WO2016137235A2

WO2016137235A2 - 마이크로 rna를 유효 성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물

Info

Publication number: WO2016137235A2
Application number: PCT/KR2016/001828
Authority: WO
Inventors: 이태우; 심상현; 유웅식; 박한오
Original assignee: (주)바이오니아
Priority date: 2015-02-25
Filing date: 2016-02-25
Publication date: 2016-09-01
Also published as: JP6538183B2; BR112017018318A2; RU2686313C2; RU2017132895A3; US20180030440A1; US20190218555A1; WO2016137235A3; US10351849B2; CA2977624C; US10612026B2; AU2016224201B2; WO2016137235A9; CN107454843B; KR101960067B1; KR20180054549A; JP2018507866A; CN113633656A; CA3134991A1; EP3263135A4; CN107454843A

Abstract

본 발명은 miR-3670, miR-4477a, miR-8078 로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA를 유효 성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 암 치료용 약학 조성물은 암 세포의 증식 억제 및 사멸을 유발하는 효과가 우수하다. 따라서 본 발명의 약학 조성물은 항암 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

마이크로 RNA를 유효 성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물

본 발명은 이중 가닥 miRNA를 유효 성분으로 포함하여 항암제로 사용되는 약학 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 암 세포의 증식을 효과적으로 억제하거나 암 세포의 자발적 사멸을 유도하는 방식을 특징으로 하는 miR-3670, miR-4477a, miR-8078 를 약제적 유효 성분으로 하고, 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 항암 약학 조성물에 관한 것이다.

유전자의 정상적인 제어가 이루어지지 않아 발생하는 질병, 대표적으로 암으로 통칭되는 질환에 대한 효과적이고 전통적인 치료 방법은 외과적으로 종양을 절제하여 제거하는 방법이 사용되었으나, 원발성 암이 타 기관으로 전이가 되는 경우는 외과적 수술이 불가하여 항암 약물 치료 요법이 사용되었다. 약물 치료로 사용되는 항암제는 주로 단분자 물질을 유기적 또는 무기적 방법으로 합성하여 사용하였는데, 이는 암 질환이 주로 신호 전달 체계에 포함된 인산 활성 인자 단백질의 과발현 등에 의하여 신호 체계를 교란 시키는 단백질에 효과적으로 결합하여 단백질의 활성을 억제하는 용도로 개발 되어 사용 되었다. 이러한 방식의 전통적 약물 치료법은 많은 부작용을 수반하는데, 그 중 한 가지는 약물로 사용되는 물질이 인위적으로 합성된 생체 외부 유래 물질이라는 것과 항암 물질의 작용점이 이미 과다 발현된 단백질을 목적으로 한다는 점이다.

상기 전통적인 약물 치료 방법을 대체하기 위한 약물 치료제의 개발이 여러 방면으로 진행 되었는데, 그 중 하나가 작은 간섭 RNA (small interfering RNA, 이하 siRNA 으로 표기) 의 이용이다(Iorns, E., Lord, C.J., Turner, N. & Ashworth, A. Utilizing RNA interference to enhance cancer drug discovery. Nat Rev Drug Discov 6, 556-68. 2007.). siRNA는 16에서 27사이의 뉴클레오티드로 구성된 단일 가닥 RNA 로서, 세포 내에서 리스크(RNA Induced Silencing Complex, RISC)라 알려진 리보핵산단백질 결합체 (ribonucleoprotein)의 구성 성분으로서 활동을 한다(Tomari, Y. & Zamore, P.D. Perspective: machines for RNAi. Genes Dev 19, 517-29, 2005, Chu, C.Y. & Rana, T.M. Potent RNAi by short RNA triggers. Rna 14, 1714-9, 2008, Mittal, V. Improving the efficiency of RNA interference in mammals. Nat Rev Genet 5, 355-65, 2004, Reynolds, A. et al. Rational siRNA design for RNA interference. Nat Biotechnol 22, 326-30. 2004). RISC는 RNA 효소 가위로서 기능을 하는데, 메신저 RNA (messenger RNA, 이하 mRNA 로 표기)를 절단하여 mRNA로부터 단백질이 생성되는 것을 저해한다. RISC에 포함된 siRNA는 siRNA 서열과 상보적인 서열을 갖는 mRNA와 결합하여 이중가닥 RNA를 형성하고, RISC는 RNA 효소 가위로 작용하여 목표가 되는 mRNA를 절단하여 mRNA가 더 이상 단백질을 반복 생성하는 형판 (template)으로서의 기능을 수행할 수 없도록 한다.

이처럼 siRNA 기반의 항암 치료제는 단백질 생성 단계 이전의 mRNA를 차단한다는 점, 그리고 RNA 와 세포 내재적인 RISC 시스템을 활용한다는 점에 있어서 상기 단분자 물질의 항암제보다 진보한 기술로 평가되나, siRNA 기반의 기술로도 해결하지 못하는 부작용이 있는데, 이는 비표적 효과 (off-target effect)로 불리는 현상이다(Jackson, A.L. et al. Widespread siRNA "off-target" transcript silencing mediated by seed region sequence complementarity. Rna 12, 1179-87, 2006., Jackson, A.L. et al. Position-specific chemical modification of siRNAs reduces "off-target" transcript silencing. Rna 12, 1197-205, 2006., Jackson, A.L. et al. Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi. Nat Biotechnol 21, 635-7, 2003., Nielsen, C.B. et al. Determinants of targeting by endogenous and exogenous microRNAs and siRNAs. Rna 13, 1894-910, 2007., Peek, A.S. & Behlke, M.A. Design of active small interfering RNAs. Curr Opin Mol Ther 9, 110-8, 2007.). 상기 기술한 바와 같이 siRNA 서열과 상보적으로 결합하는 mRNA를 분해하는데, siRNA 서열 전체와 상보적이지 않고 일부분만 상보적인 mRNA와도 결합하여 분해를 유발하는데 이를 표적이 아닌 mRNA의 분해를 유발한다 하여 비표적 효과라 불린다.

상기 기술된 siRNA 기반의 항암 치료제의 기술적 난점을 극복하기 위하여 마이크로 RNA (microRNA, 이하 miRNA로 표기)를 치료제로 사용하려는 연구가 진행 중이다(Agostini, M. & Knight, R.A. miR-34: from bench to bedside. Oncotarget 5, 872-81, 2014., van Rooij, E., Purcell, A.L. & Levin, A.A. Developing MicroRNA Therapeutics. Circulation Research 110, 496-507, 2012., Burnett, J.C. & Rossi, J.J. RNA-based therapeutics: current progress and future prospects. Chem Biol 19, 60-71, 2012., Dangwal, S. & Thum, T. microRNA therapeutics in cardiovascular disease models. Annu Rev Pharmacol Toxicol 54, 185-203, 2014.). miRNA는 16에서 27사이의 뉴클레오티드로 구성된 RNA로서 단백질로 번역되는 메신저 RNA(mRNA)에 대비하여 단백질 비생성 RNA(protein non-coding RNA)로 분류된다(Carthew, R.W. & Sontheimer, E.J. Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell 136, 642-55, 2009., MacFarlane, L.-A. & Murphy, P.R. MicroRNA: Biogenesis, Function and Role in Cancer. Current Genomics 11, 537-561, 2010., Bartel, D.P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell 136, 215-33, 2009.). miRNA는 고등 동식물 세포의 유전체에 기록 되어 있으며 세포의 생성, 성장, 분화, 사멸을 포함한 세포의 대사 및 기능을 조절하는데 핵심적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 현재까지 인간의 유전체에서는 2000 여종의 miRNA가 알려져 있으며 이 중 상당수의 miRNA의 기능은 아직 알려져 있지 않다.

