466 의 합성
교반 막대가 있는 1 드램 바이알에 NMP(0.6mL) 중 퍼플루오로페닐 (16R,19R)-1-아지도-16,19-비스(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-9,14,17,20-테트라옥소-3,6,24,27,30,33-헥사옥사-10,15,18,21-테트라아자헥사트리아콘탄-36-오에이트(26333, 1.00당량, 23.1mg, 0.0160mmol) 및 (2R,4R,5S,6S)-5-아세트아미도-6-((1S,2S)-1,2-디하이드록시-3-(3-페녹시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시-2-(2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(26335, 3.10당량, 36.9mg, 0.0495mmol)의 용액에 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(7.50당량, 44.7mg, 0.120mmol)를 첨가하였다. 생성된 맑은 연황색 용액을 캡핑하고 실온에서 10분 동안 교반하였다(천천히 녹색으로 변함). 반응물을 NMP 중 70% 아세트산의 혼합물로 희석하고, 여과하고, 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 15-65% 아세토니트릴)를 통해 정제하였다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 Cpd. No. 26466을 백색 고체로 얻었다. 수율: 35.4mg, 69%; LCMS m/z 1610.7 [M/2+1]+; 1H NMR (300 MHz,　D2O를 갖는 DMSO-d 6) δ 7.95 (s, 3H), 7.54 (d,　J　= 7.8 Hz, 3H), 7.47 - 7.30 (m, 12H), 7.12 (t,　J　= 7.4 Hz, 6H), 6.96 (d,　J　= 8.0 Hz, 6H), 4.52 - 4.37 (m, 12H), 3.90 - 2.78 (m, 99H), 2.29 - 2.18 (m, 6H), 2.18 - 2.02 (m, 4H), 1.82 (s, 9H), 1.68 - 1.36 (m, 8H), 1.36 - 1.05 (m, 8H).
Cpd. No. 26467
Cpd. No. 26467 의 합성
교반 막대가 있는 1 드램 바이알에 NMP(0.6mL) 중 퍼플루오로페닐 (16R,19R)-1-아지도-16,19-비스(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-9,14,17,20-테트라옥소-3,6,24,27,30,33-헥사옥사-10,15,18,21-테트라아자헥사트리아콘탄-36-오에이트(26333, 1.00당량, 23.7mg, 0.0164mmol) 및 (2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-페녹시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시-2-(2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(26334, 3.10당량, 37.9mg, 0.0508mmol)의 용액에 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(7.50당량, 45.8mg, 0.123mmol)를 첨가하였다. 생성된 맑은 연황색 용액을 캡핑하고 실온에서 10분 동안 교반하였다(천천히 녹색으로 변함). 반응물을 NMP 중 70% 아세트산의 혼합물로 희석하고, 여과하고, 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 15-65% 아세토니트릴)를 통해 정제하였다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 Cpd No. 26467을 백색 고체로 얻었다. 수율: 36.8mg, 70%;　LCMS m/z 1610.6 [M/2+1]+; 1H NMR (300 MHz,　D2O를 갖는 DMSO-d 6) δ 7.93 (s, 3H), 7.51 (d,　J　= 7.5 Hz, 3H), 7.46 - 7.27 (m, 12H), 7.11 (t,　J　= 8.0 Hz, 6H), 6.94 (d,　J　= 7.9 Hz, 6H), 4.48 - 4.35 (m, 12H), 4.10 - 2.82 (m, 99H), 2.45 - 2.39 (m, 2H), 2.29 - 2.17 (m, 6H), 2.13 - 2.02 (m, 2H), 1.82 (s, 9H), 1.66 - 1.36 (m, 8H), 1.36 - 1.05 (m, 8H).
(2RS,2'RS,4SR,4'SR,5RS,5'RS,6RS,6'RS)-2,2'-((((2R,2'R,3R,3'R,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-(((((SR)-9,14,22-트리옥소-16-((15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)카르바모일)-3,6,25,28-테트라옥사-10,15,21-트리아자트리아콘탄-1,30-디일)비스(1H-1,2,3-트리아졸-1,4-디일))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(3,4,5-트리하이드록시테트라하이드로-2H-피란-6,2-디일))비스(메틸렌))비스(옥시))비스(5-아세트아미도-6-((1RS,2RS)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산) (Cpd. No. 26468)
(2RS,2'RS,4SR,4'SR,5RS,5'RS,6RS,6'RS)-2,2'-((((2R,2'R,3R,3'R,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-(((((SR)-9,14,22-트리옥소-16-((15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)카르바모일)-3,6,25,28-테트라옥사-10,15,21-트리아자트리아콘탄-1,30-디일)비스(1H-1,2,3-트리아졸-1,4-디일))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(3,4,5-트리하이드록시테트라하이드로-2H-피란-6,2-디일))비스(메틸렌))비스(옥시))비스(5-아세트아미도-6-((1RS,2RS)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산) (Cpd. No. 26468 )의 합성
교반 막대가 있는 1 드램 바이알에 NMP(0.5mL) 중 퍼플루오로페닐 (R)-1-아지도-16-(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-9,14,17-트리옥소-3,6,21,24,27,30-헥사옥사-10,15,18-트리아자트리트리아콘탄-33-오에이트(26332, 1.00당량, 18.4mg, 0.0163mmol) 및 (2RS,4SR,5RS,6RS)-5-아세트아미도-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-6-(부트-3-인-1-일옥시)-3,4,5-트리하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-일)메톡시)-6-((1RS,2RS)-1,2-디하이드록시-3-(3-페녹시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(26409, 2.10당량, 24.6mg, 0.0342mmol)의 용액에 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(5.00당량, 30.4mg, 0.0815mmol를 첨가하였다 생성된 무색 용액을 캡핑하고 실온에서 10분 동안 교반했다(천천히 녹색으로 변함). 반응물을 NMP 중 70% 아세트산의 혼합물로 희석하고, 여과하고, 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 15-65% 아세토니트릴)를 통해 정제하였다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 (2RS,2'RS,4SR,4'SR,5RS,5'RS,6RS,6'RS)-2,2'-((((2R,2'R,3R,3'R,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-(((((SR)-9,14,22-트리옥소-16-((15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)카르바모일)-3,6,25,28-테트라옥사-10,15,21-트리아자트리아콘탄-1,30-디일)비스(1H-1,2,3-트리아졸-1,4-디일))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(3,4,5-트리하이드록시테트라하이드로-2H-피란-6,2-디일))비스(메틸렌))비스(옥시))비스(5-아세트아미도-6-((1RS,2RS)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산)(Cpd. No. 26468)을 백색고체로 얻었다. 수율: 28.2mg, 71%;　LCMS m/z 1226.8　[M/2+1]+;　1H NMR (300 MHz,　D2O를 갖는 DMSO-d 6) δ 7.79 (s, 2H), 7.51 (d,　J　= 7.8 Hz, 2H), 7.45 - 7.30 (m, 8H), 7.16 - 7.05 (m, 4H), 6.94 (d,　J　= 8.0 Hz, 4H), 4.42 - 4.33 (m, 4H), 4.15 - 2.69 (m, 77H), 2.44 - 2.39 (m, 2H), 2.30 - 2.18 (m, 4H), 2.14 - 2.02 (m, 2H), 1.82 (s, 6H), 1.64 - 1.38 (m, 6H), 1.38 - 1.07 (m, 4H).
(2RS,2'RS,4RS,4'RS,5SR,5'SR,6SR,6'SR)-2,2'-((((2R,2'R,3R,3'R,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-(((((RS)-9,14,22-트리옥소-16-((15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)카르바모일)-3,6,25,28-테트라옥사-10,15,21-트리아자트리아콘탄-1,30-디일)비스(1H-1,2,3-트리아졸-1,4-디일))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(3,4,5-트리하이드록시테트라하이드로-2H-피란-6,2-디일))비스(메틸렌))비스(옥시))비스(5-아세트아미도-6-((1SR,2SR)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산) (Cpd. No. 26469)
(2RS,2'RS,4RS,4'RS,5SR,5'SR,6SR,6'SR)-2,2'-((((2R,2'R,3R,3'R,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-(((((RS)-9,14,22-트리옥소-16-((15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)카르바모일)-3,6,25,28-테트라옥사-10,15,21-트리아자트리아콘탄-1,30-디일)비스(1H-1,2,3-트리아졸-1,4-디일))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(3,4,5-트리하이드록시테트라하이드로-2H-피란-6,2-디일))비스(메틸렌))비스(옥시))비스(5-아세트아미도-6-((1SR,2SR)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산) (Cpd. No. 26469 )의 합성
교반 막대가 있는 1 드램 바이알에 NMP(0.5mL) 중 퍼플루오로페닐 (R)-1-아지도-16-(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-9,14,17-트리옥소-3,6,21,24,27,30-헥사옥사-10,15,18-트리아자트리트리아콘탄-33-오에이트(26332, 1.00당량, 19.3mg, 0.0171mmol) 및 (2RS,4RS,5SR,6SR)-5-아세트아미도-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-6-(부트-3-인-1-일옥시)-3,4,5-트리하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-일)메톡시)-6-((1SR,2SR)-1,2-디하이드록시-3-(3-페녹시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(26410, 2.10당량, 25.8mg, 0.0359mmol)의 용액에 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(5.00당량, 31.8mg, 0.0854mmol)를 첨가하였다. 생성된 무색 용액을 캡핑하고 실온에서 10분 동안 교반하였다(천천히 녹색으로 변함). 반응물을 NMP 중 70% 아세트산의 혼합물로 희석하고, 여과하고, 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 15-65% 아세토니트릴)를 통해 정제하였다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 (2RS,2'RS,4RS,4'RS,5SR,5'SR,6SR,6'SR)-2,2'-((((2R,2'R,3R,3'R,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-(((((RS)-9,14,22-트리옥소-16-((15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)카르바모일)-3,6,25,28-테트라옥사-10,15,21-트리아자트리아콘탄-1,30-디일)비스(1H-1,2,3-트리아졸-1,4-디일))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(3,4,5-트리하이드록시테트라하이드로-2H-피란-6,2-디일))비스(메틸렌))비스(옥시))비스(5-아세트아미도-6-((1SR,2SR)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산)(Cpd. No. 26469)을 백색고체로 얻었다. 수율: 26.0mg, 62%;　LCMS m/z 1226.8　[M/2+1]+;　1H NMR (300 MHz,　D2O를 갖는 DMSO-d 6) δ 7.92 (bs, 2H), 7.83 (s, 2H), 7.54 (d,　J　= 7.6 Hz, 2H), 7.44 (t,　J　= 7.8 Hz, 2H), 7.41 - 7.31 (m, 6H), 7.13 (t,　J　= 7.2 Hz, 4H), 6.96 (d,　J　= 8.0 Hz, 4H), 4.45 - 4.32 (m, 4H), 3.95 - 2.70 (m, 77H), 2.31 - 2.02 (m, 8H), 1.82 (s, 6H), 1.63 - 1.37 (m, 6H), 1.37 - 1.07 (m, 4H).
Cpd. No. 26470
Cpd. No. 26470 의 합성
교반 막대가 있는 1 드램 바이알에 NMP(0.6mL) 중 퍼플루오로페닐 (16R,19R)-1-아지도-16,19-비스(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-9,14,17,20-테트라옥소-3,6,24,27,30,33-헥사옥사-10,15,18,21-테트라아자헥사트리아콘탄-36-오에이트(26333, 1.00당량, 21.6mg, 0.0149mmol) 및 (2RS,4RS,5SR,6SR)-5-아세트아미도-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-6-(부트-3-인-1-일옥시)-3,4,5-트리하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-일)메톡시)-6-((1SR,2SR)-1,2-디하이드록시-3-(3-페녹시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(26410, 3.10당량, 33.3mg, 0.0463mmol)의 용액에 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(7.50당량, 41.8mg, 0.112mmol)를 첨가하였다. 생성된 투명한 황색 용액을 캡핑하고 실온에서 10분 동안 교반하였다(천천히 녹색으로 변함). 반응물을 NMP 중 70% 아세트산의 혼합물로 희석하고, 여과하고, 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 15-65% 아세토니트릴)를 통해 정제하였다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 Cpd. No. 26470을 백색 고체로 얻었다. 수율: 27.3mg, 52%; LCMS m/z 1742.4 [M/2+1]+; 1H NMR (300 MHz,　D2O를 갖는 DMSO-d 6) δ 7.92 (bs, 3H), 7.82 (s, 3H), 7.52 (d,　J　= 7.7 Hz, 3H), 7.43 (t,　J　= 7.9 Hz, 3H), 7.39 - 7.30 (m, 9H), 7.12 (t,　J　= 7.2 Hz, 6H), 6.95 (d,　J　= 7.9 Hz, 6H), 4.42 - 4.32 (m, 6H), 4.17 - 2.70 (m, 108H), 2.31 - 2.02 (m, 10H), 1.82 (s, 9H), 1.66 - 1.38 (m, 8H), 1.38 - 1.05 (m, 8H). 수율: 12.7mg, 24%; 1H NMR (300 MHz,　D2O를 갖는 DMSO-d 6) δ 7.92 (bs, 3H), 7.83 (s, 3H), 7.54 (d,　J　= 7.7 Hz, 3H), 7.45 (t,　J　= 7.9 Hz, 3H), 7.40 - 7.31 (m, 9H), 7.13 (t,　J　= 7.0 Hz, 6H), 6.96 (d,　J　= 8.0 Hz, 6H), 4.42 - 4.33 (m, 6H), 3.96 - 2.70 (m, 108H), 2.32 - 2.03 (m, 10H), 1.82 (s, 9H), 1.66 - 1.39 (m, 8H), 1.39 - 1.07 (m, 8H).
Cpd. No. 26471
Cpd. No. 26471 의 합성
교반 막대가 있는 1 드램 바이알에 NMP(0.6mL) 중 퍼플루오로페닐 (16R,19R)-1-아지도-16,19-비스(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-9,14,17,20-테트라옥소-3,6,24,27,30,33-헥사옥사-10,15,18,21-테트라아자헥사트리아콘탄-36-오에이트(26333, 1.00당량, 17.1mg, 0.0119mmol) 및 (2RS,4SR,5RS,6RS)-5-아세트아미도-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-6-(부트-3-인-1-일옥시)-3,4,5-트리하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-일)메톡시)-6-((1RS,2RS)-1,2-디하이드록시-3-(3-페녹시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(26409, 3.10당량, 26.4mg, 0.0368mmol)의 용액에 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(7.50당량, 33.1mg, 0.0889mmol)를 첨가하였다. 생성된 투명한 황색 용액을 캡핑하고 실온에서 10분 동안 교반하였다(천천히 녹색으로 변함). 반응물을 NMP 중 70% 아세트산의 혼합물로 희석하고, 여과하고, 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 15-65% 아세토니트릴)를 통해 정제하였다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 Cpd No. 26471을 백색 고체로 얻었다. 수율: 19.7mg, 48%;　LCMS m/z 1742.5 [M/2+1]+; 1H NMR (300 MHz,　D2O를 갖는 DMSO-d 6) δ 7.94 (bs, 3H), 7.81 (s, 3H), 7.53 (d,　J　= 7.7 Hz, 3H), 7.47 - 7.31 (m, 12H), 7.17 - 7.05 (m, 6H), 6.95 (d,　J　= 8.0 Hz, 6H), 4.44 - 4.30 (m, 6H), 4.16 - 4.09 (m, 2H), 3.90 - 2.69 (m, 106H), 2.45 - 2.37 (m, 2H), 2.31 - 2.16 (m, 6H), 2.14 - 2.01 (m, 2H), 1.82 (s, 9H), 1.65 - 1.38 (m, 8H), 1.38 - 1.04 (m, 8H). 수율: 8.1mg, 20%; 1H NMR (300 MHz,　D2O를 갖는 DMSO-d 6) δ 7.93 (bs, 3H), 7.78 (s, 3H), 7.50 (d,　J　= 7.6 Hz, 3H), 7.45 - 7.29 (m, 12H), 7.16 - 7.03 (m, 6H), 6.94 (d,　J　= 8.0 Hz, 6H), 4.41 - 4.32 (m, 6H), 4.15 - 2.70 (m, 108H), 2.32 - 2.18 (m, 8H), 2.14 - 2.04 (m, 2H), 1.82 (s, 9H), 1.66 - 1.38 (m, 8H), 1.38 - 1.05 (m, 8H).
(2S,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-2,4-디하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (Cpd. No. 26473)
(1R,2R)-1-((2R,3R,4S,6S)-3-아세트아미도-4-아세톡시-6-(벤질옥시)-6-(메톡시카르보닐)테트라하이드로-2H-피란-2-일)-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로판-1,2-디일 디아세테이트 ( 3 )의 합성
무수 디클로로메탄(10.0mL) 중 (1R,2R)-1-((2R,3R,4S,6R)-3-아세트아미도-4-아세톡시-6-(메톡시카르보닐)-6-(p-톨릴티오)테트라하이드로-2H-피란-2-일)-3-(3-페녹시벤즈아미도)프로판-1,2-디일 디아세테이트(1, 0.50g, 0.66mmol), 페닐메탄올(2, 0.203mL, 2.0mmol) 및 활성화된 4Å 분말 분자체(0.50g, 100% w/w)의 현탁액을 질소 분위기 하에 실온에서 15시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 -40℃로 냉각시킨 후 1-요오도피롤리딘-2,5-디온(0.374g, 1.66mmol) 및 트리플루오로메탄술폰산(0.058mL, 0.66mmol)을 첨가하였다. 반응물을 -40℃에서 1시간 동안 교반하고 진행을 TLC 및 LCMS로 모니터링하였다. 완료 후, 반응 혼합물을 트리에틸 아민(0.1mL, 중성 pH)으로 켄칭하고 실온으로 가온하였다. 반응 혼합물을 소결 깔대기를 통해 여과하고 디클로로메탄으로 세정하였다. 여액을 중탄산나트륨의 포화 용액으로 세정하고, 황산나트륨으로 건조하고, 여과하고, 감압 하에서 농축하여 조 잔사를 얻었다. 잔사를 컬럼 크로마토그래피(헥산 중 45-60% 에틸 아세테이트)를 통해 정제하여 (1R,2R)-1-((2R,3R,4S,6S)-3-아세트아미도-4-아세톡시-6-(벤질옥시)-6-(메톡시카르보닐)테트라하이드로-2H-피란-2-일)-3-(3-페녹시벤즈아미도)프로판-1,2-디일 디아세테이트(3)를 회백색 고체로 얻었다. 수율: 0.30g, 61.31%; LCMS (ESI) m/z 7354.22 [M+1]+.
(2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-2-(벤질옥시)-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 ( 4 )의 합성
0℃에서 메탄올(10.0mL) 중 (1R,2R)-1-((2R,3R,4S,6S)-3-아세트아미도-4-아세톡시-6-(벤질옥시)-6-(메톡시카르보닐)테트라하이드로-2H-피란-2-일)-3-(3-페녹시벤즈아미도)프로판-1,2-디일 디아세테이트(3, 0.30g, 0.408mmol)의 교반된 용액에 수산화리튬(0.048g, 2.04mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 교반하고 실온으로 가온하였다. 완료 후, Dowex-Hydrogen 형태를 반응 매스에 pH 6까지 첨가하였다. 반응 혼합물을 소결 깔대기를 통해 여과하고 여액을 회전식 증발기에서 농축하여 조 (2S,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-2-(벤질옥시)-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-페녹시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(4)을 백색 고체로 얻었다. 수율: 0.24g, 조; LCMS (ESI) m/z 595.22 [M+1]+.
(2S,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-2,4-디하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (Cpd. No . 26473 )의 합성
메탄올(3.0mL) 중 (2S,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-2-(벤질옥시)-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-페녹시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(4, 0.24g, 0.403mmol)의 교반된 용액에 실온에서 10% Pd/C(0.12g, 50% w/w)를 첨가하였다. H2 가스의 풍선 압력을 사용하여 12시간 동안 반응물을 수소화하였다. 반응물을 LC-MS 및 TLC로 모니터링하고 완료 후 반응물을 셀라이트를 통해 여과하고 여액을 농축하였다. 잔사를 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 17-35% 아세토니트릴)를 통해 정제하였다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 (2S,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-페녹시벤즈아미도)프로필)-2,4-디하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(Cpd. No. 26473)을 TFA 염으로서 백색 고체로 얻었다. 수율: 0.078g, 38.31%; LCMS (ESI) m/z 505.35 [M+1]+; 1H NMR (400 MHz, 메탄올-d 4) δ 8.42 - 8.40 (m, 1H), 8.09 (d, J　= 8.4 Hz, 1H), 7.56 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.46 - 7.42 (m, 2H), 7.39 - 7.35 (m, 2H), 7.16 - 7.12 (m, 2H), 7.02 - 7.00 (m, 2H), 4.06 - 4.00 (m, 2H), 3.88 - 3.75 (m, 3H), 3.51 - 3.42 (m, 2H), 2.21 (dd, J = 12.4 & 4.8 Hz, 1H), 1.97 (s, 3H), 1.83 (t, J = 12.4 Hz, 1H).
(2R,4R,5S,6S)-6-((1S,2S)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-(2-(2-((1-(15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메톡시)에톡시)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (Cpd. No. 26474)
(2R,4R,5S,6S)-6-((1S,2S)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-(2-(2-((1-(15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메톡시)에톡시)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (Cpd. No. 26474 )의 합성
교반 막대가 있는 1 드램 바이알에 NMP(0.3mL) 중 (2R,4R,5S,6S)-6-((1S,2S)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-(2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(26464, 1.00당량, 28.0mg, 0.0434mmol)의 용액에 NMP(0.3mL) 중 퍼플루오로페닐 1-아지도-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-오에이트(1, 1.10당량, 21.9mg, 0.0478mmol)의 용액 이어서 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(2.50당량, 40.5mg, 0.109mmol)를 첨가하였다. 생성된 투명한 녹색 용액을 캡핑하고 실온에서 10분 동안 교반하였다. 반응물을 아세트산으로 희석하고, 여과하고, 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 15-65% 아세토니트릴)를 통해 정제하였다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 (2R,4R,5S,6S)-6-((1S,2S)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-(2-(2-((1-(15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메톡시)에톡시)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(Cpd. No. 26474)을 백색 고체로 얻었다. 수율: 10.7mg, 22%;　LCMS m/z 1102.7 [M+1]+;　1H NMR (300 MHz,　D2O를 갖는 DMSO-d 6) δ 7.96 (s, 1H), 7.69 (d,　J　= 8.8 Hz, 1H), 7.61 - 7.48 (m, 4H), 7.41 (t,　J　= 7.5 Hz, 2H), 7.34 - 7.24 (m, 3H), 4.52 - 4.38 (m, 3H), 4.02 - 2.69 (m, 38H), 2.31 - 2.07 (m, 1H), 1.54 - 1.38 (m, 1H).
(2R,2'R,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-2,2'-(((((((((S)-9,14,22-트리옥소-16-((15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)카르바모일)-3,6,25,28-테트라옥사-10,15,21-트리아자트리아콘탄-1,30-디일)비스(1H-1,2,3-트리아졸-1,4-디일))비스(메틸렌))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산) (Cpd. No. 26475)
(2R,2'R,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-2,2'-(((((((((S)-9,14,22-트리옥소-16-((15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)카르바모일)-3,6,25,28-테트라옥사-10,15,21-트리아자트리아콘탄-1,30-디일)비스(1H-1,2,3-트리아졸-1,4-디일))비스(메틸렌))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산) (Cpd. No. 26475 )의 합성
교반 막대가 있는 1 드램 바이알에 NMP(0.6 mL) 중 퍼플루오로페닐 (R)-1-아지도-16-(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-9,14,17-트리옥소-3,6,21,24,27,30-헥사옥사-10,15,18-트리아자트리트리아콘탄-33-오에이트(26332, 1.00당량, 21.2mg, 0.0188mmol) 및 (2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-(2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(26463, 2.10당량, 25.4mg, 0.0394mmol)의 용액에 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(5.00당량, 35.0mg, 0.0939mmol)를 첨가하였다. 생성된 투명한 황색 용액을 캡핑하고 실온에서 10분 동안 교반하였다(천천히 녹색으로 변함). 반응물을 NMP 중 70% 아세트산의 혼합물로 희석하고, 여과하고, 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 15-60% 아세토니트릴)를 통해 정제하였다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 (2R,2'R,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-2,2'-(((((((((S)-9,14,22-트리옥소-16-((15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)카르바모일)-3,6,25,28-테트라옥사-10,15,21-트리아자트리아콘탄-1,30-디일)비스(1H-1,2,3-트리아졸-1,4-디일))비스(메틸렌))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산)(Cpd. No. 26475)을 백색 고체로 얻었다. 수율: 30.2mg, 70%;　1H NMR (300 MHz, D2O를 갖는 DMSO-d 6) δ 7.96 (s, 2H), 7.80 (d,　J　= 7.1 Hz, 2H), 7.62 - 7.50 (m, 8H), 7.41 (t,　J　= 7.5 Hz, 4H), 7.35 - 7.26 (m, 6H), 4.50 - 4.38 (m, 8H), 4.13 - 2.87 (m, 79H), 2.47 - 2.40 (m, 2H), 2.30 - 2.19 (m, 4H), 2.08 (t,　J　= 7.6 Hz, 2H), 1.62 - 1.08 (m, 10H).
(2R,2'R,4R,4'R,5S,5'S,6S,6'S)-2,2'-(((((((((R)-9,14,22-트리옥소-16-((15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)카르바모일)-3,6,25,28-테트라옥사-10,15,21-트리아자트리아콘탄-1,30-디일)비스(1H-1,2,3-트리아졸-1,4-디일))비스(메틸렌))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(6-((1S,2S)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산) (Cpd. No. 26476)
(2R,2'R,4R,4'R,5S,5'S,6S,6'S)-2,2'-(((((((((R)-9,14,22-트리옥소-16-((15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)카르바모일)-3,6,25,28-테트라옥사-10,15,21-트리아자트리아콘탄-1,30-디일)비스(1H-1,2,3-트리아졸-1,4-디일))비스(메틸렌))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(6-((1S,2S)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산) (Cpd. No. 26476 )의 합성
교반 막대가 있는 1 드램 바이알에 NMP(0.6mL) 중 퍼플루오로페닐 (R)-1-아지도-16-(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-9,14,17-트리옥소-3,6,21,24,27,30-헥사옥사-10,15,18-트리아자트리트리아콘탄-33-오에이트(26332, 1.00당량, 21.9mg, 0.0194mmol) 및 (2R,4R,5S,6S)-6-((1S,2S)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-(2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(26464, 2.10당량, 26.3mg, 0.0407mmol)의 용액에 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(5.00당량, 36.1mg, 0.0970mmol)를 첨가하였다. 생성된 투명한 황색 용액을 캡핑하고 실온에서 10분 동안 교반하였다(천천히 녹색으로 변함). 반응물을 NMP 중 70% 아세트산의 혼합물로 희석하고, 여과하고, 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 15-65% 아세토니트릴)를 통해 정제하였다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 (2R,2'R,4R,4'R,5S,5'S,6S,6'S)-2,2'-(((((((((R)-9,14,22-트리옥소-16-((15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)카르바모일)-3,6,25,28-테트라옥사-10,15,21-트리아자트리아콘탄-1,30-디일)비스(1H-1,2,3-트리아졸-1,4-디일))비스(메틸렌))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(6-((1S,2S)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산)(Cpd. No. 26476)을 백색 고체로 얻었다. 수율: 14.6mg, 33%;　LCMS m/z 1152.7 [M/2+1]+;　1H NMR (300 MHz,　D2O를 갖는 DMSO-d 6) δ 7.95 (s, 2H), 7.74 (d,　J　= 8.9 Hz, 2H), 7.62 - 7.48 (m, 8H), 7.41 (t,　J　= 7.6 Hz, 4H), 7.35 - 7.24 (m, 6H), 4.51 - 4.39 (m, 7H), 4.02 - 2.70 (m, 80H), 2.30 - 2.03 (m, 8H), 1.62 - 1.37 (m, 6H), 1.37 - 1.08 (m, 4H).
Cpd. No. 26477
Cpd. No. 26477 의 합성
교반 막대가 있는 1 드램 바이알에 NMP(0.6mL) 중 퍼플루오로페닐 (16R,19R)-1-아지도-16,19-비스(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-9,14,17,20-테트라옥소-3,6,24,27,30,33-헥사옥사-10,15,18,21-테트라아자헥사트리아콘탄-36-오에이트(26333, 1.00당량, 22.5mg, 0.0156mmol) 및 (2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-(2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(26463, 3.10당량, 31.2mg, 0.0484mmol)의 용액에 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(7.50당량, 43.6mg, 0.117mmol)를 첨가하였다. 생성된 투명한 황색 용액을 캡핑하고 실온에서 10분 동안 교반하였다(천천히 녹색으로 변함). 반응물을 NMP 중 70% 아세트산의 혼합물로 희석하고, 여과하고, 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 15-65% 아세토니트릴)를 통해 정제하였다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 Cpd. No. 26477을 백색 고체로 얻었다. 수율: 23.4mg, 46%;　1H NMR (300 MHz,　D2O를 갖는 DMSO-d 6) δ 7.94 (s, 3H), 7.77 (bs, 3H), 7.60 - 7.46 (m, 12H), 7.40 (t,　J　= 7.6 Hz, 6H), 7.34 - 7.24 (m, 9H), 4.49 - 4.36 (m, 11H), 3.90 - 2.84 (m, 114H), 2.31 - 2.03 (m, 8H), 1.65 - 1.37 (m, 8H), 1.37 - 1.06 (m, 8H).
Cpd. No. 26478
Cpd. No. 26478 의 합성
교반 막대가 있는 1 드램 바이알에 NMP(0.6mL) 중 퍼플루오로페닐 (16R,19R)-1-아지도-16,19-비스(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-9,14,17,20-테트라옥소-3,6,24,27,30,33-헥사옥사-10,15,18,21-테트라아자헥사트리아콘탄-36-오에이트(26333, 1.00당량, 24.3mg, 0.0168mmol) 및 (2R,4R,5S,6S)-6-((1S,2S)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-(2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(26464, 3.10당량, 33.7mg, 0.0522mmol)의 용액에 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(7.50당량, 47.1mg, 0.126mmol)를 첨가하였다. 생성된 투명한 황색 용액을 캡핑하고 실온에서 10분 동안 교반하였다(천천히 녹색으로 변함). 반응물을 NMP 중 70% 아세트산의 혼합물로 희석하고, 여과하고, 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 15-65% 아세토니트릴)를 통해 정제하였다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 Cpd. No. 26478을 백색 고체로 얻었다. 수율: 23.4mg, 43%;　LCMS m/z 1631.8 [M/2+1]+; 1H NMR (300 MHz,　D2O를 갖는 DMSO-d 6) δ 7.96 (s, 3H), 7.74 (d,　J　= 8.9 Hz, 3H), 7.62 - 7.48 (m, 12H), 7.41 (t,　J　= 7.6 Hz, 6H), 7.35 - 7.25 (m, 9H), 4.51 - 4.38 (m, 11H), 3.90 - 2.70 (m, 110H), 2.32 - 2.03 (m, 12H), 1.65 - 1.37 (m, 8H), 1.37 - 1.06 (m, 8H).
퍼플루오로페닐 1-(4-(13-하이드록시-2,5,8,11-테트라옥사트리데실)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-오에이트 (Cpd. No. 26530)
퍼플루오로페닐 1-(4-(13-하이드록시-2,5,8,11-테트라옥사트리데실)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-오에이트 (Cpd. No. 26530 )의 합성
교반 막대가 있는 1 드램 바이알 중 3,6,9,12-테트라옥사펜타덱-14-인-1-올(1, 1.00당량, 14.4mg, 0.0620mmol)에 NMP(0.5mL) 중 퍼플루오로페닐 1-아지도-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-오에이트(2, 1.10당량, 31.2mg, 0.0682mmol)의 용액 이어서 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(2.50당량, 57.8mg, 0.155mmol)를 첨가하였다. 생성된 무색 용액을 캡핑하고 실온에서 10분 동안 교반하였다(천천히 녹색으로 변함). 반응물을 아세트산으로 희석하고, 여과하고, 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 15-65% 아세토니트릴)를 통해 정제하였다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 퍼플루오로페닐 1-(4-(13-하이드록시-2,5,8,11-테트라옥사트리데실)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-오에이트(Cpd. No. 26530)를 무색 액체로 얻었다. 수율: 16.2mg, 38%;　LCMS m/z 690.5 [M+1]+;　1H NMR (300 MHz,　클로로포름-d) δ 7.97 (s, 1H), 4.81 - 4.72 (m, 2H), 4.64 - 4.54 (m, 2H), 3.96 - 3.82 (m, 4H), 3.80 - 3.56 (m, 29H), 2.94 (t,　J　= 6.1 Hz, 2H).
퍼플루오로페닐 (RS)-9,14,17-트리옥소-1-(4-(2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-트리하이드록시-6-(하이드록시메틸)테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-16-(4-(3-(2-(2-(4-(2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-트리하이드록시-6-(하이드록시메틸)테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-3,6,21,24,27,30-헥사옥사-10,15,18-트리아자트리트리아콘탄-33-오에이트 (Cpd. No. 26531)
퍼플루오로페닐 (RS)-9,14,17-트리옥소-1-(4-(2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-트리하이드록시-6-(하이드록시메틸)테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-16-(4-(3-(2-(2-(4-(2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-트리하이드록시-6-(하이드록시메틸)테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-3,6,21,24,27,30-헥사옥사-10,15,18-트리아자트리트리아콘탄-33-오에이트 (Cpd. No. 26531 )의 합성
교반 막대가 있는 1 드램 바이알에 NMP(0.4mL) 중 퍼플루오로페닐 (R)-1-아지도-16-(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-9,14,17-트리옥소-3,6,21,24,27,30-헥사옥사-10,15,18-트리아자트리트리아콘탄-33-오에이트(26332, 1.00당량, 32.4mg, 0.0287mmol) 및 (2R,3R,4S,5R,6R)-2-(부트-3-인-1-일옥시)-6-(하이드록시메틸)테트라하이드로-2H-피란-3,4,5-트리올(26499, 2.10당량, 14.0mg, 0.0603mmol)의 용액에 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(5.00당량, 53.5mg, 0.143mmol)를 첨가하였다. 생성된 투명한 황색 용액을 캡핑하고 실온에서 10분 동안 교반하였다(천천히 녹색으로 변함). 반응물을 NMP 중 70% 아세트산의 혼합물로 희석하고, 여과하고, 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 15-60% 아세토니트릴)를 통해 정제하였다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 퍼플루오로페닐 (RS)-9,14,17-트리옥소-1-(4-(2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-트리하이드록시-6-(하이드록시메틸)테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-16-(4-(3-(2-(2-(4-(2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-트리하이드록시-6-(하이드록시메틸)테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-3,6,21,24,27,30-헥사옥사-10,15,18-트리아자트리트리아콘탄-33-오에이트(Cpd. No. 26531)를 백색 고체로 얻었다. 수율: 28.1mg, 66%;　LCMS m/z 1480.0 [M+1]+;　1H NMR (300 MHz,　D2O를 갖는 DMSO-d 6) δ 7.85 (s, 2H), 4.45 - 4.35 (m, 3H), 4.21 - 4.10 (m, 2H), 3.98 - 2.70 (m, 62H), 2.31 - 2.19 (m, 4H), 2.09 (t,　J　= 7.5 Hz, 2H), 1.64 - 1.37 (m, 4H), 1.37 - 1.07 (m, 4H).
퍼플루오로페닐 (R)-1-(4-(13-하이드록시-2,5,8,11-테트라옥사트리데실)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-16-(4-(3-(2-(2-(4-(13-하이드록시-2,5,8,11-테트라옥사트리데실)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-9,14,17-트리옥소-3,6,21,24,27,30-헥사옥사-10,15,18-트리아자트리트리아콘탄-33-오에이트 (Cpd. No. 26532)
퍼플루오로페닐 (R)-1-(4-(13-하이드록시-2,5,8,11-테트라옥사트리데실)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-16-(4-(3-(2-(2-(4-(13-하이드록시-2,5,8,11-테트라옥사트리데실)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-9,14,17-트리옥소-3,6,21,24,27,30-헥사옥사-10,15,18-트리아자트리트리아콘탄-33-오에이트 (Cpd. No. 26532 )의 합성
교반 막대가 있는 1 드램 바이알에 NMP(0.5mL) 중 퍼플루오로페닐 (R)-1-아지도-16-(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-9,14,17-트리옥소-3,6,21,24,27,30-헥사옥사-10,15,18-트리아자트리트리아콘탄-33-오에이트(26332, 1.00당량, 30.2mg, 0.0267mmol) 및 3,6,9,12-테트라옥사펜타덱-14-인-1-올(1, 2.10당량, 13.0mg, 0.0562mmol)의 용액에 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(5.00당량, 49.8mg, 0.134mmol)를 첨가하였다. 생성된 투명한 황색 용액을 캡핑하고 실온에서 10분 동안 교반하였다(천천히 녹색으로 변함). 반응물을 NMP 중 70% 아세트산의 혼합물로 희석하고, 여과하고, 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 15-60% 아세토니트릴)를 통해 정제하였다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 퍼플루오로페닐 (R)-1-(4-(13-하이드록시-2,5,8,11-테트라옥사트리데실)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-16-(4-(3-(2-(2-(4-(13-하이드록시-2,5,8,11-테트라옥사트리데실)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-9,14,17-트리옥소-3,6,21,24,27,30-헥사옥사-10,15,18-트리아자트리트리아콘탄-33-오에이트(Cpd. No. 26532)를 투명한 황색 액체로 얻었다. 수율: 17.0mg, 43%;　LCMS m/z 1480.1 [M+1]+;　1H NMR (300 MHz,　D2O를 갖는DMSO-d 6) δ 7.98 (s, 2H), 7.95 - 7.82 (m, 3H), 4.50 - 4.41 (m, 8H), 3.80 - 2.72 (m, 73H), 2.31 - 2.21 (m, 4H), 2.10 (t,　J　= 7.4 Hz, 2H), 1.65 - 1.38 (m, 4H), 1.38 - 1.08 (m, 4H).
