WO2017104556A1

WO2017104556A1 - 細胞検出装置および細胞回収装置

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Publication number: WO2017104556A1
Application number: PCT/JP2016/086676
Authority: WO
Inventors: 片山晃冶
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 2015-12-15
Filing date: 2016-12-09
Publication date: 2017-06-22
Anticipated expiration: 2018-06-15
Also published as: JP2017108738A

Abstract

体液、組織分散液、細胞培養液などの液体試料中に含まれる目的細胞を、前記目的細胞由来の画像を用いて迅速かつ正確に検出できる装置、および検出した前記目的細胞を精度よく回収可能な装置を提供すること。細胞に光を照射する細胞照射手段と、細胞照射手段で照射して得られる前記細胞由来の画像を取り込む画像取り込み手段と、画像取り込み手段で取り込まれた前記画像に対して２次元フーリエ変換を行なう画像変換手段と、画像変換手段で変換された画像の低周波数領域における空間周波数分布または画像変換手段で変換された画像の空間周波数分布の最大値のうち少なくともいずれか一つに基づき目的細胞を検出する画像検出手段と、を備えた細胞検出装置、および前記画像検出手段で検出した前記目的細胞をノズルによる吸引吐出により回収する回収手段とをさらに備えた細胞回収装置により、前記課題を解決する。

Description

細胞検出装置および細胞回収装置

　本発明は、体液、組織分散液、細胞培養液などの液体試料中に含まれる目的細胞を検出する装置、および前記検出した目的細胞を回収する装置に関する。特に本発明は、目的細胞の検出を、細胞由来の画像を用いて行なう装置に関する。

　溶液中に同じ種類の細胞が含まれていたとしても、当該細胞の性質が個々に異なることが知られている（非特許文献１）。一方で、溶液中に含まれる細胞から通常得られる情報は、個々の細胞の情報が平均化された情報となるため、個々の細胞の情報を得ることは難しい。そのため、溶液中に含まれる細胞を個別に解析し、個々の細胞の情報を得ることへの関心が高まっている。

　溶液中に含まれる細胞を個別に解析する例として、血中循環腫瘍細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ　Ｔｕｍｏｒ　Ｃｅｌｌｓ、以下ＣＴＣ）の解析があげられる。ＣＴＣは癌の転移や再発に重要な役割を果たすと考えられており、ＣＴＣの解析が可能になると、癌患者の術後診断や投薬方針を決定することができるため、治療の最適化や効率化につながると考えられる。しかしながら、ＣＴＣは未解明な点が多く、またＣＴＣが有する遺伝子の変異やコピー数変化が個々の細胞で異なるという報告もあるため、個別に細胞を解析する必要がある（非特許文献２）。

　血液試料中に含まれるＣＴＣの検出方法として、従来より、抗ＥｐＣＡＭ（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅｌｌ　Ａｄｈｅｓｉｏｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌｅ）抗体を修飾した磁気微粒子を用いてＣＴＣを濃縮し、ＣＴＣを含む細胞を蛍光免疫染色により標識後、前記標識由来の蛍光を検出することで、ＣＴＣを正常細胞（白血球）から区別して検出する方法が知られており（非特許文献３）、前記方法を用いたＣＴＣ検出装置も商品化されている（ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ、ヤンセン・ダイアグノスティックス社製）。しかしながら、近年、抗ＥｐＣＡＭ抗体と反応しないＣＴＣも存在することが知られるようになり、本方法では血液試料中に含まれるＣＴＣを取りこぼすおそれがあることがわかってきた。そのため、ＥｐＣＡＭなどのマーカーを用いずにＣＴＣを検出可能な装置が求められている。

　マーカーを用いずに目的細胞の検出が可能な装置として、細胞由来の画像を用いて光学的に目的細胞を検出する装置が知られている（特許文献１および２）。特許文献１は、細胞を撮影して得られる画像からサイズ、外形、核の形状などの特徴を抽出するための特徴抽出手段と、抽出された前記特徴から前記細胞の良否を判定する良否判定手段と、前記特徴抽出手段および前記良否判定手段の組み合わせを解析レシピとして記憶する解析レシピ記憶手段と、前記解析レシピ記憶手段から目的細胞に対応したレシピを選択し当該レシピに基づき前記特徴抽出手段および前記良否判定手段を駆動させることで目的細胞の良否を判断する解析手段とを備えた、細胞の良否を判定する装置を開示している。特許文献２は、フローセル中を流れる血液に対して光を照射することで得られた、血液中に含まれる細胞由来の画像に対し、光学的に２次元フーリエ変換を行なった後、空間光フィルタによりフーリエ変換後の像の光軸を中心とする一定範囲の部分を選択的に通過させ、前記通過した部分に対しさらに光学的に２次元フーリエ変換を行なうことで血液中に含まれる癌細胞を検出する装置を開示している。

日本国特開２００６－３３３７１０号公報日本国特開２００９－０６３３７５号公報

Ｇｒｏｒｉａ，Ｈ．Ｈ．，Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４４，２２５９－２２６５（１９８４）Ｍａｒｔｉｎａ，Ａ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，４，８１２－８１３（２０１３）Ｒｉｅｔｈｄｏｒｆ，Ｓ．，ｅｔ．　ａｌ．，Ｃｌｉｎｃａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３（３），９２０－９２８（２００７）

　本発明の課題は、体液、組織分散液、細胞培養液などの液体試料中に含まれる目的細胞を、前記目的細胞由来の画像を用いて検出する装置であって、前記目的細胞の検出を迅速かつ正確に検出可能な装置を提供することにある。また本発明の別の課題は、体液、組織分散液、細胞培養液などの液体試料中に含まれる目的細胞を、前記目的細胞由来の画像を用いて検出し、当該検出した目的細胞を回収する装置であって、前記目的細胞を精度よく回収可能な装置を提供することにある。

　上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、本発明に到達した。

　すなわち本発明の第一の態様は、
細胞に光を照射する細胞照射手段と、細胞照射手段で照射して得られる前記細胞由来の画像を取り込む画像取り込み手段と、画像取り込み手段で取り込まれた前記画像に対して２次元フーリエ変換を行なう画像変換手段と、画像変換手段で変換された画像の空間周波数分布に基づき目的細胞を検出する画像検出手段と、を備えた細胞検出装置であって、
前記画像検出手段による目的細胞の検出を、画像変換手段で変換された画像の低周波数領域における空間周波数分布または画像変換手段で変換された画像の空間周波数分布の最大値のうち少なくともいずれか一つに基づき行なう、前記装置である。

　また本発明の第二の態様は、
細胞に光を照射する細胞照射手段と、細胞照射手段で照射して得られる前記細胞由来の画像を取り込む画像取り込み手段と、画像取り込み手段で取り込まれた前記画像に対して２次元フーリエ変換を行なう画像変換手段と、画像変換手段で変換された画像の空間周波数分布に基づき細胞を検出する画像検出手段と、を備えた細胞検出装置であって、
前記装置に、画像取り込み手段で取り込まれた前記画像の蛍光または発光を検出する光検出手段をさらに備え、かつ目的細胞の検出を、画像検出手段における画像変換手段で変換された画像の低周波数領域における空間周波数分布または画像変換手段で変換された画像の空間周波数分布の最大値のうち少なくともいずれか一つに基づく検出結果、および光検出手段における蛍光検出または発光検出結果に基づき行なう、前記装置である。

　さらに本発明の第三の態様は、
細胞に光を照射する細胞照射手段と、細胞照射手段で照射して得られる前記細胞由来の画像を取り込む画像取り込み手段と、画像取り込み手段で取り込まれた前記画像に対して２次元フーリエ変換を行なう画像変換手段と、画像変換手段で変換された画像の空間周波数分布に基づき目的細胞を検出する画像検出手段と、画像検出手段で検出した前記目的細胞をノズルによる吸引吐出により回収する回収手段と、を備えた細胞回収装置であって、
前記画像検出手段による目的細胞の検出を、画像変換手段で変換された画像の低周波数領域における空間周波数分布または画像変換手段で変換された画像の空間周波数分布の最大値のうち少なくともいずれか一つに基づき行なう、前記装置である。

