KR20180075139A - Ccnd3 또는 pak2 유전자의 발현을 저해하는 암을 치료하기 위한 약학적 조성물 - Google Patents

Ccnd3 또는 pak2 유전자의 발현을 저해하는 암을 치료하기 위한 약학적 조성물 Download PDF

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Abstract

miR-4779 등의 뉴클레오티드를 포함하는, CCND3 또는 PAK2 유전자의 발현을 저해하는 물질은 암을 예방 또는 치료하기 위해 효율적으로 이용될 수 있다. 또한, CCND3 또는 PAK2 유전자의 발현을 저해하는 물질을 스크리닝하여 암을 예방 또는 치료하기 위한 후보 물질을 선별할 수 있다.

Description

CCND3 또는 PAK2 유전자의 발현을 저해하는 암을 치료하기 위한 약학적 조성물{Pharmaceutical composition inhibiting expression of CCND3 or PAK2 for prevention or treatment of cancer}
CCND3 또는 PAK2 유전자의 발현을 저해하는 암을 치료하기 위한 약학적 조성물에 관한 것이다.
암을 치료하는 방법은 크게 외과적 수술치료, 항암화학요법, 방사선치료로 나눌 수 있다. 암의 종류와 진행 정도에 따라 다르지만, 일반적으로 이들 치료법이 병용 사용된다. 이러한 다양하고 복잡한 항암치료는 암세포뿐만 아니라 정상세포에도 작용하여 여러 부작용을 야기하며, 암세포의 항암제 내성 획득이나 방사선 내성 획득으로 치료효율을 저하시킬 수 있는 문제점을 가지고 있다. 따라서 항암치료의 효과를 증진시키면서 부작용을 최소화할 수 있는 방사선 민감성 증진제와 항암제의 개발이 절실히 요구 된다.
한편, 몇몇 miRNA들은 종양 형성 및 전이 동안 특이적으로 발현되어, 각각의 다양한 표적 유전자의 발현을 조절함으로써 종양 유전자 또는 종양 억제자로서 역할을 함이 밝혀졌다. 또한 정상 조직과 암 조직 간의 특정 miRNA의 발현 양상으로 인하여, 암 치료에 있어 miRNA의 예측 표지자로서의 가능성이 증대되었다. 현재까지, 인간에는 2588개의 성숙(mature) miRNA가 발견되어 보고되었으며 (miRBase release 21), 많은 miRNA의 기능이 아직 알려지지 않았다. 따라서 계속해서 밝혀지는 새로운 인간 miRNA 라이브러리를 대상으로 보다 효능성이 높은 항암 및 방사선 민감성 증진 후보 miRNA를 발굴하고 그 기능을 규명하는 연구의 필요성이 높아진 상황이다.
일 양상은 CCND3 (cyclin D3) 또는 PAK2 (p21-activated kinase 2) 유전자의 발현을 저해하는 물질을 유효 성분으로 포함하는 암을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공한다.
다른 양상은 CCND3 또는 PAK2 유전자의 발현을 저해하는 miRNA의 생성을 유도하는 제제를 유효성분으로 포함하는 암을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물
다른 양상은 CCND3 또는 PAK2 유전자의 발현을 저해하는, 암을 예방 또는 치료하기 위한 뉴클레오티드를 제공한다.
다른 양상은 CCND3 또는 PAK2 유전자의 발현을 저해하는, 암을 예방 또는 치료하기 위한 후보물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
일 양상은 CCND3 또는 PAK2 유전자의 발현을 저해하는 물질을 유효 성분으로 포함하는 암을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공한다.
"CCND3 (cyclin D3)"는 CDK 카이네이즈의 조절자로서 기능하는 사이클린 유전자 중 하나이다. 특히 CCND3 사이클린은 세포 주기 중 G1/S 전이 단계에서 주요한 기능을 하는 것으로 알려져 있다. 본 명세서에서 용어 "CCND3"은 CCND3의 유전자, mRNA, 단백질 및 이들의 단편을 모두 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
"PAK2 (p21-activated kinase 2)"는 캐스페이즈 매개 세포 사멸(caspase-mediated apoptosis)에서 단백질 절단에 의해 활성화 되어 세포 사멸에 주요한 역할을 하는 유전자로 알려져 있다. 이의 발현 산물인 단백질은 세린/트레오닌 카이네이즈 패밀리에 속하는 단백질로서, CDC42 및 RAC1 등의 작은 GTP 결합 단백질의 표적이 된다. 본 명세서에서 용어 "PAK2"는 PAK2의 유전자, mRNA, 단백질 및 이들의 단편을 모두 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "유효 성분"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜 또는 위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양으로서 포함된 성분임을 의미하며, "약학적으로 유효한 양"과 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 상기 유효한 양은 개체의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
상기 암은 폐암, 간암, 위암, 대장암, 결장암, 췌장암, 피부암, 방광암, 전립선암, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 갑상선암, 신장암, 섬유육종, 흑색종 및 혈액암을 포함한다. 상기 암은 항암 치료에 내성이 생긴 상태의 암을 포함한다. 상기 암은 방사선 치료에 내성이 생긴 상태의 암을 포함한다.
상기 CCND3 또는 PAK2 유전자의 발현을 저해하는 물질은, CCND3 또는 PAK2의 mRNA 또는 단백질에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브, 뉴클레오티드, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 리간드, 수용체, 작용제(agonist) 또는 길항체(antagonist), 펩티드, 폴리펩티드, 단백질 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 CCND3 또는 PAK2의 mRNA 또는 단백질에 특이적으로 결합하는 물질은 고속 대량 스크리닝(high throughput screening: HTS) 등 당업계에 알려진 방법에 따라 선별할 수 있고, 또한 상업적으로 구매 가능한 것일 수 있다.
상기 물질은 CCND3 또는 PAK2의 mRNA 서열, 또는 그의 3'UTR 부위에 상보적으로 결합하는 서열을 갖는 연속된 뉴클레오티드일 수 있다. 상기 뉴클레오티드는 CCND3 또는 PAK2의 mRNA 서열의 일부 또는 전부의 서열과 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 이상 또는 100%의 서열 동일성 또는 서열 상보성을 갖는 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 뉴클레오티드는 CCND3 또는 PAK2의 mRNA 서열의 하나 이상의 부위와 상보적으로 결합하는 연속된 뉴클레오티드일 수 있다. 상기 뉴클레오티드는 CCND3 및 PAK2의 mRNA 서열에 모두 상보적으로 결합하는 서열을 갖는 연속된 뉴클레오티드일 수 있다.
