CN116744944A - 低免疫原性生物治疗药物 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了低免疫原性生物治疗药物组合物，其在个体中抑制针对自身的免疫响应的发展。本公开还提供了包含此类低免疫原性生物治疗药物的药物组合物，用于制备此类低免疫原性生物治疗药物的方法，以及用于将此类低免疫原性生物治疗药物用作治疗药物和用于研究的方法。

Description

低免疫原性生物治疗药物
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年1月11日提交的美国临时申请第63/136,128号的权益，其公开内容通过引用以其整体并入本文。
技术领域
本发明涉及在患者中抑制针对自身的免疫响应的生物治疗药物。
背景技术
治疗性蛋白质和基因疗法是用于疾病治疗的新的和成功的药物形式。然而，患者对此类治疗药物的免疫响应经常导致药物活性的抑制、药物清除的加速、药物安全性的损害和药物功效的丧失。防止中和性和非中和性药物特异性抗体(“抗药物抗体”或“ADA”)的形成是生物治疗药物领域中尚未解决的关键问题。阻断ADA对生物治疗药物的响应将改善药物暴露，提高功效的持久性，降低ADA相关的毒性，并且使原本不可药物治疗的模式(例如，从头设计的药物、基于内源性蛋白质的药物)具有有利的药理学。本发明解决了这些问题。
发明内容
本公开提供了低免疫原性生物治疗药物组合物，其在个体中抑制针对自身的免疫响应的发展。本公开还提供了包含此类低免疫原性生物治疗药物的药物组合物，用于制备此类低免疫原性生物治疗药物的方法，以及用于将此类低免疫原性生物治疗药物用作治疗药物和用于研究的方法。
附图说明
图1描绘了具有抑制的抗药物抗体响应的CD22接合生物治疗药物的模型的一个方面：B细胞受体-Siglec配体共接合物(包含药物-Siglec配体缀合物)通过抑制性CD22受体向B细胞受体复合物的物理募集来抑制或沉默药物特异性B细胞活化。
图2描绘了具有抑制的抗药物抗体响应的CD22接合生物治疗药物的模型的另一方面：B细胞受体-Siglec配体共接合物(包含药物-Siglec配体缀合物)仅抑制、沉默或删除药物特异性B细胞，同时保留那些对药物没有特异性的B细胞克隆。
图3描绘了具有降低的免疫原性的Siglec-B细胞受体共接合生物制品的多种形式：形式1.Siglec配体修饰的蛋白质：非酶促或酶促缀合。位点特异性的或非位点特异性的。形式2.Siglec配体修饰的聚糖(细胞内或体外)：生物合成的、酶促聚糖修饰(例如，在蛋白质表达期间)。形式3.Siglec配体修饰的聚糖(体外)：表达后，体外酶促多糖修饰。形式4.蛋白质/肽融合体：CD22结合的结合结构域或肽通过框内融合或缀合被并入到生物制品中。
图4描绘了示例性的可缀合的CD22结合的Siglec配体-接头结构，突出了该结构的组分：Siglec配体结合部分、Siglec配体-近端接头结构、接头和反应性/可缀合的基团。
图5描绘了示例性的Siglec配体结构，集中于决定Siglec-2结合亲和力和物种特异性的元件。
图6描绘了示例性的Siglec配体结构，示出了在Siglec配体化合价上变化的结构。
图7描绘了示例性的Siglec配体结构，示出了在接头结构上变化的结构，其中接近基于唾液酸的部分的区域由基于PEG的结构或基于半乳糖的结构组成。
图8描绘了对于Siglec-2结合增强(顶部)或未增强(中间)的示例性的可缀合的接头结构，以及不结合Siglec-2的阴性对照接头结构(底部)。示出了增强的Siglec-配体接头结构(化合物编号26288，Siglec配体：甲基-α-9-N-(联苯基-4-羰基)-氨基-9-脱氧-N-乙醇酰神经氨酸)(顶部)，含有未增强的Siglec-2结合部分的Siglec配体-接头结构(化合物编号26614，Siglec配体：N-乙醇酰神经氨酸/Neu5Gc)(中间)，和基于PEG的非Siglec结合的可缀合的接头结构(化合物编号26530)(底部)。
图9A和9B描绘了阿达木单抗hIgG1-Siglec配体缀合物的示例性纯度和物理化学表征数据。阿达木单抗缀合物在所使用的Siglec-接头的结构和缀合后配体/接头与药物比率(“LDR”)方面不同。图9A-阿达木单抗缀合物的毛细管凝胶电泳数据。图9B-阿达木单抗IgG和阿达木单抗缀合物的分析尺寸排阻色谱法概况。
图10A和10B描绘了体外B细胞活化测定，其中用B细胞受体激动的抗IgD抗体或抗IgD-Siglec配体缀合物处理小鼠原代B细胞。在剂量滴定实验中，将抗IgD和抗IgD-Siglec配体缀合物的B细胞刺激活性与CD69上调的活化读数进行比较。通过为CD69阳性的细胞的百分比(图10A)或CD69平均荧光强度(MFI)(图10B)来评估不同处理组的CD69水平。测试的缀合物中的Siglec配体在接头结构(“PEG”或“Gal”)和化合价(“单价”或“二价”)方面不同，并且缀合物在配体/接头与药物比率(“LDR”)或每个药物分子中Siglec配体结构的平均数量方面也不同。
图11A和11B描绘了体外B细胞活化测定，其中用B细胞受体激动的抗IgD抗体或抗IgD-Siglec配体缀合物处理小鼠原代B细胞。抗IgD抗体-Siglec配体缀合物具有三价Siglec配体结构。通过CD69表达的上调来测量B细胞活化，如通过细胞术测量的。通过为CD69阳性的细胞的百分比(图11A)或CD69平均荧光强度(MFI)(图11B)来评估不同处理组的CD69水平。测试的缀合物中的Siglec配体在接头结构(“PEG”或“Gal”)上不同，并且缀合物在配体/接头与药物比率(“LDR”)或每个药物分子中Siglec配体结构的平均数量上也不同。
图12A和12B描绘了体外B细胞活化测定，其中用B细胞受体激动的抗IgD抗体或抗IgD-Siglec配体缀合物处理小鼠原代B细胞。在剂量滴定实验中，将抗IgD和抗IgD-Siglec配体缀合物的B细胞刺激活性与CD69上调的活化读数进行比较。通过为CD69阳性的细胞的百分比(图12A)或CD69平均荧光强度(MFI)(图12B)来评估不同处理组的CD69水平。测试的缀合物中的Siglec配体含有基于PEG的接头结构(“PEG”)，并且在化合价上不同(“单价”、“二价”和“三价”)。缀合物在配体/接头与药物比率(“LDR”)或每个药物分子的Siglec配体结构的平均数量方面也不同。
图13A和13B描绘了与亲代的未缀合的抗IgD抗体相比，Siglec配体-抗IgD抗体缀合物与小鼠原代B细胞结合的评估。通过荧光细胞术以与Alexa-647标记的抗IgD抗体的竞争测定形式来评估结合。图13A描绘了未标记的抗IgD-Siglec配体缀合物和未缀合的未标记的抗IgD抗体对荧光标记的抗IgD与IgD+B细胞结合的浓度依赖性抑制的剂量响应结果。示出了每种未标记的测试制品的结合IC50(以纳摩尔计)。图13B是结合测定系统的示意图。
图14描绘了体外B细胞活化测定，其中用B细胞受体激动的抗IgD抗体或抗IgD-Siglec配体缀合物处理小鼠原代B细胞，其中使用相同的测试制品处理来自野生型小鼠的B细胞。缀合物Siglec配体(“单价PEG-LDR 9”、“二价PEG-LDR 6”、“三价PEG-LDR 6”和“三价PEG-LDR 8”)增强了Siglec-2的结合。在剂量滴定实验中，将抗IgD和抗IgD-Siglec配体缀合物的B细胞刺激活性与CD69上调的活化读数进行比较。通过为CD69阳性的细胞的百分比来评估不同处理组的CD69水平。测试的缀合物中的Siglec配体含有基于PEG的接头结构(“PEG”)，并且在化合价上不同(“单价”、“二价”和“三价”)。缀合物在配体/接头与药物比率(“LDR”)或每个药物分子的Siglec配体结构的平均数量方面也不同。
图15描绘了与亲代的未缀合的抗IgD抗体相比，Siglec配体-抗IgD抗体缀合物与小鼠原代B细胞结合的评估。通过荧光细胞术以与Alexa-647标记的抗IgD抗体的竞争测定形式来评估结合。示出了未标记的抗IgD-Siglec配体缀合物和未缀合的、未标记的抗IgD抗体对荧光标记的抗IgD与IgD+B细胞结合的浓度依赖性抑制的剂量响应结果。示出了每种未标记的测试制品的结合IC50(以纳摩尔计)。测试制品与图15中的测试制品相同。
图16A和16B描绘了体外B细胞活化测定，其中用B细胞受体激动的抗IgD抗体或抗IgD-Siglec配体缀合物处理小鼠原代B细胞，其中对于Siglec-2结合，Siglec配体被增强(“BPC-Neu5Gc单价PEG-LDR 9”和“BPC-Neu5Gc二价PEG-LDR 6”)或未被增强(“Neu5Gc单价PEG-LDR 10”和“Neu5Gc二价PEG-LDR 7”)。在剂量滴定实验中，将抗IgD和抗IgD-Siglec配体缀合物的B细胞刺激活性与CD69上调的活化读数进行比较。通过为CD69阳性的细胞的百分比来评估不同处理组的CD69水平。示出了单价(图16A)和二价(图16B)Siglec配体缀合物的剂量响应曲线。缀合物在配体/接头与药物比率(“LDR”)或每个药物分子的Siglec配体结构的平均数量方面也不同。
图17A至17C描绘了体外原代小鼠B细胞活化测定，其测试CD22接合对Siglec配体-缀合物介导的B细胞受体活化的抑制的重要性。用B细胞受体激动的抗IgD抗体或各种抗IgD-Siglec配体缀合物处理小鼠原代B细胞，缀合物带有增强的Siglec接头(“BPC-Neu5Gc单价PEG-LDR 9”、“BPC-Neu5Gc二价PEG-LDR 6”、“BPC-Neu5Gc三价PEG-LDR 6”和“BPC-Neu5Gc三价PEG-LDR 8”)，或缺乏Siglec结合决定簇的asialo接头(“Asialo单价PEG-LDR7”、“Asialo二价PEG-LDR 8”和“Asialo三价PEG-LDR 7”)。在剂量滴定实验中，将抗IgD和抗IgD-Siglec配体缀合物的B细胞刺激活性与CD69上调的活化读数进行比较。通过为CD69阳性的细胞的百分比来评估不同处理组的CD69水平。测试的缀合物中的Siglec配体含有基于PEG的接头结构(“PEG”)，并且在化合价上不同(“单价”(图17A)、“二价”(图17B)和“三价”(图17C))。缀合物在配体/接头与药物比率(“LDR”)或每个药物分子的Siglec配体结构的平均数量方面也不同。
图18A至18C描绘了相对于亲代抗IgD抗体，与B细胞结合的Siglec配体-抗IgD抗体缀合物的评估。抗IgD-Siglec配体缀合物带有增强的Siglec接头(“BPC-Neu5Gc单价PEG-LDR 9”、“BPC-Neu5Gc二价PEG-LDR 6”、“BPC-Neu5Gc三价PEG-LDR 6”和“BPC-Neu5Gc三价PEG-LDR 8”)或缺乏Siglec结合决定簇的asialo接头(“Asialo单价PEG-LDR 7”、“Asialo二价PEG-LDR 8”和“Asialo三价PEG-LDR 7”)。通过荧光细胞术以与Alexa-647标记的抗IgD抗体的竞争测定形式来评估结合。示出了未标记的抗IgD-Siglec配体缀合物和未缀合的、未标记的抗IgD抗体对荧光标记的抗IgD与IgD+B细胞结合的浓度依赖性抑制的剂量响应结果。测试制品与用于图17的测试制品相同。测试的缀合物中的Siglec配体含有基于PEG的接头结构(“PEG”)，并且在化合价上不同(“单价”(图18A)、“二价”(图18B)和“三价”(图18C))。缀合物在配体/接头与药物比率(“LDR”)或每个药物分子的Siglec配体结构的平均数量方面也不同。
图19A和19B描绘了体外原代小鼠B细胞活化测定，其测试了顺式B细胞受体和CD22共接合用于抑制B细胞受体活化的重要性。图19A描绘了B细胞受体活化的模型，其中抗IgDBCR激动剂和Siglec-2接合部分存在于相同或不同的分子上。在剂量滴定实验中，将抗IgD、抗IgD-Siglec配体缀合物或2nM抗IgD和不同浓度的对照抗体-Siglec配体缀合物的混合物的B细胞刺激活性与CD69上调的活化读数进行比较。通过CD69平均荧光强度(MFI)评估不同处理组的CD69水平(图19B)。测试的缀合物中的Siglec配体含有基于PEG的接头结构(“PEG”)并带有二价Siglec配体结构。
图20描绘了在激动性抗IgD抗体和非激动性Siglec配体-抗IgD缀合物的混合物中测试BCR激动作用抑制的体外原代小鼠B细胞活化测定。在存在或不存在2nM抗IgD BCR激动剂的情况下滴定Siglec配体-抗IgD缀合物。在剂量滴定实验中，将抗IgD、抗IgD-Siglec配体缀合物或2nM抗IgD与不同浓度的抗IgD-Siglec配体缀合物的混合物的B细胞刺激活性与CD69上调的活化读数进行比较。通过CD69平均荧光强度(MFI)评估不同处理组的CD69水平。测试的抗IgD缀合物带有二价Siglec-2增强的配体(MPB-Neu5Ac)和基于PEG的接头，其中配体/接头与药物比率(“LDR”)为6。
图21A和21B描绘了使用人原代B细胞和B细胞受体激动的抗IgM抗体或具有相同抗IgM抗体的Siglec配体缀合物的体外B细胞活化测定。在剂量滴定实验中，将抗IgM和抗IgM-Siglec配体缀合物的B细胞刺激活性与CD69上调的活化读数进行比较。通过为CD69阳性的细胞的百分比来评估不同处理组的CD69水平。示出了使用基于半乳糖的接头(图21A)和基于PEG的接头(图21B)的缀合物的结果。所有缀合物都带有Siglec-2增强的MPB-Neu5Ac结构，具有不同的化合价和配体/接头与药物比率(“LDR”)，或每个药物分子中Siglec配体结构的平均数量。
图22A和22B描绘了使用人原代B细胞和B细胞受体激动的抗IgM抗体或具有相同抗IgM抗体的Siglec配体缀合物的体外B细胞活化测定。缀合物带有Siglec配体结构，其对于CD22结合是增强的(“BPC-Neu5Gc单价PEG-LDR5-αIgM”和“BPC-Neu5Gc二价PEG-LDR9-αIgM”)或者未增强的(“Neu5Gc单价PEG-LDR6-αIgM”和“Neu5Gc二价PEG-LDR6-αIgM”)。在剂量滴定实验中，将抗IgM和抗IgM-Siglec配体缀合物的B细胞刺激活性与CD69上调的活化读数进行比较。通过为CD69阳性的细胞的百分比来评估不同处理组的CD69水平。测试的缀合物中的Siglec配体含有基于PEG的接头结构(“PEG”)，并且在化合价上不同(“单价”(图22A)或“二价”(图22B))。
图23A和23B描绘了Siglec配体-抗IgM抗体缀合物以及亲本抗IgM与人B细胞结合的评估。对于CD22结合，抗IgM-Siglec配体是增强的(“BPC-Neu5Gc单价PEG-LDR5-αIgM”和“BPC-Neu5Gc二价PEG-LDR9-αIgM”)或者未增强的(“Neu5Gc单价PEG-LDR6-αIgM”和“Neu5Gc二价PEG-LDR6-αIgM”)。用Alexa-647标记的抗IgM抗体，通过荧光细胞术以竞争测定的形式来评估结合。示出了未标记的抗IgM-Siglec配体缀合物和未缀合的、未标记的抗IgM抗体对荧光标记的抗IgM与IgM+B细胞结合的浓度依赖性抑制的剂量响应结果。示出了每种未标记的测试制品的结合IC50(以纳摩尔计)。测试制品与图22的实验中使用的测试制品相同。
图24A至24C描绘了在小鼠中对阿达木单抗和Siglec配体-阿达木单抗缀合物的抗药物抗体响应的评估。缀合物带有基于BPC-Neu5Gc的Siglec配体-接头结构，其对于Siglec配体是单价的、二价的或三价的，带有含半乳糖的接头结构。小鼠接受单次4mg/kg静脉内剂量的阿达木单抗或阿达木单抗-Siglec配体缀合物。在第14天、第21天和第28天测量针对阿达木单抗/阿达木单抗缀合物的血清IgG水平。图24A、图24B和图241c分别示出了第14天、第21天和第28天的个体动物血清IgG滴度值(n＝5只小鼠)。
图25A至25C描绘了在小鼠中针对阿达木单抗和Siglec配体-阿达木单抗缀合物的抗药物抗体响应的评估。缀合物带有基于BPC-Neu5Gc的Siglec配体-接头结构，其对于Siglec配体是单价的、二价的或三价的，带有含PEG的接头结构。小鼠接受单次4mg/kg静脉内剂量的阿达木单抗或阿达木单抗-Siglec配体缀合物。在第14天、第21天和第28天测量针对阿达木单抗/阿达木单抗缀合物的血清IgG水平。图25A、图25B和图25C分别示出了第14天、第21天和第28天的个体动物血清IgG滴度值(n＝5只小鼠)。
图26A和26B描绘了在小鼠中阿达木单抗hIgG和Siglec配体-阿达木单抗hIgG1缀合物的血清药代动力学分析。缀合物带有基于BPC-Neu5Gc的Siglec配体-接头结构，其对于Siglec配体是单价的、二价的或三价的，带有含PEG的接头结构。测试制品与图25中使用的测试制品相同。在静脉内给药之后，通过抗人IgG Fc ELISA(图26A)和SPR(表面等离子体共振，图26B)来分析血清样本的测试制品浓度。
图27A至27G描绘了阿达木单抗hIgG和Siglec配体-阿达木单抗hIgG1缀合物的TNFα结合活性的体外表面等离子体共振(SPR)分析。图27A是SPR测定设置的示意图，其中TNFα分析物与蛋白A芯片固定的阿达木单抗或阿达木单抗-Siglec配体缀合物结合。改变TNFα浓度以评估浓度依赖性、结合动力学和亲和力。图27B示出了传感图缔合阶段结束时结合的浓度依赖性(RUmax)。图27C-G是阿达木单抗(图27C)、阿达木单抗BPC-Neu5Gc单价GAL LDR 4(图27D)、阿达木单抗BPC-Neu5Gc单价GAL LDR 7(图27E)、阿达木单抗BPC-Neu5Gc二价GALLDR 8.5(图27F)和阿达木单抗BPC-Neu5Gc三价GAL LDR 5(图27G)的单独传感图。
图28A和28B描绘了在小鼠中对1)阿达木单抗，2)Siglec配体-阿达木单抗缀合物(“BPC-Neu5Gc单价PEG LDR 10”)，和3)阴性对照非Siglec-2-结合接头缀合物(“阴性对照单价PEG LDR 7”、“阴性对照二价PEG LDR 7”，和“阴性对照三价PEG LDR 6”)的抗药物抗体响应的评估。小鼠接受单次4mg/kg静脉内剂量的阿达木单抗、阿达木单抗-Siglec配体缀合物或阿达木单抗-阴性对照接头缀合物。在第14天和第28天测量针对阿达木单抗/阿达木单抗缀合物的血清IgG水平。图28A和图28B分别示出了在第14天和第28天的个体动物血清IgG滴度值(n＝5只小鼠)。
图29描绘了在小鼠中对1)阿达木单抗，2)增强的Siglec配体-阿达木单抗缀合物(“BPC-Neu5Gc单价PEG LDR 7”)，和3)未增强的Siglec配体-阿达木单抗缀合物(“Neu5Gc单价PEG LDR 6”、“Neu5Gc二价PEG LDR 5”和“Neu5Gc三价PEG LDR 5”)的抗药物抗体响应的评估。小鼠接受单次4mg/kg静脉内剂量的阿达木单抗IgG或缀合物。在第28天测量针对阿达木单抗/阿达木单抗缀合物的血清IgG水平。示出了在第28天的个体动物血清IgG滴度值(n＝5只小鼠)。
图30A至30E描绘了在给药4mg/kg阿达木单抗、阿达木单抗-Siglec配体缀合物(阿达木单抗-BPC-Neu5Gc二价PEG LDR 10)或PBS媒介物(第0天)的不同组合，以及随后每周给药200μg鸡蛋清溶菌酶(HEL)的小鼠中IgG免疫响应的评估(第7天、第14天、第21天和第28天)。研究计划在图30A中示出。分别针对阿达木单抗/阿达木单抗-Siglec配体缀合物和HEL测量小鼠血清IgG滴度。示出了抗阿达木单抗/阿达木单抗缀合物(图30B)和HEL(图30D)的第28天血清IgG水平。示出了抗阿达木单抗/阿达木单抗缀合物(图30C)和HEL(图30E)的滴度。
图31A至31C描绘了在小鼠中对HEL和单价Siglec配体-HEL缀合物(“HEL-BPC-Neu5Gc单价PEG LDR 1.6”)的抗药物抗体响应的评估。研究计划在图31A中示出。小鼠每周接受一次(共4次)200μg静脉内剂量的HEL或HEL缀合物(第0天、第7天、第14天和第21天)。在第27天测量针对HEL/HEL缀合物的血清IgG水平。图31B示出了来自血清样本的IgG水平稀释系列。图31C示出了个体动物第27天的血清IgG滴度值(n＝5只小鼠)。
图32描绘了在小鼠中对重组天冬酰胺酶和天冬酰胺酶-Siglec配体缀合物(“天冬酰胺酶BPC-Neu5Gc单价PEG-LDR 10”和“天冬酰胺酶BPC-Neu5Gc三价PEG-LDR 3.5”)的抗药物抗体响应的评估。BALB/c(每组n＝5)每周给药(4次)15μg天冬酰胺酶或天冬酰胺酶缀合物。在第28天通过ELISA测定来测量抗天冬酰胺酶IgG滴度。示出了每个测试制品的滴度。
具体实施方式
提供了低免疫原性生物治疗药物组合物，其在个体中抑制对自身的免疫响应的发展。还提供了包含此类低免疫原性生物治疗药物的药物组合物，用于制备此类低免疫原性生物治疗药物的方法，以及用于将此类低免疫原性生物治疗药物用作治疗药物和用于研究的方法。此类低免疫原性生物治疗药物在治疗需要重复或长期施用生物治疗药物才能有效的疾病中具有特殊用途。通过阅读如下面更全面描述的组合物和方法的细节，本发明的这些和其他目的、优点和特征对本领域技术人员来说将变得显而易见。
在描述本发明的方法和组合物之前，应该理解本发明不限于所描述的特定方法或组合物，因为它们当然可以变化。还应当理解，本文所使用的术语仅出于描述具体实施例的目的，而不旨在是限制性的，因为本发明的范围仅受所附权利要求书限制。
在提供数值范围的情况下，应当理解，除非上下文另有明确规定，否则该范围的上限和下限之间的每个中间值，直到下限单位的十分之一，也被具体公开。在所陈述的范围内的任何所陈述的值或中间值与该陈述的范围内的任何其他所陈述的值或中间值之间的每个较小范围都包含在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包含或排除在该范围内，并且其中任一个极限、没有一个极限或两个极限包括在该较小范围内的每个范围也包括在本发明内，受所陈述的范围内的任何具体排除的极限的限制。在所陈述范围包含限制中的一个或两个的情况下，排除那些被包含在内的限制中的任一个或两个的范围也包含在本发明中。
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域中的普通技术人员通常所理解相同的含义。尽管在本发明的实践或测试中可以使用类似于或等同于本文所述的方法和材料的任何方法和材料，但是现在描述一些潜在的和优选的方法和材料。在此提及的所有出版物是通过引用结合在此，以结合所引用的这些出版物来公开和描述这些方法和/或材料。应当理解，在存在矛盾的程度上，本公开取代了所并入的出版物的任何公开内容。
如本领域技术人员在阅读本公开内容时将显而易见的，在不脱离本发明的范围或精神的情况下，本文描述和示出的每个单独的实施例具有离散的部件和特征，这些部件和特征可以容易地与其他若干个实施例中任一者的特征分离或组合。任何叙述的方法可以以叙述的事件的顺序或逻辑上可能的任何其他顺序来执行。
必须注意，除非上下文另外明确指示，否则如在本文和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”、“一种”和“所述”包含复数指代物。因此，例如，提及“细胞”包含多个此类细胞，并且提及“肽”包含提及一种或多种肽及其等同物，例如本领域技术人员已知的多肽等。
过渡术语“包括”是包含性的或开放式的，并且不排除额外的、未列举的元件或方法步骤。过渡短语“由……组成”不包括任何未指定的元件、步骤或成分。过渡短语“基本上由……组成”将范围定义为特定的元件、材料或步骤以及那些不实质上影响本发明的基本和新颖特征的元件、材料或步骤。
本文讨论的出版物仅仅是为了它们在本申请的提交日期之前的公开内容而提供。本文中的任何内容都不应解释为承认本发明由于在先发明而无权先于这种公开。另外，所提供的公开日期可能与实际公开日期不同，实际公开日期可能需要独立地确认。
组合物
本文公开了低免疫原性的工程改造的生物治疗药物、用于制备此类生物治疗药物的方法及其使用方法。如本文所使用的，“生物治疗药物”是指这样的组合物，组合物由糖、氨基酸、蛋白质、脂质或核酸或这些物质的复杂组合组成并且对个体具有治疗作用。生物治疗药物的非限制性实例包括蛋白质治疗药物，例如抗体治疗药物、融合蛋白治疗药物、酶治疗药物；病毒治疗药物；细胞治疗药物；和核酸治疗药物。“工程改造的”生物治疗药物意指相对于未经如此工程改造的生物治疗药物(即，亲代生物治疗药物，其在本文中也被称为未工程改造的生物治疗药物)，已经被设计和构建为包括一个或多个修饰的生物治疗药物。“低免疫原性”组合物意指当施用于个体时，相对于参考组合物(例如相应的非工程改造的组合物)，抑制个体中不需要的药物特异性免疫响应的组合物；例如，相对于参考(例如，非工程改造的生物治疗药物)将免疫响应降低50％或更多，在一些情况下降低60％、70％、80％或更多，例如85％、90％、95％或更多，在某些情况下降低98％、99％或100％，即，使得免疫响应不可检测，即，生物治疗药物是非免疫原性的。因此，本文公开了工程改造的生物治疗药物，其保留了药理学活性，同时包括一个或多个修饰，这些修饰使得该生物治疗药物与未修饰的生物治疗药物相比能够抑制已经施用该生物治疗药物的个体中的药物特异性免疫响应。在一些实施例中，免疫响应是体液免疫响应，即B细胞驱动的响应，例如IgG响应。
本文公开了一种工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其包括这样的生物治疗药物，该生物治疗药物已经被工程改造以相对于相应的未工程改造的生物治疗药物包括经修饰的唾液酸结合免疫球蛋白型凝集素(Siglec)配体概况，同时保持治疗活性。
“Siglec”意指主要在白细胞的表面上发现并结合靶标生物制品上的唾液酸的蛋白质家族的成员。“Siglec配体概况”意指与生物治疗药物共价结合的Siglec配体的量和/或位置。在许多情况下，修饰是与生物治疗药物共价结合的Siglec配体的量和/或位置的增加，其中这种增加使得该生物治疗药物相对于相应的未修饰的生物治疗药物在个体中的免疫原性更低。
存在14种不同的哺乳动物Siglec，它们在不同类型的白细胞上表达，并且可能对表达它们的细胞产生抑制或活化作用，这取决于它们是否包括抑制性基序或活化基序。Siglec对不同的唾液酸显示出不同的结合偏好，并且连接的类型和基础糖的类型也影响唾液酸的识别。(Varki,A.and Crocker,P.R.(2009)，“I型凝集素”，《糖生物学基础(InEssentials of Glycobiology)》(第2版)(Varki,A.等人编辑)，第459-474页，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Crocker,P.R.等人(2007)《自然免疫学评论(Nat.Rev.Immunol.)》7,255-266)。总之，这提供了一系列替代的Siglec配体，它们可以被部署以调节对生物治疗药物的免疫响应。特别感兴趣的是抑制对生物治疗药物的免疫响应，并且更具体地，抑制B细胞对生物治疗药物的响应。因此，在一些实施例中，Siglec配体是在B淋巴细胞上表达的Siglec的配体，例如Siglec-2(也被称为CD22)、Siglec-5(CD170)、Siglec-6、Siglec-9(CD329)或Siglec-10(Siglec-G)。在一些实施例中，Siglec是Siglec-2。在一些实施例中，Siglec是Siglec-5。在一些实施例中，Siglec是Siglec-6。在一些实施例中，Siglec是Siglec-9。在一些实施例中，Siglec是Siglec-10。在一些实施例中，低免疫原性生物治疗药物已经被工程改造以包括一个Siglec的唾液酸配体。在其他实施例中，低免疫原性生物治疗药物已经被工程改造以包括两个或更多个Siglec(例如3个Siglec或4个Siglec，在某些情况下，5个Siglec)的Siglec配体。在一些情况下，存在5、6、7、8、9、10、11、12、13或15个Siglec。
在一些情况下，工程改造的低免疫原性生物治疗药物具有式(I)：
[Xn-L]m-Y
(I)
其中X是唾液酸基团，L是任选的接头，Y是生物治疗药物，并且n为1或更大的整数，并且m为1或更大的整数。X和L基团的组合，即[Xn-L]，在本文中被统称为Siglec配体。
唾液酸基团X
X是唾液酸基团，其中术语“唾液酸”是指具有九碳主链的α-酮酸糖。因此，由于X是唾液酸基团，所以X包括唾液酸或其衍生物。唾液酸或其衍生物可以是天然存在的或非天然存在的。在一些情况下，X包括神经氨酸，它是唾液酸或其衍生物的一个实例。
在一些实施例中，唾液酸是天然存在的唾液酸。唾液酸家族包括大约50个天然存在的成员。其中最常见的是N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)、N-乙醇酰神经氨酸(Neu5Gc，通过添加单个氧原子(即羟基化)由Neu5Ac酶促产生)、2-酮基-3脱氧尤罗索尼克酸(Kdn)和神经氨酸(Neu)；其他的是本领域熟知的，如在Schauer(2000)《糖缀合物杂志(GlycoconjugateJ)》17:485-499中综述。因此，例如，当待靶向的Siglec是CD22时，Siglec配体可以是天然存在的CD22配体，即α2,6-连接的唾液酸，如Neu5Acα2-6Galβ-4GlcNAc-6S；当Siglec是Siglec-5时，Siglec配体可以是天然存在的Siglec-5配体，即Neu5Acα8-8Neu5Ac和Neu5Acα2-6GalNAc；当Siglec是Siglec-6时，Siglec配体可以是天然存在的Siglec-6配体，即Neu5Acα2-6GalNAc；当Siglec是Siglec-9时，Siglec配体可以是天然存在的Siglec-9配体，即Neu5Acα2-3Galβ-4GlcNAc-6Sα-3岩藻糖；或者当Siglec是Siglec-10/G时，Siglec配体可以是天然存在的Siglec-10配体，即α2,6-连接的唾液酸或α2,3-连接的唾液酸，如Neu5Acα2-6Galβ-4GlcNAc(O'Reilly,M.K.和Paulson,J.C.(2009)《药理学趋势(TrendsPharmacol.Sci.)》30,240-248)。在一些实施例中，低免疫原性生物治疗药物已经被工程改造以包括两个或多个Siglec(例如，3个Siglec或4个Siglec，在某些情况下5个Siglec)的唾液酸配体。在一些情况下，存在5、6、7、8、9、10、11、12、13或15个Siglec。
在一些实施例中，唾液酸是非天然存在的，即合成的唾液酸。在本领域也是已知的并且在本文中称为“唾液酸模拟物”或“SAM”的“合成唾液酸”是指在自然界中不存在的唾液酸，即包括非天然存在的九碳主链的α-酮酸糖衍生物。与包括天然唾液酸的Siglec配体(其对于Siglec具有弱的单价结合亲和力(0.1-3mM))相比，包括SAM的Siglec配体可以具有在纳摩尔范围内的结合亲和力(Crocker,P.R.等人(2007)《自然免疫学评论》7,255-266；Prescher,H.等人(2014)《ACS化学生物学(ACS Chem.Biol.)》9,1444-1450)。在主题组合物中找到用途的SAM包含其中在从糖苷配基(C-2)到主链的其余部分(C-3到C-9)范围内的天然唾液酸的一个或多个位置已经被修饰以改善Siglec结合的那些。例如，修饰C-9-NH2(9-NH2-Neu5Ac/Me)和C-5-FAc(Neu5FAc/Me)由于增加了SAM和Siglec-2之间的氢键和亲脂性相互作用而改善了Siglec-2结合，并且并入亲脂性基团自此已经被用于合理地设计对Siglec-2具有增加的结合亲和力的额外SAM(van Rossenberg,S.M.W.等人(2001)《生物化学杂志(J Biol.Chem.)》276,12967-12973；Kelm,S.等人(2002)《实验医学杂志(J.Exp.Med.)》195,1207-1213；Zaccai,N.R.等人(2003)《结构(Structure)》11,557-567)。在本申请中找到用途的SAM的其他非限制性实例包含9-N-联苯羧基-NeuAcα2-Galβ1-4GlcNAc(6′-BPCNeuAc)、NeuAcα2-6Galβ1-4GlcNAc、NeuAcα2-6Galβ1-4(6-磺基)GlcNAc；在以下中公开的那些SAM：Bull等人(2016)“针对唾液酸Siglec轴的唾液酸模拟物(SialicAcid Mimetics to Target the Sialic Acid-Siglec Axis)”，《生物化学趋势(TrendsBiochem Sci.)》41(6):519-531和Prescher,H.等人(2014)“发现多种修饰的唾液苷作为对B细胞具有纳摩尔活性的人CD22/Siglec-2配体(Discovery of multifold modifiedsialosides as human CD22/Siglec-2 ligands with nanomolar activity on B-cells.)”，《ACS化学生物学》9,1444-1450；以及在美国专利第8,357,671号、美国专利第9,522,183号、美国专利第9,981,023号中公开的那些SAM，这些文献的全部公开内容通过引用并入本文。在某些实施例中，SAM为下表1中提供的SAM。
表1.
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如以上式(I)中所述，n为1或更大的整数，例如1至20或1至15或1至10或1至5的整数。在一些情况下，n为1、2、3、4或5。在一些情况下，n为1。在一些情况下，n为2。在一些情况下，n为3。在一些情况下，n为4。在一些情况下，n为5。
如果存在多于一个的X，即如果n大于1，则X基团可以彼此相同或不同。如果存在L，则每个X直接共价键合到L上，并且L直接共价键合到Y上。如果不存在L，则每个X直接共价键合到Y上。在一些情况下，n为1。在一些情况下，n为2或更大的整数，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10。
如上所述，m为1或更大的整数。在一些情况下，m为2或更大、3或更大、5或更大或10或更大。在一些情况下，m在1至20，例如2至10的范围内。
接头L
L是任选的接头。因此，在一些情况下，工程改造的低免疫原性生物治疗药物具有接头，并且工程改造的低免疫原性生物治疗药物可以由式[Xn-L]m-Y描述。在其他情况下，工程改造的低免疫原性生物治疗药物不具有接头，并且工程改造的生物治疗药物可以由式[Xn]m-Y描述。
工程改造的低免疫原性生物治疗药物的实施例可以用于证明[Xn-L]m-Y的可能构型。如上所述，X是包括唾液酸或其衍生物的唾液酸基团。在下面所示的化合物中，存在单个神经氨酸基团，对应于单个X基团。因此，在下面的实施例中，n为1。神经氨酸左边显示的具有式(苯基)-C(O)-亚苯基-的基团可以被认为是X基团的一部分。虽然在化合物中没有示出生物治疗药物Y，但-C(O)-O-C6F5基团可以经历与生物治疗药物Y形成共价键的化学反应。
在下面所示的实施例中，示出了三个神经氨酸基团，表明存在三个X基团，因此n为3。此外，三个X基团通过包括赖氨酸残基的衍生物的支化基团彼此共价键合。该支化基团是接头L的一部分。换句话说，该实施例包含任选的接头L，其中L是将三个X基团彼此共价连接的支化基团。接头L也将X基团共价连接到-C(O)-O-C6F5基团上(该基团可以经历与生物治疗药物Y形成共价键的化学反应)。因此，接头L也将X基团共价连接到生物治疗药物Y。
如上所述，X和L基团的组合被统称为Siglec配体。换句话说，[Xn-L]是Siglec配体。
在一些实施例中，每个X的每个}唾液酸基团通过不包含糖基团的原子链共价连接至生物治疗药物Y。例如，每个X基团包含单个唾液酸基团，但不包含任何其他糖基团。此外，在一些实施例中，如果存在L，则L将每个X直接共价连接到Y，并且L不包括糖基团。如本文使用的术语“糖”是指单糖和二糖。因此，即使L包含三糖，这种L也不在此类实施例的范围内，因为三糖包含二糖单元和单糖单元。换句话说，对于每个X，[Xn-L]中存在的唯一糖基团是单个唾液酸基团。没有唾液酸基团彼此直接共价键合。
在一些实施例中，每个X的每个唾液酸基团通过不包含含氧的杂环基团的原子链共价连接至生物治疗药物Y。值得注意的是，单糖如葡萄糖和半乳糖是在环中含有氧原子的杂环基团。在一些实施例中，每个X的每个唾液酸基团通过由一个或多个化学部分组成的原子链共价连接至生物治疗药物Y，化学部分选自由以下组成的组：烷基、烯基、炔基、聚乙二醇、芳基、杂芳基、含硫原子的杂环、含氮原子的杂环、氨基酸残基、氨基、酰基、卤素、羟基、羧基、硫氧基及其取代的类似物。
在一些实施例中，如果存在，接头L由一个或多个化学部分组成，化学部分选自由以下组成的组：烷基、烯基、炔基、聚乙二醇、芳基、杂芳基、含硫原子的杂环、含氮原子的杂环、氨基酸残基、氨基、酰基、卤素、羟基、羧基、硫氧基及其取代的类似物。此外，唾液酸和L或Y之间的X的区段由一个或多个化学部分组成，化学部分选自由以下组成的组：烷基、烯基、炔基、聚乙二醇、芳基、杂芳基、含硫原子的杂环、含氮原子的杂环、氨基酸残基、氨基、酰基、卤素、羟基、羧基、硫氧基及其取代的类似物。
在其中存在L的一些情况下，L是分支的接头。换句话说，L直接将生物治疗药物Y共价连接到两个或更多个X基团上。在一些情况下，L的分支位置包含氨基酸残基或其衍生物，例如赖氨酸或其衍生物。例如，L的分支位置可以具有下面所示的式，其中用星号(*)标记的每个位置是朝向X基团或Y基团的位点。
在一些情况下，L的分支位置不包括芳基基团或杂芳基基团。在一些情况下，L的分支位置包括烷基基团、酰胺基团、氨基酸残基基团或其组合。
在一些实施例中，接头L包括聚乙二醇基团、三唑基团或其组合。在一些情况下，唾液酸基团和L或Y之间的X的区段包括聚乙二醇基团、三唑基团或其组合。在一些情况下，三唑基团是X基团和L基团之间共价连接的一部分。
在一些实施例中，接头L可以包含一个或多个接头亚基(LS)，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个，或者甚至更多个接头亚基(LS)。例如，接头的一些实施例可以包含1至10个由式(II)描述的接头亚基(LS)：
-(LS1)a-(LS2)b-(LS3)c-(LS4)d-(LS5)e-(LS6)f-(LS7)g-(LS8)h-(LS9)i-(LS10)j- (II)
其中LS1、LS2、LS3、LS4、LS5、LS6、LS7、LS8、LS9和LS10各自独立地是接头亚基，并且a、b、c、d、e、f、g、h、i和j各自独立地为0或1。在一些实施例中，a至j的总和为1(例如，a为1，并且b至j各自为0)。在这些实施例中，接头亚基LS1在一端与Y连接，并且在另一端与X连接。在一些实施例中，a至j的总和为2(例如，a和b各自为1，并且c至j各自为0)。在这些实施例中，接头亚基LS1连接到Y上，并且接头亚基LS2连接到X上。在一些实施例中，a至j的总和为3(例如，a至c各自为1，并且d至j各自为0)。在这些实施例中，接头亚基LS1连接到Y上，并且接头亚基LS3连接到X上。在一些实施例中，a至j的总和为4(例如，a至d各自为1，并且e至j各自为0)。在这些实施例中，接头亚基LS1连接到Y上，接头亚基LS4连接到X上。在一些实施例中，a至j的总和为5(例如，a至e各自为1，并且f至j各自为0)。在这些实施例中，接头亚基LS1连接到Y上，并且接头亚基LS5连接到X上。在一些实施例中，a至j的总和为6(例如，a至f各自为1，并且g至j各自为0)。在这些实施例中，接头亚基LS1连接到Y上，并且接头亚基LS6连接到X上。在一些实施例中，a至j的总和为7(例如，a至g各自为1，并且h至j各自为0)。在这些实施例中，接头亚基LS1连接到Y上，并且接头亚基LS7连接到X上。在一些实施例中，a至j的总和为8(例如，a至h各自为1，并且i和j各自为0)。在这些实施例中，接头亚基LS1连接到Y，并且接头亚基LS9连接到X上。在一些实施例中，a至j的总和为9(例如，a至i各自为1，并且j为0)。在这些实施例中，接头亚基LS1连接到Y上，并且接头亚基LS9连接到X上。在一些实施例中，a至j的总和为10(例如，a至j各自为1)。在这些实施例中，接头亚基LS1连接到Y上，并且接头亚基LS10连接到X上。
任何便利官能团都可以用于接头中的每个接头亚基(LS)。在一些实施例中，接头亚基(LS)可以包含选自但不限于以下的基团：烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、烷氧基、取代的烷氧基、氨基、取代的氨基、羧基、羧基酯、酰基氨基、烷基酰胺、取代的烷基酰胺、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、环烷基、取代的环烷基、杂环基和取代的杂环基。
在一些实施例中，接头亚基包含独立地选自共价键、(C1-C12)烷基、取代的(C1-C12)烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、环烷基、取代的环烷基、杂环基、取代的杂环基、(PEG)n和(AA)p的官能团，其中每个n独立地是1至50的整数，并且每个p独立地是1至20的整数。如本文所使用的，“PEG”是指聚乙二醇。
如本文所使用的，“AA”是指氨基酸残基。氨基酸残基包含通常在天然存在的蛋白质中发现的氨基酸(例如，Ala或A、Cys或C、Asp或D、Glu或E、Phe或F、Gly或G、His或H、Ile或I、Lys或K、Leu或L、Met或M、Asn或N、Pro或P、Gln或Q、Arg或R、Ser或S、Thr或T、Val或V、Trp或W、Tyr或Y)。在一些实施例中，在本文所述的接头和接头亚基中使用的氨基酸残基还包含氨基酸类似物和氨基酸衍生物，它们是具有修饰的侧链或主链的天然氨基酸。氨基酸类似物还包含与天然存在的D-形式以及L-形式的氨基酸类似物具有相同立体化学的氨基酸类似物。在一些情况下，氨基酸类似物共享一个或多个天然氨基酸的主链结构和/或侧链结构，不同之处在于分子中的一个或多个修饰的基团。这种修饰可以包含但不限于用原子(如N)取代相关原子(如S)，添加基团(如甲基或羟基等)或原子(如Cl或Br等)，基团的缺失，共价键的取代(单键代替双键等)，或者将另一个基团连接到侧链或主链，或者它们的组合。例如，氨基酸类似物可以包含α-羟基酸和α-氨基酸等。在一些情况下，氨基酸类似物或氨基酸衍生物可以包含通过任选的接头连接到氨基酸类似物或氨基酸衍生物的侧链或主链的另一个基团，例如另一个唾液酸部分(X)。
在一些实施例中，接头亚基包含独立地选自(C1-C12)烷基或取代的(C1-C12)烷基的官能团。在一些实施例中，(C1-C12)烷基是直链或支链烷基基团，其包含1至12个碳原子，例如1至10个碳原子，或1至8个碳原子，或1至6个碳原子，或1至5个碳原子，或1至4个碳原子，或1至3个碳原子。在一些情况下，(C1-C12)烷基可以是烷基，例如C1-C12烷基，或C1-C10烷基，或C1-C6烷基，或C1-C3烷基。在一些情况下，(C1-C12)烷基是C2烷基。例如，(C1-C12)烷基可以是亚烷基或取代的亚烷基，例如C1-C12亚烷基，或C1-C10亚烷基，或C1-C6亚烷基，或C1-C3亚烷基。在一些情况下，(C1-C12)烷基是C1亚烷基(例如，CH2)。在一些情况下，(C1-C12)烷基是C2亚烷基(例如，CH2CH2)。
在一些实施例中，取代的(C1-C12)烷基是直链或支链取代的烷基基团，其包含1至12个碳原子，例如1至10个碳原子，或1至8个碳原子，或1至6个碳原子，或1至5个碳原子，或1至4个碳原子，或1至3个碳原子。在一些情况下，取代的(C1-C12)烷基可以是取代的烷基，例如取代的C1-C12烷基，或取代的C1-C10烷基，或取代的C1-C6烷基，或取代的C1-C3烷基。在一些情况下，取代的(C1-C12)烷基是取代的C2烷基。例如，取代的(C1-C12)烷基可以是取代的亚烷基，例如取代的C1-C12亚烷基，或取代的C1-C10亚烷基，或取代的C1-C6亚烷基，或取代的C1-C3亚烷基。在一些情况下，取代的(C1-C12)烷基是取代的C1亚烷基。在一些情况下，取代的(C1-C12)烷基是取代的C2亚烷基。
在一些实施例中，接头亚基包含独立地选自芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、环烷基、取代的环烷基、杂环基和取代的杂环基的官能团。
在一些情况下，接头亚基包含独立地选自芳基或取代的芳基的官能团。在一些情况下，接头亚基包含芳基。例如，芳基可以是苯基。在一些情况下，接头亚基包含取代的芳基。在一些情况下，取代的芳基是取代的苯基。取代的芳基可以被一个或多个取代基取代，取代基选自(C1-C12)烷基、取代的(C1-C12)烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、环烷基、取代的环烷基、杂环基和取代的杂环基。
在一些情况下，接头亚基包含独立地选自杂芳基或取代的杂芳基的官能团。在一些情况下，接头亚基包含杂芳基。在一些情况下，接头亚基包含取代的杂芳基。取代的杂芳基可以被一个或多个取代基取代，取代基选自(C1-C12)烷基、取代的(C1-C12)烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、环烷基、取代的环烷基、杂环基和取代的杂环基。
在一些情况下，接头亚基包含独立地选自环烷基或取代的环烷基的官能团。在一些情况下，接头亚基包含环烷基。在一些情况下，接头亚基包含取代的环烷基。取代的环烷基可以被一个或多个取代基取代，取代基选自(C1-C12)烷基、取代的(C1-C12)烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、环烷基、取代的环烷基、杂环基和取代的杂环基。
在一些情况下，接头亚基包含独立地选自杂环基或取代的杂环基的官能团。在一些情况下，接头亚基包含杂环烷基。例如，接头亚基可以包含三唑(例如，1,2,3-三唑)。在一些情况下，接头亚基包含取代的杂环烷基。取代的杂环基可以被一个或多个取代基取代，取代基选自(C1-C12)烷基、取代的(C1-C12烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、环烷基、取代的环烷基、杂环基和取代的杂环基。
在一些实施例中，接头不包含天然糖。
在一些实施例中，接头(L)包含与接头中的一个或多个接头亚基(LS)相邻或在其之间的一个或多个系链基团。系链基团可以促进两个接头亚基之间、接头亚基和用于缀合至感兴趣的部分(Y)的反应性末端之间或接头亚基和唾液酸部分(X)之间的连接。系链基团可以包含促进这些连接的便利官能团，例如但不限于氨基、羰基、酰胺基、氧羰基、羧基、硫醚、磺酰基、亚砜、磺酰基氨基、氨基磺酰基、硫代、氧基、磷代、磷酰胺、硫代磷酰胺等。在一些实施例中，系链基团各自独立地选自共价键、-CO-、-NR15-、-NR15(CH2)q-、-CONR15-、-NR15CO-、-C(O)O-、-OC(O)-、-O-、-S-、-S(O)-、-SO2-、-SO2NR15-、-NR15SO2-和-P(O)OH-，其中q为1至6的整数。在一些实施例中，q为1至6的整数(例如，1、2、3、4、5或6)。在一些实施例中，q为1。在一些实施例中，q为2。在一些实施例中，q为3。在一些实施例中，q为4。在一些实施例中，q为5。在一些实施例中，q为6。
在一些实施例中，每个R15独立地选自氢、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、烷氧基、取代的烷氧基、氨基、取代的氨基、羧基、羧基酯、酰基、酰氧基、酰基氨基、氨基酰基、烷基酰胺、取代的烷基酰胺、磺酰基、硫代烷氧基、取代的硫代烷氧基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、环烷基、取代的环烷基、杂环基和取代的杂环基。
在一些实施例中，R15为氢。在一些实施例中，每个R15为氢。在一些实施例中，R15为烷基或取代的烷基，例如C1-6烷基或C1-6取代的烷基，或C1-4烷基或C1-4取代的烷基，或C1-3烷基或C1-3取代的烷基。在一些实施例中，R15为烯基或取代的烯基，例如C2-6烯基或C2-6取代的烯基，或C2-4烯基或C2-4取代的烯基，或C2-3烯基或C2-3取代的烯基。在一些实施例中，R15为炔基或取代的炔基。在一些实施例中，R15为烷氧基或取代的烷氧基。在一些实施例中，R15为氨基或取代的氨基。在一些实施例中，R15为羧基或羧基酯。在一些实施例中，R15为酰基或酰氧基。在一些实施例中，R15为酰基氨基或氨基酰基。在一些实施例中，R15为烷基酰胺或取代的烷基酰胺。在一些实施例中，R15为磺酰基。在一些实施例中，R15为硫代烷氧基或取代的硫代烷氧基。在一些实施例中，R15为芳基或取代芳基，如C5-8芳基或C5-8取代的芳基，如C5芳基或C5取代的芳基，或C6芳基或C6取代的芳基。在一些实施例中，R15为杂芳基或取代的杂芳基，如C5-8杂芳基或C5-8取代的杂芳基，如C5杂芳基或C5取代的杂芳基，或C6杂芳基或C6取代的杂芳基。在一些实施例中，R15为环烷基或取代的环烷基，如C3-8环烷基或C3-8取代的环烷基，如C3-6环烷基或C3-6取代的环烷基，或C3-5环烷基或C3-5取代的环烷基。在一些实施例中，R15为杂环基或取代的杂环基，如C3-8杂环基或C3-8取代的杂环基，如C3-6杂环基或C3-6取代的杂环基，或C3-5杂环基或C3-5取代的杂环基。
在一些实施例中，接头亚基(LS)可以包含聚合物。例如，聚合物可以包含聚亚烷基二醇及其衍生物，包含聚乙二醇、甲氧基聚乙二醇、聚乙二醇均聚物、聚丙二醇均聚物、乙二醇与丙二醇的共聚物(例如，其中均聚物和共聚物未被取代或在一端被烷基基团取代)、聚乙烯醇、聚乙烯乙基醚、聚乙烯吡咯烷酮、它们的组合等。在一些实施例中，聚合物是聚亚烷基二醇。在一些实施例中，聚合物是聚乙二醇(PEG)。
在一些情况下，接头不是分支的并且将一个X基团连接到Y基团，因此可以被称为单价的。在一些情况下，接头是二价的分支接头并且将两个X基团连接到Y基团。在某些情况下，接头是三价的分支接头并且将三个X基团连接到Y基团。在一些情况下，接头是更高多价的分支接头并且将多个X基团连接到Y基团。在一些情况下，接头具有长度为500个原子或更少(例如400个原子或更少、300个原子或更少、200个原子或更少、100个原子或更少、80个原子或更少、60个原子或更少、50个原子或更少、40个原子或更少、30个原子或更少或者甚至20个原子或更少)的直链或支链主链，例如如在两个或更多个部分之间测量的。连接部分可以是连接两个基团的共价键或长度为1至500个原子(例如长度为约1、2、3、4、5、6、8、10、12、14、16、18、20、30、40、50、100、150、200、300、400或500个碳原子)的直链或支链，其中接头可以是直链的、支链的、环状的或单个原子。在某些情况下，接头主链的一个、两个、三个、四个、五个或更多个、十个或更多个或者甚至更多个碳原子可以任选地被杂原子(例如，硫、氮或氧杂原子)取代。在某些情况下，当接头包含PEG基团时，接头主链的该链段的每第三个原子被氧取代。主链原子之间的键可以是饱和的或不饱和的，通常在接头主链中不超过一个、两个或三个不饱和键。接头可以包含一个或多个取代基基团，例如烷基、芳基或烯基基团。接头可以包含但不限于以下中的一种或多种：低聚(乙二醇)、醚、硫醚、二硫化物、酰胺、碳酸酯、氨基甲酸酯、叔胺、可以是直链或支链的烷基，例如甲基、乙基、正丙基、1-甲基乙基(异丙基)、正丁基、正戊基、1,1-二甲基乙基(叔丁基)等。接头主链可以包含环状基团，例如芳基、杂环、环烷基基团或杂环基团，其中环状基团的2个或更多个原子(例如，2、3或4个原子)包含在主链中。
在一些实施例中，接头亚基(LS)可以是分支的亚基。分支的亚基可以是直接或通过用于每个唾液酸部分的相应的接头连接到两个或更多个唾液酸部分的接头亚基。例如，分支的亚基可以连接到两个唾液酸部分。在一些实施例中，分支的亚基包含氨基酸(AA)。例如，分支的亚基可以包含氨基酸，其中氨基酸的主链形成连接到第一唾液酸部分的接头的一部分，并且其中氨基酸的侧链直接或通过分支的接头(即“分支接头”)与第二唾液酸部分缀合。例如，在一些实施例中，分支的亚基包含赖氨酸，其中赖氨酸的主链形成连接到第一唾液酸部分的接头的一部分，并且其中赖氨酸的侧链直接或通过分支接头与第二唾液酸部分缀合。在一些实施例中，第二唾液酸部分通过连接在赖氨酸侧链的末端胺处而与赖氨酸缀合。在一些实施例中，分支接头是如上式(II)所述的接头。
根据本公开的接头的实例包含但不限于以下：
LS1为PEG(例如，PEG4)；LS2为杂环基(例如，1,2,3-三唑)；LS3为PEG(例如，PEG2)；并且d至j各自为0；
LS1为PEG(例如，PEG4)；LS2为分支的亚基(例如，赖氨酸)；LS3为烷基(例如，C3烷基)；LS4为PEG(例如，PEG2)；LS5为杂环基(例如，1,2,3-三唑)；LS6为PEG(例如，PEG2)；并且g至j各自为0；并且其中LS2分支的亚基连接到如下所述的分支接头：LS1为PEG(例如，PEG2)；LS2为杂环基(例如，1,2,3-三唑)；LS3为PEG(例如，PEG2)；并且d至j各自为0；
LS1为PEG(例如，PEG4)；LS2为杂环基(例如，1,2,3-三唑)；LS3为烷基(例如，C2烷基)；并且d至j各自为0；
LS1为PEG(例如，PEG4)；LS2为分支的亚基(例如，赖氨酸)；LS3为烷基(例如，C3烷基)；LS4为PEG(例如，PEG2)；LS5为杂环基(例如，1,2,3-三唑)；LS6为烷基(例如，C2烷基)；并且g至j各自为0；并且其中LS2分支的亚基连接到如下所述的分支接头：LS1为PEG(例如，PEG2)；LS2为杂环基(例如，1,2,3-三唑)；LS3为烷基(例如，C2烷基)；并且d至j各自为0；
LS1为PEG(例如，PEG4)；LS2为分支的亚基(例如，赖氨酸)；LS3为分支的亚基(例如，赖氨酸)；LS4为烷基(例如，C3烷基)；LS5为PEG(例如，PEG2)；LS6为杂环基(例如，1,2,3-三唑)；LS7为烷基(例如，C2烷基)；并且h至j各自为0；其中LS2分支的亚基连接到如下所述的分支接头：LS1为PEG(例如，PEG2)；LS2为杂环基(例如，1,2,3-三唑)；LS3为烷基(例如，C2烷基)；并且d至j各自为0；并且其中LS3分支的亚基连接到如下所述的分支接头：LS1为PEG(例如，PEG2)；LS2为杂环基(例如，1,2,3-三唑)；LS3为烷基(例如，C2烷基)；并且d至j各自为0；
LS1为PEG(例如，PEG4)；LS2为分支的亚基(例如，赖氨酸)；LS3为分支的亚基(例如，赖氨酸)；LS4为烷基(例如，C3烷基)；LS5为PEG(例如，PEG2)；LS6为杂环基(例如，1,2,3-三唑)；LS7为PEG(例如，PEG2)；并且h至j各自为0；其中LS2分支的亚基连接到如下所述的分支接头：LS1为PEG(例如，PEG2)；LS2为杂环基(例如，1,2,3-三唑)；LS3为PEG(例如，PEG2)；并且d至j各自为0；并且其中LS3分支的亚基连接到如下所述的分支接头：LS1为PEG(例如，PEG2)；LS2为杂环基(例如，1,2,3-三唑)；LS3为PEG(例如，PEG2)；并且d至j各自为0；
LS1为分支的亚基(例如，赖氨酸)；LS2为分支的亚基(例如，赖氨酸)；LS3为烷基(例如，C3烷基)；LS4为杂环基(例如，1,2,3-三唑)；LS5为PEG(例如，PEG2)；并且f至j各自为0；其中LS1分支的亚基连接到如下所述的分支接头：LS1为杂环基(例如，1,2,3-三唑)；LS2为PEG(例如，PEG2)；并且c至j各自为0；并且其中LS2分支的亚基连接到如下所述的分支接头：LS1为杂环基(例如，1,2,3-三唑)；LS2为PEG(例如，PEG2)；并且c至j各自为0；
LS1为PEG(例如，PEG4)；LS2为分支的亚基(例如，赖氨酸)；LS3为分支的亚基(例如，赖氨酸)；LS4为烷基(例如，C3烷基)；LS5为杂环基(例如，1,2,3-三唑)；LS6为PEG(例如，PEG2)；并且g至j各自为0；其中LS2分支的亚基连接到如下所述的分支接头：LS1为杂环基(例如，1,2,3-三唑)；LS2为PEG(例如，PEG2)；并且c至j各自为0；并且其中LS3分支的亚基连接到如下所述的分支接头：LS1为杂环基(例如，1,2,3-三唑)；LS2为PEG(例如，PEG2)；并且c至j各自为0；并且
LS1为PEG(例如，PEG4)；LS2为分支的亚基(例如，赖氨酸)；LS3为烷基(例如，C3烷基)；LS4为杂环基(例如，1,2,3-三唑)；LS5为PEG(例如，PEG2)；并且f至j各自为0；并且其中LS2分支的亚基连接到如下所述的分支接头：LS1为杂环基(例如，1,2,3-三唑)；LS3为PEG(例如，PEG2)；并且c至j各自为0。
上述接头可以包含一个或多个系链基团，以促进两个接头亚基之间、接头亚基和用于缀合至感兴趣的部分(Y)的反应性末端之间或接头亚基和唾液酸部分(X)之间的连接。
Siglec配体[Xn-L]m
在式[Xn-L]m-Y中，[Xn-L]表示Siglec配体，并且m表示1-25的整数。设想一个或多个Siglec配体，例如2、3、4或5个或更多个Siglec配体，在一些情况下，6、7、8、9或10个或更多个Siglec配体，在一些此类情况下，11、12、13、14、15个或更多个Siglec配体，在一些情况下，16、17、18、19、20个或更多个Siglec配体，有时21、22、23、24或25个Siglec配体，可以与生物治疗药物缀合，附加到生物治疗药物的相同或不同氨基酸上。Siglec配体可以是天然存在的，即包括天然存在的唾液酸和天然存在的聚糖的部分，其中唾液酸和聚糖通常在自然界中发现相互缔合以形成Siglec配体。Siglec配体可以是非天然存在的，例如包括天然存在的唾液酸和接头的部分、包括非天然存在的唾液酸和作为Siglec配体的一部分在自然界中发现的聚糖的部分、包括非天然存在的唾液酸和接头的部分、包括对Siglec具有亲和力的肽的部分等。
生物治疗药物Y
在式[Xn-L]m-Y中，Y是生物治疗药物。Y本身被称为未工程改造的生物治疗药物，该术语可与术语亲本生物治疗药物互换使用。然而，作为[Xn-L]m-Y的元件的组合被称为工程改造的低免疫原性生物治疗药物。Y本身具有治疗活性。[Xn-L]不介导Y的治疗活性。换句话说，Y的治疗活性与[Xn-L]的存在或不存在无关。
示例性的生物治疗药物Y基团包含抗体、酶、病毒颗粒、纳米颗粒、多肽和核酸。
任何蛋白质或核酸生物治疗药物可以用作根据本公开被工程改造成为低免疫原性生物治疗药物的生物治疗药物，包含例如蛋白质，例如抗体、融合蛋白、酶、病毒颗粒、DNA分子或RNA分子。生物治疗药物可以是天然存在的，例如作为治疗药物递送给患者的天然存在的蛋白质、天然存在的衣壳等。生物治疗药物可以是工程改造的蛋白质，例如抗体治疗药物、融合或“嵌合”蛋白质，即包括来自两种或更多种不同蛋白质的蛋白质结构域的蛋白质，或者完全非天然的蛋白质，即在其功能结构域上与任何天然存在的蛋白质具有30％或更少的同一性(参见例如Chen等人(2020)“蛋白质逻辑门的从头设计(De novo design ofprotein logic gates)”，《科学(Science)》368(6486):78-84；和Polizzi等人(2020)“确定的结构单元使小分子结合蛋白的从头设计成为可能(A defined structural unitenables de novo design of small-molecule-binding proteins)”，《科学》369(6508):1227-1233)。在一些实施例中，生物治疗药物是天然存在的蛋白质或已知工程改造的蛋白质的变体。“变体”意指与其来源的蛋白质具有低于100％序列同一性的蛋白质的突变体。例如，变体蛋白质可以是与全长天然蛋白质具有60％或更多序列同一性的蛋白质，例如65％、70％、75％或80％或更多同一性，例如85％、90％或95％或更多同一性，例如与全长天然蛋白质具有98％或99％同一性。变体还包含天然存在的蛋白质的片段，特别是那些与天然存在的蛋白质相比具有相当或改善的活性的片段。生物治疗药物可以衍生自任何来源，例如人类、非人类或工程改造的来源。
在一些实施例中，蛋白质是抗体或其片段，例如单克隆抗体、双特异性抗体、三特异性抗体、scFv、Fab、骆驼纳米抗体等。本文所预期的工程改造发现特别用途的抗体的非限制性实例包含阿达木单抗和英夫利昔单抗(用于治疗自身免疫性或炎性疾病，如类风湿性关节炎，银屑病关节炎，强直性脊柱炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎、银屑病、化脓性汗腺炎、葡萄膜炎或幼年特发性关节炎)、西妥昔单抗(用于治疗癌症，包含例如转移性结肠直肠癌、转移性非小细胞肺癌和头颈癌)、那他珠单抗(用于治疗多发性硬化)、鲁磨西替/莫塞妥莫单抗(用于治疗毛细胞白血病)、泰圣奇/阿替利珠单抗(用于治疗各种癌症)、欧狄沃/纳武单抗(用于治疗各种癌症)、Reopro/阿昔单抗(抗GPIIb/IIIa，用于预防冠状动脉手术(如血管成形术)期间和之后的血栓形成)、维布妥昔单抗(用于治疗复发或难治性霍奇金淋巴瘤(HL)和全身性间变性大细胞淋巴瘤(ALCL))、培塞利珠单抗(用于治疗克罗恩病、类风湿性关节炎、银屑病关节炎和强直性脊柱炎)、埃罗妥珠单抗(用于治疗复发性多发性骨髓瘤)、贝那珠单抗(用于治疗哮喘)、维多珠单抗(用于治疗溃疡性结肠炎和克罗恩病)、加卡奈珠单抗(用于治疗偏头痛和丛集性头痛)、利妥昔单抗(用于治疗自身免疫性疾病和各种癌症)、阿仑单抗(用于治疗慢性淋巴细胞白血病(CLL)和多发性硬化)、度匹鲁单抗(用于治疗过敏性疾病如湿疹(特应性皮炎)、哮喘和鼻息肉)、戈利木单抗(用于治疗炎症)、奥滨尤妥珠单抗(用于治疗淋巴瘤，例如慢性淋巴细胞白血病、滤泡性淋巴瘤)、替拉珠单抗(用于治疗免疫介导的炎性病症)、厄瑞努单抗(用于预防偏头痛)、美泊利单抗(用于治疗严重的嗜酸性哮喘、嗜酸性肉芽肿病和嗜酸性粒细胞增多综合征(HES))、雷莫芦单抗(用于治疗实体瘤)、雷珠单抗(用于治疗“湿性”年龄相关性黄斑变性(AMD，也称为ARMD)、糖尿病性视网膜病变和黄斑水肿)、乌司奴单抗(用于治疗银屑病、克罗恩病和溃疡性结肠炎)、瑞利珠单抗(用于治疗哮喘)、伊匹木单抗(用于治疗各种癌症)、阿莫罗布单抗(用于治疗高胆固醇)、贝利单抗(用于治疗全身性红斑狼疮(SLE))、帕尼单抗(用于治疗各种癌症)、阿维单抗(用于治疗Merkel细胞癌、尿路上皮癌和肾细胞癌)、耐昔妥珠单抗(用于治疗转移性鳞状非小细胞肺癌(NSCLC))、莫格利珠单抗(用于治疗复发性或难治性蕈样肉芽肿和Sézary疾病、复发性或难治性CCR4+成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATCLL)以及复发性或难治性CCR4+皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL))、奥拉单抗(用于治疗实体瘤)、布罗达单抗(用于治疗炎性疾病)、艾库组单抗(用于治疗阵发性夜间血红蛋白尿症(PNH)、非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)和视神经脊髓炎)、帕妥珠单抗(用于治疗转移性HER2阳性乳腺癌)、帕博利珠单抗(用于治疗各种癌症)和托珠单抗(用于治疗类风湿性关节炎(RA)和全身性幼年特发性关节炎)。
在一些实施例中，生物治疗药物Y是这样的抗体，该抗体不是对选自B细胞受体(BCR)、免疫球蛋白E的Fc区的受体Toll样受体(TLR)、T细胞受体(TCR)或其复合物的受体具有特异性的抗体。
如本文所使用的，特异性地结合至靶抗原的抗体是指包括特异性地识别并结合至靶抗原的互补决定区(CDR)结构域的抗体。因此，特异性地结合至B细胞受体或其复合物的抗体是指包括特异性地识别并结合至B细胞受体或包括B细胞受体的复合物的CDR的抗体，特异性地结合至IgE的Fc区的受体的抗体是指包括特异性地识别并结合至IgE的Fc区的受体或包括IgE的Fc区的受体的复合物的CDR的抗体，特异性地结合至Toll样受体的抗体是指包括特异性地识别并结合至Toll样受体或包括Toll样受体的复合物的CDR的抗体，并且特异性地结合至T细胞受体的抗体是指包括特异性地识别并结合至T细胞受体或包括T细胞受体的复合物的CDR的抗体。
在一些实施例中，蛋白质是天然或天然存在的蛋白质。在其他实施例中，蛋白质是工程改造的蛋白质。本文所预期的工程改造发现特别用途的蛋白质的实例包含促红细胞生成素(EPO，用于刺激红细胞的产生)、血小板生成素(TPO，用于刺激血小板的产生)、人生长激素、组织因子、IFNβ-1b(用于治疗多发性硬化)、IFNβ-1a(用于治疗多发性硬化)、IL-2或IL-2模拟阿地白介素(用于治疗黑色素瘤和肾细胞癌)、艾塞那肽(用于治疗2型糖尿病)、阿必鲁肽(用于治疗2型糖尿病)、阿法赛特(用于控制中度至重度银屑病伴斑块形成的炎症，用于治疗皮肤T细胞淋巴瘤和T细胞非霍奇金淋巴瘤)、帕利夫明(用于刺激化疗后为口腔和肠道的表面加衬的细胞的生长)、贝拉西普(用于促进移植物(graft/transplant)存活)，以及中性和碱性氨基酸转运蛋白rBAT或b(0,+)-型氨基酸转运蛋白1(用于治疗胱氨酸尿症)。
在一些实施例中，生物治疗药物Y是这样的蛋白质，该蛋白质不是卵清蛋白或免疫球蛋白E(IgE)。
在一些实施例中，蛋白质是酶，例如代谢酶、溶酶体酶、蛋白酶、肽酶等。本文所预期的工程改造发现特别用途的酶的非限制性实例包含来自菊欧文氏菌的天冬酰胺酶(用于治疗白血病)、细菌IdeS(用于组织移植后的免疫抑制或用于疗法例如基因疗法的施用，患者对其已有免疫力；用于治疗IgG抗体驱动的疾病，如全身性红斑狼疮、寻常性天疱疮或IgA肾病)、细菌粘蛋白酶(用于治疗MUC+癌，例如MUC1+癌)、因子VIII(用于治疗血友病A)、因子IX(用于治疗血友病B)、因子Xa(用于促进凝血)、补体降解蛋白酶，例如来自病原体如细菌病原体或真菌病原体的蛋白酶(例如，假单胞菌弹性蛋白酶(PaE)、假单胞菌碱性蛋白酶(PaAP)、链球菌热原性外毒素B(SpeB)、来自牙龈卟啉单胞菌的牙龈菌蛋白酶、曲霉碱性蛋白酶1(Alp1)、白色念珠菌分泌的天冬氨酰蛋白酶1(Sap1)、2(Sap2)和3(Sap3)，用于治疗补体介导的疾病，如IgA肾病)、苯丙氨酸解氨酶或模拟培伐利酶(用于治疗PKU)、α-半乳糖苷酶A(用于治疗法布里病)、酸性α-葡萄糖苷酶或模拟阿糖苷酶α(GAA，用于治疗庞贝病)、葡糖脑苷脂酶(GCase，用于治疗高雪氏病)、天冬氨酰氨基葡萄糖苷酶(AGA，用于治疗天冬氨酰氨基葡萄糖尿症)、asfotase(用于治疗低磷酸酯酶症(HPP))、α-L-艾杜糖苷酸酶(用于治疗MPS I)、艾杜糖硫酸酯酶或艾杜糖硫酸酯酶模拟物艾杜糖硫酸酯酶(用于治疗MPS II)、磺酰胺酶(用于治疗MPS IIIa)、α-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAGLU，用于治疗MPS IIIB)、乙酰肝素CoA：α-氨基葡萄糖苷N-乙酰转移酶(HGSNAT，用于治疗MPS IIIC)、N-乙酰氨基葡萄糖6-硫酸酯酶(GNS，用于治疗MPS IIID)、N-氨基葡萄糖3-O-硫酸酯酶(芳基硫酸酯酶G或ARSG，用于治疗MPS IIIE)、N-乙酰半乳糖胺6-硫酸酯酶(用于治疗MPS IVA)、β-半乳糖苷酶(用于治疗MPS IVB)、N-乙酰半乳糖胺4-硫酸酯酶(用于治疗MPS VI)、β-葡萄糖醛酸酶(用于治疗MPS VI)、棕榈酰蛋白硫酯酶(PPT1，用于治疗Batten病/CLN1)、三肽基肽酶(TPP1，用于治疗Batten病/CLN2)、精氨酸酶-1或聚乙二醇精氨酸酶(用于治疗精氨酸酶-1缺乏症)或胱硫醚β合酶或Aeglea产物AGLE-177(用于治疗胱硫醚β合酶(CBS)缺乏症，也称为经典高胱氨酸尿症)。
在一些实施例中，生物治疗药物Y是这样的酶，该酶不是因子VIII。
在一些实施例中，蛋白质是病毒蛋白质或病毒颗粒，例如重组病毒颗粒。“重组”病毒或病毒颗粒意指包括基因组的病毒/病毒颗粒，基因组包括与病毒异源的多核苷酸，即在自然界中未发现与病毒的衣壳/包膜缔合的多核苷酸，其中多核苷酸编码基因产物(RNA或蛋白质)。重组病毒颗粒在递送编码治疗性基因产物的多核苷酸中发现用途，用于基因疗法或溶瘤病毒疗法的目的。基因疗法是良好确立的技术。同样良好确立的是以下事实：由于病毒颗粒将在个体中诱导免疫响应的事实，基因疗法因无法多于一次或几次重新施用相同的病毒治疗药物而受到严重阻碍。因此，本领域普通技术人员将理解，用于基因疗法的任何病毒颗粒都将受益于如本文所预期的工程改造。可以用作根据本公开的被工程改造为低免疫原性生物治疗药物的生物治疗药物的病毒颗粒的非限制性实例包含重组腺相关病毒(rAAV)颗粒，例如包括来自由AAV1、AAV2、AAV3b、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh10、AAV11、AAV12或AAV13 VP1蛋白或其变体或假型病毒组成的组的衣壳VP1蛋白的rAAV颗粒；重组人腺病毒颗粒，例如包括来自rHAdV-A、rHAdV-B、rHAdV-C、rHAdV-D、rHAdV-E、rHAdV-F或rHAdV-G或其变体的衣壳蛋白的rHAdV颗粒；重组单纯疱疹病毒(rHSV)颗粒，例如rHSV1或rHSV2或其变体或假型病毒；重组乳头瘤病毒(PV)颗粒；重组多瘤病毒颗粒；重组痘苗病毒颗粒；重组巨细胞病毒(CMV)颗粒；重组杆状病毒颗粒；重组人乳头瘤病毒(HPV)颗粒；或重组逆转录病毒颗粒，例如重组慢病毒、重组人免疫缺陷病毒(HIV)颗粒、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)颗粒、猫免疫缺陷病毒(FIV)颗粒、美洲狮慢病毒(PLV)颗粒、马传染性贫血病毒(EIAV)颗粒、牛免疫缺陷病毒(BIV)颗粒、山羊关节炎脑炎病毒颗粒、γ逆转录病毒颗粒和鼠白血病病毒(MLV)颗粒，或其变体或假型病毒。
在一些实施例中，生物治疗药物Y不是毒素。通常，毒素是以通常非特异性方式对细胞有害的化合物，即毒素将对不同的细胞造成相似量的伤害，即使此类细胞来自显著不同的类别。相比之下，选择性地破坏化合物对某些细胞的伤害程度会明显大于对其他类型细胞的伤害。例如，选择性地破坏化合物可以基于在肺细胞中常见但在肾细胞中罕见的生物化学过程造成伤害，而毒素可以基于肺细胞和肾细胞两者共同的生物化学过程造成伤害。在一些情况下，伤害是细胞死亡。在一些情况下，毒素是假单胞菌外毒素A。在一些实施例中，生物治疗药物Y不是B细胞调节剂。Y不增加或减少B细胞的免疫作用。B细胞的调节的实例包含将B细胞分化成生物治疗药物特异性成熟B细胞，例如浆细胞或记忆细胞，防止B细胞产生抗原特异性抗体，防止活化标志物如CD69的上调，促进生物治疗药物特异性B细胞群体的生存力的降低。在一些实施例中，B细胞活化仅对于那些具有识别Y的B细胞受体的B细胞被抑制(与识别X的整个B细胞群体相反)。
如上所述，与未被工程改造成包括改变的Siglec配体概况的亲本生物治疗药物不同，本公开的低免疫原性生物治疗药物组合物将抑制对自身的免疫响应的发展。因此，通过评估工程改造的低免疫原性生物治疗药物减弱免疫细胞的活性的程度，可以在功能上将本公开的工程改造的低免疫原性生物治疗药物与其来源的未工程改造的(即，亲本的)生物治疗药物区别开来。减弱活性意指减缓活性的增加、降低活性或阻止活性，例如通过对细胞或细胞的群体进行沉默、抑制、删除等。因此，例如，减弱B细胞或B细胞的群体的活性可以包括防止B细胞分化成生物治疗药物特异性成熟B细胞，例如浆细胞或记忆细胞，防止B细胞产生抗原特异性抗体，防止活化标志物如CD69的上调，促进生物治疗药物特异性B细胞群体的生存力的降低。典型地，未工程改造的(即亲本的)生物治疗药物的治疗活性不包括削弱免疫细胞的活性。更典型地，未工程改造的(即亲本的)生物治疗药物的治疗活性不包括减弱B细胞或B细胞的群体的活性。
根据本公开工程改造的生物治疗药物抑制免疫响应的能力可以在体外或体内以任何数量的方式容易地测量。在体外，免疫抑制可以被测量为，例如，B细胞的群体被生物治疗药物活化的程度，其中较低的活化指示较高的免疫抑制。可以使用本领域已知的用于测量B细胞活化的任何方法。例如，群体中的细胞在与工程改造的生物治疗药物接触时上调CD69表达的程度可以例如通过经由FACS测量CD69+细胞的百分比、通过评估B细胞的平均荧光强度(MFI)、通过评估B细胞的活性等来评估。在此类分析中，预期工程改造的生物治疗药物将活化B细胞的鲁棒性比未工程改造的生物治疗药物低至少约2.5倍，在一些情况下鲁棒性低至少约5倍，鲁棒性低至少约7.5倍，或鲁棒性低至少约10倍，在一些情况下鲁棒性低约20倍。在体内，免疫抑制可以测量为，例如，相对于在个体(例如肌肉内或静脉内注射的小鼠，例如在存在或不存在免疫佐剂如矾的情况下，或者例如人类，在施用相应的未修饰的生物治疗药物时)中引发的ADA，工程改造的生物治疗药物引发“抗药物抗体”或ADA的程度，其中较少的ADA指示更大的免疫抑制。在一些情况下，低免疫原性生物治疗药物的ADA滴度相对于相应的未修饰的生物治疗药物降低50％或更多，例如60％、70％、80％或更多，在某些情况下85％、90％、95％或更多，优选地98％、99％或100％，即以至于不可检测。换句话说，由低免疫原性生物治疗药物引发的ADA滴度是由相应的未工程改造的生物治疗药物引发的ADA滴度的50％或更低，例如，是由相应的未工程改造的生物治疗药物引发的ADA滴度的40％、30％或20％或更低，在某些情况下，为15％、10％、5％或更低，优选地仅为2％、1％或更低。
用于检测抗体的方法，包含但不限于酶联免疫吸附测定(ELISA)、微粒ELISA、ELISPOT、放射免疫沉淀测定、电化学发光免疫测定(ECLIA)、DELFIA(解离增强镧系荧光免疫测定)时间分辨荧光(TRF)测定、表面等离子体共振免疫测定(SPRIA)、蛋白质印迹(免疫印迹)等，在本领域中是熟知的，它们中的任何一种都可以用于检测个体的血清中的抗体以确定是否生成了ADA。可以在施用低免疫原性生物治疗药物后在个体的血清中评估ADA滴度，其中在施用低免疫原性治疗物之后24小时或更长时间(例如48小时或78小时或更长时间，在一些情况下1、2、3或4周或更长时间，例如6周或8周)收集的血清中检测到的ADA水平将低于在来自用相应的未工程改造的生物治疗药物以相同给药方案和相同的持续时间治疗的对照个体的血清中检测到的ADA水平。
作为另一个实例，相对于相应的未工程改造的生物治疗药物，当暴露于工程改造的生物治疗药物时，可以在体外观察到免疫抑制作为白细胞响应的降低。例如，与暴露于已经被修饰以包括更多CD22配体的生物治疗药物的包括CD22 Siglec的B细胞相比，在暴露于未工程改造的生物治疗药物的包括CD22 Siglec的B细胞中将观察到下游信号传导途径(例如，Erk磷酸化、NFAT核转位)的更大活化。作为又一个实例，CD22 Siglec--以及同样地，表达CD22 Siglec的细胞--将对生物治疗药物具有更高的结合亲和力，生物治疗药物已经被工程改造以比未工程改造的生物治疗药物包括更多的CD22配体。
在一些实施例中，相对于在来自用相应的未工程改造的生物治疗药物以相同给药方案和相同的持续时间治疗的对照个体的血清中检测到的ADA水平，在施用主题生物治疗药物持续一天或更长时间(例如一个月或更长时间、6个月或更长时间、9个月或更长时间或1年或更长时间)之后，在治疗的个体的血清中对低免疫原性生物治疗药物的ADA较低。在某些实施例中，在施用主题生物治疗药物持续一个月或更长时间(例如6个月或更长时间、9个月或更长时间或1年或更长时间)之后，在个体的血清中检测不到低免疫原性生物治疗药物的ADA，而在用相应的未工程改造的生物治疗药物以相同的给药方案和相同的持续时间治疗的对照个体的血清中可以检测到ADA。这种施用可以是每天一次、每周一次、每两周一次、每月一次、每季度一次、每半年一次、每年一次、每两年一次、每3年一次、每4年一次、每5年一次或每10年一次。
在一些实施例中，本公开的工程改造的低免疫原性生物治疗药物可以进一步被工程改造以包括提高量的去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的配体。去唾液酸糖蛋白受体是结合去唾液酸糖蛋白和糖蛋白的凝集素，唾液酸已从去唾液酸糖蛋白和糖蛋白中被去除以暴露半乳糖残基。ASGPR的配体，例如半乳糖基化部分(半乳糖、半乳糖胺、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc))、葡糖基化部分(葡萄糖、葡糖胺、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc))及其糖模拟物，当与通常会引发T细胞响应的抗原共价结合时，反而已经显示出诱导对抗原的免疫耐受性；参见例如US20170007708A1，其全部公开内容以其整体并入本文。在某些实施例中，ASGPR配体是天然存在的半乳糖基化部分，如半乳糖、半乳糖胺或GalNAc。在其他实施例中，ASGPR配体是葡糖基化部分，如葡萄糖、葡糖胺或GlcNAc。在其他实施例中，ASGPR配体是合成配体，例如，如在例如以下中公开的糖模拟物：Mamidyala,SK等人(2012)《美国化学学会杂志(J.Am.Chem.Soc.)》2012,134,4,1978-1981。