miRNA는 유전체로부터 Pol II라 불리는 RNA 폴리머라제(polymerase)에 의해 RNA로 전사되는데, 초기 길이는 특정할 수 없이 다양하다(Carthew, R.W. & Sontheimer, E.J. Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell 136, 642-55, 2009., Brodersen, P. & Voinnet, O. Revisiting the principles of microRNA target recognition and mode of action. Nat Rev Mol Cell Biol 10, 141-148, 2009.). 이는 miRNA가 유전체에 포함된 위치의 다양성에 기인하는데, mRNA의 단백질 생성 비관여 부분인 인트론 (intron)에 위치하여 mRNA 생성 동일 시점에 전사되는 경우 및 유전체상에서 유전자간 빈 공간 (inter-genic region)에 위치하여 독자적으로 전사되는 경우 등 다양한 방식으로 생성되기 때문이다(Malone, C.D. & Hannon, G.J. Small RNAs as guardians of the genome. Cell 136, 656-68, 2009.). 이와 같이 초기에 생성된 miRNA 모체를 일차 miR(primary microRNA)라 하는데, 일차 miR는 핵 속의 드로셔(Drosha)라 불리는 RNA 절단 효소(RNase) 등에 의하여 전구체 miR(precursor miRNA, pre-miR) 로 편집된다(Bartel, D.P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell 136, 215-33, 2009.). Pre-miR는 RNA 헤어핀 구조(RNA hair-pin structure)를 이루며 대략 70-80 개의 뉴클레오티드로 구성된다. 세포 핵 내부의 Pre-miR는 exportin 단백질 등에 의해 핵에서 세포질로 이동되며, 세포질 내에서 다이서(Dicer)라 불리는 또 다른 RNA 절단 효소(RNase)에 의하여 이차 가공이 되어 16-27 개의 뉴클레오티드로 구성되는 이중 가닥의 성숙 miR(mature microRNA, 이하 다른 수식어 없이 miR 로 기술하는 경우는 성숙 miR를 의미함)를 생성한다. 이중 가닥 miR 중 한 가닥의 RNA 가 선택적으로 선정되어 상기 리보핵산단백질 결합체(ribonucleoprotein comple)인 RISC와 결합하여 활성을 가지게 되고, miR의 서열을 이용하여 목표 mRNA와 결합한다.

일반적으로 mRNA는 단백질 생성 관여 여부를 기준으로 크게 세 부분으로 나눌 수 있는데, 단백질 번역 정보를 담고 있는 코딩 부분(coding region)과 코딩 부분의 각각 5’ 과 3’ 부분으로서 단백질 번역 정보를 가지지 않는 5’-UTR(Un-Translated Region)과 3’-UTR로 구분할 수 있다. mRNA와의 상보적 서열을 이용, 목표 mRNA의 분해를 유발하는 siRNA는 mRNA 의 5’-, 3’-UTR 및 코딩 부분에 상관 없이 작용을 하는 반면, miR는 주로 3’-UTR과 결합을 한다((Carthew, R.W. & Sontheimer, E.J. Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell 136, 642-55, 2009., Bartel, D.P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell 136, 215-33, 2009.).

mRNA와의 결합 위치 차이와 더불어 siRNA와 다른 miRNA의 독특한 특징은 siRNA는 siRNA 전체 서열과 상보적인 서열을 포함한 mRNA와 주로 결합하는 반면, miRNA는 miRNA의 5’ 끝으로부터 2-8 뉴클레오티드 자리에 위치한, 한정된 크기의 씨앗부분(seed region)서열이 주로 목표 mRNA 인식에 사용되는 점이 다르며, 따라서 전체 miRNA의 서열이 목표 유전자와 완벽한 상보적인 서열을 가지지 않고 일정 부분 비상보적 서열이 포함되어도 miRNA 활성에 영향을 주지 않는다(Bartel, D.P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell 136, 215-33, 2009.). 씨앗 부분의 서열 크기가 6-8 뉴클레오티드인 만큼 이와 상보적인 서열을 3’ UTR에 가지는 mRNA 종류는 다양하며, 이러한 이유로 한 종의 miRNA로 여러 종의 mRNA를 동시에 제어할 수 있다. 이러한 miRNA의 성질은 miRNA가 세포의 분열, 성장, 분화, 사멸에 이르는 많은 부분의 세포 생리학적 측면의 제어에 관여하는 효율적인 조절인자(regulator)로서의 기능을 부과한다. 또한, 조절인자로서의 miRNA 의 기능은 효과적인 항암 효과를 구현하는데 장점으로서 작용하는데, siRNA 의 경우 단일 유전자 발현의 억제를 목표로 하는데 반하여, miRNA 는 암 유발 유전자 다수의 발현을 동시에 저해할 수 있기 때문이다.

많은 수의 mRNA가 3’ UTR에 한 종 이상의 miRNA가 결합할 가능성이 있는 부분을 포함하고 있으며, 한 생물정보학적인 계산에 따르면 전체 mRNA의 대략 30%가 miRNA에 의해 단백질 생성이 조절되고 있는 것으로 알려져 있다.

miRNA의 이러한 신호 전달 체계 내의 주요 조절인자로 작용하는 사실은 암을 포함한 주요 질환에서도 중요한 역할을 수행한다는 점에서 알 수 있다(MacFarlane, L.-A. & Murphy, P.R. MicroRNA: Biogenesis, Function and Role in Cancer. Current Genomics 11, 537-561. 2010., Malone, C.D. & Hannon, G.J. Small RNAs as guardians of the genome. Cell 136, 656-68. 2009., Nicoloso, M.S., Spizzo, R., Shimizu, M., Rossi, S. & Calin, G.A. MicroRNAs--the micro steering wheel of tumour metastases. Nat Rev Cancer 9, 293-302. 2009., Landi, D., Gemignani, F. & Landi, S. Role of variations within microRNA-binding sites in cancer. Mutagenesis 27, 205-10. 2012.). 실제로 여러 연구를 통하여 암 세포에서의 miRNA들의 발현 양식은 정상 세포에서의 발현 양식과 큰 차이를 보이는 것이 드러났다. 뿐만 아니라 암이 발생한 원발 장기에 따라서도 miRNA 발현 양식이 큰 차이가 있는데 폐암, 간암, 피부암, 혈액암 등 다양한 암들이 원발 장기에 따른 독특한 miRNA 발현 양식을 보이고, 이를 통하여 miRNA가 암 생물학에 있어 주요한 역할을 한다는 것이 알려져 있다. 특히, 암 종에서 발현되는 miRNA들이 그들의 정상 세포에서의 발현양에 대비하여 일반적으로 낮은 것이 알려져 있다.