상기 뉴클레오티드는 서열번호 1의 서열에 상보적으로 결합하는 서열을 갖는 7 내지 100개, 7 내지 30개, 10 내지 30개, 또는 15 내지 25개의 연속된 뉴클레오티드일 수 있다. 상기 뉴클레오티드는 서열번호 2의 서열을 갖는 7 내지 100개, 7 내지 30개, 10 내지 30개, 또는 15 내지 25개의 연속된 뉴클레오티드일 수 있다. 상기 뉴클레오티드는 서열번호 3의 서열을 갖는 22 내지 100개, 22 내지 30개, 22 내지 25개의 연속된 뉴클레오티드일 수 있다.
상기 뉴클레오티드는 miRNA일 수 있다.
용어 "miRNA"는 microRNA 또는 miR로 지칭될 수 있다. miRNA의 길이는 약 10 내지 30, 또는 21 내지 25개의 뉴클레오티드인 RNA 가닥일 수 있다. miRNA는 DNA로부터 전사되지만 단백질로 번역되지 않으므로, 비-코딩 RNA를 포함하는 유전자에 의해 코딩된다. miR는 공지의 원발성 전사체 pri-miRNA로부터 pre-miRNA라고 불리는 짧은 스템-루프 (stem-loop) 구조로 프로세스되고, 최종적으로 생성된 단일 가닥 miRNA로 프로세스된다. pre-miRNA는 자가-상보 영역내에서 자체적으로 안으로 접히는 구조를 형성할 수 있다. 그 후 상기 구조는 동물에서는 뉴클레아제에 의해 프로세스된다. 성숙 miRNA 분자는 하나 이상의 mRNA 분자에 부분적으로 상보적이며, 단백질의 전사를 조절하는 기능을 할 수 있다. miRNA는 "mir-[숫자]"와 같은 작명 협정에 따라 일반적으로 번호를 할당받는다. miRNA의 숫자는 이미 확인된 miRNA 종에 대해 발견된 순서에 따라 할당된다. miRNA가 상이한 유기체의 공지의 miRNA에 유사한 것으로 발견되었다면, 이름은 [유기체 확인자]- mir-[숫자]의 형태로, 선택적 유기체 확인자 이름이 제공된다. 성숙한 microRNA는 보통 접두사 "miR"가 붙고, 유전자 또는 전구물질 miRNA는 접두사 "mir"가 붙는다. 본 발명의 내용에서, 접두사 mir-* 또는 miR-*를 가진 임의의 microRNA (miRNA 또는 miR)는 명시적으로 다른 언급이 없는 한, 전구물질 및/또는 성숙 종을 모두 포함하는 것으로 이해해야 한다.
상기 miRNA는 상기 CCND3 또는 PAK2의 mRNA 서열, 또는 그의 3'UTR 부위에 상보적으로 결합하는 시드 서열 (seed sequence)을 갖는 miRNA일 수 있다. 상기 miRNA는 miR-4779를 포함한다.
상기 약학적 조성물은 독립적으로 항암제로서 이용되거나, 다른 항암제와 함께, 혹은 외과적 수술치료, 항암화학요법, 또는 방사선치료 등의 다른 항암치료와 동시에 이용될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 암세포의 방사선 민감성을 증진시켜, 방사선 치료의 효율을 증가시키는 것일 수 있다.
본 발명자들은 miR-4779가 CCND3 및 PAK2의 발현을 저해시키는 것을 확인하였다. 또한, 이로 인해 암세포의 세포 생존률이 낮아지고, 암세포의 방사선 민감성이 높아지는 것을 확인하였다. 따라서 miR-4779를 포함하는 CCND3 또는 PAK2 유전자의 발현을 저해하는 물질은 암을 예방 또는 치료하기 위해 이용될 수 있다.
다른 양상은 CCND3 또는 PAK2 유전자의 발현을 저해하는 miRNA의 생성을 유도하는 제제를 유효성분으로 포함하는 암을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공한다.
상기 miRNA의 생성을 유도하는 제제는 miRNA의 발현 벡터를 포함할 수 있다.
용어 "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로서, 숙주 세포 내에 도입되면 독립적으로 복제되어 벡터 및 내부에 삽입된 외래 DNA 등의 카피를 생산하는 뉴클레오티드를 의미한다. 용어 "재조합 발현 벡터(recombinant expression vector)" 또는 "발현 벡터"는 특정 단백질의 증폭을 목적으로 내부에 외래 DNA 단편을 삽입시킨 벡터로서, 상기 외래 DNA 단편은 특정 폴리펩티드 또는 RNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 발현 또는 클로닝을 목적으로 한 벡터 시스템의 구축은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 수행 가능하다. 상기 벡터는 본 명세서에 정의된 폴리뉴클레오티드 서열에 연결된 조절 서열을 포함할 수 있다. 용어 "조절 서열"은 코딩 서열의 발현을 수행하는데 필요한 핵산 서열을 지칭하며, 조절 서열의 성질은 숙주 유기체에 따라 다르다. 상기 발현 벡터는 조절 서열 외에, 제한 효소 절단 부위, 약물 저항성 유전자와 같은 마커 유전자, 분비 신호 서열 또는 리더(leader) 서열 등을 추가적으로 포함할 수 있다. 제한효소 절단 부위는 제한효소에 의해 특이적으로 인식되어 절단되는 특정한 염기 서열을 지칭한다. 상기 절단 부위는 예를 들면, EcoRI, BamHI, HindⅢ, kpnⅠ, SalI, NotⅠ, PstⅠ, SmaⅠ, 및 Xho I과 같은 제한효소에 의해 특이적으로 인식되는 서열일 수 있다. 상기 마커 유전자는 선택 표지로서 기능하며, 암피실린, 게나마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신, 및 테트라사이클린과 같은 약물의 내성 유전자일 수 있다. 상기 분비 신호 서열 또는 리더 서열은, 합성된 단백질을 세포 구획 (예를 들면, 주변 세포질 공간(periplasmic space))으로 향하게 하거나 세포외 배지로 분비하도록 유도하는 서열로, 전술된 폴리뉴클레오티드 서열의 코딩 서열에 첨가될 수 있다. 이와 같은 서열들은 도입되는 DNA, 숙주 세포의 종류, 배양 배지의 조건 등에 따라, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
상기 설명에서 언급된 용어 또는 요소 중 앞서 언급된 용어 또는 요소는 이미 언급된 바와 같다.
