CN111467504A

CN111467504A - miR-4469在制备抗结直肠癌药物中的应用

Info

Publication number: CN111467504A
Application number: CN202010173456.3A
Authority: CN
Inventors: 齐鲁; 张颖; 丁彦青; 宋馥瑶
Original assignee: Southern Medical University
Current assignee: Southern Medical University
Priority date: 2020-03-13
Filing date: 2020-03-13
Publication date: 2020-07-31

Abstract

本发明首次公开了miR‑4469抗结直肠癌的作用，miR‑4469作为一种比较新的microRNA，此前未见报道与结直肠癌相关，现有本项目通过结直肠癌表达谱数据，筛选并发现了miR‑4469与结直肠癌进展相关，并通过实验验证miR‑4469的确能够抑制结直肠癌细胞的增殖和迁移，具有良好的抑癌特性。

Description

miR-4469在制备抗结直肠癌药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，更具体地，涉及miR-4469在制备抗结直肠癌药物中的应用。

背景技术

MicroRNA(miRNA)是内源性产生的大约为22个核苷酸组成的单链RNA分子，能够通过靶向信使RNA(mRNA)促进其降解或者翻译抑制而发挥调节作用。miRNA首先被转录为长的初级转录物，然后经过剪切等步骤形成单链的成熟miRNA。在很多肿瘤中，miRNA能够通过靶向促癌基因进而抑制肿瘤的发生与发展。同样，miRNA在结直肠癌的发展中也起着重要作用。例如miR-532-3p能够抑制结直肠癌细胞的生长、转移和上皮间质转化(EMT)。miR-511-5p能够抑制结直肠癌细胞的生长和侵袭，促进细胞凋亡。miR-873-5p能抑制结直肠癌细胞的增殖、侵袭，影响细胞周期，促进细胞凋亡。由于很多miRNA具有这样的特性，因此miRNA在抗结直肠癌转移中能够发挥一定的作用，起到类似于抗癌小分子化合物的靶向治疗效果。由于在细胞内能够靶向特定促癌基因的mRNA序列，有些抑癌miRNA能够发挥治疗肿瘤的效果，而且由于在肿瘤中，这些抑癌miRNA通常表达较低，恢复这些miRNA的细胞表达量是治疗肿瘤的主要策略。因此通过合成这些miRNA的模拟物，然后包裹在脂质载体中能够直接应用于对肿瘤的治疗。例如已有实验表明抑癌miRNA(miR-34a)的模拟物MRX34能够通过包裹在脂质载体中抗实体肿瘤。另有研究也证明了抑癌miRNA(miR-16)模拟物MesomiR-1对胸腺癌具有一定的治疗效果。

现有部分进入临床试验的miRNA类药物，但是抗肿瘤类的miRNA药物很少，更未见能够抗结直肠癌的miRNA类药物。

发明内容

本发明第一个方面的目的，在于提供miR-4469或其模拟物在制备抗结直肠癌药物中的应用。

本发明第二个方面的目的，在于提供miR-4469或其模拟物的核苷酸片段在制备抗结直肠癌药物中的应用。

本发明第三个方面的目的，在于提供含有miR-4469或其模拟物的核苷酸序列的病毒、载体和/或药学上能接受辅料在制备抗结直肠癌药物中的应用。

本发明第四个方面的目的，在于提供含有编码miR-4469或其模拟物的核苷酸序列的病毒、载体和/或药学上能接受辅料在制备抗结直肠癌药物中的应用。

本发明第五个方面的目的，在于提供靶向上调miR-4469或增强miR-4469活性的试剂或组合物在制备抗结直肠癌药物中的应用。

本发明第六个方面的目的，在于提供一种用于治疗结直肠癌的药物。

本发明第七个方面的目的，在于提供一种用于抑制结直肠癌细胞增殖和/或迁移的药物。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供miR-4469或其模拟物在制备抗结直肠癌药物中的应用。