상기 암에 있어서의 miRNA의 깊은 연관성을 바탕으로 miRNA를 항암 치료제로 이용하려는 시도가 최근에 시작되었으며, 그 일례로 miR-34a라 명명된 miRNA의 암 세포 증식 억제 및 사멸 유도 능력을 검증하기 위한 임상 실험 중에 있다(Wiggins, J.F. et al. Development of a lung cancer therapeutic based on the tumor suppressor microRNA-34. Cancer Res 70, 5923-30. 2010., Bader, A.G. et al. miR-34 Regulated Genes and Pathways as Targets for Therapeutic Intervention. Google Patents, 2009., Hermeking, H. The miR-34 family in cancer and apoptosis. Cell Death Differ 17, 193-9. 2010., Chang, T.C. et al. Transactivation of miR-34a by p53 broadly influences gene expression and promotes apoptosis. Mol Cell 26, 745-52. 2007.).

이에 본 발명자들은 임상 실험 중인 miR-34a의 암 세포 증식 억제 및 암 세포 사멸 유도 능력 보다 효능이 뛰어난 miRNA를 발굴하고자 노력한 결과, 항암 효능이 뛰어난 miR-3670, miR-4477a, miR-8078 를 발굴하고, 이들 miRNA 들이 암 유발 유전자로 알려진 다수의 유전자 발현을 효과적 차단함으로써 항암 효과를 달성하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

발명의 요약

본 발명의 목적은 암 세포 증식 억제 및 암 세포 사멸 유도 능력이 뛰어난 miRNA 를 발굴하고 이를 유효 성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 miR-3670, miR-4477a, miR-8078 로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA를 유효 성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물을 제공한다.

도 1은 스크리닝 라이브러리 제작에 포함된 miRNA의 활성 여부를 측정하기 위하여 전체 스크리닝 라이브러리에서 대표적으로 miR-34a, miR-100 및 miR-125b를 선정하고 이들에 의해 발현이 저해된다고 알려진 각각의 mRNA 3’UTR을 루시퍼아제 (luciferase) 발현 벡터의 3’UTR 에 삽입하여 miR-34a, miR-100 및 miR-125b에 의한 단백질 발현 저해능을 확인한 것이다.

도 2는 1700 여종의 miRNA로 구성된 스크리닝 라이브러리를 NCI-H460 폐암 세포주에 처리하여 세포 성장을 레사주린(Resazurin) 시약을 사용하여 정량하고, 이를 상대적인 성장값으로 환산하여 나타낸 것이다.

도 3은 NCI-H460 세포주에서 우수한 효능을 보인 50 여종의 miRNA를 선별하고 이를 사용하여 상대적 암 세포 성장 저해 능력을 WST-1 시약으로 측정하여 나타낸 것이다.

도 4는 폐암 세포주에서의 세포 사멸 효과를 측정하기 위하여 miR-34a, miR-3670, miR-8078, miR-4477a 를 트랜스펙션 방식으로 세포내로 주입한 후 세포의 사멸 정도를 FITC 염료로 표지된 아넥신 V 로 염색하여 유세포분석기로 분석한 결과이다.

도 5는 폐암 세포주에 각 miRNA 를 트랜스펙션 방식으로 주입하고 소프트 아가 위에서 2 주간 배양하여 miRNA 의 영향에 따른 폐암 세포주의 군집 형성 능력을 측정한 것이다.

도 6은 miRNA 타겟 예측 소프트웨어인 타겟스캔을 사용하여 타겟 후보군을 선정하고, 이들을 타겟으로 하는 siRNA 를 사용하여 세포 내의 함량을 저해시킬 경우의 세포 사멸 능력을 Z-score 로 표시한 것이다.

도 7은 도 6에서 확인된 유전자들의 발현량이 miRNA 에 의하여 저해되는 정도를 qPCR 분석으로 나타낸 것이다.

도 8은 도 6에서 확인된 유전자들의 3’ UTR 을 루시퍼아제의 3’ UTR 에 클로닝하여 miRNA 에 의한 루시퍼아제 단백질의 발현 저해 정도를 표시한 것이다.

발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명에서는 항암 효과가 있다고 알려진 miR-34a보다 효능이 뛰어난 miRNA를 발굴하고, 이의 항암 효과를 확인하고자 하였다.

본 발명에서는 1700 여종의 miRNA 스크리닝 라이브러리를 합성하였고( 표 1), 이를 NCI-H460(폐암 세포주)에 처리하여, 암 세포 성장 억제능을 측정하여, miR-34a 보다 효능이 뛰어난, 하기의 염기 서열을 갖는 miR-3670, miR-4477a, miR-8078 를 발굴하고( 표 3), 이들의 항암 효능이 뛰어남을 확인하였다(도 4 내지 도 8).

따라서 본 발명은 miR-3670, miR-4477a, miR-8078로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA를 유효 성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 miR-3670 는 서열 번호 35와 서열 번호 36 또는 서열 번호 67의 염기 서열로 이루어진 이중 가닥 RNA 을 유효 성분으로 포함되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 miR-4477a 는 서열 번호 43과 서열 번호 44 또는 서열 번호 68 의 염기 서열로 이루어진 이중 가닥 RNA 을 유효 성분으로 포함되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 miR-8078 는 서열 번호 65와 서열 번호 66 또는 서열 번호 69 의 염기 서열로 이루어진 이중 가닥 RNA 을 유효 성분으로 포함되는 것을 특징으로 할 수 있다.

즉, 본 발명의 miR-3670 주형 가닥은 서열번호 35로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.

5’- AGAGCUCACAGCUGUCCUUCUCUA - 3’(MIMAT0018093. 서열번호 35)

생체내에서 궁극적으로 활성을 보이는 miRNA 는 단일 가닥이지만, RISC 에 결합하기 위하여서는 유사한 염기 크기를 갖는 염기 서열과 함께 이중 가닥 형태로 세포내에 공급되어야 한다. 이때, 상기 서열과 결합하는 반대 서열 (antisense) 는 활성 서열과 상보적인 서열을 가진다. 상보적인 서열은 완벽 상보 서열 (perfect complementary sequence) 를 가지거나, 또는 생체 내재적인 서열 (endogenous sequence ) 을 사용할 수 있다. 이중 가닥으로 구성된 각 서열 모두, 혹은 한 쪽 가닥의 3’ 에 위치한 염기는 상대 서열과의 염기 결합을 가지지 않을 수 있는데, 이를 3’ 오버행 (overhang) 이라 하며 이를 포함할 수 있다.

즉, miR-3670 의 완벽 상보 서열 (perfect complementary sequence)은 서열번호 36으로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.

5’ - GAGAAGGACAGCUGUGAGCUCUUU - 3’ (서열번호 36)

또한, miR-3670 의 내재적 상보 서열 (endogenous complementary sequence)은 서열번호 67로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.