다른 양상은 CCND3 또는 PAK2 유전자의 발현을 저해하는, 암을 예방 또는 치료하기 위한 뉴클레오티드를 제공한다. 상기 뉴클레오티드는 앞서 설명된 바와 같다.
다른 양상은 CCND3 또는 PAK2 유전자의 발현을 저해하는, 암을 예방 또는 치료하기 위한 후보물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 CCND3 (cyclin D3) 또는 PAK2 (p21-activated kinase 2)의 유전자를 발현하는 세포에 피검 물질을 접촉시키는 단계; 상기 피검 물질과 접촉한 세포의 상기 CCND3 또는 PAK2의 유전자 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 유전자 발현 수준을 변화시키는 피검 물질을 선별하는 단계를 포함할 수 있다.
또는, 상기 방법은 CCND3 또는 PAK2의 mRNA 또는 단백질 또는 그들의 단편을 포함하는 시료에 피검 물질을 접촉시키는 단계; 상기 피검 물질과 접촉한 시료에서 상기 mRNA 또는 단백질 또는 그들의 단편 및 피검 물질의 결합 수준을 측정하는 단계; 및 CCND3 또는 PAK2의 mRNA 서열의 일부 또는 전부 서열을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 시료에 피검 물질을 접촉시키는 단계; 상기 피검 물질과 접촉한 시료에서 상기 뉴클레오티드 및 피검 물질의 결합 수준을 측정하는 단계; 및 상기 뉴클레오티드와 특이적으로 결합하는 피검 물질을 선별하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 후보 물질은 CCND3 또는 PAK2의 발현을 저해시켜 암의 예방 또는 치료에 효과적인 것으로 예상되는 임의의 천연물 또는 합성물일 수 있다. 상기 세포는 개체의 일부 또는 개체로부터 분리된 것일 수 있다.
상기 측정하는 단계는, CCND3 또는 PAK2의 mRNA 또는 단백질에 특이적으로 결합하는 물질에 부착된 검출 가능한 표지로부터 나오는 신호를 검출함으로써 이루어지는 것일 수 있다. 또는 상기 피검 물질에 특이적으로 결합하는 물질에 부착된 검출 가능한 표지로부터 나오는 신호를 검출함으로써 이루어지는 것일 수 있다. 상기 측정은 당업계에 공지된 프로토콜에 따라서 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay: RPA), 노던 블롯팅 (Northern blotting), DNA를 포함한 핵산 마이크로어레이, 웨스턴블롯팅, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선 면역분석(Radioimmunoassay, RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 질량분석, 자석비드-항체 면역 침강법, 단백질 칩(protein chip), 또는 그 조합으로 수행할 수 있다.
상기 방법은 상기 세포의 CCND3 또는 PAK2의 유전자 발현 수준이 대조군의 수준에 비교하여 변화한 경우, 상기 피검 물질을 암 치료에 효과적일 수 있는 후보 물질로 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 수준의 변화는 개체의 수준이 대조군에 비하여 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900% 및 1000% 이상 증가하거나, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 및 100% 이상 감소하는 것을 포함할 수 있다.
상기 방법은, 또한 상기 피검 물질이 상기 CCND3 또는 PAK2의 mRNA 또는 단백질 또는 그들의 단편에 뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 경우, 상기 피검물질을 암 치료에 효과적일 수 있는 후보 물질로 결정하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 설명에서 이미 언급된 용어 또는 요소에 대해서는 따로 언급하는 것이 없는한 이미 상술한 바와 같다.
일 양상에 따른 CCND3 또는 PAK2 유전자의 발현을 저해하는 물질은 암을 예방 또는 치료하기 위해 효율적으로 이용될 수 있다.
다른 양상에 따른 CCND3 또는 PAK2 유전자의 발현을 저해하는 miRNA의 생성을 유도하는 제제를 유효성분으로 포함하는 암을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물에 의하면 암을 효육적으로 예방 또는 치료할 수 있다.
다른 양상에 따른 CCND3 또는 PAK2 유전자의 발현을 저해하는 뉴클레오티드는 암을 예방 또는 치료하기 위해 효율적으로 이용될 수 있다.
다른 양상에 따른 CCND3 또는 PAK2 유전자의 발현을 저해하는 물질을 스크리닝하는 방법에 따르면 암을 예방 또는 치료하기 위한 후보 물질을 선별할 수 있다.
도 1은 HCT116 세포에서 miR-4779을 과발현시킨 경우의 세포 생장, 세포 주기 및 세포 사멸을 나타낸다.
도 2는 HCT116 세포에서 miR-4779을 과발현시킨 경우의 세포 생존율 및 부착 의존성 세포 생장을 나타낸다.
도 3은 HT-29 세포에서 miR-4779을 과발현시킨 경우의 방사선 병용 처리에 의한 세포 생장, 세포 주기 및 세포 사멸에 대한 영향을 나타낸다.
도 4는 HT-29 세포에서 miR-4779을 과발현시킨 경우의 방사선 민감성을 세포 생존률 및 부착 의존성 세포 생장으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 5은 HCT116 세포에서 miR-4779의 과발현에 의해 예상 타겟 유전자인 CCND3와 PAK2의 mRNA와 단백질의 발현을 확인한 것으로, miR-4779에 의해 두 유전자의 mRNA와 단백질 발현이 감소함을 보여준다.
도 6은 miR-4779의 타겟 유전자인 CCND3와 PAK2의 3‘UTR의 각각의 예상 결합부위 염기서열과 직접적인 결합을 확인한 것이다.
도 7은 miR-4779의 타겟 유전자인 CCND3 및 PAK2의 발현 저해에 의한 세포 생장율을 확인한 것이다.