将ASGPR配体与生物治疗药物共价缔合的方法是本领域中熟知的(参见，例如，US20170007708A1，其全部公开内容通过引用并入本文)，这些方法中的任何一种都可以用于工程改造本公开的生物治疗药物。在一些实施例中，低免疫原性生物治疗药物包括的ASGPR配体比在个体中将诱导T细胞响应的相应的未工程改造的生物治疗药物多至少2倍，例如比未工程改造的生物治疗药物多3倍、多4倍、多5倍、多6倍、多7倍、多8倍、多9倍、多10倍、多11倍、多12倍、多13倍、多14倍、多15倍、多16倍、多17倍、多18倍、多19倍或者甚至多20倍的ASGPR配体。用于测量生物治疗药物组合物中聚糖的含量的任何方法，包含例如糖蛋白LC/MS、聚糖LC/MS、毛细管凝胶电泳聚糖分析、分析离子交换HPLC等，可以用于确定生物治疗药物上附加的ASGPR配体的量。
ASGPR配体与主题低免疫原性生物治疗药物的共价缔合预期将主题低免疫原性生物治疗药物导向肝脏的抗原呈递细胞(特别是与肝细胞和特别是ASGPR结合)。与肝脏中抗原呈递细胞结合的特异性可以通过例如用标志物(例如荧光标志物藻红蛋白(“PE”))标记包括ASGPR配体的主题低免疫原性生物治疗药物来证实。将主题生物治疗药物施用于合适的实验受试者。向其他组的受试者施用对照，例如未缀合的PE或媒介物(盐水)。允许主题生物治疗药物和对照循环持续1至5小时的时间段，之后收获受试者的脾和肝并测量荧光。发现荧光的特定细胞可以随后被鉴定。当以这种方式测试时，与未缀合的PE或媒介物相比，主题ASGPR配体缔合的生物治疗药物在肝脏的抗原呈递细胞中显示更高的浓度水平。
免疫调节的有效性可以通过测量OT-1CD8+细胞(移植到宿主小鼠中)响应于施用包括ASGPR配体的主题低免疫原性生物治疗药物(与单独施用低免疫原性生物治疗药物或仅施用媒介物相比)的增殖来测试。当以这种方式测试时，与单独的生物治疗药物或媒介物相比，ASGPR配体缔合的生物治疗药物显示出OT-1细胞增殖的增加，证明CD8+T细胞交叉致敏增加。为了将扩增为功能效应表型的T细胞与扩增和缺失的T细胞区分开，可以在表型上分析增殖的OT-1CD8+T细胞的耗尽的分子特征[如程序性死亡-1(PD-1)、FasL以及其他]，以及作为凋亡的标志的膜联蛋白-V结合，以及因此缺失。还可以评估OT-1CD8+T细胞对未工程改造的生物治疗药物加上佐剂的攻击的响应性，以便证明对生物治疗药物的功能性无响应性，以及因此免疫耐受性。为此，在将本公开的组合物施用到宿主小鼠中之后，接着进行蛋白质攻击，分析细胞的炎性特征。当以这种方式测试时，与对照组相比，本公开的组合物表现出非常低(例如，背景)水平的对生物治疗药物的炎性OT-1CD8+T细胞响应，从而表现出免疫耐受性。
主题ASGPR配体缔合的生物治疗药物在人类中诱导耐受性的有效性可以通过评估与T细胞响应相关联的炎性特征来评估。通常，与ASGPR配体共价缔合的生物治疗药物将引发T细胞响应，该T细胞响应是在施用生物治疗药物的个体中由相应的生物治疗药物引发的T细胞响应的50％或更少，例如，由相应未工程改造的生物治疗药物引发的T细胞响应的40％、30％或20％或更少，在某些情况下，为15％、10％、5％或更少，优选地仅为2％、1％或更少。ASGPR缔合的低免疫原性生物治疗药物诱导的耐受性可以通过定量在用ASGPR配体缔合的生物治疗药物治疗数周后施用的未工程改造生物治疗药物特异性的抗生物治疗药物抗体滴度来容易地评估。当以这种方式测试时，与未预治疗的组相比，在用ASGPR配体缔合的生物治疗药物预治疗的组中，本公开的组合物显示出低水平的对用生物治疗药物的攻击有响应的抗体形成。
如上所述，本公开的工程改造的低免疫原性生物治疗药物保留了药理活性，同时包括本文公开的一种或多种修饰，这些修饰使得生物治疗药物能够抑制免疫响应。“保持(retain和retain\ing)药理活性”意指生物治疗药物的治疗活性比相应的未工程改造的生物治疗药物将施用于初始的个体(即首次接受疗法的个体)时低不超过5倍，在一些情况下，活性比相应的未工程改造的生物治疗药物将施用于初始的个体时低不超过3倍，优选地活性低不超过2倍，更优选地至少与相应的未工程改造的生物治疗药物将施用于初始的个体时的治疗活性一样。
在一些情况下，当Y是多肽时，接头的多肽缀合反应性末端在一些情况下是能够通过多肽上的半胱氨酸硫醇基团或赖氨酸胺基团与多肽缀合的位点，因此可以是硫醇反应性基团，如马来酰亚胺或二溴马来酰亚胺，或如本文所定义的，或胺反应性基团，如活性酯(如全氟苯基酯或四氟苯基酯)，或如本文所定义的。换句话说，Y和L或X之间的连接可以是多肽上的半胱氨酸、硫醇或赖氨酸胺基团和硫醇反应性基团如L基团或X基团上的马来酰亚胺或二溴马来酰亚胺，或L基团或X基团上的胺反应性基团之间的反应产物。
在一些实施例中，X基团或L基团共价结合到生物治疗药物Y上通常未被唾液酸化的氨基酸残基或聚糖的末端，即唾液酸残基与氨基酸残基或聚糖部分是异源的。如本文所使用的，术语“异源的”是指组合物中对于组合物非天然的组分，即通常在自然界中与它所比较的实体的其余部分不缔合。例如，唾液酸可以共价结合到聚糖结构，如G0、G1、G2、G0F、G1F或G2F。在一些实施例中，唾液酸被共价地结合到通常在聚糖中唾液酸化的结构，如G1S、G2S、G2S2、G1FS、G2FS和G2FS2。在一些实施例中，唾液酸被共价地结合到N-连接的或O-连接的天然聚糖上，天然聚糖存在于相应的缺乏唾液酸修饰的未工程改造的生物治疗药物中。在其他此类实施例中，唾液酸被共价地结合到新的N-连接的聚糖位点。在其他实施例中，唾液酸被直接共价地结合到生物治疗药物的氨基酸，例如随机赖氨酸或半胱氨酸、工程改造的转谷氨酰胺酶位点、使用甲酰甘氨酸生成酶(FGE)的工程改造的Catalent甲酰甘氨酸醛位点、与包括N-末端2-羟乙胺(丝氨酸)部分的生物治疗药物的N-末端选择性缀合(SeriMab技术)或新的O-连接的聚糖位点。用于确定生物治疗药物上唾液酸化或Siglec配体缀合的位点的任何方法，包含例如蛋白水解产物LC/MS(肽图谱LC/MS)和较大产物片段(例如抗体Fc相对于轻链，Fd′)的LC/MS，可以用于确定Siglec配体在生物治疗药物中的位置。
在一些实施例中，X或L被共价结合到生物治疗药物Y的天然元件，即聚糖。
另外的方面
如上所述，在本公开的一些方面中，提供了工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中该工程改造的低免疫原性生物治疗药物(下文被称为“低免疫原性生物治疗药物”、“修饰的生物治疗药物”或简称为“主题生物治疗药物”)是已经被工程改造以包括改变的Siglec配体概况的生物治疗药物。
在一些实施例中，改变的Siglec配体概况将包括相对于亲本生物治疗药物的唾液酸富集。换句话说，工程改造的低免疫原性生物治疗药物富含唾液酸，即它是“高唾液酸化的”。例如，工程改造的低免疫原性生物治疗药物可以包括一个或多个唾液酸部分，例如1、2、3、4个或更多个唾液酸部分，在一些情况下，5、6、7、8、9或10个或更多个唾液酸部分，在一些此类情况下，11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个或更多个部分，而亲本生物治疗药物不包括唾液酸部分。作为另一个实例，主题生物治疗药物可以包括两个或更多个唾液酸部分，例如2、3、4或更多个唾液酸部分，在一些情况下，5、6、7、8、9或10个或更多个唾液酸部分，在一些此类情况下，11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个或更多个唾液酸部分，而亲本生物治疗药物仅包括一个唾液酸部分。在一些实施例中，低免疫原性生物治疗药物包括的唾液酸是将在个体中诱导免疫反应的相应未工程改造的生物治疗药物的2倍或更多，例如包括的唾液酸比未工程改造的生物治疗药物多3倍、多4倍、多5倍、多6倍、多7倍、多8倍、多9倍、多10倍、多11倍、多12倍、多13倍、多14倍、多15倍、多16倍、多17倍、多18倍、多19倍或甚至多20倍。在一些实施例中，工程改造的低免疫原性生物治疗药物的50％或更多的聚糖部分，例如60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或100％的聚糖部分包括唾液酸。
在一些实施例中，样本中50％或更多的低免疫原性生物治疗药物被高唾液酸化，例如，样本中60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或100％的低免疫原性生物治疗药物被高唾液酸化。例如，样本中50％或更多的低免疫原性生物治疗药物可以被高唾液酸化至相同或更高的程度，如上所述，这包含其中低免疫原性生物治疗药物比将在个体中诱导免疫反应的相应的未工程改造的生物治疗药物包括更多唾液酸的实施例。在一些实施例中，样本中60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或100％的低免疫原性生物治疗药物被高唾液酸化至相同或更高的程度。
用于测量生物治疗药物组合物的唾液酸化(即唾液酸含量)的任何方法，包含例如糖蛋白LC/MS、聚糖LC/MS、蛋白质LC/MS、完整药物LC/MS、毛细管凝胶电泳聚糖分析、分析离子交换HPLC、分析反相HPLC、分析疏水相互作用色谱法HPLC、分析混合模式色谱法HPLC、通过基于板的测定的总唾液酸或Siglec配体分析、UV/Vis吸收光谱、基于表面等离子体共振的Siglec配体定量测定、基于生物层干涉测量的Siglec配体定量测定等，可以用于确定生物治疗药物上附加的Siglec配体的量。
在一些实施例中，Siglec配体包括来自Siglec特异性抗体的Siglec结合片段，例如来自例如单克隆抗体的CDR、Fab、Fab'、Fv、纳米抗体等、scFv、微型抗体、双体、三体、四体、darpin、骆驼纳米抗体、亲和体、fynomer、双特异性抗体、三特异性抗体等(对Siglec是特异性的)。在一些实施例中，Siglec配体包括来自Siglec特异性嵌合抗原受体(“CAR”)的Siglec结合片段。在一些实施例中，Siglec特异性抗体或Siglec特异性CAR对Siglec-2是特异性的。在一些此类实施例中，Siglec-2特异性抗体选自由依帕珠单抗、奥英妥珠单抗、舒西利单抗、贝妥莫单抗、匹那妥珠单抗、GTB-1550、hLL2、RFB4、JNJ-75348780、HB-22.7、m971、H10-2-4和莫塞妥莫单抗组成的组。在一些此类实施例中，Siglec配体包括来源于从依帕珠单抗设计的scFv多肽序列的Siglec结合片段，或选自由PV1(GYINPRNDYTEYNQ)、PV2(CGYRNPRNDYREYCNQ)和PV3(RNDYTE)组成的组的肽，其化学结构在表2中找到(Kim,B.等人《纳米标度(Nanoscale)》2020,12,11672-11683)。在某些此类实施例中，Siglec结合片段基本上由从依帕珠单抗设计的scFv多肽序列或选自由PV1(GYINPRNDYTEYNQ)、PV2(CGYRNPRNDYREYCNQ)和PV3(RNDYTE)组成的组的肽组成。
表2.PV1、PV2和PV3的化学结构。
在一些此类实施例中，Siglec配体是衍生自单克隆抗体多肽的合成物，单克隆抗体多肽包含HB-22.5、22.7、22.23、22.33、22.13和HB22.196，如Pearson等人(《国际肽研究和治疗杂志(International Journal of Peptide Research and Therapeutics)》，14,3,237-246(2008))所述。一种此类肽是“肽5”，其来源于单克隆抗体HB22-7的CDR2区，具有氨基酸序列CLGIIWGDGRTDYNSALKSRC和在N-末端半胱氨酸和C-末端半胱氨酸之间的二硫键。
在一些实施例中，Siglec配体包括来自Siglec特异性适体的Siglec结合片段。包括在主题生物治疗药物中找到用途的Siglec结合片段的Siglec特异性适体的非限制性实例包含TD-05、TD-05.1和TD-05.17。
在一些此类实施例中，Siglec配体包括合成的、非抗体衍生的Siglec结合肽，其中该肽以可测量的亲和力和高特异性结合至CD22。例如，肽可以是WO2014044793中描述的那些，例如“肽26”，以其他方式被称为“G635BVI07IM1TK”，具有氨基酸序列RALLSIFGSLDHRHHHRTCNTTHYRVTTMSHPQFEKKKKLRMKMSHPQLINTTHYRGGPTMGGSPSRQV”。
因此，在一些实施例中，主题工程改造的低免疫原性生物治疗药物包括与一种或多种天然存在的Siglec配体缀合的生物治疗药物，即包括天然存在的唾液酸和天然存在的聚糖的部分，其中唾液酸和聚糖通常发现在自然界中彼此缔合以形成Siglec配体。在其他实施例中，主题工程改造的低免疫原性生物治疗药物包括与一种或多种非天然存在的Siglec配体缀合的生物治疗药物，例如包括天然存在的唾液酸和接头的部分、包括非天然存在的唾液酸和在自然界中作为Siglec配体的一部分发现的聚糖的部分、包括非天然存在的唾液酸和接头的部分、包括对Siglec具有亲和力的肽的部分等。例如，在工程改造的低免疫原性生物治疗药物的一些实施例中，Siglec配体是非天然存在的Siglec配体。在一些实施例中，非天然存在的Siglec配体包括天然存在的唾液酸和非天然存在的接头。在一些实施例中，非天然存在的Siglec配体基本上由天然存在的唾液酸和非天然存在的接头组成。在一些实施例中，非天然存在的Siglec配体包括非天然存在的唾液酸。在一些实施例中，非天然存在的Siglec配体包括非天然存在的接头。在一些实施例中，非天然存在的Siglec配体基本上由非天然存在的唾液酸和非天然存在的接头组成。
制造方法
如上所述，低免疫原性生物治疗药物是已经被修饰以包括异源Siglec配体(它们与生物治疗药物是异源的或者与它们所附加的氨基酸是异源的)和/或天然存在于所述生物治疗药物中的提高量的Siglec配体的生物治疗药物。通常，修饰不是简单地通过经由配制剂(例如脂质体配制剂)将Siglec配体与生物治疗药物缔合。而是，修饰是Siglec配体与生物治疗药物的共价结合。
将唾液酸共价结合到生物治疗药物的方法在本领域中是众所周知的，这些方法中的任何一种可以被部署以修饰选择的生物治疗药物，以成为本公开的工程改造的低免疫原性生物治疗药物。例如，可以通过工程改造的生物合成进行修饰。“生物合成”意指由细胞介导的合成过程。例如，在高尔基体中，20种已知的唾液酸转移酶的子集经由三种不同类型的连接(α2,3、α2,6和α2,8)将唾液酸连接到基础单糖如半乳糖上。工程改造的生物合成意指由细胞介导的合成过程，细胞已经被工程改造以进行该过程，在一些情况下是从头进行，在其他情况下是以修改的方式进行。因此，例如，可以对生产细胞系进行基因工程改造以表达一种或多种唾液酸转移酶，例如唾液酸转移酶(EC 2.4.99)、β-半乳糖胺α-2,6-唾液酸转移酶(EC 2.4.99.1)、α-N-乙酰半乳糖胺α-2,6-唾液酸转移酶(EC 2.4.99.3)、β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸转移酶(EC 2.4.99.4)、N-乙酰乳糖胺α-2,3-唾液酸转移酶(EC 2.4.99.6)、α-N-乙酰基-神经氨酸苷α-2,8-唾液酸转移酶(EC 2.4.99.8)；乳糖神经酰胺α-2,3-唾液酸转移酶(EC 2.4.99.9)或酶促途径中的其他酶，例如CMP-Neu5Ac羟化酶、唾液酸-4-O-乙酰转移酶、唾液酸-4-O-乙酰酯酶、唾液酸-7(9)-O-乙酰转移酶、唾液酸-8-O-甲基转移酶、唾液酸-9-)-乙酰转移酶等，其驱动特定唾液酸与生物治疗药物的共价结合，或者靶向特定的新氨基酸残基以用唾液酸进行共价修饰。作为另一个实例，生产细胞系可以被提供前体底物，前体底物将作为特定的Siglec配体被生产细胞系并入到所制造的生物治疗药物中。发现可用于表达用作治疗性生物治疗药物的蛋白质的任何生产细胞均可以用于该过程，例如哺乳动物细胞(CHO、HEK等)、昆虫细胞(SF9等)、细菌、原生动物(利什曼原虫等)，如在例如WO2017093291、WO2019002512、WO2019234021中所公开的，它们的全部公开内容通过引用以其整体并入本文。
作为另一个实例，可以通过化学缀合进行修饰。“化学缀合”意指细胞外源发生的过程。因此，例如，在从生产细胞系生物合成之后，Siglec配体可以通过酶促或化学方式与生物治疗药物连接。在美国专利第7,220,555号、美国专利第6,376,475B号和美国专利第5,409,817号中公开了此类体外过程的非限制性实例，这些专利的全部公开内容通过引用并入本文。在一些此类实施例中，可以部署接头以将唾液酸共价连接到生物治疗药物。在本领域中存在许多接头的实例，它们中的任何一个都可以用于将唾液酸化学缀合到生物治疗药物上，以获得本公开的低免疫原性生物治疗药物。
作为第三实例，具体涉及其中Siglec配体是肽或多肽序列的实施例，例如scFv或衍生自依帕珠单抗的肽，例如PV1、PV2或PV3，可以通过生物治疗药物的基因工程改造进行修饰，以在生物治疗药物中包括肽/多肽序列。例如，用于生产生物治疗药物的多核苷酸可以通过标准分子生物学克隆技术进行修饰，以包含在相同翻译阅读框中(“框内”)编码肽/多肽的多核苷酸序列，使得在生产细胞中生物治疗药物的转录和翻译时，生物治疗药物将包括与组成生物治疗药物的氨基酸共价缔合的肽/多肽序列，从而产生低免疫原性的生物治疗药物。优选地，肽/多肽序列将被基因工程改造到生物治疗药物的不负责生物治疗药物的治疗效果的结构域中，例如酶的酶促结构域、抗体的Fab或更具体地CDR结构域等。在修饰病毒颗粒的情况下，优选地将肽/多肽序列基因工程改造到衣壳或包膜蛋白中，以便暴露于病毒颗粒的外部，例如改造到病毒衣壳蛋白的暴露的环、表面暴露的间层蛋白等中。此类结构特征是病毒疗法领域的普通技术人员所熟知的。
使用方法
在本发明的一些方面，提供了用于治疗需要医学干预的个体的方法。术语“治疗(treatment”、“治疗(treating)”等在本文中通常用于意指获得期望的药理学和/或生理学效果。效果就完全或部分防止疾病或其症状来说，可以是预防的，且/或就部分或完全治愈疾病和/或可归因于疾病的不良影响来说，可以是治疗的。如本文所用的，“治疗”涵盖对哺乳动物的疾病的任何治疗，并且包含：(a)预防疾病在可能易患疾病但尚未诊断患有该疾病的受试者体内发生；(b)抑制疾病，即，遏制其发展；或(c)缓解疾病，即，使疾病消退。治疗剂可以在疾病或损伤的发作之前、期间或之后施用。正在进行的疾病的治疗是特别令人感兴趣的，其中该治疗稳定或减少了患者的不期望的临床症状。这种治疗理想地在受影响的组织的功能完全丧失之前进行。主题疗法理想地将在疾病的症状阶段期间施用，并且在一些情况下在疾病的症状阶段之后施用。
术语“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”在本文中可互换使用，并且是指任何需要诊断、治疗或疗法的哺乳动物受试者，尤其是人类。
发现本公开的低免疫原性组合物在治疗需要重复或长期施用治疗药物才能有效的疾病中具有特殊用途。存在许多此类状况的实例，下面和其他地方提供了其中的一些非限制性实例。预期普通技术人员将能够从这些实例推断出如本领域中已知的其他适应症和生物治疗药物。
例如，个体可能患有慢性自身免疫性或炎性疾病，例如类风湿性关节炎、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎、银屑病、化脓性汗腺炎、葡萄膜炎和幼年特发性关节炎。在此类情况下，该方法可以包括以有效治疗慢性免疫疾病的量向个体施用低免疫原性TNFα特异性抗体，例如由阿达木单抗工程改造的低免疫原性阿达木单抗，或由英夫利昔单抗工程改造的低免疫原性英夫利昔单抗。
作为另一个实例，该个体可能患有白血病，例如ALL。在此类情况下，该方法可以包括以有效治疗白血病的量向个体施用来自菊欧文氏菌的工程改造低免疫原性天冬酰胺酶。
作为另一个实例，个体可能患有结肠直肠癌、非小细胞肺癌或头颈癌。在此类情况下，该方法可以包括以有效治疗结肠直肠癌、非小细胞肺癌或头颈癌的量向个体施用工程改造的低免疫原性西妥昔单抗。
作为另一个实例，该个体可能患有多发性硬化。在此类情况下，该方法可以包括以有效治疗多发性硬化的量向个体施用工程改造的低免疫原性那他珠单抗、工程改造的低免疫原性IFNβ-1b或工程改造的低免疫原性IFNβ-1a。
作为另一个实例，个体可能是器官移植物的接受者，并且需要免疫抑制剂来保护移植的组织免受通过个体的免疫系统的排斥。在此类情况下，该方法可以包括以有效防止对移植的组织的抗体响应的量向个体施用工程改造的低免疫原性IdeS。在一些实施例中，移植的器官是同种异体移植物。在一些实施例中，移植的器官是异种移植物。在一些实施例中，器官选自肾、心脏、肺、肝、胰腺、气管、血管组织、皮肤、骨、软骨、肾上腺组织、胎儿胸腺和角膜。
作为另一个实例，个体可能患有2型糖尿病。在此类情况下，该方法将包括以有效治疗糖尿病的量向个体施用工程改造的低免疫原性艾塞那肽或工程改造的低免疫原性阿必鲁泰。
作为另一个实例，个体可能患有补体介导的疾病。在此类情况下，该方法将包括以有效降解补体和治疗疾病的量向个体施用工程改造的低免疫原性补体降解蛋白酶，例如来自病原体如细菌病原体或真菌病原体(例如，假单胞菌弹性蛋白酶(PaE)、假单胞菌碱性蛋白酶(PaAP)、链球菌热原性外毒素B(SpeB)、来自牙龈卟啉单胞菌的牙龈菌蛋白酶、曲霉碱性蛋白酶1(Alp1)、白色念珠菌分泌的天冬氨酰蛋白酶1(Sap1)、白色念珠菌分泌的天冬氨酰蛋白酶2(Sap2)和白色念珠菌分泌的天冬氨酰蛋白酶3(Sap3))。
作为另一个实例，个体可能患有酶缺乏症。在此类情况下，该方法将包括以有效治疗缺乏症的量向个体施用工程改造的低免疫原性酶。此类酶缺乏症的非限制性实例将包含PKU，其中将施用低免疫原性苯丙氨酸解氨酶；法布里病，其中将施用低免疫原性α-半乳糖苷酶A；庞贝病，其中将施用低免疫原性酸α-葡糖苷酶(GAA)；高雪氏病，其中将施用低免疫原性葡糖脑苷脂酶(GCase)；天冬氨酰氨基葡萄糖尿症，其中将施用低免疫原性天冬氨酰氨基葡萄糖苷酶(AGA)；低磷酸酯酶症(HPP)，其中将施用低免疫原性asfotase；MPS I，其中将施用低免疫原性α-L-艾杜糖苷酸酶；MPS II，其中将施用低免疫原性艾杜糖醛酸硫酸酯酶；MPS IIIa，其中将施用低免疫原性磺酰胺酶；MPS IIIB，其中将施用低免疫原性α-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAGLU)；MPS IIIC，其中将施用低免疫原性乙酰肝素CoA：α-氨基葡萄糖苷N-乙酰转移酶(HGSNAT)；MPS IIID，其中将施用低免疫原性N-乙酰葡糖胺6-硫酸酯酶(GNS)；MPS IIIE，其中将施用低免疫原性N-葡糖胺3-O-硫酸酯酶(芳基硫酸酯酶G或ARSG)；MPSIVA，其中将施用低免疫原性N-乙酰半乳糖胺6-硫酸酯酶；MPS IVB，其中将施用低免疫原性β-半乳糖苷酶；MPS VI，其中将施用低免疫原性N-乙酰半乳糖胺4-硫酸酯酶；MPS VI，其中将施用低免疫原性β-葡萄糖醛酸酶；血友病A，其中将施用低免疫原性因子VIII；血友病B，其中将施用低免疫原性因子IX；Batten病的CLN1形式，其中将施用低免疫原性棕榈酰蛋白硫酯酶(PPT1)；Batten病的CLN2形式，其中将施用低免疫原性三肽基肽酶(TPP1)；精氨酸酶-1缺乏症，其中将施用低免疫原性精氨酸酶-1或聚乙二醇精氨酸酶；和胱硫醚β合酶(CBS)缺乏症，也称为典型高胱氨酸尿症，其中施用低免疫原性胱硫醚β合酶或Aeglea产物AGLE-177。
作为另一个实例，该个体可能患有将受益于基因疗法的疾病，例如遗传疾病或复杂疾病(即不限于与特定的遗传病因学相关)，其中治疗性RNA或蛋白质的长期表达将治疗该病状。在此类情况下，该方法将包括以有效治疗疾病的量向个体施用包括编码感兴趣的治疗性基因产物的多核苷酸序列(“转基因”)的工程改造的低免疫原性病毒颗粒。可以经由主题低免疫原性病毒颗粒递送的合适转基因/基因产物的非限制性实例包含与肌营养不良、囊性纤维化、家族性高胆固醇血症和罕见疾病或孤儿疾病相关的那些。此类罕见疾病的实例可以包含脊髓性肌萎缩(SMA)、亨廷顿氏病、瑞特综合征(例如，甲基-CpG结合蛋白2(MeCP2)；UniProtKB-P51608)、肌肉萎缩性侧索硬化(ALS)、杜氏型肌肉营养不良、弗雷德里希共济失调(例如共济蛋白)、与2型脊髓小脑共济失调(SCA2)/ALS相关的ATXN2；与ALS、颗粒蛋白前体(PRGN)(与非阿尔茨海默氏病脑变性相关，包含额颞叶痴呆(FTD)、进行性非流畅性失语症(PNFA)和语义性痴呆)相关的TDP-43以及其他。参见例如，www.orpha.net/consor/cgi-bin/Disease_Search_List.php；rarediseases.info.nih.gov/diseases。
可以由转基因编码的其他有用的治疗性基因产物还包含激素以及生长和分化因子，包含但不限于胰岛素、胰高血糖素、胰高血糖素样肽1(GLP-1)、生长激素(GH)、甲状旁腺激素(PTH)、生长激素释放因子(GRF)、促卵泡激素(FSH)、促黄体激素(LH)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素、血管生长抑素、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、红细胞生成素(EPO)、结缔组织生长因子(CTGF)碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、表皮生长因子(EGF)、转型生长因子a(TGFa)、血小板衍生生长因子(PDGF)、胰岛素生长因子I和II(IGF-I和IGF-II)、转型生长因子b超家族中的任一种(包含TGF b)、活化素、抑制素或骨形态发生蛋白(BMP)BMP 1-15中的任一种、生长因子的调蛋白/神经调节蛋白/ARIA/neu分化因子(NDF)家族中的任一种、神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养素NT-3和NT-4/5、睫状神经营养因子(CNTF)、神经胶质细胞系衍生神经营养因子(GDNF)、神经营养因子、集聚蛋白、信号素/脑衰蛋白家族中的任一种、轴突引导因子-1和轴突引导因子-2、肝细胞生长因子(HGF)、肝配蛋白、头蛋白、音猬因子和酪氨酸羟化酶。
其他有用的转基因包含编码调节免疫系统的蛋白质的转基因，包含但不限于细胞因子和淋巴因子，如血小板生成素(TPO)、白介素(IL)IL-1至IL-25(包含IL-2、IL-4、IL-12和IL-18)、单核细胞趋化蛋白、白血病抑制因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、Fas配体、肿瘤坏死因子a和b、干扰素(a、b和g)、干细胞因子、Hk-2/flt3配体。由免疫系统产生的基因产物也可用于本发明。这些包含但不限于免疫球蛋白IgG、IgM、IgA、IgD和IgE、嵌合免疫球蛋白、人源化抗体、单链抗体、T细胞受体、嵌合T细胞受体、单链T细胞受体、MHC I类和II类分子以及工程改造免疫球蛋白和MHC分子。有用的基因产物还包含补体调节蛋白，如补体调节蛋白、膜辅因子蛋白(MCP)、衰变加速因子(DAF)、CR1、CF2和CD59。
另一些有用的转基因包含编码激素、生长因子、细胞因子、淋巴因子、调节蛋白和免疫系统蛋白的受体中的任何一种的基因产物的转基因。
另一些有用的转基因包含编码胆固醇调节的受体的转基因，包含低密度脂蛋白(LDL)受体、高密度脂蛋白(HDL)受体、极低密度脂蛋白(VLDL)受体和清道夫受体。本发明还涵盖基因产物，如类固醇激素受体超家族的成员，包含糖皮质激素受体和雌激素受体、维生素D受体和其他核受体。另外，有用的基因产物包含转录因子，如jun、fos、max、mad、血清响应因子(SRF)、AP-1、AP2、myb、MyoD和肌生成素、含ETS盒的蛋白质、TFE3、E2F、ATF1、ATF2、ATF3、ATF4、ZF5、NFAT、CREB、HNF-4、C/EBP、SP1、CCAAT盒结合蛋白、干扰素调节因子(IRF-1)、威尔姆斯肿瘤蛋白、ETS结合蛋白、STAT、GATA盒结合蛋白(例如，GATA-3)和带翼螺旋蛋白的叉头家族。
其他有用的基因产物包含氨甲酰基合成酶I、鸟氨酸转氨甲酰酶、精氨酸琥珀酸合成酶、精氨酸琥珀酸裂解酶、精氨酸酶、富马酸乙酰乙酸水解酶、苯丙氨酸羟化酶、α-1抗胰蛋白酶、葡萄糖-e-磷酸酶、胆色素原脱氨酶、因子VIII、因子IX、胱硫醚β-合成酶、支链酮酸脱羧酶、白蛋白、异戊酰-coA脱氢酶、丙酰CoA羧化酶、甲基丙二酰CoA变位酶、戊二酰CoA脱氢酶、胰岛素、β-葡萄糖苷酶、丙酮酸羧化酶、肝磷酸化酶、磷酸化酶激酶、甘氨酸脱羧酶、H蛋白、T蛋白、囊性纤维化跨膜调节(CFTR)序列和肌营养不良蛋白序列或其功能片段。另一些有用的基因产物包含如可以用于酶替代疗法的酶，酶替代疗法可用于由于酶活性不足而导致的各种病状。例如，可以将含有甘露糖-6-磷酸的酶用于溶酶体贮积病的疗法中(例如，合适的基因包含对b-葡糖醛酸酶(GUSB)进行编码的基因)。在另一个实例中，基因产物为泛素蛋白质连接酶E3A(UBE3A)。仍有用的基因产物包含UDP葡萄糖醛酸基转移酶家族1成员A1(UGT1A1)。
在一些实施例中，基因产物不是因子VIII。
其他有用的基因产物包含非天然存在的多肽，如具有含有插入、缺失或氨基酸取代的非天然存在的氨基酸序列的嵌合或杂合多肽。例如，单链工程改造的免疫球蛋白可能适用于某些免疫功能不全患者。其他类型的非天然存在的基因序列包含反义分子和催化核酸，如核酶，其可以用于减少靶标的过度表达。
减少和/或调节基因表达对于治疗以过度增殖细胞为特征的过度增殖性病状(如癌症和银屑病)是特别期望的。靶多肽包含与正常细胞相比在过度增殖性细胞中专门产生或以更高水平产生的那些多肽。靶抗原包含由癌基因如myb、myc、fyn和易位基因bcr/abl、ras、src、P53、neu、trk和EGRF编码的多肽。除作为靶抗原的癌基因产物之外，用于抗癌治疗和保护方案的靶多肽还包含由B细胞淋巴瘤产生的抗体的可变区和T细胞淋巴瘤的T细胞受体的可变区，在一些实施例中，可变区还被用作自身免疫疾病的靶抗原。其他肿瘤相关多肽可用作靶多肽，如在肿瘤细胞中以较高水平存在的多肽，包含由单克隆抗体17-1A识别的多肽和叶酸结合多肽。
其他合适的转基因包含编码可用于通过针对与自身免疫相关的靶标赋予广泛基础的保护性免疫响应而治疗患有自身免疫性疾病和病症的个体的治疗药物的转基因，靶标包含细胞受体和产生自身定向抗体的细胞。T细胞介导的自身免疫疾病包含类风湿关节炎(RA)、多发性硬化(MS)、Sjogren综合征、类肉瘤病、胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)、自身免疫性甲状腺炎、反应性关节炎、强直性脊柱炎、硬皮病、多发性肌炎、皮肌炎、银屑病、血管炎、韦格纳氏肉芽肿病、克罗恩病和溃疡性结肠炎。这些疾病中的每一种以与内源性抗原结合并引发与自身免疫疾病相关的发炎级联的T细胞受体(TCR)为特征。
其他有用的基因产物包含用于治疗血友病的基因产物，血友病包含血友病B(包含因子IX)和血友病A(包含因子VIII和其变体，如异二聚体和B缺失结构域的轻链和重链；美国专利第6,200,560号和美国专利第6,221,349号)。在一些实施例中，小基因包括因子VIII重链的前57个碱基对，该重链对10个氨基酸信号序列以及人生长激素(hGH)聚腺苷酸化序列进行编码。在替代的实施例中，小基因进一步包括A1和A2结构域，以及来自B结构域的N末端的5个氨基酸和/或B结构域的C末端的85个氨基酸，以及A3、Cl和C2结构域。在又一些实施例中，编码因子VIII重链和轻链的核酸在由42个编码B结构域的14个氨基酸的核酸分隔的单个小基因中提供[美国专利第6,200,560号]。
可以经由低免疫原性病毒颗粒递送的另外的说明性基因包含但不限于与糖原贮积病或1A型缺陷(GSD1)相关的葡萄糖-6-磷酸酶、与PEPCK缺陷相关的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)；与癫痫发作和严重的神经发育障碍相关的细胞周期蛋白依赖性激酶样5(CDKL5)，也被称为丝氨酸/苏氨酸激酶9(STK9)；与半乳糖血症相关的半乳糖-1磷酸尿苷酰转移酶；与苯丙酮尿症(PKU)相关的苯丙氨酸羟化酶(PAH)；与原发性高草酸尿症1型相关的基因产物，包含羟基酸氧化酶1(GO/HAOl)和AGXT，与枫糖浆尿病相关的支链α-酮酸脱氢酶，包含BCKDH、BCKDH-E2、BAKDH-Ela和BAKDH-Elb；与1型酪氨酸血症相关的延胡索乙酰乙酸水解酶；与甲基丙二酸血症相关的甲基丙二酰-CoA变位酶；与中链乙酰CoA缺乏相关的中链酰基CoA脱氢酶；与鸟氨酸转氨甲酰酶缺乏相关的鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)；与瓜氨酸血症相关的精氨琥珀酸合成酶(ASS1)；卵磷脂-胆固醇酰基转移酶(LCAT)缺乏症；甲基丙二酸血症(MMA)；与尼曼匹克病Cl型相关的NPC1；丙酸血症(PA)；与转甲状腺素蛋白(TTR)相关的遗传性淀粉样变性相关的TTR；与家族性高胆固醇血症(FH)相关的低密度脂蛋白受体(LDLR)蛋白，LDLR变体，例如WO 2015/164778中描述的那些；PCSK9；与痴呆症相关的ApoE和ApoC蛋白；与克里格勒-纳贾尔病相关的UDP-葡萄糖醛酸转移酶；与严重的联合免疫缺陷病相关的腺苷脱氨酶；与痛风和勒什-纳阳综合征相关的次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶；与生物素酶缺乏相关的生物素酶；与法布里病相关的α-半乳糖苷酶A(α-Gal A))；与GM1神经节苷脂病相关的β-半乳糖苷酶(GLB1)；与威尔逊病相关的ATP7B；与高雪氏病2型和3型相关的β-葡萄糖脑苷脂酶；与齐薇格综合征相关的过氧化物酶体膜蛋白70kDa；与异染性脑白质营养不良相关的芳基硫酸酯酶A(ARSA)、与克拉培病相关的半乳糖脑苷脂酶(GALC)、与庞贝病相关的α-葡萄糖苷酶(GAA)；与尼曼匹克病A型相关的鞘磷脂酶(SMPD1)基因；与成人发病的II型瓜氨酸血症(CTLN2)相关的精氨酸琥珀酸合酶；与尿素循环障碍相关的氨基甲酰磷酸合酶1(CPS1)；与脊髓性肌萎缩症相关的存活运动神经元(SMN)蛋白；与法伯脂肪肉芽肿相关的神经酰胺酶；与GM2神经节苷脂病和泰-萨病和桑德霍夫病相关的b-氨基己糖苷酶；与天冬氨酰葡萄糖胺尿症相关的天冬氨酰氨基葡萄糖苷酶；与岩藻糖苷贮积症相关的a-岩藻糖苷酶；与α-甘露糖苷贮积症相关的a-甘露糖苷酶；与急性间歇性卟啉症(AIP)相关的胆色素原脱氨酶；用于治疗α-1抗胰蛋白酶缺乏症(肺气肿)的α-1抗胰蛋白酶；用于治疗地中海贫血或肾功能衰竭引起的贫血的红细胞生成素；用于治疗缺血性疾病的血管内皮生长因子、血管生成素-1和成纤维细胞生长因子；用于治疗闭塞的血管(如在例如动脉粥样硬化、血栓形成或栓塞中看到的)的血栓调节蛋白和组织因子途径抑制剂；用于治疗帕金森病的芳香族氨基酸脱羧酶(AADC)和酪氨酸羟化酶(TH)；用于治疗充血性心力衰竭的β肾上腺素能受体、受磷蛋白、肌(内)质网腺苷三磷酸酶-2(SERCA2)和心脏腺苷酸环化酶的反义或突变形式；用于治疗各种癌症的肿瘤抑制基因，如p53；细胞因子，例如用于治疗炎性和免疫病症和癌症的各种白介素中的一种；用于治疗肌营养不良的肌营养不良蛋白或小肌营养不良蛋白和肌营养相关蛋白或小肌营养相关蛋白；以及用于治疗糖尿病的胰岛素或GLP-1。
药物组合物
在用主题低免疫原性生物治疗药物治疗个体的方法中，患者通常将被施用包括主题低免疫原性生物治疗药物的药物组合物。药物组合物意指已经在药学上可接受的载剂中配制的本公开的工程改造的低免疫原性生物治疗药物。如本文所使用的，“药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂”包含但不限于任何佐剂、载剂、赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、增味剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、稳定剂、等渗剂、溶剂或乳化剂，其已经被美国食品和药物管理局批准可用于人类或家畜动物。
本公开的药物组合物以治疗有效剂量(例如足以为前述疾病状态提供治疗的剂量)施用。本公开的化合物或其药学上可接受的盐的施用可以经由具有类似效用的药剂的任何可接受的施用方式进行。虽然对于本公开的化合物，人的剂量水平仍有待优化，但这些可以容易地从施用于相关动物模型(例如小鼠)的剂量中推断出，剂量导致该动物模型中疾病或病症的治疗。通常，单独的人类剂量为约0.01-2.0mg/kg体重，优选地约0.1-1.5mg/kg体重，并且最优选地约0.3-1.0mg/kg体重。治疗可以施用持续一天或几天的时间段，并且可以间隔几天、一周或几周或一个月或几个月被重复。施用可以是作为单剂量(例如，作为推注)或作为初始推注，随后在一段时间内(例如，1至7天)连续输注完整剂量的剩余部分。当然，施用的活性化合物的量将取决于以下中的任何一个或全部：被治疗的受试者和疾病状态、痛苦的严重程度、施用方式和时间表以及处方医生的判断。还应当理解，施用的量将取决于生物治疗药物的分子量、共价结合的Siglec配体的量和接头的大小。
尽管考虑了所有典型的施用途径(例如口服、局部、经皮、注射(肌内、静脉内或动脉内))，但目前优选的是提供适合于注射的液体剂型。通常，取决于预期的施用方式，药学上可接受的组合物将含有按重量计约0.1％至95％，优选地约0.5％至50％的本公开的主题低免疫原性生物治疗药物，其余为合适的药物赋形剂、载剂等。可以制备含有在0.005％至95％的范围内的活性成分且余量由无毒载剂组成的剂型或组合物。
主题药物组合物可以单独施用或与其他药物药剂组合施用。这些组合物可以包含其他医学药剂、药物药剂、载剂等，包含但不限于可以充当免疫调节剂的其他活性药剂，并且更具体地说，可以对B细胞具有抑制作用，包含抗叶酸剂、免疫抑制剂、细胞周期抑制剂、有丝分裂抑制剂和抗代谢剂，或其组合。
液体药学上可施用的组合物可以例如通过将本公开的活性组合物(例如，冻干的粉末)和任选的药用佐剂在载剂中进行溶解、分散等，从而形成溶液或悬浮液来制备，载剂如例如水(注射用水)、盐水、右旋糖水溶液、甘油、乙二醇、乙醇等(不包含半乳糖)。如果需要，待施用的药物组合物还可以含有少量无毒的辅助物质，如湿润剂、乳化剂、稳定剂、增溶剂、pH缓冲剂等，例如乙酸钠、柠檬酸钠、环糊精衍生物、脱水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺乙酸酯和三乙醇胺油酸酯等，渗透剂、氨基酸、糖和碳水化合物、蛋白质和聚合物、盐、表面活性剂、螯合剂和抗氧化剂、防腐剂和特定配体。制备此类剂型的实际方法对于本领域的技术人员来说是已知的或者是显而易见的；例如，参见《雷明顿：药学科学与实践(Remington:The Science and Practice of Pharmacy)》，药学出版社(Pharmaceutical Press)，第22版，2012。在任何情况下，待施用的组合物或配制剂将含有一定量的活性化合物，其量可有效治疗被治疗的受试者的症状。
实例
提出以下实例以便向本领域普通技术人员提供如何制造和使用本发明的完整公开和描述，并且不旨在限制诸位发明人考虑作为其发明的范围，也不旨在表示以下实验是进行的全部或仅有的实验。已经做出努力来确保关于所使用的数字(例如，量、温度等)的准确性，但仍应考虑一些实验误差和偏差。除非另外指明，否则份数是重量份，分子量是重均分子量，温度是以摄氏度为单位，并且压力是在大气压下或接近大气压。“平均”意指算术平均值。可以使用标准缩写，例如，bp：碱基对；kb：千碱基；pl：皮升；s或sec：秒；min：分钟；h或hr：小时；aa：氨基酸；kb：千碱基；bp：碱基对；nt，核苷酸；i.m.：肌内(地)；i.p.：腹膜内(地)；s.c.：皮下(地)等。
一般合成程序
除非在实例中另有说明，否则所有合成化学都在标准实验室玻璃器皿中进行。市售试剂按接收的原样使用。微波反应在Anton Paar Monowave 400中进行，使用仪器软件控制加热时间和压力。使用Masslynx软件在具有PDA和单四极杆检测器(具有交替的正离子扫描和负离子扫描)的Waters Acquity UPLC仪器上或使用LabSolutions软件在ShimadzuLCMS-2020上进行LC/MS分析。保留时间由提取的214nm和/或254nm UV色谱图确定。在由级分模块2767、泵2545和2998PDA检测器组成的Waters自动纯化系统上使用Masslynx软件/具有DAD检测器的Agilent 1260Infinity自动纯化系统，或者在Gilson系统上使用215液体处理器、333和334泵、UV/VIS-155检测器和Trilution lc软件进行制备型HPLC。使用Topspin软件在Bruker Avance 400MHz或Bruker Fourier300MHz上进行1H NMR。在二氧化硅(SigmaAldrich TLC硅胶60F254铝或玻璃TLC板，涂覆有荧光指示剂F254的硅胶)上进行分析薄层色谱法，并在UV光下可视化。手动进行硅胶色谱法，或使用Teledyne ISCO CombiFlashNextGen 300+自动化色谱法进行梯度洗脱。
提供了用于合成所公开化合物的公知化学合成方案和条件的许多通用参考文献是可获得的(参见，例如Smith和March，《March的高等有机化学：反应、机制和结构(March'sAdvanced Organic Chemistry:Reactions,Mechanisms,and Structure)》，第五版，威利出版社(Wiley-Interscience)，2001；或者Vogel，《实用有机化学教科书，包含定性有机分析》，第四版，纽约：朗文出版社(Longman)，1978)。
在制备主题化合物的任何过程中，可能需要和/或希望保护任何相关分子上的敏感或反应性基团。这可以通过标准文献中描述的常规保护基团来实现，例如J.F.W.McOmie，《有机化学中的保护基团(Protective Groups in Organic Chemistry)》，Plenum出版社(Plenum Press)，伦敦和纽约，1973；T.W.Greene和P.G.M.Wuts，《有机化学中的保护基团》，第三版，威利出版社，纽约1999；《肽(The Peptides)》，第3卷(E.Gross和J.Meienhofer编著)，学术出版社(Academic Press)，伦敦和纽约1981；《有机化学方法(Methoden derorganischen Chemie)》，Houben-Weyl，第4版，第15/l卷，Georg Thieme Verlag，斯图加特1974；H.-D.Jakubke和H.Jescheit，《氨基酸、肽、蛋白质((Aminosauren,Peptide,Proteine)》，化学出版社(Verlag Chemie)，魏因海姆、迪尔菲尔德海滩和巴塞尔1982；和/或Jochen Lehmann，《氢化化学：单糖和衍生物(Chemie der Kohlenhydrate:Monosaccharide and Derivate)》，Georg Thieme Verlag，斯图加特1974。保护基团可以使用本领域已知的方法在方便的后续阶段去除。
本主题化合物可以通过各种不同的合成路线使用可商购的起始材料和/或通过常规合成方法制备的起始材料来合成。可用于合成本文公开的化合物的各种合成路线的实例在以下方案中描述。
实例1：针对抗药物抗体响应而被抑制的接合CD22的生物治疗药物的类别的概念B细胞及其克隆型B细胞受体位于对外来药剂的基于抗体的免疫响应的核心。对于许多生物治疗药物类别，包含单克隆抗体、双特异性和多特异性抗体、酶替代疗法药物、重组微生物酶、蛋白质-Fc融合蛋白、细胞内递送构建体和基因疗法载体，抗药物抗体是药物暴露的普遍挑战。
基于具有分化成分泌抗药物抗体的浆细胞的潜力的B细胞克隆可以通过Siglec抑制性受体募集到克隆型抗药物B细胞受体而被抑制的原理，设计了一类具有抑制的或消除的体液免疫原性的新型生物分子和生物治疗药物。Siglec是一类结合唾液酸的凝集素蛋白，其在大多数或所有类型的造血细胞上表达。
图1描绘了具有抑制的抗药物抗体响应的接合CD22的生物治疗药物的模型的一个方面。B细胞受体-Siglec配体共接合物(包含药物-Siglec配体缀合物)通过抑制性CD22受体向B细胞受体复合物的物理募集来抑制或沉默药物特异性B细胞活化。
图2描绘了具有抑制的抗药物抗体响应的CD22接合生物治疗药物的模型的另一方面：B细胞受体-Siglec配体共接合物(包含药物-Siglec配体缀合物)仅抑制、沉默或删除药物特异性B细胞，同时保留那些对药物没有特异性的B细胞克隆。
实例2：Siglec-2/接合CD22的低免疫原性或非免疫原性生物治疗药物的不同形式
四种形式的Siglec-2/接合CD22的低免疫原性或非免疫原性的生物治疗药物可以被工程改造。图3示出了每种形式的代表性结构。示出了抗体以举例说明这种生物治疗药物，但是其他生物形式(例如，双特异性和多特异性抗体、酶替代疗法药物、重组微生物酶、蛋白质-Fc融合蛋白、细胞内递送构建体、基因疗法载体)可以使用四种呈现的形式被类似地工程改造。形式1、2和3使用化学并入的合成的小分子Siglec配体来赋予给定药物Siglec-2结合活性。此类合成的Siglec-2配体结构在实例3中进行描述。
“形式1”是在其多肽链上用一个或多个可缀合的Siglec配体-接头结构共价修饰的生物治疗药物。Siglec-2配体-接头结构的缀合可以通过位点特异性或非位点特异性方法来实现。
“形式2”是在具有Siglec配体结构的天然或工程改造的多糖上修饰的生物治疗药物，其中Siglec-2配体并入发生于在细胞中药物表达期间的生物合成中。这种方法将包含在药物表达期间将基于Siglec-2配体的底物供给细胞以实现在药物聚糖中生物合成并入的方法。通过在体外蛋白质翻译系统中用基于Siglec-2配体的酶底物处理，也可以实现将Siglec配体并入到聚糖中。
“形式3”是在具有Siglec配体结构的天然或工程改造的聚糖上共价修饰的生物治疗药物。具有末端Siglec-2配体结构的甘氨酸修饰是在生物制品纯化后通过化学和/或化学酶促缀合实现的。
用于对低免疫原性或非免疫原性生物制品进行工程改造的“形式4”依赖于将基于蛋白质的或基于肽的CD22结合物i并入到生物治疗药物的多肽链中。此类CD22结合物的实例将包含：1)基于免疫球蛋白的结合物，如Fab结构域、单链Fv(scFv)片段、双体和单结构域抗体片段(骆驼VHH或鲨鱼VNAR)；2)基于非免疫球蛋白的结合结构域，如亲和体、fynomer、单抗体、DARPin、Knottin、可变淋巴细胞受体(VLR)和亲合体；3)CD22结合肽，如肽适体；和4)基于寡核苷酸的Siglec结合物，如寡核苷酸适体。
所有四种图示的形式都能够使CD22募集到药物特异性B细胞上的抗药物、克隆型B细胞受体，从而抑制B细胞的活化、增殖和分化，最终阻断抗药物抗体的产生。
实例3：
设计并合成了一组可缀合的接头化合物，以确定药物Siglec-2结合的重要性以及增强的Siglec-2结合相对于未增强的Siglec-2结合对抑制体外B细胞活化和体内抗药物抗体响应的重要性。图4描绘了示例性的可缀合的CD22结合的Siglec配体-接头结构，突出了该结构的组分：Siglec配体结合部分、Siglec配体-近端接头结构、接头和反应性/可缀合的基团。图5描绘了示例性的Siglec配体结构，集中于决定Siglec-2结合亲和力和物种特异性的元件。图6描绘了示例性的Siglec-2配体结构，示出了在配体化合价上变化的结构。图7描绘了示例性的Siglec配体结构，示出了在接头结构上变化的结构，其中接近基于唾液酸的部分的区域由基于PEG的结构或基于半乳糖的结构组成。图8描绘了对于Siglec-2结合增强的(顶部)、对于Siglec-2结合未增强的(中间)的示例性的可缀合的接头结构，以及不结合Siglec-2(底部)的asialo阴性对照接头结构。示出了增强的Siglec-配体接头结构(化合物编号26288，Siglec配体：甲基-α-9-N-(联苯基-4-羰基)-氨基-9-脱氧-N-乙醇酰神经氨酸)(顶部)，含有未增强的Siglec-2结合部分的Siglec配体-接头结构(化合物编号26614，Siglec配体：N-乙醇酰神经氨酸/Neu5Gc)(中间)，和基于PEG的非Siglec结合的可缀合的接头结构(化合物编号26530)(底部)。如实例5所示，这些化合物被合成为高纯度，并与不同的生物治疗药物和蛋白质缀合。
除非在实例中另有说明，否则所有合成化学都在标准实验室玻璃器皿中进行。市售试剂按接收的原样使用。微波反应在Anton Paar Monowave 400中进行，使用仪器软件控制加热时间和压力。使用Masslynx软件在具有PDA和单四极杆检测器(具有交替的正离子扫描和负离子扫描)的Waters Acquity UPLC仪器上或使用LabSolutions软件在ShimadzuLCMS-2020上进行LC/MS分析。保留时间由提取的214nm和/或254nm UV色谱图确定。在由级分模块2767、泵2545和2998PDA检测器组成的Waters自动纯化系统上使用Masslynx软件/具有DAD检测器的Agilent 1260 Infinity自动纯化系统，或者在Gilson系统上使用215液体处理器、333和334泵、UV/VIS-155检测器和Trilution lc软件进行制备型HPLC。使用Topspin软件在Bruker Avance 400MHz或Bruker Fourier300MHz上进行1H NMR。在二氧化硅(Sigma Aldrich TLC硅胶60F254铝或玻璃TLC板，涂覆有荧光指示剂F254的硅胶)上进行分析薄层色谱法，并在UV光下可视化。手动进行硅胶色谱法，或使用Teledyne ISCOCombiFlash NextGen 300+自动化色谱法进行梯度洗脱。
实例4：可缀合的Siglec配体的合成
(2R,3S,4S,5R,6R)-2-(乙酰氧基甲基)-6-(丁-3-炔-1-基氧基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯(化合物编号26499)和(2R,3R,4S,5S,6R)-2-(丁-3-炔-1-基氧基)-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三基三苯甲酸酯(实例1)
(2R,3S,4S,5R,6R)-2-(乙酰氧基甲基)-6-(丁-3-炔-1-基氧基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯(3)的合成
在氩气气氛中，在搅拌下将(2S,3R,4S,5S,6R)-6-(乙酰氧基甲基)四氢-2H-吡喃-2,3,4,5-四酰基四乙酸酯(1，10.0g，25.62mmol)和丁-3-炔-1-醇(2，2.69g，38.43mmol)溶解在无水二氯甲烷(100.0mL)中。向该溶液中添加活化的粉末状分子筛(10.0g，100％w/w)。将反应混合物在室温下搅拌持续30min，然后冷却至0℃，随后在30min内滴加三氟化硼乙醚络合物(22.32mL，76.86mmol)。将混合物在室温下搅拌持续12h。在完成之后，用三乙胺将反应混合物淬灭直至中性pH，用硅藻土过滤，并用二氯甲烷(50mL)洗涤。在搅拌下向滤液中添加碳酸氢钠水溶液(100mL)。在10min之后，分离有机层，用水(2×50mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，并在旋转蒸发器上浓缩，得到粗残余物。粗残余物经由柱色谱法(在己烷中的60-90％乙酸乙酯)纯化，以得到呈白色固体的(2R,3S,4S,5R,6R)-2-(乙酰氧基甲基)-6-(丁-3-炔-1-基氧基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯(3)。产率：8.50g，82.87％；ELSD-MS(ESI)m/z 401.38[M+1]+。
(2R,3S,4S,5R,6R)-2-(乙酰氧基甲基)-6-(丁-3-炔-1-基氧基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯(化合物编号26499)的合成
在0℃下，向在甲醇(80mL)中的(2R,3R,4S,5R,6R)-2-(丁-3-炔-1-基氧基)-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三醇(3，8.5.0g，21.23mmol)的搅拌的溶液中滴加甲醇钠(25％，在甲醇中)溶液(0.44mL，2.12mmol)。将反应混合物在室温下搅拌持续1h。在完成之后，将反应混合物冷却至0℃，并用DOWEX氢形式淬灭以保持pH 6。将混合物通过硅藻土过滤并在减压下浓缩以获得固体，然后用乙醚研磨该固体并过滤以得到呈灰白色固体的(2R,3R,4S,5R,6R)-2-(丁-3-炔-1-基氧基)-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三醇(化合物编号26499)。产率：4.0g，81.13％；ELSD-MS(ESI)m/z 250.0[M+18]+。
(2R,3R,4S,5R,6R)-2-(丁-3-炔-1-基氧基)-6-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三醇(4)的合成
在0℃下，向在干燥吡啶(10.0ml)中的(2R,3R,4S,5R,6R)-2-(丁-3-炔-1-基氧基)-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三醇(26499，1.0gm，4.31mmol)的搅拌的溶液中添加叔丁基(氯)二甲基硅烷(0.779g，5.17mmol)。将反应混合物在室温下搅拌持续16h。在完成之后，在减压下直接浓缩反应混合物，以获得粗残余物，粗残余物然后通过柱色谱法(在己烷中的70-95％乙酸乙酯)纯化，以得到呈无色粘性液体的(2R,3R,4S,5R,6R)-2-(丁-3-炔-1-基氧基)-6-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三醇(4)。产率；0.80g，53.62％。LCMS m/z 347.0[M+1]+。
(2R,3R,4S,5S,6R)-2-(丁-3-炔-1-基氧基)-6-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三基三苯甲酸酯(5)的合成
在0℃下，向在吡啶(7.5mL)中的(2R,3R,4S,5R,6R)-2-(丁-3-炔-1-基氧基)-6-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三醇(4，0.75g，2.16mmol)的搅拌的溶液中添加苯甲酰氯(2.01mL，17.3mmol)。混合物在室温下搅拌过夜。在完成之后，将反应混合物直接在旋转蒸发器上浓缩，以获得粗残余物，该粗残余物然后经由柱色谱法(在己烷中10-30％乙酸乙酯)纯化，以得到呈无色固体的(2R,3R,4S,5S,6R)-2-(丁-3-炔-1-基氧基)-6-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三基三苯甲酸酯(5)。产率：1.25g，87.66％；LCMS m/z 659.44[M+1]+。
(2R,3R,4S,5S,6R)-2-(丁-3-炔-1-基氧基)-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三基三苯甲酸酯的合成(实例1)
在0℃下，向在氧杂环戊烷(30.0ml)中的(2R,3R,4S,5S,6R)-2-(丁-3-炔-1-基氧基)-6-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三基三苯甲酸酯(5，3.0g，4.55mmol)的搅拌的溶液中滴加四丁基氮杂鎓氟化物(6.83mL，6.83mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌持续2.5h。在完成之后，将反应混合物用水淬灭，并用乙酸乙酯提取。将有机层用无水硫酸钠干燥，并且在减压下蒸发以获得粗残余物，该粗残余物然后经由柱色谱法(在己烷中30-40％乙酸乙酯)纯化，以得到呈白色固体的(2R,3S,4S,5R,6R)-4,5-双(乙酰氧基)-6-(丁-3-炔-1-基氧基)-2-(羟基甲基)氧杂环己烷-3-基乙酸酯(实例1)。产率；1.2g,48.39％；ELSD-MS(ESI)m/z 250.0[M+18]+。1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ4.25(d,J＝7.2Hz,1H),3.98-3.92(m,3H),3.81(d,J＝2.8Hz,1H),3.78-3.66(m,3H),3.53-3.43(m,3H),2.50(dt,J＝7.2&2.8Hz,2H),2.25(t,J＝2.4Hz,1H)。
(1R,2R)-1-((2R,3R,4S,6R)-3-乙酰胺基-4-乙酰氧基-6-(甲氧基羰基)-6-(对甲苯基硫基)四氢-2H-吡喃-2-基)-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙烷-1,2-二基二乙酸酯(实例3)
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(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-2,4-二羟基-6-((1R,2R)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸甲酯(2)的合成
在室温下在氩气气氛中，向在无水甲醇(2500mL)中的(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-2,4-二羟基-6-((1R,2R)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(1，100.0g，323.3mmol)的搅拌的悬浮液中添加Amberlite IR-120(H+)树脂(80.0g)。在惰性气氛中搅拌反应混合物，直到悬浮液变成透明溶液。通过过滤除去树脂，并且在减压下浓缩滤液，以获得残余物。残余物用乙醚研磨，并过滤，以得到呈浅粉色固体的(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-2,4-二羟基-6-((1R,2R)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸甲酯(2)。产率：104.0g，99.49％；LCMS(ESI)m/z 324.2[M+1]+。
(1S,2R)-1-((2R,3R,4S,6S)-3-乙酰胺基-4,6-二乙酰氧基-6-(甲氧基羰基)四氢-2H-吡喃-2-基)丙烷-1,2,3-三基三乙酸酯(3)的合成
在2000mL圆底烧瓶中，在氩气气氛中，将(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-2,4-二羟基-6-((1R,2R)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸甲酯(2，102.0g，315mmol)在搅拌下溶解在吡啶(600mL)中。在搅拌下，在0℃下在30min内，向该溶液中滴加乙酸酐(298mL，3.15mmol)。将混合物从0℃搅拌至室温过夜。在完成之后，反应混合物在旋转蒸发器上在减压下直接浓缩。然后将获得的稠浆倒入具有乙酸乙酯(500mL)的分液漏斗中，并且用1N HCl水溶液(200mL)洗涤，随后用饱和碳酸氢钠(200mL)溶液和去离子水(2×200mL)洗涤。分离有机层，经无水硫酸钠干燥，并且在减压下浓缩以获得稠浆。用乙醚研磨该浆并过滤，以得到呈白色固体的(1S,2R)-1-((2R,3R,4S,6S)-3-乙酰胺基-4,6-二乙酰氧基-6-(甲氧基羰基)四氢-2H-吡喃-2-基)丙烷-1,2,3-三基三乙酸酯(3)。产率：130.0g，71.83％；LCMS(ESI)m/z 534.2[M+1]+。
(1S,2R)-1-((2R,3R,4S,6R)-3-乙酰胺基-4-乙酰氧基-6-(甲氧基羰基)-6-(对甲苯基硫基)四氢-2H-吡喃-2-基)丙烷-1,2,3-三基三乙酸酯(4)的合成
在氩气气氛中，在搅拌下将(1S,2R)-1-((2R,3R,4S,6S)-3-乙酰胺基-4,6-二乙酰氧基-6-(甲氧基羰基)四氢-2H-吡喃-2-基)丙烷-1,2,3-三基三乙酸酯(3，130.0g，243.68mmol)溶解在无水二氯甲烷(1300.0mL)中。向该溶液中添加活化的粉末状分子筛(40.0g)。将反应混合物在室温下搅拌持续30min，并冷却至0℃，随后在30min内滴加三氟化硼乙醚络合物(111.0mL，365.5mmol)。将混合物在室温下搅拌。在完成之后，用三乙胺将反应混合物淬灭至中性pH，用硅藻土过滤，并用二氯甲烷(100mL)洗涤。在搅拌下向滤液中添加碳酸氢钠水溶液(300mL)。在10min后，分离有机层，用水(2×300mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，并在旋转蒸发器上浓缩，以获得粗残余物。获得的粗残余物经由柱色谱法(在己烷中60-90％乙酸乙酯)纯化，以得到呈白色固体的(1S,2R)-1-((2R,3R,4S,6R)-3-乙酰胺基-4-乙酰氧基-6-(甲氧基羰基)-6-(对甲苯基硫基)四氢-2H-吡喃-2-基)丙烷-1,2,3-三基三乙酸酯(4)。产率：125.0g，85.83％；LCMS(ESI)m/z598.32[M+1]+。
(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-4-羟基-2-(对甲苯基硫基)-6-((1R,2R)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸甲酯(5)的合成
在0℃下，向在甲醇(800mL)中的(1S,2R)-1-((2R,3R,4S,6R)-3-乙酰胺基-4-乙酰氧基-6-(甲氧基羰基)-6-(对甲苯基硫基)四氢-2H-吡喃-2-基)丙烷-1,2,3-三基三乙酸酯(4，100.0g，167mmol)的搅拌的溶液中缓慢地添加甲醇钠(25％，在MeOH中)溶液(3.58mL，16.7mmol)。将反应混合物在室温下搅拌持续2h。在完成之后，将反应混合物冷却至0℃，并用DOWEX氢形式淬灭以保持pH 6。将混合物通过硅藻土过滤并在减压下浓缩以获得固体，该固体然后用乙醚研磨并过滤以得到呈灰白色固体的(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-4-羟基-2-(对甲苯基硫基)-6-((1R,2R)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸甲酯(5)。产率：71.0g，98.80％；LCMS(ESI)m/z 430.10[M+1]+。
(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(甲苯磺酰氧基)丙基)-4-羟基-2-(对甲苯基硫基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸甲酯(6)的合成
在0℃下，向在吡啶(300mL)中的(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-4-羟基-2-(对甲苯基硫基)-6-((1R,2R)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸甲酯(5，40.0g，93.1mmol)的搅拌的溶液中滴加在吡啶(100mL)中的4-甲苯-1-磺酰氯(30.2g，158mmol)的溶液。将所得的反应溶液搅拌过夜。在完成之后，将反应混合物在减压下直接浓缩，以获得稠浆。经由快速柱色谱法(在己烷中的80-95％乙酸乙酯)纯化稠浆，以得到呈白色固体的(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(甲苯磺酰氧基)丙基)-4-羟基-2-(对甲苯基硫基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸甲酯(6)。产率：21.2g，39.0％。LC-MS(ESI)m/z 584.05[M+1]+。
(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-6-((1R,2R)-3-叠氮基-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-2-(对甲苯基硫基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸甲酯(7)的合成
在惰性气氛中，在搅拌下将(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(甲苯磺酰氧基)丙基)-4-羟基-2-(对甲苯基硫基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸甲酯(6，21.0g，35.98mmol)溶解在无水N,N-二甲基甲酰胺(210.0mL)中。在室温下向该溶液中添加叠氮化钠(7.80g，120mmol)。将所得的反应混合物在60℃下搅拌持续16h。在完成之后，反应混合物直接在旋转蒸发器上浓缩，以获得粗固体。粗固体经由柱色谱法(在己烷中的80-95％乙酸乙酯)纯化，以得到呈灰白色固体的(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-6-((1R,2R)-3-叠氮基-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-2-(对甲苯基硫基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸甲酯(7)。产率：11.7g，71.55％；LCMS(ESI)m/z 453.19[M-1]-。
(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-6-((1R,2R)-3-氨基-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-2-(对甲苯基硫基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸甲酯(8)的合成
在室温下，向在四氢呋喃(100mL)中的(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-6-((1R,2R)-3-叠氮基-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-2-(对甲苯基硫基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸甲酯(7，10.0g，22.0mmol)的搅拌的溶液中添加10％ Pd/C(10.0g，100％w/w)。然后使用H2气体的气球压力将反应产物氢化持续12h。在完成之后，通过硅藻土过滤反应产物，并且浓缩滤液。在真空下干燥残余物，以得到呈稠浆的粗(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-6-((1R,2R)-3-氨基-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-2-(对甲苯基硫基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸甲酯(8)。产率9.9g，105.3％；LCMS,m/z 428.16[M+1]+。
(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基-2-(对甲苯基硫基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸甲酯(10)的合成
在氩气气氛中，在搅拌下，将(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-6-((1R,2R)-3-氨基-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-2-(对甲苯基硫基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸甲酯(8，9.90g，21.78mmol)和2,5-二氧吡咯烷-1-基3-苯氧基苯甲酸酯(9，7.91g，25.41mmol)溶解在四氢呋喃(90.0mL)中。在0℃下，向该溶液中添加乙基双(丙-2-基)胺(12.07mL，69.31mmol)。将所得的反应混合物在室温下搅拌持续12h。在完成之后，将反应混合物在减压下浓缩，以获得粗残余物，该粗残余物然后经由柱色谱法(在己烷中的80-90％乙酸乙酯)纯化，以得到呈白色固体的(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基-2-(对甲苯基硫基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸甲酯(10)。产率：8.10g，58.93％(经过两个步骤)；LCMS(ESI)m/z 625.23[M+1]+。
(1R,2R)-1-((2R,3R,4S,6R)-3-乙酰胺基-4-乙酰氧基-6-(甲氧基羰基)-6-(对甲苯基硫基)四氢-2H-吡喃-2-基)-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙烷-1,2-二基二乙酸酯的合成(实例3)
在0℃下，在30min内，向在吡啶(80.0mL)中的(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基-2-(对甲苯基硫基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸甲酯(10，8.0g，12.81mmol)的搅拌的溶液中滴加乙酸酐(5.45mL，57.63mmol)。将混合物从0℃搅拌至室温过夜。在完成之后，将反应混合物在真空下直接浓缩。将获得的稠浆倒入具有乙酸乙酯(80.0mL)的分液漏斗中，并用1N HCl溶液(50mL)洗涤，随后用饱和硫酸钠溶液(50mL)和去离子水(2×100mL)洗涤。将有机层用无水硫酸钠干燥，并在减压下浓缩以获得粗残余物。残余物经由柱色谱法(在己烷中的55-70％乙酸乙酯)纯化，以得到呈白色固体的(1R,2R)-1-((2R,3R,4S,6R)-3-乙酰胺基-4-乙酰氧基-6-(甲氧基羰基)-6-(对甲苯基硫基)四氢-2H-吡喃-2-基)-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙烷-1,2-二基二乙酸酯(实例3)。产率：4.80g，49.92％；LCMS(ESI)m/z 751.25[M+1]+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δ8.20(d,J＝9.6Hz,1H),7.82(t,J＝5.6Hz,1H),7.57-7.35(m,7H),7.17-7.01(m,6H),5.44-5.42(m,1H),5.35(dt,J＝10.4&4.8Hz,1H),4.75(dd,J＝10.4&1.8Hz,1H),4.03(d,J＝10.4Hz,2H),3.85-3.74(m,1H),3.28-4.26(m,1H),2.61(dd,J＝14.0&4.8Hz,1H),2.19(s,3H),2.08-1.96(m,7H),1.85(s,3H)。
(1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1-((2R,3R,4S,6R)-4-乙酰氧基-3-(2-乙酰氧基乙酰胺基)-6-(甲氧基羰基)-6-(对甲苯基硫基)四氢-2H-吡喃-2-基)丙烷-1,2-二基二乙酸酯(实例4)
(2R,4S,5R,6R)-5-氨基-6-((1R,2R)-3-叠氮基-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-2-(对甲苯基硫基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸甲酯(2)的合成
在0℃下，向在甲醇(210.0mL)中的(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-6-((1R,2R)-3-叠氮基-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-2-(对甲苯基硫基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸甲酯(1，21.0g，46.20mmol)的搅拌的溶液中滴加甲磺酸(18.0mL，277.2mmol)。将所得的反应混合物在63℃下搅拌持续30h。在完成之后，将反应混合物冷却至0℃并用三乙胺(约15.0mL，pH 7)淬灭。将混合物在减压下浓缩，以得到呈浅棕色凝胶的(2R,4S,5R,6R)-5-氨基-6-((1R,2R)-3-叠氮基-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-2-(对甲苯基硫基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸甲酯(2)。产率：19.0g，99.68％；LC-MS(ESI)m/z 413.57[M+1]+。
(2R,4S,5R,6R)-5-(2-乙酰氧基乙酰胺基)-6-((1R,2R)-3-叠氮基-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-2-(对甲苯基硫基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸甲酯(3)的合成
在惰性气氛中，将粗(2R,4S,5R,6R)-5-氨基-6-((1R,2R)-3-叠氮基-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-2-(对甲苯基硫基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸甲酯(2，19.0g，46.06mmol)在搅拌下溶解在干燥四氢呋喃(200.0mL)中，并冷却至0℃。在0℃下，向该溶液中缓慢地添加三乙胺(17.70mL，138.2mmol)，然后添加2-氯-2-氧代乙酸乙酯(4.95mL，46.06mmol)。在0℃下搅拌反应直到完成。将混合物在减压下浓缩，以获得粗残余物，该粗残余物然后经由柱色谱法(在己烷中的60-75％乙酸乙酯)纯化，以得到呈白色固体的(2R,4S,5R,6R)-5-(2-乙酰氧基乙酰胺基)-6-((1R,2R)-3-叠氮基-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-2-(对甲苯基硫基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸甲酯(3)。产率：15.2g，64.38％；LCMS(ESI)m/z513.42[M+1]+。
(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-叠氮基-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-(对甲苯基硫基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸甲酯(4)的合成
在0℃下，向在甲醇(150.0mL)中的(2R,4S,5R,6R)-5-(2-乙酰氧基乙酰胺基)-6-((1R,2R)-3-叠氮基-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-2-(对甲苯基硫基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸甲酯(3，15.0g，29.27mmol)的搅拌的溶液中缓慢地添加甲醇钠溶液(25％，在甲醇中，0.061mL，2.93mmol)。将反应混合物在室温下搅拌持续1h。将反应混合物冷却至0℃，并用DOWEX氢形式淬灭以保持pH 6。将混合物通过硅藻土过滤并在减压下浓缩以获得固体，将该固体用乙醚研磨并在中心漏斗上过滤以得到呈灰白色固体的(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-叠氮基-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-(对甲苯基硫基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸甲酯(4)。产率：13.0g，94.41％；LCMS(ESI)m/z,471.15[M+1]+。