更具体地，提供miR-4469或其模拟物在制备抗结直肠癌细胞增殖和/或迁移的药物中的应用。

本发明的第二个方面，提供miR-4469或其模拟物的核苷酸片段在制备抗结直肠癌药物中的应用。

更具体地，提供miR-4469或其模拟物的核苷酸片段在制备抗结直肠癌细胞增殖和/或迁移的药物中的应用。

本发明的第三个方面，提供含有miR-4469或其模拟物的核苷酸序列的病毒、载体和/或药学上能接受辅料在制备抗结直肠癌药物中的应用。

更具体地，提供含有miR-4469或其模拟物的核苷酸序列的病毒、载体和/或药学上能接受辅料在制备抗结直肠癌细胞增殖和/或迁移的药物中的应用。

本发明的第四个方面，提供含有编码miR-4469或其模拟物的核苷酸序列的病毒、载体和/或药学上能接受辅料在制备抗结直肠癌药物中的应用。

更具体地，提供含有编码miR-4469或其模拟物的核苷酸序列的病毒、载体和/或药学上能接受辅料在制备抗结直肠癌细胞增殖和/或迁移的药物中的应用。

根据本发明第一至第四个方面任一所述的应用，其中miR-4469的序列如SEQ IDNO:1所示。

根据本发明第一至第四个方面任一所述的应用，其中miR-4469模拟物的正义链序列如SEQ ID NO:2所示；反义链序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明的第五个方面，提供靶向上调miR-4469或增强miR-4469活性的试剂或组合物在制备抗结直肠癌药物中的应用。

根据权利本发明第一至第五个方面任一所述的应用，所述抗结直肠癌是指抑制结直肠癌细胞的增殖和/或迁移。

根据权利本发明第一至第五个方面任一所述的应用，通过提高结直肠癌细胞中miR-4469或其模拟物的含量/表达量从而抑制细胞的增殖和/或迁移。

进一步地，所述提高结直肠癌细胞中miR-4469或其模拟物的含量的方法为：用细胞转染试剂包裹miR-4469或其模拟物的核苷酸片段，转染结直肠癌细胞。

优选地，根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述细胞转染试剂为脂质体。

更进一步地，根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述转染结直肠癌细胞的方法为：将细胞转染试剂与miR-4469或其模拟物的核苷酸片段混合孵育，滴至细胞表面。

本发明的第六个方面，提供一种用于治疗结直肠癌的药物，所述药物中含有如下Ⅰ～Ⅳ中任一种物质：

Ⅰ.SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的RNA分子、核苷酸片段或其变体；

Ⅱ.含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的病毒、载体；

Ⅲ.含有编码SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的病毒、载体；

Ⅳ.靶向上调miR-4469或增强miR-4469活性的试剂或组合物。

本发明的第七个方面，提供一种用于抑制结直肠癌细胞增殖和/或迁移的药物，所述药物中含有如下Ⅰ～Ⅳ中任一种物质：

Ⅳ.靶向上调miR-4469或增强miR-4469活性的试剂或组合物。

根据本发明第六或第七个方面所述的药物，所述药物还包括药学上可接受的载体或辅料。

本发明的有益效果是：

本发明首次公开了miR-4469抗结直肠癌的作用，miR-4469作为一种比较新的microRNA，此前未见报道与结直肠癌相关，现有本项目通过结直肠癌表达谱数据，筛选并发现了miR-4469与结直肠癌进展相关，并通过实验验证miR-4469的确能够抑制结直肠癌细胞的增殖和迁移，具有良好的抑癌特性。

附图说明

图1miRNA-mRNA负调控网络图。

图2miR-4469表达相关基因的Gene Ontology富集分析结果。

图3miR-4469在结直肠癌细胞及组织中的表达水平。

图4CCK8细胞增殖实验检测miR-4469对结直肠癌细胞增殖能力的影响。

图5Transwell细胞迁移实验检测miR-4469对结直肠癌细胞迁移能力的影响。

具体实施方式

为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例对本发明做进一步详细描述，该实施例仅用于解释本发明，并不对本发明的保护范围构成限定。