도 8은 miR-4779의 타겟 유전자인 CCND3 및 PAK2의 발현 저해에 의한 세포 주기, 세포 사멸, 세포 생존율, 및 부착 의존성 세포 생장을 확인한 것이다.
도 9는 HCT116 이종이식(xenograft) 동물모델에서 miR-4779에 의한 종양 저해 효과를 확인한 것이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 암세포 저해 miRNA와 방사선 민감성 증진 miRNA의 스크리닝
1. 실험 방법
(1) 세포 배양
2종류의 사람 대장암 세포주 (HCT116, HT-29)를 각각 5% CO2가 공급되는 항온 항습기 (humidified chamber)에서 10% 소 태아혈청 (fetal bovine serum: FBS) 및 100 U/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신 설페이트 (streptomycin sulfate)를 포함하는 RPMI-1640 또는 DMEM에서 37℃로 배양하였다.
(2) 방사선 조사
이온화 방사선 조사 (ionizing radiation: IR)는 Gammacell 3000 Elan 방사선 조사장치 (irradiator)([137Cs] γ-ray source; MDS Nordin, 캐나다)를 이용하여 감마 이온화 방사선을 조사하였다.
(3) miRNA 라이브러리 형질주입
최종 농도 50 nM이 되게 20 μM miRNA 농축액 0.6 ㎕를 10 ㎕의 PBS 용액에 희석하고, G-fectin (제놀루션, 한국) 0.4 ㎕를 10 ㎕의 PBS 용액에 희석하였다. 위의 두 희석 용액을 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하여 잘 섞은 후 5분간 방치하였다. HCT116 또는 HT-29 세포를 2x103 세포 수 / 80 ㎕ 배지가 되게 희석하여 532 종의 miRNA/G-fectin 복합체를 포함한 각 웰에 80 ㎕씩 분주하여 잘 섞어 준 후 37℃에서 실험 조건에 따라 배양하였다.
(4) 암세포 억제 miRNA 선별
miRNA를 HCT116 세포에 형질주입 하여 72시간 배양 후 MTS 분석을 통해 세포 생장률을 측정하였다. 매 실험마다 각 샘플은 3배수로 실험하였으며, 3번 반복 실험하여 평균 세포 생장률을 50% 이하로 감소시킨 miRNA를 선별하였다.
(5) 방사선 민감성 증진 miRNA 선별
532 miRNA를 HT-29 세포에 형질주입하였으며, 이때 같은 샘플 플레이트를 2개씩 준비해서, 형질주입 16시간 후, 각각의 플레이트에 0 또는 6 Gy의 방사선을 조사하였다. 방사선 조사 후 72시간을 더 배양한 후 MTS 분석을 통해 세포 생장률을 측정하였다. 매 실험마다 각 샘플은 3배수로 실험하였으며, 3번 반복 실험하여, 각 miRNA와 방사선 병용 처리에 의한 평균 세포 생장률을 50% 이하로 감소시킨 miRNA를 선별하였다.
(6) 세포 생장률 분석
세포 생장률을 측정하기 위해, CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay kit (Promega, 미국)을 사용하여 MTS 분석을 수행하였다.
구체적으로, 96-웰 플레이트의 각 웰 (100 ㎕ 배지/웰)에 20 ㎕의 MTS 용액을 첨가한 후 2~4 시간을 더 배양한 후 A490에서 흡광도를 측정하였으며, 세포 생장률은 각 세포의 음성 대조군인 miR-NC에 대한 %로 나타내었다.
(7) 스크리닝 결과
HCT116 세포의 생장률을 50% 이하로 감소시킨 암세포 억제 miRNA로 30 종의 miRNA를 발굴하였다. 또한 HT-29 세포에 miRNA와 방사선 병용 처리에 의해 세포 생장률을 50% 이하로 감소시킨 방사선 민감성 증진 miRNA로 29종의 miRNA를 발굴하였다. 위의 30 종의 암세포 억제 miRNA와 29 종의 방사선 민감성 증진 miRNA에 공통적으로 포함된 miR-4779(5'-uaggagggaa uaguaaaagc ag-3', 서열번호 3)를 최종적으로 선택하였다.
실시예 2. miR -4779의 세포 생장, 세포 사멸, 세포 생존도 및 부착 의존성 세포 성장에 대한 효과
1. HCT116 세포의 miR -4779 과발현에 의한 세포 생장률 확인
상기 실시예 1.1(3)에 기재된 방법과 같이 miR-NC와 miR-4779를 HCT116 세포에 형질주입하였으며, 72시간 배양 후 MTS 분석을 통해 세포 생장률을 측정하였다.
도 1a 및 1b와 같이 HCT116 세포주에 miR-4779 과발현하여 세포 생장을 MTS 분석과 현미경 관찰로 확인한 결과, 아무것도 처리하지 않은 대조군(cont) 과 비타겟팅 음성 대조군 miRNA(miR-NC)에 비해 miR-4779 처리한 세포의 생장률이 현저히 감소함을 확인하였다.
2. HCT116 세포의 miR -4779 과발현에 의한 세포 주기에 대한 영향 확인
상기 실시예 2.1의 세포 생장의 억제가 세포 주기 지연에 의한 것인지를 확인하기 위해 세포 주기 분석을 확인하였다.
세포 주기 분석 실험을 위해, 먼저 6-웰 플레이트에 500 ㎕의 OPTI-MEM (invitrogene, 미국)을 첨가하고, 최종 농도가 50 nM이 되게 20 μM miRNA 농축액 (miR-NC 또는 miR-4779) 7.5 ㎕와 리포펙타민 RNAiMAX (invitrogene) 5 ㎕를 첨가하여 잘 섞은 후 5분간 방치하였다. HCT116 세포를 5x105 세포 수 / 2.5 ml 배지가 되게 희석하여 miRNA/G-fectin 복합체를 포함한 각 웰에 2.5 ml씩 분주하여 잘 섞어 준 후 37℃에서 추가 배양하였다. miR-NC와 miR-4779를 형질주입 후 48시간 배양 한 후 세포를 수확하였으며, 차가운 PBS 완충용액으로 세척한 각 세포를 다시 1 ml의 PBS에 부유시켜 세포수를 측정하였다. 각각의 세포 2x106 개씩을 4 ml의 차가운 70% 에탄올이 담긴 튜브에 천천히 섞어주면서 첨가한 후 4℃에서 하룻밤 동안 방치하여 세포를 고정하였다. 70% 에탄올에 고정된 세포를 원심 분리하여 (2000 xg에서 10분 동안 수행) 에탄올을 제거하고, 5 ml의 PBS를 첨가하여 상온에서 10분 동안 방치하였다. 이를 다시 원심 분리하고, 100 ㎕의 PBS에 부유시켜 100 ㎕의 2x PI (propidium iodide) 염색 용액 (50 μg/ml PI, 2 μg/ml DNase-free RNase A, 및 0.2 % NP-40를 포함 한 PBS 용액)을 첨가하고 빛을 차단하여 상온에서 30분간 반응시켰다. 이후 BD FACSCanto II (BD Biosciences, 미국)를 사용하여 FACS 분석을 수행하여 세포 주기를 측정하였다.