　また本発明の第四の態様は、
細胞に光を照射する細胞照射手段と、細胞照射手段で照射して得られる前記細胞由来の画像を取り込む画像取り込み手段と、画像取り込み手段で取り込まれた前記画像に対して２次元フーリエ変換を行なう画像変換手段と、画像変換手段で変換された画像の空間周波数分布に基づき細胞を検出する画像検出手段と、ノズルによる吸引吐出により細胞を回収する回収手段と、を備えた細胞回収装置であって、
前記装置に、画像取り込み手段で取り込まれた前記画像の蛍光または発光を検出する光検出手段をさらに備え、かつ回収手段で回収する目的細胞の検出を、画像検出手段における画像変換手段で変換された画像の低周波数領域における空間周波数分布または画像変換手段で変換された画像の空間周波数分布の最大値のうち少なくともいずれか一つに基づく検出結果、および光検出手段における蛍光検出または発光検出結果に基づき行なう、前記装置である。

　また本発明の第五の態様は、回収手段における前記ノズルの先端部が透光性材料で形成されており、かつ前記ノズルに光を照射するためのノズル照射部およびノズル照射部で照射した光を前記ノズルの先端部に導くためのノズル導光部を前記回収手段にさらに設けた、前記第三または第四の態様に記載の装置である。

　また本発明の第六の態様は、画像検出手段による細胞の検出を、画像変換手段で変換された画像の低周波数領域における空間周波数分布および画像変換手段で変換された画像の空間周波数分布の最大値に基づき行なう、前記第一から第五の態様のいずれかに記載の装置である。

　また本発明の第七の態様は、細胞を保持する保持部を有した細胞保持手段をさらに備え、かつ細胞照射手段が前記保持部に保持された細胞に光を照射する、前記第一から第六の態様のいずれかに記載の装置である。

　また本発明の第八の態様は、細胞照射手段から照射される光により蛍光を発する位置検出部を細胞保持手段にさらに設けた、前記第七の態様に記載の装置である。

　以下、本発明を詳細に説明する。

　本発明の装置で検出および回収する細胞に特に限定はなく、リンパ球、赤血球、白血球、血小板、腫瘍細胞が例示できる。特に本発明の装置は、血液中に含まれる腫瘍細胞（ＣＴＣ）および白血球の検出ならびに回収に有用な装置である。
　本発明の装置に備える細胞照射手段において、細胞に光を照射する光源に特に限定はなく、電球、ハロゲンランプ、水銀ランプ、メタルハライドランプ、半導体レーザー、ガスレーザー、ＬＥＤなどを用いることができる。また必要に応じ、光源からの光を、光学フィルター、ミラーおよびレンズなどから構成される光学系を経由して、細胞に照射してもよい。なお本発明の装置が、細胞を保持する保持部を有した細胞保持手段をさらに備えている場合、細胞照射手段は前記保持部に保持された細胞に光が照射されるよう、光源および光学系を設ければよい。

　本発明の装置に備える画像取り込み手段は、前述した細胞照射部で細胞を照射して得られる当該細胞由来の画像を取り込む手段である。取り込む画像の一例として、広い波長領域での透過光または反射光による光強度分布や、位相差から合成される光強度分布から構成される像（明視野像）があげられる。画像取り込み手段で取り込む明視野像は、細胞形態に関する情報が取得可能であれば、特に制限されない。細胞形態に関する情報の一例として、細胞の直径、面積、体積、周囲長、真円度があげられる。なお細胞があらかじめ免疫染色などによる蛍光標識や発光基質による標識がされている場合、当該標識物質由来の蛍光強度または発光強度の絶対値、または当該標識物質由来の蛍光強度または発光強度のピーク値、最小値、平均値もしくは積分値といった計算値から構成される像（蛍光画像または発光画像）も、画像取り込み手段で取り込む画像に含まれる。

　本発明の装置に備える画像変換手段は、前述した画像取り込み手段で取り込まれた細胞由来の画像に対して２次元フーリエ変換を行なう。具体的には、画像取り込み部で取り込んだ細胞由来の画像（明視野像や蛍光画像など）それぞれの関心領域（ＲＯＩ：Ｒｅｇｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）に対し２次元フーリエ変換を行ない、空間周波数分布画像を得る。

　本発明の装置に備える画像検出手段は、前述した画像変換手段で変換された画像の空間周波数分布に基づき目的細胞を検出する。細胞種（例えば血液試料の場合、白血球や血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）など）により形状や明暗模様が異なるため、空間周波数分布にも違いが生じる。画像検出手段は、この違いに基づき目的細胞を検出する。本発明の装置に備える画像検出手段の一態様は、画像変換手段で変換された画像のうち、低周波数領域（光軸を中心とする内側の一定領域）の空間周波数分布に基づき、目的細胞を検出する。前記検出は例えば、画像変換手段で２次元フーリエ変換された画像のうち、低周波数領域のスペクトル強度の積分値の大きさに基づき、行なえばよい。なお本明細書において低周波数領域とは３ピクセルから５０ピクセル（波長：０．８１から１３．５μｍ）までの領域のことをいい、５ピクセルから２０ピクセル（波長：２．０２５から８．１μｍ）までの領域とすると好ましく、５ピクセルから１１ピクセル（波長：３．６８から８．１μｍ）までの領域とするとより好ましい。ここで２次元フーリエ変換後の画像の波長（空間周波数）を示すのに「ピクセル」値を用いているが、本明細書において「ピクセル」値とは、２０倍の対物レンズおよびＣＣＤカメラ（８ビット輝度分解能１０２４×１０２４画素数）を用いて取り込まれた細胞由来の画像（１ピクセル＝０．４０５μｍ）を、１００×１００ピクセルの関心領域（ＲＯＩ）で２次元フーリエ変換を行ない得られた画像の空間周波数を「ピクセル」値として表記している。「ピクセル」値から波長および空間周波数への換算は以下の式を用いればよい。

　波長［μｍ］＝取り込んだ画像のＲＯＩ一辺の距離（０．４０５［μｍ／ピクセル］×１００［ピクセル］）／２次元フーリエ変換後の画像における半径ピクセル値
　空間周波数［μｍ^－１］＝１／波長［μｍ］
　具体例として、血液試料中に含まれる白血球と癌細胞（ＣＴＣ）とを区別して検出したい場合、低周波数領域を画像変換手段で２次元フーリエ変換された画像の中心から５ピクセルから１１ピクセル（波長：３．６８から８．１μｍ）までの領域とし、スペクトル強度の積分値の判別しきい値を３２７から３６４までの間に設定すればよい。なお本明細書に記載のスペクトル強度の積分値は、画像取り込み時に用いるカメラとして８ビット（２５６段階）の解像度を有したカメラを用い、０（黒）から２５５（白）までの数値で表現した輝度に基づき得られる値である。従って、画像取り込み時に用いるカメラの解像度（デジタル分解能）が８ビットから異なると、スペクトル強度の積分値も異なる。また低周波数領域（積分範囲）の設定によっても、スペクトル強度の積分値のしきい値は変化する。そのため本例の場合、あらかじめ白血球など血液試料中に含まれる正常細胞由来の画像（明視野像や蛍光画像など）に対して２次元フーリエ変換を行ない得られた画像のスペクトル強度の積分値に基づき、しきい値を設定するとよい。
また、特定の低周波数領域を決定するには、空間周波数スペクトルの変曲点により求められた空間周波数対し任意の周波数領域を設定することで決定することが出来る。例えば図１８に示すように、白血球に対しガン細胞には異なる特有の変曲点２、３を有している。判別対象（ここでは白血球）と異なる変曲点が複数存在する場合は判別に使用する空間周波数領域を複数に設定しても良い。