퍼플루오로페닐 (16RS,19RS)-9,14,17,20-테트라옥소-1-(4-(2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-트리하이드록시-6-(하이드록시메틸)테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-16,19-비스(4-(3-(2-(2-(4-(2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-트리하이드록시-6-(하이드록시메틸)테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-3,6,24,27,30,33-헥사옥사-10,15,18,21-테트라아자헥사트리아콘탄-36-오에이트 (Cpd. No. 26533)
퍼플루오로페닐 (16RS,19RS)-9,14,17,20-테트라옥소-1-(4-(2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-트리하이드록시-6-(하이드록시메틸)테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-16,19-비스(4-(3-(2-(2-(4-(2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-트리하이드록시-6-(하이드록시메틸)테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-3,6,24,27,30,33-헥사옥사-10,15,18,21-테트라아자헥사트리아콘탄-36-오에이트 (Cpd. No. 26533 )의 합성
교반 막대가 있는 1 드램 바이알에 NMP(0.4mL) 중 퍼플루오로페닐 (16R,19R)-1-아지도-16,19-비스(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-9,14,17,20-테트라옥소-3,6,24,27,30,33-헥사옥사-10,15,18,21-테트라아자헥사트리아콘탄-36-오에이트(26333, 1.00당량, 36.9mg, 0.0256mmol) 및 (2R,3R,4S,5R,6R)-2-(부트-3-인-1-일옥시)-6-(하이드록시메틸)테트라하이드로-2H-피란-3,4,5-트리올(26499, 3.10당량, 18.4mg, 0.0793mmol)의 용액에 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(7.50당량, 71.5mg, 0.192mmol)를 첨가하였다. 생성된 투명한 황색 용액을 캡핑하고 실온에서 10분 동안 교반하였다(천천히 녹색으로 변함). 반응물을 NMP 중 70% 아세트산의 혼합물로 희석하고, 여과하고, 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 15-50% 아세토니트릴)를 통해 정제하였다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 퍼플루오로페닐 (16RS,19RS)-9,14,17,20-테트라옥소-1-(4-(2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-트리하이드록시-6-(하이드록시메틸)테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-16,19-비스(4-(3-(2-(2-(4-(2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-트리하이드록시-6-(하이드록시메틸)테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-3,6,24,27,30,33-헥사옥사-10,15,18,21-테트라아자헥사트리아콘탄-36-오에이트(Cpd. No. 26533)를 백색 고체로 얻었다. 수율: 38.1mg, 74%;　LCMS m/z 1013.8 [M/2+1]+;　1H NMR (300 MHz,　D2O를 갖는 DMSO-d 6) δ 7.85 (s, 3H), 4.45 - 4.36 (m, 6H), 4.18 - 2.65 (m, 83H), 2.31 - 2.16 (m, 6H), 2.16 - 2.04 (m, 2H), 1.66 - 1.38 (m, 6H), 1.38 - 1.06 (m, 10H).
퍼플루오로페닐 (16R,19R)-1-(4-(13-하이드록시-2,5,8,11-테트라옥사트리데실)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-16,19-비스(4-(3-(2-(2-(4-(13-하이드록시-2,5,8,11-테트라옥사트리데실)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-9,14,17,20-테트라옥소-3,6,24,27,30,33-헥사옥사-10,15,18,21-테트라아자헥사트리아콘탄-36-오에이트 (Cpd. No. 26534)
퍼플루오로페닐 (16R,19R)-1-(4-(13-하이드록시-2,5,8,11-테트라옥사트리데실)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-16,19-비스(4-(3-(2-(2-(4-(13-하이드록시-2,5,8,11-테트라옥사트리데실)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-9,14,17,20-테트라옥소-3,6,24,27,30,33-헥사옥사-10,15,18,21-테트라아자헥사트리아콘탄-36-오에이트 (Cpd. No. 26534 )의 합성
교반 막대가 있는 1 드램 바이알에 NMP(0.4mL) 중 퍼플루오로페닐 (16R,19R)-1-아지도-16,19-비스(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-9,14,17,20-테트라옥소-3,6,24,27,30,33-헥사옥사-10,15,18,21-테트라아자헥사트리아콘탄-36-오에이트(26333, 1.00당량, 35.8mg, 0.0248mmol) 및 3,6,9,12-테트라옥사펜타덱-14-인-1-올(1, 3.10당량, 17.9mg, 0.0769mmol)의 용액에 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(7.50당량, 69.4mg, 0.186mmol)를 첨가하였다. 생성된 투명한 녹색 용액을 캡핑하고 실온에서 10분 동안 교반하였다. 반응물을 NMP 중 70% 아세트산의 혼합물로 희석하고, 여과하고, 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 15-50% 아세토니트릴)를 통해 정제하였다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 퍼플루오로페닐 (16R,19R)-1-(4-(13-하이드록시-2,5,8,11-테트라옥사트리데실)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-16,19-비스(4-(3-(2-(2-(4-(13-하이드록시-2,5,8,11-테트라옥사트리데실)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-9,14,17,20-테트라옥소-3,6,24,27,30,33-헥사옥사-10,15,18,21-테트라아자헥사트리아콘탄-36-오에이트(Cpd. No. 26534)를 투명한 분홍색 액체로 얻었다. 수율: 22.8mg, 45%;　LCMS m/z 1013.8 [M/2+1]+;　1H NMR (300 MHz,　D2O를 갖는 DMSO-d 6) δ 7.98 (s, 3H), 7.95 - 7.83 (m, 2H), 4.51 - 4.39 (m, 12H), 3.80 - 2.69 (m, 100H), 2.31 - 2.19 (m, 6H), 2.15 - 2.04 (m, 2H), 1.67 - 1.38 (m, 6H), 1.38 - 1.07 (m, 8H).
퍼플루오로페닐 1-(4-(2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-트리하이드록시-6-(하이드록시메틸)테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-오에이트 (Cpd. No. 26535)
퍼플루오로페닐 1-(4-(2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-트리하이드록시-6-(하이드록시메틸)테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-오에이트 (Cpd. No. 26535 )의 합성
교반 막대가 있는 1 드램 바이알 중 (2R,3R,4S,5R,6R)-2-(부트-3-인-1-일옥시)-6-(하이드록시메틸)테트라하이드로-2H-피란-3,4,5-트리올(26499, 1.00당량, 13.6mg, 0.0586mmol)에 NMP(0.5mL) 중 퍼플루오로페닐 1-아지도-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-오에이트(1, 1.10당량, 29.5mg, 0.0645mmol)의 용액 이어서 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(2.50당량, 54.6mg, 0.147mmol)를 첨가하였다. 생성된 투명한 황색 용액을 캡핑하고 실온에서 10분 동안 교반하였다(천천히 녹색으로 변함). 반응물을 아세트산으로 희석하고, 여과하고, 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 15-65% 아세토니트릴)를 통해 정제하였다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 퍼플루오로페닐 1-(4-(2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-트리하이드록시-6-(하이드록시메틸)테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-오에이트(Cpd. No. 26535)를 무색의 반고체로 얻었다. 수율: 29.0mg, 72%;　LCMS m/z　 [M+1]+;　LCMS m/z 690.5 [M+1]+;　1H NMR (300 MHz,　D2O를 갖는 DMSO-d 6) δ 7.88 (s, 1H), 4.47 - 4.37 (m, 2H), 4.16 - 4.09 (m, 1H), 3.80 - 3.21 (m, 24H), 2.95 (t,　J　= 5.9 Hz, 2H), 2.86 (t,　J　= 6.9 Hz, 2H).
(1R,2R)-1-((2R,3R,4S,6R)-3-아세트아미도-4-아세톡시-6-하이드록시-6-(메톡시카르보닐)테트라하이드로-2H-피란-2-일)-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로판-1,2-디일 디아세테이트 (Cpd. No. 26565)
(1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1-((2R,3R,4S,6R)-3-아세트아미도-4-아세톡시-6-(벤질옥시)-6-(메톡시카르보닐)테트라하이드로-2H-피란-2-일)프로판-1,2-디일 디아세테이트 ( 3 )의 합성
무수 디클로로메탄(14.0mL) 중 (1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1-((2R,3R,4S,6S)-3-아세트아미도-4-아세톡시-6-(메톡시카르보닐)-6-(p-톨릴티오)테트라하이드로-2H-피란-2-일)프로판-1,2-디일 디아세테이트(1, 1.0g, 1.24mmol)의 교반된 용액에 페닐메탄올(0.386mL, 3.72mmol) 및 활성화된 4Å 분말형 분자체(1.0g, 100% w/w)를 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 질소 분위기 하에서 15시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 -40℃로 냉각시킨 후 -40℃에서 1-요오도피롤리딘-2,5-디온(0.697g, 3.10mmol) 및 트리플루오로메탄술폰산(0.109mL, 1.24mmol)을 첨가하였다. 반응물을 -40℃에서 1시간 동안 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물을 트리에틸 아민(0.1mL, 중성 pH)으로 켄칭하고 실온으로 가온하였다. 반응 혼합물을 여과하고 디클로로메탄으로 세정하였다. 여액을 중탄산나트륨의 포화 용액으로 세정하고 황산나트륨으로 건조하고 여과하고 감압 하에서 농축하여 조 잔사를 얻었다. 조 잔사를 컬럼 크로마토그래피(헥산 중 45-60% 에틸 아세테이트)를 통해 정제하여 (1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1-((2R,3R,4S,6R)-3-아세트아미도-4-아세톡시-6-(벤질옥시)-6-(메톡시카르보닐)테트라하이드로-2H-피란-2-일)프로판-1,2-디일 디아세테이트(3)를 회백색 고체로 얻었다. 수율: 0.80g, 81.30%; LCMS (ESI) m/z 791.82 [M+1]+.
(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-5-아세트아미도-2-(벤질옥시)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 ( 4 )의 합성
0℃에서 메탄올(10.0mL) 중 (1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1-((2R,3R,4S,6R)-3-아세트아미도-4-아세톡시-6-(벤질옥시)-6-(메톡시카르보닐)테트라하이드로-2H-피란-2-일)프로판-1,2-디일 디아세테이트(3, 0.80g, 1.01mmol)의 교반된 용액에 수산화리튬(0.121g, 5.06mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하였다. 완료 후, Dowex-Hydrogen 형태를 pH 6까지 반응 매스에 첨가하였다. 반응 혼합물을 여과하고 생성된 여액을 회전식 증발기에서 농축하여 조 (2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-5-아세트아미도-2-(벤질옥시)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(4)을 백색 고체로 얻었다. 수율: 0.60g, 95.25%; LCMS (ESI) m/z 623.67 [M+1]+.
(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-2,4-디하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (Cpd. No . 26565 )의 합성
메탄올(10.0mL) 중 조 (2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디아세톡시프로필)-5-아세트아미도-4-아세톡시-2-(벤질옥시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(4, 0.60g, 0.985mmol)의 교반된 용액에 10% Pd/C(0.30g, 50% w/w)를 실온에서 첨가하였다. 이어서 반응물을 12시간 동안 H2 기체의 풍선 압력을 사용하여 수소화시켰다. 완료 후, 반응물을 셀라이트를 통해 여과하고 여액을 농축하였다. 얻어진 잔사를 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 19-38% 아세토니트릴)를 통해 정제하였다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 (2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-2,4-디하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(Cpd. No. 26565)을 TFA 염으로서 백색 고체로 얻었다. 수율: 0.088g, 17.22%; LCMS (ESI) m/z 517.34 [M+1]+; 1H NMR (400 MHz, 메탄올-d 4) δ 7.60 - 7.56 (m, 4H), 7.43 - 7.36 (m, 4H), 7.33 - 7.29 (m, 1H), 4.16 - 4.09 (m, 2H), 4.02 (s, 2H), 3.90 (t, J = 10.4 Hz, 1H), 3.77 - 3.73 (m, 1H) 3.68 - 3.64 (m, 1H), 3.59 (m, 2H), 3.39 (d, J = 9.2, 1H), 3.27 - 3.22 (m, 1H), 2.21 (dd, J = 12.8 & 4.8 Hz, 1H), 1.84 1.83 (t, J = 12.8 Hz, 1H).
(2S,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-((2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에틸)티오)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (Cpd. No. 26566)
(1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1-((2R,3R,4S,6R)-4-아세톡시-3-(2-아세톡시아세트아미도)-6-하이드록시-6-(메톡시카르보닐)테트라하이드로-2H-피란-2-일)프로판-1,2-디일 디아세테이트 ( 2 )의 합성
아세톤:물(9:1, 20.0mL) 중 (1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1-((2R,3R,4S,6S)-4-아세톡시-3-(2-아세톡시아세트아미도)-6-(메톡시카르보닐)-6-(p-톨릴티오)테트라하이드로-2H-피란-2-일)프로판-1,2-디일 디아세테이트(1, 1.0g, 1.24mmol)의 교반된 용액을 0℃로 냉각시켰다. 용액에 N-요오도석신이미드(0.35g, 3.10mmol)를 0℃에서 첨가하였다. 생성된 반응 용액을 0℃에서 3시간 동안 교반하였다. 완료 후, 메타중황화나트륨(10.0mL) 및 에틸 아세테이트(20.0mL)의 포화 수성 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 10분 동안 교반하고 분별 깔때기로 옮겼다. 유기층을 분리하고 수성상을 에틸 아세테이트(10.0mL)로 추출하였다. 유기층을 조합하고 포화 중탄산나트륨 용액 및 DM 수로 순차적으로 세정하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조하고 회전식 증발기에서 농축하여 걸쭉한 시럽을 얻었다. 걸쭉한 시럽을 컬럼 크로마토그래피(헥산 중 60-75% 에틸 아세테이트)를 통해 정제하여 (1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1-((2R,3R,4S,6R)-4-아세톡시-3-(2-아세톡시아세트아미도)-6-하이드록시-6-(메톡시카르보닐)테트라하이드로-2H-피란-2-일)프로판-1,2-디일 디아세테이트(2)를 백색 고체로 얻었다. 수율: 0.76g, 87.52%; LCMS (ESI) m/z 701.59 [M+1]+.
(1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1-((2R,3R,4S,6R)-4-아세톡시-3-(2-아세톡시아세트아미도)-6-클로로-6-(메톡시카르보닐)테트라하이드로-2H-피란-2-일)프로판-1,2-디일 디아세테이트 ( 3 )의 합성
아세틸 클로라이드(30.0mL) 중 (1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1-((2R,3R,4S,6R)-4-아세톡시-3-(2-아세톡시아세트아미도)-6-하이드록시-6-(메톡시카르보닐)테트라하이드로-2H-피란-2-일)프로판-1,2-디일 디아세테이트(2, 0.76g, 1.08mmol)의 교반된 용액에 무수 메탄올(0.3mL)을 0℃에서 점적 부가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물을 감압 하에서 농축하여 조 (1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1-((2R,3R,4S,6R)-4-아세톡시-3-(2-아세톡시아세트아미도)-6-클로로-6-(메톡시카르보닐)테트라하이드로-2H-피란-2-일)프로판-1,2-디일 디아세테이트(3)를 밝은 갈색 젤로 얻었다. 수율: 0.75g, 97%; LC-MS (ESI) m/z 719.19 [M+1]+.
(1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1-((2R,3R,4S,6S)-4-아세톡시-3-(2-아세톡시아세트아미도)-6-(아세틸티오)-6-(메톡시카르보닐)테트라하이드로-2H-피란-2-일)프로판-1,2-디일 디아세테이트 ( 5 )의 합성
불활성 분위기에서, 조 (1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1-((2R,3R,4S,6R)-4-아세톡시-3-(2-아세톡시아세트아미도)-6-클로로-6-(메톡시카르보닐)테트라하이드로-2H-피란-2-일)프로판-1,2-디일 디아세테이트(3, 0.75g, 1.04mmol, 조)를 건조 아세톤(10.0mL)에 용해시키고 0℃에서 교반하였다. 이 용액에, 포타슘 티오아세테이트(4, 0.357g, 3.13mmol)를 핀치-방식으로 0℃에서 첨가하였다. 반응물을 0℃에서 3시간 동안 교반하였다. 완료 후, 혼합물을 감압 하에서 농축하여 조 잔사를 얻었다. 조 잔사를 에틸 아세테이트에 용해시키고 생성된 용액을 1N HCl에 이어서 DM 수로 세정하였다. 유기층을 분리하고 무수 황산나트륨으로 건조하고 회전식 증발기에서 농축하여 걸쭉한 잔사를 얻었다. 잔사를 컬럼 크로마토그래피(헥산 중 60-70% 에틸 아세테이트)를 통해 정제하여 (1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1-((2R,3R,4S,6S)-4-아세톡시-3-(2-아세톡시아세트아미도)-6-(아세틸티오)-6-(메톡시카르보닐)테트라하이드로-2H-피란-2-일)프로판-1,2-디일 디아세테이트(5)를 백색 고체로 얻었다. 수율: 0.530g, 66.97%; LCMS (ESI) m/z 759.29 [M+1]+.
(1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1-((2R,3R,4S,6S)-4-아세톡시-3-(2-아세톡시아세트아미도)-6-(메톡시카르보닐)-6-((2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에틸)티오)테트라하이드로-2H-피란-2-일)프로판-1,2-디일 디아세테이트 ( Cpd. No. 26566 )의 합성
메탄올(10.0mmol)mL) 중 (1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1-((2R,3R,4S,6S)-4-아세톡시-3-(2-아세톡시아세트아미도)-6-(아세틸티오)-6-(메톡시카르보닐)테트라하이드로-2H-피란-2-일)프로판-1,2-디일 디아세테이트(5, 0.53g, 0.698mmol)의 교반된 용액에 0℃에서 나트륨 티오메톡시드(0.058g, 0.838mmol)를 첨가하였다. 생성된 반응 용액을 1시간 동안 교반하였다. 반응 용액에 0℃에서 1-요오도-2-[2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시]에탄(0.354g, 1.40mmol)을 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 완료 후, 수산화리튬(0.026g, 1.12mmol)을 실온에서 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 6시간 동안 교반하였다. 완료 후 Dowex-Hydrogen 형태를 pH 6까지 첨가하고 반응물을 소결 깔대기를 통해 여과하였다. 여액을 회전식 증발기에서 농축하여 걸쭉한 잔사를 얻은 다음 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 15-40% 아세토니트릴)를 통해 정제했다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 (2S,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-((2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에틸)티오)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(Cpd. No. 26566)을 TFA 염으로서 백색 고체로 얻었다. 수율: 0.170g, 46.04%; LC-MS (ESI) m/z 661.17 [M+1]+. 1H NMR (400 MHz, 메탄올-d 4) δ 7.61 - 7.57 (m, 4H), 7.44 - 7.37 (, 4H), 7.33 - 7.30 (m, 1H), 4.15 (d, J = 2.0 Hz,1H), 4.00 (s, 2H), 3.86 - 3.81 (m, 3H), 3.69 - 3.54 (m, 11H), 3.37 - 3.35 (m, 1H), 3.25 - 3.22 (m, 1H), 2.95 - 2.89 (m, 1H), 2.86 - 2.76 (m, 3H), 1.85 - 1.75 (m, 1H).
(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-((2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에틸)티오)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (Cpd. No. 26567)
(2S,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디아세톡시프로필)-5-(2-아세톡시아세트아미도)-2-(메톡시카르보닐)테트라하이드로-2H-피란-2,4-디일 디아세테이트 ( 2 )의 합성
피리딘(10.0mL) 중 (1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1-((2R,3R,4S,6R)-4-아세톡시-3-(2-아세톡시아세트아미도)-6-하이드록시-6-(메톡시카르보닐)테트라하이드로-2H-피란-2-일)프로판-1,2-디일 디아세테이트(1, 0.70g, 0.99mmol)의 교반된 용액에 0℃에서 아세트산 무수물(0.188mL, 2.0mmol)을 점적 부가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하고 밤새 교반하였다. 완료 후, 휘발성재료를 진공 하에서 제거하여 조 걸쭉한 시럽을 얻었다. 걸쭉한 시럽을 에틸 아세테이트(20.0mL)와 함께 분별 깔대기에 붓고 1N HCl 용액에 이어 포화 황산나트륨 용액 및 DM 수로 세정했다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조하고 감압 하에 농축하여 조 걸쭉한 시럽을 얻었다. 걸쭉한 시럽을 컬럼 크로마토그래피(헥산 중 55-70% 에틸 아세테이트)를 통해 정제하여 (2S,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디아세톡시프로필)-5-(2-아세톡시아세트아미도)-2-(메톡시카르보닐)테트라하이드로-2H-피란-2,4-디일 디아세테이트(2)를 백색 고체로 얻었다. 수율: 0.50g, 67.39%; LCMS (ESI) m/z 743.27 [M+1]+.
(1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1-((2R,3R,4S,6R)-4-아세톡시-3-(2-아세톡시아세트아미도)-6-(메톡시카르보닐)-6-((2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에틸)티오)테트라하이드로-2H-피란-2-일)프로판-1,2-디일 디아세테이트 ( 4 )의 합성
불활성 분위기에서, (2S,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디아세톡시프로필)-5-(2-아세톡시아세트아미도)-2-(메톡시카르보닐)테트라하이드로-2H-피란-2,4-디일 디아세테이트(2, 0.50g, 0.673mmol) 및 2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에탄-1-티올(3, 0.215g, 1.35mmol)을 실온에서 교반하면서 건조 디클로로메탄(10.0mL)에 용해시켰다. 생성된 반응 용액에 활성화된 분말형 4Å 분자체(0.50g, 100% w/w)를 실온에서 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 30분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 0℃로 냉각시키고 BF3·Et2O(0.586mL, 2.02mmol)를 0℃에서 5분에 걸쳐 점적 부가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물을 중성 pH까지 트리에틸아민으로 켄칭하였다. 반응 혼합물을 여과하고 포화 수성 중탄산나트륨으로 세정하였다. 유기층을 분리하고 무수 황산나트륨으로 건조하고 회전 증발기에서 농축하여 조 걸쭉한 시럽을 얻었다. 걸쭉한 시럽을 컬럼 크로마토그래피(헥산 중 60-70% 에틸 아세테이트)를 통해 정제하여 (1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1-((2R,3R,4S,6R)-4-아세톡시-3-(2-아세톡시아세트아미도)-6-(메톡시카르보닐)-6-((2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에틸)티오)테트라하이드로-2H-피란-2-일)프로판-1,2-디일 디아세테이트(4)를 백색 고체로 얻었다. 수율: 0.30g, 52.86%; LCMS (ESI) m/z 843.91 [M+1]+.
(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-((2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에틸)티오)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (Cpd. No. 26567 )의 합성
0℃에서 메탄올(10.0mL) 중 (1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1-((2R,3R,4S,6R)-4-아세톡시-3-(2-아세톡시아세트아미도)-6-(메톡시카르보닐)-6-((2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에틸)티오)테트라하이드로-2H-피란-2-일) 프로판-1,2-디일 디아세테이트(4, 0.30g, 0.355mmol)의 교반된 용액에 수산화리튬(0.051g, 2.14mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하고 6시간 동안 교반하였다. 완료 후, Dowex-Hydrogen 형태를 중성 pH까지 첨가하고 반응 혼합물을 소결 깔때기를 통해 여과하였다. 여액을 진공 하에서 제거하여 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 22-48% 아세토니트릴)를 통해 정제된 조 걸쭉한 시럽을 얻었다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 (2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-((2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에틸)티오)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(Cpd. No. 26567)은 무정형 고체로 얻었다. 수율: 0.113g, 48.05%; LCMS (ESI) m/z 661.36 [M+1]+. 1H NMR (400 MHz, 메탄올-d 4) δ 7.88 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.61 - 7.57 (m, 4H), 7.44 - 7.29 (m, 5H), 4.26 (d, J = 10.4 Hz,1H), 4.17 - 4.15 (m, 3H), 4.03 (s, 2H), 3.90 - 3.83 (m, 2H), 3.63 - 3.56 (m, 9H), 3.41 - 3.34 (m, 2H), 2.85 - 2.81 (m, 3H), 2.47 (dd, J = 14.0, 4.8 Hz, 1H), 1.95 (t, J = 14.0 Hz, 1H).
(2R,4S,5R,6R)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-(2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에톡시)-6-((1R,2R)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (Cpd. No. 26591) 및 (2S,4S,5R,6R)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-(2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에톡시)-6-((1R,2R)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (Cpd. No. 26568)
(1S,2R)-1-((2R,3R,4S)-4-아세톡시-3-(2-아세톡시아세트아미도)-6-(메톡시카르보닐)-6-(2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-일)프로판-1,2,3-트리일 트리아세테이트 ( 3 )의 합성
디클로로메탄(32.0mL) 중 (1S,2R)-1-((2R,3R,4S,6R)-3-아세트아미도-4-아세톡시-6-(메톡시카르보닐)-6-(p-톨릴티오)테트라하이드로-2H-피란-2-일)프로판-1,2,3-트리일 트리아세테이트(1, 2.0g, 3.34mmol)의 교반된 용액에 2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에탄-1-올(2, 1.206g, 8.36mmol) 및 4Å MS(2.0g 100% w/w)를 첨가하였다. 생성된 현탁액을 질소 분위기 하에 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 -40℃로 냉각시킨 후, -40℃에서 N-요오도숙신이미드(1.882g, 8.36mmol) 및 트리플루오로메탄 설폰산(0.294mL, 3.34mmol)을 순차적으로 점적 부가하였다. 생성된 반응 혼합물을 -40℃에서 1시간 동안 교반하였다. 완료 후, 트리에틸아민을 중성 pH까지 첨가하고 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하였다. 여액을 감압 하에서 농축하여 조 잔사를 얻은 다음 컬럼 크로마토그래피(헥산 중 40-60% 에틸 아세테이트)로 정제하여 (1S,2R)-1-((2R,3R,4S)-4-아세톡시-3-(2-아세톡시아세트아미도)-6-(메톡시카르보닐)-6-(2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-일)프로판-1,2,3-트리일 트리아세테이트(3)를 아노머 혼합물로서 백섹 고체로 얻었다. 수율: 1.50g, 66.34%; LC-MS (ESI) m/z 676.14 [M+1]+.
(2R,4S,5R,6R)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-(2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에톡시)-6-((1R,2R)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (Cpd. No. 26591 ) 및 (2S,4S,5R,6R)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-(2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에톡시)-6-((1R,2R)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (Cpd. No. 26568 )의 합성
0℃에서 메탄올(20.0mL) 중 (1S,2R)-1-((2R,3R,4S)-4-아세톡시-3-(2-아세톡시아세트아미도)-6-(메톡시카르보닐)-6-(2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-일)프로판-1,2,3-트리일 트리아세테이트(3, 1.50g, 2.22mmol)의 교반된 용액에 수산화리튬(0.264g, 11.1mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하고 6시간 동안 교반하였다. 완료 후, Dowex-Hydrogen 형태를 중성 pH까지 첨가하고 반응 혼합물을 소결 깔때기를 통해 여과하였다. 여액을 진공 하에서 제거하여 조 걸쭉한 시럽을 얻은 다음 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 15-45% 아세토니트릴)를 통해 정제하였다. 원하는 생성물을 함유하는 분획(2개의 피크)을 조합하고 동결건조하여 (2R,4S,5R,6R)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-(2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에톡시)-6-((1R,2R)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(Cpd. No. 26591)을 백색 고체로 얻었다. 수율: 0.234g, 46.70%; ELSD-MS (ESI) m/z 452.2 [M+1]+. 1H NMR (400 MHz, 메탄올-d 4) δ 7.90 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.19 (d, J = 2.4 Hz, 2H), 4.03 (s, 2H), 3.94 - 3.90 (m, 1H), 3.86 - 3.79 (m, 4H), 3.70 - 3.51 (m, 10H), 3.34 - 3.31 (m, 1H), 2.83 (t, J = 2.4 Hz, 1H), 2.74 (dd, J = 11.8 & 4.4 Hz, 1H), 1.95 (t, J = 11.8 Hz, 1H); (2S,4S,5R,6R)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-(2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에톡시)-6-((1R,2R)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(Cpd. No. 26568)을 백색 고체로 얻었다. 수율: 0.268g, 53.48%; ELSD-MS (ESI) m/z 452.2 [M+1]+. 1H NMR (400 MHz, 메탄올-d 4) δ 7.81 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.20 (d, J = 2.4 Hz, 2H), 4.19 - 4.15 (m, 1H), 4.04 (s, 2H), 4.02 - 4.00 (m, 1H), 3.95 - 3.91 (m, 1H), 3.69 - 3.62 (m, 7H), 3.53 - 3.47 (m, 2H), 2.84 (t, J = 2.4 Hz, 1H), 2.39 (dd, J = 12.8 & 4.8 Hz, 1H), 1.95 (t, J = 12.0 Hz, 1H).
(2S,4S,5R,6R)-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-6-(부트-3-인-1-일옥시)-3,4,5-트리하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-일)메톡시)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-6-((1R,2R)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (Cpd. No. 26590)의 합성
(2R,3S,4S,5R,6R)-2-((((2R,4S,5R,6R)-4-아세톡시-5-(2-아세톡시아세트아미도)-2-(메톡시카르보닐)-6-((1S,2R)-1,2,3-트리아세톡시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)메틸)-6-(부트-3-인-1-일옥시)테트라하이드로-2H-피란-3,4,5-트리일 트리벤조에이트 ( 3 )의 합성
무수 디클로로메탄(18.0mL) 중 (1S,2R)-1-((2R,3R,4S,6S)-4-아세톡시-3-(2-아세톡시아세트아미도)-6-(메톡시카르보닐)-6-(p-톨릴티오)테트라하이드로-2H-피란-2-일)프로판-1,2,3-트리일 트리아세테이트(1, 1.0g, 1.53mmol)의 교반된 현탁액에 질소 분위기 하에 실온에서 15시간 동안 (2R,3R,4S,5S,6R)-2-(부트-3-인-1-일옥시)-6-(하이드록시메틸)테트라하이드로-2H-피란-3,4,5-트리일 트리벤조에이트(2, 2.08g, 3.81mmol) 및 활성화된 4Å 분말형 분자체(1.0g, 100% w/w)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 -40℃로 냉각시킨 후 -40℃에서 1-요오도피롤리딘-2,5-디온(0.823g, 3.66mmol) 및 트리플루오로메탄술폰산(0.134mL, 1.53mmol)을 첨가하였다. 반응물을 -40℃에서 1시간 동안 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물을 트리에틸 아민(0.1mL, 중성 pH)으로 켄칭하고 실온으로 가온하였다. 반응 혼합물을 소결 깔대기를 통해 여과하고 디클로로메탄으로 세정하였다. 여액을 중탄산나트륨의 포화 용액으로 세정하고 황산나트륨으로 건조하고 여과하고 감압 하에서 농축하여 조 잔사를 얻었다. 조 잔사를 컬럼 크로마토그래피(헥산 중 45-55% 에틸 아세테이트)를 통해 정제하여 (2R,3S,4S,5R,6R)-2-((((2R,4S,5R,6R)-4-아세톡시-5-(2-아세톡시아세트아미도)-2-(메톡시카르보닐)-6-((1S,2R)-1,2,3-트리아세톡시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)메틸)-6-(부트-3-인-1-일옥시)테트라하이드로-2H-피란-3,4,5-트리일 트리벤조에이트(3)를 회백색 고체로 얻었다. 수율: 0.60g, 36.56%; LCMS (ESI) m/z 1077.02 [M+1]+.
(2S,4S,5R,6R)-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-6-(부트-3-인-1-일옥시)-3,4,5-트리하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-일)메톡시)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-6-((1R,2R)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (Cpd. No. 26590 )의 합성
0℃에서 메탄올(10.0mL) 중 (2R,3S,4S,5R,6R)-2-((((2R,4S,5R,6R)-4-아세톡시-5-(2-아세톡시아세트아미도)-2-(메톡시카르보닐)-6-((1S,2R)-1,2,3-트리아세톡시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)메틸)-6-(부트-3-인-1-일옥시)테트라하이드로-2H-피란 -3,4,5-트리일 트리벤조에이트(3, 0.80g, 1.01mmol)의 교반된 용액에 수산화리튬(0.080g, 3.35mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온으로 가온하고 6시간 동안 교반하였다. 완료 후, Dowex-Hydrogen 형태를 반응 매스에 pH 6까지 첨가하였다. 반응 혼합물을 소결 깔때기를 통해 여과하고 여액을 진공 하에서 제거하여 조 걸쭉한 시럽을 얻은 다음 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 20-45% 아세토니트릴)를 통해 정제하였다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 (2S,4S,5R,6R)-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-6-(부트-3-인-1-일옥시)-3,4,5-트리하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-일)메톡시)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-6-((1R,2R)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(Cpd. No. 26590)을 TFA 염으로서 백색 고체로 얻었다. 수율: 0.053g, 17.62%; ELSD-MS (ESI) m/z 540.2 [M+1]+; 1H NMR (400 MHz, 메탄올-d 4) δ 4.26 (d, J = 7.2 Hz,1H), 4.17 - 4.12 (m, 1H), 4.04 - 4.01 (m, 3H), 3.95 - 3.63 (m, 10H), 3.53 - 3.47 (m, 4H), 2.51 (dt, J = 7.2 & 2.4 Hz, 2H), 2.40 (dd, J = 13.2 & 5.2 Hz, 1H), 2.62 (t, J = 2.4 Hz, 1H), 1.66 (t, J = 12.8 Hz, 1H).
퍼플루오로페닐 (S)-23-아지도-18-(4-아지도부틸)-17,20-디옥소-4,7,10,13-테트라옥사-16,19-디아자트리코사노에이트 (Cpd. No. 26594)
tert-부틸 (S)-23-아지도-18-(4-아지도부틸)-17,20-디옥소-4,7,10,13-테트라옥사-16,19-디아자트리코사노에이트 ( 3 )의 합성
메탄올(60.0mL) 중 tert-부틸 (S)-23-아미노-18-(4-아미노부틸)-17,20-디옥소-4,7,10,13-테트라옥사-16,19-디아자트리코사노에이트(1, 3.0g, 5.61mmol)의 교반된 용액에 탄산칼륨(2.32g, 16.85mmol), 황산구리(0.219g, 1.40mmol), 및 1H-이미다졸-1-술포닐 아지드 염산염(2, 2.57g, 12.3mmol)을 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물을 1N 염산 용액으로 pH 3까지 희석하고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 고진공 하에 농축하여 조 잔사를 얻었다. 조 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피(디클로로메탄 중 0-5% 메탄올)를 통해 정제하여 tert-부틸 (S)-23-아지도-18-(4-아지도부틸)-17,20-디옥소-4,7,10,13-테트라옥사-16,19-디아자트리코사노에이트(3)를 옅은 황색 점성 액체로 얻었다. 수율: 1.50g, 45%; ELSD m/z 587.3 [M+1]+.
(S)-23-아지도-18-(4-아지도부틸)-17,20-디옥소-4,7,10,13-테트라옥사-16,19-디아자트리코산산 ( 4 )의 합성
디클로로메탄(20.0mL) 중 tert-부틸 (S)-23-아지도-18-(4-아지도부틸)-17,20-디옥소-4,7,10,13-테트라옥사-16,19-디아자트리코사노에이트(3, 1.50g, 2.55mmol)의 교반된 용액에 트리플루오로아세트산(5.0mL)을 0℃에서 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 질소 하에 4시간 동안 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물을 농축하고 건조하여 (S)-23-아지도-18-(4-아지도부틸)-17,20-디옥소-4,7,10,13-테트라옥사-16,19-디아자트리코산산(4)은 옅은 황색 점성 액체로 얻었다. 수율: 1.30g, 96%; ELSD m/z 531.3 [M+1]+.
퍼플루오로페닐 (S)-23-아지도-18-(4-아지도부틸)-17,20-디옥소-4,7,10,13-테트라옥사-16,19-디아자트리코사노에이트 (Cpd. No. 26594 )의 합성
0℃에서 테트라하이드로푸란(20.0mL) 중 S)-23-아지도-18-(4-아지도부틸)-17,20-디옥소-4,7,10,13-테트라옥사-16,19-디아자트리코산산(4, 1.30g, 2.45mmol)의 교반된 용액에 2,3,4,5,6-펜타플루오로페놀(5, 0.897g, 4.90mmol) 및 N,N'-디이소프로필카르보디이미드(0.96mL, 6.13mmol)를 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 완료 후, 용매를 농축하여 잔사를 얻은 다음 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 30-70% 아세토니트릴)를 통해 정제했다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 퍼플루오로페닐 (S)-23-아지도-18-(4-아지도부틸)-17,20-디옥소-4,7,10,13-테트라옥사-16,19-디아자트리코사노에이트(Cpd. No. 26594)를 옅은 황색 점성 액체로 얻었다. 수율: 0.160g, 12%; ELSD m/z 697.4 [M+1]+; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.90 (bs, 1H), 6.35 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.46 - 4.41 (m, 1H), 3.90 (t, J = 12.4 Hz, 1H), 3.67 - 3.61 (m, 12H), 3.56 - 3.45 (m, 5H), 3.64 (t, J = 12.4 Hz, 2H), 3.28 (t, J = 12.4 Hz, 1H), 2.97 (t, J = 12.4 Hz, 2H), 2.42 (t, J = 14.4 Hz, 2H),1.95 - 1.75 (m, 4H), 1.61 - 1.37 (m, 4H).
퍼플루오로페닐 (18S,21S)-26-아지도-18,21-비스(4-아지도부틸)-17,20,23-트리옥소-4,7,10,13-테트라옥사-16,19,22-트리아자헥사코사노에이트 (Cpd. No. 26604)
tert-부틸 (18S,21S)-26-아지도-18,21-비스(4-아지도부틸)-17,20,23-트리옥소-4,7,10,13-테트라옥사-16,19,22-트리아자헥사코사노에이트 ( 3 )의 합성
메탄올(100.0mL) 중 tert-부틸 (18S,21S)-26-아미노-18,21-비스(4-아미노부틸)-17,20,23-트리옥소-4,7,10,13-테트라옥사-16,19,22-트리아자헥사코사노에이트(1, 4.0g, 6.03mmol)의 교반된 용액에 탄산칼륨(7.51g, 54.3mmol), 황산구리(0.452g, 1.81mmol), 및 1H-이미다졸-1-설포닐 아지드 염산염(2, 4.55g, 21.7mmol)을 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물을 1N 염산 용액으로 pH 3까지 희석하고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 고진공 하에 농축하여 조 잔사를 얻었다. 조 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피(디클로로메탄 중 0-5% 메탄올)를 통해 정제하여 tert-부틸 (18S,21S)-26-아지도-18,21-비스(4-아지도부틸)-17,20,23-트리옥소-4,7,10,13-테트라옥사-16,19,22-트리아자헥사코사노에이트(3)를 옅은 황색 점성 액체로 얻었다. 수율: 2.50g, 56%; ELSD m/z 741.4 [M+1]+.
(18S,21S)-26-아지도-18,21-비스(4-아지도부틸)-17,20,23-트리옥소-4,7,10,13-테트라옥사-16,19,22-트리아자헥사코산산 ( 4 )의 합성
디클로로메탄(30.0mL) 중 tert-부틸 (18S,21S)-26-아지도-18,21-비스(4-아지도부틸)-17,20,23-트리옥소-4,7,10,13-테트라옥사-16,19,22-트리아자헥사코사노에이트(3, 2.50g, 3.37mmol)의 교반된 용액에 0℃에서 트리플루오로아세트산(5.0mL)을 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 질소 하에 4시간 동안 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물을 농축하고 건조하여 (18S,21S)-26-아지도-18,21-비스(4-아지도부틸)-17,20,23-트리옥소-4,7,10,13-테트라옥사-16,19,22-트리아자헥사코산산(4)을 옅은 황색 점성 액체로 얻었다. 수율: 2.0g, 86%; ELSD m/z 685.3 [M+1]+.