(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-氨基-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-(对甲苯基硫基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸甲酯(5)的合成
在室温下，向在甲醇(130mL)中的(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-叠氮基-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-(对甲苯基硫基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸甲酯(4，13.0g，27.63mmol)的搅拌的溶液中添加10％ Pd/C(13.0g，100％w/w)。然后使用H2气体的气球压力将反应产物氢化持续12h。在完成之后，通过硅藻土过滤反应产物，并且浓缩滤液。然后在高真空下干燥所获得的残余物，以得到呈稠浆的粗(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-氨基-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-(对甲苯基硫基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸甲酯(5)。产率：12.2g，99.41％；LCMS(ESI)m/z 445.16[M+1]+。
(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-(对甲苯基硫基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸甲酯(7)的合成
在0℃下，向在四氢呋喃(40.0mL)中的(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-氨基-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-(对甲苯基硫基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸甲酯(5，12.2g，27.45mmol)和2,5-二氧代环戊基2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酸酯(6，10.19g，32.94mmol)的搅拌的溶液中添加乙基双(丙-2-基)胺(22.4mL，137.23mmol)。将所得的反应混合物在室温下搅拌持续12h。在完成之后，将混合物在减压下浓缩，以获得粗残余物。粗残余物经由柱色谱法(在己烷中的80-90％乙酸乙酯)纯化，以得到呈白色固体的(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-(对甲苯基硫基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸甲酯(7)。产率：8.0g，45.63％；LCMS(ESI)m/z 639.23[M+1]+。
(1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1-((2R,3R,4S,6R)-4-乙酰氧基-3-(2-乙酰氧基乙酰胺基)-6-(甲氧基羰基)-6-(对甲苯基硫基)四氢-2H-吡喃-2-基)丙烷-1,2-二基二乙酸酯的合成(实例4)
在0℃下，在30min内，向在吡啶(80.0mL)中的(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-(对甲苯基硫基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸甲酯(7，8.0g，12.52mmol)的搅拌的溶液中滴加乙酸酐(11.61mL，125.2mmol)。将反应混合物从0℃搅拌至室温过夜。在完成之后，在真空下除去挥发物以获得粗稠浆。然后将粗稠浆倒入具有乙酸乙酯(240.0mL)的分液漏斗中，并用1N HCl溶液洗涤，随后用饱和硫酸钠溶液洗涤。有机层经无水硫酸钠干燥，并在减压下浓缩，以获得粗稠浆。粗稠浆经由柱色谱法(在己烷中的60-70％乙酸乙酯)纯化，以得到呈白色固体的(1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1-((2R,3R,4S,6R)-4-乙酰氧基-3-(2-乙酰氧基乙酰胺基)-6-(甲氧基羰基)-6-(对甲苯基硫基)四氢-2H-吡喃-2-基)丙烷-1,2-二基二乙酸酯(实例4)。产率：5.40g,53.43％；LCMS(ESI)m/z 807.2[M+1]+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δ7.27(d,J＝8.4Hz,2H),7.14(d,J＝8.4Hz,2H),4.03(t,J＝8.4Hz,1H),3.77(d,J＝7.6Hz,2H),3.51-3.47(m,2H),3.20(t,J＝6.4Hz,2H),2.91(dd,J＝9.6,14.4Hz,1H),2.82(dd,J＝6,14Hz,1H),2.24-2.20(m,3H),2.07(d,J＝9.6Hz,1H),1.75(d,J＝12.8Hz,2H),1.68-1.62(m,2H),1.60-1.57(m,2H),1.56-1.47(m,1H)。
(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基-2-(2-(2-((1-(15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号24836)
(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基-2-(2-(2-((1-(15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号24836)的合成
向在二甲基亚砜(2.0mL)中的(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基-2-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(26334，0.025g，0.039mmol)和1-叠氮基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸全氟苯基酯(1，0.020g,0.043mmol)的搅拌的溶液中添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(0.041g，0.111mmol)。将所得的反应混合物在室温下搅拌持续30min。此后，添加乙酸(0.5mL)，并且将反应混合物用乙腈稀释并经由制备型HPLC(含0.1％ TFA的20-42％乙腈水溶液)纯化。将含有期望的产物的级分合并，并冻干至干燥，以得到呈无定形固体的(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基-2-(2-(2-((1-(15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号24836)。产率：0.018g，41.73％，LCMS，m/z 1088.53[M+1]+；1H NMR(400MHz，DMSO-d6，用D2O交换)δ8.00(d,J＝3.2Hz,1H),7.59(d,J＝7.2Hz,1H),7.46-7.36(m,4H),7.16-7.12(m,2H),6.99(d,J＝8.0Hz,2H),4.48-4.45(m,4H),3.76-3.72(m,6H),3.62-3.57(m,2H),3.56-3.43(m,23H),3.24-3.20(m,2H),2.95(t,J＝6.0Hz,2H),2.42-2.39(m,1H),1.84(s,3H),1.53-1.47(m,1H)。
(2S,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基-2-(2-(2-((1-(15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号24838)
(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基-2-(2-(2-((1-(15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号24838)的合成
向在二甲基亚砜(2.0mL)中的(2S,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基-2-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(26335，0.035g，0.055mmol)和1-叠氮基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸全氟苯基酯(1，0.028g,0.061mmol)的搅拌的溶液中添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(0.057g，0.155mmol)将所得的反应混合物在室温下搅拌持续30min。添加乙酸(0.5mL)，并且将反应混合物用乙腈稀释并经由制备型HPLC(含0.1％ TFA的18-40％乙腈水溶液)纯化。将含有期望的产物的级分合并，并冻干至干燥，以得到呈无定形固体的(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基-2-(2-(2-((1-(15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号24838)。产率：0.017g，28.15％，LCMS，m/z 1088.56[M+1]+；1H NMR(400MHz，DMSO-d6，用D2O交换)δ7.98(s,1H),7.57(d,J＝7.6Hz,1H),7.47-7.36(m,4H),7.16-7.12(m,2H),6.98(d,J＝8.0Hz,2H),4.74-4.44(m,4H),3.76-3.55(m,9H),3.50-3.42(m,17H),3.30 -3.17(m,3H),3.04(dd,J＝14.8&7.6Hz,2H),2.93(t,J＝6.0Hz,2H),2.16-2.11(m,1H),1.84(s,3H),1.53-1.47(m,1H)1.19-1.13(m,3H)。
(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基-2-(2-(2-((1-(15-氧代-3,6,9,12-四氧杂-16-氮杂十八烷基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号24839)
(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基-2-(2-(2-((1-(15-氧代-3,6,9,12-四氧杂-16-氮杂十八烷基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号24839)的合成
向在二甲基亚砜(2.0mL)中的(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基-2-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(26334，0.025g，0.039mmol)和1-叠氮基-N-乙基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺(1，0.014g，0.043mmol)的搅拌的溶液中添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(0.041g，0.111mmol)。将所得的反应混合物在室温下搅拌持续30min。此后，添加乙酸(0.5mL)，并且将反应混合物用乙腈稀释并经由制备型HPLC(含0.1％ TFA的20-42％乙腈水溶液)纯化。将含有期望的产物的级分合并，并冻干至干燥，以得到呈灰白色固体的(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基-2-(2-(2-((1-(15-氧代-3,6,9,12-四氧杂-16-氮杂十八烷基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号24839)。产率：0.026g,60.28％,LCMS,m/z 475.62[M/2+1]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.84(bs,1H),8.31(d,J＝4.8Hz,1H),8.04(s,1H),7.97(d,J＝6.8Hz,1H),7.80-7.77(m,1H),7.64(d,J＝7.6Hz,1H),7.48-7.38(m,4H),7.18-7.14(m,2H),7.02(d,J＝8.0Hz,2H),4.51-4.48(m,4H),3.81-3.72(m,4H),3.64-3.46(m,27H),3.26-3.16(m,1H),3.07-3.02(m,2H),2.65(t,J＝6.0Hz,2H),1.86(s,3H),1.55-1.49(m,1H)0.98(t,J＝7.2Hz,3H)。
(2S,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基-2-(2-(2-((1-(15-氧代-3,6,9,12-四氧杂-16-氮杂十八烷基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号24840)
(2S,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基-2-(2-(2-((1-(15-氧代-3,6,9,12-四氧杂-16-氮杂十八烷基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号24840)的合成
向在二甲基亚砜(2.0mL)中的(2S,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基-2-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(26335，0.020g，0.032mmol)和1-叠氮基-N-乙基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺(1，0.011g，0.034mmol)的搅拌的溶液中添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(0.033g，0.088mmol)。将所得的反应混合物在室温下搅拌持续30min。然后，添加乙酸(0.5mL)，并且将反应混合物用乙腈稀释并经由制备型HPLC(含0.1％ TFA的18-40％乙腈水溶液)纯化。将含有期望的产物的级分合并，并冻干至干燥，以得到呈灰白色固体的(2S,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基-2-(2-(2-((1-(15-氧代-3,6,9,12-四氧杂-16-氮杂十八烷基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号24840)。产率：0.005g，14.49％,LCMS,m/z 949.62[M/2+1]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6，用D2O交换)δ8.00(s,1H),7.59(d,J＝7.6Hz,1H),7.48-7.37(m,4H),7.17-7.13(m,2H),7.00(d,J＝8.0Hz,2H),4.49-4.46(m,4H),3.84-3.73(m,5H),3.62-3.42(m,23H),3.24-3.16(m,3H),3.02(dd,J＝14.4&7.2Hz,2H),2.25(t,J＝6.4Hz,2H),2.17-2.12(m,1H),1.84(s,3H),1.51-1.45(m,1H)0.98-0.94(m,3H)。
(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(2-(1-(15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)甲氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号24906)
(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(2-(1-(15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)甲氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号24906)的合成
向在二甲基亚砜(3mL)中的1-叠氮基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸全氟苯基酯(1，0.156g，0.342mmol)和(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-6-(丁-3-炔-1-基氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲氧基)-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(26409，0.087g，0.310mmol)的搅拌的溶液中添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(0.324g，0.869mmol)。将所得的反应混合物在室温下搅拌持续30min。之后，添加乙酸(0.5mL)，并且将反应混合物用乙腈稀释并经由制备型HPLC(含0.1％ TFA的23-41％乙腈水溶液)纯化。将含有期望的产物的级分合并，并冻干至干燥，以得到呈灰白色固体的(2-((2R,3S,4R,5S,6R)-3,4,5-三羟基-6-((1-(15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基四氢-2H-吡喃-2-基)乙基)膦酸(化合物编号24906)。产率：0.101g，44.11％，LCMS(ESI)m/z 738.20[M+1]+；1HNMR(400MHz，DMSO-d6，用D2O交换)δ4.44(t,J＝5.2Hz,2H),3.89-3.86(m,1H),3.77-3.73(m,4H),3.60-3.56(m,2H),3.53-3.46(m,13H),3.29-3.28(m,2H),2.97(t,J＝5.6Hz,2H),2.86(d,J＝7.2Hz,2H),1.82(bs,1H),1.57(bs,1H),1.46-1.31(m,2H)。
(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(2-(1-(15-氧代-3,6,9,12-四氧杂-16-氮杂十八烷基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)甲氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号24924)
(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(2-(1-(15-氧代-3,6,9,12-四氧杂-16-氮杂十八烷基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)甲氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号24924)的合成
向在二甲基亚砜(2.0mL)中的(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-6-(丁-3-炔-1-基氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲氧基)-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(26409，0.023g，0.032mmol)和1-叠氮基-N-乙基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酰胺(1，0.011g，0.032mmol)的搅拌的溶液中添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(0.029g，0.080mmol)。将所得的反应混合物在室温下搅拌持续30min。在完成之后，添加乙酸(0.3mL)，并且将反应混合物用乙腈稀释并经由制备型HPLC(含0.1％ TFA的15-35％乙腈水溶液)纯化。将含有期望的产物的级分合并，并冻干至干燥，以得到呈白色固体的作为TFA盐的(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(2-(1-(15-氧代-3,6,9,12-四氧杂-16-氮杂十八烷基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)甲氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号24924)。产率：0.006g，18.08％；LCMS(ESI)m/z 1037.75[M+1]+；1H NMR(400MHz，DMSO-d6，用D2O交换)δ7.86(s,1H),7.59(d,J＝8.0Hz,1H),7.46-7.37(m,4H),7.16-7.11(m,2H),6.99(d,J＝7.6Hz,1H),4.42(t,J＝5.0Hz,2H),4.13(d,J＝6.8Hz,1H),3.91-3.85(m,1H),3.79-3.73(m,6H),3.63-3.60(m,2H),3.56-3.52(m,5H),3.49-3.43(m,15H),3.27-3.21(m,4H),3.02(ABq,J＝7.6Hz,2H),2.83-2.80(m,2H),2.25(t,J＝6.4Hz,1H),1.83(s,3H),1.57-1.51(m,1H),0.96(t,J＝7.2Hz,3H)。
(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(2-(1-(15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)甲氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号26288)
(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-(2-(2-((1-(15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号26288)的合成
向在二甲基亚砜(0.5mL)中的(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(26463，0.035g，0.054mmol)和1-叠氮基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸全氟苯基酯(1，0.025g，0.054mmol)的搅拌的溶液中添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(0.050g，0.135mmol)。将所得的反应混合物在室温下搅拌持续30min。在完成之后，添加乙酸(0.3mL)。将所得的溶液用乙腈稀释并经由制备型HPLC(含0.1％ TFA的19-35％乙腈水溶液)纯化。将含有期望的产物的级分合并，并冻干至干燥，以得到呈白色固体的作为TFA盐的(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-(2-(2-((1-(15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号26288)。产率：0.022g，36.77％；LCMS(ESI)m/z1102.72[M+1]+；1H NMR(400MHz，DMSO-d6，用D2O交换)δ7.98(d,J＝3.6Hz,2H),7.59(d,J＝7.2Hz,2H),7.56-7.52(m,2H),7.42(t,J＝8.0Hz,2H),7.33-7.31(m,3H),4.46(s,4H),4.11(m,2H),3.55-3.40(m,22H),3.19(d,J＝9.2Hz,2H),2.99-2.92(m,5H),2.45-2.43(m,6H),2.50(m,1H),1.20(s,1H)。
(2R,2'R,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-2,2'-(((((((S)-9,14,22-三氧代-16-((15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)氨基甲酰基)-3,6,25,28-四氧杂-10,15,21-三氮杂三十烷-1,30-二基)双(1H-1,2,3-三唑-1,4-二基))双(亚甲基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(5-乙酰胺基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸)(化合物编号26289)
(2R,2'R,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-2,2'-(((((((S)-9,14,22-三氧代-16-((15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)氨基甲酰基)-3,6,25,28-四氧杂-10,15,21-三氮杂三十烷-1,30-二基)双(1H-1,2,3-三唑-1,4-二基))双(亚甲基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(5-乙酰胺基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸)(化合物编号26289)的合成
向在二甲基亚砜(0.5mL)中的(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基-2-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(26334，0.025g，0.039mmol)和(S)-1-叠氮基-16-(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-9,14,17-三氧代-3,6,21,24,27,30-六氧杂-10,15,18-三氮杂三十三烷-33-酸全氟苯基酯(26332，0.020g，0.019mmol)的搅拌的溶液中添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(0.036g，0.099mmol)。将所得的反应混合物在室温下搅拌持续30min。通过LC-MS监测反应进程，并且在完成之后，添加乙酸(0.3mL)。将所得的溶液用乙腈稀释并经由制备型HPLC(含0.1％ TFA的25-44％乙腈水溶液)纯化。将含有期望的产物的级分合并，并冻干至干燥，以得到呈白色固体的作为TFA盐的(2R,2'R,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-2,2'-(((((((S)-9,14,22-三氧代-16-((15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)氨基甲酰基)-3,6,25,28-四氧杂-10,15,21-三氮杂三十烷-1,30-二基)双(1H-1,2,3-三唑-1,4-二基))双(亚甲基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(5-乙酰胺基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸)(化合物编号26289)。产率：0.012g，27.67％；LCMS(ESI)m/z 738.20[M+1]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6，用D2O交换)δ7.98(s,2H),7.58(d,J＝8.0Hz,2H),7.46-7.36(m,9H),7.16-7.12(m,4H),6.98(d,J＝7.6Hz,4H),4.46-4.43(m,9H),4.11(m,2H),3.53-3.35(m,56H),3.23-3.21(m,5H),3.14(bs,2H),2.97-2.93(m,9H),2.25-2.22(m,6H),2.08(bs,4H),1.83(s,6H),1.56-1.44(m,8H),1.49-1.44(m,2H),1.33-1.27(m,4H),1.20(bs,5H),0.98(d,J＝6.8Hz,2H)。
(S)-1-叠氮基-16-(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-9,14,17-三氧代-3,6,21,24,27,30-六氧杂-10,15,18-三氮杂三十三烷-33-酸全氟苯基酯(化合物编号26332)
(S)-1-叠氮基-16-(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-9,14,17-三氧代-3,6,21,24,27,30-六氧杂-10,15,18-三氮杂三十三烷-33-酸全氟苯基酯(化合物编号26332)的合成
向在0℃的四氢呋喃(10.0mL)中的(S)-1-叠氮基-16-(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-9,14,17-三氧代-3,6,21,24,27,30-六氧杂-10,15,18-三氮杂三十三烷-33-酸(26337，1.0g，1.18mmol)的搅拌的溶液中添加2,3,4,5,6-五氟苯酚(1，0.434g，2.36mmol)和N,N′-二异丙基碳二亚胺(0.461mL，2.94mmol)。将所得的反应混合物在室温下搅拌持续24h。在完成之后，将溶剂浓缩并经由制备型HPLC(含0.1％ TFA的30-75％乙腈水溶液)纯化。将含有期望的产物的级分合并，并冻干至干燥，以得到呈灰白色固体的(S)-1-叠氮基-16-(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-9,14,17-三氧代-3,6,21,24,27,30-六氧杂-10,15,18-三氮杂三十三烷-33-酸全氟苯基酯(化合物编号26332)。产率：0.291g，24％；ELSD(ESI)m/z 1015.6[M+1]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.92(t,J＝11.6Hz,1H),7.85-7.80(m,2H),7.78(t,J＝11.2Hz,1H),4.19-4.14(m,1H),3.78(t,J＝12.0Hz,2H),3.61-3.49(m,29H),3.38-3.35(m,5H),3.25-3.13(m,3H),3.07-2.99(m,6H),2.32-2.26(m,4H),1.62-1.20(m,9H)。
(16S,19S)-1-叠氮基-16,19-双(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-9,14,17,20-四氧代-3,6,24,27,30,33-六氧杂-10,15,18,21-四氮杂三十六烷-36-酸全氟苯基酯(化合物编号26333)
(16S,19S)-1-叠氮基-16,19-双(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-9,14,17,20-四氧代-3,6,24,27,30,33-六氧杂-10,15,18,21-四氮杂三十六烷-36-酸全氟苯基酯(化合物编号26333)的合成
向在0℃的四氢呋喃(20.0mL)中的(16S,19S)-1-叠氮基-16,19-双(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-9,14,17,20-四氧代-3,6,24,27,30,33-六氧杂-10,15,18,21-四氮杂三十六烷-36-酸(26338，1.5g，1.29mmol)的搅拌的溶液中添加2,3,4,5,6-五氟苯酚(1，0.475g，2.58mmol)和N,N′-二异丙基碳二亚胺(0.472mL，3.22mmol)。将所得的反应混合物在室温下搅拌持续24h。在完成之后，浓缩溶剂以获得残余物，该残余物然后经由制备型HPLC(含0.1％ TFA的20-55％乙腈水溶液)纯化。将期望的级分合并，并冻干至干燥，以得到呈灰白色粘性固体的(16S,19S)-1-叠氮基-16,19-双(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-9,14,17,20-四氧代-3,6,24,27,30,33-六氧杂-10,15,18,21-四氮杂三十六烷-36-酸全氟苯基酯(化合物编号26333)。产率：0.556g，32.25％；LC-MS(ESI)m/z 1329.09[M+1]+1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.98-7.68(m,6H),4.16(bs,2H),3.78(t,J＝11.6Hz,2H),3.59-3.49(m,35H),3.38-3.33(m,9H),3.21-3.17(m,4H),3.03-2.99(m,9H),2.30-2.27(m,6H),2.14(t,J＝14.4Hz,2H),1.60-1.57(m,4H),1.48-1.23(m,10H)。
(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基-2-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号26334)和(2S,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基-2-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号26335)
(1R,2R)-1-((2R,3R,4S,6R)-3-乙酰胺基-4-乙酰氧基-6-(甲氧基羰基)-6-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙烷-1,2-二基二乙酸酯(3)的合成
向在干燥二氯甲烷(20.0mL)中的(1R,2R)-1-((2R,3R,4S,6S)-3-乙酰胺基-4-乙酰氧基-6-(甲氧基羰基)-6-(对甲苯基硫基)四氢-2H-吡喃-2-基)-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙烷-1,2-二基二乙酸酯(1，1.0g，1.33mmol)和2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙-1-醇(2，0.288g，2.0mmol)的搅拌的溶液中添加分子筛(1.0g，100％w/w)。将所得的反应混合物在氮气气氛中搅拌持续12h。然后，在-45℃下添加1-碘代吡咯烷-2,5-二酮(0.576g，2.56mmol)和三氟甲磺酸(0.094mL，1.066mmol)。将所得的反应混合物在-45℃下搅拌持续1h。在完成之后，将反应混合物用三甲胺淬灭直至中性pH，通过硅藻土过滤，用二氯甲烷稀释，并用碳酸氢钠水溶液洗涤，随后用DM水洗涤。浓缩有机层以获得粗残余物，该粗残余物然后经由快速柱色谱法(在乙酸乙酯中的5-7.5％甲醇)纯化。将期望的级分浓缩并干燥，以得到作为异头混合物的呈白色固体的(1R,2R)-1-((2R,3R,4S,6R)-3-乙酰胺基-4-乙酰氧基-6-(甲氧基羰基)-6-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙烷-1,2-二基二乙酸酯(3)。产率：1.0g，97.41％；LCMS(ESI)m/z771.79。
(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基-2-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号26334)和(2S,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基-2-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号26335)的合成
在0℃下，向在乙醇(10.0mL)中的(1R,2R)-1-((2R,3R,4S,6R)-3-乙酰胺基-4-乙酰氧基-6-(甲氧基羰基)-6-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙烷-1,2-二基二乙酸酯(3，1.0g，1.302mmol)的搅拌的溶液中添加氢氧化锂(0.186g，7.78mmol)。将所得的反应混合物在室温下搅拌持续4h。在完成之后，添加Dowex氢形式直至pH 6，并过滤反应物料。浓缩滤液并干燥以获得粗残余物，该粗残余物然后用乙腈稀释并经由制备型HPLC(含0.1％TFA的22-38％乙腈水溶液)纯化。将含有期望的产物的级分分别合并，并冻干至干燥，以得到作为TFA盐的呈稠浆的(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基-2-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号26334)。产率：0.24g，29.33％；LCMS(ESI)m/z 631.55[M+1]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.36(t,J＝5.4Hz,1H),8.06(d,J＝7.6Hz,1H),7.65(d,J＝8.0Hz,1H),7.50-7.39(m,4H),7.17-7.15(m,2H),7.02(d,J＝8.0Hz,2H),4.83(bs,2H),4.13(d J＝2.0Hz,1H),3.76-3.71(m,4H),3.59-3.14(m,14H),2.17(dd,J＝12.8&4.8Hz,1H),1.87(s,3H),1.49(t,J＝12.0Hz,1H)；作为TFA盐的呈白色固体的(2S,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基-2-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号26335)。产率：0.23g，28.11％；LCMS(ESI)m/z 631.55[M+1]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.32(t,J＝5.2Hz,1H),7.99(d,J＝7.2Hz,1H),7.64(d,J＝7.6Hz,1H),7.48-7.39(m,4H),7.18-7.14(m,2H),7.30(d,J＝6.8Hz,2H),4.33(bs,1H),4.11(d J＝2.0Hz,1H),3.82-3.73(m,2H),3.66-3.24(m,11H),3.25-3.21(m,1H),1.88(s,3H),1.52(t,J＝12.0Hz,1H)。
(S)-1-叠氮基-16-(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-9,14,17-三氧代-3,6,21,24,27,30-六氧杂-10,15,18-三氮杂三十三烷-33-酸(化合物编号26337)
N6-((苄氧基)羰基)N2-(4-(((苄氧基)羰基)氨基)丁酰基)-L-赖氨酸甲酯(3)的合成
向N6-((苄氧基)羰基)-L-赖氨酸甲酯盐酸盐(1，5.00g，19.5mmol)的溶液中添加在N,N-二甲基甲酰胺(50.0mL)中的4-(((苄氧基)羰基)氨基)丁酸(2，4.63g，17.0mmol)、[(二甲基氨基)({3H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-3-基氧基})亚甲基]二甲基氮鎓；六氟-λ5-磷酸盐(8.07g，21.2mmol)和二异丙基乙胺(11.0mL，59.5mmol)。将所得的反应混合物在室温下搅拌持续8h。在完成之后，用饱和碳酸氢钠溶液稀释反应混合物，并用二氯甲烷提取。有机层经硫酸钠干燥，过滤，并在高真空下浓缩，以获得粗残余物，该粗残余物经快速柱色谱法(在己烷中的50-70％乙酸乙酯)纯化。在减压下浓缩期望的级分，以得到呈灰白色固体的N6-((苄氧基)羰基)N2-(4-(((苄氧基)羰基)氨基)丁酰基)-L-赖氨酸甲酯(3)。产率：7.0g，90.25％；LC-MS(ESI)m/z 514.2[M+1]+。
N6-((苄氧基)羰基)N2-(4-(((苄氧基)羰基)氨基)丁酰基)-L-赖氨酸(4)的合成
在室温下，向在甲醇(25.0mL)、四氢呋喃(25.0mL)和水(5.0mL)中的N6-((苄氧基)羰基)-N2-(4-(((苄氧基)羰基)氨基)丁酰基)-L-赖氨酸甲酯(3，7.0g，13.6mmol)的溶液中添加氢氧化锂(0.979g，40.9mmol)。将所得的混合物在40℃下搅拌持续4h。在完成之后，用1N HCl溶液(pH 4)酸化反应混合物，并用乙酸乙酯提取。有机层经硫酸钠干燥，过滤，并在高真空下浓缩，以得到呈灰白色固体的粗N6-((苄氧基)羰基)-N2-(4-(((苄氧基)羰基)氨基)丁酰基)-L-赖氨酸(4)。产率：6.0g，94.25％；LCMS(ESI)m/z 500.2[M+1]+。
(S)-10-(4-(((苄氧基)羰基)氨基)丁基)-3,8,11-三氧代-1-苯基-2,15,18,21,24-五氧杂-4,9,12-三氮杂二十七烷-27-酸叔丁酯(6)的合成
向在0℃的四氢呋喃(30.0mL)中的N6-((苄氧基)羰基)-N2-(4-(((苄氧基)羰基)氨基)丁酰基)-L-赖氨酸(4，3.0g，6.01mmol)的溶液中添加2,3,4,5,6-五氟苯酚(2.21g，12.0mmol)和N,N′-二异丙基碳二亚胺(1.91mL，15.0mmol)。将所得的反应混合物在室温下搅拌持续4h。在室温下，添加1-氨基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸叔丁酯(5,2.32g，7.21mmol)，并将反应混合物搅拌持续12h。在完成之后，在高真空下浓缩溶剂，以获得粗残余物，该粗残余物然后经由快速柱色谱法(在己烷中的70-100％乙酸乙酯)纯化。在减压下浓缩期望的级分，以得到呈浅黄色粘性物的(S)-10-(4-(((苄氧基)羰基)氨基)丁基)-3,8,11-三氧代-1-苯基-2,15,18,21,24-五氧杂-4,9,12-三氮杂二十七烷-27-酸叔丁酯(6)。产率：4.0g，84.25％；LC-MS(ESI)m/z 803.41[M+1]+。
(S)-23-氨基-18-(4-氨基丁基)-17,20-二氧代-4,7,10,13-四氧杂-16,19-二氮杂二十三烷酸叔丁酯(7)的合成
在室温下，在氮气下，向在甲醇(50mL)中的(S)-10-(4-(((苄氧基)羰基)氨基)丁基)-3,8,11-三氧代-1-苯基-2,15,18,21,24-五氧杂-4,9,12-三氮杂二十七烷-27-酸叔丁酯(6，4.0g，4.98mmol)的搅拌的溶液中添加10％碳载钯(4.0g，100％w/w)。将所得的混合物在氢气压力下在室温下搅拌持续12h。将反应混合物通过硅藻土过滤，并用甲醇洗涤。在真空下浓缩滤液，以得到呈灰白色固体的(S)-23-氨基-18-(4-氨基丁基)-17,20-二氧代-4,7,10,13-四氧杂-16,19-二氮杂二十三烷酸叔丁酯(7)。产率：2.0g，75％；ELSD(ESI)m/z803.4[M+1]+。
(S)-1-叠氮基-16-(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-9,14,17-三氧代-3,6,21,24,27,30-六氧杂-10,15,18-三氮杂三十三烷-33-酸叔丁酯(9)的合成
向在0℃的四氢呋喃(40.0mL)中的(S)-23-氨基-18-(4-氨基丁基)-17,20-二氧代-4,7,10,13-四氧杂-16,19-二氮杂二十三烷酸叔丁酯(7，2.0g，3.74mmol)的溶液中添加2,5-二氧杂吡咯烷-1-基3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酸酯(2.25g，7.48mmol)。将所得的反应混合物在室温下搅拌持续4h。在完成之后，在高真空下浓缩溶剂以获得粗残余物，该粗残余物然后经由快速柱色谱法(在二氯甲烷中的0-7.5％甲醇)纯化。在减压下浓缩期望的级分，以得到呈浅黄色粘稠液体的(S)-1-叠氮基-16-(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基-9,14,17-三氧代-3,6,21,24,27,30-六氧杂-10,15,18-三氮杂三十三烷-33-酸叔丁酯(9)。产率：1.10g，32.25％；ELSD(ESI)m/z 905.4[M+1]+。
(S)-1-叠氮基-16-(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-9,14,17-三氧代-3,6,21,24,27,30-六氧杂-10,15,18-三氮杂三十三烷-33-酸(化合物编号26337)的合成
在0℃下，向在二氯甲烷(10mL)中的(S)-1-叠氮基-16-(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-9,14,17-三氧代-3,6,21,24,27,30-六氧杂-10,15,18-三氮杂三十三烷-33-酸叔丁酯(9，1.1g，1.21mmol)的溶液中添加三氟乙酸(5.0mL)。将所得的混合物在氮气下在室温下搅拌持续4h。在完成之后，浓缩反应混合物，用乙醚洗涤，并干燥，以得到呈浅黄色粘稠液体的(S)-1-叠氮基-16-(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-9,14,17-三氧代-3,6,21,24,27,30-六氧杂-10,15,18-三氮杂三十三烷-33-酸(化合物编号26337)。产率：1.0g，99.25％；ELSD(ESI)m/z 849.6[M+1]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.0(bs,1H),7.92(t,J＝11.6Hz,1H),7.85-7.80(m,2H),7.78(t,J＝11.2Hz,1H),4.20-4.15(m,1H),3.63-3.49(m,31H),3.40-3.36(m,5H),3.25-3.17(m,2H),3.15-3.07(m,4H),2.45-2.42(m,2H),2.32-2.26(m,4H),2.13(t,J＝14.8Hz,2H),1.62-1.14(m,8H)。
(16S,19S)-1-叠氮基-16,19-双(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-9,14,17,20-四氧代-3,6,24,27,30,33-六氧杂-10,15,18,21-四氮杂三十六烷-36-酸(化合物编号26338)
N6-((苄氧基)羰基)N2-(N6-((苄氧基)羰基)N2-(4-(((苄氧基)羰基)氨基)丁酰基)-L-赖氨酰基)-L-赖氨酸甲酯(3)的合成
向在0℃的N,N-二甲基甲酰胺(50.0mL)中的N6-((苄氧基)羰基)N2-(4-(((苄氧基)羰基)氨基)丁酰基)-L-赖氨酸(1，6.0g，12.0mmol)的搅拌的溶液中添加N6-((苄氧基)羰基)L-赖氨酸甲酯(2，4.24g，14.4mmol)，随后添加[(二甲基氨基)({3H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-3-基氧基})亚甲基]二甲基氮鎓；六氟-λ5-磷酸盐(9.59g，25.2mmol)和乙基双(丙-2-基)胺(7.32mL，42.0mmol)。将所得的反应混合物在室温下搅拌持续12h。在完成之后，用饱和碳酸氢钠溶液稀释反应混合物，并用乙酸乙酯提取。有机层经硫酸钠干燥，过滤，并在高真空下浓缩，以获得粗残余物。粗残余物经由快速柱色谱法(在己烷中的50-70％乙酸乙酯)纯化，以得到呈灰白色固体的N6-((苄氧基)羰基)N2-(N6-((苄氧基)羰基)N2-(4-(((苄氧基)羰基)氨基)丁酰基)-L-赖氨酰基)-L-赖氨酸甲酯(3)。产率：9.0g，96.25％；LCMS(ESI)m/z 776.54[M+1]+。
N6-((苄氧基)羰基)N2-(N6-((苄氧基)羰基)N2-(4-(((苄氧基)羰基)氨基)丁酰基)-L-赖氨酰基)-L-赖氨酸(4)的合成
向在甲醇(30.0mL)和四氢呋喃(15.0mL)中的N6-((苄氧基)羰基)N2-(N6-((苄氧基)羰基)N2-(4-(((苄氧基)羰基)氨基)丁酰基)-L-赖氨酰基)-L-赖氨酸甲酯(3，9.0g，11.6mmol)的搅拌的溶液中添加溶解在水(1.0mL)中的氢氧化锂(0.833g，34.8mmol)。将所得的混合物在40℃下搅拌持续16h。在完成之后，浓缩反应混合物，将粗残余物溶解在水中，并用1N盐酸溶液酸化直至pH 4，并用乙酸乙酯提取。分离有机层，用无水硫酸钠干燥，并在减压下浓缩，以得到呈灰白色固体的N6-((苄氧基)羰基)N2-(N6-((苄氧基)羰基)N2-(4-(((苄氧基)羰基)氨基)丁酰基)-L-赖氨酰)-L-赖氨酸(4)。产率：8.0g，90％；LCMS(ESI)m/z762.43[M+1]+。
(10S,13S)-10,13-双(4-(((苄氧基)羰基)氨基)丁基)-3,8,11,14-四氧代-1-苯基-2,18,21,24,27-五氧杂-4,9,12,15-四氮杂三十烷-30-酸叔丁酯(6)的合成
向在0℃的四氢呋喃(40.0mL)中的N6-((苄氧基)羰基)N2-(N6-((苄氧基)羰基)N2-(4-(((苄氧基)羰基)氨基)丁酰基)-L-赖氨酰基)-L-赖氨酸(4，4.0g，5.25mmol)的搅拌的溶液中添加2,3,4,5,6-五氟苯酚(1.93g，12.0mmol)和N,N'-二异丙基碳二亚胺(1.67mL，13.1mmol)。将所得的反应混合物在室温下搅拌持续4h。向反应混合物中添加1-氨基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸叔丁酯(5，2.03g，6.30mmol)。将所得的反应混合物在室温下搅拌持续12h。在完成之后，在高真空下浓缩溶剂，以得到粗残余物，该粗残余物然后经由快速柱色谱法(在己烷中的70-100％乙酸乙酯)纯化。在减压下浓缩期望的级分，以得到呈浅黄色半固体的(10S,13S)-10,13-双(4-(((苄氧基)羰基)氨基)丁基)-3,8,11,14-四氧代-1-苯基-2,18,21,24,27-五氧杂-4,9,12,15-四氮杂三十烷-30-酸叔丁酯(6)。产率：5.0g，89.25％；LC-MS(ESI)m/z 1065.8[M+1]+。
(18S,21S)-26-氨基-18,21-双(4-氨基丁基)-17,20,23-三氧代-4,7,10,13-四氧杂-16,19,22-三氮杂二十六烷酸叔丁酯(7)的合成
在室温下，在氮气下，向在甲醇(40.0mL)中的(10S,13S)-10,13-双(4-(((苄氧基)羰基)氨基)丁基)-3,8,11,14-四氧代-1-苯基-2,18,21,24,27-五氧杂-4,9,12,15-四氮杂三十烷-30-酸叔丁酯(6，5.0g，4.69mmol)的搅拌的溶液中添加10％的碳载钯(5.0g，100％w/w)。将所得的混合物在氢气压力下在室温下搅拌持续12h。将反应混合物通过硅藻土过滤，并用甲醇洗涤。在真空下浓缩滤液，以得到呈浅黄色粘稠液体的(18S,21S)-26-氨基-18,21-双(4-氨基丁基)-17,20,23-三氧代-4,7,10,13-四氧杂-16,19,22-三氮杂二十六烷酸叔丁酯(7)。产率：3.0g，96.23％；ELSD(ESI)m/z 663.5[M+1]+。
(16S,19S)-1-叠氮基-16,19-双(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-9,14,17,20-四氧代-3,6,24,27,30,33-六氧杂-10,15,18,21-四氮杂三十六烷-36-酸叔丁酯(9)的合成
向在0℃的四氢呋喃(30.0mL)中的(18S,21S)-26-氨基-18,21-双(4-氨基丁基)-17,20,23-三氧代-4,7,10,13-四氧杂-16,19,22-三氮杂二十六烷酸叔丁酯(7，3.0g，4.53mmol)的搅拌的溶液中添加2,5-二氧代吡咯烷-1-基3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酸酯(8，4.08g，13.6mmol)。将所得的反应混合物在室温下搅拌持续4h。在完成之后，在高真空下浓缩溶剂以获得粗残余物，该粗残余物然后经由快速柱色谱法(在二氯甲烷中的0-7.5％甲醇)纯化。在减压下浓缩期望的级分，以得到呈浅黄色粘稠液体的(16S,19S)-1-叠氮基-16,19-双(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-9,14,17,20-四氧代-3,6,24,27,30,33-六氧杂-10,15,18,21-四氮杂三十六烷-36-酸叔丁酯(9)。产率：2.2g，39.30％；ELSD(ESI)m/z 1217.6[M+1]+。
(16S,19S)-1-叠氮基-16,19-双(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-9,14,17,20-四氧代-3,6,24,27,30,33-六氧杂-10,15,18,21-四氮杂三十六烷-36-酸(化合物编号26338)的合成
在0℃下，向在二氯甲烷(20mL)中的(16S,19S)-1-叠氮基-16,19-双(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-9,14,17,20-四氧代-3,6,24,27,30,33-六氧杂-10,15,18,21-四氮杂三十六烷-36-酸叔丁酯(9，2.2g，1.80mmol)的搅拌的溶液中添加三氟乙酸(5.0mL)。将所得的反应混合物在氮气下在室温下搅拌持续4h。在完成之后，浓缩反应混合物，用乙醚洗涤，并干燥，以得到呈灰白色粘稠液体的(16S,19S)-1-叠氮基-16,19-双(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-9,14,17,20-四氧代-3,6,24,27,30,33-六氧杂-10,15,18,21-四氮杂三十六烷-36-酸(化合物编号26338)。产率：1.4g，70.35％；ELSD(ESI)m/z 1161.4[M-1]-。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.0(bs,1H),7.97-7.77(m,5H),4.16(bs,2H),3.60-3.57(m,14H),3.53-3.48(m,24H),3.38-3.19(m,14H),2.94(bs,9H),2.43-2.42(m,8H),2.30-2.27(m,5H),2.14(t,J＝15.2Hz,2H),1.62-1.59(m,4H),1.49-1.48(m,2H),1.37-1.23(m,8H)。
(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-乙酰氧基-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-6-(丁-3-炔-1-基氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲氧基)-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号26339)和(2S,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-乙酰氧基-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-6-(丁-3-炔-1-基氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲氧基)-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号26411)
(2R,3S,4S,5R,6R)-2-((((2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二乙酰氧基丙基)-4-乙酰氧基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-(甲氧基羰基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)-6-(丁-3-炔-1-基氧基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三基三苯甲酸酯(3)的合成
向在干燥的二氯甲烷(30mL)中的(1R,2R)-3-(2-([1,1'-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1-((2R,3R,4S,6S)-4-乙酰氧基-3-(2-乙酰氧基乙酰胺基)-6-(甲氧基羰基)-6-(对甲苯基硫基)四氢-2H-吡喃-2-基)丙烷-1,2-二基二乙酸酯(1，1.50g，1.86mmol)和(2R,3R,4S,5S,6R)-2-(丁-3-炔-1-基氧基)-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三基三苯甲酸酯(2，2.53g，4.65mmol)的搅拌的溶液中添加分子筛(1.50g，100％w/w)。将所得的反应混合物在氮气气氛中搅拌持续12h。在将反应混合物冷却至-45℃之后，添加1-碘吡咯烷-2,5-二酮(1.05g，4.65mmol)，随后滴加三氟甲磺酸(0.164mL，1.86mmol)。将反应混合物在-45℃下搅拌持续30min。在完成之后，将反应混合物用三甲胺淬灭直至中性pH，通过硅藻土过滤，用二氯甲烷稀释，并用碳酸氢钠水溶液洗涤，然后用DM水洗涤。浓缩有机层以获得粗残余物，该粗残余物然后经由快速柱色谱法(在乙酸乙酯中的5-7.5％甲醇)纯化。浓缩并干燥期望的级分，以得到作为不可分离的异头混合物的呈白色固体的(2R,3S,4S,5R,6R)-2-((((2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二乙酰氧基丙基)-4-乙酰氧基-5-(2-乙酰氧基乙酰胺基)-2-(甲氧基羰基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)-6-(丁-3-炔-1-基氧基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三基三苯甲酸酯(3)。产率：1.40g，63.54％；LCMS(ESI)m/z 1186.20[M+1]+。
(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-乙酰氧基-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-6-(丁-3-炔-1-基氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲氧基)-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号26339)和(2S,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-乙酰氧基-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-6-(丁-3-炔-1-基氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲氧基)-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号26411)的合成
在0℃下，向在甲醇(5.0mL)中的(2R,3S,4S,5R,6R)-2-((((2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二乙酰氧基丙基)-4-乙酰氧基-5-(2-乙酰氧基乙酰胺基)-2-(甲氧基羰基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)-6-(丁-3-炔-1-基氧基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三基三苯甲酸酯(3，1.40g，1.18mmol)的搅拌的溶液中添加在水(1.0mL)中的氢氧化锂(0.071g，2.95mmol)的溶液。将反应混合物在室温下搅拌持续4h。在完成之后，添加Dowex氢形式直至pH 6，并且过滤反应物料。将滤液浓缩并干燥以获得粗残余物，该粗残余物用乙腈稀释并经由制备型HPLC(含0.1％ TFA的17-35％乙腈水溶液)纯化。将含有期望的产物的级分分别合并，并冻干至干燥，以得到作为TFA盐的呈白色固体的(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-乙酰氧基-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-6-(丁-3-炔-1-基氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲氧基)-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号26339)。产率：0.12g；13.11％；LCMS(ESI)m/z 733.18[M+1]+；1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δ7.99-7.97(m,1H),7.88(d,J＝7.2Hz,1H),7.61-7.57(m,4H),7.43-7.37(m,4H),7.31(t,J＝7.6Hz,1H),4.25(d,J＝7.2Hz,1H),4.01(s,2H),3.94-3.88(m,3H),3.86-3.82(m,3H),3.79-3.63(m,5H),3.60(s,2H),3.52-3.44(m,2H),3.38(d,J＝8.4Hz,1H),2.70(dd,J＝13.2&3.6Hz,1H),2.49(dt,J＝7.6&2.8 2H),2.25(t,J＝2.8Hz,1H),1.75(t,J＝13.2Hz,1H)；作为TFA盐的呈白色固体的(2S,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-乙酰氧基-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-6-(丁-3-炔-1-基氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲氧基)-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号26411)。产率：0.230g，25.13％；LCMS(ESI)m/z 733.24[M+1]+；1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δ8.06-8.04(m,1H),7.89(d,J＝9.2Hz,1H),7.61-7.57(m,4H),7.43-7.36(m,4H),7.31(t,J＝7.6Hz,1H),4.26(d,J＝7.2Hz,1H),4.16-4.13(m,1H),4.04-4.02(m,3H),3.94-3.83(m,5H),3.71-3.64(m,3H),3.60(s,2H),3.53-3.44(m,3H),3.39(d,J＝9.2Hz,1H),2.50(dt,J＝7.2&2.4 2H),2.40(dd,J＝12.8&4.4Hz,1H),2.25(t,J＝2.4Hz,1H),1.66(t,J＝12.8Hz,1H)。
(2S,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(2-(1-(15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)甲氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号26373)
(2S,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(2-(1-(15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)甲氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号26373)的合成
向在带有搅拌棒的1打兰小瓶中的NMP(0.3mL)中的(2S,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-6-(丁-3-炔-1-基氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲氧基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(26411，1.00当量，19.5mg，0.0266mmol)的溶液中添加在NMP(0.3mL)中1-叠氮基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸全氟苯基酯(1，1.10当量，13.4mg，0.0293mmol)的溶液，随后添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(2.50当量，24.8mg，0.0665mmol)。将得到的透明绿色溶液加盖，并在室温下搅拌持续10min。用乙酸稀释反应产物，过滤，并经由制备型HPLC(含0.1％ TFA的20-100％乙腈水溶液)纯化。将含有期望的产物的级分合并，并冻干至干燥，以得到呈白色固体的(2S,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(2-(1-(15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)甲氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号26373)。产率：19.4mg，61％；LCMS m/z 1190.8[M+1]+；1H NMR(300MHz，DMSO，采用D2O)δ7.87(s,1H),7.75(d,J＝8.8Hz,1H),7.64-7.52(m,4H),7.47-7.39(m,2H),7.36-7.28(m,3H),4.42(t,J＝5.0Hz,2H),4.20-4.11(m,1H),4.07-3.58(m,9H),3.57-3.38(m,16H),3.36-2.81(m,14H),2.19-2.08(m,1H),1.48(t,J＝12.1Hz,1H)。
(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-6-(丁-3-炔-1-基氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲氧基)-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号26409)和(2S,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-6-(丁-3-炔-1-基氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲氧基)-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号26410)
(2R,3S,4S,5R,6R)-2-((((2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-4-乙酰氧基-6-((1R,2R)-1,2-二乙酰氧基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-2-(甲氧基羰基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)-6-(丁-3-炔-1-基氧基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三基三苯甲酸酯(3)的合成
向在干燥二氯甲烷(20mL)中的(1R,2R)-1-((2R,3R,4S,6S)-3-乙酰胺基-4-乙酰氧基-6-(甲氧基羰基)-6-(对甲苯基硫基)四氢-2H-吡喃-2-基)-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙烷-1,2-二基二乙酸酯(1，0.50g，0.665mmol)和(2R,3R,4S,5S,6R)-2-(丁-3-炔-1-基氧基)-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三基三苯甲酸酯(2，0.543g，0.998mmol)的搅拌的溶液中添加分子筛(0.50g，100％w/w)。将所得的反应混合物在氮气气氛中搅拌持续12h。然后，在-45℃下添加1-碘吡咯烷-2,5-二酮(0.288g，1.28mmol)和三氟甲磺酸(0.047mL，0.533mmol)。将所得的反应混合物在-45℃下搅拌持续30min。在完成之后，将反应混合物用三甲胺淬灭直至中性pH，通过硅藻土过滤，用二氯甲烷稀释，并用碳酸氢钠水溶液洗涤，随后用DM水洗涤。浓缩有机层以获得粗残余物，该粗残余物然后经由快速柱色谱法(在乙酸乙酯中的5-7.5％甲醇)纯化。浓缩并干燥期望的级分，以得到作为异头混合物的呈黄色无定形固体的(2R,3S,4S,5R,6R)-2-((((2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-4-乙酰氧基-6-((1R,2R)-1,2-二乙酰氧基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-2-(甲氧基羰基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)-6-(丁-3-炔-1-基氧基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三基三苯甲酸酯(3)。产率：0.60g，76.93％；LCMS(ESI)m/z 1172.17[M+1]+。
(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-6-(丁-3-炔-1-基氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲氧基)-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号26409)和(2S,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-6-(丁-3-炔-1-基氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲氧基)-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号26410)的合成
向在0℃的乙醇(5.0mL)中的(2R,3S,4S,5R,6R)-2-((((2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-4-乙酰氧基-6-((1R,2R)-1,2-二乙酰氧基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-2-(甲氧基羰基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)-6-(丁-3-炔-1-基氧基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三基三苯甲酸酯(3，0.60g，0.512mmol)的搅拌的溶液中添加氢氧化锂(0.129g，3.07mmol)。将反应混合物在室温下搅拌持续4h。在完成之后，添加Dowex氢形式直至pH 6，并且过滤反应物料。将滤液浓缩并干燥以获得粗残余物，该粗残余物然后用乙腈稀释并经由制备型HPLC(含0.1％ TFA的15-35％乙腈水溶液)纯化。将含有期望的产物的级分分别合并，并冻干至干燥，以得到作为TFA盐的呈白色固体的(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-6-(丁-3-炔-1-基氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲氧基)-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号26409)。产率：0.045g，12％；LCMS(ESI)m/z 719.57[M+1]+；1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δ8.28-8.26(m,1H),8.15-8.12(m,1H),7.58(d,J＝7.6Hz,1H),7.48-7.35(m,4H),7.15-7.11(m,2H),7.01(d,J＝8.0Hz,2H),4.21(t,J＝3.6Hz,1H),4.04-4.00(m,2H),3.91-3.77(m,2H),3.72-3.57(m,6H),3.49-3.45(m,3H),3.39(d,J＝8.8Hz,1H),2.83-2.80(m,1H),2.45-2.41(m,2H),2.21(t,J＝2.8Hz,1H),1.97(s,3H),1.61(t,J＝11.6Hz,1H)；作为TFA盐的呈白色固体的(2S,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-6-(丁-3-炔-1-基氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲氧基)-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号26410)。产率：0.045g，12％；LCMS(ESI)m/z 719.57[M+1]+；1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δ7.59(d,J＝7.2Hz,1H),7.49-7.35(m,4H),7.15-7.13(m,2H),7.00(d,J＝7.6Hz,2H),4.25(t,J＝6.8Hz,1H),3.99-3.85(m,6H),3.81-3.63(m,4H),3.54-3.44(m,4H),3.36(d,J＝8.8Hz,1H),2.49-2.45(m,2H),2.42-2.37(m,1H),2.23(t,J＝2.8Hz,1H),1.95(s,3H),1.60(t,J＝12.4Hz,1H)。