　本発明の装置に備える画像検出手段の別の態様は、画像変換手段で変換された画像のうち、空間周波数分布の最大値（空間周波数分布画像の半径）に基づき、目的細胞を検出する。空間周波数分布の最大値は、例えば、空間周波数のスペクトル強度（輝度）が一定のしきい値以上となる光軸からの距離（半径）の最大値を、空間周波数分布の最大値とすればよい。なお２次元フーリエ変換により得られる画像はピクセル表現となり、粒子検出アルゴリズム等を使用して検出される空間周波数は直径値での表現となるが、空間周波数または波長に換算する場合は、得られた直径のピクセル値を半径に変換して換算すればよい。具体例として、血液試料中に含まれる白血球と癌細胞（ＣＴＣ）とを癌細胞の検出率７０％以上かつ白血球の偽陽性２０％以下の条件で区別して検出したい場合は、空間周波数のスペクトル強度のしきい値を１５に、空間周波数分布の最大値のしきい値を直径２９ピクセルから３６ピクセル（半径１４．５ピクセルから１８ピクセル、波長：２．２５から２．７９３μｍ）までの間に、それぞれ設定すればよく、血液試料中に含まれる白血球と癌細胞（ＣＴＣ）とを癌細胞の検出率８０％以上かつ白血球の偽陽性１０％以下の条件で区別して検出したい場合は、空間周波数のスペクトル強度のしきい値を１５に、空間周波数分布の最大値（空間周波数分布画像の半径）のしきい値を直径３０ピクセルから３４ピクセル（半径１５から１７ピクセル、波長：２．３８２から２．７μｍ）までの間に、それぞれ設定するとよい。

　なお本発明の装置に備える画像検出手段を、画像変換手段で変換された画像の低周波数領域の空間周波数分布および画像変換手段で変換された画像の空間周波数分布の最大値に基づき目的細胞を検出する検出部とすると、細胞種の違い（例えば、血液試料中に含まれる白血球とＣＴＣとの違い）を明確に識別できる点で好ましい。

　また本発明の装置に、画像取り込み手段で取り込まれた画像の蛍光または発光を検出する光検出手段をさらに備え、かつ目的細胞の検出を、画像検出手段における画像変換手段で変換された画像の低周波数領域における空間周波数分布または画像変換手段で変換された画像の空間周波数分布の最大値のうち少なくともいずれか一つに基づく検出結果、および光検出手段における蛍光検出または発光検出結果に基づき行なうと、目的細胞の判別精度がさらに向上する点で好ましい。前記光検出手段による目的細胞の検出方法に特に限定はなく、例えば、蛍光または発光シグナルが少しでもあれば目的細胞として検出してもよく、一定の閾値以上の蛍光または発光シグナルがあれば目的細胞として検出してもよい。また本発明の装置に導入する、目的細胞を含む試料中に含まれる当該目的細胞以外の細胞（夾雑細胞）が有する蛍光または発光シグナルに対し、一定の値以上または当該シグナルの平均値の２ＳＤ以上、３ＳＤ以上もしくは４ＳＤ以上のシグナルを有した細胞を目的細胞として検出してもよい。さらに、画像取り込み手段で取り込まれた蛍光画像または発光画像に対し、画像変換手段による２次元フーリエ変換を行ない得られた、空間周波数分布画像に基づき、目的細胞の検出を行なってもよい。なお光検出手段は、前述した画像検出手段と併せた態様として備えてもよく、前述した画像検出手段とは別の手段として備えてもよい。

　本発明の細胞検出装置に、前記装置に備えた検出手段（画像検出手段や光検出手段）で検出した目的細胞を回収する回収手段をさらに備えることで本発明の細胞回収装置となる。具体的には、前記回収手段はノズルによる吸引吐出により目的細胞を回収する。なお前記ノズルの先端部を透光性材料で形成し、かつ前記ノズルに光を照射するためのノズル照射部およびノズル照射部で照射した光を前記ノズルの先端部に導くためのノズル導光部をさらに設けると、目的細胞が存在する位置（水平位置および垂直位置）の位置合わせが容易となり、目的細胞の回収を確実かつ容易に行なえるため、好ましい。ノズル照射部の光源は、細胞照射部の光源と同様、特に限定はなく、電球、ハロゲンランプ、水銀ランプ、メタルハライドランプ、半導体レーザー、ガスレーザー、ＬＥＤなどを用いることができる。中でも、半導体レーザー、ガスレーザーやＬＥＤなど直線性を有した光源をノズル照射部の光源として用いると好ましく、小型化および低コストの観点においてＬＥＤが特に好ましい。ノズル導光部は、前記ノズル照射部から照射した光をノズルの先端部まで導くだけの透光性を有した材料で形成すればよく、前記材料の一例として、ガラス、樹脂、光ファイバーがあげられる。

　本発明の装置に、細胞を保持するための保持部を有した細胞保持手段をさらに備えると、細胞照射手段による細胞への光の照射、画像取り込み手段による前記細胞由来の画像取り込み、および回収手段による目的細胞の回収を確実に行なえるため、好ましい。前記保持部の形状は特に限定はなく、界面張力などで細胞を含む液体を維持できれば平面の保持部であってもよいが、側壁を設けた保持部とすると細胞を含む液体を細胞保持手段上で安定に保持できる点で好ましい。また細胞を含む液体を前記基板に導入し、前記細胞を前記保持部に保持させる方法に特に限定はなく、単に保持部に細胞を含む液体を導入するだけでもよいし、細胞を含む液体を導入した後、遠心力を利用して保持部へ強制的に細胞を導入させてもよい。中でも細胞を含む液体を導入した後、誘電泳動力を利用して保持部へ細胞を導入させると、細胞を保持部へ効率的に保持できる点で好ましい。

　なお細胞保持手段に、細胞照射手段から照射される光により蛍光を発する位置検出部をさらに設けると、細胞検出時または細胞回収時に生じる位置ずれの影響を受けることなく、正確に目的細胞の検出または回収が行なえる点で好ましい。位置検出部の材料は検出手段で検出可能な蛍光を発する材料で形成すればよい。同様に位置検出部の形状も、検出手段で検出可能な形状であれば特に限定はなく、十字型や四角型が例示できる。位置検出部に基づく位置情報の補正は、例えば、細胞保持手段に位置検出部を３箇所以上設け、細胞検出操作または細胞回収操作の前後で前記位置検出部の位置情報を取得し、アフィン変換法、ヘルマート変換法、最小二乗法による非線形変換法等で補正計算することで、位置ずれの有無と位置情報を補正すればよい。

　本発明の装置は、細胞に光を照射する細胞照射手段と、細胞照射手段で照射して得られる前記細胞由来の画像を取り込む画像取り込み手段と、画像取り込み手段で取り込まれた前記画像に対して２次元フーリエ変換を行なう画像変換手段と、画像変換手段で変換された画像の低周波数領域における空間周波数分布または画像変換手段で変換された画像の空間周波数分布の最大値のうち少なくともいずれか一つに基づき目的細胞を検出する画像検出手段と、を備えた細胞検出装置、および前記画像検出手段で検出した前記目的細胞をノズルによる吸引吐出により回収する回収手段とをさらに備えた細胞回収装置である。