퍼플루오로페닐 (18S,21S)-26-아지도-18,21-비스(4-아지도부틸)-17,20,23-트리옥소-4,7,10,13-테트라옥사-16,19,22-트리아자헥사코사노에이트 (Cpd. No . 26604 )의 합성
0℃에서 테트라하이드로푸란(20.0mL) 중 (18S,21S)-26-아지도-18,21-비스(4-아지도부틸)-17,20,23-트리옥소-4,7,10,13-테트라옥사-16,19,22-트리아자헥사코산산(4, 1.0g, 1.46mmol)의 교반된 용액에 N,N'-디이소프로필카르보디이미드(0.576mL, 3.65mmol)를 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 완료 후, 용매를 농축하여 잔사를 얻은 다음 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 20-55% 아세토니트릴)를 통해 정제했다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 퍼플루오로페닐 (18S,21S)-26-아지도-18,21-비스(4-아지도부틸)-17,20,23-트리옥소-4,7,10,13-테트라옥사-16,19,22-트리아자헥사코사노에이트(Cpd. No. 26604)를 옅은 황색 점성 액체로 얻었다. 수율: 0.270g, 21.7%; LCMS m/z 851.56 [M+1]+; 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.71 - 6.66 (m, 2H), 6.33 - 6.13 (m, 1H), 4.44 - 4.36 (m, 2H), 3.89 (t, J = 12.4 Hz, 1H), 3.67 - 3.61 (m, 12H), 3.56 - 3.54 (m, 2H), 3.47 - 3.44 (m, 2H), 3.37 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.28 - 3.24 (m, 4H), 2.96 (t, J = 12.4 Hz, 2H), 2.34 (t, J = 14.4 Hz, 2H), 1.96 - 1.80 (m, 4H), 1.67 - 1.59 (m, 6H), 1.43 - 1.36 (m, 4H).
(2R,4S,5R,6R)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-(2-(2-((1-(15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메톡시)에톡시)에톡시)-6-((1R,2R)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (Cpd. No. 26614)
(2R,4S,5R,6R)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-(2-(2-((1-(15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메톡시)에톡시)에톡시)-6-((1R,2R)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (Cpd. No. 26614 )의합성
교반 막대가 있는 1 드램 바이알에 NMP(0.3mL) 중 (2R,4S,5R,6R)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-(2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에톡시)-6-((1R,2R)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(26591, 1.00당량, 24.5mg, 0.0542mmol)의 용액에 NMP(0.3mL) 중 퍼플루오로페닐 1-아지도-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-오에이트(1, 1.10당량, 27.3mg, 0.0596mmol)의 용액 이어서 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(2.50당량, 50.5mg, 0.136mmol)을 첨가하였다. 생성된 투명한 녹색 용액을 캡핑하고 실온에서 10분 동안 교반하였다. 반응물을 아세트산으로 희석하고, 여과하고, 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 15-65% 아세토니트릴)를 통해 정제하였다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 (2R,4S,5R,6R)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-(2-(2-((1-(15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메톡시)에톡시)에톡시)-6-((1R,2R)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(Cpd. No. 26614)을 점성 백색 고체로 얻었다. 수율: 28.1mg, 57%;　LCMS m/z 909.6 [M+1]+;　1H NMR (300 MHz,　D2O를 갖는 DMSO-d 6) δ 7.99 (s, 1H), 7.80 (bs, 1H), 5.61 (bs, 1H), 4.52 - 4.40 (m, 4H), 3.87 - 2.69 (m, 35H), 1.56 - 1.43 (m, 2H).
(2R,2'R,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-2,2'-(((((((((S)-9,14,22-트리옥소-16-((15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)카르바모일)-3,6,25,28-테트라옥사-10,15,21-트리아자트리아콘탄-1,30-디일)비스(1H-1,2,3-트리아졸-1,4-디일))비스(메틸렌))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-6-((1R,2R)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산) (Cpd. No. 26615)
(2R,2'R,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-2,2'-(((((((((S)-9,14,22-트리옥소-16-((15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)카르바모일)-3,6,25,28-테트라옥사-10,15,21-트리아자트리아콘탄-1,30-디일)비스(1H-1,2,3-트리아졸-1,4-디일))비스(메틸렌))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-6-((1R,2R)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산) (Cpd. No. 26615 )의 합성
교반 막대가 있는 1 드램 바이알에 NMP(0.5mL) 중 퍼플루오로페닐 (R)-1-아지도-16-(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-9,14,17-트리옥소-3,6,21,24,27,30-헥사옥사-10,15,18-트리아자트리트리아콘탄-33-오에이트(26332, 1.00당량, 32.1mg, 0.0317mmol) 및 (2R,4S,5R,6R)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-(2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에톡시)-6-((1R,2R)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(26591, 2.10당량, 30.0mg, 0.0665mmol)의 용액에 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(5.00당량, 59.0mg, 0.158mmol)을 첨가하였다. 생성된 무색 용액을 캡핑하고 실온에서 10분 동안 교반하였다(천천히 녹색으로 변함). 반응물을 NMP 중 70% 아세트산의 혼합물로 희석하고, 여과하고, 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 15-65% 아세토니트릴)를 통해 정제하였다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 (2R,2'R,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-2,2'-(((((((((S)-9,14,22-트리옥소-16-((15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)카르바모일)-3,6,25,28-테트라옥사-10,15,21-트리아자트리아콘탄-1,30-디일)비스(1H-1,2,3-트리아졸-1,4-디일))비스(메틸렌))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-6-((1R,2R)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산)(Cpd. No. 26615)을 백색 고체로 얻었다. 수율: 32.9mg, 54%;　LCMS m/z 1917.5 [M+1]+;　1H NMR (300 MHz,　D2O를 갖는 DMSO-d 6) δ 7.98 (s, 2H), 7.82 (bs, 2H), 4.52 - 4.41 (m, 8H), 4.12 - 2.69 (m, 79H), 2.31 - 2.19 (m, 4H), 2.14 - 2.04 (m, 2H), 1.65 - 1.38 (m, 4H), 1.38 - 1.09 (m, 4H).
Cpd. No. 26616
Cpd. No. 26616 의 합성
교반 막대가 있는 1 드램 바이알에 NMP(0.5mL) 중 퍼플루오로페닐(16R,19R)-1-아지도-16,19-비스(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-9,14,17,20-테트라옥소-3,6,24,27,30,33-헥사옥사-10,15,18,21-테트라아자헥사트리아콘탄-36-오에이트(26333, 1.00당량, 32.3mg, 0.0224mmol) 및 ((2R,4S,5R,6R)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-(2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에톡시)-6-((1R,2R)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(26591, 3.10당량, 31.3mg, 0.0694mmol)의 용액에 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(7.50당량, 62.6mg, 0.168mmol)를 첨가하였다. 생성된 투명한 녹색 용액을 캡핑하고 실온에서 10분 동안 교반하였다. 반응물을 NMP 중 70% 아세트산의 혼합물로 희석하고 여과하고 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 15-65% 아세토니트릴)를 통해 정제했다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 Cpd. No. 26616을 백색 고체로 얻었다. 수율: 31.1mg, 52%;　LCMS m/z 1341.6 [M/2+1]+; 1H NMR (300 MHz,　D2O를 갖는 DMSO-d 6) δ 7.99 (s, 3H), 7.82 (bs, 3H), 4.53 - 4.41 (m, 12H), 4.15 - 2.70 (m, 107H), 2.31 - 2.19 (m, 6H), 2.14 - 2.04 (m, 2H), 1.66 - 1.38 (m, 8H), 1.38 - 1.08 (m, 8H).
퍼플루오로페닐 N2-(N2-(4-아지도부타노일)-N6-디아조-L-리실)-N6-디아조-L-리시네이트 (Cpd. No. 26634) 및 N2-(N2-(4-아지도부타노일)-N6-디아조-L-리실)-N6-디아조-L-라이신 (Cpd. No. 26728)
tert-부틸 N2-(N2-(4-아지도부타노일)-N6-디아조-L-리실)-N6-디아조-L-리시네이트 ( 3 )의 합성
메탄올(100.0mL) 중 tert-부틸(4-아미노부타노일)-L-리실-L-리시네이트(1, 5.0g, 12.0mmol)의 교반된 용액에 탄산칼륨(15.0g, 108mmol), 황산구리(0.901g, 3.61mmol), 및 1H-이미다졸-1-술포닐 아지드 염산염(2, 7.29g, 42.1mmol)을 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물을 1N 염산 용액으로 pH 3까지 희석하고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 고진공 하에 농축하여 조 잔사를 얻었다. 조 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피(헥산 중 30-50% 에틸 아세테이트)를 통해 정제하여 tert-부틸 N2-(N2-(4-아지도부타노일)-N6-디아조-L-리실)-N6-디아조-L-리시네이트(3)를 담황색 점성 액체로 얻었다. 수율: 1.80g, 30%; ELSD m/z 494.2 [M+1]+.
N2-(N2-(4-아지도부타노일)-N6-디아조-L-리실)-N6-디아조-L-라이신 (Cpd. No. 26728 )의 합성
0℃에서 디클로로메탄(10mL) 중 tert-부틸 N2-(N2-(4-아지도부타노일)-N6-디아조-L-리실)-N6-디아조-L-리시네이트(3, 1.0g, 2.03mmol)의 교반된 용액에 트리플루오로아세트산(3.0mL)을 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 질소 하에 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물을 농축하고 건조하여 N2-(N2-(4-아지도부타노일)-N6-디아조-L-리실)-N6-디아조-L-라이신(Cpd. No. 26728)을 담황색 점성 액체로 얻었다. 수율: 0.70g, 79%; ELSD m/z 438.2 [M+1]+, 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 12.58 (bs, 1H), 8.15 (d,　J　= 7.6 Hz, 1H), 8.00 (d,　J　= 8.4 Hz, 1H), 4.37 - 4.15 (m, 2H), 3.32 - 3.29 (m, 6H), 2.23 - 2.18 (m, 2H), 1.75 - 1.23 (m, 16 H).
퍼플루오로페닐 N2-(N2-(4-아지도부타노일)-N6-디아조-L-리실)-N6-디아조-L-리시네이트 (Cpd. No. 26634 )의 합성
0℃에서 테트라하이드로푸란(5.0mL) 중 N2-(N2-(4-아지도부타노일)-N6-디아조-L-리실)-N6-디아조-L-라이신(26728, 0.50g, 1.14mmol)의 교반된 용액에 2,3,4,5,6-펜타플루오로페놀(5, 0.421g, 2.29mmol) 및 N,N'-디이소프로필카르보디이미드(0.440mL, 2.86mmol)를 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 완료 후, 용매를 농축하여 잔사를 얻은 다음 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 30-65% 아세토니트릴)를 통해 정제했다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 퍼플루오로페닐 N2-(N2-(4-아지도부타노일)-N6-디아조-L-리실)-N6-디아조-L-리시네이트(Cpd. No. 26634)를 회백색 끈적 끈적한 고체로 얻었다. 수율: 0.080g, 11.5%; ELSD m/z 604.4 [M+1]+ 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 8.43 - 8.38 (m, 1H), 8.12 - 7.97 (m 1H), 4.62 - 4.59 (m, 1H), 4.48 - 4.47 (m, 1H), 2.24 - 2.19 (m, 3H), 1.78 - 1.23 (m, 19H).
(2S,4S,5R,6R)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-((2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에틸)티오)-6-((1R,2R)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (Cpd. No. 26635)
메틸 (2R,4S,5R,6R)-5-아미노-4-하이드록시-2-(p-톨릴티오)-6-((1R,2R)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실레이트 ( 2 )의 합성
메탄올(100.0mL) 중 (1S,2R)-1-((2R,3R,4S,6R)-3-아세트아미도-4-아세톡시-6-(메톡시카르보닐)-6-(p-톨릴티오)테트라하이드로-2H-피란-2-일)프로판-1,2,3-트리일 트리아세테이트(1, 10.0g, 16.73mmol)의 교반된 용액에 메탄 설폰산(6.52mL, 100.4mmol)을 0℃에서 점적 부가하였다. 생성된 반응 혼합물을 63℃에서 30시간 동안 교반하고 반응의 진행을 LC-MS로 모니터링하였다. 완료 후, 반응 혼합물을 0℃로 냉각시키고 트리에틸아민(~15.0mL, pH 7)으로 켄칭하였다. 혼합물을 감압 하에서 농축하여 조 메틸 (2R,4S,5R,6R)-5-아미노-4-하이드록시-2-(p-톨릴티오)-6-((1R,2R)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실레이트(2)를 밝은 갈색 젤로 얻었다. 수율: 6.0g, 92.6%; LC-MS (ESI) m/z 388.14 [M+1]+.
메틸 (2R,4S,5R,6R)-5-(2-아세톡시아세트아미도)-4-하이드록시-2-(p-톨릴티오)-6-((1R,2R)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실레이트 ( 4 )의 합성
불활성 분위기에서, 조 메틸 (2R,4S,5R,6R)-5-아미노-4-하이드록시-2-(p-톨릴티오)-6-((1R,2R)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실레이트(2, 6.0g, 15.49mmol)를 교반 하에 건조 테트라하이드로푸란(60.0mL)에 용해시키고 0℃에서 냉각시켰다. 이 용액에 트리에틸아민(6.34mL, 46.46mmol)에 이어서 2-클로로-2-옥소에틸 아세테이트(3, 1.66mL, 15.49mmol)를 0℃에서 천천히 첨가하였다; 반응물을 0℃에서 교반하고 진행을 TLC로 모니터링하였다. 완료 후, 혼합물을 감압 하에서 농축하여 조 잔사를 얻은 다음 컬럼 크로마토그래피(헥산 중 60-75% 에틸 아세테이트)를 통해 정제하여 메틸 (2R,4S,5R,6R)-5-(2-아세톡시아세트아미도)-4-하이드록시-2-(p-톨릴티오)-6-((1R,2R)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실레이트(4)를 백색 고체로 얻었다. 수율: 4.80g, 63.58%; LCMS (ESI) m/z 488.52 [M+1]+.
(1S,2R)-1-((2R,3R,4S,6R)-4-아세톡시-3-(2-아세톡시아세트아미도)-6-(메톡시카르보닐)-6-(p-톨릴티오)테트라하이드로-2H-피란-2-일)프로판-1,2,3-트리일 트리아세테이트 ( 5 )의 합성
피리딘(50.0mL) 중 메틸 (2R,4S,5R,6R)-5-(2-아세톡시아세트아미도)-4-하이드록시-2-(p-톨릴티오)-6-((1R,2R)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실레이트(4, 4.80g, 9.85mmol)의 교반된 용액에 아세트산 무수물(9.31mL, 98.46mmol)을 0℃에서 30분에 걸쳐 점적 부가하였다. 반응 혼합물을 밤새 교반하고 실온으로 가온하였다. 반응의 진행을 TLC 및 LC-MS로 모니터링하였다. 완료 후, 휘발성재료를 진공 하에서 제거하여 조 걸쭉한 시럽을 얻었다. 걸쭉한 시럽을 에틸 아세테이트(240.0mL)와 함께 분별 깔대기에 붓고 1N HCl 용액으로 세정한 후 포화 황산나트륨 용액 및 DM 수로 세정했다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조하고 감압 하에 농축하여 조 걸쭉한 시럽을 얻었다. 시럽을 컬럼 크로마토그래피(헥산 중 60-70% 에틸 아세테이트)를 통해 정제하여 (1S,2R)-1-((2R,3R,4S,6R)-4-아세톡시-3-(2-아세톡시아세트아미도)-6-(메톡시카르보닐)-6-(p-톨릴티오)테트라하이드로-2H-피란-2-일)프로판-1,2,3-트리일 트리아세테이트(5)를 백색 고체로 얻었다. 수율: 3.40g, 52.67%; LCMS (ESI) m/z 654.2 [M-1]
Figure pct00153
.
(1S,2R)-1-((2R,3R,4S,6S)-4-아세톡시-3-(2-아세톡시아세트아미도)-6-하이드록시-6-(메톡시카르보닐)테트라하이드로-2H-피란-2-일)프로판-1,2,3-트리일 트리아세테이트 ( 6 )의 합성
아세톤:물(9:1, 35.0mL) 중 (1S,2R)-1-((2R,3R,4S,6R)-4-아세톡시-3-(2-아세톡시아세트아미도)-6-(메톡시카르보닐)-6-(p-톨릴티오)테트라하이드로-2H-피란-2-일)프로판-1,2,3-트리일 트리아세테이트(5, 3.40g, 5.19mmol)의 교반된 용액을 0℃로 냉각시켰다. 이 용액에 N-요오도석신이미드(4.08g, 18.15mmol)를 첨가하고 반응 혼합물을 0℃에서 3시간 동안 유지하였다. 반응 진행을 LC-MS/TLC로 모니터링하고 완료 후 메타중황화나트륨의 포화 수성 용액(10.0mL) 및 에틸 아세테이트(30.0mL)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 추가 10분 동안 교반하고 분별 깔때기로 옮겼다. 유기층을 분리하고 수성상을 에틸 아세테이트(20mL)로 추출하였다. 유기층을 조합하고 포화 중탄산나트륨 용액 및 DM 수로 순차적으로 세정하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조하고 회전식 증발기에서 농축하여 걸쭉한 시럽을 얻었다. 걸쭉한 시럽을 컬럼 크로마토그래피(헥산 중 55-65% 에틸 아세테이트)를 통해 정제하여 (1S,2R)-1-((2R,3R,4S,6S)-4-아세톡시-3-(2-아세톡시아세트아미도)-6-하이드록시-6-(메톡시카르보닐)테트라하이드로-2H-피란-2-일)프로판-1,2,3-트리일 트리아세테이트(6)를 백색 고체로 얻었다. 수율: 1.90g, 66.68%; LCMS (ESI) m/z 550.48 [M+1]+.
(1S,2R)-1-((2R,3R,4S,6R)-4,6-디아세톡시-3-(2-아세톡시아세트아미도)-6-(메톡시카르보닐)테트라하이드로-2H-피란-2-일)프로판-1,2,3-트리일 트리아세테이트 ( 7 )의 합성
피리딘(20.0mL) 중 (1S,2R)-1-((2R,3R,4S,6S)-4-아세톡시-3-(2-아세톡시아세트아미도)-6-하이드록시-6-(메톡시카르보닐)테트라하이드로-2H-피란-2-일)프로판-1,2,3-트리일 트리아세테이트(6, 1.90g, 3.46mmol)의 교반된 용액에 아세트산 무수물(0.653mL, 6.92mmol)을 0℃에서 30분에 걸쳐 점적 부가하였다. 반응 혼합물을 밤새 교반하고 실온으로 가온하였다. 반응의 진행을 TLC 및 LC-MS로 모니터링하였다. 완료 후, 휘발성재료를 진공 하에서 제거하여 조 걸쭉한 시럽을 얻었다. 이어서 걸쭉한 시럽을 에틸 아세테이트(30.0mL)와 함께 분별 깔때기에 붓고 1N HCl 용액에 이어서 포화 황산나트륨 용액 및 DM 수로 세정하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조하고 감압 하에 농축하여 조 걸쭉한 시럽을 얻었다. 시럽을 컬럼 크로마토그래피(헥산 중 45-55% 에틸 아세테이트)를 통해 정제하여 (1S,2R)-1-((2R,3R,4S,6R)-4,6-디아세톡시-3-(2-아세톡시아세트아미도)-6-(메톡시카르보닐)테트라하이드로-2H-피란-2-일)프로판-1,2,3-트리일 트리아세테이트(7)를 백색 고체로 얻었다. 수율: 1.50g, 73.34%; LCMS (ESI) m/z 591.52 [M+1]+.
(1S,2R)-1-((2R,3R,4S,6R)-4-아세톡시-3-(2-아세톡시아세트아미도)-6-(메톡시카르보닐)-6-((2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에틸)티오)테트라하이드로-2H-피란-2-일)프로판-1,2,3-트리일 트리아세테이트 ( 9 )의 합성
불활성 분위기에서, (1S,2R)-1-((2R,3R,4S,6R)-4,6-디아세톡시-3-(2-아세톡시아세트아미도)-6-(메톡시카르보닐)테트라하이드로-2H-피란-2-일)프로판-1,2,3-트리일 트리아세테이트(7, 1.0g, 1.69mmol) 및 2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에탄-1-티올(8, 1.35g, 8.45mmol)을 실온에서 교반 하에 건조 디클로로메탄(10.0mL)에 용해시켰다. 이 용액에 활성화된 분말형 4Å 분자체(1.0g 100% w/w)를 실온에서 첨가하고 반응 혼합물을 30분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 0℃로 냉각하고 BF3·Et2O(1.50mL, 5.07mmol)를 0℃에서 15분에 걸쳐 점적 부가하였다. 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 TLC/LC-MS로 모니터링하고 완료 후 반응 혼합물을 중성 pH까지 트리에틸아민에 의해 켄칭하였다. 반응 혼합물을 여과하고 포화 수성 중탄산나트륨 용액으로 세정하였다. 유기층을 분리하고 무수 황산나트륨으로 건조하고 회전 증발기에서 농축하여 조 걸쭉한 시럽을 얻었다. 걸쭉한 시럽을 컬럼 크로마토그래피(헥산 중 60-70% 에틸 아세테이트)를 통해 정제하여 (1S,2R)-1-((2R,3R,4S,6R)-4-아세톡시-3-(2-아세톡시아세트아미도)-6-(메톡시카르보닐)-6-((2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에틸)티오)테트라하이드로-2H-피란-2-일)프로판-1,2,3-트리일 트리아세테이트(9)를 백색 고체로 얻었다. 수율: 0.70g, 59.86%; LCMS (ESI) m/z 692.70 [M+1]+.
(2R,4S,5R,6R)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-((2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에틸)티오)-6-((1R,2R)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 ( Cpd. No. 26635 )의 합성
0℃에서 메탄올(10.0mL) 중 (1S,2R)-1-((2R,3R,4S,6R)-4-아세톡시-3-(2-아세톡시아세트아미도)-6-(메톡시카르보닐)-6-((2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에틸)티오)테트라하이드로-2H-피란-2-일)프로판-1,2,3-트리일 트리아세테이트(9, 0.70g, 1.01mmol)의 교반된 용액에 수산화리튬(0.072g, 3.04mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 6시간 동안 교반하고 실온으로 가온하였다. 반응의 진행을 TLC 및 LC-MS로 모니터링하였다. 완료 후 Dowex-Hydrogen 형태를 중성 pH까지 첨가하고 반응 혼합물을 소결 깔때기를 통해 여과하였다. 여액을 진공 하에서 제거하여 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 20-45% 아세토니트릴)를 통해 정제된 조 걸쭉한 시럽을 얻었다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 (2R,4S,5R,6R)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-((2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에틸)티오)-6-((1R,2R)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(Cpd. No. 26635)을 무정형 고체로 얻었다. 수율: 0.078g, 16.49%; LCMS (ESI) m/z 468.28 [M+1]+. 1H NMR (400 MHz, 메탄올-d 4) δ 4.26 (d, J = 10.4 Hz,1H), 4.18 (d, J = 2.4 Hz, 2H), 4.14 (dd, J = 10.4 & 4.8 Hz, 2H), 4.04 (s, 2H), 3.90 (t, J = 10.4 Hz, 2H), 3.82 - 3.78 (m, 2H), 3.68 - 3.52 (m, 8H), 2.87 - 2.83 (m, 3H), 2.48 (dd, J = 14.0, 4.8 Hz, 1H), 1.95 (t, J = 14.0 Hz, 1H).
N2-(4-아지도부타노일)-N6-디아조-L-라이신 (Cpd. No. 26727)
tert-부틸 N2-(4-아지도부타노일)-N6-디아조-L-리시네이트 ( 3 )의 합성
메탄올(40.0mL) 중 tert-부틸(4-아미노부타노일)-L-리시네이트(1, 2.4g, 8.35mmol)의 교반된 용액에 탄산칼륨(6.92g, 50.1mmol), 황산구리(0.417g, 1.67mmol), 및 1H-이미다졸-1-술포닐 아지드 염산염(2, 3.61g, 20.9mmol)을 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물을 1N 염산 용액으로 pH 3까지 희석하고 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 고진공 하에 농축하여 조 잔사를 얻었다. 조 잔사를 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(헥산 중 30-50% 에틸 아세테이트)를 통해 정제하여 tert-부틸 N2-(4-아지도부타노일)-N6-디아조-L-리시네이트(3)를 담황색 점성 액체로 얻었다. 수율: 1.0g, 35%; ELSD m/z 340.5 [M+1]+.
N2-(4-아지도부타노일)-N6-디아조-L-라이신 (Cpd. No. 26727 )의 합성
디클로로메탄(10.0mL) 중 tert-부틸 N2-(4-아지도부타노일)-N6-디아조-L-리시네이트(3, 1.0g, 2.95mmol)의 교반된 용액에 트리플루오로아세트산(2.0mL)을 0℃에서 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 질소 하에 4시간 동안 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물을 농축하고 건조하여 N2-(4-아지도부타노일)-N6-디아조-L-라이신(Cpd. No. 26727)을 담황색 점성 액체로 얻었다. 수율: 0.80g, 95%; ELSD m/z 284.0 [M+1]+. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 12.08 (bs, 1H), 8.14 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.19 - 4.13 (m, 1H), 3.33 - 3.29 (m, 4H), 2.22 (t, J = 14.4 Hz, 2H), 1.78 - 1.33 (m, 8H).
(2S,4S,5R,6R)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-((2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에틸)티오)-6-((1R,2R)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (Cpd. No. 26729)
메틸 (2R,4S,5R,6R)-5-아미노-4-하이드록시-2-(p-톨릴티오)-6-((1R,2R)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실레이트 ( 2 )의 합성
메탄올(150.0mL) 중 (1S,2R)-1-((2R,3R,4S,6R)-4-아세톡시-3-(2-아세톡시아세트아미도)-6-하이드록시-6-(메톡시카르보닐)테트라하이드로-2H-피란-2-일)프로판-1,2,3-트리일 트리아세테이트(1, 1.0g, 1.82mmol)의 교반된 용액에 0℃에서 무수 메탄올(0.6mL)을 점적 부가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하고 반응의 진행을 TLC로 모니터링하였다. 완료 후, 반응 혼합물을 감압 하에서 농축하여 조 (1S,2R)-1-((2R,3R,4S,6R)-4-아세톡시-3-(2-아세톡시아세트아미도)-6-클로로-6-(메톡시카르보닐)테트라하이드로-2H-피란-2-일)프로판-1,2,3-트리일 트리아세테이트(2)를 밝은 갈색 젤로 얻었다. 수율: 1.0 g; LC-MS (ESI) m/z 550.48 [M+1]+.
(1S,2R)-1-((2R,3R,4S,6S)-4-아세톡시-3-(2-아세톡시아세트아미도)-6-(아세틸티오)-6-(메톡시카르보닐)테트라하이드로-2H-피란-2-일)프로판-1,2,3-트리일 트리아세테이트 ( 3 )의 합성
불활성 분위기에서, 건조 아세톤(20.0mL) 중 조 (1S,2R)-1-((2R,3R,4S,6R)-4-아세톡시-3-(2-아세톡시아세트아미도)-6-클로로-6-(메톡시카르보닐)테트라하이드로-2H-피란-2-일)프로판-1,2,3-트리일 트리아세테이트(2, 1.0g, 1.76mmol)용액을 0℃에서 교반하였다. 이 용액에 포타슘 티오아세테이트(0.603g, 5.28mmol)를 0℃에서 점적 부가하였다; 반응물을 0℃에서 3시간 동안 교반하고 진행을 TLC로 모니터링하였다. 완료 후, 혼합물을 감압 하에서 농축하여 조 잔사를 얻었다. 조 잔사를 에틸 아세테이트에 용해시키고 생성된 용액을 1N HCl에 이어서 DM 수로 세정하였다. 유기층을 분리하고 무수 황산나트륨으로 건조하고 황산나트륨으로 건조하고 회전식 증발기에서 농축하여 걸쭉한 잔사를 얻었다. 잔사를 컬럼 크로마토그래피(헥산 중 70-80% 에틸 아세테이트)로 정제하여 (1S,2R)-1-((2R,3R,4S,6S)-4-아세톡시-3-(2-아세톡시아세트아미도)-6-(아세틸티오)-6-(메톡시카르보닐)테트라하이드로-2H-피란-2-일)프로판-1,2,3-트리일 트리아세테이트(3)를 백색 고체로 얻었다. 수율: 0.780g, 72.91%; LCMS (ESI) m/z 685.8 [M+1]+.
(2S,4S,5R,6R)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-((2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에틸)티오)-6-((1R,2R)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 ( Cpd. No. 26729 )의 합성
메탄올(10.0mL) 중 (1S,2R)-1-((2R,3R,4S,6S)-4-아세톡시-3-(2-아세톡시아세트아미도)-6-(아세틸티오)-6-(메톡시카르보닐)테트라하이드로-2H-피란-2-일)프로판-1,2,3-트리일 트리아세테이트(3, 0.78g, 1.28mmol)의 교반된 용액에 나트륨 티오메톡시드(0.107g, 1.54mmol)를 0℃에서 첨가하였다. 생성된 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 반응물에 1-요오도-2-[2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시]에탄(3a, 0.652g, 2.57mmol)을 0℃에서 첨가하고 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응을 LCMS로 모니터링하였다. 완료 후, 동일한 반응 매스에 실온에서 수산화리튬(0.092g, 3.85mmol)을 첨가하고 반응물을 실온에서 6시간 동안 교반하였다. 반응의 진행을 LC-MS로 모니터링하고 완료 후 Dowex-Hydrogen 형태를 pH 6까지 첨가하고 반응 매스를 소결 깔대기를 통해 여과하였다. 여액을 회전식 증발기에서 농축하여 걸쭉한 잔사를 얻은 다음 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 20-45% 아세토니트릴)를 통해 정제했다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 (2S,4S,5R,6R)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-((2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에틸)티오)-6-((1R,2R)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(Cpd. No. 26729)을 황색 반-고체로 얻었다. 수율: 0.140g, 23.33%; ELSD-MS (ESI) m/z 468.2 [M+1]+. 1H NMR (400 MHz, 메탄올-d 4) δ 7.96 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.18 (d, J = 2.4 Hz,1H), 4.02 (s, 2H), 3.90 - 3.81 (m, 4H), 3.72 - 3.57 (m, 8H), 3.52 - 3.50 (m, 1H), 3.34 (s, 1H), 2.97 - 2.77 (m, 4H), 1.82 - 1.76 (t, J=10.8 Hz, 1H).
실시예 5: 추가의 접합가능한 Siglec 리간드의 합성
(2R,4R,5S,6S)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-((2-(2-((1-(15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메톡시)에톡시)에틸)티오)-6-((1S,2S)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (실시예 1)
(2R,4R,5S,6S)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-((2-(2-((1-(15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메톡시)에톡시)에틸)티오)-6-((1S,2S)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 ( 실시예 1 )의 합성
1드램 바이알에 NMP(0.3mL) 중 (2R,4R,5S,6S)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-((2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에틸)티오)-6-((1S,2S)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(26729, 1.00당량)의 교반된 용액에 NMP(0.3mL) 중 퍼플루오로페닐 1-아지도-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-오에이트(1, 1.10당량)의 용액 이어서 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(2.50당량)을 첨가한다. 생성된 용액을 캡핑하고 실온에서 10분 동안 교반한다. 반응물을 아세트산으로 희석하고, 여과하고, 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 15-65% 아세토니트릴)를 통해 정제한다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 (2R,4R,5S,6S)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-((2-(2-((1-(15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메톡시)에톡시)에틸)티오)-6-((1S,2S)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(실시예 1)을 얻었다.
(2R,2'R,4R,4'R,5S,5'S,6S,6'S)-2,2'-(((((((((R)-9,14,22-트리옥소-16-((15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)카르바모일)-3,6,25,28-테트라옥사-10,15,21-트리아자트리아콘탄-1,30-디일)비스(1H-1,2,3-트리아졸-1,4-디일))비스(메틸렌))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(술판디일))비스(4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-6-((1S,2S)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산) (실시예 2)
의합성 (2R,2'R,4R,4'R,5S,5'S,6S,6'S)-2,2'-(((((((((R)-9,14,22-트리옥소-16-((15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)카르바모일)-3,6,25,28-테트라옥사-10,15,21-트리아자트리아콘탄-1,30-디일)비스(1H-1,2,3-트리아졸-1,4-디일))비스(메틸렌))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(술판디일))비스(4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-6-((1S,2S)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산) ( 실시예 2 )
1 드램 바이알에 NMP(0.5mL) 중 퍼플루오로페닐 (R)-1-아지도-16-(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-9,14,17-트리옥소-3,6,21,24,27,30-헥사옥사-10,15,18-트리아자트리아콘탄-33-오에이트(26332, 1.00당량) 및 (2R,4R,5S,6S)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-((2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에틸)티오)-6-((1S,2S)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(26729, 2.10당량)의 교반된 용액에 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(5.00당량)를 첨가한다. 생성된 용액을 캡핑하고 실온에서 10분 동안 교반한다. 반응물을 NMP 중 70% 아세트산의 혼합물로 희석하고, 여과하고, 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 15-65% 아세토니트릴)를 통해 정제한다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 (2R,2'R,4R,4'R,5S,5'S,6S,6'S)-2,2'-(((((((((R)-9,14,22-트리옥소-16-((15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)카르바모일)-3,6,25,28-테트라옥사-10,15,21-트리아자트리아콘탄-1,30-디일)비스(1H-1,2,3-트리아졸-1,4-디일))비스(메틸렌))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(술판디일))비스(4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-6-((1S,2S)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산)(실시예 2)을 얻었다.
실시예 3
실시예 3 의 합성
1 드램 바이알에 NMP (0.5mL) 중 퍼플루오로페닐 (16R,19R)-1-아지도-16,19-비스(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-9,14,17,20-테트라옥소-3,6,24,27,30,33-헥사옥사-10,15,18,21-테트라아자헥사트리아콘탄-36-오에이트(26333, 1.00당량) 및 (2R,4R,5S,6S)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-((2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에틸)티오)-6-((1S,2S)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (26729, 3.10당량)의 교반된 용액에 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(7.50당량)를 첨가한다. 생성된 용액을 캡핑하고 실온에서 10분 동안 교반한다. 반응물을 NMP 중 70% 아세트산의 혼합물로 희석하고, 여과하고, 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 15-65% 아세토니트릴)를 통해 정제한다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 실시예 3을 얻는다.
(2R,4S,5R,6R)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-((2-(2-((1-(15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메톡시)에톡시)에틸)티오)-6-((1R,2R)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (실시예 4)
(2R,4S,5R,6R)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-((2-(2-((1-(15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메톡시)에톡시)에틸)티오)-6-((1R,2R)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 ( 실시예 4 )의 합성
1 드램 바이알에 NMP(0.3mL) 중 (2R,4S,5R,6R)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-((2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에틸)티오)-6-((1R,2R)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(26635, 1.00당량)의 교반된 용액에 NMP(0.3mL) 중 퍼플루오로페닐 1-아지도-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-오에이트(1, 1.10당량) 용액, 이어서 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(2.50당량)를 첨가한다. 생성된 용액을 캡핑하고 실온에서 10분 동안 교반한다. 반응물을 아세트산으로 희석하고, 여과하고, 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 15-65% 아세토니트릴)를 통해 정제한다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 (2R,4S,5R,6R)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-((2-(2-((1-(15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메톡시)에톡시)에틸)티오)-6-((1R,2R)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(실시예 4)을 수득한다.
(2R,2'R,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-2,2'-(((((((((S)-9,14,22-트리옥소-16-((15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)카르바모일)-3,6,25,28-테트라옥사-10,15,21-트리아자트리아콘탄-1,30-디일)비스(1H-1,2,3-트리아졸-1,4-디일))비스(메틸렌))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(술판디일))비스(4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-6-((1R,2R)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산) (실시예 5)
(2R,2'R,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-2,2'-(((((((((S)-9,14,22-트리옥소-16-((15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)카르바모일)-3,6,25,28-테트라옥사-10,15,21-트리아자트리아콘탄-1,30-디일)비스(1H-1,2,3-트리아졸-1,4-디일))비스(메틸렌))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(술판디일))비스(4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-6-((1R,2R)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산) ( 실시예 5 )의 합성
1 드램 바이알에 NMP(0.5mL) 중 퍼플루오로페닐 (R)-1-아지도-16-(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-9,14,17-트리옥소-3,6,21,24,27,30-헥사옥사-10,15,18-트리아자트리아콘탄-33-오에이트(26332, 1.00당량) 및 (2R,4S,5R,6R)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-((2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에틸)티오)-6-((1R,2R)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(26635, 2.10당량)의 교반된 용액에 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(5.00당량)를 첨가한다. 생성된 용액을 캡핑하고 실온에서 10분 동안 교반한다. 반응물을 NMP 중 70% 아세트산의 혼합물로 희석하고, 여과하고, 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 15-65% 아세토니트릴)를 통해 정제한다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 (2R,2'R,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-2,2'-(((((((((S)-9,14,22-트리옥소-16-((15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)카르바모일)-3,6,25,28-테트라옥사-10,15,21-트리아자트리아콘탄-1,30-디일)비스(1H-1,2,3-트리아졸-1,4-디일))비스(메틸렌))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(술판디일))비스(4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-6-((1R,2R)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산)(실시예 5)을 얻었다.
실시예 6
실시예 6 의 합성
1 드램 바이알의 NMP(0.5mL) 중 퍼플루오로페닐(16R,19R)-1-아지도-16,19-비스(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-9,14,17,20-테트라옥소-3,6,24,27,30,33-헥사옥사-10,15,18,21-테트라아자헥사트리아콘탄-36-오에이트(26333, 1.00당량) 및 (2R,4S,5R,6R)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-((2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에틸)티오)-6-((1R,2R)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(26635, 3.10당량)의 교반된 용액에 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(7.50당량)를 첨가한다. 생성된 용액을 캡핑하고 실온에서 10분 동안 교반한다. 반응물을 NMP 중 70% 아세트산의 혼합물로 희석하고, 여과하고, 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 15-65% 아세토니트릴)를 통해 정제한다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 실시예 6을 얻었다.
(2RS,4RS,5SR,6SR)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-트리하이드록시-6-(2-(1-(15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-일)메톡시)-6-((1SR,2SR)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (실시예 7)
(2RS,4RS,5SR,6SR)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-트리하이드록시-6-(2-(1-(15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-일)메톡시)-6-((1SR,2SR)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 ( 실시예 7 )의 합성
1 드램 바이알에 NMP(0.3mL) 중 (2RS,4RS,5SR,6SR)-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-6-(부트-3-인-1-일옥시)-3,4,5-트리하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-일)메톡시)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-6-((1SR,2SR)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(26590, 1.00당량)의 교반된 용액에 NMP(0.3mL) 중 퍼플루오로페닐 1-아지도-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-오에이트(1, 1.10당량)의 용액 이어서 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(2.50당량)을 첨가한다. 생성된 용액을 캡핑하고 실온에서 10분 동안 교반한다. 반응물을 아세트산으로 희석하고, 여과하고, 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 15-65% 아세토니트릴)를 통해 정제한다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 (2RS,4RS,5SR,6SR)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-트리하이드록시-6-(2-(1-(15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-일)메톡시)-6-((1SR,2SR)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(실시예 7)을 얻었다.