(2S,2'S,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-2,2'-((((2R,2'R,3R,3'R,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-(((((RS)-9,14,22-三氧代-16-((15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)氨基甲酰基)-3,6,25,28-四氧杂-10,15,21-三氮杂三十烷-1,30-二基)双(1H-1,2,3-三唑-1,4-二基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-6,2-二基))双(亚甲基))双(氧基))双(6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸)(化合物编号26412)
(2S,2'S,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-2,2'-((((2R,2'R,3R,3'R,4S,4'S,5R,5'R,6R,6′R)-(((((RS)-9,14,22-三氧代-16-((15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)氨基甲酰基)-3,6,25,28-四氧杂-10,15,21-三氮杂三十烷-1,30-二基)双(1H-1,2,3-三唑-1,4-二基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-6,2-二基))双(亚甲基))双(氧基))双(6-((1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸)(化合物编号26412)的合成
向在带有搅拌棒的1打兰小瓶中的NMP(0.6mL)中的(R)-1-叠氮基-16-(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-9,14,17-三氧代-3,6,21,24,27,30-六氧杂-10,15,18-三氮杂三十三烷-33-酸全氟苯基酯(26332，1.00当量，14.3mg，0.0141mmol)和(2S,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-6-(丁-3-炔-1-基氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲氧基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(26411，2.10当量，21.7mg，0.0296mmol)的溶液中添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(5.00当量，26.3mg，0.0704mmol)。将所得到的透明绿色溶液加盖，并在室温下搅拌持续10min。用乙酸稀释反应产物，过滤，并经由制备型HPLC(含0.1％ TFA的20-80％乙腈水溶液)纯化。合并含有期望的产物的级分并冻干至干燥，以得到呈白色固体的(2S,2'S,4S,4'S,5R,5′R,6R,6'R)-2,2'-((((2R,2′R,3R,3'R,4S,4′S,5R,5′R,6R,6′R)-(((((RS)-9,14,22-三氧代-16-((15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)氨基甲酰基)-3,6,25,28-四氧杂-10,15,21-三氮杂三十烷-1,30-二基)双(1H-1,2,3-三唑-1,4-二基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-6,2-二基))双(亚甲基))双(氧基))双(6-((1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸)(化合物编号26412)。产率：22.8mg，65％；LCMS m/z 1240.7[M/2+1]+；1H NMR(300MHz，DMSO，采用D2O)δ7.86(s,2H),7.75(d,J＝8.8Hz,2H),7.63-7.51(m,8H),7.42(t,J＝7.5Hz,4H),7.35-7.27(m,6H),4.46-4.34(m,4H),4.19-3.58(m,19H),3.57-2.79(m,66H),2.30-2.19(m,4H),2.18-2.03(m,4H),1.64-1.39(m,6H),1.37-1.07(m,4H)。
(2S,2′S,4S,4′S,5R,5′R,6R,6′R)-2,2′-(((((((((RS)-9,14,22-三氧代-16-((15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)氨基甲酰基)-3,6,25,28-四氧杂-10,15,21-三氮杂三十烷-1,30-二基)双(1H-1,2,3-三唑-1,4-二基))双(亚甲基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(5-乙酰胺基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸)(化合物编号26414)
(2S,2'S,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-2,2′-(((((((((RS)-9,14,22-三氧代-16-((15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)氨基甲酰基)-3,6,25,28-四氧杂-10,15,21-三氮杂三十烷-1,30-二基)双(1H-1,2,3-三唑-1,4-二基))双(亚甲基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(5-乙酰胺基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸)(化合物编号26414)的合成
向在带有搅拌棒的1打兰小瓶中的NMP(0.6mL)中的(R)-1-叠氮基-16-(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-9,14,17-三氧代-3,6,21,24,27,30-六氧杂-10,15,18-三氮杂三十三烷-33-酸全氟苯基酯(26332，1.00当量，22.5mg，0.0222mmol)和(2S,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基-2-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(26335，2.10当量，29.4mg，0.0466mmol)的溶液中添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(5.00当量，41.3mg，0.111mmol)。将所得到的透明浅黄色溶液加盖，并在室温下搅拌持续10min(缓慢地变成绿色)。用乙酸稀释反应产物，过滤，并经由制备型HPLC(含0.1％ TFA的20-90％乙腈水溶液)纯化。合并含有期望的产物的级分并冻干至干燥，以得到呈白色固体的(2S,2′S,4S,4′S,5R,5′R,6R,6'R)-2,2'-(((((((((RS)-9,14,22-三氧代-16-((15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)氨基甲酰基)-3,6,25,28-四氧杂-10,15,21-三氮杂三十烷-1,30-二基)双(1H-1,2,3-三唑-1,4-二基))双(亚甲基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(5-乙酰胺基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸)(化合物编号26414)。产率：32.9mg，65％；LCMS m/z 1138.8[M/2+1]+；1H NMR(300MHz，DMSO，采用D2O)δ7.96(s,2H),7.55(d,J＝7.7Hz,2H),7.48-7.32(m,8H),7.13(t,J＝7.4Hz,4H),6.97(d,J＝8.0Hz,4H),4.51-4.38(m,8H),3.89-2.87(m,71H),2.29-2.19(m,4H),2.18-2.03(m,4H),1.82(s,6H),1.62-1.39(m,6H),1.36-1.06(m,4H)。
(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(2-(1-(15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)甲氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号26415)
(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(2-(1-(15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)甲氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号26415)的合成
向在带有搅拌棒的1打兰小瓶中的NMP(0.3mL)中的(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-6-(丁-3-炔-1-基氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲氧基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(26339，1.00当量，26.2mg，0.0358mmol)的溶液中添加在NMP(0.3mL)中的1-叠氮基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸全氟苯基酯(1，1.10当量，18.0mg，0.0393mmol)的溶液，随后添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(2.50当量，33.3mg，0.0894mmol)。将所得到的透明绿色溶液加盖，并在室温下搅拌持续10min。用乙酸稀释反应产物，过滤，并经由制备型HPLC(含0.1％ TFA的20-70％乙腈水溶液)纯化。合并含有期望的产物的级分并冻干至干燥，以得到呈白色固体的(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(2-(1-(15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)甲氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号26415)。产率：26.5mg，62％；LCMS m/z 1190.7[M+1]+；1H NMR(300MHz，DMSO，采用D2O)δ7.83(s,1H),7.79(d,J＝7.4Hz,1H),7.62-7.50(m,4H),7.42(t,J＝7.6Hz,2H),7.34-7.26(m,3H),4.39(t,J＝4.8Hz,2H),4.15(d,J＝6.6Hz,1H),3.96-2.79(m,38H),2.47-2.40(m,1H),1.55(t,J＝12.2Hz,1H)。
(2R,2'R,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-2,2'-((((2R,2'R,3R,3'R,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-(((((RS)-9,14,22-三氧代-16-((15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)氨基甲酰基)-3,6,25,28-四氧杂-10,15,21-三氮杂三十烷-1,30-二基)双(1H-1,2,3-三唑-1,4-二基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-6,2-二基))双(亚甲基))双(氧基))双(6-((1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸)(化合物编号26416)
(2R,2'R,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-2,2'-((((2R,2'R,3R,3'R,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-(((((RS)-9,14,22-三氧代-16-((15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)氨基甲酰基)-3,6,25,28-四氧杂-10,15,21-三氮杂三十烷-1,30-二基)双(1H-1,2,3-三唑-1,4-二基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-6,2-二基))双(亚甲基))双(氧基))双(6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸)(化合物编号26416)的合成
向在带有搅拌棒的1打兰小瓶中的NMP(0.6mL)中的(R)-1-叠氮基-16-(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-9,14,17-三氧代-3,6,21,24,27,30-六氧杂-10,15,18-三氮杂三十三烷-33-酸全氟苯基酯(26332，1.00当量，20.7mg，0.0204mmol)和(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-6-(丁-3-炔-1-基氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲氧基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(26339，2.10当量，31.4mg，0.0428mmol)的溶液中添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(5.00当量，38.0mg，0.102mmol)。将所得到的透明绿色溶液加盖，并在室温下搅拌持续10min。用乙酸稀释反应产物，过滤，并经由制备型HPLC(含0.1％ TFA的20-65％乙腈水溶液)纯化。合并含有期望的产物的级分并冻干至干燥，以得到呈白色固体的(2R,2'R,4S,4'S,5R,5'R,6R,6′R)-2,2'-((((2R,2'R,3R,3'R,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-(((((RS)-9,14,22-三氧代-16-((15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)氨基甲酰基)-3,6,25,28-四氧杂-10,15,21-三氮杂三十烷-1,30-二基)双(1H-1,2,3-三唑-1,4-二基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-6,2-二基))双(亚甲基))双(氧基))双(6-((1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸)(化合物编号26416)。产率：27.2mg，54％；LCMS m/z 1240.8[M/2+1]+；1H NMR(300MHz，DMSO，采用D2O)δ7.84-7.75(m,4H),7.61-7.49(m,8H),7.41(t,J＝7.5Hz,4H),7.34-7.25(m,6H),4.42-4.32(m,4H),3.94-2.76(m,85H),2.47-2.39(m,2H),2.30-2.17(m,4H),2.08(t,J＝7.5Hz,2H),1.64-1.37(m,6H),1.35-1.07(m,4H).
化合物编号26417
/>
化合物编号26417的合成
向在带有搅拌棒的1打兰小瓶中的NMP(0.6mL)中的(16R,19R)-1-叠氮基-16,19-双(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-9,14,17,20-四氧代-3,6,24,27,30,33-六氧杂-10,15,18,21-四氮杂三十六烷-36-酸全氟苯基酯(26333，1.00当量，19.1mg，0.0144mmol)和(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-6-(丁-3-炔-1-基氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲氧基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(26339，3.10当量，32.7mg，0.0446mmol)的溶液中添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(7.50当量，40.2mg，0.108mmol)。将所得到的透明绿色溶液加盖，并在室温下搅拌持续10min。用在NMP中的70％乙酸的混合物稀释反应产物，过滤，并经由制备型HPLC(含0.1％ TFA的15-65％乙腈水溶液)纯化。合并含有期望的产物的级分并冻干至干燥，以得到呈白色固体的化合物编号26417。产率：22.8mg，45％；LCMS m/z[M+1]+；1H NMR(300MHz，DMSO，采用D2O)δ7.83-7.73(m,6H),7.60-7.48(m,12H),7.40(t,J＝7.5Hz,6H),7.33-7.25(m,9H),4.40-4.32(m,6H),3.93-2.77(m,120H),2.47-2.40(m,2H),2.30-2.18(m,6H),2.13-2.03(m,2H),1.66-1.38(m,8H),1.36-1.06(m,8H)。
化合物编号26418
/>
化合物编号26418的合成
向在带有搅拌棒的1打兰小瓶中的NMP(0.6mL)中的(16R,19R)-1-叠氮基-16,19-双(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-9,14,17,20-四氧代-3,6,24,27,30,33-六氧杂-10,15,18,21-四氮杂三十六烷-36-酸全氟苯基酯(26333，1.00当量，18.3mg，0.0138mmol)和(2S,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-6-(丁-3-炔-1-基氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲氧基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(26411，3.10当量，31.3mg，0.0427mmol)的溶液中添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(7.50当量，38.5mg，0.103mmol)。将所得到的透明绿色溶液加盖，并在室温下搅拌持续10min。用在NMP中的70％乙酸的混合物稀释反应产物，过滤，并经由制备型HPLC(含0.1％ TFA的15-65％乙腈水溶液)纯化。合并含有期望的产物的级分并冻干至干燥，以得到呈白色固体的化合物编号26418。产率：32.7mg，67％；LCMS m/z 1763.7[M/2+1]+；1H NMR(300MHz，DMSO，采用D2O)δ7.83(s,3H),7.76(d,J＝8.9Hz,3H),7.61-7.49(m,12H),7.40(t,J＝7.5Hz,6H),7.34-7.26(m,9H),4.43-4.34(m,6H),4.02-2.80(m,120H),2.30-2.04(m,10H),1.64-1.40(m,8H),1.35-1.08(m,8H)。
(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号26463)和(2S,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号26464)
(1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1-((2R,3R,4S)-4-乙酰氧基-3-(2-乙酰氧基乙酰胺基)-6-(甲氧基羰基)-6-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)丙烷-1,2-二基二乙酸酯(3)的合成
向在无水二氯甲烷(20.0mL)中的(1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1-((2R,3R,4S,6S)-4-乙酰氧基-3-(2-乙酰氧基乙酰胺基)-6-(甲氧基羰基)-6-(对甲苯基硫基)四氢-2H-吡喃-2-基)丙烷-1,2-二基二乙酸酯(1，1.0g，1.240mmol)的搅拌的溶液中添加2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙-1-醇(2，0.893g，6.20mmol)和活化的粉末状分子筛(1.0g，100％w/w)。在氮气下，将所得的反应溶液在室温下搅拌持续15h。在-40℃下，向该溶液中添加1-碘吡咯烷-2,5-二酮(0.697g，3.10mmol)和三氟甲磺酸(0.109mL，1.240mmol)。将所得的反应溶液在-40℃下搅拌持续1h。在完成之后，将反应混合物用三乙胺(0.5mL)淬灭，并温热至室温。将反应混合物通过烧结漏斗过滤，并用二氯甲烷洗涤。滤液用饱和碳酸氢钠(水溶液)洗涤，用硫酸钠干燥，过滤，并在减压下浓缩，以获得粗残余物。残余物经由柱色谱法(在己烷中的60-80％乙酸乙酯)纯化，以得到作为异头混合物的呈白色固体的(1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1-((2R,3R,4S)-4-乙酰氧基-3-(2-乙酰氧基乙酰胺基)-6-(甲氧基羰基)-6-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)丙烷-1,2-二基二乙酸酯(3)产率：0.80g，78.07％；LCMS(ESI)m/z827.30[M+1]+。
(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号26463)和(2S,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号26464)的合成
向在甲醇(5.0mL)中的(1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1-((2R,3R,4S,6R)-4-乙酰氧基-3-(2-乙酰氧基乙酰胺基)-6-(甲氧基羰基)-6-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)丙烷-1,2-二基二乙酸酯(3，0.450g，0.544mmol)的搅拌的溶液中添加在水(0.50mL)中的一水合氢氧化锂(0.137g，3.27mmol)的溶液。将所得的反应混合物在室温下搅拌持续6h。在完成之后，用Dowex 50,H+)处理反应混合物直至pH约6，并且过滤悬浮液并用甲醇洗涤。在减压下浓缩滤液，以获得粗残余物。残余物经由制备型HPLC纯化，以得到呈白色固体的(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号26463)。产率：0.316g，90％；LCMS(ESI)m/z 645.45[M+1]+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δ7.87(d,J＝7.6Hz,1H),7.61-7.56(m,4H),7.43-7.37(m,4H),7.31(t,J＝7.2Hz,1H),4.17(d,J＝2.4Hz,2H),3.90(s,2H),3.89-3.81(m,4H),3.74-3.59(m,11H),3.39-3.25(m,2H),2.82(t,J＝0.8Hz,1H),2.71(dd,J＝8.8&4.0Hz,1H),1.75(t,J＝12.4Hz,1H)；呈白色固体的(2S,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号26464)。产率：0.192g，80.25％；LCMS(ESI)m/z645.42[M+1]+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δ7.82(d,J＝8.8Hz,1H),7.61-7.57(m,4H),7.44-7.36(m,4H),7.31(t,J＝7.2Hz,1H),4.17(d,J＝2.4Hz,2H),4.15-4.119(m,1H),4.03-3.96(m,3H),3.94-3.86(m,1H),3.86-3.78(m,2H),3.36-3.62(m,2H)3.59(s,2H),3.51-3.46(m,1H),3.42-3.35(m,2H),2.84(t,J＝2.4Hz,1H),2.38(dd,J＝12.8&3.8Hz,1H),1.66(t,J＝11.6Hz,1H)。
(2S,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(2-(1-(15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)甲氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号26465)
(2S,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(2-(1-(15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)甲氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号26465)的合成
向在带有搅拌棒的1打兰小瓶中的NMP(0.3mL)中的(2S,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-6-(丁-3-炔-1-基氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲氧基)-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(26410，1.00当量，25.8mg，0.0359mmol)的溶液中添加在NMP(0.3mL)中的1-叠氮基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸全氟苯基酯(1，(1.10当量，18.1mg，0.0395mmol)的溶液，随后添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(2.50当量，33.5mg，0.0898mmol)。将所得到的透明绿色溶液加盖，并在室温下搅拌持续10min。用乙酸稀释反应产物，过滤，并经由制备型HPLC(含0.1％TFA的15-65％乙腈水溶液)纯化。合并含有期望的产物的级分并冻干至干燥，以得到呈白色固体的(2S,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(2-(1-(15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)甲氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号26465)。产率：23.5mg，56％；LCMS m/z 1176.8[M+1]+；1H NMR(300MHz，DMSO-d6，采用D2O)δ7.93(d,J＝7.5Hz,1H),7.84(s,1H),7.55(d,J＝7.7Hz,1H),7.45(t,J＝7.9Hz,1H),7.41-7.32(m,3H),7.14(t,J＝7.1Hz,2H),6.97(d,J＝8.0Hz,2H),4.44-4.34(m,2H),3.95-3.78(m,2H),3.78-2.95(m,30H),2.95-2.81(m,4H),2.18-2.06(m,1H),1.83(s,3H),1.54-1.40(m,1H)。
化合物编号26466
化合物编号26466的合成
向在带有搅拌棒的1打兰小瓶中的NMP(0.6mL)中的(16R,19R)-1-叠氮基-16,19-双(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-9,14,17,20-四氧代-3,6,24,27,30,33-六氧杂-10,15,18,21-四氮杂三十六烷-36-酸全氟苯基酯(26333，1.00当量，23.1mg，0.0160mmol)和(2R,4R,5S,6S)-5-乙酰胺基-6-((1S,2S)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基-2-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(26335，3.10当量，36.9mg，0.0495mmol)的溶液中添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(7.50当量，44.7mg，0.120mmol)。将所得到的透明浅黄色溶液加盖，并在室温下搅拌持续10min(缓慢地变成绿色)。用在NMP中的70％乙酸的混合物稀释反应产物，过滤，并经由制备型HPLC(含0.1％ TFA的15-65％乙腈水溶液)纯化。合并含有期望的产物的级分并冻干至干燥，以得到呈白色固体的化合物编号26466。产率：35.4mg，69％；LCMS m/z 1610.7[M/2+1]+；1H NMR(300MHz，DMSO-d6，采用D2O)δ7.95(s,3H),7.54(d,J＝7.8Hz,3H),7.47-7.30(m,12H),7.12(t,J＝7.4Hz,6H),6.96(d,J＝8.0Hz,6H),4.52-4.37(m,12H),3.90-2.78(m,99H),2.29-2.18(m,6H),2.18-2.02(m,4H),1.82(s,9H),1.68-1.36(m,8H),1.36-1.05(m,8H)。
化合物编号26467
化合物编号26467的合成
向在带有搅拌棒的1打兰小瓶中的NMP(0.6mL)中的(16R,19R)-1-叠氮基-16,19-双(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-9,14,17,20-四氧代-3,6,24,27,30,33-六氧杂-10,15,18,21-四氮杂三十六烷-36-酸全氟苯基酯(26333，1.00当量，23.7mg，0.0164mmol)和(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基-2-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(26334，3.10当量，37.9mg，0.0508mmol)的溶液中添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(7.50当量，45.8mg，0.123mmol)。将所得到的透明浅黄色溶液加盖，并在室温下搅拌持续10min(缓慢地变成绿色)。用在NMP中的70％乙酸的混合物稀释反应产物，过滤，并经由制备型HPLC(含0.1％ TFA的15-65％乙腈水溶液)纯化。合并含有期望的产物的级分并冻干至干燥，以得到呈白色固体的化合物编号26467。产率：36.8mg，70％；LCMS m/z1610.6[M/2+1]+；1H NMR(300MHz，DMSO-d6，采用D2O)δ7.93(s,3H),7.51(d,J＝7.5Hz,3H),7.46-7.27(m,12H),7.11(t,J＝8.0Hz,6H),6.94(d,J＝7.9Hz,6H),4.48-4.35(m,12H),4.10-2.82(m,99H),2.45-2.39(m,2H),2.29-2.17(m,6H),2.13-2.02(m,2H),1.82(s,9H),1.66-1.36(m,8H),1.36-1.05(m,8H)。
(2RS,2'RS,4SR,4'SR,5RS,5'RS,6RS,6'RS)-2,2'-((((2R,2'R,3R,3'R,4S,4'S,5R,5'R,6R,6′R)-(((((SR)-9,14,22-三氧代-16-((15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)氨基甲酰基)-3,6,25,28-四氧杂-10,15,21-三氮杂三十烷-1,30-二基)双(1H-1,2,3-三唑-1,4-二基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-6,2-二基))双(亚甲基))双(氧基))双(5-乙酰胺基-6-((1RS,2RS)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸)(化合物编号26468)
(2RS,2'RS,4SR,4'SR,5RS,5'RS,6RS,6'RS)-2,2'-((((2R,2'R,3R,3'R,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-(((((SR)-9,14,22-三氧代-16-((15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)氨基甲酰基)-3,6,25,28-四氧杂-10,15,21-三氮杂三十烷-1,30-二基)双(1H-1,2,3-三唑-1,4-二基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-6,2-二基))双(亚甲基))双(氧基))双(5-乙酰胺基-6-((1RS,2RS)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸)(化合物编号26468)的合成
向在带有搅拌棒的1打兰小瓶中的NMP(0.5mL)中的(R)-1-叠氮基-16-(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-9,14,17-三氧代-3,6,21,24,27,30-六氧杂-10,15,18-三氮杂三十三烷-33-酸全氟苯基酯(26332，1.00当量，18.4mg，0.0163mmol)和(2RS,4SR,5RS,6RS)-5-乙酰胺基-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-6-(丁-3-炔-1-基氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲氧基)-6-((1RS,2RS)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(26409，2.10当量，24.6mg，0.0342mmol)的溶液中添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(5.00当量，30.4mg，0.0815mmol)。将所得到的无色溶液加盖，并在室温下搅拌持续10min(缓慢地变成绿色)。用在NMP中的70％乙酸的混合物稀释反应产物，过滤，并经由制备型HPLC(含0.1％ TFA的15-65％乙腈水溶液)纯化。合并含有期望的产物的级分并冻干至干燥，以得到呈白色固体的(2RS,2′RS,4SR,4′SR,5RS,5'RS,6RS,6′RS)-2,2′-((((2R,2′R,3R,3′R,4S,4′S,5R,5'R,6R,6'R)-(((((SR)-9,14,22-三氧代-16-((15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)氨基甲酰基)-3,6,25,28-四氧杂-10,15,21-三氮杂三十烷-1,30-二基)双(1H-1,2,3-三唑-1,4-二基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-6,2-二基))双(亚甲基))双(氧基))双(5-乙酰胺基-6-((1RS,2RS)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸)(化合物编号26468)。产率：28.2mg，71％；LCMS m/z 1226.8[M/2+1]+；1H NMR(300MHz，DMSO-d6，采用D2O)δ7.79(s,2H),7.51(d,J＝7.8Hz,2H),7.45-7.30(m,8H),7.16-7.05(m,4H),6.94(d,J＝8.0Hz,4H),4.42-4.33(m,4H),4.15-2.69(m,77H),2.44-2.39(m,2H),2.30-2.18(m,4H),2.14-2.02(m,2H),1.82(s,6H),1.64-1.38(m,6H),1.38-1.07(m,4H)。
(2RS,2'RS,4RS,4'RS,5SR,5'SR,6SR,6'SR)-2,2'-((((2R,2'R,3R,3'R,4S,4'S,5R,5'R,6R,6′R)-(((((RS)-9,14,22-三氧代-16-((15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)氨基甲酰基)-3,6,25,28-四氧杂-10,15,21-三氮杂三十烷-1,30-二基)双(1H-1,2,3-三唑-1,4-二基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-6,2-二基))双(亚甲基))双(氧基))双(5-乙酰胺基-6-((1SR,2SR)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸)(化合物编号26469)
/>
(2RS,2′RS,4RS,4′RS,5SR,5′SR,6SR,6′SR)-2,2′-((((2R,2′R,3R,3′R,4S,4′S,5R,5′R,6R,6′R)-(((((RS)-9,14,22-三氧代-16-((15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)氨基甲酰基)-3,6,25,28-四氧杂-10,15,21-三氮杂三十烷-1,30-二基)双(1H-1,2,3-三唑-1,4-二基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-6,2-二基))双(亚甲基))双(氧基))双(5-乙酰胺基-6-((1SR,2SR)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸)(化合物编号26469)的合成
向在带有搅拌棒的1打兰小瓶中的NMP(0.5mL)中的(R)-1-叠氮基-16-(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-9,14,17-三氧代-3,6,21,24,27,30-六氧杂-10,15,18-三氮杂三十三烷-33-酸全氟苯基酯(26332，1.00当量，19.3mg，0.0171mmol)和(2RS,4RS,5SR,6SR)-5-乙酰胺基-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-6-(丁-3-炔-1-基氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲氧基)-6-((1SR,2SR)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(26410，2.10当量，25.8mg，0.0359mmol)的溶液中添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(5.00当量，31.8mg，0.0854mmol)。将所得到的无色溶液加盖，并在室温下搅拌持续10min(缓慢地变成绿色)。用在NMP中的70％乙酸的混合物稀释反应产物，过滤，并经由制备型HPLC(含0.1％ TFA的15-65％乙腈水溶液)纯化。合并含有期望的产物的级分并冻干至干燥，以得到呈白色固体的(2RS,2'RS,4RS,4'RS,5SR,5'SR,6SR,6'SR)-2,2'-((((2R,2'R,3R,3'R,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-(((((RS)-9,14,22-三氧代-16-((15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)氨基甲酰基)-3,6,25,28-四氧杂-10,15,21-三氮杂三十烷-1,30-二基)双(1H-1,2,3-三唑-1,4-二基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-6,2-二基))双(亚甲基))双(氧基))双(5-乙酰胺基-6-((1SR,2SR)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸)(化合物编号26469)。产率：26.0mg，62％；LCMS m/z 1226.8[M/2+1]+；1H NMR(300MHz，DMSO-d6，采用D2O)δ7.92(bs,2H),7.83(s,2H),7.54(d,J＝7.6Hz,2H),7.44(t,J＝7.8Hz,2H),7.41-7.31(m,6H),7.13(t,J＝7.2Hz,4H),6.96(d,J＝8.0Hz,4H),4.45-4.32(m,4H),3.95-2.70(m,77H),2.31-2.02(m,8H),1.82(s,6H),1.63-1.37(m,6H),1.37-1.07(m,4H)。
化合物编号26470
化合物编号26470的合成
向在带有搅拌棒的1打兰小瓶中的NMP(0.6mL)中的(16R,19R)-1-叠氮基-16,19-双(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-9,14,17,20-四氧代-3,6,24,27,30,33-六氧杂-10,15,18,21-四氮杂三十六烷-36-酸全氟苯基酯(26333，1.00当量，21.6mg，0.0149mmol)和(2RS,4RS,5SR,6SR)-5-乙酰胺基-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-6-(丁-3-炔-1-基氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲氧基)-6-((1SR,2SR)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(26410，3.10当量，33.3mg，0.0463mmol)的溶液中添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(7.50当量，41.8mg，0.112mmol)。将所得到的透明黄色溶液加盖，并在室温下搅拌持续10min(缓慢地变成绿色)。用在NMP中的70％乙酸的混合物稀释反应产物，过滤，并经由制备型HPLC(含0.1％ TFA的15-65％乙腈水溶液)纯化。合并含有期望的产物的级分并冻干至干燥，以得到呈白色固体的化合物编号26470。产率：27.3mg，52％；LCMS m/z 1742.4[M/2+1]+；1H NMR(300MHz，DMSO-d6，采用D2O)δ7.92(bs,3H),7.82(s,3H),7.52(d,J＝7.7Hz,3H),7.43(t,J＝7.9Hz,3H),7.39-7.30(m,9H),7.12(t,J＝7.2Hz,6H),6.95(d,J＝7.9Hz,6H),4.42-4.32(m,6H),4.17-2.70(m,108H),2.31-2.02(m,10H),1.82(s,9H),1.66-1.38(m,8H),1.38-1.05(m,8H)。产率：12.7mg，24％；1H NMR(300MHz，DMSO-d6，采用D2O)δ7.92(bs,3H),7.83(s,3H),7.54(d,J＝7.7Hz,3H),7.45(t,J＝7.9Hz,3H),7.40-7.31(m,9H),7.13(t,J＝7.0Hz,6H),6.96(d,J＝8.0Hz,6H),4.42-4.33(m,6H),3.96-2.70(m,108H),2.32-2.03(m,10H),1.82(s,9H),1.66-1.39(m,8H),1.39-1.07(m,8H)。
化合物编号26471
化合物编号26471的合成
向在带有搅拌棒的1打兰小瓶中的NMP(0.6mL)中的(16R,19R)-1-叠氮基-16,19-双(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-9,14,17,20-四氧代-3,6,24,27,30,33-六氧杂-10,15,18,21-四氮杂三十六烷-36-酸全氟苯基酯(26333，1.00当量，17.1mg，0.0119mmol)和(2RS,4SR,5RS,6RS)-5-乙酰胺基-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-6-(丁-3-炔-1-基氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲氧基)-6-((1RS,2RS)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(26409，3.10当量，26.4mg，0.0368mmol)的溶液中添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(7.50当量，33.1mg，0.0889mmol)。将所得到的透明黄色溶液加盖，并在室温下搅拌持续10min(缓慢地变成绿色)。用在NMP中的70％乙酸的混合物稀释反应产物，过滤，并经由制备型HPLC(含0.1％ TFA的15-65％乙腈水溶液)纯化。合并含有期望的产物的级分并冻干至干燥，以得到呈白色固体的化合物编号26471。产率：19.7mg，48％；LCMS m/z 1742.5[M/2+1]+；1H NMR(300MHz,DMSO-d6，采用D2O)δ7.94(bs,3H),7.81(s,3H),7.53(d,J＝7.7Hz,3H),7.47-7.31(m,12H),7.17-7.05(m,6H),6.95(d,J＝8.0Hz,6H),4.44-4.30(m,6H),4.16-4.09(m,2H),3.90-2.69(m,106H),2.45-2.37(m,2H),2.31-2.16(m,6H),2.14-2.01(m,2H),1.82(s,9H),1.65-1.38(m,8H),1.38-1.04(m,8H)。产率：8.1mg，20％；1H NMR(300MHz，DMSO-d6，采用D2O)δ7.93(bs,3H),7.78(s,3H),7.50(d,J＝7.6Hz,3H),7.45-7.29(m,12H),7.16-7.03(m,6H),6.94(d,J＝8.0Hz,6H),4.41-4.32(m,6H),4.15-2.70(m,108H),2.32-2.18(m,8H),2.14-2.04(m,2H),1.82(s,9H),1.66-1.38(m,8H),1.38-1.05(m,8H)。
(2S,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-2,4-二羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号26473)
(1R,2R)-1-((2R,3R,4S,6S)-3-乙酰胺基-4-乙酰氧基-6-(苄氧基)-6-(甲氧基羰基)四氢-2H-吡喃-2-基)-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙烷-1,2-二基二乙酸酯(3)的合成
将在无水二氯甲烷(10.0mL)中的(1R,2R)-1-((2R,3R,4S,6R)-3-乙酰胺基-4-乙酰氧基-6-(甲氧基羰基)-6-(对甲苯基硫基)四氢-2H-吡喃-2-基)-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙烷-1,2-二基二乙酸酯(1，0.50g，0.66mmol)、苯基甲醇(2，0.203mL，2.0mmol)和活化的粉末状分子筛(0.50g，100％w/w)的悬浮液在室温下在氮气气氛中搅拌持续15h。将反应混合物冷却至-40℃，随后添加1-碘吡咯烷-2,5-二酮(0.374g，1.66mmol)和三氟甲磺酸(0.058mL，0.66mmol)。将反应在-40℃下搅拌持续1h，并且通过TLC和LCMS监测反应进程。在完成之后，将反应混合物用三乙胺(0.1mL，中性pH)淬灭并温热至室温。将反应混合物通过烧结漏斗过滤，并用二氯甲烷洗涤。滤液用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，用硫酸钠干燥，过滤，并在减压下浓缩，以获得粗残余物。残余物经由柱色谱法(在己烷中的45-60％乙酸乙酯)纯化，以得到呈灰白色固体的(1R,2R)-1-((2R,3R,4S,6S)-3-乙酰胺基-4-乙酰氧基-6-(苄氧基)-6-(甲氧基羰基)四氢-2H-吡喃-2-基)-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙烷-1,2-二基二乙酸酯(3)。产率：0.30g，61.31％；LCMS(ESI)m/z 7354.22[M+1]+。
(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-2-(苄氧基)-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(4)的合成
在0℃下，向在甲醇(10.0mL)中的(1R,2R)-1-((2R,3R,4S,6S)-3-乙酰胺基-4-乙酰氧基-6-(苄氧基)-6-(甲氧基羰基)四氢-2H-吡喃-2-基)-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙烷-1,2-二基二乙酸酯(3，0.30g，0.408mmol)的搅拌的溶液中添加氢氧化锂(0.048g，2.04mmol)。搅拌混合物，并允许温热至室温。在完成之后，向反应物料中添加Dowex氢形式直至pH 6。将反应混合物通过烧结漏斗过滤，并将滤液在旋转蒸发器上浓缩，以得到呈白色固体的粗(2S,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-2-(苄氧基)-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(4)。产率：0.24g，粗；LCMS(ESI)m/z595.22[M+1]+。
(2S,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-2,4-二羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号26473)的合成
在室温下，向在甲醇(3.0mL)中的(2S,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-2-(苄氧基)-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(4，0.24g，0.403mmol)的搅拌的溶液中添加10％ Pd/C(0.12g，50％w/w)。使用H2气体的气球压力将反应产物氢化持续12h。通过LC-MS和TLC监测反应，并且在完成之后，通过硅藻土过滤反应产物，并且浓缩滤液。残余物经由制备型HPLC(含0.1％ TFA的17-35％乙腈水溶液)纯化。将含有期望的产物的级分合并，并冻干至干燥，以得到作为TFA盐的呈白色固体的(2S,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-2,4-二羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号26473)。产率：0.078g，38.31％；LCMS(ESI)m/z505.35[M+1]+；1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δ8.42-8.40(m,1H),8.09(d,J＝8.4Hz,1H),7.56(d,J＝7.6Hz,1H),7.46-7.42(m,2H),7.39-7.35(m,2H),7.16-7.12(m,2H),7.02-7.00(m,2H),4.06-4.00(m,2H),3.88-3.75(m,3H),3.51-3.42(m,2H),2.21(dd,J＝12.4&4.8Hz,1H),1.97(s,3H),1.83(t,J＝12.4Hz,1H)。
(2R,4R,5S,6S)-6-((1S,2S)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-(2-(2-((1-(15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号26474)
(2R,4R,5S,6S)-6-((1S,2S)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-(2-(2-((1-(15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号26474)的合成
向在带有搅拌棒的1打兰小瓶中的NMP(0.3mL)中的(2R,4R,5S,6S)-6-((1S,2S)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(26464，1.00当量，28.0mg，0.0434mmol)的溶液中添加在NMP(0.3mL)中的1-叠氮基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸全氟苯基酯(1，1.10当量，21.9mg，0.0478mmol)的溶液，随后添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(2.50当量，40.5mg，0.109mmol)。将所得到的透明绿色溶液加盖，并在室温下搅拌持续10min。用乙酸稀释反应产物，过滤，并经由制备型HPLC(含0.1％ TFA的15-65％乙腈水溶液)纯化。将含有期望的产物的级分合并，并冻干至干燥，以得到呈白色固体的(2R,4R,5S,6S)-6-((1S,2S)-3-(2-([1,1'-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-(2-(2-((1-(15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号26474)。产率：10.7mg，22％；LCMS m/z 1102.7[M+1]+；1H NMR(300MHz，DMSO-d6，采用D2O)δ7.96(s,1H),7.69(d,J＝8.8Hz,1H),7.61-7.48(m,4H),7.41(t,J＝7.5Hz,2H),7.34-7.24(m,3H),4.52-4.38(m,3H),4.02-2.69(m,38H),2.31-2.07(m,1H),1.54-1.38(m,1H)。
(2R,2′R,4S,4′S,5R,5′R,6R,6′R)-2,2′-(((((((((S)-9,14,22-三氧代-16-((15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)氨基甲酰基)-3,6,25,28-四氧杂-10,15,21-三氮杂三十烷-1,30-二基)双(1H-1,2,3-三唑-1,4-二基))双(亚甲基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(6-((1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸)(化合物编号26475)
(2R,2′R,4S,4′S,5R,5′R,6R,6′R)-2,2′-(((((((((S)-9,14,22-三氧代-16-((15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)氨基甲酰基)-3,6,25,28-四氧杂-10,15,21-三氮杂三十烷-1,30-二基)双(1H-1,2,3-三唑-1,4-二基))双(亚甲基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸)(化合物编号26475)的合成
向在带有搅拌棒的1打兰小瓶中的NMP(0.6mL)中的(R)-1-叠氮基-16-(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-9,14,17-三氧代-3,6,21,24,27,30-六氧杂-10,15,18-三氮杂三十三烷-33-酸全氟苯基酯(26332，1.00当量，21.2mg，0.0188mmol)和(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(26463，2.10当量，25.4mg，0.0394mmol))的溶液中添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(5.00当量，35.0mg，0.0939mmol)。将所得到的透明黄色溶液加盖，并在室温下搅拌持续10min(缓慢地变成绿色)。用在NMP中的70％乙酸的混合物稀释反应产物，过滤，并经由制备型HPLC(含0.1％ TFA的15-60％乙腈水溶液)纯化。合并含有期望的产物的级分并冻干至干燥，以得到呈白色固体的(2R,2′R,4S,4'S,5R,5′R,6R,6′R)-2,2'-(((((((((S)-9,14,22-三氧代-16-((15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)氨基甲酰基)-3,6,25,28-四氧杂-10,15,21-三氮杂三十烷-1,30-二基)双(1H-1,2,3-三唑-1,4-二基))双(亚甲基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸)(化合物编号26475)。产率：30.2mg，70％；1H NMR(300MHz，DMSO-d6，采用D2O)δ7.96(s,2H),7.80(d,J＝7.1Hz,2H),7.62-7.50(m,8H),7.41(t,J＝7.5Hz,4H),7.35-7.26(m,6H),4.50-4.38(m,8H),4.13-2.87(m,79H),2.47-2.40(m,2H),2.30-2.19(m,4H),2.08(t,J＝7.6Hz,2H),1.62-1.08(m,10H)。
(2R,2'R,4R,4'R,5S,5'S,6S,6'S)-2,2'-(((((((((R)-9,14,22-三氧代-16-((15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)氨基甲酰基)-3,6,25,28-四氧杂-10,15,21-三氮杂三十烷-1,30-二基)双(1H-1,2,3-三唑-1,4-二基))双(亚甲基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(6-((1S,2S)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸)(化合物编号26476)
(2R,2'R,4R,4'R,5S,5'S,6S,6'S)-2,2'-(((((((((R)-9,14,22-三氧代-16-((15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)氨基甲酰基)-3,6,25,28-四氧杂-10,15,21-三氮杂三十烷-1,30-二基)双(1H-1,2,3-三唑-1,4-二基))双(亚甲基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(6-((1S,2S)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸)(化合物编号26476)的合成
向在带有搅拌棒的1打兰小瓶中的NMP(0.6mL)中的(R)-1-叠氮基-16-(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-9,14,17-三氧代-3,6,21,24,27,30-六氧杂-10,15,18-三氮杂三十三烷-33-酸全氟苯基酯(26332，1.00当量，21.9mg，0.0194mmol)和(2R,4R,5S,6S)-6-((1S,2S)-3-(2-([1,1'-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(26464，2.10当量，26.3mg，0.0407mmol)的溶液中添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(5.00当量，36.1mg，0.0970mmol)。将所得到的透明黄色溶液加盖，并在室温下搅拌持续10min(缓慢地变成绿色)。用在NMP中的70％乙酸的混合物稀释反应产物，过滤，并经由制备型HPLC(含0.1％ TFA的15-65％乙腈水溶液)纯化。合并含有期望的产物的级分并冻干至干燥，以得到呈白色固体的(2R,2′R,4R,4′R,5S,5'S,6S,6'S)-2,2′-(((((((((R)-9,14,22-三氧代-16-((15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)氨基甲酰基)-3,6,25,28-四氧杂-10,15,21-三氮杂三十烷-1,30-二基)双(1H-1,2,3-三唑-1,4-二基))双(亚甲基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(6-((1S,2S)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸)(化合物编号26476)。产率：14.6mg，33％；LCMS m/z1152.7[M/2+1]+；1H NMR(300MHz，DMSO-d6，采用D2O)δ7.95(s,2H),7.74(d,J＝8.9Hz,2H),7.62-7.48(m,8H),7.41(t,J＝7.6Hz,4H),7.35-7.24(m,6H),4.51-4.39(m,7H),4.02-2.70(m,80H),2.30-2.03(m,8H),1.62-1.37(m,6H),1.37-1.08(m,4H)。
化合物编号26477
化合物编号26477的合成
向在带有搅拌棒的1打兰小瓶中的NMP(0.6mL)中的(16R,19R)-1-叠氮基-16,19-双(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-9,14,17,20-四氧代-3,6,24,27,30,33-六氧杂-10,15,18,21-四氮杂三十六烷-36-酸全氟苯基酯(26333，1.00当量，22.5mg，0.0156mmol)和(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(26463，3.10当量，31.2mg，0.0484mmol)的溶液中添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(7.50当量，43.6mg，0.117mmol)。将所得到的透明黄色溶液加盖，并在室温下搅拌持续10min(缓慢地变成绿色)。用在NMP中的70％乙酸的混合物稀释反应产物，过滤，并经由制备型HPLC(含0.1％ TFA的15-65％乙腈水溶液)纯化。合并含有期望的产物的级分并冻干至干燥，以得到呈白色固体的化合物编号26477。产率：23.4mg，46％；1HNMR(300MHz，DMSO-d6，采用D2O)δ7.94(s,3H),7.77(bs,3H),7.60-7.46(m,12H),7.40(t,J＝7.6Hz,6H),7.34-7.24(m,9H),4.49-4.36(m,11H),3.90-2.84(m,114H),2.31-2.03(m,8H),1.65-1.37(m,8H),1.37-1.06(m,8H)。
化合物编号26478
化合物编号26478的合成
向在带有搅拌棒的1打兰小瓶中的NMP(0.6mL)中的(16R,19R)-1-叠氮基-16,19-双(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-9,14,17,20-四氧代-3,6,24,27,30,33-六氧杂-10,15,18,21-四氮杂三十六烷-36-酸全氟苯基酯(26333，1.00当量，24.3mg，0.0168mmol)和(2R,4R,5S,6S)-6-((1S,2S)-3-(2-([1,1'-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(26464，3.10当量，33.7mg，0.0522mmol)的溶液中添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(7.50当量，47.1mg，0.126mmol)。将所得到的透明黄色溶液加盖，并在室温下搅拌持续10min(缓慢地变成绿色)。用在NMP中的70％乙酸的混合物稀释反应产物，过滤，并经由制备型HPLC(含0.1％ TFA的15-65％乙腈水溶液)纯化。合并含有期望的产物的级分并冻干至干燥，以得到呈白色固体的化合物编号26478。产率：23.4mg，43％；LCMSm/z 1631.8[M/2+1]+；1H NMR(300MHz，DMSO-d6，采用D2O)δ7.96(s,3H),7.74(d,J＝8.9Hz,3H),7.62-7.48(m,12H),7.41(t,J＝7.6Hz,6H),7.35-7.25(m,9H),4.51-4.38(m,11H),3.90-2.70(m,110H),2.32-2.03(m,12H),1.65-1.37(m,8H),1.37-1.06(m,8H)。
1-(4-(13-羟基-2,5,8,11-四氧杂十三烷基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸全氟苯基酯(化合物编号26530)
1-(4-(13-羟基-2,5,8,11-四氧杂十三烷基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸全氟苯基酯(化合物编号26530)的合成
向在带有搅拌棒的1打兰小瓶中的3,6,9,12-四氧杂十五-14-炔-1-醇(1，1.00当量，14.4mg，0.0620mmol)中添加在NMP(0.5mL)中的1-叠氮基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸全氟苯基酯(2，1.10当量，31.2mg，0.0682mmol)的溶液，随后添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(2.50当量，57.8mg，0.155mmol)。将所得到的无色溶液加盖，并在室温下搅拌持续10min(缓慢地变成绿色)。用乙酸稀释反应产物，过滤，并经由制备型HPLC(含0.1％ TFA的15-65％乙腈水溶液)纯化。合并含有期望的产物的级分并冻干至干燥，以得到呈无色液体的1-(4-(13-羟基-2,5,8,11-四氧杂十三烷基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸全氟苯基酯(化合物编号26530)。产率：16.2mg，38％；LCMS m/z 690.5[M+1]+；1HNMR(300MHz，氯仿-d)δ7.97(s,1H),4.81-4.72(m,2H),4.64-4.54(m,2H),3.96-3.82(m,4H),3.80-3.56(m,29H),2.94(t,J＝6.1Hz,2H)。
(RS)-9,14,17-三氧代-1-(4-(2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-16-(4-(3-(2-(2-(4-(2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-3,6,21,24,27,30-六氧杂-10,15,18-三氮杂三十三烷-33-酸全氟苯基酯(化合物编号26531)
(RS)-9,14,17-三氧代-1-(4-(2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-16-(4-(3-(2-(2-(4-(2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-3,6,21,24,27,30-六氧杂-10,15,18-三氮杂三十三烷-33-全氟苯基酸酯(化合物编号26531)的合成
向在带有搅拌棒的1打兰小瓶中的NMP(0.4mL)中的(R)-1-叠氮基-16-(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-9,14,17-三氧代-3,6,21,24,27,30-六氧杂-10,15,18-三氮杂三十三烷-33-酸全氟苯基酯(26332，1.00当量，32.4mg，0.0287mmol)和(2R,3R,4S,5R,6R)-2-(丁-3-炔-1-基氧基)-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三醇(26499，2.10当量，14.0mg，0.0603mmol)的溶液中添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(5.00当量，53.5mg，0.143mmol)。将所得到的透明黄色溶液加盖，并在室温下搅拌持续10min(缓慢地变成绿色)。用在NMP中的70％乙酸的混合物稀释反应产物，过滤，并经由制备型HPLC(含0.1％TFA的15-60％乙腈水溶液)纯化。合并含有期望的产物的级分并冻干至干燥，以得到呈白色固体的(RS)-9,14,17-三氧代-1-(4-(2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-16-(4-(3-(2-(2-(4-(2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-3,6,21,24,27,30-六氧杂-10,15,18-三氮杂三十三烷-33-酸全氟苯基酯(化合物编号26531)。产率：28.1mg，66％；LCMS m/z1480.0[M+1]+；1H NMR(300MHz，DMSO-d6，采用D2O)δ7.85(s,2H),4.45-4.35(m,3H),4.21-4.10(m,2H),3.98-2.70(m,62H),2.31-2.19(m,4H),2.09(t,J＝7.5Hz,2H),1.64-1.37(m,4H),1.37-1.07(m,4H)。
(R)-1-(4-(13-羟基-2,5,8,11-四氧杂十三烷基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-16-(4-(3-(2-(2-(4-(13-羟基-2,5,8,11-四氧杂十三烷基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-9,14,17-三氧代-3,6,21,24,27,30-六氧杂-10,15,18-三氮杂三十三烷-33-酸全氟苯基酯(化合物编号26532)
(R)-1-(4-(13-羟基-2,5,8,11-四氧杂十三烷基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-16-(4-(3-(2-(2-(4-(13-羟基-2,5,8,11-四氧杂十三烷基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-9,14,17-三氧代-3,6,21,24,27,30-六氧杂-10,15,18-三氮杂三十三烷-33-酸全氟苯基酯(化合物编号26532)的合成
向在带有搅拌棒的1打兰小瓶中的NMP(0.5mL)中的(R)-1-叠氮基-16-(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-9,14,17-三氧代-3,6,21,24,27,30-六氧杂-10,15,18-三氮杂三十三烷-33-酸全氟苯基酯(26332，1.00当量，30.2mg，0.0267mmol)和3,6,9,12-四氧杂十五-14-炔-1-醇(1，2.10当量，13.0mg，0.0562mmol)的溶液中添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(5.00当量，49.8mg，0.134mmol)。将所得到的透明黄色溶液加盖，并在室温下搅拌持续10min(缓慢地变成绿色)。用在NMP中的70％乙酸的混合物稀释反应产物，过滤，并经由制备型HPLC(含0.1％ TFA的15-60％乙腈水溶液)纯化。合并含有期望的产物的级分并冻干至干燥，以得到呈透明黄色液体的(R)-1-(4-(13-羟基-2,5,8,11-四氧杂十三烷基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-16-(4-(3-(2-(2-(4-(13-羟基-2,5,8,11-四氧杂十三烷基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-9,14,17-三氧代-3,6,21,24,27,30-六氧杂-10,15,18-三氮杂三十三烷-33-酸全氟苯基酯(化合物编号26532)。产率：17.0mg，43％；LCMS m/z 1480.1[M+1]+；1H NMR(300MHz，DMSO-d6，采用D2O)δ7.98(s,2H),7.95-7.82(m,3H),4.50-4.41(m,8H),3.80-2.72(m,73H),2.31-2.21(m,4H),2.10(t,J＝7.4Hz,2H),1.65-1.38(m,4H),1.38-1.08(m,4H)。