　本発明の装置は、あらかじめ細胞を蛍光標識することなく、目的細胞を検出することができるため、例えば血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）のように蛍光検出に基づく従来の方法では取りこぼしのおそれのある細胞に対しても、検出や回収を確実に行なうことができる。
さらに細胞を免疫染色などによる蛍光標識や発光基質による標識を行ない、かつ前記標識由来の蛍光や発光を検出する光検出手段を本発明の装置にさらに備えると、前記光検出手段による検出結果と前述した画像検出手段による画像での検出結果とを合わせることで、目的細胞の検出や回収をさらに確実に行なうことができる。

本発明の好ましい態様で備える、細胞を有する保持部を有した細胞保持手段（基板）の一例を示した図（分解図）である。図１に示す細胞保持手段（基板）の正面図である。図１に示す細胞保持手段の好ましい態様を示した図である。（Ａ）は平面図であり、（Ｂ）は細胞保持手段の四隅に設けた位置検出部（四角マーク）の拡大図であり、（Ｃ）は（Ａ）の一部領域を拡大した図である。本発明の細胞回収装置の一例を示した図である。（Ａ）は平面、正面および右側面を、（Ｂ）は平面、正面および左側面を、それぞれ示した図である。本発明の細胞回収装置を用いた、細胞検出方法および細胞回収方法の一例を示した図である。図５に示す細胞回収方法のうち、（５）および（６）の工程を詳細に示した図である。本発明の細胞回収装置に備える回収手段の好ましい態様を示す図である。実施例１で作製した細胞保持手段の詳細図である。（Ａ）は平面図であり、（Ｂ）は細胞保持手段の四隅に設けた位置検出部（四角マーク）の拡大図である。画像取り込み手段で取り込んだ、白血球およびモデル癌細胞由来の画像（明視野像）の一例を示した図である。２次元ＦＦＴ（高速フーリエ変換）処理後の、白血球およびモデル癌細胞の空間周波数分布画像の一例を示した図である。実施例２の結果を示した図である。黒ひし形はモデル癌細胞（ＰＣ９細胞）の結果を、白丸は白血球の結果を、それぞれ示す。実施例３の結果を示した図である。黒ひし形はＰＣ９細胞の結果を、黒三角はＰＣ１４細胞の結果を、黒丸はＳＢＣ３細胞の結果を、白丸は白血球の結果を、それぞれ示す。モデル癌細胞（ＰＣ９細胞、ＰＣ１４細胞およびＳＢＣ３細胞）ならびに白血球の空間周波数分布スペクトルを示した図である。実施例５でスペクトル強度積分値の算出に用いた領域（低周波数領域）を点線領域で示している。実施例５の結果を示した図である。黒ひし形はＰＣ９細胞の結果を、黒三角はＰＣ１４細胞の結果を、黒丸はＳＢＣ３細胞の結果を、白丸は白血球の結果を、それぞれ示す。実施例６の結果を示した図である。ａ）は積分範囲を５から６ピクセル（積分範囲１ピクセル）としたときの、ｂ）は積分範囲を５から７ピクセル（積分範囲２ピクセル）としたときの、ｃ）は積分範囲を５から８ピクセル（積分範囲３ピクセル）としたときの、ｄ）は積分範囲を５から９ピクセル（積分範囲４ピクセル）としたときの、ｅ）は積分範囲を５から１０ピクセル（積分範囲５ピクセル）としたときの、それぞれ結果である。また黒ひし形はＰＣ９細胞の結果を、黒三角はＰＣ１４細胞の結果を、黒丸はＳＢＣ３細胞の結果を、白丸は白血球の結果を、それぞれ示す。実施例６の結果を示した図である。ａ）は積分範囲を５から１１ピクセル（積分範囲６ピクセル）としたときの、ｂ）は積分範囲を５から１２ピクセル（積分範囲７ピクセル）としたときの、ｃ）は積分範囲を５から１３ピクセル（積分範囲８ピクセル）としたときの、ｄ）は積分範囲を５から１４ピクセル（積分範囲９ピクセル）としたときの、それぞれ結果である。また黒ひし形はＰＣ９細胞の結果を、黒三角はＰＣ１４細胞の結果を、黒丸はＳＢＣ３細胞の結果を、白丸は白血球の結果を、それぞれ示す。実施例７の結果を示した図である。空間周波数分布スペクトルの変曲点に基づく癌細胞と白血球との識別を説明するための模式図である。

　以下、図面を用いて本発明をさらに詳細に説明する。

　本発明の好ましい態様で備える、細胞を保持する保持部を有した基板の一例を図１に示す。また図１に示した基板の正面図を図２に示す。

　図１に示す基板１００は、
貫通孔１１１ａを有した平板状の遮光部材１１１と、貫通孔１１２ａを有した平板状の絶縁体１１２と、導入口１１３ａ、排出口１１３ｂおよび貫通部１１３ｃを有した平板状のスペーサ１１３とからなる細胞導入保持手段１１０と、
細胞導入保持手段１１０を上下方向に密着して挟むよう設けた電極１２１・１２２と、電極１２１・１２２同士を接続する導線１３０と、
電極１２１・１２２に信号を印加する信号発生器１４０と、
を備えている。遮光部材１１１が有する貫通孔１１１ａと絶縁体１１２が有する貫通孔１１２ａとは互いに同一の寸法および形状であり、かつそれぞれの貫通孔の位置が一致するよう遮光部材１１１および絶縁体１１２を設けている。貫通孔１１１ａ、貫通孔１１２ａおよび遮光部材１１１の下部に密着して設けた電極１２１により保持部１５０が構成され、導入口１１３ａから細胞を含む液体を導入すると、貫通部１１３ｃを通じて保持部１５０へ細胞が導入される。電極１２２はスペーサ１１３上部に密着して設けており、導入口１１３ａから導入した、細胞を含む液体の飛散や蒸発を防止している。なお保持部１５０に保持した細胞の回収を容易にするため、電極１２２はスペーサ１１３から取り外し可能な構造となっている。

　図１に示す基板１００のうち、電極１２１、遮光部材１１１および絶縁体１１２から構成される細胞保持手段１１４の好ましい態様を図３に示す。図３に示す細胞保持手段１１４の周囲（四隅）には細胞保持手段１１４の位置ずれを検出し補正するための位置検出部（四角マーク）１１５を、遮光部材１１１および絶縁体１１２を設けた位置には検出手段で取得した細胞の位置を検出し補正するための位置検出部（四角マーク１１６および十字マーク１１７）を、それぞれ設けている（図３）。

　本発明の細胞回収装置の一例を図４に示す。

　図４に示す装置は、
装置の土台となるベース３１０と、
図１および２に記載の基板１００と、
基板１００および後述する回収チューブ５００をＸＹ軸方向（水平方向）に移動させるための基板移動部３２０と、
基板１００に設けた保持部に保持された細胞へ光を照射するための照射部３３０と、
照射部３３０により前記保持部に保持された細胞へ光を照射することで得られる、前記細胞由来の光情報を取得するための検出部（対物レンズ）３４０および前記光情報に基づき前記細胞由来の画像を取り込むための画像取り込み部（画像取得カメラ）３５０と、
画像取り込み部３５０で取り込んだ細胞由来の画像に対して２次元フーリエ変換を行ない、当該変換後の画像の空間周波数分布に基づき細胞を解析するための解析部３６０と、
ベース３１０上に備えた、基板１００に設けた保持部に保持され、解析部３６０で検出した目的細胞を回収するためのノズル４１０および吸引吐出ポンプ４２０と、
ノズル４１０をＺ軸方向（垂直方向）に移動させるためのノズル移動部４３０と、
ノズル４１０で吸引した前記目的細胞を回収するための回収チューブ５００と、
を備えている。なお基板１００に設けた保持部に保持された細胞は、検出部３４０、画像取り込み部３５０および解析部３６０により光学的に検出することから、少なくとも前記保持部は透光性材料で形成する必要がある。ノズル４１０の先端部は、測定試料由来のコンタミネーションを防止するため、取り外し可能な構造とするとよい。