(2RS,2'RS,4RS,4'RS,5SR,5'SR,6SR,6'SR)-2,2'-((((2R,2'R,3R,3'R,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-(((((RS)-9,14,22-트리옥소-16-((15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)카르바모일)-3,6,25,28-테트라옥사-10,15,21-트리아자트리아콘탄-1,30-디일)비스(1H-1,2,3-트리아졸-1,4-디일))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(3,4,5-트리하이드록시테트라하이드로-2H-피란-6,2-디일))비스(메틸렌))비스(옥시))비스(4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-6-((1SR,2SR)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산) (실시예 8)
(2RS,2'RS,4RS,4'RS,5SR,5'SR,6SR,6'SR)-2,2'-((((2R,2'R,3R,3'R,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-(((((RS)-9,14,22-트리옥소-16-((15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)카르바모일)-3,6,25,28-테트라옥사-10,15,21-트리아자트리아콘탄-1,30-디일)비스(1H-1,2,3-트리아졸-1,4-디일))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(3,4,5-트리하이드록시테트라하이드로-2H-피란-6,2-디일))비스(메틸렌))비스(옥시))비스(4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-6-((1SR,2SR)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산) ( 실시예 8 )의 합성
1 드램 바이알에 NMP(0.5mL) 중 퍼플루오로페닐 (R)-1-아지도-16-(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-9,14,17-트리옥소-3,6,21,24,27,30-헥사옥사-10,15,18-트리아자트리트리아콘탄-33-오에이트(26332, 1.00당량) 및 (2RS,4RS,5SR,6SR)-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-6-(부트-3-인-1-일옥시)-3,4,5-트리하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-일)메톡시)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-6-((1SR,2SR)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(26590, 2.10당량)의 교반된 용액에 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(5.00당량)를 첨가하였다. 생성된 용액을 캡핑하고 실온에서 10분 동안 교반한다. 반응물을 NMP 중 70% 아세트산의 혼합물로 희석하고, 여과하고, 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 15-65% 아세토니트릴)를 통해 정제한다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 (2RS,2'RS,4RS,4'RS,5SR,5'SR,6SR,6'SR)-2,2'-((((2R,2'R,3R,3'R,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-(((((RS)-9,14,22-트리옥소-16-((15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)카르바모일)-3,6,25,28-테트라옥사-10,15,21-트리아자트리아콘탄-1,30-디일)비스(1H-1,2,3-트리아졸-1,4-디일))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(3,4,5-트리하이드록시테트라하이드로-2H-피란-6,2-디일))비스(메틸렌))비스(옥시))비스(4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-6-((1SR,2SR)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산)(실시예 8)을 얻었다.
실시예 9
실시예 9 의 합성
1 드램 바이알에 NMP(0.5mL) 중 퍼플루오로페닐 (16R,19R)-1-아지도-16,19-비스(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-9,14,17,20-테트라옥소-3,6,24,27,30,33-헥사옥사-10,15,18,21-테트라아자헥사트리아콘탄-36-오에이트(26333, 1.00당량) 및 (2RS,4RS,5SR,6SR)-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-6-(부트-3-인-1-일옥시)-3,4,5-트리하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-일)메톡시)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-6-((1SR,2SR)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(26590, 3.10당량)의 교반된 용액에 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(7.50당량)를 첨가하였다. 생성된 용액을 캡핑하고 실온에서 10분 동안 교반한다. 반응물을 NMP 중 70% 아세트산의 혼합물로 희석하고, 여과하고, 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 15-65% 아세토니트릴)를 통해 정제한다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 실시예 9를 얻었다.
(2R,4R,5S,6S)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-(2-(2-((1-(15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메톡시)에톡시)에톡시)-6-((1S,2S)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (실시예 10)
(2R,4R,5S,6S)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-(2-(2-((1-(15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메톡시)에톡시)에톡시)-6-((1S,2S)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 ( 실시예 10 )의 합성
1 드램 바이알에 NMP(0.3mL) 중 (2R,4R,5S,6S)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-(2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에톡시)-6-((1S,2S)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(26568, 1.00당량)의 교반된 용액에 NMP(0.3mL) 중 퍼플루오로페닐 1-아지도-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-오에이트(1, 1.10당량)의 용액 이어서 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(2.50당량)를 첨가한다. 생성된 용액을 캡핑하고 실온에서 10분 동안 교반한다. 반응물을 아세트산으로 희석하고, 여과하고, 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 15-65% 아세토니트릴)를 통해 정제한다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 (2R,4R,5S,6S)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-(2-(2-((1-(15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메톡시)에톡시)에톡시)-6-((1S,2S)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(실시예 10)을 얻었다.
(2R,2'R,4R,4'R,5S,5'S,6S,6'S)-2,2'-(((((((((R)-9,14,22-트리옥소-16-((15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)카르바모일)-3,6,25,28-테트라옥사-10,15,21-트리아자트리아콘탄-1,30-디일)비스(1H-1,2,3-트리아졸-1,4-디일))비스(메틸렌))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-6-((1S,2S)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산) (실시예 11)
(2R,2'R,4R,4'R,5S,5'S,6S,6'S)-2,2'-(((((((((R)-9,14,22-트리옥소-16-((15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)카르바모일)-3,6,25,28-테트라옥사-10,15,21-트리아자트리아콘탄-1,30-디일)비스(1H-1,2,3-트리아졸-1,4-디일))비스(메틸렌))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-6-((1S,2S)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산)( 실시예 11 )의 합성
1 드램 바이알에 NMP(0.5mL) 중 퍼플루오로페닐 (R)-1-아지도-16-(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-9,14,17-트리옥소-3,6,21,24,27,30-헥사옥사-10,15,18-트리아자트리트리아콘탄-33-오에이트(26332, 1.00당량) 및 (2R,4R,5S,6S)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-(2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에톡시)-6-((1S,2S)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(26568, 2.10당량)의 교반된 용액에 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(5.00당량)를 첨가한다. 생성된 용액을 캡핑하고 실온에서 10분 동안 교반한다. 반응물을 NMP 중 70% 아세트산의 혼합물로 희석하고, 여과하고, 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 15-65% 아세토니트릴)를 통해 정제한다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 (2R,2'R,4R,4'R,5S,5'S,6S,6'S)-2,2'-(((((((((R)-9,14,22-트리옥소-16-((15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)카르바모일)-3,6,25,28-테트라옥사-10,15,21-트리아자트리아콘탄-1,30-디일)비스(1H-1,2,3-트리아졸-1,4-디일))비스(메틸렌))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-6-((1S,2S)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산)(실시예 11)을 얻었다.
실시예 12
실시예 12 의 합성
1 드램 바이알에 NMP(0.5mL) 중 퍼플루오로페닐 (16R,19R)-1-아지도-16,19-비스(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-9,14,17,20-테트라옥소-3,6,24,27,30,33-헥사옥사-10,15,18,21-테트라아자헥사트리아콘탄-36-오에이트(26333, 1.00당량) 및 (2R,4R,5S,6S)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-(2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에톡시)-6-((1S,2S)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(26568, 3.10당량)의 교반된 용액에 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(7.50당량)를 첨가하였다. 생성된 용액을 캡핑하고 실온에서 10분 동안 교반한다. 반응물을 NMP 중 70% 아세트산의 혼합물로 희석하고, 여과하고, 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 15-65% 아세토니트릴)를 통해 정제한다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 실시예 12를 얻는다.
(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-((2-(2-((1-(15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메톡시)에톡시)에틸)티오)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (실시예 13)
(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-((2-(2-((1-(15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메톡시)에톡시)에틸)티오)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 ( 실시예 13 )의합성
1 드램 바이알에 NMP(0.3mL) 중 (2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-((2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에틸)티오)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(26567, 1.00당량)의 교반된 용액에 NMP(0.3mL) 중 퍼플루오로페닐 1-아지도-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-오에이트(1, 1.10당량)의 용액 이어서 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(2.50당량)를 첨가한다. 생성된 용액을 캡핑하고 실온에서 10분 동안 교반한다. 반응물을 아세트산으로 희석하고, 여과하고, 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 15-65% 아세토니트릴)를 통해 정제한다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 (2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-((2-(2-((1-(15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메톡시)에톡시)에틸)티오)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(실시예 13)을 얻었다.
(2R,2'R,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-2,2'-(((((((((S)-9,14,22-트리옥소-16-((15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)카르바모일)-3,6,25,28-테트라옥사-10,15,21-트리아자트리아콘탄-1,30-디일)비스(1H-1,2,3-트리아졸-1,4-디일))비스(메틸렌))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(술판디일))비스(6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산) (실시예 14)
(2R,2'R,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-2,2'-(((((((((S)-9,14,22-트리옥소-16-((15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)카르바모일)-3,6,25,28-테트라옥사-10,15,21-트리아자트리아콘탄-1,30-디일)비스(1H-1,2,3-트리아졸-1,4-디일))비스(메틸렌))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(술판디일))비스(6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산) ( 실시예 14 )의 합성
1 드램 바이알에 NMP(0.5mL) 중 퍼플루오로페닐 (R)-1-아지도-16-(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-9,14,17-트리옥소-3,6,21,24,27,30-헥사옥사-10,15,18-트리아자트리트리아콘탄-33-오에이트(26332, 1.00당량) 및 (2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-((2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에틸)티오)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(26567, 2.10당량)의 교반된 용액에 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(5.00당량)를 첨가하였다. 생성된 용액을 캡핑하고 실온에서 10분 동안 교반한다. 반응물을 NMP 중 70% 아세트산의 혼합물로 희석하고, 여과하고, 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 15-65% 아세토니트릴)를 통해 정제한다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 (2R,2'R,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-2,2'-(((((((((S)-9,14,22-트리옥소-16-((15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)카르바모일)-3,6,25,28-테트라옥사-10,15,21-트리아자트리아콘탄-1,30-디일)비스(1H-1,2,3-트리아졸-1,4-디일))비스(메틸렌))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(술판디일))비스(6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산)(실시예 14)을 얻는다.
실시예 15
실시예 15 의 합성
1 드램 바이알에 NMP(0.5mL) 중 퍼플루오로페닐 (16R,19R)-1-아지도-16,19-비스(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-9,14,17,20-테트라옥소-3,6,24,27,30,33-헥사옥사-10,15,18,21-테트라아자헥사트리아콘탄-36-오에이트(26333, 1.00당량) 및 (2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-((2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에틸)티오)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(26567, 3.10당량)의 교반된 용액에 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(7.50당량)를 첨가하였다. 생성된 용액을 캡핑하고 실온에서 10분 동안 교반한다. 반응물을 NMP 중 70% 아세트산의 혼합물로 희석하고, 여과하고, 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 15-65% 아세토니트릴)를 통해 정제한다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 실시예 15를 얻는다.
(2R,4R,5S,6S)-6-((1S,2S)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-((2-(2-((1-(15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메톡시)에톡시)에틸)티오)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (실시예 16)
(2R,4R,5S,6S)-6-((1S,2S)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-((2-(2-((1-(15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메톡시)에톡시)에틸)티오)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 ( 실시예 16 )의 합성
1 드램 바이알에 NMP(0.3mL) 중 (2R,4R,5S,6S)-6-((1S,2S)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-((2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에틸)티오)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(26566, 1.00당량)의 교반된 용액에 NMP(0.3mL) 중 퍼플루오로페닐 1-아지도-3,6,9,12-테트라옥사펜타데칸-15-오에이트(1, 1.10당량)의 용액 이어서 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(2.50당량)를 첨가한다. 생성된 용액을 캡핑하고 실온에서 10분 동안 교반한다. 반응물을 아세트산으로 희석하고, 여과하고, 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 15-65% 아세토니트릴)를 통해 정제한다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 (2R,4R,5S,6S)-6-((1S,2S)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-((2-(2-((1-(15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메톡시)에톡시)에틸)티오)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(실시예 16)을 얻는다.
(2R,2'R,4R,4'R,5S,5'S,6S,6'S)-2,2'-(((((((((R)-9,14,22-트리옥소-16-((15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)카르바모일)-3,6,25,28-테트라옥사-10,15,21-트리아자트리아콘탄-1,30-디일)비스(1H-1,2,3-트리아졸-1,4-디일))비스(메틸렌))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(술판디일))비스(6-((1S,2S)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산) (실시예 17)
(2R,2'R,4R,4'R,5S,5'S,6S,6'S)-2,2'-(((((((((R)-9,14,22-트리옥소-16-((15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)카르바모일)-3,6,25,28-테트라옥사-10,15,21-트리아자트리아콘탄-1,30-디일)비스(1H-1,2,3-트리아졸-1,4-디일))비스(메틸렌))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(술판디일))비스(6-((1S,2S)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산) ( 실시예 17 )의 합성
1 드램 바이알에 NMP(0.5mL) 중 퍼플루오로페닐 (R)-1-아지도-16-(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-9,14,17-트리옥소-3,6,21,24,27,30-헥사옥사-10,15,18-트리아자트리트리아콘탄-33-오에이트(26332, 1.00당량) 및 (2R,4R,5S,6S)-6-((1S,2S)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-((2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에틸)티오)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(26566, 2.10당량)의 교반된 용액에 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(5.00당량)를 첨가한다. 생성된 용액을 캡핑하고 실온에서 10분 동안 교반한다. 반응물을 NMP 중 70% 아세트산의 혼합물로 희석하고, 여과하고, 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 15-65% 아세토니트릴)를 통해 정제한다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 (2R,2'R,4R,4'R,5S,5'S,6S,6'S)-2,2'-(((((((((R)-9,14,22-트리옥소-16-((15-옥소-15-(퍼플루오로펜옥시)-3,6,9,12-테트라옥사펜타데실)카르바모일)-3,6,25,28-테트라옥사-10,15,21-트리아자트리아콘탄-1,30-디일)비스(1H-1,2,3-트리아졸-1,4-디일))비스(메틸렌))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(술판디일))비스(6-((1S,2S)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산)(실시예 17)을 얻는다.
실시예 18
실시예 18 의 합성
1 드램 바이알에 NMP(0.5mL) 중 퍼플루오로페닐 (16R,19R)-1-아지도-16,19-비스(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-9,14,17,20-테트라옥소-3,6,24,27,30,33-헥사옥사-10,15,18,21-테트라아자헥사트리아콘탄-36-오에이트(26333, 1.00당량) 및 (2R,4R,5S,6S)-6-((1S,2S)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-((2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에틸)티오)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(26566, 3.10당량)의 교반된 용액에 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(7.50당량)를 첨가한다. 생성된 용액을 캡핑하고 실온에서 10분 동안 교반한다. 반응물을 NMP 중 70% 아세트산의 혼합물로 희석하고, 여과하고, 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 15-65% 아세토니트릴)를 통해 정제한다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 실시예 18을 얻는다.
(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-2-(2-(2-((1-(4-(((S)-6-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-2-카르복시-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에톡시)에톡시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-1-(((S)-5-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-2-카르복시-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에톡시)에톡시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-1-카르복시펜틸)아미노)-1-옥소헥산-2-일)아미노)-4-옥소부틸)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메톡시)에톡시)에톡시)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (실시예 19)
(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-2-(2-(2-((1-(4-(((S)-6-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-2-카르복시-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에톡시)에톡시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-1-(((S)-5-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-2-카르복시-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에톡시)에톡시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-1-카르복시펜틸)아미노)-1-옥소헥산-2-일)아미노)-4-옥소부틸)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메톡시)에톡시)에톡시)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 ( 실시예 19) 의 합성
1 드램 바이알에 NMP(0.5mL) 중 N2-(N2-(4-아지도부타노일)-N6-디아조-D-리실)-N6-디아조-D-라이신(26728, 1.00당량) 및 (2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-(2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(26463, 3.10당량)의 교반된 용액에 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(7.50당량)를 첨가한다. 생성된 용액을 캡핑하고 실온에서 10분 동안 교반한다. 반응물을 NMP 중 70% 아세트산의 혼합물로 희석하고, 여과하고, 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 15-65% 아세토니트릴)를 통해 정제한다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 (2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-2-(2-(2-((1-(4-(((S)-6-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-2-카르복시-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에톡시)에톡시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-1-(((S)-5-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-2-카르복시-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에톡시)에톡시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-1-카르복시펜틸)아미노)-1-옥소헥산-2-일)아미노)-4-옥소부틸)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메톡시)에톡시)에톡시)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(실시예 19)을 얻는다.
(2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-2-(2-(2-((1-(4-(((S)-6-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-2-카르복시-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에톡시)에톡시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-1-(((S)-5-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-2-카르복시-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에톡시)에톡시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-1-카르복시펜틸)아미노)-1-옥소헥산-2-일)아미노)-4-옥소부틸)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메톡시)에톡시)에톡시)-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (실시예 20)
(2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-2-(2-(2-((1-(4-(((S)-6-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-2-카르복시-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에톡시)에톡시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-1-(((S)-5-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-2-카르복시-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에톡시)에톡시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-1-카르복시펜틸)아미노)-1-옥소헥산-2-일)아미노)-4-옥소부틸)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메톡시)에톡시)에톡시)-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 ( 실시예 20) 의 합성
1 드램 바이알에 NMP(0.5mL) 중 N2-(N2-(4-아지도부타노일)-N6-디아조-D-리실)-N6-디아조-D-라이신(26728, 1.00당량) 및 (2R,4R,5S,6S)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-((2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에틸)티오)-6-((1S,2S)-1,2,3-트리하이드록시프로필)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(26334, 3.10당량)의 교반된 용액에 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(7.50당량)를 첨가한다. 생성된 용액을 캡핑하고 실온에서 10분 동안 교반한다. 반응물을 NMP 중 70% 아세트산의 혼합물로 희석하고, 여과하고, 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 15-65% 아세토니트릴)를 통해 정제한다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 (2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-2-(2-(2-((1-(4-(((S)-6-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-2-카르복시-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에톡시)에톡시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-1-(((S)-5-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-2-카르복시-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에톡시)에톡시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-1-카르복시펜틸)아미노)-1-옥소헥산-2-일)아미노)-4-옥소부틸)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메톡시)에톡시)에톡시)-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(실시예 20)을 얻는다.
(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-2-(2-(2-((1-(4-(((S)-5-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-2-카르복시-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에톡시)에톡시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-1-카르복시펜틸)아미노)-4-옥소부틸)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메톡시)에톡시)에톡시)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (실시예 21)
(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-2-(2-(2-((1-(4-(((S)-5-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-2-카르복시-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에톡시)에톡시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-1-카르복시펜틸)아미노)-4-옥소부틸)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메톡시)에톡시)에톡시)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 ( 실시예 21 )의 합성
1 드램 바이알에 NMP(0.5mL) 중 N2-(4-아지도부타노일)-N6-디아조-D-라이신(26727, 1.00당량) 및 (2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-(2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(26463, 2.10당량)의 교반된 용액에 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(5.00당량)를 첨가한다. 생성된 용액을 캡핑하고 실온에서 10분 동안 교반한다. 반응물을 NMP 중 70% 아세트산의 혼합물로 희석하고, 여과하고, 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 15-65% 아세토니트릴)를 통해 정제한다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 (2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-2-(2-(2-((1-(4-(((S)-5-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-2-카르복시-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에톡시)에톡시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-1-카르복시펜틸)아미노)-4-옥소부틸)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메톡시)에톡시)에톡시)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(실시예 21)을 얻는다.
(2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-2-(2-(2-((1-(4-(((S)-5-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-2-카르복시-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에톡시)에톡시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-1-카르복시펜틸)아미노)-4-옥소부틸)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메톡시)에톡시)에톡시)-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (실시예 22)
(2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-2-(2-(2-((1-(4-(((S)-5-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-2-카르복시-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에톡시)에톡시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-1-카르복시펜틸)아미노)-4-옥소부틸)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메톡시)에톡시)에톡시)-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 ( 실시예 22 )의 합성
1 드램 바이알에 NMP(0.5mL) 중 N2-(4-아지도부타노일)-N6-디아조-D-라이신(26727, 1.00당량) 및 (2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시-2-(2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(26334, 2.10당량)의 교반된 용액에 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(5.00당량)를 첨가한다. 생성된 용액을 캡핑하고 실온에서 10분 동안 교반한다. 반응물을 NMP 중 70% 아세트산의 혼합물로 희석하고, 여과하고, 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 15-65% 아세토니트릴)를 통해 정제한다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 (2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-2-(2-(2-((1-(4-(((S)-5-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-2-카르복시-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에톡시)에톡시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-1-카르복시펜틸)아미노)-4-옥소부틸)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메톡시)에톡시)에톡시)-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(실시예 22)을 얻는다.
(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-2-(2-(2-((1-(4-(((S)-6-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-2-카르복시-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에톡시)에톡시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-1-(((S)-6-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-2-카르복시-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에톡시)에톡시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-1-옥소-1-(퍼플루오로펜옥시)헥산-2-일)아미노)-1-옥소헥산-2-일)아미노)-4-옥소부틸)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메톡시)에톡시)에톡시)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (실시예 23)
(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-2-(2-(2-((1-(4-(((S)-6-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-2-카르복시-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에톡시)에톡시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-1-(((S)-6-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-2-카르복시-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에톡시)에톡시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-1-옥소-1-(퍼플루오로펜옥시)헥산-2-일)아미노)-1-옥소헥산-2-일)아미노)-4-옥소부틸)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메톡시)에톡시)에톡시)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 ( 실시예 23) 의 합성
1 드램 바이알에 NMP(0.5mL) 중 퍼플루오로페닐 N2-(N2-(4-아지도부타노일)-N6-디아조-D-리실)-N6-디아조-D-리시네이트(26634, 1.00당량) 및 (2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-(2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(26463, 3.10당량)의 교반된 용액에 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(7.50당량)를 첨가한다. 생성된 용액을 캡핑하고 실온에서 10분 동안 교반한다. 반응물을 NMP 중 70% 아세트산의 혼합물로 희석하고, 여과하고, 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 15-65% 아세토니트릴)를 통해 정제한다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 (2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-2-(2-(2-((1-(4-(((S)-6-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-2-카르복시-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에톡시)에톡시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-1-(((S)-6-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-2-카르복시-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에톡시)에톡시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-1-옥소-1-(퍼플루오로펜옥시)헥산-2-일)아미노)-1-옥소헥산-2-일)아미노)-4-옥소부틸)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메톡시)에톡시)에톡시)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(실시예 23)을 얻는다.
(2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-2-(2-(2-((1-(4-(((S)-6-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-2-카르복시-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에톡시)에톡시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-1-(((S)-6-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-2-카르복시-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에톡시)에톡시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-1-옥소-1-(퍼플루오로펜옥시)헥산-2-일)아미노)-1-옥소헥산-2-일)아미노)-4-옥소부틸)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메톡시)에톡시)에톡시)-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (실시예 24)
(2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-2-(2-(2-((1-(4-(((S)-6-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-2-카르복시-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에톡시)에톡시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-1-(((S)-6-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-2-카르복시-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에톡시)에톡시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-1-옥소-1-(퍼플루오로펜옥시)헥산-2-일)아미노)-1-옥소헥산-2-일)아미노)-4-옥소부틸)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메톡시)에톡시)에톡시)-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 ( 실시예 24) 의 합성
1 드램 바이알에 NMP(0.5mL) 중 퍼플루오로페닐 N2-(N2-(4-아지도부타노일)-N6-디아조-D-리실)-N6-디아조-D-리시네이트(26634, 1.00당량) 및 (2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시-2-(2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(26334, 3.10당량)의 교반된 용액에 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(7.50당량)를 첨가한다. 생성된 용액을 캡핑하고 실온에서 10분 동안 교반한다. 반응물을 NMP 중 70% 아세트산의 혼합물로 희석하고, 여과하고, 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 15-65% 아세토니트릴)를 통해 정제한다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 (2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-2-(2-(2-((1-(4-(((S)-6-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-2-카르복시-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에톡시)에톡시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-1-(((S)-6-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-2-카르복시-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에톡시)에톡시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-1-옥소-1-(퍼플루오로펜옥시)헥산-2-일)아미노)-1-옥소헥산-2-일)아미노)-4-옥소부틸)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메톡시)에톡시)에톡시)-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(실시예 24)을 얻는다.
(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-2-(2-(2-((1-((S)-16-((S)-6-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-2-카르복시-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에톡시)에톡시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-2-(4-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-2-카르복시-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에톡시)에톡시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)부탄아미도)헥산아미도)-1-옥소-1-(퍼플루오로펜옥시)-4,7,10,13-테트라옥사이코산-20-일)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메톡시)에톡시)에톡시)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (실시예 25)
(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-2-(2-(2-((1-((S)-16-((S)-6-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-2-카르복시-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에톡시)에톡시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-2-(4-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-2-카르복시-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에톡시)에톡시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)부탄아미도)헥산아미도)-1-옥소-1-(퍼플루오로펜옥시)-4,7,10,13-테트라옥사이코산-20-일)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메톡시)에톡시)에톡시)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 ( 실시예 25) 의 합성
1 드램 바이알에 NMP(0.5mL) 중 퍼플루오로페닐 (16R,19R)-24-아지도-16,19-비스(4-아지도부틸)-18,21-디옥소-4,7,10,13-테트라옥사-17,20-디아자테트라코사노산(26604, 1.00당량) 및 (2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-(2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(26463, 3.10당량)의 교반된 용액에 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(7.50당량)를 첨가한다. 생성된 용액을 캡핑하고 실온에서 10분 동안 교반한다. 반응물을 NMP 중 70% 아세트산의 혼합물로 희석하고, 여과하고, 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 15-65% 아세토니트릴)를 통해 정제한다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 (2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-2-(2-(2-((1-((S)-16-((S)-6-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-2-카르복시-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에톡시)에톡시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-2-(4-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-2-카르복시-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에톡시)에톡시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)부탄아미도)헥산아미도)-1-옥소-1-(퍼플루오로펜옥시)-4,7,10,13-테트라옥사이코산-20-일)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메톡시)에톡시)에톡시)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(실시예 25)을 얻는다.
(2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-2-(2-(2-((1-((S)-16-((S)-6-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-2-카르복시-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에톡시)에톡시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-2-(4-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-2-카르복시-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에톡시)에톡시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)부탄아미도)헥산아미도)-1-옥소-1-(퍼플루오로펜옥시)-4,7,10,13-테트라옥사이코산-20-일)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메톡시)에톡시)에톡시)-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (실시예 26)
(2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-2-(2-(2-((1-((S)-16-((S)-6-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-2-카르복시-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에톡시)에톡시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-2-(4-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-2-카르복시-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에톡시)에톡시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)부탄아미도)헥산아미도)-1-옥소-1-(퍼플루오로펜옥시)-4,7,10,13-테트라옥사이코산-20-일)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메톡시)에톡시)에톡시)-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 ( 실시예 26) 의 합성
1 드램 바이알에 NMP(0.5mL) 중 퍼플루오로페닐 (16R,19R)-24-아지도-16,19-비스(4-아지도부틸)-18,21-디옥소-4,7,10,13-테트라옥사-17,20-디아자테트라코사노산(26604, 1.00당량) 및 (2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시-2-(2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(26334, 3.10당량)의 교반된 용액에 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(7.50당량)를 첨가한다. 생성된 용액을 캡핑하고 실온에서 10분 동안 교반한다. 반응물을 NMP 중 70% 아세트산의 혼합물로 희석하고, 여과하고, 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 15-65% 아세토니트릴)를 통해 정제한다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 (2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-2-(2-(2-((1-((S)-16-((S)-6-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-2-카르복시-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에톡시)에톡시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)-2-(4-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-2-카르복시-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에톡시)에톡시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)부탄아미도)헥산아미도)-1-옥소-1-(퍼플루오로펜옥시)-4,7,10,13-테트라옥사이코산-20-일)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메톡시)에톡시)에톡시)-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(실시예 26)을 얻는다.
(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-2-(2-(2-((1-((S)-18-(4-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-2-카르복시-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에톡시)에톡시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)부탄아미도)-1,17-디옥소-1-(퍼플루오로펜옥시)-4,7,10,13-테트라옥사-16-아자도코산-22-일)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메톡시)에톡시)에톡시)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (실시예 27)
(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-2-(2-(2-((1-((S)-18-(4-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-2-카르복시-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에톡시)에톡시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)부탄아미도)-1,17-디옥소-1-(퍼플루오로펜옥시)-4,7,10,13-테트라옥사-16-아자도코산-22-일)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메톡시)에톡시)에톡시)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 ( 실시예 27) 의 합성
1 드램 바이알에 NMP(0.5mL) 중 퍼플루오로페닐 (R)-23-아지도-18-(4-아지도부틸)-17,20-디옥소-4,7,10,13-테트라옥사-16,19-디아자트리코사노에이트(26594, 1.00당량) 및 (2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-(2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(26463, 3.10당량)의 교반된 용액에 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(5.00당량)를 첨가한다. 생성된 용액을 캡핑하고 실온에서 10분 동안 교반한다. 반응물을 NMP 중 70% 아세트산의 혼합물로 희석하고, 여과하고, 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 15-65% 아세토니트릴)를 통해 정제한다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 (2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-2-(2-(2-((1-((S)-18-(4-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-2-카르복시-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에톡시)에톡시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)부탄아미도)-1,17-디옥소-1-(퍼플루오로펜옥시)-4,7,10,13-테트라옥사-16-아자도코산-22-일)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메톡시)에톡시)에톡시)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(실시예 27)을 얻는다.
(2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-2-(2-(2-((1-((S)-18-(4-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-2-카르복시-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에톡시)에톡시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)부탄아미도)-1,17-디옥소-1-(퍼플루오로펜옥시)-4,7,10,13-테트라옥사-16-아자도코산-22-일)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메톡시)에톡시)에톡시)-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 (실시예 28)
(2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-2-(2-(2-((1-((S)-18-(4-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-2-카르복시-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에톡시)에톡시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)부탄아미도)-1,17-디옥소-1-(퍼플루오로펜옥시)-4,7,10,13-테트라옥사-16-아자도코산-22-일)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메톡시)에톡시)에톡시)-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산 ( 실시예 28) 의 합성
1 드램 바이알에 NMP(0.5mL) 중 퍼플루오로페닐 (R)-23-아지도-18-(4-아지도부틸)-17,20-디옥소-4,7,10,13-테트라옥사-16,19-디아자트리코사노에이트(26594, 1.00당량) 및 (2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시-2-(2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(26334, 3.10당량)의 교반된 용액에 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(5.00당량)를 첨가한다. 생성된 용액을 캡핑하고 실온에서 10분 동안 교반한다. 반응물을 NMP 중 70% 아세트산의 혼합물로 희석하고, 여과하고, 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 15-65% 아세토니트릴)를 통해 정제한다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 (2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-2-(2-(2-((1-((S)-18-(4-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-2-카르복시-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-일)옥시)에톡시)에톡시)메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-1-일)부탄아미도)-1,17-디옥소-1-(퍼플루오로펜옥시)-4,7,10,13-테트라옥사-16-아자도코산-22-일)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메톡시)에톡시)에톡시)-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(실시예 28)을 얻는다.
실시예 29
실시예 29 의 합성
1 드램 바이알에 NMP(0.5mL) 중 (16R,19R)-1-아지도-16,19-비스(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-9,14,17,20-테트라옥소-3,6,24,27,30,33-헥사옥사-10,15,18,21-테트라아자헥사트리아콘탄-36-오산(26338, 1.00당량) 및 (2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-(2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(26463, 3.10당량)의 교반된 용액에 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(7.50당량)를 첨가한다. 생성된 용액을 캡핑하고 실온에서 10분 동안 교반한다. 반응물을 NMP 중 70% 아세트산의 혼합물로 희석하고, 여과하고, 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 15-65% 아세토니트릴)를 통해 정제한다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 실시예 29를 얻는다.
실시예 30
실시예 30 의 합성
1 드램 바이알에 NMP(0.5mL) 중 (16R,19R)-1-아지도-16,19-비스(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-9,14,17,20-테트라옥소-3,6,24,27,30,33-헥사옥사-10,15,18,21-테트라아자헥사트리아콘탄-36-오산(26338, 1.00당량) 및 (2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시-2-(2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(26334, 3.10당량)의 교반된 용액에 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(7.50당량)를 첨가한다. 생성된 용액을 캡핑하고 실온에서 10분 동안 교반한다. 반응물을 NMP 중 70% 아세트산의 혼합물로 희석하고, 여과하고, 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 15-65% 아세토니트릴)를 통해 정제한다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 실시예 30을 얻는다.
(2R,2'R,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-2,2'-(((((((((S)-16-((14-카르복시-3,6,9,12-테트라옥사테트라데실)카르바모일)-9,14,22-트리옥소-3,6,25,28-테트라옥사-10,15,21-트리아자트리아콘탄-1,30-디일)비스(1H-1,2,3-트리아졸-1,4-디일))비스(메틸렌))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산) (실시예 31)
(2R,2'R,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-2,2'-(((((((((S)-16-((14-카르복시-3,6,9,12-테트라옥사테트라데실)카르바모일)-9,14,22-트리옥소-3,6,25,28-테트라옥사-10,15,21-트리아자트리아콘탄-1,30-디일)비스(1H-1,2,3-트리아졸-1,4-디일))비스(메틸렌))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산) ( 실시예 31 )의 합성
1 드램 바이알에 NMP(0.5mL) 중 (R)-1-아지도-16-(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-9,14,17-트리옥소-3,6,21,24,27,30-헥사옥사-10,15,18-트리아자트리트리아콘탄-33-오산(26337, 1.00당량) 및 (2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)-2-(2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(26463, 2.10당량)의 교반된 용액에 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(5.00당량)를 첨가한다. 생성된 용액을 캡핑하고 실온에서 10분 동안 교반한다. 반응물을 NMP 중 70% 아세트산의 혼합물로 희석하고, 여과하고, 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 15-65% 아세토니트릴)를 통해 정제한다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 (2R,2'R,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-2,2'-(((((((((S)-16-((14-카르복시-3,6,9,12-테트라옥사테트라데실)카르바모일)-9,14,22-트리옥소-3,6,25,28-테트라옥사-10,15,21-트리아자트리아콘탄-1,30-디일)비스(1H-1,2,3-트리아졸-1,4-디일))비스(메틸렌))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-비페닐]-4-일)아세트아미도)-1,2-디하이드록시프로필)-4-하이드록시-5-(2-하이드록시아세트아미도)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산)(실시예 31)을 얻는다.
(2R,2'R,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-2,2'-(((((((((S)-16-((14-카르복시-3,6,9,12-테트라옥사테트라데실)카르바모일)-9,14,22-트리옥소-3,6,25,28-테트라옥사-10,15,21-트리아자트리아콘탄-1,30-디일)비스(1H-1,2,3-트리아졸-1,4-디일))비스(메틸렌))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(5-아세트아미도-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산) (실시예 32)
(2R,2'R,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-2,2'-(((((((((S)-16-((14-카르복시-3,6,9,12-테트라옥사테트라데실)카르바모일)-9,14,22-트리옥소-3,6,25,28-테트라옥사-10,15,21-트리아자트리아콘탄-1,30-디일)비스(1H-1,2,3-트리아졸-1,4-디일))비스(메틸렌))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(5-아세트아미도-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산) ( 실시예 32 )의 합성
1 드램 바이알에 NMP(0.5mL) 중 (R)-1-아지도-16-(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부틸)-9,14,17-트리옥소-3,6,21,24,27,30-헥사옥사-10,15,18-트리아자트리트리아콘탄-33-오산(26337, 1.00당량) 및 (2R,4S,5R,6R)-5-아세트아미도-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시-2-(2-(2-(프로프-2-인-1-일옥시)에톡시)에톡시)테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산(26334, 2.10당량)의 교반된 용액에 테트라키스(아세토니트릴)구리(I) 헥사플루오로포스페이트(5.00당량)를 첨가한다. 생성된 용액을 캡핑하고 실온에서 10분 동안 교반한다. 반응물을 NMP 중 70% 아세트산의 혼합물로 희석하고, 여과하고, 분취용 HPLC(0.1% TFA를 갖는 물 중 15-65% 아세토니트릴)를 통해 정제한다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 (2R,2'R,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-2,2'-(((((((((S)-16-((14-카르복시-3,6,9,12-테트라옥사테트라데실)카르바모일)-9,14,22-트리옥소-3,6,25,28-테트라옥사-10,15,21-트리아자트리아콘탄-1,30-디일)비스(1H-1,2,3-트리아졸-1,4-디일))비스(메틸렌))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(에탄-2,1-디일))비스(옥시))비스(5-아세트아미도-6-((1R,2R)-1,2-디하이드록시-3-(3-펜옥시벤즈아미도)프로필)-4-하이드록시테트라하이드로-2H-피란-2-카르복실산)(실시예 32)을 얻는다.
퍼플루오로페닐 N2-(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부타노일)-N6-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로파노일)-L-리시네이트 (Cpd. No. ISP6-062)
tert-부틸 N6-((벤질옥시)카르보닐)-N2-(4-(((벤질옥시)카르보닐)아미노)부타노일)-L-리시네이트 ( 3 )의 합성
N,N-디메틸포름아미드(50.0mL) 중 메틸 N6-((벤질옥시)카르보닐)-L-리시네이트 염산염(1, 10.0g, 29.7mmol) 및 4-(((벤질옥시)카르보닐)아미노)부탄산(2, 5.88g, 24.8mmol)의 교반된 용액에 [(디메틸아미노)({3H-[1,2,3]트리아졸로[4,5-b]피리딘-3-일옥시})메틸리덴]디메틸아자늄; 헥사플루오로-λ5-포스파누이드(11.3g, 29.7mmol) 및 디이소프로필에틸아민(8.63mL, 49.5mmol)을 첨가한다. 반응 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반한다. 완료 후, 반응 혼합물을 포화 중탄산나트륨 용액으로 희석하고 디클로로메탄으로 추출한다. 유기층을 황산나트륨으로 건조하고, 여과하고, 고진공 하에서 농축하여 조 잔사를 얻은 다음 플래시 컬럼 크로마토그래피(헥산 중 50-70% 에틸 아세테이트)를 통해 정제한다. 원하는 분획을 감압 하에서 농축하여 tert-부틸 N6-((벤질옥시)카르보닐)-N2-(4-(((벤질옥시)카르보닐)아미노)부타노일)-L-리시네이트(3)를 회백색 고체로 얻는다. 수율: 11.0g, 79.7%; LC-MS m/z 556.3 [M+1]+.
tert-부틸 (4-아미노부타노일)-L-리시네이트 ( 4 )의 합성
메탄올(250.0mmol) 중 tert-부틸 N6-((벤질옥시)카르보닐)-N2-(4-(((벤질옥시)카르보닐)아미노)부타노일)-L-리시네이트(3, 8.0g, 14.4mmol)의 교반된 용액에 탄소 상 10% 팔라듐(3.50g)을 실온에서 질소 하에 첨가한다. 생성된 혼합물을 수소 기체 압력 하에 실온에서 12시간 동안 교반한다. 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고 메탄올로 세정한다. 여액을 진공 하에서 농축하여 tert-부틸(4-아미노부타노일)-L-리시네이트(4)를 담황색 점성 액체로 얻는다. 수율: 4.0g, 95%; ELSD m/z 288.4 [M+1]+.
tert-부틸 N2-(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부타노일)-N6-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로파노일)-L-리시네이트 ( 6 )의 합성.