发明人的研究团队聚焦于抗结直肠癌发展和转移的miRNA，从NCBI的GEO数据库中获得了样本数较多的结直肠癌miRNA表达谱数据(ID:GSE115513)，包含正常结直肠组织数据649例，具有结直肠癌分期信息的数据731例，其中I期数据231例，II期数据181例，III期数据219例，IV期数据100例。通过分析结直肠癌miRNA表达谱数据，获得了多个与结直肠癌进展相关的miRNA，创造性地筛选出了结直肠癌各阶段表达持续递增或递减的miRNA，发明人根据miRNA与mRNA的负调控关系，构建与结直肠癌进展相关的miRNA与mRNA调控网络。随后通过构建miRNA-mRNA负调控网络，结合相关文献报道，获得了一个与结直肠癌进展呈负相关的miRNA miR-4469。

组织标本来源与细胞培养

结直肠癌组织及其配对正常组织采集自南方医科大学南方医院外科手术室(广州，中国)，储存于病理实验室液氮罐中，事前已通过患者的知情同意。人类结直肠癌细胞株为南方医科大学病理实验室自存，使用含10％胎牛血清(MRC，中国)的RPMI-1640培养基(Gibco，美国)培养。

RNA提取与QPCR

细胞及组织的总RNA通过Trizol(Takara，日本)提取，microRNA由试剂Mir-X^TMmiRNA First Strand Synthesis Kit(Takara)逆转录为cDNA。QPCR反应试剂为TB

Premix Ex Taq^TMII(Takara)，QPCR反应仪器是7500荧光定量PCR仪(ABI,美国)。miR-4469上游引物序列为5’-CTCTAGGGTCGCTCGGAAA-3’(SEQ ID NO:5)。U6上下游引物和miRNA下游引物来源于Mir-X^TMmiRNA First Strand Synthesis Kit(Takara)。QPCR反应程序为：预变性(95℃30秒)，PCR反应(95℃5秒，60℃30～34秒，40个循环)。

瞬时转染

转染试剂为脂质体Lipofectamine 3000(Invitrogen，美国)，miR-4469mimics，miR-4469inhibitor，均购自广州锐博生物科技有限公司。转染方法为将脂质体与转染的RNA片段混合孵育10分钟，再滴加到相应细胞中完成转染，在细胞培养箱中培养24小时后换液，用于后续实验。

miR-4469的序列为：5’-GCUCCCUCUAGGGUCGCUCGGA-3’(SEQ ID NO:1)。

miR-4469mimics即为miR-4469的模拟物，是人工合成的miR-4469序列的模拟物，具有miR4469的功能。miRNA mimic能模拟细胞中内源性成熟miRNA的高水平表达，以增强内源性miRNA的调控作用，是miRNA功能研究的一大利器。

其正义链序列为：5’-GCUCCCUCUAGGGUCGCUCGGA-3’(SEQ ID NO:2)，

反义链序列为：5’-UCCGAGCGACCCUAGAGGGAGC-3’(SEQ ID NO:3)。

miR-4469inhibitor为miR-4469抑制剂，

其序列为：5’-UCCGAGCGACCCUAGAGGGAGC-3’(SEQ ID NO:4)。

CCK8细胞增殖实验

瞬时转染24小时后的细胞，消化重悬计数，以1500/孔的密度铺于96孔板中，连续测量5天，每次测量5个复孔，每孔加入10ul CCK8试剂(同仁，日本)，避光置于培养箱2小时后，通过酶标仪测量OD值(450nm)，绘制生长曲线。

Transwell细胞迁移实验

每个小室(康宁，美国，8um孔膜)内加入瞬时转染细胞10万-20万个(含无血清培养基的细胞悬液200ul)，将小室置于24孔板中，下室为600ul含20％血清的培养基，于细胞培养箱中培养48h，吸去小室内培养基。用甲醇固定，4％结晶紫染色，PBS漂洗小室，用棉签擦去小室上层未穿过的细胞，显微镜(200倍物镜)下拍照计数。