　次に図１から図４に示す本発明の細胞回収装置を用いた細胞検出方法および細胞回収方法の一例を、図５および図６を用いて説明する。

　（１）保持部へ細胞を導入する工程
　図１に示す基板１００に設けた導入口１１３ａから細胞２００を含む液体を導入し、誘電泳動力６００を利用して細胞２００を保持部１５０へ導入させる。具体的には、信号発生器１４０から電極１２１・１２２へ交流電圧を印加することで誘電泳動力６００を発生させ、保持部１５０へ細胞２００を導入する。図１に示す基板１００に導入する細胞を含む液体は、誘電泳動力で細胞が移動できるよう懸濁された液であればよく、例えば、マンニトール、グルコース、スクロース等の糖類を含んだ水溶液や、当該水溶液に塩化カルシウム、塩化マグネシウム等の電解質、および／またはＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）等のタンパク質をさらに含んだ水溶液に、細胞を含んだ試料を懸濁させた液体があげられる。
特に細胞を含む液体として、マンニトールを含む水溶液に細胞を含んだ試料を懸濁させた液体を用いると、細胞へのダメージが少なくなる点で好ましい。添加するマンニトールの濃度は等張液となる濃度とすればよく、具体的には２５０ｍＭから３５０ｍＭの間とする
とよい。

　信号発生器１４０から電極１２１・１２２へ印加する交流電圧は、保持部１５０に保持された細胞２００の充放電が周期的に繰り返される波形を有した交流電圧とすると好ましく、周波数を１００ｋＨｚから３ＭＨｚまでの間とし、電界強度を１×１０^５から５×１０^５Ｖ／ｍまでの間とすると特に好ましい（ＷＯ２０１１／１４９０３２号および特開２０１２－０１３５４９号公報参照）。

　（２）接着物質７００を含む試薬を添加する工程
　図１に示す基板１００に設けた導入口１１３ａから接着物質７００を含む試薬を導入することで、保持部１５０を接着物質７００で修飾し、接着物質７００を介して保持部１５０と保持部に導入した細胞２００とを接着させる。なお接着物質７００による保持部１５０の修飾は前記（１）の工程の前に実施してもよい。

　接着物質は細胞と特異的に結合可能な物質であれば特に制限はない。一例として、細胞表面にある物質と特異的に結合可能な分子（リガンド－レセプター、糖鎖－レクチン、抗原－抗体）や、細胞の脂質二重膜に結合する脂質オレイル基を有したＢｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ　Ａｎｃｈｏｒ　ｆｏｒ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ（ＢＡＭ）があげられる。中でも、ポリ－Ｌ－リジンが、比較的短時間に細胞表面と静電的に結合できる点で好ましい。

　接着物質としてポリ－Ｌ－リジンを用いる場合、その濃度は０．０１（ｗ／ｖ）％以下とすると好ましい。また本工程は、細胞へのダメージを少なくするために、短時間で完了させるとよい。本工程の具体例として、ポリ－Ｌ－リジンを０．０１（ｗ／ｖ）％含む溶液を導入口１１３ａから３分間導入して、保持部１５０を置換する工程があげられる。

　本工程を前記（１）の工程の後に実施する場合、信号発生器１４０から電極１２１・１２２へ交流電圧を印加した状態（つまり細胞への誘電泳動力が存在する状態）で実施すると、添加した接着物質７００を含む試薬の流れによる保持部１５０からの細胞２００の脱離を防止できる点で好ましい。前記好ましい態様で本工程を実施する場合、接着物質７００を含む試薬に、前記（１）で導入した、細胞２００を含む液体と同じ濃度の糖類（例えば、２５０ｍＭから３５０ｍＭのマンニトール）を含むとよい。

　（３）細胞２００由来の画像を取り込む工程
　排出口１１３ｂから接着物質７００を含む試薬を排出した後、基板移動部３２０で基板をＸＹ軸方向に移動させながら、照射部３３０、検出部３４０および画像取り込み部３５０により、保持部１５０に保持された細胞２００由来の画像（明視野像）および細胞２００の位置情報を取得する。なお細胞２００由来の画像（明視野像）は、保持部１５０に保持された細胞それぞれに対して複数取得する。

　（４）取り込んだ画像を変換する工程（図示せず）
　（３）の工程で取得した、保持部１５０に保持された細胞２００由来の複数の画像から単細胞の画像領域を認識し、関心領域（ＲＯＩ）設定を行なった後、２次元ＦＦＴ（高速フーリエ変換）処理を行ない、空間周波数分布画像を得る。得られた前記画像のうち、低周波数領域の空間周波数分布または空間周波数分布の最大値のうち少なくともいずれか一つに基づき、目的細胞を検出する。

　（５）目的細胞２１０を回収する工程
　前記（４）の工程で検出した目的細胞２１０を回収するために、電極１２２をスペーサ１１３から取り外した後、ノズル４１０で吸引することで、基板１００から目的細胞２１０を回収する。電極１２２を取り外す際は、スペーサ１１３を剥がさないよう取り外す必要がある。もしスペーサ１１３が絶縁体１１２から剥がれると、装置内に保持されている溶液が系外に流れてしまい、目的細胞２１０が破壊されるおそれがあるからである。

　目的細胞２１０の吸引は、基板移動部３２０およびノズル移動部４３０を用いて前記（４）の工程で検出した目的細胞２１０が保持されている保持部をノズル４１０の中心に移動させ、ノズル４１０により液を吸引することで目的細胞２１０を回収する。電極１２２をスペーサ１１３から取り外す際、基板（細胞保持手段）と検出部３４０の光軸中心との間に数十から数百μｍのずれが生じるため、スペーサ１１３から取り外す前と後で、基板（細胞保持手段）に設けた位置検出部（図３の１１５・１１６・１１７）のうち、少なくとも３点についてその中心をそれぞれ算出する。算出した結果からヘルマート変換式を用いてスペーサ１１３から取り外す工程で生じたずれを算出する。得られた補正値を用いて、基板移動部３２０の物理アドレスを補正して基板（細胞保持手段）の正確な位置として認識させる。なお、あらかじめノズル４１０を検出部３４０の光軸中央に調整しておくことで前記補正した保持手段１１０の位置に変換された目的細胞２１０の位置へ、基板移動部３２０により移動させればよい。

　またノズル４１０による目的細胞２１０の吸引位置を、目的細胞２１０を標本化した保持部１５０の中心から水平方向に一定距離ずらした位置とすると、目的細胞２１０の吸引を容易に行なえるため、好ましい。具体的には目的細胞２１０の吸引位置を、保持部１５０の中心から水平方向に保持部１５０の直径の０．１倍から２倍の長さ分（ただし隣接する保持部１５０間の距離の２分の１以下）ずらし、かつ保持部１５０の高さから垂直方向に保持部１５０の高さの０．０１倍から２倍の高さ分高い位置とすると好ましい。またノズル４１０による目的細胞２１０の吸引操作の前に、目的細胞２１０と保持部１５０との接着性を弱める酵素を含む溶液を添加する操作を行なってもよい。

　前記（４）の工程で検出した目的細胞２１０が保持されている保持部をノズル４１０の中心に移動させる操作は、基板移動部３２０により前記保持部の位置情報からノズル４１０先端部の中心位置を保持部１５０の中心（または保持部の中心から水平方向に一定距離ずらした位置）に合致させるよう基板１００を移動させた後、ノズル移動部４３０によりノズル４１０先端部の垂直方向の位置を、保持部１５０の高さから垂直方向に一定の高さ分高い位置（例えば、保持部１５０の高さの０．０１倍から２倍の高さ分高い位置）まで移動させて行なう。