0℃에서 테트라하이드로푸란(20.0mL) 중 tert-부틸 (4-아미노부타노일)-L-리시네이트(4, 1.0g, 3.48mmol)의 교반된 용액에 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로파노에이트(5, 2.09g, 6.96mmol)를 첨가한다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반한다. 완료 후, 용매를 고진공 하에서 농축하여 조 잔사를 얻은 다음 플래시 컬럼 크로마토그래피(디클로로메탄 중 0-7.5% 메탄올)를 통해 정제한다. 원하는 분획을 감압 하에서 농축하여 tert-부틸 N2-(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부타노일)-N6-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로파노일)-L-리시네이트(6)를 담황색 점성 액체로 얻는다 수율: 1.20g, 52%; ELSD m/z 658.2 [M+1]+.
N2-(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부타노일)-N6-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로파노일)-L-라이신 ( 7 )의 합성
디클로로메탄(5mL) 중 tert-부틸 N2-(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부타노일)-N6-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로파노일)-L-리시네이트(6, 0.40g, 0.608mmol)의 교반된 용액에 트리플루오로아세트산(1.0mL)을 0℃에서 첨가한다. 생성된 혼합물을 실온에서 질소 하에 4시간 동안 교반한다. 완료 후, 반응 혼합물을 농축하고, 디에틸 에테르로 세정하고, 건조하여 N2-(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부타노일)-N6-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로파노일)-L-라이신(7)을 담황색 점성 액체로 얻는다. 수율: 0.350g, 96%; ELSD m/z 602.4 [M+1]+.
퍼플루오로페닐 N2-(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부타노일)-N6-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로파노일)-L-리시네이트 (Cpd. No. ISP6-062 )의 합성.
0℃에서 테트라하이드로푸란 중 N2-(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부타노일)-N6-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로파노일)-L-라이신(7, 1.0당량)의 교반된 용액에 2,3,4,5,6-펜타플루오로페놀(8, 2.0 eq) 및 N, N'-디이소프로필카르보디이미드(2.5당량)를 첨가한다. 생성된 반응 용액을 실온에서 교반한다. 완료 후, 용매를 농축하여 조 잔사를 얻은 다음 분취용 HPLC를 통해 정제한다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 퍼플루오로페닐 N2-(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부타노일)-N6-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로파노일)-L-리시네이트(Cpd. No. ISP6-062)를 얻는다.
퍼플루오로페닐 N2-(N2-(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부타노일)-N6-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로파노일)-L-리실)-N6-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로파노일)-L-리시네이트 (Cpd. No. ISP6-065)
N6-((벤질옥시)카르보닐)-N2-(4-(((벤질옥시)카르보닐)아미노)부타노일)-L-라이신 ( 2 )의 합성
디클로로메탄(50.0mmol) 중 tert-부틸 N6-((벤질옥시)카르보닐)-N2-(4-(((벤질옥시)카르보닐)아미노)부타노일)-L-리시네이트(1, 5.0g, 9.0mmol)의 교반된 용액에mL)에 트리플루오로아세트산(10.0mL)을 0℃에서 첨가한다. 생성된 혼합물을 실온에서 질소 하에 6시간 동안 교반한다. 완료 후, 반응 혼합물을 농축하고, 디에틸 에테르로 세정하고, 건조하여 N6-((벤질옥시)카르보닐)-N2-(4-(((벤질옥시)카르보닐)아미노)부타노일)-L-라이신(2)을 회백색 고체로 얻었다. 수율: 3.8g, 85%; LC-MS m/z 500.1 [M+1]+.
tert-부틸 N6-((벤질옥시)카르보닐)-N2-(N6-((벤질옥시)카르보닐)-N2-(4-(((벤질옥시)카르보닐)아미노)부타노일)-L-리실)-L-리시네이트 ( 4 )의 합성
N,N-디메틸포름아미드(50.0mL) 중 N6-((벤질옥시)카르보닐)-N2-(4-(((벤질옥시)카르보닐)아미노)부타노일)-L-라이신(2, 3.80g, 7.61mmol) 및 tert-부틸 N6-((벤질옥시)카르보닐)-L-리시네이트 염산염(3, 3.38g, 9.13mmol)의 교반된 용액에 [(디메틸아미노)({3H-[1,2,3]트리아졸로[4,5-b]피리딘-3-일옥시})메틸리덴]디메틸아자늄; 헥사플루오로-λ5-포스파누이드(3.47g, 9.13mmol) 및 디이소프로필에틸아민(3.32ml, 19mmol)을 첨가한다. 반응 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반한다. 완료 후, 반응 혼합물을 포화 중탄산나트륨 용액으로 희석하고 디클로로메탄으로 추출한다. 유기층을 황산나트륨으로 건조하고, 여과하고, 고진공 하에서 농축하여 조 잔사를 얻은 다음 플래시 컬럼 크로마토그래피(헥산 중 70-100% 에틸 아세테이트)를 통해 정제한다. 원하는 분획을 감압 하에서 농축하여 tert-부틸 N6-((벤질옥시)카르보닐)-N2-(N6-((벤질옥시)카르보닐)-N2-(4-(((벤질옥시)카르보닐) 아미노) 부타노일)-L-리실)-L-리시네이트(4)를 회백색 고체로 얻는다. 수율: 5.70g, 90%; LC-MS m/z 818.4 [M+1]+.
tert-부틸 (4-아미노부타노일)-L-리실-L-리시네이트 ( 5 )의 합성
메탄올(100mL) 중 tert-부틸 N6-((벤질옥시)카르보닐)-N2-(N6-((벤질옥시)카르보닐)-N2-(4-(((벤질옥시)카르보닐)아미노)부타노일)-L-리실)-L-리시네이트(4, 4.0g, 4.89mmol)의 교반된 용액에 탄소 상 10% 팔라듐(1.5g)을 실온에서 질소 하에 첨가한다. 생성된 혼합물을 수소 기체 압력 하에 실온에서 12시간 동안 교반한다. 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고 메탄올로 세정한다. 여액을 진공 하에 농축하여 tert-부틸 (4-아미노부타노일)-L-리실-L-리시네이트(5)를 담황색 점성 액체로 얻었다. 수율: 2.0g, 98%; ELSD m/z 416.2 [M+1]+.
tert-부틸 N2-(N2-(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부타노일)-N6-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로파노일)-L-리실)-N6-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로파노일)-L-리시네이트 ( 7 )의 합성.
0℃에서 테트라하이드로푸란(20.0mL) 중 tert-부틸(4-아미노부타노일)-L-리실-L-리시네이트(5, 1.0g, 2.41mmol)의 교반된 용액에 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로파노에이트(6, 2.17g, 7.22mmol)를 첨가한다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반한다. 완료 후, 용매를 고진공 하에서 농축하여 조 잔사를 얻은 다음 플래시 컬럼 크로마토그래피(디클로로메탄 중 0-7.5% 메탄올)를 통해 정제한다. 원하는 분획을 감압 하에서 농축하여 tert-부틸 N2-(N2-(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부타노일)-N6-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로파노일)-L-리실)-N6-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로파노일)-L-리시네이트(7)를 무색 점성 액체로 얻는다. 수율: 1.30g, 55%; ELSD m/z 971.8 [M+1]+.
N2-(N2-(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부타노일)-N6-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로파노일)-L-리실)-N6-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로파노일)-L-라이신 ( 8 )의 합성
디클로로메탄(2mL) 중 tert-부틸 N2-(N2-(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부타노일)-N6-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로파노일)-L-리실)-N6-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로파노일)-L-리시네이트(7, 0.180g, 0.185mmol)의 교반된 용액에 0℃에서 트리플루오로아세트산(0.3mL)을 첨가한다. 생성된 혼합물을 실온에서 질소 하에 6시간 동안 교반한다. 완료 후, 반응 혼합물을 농축하고, 디에틸 에테르로 세정하고, 건조시켜 N2-(N2-(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부타노일)-N6-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로파노일)-L-리실)-N6-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로파노일)-L-라이신(8)을 담황색 점성 액체로 얻었다. 수율: 0.170g, 98%; ELSD m/z 915.5 [M+1]+.
퍼플루오로페닐 N2-(N2-(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부타노일)-N6-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로파노일)-L-리실)-N6-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로파노일)-L-리시네이트 (Cpd. No. ISP6-065) 의 합성.
0℃에서 테트라하이드로푸란 중 N2-(N2-(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부타노일)-N6-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로파노일)-L-리실)-N6-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로파노일)-L-라이신(8, 1.0당량)의 교반된 용액에 2,3,4,5,6-펜타플루오로페놀(9, 2.0당량) 및 N,N'-디이소프로필카르보디이미드(2.5당량)를 첨가한다. 생성된 반응 용액을 실온에서 교반한다. 완료 후, 용매를 농축하고 분취용 HPLC를 통해 정제한다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 동결건조하여 퍼플루오로페닐 N2-(N2-(4-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로판아미도)부타노일)-N6-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로파노일)-L-리실)-N6-(3-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)프로파노일)-L-리시네이트(Cpd. No. ISP6-065)를 얻는다.
실시예에 기재된 접합체에 사용된 링커 구조는 표 1에 나열되어 있다.
실시예 6 : 표면 플라스몬 공명에 의한 Siglec-2/CD22와의 합성 Siglec-2/CD22 리간드 상호작용의 결합 분석
목적
재조합 인간 및 마우스 CD22 엑토도메인에 대한 합성 Siglec 리간드의 시험관내 결합 특성을 결정하기 위함.
재료 및 방법
다음 리간드를 마우스 및 인간 CD22 결합에 대해 평가하였다: 1) BPC-Neu5Gc PEG(Cpd. No. 26463), 2) BPC-Neu5Gc GAL(Cpd. No. 26339), 3) MPB-Neu5Ac PEG(Cpd. No. 26334), 4) MPB-Neu5Ac GAL(Cpd. No. 26409), 5) Neu5Gc PEG(Cpd. No. 26591). 테스트된 모든 화합물은 다음 실시예에서 접합체에 사용된 PFP-종결, 접합가능한 Siglec 링커 구조의 알킨-종결 전구체이다.
CD22 수용체 엑토도메인에 결합하는 합성 CD22 리간드에 대한 결합 검정을 Biacore 8K+ 기기(Cytiva) 상에서 실행했다. 인간 또는 마우스 CD22 단백질에 결합하는 CD22 접합체를 위한 표면 준비는 두 단계, 즉 스트렙타비딘의 공유 고정화에 이어 Avi-태그되고 비오티닐화된 인간 CD22-Fc 융합(R&D Systems, Cat# AVI1968-050) 및 마우스 CD22의 모노-Fc 융합의 포획으로 구성되었다. 표준 아민 커플링 프로토콜을 사용하여 스트렙타비딘(Invitrogen, Cat#: 434301)을 아세트산나트륨, pH 4.5(Cytiva, Cat# BR100350)에 양 유동 세포 상에 100ug/mL에서 주입함에 의하여 Cytiva CM5 칩(Cytiva, Cat# BR100530)에 고정화하여, 2500RU의 최종 응답을 생성한다. 비오티닐화된 모노 Fc 인간 CD22의 포획은 활성 유동 세포(2) 상의 채널 1-4 및 채널 5-8에서 마우스 CD22에서 수행되었고 참조 유동 세포(1)는 임의의 비-특이적 결합을 고려하기 위해 비변형된 스트렙타비딘으로 유지되었다. 인간 CD22 또는 마우스 CD22(모노-Fc 융합, 5μg/mL)를 활성 유동 세포(2)에 90초 동안 5μL/분으로 주입하여, 약 210RU의 포획된 작제물을 생성했다.
Siglec-리간드 접합된 단백질의 결합 실험은 실행 완충액으로서 HBS-EP+(10mM HEPES, 150mM NaCl, 3mM EDTA, 0.05% Tween-20, pH 7.5)에서 상기에 제조된 표면에 대해 수행되었다. 접합체는 1μM에서 31.25nM까지 실행 완충액에서 1:1로 일련으로 희석되었고 30μL/분에서 90초 동안 참조 및 활성 유동 세포 둘 모두에 대해 주입되었다. 접합체는 그런 다음 300초 동안 표면으로부터 해리되도록 허용되었다. 접합체는 30초 후에 표면으로부터 완전히 해리되므로 재생이 필요하지 않았다.
결과 및 결론
친화성 결정은 표 2에 요약되어 있다. 예상대로, 소위 BPC-Neu5Gc 및 MPB-Neu5Ac-기반 Siglec 리간드 구조는 시알산-기반 Neu5Gc-기반 Siglec 리간드 구조보다 재조합 인간 CD22에 더 단단하게 결합한다. PEG 링커와 GAL 링커를 기반으로 하는 리간드 구조는 결합 친화력에서 다르지 않다. 또한 예상대로, MPB-Neu5Ac-기반 구조는 인간 CD22에 단단하게 결합하고 마우스 CD22에는 매우 약하게만 결합한다. 따라서 BPC-Neu5Gc 및 MPB-Neu5Ac는 Siglec-2 결합에 대해 강화된 Siglec-2/CD22 리간드 접합체에 대한 기초를 형성할 수 있다.
실시예 7 : 단백질-Siglec 리간드 접합체의 생산 및 특성화
목적
시험관내 B 세포 시그널링 검정 및 생체내 면역원성 실험에서 평가하기 위한 단백질의 Siglec 리간드-링커 접합체를 생산하기 위함. 단백질은 아래에 기술된 바와 같이 사내에서 생산하거나 상업적 공급원에서 조달했다.
재료 및 방법
항체(항-IgD 인간 IgG1 키메라 항체, 아달리무맙 항-hTNFα hIgG1) 발현, 정제 및 분석
항체 발현을 위해, ExpiFectamine 293 트랜스펙션 키트(Life Technologies, A14524)를 사용하여 서스펜션 Expi293F 세포(Life Technologies, A14527)를 중쇄 및 경쇄 플라스미드(pTT5-기반)로 1:1 비율에서 형질감염시켰다. 형질감염-후 3-6일에 원심분리에 의해 배지를 수확하고 0.2μm PES 진공 멸균 일회용 필터 유닛(ThermoScientific, 5670020)을 사용하여 여과하였다.
정제는 각 250mL 배양 상등액에 대해 1.5mL MabSelect Sure 수지(Cytiva/GE Cat #: 17-5438-03)로 수행했다. 간략하게, 각각의 컬럼을 PBS pH 7.2로 평형화하고 배양 상등액을 장입하였다. 장입 단계 후, 컬럼을 PBS pH 7.2로 세정하고 10mL IgG 용리 완충액(Thermo Scientific Ref 21004)으로 용리하였다. 용리 풀의 pH는 각 10mL 용리 풀에 대해 1mL 1M 인산나트륨 pH 6.5로 조정되었다. 마지막으로, 30kDa Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit을 사용하여 PBS pH 7.2로 완충액 교환을 수행했다.
내독소 함량의 분석은 Charles River Endosafe PTS 0.01-1 EU/ml 검출을 사용하여 수행되었다. 크기 배제 크로마토그래피는 Sepax-Zenix SEC-300, 200mm x 7.8mm ID, 3uM 컬럼이 있는 Agilent Chemstation HPLC-SEC에서 수행되었다. 모세관 겔 전기영동(cGE)은 Perkin Elmer Chip(Cat # 760499)이 있는 Caliper LabChip GXII Protein 200에서 수행되었다. LC-MS 분석은 Agilent AdvanceBio Desalting-RP, 컬럼 1000A, 10um가 있는 SciEX LC 5600+, ExionLC AD, Analyst TF 1.8.1에서 수행되었다.
대장균 L-아스파라기나제의 발현 및 정제
대장균으로부터 L-아스파라기나아제 2에 상응하는 DNA 서열(aa L23-Y348, uniprot P00805)을 N-말단 His 태그를 함유하는 pET 플라스미드 안으로 클로닝했다. 작제물을 ClearColi BL21(DE3) electrocompetent 세포(Lucigen, 60810-1) 안으로 형질전환하고 100μg/mL 암피실린을 함유하는 Miller's Luria 브로쓰(LB)에서 밤새 성장시켰다. 다음으로, 하룻밤 배양물을 100μg/mL 암피실린을 함유하는 신선한 LB에서 1:50으로 희석하고 37℃에서 OD600 1-1.5로 성장시켰다. 배양물을 그 다음 37℃에서 24시간 동안 0.1mM 이소프로필 β-d-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG)로 유도하였다. 세포를 20mL에 대해 4,000rpm에서 원심분리에 의해 펠릿화하고 40mL의 용리 완충액(50mM 인산나트륨 pH 7.86, 200mM NaCl, 20mM 이미다졸 및 EDTA-유리 프로테아제 억제제 칵테일 정제)에 재현탁시켰다. 재현탁된 세포를 Qsonica 초음파처리기를 사용하여 초음파 처리했다(매개변수: 펄스 ON 1초, 펄스 OFF 2초, 2분, 진폭 40%). 용리물을 16,000rpm에서 20분 동안 원심분리에 의해 정화하고 Ni-NTA 수지(Invitrogen, 60-0442)와 함께 4℃에서 1시간 동안 종단간 혼합하면서 인큐베이션했다. 혼합물을 중력 흐름 크로마토그래피를 위해 25mL 컬럼으로 옮기고 세정 완충액(50mM 인산나트륨 pH 7.86, 200mM NaCl, 20mM 이미다졸)으로 세정하였다. 단백질을 50mM 인산나트륨 pH 7.86, 200mM NaCl 및 300mM 이미다졸을 함유하는 완충액으로 용리하고 10kDa Amicon Ultra-15 원심분리 필터 유닛을 사용하여 PBS pH 7.2로 완충액 교환을 수행하였다. 내독소 제거는 Triton X-114 추출 방법을 사용하여 수행하였다. 간단히 말해, Triton X-114를 최종 농도 2% v/v로 단백질 용액에 첨가하였다. 용액을 4℃에서 2시간 동안 종단간 혼합하면서 인큐베이션하였다. 샘플을 37℃ 수조로 10분 동안 옮기고 이어서 실온에서 20분 동안 20,000g에서 원심분리했다. 상단 단백질 층은 피펫팅에 의해 Triton X-114 층에서 분리했다. 제조업체 프로토콜에 따라 HiPPR 세정제 제거 수지(ThermoFisher, 88305)를 사용하여 세정제를 제거했다.
내독소 함량의 분석은 Charles River Endosafe PTS 0.01-1 EU/ml 검출을 사용하여 수행되었다. 크기 배제 크로마토그래피는 Sepax-Zenix SEC-300, 200mm x 7.8mm ID, 3uM 컬럼이 있는 Agilent Chemstation HPLC-SEC에서 수행되었다. 모세관 겔 전기영동(cGE)은 Perkin Elmer Chip(Cat # 760499)이 장착된 Caliper LabChip GXII Protein 200 상에서 수행되었다. LC-MS 분석은 Agilent AdvanceBio Desalting-RP, 컬럼 1000A, 10um가 있는 SciEX LC 5600+, ExionLC AD, Analyst TF 1.8.1 상에서 수행되었다.
단백질-Siglec 리간드 접합
펜타플루오로페닐(PFP) 접합가능한 Siglec 리간드 링커는 10% v/v의 50mM 테트라붕산나트륨 pH 8.5 및 10% v/v DMSO의 존재에서 원하는 표지화 정도를 기준으로 단백질보다 4-30배의 몰비로 반응 혼합물에 첨가되었다. 반응물은 25℃에서 3시간 동안 인큐베이션되었다. 3시간 인큐베이션 기간 후, 10% v/v의 1M Tris-HCl pH 8.0을 첨가하여 미반응된 링커-페이로드를 켄칭했다. 그런 다음 중화된 반응물은 25℃에서 15분 동안 인큐베이션하도록 허용되었다.
단백질 Siglec-리간드 접합체 정제
켄칭된 접합 반응물은 4℃에서 Superdex 200 Increase 10/300 GL 또는 HiLoad 16/600 Superdex 200 pg를 유속 0.75mL/분에서, PBS pH 7.2로 사용하여 분취용 크기 배제 크로마토그래피로 정제된다.
단백질-Siglec 리간드 접합체의 분석
LC-MS
질량 분석계: SciEX LC 5600+, ExionLC AD, Analyst TF 1.8.1
HPLC: Agilent AdvanceBio Desalting-RP, 컬럼 1000A, 10um
2.1mm x 12.5mm, 유속 400ul/분, 샘플 장입: 5ug
완충액 A: 물 + 0.1% 포름산
완충액 B: 아세토니트릴 + 0.1% 포름산
분석적 SEC
Superose 6 Increase 10/300 GL
주입 부피: 샘플 1mg/mL에서 25uL.
완충액: 50mM 인산나트륨 + 400mM 과염소산나트륨, pH 6.2
유속: 0.7mL/분
25℃에서 실행 시간 40분
모세관 겔 전기영동
Caliper LabChip GXII 단백질 200
내독소 측정
Charles River Endosafe PTS 카트리지 0.01-1 EU/ml
Lonza Pyrogene C 평가변수 내독소 검정
"LDR" 또는 리간드-대-약물 비율은 여기에 기술된 바와 같이 접합의 정도가 다른 종의 상대적 존재비를 평가함에 의해 LC/MS에 의해 각 접합체 제제에 대해 측정되었다. 무작위 접합 방법(이 경우 라이신/아민에 대한 것)은 아달리무맙 종당 접합의 정도가 다른 종의 혼합물을 초래한다. 이러한 일련의 분자 종은 다음과 같이 제시될 수 있다:
이 설명에서, 각 생물치료제 Y(이 경우 아달리무맙)는 X n L에 의해 정의된 Siglec 리간드에 공유적으로 결합되며, 여기서 X는 원자가 n의 시알산 종으로 0에서 m 사이의 다양한 Siglec 리간드-대-생물치료제 비율을 갖는다. 모든 종은 동일한 시알산 원자가 n(1가, 2가 또는 3가)을 갖는다.
접합의 정도가 다양한 종의 그러한 앙상블에서 접합의 정도의 총 측정치로서, LDR은 다음과 같이 정의될 수 있다: LDR은 상기 비율이 다양한 종의 혼합물에서 개별 Siglec 리간드-대-생물치료제 비율(정수 값 i)의 가중 평균이고 P i(로, )는 혼합물에서 각 종의 분획 풍부도를 나타낸다:
결과
샘플 연구에 사용된 Siglec-리간드 접합체의 예로서, 아달리무맙 및 아달리무맙-Siglec 리간드 접합체에 대한 순도 데이터가 도 9에 나타나 있다. 도 9는 아달리무맙 hIgG1-Siglec 리간드 접합체에 대한 예시적인 순도 및 물리화학적 특성화 데이터를 묘사한다. 아달리무맙 접합체는 접합 후 사용되는 Siglec-링커의 구조와 리간드/링커-대-약물 비율("LDR")에서 다양하다.
도 9a는 아달리무맙 접합체에 대한 모세관 겔 전기영동 데이터를 보여준다. PFP Siglec-링커 화합물과 무작위 라이신 접합의 사용에 기인하여, LC/MS 분석과 cGE(모세관 겔 전기영동) 분석 둘 모두는 LDR에서 이종성을 밝힌다. 예상대로 각 접합체는 정의된 LDR이 다른 종의 앙상블이다. cGE는 이 이종성과 일치하는 느린 이동성과 결합을 보여준다. LDR은 LC/MS 분석에 의해 결정되고 개별 LDR 종의 가중 평균으로 정의된다.
모든 접합체는, 목적하는 올리고머 구조(예를 들어, 단량체, 이량체, 삼량체)가 분취용 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제됨으로 올리고머 종에 대해 균질하게 정제되었다. 도 9b는 분석적 크기 배제에 의해 측정된, 모체의 아달리무맙 IgG 및 아달리무맙-Siglec 리간드 접합체에 대한 예시적인 순도 데이터를 보여준다. 모든 모체의 단백질 제제 및 접합체 제제는 분석적 SEC에 의해 >99% 순도였다.
실시예 8 : Siglec 리간드-항-IgD 항체 접합체에 의한 마우스 일차 B 세포의 B 세포 수용체-매개된 활성화의 억제.
목적 및 소개
이 실험의 목적은 B 세포 수용체(BCR) 작용제 IgG-Siglec 리간드 접합체의 마우스 B 세포 활성화에 대한 억제성 효과에 대해 테스트하는 것이었다.
기재된 플랫폼 기술은 그 클론유형 B 세포 수용체를 통한 B 세포의 활성화가 CD22/Siglec-2 억제성 공동수용체의 공동-계합된 B 세포 수용체에 물리적인 동원을 통하여 억제될 수 있다는 전제에 근거한다. 이론에 구애됨이 없이, B 세포 수용체에 동원된 CD22는 B 세포 수용체에서 높은 국소 단백질 키나아제 활성에 대한 그 근접성의 장점에 의해 그 ITIM 세포질 모티프 티로신에서 인산화된다. 그런 다음 인산화된 CD22는 SHP-1 및 SHP-2와 같은 포스파타제를 B 세포 활성화 복합체에 근접한 세포 표면으로 동원한다. 이러한 상승된 국소 포스파타제 활성은 B 세포 활성화에 필요한 B 세포 활성화 복합체의 성분을 탈인산화하고 따라서 B 세포 수용체 계합에 대한 반응을 차단한다. 정상적인 상황 하에서 Siglec-2 면역억제 메커니즘은 비정상적인 B 세포 활성화를 확인하여 자가반응성 항체 생산, 과염증 및 자가면역으로부터 보호하는 작용을 한다. 기재된 플랫폼 기술은 이 자연 현상을 이용하여 외부 단백질을 자체로 은폐하여 주어진 외부 단백질에 특이적인 나이브 B 세포 클론에서만 B 세포 활성화를 약화시켜 다른 온전한 항원에 대한 B 세포 반응은 남겨 두면서 외부 단백질에 대한 면역글로불린 생산을 차단한다.
일차 B 세포 모집단의 높은 다양성, 및 B 세포 수용체 서열과 클론의 높은 다양성(인간당 최대 1012)은 단일의 잘-정의된 BCR 항원으로 시험관내 BCR 작용기전을 연구하는데 어려움을 제시한다. 이 이유로, B 세포/BCR 클론성에 관계없이 - BCR에 결합, 가교 및 활성화할 수 있는 항-IgD 또는 항-IgM 항체와 같은 범-BCR 활성화제가 시험관내에서 BCR 활성화를 평가하는데 사용된다. 이 실시예에 기재된 실험에서 항-마우스 IgD 모노클로날 항체는 B 세포 활성화에 대한 Siglec-2-B 세포 수용체 공동-계합의 효과를 연구하기 위해 모체의 IgG 형태에 또는 IgG-Siglec-리간드 접합체로 사용된다.
BCR 결합 효능에 대한 항-IgD 접합의 영향을 제어하기 위해, 경쟁 결합 검정을 사용하여 Siglec 리간드 접합체의 결합 활성을 평가하고 명백한 억제 효과가 Siglec-2 x BCR 공동-계합으로 인한 것이고 수용체 결합을 위한 항-IgD의 일반적인 손상이 아니었음을 확인했다.
재료 및 방법 - 시험관내 뮤어라인 B-세포 활성화 및 표면 IgD 경쟁 검정
항-IgD 및 항-IgD-Siglec 리간드 테스트 항목을 실시예 7에 기재된 바와 같이 제조하였다.
C57BL/6 마우스로부터 비장세포를 단일 세포 현탁액으로 수확하고, ACK 완충액을 사용하여 적혈구 용리를 실시하고, 완전 RPMI 배지에서 둥근 바닥 96 웰 플레이트에 웰당 200,000개 세포의 농도로 도말하였다. 세포를 증가하는 농도의 항-마우스 IgD 또는 Siglec 리간드-접합된 항-마우스 IgD의 첨가에 의해 3시간 동안 자극하였다. B 세포 활성화는 유동 세포분석법에 의해 평가하였다.
기재된 자극 후 B 세포 활성화를 측정하기 위해, 세포를 1200rpm에서 5분 동안 회전시키고 PBS로 헹구어 세포를 두 번 세정했다. 그런 다음 세포를 염색 완충액(1% 소 혈청 알부민/0.1% 아지드화 나트륨/1 x 인산염 완충 식염수)에 재현탁하고 항-CD45, 항-CD19, 항-CD69 및 항-CD86 항체(BD Biosciences, Biolegend, Fisher)의 첨가 전에 5분 동안 Fc-블록(BD Biosciences)과 함께 인큐베이션하였다. 그런 다음 세포를 실온에서 추가로 30분 동안 어두운 곳에서 인큐베이션했다. 그런 다음 세포를 염색 완충액으로 3회 세정한 다음 ZE5(BioRad)에서 분석했다. FlowJo(v10.8.0) 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석을 수행했다.
Siglec 리간드-접합된 항-마우스 IgD 및 항-마우스 IgD 결합의 경쟁 결합 분석은 상기 기술된 바와 같이 제조된 비장세포에서 수행되었다. 이 검정을 위해, 세포를 완전한 RPMI 배지에서 둥근 바닥 96웰 플레이트에 웰당 200,000개 세포의 농도로 시딩했다. 세포를 그 다음 마우스 Fc-블록(BD Biosciences)과 함께 5분 동안 인큐베이션하였다. 이 배양 기간 후, 0.14nM의 고정된 농도에서 항-마우스-IgD-AlexaFluor647을 RPMI 단독 또는, 항-CD19 및 항-CD45뿐만 아니라, 비-형광으로 표지된 Siglec 리간드-접합된 항-마우스 IgD의 증가하는 적정과 함께 세포에 첨가하였다. 세포를 어두운 곳에서 30분 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 그 후 세포를 염색 완충액(1% 소 혈청 알부민/0.1% 아지드화 나트륨/1 x 인산염 완충 식염수)으로 원심분리에 의해 2회 세정하고 항체 결합은 적어도 10,000개 세포의 평균 형광 강도(MFI)의 결정을 통해 유동 세포분석법(ZE5, BioRad)에 의해 분석하였다.
결과 및 결론
도 10, 도 11 및 도 12 모두는 마우스 일차 B 세포가 B 세포 수용체-작용 항-IgD 항체 또는 1가 또는 2가 리간드 구조를 담지하는 B 세포 수용체-작용 항-IgD-Siglec 리간드 접합체로 처리되는 시험관내 B 세포 활성화 검정을 묘사한다. 항-IgD 및 항-IgD-Siglec 리간드 접합체의 B 세포 자극 활성을 용량 적정 실험에서 CD69 상향조절의 활성화 판독값과 비교한다. 상이한 처리 그룹에서의 CD69 수준은 CD69-양성인 세포의 백분율(도 10a, 11a, 12a) 또는 CD69 평균 형광 강도(MFI)(도 10b, 11b, 12b)를 통해 평가된다. 테스트된 접합체에서 Siglec 리간드는 링커 구조("PEG" 또는 "Gal") 및 원자가("1가" 또는 "2가")에서 다양하고 접합체는 또한 리간드/링커-대-약물 비율("LDR"), 또는 약물 분자당 Siglec 리간드 구조의 평균 수에서 다양하다. 모체의 항-IgD IgG가 % CD69-양성 세포 및 CD69 MFI에서 강력한 농도-의존적 증가를 유도하는 경우, Siglec 리간드-항-IgD 접합체는 억제된 활성화를 나타낸다. 억제의 정도는 원자가에 따라 증가하고 GAL-기반 링커보다 PEG-기반 링커에서 또한 더 강력하다. 일반적으로, 억제의 정도에 대해 3가 > 2가 > 1가 Siglec 리간드 구조로, 더 높은 원자가가 B 세포 활성화의 더 큰 억제를 초래한다. 어떤 경우에는 B 세포 활성화가 완전히 억제된다(예를 들어, BPC-Neu5Gc 3가 PEG - LDR 8).
도 13은 모체의, 비접합된 항-IgD 항체와 비교하여 마우스 일차 B 세포에 결합하는 Siglec 리간드-항-IgD 항체 접합체의 평가를 묘사한다. 결합은 Alexa-647-표지된 항-IgD 항체와의 경쟁 검정 형식에서 형광 세포계수법에 의해 평가된다. 도 13a는 비표지된 항-IgD-Siglec 리간드 접합체 및 비접합된, 비표지된 항-IgD 항체에 의한 IgD+ B 세포에 대한 형광-표지된 항-IgD 결합의 농도-의존적 억제에 대한 용량-반응 결과를 묘사한다. 각각의 비표지된 테스트 항목에 대한, 나노몰로의 결합 IC50이 표시된다. 도 13b는 결합 검정 시스템에 대한 개략도이다. 데이터는 Siglec 리간드 접합체에 대한 결합 IC50에 대해 효과가 없거나 약간의 효과를 나타내며, 이는 도 10, 도 11 및 도 12에서 관찰된 B 세포 활성화가 접합체의 고유한 B 세포 수용체 특성에 대한 손상을 통해 설명될 수 없음을 나타낸다.
실시예 9 : Siglec 리간드-항-IgD 항체 접합체에 의한 마우스 일차 B 세포의 B 세포 수용체-매개된 활성화의 억제는 강력하게 CD22-의존적이다
목적
이들 실험의 목적은 항-IgD-Siglec 리간드 접합체에 의한 B 세포 수용체-매개된 B 세포 활성화의 억제의 CD22-의존성을 평가하는 것이었다. 이 실시예는 B 세포 활성화에 대한 CD22-B 세포 수용체 공동-계합의 효과를 연구하기 위해 B 세포 클론의 풀에서 범-B 세포 수용체 작용기전을 사용하는 실시예 8에 기술된 실험으로부터 후속한다. 이 실시예에서 야생형 마우스로부터 일차 B 세포를 사용하여 CD22에 대한 BCR 억제의 의존성을 평가했다. 실시예 8에서와 같이, 경쟁적 BCR 결합 분석을 사용하여 항-IgD-Siglec 리간드 접합체의 BCR 결합 활성에 대한 단백질 라이신 접합의 손상 효과에 대해 제어하였다.
재료 및 방법
항-IgD 및 항-IgD-Siglec 리간드 테스트 항목을 실시예 7에 기재된 바와 같이 제조하였다.
C57BL/6 마우스로부터 비장세포를 단일 세포 현탁액으로 수확하고, ACK 완충액을 사용하여 적혈구 용리를 실시하고, 완전 RPMI 배지에서 둥근 바닥 96 웰 플레이트에 웰당 200,000개 세포의 농도로 도말하였다. 세포를 증가하는 농도의 항-마우스 IgD 또는 Siglec 리간드-접합된 항-마우스 IgD의 첨가에 의해 3시간 동안 자극하였다. B 세포 활성화는 그 다음 유동 세포분석법에 의해 평가하였다.
기재된 자극 후 B 세포 활성화를 측정하기 위해 세포를 1200rpm에서 5분 동안 회전시키고 PBS로 헹구어 세포를 두 번 세정했다. 그런 다음 세포를 염색 완충액(1% 소 혈청 알부민/0.1% 아지드화 나트륨/1 x 인산염 완충 식염수)에 재현탁하고 항-CD45, 항-CD19, 항-CD69 및 항-CD86 항체(BD Biosciences, Biolegend, Fisher)의 첨가 전에 5분 동안 Fc-블록(BD Biosciences)과 함께 인큐베이션하였다. 그런 다음 세포를 실온에서 추가로 30분 동안 어두운 곳에서 인큐베이션했다. 그런 다음 세포를 염색 완충액으로 3회 세정한 다음 ZE5(BioRad)에서 분석했다. FlowJo(v10.8.0) 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석을 수행했다.
Siglec 리간드-접합된 항-마우스 IgD 및 항-마우스 IgD 결합의 경쟁은 상기 기술된 바와 같이 제조된 비장 세포에서 수행되었다. 이 검정을 위해, 세포를 완전한 RPMI 배지에서 둥근 바닥 96웰 플레이트에 웰당 200,000개 세포의 농도로 시딩했다. 세포를 그 다음 마우스 Fc-블록(BD Biosciences)과 함께 5분 동안 인큐베이션하였다. 이 배양 기간 후, 0.14nM의 고정된 농도에서 항-마우스-IgD-AlexaFluor647을 RPMI 단독 또는, 항-CD19 및 항-CD45뿐만 아니라, 비-형광으로 표지된 Siglec 리간드-접합된 항-마우스 IgD의 증가하는 적정과 함께 세포에 첨가하였다 세포를 어두운 곳에서 30분 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 그 후 세포를 염색 완충액(1% 소 혈청 알부민/0.1% 아지드화 나트륨/1 x 인산염 완충 식염수)으로 원심분리에 의해 2회 세정하고 항체 결합은 적어도 10,000개 세포의 평균 형광 강도(MFI)의 결정에 의해 유동 세포분석법(ZE5, BioRad)에 의해 분석하였다.
결과 및 결론
도 14는 마우스 일차 B 세포가 B 세포 수용체 작용 항-IgD 항체 또는 항-IgD-Siglec 리간드 접합체로 처리되는 시험관내 B 세포 활성화 검정을 묘사하고, 여기서 동일한 테스트 항목이 야생형 마우스로부터의 B 세포를 처리하는데 사용된다. 접합체 Siglec 리간드("BPC-Neu5Gc 1가 PEG - LDR 9", "BPC-Neu5Gc 2가 PEG - LDR 6", "BPC-Neu5Gc 3가 PEG - LDR 6" 및 "BPC-Neu5Gc 3가 PEG - LDR 8")는 Siglec-2 결합에 대해 강화된다. 항-IgD 및 항-IgD-Siglec 리간드 접합체의 B 세포 자극 활성을 용량 적정 실험에서 CD69 상향조절의 활성화 판독값과 비교한다. 상이한 처리 그룹에서의 CD69 수준은 CD69-양성인 세포의 백분율을 통해 평가된다. 테스트된 접합체에서의 Siglec 리간드는 PEG-기반 링커 구조("PEG")를 함유하고 원자가에서 다양하다("1가", "2가" 및 "3가"). 접합체는 또한 리간드/링커-대-약물 비율("LDR") 또는 약물 분자당 Siglec 리간드 구조의 평균 수에서 다양하다. 이전에 실시예 8 및 도 10, 도 11 및 도 12에 도시된 바와 같이, 야생형 B 세포 활성화는 Siglec 리간드-담지 항-IgD 접합체로 강력하게 억제된다. 대조적으로, CD22 녹아웃("CD22 KO") 마우스로부터 B 세포는, 활성화 효능에 영향을 미치지 않거나 약간만 영향을 미침으로 Siglec 리간드-접합체에 대해 완전한 B 세포 활성화 활성을 나타낼 수 있다. 중요하기로는, 이들 결과는 Siglec-2 리간드 접합체의 억제 효과가 예상대로 Siglec-2/CD22에 의해 매개됨을 나타낸다.