5’- GACUGGUAUAGCUGCUUUUGGAGCCUCA - 3’ (서열번호 67)

상기 배경 기술에서 기술한 바와 같이 miRNA 활성 서열의 두 번째 염기로부터 8-9 번째 염기까지 해당하는 씨앗 서열 (seed region) 이 활성의 주요한 인자인데, 이중 가닥 RNA 를 제조할 때 이를 포함하는 긴 이중 가닥을 제조하여 사용할 수도 있다.

miR-3670 과 마찬가지로 miR-4477a 및 miR-8078 의 활성 서열 및 이들과 이중 가닥을 이루기 위한 상보 서열은 아래에 기재된 바와 같이 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다. 이들 이중 가닥도 전술한 바와 같이 3’ 오버행을 포함하여 이중 가닥을 구성할 수 있으며, 또한 씨앗 지역 (seed region) 을 포함한 긴 서열의 이중 가닥을 구성하여 사용할 수 있다.

miR-4477a

5’ - CUAUUAAGGACAUUUGUGAUUC -3’ (MIMAT0019004 서열번호 43)

miR-4477a 의 완벽 상보 서열 (perfect complementary sequence)

5’- AUCACAAAUGUCCUUAAUAGUU -3’ (서열번호 44)

miR-4477a 의 내재 상보 서열 (endogenous complementary sequence)

5’- AUCACAAAUGUCCUUAAUGGCA -3’ (서열번호 68)

miR-8078

5’- GGUCUAGGCCCGGUGAGAGACUC (MIMAT0031005, 서열번호 65)

miR-8078 의 완벽 상보 서열 (perfect complementary sequence)

5’- GUCUCUCACCGGGCCUAGACCUU (서열번호 66)

miR-8078 의 내재 상보 서열 (endogenous complementary sequence)

5’- CUCCACCGGGCUGACCGGCCUG -3’ (서열번호 69)

본 발명에서 라이브러리 스크린을 통하여 발굴된 상기 miRNA 는 암의 유발, 생성 및 성장에 주요한 역할을 하는 것으로 통상적으로 알려진 유전자를 제어함으로써 항암 효능을 발생시키는 것을 확인하였다. 한 종의 miRNA 가 다수의 mRNA 발현을 동시에 제어 할 수 있는 것이 miRNA 의 특징인데, 이러한 성질은 본 발명에서도 확인 되었으며, 올리고 기반의 항암 신약 개발에 유용한 성질이다.

본 발명의 miR-3670 은 CBX4, NRAS, CASR, TXLNA, SNIP1, HNF1A, FZD4, TRIB1, ADMA19, CKAP5 의 발현을 동시에 억제하고, miR-8078 은 GREB1, HECTD3, RIPK4 의 발현을 억제하며, miR-4477a 는 STIL, KIF11, AKAP11, FAM120A 의 발현을 동시에 억제함을 확인하였다(도 6).

본 발명의 miRNA가 억제하는 타겟 유전자들은 하기와 같은 기능을 하는 것으로알려져 있다.

CBX4 (polycomb chromobox 4) 는 종양의 혈관 생성 및 종양의 전이 촉진에 관여하며 NRAS 는 종양의 성장 및 세포 분열에 주요한 역할을 수행한다고 알려져 있다(Orouji, E. et al. MAP Kinase pathway gene copy alterations in NRAS/BRAF wild-type advanced melanoma. Int J Cancer (2015); Zheng, C. et al. MicroRNA-195 functions as a tumor suppressor by inhibiting CBX4 in hepatocellular carcinoma. Oncol Rep 33, 1115-22 (2015); Jiao, H.K. et al. Prognostic significance of Cbx4 expression and its beneficial effect for transarterial chemoembolization in hepatocellular carcinoma. Cell Death Dis 6, e1689 (2015); Ohashi, K. et al. Characteristics of lung cancers harboring NRAS mutations. Clin Cancer Res 19, 2584-91 (2013)).

CASR 은 종양에서 과다 발현되는 것이 발견되고 종양의 전이에 필요하며, TXLNA 는 종양의 성장 및 전이에 관련된 것으로 알려져 있는데 발현률이 높은 환자군의 생존율이 낮다는 임상 결과가 발표되었다(Mashidori, T., Shirataki, H., Kamai, T., Nakamura, F. & Yoshida, K. Increased alpha-taxilin protein expression is associated with the metastatic and invasive potential of renal cell cancer. Biomed Res 32, 103-10 (2011); Tennakoon, S., Aggarwal, A. & Kallay, E. The calcium-sensing receptor and the hallmarks of cancer. Biochim Biophys Acta (2015); Ohtomo, N. et al. Expression of alpha-taxilin in hepatocellular carcinoma correlates with growth activity and malignant potential of the tumor. Int J Oncol 37, 1417-23 (2010)).

전사 공동 활성 인자 (transcriptional coactivator) 로 알려진 SNIP1 은 세포의 성장 및 분열에 필수적인 cyclin D1 의 발현을 촉진시키는데 SNIP1 의 발현량이 높은 환자군의 항암 예후가 좋지 않다는 것이 알려져 있다. 또한, 세포 증식의 주요 조절자로서의 역할을 하는 c-Myc 과 결합하여 종양 성장을 촉진하는 역할을 한다고 알려져 있다(Li, Q. et al. SNIP1: a new activator of HSE signaling pathway. Mol Cell Biochem 362, 1-6 (2012); Fujii, M. et al. SNIP1 is a candidate modifier of the transcriptional activity of c-Myc on E box-dependent target genes. Mol Cell 24, 771-83 (2006); Roche, K.C., Rocha, S., Bracken, C.P. & Perkins, N.D. Regulation of ATR-dependent pathways by the FHA domain containing protein SNIP1. Oncogene 26, 4523-30 (2007); Jeon, H.S. et al. High expression of SNIP1 correlates with poor prognosis in non-small cell lung cancer and SNIP1 interferes with the recruitment of HDAC1 to RB in vitro. Lung Cancer 82, 24-30 (2013); Liang, X. et al. Hypoxia-inducible factor-1 alpha, in association with TWIST2 and SNIP1, is a critical prognostic factor in patients with tongue squamous cell carcinoma. Oral Oncol 47, 92-7 (2011))

HNF1A 와 FZD4 는 종양의 성장 및 생존에 깊이 관여하는 Wnt 신호 전달 체계의 구성 인자이며 Wnt 신호 전달 체계는 종양 생물학에서 집중적으로 연구되어 그 중요성이 널리 알려져 있다. TRIB1 은 종양 세포의 성장, 전이 및 세포의 자살 억제 역할이 알려져 있으며 이는 종양 성장의 주된 신호 전달 체계의 하나인 MAPK 신호 전달 체계를 조절하는 인자로 알려져 있다(Pecina-Slaus, N. et al. Wnt signaling transcription factors TCF-1 and LEF-1 are upregulated in malignant astrocytic brain tumors. Histol Histopathol 29, 1557-64 (2014); Ueno, K. et al. Tumor suppressor microRNA-493 decreases cell motility and migration ability in human bladder cancer cells by downregulating RhoC and FZD4. Mol Cancer Ther 11, 244-53 (2012); Lin, Z.Y. et al. MicroRNA-224 inhibits progression of human prostate cancer by downregulating TRIB1. Int J Cancer 135, 541-50 (2014); Soubeyrand, S., Naing, T., Martinuk, A. & McPherson, R. ERK1/2 regulates hepatocyte Trib1 in response to mitochondrial dysfunction. Biochim Biophys Acta 1833, 3405-14 (2013)).