　検出部（対物レンズ）３４０および画像取り込み部（画像取得カメラ）３５０で取得するノズル４１０先端部の画像は不明瞭なため、そのままではノズル４１０先端部の位置を正確に把握するのは困難であり、目的細胞２１０が保持されている保持部を正確にノズル４１０の中心へ移動させるのは困難である。本態様の細胞回収装置に設けたノズル４１０は図７に示すように、根元にノズル照射部４４０を設けており、ノズル照射部４４０から光４５１を照射すると、ノズル導光部４６０を経由し、ノズル４１０先端から基板へ光４５２が照射される。そうすることでノズル４１０先端部を、検出部３４０および計測部により、リング状の鮮明な画像として取得できるため、ノズル４１０先端部の位置を正確に算出することができ、目的細胞２１０が保持されている保持部１５０からのずれを算出することが容易となる。

　同様にノズル４１０先端部の垂直方向の位置も、図７に示すノズルによりノズル４１０先端部から基板へ光を照射し、検出部３４０および画像取り込み部３５０により得られる画像のコントラストまたは画像微分値の最大値の変化等を計測し、焦点位置を算出することで、正確に算出することができる。

　なお前述した操作を、前記（３）の工程（細胞由来の画像を取り込む工程）を行ないながら実施する際は、ノズル４１０先端部から照射される光が検出部（対物レンズ）３４０に極力入射されない必要がある。本態様の細胞回収装置に設けたノズル（図７）は、根元から先端部までの間に２か所屈曲しており、ノズル根元から照射する光４５１の方向が基板および検出部３４０に直接照射しない方向となっているため、好ましいノズル４１０の態様といえる。

　図４に示す装置では、ノズル４１０で目的細胞２１０を吸引する方法として、ポンプ４２０を用いた陰圧により吸引する方法を採用している。目的細胞２１０は保持部１５０に比較的強く接着されていることから、ポンプとしてシリンジポンプを用いる場合は高流速で吸引する必要があり、具体的には０．０１μＬ／ｓ以上の流量が必要である。しかしながら流量を大きくしすぎると、流路内に気泡が発生し、著しく流量が低下してしまうため、流量は０．０１から５．０μＬ／ｓの間が好ましい。

　ノズル４１０の内径は、吸引後のノズル４１０の詰まりを防ぐため、吸引する細胞の直径よりも大きくするとよい。例えば、直径３０μｍの保持部（保持部間の距離は５０μｍ）に導入された細胞を吸引する場合は、ノズル４１０の内径を２５μｍから３５μｍの間とするとよい。

　（６）回収した目的細胞２１０を回収チューブ５００へ吐出する工程
　ノズル４１０による吸引で回収した目的細胞２１０を回収チューブ５００へ吐出する。回収チューブ５００に回収された目的細胞２１０はその後遺伝子解析等さらなる解析に供される。

　なお前述した細胞検出方法および細胞回収方法では、目的細胞の検出および回収を細胞由来の明視野像のみに基づき行なっているが、目的細胞の検出および回収を細胞由来の明視野像および蛍光画像もしくは発光画像に基づき行なう場合は、前記（２）の工程と前記（３）の工程との間に、細胞を膜透過する工程、非特異標識の発生を防止するためのブロッキング剤を添加する工程、および蛍光標識試薬を添加する工程を追加すればよい（特願２０１５－０１８４１０号）。

　以下、実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は本例の内容に限定されるものではない。

　実施例１　細胞保持手段の作成
　以下に示す方法で、図１および図３に示す、遮光部材１１１と絶縁体１１２と電極１２１とが一体となった細胞保持手段１１４を作成した。
（１）ＩＴＯ導電膜を成膜した１．２ｍｍ厚の青板ガラス基板上にＣｒ膜を２００ｎｍ成膜した。
（２）レジスト剤をスピンコーターで塗布し、微細孔１１１ａ、位置検出部（四角マーク）１１５・１１６、および位置検出部（十字マーク）１１７を形成する領域をマスキングした。なお位置検出部１１５は図３（Ｂ）に示すように内部にさらに細かな四角形状を形成した。一般に対物レンズの焦点位置の決定は、顕微鏡の対物レンズを上下させたときに撮像した画像の微分値の変化を求め、微分値が最大となる対物レンズの位置を最も焦点が合った位置に決定する。前記操作を行なう際、コントラストの変動部（明暗の差）を撮像画像に多く分布させると、広い範囲の画像領域で焦点位置を容易かつ精度よく特定することができるため、位置検出部１１５を図３（Ｂ）に示した形状とした。
（３）ＵＶ光源で露光し、エッチング（現像液：４％リン酸塩）処理することで、マスキングした領域のＣｒ膜を除去した後、ベークすることでパターンを形成した。
（４）レジストを除去後、マイクロケム社製ＳＵ－８をスピンコーターにより厚さ４０μｍとなるよう塗布し、９５℃でベーク後、微細孔１１１ａと同じ位置をマスキングした。
（５）ＵＶ光源で露光し、現像工程（現像液：プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート）およびベーク工程により、図３に示す細胞保持手段１１４を作製した。なお位置検出部１１６と位置検出部１１７の領域は、エッチング処理でＣｒ膜は除去されているが、ＳＵ－８膜は残存したままである。ＳＵ－８は若干ではあるが自己蛍光を有しているため、検出部による蛍光検出により位置検出部を検出することができる。

　上記方法で実際に作製した細胞保持手段１１４を図８に示す。４つの位置検出部１１５ａ・１１５ｂ・１１５ｃ・１１５ｄは一辺５００μｍの四角形状（図８（Ｂ））であり、このうち、位置検出部１１５ａを座標原点（０ｍｍ，０ｍｍ）とした。その他の位置検出部の位置はそれぞれ、位置検出部１１５ｂは（５５ｍｍ，０ｍｍ）となり、位置検出部１１５ｃは（５５ｍｍ，２８ｍｍ）となり、位置検出部１１５ｄは（０ｍｍ，２８ｍｍ）となる（図８（Ａ））。

　実施例２　空間周波数分布の最大値に基づく癌細胞の検出（その１）
（１）実施例１で作製した細胞保持手段１１４（図８）に、スペーサ１１３および電極１２２を組み合わせることで、図１に記載の基板１００を作製した。
（２）作製した基板１００に設けた導入口１１３ａから白血球およびモデル癌細胞としてＰＣ９細胞（肺分化型腺癌細胞）を含む溶液を導入し、交流電圧（電圧２０Ｖｐｐ、周波数１ＭＨｚ、矩形波）を印加することで、誘電泳動力により細胞を保持部（孔径Φ３０μｍ、深さ４０μｍ）に保持させた。
（３）前記交流電圧を印加しながら、導入口１１３ａから０．０１％（ｗ／ｖ）ポリ－Ｌ－リジンを含む３００ｍＭマンニトール水溶液を導入し、３分間静置後、前記交流電圧の印加を停止し、排出口１１３ｂから前記溶液を除去した。
（４）導入口１１３ａから細胞膜透過試薬を導入し、１０分間静置することで細胞膜を透過後、排出口１１３ｂから前記溶液を除去し、導入口１１３ａからＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓａｌｉｎｅ）を導入することで収容部内に残留した細胞膜透過試薬を洗浄した。
（５）導入口１１３ａから細胞染色液（フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗サイトケラチン（ＣＫ）抗体、Ｒ－フィコエリスリン（ＰＥ）標識抗ＨＥＲ２抗体、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）標識抗ＣＤ４５抗体、ＤＡＰＩ（４’，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）をそれぞれ０．５μｇ／ｍＬ含む溶液）８００μＬを導入し、２５℃で３０分間反応させることで細胞標識後、導入口１１３ａからマンニトール水溶液を導入することで洗浄した。ＤＡＰＩ陽性、かつＣＫ陽性の細胞をＰＣ９細胞として、ＤＡＰＩ陽性、かつＣＤ４５陽性の細胞を白血球として、それぞれ検出した。
（６）電子増倍型冷却ＣＣＤ（ＥＭＣＣＤ）カメラ（フローベル社製ＡＤＴ－１００）を備えた蛍光顕微鏡（オリンパス社製ＩＸ８３）を用いて、保持部に保持された細胞由来の画像（明視野像）を撮影し、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製ＬａｂＶＩＥＷを用いて前記画像を取り込んだ（取り込み画像の一例を図９に示す）。
（７）取り込んだ画像から、細胞を保持した保持部それぞれに対してＲＯＩ（１００ピクセル×１００ピクセル：０．４０５μｍ／ピクセル）を設定して処理画像を切り出し、ＬａｂＶＩＥＷを用いて２次元ＦＦＴ（高速フーリエ変換）処理を行なうことで、計算により空間周波数分布画像を得た（空間周波数分布画像の一例を図１０に示す）。
（８）得られた空間周波数分布画像を、空間周波数のスペクトル強度（輝度）のしきい値１５で２値化処理後、ＬＡＢＶＩＥＷのＶｉｓｉｏｎ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　Ｍｏｄｕｌｅである粒子検出ｖｉを用いて、空間周波数分布の最大値を算出した。