(16RS,19RS)-9,14,17,20-四氧代-1-(4-(2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-16,19-双(4-(3-(2-(2-(4-(2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-3,6,24,27,30,33-六氧杂-10,15,18,21-四氮杂三十六烷-36-酸全氟苯基酯(化合物编号26533)
/>
(16RS,19RS)-9,14,17,20-四氧代-1-(4-(2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-16,19-双(4-(3-(2-(2-(4-(2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-3,6,24,27,30,33-六氧杂-10,15,18,21-四氮杂三十六烷-36-酸全氟苯基酯(化合物编号26533)的合成
向在带有搅拌棒的1打兰小瓶中的NMP(0.4mL)中的(16R,19R)-1-叠氮基-16,19-双(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-9,14,17,20-四氧代-3,6,24,27,30,33-六氧杂-10,15,18,21-四氮杂三十六烷-36-酸全氟苯基酯(26333，1.00当量，36.9mg，0.0256mmol)和(2R,3R,4S,5R,6R)-2-(丁-3-炔-1-基氧基)-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三醇(26499，3.10当量，18.4mg，0.0793mmol)的溶液中添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(7.50当量，71.5mg，0.192mmol)。将所得到的透明黄色溶液加盖，并在室温下搅拌持续10min(缓慢地变成绿色)。用在NMP中的70％乙酸的混合物稀释反应产物，过滤，并经由制备型HPLC(含0.1％ TFA的15-50％乙腈水溶液)纯化。合并含有期望的产物的级分并冻干至干燥，以得到呈白色固体的(16RS,19RS)-9,14,17,20-四氧代-1-(4-(2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-16,19-双(4-(3-(2-(2-(4-(2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-3,6,24,27,30,33-六氧杂-10,15,18,21-四氮杂三十六烷-36-酸全氟苯基酯(化合物编号26533)。产率：38.1mg，74％；LCMS m/z 1013.8[M/2+1]+；1H NMR(300MHz，DMSO-d6，采用D2O)δ7.85(s,3H),4.45-4.36(m,6H),4.18-2.65(m,83H),2.31-2.16(m,6H),2.16-2.04(m,2H),1.66-1.38(m,6H),1.38-1.06(m,10H)。
(16R,19R)-1-(4-(13-羟基-2,5,8,11-四氧杂十三烷基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-16,19-双(4-(3-(2-(2-(4-(13-羟基-2,5,8,11-四氧杂十三烷基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-9,14,17,20-四氧代-3,6,24,27,30,33-六氧杂-10,15,18,21-四氮杂三十六烷-36-酸全氟苯基酯(化合物编号26534)
(16R,19R)-1-(4-(13-羟基-2,5,8,11-四氧杂十三烷基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-16,19-双(4-(3-(2-(2-(4-(13-羟基-2,5,8,11-四氧杂十三烷基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-9,14,17,20-四氧代-3,6,24,27,30,33-六氧杂-10,15,18,21-四氮杂三十六烷-36-酸全氟苯基酯(化合物编号26534)的合成
向在带有搅拌棒的1打兰小瓶中的NMP(0.4mL)中的(16R,19R)-1-叠氮基-16,19-双(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-9,14,17,20-四氧代-3,6,24,27,30,33-六氧杂-10,15,18,21-四氮杂三十六烷-36-酸全氟苯基酯(26333，1.00当量，35.8mg，0.0248mmol)和3,6,9,12-四氧杂十五-14-炔-1-醇(1，3.10当量，17.9mg，0.0769mmol)的溶液中添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(7.50当量，69.4mg，0.186mmol)。将所得到的透明绿色溶液加盖，并在室温下搅拌持续10min。用在NMP中的70％乙酸的混合物稀释反应产物，过滤，并经由制备型HPLC(含0.1％ TFA的15-50％乙腈水溶液)纯化。合并含有期望的产物的级分并冻干至干燥，以得到呈透明粉色液体的(16R,19R)-1-(4-(13-羟基-2,5,8,11-四氧杂十三烷基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-16,19-双(4-(3-(2-(2-(4-(13-羟基-2,5,8,11-四氧杂十三烷基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-9,14,17,20-四氧代-3,6,24,27,30,33-六氧杂-10,15,18,21-四氮杂三十六烷-36-酸全氟苯基酯(化合物编号26534)。产率：22.8mg，45％；LCMS m/z 1013.8[M/2+1]+；1H NMR(300MHz，DMSO-d6，采用D2O)δ7.98(s,3H),7.95-7.83(m,2H),4.51-4.39(m,12H),3.80-2.69(m,100H),2.31-2.19(m,6H),2.15-2.04(m,2H),1.67-1.38(m,6H),1.38-1.07(m,8H)。
1-(4-(2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸全氟苯基酯(化合物编号26535)
1-(4-(2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸全氟苯基酯(化合物编号26535)的合成
向在带有搅拌棒的1打兰小瓶中的To(2R,3R,4S,5R,6R)-2-(丁-3-炔-1-基氧基)-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三醇(26499，1.00当量，13.6mg，0.0586mmol)中添加在NMP(0.5mL)中的1-叠氮基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸全氟苯基酯(1，1.10当量，29.5mg，0.0645mmol)的溶液，随后添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(2.50当量，54.6mg，0.147mmol)。将所得到的透明黄色溶液加盖，并在室温下搅拌持续10min(缓慢地变成绿色)。用乙酸稀释反应产物，过滤，并经由制备型HPLC(含0.1％ TFA的15-65％乙腈水溶液)纯化。合并含有期望的产物的级分并冻干至干燥，以得到呈无色半固体的1-(4-(2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸全氟苯基酯(化合物编号26535)。产率：29.0mg，72％；LCMS m/z[M+1]+；LCMS m/z 690.5[M+1]+；1H NMR(300MHz，DMSO-d6，采用D2O)δ7.88(s,1H),4.47-4.37(m,2H),4.16-4.09(m,1H),3.80-3.21(m,24H),2.95(t,J＝5.9Hz,2H),2.86(t,J＝6.9Hz,2H)。
(1R,2R)-1-((2R,3R,4S,6R)-3-乙酰胺基-4-乙酰氧基-6-羟基-6-(甲氧基羰基)四氢-2H-吡喃-2-基)-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙烷-1,2-二基二乙酸酯(化合物编号26565)
(1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1-((2R,3R,4S,6R)-3-乙酰胺基-4-乙酰氧基-6-(苄氧基)-6-(甲氧基羰基)四氢-2H-吡喃-2-基)丙烷-1,2-二基二乙酸酯(3)的合成
向在无水二氯甲烷(14.0mL)中的(1R,2R)-3-(2-([1,1'-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1-((2R,3R,4S,6S)-3-乙酰胺基-4-乙酰氧基-6-(甲氧基羰基)-6-(对甲苯基硫基)四氢-2H-吡喃-2-基)丙烷-1,2-二基二乙酸酯(1，1.0g，1.24mmol)的搅拌的溶液中添加苯基甲醇(0.386mL，3.72mmol)和活化的粉末状分子筛(1.0g，100％w/w)。将所得到的反应混合物在氮气气氛中搅拌持续15h。将反应混合物冷却至-40℃，然后在-40℃下添加1-碘代吡咯烷-2,5-二酮(0.697g，3.10mmol)和三氟甲磺酸(0.109mL，1.24mmol。将反应在-40℃下搅拌持续1h。在完成之后，将反应混合物用三乙胺(0.1mL，中性pH)淬灭并温热至室温。将反应混合物过滤并用二氯甲烷洗涤。滤液用碳酸氢钠饱和溶液洗涤，并用硫酸钠干燥，过滤并在减压下浓缩以获得粗残余物。粗残余物经由柱色谱法(在己烷中的45-60％乙酸乙酯)纯化，以得到呈灰白色固体的(1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1-((2R,3R,4S,6R)-3-乙酰胺基-4-乙酰氧基-6-(苄氧基)-6-(甲氧基羰基)四氢-2H-吡喃-2-基)丙烷-1,2-二基二乙酸酯(3)。产率：0.80g，81.30％；LCMS(ESI)m/z 791.82[M+1]+。
(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-5-乙酰胺基-2-(苄氧基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(4)的合成
向在0℃的甲醇(10.0mL)中的((1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1-((2R,3R,4S,6R)-3-乙酰胺基-4-乙酰氧基-6-(苄氧基)-6-(甲氧基羰基)四氢-2H-吡喃-2-基)丙烷-1,2-二基二乙酸酯(3，0.80g，1.01mmol)的搅拌的溶液中添加氢氧化锂(0.121g，5.06mmol)。允许反应混合物温热至室温。在完成之后，向反应物料中添加Dowex氢形式直至pH 6。过滤反应混合物，并将所得的滤液在旋转蒸发器上浓缩，以得到呈白色固体的粗(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-5-乙酰胺基-2-(苄氧基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(4)。产率：0.60g，95.25％；LCMS(ESI)m/z 623.67[M+1]+。
(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-2,4-二羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号26565)的合成
在室温下，向在甲醇(10.0mL)中的粗(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二乙酰氧基丙基)-5-乙酰胺基-4-乙酰氧基-2-(苄氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(4，0.60g，0.985mmol)的搅拌的溶液中添加10％ Pd/C(0.30g，50％w/w)。然后使用H2气体的气球压力将反应产物氢化持续12h。在完成之后，通过硅藻土过滤反应产物，并且浓缩滤液。所获得的残余物经由制备型HPLC(含0.1％TFA的19-38％乙腈水溶液)纯化。合并含有期望的产物的级分并冻干至干燥，以得到作为TFA盐的呈白色固体的((2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-2,4-二羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号26565)。产率：0.088g，17.22％；LCMS(ESI)m/z 517.34[M+1]+；1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δ7.60-7.56(m,4H),7.43-7.36(m,4H),7.33-7.29(m,1H),4.16-4.09(m,2H),4.02(s,2H),3.90(t,J＝10.4Hz,1H),3.77-3.73(m,1H)3.68-3.64(m,1H),3.59(m,2H),3.39(d,J＝9.2,1H),3.27-3.22(m,1H),2.21(dd,J＝12.8&4.8Hz,1H),1.84 1.83(t,J＝12.8Hz,1H)。
(2S,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-((2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙基)硫基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号26566)
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(1R,2R)-3-(2-([1,1'-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1-((2R,3R,4S,6R)-4-乙酰氧基-3-(2-乙酰氧基乙酰胺基)-6-羟基-6-(甲氧基羰基)四氢-2H-吡喃-2-基)丙烷-1,2-二基二乙酸酯(2)的合成
将在丙酮：水(9:1,20.0mL)中的(1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1-((2R,3R,4S,6S)-4-乙酰氧基-3-(2-乙酰氧基乙酰胺基)-6-(甲氧基羰基)-6-(对甲苯基硫基)四氢-2H-吡喃-2-基)丙烷-1,2-二基二乙酸酯(1，1.0g，1.24mmol)的搅拌的溶液冷却到0℃。在0℃下，向溶液中添加N-碘代琥珀酰亚胺(0.35g，3.10mmol)。将所得的反应溶液在0℃下搅拌持续3h。在完成之后，添加偏亚硫酸氢钠(10.0mL)和乙酸乙酯(20.0mL)的饱和水溶液。将反应混合物搅拌持续10min并转移到分液漏斗中。分离有机层，并用乙酸乙酯(10.0mL)提取水相。合并有机层，并依次用饱和碳酸氢钠溶液和DM水洗涤。有机层经无水硫酸钠干燥，并在旋转蒸发器上浓缩以获得稠浆。经由柱色谱法(在己烷中的60-75％乙酸乙酯)来纯化稠浆，以得到呈白色固体的(1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1-((2R,3R,4S,6R)-4-乙酰氧基-3-(2-乙酰氧基乙酰胺基)-6-羟基-6-(甲氧基羰基)四氢-2H-吡喃-2-基)丙烷-1,2-二基二乙酸酯(2)。产率：0.76g，87.52％；LCMS(ESI)m/z 701.59[M+1]+。
(1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1-((2R,3R,4S,6R)-4-乙酰氧基-3-(2-乙酰氧基乙酰胺基)-6-氯-6-(甲氧基羰基)四氢-2H-吡喃-2-基)丙烷-1,2-二基二乙酸酯(3)的合成
在0℃下，向在乙酰氯(30.0mL)中的(1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1-((2R,3R,4S,6R)-4-乙酰氧基-3-(2-乙酰氧基乙酰胺基)-6-羟基-6-(甲氧基羰基)四氢-2H-吡喃-2-基)丙烷-1,2-二基二乙酸酯(2，0.76g，1.08mmol)的搅拌的溶液中滴加无水甲醇(0.3mL)。将所得的反应混合物在室温下搅拌持续24h。在完成之后，在减压下浓缩反应混合物，以得到呈浅棕色凝胶的粗(1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1-((2R,3R,4S,6R)-4-乙酰氧基-3-(2-乙酰氧基乙酰胺基)-6-氯-6-(甲氧基羰基)四氢-2H-吡喃-2-基)丙烷-1,2-二基二乙酸酯(3)。产率：0.75g，97％；LC-MS(ESI)m/z 719.19[M+1]+。
(1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1-((2R,3R,4S,6S)-4-乙酰氧基-3-(2-乙酰氧基乙酰胺基)-6-(乙酰基硫基)-6-(甲氧基羰基)四氢-2H-吡喃-2-基)丙烷-1,2-二基二乙酸酯(5)的合成
在惰性气氛中，将粗(1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1-((2R,3R,4S,6R)-4-乙酰氧基-3-(2-乙酰氧基乙酰胺基)-6-氯-6-(甲氧基羰基)四氢-2H-吡喃-2-基)丙烷-1,2-二基二乙酸酯(3，0.75g，1.04mmol，粗)溶解在干燥丙酮(10.0mL)中，并在0℃下搅拌。在0℃下，向该溶液中逐点添加硫代乙酸钾(4，0.357g，3.13mmol)。将反应在0℃下搅拌持续3h。在完成之后，将混合物在减压下浓缩，以获得粗残余物。将粗残余物溶解在乙酸乙酯中，并用1N HCl洗涤所得的溶液，然后用DM水洗涤。分离有机层，用无水硫酸钠干燥，并在旋转蒸发器上浓缩以获得稠残余物。残余物经由柱色谱法(在己烷中的60-70％乙酸乙酯)纯化，以得到呈白色固体的((1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1-((2R,3R,4S,6S)-4-乙酰氧基-3-(2-乙酰氧基乙酰胺基)-6-(乙酰基硫基)-6-(甲氧基羰基)四氢-2H-吡喃-2-基)丙烷-1,2-二基二乙酸酯(5)。产率：0.530g，66.97％；LCMS(ESI)m/z 759.29[M+1]+。
(1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1-((2R,3R,4S,6S)-4-乙酰氧基-3-(2-乙酰氧基乙酰胺基)-6-(甲氧基羰基)-6-((2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙基)硫基)四氢-2H-吡喃-2-基)丙烷-1,2-二基二乙酸酯(化合物编号26566)的合成
在0℃下，向在甲醇(10.0mL)中的(1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1-((2R,3R,4S,6S)-4-乙酰氧基-3-(2-乙酰氧基乙酰胺基)-6-(乙酰基硫基)-6-(甲氧基羰基)四氢-2H-吡喃-2-基)丙烷-1,2-二基二乙酸酯(5，0.53g，0.698mmol)的搅拌的溶液中添加硫代甲醇钠(0.058g，0.838mmol)。将所得的反应溶液搅拌持续1h。在0℃下向反应溶液中添加1-碘-2-[2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基]乙烷(0.354g，1.40mmol)。将所得的反应混合物在室温下搅拌持续1h。在完成之后，在室温下添加氢氧化锂(0.026g，1.12mmol)。将所得的反应混合物在室温下搅拌持续6h。在完成之后，添加Dowex氢形式直至pH 6，并通过烧结漏斗过滤反应物料。滤液在旋转蒸发器上浓缩以获得稠的残余物，该稠的残余物然后经由制备型HPLC(含0.1％TFA的15-40％乙腈水溶液)纯化。合并含有期望的产物的级分并冻干至干燥，以得到作为TFA盐的呈白色固体的((2S,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-((2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙基)硫基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号26566)。产率：0.170g，46.04％；LC-MS(ESI)m/z 661.17[M+1]+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δ7.61-7.57(m,4H),7.44-7.37(,4H),7.33-7.30(m,1H),4.15(d,J＝2.0Hz,1H),4.00(s,2H),3.86-3.81(m,3H),3.69-3.54(m,11H),3.37-3.35(m,1H),3.25-3.22(m,1H),2.95-2.89(m,1H),2.86-2.76(m,3H),1.85-1.75(m,1H)。
(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-((2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙基)硫基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号26567)
(2S,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二乙酰氧基丙基)-5-(2-乙酰氧基乙酰胺基)-2-(甲氧基羰基)四氢-2H-吡喃-2,4-二基二乙酸酯(2)的合成
在0℃下，向在吡啶(10.0mL)中的(1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1-((2R,3R,4S,6R)-4-乙酰氧基-3-(2-乙酰氧基乙酰胺基)-6-羟基-6-(甲氧基羰基)四氢-2H-吡喃-2-基)丙烷-1,2-二基二乙酸酯(1，0.70g，0.99mmol)搅拌的溶液中滴加乙酸酐(0.188mL，2.0mmol)。允许反应混合物温热至室温并搅拌过夜。在完成之后，在真空下除去挥发物以获得粗稠浆。将稠浆与乙酸乙酯(20.0mL)一起倒入分液漏斗中，并用1N HCl溶液洗涤，然后用饱和硫酸钠溶液和DM水洗涤。有机层经无水硫酸钠干燥，并在减压下浓缩，以获得粗稠浆。稠浆经由柱色谱法(在己烷中的55-70％乙酸乙酯)纯化，以得到呈白色固体的(2S,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二乙酰氧基丙基)-5-(2-乙酰氧基乙酰胺基)-2-(甲氧基羰基)四氢-2H-吡喃-2,4-二基二乙酸酯(2)产率：0.50g，67.39％；LCMS(ESI)m/z 743.27[M+1]+。
(1R,2R)-3-(2-([1,1'-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1-((2R,3R,4S,6R)-4-乙酰氧基-3-(2-乙酰氧基乙酰胺基)-6-(甲氧基羰基)-6-((2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙基)硫基)四氢-2H-吡喃-2-基)丙烷-1,2-二基二乙酸酯(4)的合成
在惰性气氛中，在室温下，在搅拌下将(2S,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二乙酰氧基丙基)-5-(2-乙酰氧基乙酰胺基)-2-(甲氧基羰基)四氢-2H-吡喃-2,4-二基二乙酸酯(2，0.50g，0.673mmol)和2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙烷-1-硫醇(3，0.215g，1.35mmol)溶解在干燥的二氯甲烷(10.0mL)中。在室温下，向所得的反应溶液中添加活化的粉末状分子筛(0.50g，100％w/w)。将所得的反应混合物搅拌持续30min。将反应混合物冷却至0℃，并在0℃下在5分钟内滴加BF3·Et2O(0.586mL，2.02mmol)。将所得的反应混合物在室温下搅拌持续16h。在完成之后，将反应混合物用三乙胺淬灭直至中性pH。将反应混合物过滤并用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤。分离有机层，用无水硫酸钠干燥，并在旋转蒸发器上浓缩以获得粗稠浆。稠浆经由柱色谱法(在己烷中的60-70％乙酸乙酯)纯化，以得到呈白色固体的(1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1-((2R,3R,4S,6R)-4-乙酰氧基-3-(2-乙酰氧基乙酰胺基)-6-(甲氧基羰基)-6-((2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙基)硫基)四氢-2H-吡喃-2-基)丙烷-1,2-二基二乙酸酯(4)。产率：0.30g，52.86％；LCMS(ESI)m/z 843.91[M+1]+。
(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-((2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙基)硫基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号26567)的合成
向在0℃的甲醇(10.0mL)中的(1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1-((2R,3R,4S,6R)-4-乙酰氧基-3-(2-乙酰氧基乙酰胺基)-6-(甲氧基羰基)-6-((2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙基)硫基)四氢-2H-吡喃-2-基)丙烷-1,2-二基二乙酸酯(4，0.30g，0.355mmol)的搅拌的溶液中添加氢氧化锂(0.051g，2.14mmol)。允许反应混合物温热至室温并搅拌持续6h。在完成之后，添加Dowex氢形式直至中性pH，并通过烧结漏斗过滤反应混合物。在真空下除去滤液以获得粗稠浆，该粗稠浆经由制备型HPLC(含0.1％TFA的22-48％乙腈水溶液)纯化。合并含有期望的产物的级分并冻干至干燥，以得到呈无定形固体的(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-((2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙基)硫基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号26567)。产率：0.113g，48.05％；LCMS(ESI)m/z 661.36[M+1]+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δ7.88(d,J＝8.8Hz,1H),7.61-7.57(m,4H),7.44-7.29(m,5H),4.26(d,J＝10.4Hz,1H),4.17-4.15(m,3H),4.03(s,2H),3.90-3.83(m,2H),3.63-3.56(m,9H),3.41-3.34(m,2H),2.85-2.81(m,3H),2.47(dd,J＝14.0,4.8Hz,1H),1.95(t,J＝14.0Hz,1H)。
(2R,4S,5R,6R)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)-6-((1R,2R)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号26591)和(2S,4S,5R,6R)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)-6-((1R,2R)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号26568)
(1S,2R)-1-((2R,3R,4S)-4-乙酰氧基-3-(2-乙酰氧基乙酰胺基)-6-(甲氧基羰基)-6-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)丙烷-1,2,3-三基三乙酸酯(3)的合成
向在二氯甲烷(32.0mL)中的(1S,2R)-1-((2R,3R,4S,6R)-3-乙酰胺基-4-乙酰氧基-6-(甲氧基羰基)-6-(对甲苯基硫基)四氢-2H-吡喃-2-基)丙烷-1,2,3-三基三乙酸酯(1，2.0g，3.34mmol)的搅拌的溶液中添加2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙-1-醇(2，1.206g，8.36mmol)和MS(2.0g 100％w/w)。将所得的悬浮液在氮气气氛中搅拌持续12h。将反应混合物冷却至-40℃，然后在-40℃下依次滴加N-碘代琥珀酰亚胺(1.882g，8.36mmol)和三氟甲磺酸(0.294mL，3.34mmol)。将所得的反应混合物在-40℃下搅拌持续1h。在完成之后，添加三乙胺直至中性pH，并通过硅藻土过滤反应混合物。在减压下浓缩滤液以获得粗残余物，该粗残余物然后用柱色谱法(在己烷中的40-60％乙酸乙酯)纯化，以得到作为异头混合物的呈白色固体的((1S,2R)-1-((2R,3R,4S)-4-乙酰氧基-3-(2-乙酰氧基乙酰胺基)-6-(甲氧基羰基)-6-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)丙烷-1,2,3-三基三乙酸酯(3)。产率：1.50g，66.34％；LC-MS(ESI)m/z676.14[M+1]+。
(2R,4S,5R,6R)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)-6-((1R,2R)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号26591)和(2S,4S,5R,6R)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)-6-((1R,2R)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号26568)的合成
向在0℃的甲醇(20.0mL)中的(1S,2R)-1-((2R,3R,4S)-4-乙酰氧基-3-(2-乙酰氧基乙酰胺基)-6-(甲氧基羰基)-6-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)丙烷-1,2,3-三基三乙酸酯(3，1.50g，2.22mmol)的搅拌的溶液中添加氢氧化锂(0.264g，11.1mmol)。允许反应混合物温热至室温并搅拌持续6h。在完成之后，添加Dowex氢形式直至中性pH，并通过烧结漏斗过滤反应混合物。在真空下除去滤液以获得粗稠浆，该粗稠浆然后经由制备HPLC型(含0.1％TFA的15-45％乙腈水溶液)纯化。合并含有期望的产物(两个峰)的级分并冻干至干燥，以得到呈白色固体的(2R,4S,5R,6R)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)-6-((1R,2R)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号26591)。产率：0.234g，46.70％；ELSD-MS(ESI)m/z 452.2[M+1]+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δ7.90(d,J＝7.6Hz,1H),4.19(d,J＝2.4Hz,2H),4.03(s,2H),3.94-3.90(m,1H),3.86-3.79(m,4H),3.70-3.51(m,10H),3.34-3.31(m,1H),2.83(t,J＝2.4Hz,1H),2.74(dd,J＝11.8&4.4Hz,1H),1.95(t,J＝11.8Hz,1H)；作为白色固体的(2S,4S,5R,6R)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)-6-((1R,2R)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号26568)。产率：0.268g，53.48％；ELSD-MS(ESI)m/z 452.2[M+1]+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δ7.81(d,J＝7.6Hz,1H),4.20(d,J＝2.4Hz,2H),4.19-4.15(m,1H),4.04(s,2H),4.02-4.00(m,1H),3.95-3.91(m,1H),3.69-3.62(m,7H),3.53-3.47(m,2H),2.84(t,J＝2.4Hz,1H),2.39(dd,J＝12.8&4.8Hz,1H),1.95(t,J＝12.0Hz,1H)。
(2S,4S,5R,6R)-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-6-(丁-3-炔-1-基氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲氧基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-6-((1R,2R)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号26590)的合成
(2R,3S,4S,5R,6R)-2-((((2R,4S,5R,6R)-4-乙酰氧基-5-(2-乙酰氧基乙酰胺基)-2-(甲氧基羰基)-6-((1S,2R)-1,2,3-三乙酰氧基丙基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)-6-(丁-3-炔-1-基氧基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三基三苯甲酸酯(3)的合成
在室温下，在氮气气氛中，在15h内，向在无水二氯甲烷(18.0mL)中的(1S,2R)-1-((2R,3R,4S,6S)-4-乙酰氧基-3-(2-乙酰氧基乙酰胺基)-6-(甲氧基羰基)-6-(对甲苯基硫基)四氢-2H-吡喃-2-基)丙烷-1,2,3-三基三乙酸酯(1，1.0g，1.53mmol)的搅拌的溶液中添加(2R,3R,4S,5S,6R)-2-(丁-3-炔-1-基氧基)-6-(羟基甲基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三基三苯甲酸酯(2，2.08g，3.81mmol)和活化的粉末状分子筛(1.0g，100％w/w)。将反应混合物冷却至-40℃，然后在-40℃下添加1-碘代吡咯烷-2,5-二酮(0.823g，3.66mmol)和三氟甲磺酸(0.134mL，1.53mmol)。将反应在-40℃下搅拌持续1h。在完成之后，将反应混合物用三乙胺(0.1mL，中性pH)淬灭并温热至室温。将反应混合物通过烧结漏斗过滤并用二氯甲烷洗涤。滤液用碳酸氢钠饱和溶液洗涤，并用硫酸钠干燥，过滤，并在减压浓缩，以获得粗残余物。粗残余物经由柱色谱法(在己烷中的45-55％乙酸乙酯)纯化，以得到呈灰白色固体的((2R,3S,4S,5R,6R)-2-((((2R,4S,5R,6R)-4-乙酰氧基-5-(2-乙酰氧基乙酰胺基)-2-(甲氧基羰基)-6-((1S,2R)-1,2,3-三乙酰氧基丙基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)-6-(丁-3-炔-1-基氧基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三基三苯甲酸酯(3)。产率：0.60g，36.56％；LCMS(ESI)m/z 1077.02[M+1]+。
(2S,4S,5R,6R)-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-6-(丁-3-炔-1-基氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲氧基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-6-((1R,2R)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号26590)的合成
向在0℃的甲醇(10.0mL)中的(2R,3S,4S,5R,6R)-2-((((2R,4S,5R,6R)-4-乙酰氧基-5-(2-乙酰氧基乙酰胺基)-2-(甲氧基羰基)-6-((1S,2R)-1,2,3-三乙酰氧基丙基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)甲基)-6-(丁-3-炔-1-基氧基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三基三苯甲酸酯(3，0.80g，1.01mmol)的搅拌的溶液中添加氢氧化锂(0.080g，3.35mmol)。允许反应混合物温热至室温并搅拌持续6h。在完成之后，向反应物料中添加Dowex氢形式直至pH 6。通过烧结漏斗过滤反应混合物，并且在真空下除去滤液以获得粗稠浆，该粗稠浆然后经由制备HPLC型(含0.1％TFA的20-45％乙腈水溶液)纯化。合并含有期望的产物的级分并冻干至干燥，以得到作为TFA盐的呈白色固体的(2S,4S,5R,6R)-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-6-(丁-3-炔-1-基氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲氧基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-6-((1R,2R)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号26590)。产率：0.053g，17.62％；ELSD-MS(ESI)m/z 540.2[M+1]+；1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δ4.26(d,J＝7.2Hz,1H),4.17-4.12(m,1H),4.04-4.01(m,3H),3.95-3.63(m,10H),3.53-3.47(m,4H),2.51(dt,J＝7.2&2.4Hz,2H),2.40(dd,J＝13.2&5.2Hz,1H),2.62(t,J＝2.4Hz,1H),1.66(t,J＝12.8Hz,1H)。
(S)-23-叠氮基-18-(4-叠氮基丁基)-17,20-二氧代-4,7,10,13-四氧杂-16,19-二氮杂二十三烷酸全氟苯基酯(化合物编号26594)
(S)-23-叠氮基-18-(4-叠氮基丁基)-17,20-二氧代-4,7,10,13-四氧杂-16,19-二氮杂二十三烷酸叔丁酯(3)的合成
向在甲醇(60.0mL)中的(S)-23-氨基-18-(4-氨基丁基)-17,20-二氧代-4,7,10,13-四氧杂-16,19-二氮杂二十三烷酸叔丁酯(1，3.0g，5.61mmol)的搅拌的溶液中添加碳酸钾(2.32g，16.85mmol)、硫酸铜(0.219g，1.40mmol)和1H-咪唑-1-磺酰基叠氮化物盐酸盐(2，2.57g，12.3mmol)。将所得的反应混合物在室温下搅拌持续24h。在完成之后，将反应混合物用1N盐酸溶液稀释直至pH 3，并用乙酸乙酯提取。有机层经硫酸钠干燥，过滤，并在高真空下浓缩，以获得粗残余物。粗残余物经由快速柱色谱法(在二氯甲烷中的0-5％甲醇)纯化，以得到成浅黄色粘稠液体的(S)-23-叠氮基-18-(4-叠氮基丁基)-17,20-二氧代-4,7,10,13-四氧杂-16,19-二氮杂二十三烷酸叔丁酯(3)。产率：1.50g，45％；ELSD m/z 587.3[M+1]+。
(S)-23-叠氮基-18-(4-叠氮基丁基)-17,20-二氧代-4,7,10,13-四氧杂-16,19-二氮杂二十三烷酸(4)的合成
在0℃下，向在二氯甲烷(20.0mL)中的(S)-23-叠氮基-18-(4-叠氮基丁基)-17,20-二氧代-4,7,10,13-四氧杂-16,19-二氮杂二十三烷酸叔丁酯(3，1.50g，2.55mmol)的搅拌的溶液中添加三氟乙酸(5.0mL)。将所得的反应混合物在氮气下在室温下搅拌持续4h。在完成之后，浓缩反应混合物并干燥，以得到呈浅黄色粘稠液体的(S)-23-叠氮基-18-(4-叠氮基丁基)-17,20-二氧代-4,7,10,13-四氧杂-16,19-二氮杂二十三烷酸(4)。产率：1.30g，96％；ELSD m/z 531.3[M+1]+。
(S)-23-叠氮基-18-(4-叠氮基丁基)-17,20-二氧代-4,7,10,13-四氧杂-16,19-二氮杂二十三烷酸全氟苯基酯(化合物编号26594)的合成
向在0℃的四氢呋喃(20.0mL)中的S)-23-叠氮基-18-(4-叠氮基丁基)-17,20-二氧代-4,7,10,13-四氧杂-16,19-二氮杂二十三烷酸(4，1.30g，2.45mmol)的搅拌的溶液中添加2,3,4,5,6-五氟苯酚(5，0.897g，4.90mmol)和N,N′-二异丙基碳二亚胺(0.96mL，6.13mmol)。将所得的反应混合物在室温下搅拌持续24h。在完成之后，浓缩溶剂以获得残余物，该残余物然后经由制备型HPLC(含0.1％ TFA的30-70％乙腈水溶液)纯化。将含有期望的产物的级分合并，并冻干至干燥，以得到呈浅黄色粘稠液体的(S)-23-叠氮基-18-(4-叠氮基丁基)-17,20-二氧代-4,7,10,13-四氧杂-16,19-二氮杂二十三烷酸全氟苯基酯(化合物编号26594)。产率：0.160g，12％；ELSD m/z 697.4[M+1]+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.90(bs,1H),6.35(d,J＝7.6Hz,1H),4.46-4.41(m,1H),3.90(t,J＝12.4Hz,1H),3.67-3.61(m,12H),3.56-3.45(m,5H),3.64(t,J＝12.4Hz,2H),3.28(t,J＝12.4Hz,1H),2.97(t,J＝12.4Hz,2H),2.42(t,J＝14.4Hz,2H),1.95-1.75(m,4H),1.61-1.37(m,4H)。
(18S,21S)-26-叠氮基-18,21-双(4-叠氮基丁基)-17,20,23-三氧代-4,7,10,13-四氧杂-16,19,22-三氮杂二十六烷酸全氟苯基酯(化合物编号26604)
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(18S,21S)-26-叠氮基-18,21-双(4-叠氮基丁基)-17,20,23-三氧代-4,7,10,13-四氧杂-16,19,22-三氮杂二十六烷酸叔丁酯(3)的合成
向在甲醇(100.0mL)中的(18S,21S)-26-氨基-18,21-双(4-氨基丁基)-17,20,23-三氧代-4,7,10,13-四氧杂-16,19,22-三氮杂二十六烷酸叔丁酯(1，4.0g，6.03mmol)的搅拌的溶液中添加碳酸钾(7.51g，54.3mmol)、硫酸铜(0.452g，1.81mmol)和1H-咪唑-1-磺酰基叠氮化物盐酸盐(2，4.55g，21.7mmol)。将所得的反应混合物在室温下搅拌持续24h。在完成之后，将反应混合物用1N盐酸溶液稀释直至pH 3，并用乙酸乙酯提取。有机层经硫酸钠干燥，过滤，并在高真空下浓缩，以获得粗残余物。粗残余物经由快速柱色谱法(在二氯甲烷中的0-5％甲醇)纯化，以得到呈浅黄色粘稠液体的(18S,21S)-26-叠氮基-18,21-双(4-叠氮基丁基)-17,20,23-三氧代-4,7,10,13-四氧杂-16,19,22-三氮杂二十六烷酸叔丁酯(3)。产率：2.50g，56％；ELSD m/z 741.4[M+1]+。
(18S,21S)-26-叠氮基-18,21-双(4-叠氮基丁基)-17,20,23-三氧代-4,7,10,13-四氧杂-16,19,22-三氮杂二十六烷酸(4)的合成
在0℃下，向在二氯甲烷(30.0mL)中的(18S,21S)-26-叠氮基-18,21-双(4-叠氮基丁基)-17,20,23-三氧代-4,7,10,13-四氧杂-16,19,22-三氮杂二十六烷酸叔丁酯(3，2.50g，3.37mmol)的搅拌的溶液中添加三氟乙酸(5.0mL)。将所得的反应混合物在室温下在氮气下搅拌持续4h。在完成之后，将反应混合物浓缩并干燥，以得到呈浅黄色粘稠液体的(18S,21S)-26-叠氮基-18,21-双(4-叠氮基丁基)-17,20,23-三氧代-4,7,10,13-四氧杂-16,19,22-三氮杂二十六烷酸(4)。产率：2.0g，86％；ELSD m/z 685.3[M+1]+。
(18S,21S)-26-叠氮基-18,21-双(4-叠氮基丁基)-17,20,23-三氧代-4,7,10,13-四氧杂-16,19,22-三氮杂二十六烷酸全氟苯基酯(化合物编号26604)的合成。
向在0℃的四氢呋喃(20.0mL)中的(18S,21S)-26-叠氮基-18,21-双(4-叠氮基丁基)-17,20,23-三氧代-4,7,10,13-四氧杂-16,19,22-三氮杂二十六烷酸(4，1.0g，1.46mmol)的搅拌的溶液中添加2,3,4,5,6-五氟苯酚(5，0.538g，2.92mmol)和N,N′-二异丙基碳二亚胺(0.576mL，3.65mmol)。将所得的反应混合物在室温下搅拌持续24h。在完成之后，浓缩溶剂以获得残余物，该残余物然后经由制备型HPLC(含0.1％TFA的20-55％乙腈水溶液)纯化。将含有期望的产物的级分合并，并冻干至干燥，以得到呈浅黄色粘稠液体的(18S,21S)-26-叠氮基-18,21-双(4-叠氮基丁基)-17,20,23-三氧代-4,7,10,13-四氧杂-16,19,22-三氮杂二十六烷酸酯(化合物编号26604)。产率：0.270g，21.7％；LCMS m/z851.56[M+1]+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.71-6.66(m,2H),6.33-6.13(m,1H),4.44-4.36(m,2H),3.89(t,J＝12.4Hz,1H),3.67-3.61(m,12H),3.56-3.54(m,2H),3.47-3.44(m,2H),3.37(t,J＝6.4Hz,2H),3.28-3.24(m,4H),2.96(t,J＝12.4Hz,2H),2.34(t,J＝14.4Hz,2H),1.96-1.80(m,4H),1.67-1.59(m,6H),1.43-1.36(m,4H)。
(2R,4S,5R,6R)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-(2-(2-((1-(15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙氧基)-6-((1R,2R)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号26614)
(2R,4S,5R,6R)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-(2-(2-((1-(15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙氧基)-6-((1R,2R)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号26614)的合成
向在带有搅拌棒的1打兰小瓶中的NMP(0.3mL)中的(2R,4S,5R,6R)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)-6-((1R,2R)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(26591，1.00当量，24.5mg，0.0542mmol)的溶液中添加在NMP(0.3mL)中的1-叠氮基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸全氟苯基酯(1，1.10当量，27.3mg，0.0596mmol)的溶液，随后添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(2.50当量，50.5mg，0.136mmol)。将所得到的透明绿色溶液加盖，并在室温下搅拌持续10min。用乙酸稀释反应产物，过滤，并经由制备型HPLC(含0.1％ TFA的15-65％乙腈水溶液)纯化。合并含有期望的产物的级分并冻干至干燥，以得到呈粘性白色固体的(2R,4S,5R,6R)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-(2-(2-((1-(15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙氧基)-6-((1R,2R)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号26614)。产率：28.1mg，57％；LCMS m/z 909.6[M+1]+；1H NMR(300MHz,DMSO-d6，采用D2O)δ7.99(s,1H),7.80(bs,1H),5.61(bs,1H),4.52-4.40(m,4H),3.87-2.69(m,35H),1.56-1.43(m,2H)。
(2R,2'R,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-2,2'-(((((((((S)-9,14,22-三氧代-16-((15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)氨基甲酰基)-3,6,25,28-四氧杂-10,15,21-三氮杂三十烷-1,30-二基)双(1H-1,2,3-三唑-1,4-二基))双(亚甲基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-6-((1R,2R)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸)(化合物编号26615)
(2R,2′R,4S,4′S,5R,5′R,6R,6′R)-2,2′-(((((((((S)-9,14,22-三氧代-16-((15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)氨基甲酰基)-3,6,25,28-四氧杂-10,15,21-三氮杂三十烷-1,30-二基)双(1H-1,2,3-三唑-1,4-二基))双(亚甲基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-6-((1R,2R)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸)(化合物编号26615)的合成
向在带有搅拌棒的1打兰小瓶中的NMP(0.5mL)中的(R)-1-叠氮基-16-(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-9,14,17-三氧代-3,6,21,24,27,30-六氧杂-10,15,18-三氮杂三十三烷-33-酸全氟苯基酯(26332，1.00当量，32.1mg，0.0317mmol)和(2R,4S,5R,6R)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)-6-((1R,2R)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(26591，2.10当量，30.0mg，0.0665mmol)的溶液中添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(5.00当量，59.0mg，0.158mmol)。将所得到的无色溶液加盖，并在室温下搅拌持续10min(缓慢地变成绿色)。用在NMP中的70％乙酸的混合物稀释反应产物，过滤，并经由制备型HPLC(含0.1％ TFA的15-65％乙腈水溶液)纯化。合并含有期望的产物的级分并冻干至干燥，以得到呈白色固体的(2R,2′R,4S,4′S,5R,5′R,6R,6′R)-2,2′-(((((((((S)-9,14,22-三氧代-16-((15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)氨基甲酰基)-3,6,25,28-四氧杂-10,15,21-三氮杂三十烷-1,30-二基)双(1H-1,2,3-三唑-1,4-二基))双(亚甲基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-6-((1R,2R)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸)(化合物编号26615)。产率：32.9mg，54％；LCMS m/z1917.5[M+1]+；1H NMR(300MHz，DMSO-d6，采用D2O)δ7.98(s,2H),7.82(bs,2H),4.52-4.41(m,8H),4.12-2.69(m,79H),2.31-2.19(m,4H),2.14-2.04(m,2H),1.65-1.38(m,4H),1.38-1.09(m,4H)。
化合物编号26616
化合物编号26616的合成
向在带有搅拌棒的1打兰小瓶中的NMP(0.5mL)中的(16R,19R)-1-叠氮基-16,19-双(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-9,14,17,20-四氧代-3,6,24,27,30,33-六氧杂-10,15,18,21-四氮杂三十六烷-36-酸全氟苯基酯(26333，1.00当量，32.3mg，0.0224mmol)和((2R,4S,5R,6R)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)-6-((1R,2R)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(26591，3.10当量，31.3mg，0.0694mmol)的溶液中添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(7.50当量，62.6mg，0.168mmol)。将所得到的透明绿色溶液加盖，并在室温下搅拌持续10min。用在NMP中的70％乙酸的混合物稀释反应产物，过滤，并经由制备型HPLC(含0.1％ TFA的15-65％乙腈水溶液)纯化。合并含有期望的产物的级分并冻干至干燥，以得到呈白色固体的化合物编号26616。产率：31.1mg，52％；LCMS m/z 1341.6[M/2+1]+；1H NMR(300MHz，DMSO-d6，采用D2O)δ7.99(s,3H),7.82(bs,3H),4.53-4.41(m,12H),4.15-2.70(m,107H),2.31-2.19(m,6H),2.14-2.04(m,2H),1.66-1.38(m,8H),1.38-1.08(m,8H)。
N2-(N2-(4-叠氮基丁酰基)-N6-重氮基-L-赖氨酰基)-N6-重氮基-L-赖氨酸全氟苯基酯(化合物编号26634)和N2-(N2-(4-叠氮基丁酰基)-N6-重氮基-L-赖氨酰基)-N6-重氮基-L-赖氨酸(化合物编号26728)
N2-(N2-(4-叠氮基丁酰基)-N6-重氮基-L-赖氨酰基)-N6-重氮基-L-赖氨酸叔丁酯(3)的合成
向在甲醇(100.0mL)中的(4-氨基丁酰基)-L-赖氨酸叔丁酯(1，5.0g，12.0mmol)的搅拌的溶液中添加碳酸钾(15.0g，108mmol)、硫酸铜(0.901g，3.61mmol)和1H-咪唑-1-磺酰基叠氮化物盐酸盐(2，7.29g，42.1mmol。将所得的反应混合物在室温下搅拌持续24h。在完成之后，将反应混合物用1N盐酸溶液稀释直至pH 3，并用乙酸乙酯提取。有机层经硫酸钠干燥，过滤，并在高真空下浓缩，以获得粗残余物。粗残余物经由快速柱色谱法(在己烷中的30-50％乙酸乙酯)纯化，以得到呈浅黄色粘稠液体的N2-(N2-(4-叠氮基丁酰基)-N6-重氮基-L-赖氨酰基)-N6-重氮基-L-赖氨酸叔丁酯(3)。产率：1.80g，30％；ELSD m/z 494.2[M+1]+。
N2-(N2-(4-叠氮基丁酰基)-N6-重氮基-L-赖氨酰基)-N6-重氮基-L-赖氨酸(化合物编号26728)的合成
向在0℃的二氯甲烷(10mL)中的N2-(N2-(4-叠氮基丁酰基)-N6-重氮基-L-赖氨酰基)-N6-重氮基-L-赖氨酸叔丁酯(3，1.0g，2.03mmol)的搅拌的溶液中添加三氟乙酸(3.0mL)。将所得的反应混合物在室温下在氮气下搅拌持续5h。在完成之后，将反应混合物浓缩并干燥，以得到呈浅黄色粘稠液体的N2-(N2-(4-叠氮基丁酰基)-N6-重氮基-L-赖氨酰基)-N6-重氮基-L-赖氨酸(化合物编号26728)。产率：0.70g，79％；ELSD m/z 438.2[M+1]+,1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.58(bs,1H),8.15(d,J＝7.6Hz,1H),8.00(d,J＝8.4Hz,1H),4.37-4.15(m,2H),3.32-3.29(m,6H),2.23-2.18(m,2H),1.75-1.23(m,16H)。
N2-(N2-(4-叠氮基丁酰基)-N6-重氮基-L-赖氨酰基)-N6-重氮基-L-赖氨酸全氟苯基酯(化合物编号26634)的合成
向在0℃的四氢呋喃(5.0mL)中的N2-(N2-(4-叠氮基丁酰基)-N6-重氮基-L-赖氨酰基)-N6-重氮基-L-赖氨酸(26728，0.50g，1.14mmol)的搅拌的溶液中添加2,3,4,5,6-五氟苯酚(5，0.421g，2.29mmol)和N,N′-二异丙基碳二亚胺(0.440mL，2.86mmol)。将所得的反应混合物在室温下搅拌持续16h。在完成之后，浓缩溶剂以获得残余物，该残余物然后经由制备型HPLC(含0.1％ TFA的30-65％乙腈水溶液)纯化。将含有期望的产物的级分合并，并冻干至干燥，以得到呈灰白色粘性固体的N2-(N2-(4-叠氮基丁酰基)-N6-重氮基-L-赖氨酰基)-N6-重氮基-L-赖氨酸全氟苯基酯(化合物编号26634)。产率：0.080g，11.5％；ELSD m/z604.4[M+1]+1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.43-8.38(m,1H),8.12-7.97(m 1H),4.62-4.59(m,1H),4.48-4.47(m,1H),2.24-2.19(m,3H),1.78-1.23(m,19H)。
(2S,4S,5R,6R)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-((2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙基)硫基)-6-((1R,2R)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号26635)
(2R,4S,5R,6R)-5-氨基-4-羟基-2-(对甲苯基硫基)-6-((1R,2R)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸甲酯(2)的合成
在0℃下，向在甲醇(100.0mL)中的((1S,2R)-1-((2R,3R,4S,6R)-3-乙酰胺基-4-乙酰氧基-6-(甲氧基羰基)-6-(对甲苯基硫基)四氢-2H-吡喃-2-基)丙烷-1,2,3-三基三乙酸酯(1，10.0g，16.73mmol)的搅拌的溶液中滴加甲烷磺酸(6.52mL，100.4mmol)。将所得的反应混合物在63℃下搅拌持续30h，并通过LC-MS监测反应的进展。在完成之后，将反应混合物冷却至0℃并用三乙胺(约15.0mL，pH 7)淬灭。在减压下浓缩混合物以获得呈浅棕色凝胶的粗(2R,4S,5R,6R)-5-氨基-4-羟基-2-(对甲苯基硫基)-6-((1R,2R)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸甲酯(2)。产率：6.0g，92.6％；LC-MS(ESI)m/z 388.14[M+1]+。
(2R,4S,5R,6R)-5-(2-乙酰氧基乙酰胺基)-4-羟基-2-(对甲苯基硫基)-6-((1R,2R)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸甲酯(4)的合成
在惰性气氛中，在搅拌下，将粗(2R,4S,5R,6R)-5-氨基-4-羟基-2-(对甲苯基硫基)-6-((1R,2R)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸甲酯(2，6.0g，15.49mmol)溶解在干燥的四氢呋喃(60.0mL)中，并在0℃下冷却。在0℃下，向该溶液中缓慢添加三乙胺(6.34mL，46.46mmol)，然后添加2-氯-2-氧代乙酸乙酯(3，1.66mL，15.49mmol)；在0℃下搅拌反应，并通过TLC监测进展。在完成之后，将混合物在减压下浓缩，以获得粗残余物，该粗残余物然后经由柱色谱法(在己烷中的60-75％乙酸乙酯)纯化，以得到呈白色固体的(2R,4S,5R,6R)-5-(2-乙酰氧基乙酰胺基)-4-羟基-2-(对甲苯基硫基)-6-((1R,2R)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸甲酯(4)。产率：4.80g，63.58％；LCMS(ESI)m/z 488.52[M+1]+。
(1S,2R)-1-((2R,3R,4S,6R)-4-乙酰氧基-3-(2-乙酰氧基乙酰胺基)-6-(甲氧基羰基)-6-(对甲苯基硫基)四氢-2H-吡喃-2-基)丙烷-1,2,3-三基三乙酸酯(5)的合成
在0℃下，在30min内，向在吡啶(50.0mL)中的(2R,4S,5R,6R)-5-(2-乙酰氧基乙酰胺基)-4-羟基-2-(对甲苯基硫基)-6-((1R,2R)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸甲酯(4，4.80g，9.85mmol)的搅拌的溶液中滴加醋酸酐(9.31mL，98.46mmol)。将反应混合物搅拌过夜并允许温热至室温。通过TLC和LC-MS监测反应的进展。在完成之后，在真空下除去挥发物以获得粗稠浆。将稠浆与乙酸乙酯(240.0mL)一起倒入分离漏斗中，并用1N HCl溶液洗涤，然后用饱和硫酸钠溶液和DM水洗涤。有机层经无水硫酸钠干燥，并在减压下浓缩，以获得粗稠浆。该稠浆经由柱色谱法(在己烷中的60-70％乙酸乙酯)纯化，以得到呈白色固体的(1S,2R)-1-((2R,3R,4S,6R)-4-乙酰氧基-3-(2-乙酰氧基乙酰胺基)-6-(甲氧基羰基)-6-(对甲苯基硫基)四氢-2H-吡喃-2-基)丙烷-1,2,3-三基三乙酸酯(5)。产率：3.40g，52.67％；LCMS(ESI)m/z 654.2[M-1]-。
(1S,2R)-1-((2R,3R,4S,6S)-4-乙酰氧基-3-(2-乙酰氧基乙酰胺基)-6-羟基-6-(甲氧基羰基)四氢-2H-吡喃-2-基)丙烷-1,2,3-三基三乙酸酯(6)的合成
将在丙酮：水(9:1，35.0mL)中的((1S,2R)-1-((2R,3R,4S,6R)-4-乙酰氧基-3-(2-乙酰氧基乙酰胺基)-6-(甲氧基羰基)-6-(对甲苯基硫基)四氢-2H-吡喃-2-基)丙烷-1,2,3-三基三乙酸酯(5，3.40g，5.19mmol)的搅拌的溶液冷却至0℃。向该溶液中添加N-碘代琥珀酰亚胺(4.08g，18.15mmol)，并将反应混合物在0℃下保持持续3h。通过LC-MS/TLC监测反应进展，并且在完成之后，添加焦亚硫酸钠(10.0mL)和乙酸乙酯(30.0mL)的饱和水溶液。将反应混合物再搅拌10mn并转移到分液漏斗中。分离有机层，并用乙酸乙酯(20mL)提取水相。合并有机层，并依次用饱和碳酸氢钠溶液和DM水洗涤。有机层经无水硫酸钠干燥，并在旋转蒸发器上浓缩以获得稠浆。该稠浆经由柱色谱法(在己烷中的55-65％乙酸乙酯)纯化，以得到呈白色固体的(1S,2R)-1-((2R,3R,4S,6S)-4-乙酰氧基-3-(2-乙酰氧基乙酰胺基)-6-羟基-6-(甲氧基羰基)四氢-2H-吡喃-2-基)丙烷-1,2,3-三基三乙酸酯(6)。产率：1.90g，66.68％；LCMS(ESI)m/z 550.48[M+1]+。
(1S,2R)-1-((2R,3R,4S,6R)-4,6-二乙酰氧基-3-(2-乙酰氧基乙酰胺基)-6-(甲氧基羰基)四氢-2H-吡喃-2-基)丙烷-1,2,3-三基三乙酸酯(7)的合成
在0℃下，在30min内，向在吡啶(20.0mL)中的(1S,2R)-1-((2R,3R,4S,6S)-4-乙酰氧基-3-(2-乙酰氧基乙酰胺基)-6-羟基-6-(甲氧基羰基)四氢-2H-吡喃-2-基)丙烷-1,2,3-三基三乙酸酯(6，1.90g，3.46mmol)的搅拌的溶液中滴加乙酸酐(0.653mL，6.92mmol)。将反应混合物搅拌过夜并且允许温热至室温。通过TLC和LC-MS监测反应的进展。在完成之后，在真空下除去挥发物以获得粗稠浆。然后将稠浆与乙酸乙酯(30.0mL)一起倒入分液漏斗中，并用1N HCl溶液洗涤，然后用饱和硫酸钠溶液和DM水洗涤。有机层经无水硫酸钠干燥，并在减压下浓缩，以获得粗稠浆。该稠浆经由柱色谱法(在己烷中的45-55％乙酸乙酯)纯化，以得到呈白色固体的(1S,2R)-1-((2R,3R,4S,6R)-4,6-二乙酰氧基-3-(2-乙酰氧基乙酰胺基)-6-(甲氧基羰基)四氢-2H-吡喃-2-基)丙烷-1,2,3-三基三乙酸酯(7)。产率：1.50g，73.34％；LCMS(ESI)m/z 591.52[M+1]+。
(1S,2R)-1-((2R,3R,4S,6R)-4-乙酰氧基-3-(2-乙酰氧基乙酰胺基)-6-(甲氧基羰基)-6-((2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙基)硫基)四氢-2H-吡喃-2-基)丙烷-1,2,3-三基三乙酸酯(9)的合成
在惰性气氛中，在室温下在搅拌下，将(1S,2R)-1-((2R,3R,4S,6R)-4,6-二乙酰氧基-3-(2-乙酰氧基乙酰胺基)-6-(甲氧基羰基)四氢-2H-吡喃-2-基)丙烷-1,2,3-三基三乙酸酯(7，1.0g，1.69mmol)和2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙烷-1-硫醇(8，1.35g，8.45mmol)溶解在干燥的二氯甲烷(10.0mL)中。在室温下，向该溶液中添加活化的粉末状分子筛(1.0g 100％w/w)，并搅拌反应混合物持续30min。将反应混合物冷却至0℃，并在0℃下在15min内，滴加BF3·Et2O(1.50mL，5.07mmol)。将混合物在室温下搅拌持续16h。通过TLC/LC-MS监测反应混合物，并且在完成之后，通过三乙胺将反应混合物淬灭直至中性pH。将反应混合物过滤并用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤。分离有机层，用无水硫酸钠干燥，并在旋转蒸发器上浓缩以获得粗稠浆。该稠浆经由柱色谱法(在己烷中的60-70％乙酸乙酯)纯化，以得到呈白色固体的(1S,2R)-1-((2R,3R,4S,6R)-4-乙酰氧基-3-(2-乙酰氧基乙酰胺基)-6-(甲氧基羰基)-6-((2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙基)硫基)四氢-2H-吡喃-2-基)丙烷-1,2,3-三基三乙酸酯(9)。产率：0.70g，59.86％；LCMS(ESI)m/z 692.70[M+1]+。
(2R,4S,5R,6R)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-((2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙基)硫基)-6-((1R,2R)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号26635)的合成
向在0℃的甲醇(10.0mL)中的(1S,2R)-1-((2R,3R,4S,6R)-4-乙酰氧基-3-(2-乙酰氧基乙酰胺基)-6-(甲氧基羰基)-6-((2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙基)硫基)四氢-2H-吡喃-2-基)丙烷-1,2,3-三基三乙酸酯(9，0.70g，1.01mmol)的搅拌的溶液中添加氢氧化锂(0.072g，3.04mmol)。将反应混合物搅拌持续6h，并允许温热至室温。通过TLC和LC-MS监测反应的进展。在完成之后，添加Dowex氢形式直至中性pH，并通过烧结漏斗过滤反应混合物。在真空下除去滤液以获得粗稠浆，该粗稠浆经由制备型HPLC(含0.1％ TFA的20-45％乙腈水溶液)纯化。合并含有期望的产物的级分并冻干至干燥，以得到呈无定形固体的(2R,4S,5R,6R)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-((2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙基)硫基)-6-((1R,2R)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号26635)。产率：0.078g，16.49％；LCMS(ESI)m/z 468.28[M+1]+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δ4.26(d,J＝10.4Hz,1H),4.18(d,J＝2.4Hz,2H),4.14(dd,J＝10.4&4.8Hz,2H),4.04(s,2H),3.90(t,J＝10.4Hz,2H),3.82-3.78(m,2H),3.68-3.52(m,8H),2.87-2.83(m,3H),2.48(dd,J＝14.0,4.8Hz,1H),1.95(t,J＝14.0Hz,1H)。
N2-(4-叠氮基丁酰基)-N6-重氮基-L-赖氨酸(化合物编号26727)
N2-(4-叠氮基丁酰基)-N6-重氮基-L-赖氨酸叔丁酯(3)的合成
向在甲醇(40.0mL)中的(4-氨基丁酰基)-L-赖氨酸叔丁酯(1，2.4g，8.35mmol)的搅拌的溶液中添加碳酸钾(6.92g，50.1mmol)、硫酸铜(0.417g，1.67mmol)和1H-咪唑-1-磺酰基叠氮化物盐酸盐(2，3.61g，20.9mmol)。将所得的反应混合物在室温下搅拌持续24h。在完成之后，将反应混合物用1N盐酸溶液稀释直至pH 3，并用乙酸乙酯提取。有机层经硫酸钠干燥，过滤，并在高真空下浓缩，以获得粗残余物。粗残余物经由快速柱色谱法(在己烷中的30-50％乙酸乙酯)纯化，以得到呈浅黄色粘稠液体的N2-(4-叠氮丁酰基)-N6-重叠基-L-赖氨酸叔丁酯(3)。产率：1.0g，35％；ELSD m/z 340.5[M+1]+。
N2-(4-叠氮基丁酰基)-N6-重氮基-L-赖氨酸(化合物编号26727)的合成
在0℃下，向在二氯甲烷(10.0mL)中的N2-(4-叠氮丁酰基)-N6-重叠基-L-赖氨酸叔丁酯(3，1.0g，2.95mmol)的搅拌的溶液中添加三氟乙酸(2.0mL)。将所得的混合物在室温下在氮气下搅拌持续4h。在完成之后，将反应混合物浓缩并干燥，以得到呈浅黄色粘稠液体的N2-(4-叠氮丁酰基)-N6-二氮杂-L-赖氨酸(化合物编号26727)。产率：0.80g，95％；ELSDm/z 284.0[M+1]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.08(bs,1H),8.14(d,J＝7.6Hz,1H),4.19-4.13(m,1H),3.33-3.29(m,4H),2.22(t,J＝14.4Hz,2H),1.78-1.33(m,8H)。
(2S,4S,5R,6R)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-((2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙基)硫基)-6-((1R,2R)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号26729)
(2R,4S,5R,6R)-5-氨基-4-羟基-2-(对甲苯基硫基)-6-((1R,2R)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸甲酯(2)的合成
在0℃下，向在甲醇(150.0mL)中的(1S,2R)-1-((2R,3R,4S,6R)-4-乙酰氧基-3-(2-乙酰氧基乙酰胺基)-6-羟基-6-(甲氧基羰基)四氢-2H-吡喃-2-基)丙烷-1,2,3-三基三乙酸酯(1，1.0g，1.82mmol)的搅拌的溶液中滴加无水甲醇(0.6mL)。将所得的反应混合物在室温下搅拌持续24h，并通过TLC监测反应的进展。在完成之后，在减压下浓缩反应混合物以获得呈浅棕色凝胶的粗(1S,2R)-1-((2R,3R,4S,6R)-4-乙酰氧基-3-(2-乙酰氧基乙酰胺基)-6-氯-6-(甲氧基羰基)四氢-2H-吡喃-2-基)丙烷-1,2,3-三基三乙酸酯(2)。产率：1.0g；LC-MS(ESI)m/z 550.48[M+1]+。
(1S,2R)-1-((2R,3R,4S,6S)-4-乙酰氧基-3-(2-乙酰氧基乙酰胺基)-6-(乙酰基硫基)-6-(甲氧基羰基)四氢-2H-吡喃-2-基)丙烷-1,2,3-三基三乙酸酯(3)的合成