ADAM19 은 세포막에 분포하여 있는 단백질로서 세포-세포간 접촉과 세포-세포외 매트릭스와의 접촉을 포함한 생물학적 다양한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있는데 종양 생물학에서는 종양의 성장 및 전이와 깊은 연관이 있는 것으로 알려져 있다. 유전자 기능적 스크린을 통하여 종양의 생존에 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려진 CKAP5 유전자도 상기 miRNA 에 의하여 제어되는 것으로 본 발명을 통하여 밝혀졌으며, GREB1 은 호르몬에 반응하는 조직 또는 종양의 신호 전달 체계와 관련이 있는 유전자로서 다양한 종류의 종양에서 과다 발현하여 세포의 성장을 촉진시킨다고 알려져 있다(Zhang, Q. et al. Role of microRNA-30c targeting ADAM19 in colorectal cancer. PLoS One 10, e0120698 (2015); Shan, N., Shen, L., Wang, J., He, D. & Duan, C. MiR-153 inhibits migration and invasion of human non-small-cell lung cancer by targetin;g ADAM19. Biochem Biophys Res Commun 456, 385-91 (2015); Martens-de Kemp, S.R. et al. Functional genetic screens identify genes essential for tumor cell survival in head and neck and lung cancer. Clin Cancer Res 19, 1994-2003 (2013); Rae, J.M. et al. GREB1 is a novel androgen-regulated gene required for prostate cancer growth. Prostate 66, 886-94 (2006); Zhang, L. et al. Development of transcriptomic biomarker signature in human saliva to detect lung cancer. Cell Mol Life Sci 69, 3341-50 (2012); Laviolette, L.A., Hodgkinson, K.M., Minhas, N., Perez-Iratxeta, C. & Vanderhyden, B.C. 17beta-estradiol upregulates GREB1 and accelerates ovarian tumor progression in vivo. Int J Cancer 135, 1072-84 (2014)).

HECTD3 는 E3 유비퀴틴 리가제 (E3 ubiquitin ligase) 로서 세포의 자살을 촉발하는 캐스파제-8 (caspase-8) 에 폴리유비퀴틴을 부착하여 캐스파제-8 의 분해를 유도함으로써 종양의 사멸을 억제하는 한편, MALT1 단백질을 안정화시켜 시스플라틴 (cisplatin) 항암제에 대한 약물 저항성을 증대 시키는 것으로 알려져 있다. RIPK4 는 수용체 반응 단백질 키나제 4 (receptor-interactin protein kinase 4) 로서 세포 성장 신호 인자인 베타-카테닌 (β-catennin) 의 축적을 유발함과 동시에 Wnt 신호 전달 체계를 활성화하는 것으로 보고되어 있다. RIPK4 의 인위적 제거를 통하여 종양 동물 모델에서의 종양의 성장을 억제할 수 있음이 밝혀져 있다(Li, Y. et al. The HECTD3 E3 ubiquitin ligase facilitates cancer cell survival by promoting K63-linked polyubiquitination of caspase-8. Cell Death Dis 4, e935 (2013); Li, Y. et al. The HECTD3 E3 ubiquitin ligase suppresses cisplatin-induced apoptosis via stabilizing MALT1. Neoplasia 15, 39-48 (2013); Huang, X. et al. Phosphorylation of Dishevelled by protein kinase RIPK4 regulates Wnt signaling. Science 339, 1441-5 (2013)).

세포 주기 순환 중 G2 상 (phase) 에서 M 상(phase) 로의 전이 과정 중 필수적인 요소로서의 STIL 유전자는 다양한 종류의 암 종에서 발현율이 높은 것으로 관측되며, 종양 증식과 생존에 필요한 것으로 알려져 있다. KIF11 또한 종양 세포의 성장 및 전이에 필요한 요소 중 하나로 보고 되어 있으며 KIF11 의 활동을 저해함으로써 종양의 성장을 억제할 수 있다고 알려져 있다(Erez, A. et al. Sil overexpression in lung cancer characterizes tumors with increased mitotic activity. Oncogene 23, 5371-7 (2004); Erez, A. et al. The SIL gene is essential for mitotic entry and survival of cancer cells. Cancer Res 67, 4022-7 (2007); Tang, Y., Orth, J.D., Xie, T. & Mitchison, T.J. Rapid induction of apoptosis during Kinesin-5 inhibitor-induced mitotic arrest in HL60 cells. Cancer Lett 310, 15-24 (2011); Venere, M. et al. The mitotic kinesin KIF11 is a driver of invasion, proliferation, and self-renewal in glioblastoma. Sci Transl Med 7, 304ra143 (2015)).

단백질 키나제 A (PKA) 와 결합하여 PKA 의 활성을 증가시키는 AKAP11 는 GSK-3beta 와도 동시에 결합하여 PKA 에 의한 GSK-3beta 의 인산화 작용을 촉진 시킨다. 인산화 GSK-3beta 는 활성을 잃게 되는데, 이는 세포에서 성장을 촉진시키는 신호로 인식되어 종양의 성장을 유발하는 주요 기전 중의 하나이다. 종양 세포들은 산성 조건, 산소 결핍 조건 등의 다양한 스트레스 조건에 노출되는데, 이러한 가호한 조건 속에서도 종양 세포의 사멸을 억제하는 기전을 유지하고 있다. 그 하나로서 RNA 결합 단백질인 FAM120A 는 Src 등의 키나제 (Kinase) 를 활성화시켜 세포의 사멸 억제 및 약물에 대한 저항성을 증가시키는 것으로 알려져 있다(Logue, J.S. et al. AKAP220 protein organizes signaling elements that impact cell migration. J Biol Chem 286, 39269-81 (2011); Whiting, J.L. et al. Protein Kinase A Opposes the Phosphorylation-dependent Recruitment of Glycogen Synthase Kinase 3beta to A-kinase Anchoring Protein 220. J Biol Chem 290, 19445-57 (2015); Tanji, C. et al. A-kinase anchoring protein AKAP220 binds to glycogen synthase kinase-3beta (GSK-3beta ) and mediates protein kinase A-dependent inhibition of GSK-3beta. J Biol Chem 277, 36955-61 (2002); Tanaka, M. et al. A novel RNA-binding protein, Ossa/C9orf10, regulates activity of Src kinases to protect cells from oxidative stress-induced apoptosis. Mol Cell Biol 29, 402-13 (2009); Bartolome, R.A. et al. IL13 Receptor alpha2 Signaling Requires a Scaffold Protein, FAM120A, to Activate the FAK and PI3K Pathways in Colon Cancer Metastasis. Cancer Res 75, 2434-44 (2015)).