　白血球（２０検体）およびモデル癌（ＰＣ９）細胞（２０検体）、それぞれについて空間周波数分布の最大値を算出した結果を図１１に示す。なお図１１では空間周波数分布の最大値を、２次元ＦＦＴ処理後の空間周波数分布画像における直径のピクセル値として縦軸に示している。図１１より、例えば直径３５ピクセル（半径１７．５ピクセル）（波長：２．３１４μｍ、空間周波数：０．４３２１μｍ－１）を空間周波数分布の最大値のしきい値とすることでＰＣ９細胞を白血球と区別して検出できることがわかる。

　実施例３　空間周波数分布の最大値に基づく癌細胞の検出（その２）
　実施例２（２）で基板１００に導入する細胞を、白血球ならびにモデル癌細胞としてＰＣ９細胞、ＰＣ１４細胞（肺低分化型腺癌）およびＳＢＣ３細胞（肺小細胞癌細胞）を含む溶液とした他は、実施例２と同様な方法でモデル癌細胞を検出した。結果を図１２に示す。モデル癌細胞のうちＰＣ１４細胞は、ＰＣ９細胞（実施例２）と同様、例えば、空間周波数分布の最大値（２次元ＦＦＴ処理後の空間周波数分布画像の直径）のしきい値を３５ピクセル（波長：２．３１４μｍ、空間周波数：０．４３２１μｍ－１）とすることで、白血球と区別して検出できた。一方ＳＢＣ３細胞は、白血球における空間周波数分布の最大値と一部重なる検体があり、空間周波数分布の最大値のみでは明確に白血球と区別して検出することはできなかった。

　実施例４　空間周波数分布の最大値に基づく癌細胞の検出（その３）
　実施例２および３では、空間周波数のスペクトル強度（２値化）のしきい値を１５としたときの、空間周波数分布の最大値に基づく癌細胞の検出を行なったが、２値化しきい値を変化させたときの、空間周波数分布最大値のしきい値への影響を検討した。具体的には、実施例２（６）で得られた各細胞（ＰＣ９細胞、ＳＢＣ３細胞、ＰＣ１４細胞または白血球）の空間周波数分布画像から、２値化のしきい値８から１５の条件で最大値を算出した。

　結果を表１に示す。表１の数字は、設定した空間周波数分布の最大値のしきい値における各細胞の陽性検出率（％）を表している。また表１中、モデル癌細胞の検出率７０％以上かつ白血球の偽陽性２０％以下で検出可能な条件を、黒背景白文字の領域で示している。２値化のしきい値を１０とした場合は空間周波数分布の最大値（空間周波数分布画像の直径）のしきい値を４０ピクセルから４１ピクセル（波長：１．９７６から２．０２５μｍ）までの間に、２値化のしきい値を１１とした場合は空間周波数分布の最大値のしきい値を３８ピクセルから４１ピクセル（波長：１．９７６から２．１３２μｍ）までの間に、２値化のしきい値を１２とした場合は空間周波数分布の最大値のしきい値を３５ピクセルから３９ピクセル（波長：２．０７７から２．３１４μｍ）までの間に、２値化のしきい値を１３とした場合は空間周波数分布の最大値のしきい値を３２ピクセルから３８ピクセル（波長：２．１３２から２．５３１μｍ）までの間に、２値化のしきい値を１４とした場合は空間周波数分布の最大値のしきい値を３１ピクセルから３７ピクセル（波長：２，１８９から２．６１３μｍ）までの間に、２値化のしきい値を１５とした場合は空間周波数分布の最大値のしきい値を２９ピクセルから３６ピクセル（波長：２．２５から２．７９３μｍ）までの間に、それぞれ設定すれば、モデル癌細胞の検出率７０％以上かつ白血球の偽陽性２０％以下で検出することができる。また２値化のしきい値を１２とした場合は空間周波数分布の最大値のしきい値を３５ピクセルから３７ピクセル（波長：２．１８９から２．３１４μｍ）までの間に、２値化のしきい値を１３とした場合は空間周波数分布の最大値のしきい値を３４ピクセルから３５ピクセル（波長：２．３１４から２．３８２μｍ）までの間に、２値化のしきい値を１４とした場合は空間周波数分布の最大値のしきい値を３１ピクセルから３５ピクセル（波長：２．３１４から２．６１３μｍ）までの間に、２値化のしきい値を１５とした場合は空間周波数分布の最大値のしきい値を３０ピクセルから３４ピクセル（波長：２．３８２から２．７０μｍ）までの間に、それぞれ設定すれば、モデル癌細胞の検出率８０％以上かつ白血球の偽陽性１０％以下で検出することができる。なお本例では、全てのモデル癌細胞を白血球と区別して検出できる条件は見いだせなかった。

　実施例５　低周波数領域における空間周波数分布に基づく癌細胞の検出（その１）
　実施例３および４より空間周波数分布の最大値に基づく方法では、モデル癌細胞の一部で偽陽性（または偽陰性）になるおそれがあることがわかった（図１２および表１）。そこで別の視点から空間周波数分布に基づくモデル癌細胞の検出を試みた。

　実施例２（６）で得られた各細胞（ＰＣ９細胞、ＰＣ１４細胞、ＳＢＣ３細胞または白血球）の空間周波数分布画像のうち低周波数領域、具体的には空間周波数分布画像の中心から５ピクセル（波長：８．１μｍ）から１１ピクセル（波長：３．６８μｍ）まで（図１３中、点線領域）の領域におけるスペクトル強度の積分値を算出した。結果を図１４に示す。スペクトル強度の積分値のしきい値を３４０とすることで、いずれのモデル癌細胞（ＰＣ９細胞、ＰＣ１４細胞およびＳＢＣ３細胞）も白血球と区別して検出することができた。

　実施例６　低周波数領域における空間周波数分布に基づく癌細胞の検出（その２）
　実施例５より、空間周波数分布画像の中心から５ピクセルから１１ピクセルまでの領域におけるスペクトル強度の積分値を用いることで、モデル癌細胞を白血球と区別して検出できることがわかったが、スペクトル強度の積分値の計算範囲を変えても同様な検出が行なえるか、検証した。