在惰性气氛中，在0℃下，搅拌在干燥丙酮(20.0mL)中的粗(1S,2R)-1-((2R,3R,4S,6R)-4-乙酰氧基-3-(2-乙酰氧基乙酰胺基)-6-氯-6-(甲氧基羰基)四氢-2H-吡喃-2-基)丙烷-1,2,3-三基三乙酸酯(2，1.0g，1.76mmol)的溶液。在0℃下，向该溶液中逐份添加硫代乙酸钾(0.603g，5.28mmol)；将反应在0℃下搅拌持续3h，并通过TLC监测进展。在完成之后，将混合物在减压下浓缩，以获得粗残余物。将粗残余物溶解在乙酸乙酯中，并用1NHCl洗涤所得的溶液，然后用DM水洗涤。分离有机层，用无水硫酸钠干燥，用硫酸钠干燥并在旋转蒸发器上浓缩以获得稠残余物。残余物经由柱色谱法(在己烷中的70-80％乙酸乙酯)纯化，以获得呈白色固体的(1S,2R)-1-((2R,3R,4S,6S)-4-乙酰氧基-3-(2-乙酰氧基乙酰胺基)-6-(乙酰基硫基)-6-(甲氧基羰基)四氢-2H-吡喃-2-基)丙烷-1,2,3-三基三乙酸酯(3)。产率：0.780g，72.91％；LCMS(ESI)m/z 685.8[M+1]+。
(2S,4S,5R,6R)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-((2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙基)硫基)-6-((1R,2R)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号26729)的合成
在0℃下，向在甲醇(10.0mL)中的(1S,2R)-1-((2R,3R,4S,6S)-4-乙酰氧基-3-(2-乙酰氧基乙酰胺基)-6-(乙酰基硫基)-6-(甲氧基羰基)四氢-2H-吡喃-2-基)丙烷-1,2,3-三基三乙酸酯(3，0.78g，1.28mmol)的搅拌的溶液中添加硫代甲醇钠(0.107g，1.54mmol)。将所得的混合物搅拌持续1h。在0℃下，向反应中添加1-碘-2-[2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基]乙烷(3a，0.652g，2.57mmol)，并将反应混合物在室温下搅拌持续1h。通过LCMS来监测反应。在完成之后，在室温下，向相同的反应物料中添加氢氧化锂(0.092g，3.85mmol)，并将反应在室温下搅拌持续6h。通过LC-MS监测反应的进展，并且在完成之后，添加Dowex氢形式直至pH 6，并通过烧结漏斗过滤反应物料。将滤液在旋转蒸发器上浓缩以获得稠的残余物，该稠的残余物然后经由制备型HPLC(含0.1％ TFA的20-45％乙腈水溶液)纯化。合并含有期望的产物的级分并冻干至干燥，以得到呈黄色半固体的(2S,4S,5R,6R)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-((2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙基)硫基)-6-((1R,2R)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(化合物编号26729)。产率：0.140g，23.33％；ELSD-MS(ESI)m/z468.2[M+1]+。1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δ7.96(d,J＝7.6Hz,1H),4.18(d,J＝2.4Hz,1H),4.02(s,2H),3.90-3.81(m,4H),3.72-3.57(m,8H),3.52-3.50(m,1H),3.34(s,1H),2.97-2.77(m,4H),1.82-1.76(t,J＝10.8Hz,1H)。
实例5：另外的可缀合的Siglec配体的合成
(2R,4R,5S,6S)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-((2-(2-((1-(15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙基)硫基)-6-((1S,2S)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(实例1)
(2R,4R,5S,6S)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-((2-(2-((1-(15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙基)硫基)-6-((1S,2S)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(实例1)的合成
向在1打兰小瓶中的NMP(0.3mL)中的(2R,4R,5S,6S)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-((2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙基)硫基)-6-((1S,2S)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(26729，1.00当量)的搅拌的溶液中添加在NMP(0.3mL)中的1-叠氮基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸全氟苯基酯(1，1.10当量)的溶液，随后添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(2.50当量)。将所得的溶液加盖并在室温下搅拌持续10min。用乙酸稀释反应产物，过滤，并经由制备型HPLC(含0.1％TFA的15-65％乙腈水溶液)纯化。将含有期望的产物的级分合并，并冻干至干燥，以得到(2R,4R,5S,6S)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-((2-(2-((1-(15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙基)硫基)-6-((1S,2S)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(实例1)。
(2R,2'R,4R,4′R,5S,5'S,6S,6'S)-2,2'-(((((((((R)-9,14,22-三氧代-16-((15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)氨基甲酰基)-3,6,25,28-四氧杂-10,15,21-三氮杂三十烷-1,30-二基)双(1H-1,2,3-三唑-1,4-二基))双(亚甲基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(磺胺二基))双(4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-6-((1S,2S)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸)(实例2)
(2R,2′R,4R,4'R,5S,5'S,6S,6'S)-2,2'-(((((((((R)-9,14,22-三氧代-16-((15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)氨基甲酰基)-3,6,25,28-四氧杂-10,15,21-三氮杂三十烷-1,30-二基)双(1H-1,2,3-三唑-1,4-二基))双(亚甲基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(磺胺二基))双(4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-6-((1S,2S)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸)(实例2)的合成
向在1打兰小瓶中的NMP(0.5mL)中的(R)-1-叠氮基-16-(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-9,14,17-三氧代-3,6,21,24,27,30-六氧杂-10,15,18-三氮杂三十三烷-33-酸全氟苯基酯(26332，1.00当量)和(2R,4R,5S,6S)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-((2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙基)硫基)-6-((1S,2S)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(26729，2.10当量)的搅拌的溶液中添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(5.00当量)。将所得的溶液加盖并在室温下搅拌持续10min。用在NMP中的70％乙酸的混合物稀释反应产物，过滤，并经由制备型HPLC(含0.1％TFA的15-65％乙腈水溶液)纯化。将含有期望的产物的级分合并，并冻干至干燥，以得到(2R,2′R,4R,4′R,5S,5′S,6S,6′S)-2,2′-(((((((((R)-9,14,22-三氧代-16-((15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)氨基甲酰基)-3,6,25,28-四氧杂-10,15,21-三氮杂三十烷-1,30-二基)双(1H-1,2,3-三唑-1,4-二基))双(亚甲基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(磺胺二基))双(4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-6-((1S,2S)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸)(实例2)。
实例3
/>
实例3的合成
向在1打兰小瓶中的NMP(0.5mL)中的(16R,19R)-1-叠氮基-16,19-双(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-9,14,17,20-四氧代-3,6,24,27,30,33-六氧杂-10,15,18,21-四氮杂三十六烷-36-酸全氟苯基酯(26333，1.00当量)和(2R,4R,5S,6S)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-((2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙基)硫基)-6-((1S,2S)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(26729，3.10当量)的搅拌的溶液中添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(7.50当量)。将所得的溶液加盖并在室温下搅拌持续10min。用在NMP中的70％乙酸的混合物稀释反应产物，过滤，并经由制备型HPLC(含0.1％TFA的15-65％乙腈水溶液)纯化。将含有期望的产物的级分合并，并冻干至干燥，以得到实例3。
(2R,4S,5R,6R)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-((2-(2-((1-(15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙基)硫基)-6-((1R,2R)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(实例4)
/>
(2R,4S,5R,6R)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-((2-(2-((1-(15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙基)硫基)-6-((1R,2R)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(实例4)的合成
向在1打兰小瓶中的NMP(0.3mL)中的(2R,4S,5R,6R)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-((2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙基)硫基)-6-((1R,2R)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(26635，1.00当量)的搅拌的溶液中添加在NMP(0.3mL)中的1-叠氮基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸全氟苯基酯(1，1.10当量)的溶液，随后添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(2.50当量)。将所得的溶液加盖并在室温下搅拌持续10min。用乙酸稀释反应产物，过滤，并经由制备型HPLC(含0.1％TFA的15-65％乙腈水溶液)纯化。将含有期望的产物的级分合并，并冻干至干燥，以得到(2R,4S,5R,6R)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-((2-(2-((1-(15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙基)硫基)-6-((1R,2R)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(实例4)。
(2R,2′R,4S,4′S,5R,5′R,6R,6′R)-2,2′-(((((((((S)-9,14,22-三氧代-16-((15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)氨基甲酰基)-3,6,25,28-四氧杂-10,15,21-三氮杂三十烷-1,30-二基)双(1H-1,2,3-三唑-1,4-二基))双(亚甲基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(磺胺二基))双(4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-6-((1R,2R)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸)(实例5)
/>
(2R,2'R,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-2,2′-(((((((((S)-9,14,22-三氧代-16-((15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)氨基甲酰基)-3,6,25,28-四氧杂-10,15,21-三氮杂三十烷-1,30-二基)双(1H-1,2,3-三唑-1,4-二基))双(亚甲基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(磺胺二基))双(4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-6-((1R,2R)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸)(实例5)的合成
向在1打兰小瓶中的NMP(0.5mL)中的(R)-1-叠氮基-16-(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-9,14,17-三氧代-3,6,21,24,27,30-六氧杂-10,15,18-三氮杂三十三烷-33-酸全氟苯基酯(26332，1.00当量)和(2R,4S,5R,6R)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-((2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙基)硫基)-6-((1R,2R)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(26635，2.10当量)的搅拌的溶液中添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(5.00当量)。将所得的溶液加盖并在室温下搅拌持续10min。用在NMP中的70％乙酸的混合物稀释反应产物，过滤，并经由制备型HPLC(含0.1％TFA的15-65％乙腈水溶液)纯化。将含有期望的产物的级分合并，并冻干至干燥，以得到(2R,2′R,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-2,2'-(((((((((S)-9,14,22-三氧代-16-((15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)氨基甲酰基)-3,6,25,28-四氧杂-10,15,21-三氮杂三十烷-1,30-二基)双(1H-1,2,3-三唑-1,4-二基))双(亚甲基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(磺胺二基))双(4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-6-((1R,2R)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸)(实例5)。
实例6
实例6的合成
向在1打兰小瓶中的NMP(0.5mL)中的(16R,19R)-1-叠氮基-16,19-双(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-9,14,17,20-四氧代-3,6,24,27,30,33-六氧杂-10,15,18,21-四氮杂三十六烷-36-酸全氟苯基酯(26333，1.00当量)和(2R,4S,5R,6R)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-((2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙基)硫基)-6-((1R,2R)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(26635，3.10当量)的搅拌的溶液中添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(7.50当量)。将所得的溶液加盖并在室温下搅拌持续10min。用在NMP中的70％乙酸的混合物稀释反应产物，过滤，并经由制备型HPLC(含0.1％TFA的15-65％乙腈水溶液)纯化。将含有期望的产物的级分合并，并冻干至干燥，以得到实例6。
(2RS,4RS,5SR,6SR)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(2-(1-(15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)甲氧基)-6-((1SR,2SR)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(实例7)
(2RS,4RS,5SR,6SR)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(2-(1-(15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)甲氧基)-6-((1SR,2SR)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(实例7)的合成
向在1打兰小瓶中的NMP(0.3mL)中的(2RS,4RS,5SR,6SR)-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-6-(丁-3-炔-1-基氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲氧基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-6-((1SR,2SR)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(26590，1.00当量)的搅拌的溶液中添加在NMP(0.3mL)中的1-叠氮基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸全氟苯基酯(1，1.10当量)的溶液，随后添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(2.50当量)。将所得的溶液加盖并在室温下搅拌持续10min。用乙酸稀释反应产物，过滤，并经由制备型HPLC(含0.1％TFA的15-65％乙腈水溶液)纯化。将含有期望的产物的级分合并，并冻干至干燥，以得到(2RS,4RS,5SR,6SR)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(2-(1-(15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-基)甲氧基)-6-((1SR,2SR)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(实例7)。
(2RS,2′RS,4RS,4′RS,5SR,5′SR,6SR,6′SR)-2,2′-((((2R,2′R,3R,3′R,4S,4′S,5R,5′R,6R,6′R)-(((((RS)-9,14,22-三氧代-16-((15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)氨基甲酰基)-3,6,25,28-四氧杂-10,15,21-三氮杂三十烷-1,30-二基)双(1H-1,2,3-三唑-1,4-二基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-6,2-二基))双(亚甲基))双(氧基))双(4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-6-((1SR,2SR)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸)(实例8)
(2RS,2′RS,4RS,4′RS,5SR,5′SR,6SR,6′SR)-2,2′-((((2R,2′R,3R,3′R,4S,4′S,5R,5′R,6R,6′R)-(((((RS)-9,14,22-三氧代-16-((15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)氨基甲酰基)-3,6,25,28-四氧杂-10,15,21-三氮杂三十烷-1,30-二基)双(1H-1,2,3-三唑-1,4-二基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-6,2-二基))双(亚甲基))双(氧基))双(4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-6-((1SR,2SR)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸)(实例8)的合成
向在1打兰小瓶中的NMP(0.5mL)中的(R)-1-叠氮基-16-(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-9,14,17-三氧代-3,6,21,24,27,30-六氧杂-10,15,18-三氮杂三十三烷-33-酸全氟苯基酯(26332，1.00当量)和(2RS,4RS,5SR,6SR)-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-6-(丁-3-炔-1-基氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲氧基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-6-((1SR,2SR)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(26590，2.10当量)的搅拌的溶液中添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(5.00当量)。将所得的溶液加盖并在室温下搅拌持续10min。用在NMP中的70％乙酸的混合物稀释反应产物，过滤，并经由制备型HPLC(含0.1％TFA的15-65％乙腈水溶液)纯化。将含有期望的产物的级分合并，并冻干至干燥，以得到(2RS,2′RS,4RS,4′RS,5SR,5′SR,6SR,6′SR)-2,2'-((((2R,2'R,3R,3'R,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-(((((RS)-9,14,22-三氧代-16-((15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)氨基甲酰基)-3,6,25,28-四氧杂-10,15,21-三氮杂三十烷-1,30-二基)双(1H-1,2,3-三唑-1,4-二基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-6,2-二基))双(亚甲基))双(氧基))双(4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-6-((1SR,2SR)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸)(实例8)。
实例9
实例9的合成
向在1打兰小瓶中的NMP(0.5mL)中的(16R,19R)-1-叠氮基-16,19-双(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-9,14,17,20-四氧代-3,6,24,27,30,33-六氧杂-10,15,18,21-四氮杂三十六烷-36-酸全氟苯基酯(26333，1.00当量)和(2RS,4RS,5SR,6SR)-2-(((2R,3R,4S,5R,6R)-6-(丁-3-炔-1-基氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-基)甲氧基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-6-((1SR,2SR)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(26590，3.10当量)的搅拌的溶液中添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(7.50当量)。将所得的溶液加盖并在室温下搅拌持续10min。用在NMP中的70％乙酸的混合物稀释反应产物，过滤，并经由制备型HPLC(含0.1％TFA的15-65％乙腈水溶液)纯化。将含有期望的产物的级分合并，并冻干至干燥，以得到实例9。
(2R,4R,5S,6S)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-(2-(2-((1-(15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙氧基)-6-((1S,2S)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(实例10)
(2R,4R,5S,6S)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-(2-(2-((1-(15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙氧基)-6-((1S,2S)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(实例10)的合成
向在1打兰小瓶中的NMP(0.3mL)中的(2R,4R,5S,6S)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)-6-((1S,2S)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(26568，1.00当量)的搅拌的溶液中添加在NMP(0.3mL)中的1-叠氮基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸全氟苯基酯(1，1.10当量)的溶液，随后添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(2.50当量)。将所得的溶液加盖并在室温下搅拌持续10min。用乙酸稀释反应产物，过滤，并经由制备型HPLC(含0.1％TFA的15-65％乙腈水溶液)纯化。将含有期望的产物的级分合并，并冻干至干燥，以得到(2R,4R,5S,6S)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-(2-(2-((1-(15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙氧基)-6-((1S,2S)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(实例10)。
(2R,2'R,4R,4'R,5S,5'S,6S,6'S)-2,2'-(((((((((R)-9,14,22-三氧代-16-((15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)氨基甲酰基)-3,6,25,28-四氧杂-10,15,21-三氮杂三十烷-1,30-二基)双(1H-1,2,3-三唑-1,4-二基))双(亚甲基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-6-((1S,2S)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸)(实例11)
(2R,2′R,4R,4′R,5S,5′S,6S,6′S)-2,2′-(((((((((R)-9,14,22-三氧代-16-((15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)氨基甲酰基)-3,6,25,28-四氧杂-10,15,21-三氮杂三十烷-1,30-二基)双(1H-1,2,3-三唑-1,4-二基))双(亚甲基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-6-((1S,2S)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸)(实例11)的合成
向在1打兰小瓶中的NMP(0.5mL)中的(R)-1-叠氮基-16-(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-9,14,17-三氧代-3,6,21,24,27,30-六氧杂-10,15,18-三氮杂三十三烷-33-酸全氟苯基酯(26332，1.00当量)和(2R,4R,5S,6S)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)-6-((1S,2S)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(26568，2.10当量)的搅拌的溶液中添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(5.00当量)。将所得的溶液加盖并在室温下搅拌持续10min。用在NMP中的70％乙酸的混合物稀释反应产物，过滤，并经由制备型HPLC(含0.1％TFA的15-65％乙腈水溶液)纯化。将含有期望的产物的级分合并，并冻干至干燥，以得到(2R,2′R,4R,4′R,5S,5′S,6S,6′S)-2,2′-(((((((((R)-9,14,22-三氧代-16-((15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)氨基甲酰基)-3,6,25,28-四氧杂-10,15,21-三氮杂三十烷-1,30-二基)双(1H-1,2,3-三唑-1,4-二基))双(亚甲基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-6-((1S,2S)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸)(实例11)。
实例12
实例12的合成
向在1打兰小瓶中的NMP(0.5mL)中的(16R,19R)-1-叠氮基-16,19-双(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-9,14,17,20-四氧代-3,6,24,27,30,33-六氧杂-10,15,18,21-四氮杂三十六烷-36-酸全氟苯基酯(26333，1.00当量)和(2R,4R,5S,6S)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)-6-((1S,2S)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(26568，3.10当量)的搅拌的溶液中添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(7.50当量)。将所得的溶液加盖并在室温下搅拌持续10min。用在NMP中的70％乙酸的混合物稀释反应产物，过滤，并经由制备型HPLC(含0.1％TFA的15-65％乙腈水溶液)纯化。将含有期望的产物的级分合并，并冻干至干燥，以得到实例12。
(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-((2-(2-((1-(15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙基)硫基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(实例13)
(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-((2-(2-((1-(15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙基)硫基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(实例13)的合成
向在1打兰小瓶中的NMP(0.3mL)中的(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-((2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙基)硫基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(26567，1.00当量)的搅拌的溶液中添加在NMP(0.3mL)中的1-叠氮基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸全氟苯基酯(1，1.10当量)的溶液，随后添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(2.50当量)。将所得的溶液加盖并在室温下搅拌持续10min。用乙酸稀释反应产物，过滤，并经由制备型HPLC(含0.1％TFA的15-65％乙腈水溶液)纯化。将含有期望的产物的级分合并，并冻干至干燥，以得到(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-((2-(2-((1-(15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙基)硫基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(实例13)。
(2R,2'R,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-2,2'-(((((((((S)-9,14,22-三氧代-16-((15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)氨基甲酰基)-3,6,25,28-四氧杂-10,15,21-三氮杂三十烷-1,30-二基)双(1H-1,2,3-三唑-1,4-二基))双(亚甲基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(磺胺二基))双(6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸)(实例14)
(2R,2'R,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-2,2′-(((((((((S)-9,14,22-三氧代-16-((15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)氨基甲酰基)-3,6,25,28-四氧杂-10,15,21-三氮杂三十烷-1,30-二基)双(1H-1,2,3-三唑-1,4-二基))双(亚甲基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(磺胺二基))双(6-((1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸)(实例14)的合成
向在1打兰小瓶中的NMP(0.5mL)中的(R)-1-叠氮基-16-(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-9,14,17-三氧代-3,6,21,24,27,30-六氧杂-10,15,18-三氮杂三十三烷-33-酸全氟苯基酯(26332，1.00当量)和(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-((2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙基)硫基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(26567，2.10当量)的搅拌的溶液中添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(5.00当量)。将所得的溶液加盖并在室温下搅拌持续10min。用在NMP中的70％乙酸的混合物稀释反应产物，过滤，并经由制备型HPLC(含0.1％TFA的15-65％乙腈水溶液)纯化。将含有期望的产物的级分合并，并冻干至干燥，以得到(2R,2′R,4S,4′S,5R,5'R,6R,6'R)-2,2'-(((((((((S)-9,14,22-三氧代-16-((15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)氨基甲酰基)-3,6,25,28-四氧杂-10,15,21-三氮杂三十烷-1,30-二基)双(1H-1,2,3-三唑-1,4-二基))双(亚甲基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(磺胺二基))双(6-((1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸)(实例14)。
实例15
实例15的合成
向在1打兰小瓶中的NMP(0.5mL)中的(16R,19R)-1-叠氮基-16,19-双(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-9,14,17,20-四氧代-3,6,24,27,30,33-六氧杂-10,15,18,21-四氮杂三十六烷-36-酸全氟苯基酯(26333，1.00当量)和(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-((2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙基)硫基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(26567，3.10当量)的搅拌的溶液中添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(7.50当量)。将所得的溶液加盖并在室温下搅拌持续10min。用在NMP中的70％乙酸的混合物稀释反应产物，过滤，并经由制备型HPLC(含0.1％TFA的15-65％乙腈水溶液)纯化。将含有期望的产物的级分合并，并冻干至干燥，以得到实例15。
(2R,4R,5S,6S)-6-((1S,2S)-3-(2-([1,1'-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-((2-(2-((1-(15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙基)硫基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(实例16)
(2R,4R,5S,6S)-6-((1S,2S)-3-(2-([1,1'-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-((2-(2-((1-(15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙基)硫基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(实例16)的合成
向在1打兰小瓶中的NMP(0.3mL)中的(2R,4R,5S,6S)-6-((1S,2S)-3-(2-([1,1'-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-((2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙基)硫基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(26566，1.00当量)的搅拌的溶液中添加在NMP(0.3mL)中的1-叠氮基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸全氟苯基酯(1，1.10当量)的溶液，随后添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(2.50当量)。将所得的溶液加盖并在室温下搅拌持续10min。用乙酸稀释反应产物，过滤，并经由制备型HPLC(含0.1％TFA的15-65％乙腈水溶液)纯化。将含有期望的产物的级分合并，并冻干至干燥，以得到(2R,4R,5S,6S)-6-((1S,2S)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-((2-(2-((1-(15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙基)硫基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(实例16)。
(2R,2′R,4R,4′R,5S,5′S,6S,6′S)-2,2′-(((((((((R)-9,14,22-三氧代-16-((15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)氨基甲酰基)-3,6,25,28-四氧杂-10,15,21-三氮杂三十烷-1,30-二基)双(1H-1,2,3-三唑-1,4-二基))双(亚甲基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(磺胺二基))双(6-((1S,2S)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸)(实例17)
(2R,2′R,4R,4′R,5S,5′S,6S,6′S)-2,2′-(((((((((R)-9,14,22-三氧代-16-((15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)氨基甲酰基)-3,6,25,28-四氧杂-10,15,21-三氮杂三十烷-1,30-二基)双(1H-1,2,3-三唑-1,4-二基))双(亚甲基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(磺胺二基))双(6-((1S,2S)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸)(实例17)的合成
向在1打兰小瓶中的NMP(0.5mL)中的(R)-1-叠氮基-16-(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-9,14,17-三氧代-3,6,21,24,27,30-六氧杂-10,15,18-三氮杂三十三烷-33-酸全氟苯基酯(26332，1.00当量)和(2R,4R,5S,6S)-6-((1S,2S)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-((2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙基)硫基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(26566，2.10当量)的搅拌的溶液中添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(5.00当量)。将所得的溶液加盖并在室温下搅拌持续10min。用在NMP中的70％乙酸的混合物稀释反应产物，过滤，并经由制备型HPLC(含0.1％TFA的15-65％乙腈水溶液)纯化。将含有期望的产物的级分合并，并冻干至干燥，以得到(2R,2'R,4R,4'R,5S,5'S,6S,6'S)-2,2'-(((((((((R)-9,14,22-三氧代-16-((15-氧代-15-(全氟苯氧基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷基)氨基甲酰基)-3,6,25,28-四氧杂-10,15,21-三氮杂三十烷-1,30-二基)双(1H-1,2,3-三唑-1,4-二基))双(亚甲基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(磺胺二基))双(6-((1S,2S)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸)(实例17)。
实例18
实例18的合成
向在1打兰小瓶中的NMP(0.5mL)中的(16R,19R)-1-叠氮基-16,19-双(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-9,14,17,20-四氧代-3,6,24,27,30,33-六氧杂-10,15,18,21-四氮杂三十六烷-36-酸全氟苯基酯(26333，1.00当量)和(2R,4R,5S,6S)-6-((1S,2S)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-((2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙基)硫基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(26566，3.10当量)的搅拌的溶液中添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(7.50当量)。将所得的溶液加盖并在室温下搅拌持续10min。用在NMP中的70％乙酸的混合物稀释反应产物，过滤，并经由制备型HPLC(含0.1％TFA的15-65％乙腈水溶液)纯化。将含有期望的产物的级分合并，并冻干至干燥，以得到实例18。
(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-2-(2-(2-((1-(4-(((S)-6-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-2-羧基-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-1-(((S)-5-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-2-羧基-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-1-羧基戊基)氨基)-1-氧代己-2-基)氨基)-4-氧代丁基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙氧基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(实例19)
(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-2-(2-(2-((1-(4-(((S)-6-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-2-羧基-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-1-(((S)-5-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-2-羧基-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-1-羧基戊基)氨基)-1-氧代己-2-基)氨基)-4-氧代丁基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙氧基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(实例19)的合成
向在1打兰小瓶中的NMP(0.5mL)中的N2-(N2-(4-叠氮基丁酰基)-N6-重氮基-D-赖氨酰基)-N6-重氮基-D-赖氨酸(26728，1.00当量)和(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(26463，3.10当量)的搅拌的溶液中添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(7.50当量)。将所得的溶液加盖并在室温下搅拌持续10min。用在NMP中的70％乙酸的混合物稀释反应产物，过滤，并经由制备型HPLC(含0.1％TFA的15-65％乙腈水溶液)纯化。将含有期望的产物的级分合并，并冻干至干燥，以得到(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-2-(2-(2-((1-(4-(((S)-6-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-2-羧基-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-1-(((S)-5-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-2-羧基-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-1-羧基戊基)氨基)-1-氧代己-2-基)氨基)-4-氧代丁基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙氧基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(实例19)。
(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-2-(2-(2-((1-(4-(((S)-6-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-2-羧基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-1-(((S)-5-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-2-羧基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-1-羧基戊基)氨基)-1-氧代己-2-基)氨基)-4-氧代丁基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙氧基)-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(实例20)
(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-2-(2-(2-((1-(4-(((S)-6-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-2-羧基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-1-(((S)-5-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-2-羧基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-1-羧基戊基)氨基)-1-氧代己-2-基)氨基)-4-氧代丁基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙氧基)-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(实例20)的合成
向在1打兰小瓶中的NMP(0.5mL)中的N2-(N2-(4-叠氮基丁酰基)-N6-重氮基-D-赖氨酰基)-N6-重氮基-D-赖氨酸(26728，1.00当量)和(2R,4R,5S,6S)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-((2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙基)硫基)-6-((1S,2S)-1,2,3-三羟丙基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(26334，3.10当量)的搅拌的溶液中添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(7.50当量)。将所得的溶液加盖并在室温下搅拌持续10min。用在NMP中的70％乙酸的混合物稀释反应产物，过滤，并经由制备型HPLC(含0.1％TFA的15-65％乙腈水溶液)纯化。将含有期望的产物的级分合并，并冻干至干燥，以得到(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-2-(2-(2-((1-(4-(((S)-6-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-2-羧基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-1-(((S)-5-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-2-羧基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-1-羧基戊基)氨基)-1-氧代己-2-基)氨基)-4-氧代丁基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙氧基)-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(实例20)。
(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-2-(2-(2-((1-(4-(((S)-5-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-2-羧基-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-1-羧基戊基)氨基)-4-氧代丁基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙氧基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(实例21)
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(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-2-(2-(2-((1-(4-(((S)-5-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-2-羧基-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-1-羧基戊基)氨基)-4-氧代丁基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙氧基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(实例21)的合成
向在1打兰小瓶中的NMP(0.5mL)中的N2-(4-叠氮基丁酰基)-N6-重氮基-D-赖氨酸(26727，1.00当量)和(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(26463，2.10当量)的搅拌的溶液中添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(5.00当量)。将所得的溶液加盖并在室温下搅拌持续10min。用在NMP中的70％乙酸的混合物稀释反应产物，过滤，并经由制备型HPLC(含0.1％TFA的15-65％乙腈水溶液)纯化。将含有期望的产物的级分合并，并冻干至干燥，以得到(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-2-(2-(2-((1-(4-(((S)-5-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-2-羧基-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-1-羧基戊基)氨基)-4-氧代丁基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙氧基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(实例21)。
(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-2-(2-(2-((1-(4-(((S)-5-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-2-羧基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-1-羧基戊基)氨基)-4-氧代丁基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙氧基)-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(实例22)
(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-2-(2-(2-((1-(4-(((S)-5-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-2-羧基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-1-羧基戊基)氨基)-4-氧代丁基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙氧基)-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(实例22)的合成。
向在1打兰小瓶中的NMP(0.5mL)中的N2-(4-叠氮基丁酰基)-N6-重氮基-D-赖氨酸(26727，1.00当量)和(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基-2-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(26334，2.10当量)的搅拌的溶液中添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(5.00当量)。将所得的溶液加盖并在室温下搅拌持续10min。用在NMP中的70％乙酸的混合物稀释反应产物，过滤，并经由制备型HPLC(含0.1％TFA的15-65％乙腈水溶液)纯化。将含有期望的产物的级分合并，并冻干至干燥，以得到(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-2-(2-(2-((1-(4-(((S)-5-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-2-羧基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-1-羧基戊基)氨基)-4-氧代丁基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙氧基)-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(实例22)。
(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-2-(2-(2-((1-(4-(((S)-6-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-2-羧基-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-1-(((S)-6-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-2-羧基-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-1-氧代-1-(全氟苯氧基)己-2-基)氨基)-1-氧代己-2-基)氨基)-4-氧代丁基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙氧基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(实例23)
(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-2-(2-(2-((1-(4-(((S)-6-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-2-羧基-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-1-(((S)-6-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-2-羧基-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-1-氧代-1-(全氟苯氧基)己-2-基)氨基)-1-氧代己-2-基)氨基)-4-氧代丁基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙氧基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(实例23)的合成
向在1打兰小瓶中的NMP(0.5mL)中的N2-(N2-(4-叠氮基丁酰基)-N6-重氮基-D-赖氨酰基)-N6-重氮基-D-赖氨酸全氟苯基酯(26634，1.00当量)和(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(26463，3.10当量)的搅拌的溶液中添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(7.50当量)。将所得的溶液加盖并在室温下搅拌持续10min。用在NMP中的70％乙酸的混合物稀释反应产物，过滤，并经由制备型HPLC(含0.1％TFA的15-65％乙腈水溶液)纯化。将含有期望的产物的级分合并，并冻干至干燥，以得到(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-2-(2-(2-((1-(4-(((S)-6-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-2-羧基-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-1-(((S)-6-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-2-羧基-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-1-氧代-1-(全氟苯氧基)己-2-基)氨基)-1-氧代己-2-基)氨基)-4-氧代丁基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙氧基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(实例23)。
(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-2-(2-(2-((1-(4-(((S)-6-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-2-羧基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-1-(((S)-6-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-2-羧基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-1-氧代-1-(全氟苯氧基)己-2-基)氨基)-1-氧代己-2-基)氨基)-4-氧代丁基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙氧基)-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(实例24)
(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-2-(2-(2-((1-(4-(((S)-6-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-2-羧基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-1-(((S)-6-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-2-羧基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-1-氧代-1-(全氟苯氧基)己-2-基)氨基)-1-氧代己-2-基)氨基)-4-氧代丁基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙氧基)-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(实例24)的合成
向在1打兰小瓶中的NMP(0.5mL)中的N2-(N2-(4-叠氮基丁酰基)-N6-重氮基-D-赖氨酰基)-N6-重氮基-D-赖氨酸全氟苯基酯(26634，1.00当量)和(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基-2-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(26334，3.10当量)的搅拌的溶液中添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(7.50当量)。将所得的溶液加盖并在室温下搅拌持续10min。用在NMP中的70％乙酸的混合物稀释反应产物，过滤，并经由制备型HPLC(含0.1％TFA的15-65％乙腈水溶液)纯化。将含有期望的产物的级分合并，并冻干至干燥，以得到(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-2-(2-(2-((1-(4-(((S)-6-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-2-羧基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-1-(((S)-6-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-2-羧基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-1-氧代-1-(全氟苯氧基)己-2-基)氨基)-1-氧代己-2-基)氨基)-4-氧代丁基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙氧基)-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(实例24)。
(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-2-(2-(2-((1-((S)-16-((S)-6-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-2-羧基-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-2-(4-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-2-羧基-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丁酰胺基)己酰胺基)-1-氧代-1-(全氟苯氧基)-4,7,10,13-四氧杂二十烷-20-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙氧基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(实例25)
(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-2-(2-(2-((1-((S)-16-((S)-6-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-2-羧基-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-2-(4-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-2-羧基-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丁酰胺基)己酰胺基)-1-氧代-1-(全氟苯氧基)-4,7,10,13-四氧杂二十烷-20-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙氧基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(实例25)的合成
向在1打兰小瓶中的NMP(0.5mL)中的(16R,19R)-24-叠氮基-16,19-双(4-叠氮基丁基)-18,21-二氧代-4,7,10,13-四氧杂-17,20-二氮杂二十四烷酸全氟苯基酯(26604，1.00当量)和(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(26463，3.10当量)的搅拌的溶液中添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(7.50当量)。将所得的溶液加盖并在室温下搅拌持续10min。用在NMP中的70％乙酸的混合物稀释反应产物，过滤，并经由制备型HPLC(含0.1％TFA的15-65％乙腈水溶液)纯化。将含有期望的产物的级分合并，并冻干至干燥，以得到(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-2-(2-(2-((1-((S)-16-((S)-6-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-2-羧基-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-2-(4-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-2-羧基-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丁酰胺基)己酰胺基)-1-氧代-1-(全氟苯氧基)-4,7,10,13-四氧杂二十烷-20-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙氧基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(实例25)。
(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-2-(2-(2-((1-((S)-16-((S)-6-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-2-羧基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-2-(4-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-2-羧基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丁酰胺基)己酰胺基)-1-氧代-1-(全氟苯氧基)-4,7,10,13-四氧杂二十烷-20-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙氧基)-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(实例26)