본 발명에서는 상기 유전자들을 siRNA 를 사용하여 세포내 함량을 저하시키면 miR-3670, miR4477a, miR-8078 을 사용하는 경우와 마찬가지로 세포의 성장이 저하되는 것을 확인하였으며(도 6), miR-3670, miR-4477a, miR-8078 을 폐암 세포내로 전달하는 경우, 상기 유전자들의 mRNA 발현이 저하되는 것을 모두 qPCR 결과로서 확인하였다(도 7). 또한, 상기 유전자들이 miR-3670, miR-4477a, miR-8078 의 직접적인 타겟임을 루시퍼아제 결과로서 확인하였다(도 8). 이러한 사실은 miR-3670, miR-4477a, miR-8078 이 종양 세포의 성장 및 생존에 중요한 여러 유전자를 직접적인 방식으로 발현을 동시에 억제함으로써 종양 세포의 사멸을 유도한다는 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 암은 폐암, 간암, 위암, 대장암, 췌장암, 담낭 및 담도암, 유방암, 백혈병, 식도암, 비호치킨 림프종, 갑상선암, 자궁경부암, 피부암의 원발성 암과 이로부터 기타 장기로 전이되어 유발되는 전이암 및 비정상적인 과다 세포 분열을 촉진하여 생성되는 종양성 세포 질환으로 구성되는 군으로부터 선택된 1종 이상의 암인 것을 특징으로 하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서 제공하는 암 치료용 약학 조성물의 유효성분으로서 사용 가능한 miRNA 서열은 인간 유전체 유래의 서열이나, miRNA의 유래 유전체를 인간 유전체로 한정하지 않고 다른 동물 유래 유전체부터 구해진 miRNA 서열 역시 사용할 수 있다.

본 발명에서 miRNA는 miRNA의 생물학적 등가 효능을 발생시키는 다양한 miRNA 유도체(miRNA mimic)의 형태로 사용할 수 있는데, 동일한 씨앗 부분 (seed region)을 포함하는 miRNA 서열을 포함하는 변형된 miRNA를 사용할 수 있다. 이 때 서열 1 또는 서열 2의 길이를 줄일 수 있는데, 길이가 15개 의 뉴클레오티드로 구성된 짧은 유도체 사용도 가능하다.

본 발명에서 상기 miRNA에 대한 miRNA 유도체로서는 RNA 인산 뼈대 구조 (phosphate backbone structure)를 황 등의 다른 원소로 치환한 형태인 포스포로사이오에이트 (phosphorothiolate) 구조를 부분적으로 포함할 수 있으며, RNA 대신 DNA, PNA(petide nucleic acids) 및 LNA(locked nucleic acid) 분자로의 전체 또는 부분적으로 치환한 형태로 사용 가능하고, 또한, RNA 당의 2’수산화기를 다양한 기능성 구조로 치환한 형태로 사용이 가능한데, 이는 메틸화, 메톡시화, 플르오르화 등을 포함하나 이러한 변형에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 miRNA는 성숙 miRNA(mature miRNA)와 이로부터 유도된 상기 miRNA 유도체의 이중 가닥 RNA에 한정하는 것이 아니고, miRNA 전구체의 형태로 사용될 수 있으며, miRNA 전구체 또한 상기 기술된 RNA 인산 뼈대 구조, RNA 핵산의 DNA, PNA 및 LNA 등으로의 부분 또는 전체 치환, RNA 당 분자의 2’수산화기의 변형이 가능하다.

본 발명에서 miRNA는 miRNA 전구체 또는 일차 miRNA (pri-miRNA) 형태로 사용 가능한데 이를 화학적인 방법으로 합성하거나 또는 플라스미드 (plasmid)의 형태로 세포로 전달하여 발현하는 것이 가능하다.

본 발명에 있어서, miRNA를 배양 접시에서 배양한 세포로 전달하는 방법은 양이온성 지질과의 혼합물 사용하는 방법, 전기적인 자극으로 전달하는 방법 및 바이러스를 이용하는 방법등을 사용할 수 있으나 이러한 방법에 제한을 두는 것은 아니다.

본 발명의 상기 miRNA를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 함체와 함께 제제화 될 수 있다.

본 발명에서 용어, "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

본 발명의 상기 miRNA 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물은 이를 유효성분으로 포함하는 어떠한 제형으로도 적용가능하며, 경구용 또는 비경구용 제형으로 제조할 수 있다. 본 발명의 약학적 제형은 구강(oral), 직장(rectal), 비강(nasal), 국소(topical; 볼 및 혀 밑을 포함), 피하, 질(vaginal) 또는 비경구(parenteral; 근육내, 피하 및 정맥내를 포함) 투여에 적당한 것 또는 흡입 (inhalation) 또는 주입(insufflation)에 의한 투여에 적당한 형태를 포함한다.

본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 경구 투여용 제형으로는, 예를 들어 정제, 트로키제, 로렌지, 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제로 제제화할 수 있다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제, 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제, 스테아르산 마스네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유를 포함할 수 있으며, 캡슐제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 더 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 비경구 투여용 제형으로는, 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사 등의 주사용 형태, 좌제 주입방식 또는 호흡기를 통하여 흡입이 가능하도록 하는 에어로졸제 등 스프레이용으로 제제화할 수 있다. 주사용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다. 좌제로 주입하기 위해서는, 코코아버터 또는 다른 글리세라이드 등 통상의 좌약 베이스를 포함하는 좌약 또는 관장제와 같은 직장투여용 조성물로 제제화할 수 있다. 에어로졸제 등의 스프레이용으로 제형화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: miRNA 스크리닝 라이브러리 제작

miRNA 데이터베이스인 miRBase (www.mirbase.org) 에서 제공하는 21 버전의 인간 miRNA 서열로서 줄기고리 구조 (stem-loop structure) 기준으로 1700 여종의 miRNA 스크리닝 라이브러리를 통상의 올리고 합성에 사용되는 고체 합성법으로 두 가닥 서열의 miRNA 합성하였다. 합성된 miRNA 각 가닥은 C18 수지를 사용하여 역상 분리 방식 (reverse phase separation) 으로 정제하였다. 합성된 모든 miRNA 가닥은 MALDI-TOF 방식의 질량 분석기를 사용하여 의도한 서열의 합성 여부를 판별 및 확인하였다. 이중 가닥의 miRNA를 제조하기 위하여 상응하는 상보 가닥을 염 존재하에서 95℃ 2분간 가열 후 서서히 냉각하여 이중 가닥을 결합시켰다.