　実施例２（６）で得られた各細胞（ＰＣ９細胞、ＰＣ１４細胞、ＳＢＣ３細胞または白血球）の空間周波数分布画像のうち、空間周波数分布画像の中心から５ピクセル（波長：８．１μｍ）を起点に終点を６ピクセルから１４ピクセルまで１ピクセルごとに積分範囲を設定（すなわち積分範囲を１から９ピクセルまで１ピクセルごとに設定）し、各細胞のスペクトル強度の積分値をそれぞれ算出した。結果を図１５および１６に示す。なお図１５および１６において、空間周波数のスペクトル強度積分値（横軸）は、対象細胞８０個（ＰＣ９細胞、ＰＣ１４細胞、ＳＢＣ３細胞および白血球各２０個）のうち、スペクトル強度積分値が最大であった細胞の積分値を１としたときの相対値で表している。積分範囲を４ピクセル以上（本例では５ピクセルから９ピクセルまでの範囲よりも広い範囲）とすれば、モデル癌細胞を白血球と区別して検出できることがわかる（図１５（ｄ）および（ｅ）ならびに図１６）。

　実施例７　低周波数領域における空間周波数分布に基づく癌細胞の検出（その３）
　実施例６では、積分範囲を１ピクセル（５ピクセルから６ピクセルまでの範囲）から９ピクセル（５ピクセルから１４ピクセルまでの範囲）としたときの、モデル癌細胞と白血球とのスペクトル強度積分値を比較したが、さらに積分範囲を１５ピクセル（５ピクセルから２０ピクセルまでの範囲）、２５ピクセル（５ピクセルから３０ピクセルまでの範囲）、３５ピクセル（５ピクセルから４０ピクセルまでの範囲）、４５ピクセル（５ピクセルから５０ピクセルまでの範囲）および６５ピクセル（５ピクセルから７０ピクセルまでの範囲）に拡大し、同様に検討した。

　各積分領域について、スペクトル強度積分値が最大であった細胞の積分値を１としたときの、スペクトル強度積分値が最小のモデル癌細胞（ＰＣ９細胞、ＳＢＣ３細胞またはＰＣ１４細胞）の相対値とスペクトル強度積分値が最大の白血球細胞の相対値との差をプロットした図を図１７に示す。なお図１７は実施例６の結果もあわせてプロットしている。図１７より、積分範囲が４ピクセルから４５ピクセルの間であれば、スペクトル強度積分値が最小のモデル癌細胞の相対値とスペクトル強度積分値が最大の白血球細胞の相対値との差が０以上であり、モデル癌細胞を白血球と区別して検出できることがわかる。また積分範囲を５ピクセルから１５ピクセルまでの間とすると、モデル癌細胞を白血球とより区別して検出できることがわかる。

　本発明を詳細に、また特定の実施態様を参照して説明してきたが、本発明の本質と範囲を逸脱することなく様々な変更や修正を加えることには当業者にとって明らかである。

　なお、２０１５年１２月１５日に出願された日本特許出願２０１５－２４３９３９号の明細書、特許請求の範囲、図面及び要約書の全内容をここに引用し、本発明の明細書の開示として、取り入れるものである。

　１００：基板
　１１０：細胞導入保持手段
　１１１：遮光部材
　１１２：絶縁体
　１１１ａ、１１２ａ：貫通孔
　１１３：スペーサ
　１１３ａ：導入口
　１１３ｂ：排出口
　１１３ｃ：貫通部
　１１４：細胞保持手段
　１１５、１１６：位置検出部（四角マーク）
　１１７：位置検出部（十字マーク）
　１２１、１２２：電極
　１３０：導線
　１４０：信号発生器
　１５０：保持部
　２００：細胞
　２１０：目的細胞
　３１０：ベース
　３２０：基板移動部
　３３０：照射部
　３４０：検出部（対物レンズ）
　３５０：画像取り込み部（画像取得カメラ）
　３６０：解析部
　４１０：ノズル
　４２０：吸引吐出用ポンプ
　４３０：ノズル移動部
　４４０：ノズル照射部
　４５１：ノズル照射部からの光
　４５２：ノズル先端部から発せられる光
　４６０：ノズル導光部
　５００：回収チューブ
　６００：誘電泳動力
　７００：接着物質

Claims

細胞に光を照射する細胞照射手段と、細胞照射手段で照射して得られる前記細胞由来の画像を取り込む画像取り込み手段と、画像取り込み手段で取り込まれた前記画像に対して２次元フーリエ変換を行なう画像変換手段と、画像変換手段で変換された画像の空間周波数分布に基づき目的細胞を検出する画像検出手段と、を備えた細胞検出装置であって、
前記画像検出手段による目的細胞の検出を、画像変換手段で変換された画像の低周波数領域における空間周波数分布または画像変換手段で変換された画像の空間周波数分布の最大値のうち少なくともいずれか一つに基づき行なう、前記装置。
細胞に光を照射する細胞照射手段と、細胞照射手段で照射して得られる前記細胞由来の画像を取り込む画像取り込み手段と、画像取り込み手段で取り込まれた前記画像に対して２次元フーリエ変換を行なう画像変換手段と、画像変換手段で変換された画像の空間周波数分布に基づき細胞を検出する画像検出手段と、を備えた細胞検出装置であって、
前記装置に、画像取り込み手段で取り込まれた前記画像の蛍光または発光を検出する光検出手段をさらに備え、かつ目的細胞の検出を、画像検出手段における画像変換手段で変換された画像の低周波数領域における空間周波数分布または画像変換手段で変換された画像の空間周波数分布の最大値のうち少なくともいずれか一つに基づく検出結果、および光検出手段における蛍光検出または発光検出結果に基づき行なう、前記装置。
細胞に光を照射する細胞照射手段と、細胞照射手段で照射して得られる前記細胞由来の画像を取り込む画像取り込み手段と、画像取り込み手段で取り込まれた前記画像に対して２次元フーリエ変換を行なう画像変換手段と、画像変換手段で変換された画像の空間周波数分布に基づき目的細胞を検出する画像検出手段と、画像検出手段で検出した前記目的細胞をノズルによる吸引吐出により回収する回収手段と、を備えた細胞回収装置であって、
前記画像検出手段による目的細胞の検出を、画像変換手段で変換された画像の低周波数領域における空間周波数分布または画像変換手段で変換された画像の空間周波数分布の最大値のうち少なくともいずれか一つに基づき行なう、前記装置。
細胞に光を照射する細胞照射手段と、細胞照射手段で照射して得られる前記細胞由来の画像を取り込む画像取り込み手段と、画像取り込み手段で取り込まれた前記画像に対して２次元フーリエ変換を行なう画像変換手段と、画像変換手段で変換された画像の空間周波数分布に基づき細胞を検出する画像検出手段と、ノズルによる吸引吐出により細胞を回収する回収手段と、を備えた細胞回収装置であって、
前記装置に、画像取り込み手段で取り込まれた前記画像の蛍光または発光を検出する光検出手段をさらに備え、かつ回収手段で回収する目的細胞の検出を、画像検出手段における画像変換手段で変換された画像の低周波数領域における空間周波数分布または画像変換手段で変換された画像の空間周波数分布の最大値のうち少なくともいずれか一つに基づく検出結果、および光検出手段における蛍光検出または発光検出結果に基づき行なう、前記装置。
回収手段における前記ノズルの先端部が透光性材料で形成されており、かつ前記ノズルに光を照射するためのノズル照射部およびノズル照射部で照射した光を前記ノズルの先端部に導くためのノズル導光部を前記回収手段にさらに設けた、請求項３または４に記載の装置。
画像検出手段による細胞の検出を、画像変換手段で変換された画像の低周波数領域における空間周波数分布および画像変換手段で変換された画像の空間周波数分布の最大値に基づき行なう、請求項１から５のいずれか一項に記載の装置。
細胞を保持する保持部を有した細胞保持手段をさらに備え、かつ細胞照射手段が前記保持部に保持された細胞に光を照射する、請求項１から６のいずれか一項に記載の装置。
細胞照射手段から照射される光により蛍光を発する位置検出部を細胞保持手段にさらに設けた、請求項７に記載の装置。