(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-2-(2-(2-((1-((S)-16-((S)-6-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-2-羧基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-2-(4-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-2-羧基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丁酰胺基)己酰胺基)-1-氧代-1-(全氟苯氧基)-4,7,10,13-四氧杂二十烷-20-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙氧基)-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(实例26)的合成
向在1打兰小瓶中的NMP(0.5mL)中的(16R,19R)-24-叠氮基-16,19-双(4-叠氮基丁基)-18,21-二氧代-4,7,10,13-四氧杂-17,20-二氮杂二十四烷酸全氟苯基酯(26604，1.00当量)和(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基-2-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(26334，3.10当量)的搅拌的溶液中添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(7.50当量)。将所得的溶液加盖并在室温下搅拌持续10min。用在NMP中的70％乙酸的混合物稀释反应产物，过滤，并经由制备型HPLC(含0.1％TFA的15-65％乙腈水溶液)纯化。将含有期望的产物的级分合并，并冻干至干燥，以得到(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-2-(2-(2-((1-((S)-16-((S)-6-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-2-羧基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)-2-(4-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-2-羧基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丁酰胺基)己酰胺基)-1-氧代-1-(全氟苯氧基)-4,7,10,13-四氧杂二十烷-20-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙氧基)-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(实例26)。
(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-2-(2-(2-((1-((S)-18-(4-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-2-羧基-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丁酰胺基)-1,17-二氧代-1-(全氟苯氧基)-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂二十二烷-22-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙氧基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(实例27)
(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-2-(2-(2-((1-((S)-18-(4-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-2-羧基-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丁酰胺基)-1,17-二氧代-1-(全氟苯氧基)-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂二十二烷-22-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙氧基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(实例27)的合成
向在1打兰小瓶中的NMP(0.5mL)中的(R)-23-叠氮基-18-(4-叠氮基丁基)-17,20-二氧代-4,7,10,13-四氧杂-16,19-二氮杂二十三烷酸全氟苯基酯(26594，1.00当量)和(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(26463，3.10当量)的搅拌的溶液中添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(5.00当量)。将所得的溶液加盖并在室温下搅拌持续10min。用在NMP中的70％乙酸的混合物稀释反应产物，过滤，并经由制备型HPLC(含0.1％TFA的15-65％乙腈水溶液)纯化。将含有期望的产物的级分合并，并冻干至干燥，以得到(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-2-(2-(2-((1-((S)-18-(4-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-2-羧基-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丁酰胺基)-1,17-二氧代-1-(全氟苯氧基)-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂二十二烷-22-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙氧基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(实例27)。
(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-2-(2-(2-((1-((S)-18-(4-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-2-羧基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丁酰胺基)-1,17-二氧代-1-(全氟苯氧基)-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂二十二烷-22-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙氧基)-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(实例28)
(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-2-(2-(2-((1-((S)-18-(4-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-2-羧基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丁酰胺基)-1,17-二氧代-1-(全氟苯氧基)-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂二十二烷-22-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙氧基)-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(实例28)的合成
向在1打兰小瓶中的NMP(0.5mL)中的(R)-23-叠氮基-18-(4-叠氮基丁基)-17,20-二氧代-4,7,10,13-四氧杂-16,19-二氮杂二十三烷酸全氟苯基酯(26594，1.00当量)和(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基-2-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(26334，3.10当量)的搅拌的溶液中添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(5.00当量)。将所得的溶液加盖并在室温下搅拌持续10min。用在NMP中的70％乙酸的混合物稀释反应产物，过滤，并经由制备型HPLC(含0.1％TFA的15-65％乙腈水溶液)纯化。将含有期望的产物的级分合并，并冻干至干燥，以得到(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-2-(2-(2-((1-((S)-18-(4-(4-((2-(2-(((2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-2-羧基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)乙氧基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)丁酰胺基)-1,17-二氧代-1-(全氟苯氧基)-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂二十二烷-22-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)乙氧基)乙氧基)-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(实例28)。
实例29：
实例29的合成
向在1打兰小瓶中的NMP(0.5mL)中的(16R,19R)-1-叠氮基-16,19-双(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-9,14,17,20-四氧代-3,6,24,27,30,33-六氧杂-10,15,18,21-四氮杂三十六烷-36-酸(26338，1.00当量)和(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(26463，3.10当量)的搅拌的溶液中添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(7.50当量)。将所得的溶液加盖并在室温下搅拌持续10min。用在NMP中的70％乙酸的混合物稀释反应产物，过滤，并经由制备型HPLC(含0.1％TFA的15-65％乙腈水溶液)纯化。将含有期望的产物的级分合并，并冻干至干燥，以得到实例29。
实例30：
实例30的合成
向在1打兰小瓶中的NMP(0.5mL)中的(16R,19R)-1-叠氮基-16,19-双(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-9,14,17,20-四氧代-3,6,24,27,30,33-六氧杂-10,15,18,21-四氮杂三十六烷-36-酸(26338，1.00当量)和(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基-2-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(26334，3.10当量)的搅拌的溶液中添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(7.50当量)。将所得的溶液加盖并在室温下搅拌持续10min。用在NMP中的70％乙酸的混合物稀释反应产物，过滤，并经由制备型HPLC(含0.1％TFA的15-65％乙腈水溶液)纯化。将含有期望的产物的级分合并，并冻干至干燥，以得到实例30。
(2R,2′R,4S,4′S,5R,5′R,6R,6′R)-2,2′-(((((((((S)-16-((14-羧基-3,6,9,12-四氧杂十四烷基)氨基甲酰基)-9,14,22-三氧代-3,6,25,28-四氧杂-10,15,21-三氮杂三十烷-1,30-二基)双(1H-1,2,3-三唑-1,4-二基))双(亚甲基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(6-((1R,2R)-3-(2-([1,1′-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸)(实例31)
(2R,2'R,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-2,2'-(((((((((S)-16-((14-羧基-3,6,9,12-四氧杂十四烷基)氨基甲酰基)-9,14,22-三氧代-3,6,25,28-四氧杂-10,15,21-三氮杂三十烷-1,30-二基)双(1H-1,2,3-三唑-1,4-二基))双(亚甲基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸)(实例31)的合成
向在1打兰小瓶中的NMP(0.5mL)中的(R)-1-叠氮基-16-(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-9,14,17-三氧代-3,6,21,24,27,30-六氧杂-10,15,18-三氮杂三十三烷-33-酸(26337，1.00当量)和(2R,4S,5R,6R)-6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)-2-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(26463，2.10当量)的搅拌的溶液中添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(5.00当量)。将所得的溶液加盖并在室温下搅拌持续10min。用在NMP中的70％乙酸的混合物稀释反应产物，过滤，并经由制备型HPLC(含0.1％TFA的15-65％乙腈水溶液)纯化。将含有期望的产物的级分合并，并冻干至干燥，以得到(2R,2'R,4S,4′S,5R,5'R,6R,6'R)-2,2'-(((((((((S)-16-((14-羧基-3,6,9,12-四氧杂十四烷基)氨基甲酰基)-9,14,22-三氧代-3,6,25,28-四氧杂-10,15,21-三氮杂三十烷-1,30-二基)双(1H-1,2,3-三唑-1,4-二基))双(亚甲基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(6-((1R,2R)-3-(2-([1,1'-联苯基]-4-基)乙酰胺基)-1,2-二羟基丙基)-4-羟基-5-(2-羟基乙酰胺基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸)(实例31)。
(2R,2′R,4S,4′S,5R,5'R,6R,6'R)-2,2′-(((((((((S)-16-((14-羧基-3,6,9,12-四氧杂十四烷基)氨基甲酰基)-9,14,22-三氧代-3,6,25,28-四氧杂-10,15,21-三氮杂三十烷-1,30-二基)双(1H-1,2,3-三唑-1,4-二基))双(亚甲基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(5-乙酰胺基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸)(实例32)
(2R,2'R,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-2,2'-(((((((((S)-16-((14-羧基-3,6,9,12-四氧杂十四烷基)氨基甲酰基)-9,14,22-三氧代-3,6,25,28-四氧杂-10,15,21-三氮杂三十烷-1,30-二基)双(1H-1,2,3-三唑-1,4-二基))双(亚甲基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(5-乙酰胺基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸)(实例32)的合成
向在1打兰小瓶中的NMP(0.5mL)中的(R)-1-叠氮基-16-(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁基)-9,14,17-三氧代-3,6,21,24,27,30-六氧杂-10,15,18-三氮杂三十三烷-33-酸(26337，1.00当量)和(2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基-2-(2-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)乙氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃-2-羧酸(26334，2.10当量)的搅拌的溶液中添加六氟磷酸四(乙腈)铜(I)(5.00当量)。将所得的溶液加盖并在室温下搅拌持续10min。用在NMP中的70％乙酸的混合物稀释反应产物，过滤，并经由制备型HPLC(含0.1％TFA的15-65％乙腈水溶液)纯化。将含有期望的产物的级分合并，并冻干至干燥，以得到(2R,2′R,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-2,2'-(((((((((S)-16-((14-羧基-3,6,9,12-四氧杂十四烷基)氨基甲酰基)-9,14,22-三氧代-3,6,25,28-四氧杂-10,15,21-三氮杂三十烷-1,30-二基)双(1H-1,2,3-三唑-1,4-二基))双(亚甲基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(乙烷-2,1-二基))双(氧基))双(5-乙酰胺基-6-((1R,2R)-1,2-二羟基-3-(3-苯氧基苯甲酰胺基)丙基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸)(实例32)。
N2-(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁酰基)-N6-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰基)-L-赖氨酸全氟苯基酯(化合物编号ISP6-062)
N6-((苄氧基)羰基)N2-(4-(((苄氧基)羰基)氨基)丁酰基)-L-赖氨酸叔丁酯(3)的合成
向在N,N-二甲基甲酰胺(50.0mL)中的N6-((苄氧基)羰基)L-赖氨酸甲酯盐酸盐(1，10.0g，29.7mmol)和4-(((苄氧基)羰基)氨基)丁酸(2,5.88g，24.8mmol)的搅拌的溶液中添加[(二甲基氨基)({3H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-3-基氧基})亚甲基]二甲基氮鎓；六氟-λ5-磷酸盐(11.3g，29.7mmol)和二异丙基乙胺(8.63mL，49.5mmol)。将反应混合物在室温下搅拌持续16h。在完成之后，用饱和碳酸氢钠溶液稀释反应混合物，并用二氯甲烷提取。有机层经硫酸钠干燥，过滤，并在高真空下浓缩，以获得粗残余物，该粗残余物然后经由快速柱色谱法(在己烷的50-70％乙酸乙酯中)纯化。在减压下浓缩期望的级分，以得到呈灰白色固体的N6-((苄氧基)羰基)N2-(4-(((苄氧基)羰基)氨基)丁酰基)-L-赖氨酸叔丁酯(3)。产率：11.0g，79.7％；LC-MS m/z 556.3[M+1]+。
(4-氨基丁酰基)-L-赖氨酸叔丁酯(4)的合成
在室温下，在氮气下，向在甲醇(250.0mL)中的N6-((苄氧基)羰基)N2-(4-(((苄氧基)羰基)氨基)丁酰基)-L-赖氨酸叔丁酯(3,8.0g，14.4mmol)的搅拌的溶液中添加10％碳载钯(3.50g)。将所得的混合物在室温下在氢气压力下搅拌持续12h。反应混合物通过硅藻土过滤并用甲醇洗涤。滤液在真空下浓缩，以得到呈浅黄色粘稠液体的(4-氨基丁酰基)-L-赖氨酸叔丁酯(4)。产率：4.0g，95％；ELSD m/z 288.4[M+1]+。
N2-(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁酰基)-N6-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰基)-L-赖氨酸叔丁酯(6)的合成
向在0℃的四氢呋喃(20.0mL)中的(4-氨基丁酰基)-L-赖氨酸叔丁酯(4，1.0g，3.48mmol)的搅拌的溶液中添加2,5-二氧代吡咯烷-1-基3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酸酯(5，2.09g，6.96mmol)。将所得的反应混合物在室温下搅拌持续4h。在完成之后，在高真空下浓缩溶剂以获得粗残余物，该粗残余物然后经由快速柱色谱法(在二氯甲烷中的0-7.5％甲醇)纯化。在减压下浓缩期望的级分，以得到呈浅黄色粘稠液体的N2-(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁酰基)-N6-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰基)-L-赖氨酸叔丁酯(6)。产率：1.20g，52％；ELSD m/z 658.2[M+1]+。
N2-(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁酰基)-N6-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰基)-L-赖氨酸(7)的合成
在0℃下，向在二氯甲烷(5mL)中的N2-(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁酰基)-N6-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰基)-L-赖氨酸叔丁酯(6，0.40g，0.608mmol)的搅拌的溶液中添加三氟乙酸(1.0mL)。将所得的混合物在室温下在氮气下搅拌持续4h。在完成之后，浓缩反应混合物，用乙醚洗涤，并干燥，以得到呈浅黄色粘稠液体的N2-(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁酰基)-N6-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰基)-L-赖氨酸(7)。产率：0.350g，96％；ELSD m/z 602.4[M+1]+。
N2-(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁酰基)-N6-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰基)-L-赖氨酸全氟苯基酯(化合物编号ISP6-062)的合成。
向在0℃的四氢呋喃中的N2-(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁酰基)-N6-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰基)-L-赖氨酸(7，1.0当量)的搅拌的溶液中添加2,3,4,5,6-五氟苯酚(8，2.0当量)和N,N'-二异丙基碳二亚胺(2.5当量)。将得到的反应溶液在室温下搅拌。在完成之后，将溶剂浓缩，以得到粗残余物，该粗残余物然后经由制备型HPLC纯化。将含有期望的产物的级分合并并冷干至干燥，以得到N2-(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁酰基)-N6-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰基)-L-赖氨酸全氟苯基酯(化合物编号ISP6-062)。
N2-(N2-(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁酰基)-N6-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰基)-L-赖氨酰基)-N6-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰基)-L-赖氨酸全氟苯基酯(化合物编号ISP6-065)
N6-((苄氧基)羰基)N2-(4-(((苄氧基)羰基)氨基)丁酰基)-L-赖氨酸(2)的合成
在0℃下，向在二氯甲烷(50.0mL)中的N6-((苄氧基)羰基)N2-(4-(((苄氧基)羰基)氨基)丁酰基)-L-赖氨酸叔丁酯(1，5.0g，9.0mmol)的搅拌的溶液中添加三氟乙酸(10.0mL)。将所得的混合物在室温下在氮气下搅拌持续6h。在完成之后，浓缩反应混合物，用乙醚洗涤，并干燥，以得到呈灰白色固体的N6-((苄氧基)羰基)N2-(4-(((苄氧基)羰基)氨基)丁酰基)-L-赖氨酸(2)。产率：3.8g，85％；LC-MS m/z 500.1[M+1]+。
N6-((苄氧基)羰基)N2-(N6-((苄氧基)羰基)N2-(4-(((苄氧基)羰基)氨基)丁酰基)-L-赖氨酰基)-L-赖氨酸叔丁酯(4)的合成
向在N,N-二甲基甲酰胺(50.0mL)中的N6-((苄氧基)羰基)N2-(4-(((苄氧基)羰基)氨基)丁酰基)-L-赖氨酸(2，3.80g，7.61mmol)和N6-((苄氧基)羰基)L-赖氨酸叔丁酯盐酸盐(3，3.38g，9.13mmol)的搅拌的溶液中添加[(二甲基氨基)({3H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-3-基氧基})亚甲基]二甲基氮鎓；六氟-λ5-磷酸盐(3.47g，9.13mmol)和二异丙基乙胺(3.32mL，19mmol)。将反应混合物在室温下搅拌持续16h。在完成之后，用饱和碳酸氢钠溶液稀释反应混合物，并用二氯甲烷提取。有机层经硫酸钠干燥，过滤，并在高真空下浓缩，以得到粗残余物，该粗残余物然后经由快速柱色谱法(在己烷中的70-100％乙酸乙酯)纯化。在减压下浓缩期望的级分，以得到呈灰白色固体的N6-((苄氧基)羰基)N2-(N6-((苄氧基)羰基)N2-(4-(((苄氧基)羰基)氨基)丁酰基)-L-赖氨酰基)-L-赖氨酸叔丁酯(4)。产率：5.70g，90％；LC-MS m/z 818.4[M+1]+。
(4-氨基丁酰基)-L-lysyl-L-赖氨酸叔丁酯(5)的合成
在室温下，在氮气下，向在甲醇(100mL)中的N6-((苄氧基)羰基)N2-(N6-((苄氧基)羰基)N2-(4-(((苄氧基)羰基)氨基)丁酰基)-L-赖氨酰基)-L-赖氨酸叔丁酯(4，4.0g，4.89mmol)的搅拌的溶液中添加10％的碳载钯(1.5g)。将所得的混合物在室温下在氢气压力下搅拌持续12h。反应混合物通过硅藻土过滤并用甲醇洗涤。滤液在真空下浓缩，以得到呈浅黄色粘稠液体的(4-氨基丁酰基)-L-赖氨酸叔丁酯(5)。产率：2.0g，98％；ELSD m/z416.2[M+1]+。
N2-(N2-(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁酰基)-N6-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰基)-L-赖氨酰基)-N6-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰基)-L-赖氨酸叔丁酯(7)的合成。
向在0℃的四氢呋喃(20.0mL)中的(4-氨基丁酰基)-L-lysyl-L-赖氨酸叔丁酯(5，1.0g，2.41mmol)的搅拌的溶液中添加2,5-二氧代吡咯烷-1-基3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酸酯(6，2.17g，7.22mmol)。将所得的反应混合物在室温下搅拌持续4h。在完成之后，在高真空下浓缩溶剂以获得粗残余物，该粗残余物然后经由快速柱色谱法(在二氯甲烷中的0-7.5％甲醇)纯化。在减压下浓缩期望的级分，以得到呈无色粘稠液体的N2-(N2-(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁酰基)-N6-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰基)-L-赖氨酰基)-N6-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰基)-L-赖氨酸叔丁酯(7)。产率：1.30g，55％；ELSD m/z 971.8[M+1]+。
N2-(N2-(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁酰基)-N6-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰基)-L-赖氨酰基)-N6-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰基)-L-赖氨酸(8)的合成
在0℃下，向在二氯甲烷(2mL)中的N2-(N2-(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁酰基)-N6-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰基)-L-赖氨酰基)-N6-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰基)-L-赖氨酸叔丁酯(7，0.180g，0.185mmol)的搅拌的溶液中添加三氟乙酸(0.3mL)。将所得的反应混合物在室温下在氮气下搅拌持续6h。在完成之后，将反应混合物浓缩，用乙醚洗涤，并干燥，以得到呈浅黄色粘稠液体的N2-(N2-(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁酰基)-N6-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰基)-L-赖氨酰基)-N6-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰基)-L-赖氨酸(8)。产率：0.170g，98％；ELSD m/z 915.5[M+1]+。
N2-(N2-(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁酰基)-N6-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰基)-L-赖氨酰基)-N6-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰基)-L-赖氨酸全氟苯基酯(化合物编号ISP6-065)的合成。
向在0℃的四氢呋喃中的N2-(N2-(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁酰基)-N6-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰基)-L-赖氨酰基)-N6-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰基)-L-赖氨酸(8，1.0当量)的搅拌的溶液中添加2,3,4,5,6-五氟苯酚(9，2.0当量)和N,N'-二异丙基碳二亚胺(2.5当量)。将得到的反应溶液在室温下搅拌。在完成之后，对溶剂进行浓缩并经由制备型HPLC纯化。合并含有期望的产物的级分并冻干至干燥，以得到N2-(N2-(4-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰胺基)丁酰基)-N6-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰基)-L-赖氨酰基)-N6-(3-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)丙酰基)-L-赖氨酸全氟苯基酯(化合物编号ISP6-065)。
在表1中列出了在实例中描述的缀合物中使用的接头结构。
表1
实例6：通过表面等离子共振的合成Siglec-2/CD22配体与Siglec-2/CD22相互作用的结合分析
目的
确定合成Siglec配体与重组人和小鼠CD22胞外域的体外结合性质。
材料和方法
评估了以下配体与小鼠和人CD22的结合：1)BPC-Neu5Gc PEG(化合物编号26463)，2)BPC-Neu5Gc GAL(化合物编号26339)，3)MPB-Neu5Ac PEG(化合物编号26334)，4)MPB-Neu5Ac GAL(化合物编号26409)，5)Neu5Gc PEG(化合物编号26591)。所有测试的化合物都是在以下实例的缀合物中使用的PFP封端的可缀合的Siglec接头结构的炔烃封端前体。
合成CD22配体与CD22受体胞外域结合的结合测定在Biacore 8K+仪器(Cytiva)上运行。结合至人或小鼠CD22蛋白的CD22缀合物的表面制备包含两个步骤，链霉亲和素的共价固定，随后捕获Avi标记和生物素化的人CD22-Fc融合体(R&D系统，目录号AVI1968-050)和小鼠CD22的单Fc融合体。使用标准的胺偶联方案，通过在两个流动池中以100ug/mL注射pH 4.5的乙酸钠(Cytiva，目录号BR100350)，将链霉亲和素(Invitrogen，目录号434301)固定到Cytiva CM5芯片(Cytiva，目录号BR100530)上，产生2500RU的最终响应。生物素化的单Fc人CD22的捕获在主动流动池(2)的通道1-4上进行，并且小鼠CD22的捕获在该主动流动池的通道5-8上进行，并且参考流动池(1)保持为未修饰的链霉亲和素，以说明任何非特异性结合。以5μL/min将人CD22或小鼠CD22(单Fc融合体，5μg/mL)注射到主动流动池(2)上持续90秒，产生约210RU的捕获的构建体。
在作为运行缓冲液的HBS-EP+(10mM HEPES，150mM NaCl，3mM EDTA，0.05％吐温-20，pH 7.5)中，在上面制备的表面上进行Siglec-配体缀合的蛋白质的结合实验。将缀合物在运行缓冲液中以1:1从1μM连续稀释至31.25nM，并以30μL/min注射到参考流动池和主动流动池持续90秒。然后允许缀合物从表面解离持续300秒。不需要再生，因为在30秒后缀合物完全从表面解离。
结果和结论
在表2中总结了亲和力确定。如所预期的，所谓的基于BPC-Neu5Gc的Siglec配体结构和基于MPB-Neu5Ac的Siglec配体结构比基于唾液酸的基于Neu5Gc的Siglec配体结构与重组人CD22结合更紧密。基于PEG接头相对于GAL接头的配体结构在结合亲和力上没有区别。同样如所预期的，基于MPB-Neu5Ac的结构与人CD22紧密地结合，并且与小鼠CD22仅非常弱地结合。因此，BPC-Neu5Gc和MPB-Neu5Ac可以形成增强Siglec-2结合的Siglec-2/CD22配体缀合物的基础。
表2
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实例7：蛋白质-Siglec配体缀合物的制备和表征
目的
生产蛋白质的Siglec配体-接头缀合物，用于评估体外B细胞信号传导测定和体内免疫原性实验。如下所述，蛋白质是内部生产的，或者是从商业来源获得的。
材料和方法
抗体(抗IgD人IgG1嵌合抗体，阿达木单抗抗hTNFαhIgG1)表达、纯化和分析
对于抗体表达，使用ExpiFectamine 293转染试剂盒(Life Technologies,A14524)以1:1的比率用重链和轻链质粒(基于pTT5)转染悬浮Expi293F细胞(LifeTechnologies,A14527)。转染后3-6天通过离心收获培养基，并使用0.2μm PES真空无菌一次性过滤单元(ThermoScientific，5670020)过滤。
对于每250mL培养上清液，用1.5mL MabSelect Sure树脂(Cytiva/GE目录号17-5438-03)进行纯化。简而言之，每个柱用pH 7.2的PBS平衡，并装载有培养上清液。在装载步骤之后，用pH 7.2的PBS洗涤该柱，并用10mL IgG洗脱缓冲液(Thermo Scientific Ref21004)洗脱。对于每10mL洗脱池，用1mL 1M磷酸钠(pH 6.5)调节洗脱池的pH。最后，使用30kDa Amicon Ultra-15离心过滤单元，用pH 7.2的PBS进行缓冲液交换。
使用Charles River Endosafe PTS 0.01-1EU/ml检测进行内毒素含量的分析。尺寸排阻色谱在Agilent Chemstation HPLC-SEC上使用Sepax-Zenix SEC-300,200mm x7.8mm ID,3uM柱进行。毛细管凝胶电泳(cGE)在带有Perkin Elmer芯片(目录号760499)的Caliper LabChip GXII Protein 200上进行。LC-MS分析在SciEX LC 5600+，ExionLC AD，Analyst TF 1.8.1上使用Agilent AdvanceBio Desalting-RP，柱1000A，10um进行。
大肠杆菌L-天冬酰胺酶的表达和纯化
将对应于来自大肠杆菌的L-天冬酰胺酶2的DNA序列(aa L23-Y348,uniprotP00805)克隆到含有N-末端His标签的pET质粒中。将该构建体转化到ClearColi BL21(DE3)电感受态细胞(Lucigen,60810-1)中，并在含有100μg/mL氨苄青霉素的米勒氏Luria肉汤(LB)中生长过夜。接下来，将过夜培养物在含有100μg/mL氨苄青霉素的新鲜LB中以1:50稀释，并在37℃下生长至OD600 1-1.5。然后用0.1mM异丙基β-d-1-硫代半乳糖苷(IPTG)在37℃下诱导培养物持续24小时。通过以4,000rpm离心20mL沉淀细胞，并重新悬浮于40mL的裂解缓冲液(50mM磷酸钠pH 7.86、200mM NaCl、20mM咪唑和不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合物片剂)。使用Qsonica超声仪对重悬浮的细胞进行超声处理(参数：脉冲开启1sec，脉冲关闭2sec，2min，振幅40％)。裂解物通过以16,000rpm离心持续20分钟来透明，并在4℃下与Ni-NTA树脂(Invitrogen，60-0442)温育1小时，进行端对端混合。将混合物转移到25mL柱中进行重力流色谱法，并用洗涤缓冲液(50mM磷酸钠pH 7.86，200mM NaCl，20mM咪唑)洗涤。用含有50mM磷酸钠pH 7.86、200mM NaCl和300mM咪唑的缓冲液洗脱蛋白质，并使用10kDaAmicon Ultra-15离心过滤单元用PBS pH 7.2进行缓冲液交换。使用Triton X-114提取方法进行内毒素去除。简而言之，将Triton X-114添加到蛋白质溶液中，达到2％v/v的最终浓度。将该溶液在4℃下温育持续2小时，进行端对端混合。将样本转移到37℃水浴中持续10分钟，然后在室温下以20,000g离心持续20分钟。通过移液将顶部蛋白质层与Triton X-114层分离。按照制造商的方案，使用HiPPR洗涤剂去除树脂(ThermoFisher，88305)去除洗涤剂。
使用Charles River Endosafe PTS 0.01-1EU/ml检测进行内毒素含量的分析。尺寸排阻色谱在Agilent Chemstation HPLC-SEC上使用Sepax-Zenix SEC-300,200mm x7.8mm ID,3uM柱进行。毛细管凝胶电泳(cGE)在带有Perkin Elmer芯片(目录号760499)的Caliper LabChip GXII Protein 200上进行。LC-MS分析在SciEX LC 5600+，ExionLC AD，Analyst TF 1.8.1上使用Agilent AdvanceBio Desalting-RP，柱1000A，10um进行。
蛋白质-Siglec配体缀合
在10％v/v的50mM四硼酸钠pH 8.5和10％v/v的DMSO的存在下，将五氟苯基(PFP)可缀合的Siglec配体接头以比基于期望的标记程度的蛋白质高4-30倍的摩尔比添加到反应混合物中。将反应在25℃下温育持续3小时。在3h温育期之后，添加10％v/v的1M Tris-HCl pH 8.0以淬灭未反应的接头-有效载荷(payload)。然后允许中和的反应在25℃下温育持续15分钟。
蛋白质Siglec-配体缀合物的纯化
淬灭的缀合反应通过制备型尺寸排阻色谱法在4℃下使用Superdex 200Increase 10/300 GL或HiLoad 16/600 Superdex 200pg纯化，流量为0.75mL/min，PBS pH7.2。
蛋白质-Siglec配体缀合物的分析
LC-MS
质谱仪：SciEX LC 5600+，ExionLC AD，Analyst TF 1.8.1
HPLC：Agilent AdvanceBio Desalting-RP，柱1000A，10um
2.1mm x 12.5mm，流量400ul/min，样本负载：5ug
缓冲液A：水+0.1％甲酸
缓冲液B：乙腈+0.1％甲酸
分析SEC
Superose 6Increase 10/300GL
注射体积：25uL 1mg/mL样本。
缓冲液：50mM磷酸钠+400mM高氯酸钠，pH 6.2
流量：0.7mL/min
在25℃下运行40min
毛细管凝胶电泳
卡尺实验室芯片GXII蛋白200
内毒素测量
Charles River Endosafe PTS Cartridge 0.01-1EU/ml
Lonza热原C终点内毒素测定
如本文所述，通过LC/MS，通过评估缀合程度不同的种类的相对丰度，测量每种缀合物制剂的“LDR”，或配体与药物的比率。随机缀合方法(在这种情况下与赖氨酸/胺缀合)产生了每个阿达木单抗种类缀合程度不同的种类的混合物。此类系列分子种类可以表示为：
/>
在该陈述中，每种生物治疗药物Y(在这种情况下为阿达木单抗)共价结合到如由XnL定义的Siglec配体上，其中X是价态为n的唾液酸种类，其中Siglec配体与生物治疗药物的比率在0和m之间变化。所有种类都具有相同的唾液酸化合价n(单价、二价或三价)。
作为具有不同缀合程度的此类种类集合中缀合程度的总量度，LDR可以定义如下：LDR是在以所述比率变化的种类的混合物中单独的Siglec配体与生物治疗药物的比率(整数值i)的加权平均值，并且，Pi(0≤Pi≤1，其中代表混合物中每种种类的分数丰度：
结果
作为在样本研究中使用的Siglec-配体缀合物的实例，阿达木单抗和阿达木单抗-Siglec配体缀合物的纯度数据在图9中示出。图9描绘了阿达木单抗hIgG1-Siglec配体缀合物的示例性纯度和物理化学表征数据。阿达木单抗缀合物在所使用的Siglec接头的结构和缀合后配体/接头与药物比率(“LDR”)方面有所不同。
图9A示出了阿达木单抗缀合物的毛细管凝胶电泳数据。由于使用了与PFP-Siglec-接头化合物的随机赖氨酸缀合，所有LC/MS分析和cGE(毛细管凝胶电泳)分析都揭示了LDR的异质性；如所预期的，每个缀合物是具有不同定义的LDR的物种的集合。cGE显示出较慢的迁移率和与这种异质性一致的条带。LDR通过LC/MS分析来确定并且被定义为单独的LDR物种的加权平均值。
将所有缀合物纯化至寡聚体种类的均一性，其中通过制备型尺寸排阻色谱法来纯化预期的寡聚体结构(例如单体、二聚体、三聚体)。图9B示出了亲本阿达木单抗IgG和阿达木单抗-Siglec配体缀合物的示例性纯度数据，如通过分析尺寸排阻所测量的。通过分析性SEC，所有的亲本蛋白质制剂和结合物制剂的纯度>99％。
实例8：通过Siglec配体-抗IgD抗体缀合物抑制B细胞受体介导的小鼠原代B细胞活化。
目的和介绍
本实验的目的是测试B细胞受体(BCR)激动剂IgG-Siglec配体缀合物对小鼠B细胞活化的抑制作用。
所描述的平台技术基于这样的前提，即B细胞通过其克隆型B细胞受体的活化可以通过CD22/Siglec-2抑制性辅受体到共接合的B细胞受体的物理募集来抑制。不希望被理论所束缚，募集到B细胞受体的CD22由于其接近B细胞受体处的高局部蛋白激酶活性而在其ITIM细胞质基序酪氨酸上被磷酸化。磷酸化的CD22然后将磷酸酶(如SHP-1和SHP-2)募集到细胞表面，靠近B细胞活化复合物。此类升高的局部磷酸酶活性使B细胞活化所必需的B细胞活化复合物的组分去磷酸化，从而关闭了对B细胞受体接合的响应。在正常情况下，Siglec-2免疫抑制机制充当对异常B细胞活化的检查，保护自身反应性抗体产生、过度炎症和自身免疫。所描述的平台技术利用这种自然现象将外源蛋白伪装成自身，仅抑制对给定外源蛋白具有特异性的初始B细胞克隆上的B细胞活化，从而阻断针对外源蛋白的免疫球蛋白产生，同时保持B细胞对其他抗原的响应完整。
原代B细胞群体的高度多样性，以及B细胞受体序列和克隆的高度多样性(每个人高达1012个)，对用单一的、明确定义的BCR抗原体外研究BCR激动作用提出了挑战。因此，泛BCR活化剂(如抗IgD抗体或抗IgM抗体)可以结合、交联和活化BCR—不考虑B细胞/BCR克隆性—被用于体外评估BCR活化。在本实例中描述的实验中，抗小鼠IgD单克隆抗体以亲本IgG形式或以IgG-Siglec-配体缀合物的形式用于研究Siglec-2-B细胞受体共接合对B细胞活化的影响。
为了控制抗IgD缀合物对BCR结合能力的影响，使用竞争结合测定来评估Siglec配体缀合物的结合活性，并确保明显的抑制作用是由于Siglec-2 x BCR的共接合，而不是抗IgD对受体结合的普遍破坏。
材料和方法—体外鼠B细胞活化和表面IgD竞争测定
如实例7所述制备抗IgD和抗IgD-Siglec配体测试制品。
将来自C57BL/6小鼠的脾细胞收获到单细胞悬浮液中，使用ACK缓冲液进行红细胞裂解，并以每孔200,000个细胞的浓度铺在完全RPMI培养基中的圆底96孔板中。通过添加渐增浓度的抗小鼠IgD或Siglec配体缀合的抗小鼠IgD刺激细胞持续3小时。通过流式细胞术评估B细胞活化。
为了测量所述刺激后的B细胞活化，通过以1200rpm旋转细胞持续5分钟并用PBS冲洗来洗涤细胞两次。然后将细胞重悬于染色缓冲液(1％牛血清白蛋白/0.1％叠氮化钠/1x磷酸盐缓冲盐水)中，并在添加抗CD45、抗CD19、抗CD69和抗CD86抗体(BD Biosciences,Biolegend,Fisher)之前，与Fc-block(BD Biosciences)一起温育持续五分钟。然后将细胞在室温下在黑暗中温育持续另外的30分钟。然后用染色缓冲液洗涤细胞三次，然后在ZE5(BioRad)上分析。使用FlowJo(v10.8.0)软件进行数据分析。
对如上所述制备的脾细胞进行Siglec配体缀合的抗小鼠IgD和抗小鼠IgD结合的竞争结合分析。对于该测定，将细胞以每孔200,000个细胞的浓度接种在完全RPMI培养基中的圆底96孔板中。然后将细胞与小鼠Fc-block(BD Biosciences)一起温育持续五分钟。在该温育期后，将0.14nM的固定浓度的抗小鼠-IgD-AlexaFluor647与单独的RPMI或渐增滴定的非荧光标记的Siglec配体缀合的抗小鼠IgD以及抗CD19和抗CD45一起添加到细胞中。将细胞在4℃下在黑暗中温育持续30分钟。之后，用染色缓冲液(1％牛血清白蛋白/0.1％叠氮化钠/1×磷酸盐缓冲盐水)离心洗涤细胞两次，通过流式细胞仪(ZE5，BioRad)测定至少10,000个细胞的平均荧光强度(MFI)来分析抗体结合。
结果和结论
图10、图11和图12都描绘了体外B细胞活化测定，其中用带有单价或二价配体结构的B细胞受体激动的抗IgD抗体或B细胞受体激动的抗IgD-Siglec配体缀合物处理小鼠原代B细胞。在剂量滴定实验中，将抗IgD和抗IgD-Siglec配体缀合物的B细胞刺激活性与CD69上调的活化读数进行比较。通过为CD69阳性的细胞的百分比(图10A、11A、12A)或CD69平均荧光强度(MFI)(图10B、11B、12B)来评估不同处理组的CD69水平。测试的缀合物中的Siglec配体在接头结构(“PEG”或“Gal”)和化合价(“单价”或“二价”)方面不同，并且缀合物在配体/接头与药物比率(“LDR”)或每个药物分子中Siglec配体结构的平均数量方面也不同。在亲代抗IgD IgG诱导CD69阳性细胞％和CD69 MFI的浓度依赖性增加时，Siglec配体-抗IgD缀合物显示抑制的活化。抑制程度随着化合价的增加而增加，并且基于PEG的接头比基于GAL的接头更强。一般来说，较高的化合价导致对B细胞活化的更大抑制，其中抑制程度为三价>二价>单价Siglec配体结构。在某些情况下，存在B细胞活化的完全抑制(例如，BPC-Neu5Gc三价PEG-LDR 8)。
图13描绘了与亲代的未缀合的抗IgD抗体相比，Siglec配体-抗IgD抗体缀合物与小鼠原代B细胞结合的评估。通过荧光细胞术以与Alexa-647标记的抗IgD抗体的竞争测定形式来评估结合。图13A描绘了未标记的抗IgD-Siglec配体缀合物和未缀合的未标记的抗IgD抗体对荧光标记的抗IgD与IgD+B细胞结合的浓度依赖性抑制的剂量响应结果。示出了每种未标记的测试制品的结合IC50(以纳摩尔计)。图13B是结合测定系统的示意图。数据显示对Siglec配体缀合物的结合IC50没有影响或适度的影响，表明在图10、图11和图12中观察到的B细胞活化不能通过缀合物固有的B细胞受体性能的破坏来解释。
实例9：Siglec配体-抗IgD抗体缀合物抑制B细胞受体介导的小鼠原代B细胞活化是强烈的CD22依赖性
目的
这些实验的目的是评价抗IgD-Siglec配体缀合物抑制B细胞受体介导的B细胞活化的CD22依赖性。本实例是实例8所述实验的继续，使用B细胞克隆池中的泛B细胞受体激动作用来研究CD22-B细胞受体共接合对B细胞活化的影响。在该实例中，来自野生型小鼠的原代B细胞用于评估BCR抑制对CD22的依赖性。如在实例8中，竞争性BCR结合分析用于控制蛋白质赖氨酸缀合对抗IgD-Siglec配体缀合物的BCR结合活性的破坏作用。
材料和方法
如实例7所述制备抗IgD和抗IgD-Siglec配体测试制品。
将来自C57BL/6小鼠的脾细胞收获到单细胞悬浮液中，使用ACK缓冲液进行红细胞裂解，并以每孔200,000个细胞的浓度铺在完全RPMI培养基中的圆底96孔板中。通过添加渐增浓度的抗小鼠IgD或Siglec配体缀合的抗小鼠IgD刺激细胞持续3小时。然后通过流式细胞术评估B细胞活化。
为了测量所述刺激后的B细胞活化，通过以1200rpm旋转细胞持续5分钟并用PBS冲洗来洗涤细胞两次。然后将细胞重悬于染色缓冲液(1％牛血清白蛋白/0.1％叠氮化钠/1x磷酸盐缓冲盐水)中，并在添加抗CD45、抗CD19、抗CD69和抗CD86抗体(BD Biosciences,Biolegend,Fisher)之前，与Fc-block(BD Biosciences)一起温育持续五分钟。然后将细胞在室温下在黑暗中温育持续另外的30分钟。然后用染色缓冲液洗涤细胞三次，然后在ZE5(BioRad)上分析。使用FlowJo(v10.8.0)软件进行数据分析。
在如上所述制备的脾细胞上进行Siglec配体缀合的抗小鼠IgD和抗小鼠IgD结合的竞争。对于该测定，将细胞以每孔200,000个细胞的浓度接种在完全RPMI培养基中的圆底96孔板中。然后将细胞与小鼠Fc-block(BD Biosciences)一起温育持续五分钟。在该温育期后，将0.14nM的固定浓度的抗小鼠-IgD-AlexaFluor647与单独的RPMI或渐增滴定的非荧光标记的Siglec配体缀合的抗小鼠IgD一起添加到细胞中，以及将抗CD19和抗CD45将细胞在4℃下在黑暗中温育持续30分钟。然后，用染色缓冲液(1％牛血清白蛋白/0.1％叠氮化钠/1x磷酸盐缓冲盐水)离心洗涤细胞两次，并通过流式细胞术(ZE5，BioRad)通过确定至少10,000个细胞的平均荧光强度(MFI)来分析抗体结合。
结果和结论
图14描绘了体外B细胞活化测定，其中用B细胞受体激动的抗IgD抗体或抗IgD-Siglec配体缀合物处理小鼠原代B细胞，其中使用相同的测试制品来处理来自野生型小鼠的B细胞。缀合物Siglec配体(“BPC-Neu5Gc单价PEG-LDR 9”、“BPC-Neu5Gc二价PEG-LDR 6”、“BPC-Neu5Gc三价PEG-LDR 6”和“BPC-Neu5Gc三价PEG-LDR 8”)增强了Siglec-2结合。在剂量滴定实验中，将抗IgD和抗IgD-Siglec配体缀合物的B细胞刺激活性与CD69上调的活化读数进行比较。通过为CD69阳性的细胞的百分比来评估不同处理组的CD69水平。测试的缀合物中的Siglec配体含有基于PEG的接头结构(“PEG”)，并且在化合价上不同(“单价”、“二价”和“三价”)。缀合物在配体/接头与药物比率(“LDR”)或每个药物分子的Siglec配体结构的平均数量方面也不同。如前面实例8和图10、图11和图12所示，野生型B细胞的活化被带有Siglec配体的抗IgD缀合物强烈地抑制。相比之下，来自CD22敲除(“CD22 KO”)小鼠的B细胞可以显示Siglec配体-缀合物的完全B细胞活化活性，而对活化效力没有影响或只有适度影响。重要的是，这些结果表明Siglec-2配体缀合物的抑制作用是由Siglec-2/CD22介导的，如所预期的。
如先前在实例8中测试的(图13)，Siglec配体-抗IgD缀合物和亲本IgD的BCR结合活性在细胞计量测定中评估(图15)，使用与上文在图14中测试BCR活化的那些制剂相同的制剂。竞争结合分析显示，除了最高的LDR三价缀合物(BPC-Neu5Gc三价PEG-LDR 8之外，所有缀合物制剂对BCR结合都是完全活性的。这些结果证实了CD22KO活化实验结果，其中抗IgD缀合物中B细胞活化的抑制由于BCR的失活而不能解释。
实例10：Siglec配体-抗IgD抗体缀合物抑制B细胞受体介导的小鼠原代B细胞活化需要增强Siglec-2/CD22结合
目的
本文所述的实验的目的是评估增强的Siglec-2结合对抑制B细胞受体介导的B细胞活化的重要性。本实例是实例8和9中描述的实验的继续，使用B细胞克隆池中的泛B细胞受体激动作用来研究CD22-B细胞受体共接合对小鼠B细胞活化的影响。在本实例中，使用增强的Siglec-2配体缀合物(基于BPC-Neu5Gc)或基于天然神经氨酸结构的Siglec-2配体(Neu5Gc)，制备的缀合物上存在的Siglec-2配体在Siglec-2结合的能力方面有所不同。此处使用的Siglec配体先前在实例4中评估并验证了CD22结合能力。比较带有增强的和未增强的Siglec-2的缀合物，能够评估Siglec-2亲和力对所述平台技术的B细胞受体抑制作用的重要性。
材料和方法
如实例7所述制备抗IgD和抗IgD-Siglec配体测试制品。
将来自C57BL/6小鼠的脾细胞收获到单细胞悬浮液中，使用ACK缓冲液进行红细胞裂解，并以每孔200,000个细胞的浓度铺在完全RPMI培养基中的圆底96孔板中。通过添加渐增浓度的抗小鼠IgD或Siglec配体缀合的抗小鼠IgD刺激细胞持续3小时。通过流式细胞术评估B细胞活化。
为了测量所述刺激后的B细胞活化，通过以1200rpm旋转细胞持续5分钟并用PBS冲洗来洗涤细胞两次。然后将细胞重悬于染色缓冲液(1％牛血清白蛋白/0.1％叠氮化钠/1x磷酸盐缓冲盐水)中，并在添加抗CD45、抗CD19、抗CD69和抗CD86抗体(BD Biosciences,Biolegend,Fisher)之前，与Fc-block(BD Biosciences)一起温育持续五分钟。然后将细胞在室温下在黑暗中温育持续另外的30分钟。然后用染色缓冲液洗涤细胞三次，然后在ZE5(BioRad)上分析。使用FlowJo(v10.8.0)软件进行数据分析。
在如上所述制备的脾细胞上进行Siglec配体缀合的抗小鼠IgD和抗小鼠IgD结合的竞争。对于该测定，将细胞以每孔200,000个细胞的浓度接种在完全RPMI培养基中的圆底96孔板中。然后将细胞与小鼠Fc-block(BD Biosciences)一起温育持续五分钟。在该温育期后，将0.14nM的固定浓度的抗小鼠-IgD-AlexaFluor647与单独的RPMI或渐增滴定的非荧光标记的Siglec配体缀合的抗小鼠IgD一起添加到细胞中，以及将抗CD19和抗CD45将细胞在4℃下在黑暗中温育持续30分钟。然后，用染色缓冲液(1％牛血清白蛋白/0.1％叠氮化钠/1x磷酸盐缓冲盐水)离心洗涤细胞两次，并通过流式细胞术(ZE5，BioRad)通过确定至少10,000个细胞的平均荧光强度(MFI)来分析抗体结合。
结果和结论
图16描述了体外B细胞活化测试，其中用B细胞受体激动的抗IgD抗体或抗IgD-Siglec配体缀合物处理小鼠原代B细胞，其中对于Siglec-2结合，Siglec配体被增强(“BPC-Neu5Gc单价PEG-LDR 9”和“BPC-Neu5Gc二价PEG-LDR 6”)或未被增强(“Neu5Gc单价PEG-LDR10”和“Neu5Gc二价PEG-LDR 7”)。在剂量滴定实验中，将抗IgD和抗IgD-Siglec配体缀合物的B细胞刺激活性与CD69上调的活化读数进行比较。通过为CD69阳性的细胞的百分比来评估不同处理组的CD69水平。示出了单价(图16A)和二价(图16B)Siglec配体缀合物的剂量响应曲线。缀合物在配体/接头与药物比率(“LDR”)或每个药物分子的Siglec配体结构的平均数量方面也不同。增强的Siglec配体缀合物显示出对B细胞活化的强烈抑制，而带有未增强的Neu5Gc Siglec配体的缀合物显示出对B细胞活化的完全无抑制。重要的是，该实例揭示了天然神经氨酸对CD22的亲和力不足以介导Siglec配体缀合物的BCR抑制作用。这些结果也证实了BCR活化抑制作用不是通过缀合对抗IgD抗体的损害的简单和微不足道的后果；同样，在Siglec-2结合太弱的情况下或者在B细胞缺乏CD22的情况下，缀合的抗IgD分子对BCR活化完全有效。
图17描绘了单独的体外原代小鼠B细胞活化测定，其测试了CD22接合对Siglec配体-缀合物介导的B细胞受体活化抑制的重要性。如图16和实例8和9所示，用B细胞受体激动的抗IgD抗体或各种抗IgD-Siglec配体缀合物处理小鼠原代B细胞。在这种情况下，缀合物携带增强的Siglec接头(“BPC-Neu5Gc单价PEG-LDR 9”、“BPC-Neu5Gc二价PEG-LDR 6”、“BPC-Neu5Gc三价PEG-LDR 6”和“BPC-Neu5Gc三价PEG-LDR 8”)，或阴性对照，缺乏Siglec结合决定簇的asialo接头(“Asialo单价PEG-LDR 7”、“Asialo二价PEG-LDR 8”和“Asialo三价PEG-LDR 7”)。如同带有弱亲和力Siglec-2配体的缀合物一样，带有缺乏Siglec-2结合活性的接头的缀合物对BCR和B细胞活化完全有活性。
如在实例8和9中，在竞争性细胞计量测定中评估缀合物(增强的形式和asialo形式)和亲本抗IgD的结合活性(图18)。测试制品与用于图17的测试制品相同。单价和二价缀合物对亲本抗IgD抗体显示相同的结合IC50。对于三价缀合物，低LDR制剂不受结合的干扰，而如图15所示，高LDR三价缀合物在竞争结合测定中显示出较弱的结合IC50。总的来说，这些结果证实了上述实例的结果，其中Siglec配体抗IgD缀合物可以保留对BCR结合的全部功能活性，同时通过Siglec-2/CD22共接合活性抑制BCR活化。
实例11：Siglec配体-抗IgD抗体缀合物抑制B细胞受体介导的小鼠原代B细胞活化需要BCR和CD22/Siglec-2以顺式方式接合
目的和介绍
本文所述的实验的目的是评估CD22/Siglec-2和B细胞受体上相同分子的顺式共接合对通过B细胞受体抑制B细胞活化的重要性。本实例是实例8、9和10中描述的实验的继续，使用B细胞克隆池中的泛B细胞受体激动作用来研究CD22-B细胞受体共接合对B细胞活化的影响。在该实例中，Siglec-2配体(增强的，基于BPC-Neu5Gc)以顺式存在于抗IgD抗体上(如在上述实验中)或以反式存在于不与B细胞受体接合的单独的阴性对照抗体(阿达木单抗抗TNFα)上。在后一种情况下，将阿达木单抗-Siglec配体与固定浓度的未修饰的抗IgDBCR激动剂抗体共同施用于脾细胞。
第二个实验评估了在存在BCR激动剂抗体和Siglec配体-BCR激动剂抗体缀合物的混合物的情况下B细胞活化的结果。评估抗IgD IgG和Siglec配体-抗IgD缀合物的混合物对B细胞活化的抑制，其中在存在或不存在2nM抗IgD激动剂抗体的情况下，以不同浓度添加BPC-Neu5Gc二价PEG LDR6-抗IgD。
材料和方法
如实例7所述制备抗IgD和抗IgD-Siglec配体测试制品。
对如上所述制备的来自C57BL/6小鼠的脾细胞进行测定，以确定SigL介导的B细胞活化抑制是以顺式还是反式发生。对于该测定，将细胞以每孔200,000个细胞的浓度接种在完全RPMI培养基中的圆底96孔板中。将细胞与小鼠Fc-block(BD Biosciences)一起温育持续五分钟。在该温育期后，向细胞中添加渐增浓度的人IgG1同种型、抗小鼠IgD、Siglec配体缀合的抗小鼠IgD或Siglec配体缀合的阿达木单抗。在一组单独的条件下，将固定浓度的2nM抗小鼠IgD以及增加浓度的SigL缀合的阿达木单抗一起添加到细胞中。细胞被刺激持续3小时，然后通过流式细胞术评估B细胞活化。
为了测量所述刺激后的B细胞活化，通过以1200rpm旋转细胞持续5分钟并用PBS冲洗来洗涤细胞两次。然后将细胞重悬于染色缓冲液(1％牛血清白蛋白/0.1％叠氮化钠/1x磷酸盐缓冲盐水)中，并在添加抗CD45、抗CD19、抗CD69和抗CD86抗体(BD Biosciences,Biolegend,Fisher)之前，与Fc-block(BD Biosciences)一起温育持续五分钟。然后将细胞在室温下在黑暗中温育持续另外的30分钟。然后用染色缓冲液洗涤细胞三次，然后在ZE5(BioRad)上分析。使用FlowJo(v10.8.0)软件进行数据分析。
结果和结论
图19描绘了体外原代小鼠B细胞活化测定，其测试了顺式B细胞受体和CD22共接合对抑制B细胞受体活化的重要性。图19A描绘了B细胞受体活化的模型，其中抗IgD BCR激动剂和Siglec-2接合部分存在于相同或不同的分子上。在剂量滴定实验中，将抗IgD、抗IgD-Siglec配体缀合物或2nM抗IgD和不同浓度的对照抗体-Siglec配体缀合物的混合物的B细胞刺激活性与CD69上调的活化读数进行比较。通过CD69平均荧光强度(MFI)评估不同处理组的CD69水平(图19B)。测试的缀合物中的Siglec配体含有基于PEG的接头结构(“PEG”)并带有二价Siglec配体结构。数据示出了BCR激动剂活性和Siglec-2结合活性在同一分子中呈顺式的明确要求。
图20描绘了在激动性抗IgD抗体和非激动性Siglec配体-抗IgD缀合物的混合物中测试BCR激动作用抑制的体外原代小鼠B细胞活化测定。在存在或不存在2nM抗IgD BCR激动剂的情况下滴定Siglec配体-抗IgD缀合物。在剂量滴定实验中，将抗IgD、抗IgD-Siglec配体缀合物或2nM抗IgD与不同浓度的抗IgD-Siglec配体缀合物的混合物的B细胞刺激活性与CD69上调的活化读数进行比较。通过CD69平均荧光强度(MFI)评估不同处理组的CD69水平。测试的抗IgD缀合物带有二价Siglec-2增强的配体(MPB-Neu5Ac)和基于PEG的接头，其中配体/接头与药物比率(“LDR”)为6。
结果表明，Siglec配体缀合物必须用抗IgD抗体大致等化学计量滴定，以抑制50％的B细胞活化。因此，抗IgD和Siglec配体-抗IgD缀合物都不是BCR结果的主要因素。两者在B细胞活化的效果上竞争相当。
实例12：通过Siglec配体-抗IgM抗体缀合物抑制B细胞受体介导的人原代B细胞活化。
目的
本实验的目的是测试B细胞受体激动剂IgG-Siglec配体缀合物对人B细胞活化的抑制作用。该实验类似于实例8中所述的实验，此处的焦点是原代人PBMC来源的B细胞，而不是实例8至11中所使用的原代小鼠脾细胞。
所描述的平台技术基于这样的前提，即B细胞通过其克隆型B细胞受体的活化可以通过募集CD22/Siglec-2抑制性共受体而被抑制，所述共受体紧邻共接合的B细胞受体。募集到B细胞受体的CD22在其ITIM细胞质基序酪氨酸上被磷酸化，这是由于它接近B细胞受体上的高局部蛋白激酶活性。磷酸化的CD22然后将磷酸酶(如SHP-1和SHP-2)募集到细胞表面，靠近B细胞活化复合物。此类升高的局部磷酸酶活性使B细胞活化所必需的B细胞活化复合物的组分去磷酸化，从而关闭了对B细胞受体接合的响应。在正常情况下，Siglec-2免疫抑制机制充当对异常B细胞活化的检查，保护自身反应性抗体产生、过度炎症和自身免疫。所描述的平台技术利用这种自然现象将外源蛋白伪装成自身，仅抑制对给定外源蛋白具有特异性的初始B细胞克隆上的B细胞活化，从而阻断外源蛋白的免疫球蛋白产生，同时保持B细胞对其他抗原的响应完整。
材料和方法
如实例7所述制备抗IgM和抗IgM-Siglec配体测试制品。
将人PBMC(StemExpress)以每孔200,000个细胞的浓度铺在完全RPMI培养基中的圆底96孔板中。通过添加渐增浓度的抗人IgM或Siglec配体缀合的抗人IgM刺激细胞持续18小时。通过流式细胞术评估B细胞活化。
为了测量所述刺激后的B细胞活化，通过以1200rpm旋转细胞持续5分钟并用PBS冲洗来洗涤细胞两次。将细胞重悬于染色缓冲液(1％牛血清白蛋白/0.1％叠氮化钠/1x磷酸盐缓冲盐水)中，并在添加抗CD45、抗CD19、抗CD69和抗CD86抗体(BD Biosciences,Biolegend,Fisher)之前与Fc-block(BD Biosciences)一起温育持续五分钟。细胞在室温下在黑暗中温育持续另外的30分钟，然后用染色缓冲液洗涤三次，然后在ZE5(BioRad)上分析。使用FlowJo(v10.8.0)软件进行数据分析。
结果
图21描绘了使用人原代B细胞和B细胞受体激动的抗IgM抗体或与相同抗IgM抗体的Siglec配体缀合物的体外B细胞活化测定。在剂量滴定实验中，将抗IgM和抗IgM-Siglec配体缀合物的B细胞刺激活性与CD69上调的活化读数进行比较。通过为CD69阳性的细胞的百分比来评估不同处理组的CD69水平。示出了使用基于半乳糖的接头(图21A)和基于PEG的接头(图21B)的缀合物的结果。所有缀合物都带有Siglec-2增强的MPB-Neu5Ac结构，具有不同的化合价和配体/接头与药物比率(“LDR”)，或每个药物分子中Siglec配体结构的平均数量。
结论
在亲本抗IgM IgG诱导CD69阳性细胞百分比和CD69 MFI的浓度依赖性增加的情况下，Siglec配体-抗IgD缀合物显示出非常强的抑制活性。抑制程度随着化合价的增加而增加，但是在基于PEG的接头和基于GAL的接头之间通常是相等的。重要的是，这些数据示出了Siglec-2配体缀合物的抑制作用在原代人B细胞系统和原代小鼠B细胞系统之间的转化(实例8至11)。
实例13：通过Siglec配体-抗IgM抗体缀合物抑制B细胞受体介导的人原代B细胞活化需要增强Siglec-2/CD22结合
目的
本文所述实验的目的是评估增强的Siglec-2结合对抑制人类B细胞受体介导的B细胞活化的重要性。本实例是实例12所述实验的继续，使用人B细胞克隆池中的泛B细胞受体激动作用来研究CD22-B细胞受体共接合对B细胞活化的影响。在本实例中，使用增强的Siglec-2配体缀合物(基于BPC-Neu5Gc)或基于天然神经氨酸结构的Siglec-2配体(Neu5Gc)，制备的缀合物上存在的Siglec-2配体在Siglec-2结合的能力方面有所不同。比较带有增强的和未增强的Siglec-2的缀合物，能够评估Siglec-2亲和力对所述平台技术的B细胞受体抑制作用的重要性。
这些采用人B细胞的实验类似于实例10中所述的用增强的和未增强的Siglec-2配体抑制小鼠B细胞活化的实验。
材料和方法
如实例7所述制备抗IgM和抗IgM-Siglec配体测试制品。
将人PBMC(StemExpress)以每孔200,000个细胞的浓度铺在完全RPMI培养基中的圆底96孔板中。通过添加渐增浓度的抗人IgM或Siglec配体缀合的抗人IgM刺激细胞持续18小时。通过流式细胞术评估B细胞活化。
为了测量所述刺激后的B细胞活化，通过以1200rpm旋转细胞持续5分钟并用PBS冲洗来洗涤细胞两次。将细胞重悬于染色缓冲液(1％牛血清白蛋白/0.1％叠氮化钠/1x磷酸盐缓冲盐水)中，并在添加抗CD45、抗CD19、抗CD69和抗CD86抗体(BD Biosciences,Biolegend,Fisher)之前与Fc-block(BD Biosciences)一起温育持续五分钟。细胞在室温下在黑暗中温育持续另外的30分钟，然后用染色缓冲液洗涤三次，然后在ZE5(BioRad)上分析。使用FlowJo(v10.8.0)软件进行数据分析。
Siglec配体缀合的抗人IgD和抗人IgM结合的竞争在来自上述分析中使用的相同供体的人PBMC上进行。对于该测定，将细胞以每孔200,000个细胞的浓度接种在完全RPMI培养基中的圆底96孔板中。随后将细胞与人Fc-block(BD Biosciences)一起温育持续五分钟。在该温育期后，将2.4nM抗人IgM-AlexaFluor647与单独的RPMI或渐增滴定的非荧光标记的Siglec配体缀合的抗人IgM和抗CD19一起添加到细胞中。将细胞在4℃下在黑暗中温育持续30分钟。在温育后，通过用染色缓冲液(1％牛血清白蛋白/0.1％叠氮化钠/1x磷酸盐缓冲盐水)离心洗涤细胞两次，并通过流式细胞术(ZE5，BioRad)通过确定至少5000个细胞的平均荧光强度(MFI)来分析抗体结合。
结果和结论
图22描绘了使用人原代B细胞和B细胞受体激动抗IgM抗体或与相同抗IgM抗体的Siglec配体缀合物的体外B细胞活化测定。缀合物带有Siglec配体结构，其对于CD22结合是增强的(“BPC-Neu5Gc单价PEG-LDR5-αIgM”和“BPC-Neu5Gc二价PEG-LDR9-αIgM”)或者未增强的(“Neu5Gc单价PEG-LDR6-αIgM”和“Neu5Gc二价PEG-LDR6-αIgM”)。如图17(实例10)中，对于小鼠B细胞系统，携带对于CD22结合未增强的Siglec配体的缀合物对于BCR活化是完全活性的，而如前所述，增强的结合物缀合物显示出强的BCR抑制。
如上述实例中一样，使用BCR竞争测定来控制与B细胞受体结合的缀合物的扰动(图23)。测试制品与图22中B细胞活化实验中使用的测试制品相同。增强的和未增强的缀合物显示出与亲本抗IgM抗体的等效结合IC50，从而表明Siglec配体缀合物的BCR结合缺乏干扰。
实例14：在用Siglec配体-阿达木单抗缀合物处理的小鼠中抗药物抗体的体内抑制。
目的
本实验的目的是测试给药有阿达木单抗-Siglec-2配体缀合物的小鼠的免疫原性的抑制。亲本阿达木单抗hIgG1在小鼠中具有高度免疫原性，在单次4mg/kg剂量后具有强烈的免疫球蛋白响应。该实例和随后的实例旨在通过对具有不同蛋白质的Siglec配体缀合物的免疫原性影响的体内评估来证实实例8至13中所示的体外B细胞抑制作用。
材料和方法
如实例7所述制备阿达木单抗hIgG1和阿达木单抗-Siglec配体缀合物。
为了评估对阿达木单抗和/或阿达木单抗-Siglec配体缀合物特异性的抗体的产生，通过静脉内注射阿达木单抗或Siglec配体缀合的阿达木单抗来免疫C57BL/6小鼠。在研究的第-1天，基于体重将动物随机分成治疗组。在研究的第0天，对动物进行放血以获得基线血清，然后静脉内注射阿达木单抗或阿达木单抗-Siglec配体缀合物。通过在无菌缓冲盐水中制备0.8mg/ml抗原溶液来制备单独的抗原。然后经由尾静脉向动物注射0.1ml(约4ml/kg)的0.8mg/ml的抗原。基于20g小鼠的总剂量将为4mg/kg。在整个研究过程中，在吸入的异氟烷麻醉下，每周经由眶后窦对动物进行放血。在研究当天，28只动物用吸入的异氟烷麻醉，然后经由心脏穿刺放血，然后通过颈椎脱臼处死。将全血收集到Microvette EDTA毛细管收集管(Sarstedt Inc)中，然后按照制造商的血清收集说明进行进一步加工。样本储存在-80℃下，直到进行分析。
ADA测定在涂覆有抗原的96孔测定板(Nunc板，黑色96孔免疫板，ThermoScientific,437111)上进行，如下所述。阿达木单抗和阿达木单抗缀合物的混合物以每种5μg/ml的浓度包被，每孔100μL。所有包被的抗原在pH 7.2的PBS中稀释，并在4℃下温育过夜。第二天，除去板包被溶液，并在室温下用200μL/孔的在PBS中的3％ BSA、20μM的EDTA、0.1％吐温-20封闭板持续1小时。血清样本在PBS中的3％ BSA、20μM的EDTA、0.1％吐温-20中以1:185稀释，并以三倍连续稀释添加。板在室温下温育持续1小时，然后用含0.05％吐温-20的PBS缓冲液洗涤。在洗涤之后，添加100μL的1:2500稀释的驴抗小鼠IgG(H+L)-HRP(SouthernBiotech,6411-05)，并且在室温下温育持续1小时。在洗涤测定板之后，将100μL的QuantaBlu底物溶液(Thermo Scientific,15169)添加到每个孔中，并温育持续15分钟。QuantaBlu Fluorogenic过氧化物底物的激发和发射设置为325nm和420nm，并且使用SpectraMax板读取器测量相对荧光单位。生成第7天、第14天、第21天和第28天的血清稀释曲线。通过稀释血清来确定滴度，其给出高于背景的2x OD。
结果和结论
图24和图25描绘了在小鼠中对阿达木单抗和Siglec配体-阿达木单抗缀合物的抗药物抗体响应的评估。缀合物带有基于BPC-Neu5Gc的Siglec配体-接头结构，该结构对于Siglec配体是单价的、二价的或三价的，具有含半乳糖(图24)或含PEG(图25)的接头结构。小鼠接受单次4mg/kg静脉内剂量的阿达木单抗或阿达木单抗-Siglec配体缀合物。在第14天、第21天和第28天测量针对阿达木单抗/阿达木单抗缀合物的血清IgG水平。对于含有GAL接头的缀合物和含有PEG接头的缀合物两者，其中亲本阿达木单抗hIgG1在第14天、第21天和第28天表现出高的小鼠IgG血清滴度，Siglec配体缀合物在抗药物滴度方面都受到强烈抑制，在单价、二价和三价缀合物之间在抑制程度方面存在一些适度差异。与之前描述的体外泛BCR活化测定(其中三价缀合物在BCR抑制中明显更强)相比，体内免疫原性结果显示单价、二价和三价缀合物在抑制抗药物滴度方面都是有效的。
这些抑制小鼠的免疫原性的结果与实例8至13中的体外B细胞活化结果相关；用增强的Siglec配体修饰免疫原性抗体足以强烈地抑制免疫原性。
实例15：阿达木单抗和Siglec配体缀合的阿达木单抗在C57BL/6小鼠体内的药代动力学分析
目的
本实验的目的是确定Siglec配体缀合物阿达木单抗制剂相对于亲本阿达木单抗IgG的药代动力学是否存在扰动。
材料和方法
在单次静脉内施用阿达木单抗或单独的SigL缀合的阿达木单抗抗体后，在C57BL/6小鼠中进行药代动力学监测。在研究第-1天，根据体重将小鼠随机分为治疗组。在研究的第0天，经由尾静脉IV对动物施用测试制品，其中含有0.1mL的0.8mg/mL的在无菌缓冲盐水中的抗原溶液，总剂量为约4mg/kg。在整个研究过程中，在测试制品施用0.3天、1天、7天、5天、7天和10天后，在吸入的异氟烷麻醉下，每周经由眶后窦对动物进行放血。将全血收集到Microvette K2EDTA毛细管收集管(Sarstedt Inc)中，然后按照制造商的说明进一步加工以收集血浆。血浆样本中阿达木单抗和SigL缀合的阿达木单抗的水平使用AlphaLISA人IgG测定(Perkin Elmer)按照制造商的方案进行测量。