실시예 8(도 13)에서 이전에 테스트된 바와 같이, Siglec 리간드-항-IgD 접합체 및 모체의 IgD의 BCR 결합 활성은, BCR 활성화에 대해 상기 도 14에서 테스트된 것과 동일한 제제로 세포측정 검정(도 15)에서 평가되었다. 경쟁 결합 분석은 가장 높은 LDR 3가 접합체(BPC-Neu5Gc 3가 PEG - LDR 8)를 제외한 모든 접합체 제제가 BCR 결합에 대해 완전히 활성임을 밝힌다. 이들 결과는 항-IgD 접합체에서 B 세포 활성화의 억제가 BCR의 불활성화로 인해 설명될 수 없었던 CD22 KO 활성화 실험 결과를 확증한다.
실시예 10 : Siglec 리간드-항-IgD 항체 접합체에 의한 마우스 일차 B 세포의 B 세포 수용체-매개된 활성화의 억제는 Siglec-2/CD22 결합의 강화를 필요로 한다
목적
여기에 기재된 실험의 목적은 B 세포 수용체-매개된 B 세포 활성화의 억제를 위한 강화된 Siglec-2 결합의 중요성을 평가하는 것이었다. 본 실시예는 마우스 B 세포 활성화에 대한 CD22-B 세포 수용체 공동-계합의 효과를 연구하기 위해 B 세포 클론의 풀에서 범-B 세포 수용체 작용기전을 사용하는 실시예 8 및 9에 기술된 실험으로부터 후속한다. 이 실시예에서, 준비된 접합체에 제시된 Siglec-2 리간드는 강화된 Siglec-2 리간드 접합체(BPC-Neu5Gc-기반) 또는 네이티브 뉴라민산 구조에 기반한 Siglec-2 리간드(Neu5Gc)를 사용하여, Siglec-2 결합에 대해 그 효능에서 다양했다. 여기서 사용된 Siglec 리간드는 이전에 실시예 4에서 평가되었고 CD22 결합 효능에 대해 확인되었다. 강화된 및 비-강화된 Siglec-2를 담지하는 접합체의 비교는 기재된 플랫폼 기술의 B 세포 수용체-억제 효과에 대한 Siglec-2 친화성의 중요성을 평가할 수 있었다.
재료 및 방법
항-IgD 및 항-IgD-Siglec 리간드 테스트 항목을 실시예 7에 기재된 바와 같이 제조하였다.
C57BL/6 마우스로부터 비장세포를 단일 세포 현탁액으로 수확하고, ACK 완충액을 사용하여 적혈구 용리를 실시하고, 완전 RPMI 배지에서 둥근 바닥 96웰 플레이트에 웰당 200,000개 세포의 농도로 도말했다. 증가하는 농도의 항-마우스 IgD 또는 Siglec 리간드-접합된 항-마우스 IgD를 첨가함에 의해 세포를 3시간 동안 자극하였다. B 세포 활성화를 유동 세포분석법에 의해 평가하였다.
기재된 자극 후 B 세포 활성화를 측정하기 위해, 세포를 1200rpm에서 5분 동안 회전시키고 PBS로 헹구어 세포를 두 번 세정했다. 그런 다음 세포를 염색 완충액(1% 소 혈청 알부민/0.1% 아지드화 나트륨/1 x 인산염 완충 식염수)에 재현탁하고 항-CD45, 항-CD19, 항-CD69 및 항-CD86 항체(BD Biosciences, Biolegend, Fisher)의 첨가 전에 5분 동안 Fc-블록(BD Biosciences)과 함께 인큐베이션하였다. 그런 다음 세포를 실온에서 추가로 30분 동안 어두운 곳에서 인큐베이션했다. 그런 다음 세포를 염색 완충액으로 3회 세정한 다음 ZE5(BioRad)에서 분석했다. FlowJo(v10.8.0) 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석을 수행했다.
Siglec 리간드-접합된 항-마우스 IgD 및 항-마우스 IgD 결합의 경쟁은 상기 기술된 바와 같이 제조된 비장세포에서 수행되었다. 이 검정을 위해, 세포를 완전한 RPMI 배지에서 둥근 바닥 96웰 플레이트에 웰당 200,000개 세포의 농도로 시딩했다. 세포를 그 다음 마우스 Fc-블록(BD Biosciences)과 함께 5분 동안 인큐베이션하였다. 이 배양 기간 후, 0.14nM의 고정된 농도에서 항-마우스-IgD-AlexaFluor647을 RPMI 단독 또는, 항-CD19 및 항-CD45뿐만 아니라, 비-형광으로 표지된 Siglec 리간드-접합된 항-마우스 IgD의 증가하는 적정과 함께 세포에 첨가하였다 세포를 어두운 곳에서 30분 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 그 후 세포를 염색 완충액(1% 소 혈청 알부민/0.1% 아지드화 나트륨/1 x 인산염 완충 식염수)으로 원심분리에 의해 2회 세정하고 항체 결합은 적어도 10,000개 세포의 평균 형광 강도(MFI)의 결정에 의해 유동 세포분석법(ZE5, BioRad)에 의해 분석하였다.
결과 및 결론
도 16은 마우스 일차 B 세포가 B 세포 수용체 작용 항-IgD 항체 또는 항-IgD-Siglec 리간드 접합체로 처리되는 시험관내 B 세포 활성화 검정을 묘사하고, 여기서 Siglec 리간드는 Siglec-2 결합에 대해 강화되거나("BPC-Neu5Gc 1가 PEG - LDR 9" 및 "BPC-Neu5Gc 2가 PEG - LDR 6") 또는 강화되지 않는다("Neu5Gc 1가 PEG - LDR 10" 및 "Neu5Gc 2가 PEG - LDR 7"). 항-IgD 및 항-IgD-Siglec 리간드 접합체의 B 세포 자극 활성을 용량 적정 실험에서 CD69 상향조절의 활성화 판독값과 비교한다. 상이한 처리 그룹에서의 CD69 수준은 CD69-양성인 세포의 백분율을 통해 평가된다. 1가(도 16a) 및 2가(도 16b) Siglec 리간드 접합체에 대한 용량 반응 곡선이 도시되어 있다. 접합체는 또한 리간드/링커-대-약물 비율("LDR") 또는 약물 분자당 Siglec 리간드 구조의 평균 수에서 다양하다. 강화된 Siglec 리간드 접합체가 B 세포 활성화의 강력한 억제를 나타내는 경우, 강화되지 않은 Neu5Gc Siglec 리간드를 담지하는 접합체는 B 세포 활성화의 억제의 완전한 부재를 나타낸다. 중요하게도, 이 실시예는 CD22에 대한 네이티브 뉴라민 친화성이 Siglec 리간드 접합체의 BCR 억제 효과를 매개하기에 불충분하다는 것을 밝힌다. 이들 결과는 또한 BCR 활성화 억제 효과가 접합을 통한 항-IgD 항체에 대한 손상의 단순하고 사소한 결과가 아님을 확인한다; 다시 한 번, 접합된 항-IgD 분자는 Siglec-2 결합이 너무 약하거나 B 세포가 CD22를 결하는 경우 BCR 활성화에 대해 완전히 활성이다.
도 17은 B 세포 수용체 활성화의 Siglec 리간드-접합체-매개된 억제를 위한 CD22 계합의 중요성에 대해 시험하는 별도의 시험관내 일차 마우스 B 세포 활성화 검정을 묘사한다. 도 16 및 실시예 8 및 9에서와 같이, 마우스 일차 B 세포를 B 세포 수용체 작용 항-IgD 항체 또는 다양한 항-IgD-Siglec 리간드 접합체로 처리하였다. 이 경우 접합체는 강화된 Siglec 링커("BPC-Neu5Gc 1가 PEG - LDR 9", "BPC-Neu5Gc 2가 PEG - LDR 6", "BPC-Neu5Gc 3가 PEG - LDR 6" 및 "BPC-Neu5Gc 3가 PEG - LDR 8"), 또는 음성 대조군, Siglec 결합 결정자를 결하는 아시알로 링커("Asialo 1가 PEG - LDR 7", "Asialo 2가 PEG - LDR 8" 및 "Asialo 3가 PEG - LDR 7")를 수반한다. 약한 친화력 Siglec-2 리간드를 담지하는 접합체와 마찬가지로 Siglec-2 결합 활성이 없는 링커를 담지하는 접합체는 BCR 및 B 세포 활성화에 대해 완전히 활성이다.
실시예 8 및 9에서와 같이, 접합체(강화 및 아시알로 형태) 및 모체의 항-IgD를 경쟁 세포측정 검정에서 결합 활성에 대해 평가하였다(도 18). 테스트 항목은 도 17에 사용된 것과 동일하다. 1가 및 2가 접합체는 모체의 항-IgD에 대해 동일한 결합 IC50을 나타낸다. 3가 접합체의 경우, 낮은 LDR 제제는 결합에 대해 교란되지 않는 반면, 도 15에서와 같이, 높은 LDR 3가 접합체는 경쟁 결합 검정에서 더 약한 결합 IC50을 나타낸다. 전반적으로, 이들 결과는 Siglec 리간드 항-IgD 접합체가 Siglec-2/CD22 공동-계합 활성을 통한 BCR 활성화에 대해 억제되는 동안 BCR 결합에 대한 완전한 기능적 활성을 유지할 수 있는 상기 실시예 결과를 확증한다.
실시예 11 : Siglec 리간드-항-IgD 항체 접합체에 의한 마우스 일차 B 세포의 B 세포 수용체-매개된 활성화의 억제는 시스 에서 BCR 및 CD22/Siglec-2의 계합을 필요로 한다
목적 및 소개
여기에 기재된 실험의 목적은 B 세포 수용체를 통한 B 세포 활성화의 억제를 위해 CD22/Siglec-2 및 B 세포 수용체에서 동일한 분자에 의한 시스 공동-계합의 중요성을 평가하는 것이다. 본 실시예는 B 세포 활성화에 대한 CD22-B 세포 수용체 공동-계합의 효과를 연구하기 위해 B 세포 클론의 풀에서 범-B 세포 수용체 작용기전을 사용하는 실시예 8, 9 및 10에 기술된 실험으로부터 후속한다. 이 실시예에서 Siglec-2 리간드(강화, BPC-Neu5Gc-기반)는 항-IgD(상기 실험에서와 같음)에서 시스로 존재하거나 B 세포 수용체를 계합하지 않는 별도의 음성 대조군 항체(아달리무맙 항-TNFα)에서 트랜스로 존재했다. 후자의 경우, 아달리무맙-Siglec 리간드를 변형되지 않은 항-IgD BCR 작용제 항체의 고정된 농도와 함께 비장세포에 공동-투여했다.
제2 실험은 BCR 작용제 항체와 Siglec 리간드-BCR 작용제 항체 접합체의 혼합물이 있는 경우에 B 세포 활성화에 대한 결과를 평가했다. 항-IgD IgG와 Siglec 리간드-항-IgD 접합체의 혼합물을 B 세포 활성화의 억제에 대해 평가했으며, 여기서 BPC-Neu5Gc 2가 PEG LDR6-항-IgD는 2nM 항-IgD 작용제 항체의 존재 또는 부재에서 다양한 농도로 첨가되었다.
재료 및 방법
항-IgD 및 항-IgD-Siglec 리간드 테스트 항목을 실시예 7에 기재된 바와 같이 제조하였다.
B 세포 활성화의 SigL-매개된 억제가 시스 또는 트랜스에서 발생하는지를 결정하기 위한 검정을 상기 기재된 바와 같이 제조된 C57BL/6 마우스로부터의 비장세포에 대해 수행하였다. 이 검정을 위해 세포를 완전한 RPMI 배지에서 둥근 바닥 96 웰 플레이트에 웰당 200,000개 세포의 농도로 시딩했다. 세포를 마우스 Fc-블록(BD Biosciences)과 함께 5분 동안 인큐베이션하였다. 이 인큐베이션 기간 후, 인간 IgG1 동형, 항-마우스 IgD, Siglec 리간드-접합된 항-마우스 IgD 또는 Siglec 리간드-접합된 아달리무맙의 증가하는 농도를 세포에 첨가하였다. 별도의 조건 세트에서, SigL-접합된 아달리무맙의 증가하는 농도와 함께 고정된 농도의 2nM 항-마우스 IgD를 세포에 첨가하였다. 세포를 3시간 동안 자극한 다음 B 세포 활성화를 유세포 분석법에 의해 평가했다.
기재된 자극에 이어서 B 세포 활성화를 측정하기 위해, 세포를 1200rpm에서 5분 동안 회전시키고 PBS로 헹구어 세포를 두 번 세정했다. 그런 다음 세포를 염색 완충액(1% 소 혈청 알부민/0.1% 아지드화 나트륨/1 x 인산염 완충 식염수)에 재현탁하고 항-CD45, 항-CD19, 항-CD69 및 항-CD86 항체(BD Biosciences, Biolegend, Fisher)의 첨가 전에 5분 동안 Fc-블록(BD Biosciences)과 함께 인큐베이션하였다. 그런 다음 세포를 실온에서 추가로 30분 동안 어두운 곳에서 인큐베이션했다. 그런 다음 세포를 염색 완충액으로 3회 세정한 다음 ZE5(BioRad)에서 분석했다. FlowJo(v10.8.0) 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석을 수행했다.
결과 및 결론
도 19는 B 세포 수용체 활성화의 억제를 위한 시스 B 세포 수용체 및 CD22 공동-계합의 중요성에 대한 시험관내 일차 마우스 B 세포 활성화 검정을 묘사한다. 도 19a는 항-IgD BCR 작용제 및 Siglec-2-계합 모이어티가 동일한 또는 별도의 분자 상에 제시된 B 세포 수용체 활성화에 대한 모델을 묘사한다. 항-IgD, 항-IgD-Siglec 리간드 접합체 또는 2nM 항-IgD와 다양한 농도의 대조군 항체-Siglec 리간드 접합체의 혼합물의 B 세포 자극 활성을 용량 적정 실험에서 CD69 상향조절의 활성화 판독값과 비교했다. 상이한 처리 그룹에서의 CD69 수준은 CD69 평균 형광 강도(MFI)를 통해 평가되었다(도 19b). 테스트된 접합체에서의 Siglec 리간드는 PEG-기반 링커 구조("PEG")를 함유하고 2가 Siglec 리간드 구조를 담지한다. 데이터는 BCR 작용제 활성 및 Siglec-2 결합 활성이 동일한 분자에서 시스로 있어야 한다는 명확한 요구사항을 보여준다.
도 20은 작용적 항-IgD 항체 및 비-작용적 Siglec 리간드-항-IgD 접합체의 혼합물에서 BCR 작용기전 억제에 대해 시험하는 시험관내 일차 마우스 B 세포 활성화 검정을 묘사한다. Siglec 리간드-항-IgD 접합체는 2nM 항-IgD BCR 작용제의 존재 또는 부재에서 적정된다. 항-IgD, 항-IgD-Siglec 리간드 접합체 또는 다양한 농도의 항-IgD-Siglec 리간드 접합체와 2nM 항-IgD의 혼합물의 B 세포 자극 활성을 용량 적정 실험에서 CD69 상향조절의 활성화 판독값과 비교한다. 상이한 처리 그룹에서의 CD69 수준은 CD69 평균 형광 강도(MFI)를 통해 평가된다. 테스트된 항-IgD 접합체는 6의 리간드/링커-대-약물 비율("LDR")로 2가, Siglec-2-강화된 리간드(MPB-Neu5Ac) 및 PEG-기반 링커를 담지한다.
결과는 Siglec 리간드 접합체가 B 세포 활성화의 50%를 억제하기 위해 항-IgD 항체로 대략 등화학양론적으로 적정되어야 함을 보여준다. 따라서, 항-IgD 또는 Siglec 리간드-항-IgD 접합체 어느 것도 BCR 결과에 우세하지 않다. 둘 모두 B 세포 활성화에 미치는 영향에 대해 동등하게 경쟁한다.
실시예 12 : Siglec 리간드-항-IgM 항체 접합체에 의한 인간 일차 B 세포의 B 세포 수용체-매개된 활성화의 억제.
목적
이 실험의 목적은 B 세포 수용체 작용제 IgG-Siglec 리간드 접합체로 인간 B 세포 활성화에 대한 억제 효과에 대해 테스트하는 것이다. 이 실험은 실시예 8 내지 11에서 사용된 1차 마우스 비장세포가 아닌 1차 인간 PBMC-유래된 B 세포에 대해 여기서 초점을 맞추어, 실시예 8에 기재된 것과 유사하다.
기재된 플랫폼 기술은 그 클론유형 B 세포 수용체를 통한 B 세포의 활성화가 공동-계합된 B 세포 수용체에 근접한 CD22/Siglec-2 억제성 공동수용체의 동원을 통하여 억제될 수 있다는 전제에 근거한다. B 세포 수용체에 동원된 CD22는 B 세포 수용체에서 높은 국소 단백질 키나아제 활성에 대한 그 근접성의 장점에 의해 그 ITIM 세포질 모티프 티로신에서 인산화된다. 그런 다음 인산화된 CD22는 SHP-1 및 SHP-2와 같은 포스파타제를 B 세포 활성화 복합체에 근접한 세포 표면으로 동원한다. 이러한 상승된 국소 포스파타제 활성은 B 세포 활성화에 필요한 B 세포 활성화 복합체의 성분을 탈인산화하고 따라서 B 세포 수용체 계합에 대한 반응을 차단한다. 정상적인 상황 하에서 Siglec-2 면역억제 메커니즘은 비정상적인 B 세포 활성화를 확인하여 자가반응성 항체 생산, 과염증 및 자가면역으로부터 보호하는 작용을 한다. 기재된 플랫폼 기술은 이 자연 현상을 이용하여 외부 단백질을 자체로 은폐하여 주어진 외부 단백질에 특이적인 나이브 B 세포 클론에서만 B 세포 활성화를 약화시켜 다른 온전한 항원에 대한 B 세포 반응은 남겨 두면서 외부 단백질에 대한 면역글로불린 생산을 차단한다.
재료 및 방법
항-IgM 및 항-IgM-Siglec 리간드 테스트 항목을 실시예 7에 기재된 바와 같이 제조하였다.
인간 PBMC(StemExpress)를 완전한 RPMI 배지에서 둥근 바닥 96 웰 플레이트에 웰당 200,000개 세포의 농도로 도말하였다. 세포를 증가하는 농도의 항-인간 IgM 또는 Siglec 리간드-접합된 항-인간 IgM의 첨가에 의해 18시간 동안 자극하였다. B 세포 활성화는 유동 세포분석법에 의해 평가하였다.
기재된 자극 후 B 세포 활성화를 측정하기 위해, 세포를 1200rpm에서 5분 동안 회전시키고 PBS로 헹구어 세포를 두 번 세정했다. 세포를 염색 완충액(1% 소 혈청 알부민/0.1% 아지드화 나트륨/1 x 인산염 완충 식염수)에 재현탁하고 항-CD45, 항-CD19, 항-CD69 및 항-CD86 항체(BD Biosciences, Biolegend, Fisher)의 첨가 전에 5분 동안 Fc-블록(BD Biosciences)과 함께 인큐베이션하였다. 세포를 실온에서 추가로 30분 동안 어두운 곳에서 인큐베이션한 다음 염색 완충액으로 3회 세정한 다음 ZE5(BioRad)에서 분석했다. FlowJo(v10.8.0) 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석을 수행했다.
결과
도 21은 인간 일차 B 세포 및 B 세포 수용체 작용 항-IgM 항체 또는 동일한 항-IgM 항체와의 Siglec 리간드 접합체를 사용하는 시험관내 B 세포 활성화 검정을 묘사한다. 항-IgM 및 항-IgM-Siglec 리간드 접합체의 B 세포 자극 활성을 용량 적정 실험에서 CD69 상향조절의 활성화 판독값과 비교한다. 상이한 처리 그룹에서의 CD69 수준은 CD69-양성인 세포의 백분율을 통해 평가된다. 갈락토스-기반 링커(도 21a) 및 PEG-기반 링커(도 21b)를 사용하는 접합체로의 결과가 도시되어 있다. 모든 접합체는 다양한 원자가 및 리간드/링커-대-약물 비율("LDR") 또는 약물 분자당 평균 Siglec 리간드 구조 수를 갖는 Siglec-2-강화된 MPB-Neu5Ac 구조를 담지한다.
결론
모체의 항-IgM IgG가 % CD69-양성 세포 및 CD69 MFI에서 강력한 농도-의존적 증가를 유도하는 경우, Siglec 리간드-항-IgD 접합체는 매우 강력하게 억제된 활성화를 나타낸다. 억제의 정도는 원자가에 따라 증가하지만 일반적으로 PEG-기반 링커와 GAL-기반 링커 사이에서 동등하다. 중요하게도, 이들 데이터는 일차 인간 B 세포 시스템과 일차 마우스 B 세포 시스템에서 나타난 것 사이의 Siglec-2 리간드 접합체의 억제 효과의 번역을 보여준다(실시예 8 내지 11).
실시예 13 : Siglec 리간드-항-IgM 항체 접합체에 의한 인간 일차 B 세포의 B 세포 수용체-매개된 활성화의 억제는 Siglec-2/CD22 결합의 강화를 필요로 한다
목적
여기에 기재된 실험의 목적은 인간 B 세포 수용체-매개된 B 세포 활성화의 억제에 대한 강화된 Siglec-2 결합의 중요성을 평가하는 것이다. 본 실시예는 B 세포 활성화에 대한 CD22-B 세포 수용체 공동-계합의 효과를 연구하기 위해 인간 B 세포 클론의 풀에서 범-B 세포 수용체 작용기전을 사용하는 실시예 12에 기술된 실험으로부터 후속한다. 이 실시예에서, 준비된 접합체에 제시된 Siglec-2 리간드는 강화된 Siglec-2 리간드 접합체(BPC-Neu5Gc-기반) 또는 네이티브 뉴라민산 구조에 기반한 Siglec-2 리간드(Neu5Gc)를 사용하여 Siglec-2 결합에 대한 그 효능에서 다양했다. 강화된 및 비-강화된 Siglec-2를 담지하는 접합체의 비교는 기재된 플랫폼 기술의 B 세포 수용체-억제 효과에 대한 Siglec-2 친화성의 중요성을 평가할 수 있었다.
인간 B 세포로의 이들 실험은 강화된 및 비-강화된 Siglec-2 리간드로의 마우스 B 세포 활성화의 억제에 대한 실시예 10에 기술된 실험과 유사하다.
재료 및 방법
항-IgM 및 항-IgM-Siglec 리간드 테스트 항목을 실시예 7에 기재된 바와 같이 제조하였다.
인간 PBMC(StemExpress)를 완전한 RPMI 배지에서 둥근 바닥 96 웰 플레이트에 웰당 200,000개 세포의 농도로 도말하였다. 세포를 증가하는 농도의 항-인간 IgM 또는 Siglec 리간드-접합된 항-인간 IgM의 첨가에 의해 18시간 동안 자극하였다. B 세포 활성화는 유동 세포분석법에 의해 평가하였다.
기재된 자극 후 B 세포 활성화를 측정하기 위해, 세포를 1200rpm에서 5분 동안 회전시키고 PBS로 헹구어 세포를 두 번 세정했다. 세포를 염색 완충액(1% 소 혈청 알부민/0.1% 아지드화 나트륨/1 x 인산염 완충 식염수)에 재현탁하고 항-CD45, 항-CD19, 항-CD69 및 항-CD86 항체(BD Biosciences, Biolegend, Fisher)의 첨가 전에 5분 동안 Fc-블록(BD Biosciences)과 함께 인큐베이션하였다. 세포를 실온에서 추가로 30분 동안 어두운 곳에서 인큐베이션한 다음 염색 완충액으로 3회 세정한 다음 ZE5(BioRad)에서 분석했다. FlowJo(v10.8.0) 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석을 수행했다.
Siglec 리간드-접합된 항-인간 IgD 및 항-인간 IgM 결합의 경쟁은 상기 기술된 검정에서 사용된 동일한 공여자로부터의 인간 PBMC에서 수행되었다. 이 검정을 위해, 세포를 완전한 RPMI 배지에서 둥근 바닥 96 웰 플레이트에 웰당 200,000개 세포의 농도로 시딩했다. 이어서 세포를 인간 Fc-블록(BD Biosciences)과 함께 5분 동안 인큐베이션하였다. 이 인큐베이션 기간 후, 2.4nM 항-인간-IgM-AlexaFluor647을 RPMI 단독 또는 비-형광으로 표지된 Siglec 리간드-접합된 항-인간 IgM 및 항-CD19의 증가하는 적정과 함께 세포에 첨가하였다. 세포를 어두운 곳에서 30분 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 염색 완충액(1% 소 혈청 알부민/0.1% 아지드화 나트륨/1 x 인산염 완충 식염수)으로 원심분리에 의해 2회 세정하고 항체 결합을 적어도 5,000개 세포의 평균 형광 강도(MFI)의 결정에 의해 유동 세포분석법(ZE5, BioRad)에 의해 분석했다.
결과 및 결론
도 22는 인간 일차 B 세포 및 B 세포 수용체 작용 항-IgM 항체 또는 동일한 항-IgM 항체와의 Siglec 리간드 접합체를 사용하는 시험관내 B 세포 활성화 검정을 묘사한다. 접합체는 CD22 결합에 대해 강화된("BPC-Neu5Gc 1가 PEG - LDR5-αIgM" 및 "BPC-Neu5Gc 2가 PEG - LDR9-αIgM") 또는 비강화된("Neu5Gc 1가 PEG - LDR6-αIgM" 및 "Neu5Gc 2가 PEG - LDR6-αIgM")인 Siglec 리간드 구조를 담지한다. 마우스 B 세포 시스템에 대한 도 17(실시예 10)에서와 같이, CD22 결합에 대해 강화되지 않은 Siglec 리간드를 담지하는 접합체는 BCR 활성화에 대해 완전히 활성인 반면, 이전과 같이 강화된 결합제 접합체는 강력한 BCR 억제를 나타낸다.
상기 실시예에서와 같이 BCR 경쟁 검정을 사용하여 B 세포 수용체에 대한 접합체 결합의 교란에 대해 제어하였다(도 23). 테스트 항목은 도 22에서 B 세포 활성화 실험에 사용된 것과 동일하다. 강화된 및 비강화된 접합체는 모체의 항-IgM 항체에 대해 동등한 결합 IC50을 나타내고 따라서 Siglec 리간드 접합체에 대한 BCR 결합의 교란의 결여를 입증한다.
실시예 14 : Siglec 리간드-아달리무맙 접합체로 처리된 마우스에서 항-약물 항체의 생체내 억제.
목적
이 실험의 목적은 아달리무맙-Siglec-2 리간드 접합체를 투여한 마우스에서 면역원성의 억제에 대해 테스트하는 것이었다. 모체의 아달리무맙 hIgG1은 단일 4mg/kg 용량 후 강한 면역글로불린 반응으로 마우스에서 고도로 면역원성이다. 이 실시예 및 후속 실시예는 상이한 단백질을 갖는 Siglec 리간드 접합체에 대한 면역원성에 대한 효과의 생체내 평가와 함께 실시예 8 내지 13에 나타낸 시험관내 B 세포 억제 효과를 확증하기 위해 제시된다.
재료 및 방법
아달리무맙 hIgG1 및 아달리무맙-Siglec 리간드 접합체를 실시예 7에 기재된 바와 같이 제조하였다.
아달리무맙 및/또는 아달리무맙-Siglec 리간드 접합체에 특이적인 항체의 생성을 평가하기 위해, C57BL/6 마우스를 아달리무맙 또는 Siglec 리간드-접합된 아달리무맙으로 정맥내 주사를 통해 면역화시켰다. 연구 -1일차에, 동물을 체중에 기반하여 처리군으로 무작위화하였다. 연구 0일차에, 동물을 기준선 혈청을 위해 채혈한 다음 아달리무맙 또는 아달리무맙-Siglec 리간드 접합체로 IV 주사했다. 멸균 완충 식염수에 0.8mg/ml 항원 용액을 만들어 개별 항원을 준비했다. 그런 다음 동물에게 꼬리 정맥을 통해 0.1ml(~4ml/kg)의 0.8mg/ml 항원을 주사했다. 20g 마우스를 기준으로 한 총 용량은 4mg/kg이다. 동물은 흡입된 이소플루란 마취하에 연구 내내 매주 안와후동을 통해 채혈되었다. 연구 당일에, 28마리의 동물을 흡입된 이소플루란 마취로 마취한 다음 심장 천자를 통해 채혈하고 그 다음 경추 탈구에 의해 희생시켰다. 전혈을 Microvette EDTA 모세관 수집 튜브(Sarstedt Inc) 안에 수집한 다음 혈청 수집에 대한 제조업체의 지침에 따라 추가 처리했다. 샘플은 분석이 수행될 때까지 -80C에서 보관했다.
ADA 검정은 다음과 같이 항원으로 코팅된 96-웰 검정 플레이트(Nunc Plates, Black 96-Well Immuno Plates, Thermo Scientific, 437111)에서 수행되었다. 아달리무맙과 아달리무맙 접합체의 혼합물을 100μl/웰로 각각 5μg/ml에서 코팅하였다. 코팅된 모든 항원을 PBS pH 7.2로 희석하고 4℃에서 밤새 인큐베이션했다. 다음 날, 플레이트 코팅 용액을 제거하고 플레이트를 PBS 중 200μL/웰의 3% BSA, 20μM EDTA, 0.1% Tween-20으로 실온에서 1시간 동안 차단하였다. 혈청 샘플을 PBS 중 3% BSA, 20μM EDTA, 0.1% Tween-20에 1:185로 희석하고 3-배 일련의 희석에서 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 0.05% Tween-20을 갖는 PBS 완충액으로 세정했다. 세정 후, 1:2500으로 희석된 당나귀 항-마우스 IgG(H+L)-HRP(SouthernBiotech, 6411-05) 100μL를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 검정 플레이트를 세정한 후 QuantaBlu 기판 용액(Thermo Scientific, 15169) 100μL를 각 웰에 첨가하고 15분 동안 인큐베이션했다. QuantaBlu 형광성 과산화물 기판의 여기 및 방출 설정은 325nm 및 420nm이고 상대 형광 단위는 SpectraMax 플레이트 판독기를 사용하여 측정되었다. 혈청 희석 곡선은 7, 14, 21 및 28일차에 대해 생성되었다. 역가는 배경보다 2x OD를 제공하는 혈청의 희석에 의해 결정되었다.
결과 및 결론
도 24 및 도 25는 아달리무맙 및 Siglec 리간드-아달리무맙 접합체에 대한 마우스에서의 항-약물 항체 반응의 평가를 묘사한다. 접합체는 갈락토스-(도 24) 또는 PEG-함유(도 25) 링커 구조를 갖는, Siglec 리간드에 대해 1가, 2가 또는 3가인 BPC-Neu5Gc-기반 Siglec 리간드-링커 구조를 담지한다. 마우스는 단일 4mg/kg i.v. 용량의 아달리무맙 또는 아달리무맙-Siglec 리간드 접합체를 투여받았다. 아달리무맙/아달리무맙 접합체에 대한 혈청 IgG 수준을 14일차, 21일차 및 28일차에 측정하였다. 모체의 아달리무맙 hIgG1이 14일차, 21일차 및 28일차에 높은 마우스 IgG 혈청 역가를 나타내는 GAL- 및 PEG-링커 함유 접합체 둘 모두에 대해, Siglec 리간드 접합체는 모두 항-약물 역가에 대해 강력하게 억제되며, 억제의 정도에 대한 1가, 2가 및 3가 접합체 사이에는 일부 약간의 차이가 있다. 3가 접합체가 BCR 억제에서 현저하게 더 강한 이전에 기술된 시험관내 범-BCR 활성화 검정과 관련하여, 생체내 면역원성 결과는 1가, 2가 및 3가 접합체 모두가 항-약물 역가의 억제에서 강력함을 보여준다.
마우스에서 면역원성의 억제에 대한 이들 결과는 실시예 8 내지 13에서의 시험관내 B 세포 활성화 결과와 상관관계가 있다; 강화된 Siglec 리간드로 면역원성 항체의 꾸밈은 면역원성을 강력하게 억제하기에 충분하다.
실시예 15 : C57BL/6 마우스에서 아달리무맙 및 Siglec 리간드-접합된 아달리무맙의 약동학적 분석
목적
이 실험의 목적은 모체의 아달리무맙 IgG에 비해 Siglec 리간드-접합 아달리무맙 제제의 약동학에서 교란이 있는지를 결정하는 것이었다.
재료 및 방법
약동학적 모니터링은 아달리무맙 또는 개별 SigL-접합된 아달리무맙 항체의 단일 정맥내 투여 후 C57BL/6 마우스에서 수행되었다. 연구 -1일차에, 마우스를 체중에 의해 처리군으로 무작위화하였다. 연구 0일차에, 동물에게 테스트 항목을 대략적으로 4mg/kg의 총 용량에 대해 멸균 완충 식염수 중 0.1mL의 0.8mg/mL 항원 용액으로 꼬리 정맥을 통해 IV 투여하였다. 테스트-항목 투여 후 0.3-, 1-, 7-, 5-, 7- 및 10-일에 흡입된 이소플루란 마취 하에 연구 내내 매주 동물을 후안와동을 통해 채혈하였다. 전혈을 Microvette K2EDTA 모세관 수집 튜브(Sarstedt Inc) 안에 수집한 다음 제조 지침에 따라 추가 처리하여 혈장을 수집했다. 제조사의 프로토콜에 따라 AlphaLISA 인간 IgG 검정(Perkin Elmer)을 사용하여 혈장 샘플 내 아달리무맙 및 SigL-접합된 아달리무맙의 수준을 측정했다.
직교 분석 방법을 사용하여 마우스 혈청에서 아달리무맙의 PK 분석을 Biacore 8K+에서 25℃에서 수행했다. 간단히 말해서, Cytiva로부터의 인간 항체 포획 키트(Cat#: 29234600)로부터 항-인간 Fc 항체는 약 7000RU의 최종 반응을 위해 모든 8개 채널에 걸쳐 유동 세포 2에 아민 커플링되었다. 각 테스트 항목에 대한 보정 시리즈는 실행 완충액(HBS-EP+)에서 나이브 마우스 혈청의 1:300 희석액에 스톡 농도를 스파이킹하고 1000μg/mL에서 0.976μg/mL로 1:1로 일련으로 희석함에 의해 확립되었다. 테스트 혈청 샘플도 실행 완충액에서 1:300으로 희석되었다. 혈청 및 보정 샘플이 30μL/분에서 400초 동안 양쪽 표면에 걸쳐 주입되고 120초 동안 해리되도록 허용되었다. 표면의 재생은 30μL/분에서 15초 동안 3M MgCl2의 2회 주입하여 달성되었다. 분석을 위해 샘플의 주입 5초 후에 보고 지점을 선택했다. 이 보고 지점을 사용하여, 보정 곡선을 S자형, 4PL 최소 제곱법을 사용한 GraphPad Prism(버전 9.0.0)에서 구성하고, 이 곡선에서 테스트 혈청 샘플 농도를 보간했다.
결과 및 결론
도 26은 마우스에서 아달리무맙 hIgG 및 Siglec 리간드-아달리무맙 hIgG1 접합체에 대한 혈청 약동학의 분석을 묘사한다. 접합체는 PEG-함유 링커 구조를 갖는 Siglec 리간드에 대해 1가, 2가 또는 3가인 BPC-Neu5Gc-기반 Siglec 리간드-링커 구조를 담지한다. 테스트 항목은 실시예 13(도 25)에서 사용된 것과 동일하다. 정맥내 투여 후, 항-인간 IgG Fc ELISA(도 26a) 및 SPR(표면 플라스몬 공명, 도 26b)에 의해 테스트 항목 농도에 대해 혈청 샘플을 분석하였다.
아달리무맙 IgG 및 아달리무맙 접합체는 2개의 독립적인 검정 시스템(ELISA 및 SPR)에 의해 측정했을 때 동등한 혈청 PK 프로필을 나타낸다. PK 연구는 실시예 14에서의 면역원성 연구와 동일한 용량(4mg/kg)에서 수행되었음을 주목해야 한다. 따라서 이들 결과는 실시예 14에서 억제된 면역원성에 대한 근거로서 약물 노출의 부족을 배제하고 또한 혈청 PK에서 교란에 대해 Siglec 리간드 접합체를 위험하게 하지 않는다.
실시예 16 : TNF(SPR)에 대한 아달리무맙 및 아달리무맙 접합체의 결합 분석
목적
이 실험의 목적은 TNFα 결합의 친화성 분석을 통해 측정된 기능적 활성의 교란에 대해 아달리무맙 Siglec 리간드 접합체를 평가하는 것이었다.
재료 및 방법
아달리무맙 접합체의 결합 실험은 Cytiva 단백질 A 칩 시리즈 S(Cat# 29127555)를 사용하여 Biacore 8K+에서 수행되었다. 요약하면, 접합체를 실행 완충액(HBS-EP+)에 희석하고 활성 표면(유동 세포 2)에 30μL/분에서 20초의 주입 후 반응의 약 30RU를 산출하는 농도에 대해 정찰했다. 인간 TNFα를 100nM에서 0.1953nM까지 실행 완충액에서 1:1로 일련으로 희석한 다음 기준(유동 세포 1)과 활성 표면(유동 세포 2) 둘 모두에 걸쳐 30μL/분에서 120초 동안 주입하고 600초 동안 해리되도록 허용했다. 표면의 재생은 30μL/분에서 10mM 글리신, pH 1.5의 30초 펄스로 달성되었다. 센서그램은 Biacore Insight 평가 소프트웨어 버전 3.0.11.15423에서 1:1 결합 모델에 맞춰졌다.
결과
도 27은 아달리무맙 hIgG 및 Siglec 리간드-아달리무맙 hIgG1 접합체에 대한 TNFα 결합 활성의 시험관내 표면 플라즈몬 공명(SPR) 분석을 묘사한다. 도 27a는 TNFα 분석물이 단백질 A 칩-고정화된 아달리무맙 또는 아달리무맙-Siglec 리간드 접합체에 결합하는 SPR 검정 프로토콜에 대한 개략도이다. TNFα 농도는 농도 의존성, 결합 동역학 및 친화성을 평가하기 위해 다양하다. 도 27b는 센서그램 연합 단계(RUmax)의 말단에서 결합의 농도 의존성을 나타낸다. 도 27c-g는 아달리무맙(도 27c), 아달리무맙 BPC-Neu5Gc 1가 GAL LDR 4(도 27d), 아달리무맙 BPC-Neu5Gc 1가 GAL LDR 7(도 27e), 아달리무맙 BPC-Neu5Gc 2가 GAL LDR 8.5(도 27f), 및 아달리무맙 BPC-Neu5Gc 3가 GAL LDR 5(도 27g)에 대한 개별 센서그램이다. 맞춤 동역학 및 친화성 매개변수는 표 3에 요약되어 있다.