그 결과, 도 1c와 같이 miR-4779에 과발현에 의해 HCT116의 subG1과 G1기의 세포 수가 증가함을 확인하였고, 특히 subG1의 세포수가 현저히 증가함을 확인할 수 있었다.
3. HCT116 세포의 miR -4779 과발현에 의한 세포 사멸에 대한 영향 확인
상기 실시예 2.1과 2.2에서 확인한 miR-4779의 세포 생장 억제 효과가 세포 사멸에 의한 것인지를 다시 확인하기 위해, Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (BioVision, 미국)을 사용하여 Annexin V-FITC/PI 이중 염색을 통해 세포 사멸 (apoptosis) 분석을 수행하였다.
세포 사멸 분석을 위해, 상기 실시예 2.2에서와 같이 6-웰 플레이트에 miR-NC 또는 miR-4779를 형질주입하고 48시간 후 세포를 수확하였다. 차가운 PBS 완충용액으로 세척한 각 세포를 다시 반응 완충용액 (10 mM HEPES, pH 7.4, 140 mM NaCl, 25 mM CaCl2)에 부유시켜 세포수를 측정하였다. 각각의 세포 5x105 / 100 ㎕에 5 ㎕의 PI 용액과 5 ㎕의 Annexin V-FITC 용액을 첨가하고 빛을 차단하여 상온에서 10분간 반응 시킨 후, FACS 분석을 수행하였다. Annexin V-FITC 양성 세포 (초기 세포 사멸 단계)와 PI 양성 세포 (말기 세포 사멸 단계)를 합하여 전체 세포에 대한 세포 사멸 세포의 %를 표시하였다.
그 결과, 도 1d과 같이 miR-NC 처리한 세포에 비해 miR-4779 처리한 세포의 세포 사멸이 2.5배 이상 증가함을 확인하였다.
4. HCT116 세포의 miR -4779 과발현에 의한 세포 생존도 확인
miR-4779 과발현에 의한 세포 생존도를 측정하기 위해 콜로니 형성 분석을 수행하였다.
콜로니 형성 분석을 위해, 상기 실시예 2.1과 같이 6-웰 플레이트에 miR-NC 또는 mR-4779를 형질 주입하였다. 24시간 후, 각 세포를 수확하여, 세포수를 측정하고, 새로운 6-웰 플레이트에 200개의 세포를 접종하여 7일 동안 추가 배양하였다. 형성된 콜로니는 0.4% 크리스탈 바이올렛으로 상온에서 5분간 염색하였으며, 여분의 염색 용액을 흐르는 물로 세척 후 말려서, 이미지를 스캔하고, 염색된 콜로니 수를 측정하였다. 각 실험은 3배수로 수행하였다.
그 결과, 도 2a와 같이 대조군 및 miR-NC와 비교해서 miR-4779 과발현한 세포의 콜로니 수가 3배 이상 감소함을 확인하였다.
5. miR -4779 과발현에 의한 부착 의존성 세포 증식 조사
miR-4779 과발현에 의한 부착 의존성 세포 증식을 측정하기 위해 연한천 분석 (soft agar assay)을 수행하였다.
연한천 분석을 위해, 상기 실시예 2.1과 같이 6-웰 플레이트에 miR-NC 또는 mR-4779를 형질주입하고 24시간 후, 각 세포를 수확하여, 세포수를 측정하였다. 2000개의 세포를 1 ml의 0.3% 한천을 포함하는 배지에 희석하여 (2000 세포/ 1 ml의 0.3% 한천을 포함하는 배지), 0.8%의 한천을 코팅한 6-웰 플레이트에 1 ml 씩 분주하였다. 클린벤치에서 30분간 방치하여 한천을 굳힌 다음 14일간 추가 배양하였다. 0.5 ml의 INT (iodonitrotetrazolium violet, 0.5 mg/ml in PBS) 용액을 각 웰에 첨가하여 하룻밤 동안 반응시켜 콜로니를 염색하였으며, 염색한 콜로니를 포함하는 플레이는 이미지를 스캔하고, 염색된 콜로니 수를 측정하였다.
그 결과, 도 2b와 같이 miR-NC와 비교해서 miR-4779를 과발현시킨 부착 의존성 세포의 콜로니 수가 현저히 감소함을 확인하였다.
실시예 3. miR -4779 과발현에 의한 방사선 민감성 증진 효과
1. miR -4779과 방사선 병용 처리에 의한 세포 생장률 조사
상기 실시예 1.1.(3)에 기재된 방법과 같이 miR-NC와 miR-4779를 HT-29 세포에 형질주입하였으며, 16시간 후 방사선을 조사하였다 (0, 6 Gy). 계속해서 72시간 배양 후 MTS 분석을 통해 세포 생장률을 측정하였다.
그 결과, 도 3a와 같이 miR-NC에 비해 miR-4779 과발현한 세포에서 방사선에 의한 세포 생장이 현저히 감소하였다. 즉, 방사선 저항성 암세포주인 HT-29 세포에서, miR-4779 과발현에 의해 방사선에 대한 민감성이 증가함을 확인하였다. 또한 도 3b와 같이 miR-4779 과발현한 세포의 형태가 방사선을 조사하는 경우 더 현저히 변화하여, 방사선에 대한 민감성이 증가함을 나타냈다.