실시예 2: miRNA 라이브러리 표본의 활성 측정

실시예 1에서 합성한 miRNA 이중 가닥의 활성 여부를 측정하기 위하여 1700 여종의 miRNA 스크리닝 라이브러리로부터 선별적으로 miR-34a, miR-100, miR-125b 를 선택하였다. 선별된 miRNA 는 기 수행된 많은 연구로부터 기능 및 발현을 제어하는 목표 mRNA 종류 및 각 mRNA 3’UTR 에 결합하는 결합 구역 등에 관한 연구가 많이 진행되어 있는 관계로 선택하였다. miR-34a, miR-100, miR-125b 각각에 의하여 발현이 제어되는 것으로 널리 알려진 Bcl2, mTOR, Lin28b mRNA 의 3’ UTR 부분을 파이어플라이 루시퍼아제 벡터 (firefly luciferase vector) 의 3’ UTR 에 치환하여 각 miRNA 에 상응하는 벡터를 제작하였다. 각 벡터와 miR 대조군, 또는 각 벡터에 상응하는 miR-34a, miR-100, miR-125b 를 올리고의 세포 내 전달 시약인 리포펙타민 2000(Lipofectamine 2000, Invitrogen)을 사용하여 HEK-293T 세포주에 co-transfection 하고 (세 반복 시료 제작), 37°C, 5% (v/v) 이산화탄소 조건에서 24 시간 배양하였다. 루시퍼아제의 활성은 Luminometer(Thermo scientific)를 사용하여 측정하여 합성된 miRNA의 활성을 확인하였다(도 1).

실시예 3: 폐암 세포주의 증식 억제 유발 마이크로 RNA 발굴을 위한 스크리닝

96-well plate 에 3,000 - 10,000 개의 NCI-H460 세포주를 분주하여 24시간 동안 37℃, 5% (v/v) 이산화탄소 조건에서 배양한 후, miRNA 라이브러리의 각 miRNA 를 RNAiMAX 시약(Invitrogen)을 사용하여 최종 농도가 100nM 이 되도록 transfection을 진행하였다. 각 miRNA는 3회 반복하여 transfection을 진행하였기 때문에, 96-well plate에 보관된 miRNA 라이브러리 한 개의 plate 당 세 개의 실험 96-well plate를 준비한 것이다. 이를 상기 세포 배양 조건과 동일한 조건에서 24시간 더 배양한 후 레사주린 (Resazurin) 시약(Promega)을 첨가하여 발생하는 형광 값을 형광 측정기 (Fluoremeter, Tecan)를 사용하여 측정하였다. 각 miRNA에 의한 세포 증식 억제 능력을 상대적으로 비교 평가 하기 위하여, 96-well plate에서 측정된 96개 값의 평균값과 표준 편차를 구하고, 평균값으로부터 각 miRNA가 포함된 well 에서의 측정값이 몇 표준 편차 배수만큼 떨어져 있는지를 (Z-score) 아래의 공식에 대입하여 계산하였다.

이 때, x_i 는 각 well 의 측정값이고, μ는 plate 의 전체 well 측정값의 평균값이고, σ는 표준 편차이다. 각 well의 표준 편차 배수 z_i는 3회 반복 plate에서 얻어진 평균값으로 이를 통하여 z 값이 -2 보다 작은 값을 보이는 50 여개의 1차 후보 miRNA를 선정하였다(도 2, 표 2).

실시예 4: 폐암 세포주의 증식 억제 효능의 miRNA 발굴을 위한 2차 스크리닝

1차 스크리닝에서 얻어진 50 여개의 miRNA 후보군을 사용하여 측정 정밀도를 향상시켜 2차 스크리닝을 진행하였다. 실험 조건은 1차 스크리닝 조건과 동일하게 진행하였으며, 다른 점은 세포의 증식 능력을 측정하기 위한 시약으로 레사주린 대신 WST-1 시약(Roche)을 이용하였다. WST-1 이 레사주린에 비하여 신호의 세기가 보다 정량적으로 측정될 수 있는 장점이 있어 사용하였다. 각 miRNA에 의한 세포 억제 능력의 측정값을 대조군 대비 상대적인 값으로 도 3에 개시 하였으며, 양성 대조군으로서 miR-34a 또한 포함하였다.

실시예 5: 세포 자살 유도 능력 분석

스크리닝에서 사용된 방법은 정량적 의미에서 세포의 개수를 측정함으로써 상대적인 세포 증식의 억제 정도를 측정하는 방법이다. 세포의 증식을 억제하는 기전은 세포의 분열 주기 속도를 감속시키는 방법과 세포의 자살을 유도하는 방법이 있다. 본 발명에서 발견한 miRNA 의 세포 증식 억제력의 작용 기전을 분석하기 위하여 세포 자살 정도를 유세포분석기 (Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS) 를 사용하여 분석하였다. 이를 위하여 세포를 6-well plate 에 분주하고 RNAiMAX 시약으로 해당 miRNA를 세포에 주입한 후 48 시간 동안 상기 기술한 조건에서 세포를 배양하였다. 이후 세포를 FIT-C 형광 염료가 표지된 아넥신V (annexin V) 로 처리한 후 유세포분석기로 분석하였다 (도 4). 분석 결과 miR-3670, miR-4477a, miR-8078으로 처리된 대부분의 세포가 사멸된 것을 확인할 수 있다. 이는 스크리닝에서 확인된 miRNA의 종양 성장 억제 효과가 세포의 사멸을 유발함으로써 이루어진 것임을 알 수 있다(표 3).

실시예 6: miRNA 에 의한 소프트 아가 (soft agar) 에서의 종양 성장 억제

소프트 아가를 이용하여 종양 세포를 배양함으로써 종양 세포로서의 특질을 측정할 수 있다. 정상 세포의 경우 성장하기 위하여 배양접시와 같은 지지대가 필요한 반면 종양 세포는 소프트 아가와 같이 물리적으로 견고한 지지대가 없는 환경에서도 성장하는 특징을 가지고 있다. 이러한 종양 특이적 성질을 사용하여 소프트 아가에서의 세포 군집 능력을 파악하였다. NCI-H460 폐암 세포주를 control miRNA, miR-34a, miR-8078, miR-3670, miR-4477a, miR-4765 로 각각 처리하여 24 시간 배양한 후, 이를 소프트 아가와 혼합하여 6 well-plate 에서 2주간 배양하였다. 세포를 크리스탈 비올렛 (crystal violet) 염료로 염색하여 각 군집의 개수를 측정하였다 (도5). 그 결과, miR-8078 및 miR-3670으로 처리한 세포는 거의 군집을 형성하지 못하였고, miR-4477a 로 처리한 세포군의 경우는 대조군 대비 대략 30% 정도의 군집 형성 능력을 보이는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 7: miRNA 의 타겟 mRNA 의 세포 증식 억제 효과 측정

miRNA 에 의하여 단백질 발현이 제어되는 타겟 mRNA 는 miRNA 의 서열과 부분적으로 상보적인 서열을 갖는다. miRNA 는 mRNA 의 발현을 억제하기 위하여 특히 씨앗 지역 (seed region) 의 서열이 중요한데, 이는 씨앗 지역 서열과 상보적인 서열을 갖는 mRNA 와 결합하여 유전자의 발현을 저해하기 때문이다. 그러나 씨앗 지역 서열이 8-9개의 염기로 비교적 짧기 때문에 miRNA 의 타겟이 되는 mRNA 는 소프트웨어를 사용하여 예측하게 된다. 그러나, 소프트웨어를 사용하는 경우에도 예측된 타겟 중 일부만이 실질적 타겟인 것으로 알려져 있다. 이러한 난점을 해결하기 위하여 소프트웨어를 통하여 예측된 타겟 유전자에 대하여 siRNA 를 사용하여 세포내의 함량을 저하시킨 후, 세포의 성장이 억제되는지 여부를 판단함으로써 타겟 유전자를 선정하였다. miRNA 의 타겟 mRNA 를 예측하기 위하여 이 분야에서 범용적으로 사용되는 타겟 예측 소프트웨어로 타겟스캔 (TargetScan) 을 사용하였으며, miR-3670, miR-4477a, miR-8078 의 예상 타겟으로 총 600 여종의 유전자를 선정하였다. 선정된 각 유전자에 대하여 3 종의 siRNA 를 합성하였고, 이를 사용하여 실시예 3 에서 수행한 방법과 동일하게 실험을 진행하였다. 세포를 96 well-plate 에 분주하고, 각 siRNA 로 처리한 후 48 시간 배양한 후, 레사주린 시약을 사용하여 세포 증식 능력을 측정하였다. 실시예 3 에서 처리한 방법과 동일한 방식으로 총 1800 여개 (600 여 유전자 × 3 종의 siRNA) 의 측정값 평균으로부터 각 유전자의 Z-score 를 계산하여 도 6에 개시하였다.