결론
아달리무맙 및 Siglec Ligand-아달리무맙 접합체는 모두 유사한 겉보기 친화성 및 백분율 활성으로 TNFα에 결합한다. 따라서 아달리무맙-Siglec 리간드 접합체는 그 TNFα 결합 특성에서 교란되지 않는다. 중요하게도, 이들 결과는 Siglec 리간드 결합을 통해 면역원성을 제거하면서 생물치료제에서의 기능적 활성이 유지될 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 17 : Siglec 리간드-아달리무맙 접합체로 처리된 마우스에서 항-약물 항체의 생체내 억제는 CD22/Siglec-2 리간드를 필요로 한다
목적
이 실험의 목적은 아달리무맙-Siglec-2 리간드 접합체가 투여된 마우스에서 관찰되는 억제된 면역원성에 대한 아달리무맙 접합체에서의 Siglec-2 결합 활성의 중요성에 대해 테스트하는 것이었다. 이 연구는 음성 대조군 아달리무맙-링커 접합체에 대한 Siglec-2에 결합하지 않는 실시예 10(도 17 및 도 18)으로부터 동일한 아시알로, PEG-기반 링커 구조를 사용한다.
재료 및 방법
아달리무맙 hIgG1 및 아달리무맙-Siglec 리간드 접합체를 실시예 7에 기재된 바와 같이 제조하였다.
아달리무맙 및/또는 아달리무맙-Siglec 리간드 접합체에 특이적인 항체의 생성을 평가하기 위해, C57BL/6 마우스를 아달리무맙 또는 Siglec 리간드-접합된 아달리무맙으로 정맥내 주사를 통해 면역화시켰다. 연구 -1일차에, 동물을 체중에 기반하여 처리군으로 무작위화하였다. 연구 0일차에, 동물을 기준선 혈청을 위해 채혈한 다음 아달리무맙 또는 아달리무맙-Siglec 리간드 접합체로 IV 주사했다. 멸균 완충 식염수에 0.8mg/ml 항원 용액을 만들어 개별 항원을 준비했다. 그런 다음 동물에 꼬리 정맥을 통해 0.1ml(~4ml/kg)의 0.8mg/ml 항원을 주사했다. 20g 마우스를 기준으로 한 총 용량은 4mg/kg이다. 동물을 흡입된 이소플루란 마취 하에 연구 내내 매주 안와후동을 통해 채혈하였다. 연구 당일에, 28마리의 동물을 흡입된 이소플루란 마취로 마취한 다음 심장 천자를 통해 채혈한 다음 경추 탈구에 의해 희생시켰다. 전혈을 Microvette EDTA 모세관 수집 튜브(Sarstedt Inc) 안에 수집한 다음 제조업체의 혈청 수집 지침에 따라 추가 처리했다. 샘플은 분석이 수행될 때까지 -80C에서 보관했다.
ADA 검정은 다음과 같이 항원으로 코팅된 96-웰 검정 플레이트(Nunc Plates, Black 96-Well Immuno Plates, Thermo Scientific, 437111)에서 수행되었다. 아달리무맙과 아달리무맙 접합체의 혼합물을 100μl/웰로 각각 5μg/ml에서 코팅하였다. 코팅된 모든 항원을 PBS pH 7.2로 희석하고 4℃에서 밤새 인큐베이션했다. 다음 날, 플레이트 코팅 용액을 제거하고 플레이트를 PBS 중 200μL/웰의 3% BSA, 20μM EDTA, 0.1% Tween-20으로 실온에서 1시간 동안 차단하였다. 혈청 샘플을 PBS 중 3% BSA, 20μM EDTA, 0.1% Tween-20에 1:185로 희석하고 3-배 일련의 희석에서 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 0.05% Tween-20을 갖는 PBS 완충액으로 세정했다. 세정 후, 1:2500으로 희석된 당나귀 항-마우스 IgG(H+L)-HRP(SouthernBiotech, 6411-05) 100μL를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 검정 플레이트를 세정한 후 QuantaBlu 기판 용액(Thermo Scientific, 15169) 100μL를 각 웰에 첨가하고 15분 동안 인큐베이션했다. QuantaBlu 형광성 과산화물 기판의 여기 및 방출 설정은 325nm 및 420nm이고 상대 형광 단위는 SpectraMax 플레이트 판독기를 사용하여 측정되었다. 혈청 희석 곡선은 7, 14, 21 및 28일차에 대해 생성되었다. 역가는 배경보다 2x OD를 제공하는 혈청의 희석에 의해 결정되었다.
결과 및 결론
도 28은 1) 아달리무맙, 2) 강화된 Siglec 리간드-아달리무맙 접합체("BPC-Neu5Gc 1가 PEG LDR 10"), 및 3) 음성 대조군, 비-Siglec-2-결합 링커 접합체("Neg Ctrl 1가 PEG LDR 7", "Neg Ctrl 2가 PEG LDR 7" 및 "Neg Ctrl 3가 PEG LDR 6")에 대한 마우스에서의 항-약물 항체 반응의 평가를 묘사한다. 마우스에는 단일 4mg/kg i.v. 용량의 아달리무맙, 아달리무맙-Siglec 리간드 접합체 또는 아달리무맙-음성 대조군 링커 접합체를 투여하였다. 아달리무맙/아달리무맙 접합체에 대한 혈청 IgG 수준을 14일차 및 28일차에 측정하였다. 도 28a 및 도 28b는 각각 14일차 및 28일차에 개별 동물 혈청 IgG 역가 값(n = 5 마우스)을 나타낸다. 강화된 Siglec 리간드-아달리무맙 접합체는 14일차 및 28일차에 면역원성의 완전한 억제를 나타내는 반면, 음성 대조군 아달리무맙 접합체는 면역원성에서 완전하게 교란되지 않는다. 데이터는 실시예 10(도 17 및 도 18)에서의 시험관내 마우스 B 세포 활성화 검정 관찰과 일치하며, 여기서 아시알로 접합체는 BCR 활성화의 억제에 대해 불활성이다. 중요하기로는, 이들 결과는 플랫폼 Siglec 리간드 접합체 기술을 사용한 아달리무맙의 억제된 면역원성이 Siglec 리간드-결합 화학 물질에 결정적으로 의존한다는 것을 보여준다.
실시예 18 : Siglec 리간드-아달리무맙 접합체로 처리된 마우스에서 항-약물 항체의 생체내 억제는 CD22/Siglec-2 리간드의 강화된 결합을 필요로 한다
목적
실시예 10(도 16)이 BCR 활성화의 억제를 위한 강화된(대 비강화된) Siglec-2 결합의 중요성을 나타낸 경우, 이 실험의 목적은 아달리무맙 면역원성의 억제를 위한 강화된 Siglec-2 결합의 중요성을 테스트하는 것이었다.
재료 및 방법
아달리무맙 hIgG1 및 아달리무맙-Siglec 리간드 접합체를 실시예 7에 기재된 바와 같이 제조하였다.
아달리무맙 및/또는 아달리무맙-Siglec 리간드 접합체에 특이적인 항체의 생성을 평가하기 위해, C57BL/6 마우스를 아달리무맙 또는 Siglec 리간드-접합된 아달리무맙으로 정맥내 주사를 통해 면역화시켰다. 연구 -1일차에, 동물을 체중에 기반하여 처리군으로 무작위화하였다. 연구 0일차에, 동물을 기준선 혈청을 위해 채혈한 다음 아달리무맙 또는 아달리무맙-Siglec 리간드 접합체로 IV 주사했다. 멸균 완충 식염수에 0.8mg/ml 항원 용액을 만들어 개별 항원을 준비했다. 그런 다음 동물에 꼬리 정맥을 통해 0.1ml(~4ml/kg)의 0.8mg/ml 항원을 주사했다. 20g 마우스를 기준으로 한 총 용량은 4mg/kg이다. 동물을 흡입된 이소플루란 마취 하에 연구 내내 매주 안와후동을 통해 채혈하였다. 연구 당일에, 28마리의 동물을 흡입된 이소플루란 마취로 마취한 다음 심장 천자를 통해 채혈하고 그 다음 경추 탈구로 희생시켰다. 전혈을 Microvette EDTA 모세관 수집 튜브(Sarstedt Inc) 안에 수집한 다음 제조업체의 혈청 수집에 대한 지침에 따라 추가 처리했다. 샘플은 분석이 수행될 때까지 -80C에서 보관했다.
ADA 검정은 다음과 같이 항원으로 코팅된 96-웰 검정 플레이트(Nunc Plates, Black 96-Well Immuno Plates, Thermo Scientific, 437111)에서 수행되었다. 아달리무맙과 아달리무맙 접합체의 혼합물을 100μl/웰로 각각 5μg/ml에서 코팅하였다. 코팅된 모든 항원을 PBS pH 7.2로 희석하고 4℃에서 밤새 인큐베이션했다. 다음 날, 플레이트 코팅 용액을 제거하고 플레이트를 PBS 중 200μL/웰의 3% BSA, 20μM EDTA, 0.1% Tween-20으로 실온에서 1시간 동안 차단하였다. 혈청 샘플을 PBS 중 3% BSA, 20μM EDTA, 0.1% Tween-20에 1:185로 희석하고 3-배 일련의 희석에서 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 0.05% Tween-20을 갖는 PBS 완충액으로 세정했다. 세정 후, 1:2500으로 희석된 당나귀 항-마우스 IgG(H+L)-HRP(SouthernBiotech, 6411-05) 100μL를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 검정 플레이트를 세정한 후 QuantaBlu 기판 용액(Thermo Scientific, 15169) 100μL를 각 웰에 첨가하고 15분 동안 인큐베이션했다. QuantaBlu 형광성 과산화물 기판의 여기 및 방출 설정은 325nm 및 420nm이고 상대 형광 단위는 SpectraMax 플레이트 판독기를 사용하여 측정되었다. 혈청 희석 곡선은 7, 14, 21 및 28일차에 대해 생성되었다. 역가는 배경보다 2x OD를 제공하는 혈청의 희석에 의해 결정되었다.
결과 및 결론
도 29는 1) 아달리무맙, 2) 강화된 Siglec 리간드-아달리무맙 접합체("BPC-Neu5Gc 1가 PEG LDR 7"), 및 3) 비-강화된 Siglec 리간드-아달리무맙 접합체("Neu5Gc 1가 PEG LDR 6", "Neu5Gc 2가 PEG LDR 5", 및 "Neu5Gc 3가 PEG LDR 5")에 대한 마우스에서의 항-약물 항체 반응의 평가를 묘사한다. 마우스에는 단일 4mg/kg i.v. 용량의 아달리무맙 IgG 또는 접합체를 투여하였다. 아달리무맙/아달리무맙 접합체에 대한 혈청 IgG 수준을 28일차에 측정했다. 28일차에 대한 개별 동물 혈청 IgG 역가 값(n = 5 마우스)이 도시되어 있다.
이 실험에서 강화된 Siglec 리간드 접합체는 면역원성에 대해 강력하게 억제된 반면, 강화되지 않은 Neu5Gc 링커 구조를 담지하는 3가지 상이한(1가, 2가 및 3가) 접합체는 고도로 면역원성이었다. 이들 데이터는 실시예 10(도 17 및 도 18)에서의 시험관내 B 세포 검정 결과와 일치하며, 여기에서 강화된 Siglec-2 결합은 BCR 활성화의 억제에 결정적이었다. 따라서 강화는 범-B 세포 활성화 검정에서 BCR 활성화의 억제뿐만 아니라 아달리무맙-Siglec 리간드 접합체에 대한 면역원성의 생체내 억제에도 중요하다. 이 결과로부터, 아달리무맙의 과시알릴화된 형태(네이티브이고, 강화되지 않은 Neu5Gc 또는 Neu5Ac 구조를 담지함)는 생체내 면역원성에 대해 교란되지 않을 것으로 예상된다.
실시예 19 : Siglec 리간드-아달리무맙 접합체로 처리된 마우스에서 항-약물 항체의 생체내 억제는 공동-투여된 비-접합 면역원이 아니라 Siglec 리간드-접합체에 특이적이다
목적
이 실험의 목적은 별도의 표준 면역원인 암탉 난백 리소자임에 대한 마우스 체액 반응에 대한 아달리무맙-Siglec 리간드 접합체 투여의 효과에 대해 테스트하는 것이었다. 투여된 약물의 면역원성을 감소시키는 다른 방법이 면역원성 반응의 전반적인 억제로 아마도 이어질 수 있는 경우, Siglec 리간드-접합체의 작용 메커니즘은 다른 병용-투여된 면역원이 아닌 접합체에 대해서만 면역원성을 억제하는 것으로 예상된다.
재료 및 방법
아달리무맙 hIgG1 및 아달리무맙-Siglec 리간드 접합체를 실시예 7에 기재된 바와 같이 제조하였다.
도 30a는 C57BL/6 마우스에게 아달리무맙, 아달리무맙-Siglec 리간드 접합체, 또는 PBS 비히클 대조군의 투여에 이어 암탉 난백 리소자임(HEL)의 투여에 대한 연구 계획을 나타낸다. 연구 -1일차에, 동물을 체중에 기반하여 처리군으로 무작위화하였다. 연구 0일차에, 동물을 기준선 혈청을 위해 채혈한 다음 아달리무맙, 아달리무맙-Siglec 리간드 접합체 또는 PBS 비히클로 IV 주사했다. 멸균 완충 식염수에 0.8mg/ml 항원 용액을 만들어 개별 아달리무맙-기반 항원을 준비했다. 그런 다음 동물에 꼬리 정맥을 통해 0.1ml(~4ml/kg)의 0.8mg/ml 항원을 주사했다. 20g 마우스를 기준으로 한 총 용량은 4mg/kg이다. 이어서 마우스에 7일차, 14일차 및 21일차에 200μg HEL을 투여했다. 전혈을 Microvette EDTA 모세관 수집 튜브(Sarstedt Inc) 안에 수집한 다음 제조업체의 혈청 수집에 대한 지침에 따라 추가 처리했다. 샘플은 분석이 수행될 때까지 -80C에서 보관했다.
ADA 검정은 다음과 같이 항원으로 코팅된 96-웰 검정 플레이트(Nunc Plates, Black 96-Well Immuno Plates, Thermo Scientific, 437111)에서 수행되었다. 아달리무맙 혈청 역가의 평가를 위해, 제1 플레이트 세트를 아달리무맙과 접합체의 혼합물(각각 100μL/웰, 5μg/mL)로 코팅하였다. HEL 혈청 역가의 평가를 위해, 제2 플레이트 세트를 100μL/웰의 5μg/mL 정제된 리소자임(HEL, Sigma, L4919-1G)으로 코팅하였다. 다음 날, 플레이트 코팅 용액을 제거하고 플레이트를 PBS 중 200μL/웰의 3% BSA, 20μM EDTA, 0.1% Tween-20으로 실온에서 1시간 동안 차단하였다. 혈청 샘플을 PBS 중 3% BSA, 20μM EDTA, 0.1% Tween-20에 1:185로 희석하고 3-배 일련의 희석에서 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 0.05% Tween-20을 갖는 PBS 완충액으로 세정했다. 세정 후, 1:2500으로 희석된 당나귀 항-마우스 IgG(H+L)-HRP(SouthernBiotech, 6411-05) 100μL를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 검정 플레이트를 세정한 후 QuantaBlu 기판 용액(Thermo Scientific, 15169) 100μL를 각 웰에 첨가하고 15분 동안 인큐베이션했다. QuantaBlu 형광성 과산화물 기판의 여기 및 방출 설정은 325nm 및 420nm이고 상대 형광 단위는 SpectraMax 플레이트 판독기를 사용하여 측정되었다. 혈청 희석 곡선은 7, 14, 21 및 28일차에 대해 생성되었다. 역가는 배경보다 2x OD를 제공하는 혈청의 희석에 의해 결정되었다.
결과 및 결론
도 30은 4mg/kg 아달리무맙, 아달리무맙-Siglec 리간드 접합체(아달리무맙-BPC-Neu5Gc 2가 PEG LDR 10), 또는 PBS 비히클(0일차), 및 이후 매주 200μg 암닭 난백 리소자임(HEL)을 투여한(7, 14, 21 및 28일차) 것의 상이한 조합으로 투여된 마우스에서의 IgG 면역 반응의 평가를 묘사한다. 아달리무맙/아달리무맙-Siglec 리간드 접합체 및 HEL에 대해 마우스 혈청 IgG 역가를 개별적으로 측정하였다. 항-아달리무맙/아달리무맙 접합체(도 30b) 및 HEL(도 30d)에 대한 28일차 혈청 IgG 수준이 도시되어 있다. 항-아달리무맙/아달리무맙 접합체(도 30c) 및 HEL(도 30e)에 대한 역가가 도시되어 있다.
아달리무맙 면역화가 강한 IgG 반응을 유도한 이전 실험(실시예 14, 17 및 18)에서와 같이, 아달리무맙-Siglec 리간드 접합체는 항체 반응에 대해 매우 강하게 억제되었다. 대조적으로, 1, 2 및 3주 후에 HEL을 투여했을 때 (그리고 이전 PK 분석에서 아달리무맙 접합체가 투여된 동물에 여전히 존재함을 나타내는) 동일한 동물은 HEL에 대해 완전히 교란되지 않은 IgG 반응을 나타냈다. 따라서, 여기에 기재된 Siglec 리간드-접합체 기술 플랫폼은 직접적으로-결합된 분자에만 영향을 미치고 관련되지 않은 항원에 대한 B 세포 항체 반응에는 영향을 미치지 않으며, 즉 Siglec 리간드-접합체는 일반적이 아닌 특이적 면역억제제로 유일하다.
실시예 20 : Siglec 리간드-암닭 난백 리소자임 접합체로 처리된 마우스에서 특이적 항체 반응의 생체내 억제.
목적
이 실험의 목적은 제2 면역원인 HEL을 투여한 마우스에서 면역원성의 억제에 대해 테스트하는 것이었다. 실시예 19에 나타낸 바와 같이, HEL은 마우스에서 고도로 면역원성이다. 따라서 본 실시예는 아달리무맙 hIgG1을 넘어 다른 면역원에 대한 생체내 면역원성 억제의 입증을 확장하도록 설정된다.
재료 및 방법
HEL(Sigma, L4919-1G) 및 HEL-Siglec 리간드 접합체(Sigma로부터 제조됨, L4919-1G)를 실시예 7에 기술된 방법을 사용하여 제조하였다. HEL-BPC-Neu5Gc를 1.6의 LDR을 갖는 고순도로 제조하였다(cGE, anSEC, LC/MS).
도 31a는 C57BL/6 마우스에 암닭 난백 리소자임(HEL) 및 HEL-Siglec 리간드 접합체의 투여를 위한 연구 계획을 도시한다. 연구 -1일차에, 동물을 체중에 기반하여 처리군으로 무작위화하였다. 연구 0일차에 동물을 기준 혈청을 위해 채혈한 다음 200μg/마우스 HEL 또는 HEL-Siglec 리간드 접합체(HEL-BPC-Neu5Gc 1가 PEG - LDR 1.6)로 IV 주사했다. 이어서 마우스에 7, 14 및 21일차에 200μg/마우스 HEL을 투여했다. HEL/HEL 접합체에 대한 혈청 IgG 수준을 27일차에 측정했다. 전혈을 Microvette EDTA 모세관 수집 튜브(Sarstedt Inc) 안에 수집한 다음 혈청 수집에 대한 제조업체의 지침에 따라 추가 처리했다. 샘플은 분석이 수행될 때까지 -80C에서 보관했다.
ADA 검정은 다음과 같이 항원으로 코팅된 96-웰 검정 플레이트(Nunc Plates, Black 96-Well Immuno Plates, Thermo Scientific, 437111)에서 수행되었다. 플레이트를 5μg/ml HEL-Siglec 리간드 접합체와 5μg/mL의 정제된 리소자임(HEL, Sigma, L4919-1G)의 혼합물 100μL/웰로 코팅했다. 코팅된 항원을 PBS pH 7.2에서 희석하고 4℃에서 밤새 인큐베이션했다. 다음날, 코팅 용액을 제거하고 플레이트를 PBS 중 200μL/웰의 3% BSA, 20μM EDTA, 0.1% Tween-20으로 실온에서 1시간 동안 차단하였다. 혈청 샘플을 PBS 중 3% BSA, 20μM EDTA, 0.1% Tween-20에 1:185로 희석하고 3-배 일련의 희석에서 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, PBS 완충액 + 0.05% Tween-20으로 세정했다. 세정 후, 1:2500으로 희석된 당나귀 항-마우스 IgG(H+L)-HRP(SouthernBiotech, 6411-05) 100μL를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 검정 플레이트를 세정한 후 QuantaBlu 기판 용액(Thermo Scientific, 15169) 100μL를 각 웰에 첨가하고 15분 동안 인큐베이션했다. QuantaBlu 형광성 과산화물 기판의 여기 및 방출 설정은 325nm 및 420nm이고 상대 형광 단위는 SpectraMax 플레이트 판독기를 사용하여 측정되었다. 혈청 희석 곡선은 7, 14, 21 및 28일차에 대해 생성되었다. 역가는 배경보다 2x OD를 제공하는 혈청의 희석에 의해 결정되었다.
결과 및 결론
도 31은 HEL 및 1가 Siglec 리간드-HEL 접합체("HEL-BPC-Neu5Gc 1가 PEG LDR 1.6)에 대한 마우스에서의 항-약물 항체 반응의 평가를 묘사한다. 마우스에 매주 4회 200μg i.v. 용량의 HEL 또는 HEL 접합체(0, 7, 14 및 21일차)를 투여하였다. 도 31b는 혈청 샘플로부터의 IgG 수준 희석 시리즈를 나타낸다. 도 31c는 개별 동물 27일차 혈청 IgG 역가 값을 나타낸다(n = 5 마우스).
반복(4) 용량의 HEL을 투여한 마우스는 HEL에 대해 활발한 IgG 반응을 보인 반면, Siglec 리간드-HEL 접합체를 투여한 마우스는 면역원성에 대해 완전하게 억제되었다. 따라서, 이전에 아달리무맙으로 나타낸, Siglec 리간드 접합체 기술로 나타낸 면역원성의 억제는 관련되지 않은 항원인 HEL로도 나타난다. 따라서, 기재된 CD22-coengagin 기술로의 면역원성의 억제는 다른 비-항체 면역원에 적용되고 많은 관련 없는 약물 양식에 적용될 수 있다.
실시예 21 : 생체내 항-아스파라기나아제 반응은 아스파라기나아제-Siglec 리간드 접합체에 대해 억제된다
목적
이 실험의 목적은 제3의 면역원인 대장균-유래된 효소인 아스파라기나제를 투여한 마우스에서 면역원성의 억제에 대해 테스트하는 것이었다. 따라서 본 실시예는 아달리무맙 hIgG1 및 HEL을 넘어 다른 면역원에 대한 생체내 면역원성 억제의 입증을 확장하도록 설정된다. 이전 실시예에서와 같이, 이번에는 정제된 아스파라기나아제 효소를 사용하여, 강화된 Siglec 리간드 접합체를 생산하고 정제했다.
재료 및 방법
아스파라기나제에 특이적인 항체의 생성을 평가하기 위해, BALB/c 마우스를 재조합 아스파라기나제 또는 개별 Siglec 리간드-아스파라기나제 접합체 제제로 면역화했다. 연구 -1일차에, 동물을 체중에 기반하여 처리군으로 무작위화하였다. 연구 0일차에, 동물을 기준선 혈청을 위해 채혈하였다. 마우스에 0일차, 7일차, 14일차 및 21일차에 마우스당 15μg 재조합 아스파라기나제 또는 Siglec 리간드-접합된 아스파라기나제 제제로 i.v. 주사하였다. 동물을 흡입된 이소플루란 마취 하에 연구 내내 매주 후안와동을 통해 채혈했다. 전혈을 Microvette EDTA 모세관 수집 튜브(Sarstedt Inc) 안에 수집한 다음 혈청을 수집하기 위해 제조업체 지침에 따라 추가 처리하였다. 샘플은 분석이 수행될 때까지 -80C에 보관했다.
ADA 검정은 PBS에서 100μL/웰의 5μg/mL 아스파라기나제로 코팅된 96-웰 검정 플레이트(Nunc Plates, Black 96-Well Immuno Plates, Thermo Scientific, 437111)에서 수행되었다. 플레이트를 4℃에서 밤새 인큐베이션했다. 다음날, 코팅 용액을 제거하고 플레이트를 PBS 중 200μL/웰의 3% BSA, 20μM EDTA, 0.1% Tween-20으로 실온에서 1시간 동안 차단하였다. 혈청 샘플을 PBS 중 3% BSA, 20μM EDTA, 0.1% Tween-20에 1:185로 희석하고 3-배 일련의 희석에서 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 0.05% Tween-20을 갖는 PBS 완충액으로 세정했다. 세정 후 100μL의 1:2500 희석된 당나귀 항-마우스 IgG(H+L)-HRP(SouthernBiotech, 6411-05)를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 검정 플레이트를 세정한 후 QuantaBlu 기판 용액(Thermo Scientific, 15169) 100μL를 각 웰에 첨가하고 15분 동안 인큐베이션했다. QuantaBlu 형광성 과산화물 기판의 여기 및 방출 설정은 325nm 및 420nm이고 상대 형광 단위는 SpectraMax 플레이트 판독기를 사용하여 측정되었다. 혈청 희석 곡선은 7, 14, 21 및 28일차에 대해 생성되었다. 역가는 배경보다 2x OD를 제공하는 혈청의 희석에 의해 결정되었다.
결과
도 32는 재조합 아스파라기나제 효소 및 아스파라기나제-Siglec 리간드 접합체("Asn'ase BPC-Neu5Gc 1가 PEG - LDR 10" 및 "Asn'ase BPC-Neu5Gc 3가 PEG - LDR 3.5")에 대한 마우스에서의 항-약물 항체 반응의 평가를 묘사한다. BALB/c(n = 그룹당 5) 마우스에는 15μg 아스파라기나제 또는 아스파라기나제 접합체를 매주(4회) 투여했다. 항-아스파라기나아제 IgG 역가는 ELISA 검정에 의해 28일차에 측정되었다. 역가는 각 테스트 항목에 대해 도시된다. Siglec 리간드-아스파라기나아제로 처리된 마우스, 특히 3가 Siglec 리간드-아스파라기나아제 접합체로 처리된 마우스는 억제된 항-아스파라기나아제 반응을 보였다.
발명의 실시형태
본 발명의 실시형태는 다음 조항을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
1. 치료적 활성을 유지하면서 상응하는 조작되지 않은 생물치료제에 비해 변형된 시알산-결합 면역글로불린-유형 렉틴(Siglec) 리간드 프로필을 포함하도록 조작된 생물치료제를 포함하는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
2. 1항에 있어서, Siglec 리간드 프로필은 상응하는 조작되지 않은 생물치료제에 비해 조작된 저면역원성 생물치료제에 공유적으로 결합된 하나 이상의 Siglec 리간드의 상승된 양을 포함하는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
3. 1항 또는 2항에 있어서, 하나 이상의 Siglec 리간드는 B 세포-연관된 Siglec에 대한 리간드인, 조작된 저면역원성 생물치료제.
4. 3항에 있어서, B-세포 연관된 Siglec은 Siglec-2(CD22), Siglec-5(CD170), Siglec-6, Siglec-9(CD329) 및 Siglec-10(Siglec G)으로 구성된 군으로부터 선택되는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
5. 1항 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서, Siglec 리간드는 시알산을 포함하는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
6. 5항에 있어서, 시알산은 천연 발생 시알산인, 조작된 저면역원성 생물치료제.
7. 6항에 있어서, Siglec 리간드는 천연 발생 Siglec 리간드인, 조작된 저면역원성 생물치료제.
8. 6항에 있어서, Siglec 리간드는 비-천연 발생 Siglec 리간드인, 조작된 저면역원성 생물치료제.
9. 8항에 있어서, 천연 발생 시알산은 생물치료제에 공유적으로 결합되는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
10. 8항에 있어서, 비-천연 발생 Siglec 리간드는 비-천연 발생 링커를 추가로 포함하는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
11. 10항에 있어서, 비-천연 발생 Siglec 리간드는 비-천연 발생 링커에 결합된 천연 발생 시알산으로 본질적으로 구성되는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
12. 10항 또는 11항에 있어서, 링커는 당류를 포함하지 않는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
13. 5항에 있어서, Siglec 리간드는 비-천연 발생 시알산을 포함하는 비-천연 발생 Siglec 리간드인, 조작된 저면역원성 생물치료제.
14. 13항에 있어서, 비-천연 발생 시알산은 생물치료제에 공유적으로 결합된, 저면역원성 생물치료제.
15. 13항에 있어서, 비-천연 발생 Siglec 리간드는 비-천연 발생 링커를 추가로 포함하는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
16. 15항에 있어서, 비-천연 발생 Siglec 리간드는 비-천연 발생 링커에 공유적으로 결합된 비-천연 발생 시알산으로 본질적으로 구성되는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
17. 15항 또는 16항에 있어서, 링커는 당류를 포함하지 않는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
18. 5항에 있어서, Siglec 리간드는 2개의 시알산 및 링커를 포함하며, 여기서 링커는 분지형 링커이고 2개의 시알산은 링커에 부착되는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
19. 5항에 있어서, Siglec 리간드는 3개의 시알산 및 링커를 포함하며, 여기서 링커는 분지형 링커이고 3개의 시알산은 링커에 부착되는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
20. 18항 또는 19항에 있어서, 링커는 천연 당류를 포함하지 않는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
21. 1항 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서, Siglec 리간드는 Siglec 결합 펩티드를 포함하는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
22. 21항에 있어서, Siglec 결합 펩티드는 RNDYTE를 포함하는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
23. 1항 내지 22항 중 어느 항 항에 있어서, 저면역원성 생물치료제는 Siglec-2 및 Siglec-10 둘 모두에 대한 Siglec 리간드를 포함하는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
24. 1항 내지 23항 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 저면역원성 생물치료제는 하나 이상의 Siglec 리간드를 포함하고 상응하는 조작되지 않은 면역원성 생물치료제는 조작된 저면역원성 생물치료제보다 더 적은 Siglec 리간드를 포함하는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
25. 24항에 있어서, 조작된 저면역원성 생물치료제는 하나 이상의 Siglec 리간드를 포함하고 상응하는 조작되지 않은 면역원성 생물치료제는 Siglec 리간드를 포함하지 않는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
26. 1항 내지 23항 중 어느 한 항에 있어서, 저면역원성 생물치료제는 생물치료제를 투여받은 개체에서 항체 반응을 유도하는 상응하는 조작되지 않은 면역원성 생물치료제보다 2-배 더 많은 Siglec 리간드를 포함하는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
27. 1항 내지 23항 중 어느 한 항에 있어서, 저면역원성 생물치료제는 생물치료제를 투여받은 개체에서 항체 반응을 유도하는 상응하는 조작되지 않은 생물치료제보다 3-배 더 많은 Siglec 리간드를 포함하는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
28. 1항 내지 23항 중 어느 한 항에 있어서, 저면역원성 생물치료제는 생물치료제를 투여받은 개체에서 항체 반응을 유도하는 상응하는 조작되지 않은 생물치료제보다 5-배 더 많은 Siglec 리간드를 포함하는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
29. 1항 내지 23항 중 어느 한 항에 있어서, 저면역원성 생물치료제는 생물치료제를 투여받은 개체에서 항체 반응을 유도하는 상응하는 조작되지 않은 생물치료제보다 10-배 더 많은 Siglec 리간드를 포함하는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
30. 1항 내지 23항 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 저면역원성 생물치료제는 상응하는 조작되지 않은 생물치료제에 비해 조작된 저면역원성 생물치료제에 공유적으로 결합된 상승된 양의 ASGPR 리간드를 추가로 포함하는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
31. 30항에 있어서, ASGPR 리간드는 천연 발생 GalNAc인, 조작된 저면역원성 생물치료제.
32. 30항에 있어서, ASGPR 리간드는 GalNAc 글리코미메틱인, 조작된 저면역원성 생물치료제.
33. 1항 내지 32항 중 어느 한 항에 있어서, 저면역원성 생물치료제는 생물치료제를 투여받은 개체에서 상응하는 조작되지 않은 생물치료제에 의해 도출될 생물치료제-특이적 항체 역가의 50% 이하인 생물치료제-특이적 항체 역가를 도출하는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
34. 33항에 있어서, 저면역원성 생물치료제는 1개월 이상 동안 개체에게 투여되는, 저면역원성 생물치료제.
35. 33항에 있어서, 저면역원성 생물치료제는 3개월 이상 동안 개체에게 투여되는, 저면역원성 생물치료제.
36. 33항에 있어서, 저면역원성 생물치료제는 6개월 이상 동안 개체에게 투여되는, 저면역원성 생물치료제.
37. 33항에 있어서, 저면역원성 생물치료제는 1년 이상 동안 개체에게 투여되는, 저면역원성 생물치료제.
38. 33항 내지 37항 중 어느 항 항에 있어서, 개체에 대한 투여는 매주인, 조작된 저면역원성 생물치료제.
39. 33항 내지 37항 중 어느 항 항에 있어서, 개체에 대한 투여는 격주인, 조작된 저면역원성 생물치료제.
40. 33항 내지 37항 중 어느 항 항에 있어서, 개체에 대한 투여는 매월인, 조작된 저면역원성 생물치료제.
41. 33항 내지 37항 중 어느 항 항에 있어서, 개체에 대한 투여는 분기별 또는 반기별인, 조작된 저면역원성 생물치료제.
42. 33항 내지 37항 중 어느 항 항에 있어서, 개체에 대한 투여는 매년 또는 격년인, 조작된 저면역원성 생물치료제.
43. 33항 내지 37항 중 어느 항 항에 있어서, ADA 역가는 생물치료제의 마지막 투여 후 8주째에 측정되는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
44. 1항 내지 43항 중 어느 항 항에 있어서, 생물치료제는 단백질인, 조작된 저면역원성 생물치료제.
45. 44항에 있어서, 단백질은 항체, 효소, 키메라 단백질 및 바이러스 입자로 구성된 군으로부터 선택되는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
46. 45항에 있어서, 항체는 모노클로날 항체, 이중특이적 항체, scFv, Fab, 카멜리드 또는 나노바디로 구성된 군으로부터 선택되는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
47. 46항에 있어서, 항체는 아달리무맙, 인플릭시맙, 세툭시맙, 나탈리주맙, 목세투모맙 파수도톡스, 아테졸리주맙, 니볼루맙, 압식시맙, 브렌툭시맙, 세르톨리주맙 페골, 엘로투주맙, 벤랄리주맙, 베돌리주맙, 갈카네주맙, 리툭시맙, 알렘투주맙, 두필루맙, 골리무맙, 오비누투주맙, 틸드라키주맙, 에레누맙, 메폴리주맙, 타무시루맙, 라니비주맙, 우스테키누맙, 레슬리주맙, 이필리무맙, 알리로쿠맙, 벨리무맙, 파니투무맙, 아벨루맙, 네시투무맙, 모가물리주맙, 올라라투맙, 브로달루맙, 에쿨리주맙, 페르투주맙, 펨브롤리주맙 및 토실리주맙으로 구성된 군으로부터 선택되는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
48. 44항에 있어서, 단백질은 에리트로포이에틴, 트롬보포이에틴, 인간 성장 호르몬, 조직 인자, IFNβ-1b, IFNβ-1a, IL-2 또는 IL-2 모방 알데스류킨, 엑세나타이드, 알비글루타이드, 알레파셉트, 팔리페르민 및 벨라타셉트로 구성된 군으로부터 선택되는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
49. 45항에 있어서, 효소는 아스파라기나아제 에르위니아 크리산테미, 페닐알라닌 암모니아-분해효소, 알파-갈락토시다아제 A, 산성 α-글루코시다아제(GAA), 글루코세레브로시다아제(GCase), 아스파르틸글루코사미니다아제(AGA), 알파-L-이두로니다아제, 이두로네이트 설파타아제, 설파미나아제, α-N-아세틸글루코사미니다아제(NAGLU), 헤파린 아세틸 CoA: α-글루코사미나이드 N-아세틸트랜스퍼라제(HGSNAT), N-아세틸글루코사민 6-설파타아제(GNS), N-글루코사민 3-O-설파타제(아릴설파타제 G 또는 ARSG), N-아세틸갈락토사민 6-설파타제, 베타-갈락토시다제, N-아세틸갈락토사민 4-설파타제, 베타-글루쿠로니다제, 인자 VIII, 인자 IX, 팔미토일 단백질 티오에스테라제(PPT1), 트리펩티딜 펩티다제(TPP1), 슈도모나스 엘라스타제(PaE), 슈도모나스 알칼리성 프로테아제(PaAP) 및 연쇄상구균 발열성 외독소 B(SpeB)로 구성된 군으로부터 선택되는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
50. 45항에 있어서, 바이러스 입자는 재조합 아데노-연관된 바이러스(rAAV) 입자, 재조합 인간 아데노바이러스(rHAdV) 입자, 재조합 단순 헤르페스 바이러스(rHSV) 입자, 재조합 유두종바이러스(PV) 입자, 재조합 폴리오마바이러스 입자, 재조합 백시니아 바이러스 입자, 재조합 사이토메갈로바이러스(CMV) 입자, 재조합 바큘로바이러스 입자, 재조합 인간 유두종바이러스(HPV) 입자 및 재조합 레트로바이러스 입자로부터 선택되는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
51. 50항에 있어서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3b, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAV11, AAV12, 및 AAV13 VP1 단백질 또는 이의 변이체로 구성된 군으로부터 선택되는 캡시드 VP1 단백질을 포함하는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
52. 50항에 있어서, 재조합체는 재조합 HAdV-A, HAdV-B, HAdV-C, HAdV-D, HAdV-E, HAdV-F 및 HAdV-G 또는 이의 변이체로 구성된 군으로부터 선택되는 인간 아데노바이러스 입자로부터의 캡시드 단백질을 포함하는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
53. 50항에 있어서, 재조합 HSV 입자는 재조합 HSV1 또는 HSV2 입자 또는 이의 변이체로부터 선택되는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
54. 50항에 있어서, 재조합 레트로바이러스 입자는 렌티바이러스 입자, 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 입자, 유인원 면역결핍 바이러스(SIV) 입자, 고양이 면역결핍 바이러스(FIV) 입자, 퓨마 렌티바이러스(PLV) 입자, 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV) 입자, 소 면역결핍 바이러스(BIV) 입자, 염소 관절염 뇌염 바이러스 입자, 감마레트로바이러스 입자 및 뮤어라인 백혈병 바이러스(MLV) 입자, 또는 이의 변이체 또는 유사형 바이러스로 구성된 군으로부터 선택되는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
55. 저면역원성 생물치료제를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 시알산을 생물치료제에 공유적으로 부착시켜 조작된 저면역원성 생물치료제를 생성하는 것을 포함하는, 방법.