2. miR -4779과 방사선 병용 처리에 의한 세포 주기 및 세포 사멸에 대한 영향 조사
상기 실시예 3.1에서 확인한 세포 생장의 억제가 세포 주기 지연에 의한 것인지를 확인하기 위해, 상기 실시예 2.2에 기재된 방법과 같이, HT-29 세포에 miR-4779를 과발현시킨 후 방사선을 조사하고 (0, 6 Gy), 48시간 후 세포 주기 분석을 시행하였다.
도 3c는 HT-29 세포에 miR-4779를 과발현시키고 방사선을 조사하여 세포 주기를 분석한 결과를 나타낸다. 도 3c에 나타난 바와 같이, 방사선 단독처리에 의해 G2/M기에서의 세포 주기 지연현상과 동시에 subG1의 세포 수가 증가함을 확인하였다. 또한 miR-4779 단독처리에 의해서는 G2/M기의 세포 수가 감소하고 subG1의 세포 수가 증가함을 확인하였다. 이는 miR-4779 과발현과 방사선을 병용 처리하면, 방사선 단독처리 또는 miR-4779 단독처리에 의한 subG1의 세포 수 증가(세포 사멸)가 서로 시너지 효과를 보임을 나타낸다. 또한 방사선 처리에 의한 G2/M기에서의 세포 주기 지연현상은 miR-4779 과발현 세포에서도 유지됨을 알 수 있다.
3. miR -4779 과발현과 방사선 병용 처리에 의한 세포 생존도 및 조사 부착 의존성 세포 증식 조사
miR-4779 과발현과 방사선 병용 처리에 의한 세포 생존율을 확인하기 콜로니 형성 분석을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 2.1에 기재된 방법과 같이 6-웰 플레이트에 miR-NC 또는 mR-4779를 HT-29 세포에 형질 주입하였다. 16시간 후, 방사선을 조사 (0, 2 Gy) 하고 세포를 수확하여, 상기 실시예 2.4 및 2.5에 기재된 방법과 같이 콜로니 형성 분석 및 연한천 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 4a와 같이 miR-NC에 비해 miR-4779 과발현한 세포에서 방사선에 의해 콜로니 수가 현저히 감소함으로써, miR-4779 과발현에 의해 방사선 민감성이 증가함을 확인하였다. 또한, 상기 실시예 2.5의 결과와 유사하게, 도 4b와 같이, HT-29 세포에 miR-4779를 과발현시켰을 때 방사선 조사 없이도 부착 의존성 세포 성장이 완전히 없어짐을 볼 수 있었다.
실시예 4. miR -4779의 표적 유전자 확인
1. miR -4779의 표적 유전자 예측
miR-4779의 암세포 억제 기능과 관련된 타겟 유전자를 발굴하고자 miRNA의 타겟 유전자 예측 데이터베이스 (miRDB 및 Targetscan)를 통해 세포 성장 또는 세포 사멸과 관련된 타겟 후보 유전자로 CCND3 (cyclin D3)와 PAK2 (p21-activated kinase 2)을 선별하였다.
2. miR -4779 과발현에 의한 CCND3와 PAK2 유전자의 mRNA 발현 감소
miR-4779의 타겟 후보 유전자로 선정된 CCND3와 PAK2의 mRNA 발현 레벨을 확인하기 위해 qRT-PCR 분석을 수행하였다.
구체적으로, HCT116 세포에 50 nM의 miR-NC 또는 miR-4779을 형질주입하고 20시간 후 각 세포를 수확한 후, RNeasy mini kit (Qiagen, 미국)을 사용하여 총 RNA를 추출하였다. 1 μg RNA를 주형으로 PrimeScript RT Master Mix (Takara, 일본)을 이용하여 10 ㎕의 cDNA를 합성하였다. 계속해서 cDNA를 5배 희석하여 qRT-PCR 분석에 사용하였으며, 2x Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystem, 미국)와 hCCND3, hPAK2 및 hHPRT1에 대한 validated q-RT primer (바이오니아, 한국)를 사용하여 qRT-PCR을 수행하였다.
그 결과, 도 5a와 같이 miR-4779에 의해 CCND3와 PAK2의 mRNA 발현이 하향 조절됨을 확인하였다.
3. miR -4779 과발현에 의한 CCND3와 PAK2 유전자의 단백질 발현 저하
miR-4779의 타겟 후보 유전자로 선별된 CCND3와 PAK2의 단백질 발현 양을 확인하기 위해 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다.
먼저, HCT116 세포에 50 nM의 miR-NC 또는 miR-4779을 형질주입하고 48시간 후 각 세포를 차가운 PBS 완충용액으로 세척하하였다. 세포 추출용 완충용액 (20 mM Tri-HCl, pH 6.8, 2% SDS, 2 mM EDTA, 1mM Na3VO4, 1mM DTT, 20% glycerol, 0.5mM PMSF)으로 총 단백질을 추출하였고, 총 단백질 추출물의 끈적거림이 없어질 때까지 초음파 분쇄기를 이용하여, 초음파를 처리하였다. 세포 추출물의 총 단백질의 정량은 BCA Protein Assay Kit(Pierce, 미국)을 사용하여 측정하였으며, BSA (bovine serum albumin)를 표준단백질로 사용하였다. 정량한 총 단백질은 SDS-PAGE용 샘플 완충 용액을 첨가하여 95℃에서 5분간 끓인 후 사용하였다. 동일한 양의 단백질을 12% SDS-PAGE에 주입하여 전기영동 하였고, 이후 anti-CCND3 (cell signaling, 미국), anti-PAK2 (cell signaling), anti-β-actin (sigma, 미국)를 사용하여 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다.
도 5b와 같이, 웨스턴 블럿 분석 결과 miR-NC 음성 대조군에 비해 miR-4779 처리 샘플에서 두 단백질 모두 현저히 감소하였다. 이로부터, CCND3 및 PAK2가 miR-4779의 타겟 유전자로서 miR-4779에 의해 하향 조절됨을 확인하였다.
4. miR -4779와 CCND3 또는 PAK2의 각 3'- UTR 부위의 결합 확인
miR-4779가 타겟 유전자로 예상되는 CCND3와 PAK2와 직접적인 결합을 하는지 여부를 아래 기술한 바와 같이 두 유전자의 여러 3'-UTR DNA 컨스트럭트의 루시퍼라아제 활성을 측정하여 확인하였다.