실시예 8: miRNA 의 타겟 mRNA 분석

miRNA 의 작용 방식은 mRNA 로부터 단백질을 생성하는 것을 저하시키며, 이와 동시에 타겟이 되는 대부분의 mRNA 의 분해를 유발시킨다. 따라서, 세포 내에 miRNA 를 주입하고 miRNA 의 타겟이 되는 mRNA 의 함량을 qPCR 을 사용하여 분석, 함량 저하를 측정함으로써 miRNA 의 타겟 mRNA 여부를 판별할 수 있는 하나의 기준으로 사용할 수 있다. 실시예 7 에서 확인된 miRNA 의 타겟 유전자를 대상으로 하여 miRNA 를 세포내로 전달한 경우 실질적으로 타겟 mRNA 가 저하되는지 여부를 측정하기 위하여, miR-3670, miR-4477a, miR-8078을 폐암 세포주에 각각 주입하여 48 시간 배양한 후 각 세포에서 RNA 를 추출하여 RNA 함량을 정량적으로 측정하였다 (도 7). 그 결과, miR-3670, miR-4477a, miR-8078 의 예상 타겟 mRNA 의 함량이 현저히 저하되는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 9: 루시퍼아제 측정법에 의한 타겟 mRNA 의 확인

miRNA 는 타겟 mRNA 의 3’ UTR (untranslated region) 에 결합함으로써 타겟 mRNA 에서의 단백질 생성을 저해하기 때문에 miRNA 와 타겟 mRNA 와의 관계를 직접적으로 측정하는 방법으로서 루시퍼아제 측정법을 통상적으로 사용한다. 타겟스캔 (TargetScan) 소프트웨어에서 miRNA 결합 서열이 포함된 3’ UTR 서열을 제공하는데 이를 상기 실시예 2 에서 기술한 바와 같이 파이어플라이 루시퍼아제 (firefly luciferase) 의 3’ UTR 에 유전자 클로닝 (gene cloning) 기법으로 삽입하고, 이러한 방식으로 제작된 벡터를 해당 miRNA 와 동시에 Human Embryonic Kidney (HEK) 세포에 트랜스펙션하여 벡터의 루시퍼아제 발현량을 측정하였다. 이 때 트랜스펙션 효율을 보정하기 위하여 레닐라 루시퍼아제 (renilla luciferase) 도 동시에 트랜스펙션하여 측정치를 보정하였다. miRNA, 파이어플라이 루시퍼아제, 레닐라 루시퍼아제를 동시에 주입하고 48시간 동안 배양한 후 루미노미터 (Luminometer) 로 측정하였다 (도 9). 그 결과, 각 타겟 mRNA 가 해당 miRNA 에 의하여 직접적으로 제어된다는 것을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

본 발명에 따른 암 치료용 약학 조성물은, miR-3670, miR-4477a, miR-8078, 로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA를 유효 성분으로 포함하여, 기존의 항암제로서의 적합성을 측정하기 위하여 임상 실험 진행 중인 miR-34a 및 기타 다른 miRNA를 유효 성분으로 하는 암 치료용 약학 조성물 대비 개선된 항암 효과를 보이는 바 항암 치료 조성물로서 널리 활용될 수 있다.

전자파일 첨부하였음.

Claims

miR-3670, miR-4477a, miR-8078로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA를 유효 성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서,

상기 miR-3670 는 서열 번호 35와 서열 번호 36 또는 서열 번호 67의 염기 서열로 이루어진 이중 가닥 RNA로 구성되는 이중 가닥이 유효 성분으로 포함되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제1항에 있어서,

상기 miR-4477a 는 서열 번호 43과 서열 번호 44 또는 서열 번호 68의 염기 서열로 이루어진 이중 가닥 RNA로 구성되는 이중 가닥이 유효 성분으로 포함되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제1항에 있어서,

상기 miR-8078 는 서열 번호 65와 서열 번호 66 또는 서열 번호 69의 염기 서열로 이루어진 이중 가닥 RNA로 구성되는 이중 가닥이 유효 성분으로 포함되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제1항에 있어서,

상기 miRNA는 암 세포의 자살 기전을 유도하여 암을 치료하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제1항에 있어서,

상기 암은 폐암, 간암, 위암, 대장암, 췌장암, 담낭 및 담도암, 유방암, 백혈병, 식도암, 비호치킨 림프종, 갑상선암, 자궁경부암, 피부암의 원발성 암과 이로부터 기타 장기로 전이되어 유발되는 전이암 및 비정상적인 과다 세포 분열을 촉진하여 생성되는 종양성 세포 질환으로 구성되는 군으로부터 선택된 1종 이상의 암인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 miRNA는 miRNA유도체인 것을 특징으로 하는 조성물.
제7항에 있어서, 상기 miRNA 유도체는 RNA 인산 뼈대 구조 (phosphate backbone structure)를 황 등의 다른 원소로 치환한 형태인 포스포로사이오에이트 (phosphorothiolate) 구조를 부분적으로 포함하는 형태; RNA 대신 DNA, PNA(petide nucleic acids) 및 LNA(locked nucleic acid) 분자로의 전체 또는 부분적으로 치환된 형태; 및 RNA 당의 2’수산화기를 메틸화, 메톡시화, 플르오르화 등의 기능성 구조로 치환한 형태로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제7항에 있어서, 상기 miRNA 유도체는 pri-miRNA 또는 precursor miRNA의 miRNA 전구체 형태; 또는 플라스미드 형태의 miRNA 전구체로 구성되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제9항에 있어서, 상기 miRNA 전구체는 RNA 인산 뼈대 구조 (phosphate backbone structure)를 황 등의 다른 원소로 치환한 형태인 포스포로사이오에이트 (phosphorothiolate) 구조를 부분적으로 포함하는 형태; RNA 대신 DNA, PNA(petide nucleic acids) 및 LNA(locked nucleic acid) 분자로의 전체 또는 부분적으로 치환된 형태; 및 RNA 당의 2’수산화기를 메틸화, 메톡시화, 플르오르화 등의 기능성 구조로 치환한 형태로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.