使用正交分析方法，在Biacore 8K+上在25℃下对小鼠血清中的阿达木单抗进行PK分析。简言之，来自来自Cytiva的人抗体捕获试剂盒(目录号29234600)的抗人Fc抗体在流动池2上通过所有8个通道进行胺偶联，最终响应为约7000RU。通过在运行缓冲液(HBS-EP+)中以1:300稀释初始小鼠血清，并以1:1从1000μg/mL连续稀释至0.976μg/mL，建立每种测试制品的校准系列。测试血清样本也在运行缓冲液中以1:300稀释。将血清和校准样本以30μL/min注入到两个表面中持续400秒，并允许解离持续120秒。通过以30μL/min注射2次3MMgCl2持续15秒，实现表面的再生。在注射样本5秒后选择报告点进行分析。使用该报告点，在GraphPad Prism(版本9.0.0)中使用s形4PL最小二乘法拟合构建校准曲线，并从该曲线内插测试血清样本浓度。
结果和结论
图26描绘了小鼠中阿达木单抗hIgG和Siglec配体-阿达木单抗hIgG1缀合物的血清药代动力学的分析。缀合物带有基于BPC-Neu5Gc的Siglec配体-接头结构，其对于Siglec配体是单价的、二价的或三价的，带有含PEG的接头结构。测试制品与实例13中使用的测试制品相同(图25)。在静脉内给药之后，通过抗人IgG Fc ELISA(图26A)和SPR(表面等离子体共振，图26B)来分析血清样本的测试制品浓度。
阿达木单抗IgG和阿达木单抗缀合物显示出如由两个独立的测定系统(ELISA和SPR)测量的相同的血清PK曲线。应当注意，PK研究以与实例14中的免疫原性研究相同的剂量(4mg/kg)运行。因此，这些结果排除了缺乏药物暴露作为实例14中抑制的免疫原性的基础，并且也排除了Siglec配体缀合物对血清PK的干扰。
实例16：阿达木单抗和阿达木单抗缀合物与TNF(SPR)的结合分析
目的
本实验的目的是评估阿达木单抗Siglec配体缀合物的功能活性扰动，如通过TNFα结合的亲和力分析所测量的。
材料和方法
阿达木单抗缀合物的结合实验在Biacore 8K+上使用Cytiva蛋白A芯片系列S(目录号29127555)进行。简言之，在运行缓冲液(HBS-EP+)中稀释缀合物，并在活性表面上以30μL/min注射持续20秒之后寻找产生约30RU的响应的浓度(流动池2)。将人TNFα在运行缓冲液1:1中从100nM连续稀释至0.1953nM，然后以30μL/min注射穿过参考(流动池1)和活性表面(流动池2)持续120秒，并允许解离持续600s。用10mM甘氨酸，pH 1.5，30μL/min的30秒脉冲实现表面再生。传感图符合Biacore Insight评估软件版本3.0.11.15423中的1:1结合模型。
结果
图27描绘了阿达木单抗hIgG和Siglec配体-阿达木单抗hIgG1缀合物的TNFα结合活性的体外表面等离子体共振(SPR)分析。图27A是SPR测定方案的示意图，其中TNFα分析物与蛋白A芯片固定的阿达木单抗或阿达木单抗-Siglec配体缀合物结合。改变TNFα浓度以评估浓度依赖性、结合动力学和亲和力。图27B示出了传感图缔合阶段结束时结合的浓度依赖性(RUmax)。图27C-G是阿达木单抗(图27C)、阿达木单抗BPC-Neu5Gc单价GAL LDR 4(图27D)、阿达木单抗BPC-Neu5Gc单价GAL LDR 7(图27E)、阿达木单抗BPC-Neu5Gc二价GAL LDR 8.5(图27F)和阿达木单抗BPC-Neu5Gc三价GAL LDR 5(图27G)的单独传感图。拟合动力学和亲和力参数总结在表3中。
表3
结论
阿达木单抗和Siglec配体-阿达木单抗缀合物都以相似的表观亲和力和活性百分比结合TNFα。因此，阿达木单抗-Siglec配体缀合物的TNFα结合性质不受干扰。重要的是，这些结果表明，在通过Siglec配体缀合消除免疫原性的同时，可以保持生物治疗药物中的功能活性。
实例17：在用Siglec配体-阿达木单抗缀合物治疗的小鼠中体内抑制抗药物抗体需要CD22/Siglec-2配体
目的
本实验的目的是测试阿达木单抗缀合物中Siglec-2结合活性对于在给药阿达木单抗-Siglec-2配体缀合物的小鼠中观察到的抑制的免疫原性的重要性。对于阴性对照阿达木单抗-接头缀合物，本研究使用来自实例10(图17和图18)的不结合Siglec-2的相同的asialo、基于PEG的接头结构。
材料和方法
如实例7所述制备阿达木单抗hIgG1和阿达木单抗-Siglec配体缀合物。
为了评估对阿达木单抗和/或阿达木单抗-Siglec配体缀合物特异性的抗体的产生，通过静脉内注射阿达木单抗或Siglec配体缀合的阿达木单抗来免疫C57BL/6小鼠。在研究的第-1天，基于体重将动物随机分成治疗组。在研究的第0天，对动物进行放血以获得基线血清，然后静脉内注射阿达木单抗或阿达木单抗-Siglec配体缀合物。通过在无菌缓冲盐水中制备0.8mg/ml抗原溶液来制备单独的抗原。然后经由尾静脉向动物注射0.1ml(约4ml/kg)的0.8mg/ml的抗原。基于20g小鼠的总剂量将为4mg/kg。在整个研究过程中，在吸入的异氟烷麻醉下，每周经由眶后窦对动物进行放血。在研究当天，28只动物用吸入的异氟烷麻醉，然后经由心脏穿刺放血，然后通过颈椎脱臼处死。将全血收集到Microvette EDTA毛细管收集管(Sarstedt Inc)中，然后按照制造商的血清收集说明进行进一步加工。样本储存在-80℃下，直到进行分析。
ADA测定在涂覆有抗原的96孔测定板(Nunc板，黑色96孔免疫板，ThermoScientific,437111)上进行，如下所述。阿达木单抗和阿达木单抗缀合物的混合物以每种5μg/ml的浓度包被，每孔100μL。所有包被的抗原在pH 7.2的PBS中稀释，并在4℃下温育过夜。第二天，除去板包被溶液，并在室温下用200μL/孔的在PBS中的3％ BSA、20μM的EDTA、0.1％吐温-20封闭板持续1小时。血清样本在PBS中的3％ BSA、20μM的EDTA、0.1％吐温-20中以1:185稀释，并以三倍连续稀释添加。板在室温下温育持续1小时，然后用含0.05％吐温-20的PBS缓冲液洗涤。在洗涤之后，添加100μL的1:2500稀释的驴抗小鼠IgG(H+L)-HRP(SouthernBiotech,6411-05)，并且在室温下温育持续1小时。在洗涤测定板之后，将100μL的QuantaBlu底物溶液(Thermo Scientific,15169)添加到每个孔中，并温育持续15分钟。QuantaBlu Fluorogenic过氧化物底物的激发和发射设置为325nm和420nm，并且使用SpectraMax板读取器测量相对荧光单位。生成第7天、第14天、第21天和第28天的血清稀释曲线。通过稀释血清来确定滴度，其给出高于背景的2x OD。
结果和结论
图28描绘了在小鼠中对1)阿达木单抗，2)增强的Siglec配体-阿达木单抗缀合物(“BPC-Neu5Gc单价PEG LDR 10”)，和3)阴性对照、非Siglec-2-结合接头缀合物(“阴性对照单价PEG LDR 7”、“阴性对照二价PEG LDR 7”和“阴性对照三价PEG LDR 6”)的抗药物抗体响应的评估。小鼠接受单次4mg/kg静脉内剂量的阿达木单抗、阿达木单抗-Siglec配体缀合物或阿达木单抗-阴性对照接头缀合物。在第14天和第28天测量针对阿达木单抗/阿达木单抗缀合物的血清IgG水平。图28A和图28B分别示出了在第14天和第28天的个体动物血清IgG滴度值(n＝5只小鼠)。虽然增强的Siglec配体-阿达木单抗缀合物在第14天和第28天显示出免疫原性的完全抑制，但阴性对照阿达木单抗缀合物的免疫原性完全不受干扰。数据与实例10(图17和图18)中的体外小鼠B细胞活化测定观察一致，其中asialo缀合物对抑制BCR活化无活性。重要的是，这些结果表明，使用平台Siglec配体缀合技术抑制阿达木单抗的免疫原性关键取决于Siglec配体结合化学物质。
实例18：在用Siglec配体-阿达木单抗缀合物处理的小鼠中体内抑制抗药物抗体需要CD22/Siglec-2配体的增强的结合
目的
在实例10(图16)示出了增强的(相对于未增强的)Siglec-2结合对于抑制BCR活化的重要性的情况下，该实验的目的是测试增强的Siglec-2结合对于抑制阿达木单抗免疫原性的重要性。
材料和方法
如实例7所述制备阿达木单抗hIgG1和阿达木单抗-Siglec配体缀合物。
为了评估对阿达木单抗和/或阿达木单抗-Siglec配体缀合物特异性的抗体的产生，通过静脉内注射阿达木单抗或Siglec配体缀合的阿达木单抗来免疫C57BL/6小鼠。在研究的第-1天，基于体重将动物随机分成治疗组。在研究的第0天，对动物进行放血以获得基线血清，然后静脉内注射阿达木单抗或阿达木单抗-Siglec配体缀合物。通过在无菌缓冲盐水中制备0.8mg/ml抗原溶液来制备单独的抗原。然后经由尾静脉向动物注射0.1ml(约4ml/kg)的0.8mg/ml的抗原。基于20g小鼠的总剂量将为4mg/kg。在整个研究过程中，在吸入的异氟烷麻醉下，每周经由眶后窦对动物进行放血。在研究当天，28只动物用吸入的异氟烷麻醉，然后经由心脏穿刺放血，然后通过颈椎脱臼处死。将全血收集到Microvette EDTA毛细管收集管(Sarstedt Inc)中，然后按照制造商的血清收集说明进行进一步加工。样本储存在-80℃下，直到进行分析。
ADA测定在涂覆有抗原的96孔测定板(Nunc板，黑色96孔免疫板，ThermoScientific,437111)上进行，如下所述。阿达木单抗和阿达木单抗缀合物的混合物以每种5μg/ml的浓度包被，每孔100μL。所有包被的抗原在pH 7.2的PBS中稀释，并在4℃下温育过夜。第二天，除去板包被溶液，并在室温下用200μL/孔的在PBS中的3％ BSA、20μM的EDTA、0.1％吐温-20封闭板持续1小时。血清样本在PBS中的3％ BSA、20μM的EDTA、0.1％吐温-20中以1:185稀释，并以三倍连续稀释添加。板在室温下温育持续1小时，然后用含0.05％吐温-20的PBS缓冲液洗涤。在洗涤之后，添加100μL的1:2500稀释的驴抗小鼠IgG(H+L)-HRP(SouthernBiotech,6411-05)，并且在室温下温育持续1小时。在洗涤测定板之后，将100μL的QuantaBlu底物溶液(Thermo Scientific,15169)添加到每个孔中，并温育持续15分钟。QuantaBlu Fluorogenic过氧化物底物的激发和发射设置为325nm和420nm，并且使用SpectraMax板读取器测量相对荧光单位。生成第7天、第14天、第21天和第28天的血清稀释曲线。通过稀释血清来确定滴度，其给出高于背景的2x OD。
结果和结论
图29描绘了在小鼠中对1)阿达木单抗，2)增强的Siglec配体-阿达木单抗缀合物(“BPC-Neu5Gc单价PEG LDR 7”)，和3)未增强的Siglec配体-阿达木单抗缀合物(“Neu5Gc单价PEG LDR 6”、“Neu5Gc二价PEG LDR 5”和“Neu5Gc三价PEG LDR 5”)的抗药物抗体响应的评估。小鼠接受单次4mg/kg静脉内剂量的阿达木单抗IgG或缀合物。在第28天测量针对阿达木单抗/阿达木单抗缀合物的血清IgG水平。示出了在第28天的个体动物血清IgG滴度值(n＝5只小鼠)。
在该实验中，增强的Siglec配体缀合物的免疫原性受到强烈抑制，而带有未增强的Neu5Gc接头结构的三种不同(单价、二价和三价)缀合物具有高度免疫原性。这些数据与实例10(图17和图18)中的体外B细胞测定结果一致，其中增强的Siglec-2结合对于抑制BCR活化是至关重要的。因此，增强作用不仅对于在泛B细胞活化测定中抑制BCR活化，而且对于在体内抑制阿达木单抗-Siglec配体缀合物的免疫原性都是至关重要的。根据该结果，预计超唾液酸化形式的阿达木单抗(具有天然的、未增强的Neu5Gc或Neu5Ac结构)在体内的免疫原性将不受干扰。
实例19：在用Siglec配体-阿达木单抗缀合物处理的小鼠中，抗药物抗体的体内抑制对Siglec配体-缀合物是特异性的，而不是共同施用的非缀合免疫原
目的
本实验的目的是测试施用阿达木单抗-Siglec配体缀合物对小鼠对单独的标准免疫原(鸡蛋白溶菌酶)的体液响应的影响。在降低施用的药物的免疫原性的其他方法可能想得到地导致免疫原性反应的普遍抑制的情况下，Siglec配体-缀合物的作用机制预计仅抑制缀合物的免疫原性，而不抑制其他共同给药的免疫原。
材料和方法
如实例7所述制备阿达木单抗hIgG1和阿达木单抗-Siglec配体缀合物。
图30A示出了对C57BL/6小鼠施用阿达木单抗、阿达木单抗-Siglec配体缀合物或PBS媒介物对照，然后施用鸡蛋清溶菌酶(HEL)的研究方案。在研究的第-1天，基于体重将动物随机分成治疗组。在研究的第0天，对动物进行放血以获得基线血清，然后静脉内注射阿达木单抗、阿达木单抗-Siglec配体缀合物或PBS媒介物。通过在无菌缓冲盐水中制备0.8mg/ml抗原溶液来制备单独的基于阿达木单抗的抗原。然后经由尾静脉向动物注射0.1ml(约4ml/kg)的0.8mg/ml的抗原。基于20g小鼠的总剂量将为4mg/kg。随后在第7、14和21天向小鼠施用200μg HEL。将全血收集到Microvette EDTA毛细管收集管(Sarstedt Inc)中，然后按照制造商的血清收集说明进行进一步加工。样本储存在-80℃下，直到进行分析。
ADA测定在涂覆有抗原的96孔测定板(Nunc板，黑色96孔免疫板，ThermoScientific,437111)上进行，如下所述。为了评估阿达木单抗血清滴度，第一组板用阿达木单抗和缀合物的混合物包被(100μL/孔，每孔5μg/mL)。为了评估HEL血清滴度，第二组板用100μL/孔的5μg/mL纯化的溶菌酶(HEL,Sigma,L4919-1G)包被。第二天，除去板包被溶液，并在室温下用200μL/孔的在PBS中的3％ BSA、20μM的EDTA、0.1％吐温-20封闭板持续1小时。血清样本在PBS中的3％ BSA、20μM的EDTA、0.1％吐温-20中以1:185稀释，并以三倍连续稀释添加。板在室温下温育持续1小时。用含0.05％吐温-20的PBS缓冲液洗涤板。在洗涤之后，添加100μL的1:2500稀释的驴抗小鼠IgG(H+L)-HRP(SouthernBiotech,6411-05)，并且在室温下温育持续1小时。在洗涤测定板之后，将100μL的QuantaBlu底物溶液(ThermoScientific,15169)添加到每个孔中，并温育持续15分钟。QuantaBlu Fluorogenic过氧化物底物的激发和发射设置为325nm和420nm，并且使用SpectraMax板读取器测量相对荧光单位。生成第7天、第14天、第21天和第28天的血清稀释曲线。通过稀释血清来确定滴度，其给出高于背景的2x OD。
结果和结论
图30描绘了在施用4mg/kg阿达木单抗、阿达木单抗-Siglec配体缀合物(阿达木单抗-BPC-Neu5Gc二价PEG LDR 10)或PBS媒介物(第0天)的不同组合以及随后每周施用200μg鸡蛋清溶菌酶(HEL)(第7天、第14天、第21天和第28天)小鼠中的IgG免疫响应的评价。分别针对阿达木单抗/阿达木单抗-Siglec配体缀合物和HEL测量小鼠血清IgG滴度。示出了抗阿达木单抗/阿达木单抗缀合物(图30B)和HEL(图30D)的第28天血清IgG水平。示出了抗阿达木单抗/阿达木单抗缀合物(图30C)和HEL(图30E)的滴度。
如在先前的实验(实例14、17和18)中，其中阿达木单抗免疫诱导了强烈的IgG响应，阿达木单抗-Siglec配体缀合物对于抗体响应被非常强烈地抑制。相反，当1、2和3周后用HEL给药时(并且其中先前的PK分析显示阿达木单抗缀合物仍会存在于给药的动物中)，相同的动物显示出对HEL完全未受干扰的IgG响应。因此，本文所述的Siglec配体-缀合物技术平台仅影响直接缀合的分子，而不影响B细胞对无关抗原的抗体响应，即Siglec配体-缀合物是独特的特异性免疫抑制物，而非一般性免疫抑制物。
实例20：用Siglec配体-鸡蛋清溶菌酶缀合物处理的小鼠中特异性抗体响应的体内抑制。
目的
该实验的目的是测试施用第二种免疫原HEL的小鼠的免疫原性的抑制。如实例19所示，HEL在小鼠中具有高度免疫原性。因此，本实例旨在将体内免疫原性抑制的证明扩展到除阿达木单抗hIgG1之外的其他免疫原。
材料和方法
使用实例7中描述的方法制备HEL(Sigma,L4919-1G)和HEL-Siglec配体缀合物(从Sigma，L4919-1G制备)。将HEL-BPC-Neu5Gc制备成高纯度(cGE，anSEC，LC/MS)，其中LDR为1.6。
图31A示出了对C57BL/6小鼠施用鸡蛋白溶菌酶(HEL)和HEL-Siglec配体缀合物的研究方案。在研究的第-1天，基于体重将动物随机分成治疗组。在研究的第0天，对动物进行放血以获得基线血清，然后静脉内注射200μg/小鼠HEL或HEL-Siglec配体缀合物(HEL-BPC-Neu5Gc单价PEG-LDR 1.6)。随后在第7、14和21天向小鼠施用200μg/小鼠HEL。在第27天测量针对HEL/HEL缀合物的血清IgG水平。将全血收集到Microvette EDTA毛细管收集管(Sarstedt Inc)中，然后按照制造商的血清收集说明进行进一步加工。样本储存在-80℃下，直到进行分析。
ADA测定在涂覆有抗原的96孔测定板(Nunc板，黑色96孔免疫板，ThermoScientific,437111)上进行，如下所述。用100μL/孔的5μg/mL的纯化的溶菌酶(HEL,Sigma,L4919-1G)与5μg/ml HEL-Siglec配体缀合物的混合物包被板。包被的抗原在pH7.2的PBS中稀释，并在4℃下温育过夜。第二天，除去包被溶液，并在室温下用200μL/孔的在PBS中的3％BSA、20μM的EDTA、0.1％吐温-20封闭板持续1小时。血清样本在PBS中的3％ BSA、20μM的EDTA、0.1％吐温-20中以1:185稀释，并以三倍连续稀释添加。板在室温下温育持续1小时，然后用PBS缓冲液+0.05％吐温-20洗涤。在洗涤之后，添加100μL的1:2500稀释的驴抗小鼠IgG(H+L)-HRP(SouthernBiotech,6411-05)，并且在室温下温育持续1小时。在洗涤测定板之后，将100μL的QuantaBlu底物溶液(Thermo Scientific,15169)添加到每个孔中，并温育持续15分钟。QuantaBlu Fluorogenic过氧化物底物的激发和发射设置为325nm和420nm，并且使用SpectraMax板读取器测量相对荧光单位。生成第7天、第14天、第21天和第28天的血清稀释曲线。通过稀释血清来确定滴度，其给出高于背景的2x OD。
结果和结论
图31描述了在小鼠中对HEL和单价Siglec配体-HEL缀合物(“HEL-BPC-Neu5Gc单价PEG LDR 1.6”)的抗药物抗体响应的评估。小鼠已经接受了每周4次200μg静脉内注射剂量的HEL或HEL缀合物(第0天、第7天、第14天和第21天)。图31B示出了来自血清样本的IgG水平稀释系列。图31C示出了个体动物第27天的血清IgG滴度值(n＝5只小鼠)。
虽然施用重复(4)剂量的HEL的小鼠表现出对HEL的强烈IgG响应，但施用Siglec配体-HEL缀合物的小鼠的免疫原性被完全抑制。因此，在Siglec配体缀合物技术中观察到的免疫原性抑制，以前在阿达木单抗中观察到，在无关抗原HEL中也观察到。因此，用所述CD22共接合物技术抑制免疫原性适用于其他非抗体免疫原，并且可以适用于许多不相关的药物形式。
实例21：对于天冬酰胺酶-Siglec配体缀合物，体内抗天冬酰胺酶响应受到抑制
目的
该实验的目的是测试在施用第三种免疫原(大肠杆菌衍生的酶，天冬酰胺酶)的小鼠中的免疫原性的抑制。因此，本实例旨在将体内免疫原性抑制的证明扩展到阿达木单抗hIgG1和HEL之外的其他免疫原。如在前面的实例中，产生并纯化了增强的Siglec配体缀合物，这次使用纯化的天冬酰胺酶。
材料和方法
为了评估对天冬酰胺酶特异性的抗体的产生，用重组天冬酰胺酶或单独的Siglec配体-天冬酰胺酶缀合物制剂来免疫BALB/c小鼠。在研究的第-1天，基于体重将动物随机分成治疗组。在研究的第0天，对动物进行放血以获得基线血清。在第0天、第7天、第14天和第21天，小鼠被静脉内注射15μg重组天冬酰胺酶或Siglec配体缀合的天冬酰胺酶制剂/小鼠。在整个研究过程中，在吸入的异氟烷麻醉下，每周经由眶后窦对动物进行放血。将全血收集到Microvette EDTA毛细管收集管(Sarstedt Inc)中，然后按照制造商的说明进一步加工以收集血清。然后将样本储存在-80℃下，直到进行分析。
ADA测定在96孔测定板(Nunc板，黑色96孔免疫板，Thermo Scientific,437111)上进行，该板涂覆有在PBS中的100μL/孔的5μg/mL天冬酰胺酶。将板在4℃下温育过夜。第二天，除去包被溶液，用200μL/孔的在PBS中的3％ BSA、20μM的EDTA、0.1％吐温-20在室温下封闭板1持续小时。血清样本在PBS中的3％ BSA、20μM的EDTA、0.1％吐温-20中以1:185稀释，并以三倍连续稀释添加。板在室温下温育持续1小时。用含0.05％吐温-20的PBS缓冲液洗涤板。在洗涤之后，添加100μL的1:2500稀释的驴抗小鼠IgG(H+L)-HRP(SouthernBiotech,6411-05)，并且在室温下温育持续1小时。在洗涤测定板之后，将100μL的QuantaBlu底物溶液(Thermo Scientific,15169)添加到每个孔中，并温育持续15分钟。QuantaBlu Fluorogenic过氧化物底物的激发和发射设置为325nm和420nm，并且使用SpectraMax板读取器测量相对荧光单位。生成第7天、第14天、第21天和第28天的血清稀释曲线。通过稀释血清来确定滴度，其给出高于背景的2x OD。
结果
图32描绘了在小鼠中对重组天冬酰胺酶和天冬酰胺酶-Siglec配体缀合物(“天冬酰胺酶BPC-Neu5Gc单价PEG-LDR 10”和“天冬酰胺酶BPC-Neu5Gc三价PEG-LDR 3.5”)的抗药物抗体响应的评估。BALB/c小鼠(每组n＝5)每周(4次)被给药15μg天冬酰胺酶或天冬酰胺酶缀合物。在第28天通过ELISA测定来测量抗天冬酰胺酶IgG滴度。示出了每个测试制品的滴度。用Siglec配体-天冬酰胺酶处理的小鼠，特别是用三价Siglec配体-天冬酰胺酶缀合物处理的小鼠，表现出抑制的抗天冬酰胺酶响应。
本发明的实施例
本发明的实施例包含但不限于以下条款。
1.一种工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其包括已经被工程改造成相对于相应的未经工程改造的生物治疗药物包括修饰的唾液酸结合免疫球蛋白型凝集素(Siglec)配体概况同时保留治疗活性的生物治疗药物。
2.根据条款1所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中相对于所述相应的未经工程改造的生物治疗药物，所述Siglec配体概况包括提高量的一种或多种与所述工程改造的低免疫原性生物治疗药物共价结合的Siglec配体。
3.根据条款1或2所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述Siglec配体中的一种或多种是B细胞缔合的Siglec的配体。
4.根据条款3所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述B细胞缔合的Siglec选自由Siglec-2(CD22)、Siglec-5(CD170)、Siglec-6、Siglec-9(CD329)和Siglec-10(Siglec G)组成的组。
5.根据条款1-4中任一项所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述Siglec配体包括唾液酸。
6.根据条款5所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述唾液酸是天然存在的唾液酸。
7.根据条款6所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述Siglec配体是天然存在的Siglec配体。
8.根据条款6所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述Siglec配体是非天然存在的Siglec配体。
9.根据条款8所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述天然存在的唾液酸与所述生物治疗药物共价结合。
10.根据条款8所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述非天然存在的Siglec配体进一步包括非天然存在的接头。
11.根据条款10所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述非天然存在的Siglec配体基本上由结合到所述非天然存在的接头上的所述天然存在的唾液酸组成。
12.根据条款10或11所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述接头不包括糖。
13.根据条款5所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述Siglec配体为包括非天然存在的唾液酸的非天然存在的Siglec配体。
14.根据条款13所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述非天然存在的唾液酸与所述生物治疗药物共价结合。
15.根据条款13所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述非天然存在的Siglec配体进一步包括非天然存在的接头。
16.根据条款15所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述非天然存在的Siglec配体基本上由共价结合至所述非天然存在的接头的所述非天然存在的唾液酸组成。
17.根据条款15或16所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述接头不包括糖。
18.根据条款5所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述Siglec配体包括两种唾液酸和一个接头，其中所述接头是分支接头，并且所述两种唾液酸连接至所述接头。
19.根据条款5所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述Siglec配体包括三种唾液酸和一个接头，其中所述接头是分支接头，并且所述三种唾液酸连接至所述接头。
20.根据条款18或19所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述接头不包括天然糖。
21.根据条款1-4中任一项所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述Siglec配体包括Siglec结合肽。
22.根据条款21所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述Siglec结合肽包括RNDYTE。
23.根据条款1-22中任一项所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述低免疫原性生物治疗药物包括Siglec-2和Siglec 10两者的Siglec配体。
24.根据条款1-23中任一项所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述工程改造的低免疫原性生物治疗药物包括一种或多种Siglec配体，并且所述相应的未工程改造的免疫原性生物治疗药物包括比所述工程改造的低免疫原性生物治疗药物更少的Siglec配体。
25.根据条款24所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述工程改造的低免疫原性生物治疗药物包括一种或多种Siglec配体，并且相应的所述未工程改造的免疫原性生物治疗药物不包括Siglec配体。
26.根据条款1-23中任一项所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述低免疫原性生物治疗药物包括比相应的未工程改造的免疫原性生物治疗药物多2倍的Siglec配体，所述Siglec配体在施用所述生物治疗药物的个体中诱导抗体响应。
27.根据条款1-23中任一项所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述低免疫原性生物治疗药物包括比相应的未工程改造的生物治疗药物多3倍的Siglec配体，所述Siglec配体在施用所述生物治疗药物的个体中诱导抗体响应。
28.根据条款1-23中任一项所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述低免疫原性生物治疗药物包括比相应的未工程改造的生物治疗药物多5倍的Siglec配体，所述Siglec配体在施用所述生物治疗药物的个体中诱导抗体响应。
29.根据条款1-23中任一项所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述低免疫原性生物治疗药物包括比相应的未工程改造的生物治疗药物多10倍的Siglec配体，所述Siglec配体在施用所述生物治疗药物的个体中诱导抗体响应。
30.根据条款1-23中任一项所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中相对于所述相应的未工程改造的生物治疗药物，所述工程改造的低免疫原性生物治疗药物进一步包括提高量的与所述工程改造的低免疫原性生物治疗药物共价结合的ASGPR配体。
31.根据条款30所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述ASGPR配体是天然存在的GalNAc。
32.根据条款30所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述ASGPR配体是GalNAc糖模拟物。
33.根据条款1-32中任一项所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述低免疫原性生物治疗药物引发的生物治疗药物特异性抗体滴度为在施用所述生物治疗药物的个体中将由相应的未工程改造的生物治疗药物引发的生物治疗药物特异性抗体滴度的50％或更低。
34.根据条款33所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述低免疫原性生物治疗药物被施用于个体持续1个月或更长时间。
35.根据条款33所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述低免疫原性生物治疗药物被施用于个体持续3个月或更长时间。
36.根据条款33所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述低免疫原性生物治疗药物被施用于个体持续6个月或更长时间。
37.根据条款33所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述低免疫原性生物治疗药物被施用于个体持续1年或更长时间。
38.根据条款33-37中任一项所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中向所述个体的施用是每周一次。
39.根据条款33-37中任一项所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中向所述个体的施用是每两周一次。
40.根据条款33-37中任一项所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中向所述个体的施用是每月一次。
41.根据条款33-37中任一项所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中向所述个体的施用是每季度或每半年一次。
42.根据条款33-37中任一项所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中向所述个体的施用是每年一次或每两年一次。
43.根据条款33-37中任一项所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述ADA滴度在所述生物治疗药物最后一次施用8周后测量。
44.根据条款1-43中任一项所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述生物治疗药物是蛋白质。
45.根据条款44所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述蛋白质选自由抗体、酶、嵌合蛋白质和病毒颗粒组成的组。
46.根据条款45所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述抗体选自由单克隆抗体、双特异性抗体、scFv、Fab、骆驼抗体或纳米抗体组成的组。
47.根据条款46所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述抗体选自由以下组成的组：阿达木单抗、英夫利昔单抗、西妥昔单抗、那他珠单抗、莫塞妥莫单抗、阿替利珠单抗、纳武单抗、阿昔单抗、维布妥昔单抗、培塞利珠单抗、埃罗妥珠单抗、贝那珠单抗、维多珠单抗、加卡奈珠单抗、利妥昔单抗、阿仑单抗、度匹鲁单抗、戈利木单抗、奥滨尤妥珠单抗、替拉珠单抗、厄瑞努单抗、美泊利单抗、雷莫芦单抗、雷珠单抗、乌司奴单抗、瑞利珠单抗、伊匹木单抗、阿莫罗布单抗、贝利单抗、帕尼单抗、阿维单抗、耐昔妥珠单抗、莫格利珠单抗、奥拉单抗、布罗达单抗、艾库组单抗、帕妥珠单抗、帕博利珠单抗和托珠单抗。
48.根据条款44所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述蛋白质选自由促红细胞生成素、血小板生成素、人生长激素、组织因子、IFNβ-1b、IFNβ-1a、IL-2或IL-2模拟物阿地白介素、艾塞那肽、阿必鲁泰、阿法赛特、帕利夫明和贝拉西普组成的组。
49.根据条款45所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述酶选自由以下组成的组：天冬酰胺酶菊欧文氏菌、苯丙氨酸解氨酶、α-半乳糖苷酶A、酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)、葡萄糖脑苷脂酶(GCase)、天冬氨酰氨基葡萄糖苷酶(AGA)、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、硫氨酶、α-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAGLU)、乙酰肝素CoA：α-氨基葡萄糖苷N-乙酰转移酶(HGSNAT)、N-乙酰氨基葡萄糖6-硫酸酯酶(GNS)、N-氨基葡萄糖3-O-硫酸酯酶(芳基硫酸酯酶G或ARSG)、N-乙酰半乳糖胺6-硫酸酯酶、β-半乳糖苷酶、N-乙酰半乳糖胺4-硫酸酯酶、β-葡萄糖醛酸酶、因子VIII、因子IX、棕榈酰蛋白硫酯酶(PPT1)、三肽基肽酶(TPP1)、假单胞菌弹性蛋白酶(PaE)、假单胞菌碱性蛋白酶(PaAP)和链球菌热原性外毒素B(SpeB)。
50.根据条款45所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述病毒颗粒选自重组腺相关病毒(rAAV)颗粒、重组人腺病毒(rHAdV)颗粒、重组单纯疱疹病毒(rHSV)颗粒、重组乳头瘤病毒(PV)颗粒、重组多瘤病毒颗粒、重组痘苗病毒颗粒、重组巨细胞病毒(CMV)颗粒、重组杆状病毒颗粒、重组人乳头瘤病毒(HPV)颗粒和重组逆转录病毒颗粒。
51.根据条款50所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述rAAV颗粒包括选自由AAV1、AAV2、AAV3b、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh10、AAV11、AAV12和AAV13 VP1蛋白或其变体组成的组的衣壳VP1蛋白。
52.根据条款50所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述重组体包括来自人腺病毒颗粒的衣壳蛋白，所述人腺病毒颗粒选自由重组HAdV-A、HAdV-B、HAdV-C、HAdV-D、HAdV-E、HAdV-F和HAdV-G或其变体组成的组。
53.根据条款50所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述重组HSV颗粒选自重组HSV1或HSV2颗粒或其变体。
54.根据条款50所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述重组逆转录病毒颗粒选自由以下组成的组：慢病毒颗粒、人类免疫缺陷病毒(HIV)颗粒、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)颗粒、猫免疫缺陷病毒(FIV)颗粒、美洲狮慢病毒(PLV)颗粒、马传染性贫血病毒(EIAV)颗粒、牛免疫缺陷病毒(BIV)颗粒、山羊关节炎脑炎病毒颗粒、γ-逆转录病毒颗粒和鼠白血病病毒(MLV)颗粒，或其变体或假型病毒。
55.一种制备低免疫原性生物治疗药物的方法，所述方法包括将唾液酸共价地连接到生物治疗药物上以产生工程改造的低免疫原性生物治疗药物。
56.根据条款55所述的方法，其中所述共价地连接包括通过工程改造的生物合成的唾液酸化。
57.根据条款55所述的方法，其中所述共价地连接包括通过化学缀合的唾液酸化。
58.根据条款55-57中任一项所述的方法，其中所述唾液酸与所述生物治疗药物的聚糖进行化学缀合。
59.根据条款58所述的方法，其中所述唾液酸与所述生物治疗药物的所述聚糖的化学缀合导致所述唾液酸和所述聚糖之间的共价键。
60.根据条款58所述的方法，其中所述唾液酸与所述生物治疗药物的所述聚糖的化学缀合在所述唾液酸和所述聚糖之间并入接头。
61.根据条款55-57中任一项所述的方法，其中所述唾液酸与所述生物治疗药物的氨基酸进行化学缀合。
62.根据条款61所述的方法，其中所述唾液酸与所述生物治疗药物的所述氨基酸的化学缀合导致所述唾液酸和所述氨基酸之间的共价键。
63.根据条款61所述的方法，其中所述唾液酸与所述生物治疗药物的所述氨基酸的化学缀合在所述唾液酸和所述氨基酸之间并入接头。
64.根据条款55-63中任一项所述的方法，其中所述唾液酸是天然存在的唾液酸。
65.根据条款55-63中任一项所述的方法，其中所述唾液酸是非天然存在的唾液酸。
66.根据条款55所述的方法，其中所述共价地连接包括通过基因工程改造将Siglec结合肽或多肽插入到所述生物治疗药物的氨基酸序列中。
67.根据条款66的方法，其中所述Siglec结合肽是RNDYTE。
68.根据条款55-67中任一项所述的方法，其中所述共价地连接导致Siglec配体的产生。
69.根据条款68的方法，其中所述Siglec配体是B细胞缔合的Siglec的配体。
70.根据条款69所述的方法，其中所述B细胞缔合的Siglec选自由Siglec-2(CD22)、Siglec-5(CD170)、Siglec-6、Siglec-9(CD329)和Siglec-10(Siglec G)组成的组。
71.根据条款55-70中任一项所述的方法，其中在共价连接后，与所述生物治疗药物缔合的唾液酸的量增加2倍或更多。
72.根据条款55-70中任一项所述的方法，其中在共价连接后，与所述生物治疗药物缔合的Siglec配体的量增加5倍或更多。
73.根据条款55-70中任一项所述的方法，其中在共价连接后，与所述生物治疗药物缔合的Siglec配体的量增加10倍或更多。
74.根据条款55-73中任一项所述的方法，其中相对于所述相应的未工程改造的生物治疗药物，所述工程改造的低免疫原性生物治疗药物进一步包括提高量的与所述工程改造的低免疫原性生物治疗药物共价结合的ASGPR配体。
75.根据条款74所述的方法，其中所述ASGPR配体是天然存在的GalNAc。
76.根据条款74所述的方法，其中所述ASGPR配体是GalNAc糖模拟物。
77.根据条款55-76中任一项所述的方法，其中所述生物治疗药物是蛋白质。
78.根据条款77所述的方法，其中所述蛋白质选自由抗体、酶、嵌合蛋白质和病毒颗粒组成的组。
79.根据条款78所述的方法，其中所述抗体选自由单克隆抗体、双特异性抗体、scFv、Fab、骆驼抗体或纳米抗体组成的组。
80.根据条款78或79所述的方法，其中所述抗体选自由以下组成的组：阿达木单抗、英夫利昔单抗、西妥昔单抗、那他珠单抗、莫塞妥莫单抗、阿替利珠单抗、纳武单抗、阿昔单抗、维布妥昔单抗、培塞利珠单抗、埃罗妥珠单抗、贝那珠单抗、维多珠单抗、加卡奈珠单抗、利妥昔单抗、阿仑单抗、度匹鲁单抗、戈利木单抗、奥滨尤妥珠单抗、替拉珠单抗、厄瑞努单抗、美泊利单抗、雷莫芦单抗、雷珠单抗、乌司奴单抗、瑞利珠单抗、伊匹木单抗、阿莫罗布单抗、贝利单抗、帕尼单抗、阿维单抗、耐昔妥珠单抗、莫格利珠单抗、奥拉单抗、布罗达单抗、艾库组单抗、帕妥珠单抗、帕博利珠单抗和托珠单抗。
81.根据条款77所述的方法，其中所述蛋白质选自由促红细胞生成素、血小板生成素、人生长激素、组织因子、IFNβ-1b、IFNβ-1a、IL-2或IL-2模拟物阿地白介素、艾塞那肽、阿必鲁泰、阿法赛特、帕利夫明和贝拉西普组成的组
82.根据条款78所述的方法，其中所述酶选自由以下组成的组：天冬酰胺酶菊欧文氏菌、苯丙氨酸解氨酶、α-半乳糖苷酶A、酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)、葡萄糖脑苷脂酶(GCase)、天冬氨酰氨基葡萄糖苷酶(AGA)、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、硫氨酶、α-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAGLU)、乙酰肝素CoA：α-氨基葡萄糖苷N-乙酰转移酶(HGSNAT)、N-乙酰氨基葡萄糖6-硫酸酯酶(GNS)、N-氨基葡萄糖3-O-硫酸酯酶(芳基硫酸酯酶G或ARSG)、N-乙酰半乳糖胺6-硫酸酯酶、β-半乳糖苷酶、N-乙酰半乳糖胺4-硫酸酯酶、β-葡萄糖醛酸酶、因子VIII、因子IX、棕榈酰蛋白硫酯酶(PPT1)和三肽基肽酶(TPP1)。
83.根据条款78所述的方法，其中所述病毒颗粒选自重组腺相关病毒(rAAV)颗粒、重组人腺病毒(rHAdV)颗粒、重组单纯疱疹病毒(rHSV)颗粒、重组乳头瘤病毒(PV)颗粒、重组多瘤病毒颗粒、重组痘苗病毒颗粒、重组巨细胞病毒(CMV)颗粒、重组杆状病毒颗粒、重组人乳头瘤病毒(HPV)颗粒和重组逆转录病毒颗粒。
84.一种药物组合物，包括：
根据条款1-54中任一项所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物或根据条款55-83中任一项制造的组合物；和
药物赋形剂。
85.一种治疗患有可以通过施用生物治疗剂来治疗的病症或疾病的个体的方法，所述方法包括以有效治疗所述病症或疾病的量向所述个体施用根据条款84所述的药物组合物，其中所述药物组合物引发相对于所述未工程改造的生物治疗药物降低的抗药物抗体滴度。
86.根据条款85所述的方法，其中所述疾病是选自由类风湿性关节炎、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎、银屑病、化脓性汗腺炎、葡萄膜炎和幼年特发性关节炎组成的组的慢性免疫疾病，其中所述施用包括以有效治疗所述慢性免疫疾病的量向所述个体施用选自阿达木单抗和英夫利昔单抗的工程改造的低免疫原性TNFα特异性抗体。
87.根据条款85所述的方法，其中所述疾病为白血病，其中所述施用包括以治疗癌症的有效量向所述个体施用来自菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi)的工程改造的低免疫原性天冬酰胺酶。
88.根据条款85所述的方法，其中所述疾病为多发性硬化，其中所述施用包括以有效治疗所述多发性硬化的量向所述个体施用工程改造的低免疫原性那他珠单抗、工程改造的低免疫原性IFNβ-1b或工程改造的低免疫原性IFNβ-1a。
89.根据条款85所述的方法，其中所述病症是对移植的组织的抗体响应，其中所述施用包括以有效抑制对所述移植的组织的所述抗体响应的量向所述个体施用工程改造的低免疫原性IdeS。
90.根据条款89所述的方法，其中所述移植的组织是同种异体移植物。
91.根据条款89所述的方法，其中所述移植的组织是异种移植物。
92.根据条款86-91中任一项所述的方法，其中所述组织选自肾、心脏、肺、肝、胰腺、气管、血管组织、皮肤、骨、软骨、肾上腺组织、胎儿胸腺和角膜。
93.根据条款85所述的方法，其中所述病症为2型糖尿病，其中所述施用包括以有效治疗所述病症的量向所述个体施用工程改造的低免疫原性艾塞那肽或工程改造的低免疫原性阿必鲁泰。
94.根据条款85所述的方法，其中所述病症是酶缺乏症，其中所述施用包括以有效治疗所述缺乏症的量向所述个体施用工程改造的低免疫原性酶。
95.根据条款94所述的方法，其中所述酶缺乏症是选自由以下组成的组的酶缺乏症：苯丙氨酸解氨酶(PKU)、α-半乳糖苷酶A(针对法布里病)、酸性α-葡萄糖苷酶(GAA，针对Pompe)、葡萄糖脑苷脂酶(GCase，针对高雪氏病)、天冬氨酰氨基葡萄糖苷酶(AGA，针对天冬氨酰氨基葡萄糖尿症)、α-L-艾杜糖苷酸酶(针对MPS I)、艾杜糖醛酸硫酸酯酶(针对MPSII)、磺酰胺酶(MPS IIIa)、α-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAGLU，针对MPS IIIB)、乙酰肝素CoA：α-氨基葡萄糖苷N-乙酰转移酶(HGSNAT，针对MPS IIIC)、N-乙酰氨基葡萄糖6-硫酸酯酶(GNS，针对MPS IIID)、N-氨基葡萄糖3-O-硫酸酯酶(芳基硫酸酯酶G或ARSG，MPS IIIE)、N-乙酰半乳糖胺6-硫酸酯酶(针对MPS IVA)、β-半乳糖苷酶(针对MPS IVB)、N-乙酰半乳糖胺4-硫酸酯酶(针对MPS VI)、β-葡萄糖醛酸酶(针对MPS VI)、因子VIII(针对血友病A)、因子IX(针对血友病B)、棕榈酰蛋白硫酯酶(PPT1，针对CLN1)、三肽基肽酶(TPP1，针对CLN2)和胱硫醚β合酶(CBS)缺乏症。
96.根据条款85所述的方法，其中所述病症是单基因疾病，其中所述施用包括以有效治疗所述疾病的量向所述个体施用包括编码治疗性产物的转基因的工程改造的低免疫原性病毒颗粒。
97.根据条款85-96中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括：
在施用所述工程改造的低免疫原性生物治疗药物8周后，从所述个体抽取血清，并评估所述血清中的生物治疗药物特异性抗体，其中所述生物治疗药物特异性抗体的滴度是将由相应的未工程改造的生物治疗药物引发的滴度的50％。
98.根据条款97所述的方法，其中生物治疗药物特异性抗体的滴度是将由相应的未工程改造的生物治疗药物引发的滴度的20％。
99.根据条款97所述的方法，其中所述生物治疗药物特异性抗体的滴度是将由相应的未工程改造的生物治疗药物引发的滴度的5％。
100.根据条款97所述的方法，其中不能检测生物治疗药物特异性抗体。
101.一种工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其包括与非天然存在的Siglec配体共价结合的生物治疗药物，其中所述Siglec配体包括
选自由以下组成的组的非天然存在的唾液酸：
和选自由以下组成的组的接头：
其中所述接头将所述唾液酸连接到所述生物治疗药物。
102.根据条款101所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述非天然存在的Siglec配体选自由以下组成的组：
/>
/>
103.根据条款101或102所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述非天然存在的Siglec配体在所述接头和所述唾液酸之间不包括糖。
104.一种式(I)的工程改造的低免疫原性生物治疗药物：
[Xn-L]m-Y
(I)
其中X是唾液酸基团，L是任选的接头，Y是生物治疗药物，并且n是1或更大的整数。
前面仅仅说明了本发明的原理。因此将理解，所属领域的技术人员将能够设计各种布置，所述布置虽然没有在本文中明确地描述或示出，但体现本发明的原理并且被包含在其精神和范围内。此外，本文中叙述的所有实例和条件语言主要旨在帮助读者理解本发明的原理和由发明人为促进本领域所贡献的概念，并且应被解释为不限于这些专门叙述的实例和条件。此外，本文叙述本发明的原理、方面和实施例及其具体实例的所有陈述旨在涵盖其结构等同物和功能等同物两者。此外，旨在是此类等同物包含当前已知的等同物和将来开发的等同物两者，即开发的执行相同功能的任何元件，而不管结构如何。因此，本发明的范围并不旨在局限于本文所示和所述的示例性实施例。而是，本发明的范围和精神由所附权利要求体现。

Claims (104)

1.一种工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其包括已经被工程改造成相对于相应的未经工程改造的生物治疗药物包括修饰的唾液酸结合免疫球蛋白型凝集素(Siglec)配体概况同时保留治疗活性的生物治疗药物。
2.根据权利要求1所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中相对于所述相应的未经工程改造的生物治疗药物，所述Siglec配体概况包括提高量的一种或多种与所述工程改造的低免疫原性生物治疗药物共价结合的Siglec配体。
3.根据权利要求1或2所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述Siglec配体中的一种或多种是B细胞缔合的Siglec的配体。
4.根据权利要求3所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述B细胞缔合的Siglec选自由Siglec-2(CD22)、Siglec-5(CD170)、Siglec-6、Siglec-9(CD329)和Siglec-10(Siglec G)组成的组。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述Siglec配体包括唾液酸。
6.根据权利要求5所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述唾液酸是天然存在的唾液酸。
7.根据权利要求6所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述Siglec配体是天然存在的Siglec配体。
8.根据权利要求6所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述Siglec配体是非天然存在的Siglec配体。
9.根据权利要求8所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述天然存在的唾液酸与所述生物治疗药物共价结合。
10.根据权利要求8所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述非天然存在的Siglec配体进一步包括非天然存在的接头。
11.根据权利要求10所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述非天然存在的Siglec配体基本上由结合到所述非天然存在的接头上的所述天然存在的唾液酸组成。
12.根据权利要求10或11所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述接头不包括糖。
13.根据权利要求5所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述Siglec配体为包括非天然存在的唾液酸的非天然存在的Siglec配体。
14.根据权利要求13所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述非天然存在的唾液酸与所述生物治疗药物共价结合。
15.根据权利要求13所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述非天然存在的Siglec配体进一步包括非天然存在的接头。
16.根据权利要求15所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述非天然存在的Siglec配体基本上由共价结合至所述非天然存在的接头的所述非天然存在的唾液酸组成。
17.根据权利要求15或16所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述接头不包括糖。
18.根据权利要求5所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述Siglec配体包括两种唾液酸和一个接头，其中所述接头是分支接头，并且所述两种唾液酸连接至所述接头。
19.根据权利要求5所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述Siglec配体包括三种唾液酸和一个接头，其中所述接头是分支接头，并且所述三种唾液酸连接至所述接头。
20.根据权利要求18或19所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述接头不包括天然糖。
21.根据权利要求1至4中任一项所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述Siglec配体包括Siglec结合肽。
22.根据权利要求21所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述Siglec结合肽包括RNDYTE。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述低免疫原性生物治疗药物包括Siglec-2和Siglec 10两者的Siglec配体。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述工程改造的低免疫原性生物治疗药物包括一种或多种Siglec配体，并且所述相应的未工程改造的免疫原性生物治疗药物包括比所述工程改造的低免疫原性生物治疗药物更少的Siglec配体。
25.根据权利要求24所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述工程改造的低免疫原性生物治疗药物包括一种或多种Siglec配体，并且所述相应的未工程改造的免疫原性生物治疗药物不包括Siglec配体。
26.根据权利要求1至23中任一项所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述低免疫原性生物治疗药物包括比相应的未工程改造的免疫原性生物治疗药物多2倍的Siglec配体，所述Siglec配体在施用所述生物治疗药物的个体中诱导抗体响应。
27.根据权利要求1至23中任一项所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述低免疫原性生物治疗药物包括比相应的未工程改造的生物治疗药物多3倍的Siglec配体，所述Siglec配体在施用所述生物治疗药物的个体中诱导抗体响应。
28.根据权利要求1至23中任一项所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述低免疫原性生物治疗药物包括比相应的未工程改造的生物治疗药物多5倍的Siglec配体，所述Siglec配体在施用所述生物治疗药物的个体中诱导抗体响应。
29.根据权利要求1至23中任一项所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述低免疫原性生物治疗药物包括比相应的未工程改造的生物治疗药物多10倍的Siglec配体，所述Siglec配体在施用所述生物治疗药物的个体中诱导抗体响应。
30.根据权利要求1至23中任一项所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中相对于所述相应的未工程改造的生物治疗药物，所述工程改造的低免疫原性生物治疗药物进一步包括提高量的与所述工程改造的低免疫原性生物治疗药物共价结合的ASGPR配体。
31.根据权利要求30所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述ASGPR配体是天然存在的GalNAc。
32.根据权利要求30所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述ASGPR配体是GalNAc糖模拟物。
33.根据权利要求1至32中任一项所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述低免疫原性生物治疗药物引发的生物治疗药物特异性抗体滴度为在施用所述生物治疗药物的个体中将由相应的未工程改造的生物治疗药物引发的生物治疗药物特异性抗体滴度的50％或更低。
34.根据权利要求33所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述低免疫原性生物治疗药物被施用于个体持续1个月或更长时间。
35.根据权利要求33所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述低免疫原性生物治疗药物被施用于个体持续3个月或更长时间。
36.根据权利要求33所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述低免疫原性生物治疗药物被施用于个体持续6个月或更长时间。
37.根据权利要求33所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述低免疫原性生物治疗药物被施用于个体持续1年或更长时间。
38.根据权利要求33至37中任一项所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中向所述个体的施用是每周一次。
39.根据权利要求33至37中任一项所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中向所述个体的施用是每两周一次。
40.根据权利要求33至37中任一项所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中向所述个体的施用是每月一次。
41.根据权利要求33至37中任一项所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中向所述个体的施用是每季度或每半年一次。
42.根据权利要求33至37中任一项所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中向所述个体的施用是每年一次或每两年一次。
43.根据权利要求33至37中任一项所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述ADA滴度在所述生物治疗药物最后一次施用8周后测量。
44.根据权利要求1至43中任一项所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述生物治疗药物是蛋白质。
45.根据权利要求44所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述蛋白质选自由抗体、酶、嵌合蛋白质和病毒颗粒组成的组。
46.根据权利要求45所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述抗体选自由单克隆抗体、双特异性抗体、scFv、Fab、骆驼抗体或纳米抗体组成的组。
47.根据权利要求46所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述抗体选自由以下组成的组：阿达木单抗、英夫利昔单抗、西妥昔单抗、那他珠单抗、莫塞妥莫单抗、阿替利珠单抗、纳武单抗、阿昔单抗、维布妥昔单抗、培塞利珠单抗、埃罗妥珠单抗、贝那珠单抗、维多珠单抗、加卡奈珠单抗、利妥昔单抗、阿仑单抗、度匹鲁单抗、戈利木单抗、奥滨尤妥珠单抗、替拉珠单抗、厄瑞努单抗、美泊利单抗、雷莫芦单抗、雷珠单抗、乌司奴单抗、瑞利珠单抗、伊匹木单抗、阿莫罗布单抗、贝利单抗、帕尼单抗、阿维单抗、耐昔妥珠单抗、莫格利珠单抗、奥拉单抗、布罗达单抗、艾库组单抗、帕妥珠单抗、帕博利珠单抗和托珠单抗。
48.根据权利要求44所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述蛋白质选自由促红细胞生成素、血小板生成素、人生长激素、组织因子、IFNβ-1b、IFNβ-1a、IL-2或IL-2模拟物阿地白介素、艾塞那肽、阿必鲁泰、阿法赛特、帕利夫明和贝拉西普组成的组。
49.根据权利要求45所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述酶选自由以下组成的组：天冬酰胺酶菊欧文氏菌、苯丙氨酸解氨酶、α-半乳糖苷酶A、酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)、葡萄糖脑苷脂酶(GCase)、天冬氨酰氨基葡萄糖苷酶(AGA)、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、硫氨酶、a-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAGLU)、乙酰肝素CoA：a-氨基葡萄糖苷N-乙酰转移酶(HGSNAT)、N-乙酰氨基葡萄糖6-硫酸酯酶(GNS)、N-氨基葡萄糖3-O-硫酸酯酶(芳基硫酸酯酶G或ARSG)、N-乙酰半乳糖胺6-硫酸酯酶、β-半乳糖苷酶、N-乙酰半乳糖胺4-硫酸酯酶、β-葡萄糖醛酸酶、因子VIII、因子IX、棕榈酰蛋白硫酯酶(PPT1)、三肽基肽酶(TPP1)、假单胞菌弹性蛋白酶(PaE)、假单胞菌碱性蛋白酶(PaAP)和链球菌热原性外毒素B(SpeB)。
50.根据权利要求45所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述病毒颗粒选自重组腺相关病毒(rAAV)颗粒、重组人腺病毒(rHAdV)颗粒、重组单纯疱疹病毒(rHSV)颗粒、重组乳头瘤病毒(PV)颗粒、重组多瘤病毒颗粒、重组痘苗病毒颗粒、重组巨细胞病毒(CMV)颗粒、重组杆状病毒颗粒、重组人乳头瘤病毒(HPV)颗粒和重组逆转录病毒颗粒。
51.根据权利要求50所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述rAAV颗粒包括选自由AAV1、AAV2、AAV3b、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh10、AAV11、AAV12和AAV13 VP1蛋白或其变体组成的组的衣壳VP1蛋白。
52.根据权利要求50所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述重组体包括来自人腺病毒颗粒的衣壳蛋白，所述人腺病毒颗粒选自由重组HAdV-A、HAdV-B、HAdV-C、HAdV-D、HAdV-E、HAdV-F和HAdV-G或其变体组成的组。
53.根据权利要求50所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述重组HSV颗粒选自重组HSV1或HSV2颗粒或其变体。
54.根据权利要求50所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述重组逆转录病毒颗粒选自由以下组成的组：慢病毒颗粒、人类免疫缺陷病毒(HIV)颗粒、猿猴免疫缺陷病毒(SIv)颗粒、猫免疫缺陷病毒(FIV)颗粒、美洲狮慢病毒(PLV)颗粒、马传染性贫血病毒(EIAV)颗粒、牛免疫缺陷病毒(BIV)颗粒、山羊关节炎脑炎病毒颗粒、γ-逆转录病毒颗粒和鼠白血病病毒(MLV)颗粒，或其变体或假型病毒。
55.一种制备低免疫原性生物治疗药物的方法，所述方法包括将唾液酸共价地连接到生物治疗药物上以产生工程改造的低免疫原性生物治疗药物。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述共价地连接包括通过工程改造的生物合成的唾液酸化。
57.根据权利要求55所述的方法，其中所述共价地连接包括通过化学缀合的唾液酸化。
58.根据权利要求55至57中任一项所述的方法，其中所述唾液酸与所述生物治疗药物的聚糖进行化学缀合。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述唾液酸与所述生物治疗药物的所述聚糖的化学缀合导致所述唾液酸和所述聚糖之间的共价键。
60.根据权利要求58所述的方法，其中所述唾液酸与所述生物治疗药物的所述聚糖的化学缀合在所述唾液酸和所述聚糖之间并入接头。
61.根据权利要求55至57中任一项所述的方法，其中所述唾液酸与所述生物治疗药物的氨基酸进行化学缀合。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述唾液酸与所述生物治疗药物的所述氨基酸的化学缀合导致所述唾液酸和所述氨基酸之间的共价键。
63.根据权利要求61所述的方法，其中所述唾液酸与所述生物治疗药物的所述氨基酸的化学缀合在所述唾液酸和所述氨基酸之间并入接头。
64.根据权利要求55至63中任一项所述的方法，其中所述唾液酸是天然存在的唾液酸。
65.根据权利要求55至63中任一项所述的方法，其中所述唾液酸是非天然存在的唾液酸。
66.根据权利要求55所述的方法，其中所述共价地连接包括通过基因工程改造将Siglec结合肽或多肽插入到所述生物治疗药物的氨基酸序列中。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述Siglec结合肽是RNDYTE。
68.根据权利要求55至67中任一项所述的方法，其中所述共价地连接导致Siglec配体的产生。
69.根据权利要求68所述的方法，其中所述Siglec配体是B细胞缔合的Siglec的配体。
70.根据权利要求69所述的方法，其中所述B细胞缔合的Siglec选自由Siglec-2(CD22)、Siglec-5(CD170)、Siglec-6、Siglec-9(CD329)和Siglec-10(Siglec G)组成的组。
71.根据权利要求55至70中任一项所述的方法，其中在共价连接后，与所述生物治疗药物缔合的唾液酸的量增加2倍或更多。
72.根据权利要求55至70中任一项所述的方法，其中在共价连接后，与所述生物治疗药物缔合的Siglec配体的量增加5倍或更多。
73.根据权利要求55至70中任一项所述的方法，其中在共价连接后，与所述生物治疗药物缔合的Siglec配体的量增加10倍或更多。
74.根据权利要求55至73中任一项所述的方法，其中相对于所述相应的未工程改造的生物治疗药物，所述工程改造的低免疫原性生物治疗药物进一步包括提高量的与所述工程改造的低免疫原性生物治疗药物共价结合的ASGPR配体。
75.根据权利要求74所述的方法，其中所述ASGPR配体是天然存在的GalNAc。
76.根据权利要求74所述的方法，其中所述ASGPR配体是GalNAc糖模拟物。
77.根据权利要求55至76中任一项所述的方法，其中所述生物治疗药物是蛋白质。
78.根据权利要求77所述的方法，其中所述蛋白质选自由抗体、酶、嵌合蛋白质和病毒颗粒组成的组。
79.根据权利要求78所述的方法，其中所述抗体选自由单克隆抗体、双特异性抗体、scFv、Fab、骆驼抗体或纳米抗体组成的组。
80.根据权利要求78或79所述的方法，其中所述抗体选自由以下组成的组：阿达木单抗、英夫利昔单抗、西妥昔单抗、那他珠单抗、莫塞妥莫单抗、阿替利珠单抗、纳武单抗、阿昔单抗、维布妥昔单抗、培塞利珠单抗、埃罗妥珠单抗、贝那珠单抗、维多珠单抗、加卡奈珠单抗、利妥昔单抗、阿仑单抗、度匹鲁单抗、戈利木单抗、奥滨尤妥珠单抗、替拉珠单抗、厄瑞努单抗、美泊利单抗、雷莫芦单抗、雷珠单抗、乌司奴单抗、瑞利珠单抗、伊匹木单抗、阿莫罗布单抗、贝利单抗、帕尼单抗、阿维单抗、耐昔妥珠单抗、莫格利珠单抗、奥拉单抗、布罗达单抗、艾库组单抗、帕妥珠单抗、帕博利珠单抗和托珠单抗。
81.根据权利要求77所述的方法，其中所述蛋白质选自由促红细胞生成素、血小板生成素、人生长激素、组织因子、IFNβ-1b、IFNβ-1a、IL-2或IL-2模拟物阿地白介素、艾塞那肽、阿必鲁泰、阿法赛特、帕利夫明和贝拉西普组成的组
82.根据权利要求78所述的方法，其中所述酶选自由以下组成的组：天冬酰胺酶菊欧文氏菌、苯丙氨酸解氨酶、α-半乳糖苷酶A、酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)、葡萄糖脑苷脂酶(GCase)、天冬氨酰氨基葡萄糖苷酶(AGA)、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、硫氨酶、a-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAGLU)、乙酰肝素CoA：α-氨基葡萄糖苷N-乙酰转移酶(HGSNAT)、N-乙酰氨基葡萄糖6.硫酸酯酶(GNS)、N.氨基葡萄糖3.O.硫酸酯酶(芳基硫酸酯酶G或ARSG)、N.乙酰半乳糖胺6.硫酸酯酶、β.半乳糖苷酶、N.乙酰半乳糖胺4.硫酸酯酶、β-葡萄糖醛酸酶、因子VIII、因子IX、棕榈酰蛋白硫酯酶(PPT1)和三肽基肽酶(TPP1)。
83.根据权利要求78所述的方法，其中所述病毒颗粒选自重组腺相关病毒(rAAV)颗粒、重组人腺病毒(rHAdV)颗粒、重组单纯疱疹病毒(rHSV)颗粒、重组乳头瘤病毒(PV)颗粒、重组多瘤病毒颗粒、重组痘苗病毒颗粒、重组巨细胞病毒(CMV)颗粒、重组杆状病毒颗粒、重组人乳头瘤病毒(HPV)颗粒和重组逆转录病毒颗粒。
84.一种药物组合物，包括：
根据权利要求1至54中任一项所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物或根据权利要求55至83中任一项制造的组合物；和
药物赋形剂。
85.一种治疗患有可以通过施用生物治疗剂来治疗的病症或疾病的个体的方法，所述方法包括以有效治疗所述病症或疾病的量向所述个体施用根据权利要求84所述的药物组合物，其中所述药物组合物引发相对于所述未工程改造的生物治疗药物降低的抗药物抗体滴度。
86.根据权利要求85所述的方法，其中所述疾病是选自由类风湿性关节炎、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎、银屑病、化脓性汗腺炎、葡萄膜炎和幼年特发性关节炎组成的组的慢性免疫疾病，其中所述施用包括以有效治疗所述慢性免疫疾病的量向所述个体施用选自阿达木单抗和英夫利昔单抗的工程改造的低免疫原性TNFα特异性抗体。
87.根据权利要求85所述的方法，其中所述疾病为白血病，其中所述施用包括以治疗癌症的有效量向所述个体施用来自菊欧文氏菌的工程改造的低免疫原性天冬酰胺酶。
88.根据权利要求85所述的方法，其中所述疾病为多发性硬化，其中所述施用包括以有效治疗所述多发性硬化的量向所述个体施用工程改造的低免疫原性那他珠单抗、工程改造的低免疫原性IFNβ-1b或工程改造的低免疫原性IFNβ-1a。
89.根据权利要求85所述的方法，其中所述病症是对移植的组织的抗体响应，其中所述施用包括以有效抑制对所述移植的组织的所述抗体响应的量向所述个体施用工程改造的低免疫原性IdeS。
90.根据权利要求89所述的方法，其中所述移植的组织是同种异体移植物。
91.根据权利要求89所述的方法，其中所述移植的组织是异种移植物。
92.根据权利要求86至91中任一项所述的方法，其中所述组织选自肾、心脏、肺、肝、胰腺、气管、血管组织、皮肤、骨、软骨、肾上腺组织、胎儿胸腺和角膜。
93.根据权利要求85所述的方法，其中所述病症为2型糖尿病，其中所述施用包括以有效治疗所述病症的量向所述个体施用工程改造的低免疫原性艾塞那肽或工程改造的低免疫原性阿必鲁泰。
94.根据权利要求85的方法，其中所述病症是酶缺乏症，其中所述施用包括以有效治疗所述缺乏症的量向所述个体施用工程改造的低免疫原性酶。
95.根据权利要求94所述的方法，其中所述酶缺乏症是选自由以下组成的组的酶缺乏症：苯丙氨酸解氨酶(PKU)、α-半乳糖苷酶A(针对法布里病)、酸性α-葡萄糖苷酶(GAA，针对庞贝病)、葡萄糖脑苷脂酶(GCase，针对高雪氏病)、天冬氨酰氨基葡萄糖苷酶(AGA，针对天冬氨酰氨基葡萄糖尿症)、a-L-艾杜糖苷酸酶(针对MPS I)、艾杜糖醛酸硫酸酯酶(针对MPSII)、磺酰胺酶(MPS IIIa)、a-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAGLU，针对MPSIIIB)、乙酰肝素CoA：α-氨基葡萄糖苷N-乙酰转移酶(HGSNAT，针对MPS IIIC)、N-乙酰氨基葡萄糖6-硫酸酯酶(GNS，针对MPS IIID)、N-氨基葡萄糖3-O-硫酸酯酶(芳基硫酸酯酶G或ARSG，MPS IIIE)、N-乙酰半乳糖胺6-硫酸酯酶(针对MPS IVA)、β-半乳糖苷酶(针对MPS IVB)、N-乙酰半乳糖胺4-硫酸酯酶(针对MPS VI)、β-葡萄糖醛酸酶(针对MPS VI)、因子VIII(针对血友病A)、因子IX(针对血友病B)、棕榈酰蛋白硫酯酶(PPT1，针对CLN1)、三肽基肽酶(TPP1，针对CLN2)和胱硫醚β合酶(CBS)缺乏症。
96.根据权利要求85所述的方法，其中所述病症是单基因疾病，其中所述施用包括以有效治疗所述疾病的量向所述个体施用包括编码治疗性产物的转基因的工程改造的低免疫原性病毒颗粒。
97.根据权利要求85至96中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括：
在施用所述工程改造的低免疫原性生物治疗药物8周后，从所述个体抽取血清，并评估所述血清中的生物治疗药物特异性抗体，其中所述生物治疗药物特异性抗体的滴度是将由相应的未工程改造的生物治疗药物引发的滴度的50％。
98.根据权利要求97所述的方法，其中所述生物治疗药物特异性抗体的滴度是将由相应的未工程改造的生物治疗药物引发的滴度的20％。
99.根据权利要求97所述的方法，其中所述生物治疗药物特异性抗体的滴度是将由相应的未工程改造的生物治疗药物引发的滴度的5％。
100.根据权利要求97所述的方法，其中不能检测生物治疗药物特异性抗体。
101.一种工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其包括与非天然存在的Siglec配体共价结合的生物治疗药物，其中所述Siglec配体包括
选自由以下组成的组的非天然存在的唾液酸：
和选自由以下组成的组的接头：
其中所述接头将所述唾液酸连接到所述生物治疗药物。
102.根据权利要求101所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述非天然存在的Siglec配体选自由以下组成的组：
/>
103.根据权利要求101或102所述的工程改造的低免疫原性生物治疗药物，其中所述非天然存在的Siglec配体在所述接头和所述唾液酸之间不包括糖。
104.一种式(I)的工程改造的低免疫原性生物治疗药物：
[Xn-L]m-Y
(I)
其中X是唾液酸基团，L是任选的接头，Y是生物治疗药物，n是1或更大的整数，并且m是1或更大的整数。
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