먼저, 도 6a 및 6b와 같이, 두 유전자의 3'-UTR 부위에서 miR-4779의 시드 서열(seed sequence)(-AGGAGGG-)에 상보적인 염기서열 (-CCCTCCT-)의 위치를 TargetScan 분석 프로그램을 통해 확인하였다. PAK2의 3'-UTR 분석결과 2개의 miR-4779 결합 염기서열 (894-900, 2106-2112)이 존재하였으며, CCND3의 3'-UTR 분석결과 1개의 miR-4779 결합 염기서열 (795-800)이 존재하였다.
상기 선별된 3개의 miR-4779 결합 염기서열 부분을 포함하는 두 유전자의 3'UTR DNA 컨스트럭트를 (PAK2 3'UTR-1, PAK2 3'UTR-2, CCND3 3'UTR)를 HCT116 cDNA를 주형으로 하여 PCR로 증폭하여, pGL3 벡터 (Promega, 미국)의 루시퍼라아제 유전자 뒤쪽에 클로닝하여, 3종의 플라스미드 DNA를 제조하였다. QuickChange II XL Site-Directed Mutagenesis kit (Agilent Technologies, 미국)을 사용하여 이들 상기 3종의 플라스미드 DNA (wt, 야생형)의 miR-4779 결합 염기서열 (-CCCTCCT-)을 (-CCGGGCT-)로 치환하여 miR-4779에 결합하지 못하는 3종의 돌연변이형 (mut) 플라스미드 DNA를 만들었다.
24-웰 플레이트에 5×104 개의 HCT116 세포를 접종하고 (5×104/웰) 20시간 경과시켰다. 상기 제조한 6종 중 1종의 pGL3-Luc-3'UTR 리포터 플라스미드 DNA (200 ng) 및 레닐라 루시퍼라제(renilla luciferase) 리포터 플라스미드 DNA (10 ng, pRL-CMV, promega)를, 10 nM miR-NC 또는 10 nM miR-4779와 함께, 리포펙타민 2000 (invitrogen)을 사용하여 형질주입하였다. 계속해서 48시간 경과 후, Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega)를 사용하여 루시퍼라아제 활성을 측정하였다. 상기 6종 pGL3-Luc-3'UTR 리포터 플라스미드 DNA 각각의 루시퍼라아제 활성을 측정하였다.
그 결과, 도 6c와 같이 3'-UTR DNA 컨스트럭트를 포함하지 않는 대조군(mock)의 경우 miR-NC와 비교하여 miR-4779에 의해 루시퍼라아제 활성 변화가 관찰되지 않았다. PAK2 3’UTR-1의 야생형의 경우 miR-4779에 의해 루시퍼라아제 활성이 감소하였으나, 돌연변이형의 경우에서도 miR-4779에 의해 루시퍼라아제 활성이 감소해서 miR-4779가 PAK2 3'UTR-1에 특이적이고 직접적으로 결합 된다고 볼 수 없었다. PAK2 3'UTR-2의 야생형의 경우 miR-4779에 의해 루시퍼라아제 활성이 감소하였고, 돌연변이형의 경우 miR-4779에 의해 루시퍼라아제 활성이 변화가 없었으므로, miR-4779가 PAK2 3'UTR-2 에 특이적이고 직접적으로 결합함을 확인하였다. CCND3 3'UTR의 야생형의 경우 miR-4779에 의해 루시퍼라아제 활성이 감소하였고, 돌연변이형의 경우 miR-4779에 의해 루시퍼라아제 활성이 변화가 없었으므로, miR-4779가 CCND3 3'UTR에 특이적이고 직접적으로 결합한다고 할 수 있었다.
결론적으로, PAK2의 경우 miR-4779의 직접적인 타켓 유전자로, miR-4779가 PAK2 3'UTR-2 부위에서 결합하여 PAK2의 발현을 저해함을 확인하였다. 또한 CCND3의 경우도 miR-4779의 직접적인 타켓 유전자로, miR-4779가 CCND3 3'UTR 부위에서 결합하여 PAK2의 발현을 저해함을 확인하였다.
실시예 5. miR -4779의 표적 유전자인 CCND3 및 PAK2의 발현 억제에 의한 영향 확인
1. CCND3 또는 PAK2 발현 억제에 의한 세포 생장의 저하
miR-4779의 과발현에 의한 세포 생장 억제가 miR-4779의 직접적인 표적 유전자로 규명된 CCND3 또는 PAK2의 발현억제에서 기인하는지를 확인하고자, HCT116 세포에 각각의 si-RNA (si-NC, si-CCND3, si-PAK2)를 형질주입하여 각 단백질의 발현을 억제하고 세포 생장률을 현미경 관찰과 MTS 분석으로 확인하였다.
먼저 si-CCND3 또는 si-PAK2를 HCT116 세포에 형질주입하고, 도 7a와 같이 qPCR로 PAK2 및 CCND3 유전자의 mRNA의 양을 확인하여, 각각의 si-RNA에 해당하는 유전자의 mRNA 양이 현저히 감소하였음을 관찰하였다. 이후, 도 7b에서와 같이 음성 대조군인 si-NC 처리한 세포와 비교하여 si-PAK2 처리한 세포는 세포 생장률이 50% 가량 감소했고, si-CCND3 처리한 세포는 70%가 감소하였다. 또한, 도 7c와 같이 세포 모양을 보면, si-PAK2에 의해 세포 성장이 억제되고, si-CCND3에 의해 세포 사멸이 촉진됨을 확인하였다. 이상의 결과로부터, miR-4779 과발현에 의한 세포 생장률의 저하는 PAK2 발현 억제에 의한 세포 성장 억제와 CCND3 발현 억제에 의한 세포 사멸 촉진이 한꺼번에 영향을 미치는 결과임을 확인하였다.
2. CCND3 또는 PAK2 발현 억제에 의한 세포 주기에 대한 영향
상기 실시예 2.2에 기재된 방법으로, CCND3 또는 PAK2 발현을 억제 시킨 경우의 HCT116 세포의 세포 주기를 분석하였다.