实施例1 miR-4469抗结直肠癌的实验验证

差异表达miRNA筛选结果

通过筛选结直肠癌各阶段差异表达miRNA，发明人获得了结直肠癌从正常、I期、II期、III期、IV期表达水平递增的miRNA共8个，分别为hsa-miR-135b-5p、hsa-miR-183-5p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-3147、hsa-miR-3648、hsa-miR-4417、hsa-miR-4482-3p、hsa-miR-663a。表达递减的miRNA共6个，分别为hsa-miR-194-3p、hsa-miR-1973、hsa-miR-4469、hsa-miR-451a、hsa-miR-4728-5p、hsa-miR-5696。考虑到GSE115513数据中有部分miRNA的信号值为0，因此发明人将对差异miRNA进行进一步筛选及实验验证。

miRNA靶基因分析及网络构建

发明人通过Diana TarBase v8和miRTarBase数据库获得上述差异表达miRNA的靶基因。由于在前期研究中，发明人获得了结直肠癌从正常、I期、II期、III期、IV期表达水平递增或递减的基因。因此将递增的8个miRNA的靶基因分别与前期研究中获得的290个递减基因取交集，将递减的6个miRNA的靶基因分别与295个递增基因取交集。去除无靶基因交集的miRNA后，发明人通过Cytoscape工具构建了miRNA与mRNA的负调控网络，因此网络中的miRNA及靶基因，均在结直肠癌从正常、I期、II期、III期、IV期表达持续递增或递减。从网络中发明人能够看出，持续递增的miRNA中hsa-miR-135b-5p、hsa-miR-183-5p、hsa-miR-31-5p的靶基因数目较多，同时这些miRNA的已有研究报道也较多，而在持续递减的miRNA中，hsa-miR-4728-5p、hsa-miR-4469、hsa-miR-194-3p的靶基因数目较多(见附图1)，发明人结合文献报道情况，最终筛选出hsa-miR-4469这一miRNA。

miR-4469调控机制分析

为了进一步分析miR-4469可能参与的调控机制，发明人将RNA-seq测序数据GSE104836根据miR-4469表达值进行排序并分成高表达组和低表达组，通过筛选差异表达基因发明人获得了在miR-4469高表达组中上调基因861个，下调基因282个。发明人通过Gene ontology富集分析发现，miR-4469高表达组的上调基因主要参与了各种代谢进程，例如脂肪酸代谢，有机酸代谢，核苷酸代谢等，细胞组分富集结果显示这些基因主要定位于线粒体。与之相反，miR-4469高表达组的下调基因主要参与了炎症反应，免疫系统进程，白细胞激活，细胞因子应答反应等与炎细胞趋化相关的生物进程，细胞组分富集结果显示这些基因主要定位于分泌性囊泡，细胞表面以及细胞外基质等细胞外的区域(见附图2)。这反映了miR-4469在高表达时能够抑制结直肠癌炎细胞趋化作用，而促进各种代谢进程，低表达时则相反。这些特征十分符合发明人在前期研究中对结直肠癌进展相关的分子事件研究，发明人在前期研究中对结直肠癌各阶段差异基因进行了分析，发现在结直肠癌发展及转移过程中，上调基因参与的关键分子事件同样是炎细胞趋化，主要定位于细胞外，而下调基因参与的关键分子事件同样是各种代谢进程，主要定位于线粒体。本次分析的miR-4469高表达组的差异基因与上述结直肠癌进展的分子事件是相反的。因此发明人推测，miR-4469能够抑制结直肠癌的发展及转移。另外，发明人通过UCSC基因组浏览器分析miR-4469的基因组定位发明人发现，miR-4469定位于RNF170基因的内含子中，因此发明人推测，miR-4469的表达与RNF170的表达具有相关性，而在miR-4469高表达组表达上调的861个基因中，发明人确实发现上调基因包含了RNF170，这也进一步证明了miR-4469调控机制分析的可靠性。