56. 55항에 있어서, 공유적으로 부착하는 것은 조작된 생합성에 의한 시알릴화를 포함하는, 방법.
57. 55항에 있어서, 공유적으로 부착하는 것은 화학적 접합에 의한 시알릴화를 포함하는, 방법.
58. 55항 내지 57항 중 어느 한 항에 있어서, 시알산의 화학적 접합은 생물치료제의 글리칸에 대한 것인, 방법.
59. 58항에 있어서, 생물치료제의 글리칸에 대한 시알산의 화학적 접합은 시알산과 글리칸 사이에 공유 결합을 초래하는, 방법.
60. 58항에 있어서, 생물치료제의 글리칸에 대한 시알산의 화학적 접합은 시알산과 글리칸 사이에 링커를 통합하는, 방법.
61. 55항 내지 57항 중 어느 한 항에 있어서, 시알산의 화학적 접합은 생물치료제의 아미노산에 대한 것인, 방법.
62. 61항에 있어서, 생물치료제의 아미노산에 대한 시알산의 화학적 접합은 시알산과 아미노산 사이에 공유 결합을 초래하는, 방법.
63. 61항에 있어서, 생물치료제의 아미노산에 대한 시알산의 화학적 접합은 시알산과 아미노산 사이에 링커를 통합하는, 방법.
64. 55항 내지 63항 중 어느 한 항에 있어서, 시알산은 천연 발생 시알산인, 방법.
65. 55항 내지 63항 중 어느 한 항에 있어서, 시알산은 비-천연 발생 시알산인, 방법.
66. 55항에 있어서, 공유적으로 부착하는 것은 유전 공학에 의해 생물치료제의 아미노산 서열내로 Siglec 결합 펩티드 또는 폴리펩티드의 삽입을 포함하는, 방법.
67. 66항에 있어서, Siglec 결합 펩티드는 RNDYTE인, 방법.
68. 55항 내지 67항 중 어느 한 항에 있어서, 공유적으로 부착하는 것은 Siglec 리간드의 생성을 야기하는, 방법.
69. 68항에 있어서, Siglec 리간드는 B-세포 연관된 Siglec에 대한 리간드인, 방법.
70. 69항에 있어서, B-세포 연관된 Siglec은 Siglec-2(CD22), Siglec-5(CD170), Siglec-6, Siglec-9(CD329) 및 Siglec-10(Siglec G)으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
71. 55항 내지 70항 중 어느 한 항에 있어서, 생물치료제와 회합된 시알산의 양은 공유 부착 후에 2-배 이상 증가되는, 방법.
72. 55항 내지 70항 중 어느 한 항에 있어서, 생물치료제와 회합된 Siglec 리간드의 양은 공유 부착 후에 5-배 이상 증가되는, 방법.
73. 55항 내지 70항 중 어느 한 항에 있어서, 생물치료제와 회합된 Siglec 리간드의 양은 공유 부착 후에 10-배 이상 증가되는, 방법.
74. 55항 내지 73항 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 저면역원성 생물치료제는 상응하는 조작되지 않은 생물치료제에 비해 조작된 저면역원성 생물치료제에 공유적으로 결합된 상승된 양의 ASGPR 리간드를 추가로 포함하는, 방법.
75. 74항에 있어서, ASGPR 리간드는 천연 발생 GalNAc인, 방법.
76. 74항에 있어서, ASGPR 리간드는 GalNAc 글리코미메틱인, 방법.
77. 55항 내지 76항 중 어느 한 항에 있어서, 생물치료제는 단백질인, 방법.
78. 77항에 있어서, 단백질은 항체, 효소, 키메라 단백질 및 바이러스 입자로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
79. 78항에 있어서, 항체는 모노클로날 항체, 이중특이적 항체, scFv, Fab, 카멜리드 또는 나노바디로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
80. 78항 또는 79항에 있어서, 항체는 아달리무맙, 인플릭시맙, 세툭시맙, 나탈리주맙, 목세투모맙 파수도톡스, 아테졸리주맙, 니볼루맙, 압식시맙, 브렌툭시맙, 세르톨리주맙 페골, 엘로투주맙, 벤랄리주맙, 베돌리주맙, 갈카네주맙, 리툭시맙, 알렘투주맙, 두필루맙, 골리무맙, 오비누투주맙, 틸드라키주맙, 에레누맙, 메폴리주맙, 타무시루맙, 라니비주맙, 우스테키누맙, 레슬리주맙, 이필리무맙, 알리로쿠맙, 벨리무맙, 파니투무맙, 아벨루맙, 네시투무맙, 모가물리주맙, 올라라투맙, 브로달루맙, 에쿨리주맙, 페르투주맙, 펨브롤리주맙 및 토실리주맙으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
81. 77항에 있어서, 단백질은 에리트로포이에틴, 트롬보포이에틴, 인간 성장 호르몬, 조직 인자, IFNβ-1b, IFNβ-1a, IL-2 또는 IL-2 모방 알데스류킨, 엑세나타이드, 알비글루타이드, 알레파셉트, 팔리페르민 및 벨라타셉트로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
82. 78항에 있어서, 효소는 아스파라기나아제 에르위니아 크리산테미, 페닐알라닌 암모니아-분해효소, 알파-갈락토시다아제 A, 산성 α-글루코시다아제(GAA), 글루코세레브로시다아제(GCase), 아스파르틸글루코사미니다아제(AGA), 알파-L-이두로니다아제, 이두로네이트 설파타아제, 설파미나아제, α-N-아세틸글루코사미니다아제(NAGLU), 헤파린 아세틸 CoA: α-글루코사미나이드 N-아세틸트랜스퍼라제(HGSNAT), N-아세틸글루코사민 6-설파타아제(GNS), N-글루코사민 3-O-설파타제(아릴설파타제 G 또는 ARSG), N-아세틸갈락토사민 6-설파타제, 베타-갈락토시다제, N-아세틸갈락토사민 4-설파타제, 베타-글루쿠로니다제, 인자 VIII, 인자 IX, 팔미토일 단백질 티오에스테라제(PPT1), 및 트리펩티딜 펩티다제(TPP1)로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
83. 78항에 있어서, 바이러스 입자는 재조합 아데노-연관된 바이러스(rAAV) 입자, 재조합 인간 아데노바이러스(rHAdV) 입자, 재조합 단순 헤르페스 바이러스(rHSV) 입자, 재조합 유두종바이러스(PV) 입자, 재조합 폴리오마바이러스 입자, 재조합 백시니아 바이러스 입자, 재조합 사이토메갈로바이러스(CMV) 입자, 재조합 바큘로바이러스 입자, 재조합 인간 유두종바이러스(HPV) 입자 및 재조합 레트로바이러스 입자로부터 선택되는, 방법.
84. 다음을 포함하는 약학적 조성물:
1항 내지 54중 어느 한 항에 따른 조작된 저면역원성 생물치료제 또는 55항 내지 83항 중 어느 한 항에 따라 제조된 조성물; 및
약학적 부형제.
85. 생물치료제 작용제의 투여에 의해 치료될 수 있는 장애 또는 질환을 앓고 있는 개체를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 장애 또는 질환을 치료하기에 유효한 양으로 84항에 따른 약학적 조성물을 개체에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 약학적 조성물은 조작되지 않은 생물치료제에 비해 감소된 항-약물 항체 역가를 도출하는, 방법.
86. 85항에 있어서, 질환은 류마티스성 관절염, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 크론병, 궤양성 대장염, 건선, 화농한선염, 포도막염 및 소아 특발성 관절염으로 구성된 군으로부터 선택되는 만성 면역 질환이고, 여기서 투여하는 것은 아달리무맙 및 인플릭시맙으로부터 선택되는 조작된 저면역원성 TNFα-특이적 항체를 만성 면역 질환을 치료하기에 유효한 양으로 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
87. 85항에 있어서, 질환은 백혈병이고, 여기서 투여하는 것은 에르위니아 크리산테미로부터 조작된 저면역원성 아스파라기나제를 암을 치료하기에 유효한 양으로 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
88. 85항에 있어서, 질환은 다발성 경화증이고, 여기서 투여하는 것은 조작된 저면역원성 나탈리주맙, 조작된 저면역원성 IFNβ-1b, 또는 조작된 저면역원성 IFNβ-1a를 다발성 경화증을 치료하기에 유효한 양으로 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
89. 85항에 있어서, 장애는 이식된 조직에 대한 항체 반응이고, 여기서 투여하는 것은 조작된 저면역원성 IdeS를 이식된 조직에 대한 항체 반응을 억제하기에 유효한 양으로 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
90. 89항에 있어서, 이식된 조직은 동종이계 이식편인, 방법.
91. 89항에 있어서, 이식된 조직은 이종이식편인, 방법.
92. 86항 내지 91항 중 어느 한 항에 있어서, 조직은 신장, 심장, 폐, 간, 췌장, 기관, 혈관 조직, 피부, 뼈, 연골, 부신 조직, 태아 흉선 및 각막으로부터 선택되는, 방법.
93. 85항에 있어서, 장애는 제2형 당뇨병이고, 여기서 투여하는 것은 조작된 저면역원성 엑세나타이드 또는 조작된 저면역원성 알비글루타이드를 장애를 치료하기에 유효한 양으로 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
94. 85항에 있어서, 장애는 효소 결핍이고, 여기서 투여하는 것은 조작된 저면역원성 효소를 결핍을 치료하기에 유효한 양으로 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
95. 94항에 있어서, 효소 결핍은 페닐알라닌 암모니아-분해효소(PKU), 알파-갈락토시다아제 A(파브리용), 산 α-글루코시다아제(GAA, 폼페용), 글루코세레브로시다제(GCase, 고셔용), 아스파르틸글리코사미니다제(AGA, 아스파르틸글리코사미뇨증용), 알파-L-이두로니다제(MPS I용), 이두로네이트 설파타제(MPS II용), 술파미나제(MPS IIIa), α-N-아세틸글루코사미니다제(NAGLU, MPS IIIB용), 헤파린 아세틸 CoA: α-글루코사미나이드 N-아세틸트랜스퍼라제(HGSNAT, MPS IIIC용), N-아세틸글루코사민 6-설파타제(GNS, MPS IIID용), N-글루코사민 3-O-설파타제(아릴설파타제 G 또는 ARSG, MPS IIIE), N-아세틸갈락토사민 6-설파타제(MPS IVA용), 베타-갈락토시다제(MPS IVB용), N-아세틸갈락토사민 4-설파타제(MPS VI용), 베타-글루쿠로니다제(MPS VI용), 인자 VIII(혈우병 A용), 인자 IX(혈우병 B용), 팔미토일 단백질 티오에스테라아제(PPT1, CLN1용), 트리펩티딜 펩티다아제(TPP1, CLN2용) 및 시스타티오닌 베타 합성효소(CBS) 결핍으로 구성된 군으로부터 선택된 효소에 대한 결핍인, 방법.
96. 85항에 있어서, 장애는 단일유전자 질환이고, 여기서 투여하는 것은 치료적 생성물을 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 조작된 저면역원성 바이러스 입자를 질환을 치료하기에 유효한 양으로 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
97. 85항 내지 96항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은:
조작된 저면역원성 생물치료제를 투여한 후 8주째에 개체로부터 혈청을 채취하고 생물치료제-특이적 항체에 대해 혈청을 평가하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 생물치료제-특이적 항체의 역가는 상응하는 조작되지 않은 생물치료제에 의해 도출될 역가의 50%인, 방법.
98. 97항에 있어서, 생물치료제-특이적 항체의 역가는 상응하는 조작되지 않은 생물치료제에 의해 도출될 역가의 20%인, 방법.
99. 97항에 있어서, 생물치료제-특이적 항체의 역가는 상응하는 조작되지 않은 생물치료제에 의해 도출될 역가의 5%인, 방법.
100. 97항에 있어서, 생물치료제-특이적 항체는 검출될 수 없는, 방법.
101. 비천연 발생 Siglec 리간드에 공유적으로 결합된 생물치료제를 포함하는 조작된 저면역원성 생물치료제로서, 상기 Siglec 리간드는 , , , 및 로 구성된 군으로부터 선택되는 비-천연 발생 시알산, 및
, , 및 로 구성된 군으로부터 선택되는 링커를 포함하며,
여기서 링커는 시알산을 생물치료제에 부착시키는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
102. 101항에 있어서, 비천연 발생 Siglec 리간드는 하기로 구성된 군으로부터 선택되는, 조작된 저면역원성 생물치료제:
, , , , , , , , , , , 및 .
103. 101항 또는 102항에 있어서, 비천연 발생 Siglec 리간드는 링커와 시알산 사이에 당류를 포함하지 않는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
104. 식 (I)의 조작된 저면역원성 생물치료제:
[Xn-L]m-Y
(I)
여기서 X는 시알산기이고, L은 선택적 링커이고, Y는 생물치료제이고, n은 1 이상의 정수이고, m은 1 이상의 정수임.
전술한 것은 단지 발명의 원리를 예시한다. 당업자는 본 명세서에 명시적으로 기술되거나 도시되지는 않았지만 발명의 원리를 구현하고 발명의 사상 및 범주 내에 포함되는 다양한 구성을 고안할 수 있음을 이해할 것이다. 더욱이, 본 명세서에 인용된 모든 실시예 및 조건부 언어는 주로 독자가 발명의 원리 및 기술을 발전시키는 것에 대해 발명자에 의해 기여된 개념을 이해하는데 도움을 주기 위한 것이고, 이러한 구체적으로 인용된 실시예 및 조건에 제한되지 않는 것으로 해석되어야 한다. 더욱이, 발명의 원리, 양태 및 실시형태뿐만 아니라 그의 구체적인 실시예를 인용하는 본 명세서에서 모든 진술은 그의 구조적 및 기능적 등가물 모두를 포함하도록 의도된다. 부가적으로, 그러한 등가물은 현재 알려진 등가물과 미래에 개발될 등가물, 즉 구조에 관계없이 동일한 기능을 수행하는 개발되는 임의의 요소를 모두 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, 본 발명의 범주는 본 명세서에 도시되고 기재된 예시적인 실시형태로 제한되도록 의도되지 않는다. 오히려, 본 발명의 범주 및 사상은 첨부된 청구범위에 의해 구체화된다.

Claims (104)

  1. 치료적 활성을 유지하면서 상응하는 조작되지 않은 생물치료제에 비해 변형된 시알산-결합 면역글로불린-유형 렉틴(Siglec) 리간드 프로필을 포함하도록 조작된 생물치료제를 포함하는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
  2. 제1항에 있어서, Siglec 리간드 프로필은 상응하는 조작되지 않은 생물치료제에 비해 조작된 저면역원성 생물치료제에 공유적으로 결합된 하나 이상의 Siglec 리간드의 상승된 양을 포함하는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, Siglec 리간드 중 하나 이상은 B 세포-연관된 Siglec에 대한 리간드인, 조작된 저면역원성 생물치료제.
  4. 제3항에 있어서, B-세포 연관된 Siglec은 Siglec-2(CD22), Siglec-5(CD170), Siglec-6, Siglec-9(CD329) 및 Siglec-10(Siglec G)으로 구성된 군으로부터 선택되는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, Siglec 리간드는 시알산을 포함하는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
  6. 제5항에 있어서, 시알산은 천연 발생 시알산인, 조작된 저면역원성 생물치료제.
  7. 제6항에 있어서, Siglec 리간드는 천연 발생 Siglec 리간드인, 조작된 저면역원성 생물치료제.
  8. 제6항에 있어서, Siglec 리간드는 비-천연 발생 Siglec 리간드인, 조작된 저면역원성 생물치료제.
  9. 제8항에 있어서, 천연 발생 시알산은 생물치료제에 공유적으로 결합되는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
  10. 제8항에 있어서, 비-천연 발생 Siglec 리간드는 비-천연 발생 링커를 추가로 포함하는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
  11. 제10항에 있어서, 비-천연 발생 Siglec 리간드는 비-천연 발생 링커에 결합된 천연 발생 시알산으로 본질적으로 구성되는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 링커는 당류를 포함하지 않는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
  13. 제5항에 있어서, Siglec 리간드는 비-천연 발생 시알산을 포함하는 비-천연 발생 Siglec 리간드인, 조작된 저면역원성 생물치료제.
  14. 제13항에 있어서, 비-천연 발생 시알산은 생물치료제에 공유적으로 결합된, 조작된 저면역원성 생물치료제.
  15. 제13항에 있어서, 비-천연 발생 Siglec 리간드는 비-천연 발생 링커를 추가로 포함하는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
  16. 제15항에 있어서, 비-천연 발생 Siglec 리간드는 비-천연 발생 링커에 공유적으로 결합된 비-천연 발생 시알산으로 본질적으로 구성되는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 링커는 당류를 포함하지 않는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
  18. 제5항에 있어서, Siglec 리간드는 2개의 시알산 및 링커를 포함하며, 여기서 링커는 분지형 링커이고 2개의 시알산은 링커에 부착되는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
  19. 제5항에 있어서, Siglec 리간드는 3개의 시알산 및 링커를 포함하며, 여기서 링커는 분지형 링커이고 3개의 시알산은 링커에 부착되는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 링커는 천연 당류를 포함하지 않는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
  21. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, Siglec 리간드는 Siglec 결합 펩티드를 포함하는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
  22. 제21항에 있어서, Siglec 결합 펩티드는 RNDYTE를 포함하는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 항 항에 있어서, 저면역원성 생물치료제는 Siglec-2 및 Siglec-10 둘 모두에 대한 Siglec 리간드를 포함하는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 저면역원성 생물치료제는 하나 이상의 Siglec 리간드를 포함하고 상응하는 조작되지 않은 면역원성 생물치료제는 조작된 저면역원성 생물치료제보다 더 적은 Siglec 리간드를 포함하는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
  25. 제24항에 있어서, 조작된 저면역원성 생물치료제는 하나 이상의 Siglec 리간드를 포함하고 상응하는 조작되지 않은 면역원성 생물치료제는 Siglec 리간드를 포함하지 않는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
  26. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 저면역원성 생물치료제는 생물치료제를 투여받은 개체에서 항체 반응을 유도하는 상응하는 조작되지 않은 면역원성 생물치료제보다 2-배 더 많은 Siglec 리간드를 포함하는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
  27. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 저면역원성 생물치료제는 생물치료제를 투여받은 개체에서 항체 반응을 유도하는 상응하는 조작되지 않은 생물치료제보다 3-배 더 많은 Siglec 리간드를 포함하는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
  28. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 저면역원성 생물치료제는 생물치료제를 투여받은 개체에서 항체 반응을 유도하는 상응하는 조작되지 않은 생물치료제보다 5-배 더 많은 Siglec 리간드를 포함하는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
  29. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 저면역원성 생물치료제는 생물치료제를 투여받은 개체에서 항체 반응을 유도하는 상응하는 조작되지 않은 생물치료제보다 10-배 더 많은 Siglec 리간드를 포함하는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
  30. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 저면역원성 생물치료제는 상응하는 조작되지 않은 생물치료제에 비해 조작된 저면역원성 생물치료제에 공유적으로 결합된 상승된 양의 ASGPR 리간드를 추가로 포함하는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
  31. 제30항에 있어서, ASGPR 리간드는 천연 발생 GalNAc인, 조작된 저면역원성 생물치료제.
  32. 제30항에 있어서, ASGPR 리간드는 GalNAc 글리코미메틱인, 조작된 저면역원성 생물치료제.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 저면역원성 생물치료제는 생물치료제를 투여받은 개체에서 상응하는 조작되지 않은 생물치료제에 의해 도출될 생물치료제-특이적 항체 역가의 50% 이하인 생물치료제-특이적 항체 역가를 도출하는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
  34. 제33항에 있어서, 저면역원성 생물치료제는 1개월 이상 동안 개체에게 투여되는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
  35. 제33항에 있어서, 저면역원성 생물치료제는 3개월 이상 동안 개체에게 투여되는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
  36. 제33항에 있어서, 저면역원성 생물치료제는 6개월 이상 동안 개체에게 투여되는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
  37. 제33항에 있어서, 저면역원성 생물치료제는 1년 이상 동안 개체에게 투여되는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
  38. 제33항 내지 제37항 중 어느 항 항에 있어서, 개체에 대한 투여는 매주인, 조작된 저면역원성 생물치료제.
  39. 제33항 내지 제37항 중 어느 항 항에 있어서, 개체에 대한 투여는 격주인, 조작된 저면역원성 생물치료제.
  40. 제33항 내지 제37항 중 어느 항 항에 있어서, 개체에 대한 투여는 매월인, 조작된 저면역원성 생물치료제.
  41. 제33항 내지 제37항 중 어느 항 항에 있어서, 개체에 대한 투여는 분기별 또는 반기별인, 조작된 저면역원성 생물치료제.
  42. 제33항 내지 제37항 중 어느 항 항에 있어서, 개체에 대한 투여는 매년 또는 격년인, 조작된 저면역원성 생물치료제.
  43. 제33항 내지 제37항 중 어느 항 항에 있어서, ADA 역가는 생물치료제의 마지막 투여 후 8주째에 측정되는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 항 항에 있어서, 생물치료제는 단백질인, 조작된 저면역원성 생물치료제.
  45. 제44항에 있어서, 단백질은 항체, 효소, 키메라 단백질 및 바이러스 입자로 구성된 군으로부터 선택되는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
  46. 제45항에 있어서, 항체는 모노클로날 항체, 이중특이적 항체, scFv, Fab, 카멜리드 또는 나노바디로 구성된 군으로부터 선택되는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
  47. 제46항에 있어서, 항체는 아달리무맙, 인플릭시맙, 세툭시맙, 나탈리주맙, 목세투모맙 파수도톡스, 아테졸리주맙, 니볼루맙, 압식시맙, 브렌툭시맙, 세르톨리주맙 페골, 엘로투주맙, 벤랄리주맙, 베돌리주맙, 갈카네주맙, 리툭시맙, 알렘투주맙, 두필루맙, 골리무맙, 오비누투주맙, 틸드라키주맙, 에레누맙, 메폴리주맙, 타무시루맙, 라니비주맙, 우스테키누맙, 레슬리주맙, 이필리무맙, 알리로쿠맙, 벨리무맙, 파니투무맙, 아벨루맙, 네시투무맙, 모가물리주맙, 올라라투맙, 브로달루맙, 에쿨리주맙, 페르투주맙, 펨브롤리주맙 및 토실리주맙으로 구성된 군으로부터 선택되는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
  48. 제44항에 있어서, 단백질은 에리트로포이에틴, 트롬보포이에틴, 인간 성장 호르몬, 조직 인자, IFNβ-1b, IFNβ-1a, IL-2 또는 IL-2 모방 알데스류킨, 엑세나타이드, 알비글루타이드, 알레파셉트, 팔리페르민 및 벨라타셉트로 구성된 군으로부터 선택되는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
  49. 제45항에 있어서, 효소는 아스파라기나아제 에르위니아 크리산테미, 페닐알라닌 암모니아-분해효소, 알파-갈락토시다아제 A, 산성 α-글루코시다아제(GAA), 글루코세레브로시다아제(GCase), 아스파르틸글루코사미니다아제(AGA), 알파-L-이두로니다아제, 이두로네이트 설파타아제, 설파미나아제, α-N-아세틸글루코사미니다아제(NAGLU), 헤파린 아세틸 CoA: α-글루코사미나이드 N-아세틸트랜스퍼라제(HGSNAT), N-아세틸글루코사민 6-설파타아제(GNS), N-글루코사민 3-O-설파타제(아릴설파타제 G 또는 ARSG), N-아세틸갈락토사민 6-설파타제, 베타-갈락토시다제, N-아세틸갈락토사민 4-설파타제, 베타-글루쿠로니다제, 인자 VIII, 인자 IX, 팔미토일 단백질 티오에스테라제(PPT1), 트리펩티딜 펩티다제(TPP1), 슈도모나스 엘라스타제(PaE), 슈도모나스 알칼리성 프로테아제(PaAP) 및 연쇄상구균 발열성 외독소 B(SpeB)로 구성된 군으로부터 선택되는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
  50. 제45항에 있어서, 바이러스 입자는 재조합 아데노-연관된 바이러스(rAAV) 입자, 재조합 인간 아데노바이러스(rHAdV) 입자, 재조합 단순 헤르페스 바이러스(rHSV) 입자, 재조합 유두종바이러스(PV) 입자, 재조합 폴리오마바이러스 입자, 재조합 백시니아 바이러스 입자, 재조합 사이토메갈로바이러스(CMV) 입자, 재조합 바큘로바이러스 입자, 재조합 인간 유두종바이러스(HPV) 입자 및 재조합 레트로바이러스 입자로부터 선택되는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
  51. 제50항에 있어서, rAAV 입자는 AAV1, AAV2, AAV3b, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAV11, AAV12, 및 AAV13 VP1 단백질 또는 이의 변이체로 구성된 군으로부터 선택되는 캡시드 VP1 단백질을 포함하는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
  52. 제50항에 있어서, 재조합체는 재조합 HAdV-A, HAdV-B, HAdV-C, HAdV-D, HAdV-E, HAdV-F 및 HAdV-G 또는 이의 변이체로 구성된 군으로부터 선택되는 인간 아데노바이러스 입자로부터의 캡시드 단백질을 포함하는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
  53. 제50항에 있어서, 재조합 HSV 입자는 재조합 HSV1 또는 HSV2 입자 또는 이의 변이체로부터 선택되는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
  54. 제50항에 있어서, 재조합 레트로바이러스 입자는 렌티바이러스 입자, 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 입자, 유인원 면역결핍 바이러스(SIV) 입자, 고양이 면역결핍 바이러스(FIV) 입자, 퓨마 렌티바이러스(PLV) 입자, 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV) 입자, 소 면역결핍 바이러스(BIV) 입자, 염소 관절염 뇌염 바이러스 입자, 감마레트로바이러스 입자 및 뮤어라인 백혈병 바이러스(MLV) 입자, 또는 이의 변이체 또는 유사형 바이러스로 구성된 군으로부터 선택되는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
  55. 저면역원성 생물치료제를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 시알산을 생물치료제에 공유적으로 부착시켜 조작된 저면역원성 생물치료제를 생성하는 것을 포함하는, 방법.
  56. 제55항에 있어서, 공유적으로 부착하는 것은 조작된 생합성에 의한 시알릴화를 포함하는, 방법.
  57. 제55항에 있어서, 공유적으로 부착하는 것은 화학적 접합에 의한 시알릴화를 포함하는, 방법.
  58. 제55항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 시알산의 화학적 접합은 생물치료제의 글리칸에 대한 것인, 방법.
  59. 제58항에 있어서, 생물치료제의 글리칸에 대한 시알산의 화학적 접합은 시알산과 글리칸 사이에 공유 결합을 초래하는, 방법.
  60. 제58항에 있어서, 생물치료제의 글리칸에 대한 시알산의 화학적 접합은 시알산과 글리칸 사이에 링커를 통합하는, 방법.
  61. 제55항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 시알산의 화학적 접합은 생물치료제의 아미노산에 대한 것인, 방법.
  62. 제61항에 있어서, 생물치료제의 아미노산에 대한 시알산의 화학적 접합은 시알산과 아미노산 사이에 공유 결합을 초래하는, 방법.
  63. 제61항에 있어서, 생물치료제의 아미노산에 대한 시알산의 화학적 접합은 시알산과 아미노산 사이에 링커를 통합하는, 방법.
  64. 제55항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 시알산은 천연 발생 시알산인, 방법.
  65. 제55항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 시알산은 비-천연 발생 시알산인, 방법.
  66. 제55항에 있어서, 공유적으로 부착하는 것은 유전 공학에 의해 생물치료제의 아미노산 서열내로 Siglec 결합 펩티드 또는 폴리펩티드의 삽입을 포함하는, 방법.
  67. 제66항에 있어서, Siglec 결합 펩티드는 RNDYTE인, 방법.
  68. 제55항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 공유적으로 부착하는 것은 Siglec 리간드의 생성을 초래하는, 방법.
  69. 제68항에 있어서, Siglec 리간드는 B-세포 연관된 Siglec에 대한 리간드인, 방법.
  70. 제69항에 있어서, B-세포 연관된 Siglec은 Siglec-2(CD22), Siglec-5(CD170), Siglec-6, Siglec-9(CD329) 및 Siglec-10(Siglec G)으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  71. 제55항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 생물치료제와 회합된 시알산의 양은 공유 부착 후에 2-배 이상 증가되는, 방법.
  72. 제55항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 생물치료제와 회합된 Siglec 리간드의 양은 공유 부착 후에 5-배 이상 증가되는, 방법.
  73. 제55항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 생물치료제와 회합된 Siglec 리간드의 양은 공유 부착 후에 10-배 이상 증가되는, 방법.
  74. 제55항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 저면역원성 생물치료제는 상응하는 조작되지 않은 생물치료제에 비해 조작된 저면역원성 생물치료제에 공유적으로 결합된 상승된 양의 ASGPR 리간드를 추가로 포함하는, 방법.
  75. 제74항에 있어서, ASGPR 리간드는 천연 발생 GalNAc인, 방법.
  76. 제74항에 있어서, ASGPR 리간드는 GalNAc 글리코미메틱인, 방법.
  77. 제55항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 생물치료제는 단백질인, 방법.
  78. 제77항에 있어서, 단백질은 항체, 효소, 키메라 단백질 및 바이러스 입자로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  79. 제78항에 있어서, 항체는 모노클로날 항체, 이중특이적 항체, scFv, Fab, 카멜리드 또는 나노바디로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  80. 제78항 또는 제79항에 있어서, 항체는 아달리무맙, 인플릭시맙, 세툭시맙, 나탈리주맙, 목세투모맙 파수도톡스, 아테졸리주맙, 니볼루맙, 압식시맙, 브렌툭시맙, 세르톨리주맙 페골, 엘로투주맙, 벤랄리주맙, 베돌리주맙, 갈카네주맙, 리툭시맙, 알렘투주맙, 두필루맙, 골리무맙, 오비누투주맙, 틸드라키주맙, 에레누맙, 메폴리주맙, 타무시루맙, 라니비주맙, 우스테키누맙, 레슬리주맙, 이필리무맙, 알리로쿠맙, 벨리무맙, 파니투무맙, 아벨루맙, 네시투무맙, 모가물리주맙, 올라라투맙, 브로달루맙, 에쿨리주맙, 페르투주맙, 펨브롤리주맙 및 토실리주맙으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  81. 제77항에 있어서, 단백질은 에리트로포이에틴, 트롬보포이에틴, 인간 성장 호르몬, 조직 인자, IFNβ-1b, IFNβ-1a, IL-2 또는 IL-2 모방 알데스류킨, 엑세나타이드, 알비글루타이드, 알레파셉트, 팔리페르민 및 벨라타셉트로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  82. 제78항에 있어서, 효소는 아스파라기나아제 에르위니아 크리산테미, 페닐알라닌 암모니아-분해효소, 알파-갈락토시다아제 A, 산성 α-글루코시다아제(GAA), 글루코세레브로시다아제(GCase), 아스파르틸글루코사미니다아제(AGA), 알파-L-이두로니다아제, 이두로네이트 설파타아제, 설파미나아제, α-N-아세틸글루코사미니다아제(NAGLU), 헤파린 아세틸 CoA: α-글루코사미나이드 N-아세틸트랜스퍼라제(HGSNAT), N-아세틸글루코사민 6-설파타아제(GNS), N-글루코사민 3-O-설파타제(아릴설파타제 G 또는 ARSG), N-아세틸갈락토사민 6-설파타제, 베타-갈락토시다제, N-아세틸갈락토사민 4-설파타제, 베타-글루쿠로니다제, 인자 VIII, 인자 IX, 팔미토일 단백질 티오에스테라제(PPT1), 및 트리펩티딜 펩티다제(TPP1)로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  83. 제78항에 있어서, 바이러스 입자는 재조합 아데노-연관된 바이러스(rAAV) 입자, 재조합 인간 아데노바이러스(rHAdV) 입자, 재조합 단순 헤르페스 바이러스(rHSV) 입자, 재조합 유두종바이러스(PV) 입자, 재조합 폴리오마바이러스 입자, 재조합 백시니아 바이러스 입자, 재조합 사이토메갈로바이러스(CMV) 입자, 재조합 바큘로바이러스 입자, 재조합 인간 유두종바이러스(HPV) 입자 및 재조합 레트로바이러스 입자로부터 선택되는, 방법.
  84. 다음을 포함하는 약학적 조성물:
    제1항 내지 제54중 어느 한 항에 따른 조작된 저면역원성 생물치료제 또는 제55항 내지 제83항 중 어느 한 항에 따라 제조된 조성물; 및
    약학적 부형제.
  85. 생물치료제 작용제의 투여에 의해 치료될 수 있는 장애 또는 질환을 앓고 있는 개체를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 장애 또는 질환을 치료하기에 유효한 양으로 제84항에 따른 약학적 조성물을 개체에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 약학적 조성물은 조작되지 않은 생물치료제에 비해 감소된 항-약물 항체 역가를 도출하는, 방법.
  86. 제85항에 있어서, 질환은 류마티스성 관절염, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 크론병, 궤양성 대장염, 건선, 화농한선염, 포도막염 및 소아 특발성 관절염으로 구성된 군으로부터 선택되는 만성 면역 질환이고, 여기서 투여하는 것은 아달리무맙 및 인플릭시맙으로부터 선택되는 조작된 저면역원성 TNFα-특이적 항체를 만성 면역 질환을 치료하기에 유효한 양으로 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  87. 제85항에 있어서, 질환은 백혈병이고, 여기서 투여하는 것은 에르위니아 크리산테미로부터 조작된 저면역원성 아스파라기나제를 암을 치료하기에 유효한 양으로 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  88. 제85항에 있어서, 질환은 다발성 경화증이고, 여기서 투여하는 것은 조작된 저면역원성 나탈리주맙, 조작된 저면역원성 IFNβ-1b, 또는 조작된 저면역원성 IFNβ-1a를 다발성 경화증을 치료하기에 유효한 양으로 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  89. 제85항에 있어서, 장애는 이식된 조직에 대한 항체 반응이고, 여기서 투여하는 것은 조작된 저면역원성 IdeS를 이식된 조직에 대한 항체 반응을 억제하기에 유효한 양으로 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  90. 제89항에 있어서, 이식된 조직은 동종이계 이식편인, 방법.
  91. 제89항에 있어서, 이식된 조직은 이종이식편인, 방법.
  92. 제86항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 조직은 신장, 심장, 폐, 간, 췌장, 기관, 혈관 조직, 피부, 뼈, 연골, 부신 조직, 태아 흉선 및 각막으로부터 선택되는, 방법.
  93. 제85항에 있어서, 장애는 제2형 당뇨병이고, 여기서 투여하는 것은 조작된 저면역원성 엑세나타이드 또는 조작된 저면역원성 알비글루타이드를 장애를 치료하기에 유효한 양으로 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  94. 제85항에 있어서, 장애는 효소 결핍이고, 여기서 투여하는 것은 조작된 저면역원성 효소를 결핍을 치료하기에 유효한 양으로 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  95. 제94항에 있어서, 효소 결핍은 페닐알라닌 암모니아-분해효소(PKU), 알파-갈락토시다아제 A(파브리용), 산 α-글루코시다아제(GAA, 폼페용), 글루코세레브로시다제(GCase, 고셔용), 아스파르틸글리코사미니다제(AGA, 아스파르틸글리코사미뇨증용), 알파-L-이두로니다제(MPS I용), 이두로네이트 설파타제(MPS II용), 술파미나제(MPS IIIa), α-N-아세틸글루코사미니다제(NAGLU, MPS IIIB용), 헤파린 아세틸 CoA: α-글루코사미나이드 N-아세틸트랜스퍼라제(HGSNAT, MPS IIIC용), N-아세틸글루코사민 6-설파타제(GNS, MPS IIID용), N-글루코사민 3-O-설파타제(아릴설파타제 G 또는 ARSG, MPS IIIE), N-아세틸갈락토사민 6-설파타제(MPS IVA용), 베타-갈락토시다제(MPS IVB용), N-아세틸갈락토사민 4-설파타제(MPS VI용), 베타-글루쿠로니다제(MPS VI용), 인자 VIII(혈우병 A용), 인자 IX(혈우병 B용), 팔미토일 단백질 티오에스테라아제(PPT1, CLN1용), 트리펩티딜 펩티다아제(TPP1, CLN2용) 및 시스타티오닌 베타 합성효소(CBS) 결핍으로 구성된 군으로부터 선택된 효소에 대한 결핍인, 방법.
  96. 제85항에 있어서, 장애는 단일유전자 질환이고, 여기서 투여하는 것은 치료적 생성물을 인코딩하는 이식유전자를 포함하는 조작된 저면역원성 바이러스 입자를 질환을 치료하기에 유효한 양으로 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  97. 제85항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은:
    조작된 저면역원성 생물치료제를 투여한 후 8주째에 개체로부터 혈청을 채취하고 생물치료제-특이적 항체에 대해 혈청을 평가하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 생물치료제-특이적 항체의 역가는 상응하는 조작되지 않은 생물치료제에 의해 도출될 역가의 50%인, 방법.
  98. 제97항에 있어서, 생물치료제-특이적 항체의 역가는 상응하는 조작되지 않은 생물치료제에 의해 도출될 역가의 20%인, 방법.
  99. 제97항에 있어서, 생물치료제-특이적 항체의 역가는 상응하는 조작되지 않은 생물치료제에 의해 도출될 역가의 5%인, 방법.
  100. 제97항에 있어서, 생물치료제-특이적 항체는 검출될 수 없는, 방법.
  101. 비천연 발생 Siglec 리간드에 공유적으로 결합된 생물치료제를 포함하는 조작된 저면역원성 생물치료제로서, 상기 Siglec 리간드는 , , , 및 로 구성된 군으로부터 선택되는 비-천연 발생 시알산, 및
    , , 및 로 구성된 군으로부터 선택되는 링커를 포함하며,
    여기서 링커는 시알산을 생물치료제에 부착시키는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
  102. 제101항에 있어서, 비천연 발생 Siglec 리간드는 하기로 구성된 군으로부터 선택되는, 조작된 저면역원성 생물치료제:
    , , , , , , , , , , , 및 .
  103. 제101항 또는 제102항에 있어서, 비천연 발생 Siglec 리간드는 링커와 시알산 사이에 당류를 포함하지 않는, 조작된 저면역원성 생물치료제.
  104. 식 (I)의 조작된 저면역원성 생물치료제:
    [Xn-L]m-Y
    (I)
    여기서 X는 시알산기이고, L은 선택적 링커이고, Y는 생물치료제이고, n은 1 이상의 정수이고, m은 1 이상의 정수임.
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