도 8a와 같이, si-NC와 비교하여, si-PAK2에 의해 subG1 세포 수가 조금 증가하고, G1기의 세포 수는 현저히 증가하였다. 이로서, si-PAK2에 의한 세포 생장 억제는 주로 G1에서의 세포 주기 지연에 의한 세포 성장 억제 때문임을 확인하였다. 한편, si-NC와 비교해 si-CCND3에 의해 subG1의 세포 수가 증가하였으며, 이로서 si-CCND3에 의한 세포 생장의 억제는 세포 사멸에 의한 것임을 확인하였다.
3. CCND3 또는 PAK2 발현 억제에 의한 세포 사멸의 촉진
miR-4779에 의한 세포 사멸의 증가가 PAK2의 발현 억제보다는 CCND3의 발현억제 때문인지를 더 정확히 확인하고자 실시예 2.3에 기재된 방법과 같이 세포 사멸 분석을 수행하였다.
도 8b와 같이 si-CCND3에 의해 세포 사멸이 크게 증가함을 확인하였다. 따라서, miR-4779 과발현에 의한 세포 사멸 효과는 CCND3의 발현 억제 때문임을 확인하였다.
4. CCND3 또는 PAK2 발현 억제에 의한 세포 생존 감소와 부착 의존성 세포 성장의 억제
실시예 2.4 및 2.5에 기재된 방법과 같이 콜로니 형성 분석 및 연한천 분석을 통해 CCND3 또는 PAK2 발현 억제에 의한 세포 생존율 및 부착 의존성 세포의 성장의 억제를 확인하였다.
그 결과 도 8c 및 8d에서와 같이 si-PAK2 또는 si-CCND3이 형질주입된 세포의 경우 대조군에 비해 콜로니 수가 확연히 줄어들었다.
실시예 6. HCT116 이종이식 동물모델에서 miR -4779에 의한 종양 억제 효과
miR-4779의 종양 억제 효과를 동물모델에서 확인하기 위해, HCT116 이종이식(xenograft) 동물모델을 수립하였다. 먼저, 10마리의 5주령의 면역결핍 마우스 (Balb/c-nude mouse) 암컷의 등에 5x106 개의 HCT116 세포를 피하 주사여 종양을 생성시켰다. 종양의 평균 부피가 약 120 mm3이 될 때 5마리씩 2개의 군으로 나누어 각각에 miR-NC 또는 miR-4779를 in vivo-jetPEI/miRNA complex 상태로 각각의 종양에 3일 간격으로 2번 주사하였다. 일주일에 2번씩 종양의 부피를 측정하였으며 (도 9a), 종양 세포 이식 후 22일째 마우스의 사진을 찍고, 안락사 시켜 종양을 추출하여 종양의 무게를 측정하였다 (도 9b). 도 9a 및 9b는 miR-4779가 주사된 동물 모델에서 종양 부피가 현저히 줄어든 것을 나타내어, 이러한 결과로부터 miR-4779에 의한 in vivo 종양 억제 효과를 확인하였다.
<110> KOREA INSTITUTE OF RADIOLOGICAL & MEDICAL SCIENCES <120> Pharmaceutical composition inhibiting expression of CCND3 or PAK2 for prevention or treatment of cancer <130> pn115616 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 7 <212> DNA <213> Homo sapience <400> 1 ccctcct 7 <210> 2 <211> 7 <212> RNA <213> Homo sapience <400> 2 aggaggg 7 <210> 3 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapience <400> 3 uaggagggaa uaguaaaagc ag 22

Claims (15)

  1. CCND3 (cyclin D3) 또는 PAK2 (p21-activated kinase 2) 유전자의 발현을 저해하는 물질을 유효 성분으로 포함하는 암을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 물질은 CCND3 또는 PAK2의 mRNA 서열에 상보적으로 결합하는 서열을 갖는 연속된 뉴클레오티드인 약학적 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 물질은 CCND3 또는 PAK2의 mRNA 서열의 3'UTR 부위에 상보적으로 결합하는 서열을 갖는 연속된 뉴클레오티드인 약학적 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 물질은 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열에 상보적으로 결합하는 7 내지 100개의 연속된 뉴클레오티드인 약학적 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 물질은 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 7개 내지 100개의 연속된 뉴클레오티드인 약학적 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 물질은 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 갖는 22개 내지 100개의 연속된 뉴클레오티드인 약학적 조성물.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 암은 방사선 치료에 내성을 갖는 상태인 약학적 조성물.
  8. 청구항 1에 있어서, 암세포의 방사선 민감성을 증진시키기 위한 것인 약학적 조성물.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 물질은 CCND3 및 PAK2 유전자의 발현을 모두 저해하는 조성물.
  10. CCND3 (cyclin D3) 또는 PAK2 (p21-activated kinase 2) 유전자의 발현을 저해하는 miRNA의 생성을 유도하는 제제를 유효성분으로 포함하는 암을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 제제는 miRNA의 발현 벡터인 약학적 조성물.
  12. 청구항 10에 있어서, 상기 miRNA는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 7개 내지 100개의 연속된 뉴클레오티드인 약학적 조성물.
  13. 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 7개 내지 100개의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 암을 예방 또는 치료하기 위한 뉴클레오티드.
  14. CCND3 (cyclin D3) 또는 PAK2 (p21-activated kinase 2)의 유전자를 발현하는 세포에 피검 물질을 접촉시키는 단계;
    상기 피검 물질과 접촉한 세포의 상기 CCND3 또는 PAK2의 유전자 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    상기 유전자 발현 수준을 변화시키는 피검 물질을 선별하는 단계를 포함하는 암을 예방 또는 치료하기 위한 후보물질을 스크리닝하는 방법.
  15. CCND3 (cyclin D3) 또는 PAK2 (p21-activated kinase 2)의 mRNA 또는 단백질 또는 그들의 단편을 포함하는 시료에 피검 물질을 접촉시키는 단계;
    상기 피검 물질과 접촉한 시료에서 상기 mRNA 또는 단백질 또는 그들의 단편 및 피검 물질의 결합 수준을 측정하는 단계; 및
    상기 mRNA 또는 단백질 또는 그들의 단편과 특이적으로 결합하는 피검 물질을 선별하는 단계를 포함하는 암을 예방 또는 치료하기 위한 후보물질을 스크리닝하는 방법.
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