实施例2 miR-4469抗结直肠癌转移的实验验证

为了验证miR-4469对结直肠癌的抑癌作用，发明人首先通过qPCR检测了miR-4469在结直肠癌细胞和组织中的表达水平。在细胞中，发明人检测了结直肠癌细胞株HCT116、RKO、HT29、SW480、SW620、LoVo的miR-4469内源性表达，发明人发现，miR-4469在HCT116、RKO中的表达水平最高，而在SW620、LoVo中的表达水平最低(见图3A)，SW620、LoVo是结直肠癌转移灶来源的细胞系，具有高侵袭性特征，而miR-4469在LoVo细胞(来源于远隔器官转移灶)要比SW620细胞(来源于淋巴结转移灶)表达更低，这也验证了miR-4469与结直肠癌转移密切相关。

在组织中，发明人检测了10例结直肠癌组织以及与之配对的10例癌旁正常组织的miR-4469表达(见附图3B)，发明人发现miR-4469在结直肠癌组织中的表达水平均低于配对的正常组织，这同样反映了miR-4469是结直肠癌的抑癌miRNA。

接着发明人通过瞬时转染的方法对miR-4469在细胞中的表达进行干预。发明人选择miR-4469表达最高的两株细胞HCT116、RKO进行miR-4469的干扰，对表达最低的两株细胞SW620、LoVo进行miR-4469的过表达，发明人对干扰效率及过表达效率通过QPCR进行了表达验证后，对上述细胞分别通过CCK8细胞增殖实验和Transwell细胞迁移实验检测结直肠癌细胞增殖和迁移能力的变化。发明人发现，在过表达miR-4469以后，与对照组相比SW620和LoVo细胞的增殖能力明显减弱，差异随着时间的增加而增大(见附图4)，同样，细胞的迁移能力也明显减弱，过表达miR-4469后穿膜细胞的数量明显减少(见附图5)。这说明了过表达miR-4469能够明显抑制结直肠癌细胞的增殖和迁移能力。相反，在干扰miR-4469以后，与对照组相比HCT116和RKO细胞的增殖能力明显增强，差异随着时间的增加而增大(见附图4)，细胞的迁移能力也明显增强，干扰miR-4469后穿膜细胞的数量明显增多(见附图5)。这说明了干扰miR-4469能够明显促进结直肠癌细胞的增殖和迁移能力。

以上实施例均验证了miRNA4469能够显著抑制结直肠癌细胞的生长和转移，与生物信息学分析结果相吻合。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 南方医科大学

<120> miR-4469在制备抗结直肠癌药物中的应用

<130>

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

gcucccucua gggucgcucg ga 22

<210> 2

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 2

gcucccucua gggucgcucg ga 22

<210> 3

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 3

uccgagcgac ccuagaggga gc 22

<210> 4

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 4

uccgagcgac ccuagaggga gc 22

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ctctagggtc gctcggaaa 19

Claims

1.miR-4469或其模拟物在制备抗结直肠癌药物中的应用。

2.含有miR-4469或其模拟物的核苷酸序列的病毒、载体在制备抗结直肠癌的药物中的应用。

3.含有编码miR-4469或其模拟物的核苷酸序列的病毒、载体在制备抗结直肠癌的药物中的应用。

4.靶向上调miR-4469或增强miR-4469活性的试剂或组合物在制备抗结直肠癌药物中的应用。

5.根据权利要求1至4任一所述的应用，其特征在于，通过提高结直肠癌细胞中miR-4469或其模拟物的含量/表达量从而抑制细胞的增殖和/或迁移。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述提高结直肠癌细胞中miR-4469的含量的方法为：用细胞转染试剂包裹miR-4469或其模拟物的核苷酸片段，转染结直肠癌细胞。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述转染结直肠癌细胞的方法为：将细胞转染试剂与miR-4469或其模拟物的核苷酸片段混合孵育，滴至细胞表面。

8.一种用于治疗结直肠癌的药物，其特征在于，所述药物中含有如下Ⅰ～Ⅳ中任一种物质：

Ⅳ.靶向上调miR-4469或增强miR-4469活性的试剂或组合物。

9.一种用于抑制结直肠癌细胞增殖和/或迁移的药物，其特征在于，所述药物中含有如下Ⅰ～Ⅳ中任一种物质：

Ⅳ.靶向上调miR-4469或增强miR-4469活性的试剂或组合物。

10.根据权利要求8或9所述的药物，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的载体或辅料。